CN103083660B - 一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，它是以pVAX1质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX-IL21-IL15，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂具有显著提升MIC8基因免疫效果的作用，进而，能够显著增强弓形虫免疫预防疫苗的免疫效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫佐剂，具体地，涉及一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用。
背景技术
弓形虫（T.gondii）广泛寄生于多种哺乳动物的有核细胞内，是一种重要的人兽共患性寄生虫病病原，具有发病率高、危害严重的流行病学特点。婴幼儿、孕妇或免疫低下者感染，可引发流产、畸胎或急性获得性弓形虫病等。艾滋病又名获得性免疫缺陷综合征（AIDS），研究发现10%～30%艾滋病患者并发弓形虫脑炎，是艾滋病患者死亡的主要原因之一。鉴于药物治疗弓形虫病能力有限且毒副作用大的特点，研制疫苗尤其是DNA疫苗已逐渐成为一种较为有效的举措。从1990年Wolff等发现小鼠肌注外源性重组质粒，质粒被摄取并表达出编码蛋白时起，重组质粒的数量和种类已举不胜举，其中近些年，弓形虫重组质粒包括ROP13，ROP16，ROP18，MIC6，MIC8等先后被评价。结果发现，除少数个别基因（如ROP18等）免疫效果较好外，其他重组疫苗均有不理想的特征。为了增强免疫效果，提高免疫保护率，免疫佐剂的研制将成为一个重要的研究课题。按照是否具有免疫原性，免疫佐剂可分为两大类，即具备免疫原性的佐剂如卡介苗，细胞因子等，和不具备免疫原性的佐剂如铝盐佐剂等，或两者的混合形式。其中，白细胞介素（IL）是一种常见的免疫佐剂。
IL15是Grabstein于1994年从猿肾上皮细胞系CV-1/EBNA的培养上清液中发现的，它是一种重要的免疫调节因子，属于IL2家族，主要由单核细胞、吞噬细胞和树突状细胞等白细胞产生，能维持依赖IL-2的CTLL细胞系的增殖，同时对CD8+ T细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞的发育及内环境稳态至关重要。IL15分子包含Cys-35-Cys-85和Cys-42-Cys-88两个二硫键，三级结构含有4个螺旋和3个连接环。IL15受体（IL15R）由3个亚基组成，β、γ亚基与IL2R相同，α亚基为IL15独有。在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中，IL15引起由IgM交叉耦合诱导的细胞增殖并抑制细胞凋亡，还可增加Shc和 ERK1/2的磷酸化作用，而IL21促进细胞凋亡且不能引起CLL细胞的增殖。
IL21是Parrish-Novak首次发现的，属于I型细胞因子，亦是IL-2家族成员。人IL21基因与IL2、IL15定位于同一条染色体上，位于4q26-q27，距IL-2基因大约180 kb，相距IL15则较远，与IL2、IL4、IL15有较高的同源性，鼠IL21与人的IL21有57%的同源性。IL21包含4个螺旋，与IL15有两对相同的Cys位点残基：一对是在IL21和IL15中特有的, 另一对在IL2、IL4和GM-CSF中也有表达。IL21具有很强的免疫刺激作用，特别是能够增强并维持CD8+ T细胞应答，已经被证明是很好的免疫增强因子。IL21的信号传导是由IL21受体与IL2受体家族共同的γc受体组成的异二聚体受体介导的。IL21是启动先天性和适应性免疫应答的辅助细胞因子, 并导致免疫应答进一步放大。IL21对机体的细胞免疫和体液免疫具有广泛的调节作用，它可调节T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞的分化和增殖，其中最显著的特征是能持续增强效应T细胞及活化NK细胞的功能，在促进机体由先天性免疫向获得性免疫的转变中起着关键作用。IL21对B细胞的调节主要表现为促进B细胞向浆细胞分化，调节免疫球蛋白的产生。IL21具有增强免疫激活、促进CTL应答和维持记忆性T细胞应答的能力，使其成为癌症免疫治疗最具潜力的候选药物之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，它是以pVAX1质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX-IL21-IL15，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
本发明的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在提升MIC8基因免疫效果中的应用。
本发明的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在增强弓形虫免疫预防疫苗效果中的应用。
本发明的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在制备弓形虫免疫预防疫苗中的应用。
以下为本发明的实验内容：
参照弓形虫MIC8基因序列，设计了扩增弓形虫MIC8基因的引物序列。包括：
FMIC8：5′-CGCGGATCCATGAAGGCCAATCGAATATGGTG-3′；
RMIC8：5′-CCGCTCGAGTTAGGACCAGATACCGCCCGAA-3′；
参照小家鼠（Mus musculus）IL15基因序列，设计了IL15基因引物序列。包括：
F15B：5′-AACTGCAGATGAACTGGATAGATGTAAGATATG-3′；
R15B：5′-TGCTCTAGATCAGGACGTGTTGATGAAC-3′；
参照小家鼠（Mus musculus）IL21基因序列，设计了IL21基因引物序列。包括：
F21：5′-CGGGGTACCATGCATAAATCAAGCCCCCAAG-3′ ；
R21：5′-AACTGCAGCTAGGAGAGATGCTGATGAATC-3′；
弓形虫RH株pVAX-MIC8疫苗的制备；
KM鼠pVAX-IL21-IL15免疫佐剂的构建；
KM鼠免疫与分组。
（一）弓形虫RH株pVAX-MIC8疫苗的制备包括如下顺序的步骤：
1．虫体基因组DNA的提取：弓形虫RH株腹腔接种KM鼠96 h后，经颈椎脱臼致死，无菌收集小鼠腹水1.0mL，10000rpm离心3～5min，弃上清，备用。弓形虫RH株DNA提取的具体方法和步骤参照Promega公司试剂盒Wizard SV Genomic DNA Purification System使用说明进行。
扩增：以所提取的弓形虫RH株基因组DNA为模板，进行MIC8基因的PCR扩增。MIC8基因PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性 1min， 62℃复性1min；72℃延伸 2min；35个循环。
纯化产物的连接：MIC8基因PCR纯化产物的连接反应参照TaKaRa公司pMD18-T Vector使用说明进行。16℃反应2～4h或4℃连接过夜，连接产物标记为pMD18-MIC8。
的序列测定：将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。
质粒的小量提取：按天根生化科技（北京）有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用说明进行。
载体（图6所示）及MIC8目的片段的回收：用BamHI和XhoI分别双酶切pVAX1质粒及pMD18-MIC8重组质粒，按照天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明回收载体及目的片段。
