KR102221150B1 - 이중 항원 발현벡터 및 이를 포함한 유전자 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이중 항원 발현벡터, 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 세포, 이중 항원 발현벡터의 제조방법 및 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신용 조성물에 관한 것이다.

Description

이중 항원 발현벡터 및 이를 포함한 유전자 백신{EXPRESSION VETOR FOR DUAL ANTIGEN AND GENETIC VACCINE COMPRISING THE SAME}

본 발명은 이중 항원 발현벡터, 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 세포, 이중 항원 발현벡터의 제조방법 및 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신용 조성물에 관한 것이다.

전통적인 형태의 백신은 불활성화된 바이러스나 약독화된 균주, 재조합 단백질, 바이러스 단편(particle)과 같은 면역원을 체내에 주입함으로써 항체에 의존적인 기작을 활성화 또는 유도하여 바이러스나 병원균에 대한 방어력을 향상시키는 것이다. 그러나 기존의 백신의 경우에는 체액성 면역 반응에 대해 충분한 효과를 발휘하지 못해 일부 바이러스나 기생충, 병원체에 대한 방어력을 갖기에는 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 체액성 면역 뿐만 아니라 세포성 면역을 생성하기 위한 새로운 백신이 개발되고 이 중 유전자 백신의 경우 이 두 가지 면역반응을 모두 유도할 수 있다는 점에서 매우 각광 받고 있다. 또한 백신 설계, 제조 및 정제가 단백질 재조합 백신에 비해 비교적 단순하고 보관이 용이하기 때문에 비용적인 측면에서도 많이 장점을 가지고 있다.

유전자 백신이란 병원균의 감염에 의해 유발되는 질병을 예방하기 위해 항원을 코딩하는 유전자를 포함한 정제된 플라스미드 벡터를 생체내에 주입하고 숙주 시스템의 핵에 항원유전자의 전사, 번역 과정을 통하여 단백질/펩타이드로 발현된 항원이 세포내외로 분비되어 면역 반응을 유도시키는 형태의 백신을 말한다. 유전자 백신에 사용되는 플라스미드 벡터는 동물세포 내에서 항원단백질을 강력하게 발현할 수 있는 프로모터 서열을 가지고 있으며, 박테리아에서 대량으로 플라스미드 벡터를 증폭시키기 위해서 동물세포와 박테리아에서 모두 적용 가능한 셔틀벡터를 사용하게 된다. 박테리아에서 대량 증폭된 플라스미드 벡터는 분리 정제를 거친 다음 생체의 근육세포에 투여하며, 근육세포 내로 도입된 유전자 백신은 세포의 핵 내에서 전사된 다음 세포질에서 번역되어 목적하는 항원 단백질을 발현시키게 된다.

유전자 백신은 기존의 백신에 비해 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, 유전자 백신은 전염성이 없거나 복제가 불가능하기 때문에 살아있는 형태의 백신이나 비활성화된 바이러스 백신보다 안전하다. 둘째, 유전자 백신은 여러 개의 항원에 대해 체액성 면역과 세포성 면역을 유도할 수 있으나 전달 벡터에 대한 면역은 유도하지 않는다. 셋째, 유전자 백신은 비교적 저렴한 비용으로 높은 순도로 쉽게 제조할 수 있으며 기존의 다른 백신과 비교하여 보관 및 운송이 용이하다.

이러한 장점에도 불구하고 아직은 충분한 양의 표적항원 단백질을 체내에서 발현시키기에 부족함이 있어 충분한 방어능을 갖기 위한 면역원성을 나타내는데 한계가 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 기존의 유전자 백신의 한계를 보완할 수 있는 유전자 백신용 항원 발현벡터를 개발한 후, 이를 2가지 질병을 한번에 예방하기 위한 유전자 백신용 이중 항원 발현벡터로 개발하고, 유전자 백신의 형태로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2019-0098168호(2019.08.21. 공개)

본 발명의 목적은 2개의 다른 표적 항원을 동시에 발현할 수 있는 이중 항원 발현벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 이중 항원 발현벡터의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 항원 발현벡터를 포함하는 유전자 백신용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 CMV 프로모터, 표적 항원, BGH poly(A) tail, 연속적인 2개의 SV40 인핸서의 순서로 배열된 단편을 포함하고, 상기 발현벡터는 상기 단편을 2개 포함하며, 상기 2개의 단편에 포함된 표적 항원은 상이한, 이중 항원 발현벡터를 제공한다.

또한, 상기 단편은 Kozak 서열을 더 포함하고, 상기 Kozak 서열은 CMV 프로모터와 표적 항원 사이에 위치한 것일 수 있다.

또한, 상기 단편은 IgM signal 펩타이드 서열을 더 포함하고, 상기 IgM signal 펩타이드 서열은 Kozak 서열과 표적 항원 사이에 위치한 것일 수 있다.

또한, 상기 이중 항원 발현벡터는, 카나마이신 항생제 마커를 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 이중 항원 발현벡터는, 유전자 백신용 이중 항원 유전자를 전달하는 것일 수 있다.

또한, 상기 2개의 단편에 포함된 표적 항원은, 각각 다른 병원체 항원분자인 것일 수 있다.

또한, 상기 각각 다른 병원체 항원분자는, 탄저균의 일부과 보툴리눔 독소의 일부인 것일 수 있다.

또한, 상기 탄저균의 일부는 탄저균 보호항원 D4 도메인이고, 보툴리눔 독소의 일부는 보툴리눔 독소 A형 HCR 도메인인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공한다.

또한, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계 및 배양액으로부터 이중 항원 발현벡터를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 이중 항원 발현벡터의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 이중 항원 발현벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 유전자 백신용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 이중 항원 발현벡터 및 이를 포함한 유전자 백신은 서로 다른 2개의 표적항원을 포함하여 이들을 동시에 발현할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 이중 항원 발현벡터 및 이를 포함한 유전자 백신은 서로 다른 2개의 표적항원을 생체 내로 효과적으로 전달할 뿐만 아니라 그 발현량을 현저히 상승시키고, 중화항체 생성을 유도함으로써 2가지의 대상 병원균에 대한 방어효과를 동시에 나타낼 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 탄저균 보호항원 및 보툴리눔 독소 A형 항원을 삽입한 이중 항원 발현벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 동물세포에서 발현된 PA-D4 항원 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 동물세포에서 발현된 BoNT/A HCR 항원 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신을 마우스에 접종한 후, PA-D4 및 BoNT/A HCR 항원에 대한 항체 형성 및 그 정도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신을 마우스에 접종한 후, PA-D4 및 BoNT/A HCR 항원에 대해 특이한(specific) 항체 생성량을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신을 마우스에 접종한 후, 마우스 생체 내에서 발생한 탄저균과 보툴리눔 A 독소에 대한 방어효과를 나타낸 것이다.

하기의 설명에서는 본 발명의 실시예를 이해하는데 필요한 부분만이 설명되며, 그 이외 부분의 설명은 본 발명의 요지를 흩트리지 않는 범위에서 생략될 것이라는 것을 유의하여야 한다.

이하에서 설명되는 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념으로 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

발현벡터

본 발명의 발현벡터는, 유전자 백신으로 사용하기 위해 특정 항원 유전자를 전달하기 위한 플라스미드 벡터이며, 유전자 백신용 항원 서열을 생체 내에 효과적으로 전달하고, 효과적인 발현 및 중화항체 형성을 유도할 수 있다. 또한, 해당 병원체에 대한 감염을 예방하고 치료하기 위한 다양한 서열의 유전자 백신 조성물의 유효 성분으로 활용할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는, CMV 프로모터, 표적 항원, BGH poly(A) tail, 연속적인 2개의 SV40 인핸서의 순서로 배열된 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편의 배열 순서는 표적항원을 생체 내에 효과적으로 전달하고, 표적항원의 발현량을 현저히 상승시키며, 중화항체 생성을 유도하여 대상 병원균에 대한 방어효과를 상승시키는 핵심적 요소이다.

상기 단편은 Kozak 서열을 더 포함하고, 상기 Kozak 서열은 CMV 프로모터와 표적 항원 사이에 위치한 것일 수 있다. 또한 상기 단편은 IgM signal 펩타이드 서열을 더 추가로 포함하고, 상기 IgM signal 펩타이드 서열은 Kozak 서열과 표적 항원 사이에 위치하는 것일 수 있다. 또한, 상기 항원 발현벡터는 카나마이신 항생제 마커를 더 포함할 수 있다.

도 1에서 도시한 바와 같이, 상기 단편의 서열은 바람직하게는 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, Kozak 서열, IgM signal 펩타이드 서열, 표적 항원, BGH(Bovine Growth Hormone) poly(A) tail, 연속적인 2개의 SV40 인핸서의 순서로 배열될 수 있고, 상기 항원 발현벡터는 카나마이신 항생제 마커를 포함할 수 있다.