载体及MIC8目的片段的连接：将经切胶回收纯化得到的MIC8基因片段定向亚克隆至pVAX1载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-MIC8。
连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。pVAX-MIC8构建路线参照图1。
（二） KM鼠pVAX-IL21-IL15重组质粒的构建
1. KM鼠脾脏总RNA的提取：弓形虫RH株腹腔接种KM鼠72 h后，将其经颈椎脱臼致死，并将其置75%乙醇溶液中浸泡2～3min，无菌取出脾脏。将脾脏装入一个RNase-Free离心管，后续实验按天根生化科技（北京）有限公司试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit使用说明进行；
2. RT-PCR扩增目的片段：以KM鼠脾脏总RNA为模板，进行IL21和IL15基因序列的RT-PCR扩增，实验步骤参考大连宝生物工程公司PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒的使用说明进行。
纯化产物的连接：RT-PCR纯化产物的连接反应参照TaKaRa公司pMD18-T Vector简易操作说明进行；16℃反应2～4h或4℃连接过夜，产物依次标记为pMD18-IL21和pMD18-IL15；pMD18-T载体如图5所示。
和pMD18-IL15重组质粒的小量提取：按天根生化科技（北京）有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用说明进行。
和IL15的序列测定：将经菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。
及目的片段IL15的回收与连接：用PstI和XbaI双酶切pVAX1质粒和pMD18-IL15重组质粒，按照天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明分别回收载体及目的片段。然后将经切胶回收纯化得到的IL21、IL15基因片段定向亚克隆到相应pVAX1载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL15。
和pMD18-IL21重组质粒的小量提取：按天根生化科技（北京）有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用说明进行。
及目的片段IL21的回收与连接：用KpnI和PstI双酶切pVAX-IL15和pMD18-IL21重组质粒。按照天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的指导说明回收线性载体pVAX-IL15及目的片段IL21，将经切胶回收纯化得到的IL21基因片段定向亚克隆到pVAX-IL15载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL21-IL15。pVAX-IL21-IL15构建路线参照图2。
（三）大量制备质粒
1. 挑取含有目的质粒（pVAX1，pVAX-IL21-IL15和pVAX-MIC8）的阳性菌液于LB（含1000U/mL Kan+，下同）固体选择培养基上划线，37℃培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于12mL LB液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h。将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有400mL LB培养基的1000mL锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜。
2. 将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱数分钟，4℃，9000rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出。10mL预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散。加入1mL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液（pH8.0），震荡混匀，此步可省略。
3. 加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀2～4次。再加入15mL预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或-20℃冰箱放置10min。加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4℃或室温，11000rpm离心10min，利用4层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中。
4. 上清与0.6倍体积异丙醇（15mL）混匀，室温放置10min。室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟数分钟，除去残余。加入3mL ddH2O充分溶解（很重要），再加入3mL预冷的5M LiCl溶液，充分混匀（不可吹打）。两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min。4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积（12mL）预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min。4℃或室温，11000rpm离心10min，小心弃上清，倒置控干管内液体，一般倒置10～15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。
5. 加入3mL ddH2O或TE溶液（pH8.0）溶解沉淀，并加入30 10mg/mL RNase A，37℃水浴1h除去RNA。加入2倍体积（8mL）无水乙醇和1/10体积（300）3M NaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min。4℃，11000rpm离心10min，小心将上清吸出（勿倒），并将离心管倒置于滤纸上控干（非常重要）。加入100 ddH2O或TE溶液（pH8.0），充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用。
（四） 质粒DNA的纯度检测
以ddH2O或TE（pH8.0）为空白对照，用分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度（OD）值。双链DNA纯品的OD260/OD280值为1.8，若样品OD260/OD280值低于1.8，说明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。
（五） 重组质粒的免疫效果评价
1. KM鼠免疫与分组：为了降低应激反应，KM鼠买回后需饲养1w，然后将其随机分为6个组，每组19只，具体分组见表10。
表10 免疫实验分组情况
以左后腿胫后肌注射途径进行免疫，首先将提取纯化的重组质粒pVAX-IL21-IL15、pVAX-MIC8和空载体pVAX1用PBS（pH7.4）溶液稀释至100μg/100μL，于第3～5组中每只小鼠各注射100μL；再将纯化的重组质粒pVAX-IL21-IL15和pVAX-MIC8用PBS（pH7.4）溶液稀释至200μg/100μL，然后将pVAX-IL21-IL15与pVAX-MIC8等体积混合，混匀后于第6组中每只小鼠各注射100μL。初次免疫后，第2w和第4w各自加强免疫一次。