이중 항원 발현벡터

본 발명은, 상기 단편을 2개 포함하는 발현벡터로서, 상기 2개의 단편에 포함된 표적 항원은 서로 상이한, 이중 항원 발현벡터에 관한 것이다.

상기 이중 항원 발현벡터는 유전자 백신용 이중 항원 유전자를 전달하는 것일 수 있다. 상기 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신은 접종 후 체내에서 2개의 항원을 동시에 발현할 수 있다.

표적항원

본 발명의 표적 항원은 상기 2개의 단편에 각각 포함되어 있고, 서로 다른 병원체 항원분자일 수 있다. 또한, 상기 항원 발현벡터는 표적항원(들)이 발현벡터 내에 삽입되었는지 효과적으로 선별하기 위해 카나마이신 항생제 마커를 포함할 수 있다.

또한, 상기 각각 다른 병원체 항원분자는 탄저균의 일부과 보툴리눔 독소의 일부일 수 있다.

<탄저균>

탄저병은 인수공통전염병으로 그람 양성 박테리아인 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)에 의해 발병되는 질병이다. 탄저병은 자연상태에서 사람에 감염될 확률은 매우 적으나, 2001년 미국의 911 사태에서 바이오테러의 생물학 무기로 사용되어 높은 치사율을 보여준 이래로 이에 대한 예방 및 치료 방법에 대해 활발한 연구가 진행되고 있다. 특히 호흡기를 통해 감염되는 폐탄저의 경우 치사율이 매우 높아 적절한 치료가 이루어지지 않으면 거의 100% 인 것으로 알려져 있다. 탄저 독소는 3가지의 단백질로 구성되어 있다. 치사인자(Lethal factor, LF)는 프로테아제의 역할을 하는 단백질로, 세포의 신호전달 과정을 교란시켜 결국 세포를 사멸시킨다. 또 다른 단백질인 부종인자(Edema factor, EF)는 세포의 시클릭 에엠피 (cyclic AMP)를 증가시켜 부종을 형성시킨다. 마지막으로 보호항원(Protective antigen, PA)은 치사인자(LF) 또는 부종인자(EF)와 결합하여 이들 독소를 세포 안으로 이동시켜 치사인자 또는 부종인자에 의한 독성이 발생하게 해주는 역할을 한다. 현재 탄저균에 대한 예방법으로 사용되는 백신은 방어항원(PA)를 항원으로 사용하는 단백질 백신으로, 그 제조방법은 바실러스 안트라시스를 배양하여 얻은 배양액을 여과하여 제조된다.

그러나, 이와 같이 제조된 백신은 불순물을 포함하게 되어 많은 부작용을 유발하며, 생산되는 배양액이 균일하지 못한 단점을 가지고 있다. 또한, 충분한 면역력을 유도하기 위해서는 상기 백신을 18개월 동안 6번의 접종을 받은 후에 매년 또 다시 접종을 받아야만 하는 매우 복잡한 접종 일정을 필요로 한다. 따라서 탄저균을 표적항원으로 하는 유전자 백신이 요구된다.

본 발명의 탄저균 항원은 탄저균 보호항원(PA)의 D4 도메인을 사용하는 것이 바람직하다.

<보툴리눔 독소>

보툴리눔 독소는 그람 양성균인 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 만들어지는 신경독소로서, 현존하는 독소 중 가장 독성이 높아 나노 그램 수준에서도 인체에 치명적인 영향을 미친다. 보튤리눔 독소는 8개의 혈청 타입(type)으로 분류되고, 특히 이중 타입 A에 의한 중독증이 가장 많이 발병하고 있다. 보툴리눔 독소는 150 kDa의 폴리펩티드(polypeptide)로 50kDa의 경쇄(light chain)와 100 kDa의 중쇄(heavy chain)로 구분된다. 경쇄는 효소의 기능을 보유하고 중쇄 N-말단은 경쇄 세포내 이동을 도와주는 역할하며, 중쇄의 C-말단은 세포 수용체 결합 부위로 알려져 있다. 경쇄의 역할은 혈청 타입 별로 다른데, 다양한 SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor) 단백질을 선택적으로 절단시킨다.

보툴리눔 독소는 신경전달 물질을 운반하는 SNARE 단백질을 분해시켜 결국에는 신경마비를 일으키게 된다. 이러한 위험성 때문에 바이오테러나 생물학 무기로 사용될 수 있는 가능성이 매우 높은 것으로 보고되고 있어, 이를 방어하기 위한 백신의 개발은 요구된다.

본 발명의 보툴리눔 독소 항원은 보툴리눔 독소 A형 HCR 도메인인 것이 바람직하다.

형질전환 세포

본 발명은, 상기 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공한다.

또한, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포인 것일 수 있다.

상기 이중 항원 발현벡터로 형질 전환된 형질전환 세포를 제공하는 방법은 본 발명의 기술 분야에서 알려진 통상의 방법에 따라 실시할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.

이중 항원 발현벡터의 제조방법

본 발명은, 상기 형질 전환 세포를 이용하여 이중 항원 발현벡터를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 전달 효율 및 면역반응 효율을 위하여 고농도 및 고순도로 대량생산이 가능할 수 있다. 예를 들어, 상기 형질 전환 세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 이중 항원 발현벡터를 분리 및 정제하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 발현벡터의 제조방법은 본 발명의 기술 분야에서 알려진 통상의 형질전환 공정, 배양 공정, 분리, 정제 공정 등을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.

유전자 백신용 조성물

본 발명은, 상기 이중 항원 발현벡터를 포함하는 유전자 백신용 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명에 의한 유전자 백신용 조성물은, 본 발명에 의한 이중 항원 발현벡터를 이용하여 유전자 백신용 항원 서열을 체내로 전달함으로써 효과적인 발현 및 중화항체 형성을 유도하여 해당 병원체에 대하 방어능력을 개선시킬 수 있다.

상기 조성물은, 이중 항원 발현벡터 및 담체를 포함하고, 상기 이중 항원 발현벡터는 유효 성분으로 포함될 수 있다.

상기 조성물은, 설하 투여, 비강 투여 또는 근육 내 투여에 적합한 제형이여, 바람직하게는 액상, 예를 들어, 주사제 백신일 수 있다. 상기 액상 성분은 물 등의 용매를 포함할 수 있다. 상기 담체는, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제이며, 이는 본 발명의 기술 분야에서 백신 조성물에 첨가 가능한 것이라면 제한 없이 적용될 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 탄저균 보호항원(PA)의 D4 도메인을 PA-D4로 표기하고, 보툴리눔 독소 A형 HCR 도메인을 BoNT/A HCR으로 표기한다.

실시예 1: PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터의 제조

(1) PA-D4 항원을 포함하는 벡터의 제조

SV40 인핸서를 삽입하기 전, pVAX1 original 벡터에 DNA 유전자 서열을 삽입하기 위한 플라스미드 벡터로써 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, Kozak 서열, IgM signal 펩타이드 서열, PA-D4 항원, BGH(Bovine Growth Hormone) poly(A) tail 서열을 순차적으로 포함하는 벡터를 제작하였다. PA-D4 항원의 염기서열은 서열번호 1로 나타내었다.

먼저, Kozak 서열, IgM signal 펩타이드 서열 및 PA-D4 항원을 포함하는 gene sequence를 합성하고, Hind III enzyme과 EcoR I enzyme을 처리한 후, PA-D4 insert sequence를 pVAX1 벡터에 삽입하였다 (pAB).

그 다음, SV40 인핸서 2개를 pAB 벡터에 삽입하기 위하여, SV40 인핸서 2개를 포함하는 sequence를 PCR 수행하였다. 그 후 infusion cloning 방법을 통해 XCM I restriction enzyme을 이용하여 SV40 인핸서 2개를 삽입하였다 (pAB05/PA-D4).

(2) BoNT-A HCR 항원을 포함하는 벡터의 제조

항원으로 BoNT-A HCR 항원을 사용한 것을 제외하고는 상기와 같은 방법으로 제조하였다 (pAB05/BoNT/A HCR). BoNT-A HCR 항원의 염기서열은 서열번호 2로 나타내었다.

(3) PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 벡터의 제조

PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 벡터의 제조를 위해, pAB/BoNT/A HCR로부터, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, Kozak 서열, IgM signal 펩타이드 서열, BoNT/A HCR 항원, BGH(Bovine Growth Hormone) poly(A) tail, 및 SV40 인핸서 2개를 포함하는 서열을 아래의 primer를 이용하여 PCR 하였다.

- Primer 1 (Forward): AAATGCTTCAATAATAGCACGTGGACATTGATTATTGACTAGT

- Primer 2 (Reverse): TAAAAATGAAGTTTTAGCACGTGTTGATCCCCTGCG

PCR된 product를 pAB/PA-D4에 PmlI restriction enzyme을 이용하여 in fusion cloning 방법을 통해 삽입하여 이중 항원 발현벡터를 제조하였다 (pAB05/PA-D4-BoNT/A HCR). pAB05/PA-D4-BoNT/A HCR의 이중 항원 발현벡터의 염기서열는 서열번호 3으로 나타내었다.