腹腔注射感染弓形虫RH株：弓形虫RH株的复苏需在攻虫前2w进行。从液氮罐中取出保存有弓形虫RH株虫体的冻存管，并立即将其放入37℃温水中进行解冻。将冻存管中的液体混匀，每只小鼠腹腔注射200μL，进行第一次传代。待感染小鼠发病（4～6d），颈椎脱臼处死后无菌采集小鼠腹水1～2mL。混匀后，吸取10μL腹水进行镜检。按照上述方式进行第二和第三次传代。将经第三次传代纯化后所得虫体按1×103个速殖子/只的剂量，腹腔接种各组小鼠各6只，观察并记录其存活时间。
灌胃感染弓形虫PRU株：弓形虫PRU株的准备需在攻虫前30天进行。颈椎脱臼处死被弓形虫PRU株感染的小鼠，75%酒精浸泡2～3min。取出并于超净工作台中，无菌采集脑组织并将其置于研钵中，加入1mL生理盐水进行研磨。待研磨完全后，吸取10μL进行镜检，并观察计数。按10个包囊/只的剂量，以灌胃的方式感染各组小鼠各8只，攻虫后30d进行脑包囊计数；按80个包囊/只的剂量，灌胃感染各组小鼠各5只，观察并记录其存活时间。
本发明的有益效果将通过以下数据说明：
1. PRU脑包囊计数和减少率：
2. 弓形虫RH株死亡情况：
如图3所示，与对照组（Control，PBS和pVAX1）相比，实验组小鼠存活时间均显著性增加，pVAX-IL21-IL15+pVAX-MIC8，pVAX-IL21-IL15和 pVAX-MIC8的存活时间分别为16.2±1.30d，11.7±0.62d，9.8±0.59d；与pVAX-IL21-IL15或 pVAX-MIC8相比，pVAX-IL21-IL15+pVAX-MIC8能够显著性增加实验鼠感染T.gondii RH株后的存活天数；7d内对照组小鼠无存活。
弓形虫PRU株死亡情况：
如图4所示，pVAX-IL21-IL15+pVAX-MIC8，pVAX-IL21-IL15和 pVAX-MIC8的存活时间分别为44.8±4.45d，37.8±2.56d，33.2±2.14d，与对照组（Control，PBS和pVAX1）相比，其存活时间均显著性增加；而与pVAX-IL21-IL15或 pVAX-MIC8对比，联合免疫组能够显著性增加实验鼠感染T.gondii PRU株后的存活天数；27d内对照组小鼠无存活。
从上述表格可以看出，无论是减少PRU脑包囊数目，还是延缓RH和PRU的死亡时间，都说明重组质粒pVAX-IL21-IL15可有效地提升MIC8的免疫效果，可作为一种良好的免疫佐剂应用于实际的弓形虫感染预防中。
综上所述，本发明（pVAX-IL21-IL15重组体）作为佐剂，可有效地预防和控制弓形虫对实验室（昆明鼠）的感染，能够显著性提升感染鼠的存活时间和减少实验鼠脑包囊的数目，由此可认为pVAX-IL21-IL15重组体是一种良好的免疫佐剂。
雌性KM鼠，6w龄左右，体重20±2g，购自兰州大学医学实验中心。
宿主菌，弓形虫RH、PRU株， pVAX1真核表达载体等材料，均为中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保存。
PrimeScriptOne Step RT-PCR Kit Ver.2、10×PCR Buffer（Mg2+ free）、MgCl2（25mM）、dNTP Mixture（2.5mM each）、Ex-Taq（5U/μL）、pMD18-T Vector、BamHI、XhoI、KpnI、PstI、XbaI、10×M Buffer、10×K Buffer、10×和6×Loading Buffer：TaKaRa公司；
Wizard SV Genomic DNA Purification System、Tris-Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4 DNA连接酶：Promega公司；
RNAprep Pure Tissue Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；
氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、琼脂糖：Sigma公司；
其他化学试剂如NaCl、、无水乙醇等均为国产分析纯级产品。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是pVAX-MIC8构建路线；
图2是pVAX-IL21-IL15构建路线；
图3是弓形虫RH株死亡情况；
图4是弓形虫PRU株死亡情况；
图5是pMD18-T 质粒；
图6是pVAX1质粒。
具体实施方式
用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，它是以pVAX质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX-IL21-IL15，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
pVAX-IL21-IL15重组质粒的构建方法如下：
1. KM鼠脾脏总RNA的提取：弓形虫RH株腹腔接种KM鼠72 h后，将其经颈椎脱臼致死，并将其置75%乙醇溶液中浸泡2～3min，无菌取出脾脏。将脾脏装入一个RNase-Free离心管，后续实验按天根生化科技（北京）有限公司试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit使用说明进行；
2. RT-PCR扩增目的片段：以KM鼠脾脏总RNA为模板，进行IL21和IL15基因序列的RT-PCR扩增，实验步骤参考大连宝生物工程公司PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒的使用说明进行。
纯化产物的连接：RT-PCR纯化产物的连接反应参照TaKaRa公司pMD18-T Vector简易操作说明进行；16℃反应2～4h或4℃连接过夜，产物依次标记为pMD18-IL21和pMD18-IL15；
4. pMD18-IL21和pMD18-IL15重组质粒的小量提取：按天根生化科技（北京）有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用说明进行。
和IL15的序列测定：将经菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。
及目的片段IL15的回收与连接：用PstI和XbaI双酶切pVAX1质粒和pMD18-IL15重组质粒，按照天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明分别回收载体及目的片段。然后将经切胶回收纯化得到的IL21、IL15基因片段定向亚克隆到相应pVAX1载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL15。
和pMD18-IL21重组质粒的小量提取：按天根生化科技（北京）有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用说明进行。
及目的片段IL21的回收与连接：用KpnI和PstI双酶切pVAX-IL15和pMD18-IL21重组质粒。按照天根生化科技（北京）有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的指导说明回收线性载体pVAX-IL15及目的片段IL21，将经切胶回收纯化得到的IL21基因片段定向亚克隆到pVAX-IL15载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-IL21-IL15。pVAX-IL21-IL15构建路线参照图2。
用于弓形虫感染预防的免疫佐剂能够提升MIC8基因的免疫效果。
用于弓形虫感染预防的免疫佐剂能够增强弓形虫免疫预防疫苗的免疫效果。
其中，重组质粒pVAX-IL21-IL15的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示：
SEQ ID NO: 1
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accatgcata aatcaagccc ccaagggcca gatcgcctcc tgattagact tcgtcacctt 780
attgacattg ttgaacagct gaaaatctat gaaaatgact tggatcctga acttctatca 840
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aaactcaagc catcaaaccc tggaaacaat aagacattca tcattgacct cgtggcccag 960
ctcaggagga ggctgcctgc caggagggga ggaaagaaac agaagcacat agctaaatgc 1020
ccttcctgtg attcgtatga gaaaaggaca cccaaagaat tcctagaaag actaaaatgg 1080
ctccttcaaa agatgattca tcagcatctc tcctagctgc agatgaactg gatagatgta 1140
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tacactgaca gtgactttca tcccagttgc aaagttactg caatgaactg ctttctcctg 1260
gaattgcagg ttattttaca tgagtacagt aacatgactc ttaatgaaac agtaagaaac 1320
gtgctctacc ttgcagacag cactctgtct tctaacaaga atgtagcaga atctggctgc 1380
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attgtccaaa tgttcatcaa cacgtcctga tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1500
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1560
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cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1680
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact 1740
gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg 1800
ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca 1860
ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 1920
gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 1980
aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 2040
ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 2100
ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 2160
aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 2220
accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 2280
ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 2340
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 2400
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 2460
tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 2520
tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 2580
gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 2640
tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 2700
ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 2760
cacaccgcat acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 2820
tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 2880
ataatagcac gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 2940
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3000
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3060
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3120
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 3180
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3240
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3300
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3360
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3420
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3480
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3540
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3600
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc 3660
ttttgctcac atgttctt 3678
重组质粒pVAX-MIC8的序列，如SEQ ID NO: 2所示：
SEQ ID NO: 2
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccatgaa ggccaatcga atatggtgtt tttttgcgtg gcgtatggtt 780
gtgcgggcct catttctgaa agagatggac agcattttcg tttctgctat ccgacagaat 840