실시예 2: PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 동물세포 및 이중 항원의 발현

(1) In vitro expression

상기 실시예 1에서 제조된 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터 in vitro 상 단백질 발현을 확인하기 위해, Thermo Fisher社의 Expi293 suspension cell line을 이용하였다. Cell 배양은 8% CO₂, 37 ℃ 인큐베이터에서 125 rpm의 교반속도로 shaking 하여 3일 주기로 subculture 하였다. Transfection reagent로는 Invitrogen社 의 ExpiFectamine 293 transfection Kit를 사용하였다.

Transfection 하루 전, 8% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 Expi293 cell을 centrifuge(1000 rpm, 3min) 하여 cell-down 후 resuspension하여 counting한다. Counting 된 cell을 3*10^5 cell/mL density가 되게 희석한 후 125ml Erlenmeyer flask에 seeding 한다.

Seed 후 다음 날, ExpiFectamine Kit에 고시된 protocol대로 transfection 한다. 상기 제조된 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 벡터 30ug을 Opti-MEM Reduced Serum Medium에 넣어 최종 volume 1.5mL로 희석한다. 동시에, ExpiFectamine 293 reagent 81uL를 동일 미디어에 동일 volume으로 희석한다. 각각 5분간 상온에서 반응시킨 후 DNA와 ExpiFectamine 293 reagent를 섞은 후 다시 20분간 상온에서 반응시킨다. 최종 반응물을 seed 된 flask에 천천히 섞어준다.

20시간 후 ExpiFectamine Transfection Enhancer 1과 Enhancer 2를 각각 150uL, 1.5mL 섞은 후 Transfection 시킨 플라스크에 넣어준다.

Seed 후 7일차 되는 날 cell을 회수하여 Centrifuge(12,000 rpm, 3min)하여 supernatant를 취하여 sup으로 명명하고, 그 cell은 RIPA buffer (w/protease inhibitor)로 냉장에서 20분간 lysis한 후 centrifuge(12,000 rpm, 20min)하여 그 supernatant를 취하여 lysate로 명명하여 냉동(-20 ℃) 보관한다.

(2) Western blot

수집된 lysate와 supernatant 샘플을 상온에서 녹인 후, 5X SDS-PAGE loading dye와 섞어 100 ℃에서 10분간 끓여 준비하였다. 준비된 샘플을 SDS-PAGE에 로딩한 후, 80V에서 30분, 120V에서 120분간 electrophoresis 하였다. 그 후, PVDF membrane에 300mA로 2시간 동안 냉장상태로 transfer하여 실험 진행하였다.

Transfer 종료 후, membrane을 shaker plate위에 올려 5% skim milk in TBST를 넣어 4시간 이상 blocking 하였다. Blocking buffer는 제거한 후, 1st Antibody를 5% skim milk in TBST에 희석하여 냉장상태로 o/n 반응시킨 후 2nd Antibody를 같은 buffer에 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체반응 후, Bio-rad社의 Clarify Western ECL substrate kit를 이용하여 단백질 발현량을 측정하였다.

(3) 분석결과

도 2는 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 동물세포에서 발현된 PA-D4 항원 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이고, 도 3은 PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 동물세포에서 발현된 BoNT/A HCR 항원 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 것이다. PA-D4와 BoNT/A HCR에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 발현된 항원이 PA-D4와 BoNT/A HCR이 맞는지 확인하였다.

도 2와 도 3에서 1번 레인은 형질전환되지 않은 Expi293T 세포의 7일 후, 2번 레인은 이중 항원이 없는 발현벡터를 형질전환한 Expi293T 세포의 7일 후, 그리고 3번 레인은 PA-D4/BoNT-A HCR 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 Expi293T 세포의 7일 후 결과를 나타낸다.

도 2의 3번 레인에서 PA-D4 항원 단백질이 발현된 것을 확인할 수 있고, 도 3의 3번 레인에서 BoNT-A HCR 항원 단백질이 발현된 것을 확인할 수 있다. Lysate는 세포를 파쇄한 것이고 Sup는 세포 배양액을 확인한 것이므로, 세포 내에서 생성된 PA-D4 항원과 BoNT-A HCR 항원이 세포 외부로 잘 분비된 것을 확인할 수 있다.