gtacagcata ctcattctgc ccttctcgcc aaactgaagg aacccccaga tccagatgat 900
gagaactctt ggctttgtcg aatatcaaaa aaatatgacg catgcggtag cagggaatat 960
tccgataagg gcctcaaagg gacgtactgt cccgaggatt tttgctgtag caagacggca 1020
tgtttttacg gttcatgtgg gagttggtgc cacgacaact gggctctgtg cagctcatct 1080
ataatctacc acgacgagta cagttacggg aaatgcaact gtaaacggtt tcaagaaaac 1140
tgtgatgtga atgcaatttg tgtgcatgcg aacagagagg atggcggtgc gtattgtcag 1200
tgcaaggaag gatattgggg tgatggtaaa tcgtgcaaga ttgacttctg ccaactgcag 1260
ccctgtggtg cagggacctg caccaggacg gatgaaggat acaagtgtga ttgcccagaa 1320
actcacaagc ttattgtcgt tgaagacaaa gagacgtgca aggcaaaacc ggacttttgc 1380
gcggaagagc cttgcggacc accctctatg gttgaaaatt gcgtgaacac cgatgacagc 1440
tacgaatgtg tttgcaaaca ggggtatgaa gtgaggaacg gtcggtgcga agaaattgac 1500
ttatgcgcgg acaagccatg tgggccagat gagggtgtgc atgagtgtgt aacagagagg 1560
caaccgaaat taaggtacag atgcacgtgc aaggcaggat tcgatttgac caccttgcct 1620
gatggtgttt cccagaagtg cctgaagaac ttctgttacg aggagccctg cggcacccgg 1680
gacctagttg aaagctgtaa gtcaaaggca tatggatact cgtgtttgtg tgcggcaggt 1740
gccatggttc aagtgattaa cggaaaagaa aagtgcatca aggcggactt gtgccgcaat 1800
gatccgtgtg gtccagagac agcagtgatt caatgttact ctcatggcac cagctatagg 1860
tgtttgtgca aagcaggcta cactgaagtt tttgttaacg ggaagagttc atgtcaaaag 1920
ggcgacccct gcactctgaa catgtgtggc ggtaacgaag cggtccagga gtgcacaact 1980
gatggcacgg cgtacgggtg tacctgcaag ccaggctatt cgatagccat taagcatggt 2040
cagaagtttt gcaaccctga agaggagtgt gcttctcatt gtggctcggc agctgcagtg 2100
aaaagctgtg aaatacttga ctctggcgga taccagtgta catgcaatcc aggatacgtc 2160
atgagataca gcgactatgt aaaaggatgc gtcgagggaa atcagtgttc tctcaatcct 2220
tgtggggagc aggaagccgt gcaaaggtgc attcctgaag gtgacacgta tgattgcgag 2280
tgcaatccgg ggttcgtcaa aagagtcttg ccggatggga atttcatttg cgccgatcca 2340
gcgagctgtg tagggaatcc ctgtggtagc tcagatgcgg tcgatgcgtg cattgccggg 2400
actagcacgt atacatgcag gtgtaaggac ggatacacac ctcagtcaat tgggtcaaag 2460
ttgcagtgtt taccagaaag cactgatcag acagatttcg attccaaaca caaaccagag 2520
gacaacaaag gtcgatattc gaaaggaaca attgcattgg tggttgtggg gtgtgtagcc 2580
ttgttgggta ttatagccgg aggaatttct tacgccagaa acagaggagg tgagcgcgat 2640
gatgaagact tggcaccacc acctcgttcc acacgagaac ggaggctctc atcaatgggc 2700
gaaggttttg agaatgcctc atgggcatct tctgtaagta tgattcctag tgcacctgct 2760
ccgccacctt cgggcggtat ctggtcctaa ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc 2820
tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 2880
ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 2940
gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 3000
aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 3060
tctactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg 3120
gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt ctcgccgcca aggatctgat 3180
ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 3240
aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 3300
gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 3360
gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg 3420
cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 3480
tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 3540
catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 3600
atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 3660
cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 3720
ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc 3780
tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 3840
ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 3900
ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 3960
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 4020
tctgaattat taacgcttac aatttcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg 4080
gtatttcaca ccgcatacag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 4140
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 4200
gcttcaataa tagcacgtgc taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 4260
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 4320
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 4380
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 4440
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 4500
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 4560
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 4620
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 4680
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 4740
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 4800
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 4860
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 4920
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg 4980
ctggcctttt gctcacatgt tctt 5004
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3678
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 重组质粒pVAX-IL21-IL15
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accatgcata aatcaagccc ccaagggcca gatcgcctcc tgattagact tcgtcacctt 780
attgacattg ttgaacagct gaaaatctat gaaaatgact tggatcctga acttctatca 840
gctccacaag atgtaaaggg gcactgtgag catgcagctt ttgcctgttt tcagaaggcc 900
aaactcaagc catcaaaccc tggaaacaat aagacattca tcattgacct cgtggcccag 960
ctcaggagga ggctgcctgc caggagggga ggaaagaaac agaagcacat agctaaatgc 1020
ccttcctgtg attcgtatga gaaaaggaca cccaaagaat tcctagaaag actaaaatgg 1080
ctccttcaaa agatgattca tcagcatctc tcctagctgc agatgaactg gatagatgta 1140
agatatgacc tggagaaaat tgaaagcctt attcaatcta ttcatattga caccacttta 1200
tacactgaca gtgactttca tcccagttgc aaagttactg caatgaactg ctttctcctg 1260
gaattgcagg ttattttaca tgagtacagt aacatgactc ttaatgaaac agtaagaaac 1320
gtgctctacc ttgcagacag cactctgtct tctaacaaga atgtagcaga atctggctgc 1380
aaggaatgtg aggagctgga ggagaaaacc ttcacagagt ttttgcaaag ctttatacgc 1440
attgtccaaa tgttcatcaa cacgtcctga tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1500
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1560
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1620
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1680
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact 1740
gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg 1800
ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca 1860
ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 1920
gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 1980
aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 2040
ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 2100
ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 2160
aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 2220
accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 2280
ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 2340
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 2400
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 2460
tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 2520
tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 2580
gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 2640
tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa 2700
ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 2760
cacaccgcat acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 2820
tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 2880
ataatagcac gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 2940
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3000
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3060
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3120
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 3180
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3240
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3300
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3360
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3420
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3480
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3540
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3600
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc 3660
ttttgctcac atgttctt 3678
<210> 2
<211> 5004
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 重组质粒pVAX-MIC8
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccatgaa ggccaatcga atatggtgtt tttttgcgtg gcgtatggtt 780
gtgcgggcct catttctgaa agagatggac agcattttcg tttctgctat ccgacagaat 840
gtacagcata ctcattctgc ccttctcgcc aaactgaagg aacccccaga tccagatgat 900
gagaactctt ggctttgtcg aatatcaaaa aaatatgacg catgcggtag cagggaatat 960
tccgataagg gcctcaaagg gacgtactgt cccgaggatt tttgctgtag caagacggca 1020
tgtttttacg gttcatgtgg gagttggtgc cacgacaact gggctctgtg cagctcatct 1080
ataatctacc acgacgagta cagttacggg aaatgcaact gtaaacggtt tcaagaaaac 1140
tgtgatgtga atgcaatttg tgtgcatgcg aacagagagg atggcggtgc gtattgtcag 1200
tgcaaggaag gatattgggg tgatggtaaa tcgtgcaaga ttgacttctg ccaactgcag 1260
ccctgtggtg cagggacctg caccaggacg gatgaaggat acaagtgtga ttgcccagaa 1320
actcacaagc ttattgtcgt tgaagacaaa gagacgtgca aggcaaaacc ggacttttgc 1380
gcggaagagc cttgcggacc accctctatg gttgaaaatt gcgtgaacac cgatgacagc 1440
tacgaatgtg tttgcaaaca ggggtatgaa gtgaggaacg gtcggtgcga agaaattgac 1500
ttatgcgcgg acaagccatg tgggccagat gagggtgtgc atgagtgtgt aacagagagg 1560
caaccgaaat taaggtacag atgcacgtgc aaggcaggat tcgatttgac caccttgcct 1620
gatggtgttt cccagaagtg cctgaagaac ttctgttacg aggagccctg cggcacccgg 1680
gacctagttg aaagctgtaa gtcaaaggca tatggatact cgtgtttgtg tgcggcaggt 1740
gccatggttc aagtgattaa cggaaaagaa aagtgcatca aggcggactt gtgccgcaat 1800
gatccgtgtg gtccagagac agcagtgatt caatgttact ctcatggcac cagctatagg 1860
tgtttgtgca aagcaggcta cactgaagtt tttgttaacg ggaagagttc atgtcaaaag 1920
ggcgacccct gcactctgaa catgtgtggc ggtaacgaag cggtccagga gtgcacaact 1980
gatggcacgg cgtacgggtg tacctgcaag ccaggctatt cgatagccat taagcatggt 2040
cagaagtttt gcaaccctga agaggagtgt gcttctcatt gtggctcggc agctgcagtg 2100
aaaagctgtg aaatacttga ctctggcgga taccagtgta catgcaatcc aggatacgtc 2160
atgagataca gcgactatgt aaaaggatgc gtcgagggaa atcagtgttc tctcaatcct 2220
tgtggggagc aggaagccgt gcaaaggtgc attcctgaag gtgacacgta tgattgcgag 2280
tgcaatccgg ggttcgtcaa aagagtcttg ccggatggga atttcatttg cgccgatcca 2340
gcgagctgtg tagggaatcc ctgtggtagc tcagatgcgg tcgatgcgtg cattgccggg 2400
actagcacgt atacatgcag gtgtaaggac ggatacacac ctcagtcaat tgggtcaaag 2460
ttgcagtgtt taccagaaag cactgatcag acagatttcg attccaaaca caaaccagag 2520
gacaacaaag gtcgatattc gaaaggaaca attgcattgg tggttgtggg gtgtgtagcc 2580
ttgttgggta ttatagccgg aggaatttct tacgccagaa acagaggagg tgagcgcgat 2640