실시예 3: PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신의 접종

실시예 1에서 제조된 이중 항원 발현벡터가 생체에서도 작용하여 PA-D4 및 BoNT/A HCR 의 항원 단백질을 동시에 발현하고, 해당 항원 단백질에 대한 항체가 생성되는지를 확인하기 위하여, PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신(이하 '이중 유전자 백신'이라 함)을 A/J 마우스에 접종하였다.

상기 이중 항원 발현벡터를 PBS에 용해시켜 이중 유전자 백신(이중 항원 발현벡터 50 ㎍/PBS 100 ㎕)을 제조하였다. A/J 마우스 (6-8 주령)를 마취시킨 후, 상기와 같이 제조된 이중 유전자 백신을 피내주사(ID, intradermal) 방법으로 접종하였다. 그 후, 전기천공 기기(BTX ECM-830 electroporator (Hollison, 미국))를 이용하여 90V, 20ms length, 3 pulse, 100 ms interval 조건으로 자극을 주었다.

상기 이중 유전자 백신은 3주 동안 총 3번 접종하였고, 3번째 접종 후 1주일 지난 뒤에 마취 후 안와정맥에서 채혈하였다. 혈액은 centrifuge 한 후 혈장만 채취하여 -20 ℃에 보관하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터를 포함한 유전자 백신을 접종한 마우스에서 PA-D4 및 BoNT/A HCR 항원에 대한 항체 형성을 확인한 결과, 3회에 걸친 접종 후에는 접종 전과 비교하여 면역력이 크게 증가되었음을 확인할 수 있다.

실시예 4: ELISA에 의한 특이 항체 검출

PA-D4-BoNT/A HCR 이중 유전자 백신을 접종한 마우스에서 PA-D4 또는 BoNT/A HCR 항원에 대한 특이 항체가 발현되었는지를 확인하여 위하여, 상기 마우스에서 채혈한 serum에 대해 ELISA 분석하였다.

ELISA 분석을 위하여, coating buffer (Carbonate-bicarbonate 1 capsule in 100ml 1X PBS), blocking buffer (1% Casein in 1X PBS), Wash buffer (0.5% tween-20 in 1X PBS), serum dilution buffer (50g Sucrose, 50ml inactivated FBS, 40ml 5% casein, 750ul Triton X-100, 1.25ml 10% SDS, 250ul Proclin300 in 500 mL SDW)를 준비하였다. 분석 하루 전, ELISA plate에 우선 재조합된 PA-D4 또는 BoNT/A HCR 단백질을 1 ug/mL로 coating buffer에 희석하여 100 uL/well로 분주한 후, 16시간 이상 상온에서 호일로 감싸 반응하였다. Coating buffer를 제거한 후, blocking buffer 300ul/well에 분주하여 상온에서 1시간 반응시켰다.

Blocking buffer를 제거한 후, 채혈한 serum을 준비하여 serum dilution buffer를 이용하여 희석된 serum을 100ul/well씩 분주한다. 호일로 감싸 30분간 37 ℃ 인큐베이터에서 정치, 반응시킨 후 Wash buffer를 300ul/well씩 분주하여 총 5회 wash 한다.

잔존하는 용액을 완전히 털어낸 후, 2nd anti-mouse 또는 anti-human HRP antibody를 1:2,000으로 0.2% casein in 1X PBS에 희석하여 100ul/well씩 분주한다. 호일로 감싸 30분간 37 ℃ 인큐베이터에서 정치, 반응시킨 후 Wash buffer로 300ul/well씩 분주하여 총 5회 serum을 wash한다. 완전히 용액을 제거한 후, Surmodics Inc.社의 BioFX TMB solution을 100ul/well씩 분주한 후 10분간 상온에서 반응시킨다. 1N 황산용액을 넣어 TMB 반응을 종결시킨 후 ELISA reader기를 이용하여 Absorbance 450nm/reference 620nm에서 분석하였다.

실시예 5: PA-D4-BoNT/A HCR 항체 정량화

PA-D4-BoNT/A HCR 이중 유전자 백신 접종 후 마우스에서 생성된 PA-D4 및 BoNT/A HCR 항원에 특이적으로 생성된 항체를 정량화하기 위하여 마지막 백신 투여 후 1주 후에 혈청을 채취하여 end point titration 방법으로 분석하였다.

그 결과는 도 5에서 확인할 수 있듯이, PA-D4-BoNT/A HCR 이중 유전자 백신을 접종한 마우스에서 PA-D4와 BoNT/A HCR 항원 각각에 대한 충분한 항체가 형성되었음을 알 수 있다.

실시예 6: 마우스 면역효능 확인

PA-D4-BoNT/A HCR 이중 유전자 백신의 면역효능을 평가하기 위하여 상기 이중 유전자 백신을 3주 간격으로 3회 접종한 A/J 마우스와 유전자 백신 접종을 하지 않은 A/J 마우스(대조군)에 Bacillus Anthracis Sterne 균주를 10LD₅₀에 해당하는 33,390 CFU/head를 피하투여하고, BoNT/A 독소를 20LD₅₀에 해당하는 1.5 ng/head를 복강투여한 후, 시험군별 임상증상 및 생존율을 확인하였다.

도 6에서 확인할 수 있듯이, Bacillus Anthracis Sterne 균주(ba Sterne 10 LD₅₀)의 공격에 대하여, PA-D4-BoNT/A HCR 이중 유전자 백신 접종 군은 생존율이 100% 인 반면, 대조군은 3일 이후 생존률이 0% 임을 알 수 있고, BoNT/A 독소(Bont A 20 LD₅₀)의 공격에 대하여, PA-D4-BoNT/A HCR 이중 유전자 백신 접종 군은 생존율 100% 인 반면, 대조군은 공격 직후부터 생존율 0% 임을 알 수 있다. 따라서, PA-D4-BoNT/A HCR 이중 유전자 백신은 탄저병 및 보툴리눔 독소에 대한 면역 및 방어 효능을 우수함을 확인하였다.

지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 항원 발현벡터, 형질전환 세포, 이중 항원 발현벡터의 제조방법 및 유전자 백신용 조성물에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.

그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<서열목록의 설명>

서열번호 1은 PA-D4 항원의 염기서열이다.

서열번호 2는 BoNT/A HCR 항원의 염기서열이다.

서열번호 3은 pAB05/PA-D4-BoNT/A HCR 이중 항원 발현벡터의 염기서열이다.