gatgaagact tggcaccacc acctcgttcc acacgagaac ggaggctctc atcaatgggc 2700
gaaggttttg agaatgcctc atgggcatct tctgtaagta tgattcctag tgcacctgct 2760
ccgccacctt cgggcggtat ctggtcctaa ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc 2820
tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 2880
ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 2940
gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 3000
aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 3060
tctactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg 3120
gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt ctcgccgcca aggatctgat 3180
ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 3240
aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 3300
gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 3360
gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg 3420
cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 3480
tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 3540
catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 3600
atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 3660
cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 3720
ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc 3780
tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 3840
ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 3900
ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 3960
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 4020
tctgaattat taacgcttac aatttcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg 4080
gtatttcaca ccgcatacag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 4140
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 4200
gcttcaataa tagcacgtgc taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 4260
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 4320
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 4380
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 4440
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 4500
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 4560
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 4620
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 4680
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 4740
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 4800
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 4860
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 4920
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ctggcctttt gctcacatgt tctt 5004
Claims (2)
1.一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在制备提升MIC8 基因免疫效果的药物中的应用；所述免疫佐剂是以pVAX1 质粒作为载体、融合白细胞介素IL21 和IL15 的重组质粒pVAX-IL21-IL15，其碱基序列如SEQ ID NO: 1 所示。
2.一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，所述免疫疫苗是以pVAX1 质粒作为载体、融合白细胞介素IL21 和IL15 的重组质粒pVAX-IL21-IL15，其碱基序列如SEQ ID NO: 1 所示。
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| Co-Administration of a Plasmid DNA Encoding IL-15 Improves Long-Term Protection of a Genetic Vaccine against Trypanosoma cruzi;Christopher S. Eickhoff et al.;《PLOSNTDS》;20110308;第5卷(第3期);第1-13页 * |
| IL-21 and IL-15 cytokine DNA augments HSV specific effector and memory CD8+ T cell response;Luiz Rodrigues et al.;《Molecular Immunology》;20090223;第46卷;第1494-1504页 * |
| Toxoplasma gondii microneme protein 8 (MIC8) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis;M. M. Liu et al.;《Parasitol Res》;20110223(第106期);第1079–1084页 * |
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