<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> EXPRESSION VETOR FOR DUAL ANTIGEN AND GENETIC VACCINE COMPRISING THE SAME <130> PT20200197 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 471 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 1 aagatcaagc tgaatgccaa gatgaatatc ctgatccggg acaagagatt ccactacgat 60 aggaacaaca tcgccgtggg cgccgacgag agcgtggtga aggaggccca cagagaagtg 120 attaactctt ctaccgaggg actgctgctg aacattgaca aggacatccg gaagatcctg 180 agcggctata tcgtggagat cgaggatacc gagggcctga aagaagtgat caatgacaga 240 tacgacatgc tgaacatcag cagcctgcgg caggatggca agacctttat cgacttcaaa 300 aaatacaatg ataagctgcc actgtacatc agcaacccca actataaggt gaacgtgtac 360 gccgtgacaa aggagaatac catcatcaat ccttccgaga acggcgatac cagcaccaat 420 ggcattaaga agattctgat tttcagcaaa aagggatacg aaatcggctg a 471 <210> 2 <211> 1266 <212> DNA <213> Clostridium botulinum <400> 2 acatccatcc tgaacctgag atacgagagc aaccacctga tcgacctgag cagatacgcc 60 agcaagatca acatcggcag caaagtgaac ttcgacccca tcgacaagaa ccagatccag 120 ctgttcaacc tggaaagctc caagatcgaa gtgatcctga agaacgccat cgtgtacaac 180 tctatgtacg agaacttcag caccagcttt tggatcagaa tccccaagta cttcaacagc 240 atcagcctga acaacgagta caccatcatc aactgcatgg aaaacaacag cggctggaag 300 gtgtccctga actacggcga gatcatctgg acactgcagg acacccaaga gatcaagcag 360 agagtggtgt tcaagtactc tcagatgatc aatatcagcg actacatcaa ccggtggatc 420 ttcgtgacca tcaccaacaa ccggctgaac aattccaaga tctacatcaa tggccggctc 480 atcgaccaga agcctatcag caacctgggc aacatccacg cctccaacaa catcatgttc 540 aagctggacg gctgccggga cacccaccgg tatatctgga tcaagtactt taacctgttc 600 gacaaagagc tgaacgagaa agagattaag gacctgtacg acgcccagag caacagcgga 660 atcctgaagg acttctgggg cgactacctg cagtacgaca agccctacta catgctgaat 720 ctgtacgacc cgaacaaata cgtggacgtg aacaacgtgg gcatccgcgg ctacatgtac 780 ctgaagggcc ctagaggcag cgtgatgacc accaacatct atctgcagag cagcctgtac 840 cggggcacca agttcatcat caagaagtac gccagcggca acaaggacaa catcgtgcgg 900 aacaacgacc gggtgtacat caacgtggtg gtcaagaaca aagagtaccg gctggccaca 960 caggcctctc aggctggcgt ggaaaagatc ctgagcgccc tggaaatccc cgacgtgggc 1020 aatctgtctc aggtggtcgt gatgaagtcc aagaacgacc agggcatcac aaacaagtgc 1080 aagatgaacc tccaggacaa caacggcaac gacatcggct ttatcggctt ccaccagttc 1140 aacaatatcg ccaagctggt ggccagcaac tggtacaatg cccagatcga gcggagcagc 1200 agaaccctgg gatgcagctg ggagttcatc cccgtggatg atggctgggg cgaaagacct 1260 ctgtga 1266 <210> 3 <211> 3724 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of expression vector comprising dual antigen PA-D4-BoNT/A HCR <400> 3 gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240 gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600 ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660 aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttgcc 720 accatgaaat tcagctgggt catgttcttc ctgatggcag tggttacagg ggtcaattca 780 gagaagatca agctgaatgc caagatgaat atcctgatcc gggacaagag attccactac 840 gataggaaca acatcgccgt gggcgccgac gagagcgtgg tgaaggaggc ccacagagaa 900 gtgattaact cttctaccga gggactgctg ctgaacattg acaaggacat ccggaagatc 960 ctgagcggct atatcgtgga gatcgaggat accgagggcc tgaaagaagt gatcaatgac 1020 agatacgaca tgctgaacat cagcagcctg cggcaggatg gcaagacctt tatcgacttc 1080 aaaaaataca atgataagct gccactgtac atcagcaacc ccaactataa ggtgaacgtg 1140 tacgccgtga caaaggagaa taccatcatc aatccttccg agaacggcga taccagcacc 1200 aatggcatta agaagattct gattttcagc aaaaagggat acgaaatcgg ctgagaattc 1260 tgcagatatc cagcacagtg gcggccgctc gagtctagag ggcccgttta aacccgctga 1320 tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 1380 tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 1440 tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 1500 ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct 1560 actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta 1620 aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggt 1680 tgctcacatg ttcttgctgc ttcgcgaatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct 1740 ggggactttc cacaccctaa ctgacacaca ttccacagct ggttacgcgt atgctttgca 1800 tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taactgacac acattccaca 1860 gctggttcgc gttgacattg attattgacc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagctc 1920 tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 1980 ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 2040 ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 2100 gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct 2160 ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 2220 ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 2280 cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 2340 ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 2400 cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 2460 gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 2520 tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 2580 ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 2640 agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 2700 ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaatta ttaacgctta 2760 caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatcag 2820 gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 2880 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tagcacgtgc 2940 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 3000 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 3060 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 3120 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 3180 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 3240 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 3300 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 3360 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 3420 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 3480 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 3540 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 3600 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 3660 acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 3720 tctt 3724

Claims (12)

1. 발현벡터에 있어서,
   상기 발현벡터는 CMV 프로모터, IgM signal 펩타이드 서열, 표적 항원, BGH poly(A) tail, 연속적인 2개의 SV40 인핸서의 순서로 배열된 단편을 포함하고,
   상기 발현벡터는 상기 단편을 2개 포함하고,
   상기 2개의 단편에 포함된 표적 항원은 상이하고,
   상이한 표적 항원은 각각 탄저균의 일부와 보툴리눔 독소의 일부이며,
   유전자 백신용 이중 항원 유전자를 전달하는 것을 특징으로 하는,
   이중 항원 발현벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 단편은 Kozak 서열을 더 포함하고,
   상기 Kozak 서열은 CMV 프로모터와 IgM signal 펩타이드 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는,
   이중 항원 발현벡터.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 이중 항원 발현벡터는,
   카나마이신 항생제 마커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
   이중 항원 발현벡터.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   상기 탄저균의 일부는 탄저균 보호항원 D4 도메인이고,
   보툴리눔 독소의 일부는 보툴리눔 독소 A형 HCR 도메인인 것을 특징으로 하는,
   이중 항원 발현벡터.
   
9. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제8항 중 어느 한 항의 이중 항원 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는,
   생체 외(in vitro) 형질전환 세포.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포인 것을 특징으로 하는,
    생체 외(in vitro) 형질전환 세포.
    
11. 제9항의 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및
    배양액으로부터 이중 항원 발현벡터를 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    이중 항원 발현벡터의 제조방법.
    
12. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제8항 중 어느 한 항의 이중 항원 발현벡터; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체;를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    유전자 백신용 조성물.
    

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