CN110964748B - 含线粒体靶向序列的载体及其构建方法和应用 - Google Patents
含线粒体靶向序列的载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及含线粒体靶向序列的载体及其构建方法和应用。具体地,本发明基于pAAV‑MCS腺相关病毒载体,将氨苄青霉素抗性换成卡那霉素抗性,增加多克隆酶切位点(MCS),并在MCS前增加特定的线粒体靶向序列,得到本发明的腺相关病毒载体。本发明的腺相关病毒载体可用作适用于治疗多种线粒体疾病的通用工具,有效的治疗线粒体疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及含线粒体靶向序列的载体及其构建方法和应用。
背景技术
线粒体是细胞内储存和供给能量的场所,直接影响到细胞生存和增殖。人类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)被称为“第25号染色体”,16569bp的闭合双链环状分子包含13个氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)酶亚单位基因,2个与基因翻译有关的rRNA基因(12SrRNA和16SrRNA)及22个tRNA基因。mtDNA无组蛋白保护,线粒体缺乏有效的DNA修复系统。线粒体基因组突变率较染色体DNA高10-20倍。线粒体氧化磷酸化障碍可能是最常见的代谢病。
线粒体的DNA突变最终结果引起线粒体基因编码的线粒体蛋白缺陷。已发现与人类疾病相关联的50多种mtDNA点突变和100多种mtDNA重排。线粒体病的临床表现极为广泛,几乎涉及到所有的组织和器官,属于一类分散的临床征候群。而中枢神经系统、心脏、骨骼肌、内分泌腺等能量消耗较多的组织更易发生病变。由线粒体病引发的常见病征包括肌无力、神经退化、视网膜病、糖尿病、神经性耳聋等。一般来说,由mtDNA异常所致线粒体病始发于童年,病情渐进式发展为瘫痪或无自理能力,最后由于重要器官病变导致死亡。
由于线粒体是相对独立的细胞器,mtDNA是多拷贝的核外基因,加上线粒体基因突变的复杂性,线粒体病的治疗研究举步维艰。目前线粒体病仍是不治之症,所能做的只是对症治疗。如KSS患者安装起博器以修补心脏的功能;神经性耳聋可以通过植入人工耳蜗减轻;糖尿病,不论是胰岛素依赖与否,都可以通过饮食或药物疗法控制。然而,要根治线粒体病只能寄希望于基因治疗。
因此,本领域迫切需要开发一种适用于治疗多种线粒体疾病的高效的通用工具,从而有效的治疗线粒体疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于治疗多种线粒体疾病的高效的通用工具,从而有效的治疗线粒体疾病。
本发明的第一方面,提供了一种腺相关病毒载体,所述腺相关病毒载体包含第一表达盒和第二表达盒,
其中,所述第一表达盒从5’-3’端具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
Z1为无或第一启动子;
Z2为线粒体靶向肽的编码序列;
Z3为多克隆位点,所述多克隆位点具有如SEQ ID NO.:1所示的序列;
Z4为无或polyA;
以及,所述的第二表达盒为筛选标记表达盒,所述筛选标记表达盒含有卡那霉素抗性基因。
在另一优选例中,所述第一启动子为哺乳动物启动子,较佳地为CMV启动子。
在另一优选例中,所述线粒体靶向肽的编码序列包括:COX8的编码序列、COX10的编码序列、OPA1的编码序列、或其组合。
在另一优选例中,所述线粒体靶向肽的编码序列为优化或未优化的COX10的编码序列,更佳地优化的COX10的编码序列。
在另一优选例中,所述COX8的编码序列具有如SEQ ID NO.:2所示的序列。
在另一优选例中,所述优化的COX10的编码序列具有如SEQ ID NO.:3所示的序列。
在另一优选例中,所述未优化的COX10编码序列具有如SEQ ID NO.:4所示的序列。
在另一优选例中,所述OPA1的编码序列具有如SEQ ID NO.:5所示的序列。
在另一优选例中,各个核苷酸连接序列的长度为0-21nt,较佳地3-12nt。
在另一优选例中,所述第二表达盒从5’-3’端具有式II结构:
X1-X2-X3 (II)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
X1为无或第二启动子;
X2为卡那霉素抗性基因;
X3为终止子。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体还包含选自下组的元件:内含子(优选为人类β-球蛋白内含子)、ITR序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、同源重组位点、或其组合。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体衍生自pAAV-MCS载体。
在另一优选例中,所述pAAV-MCS载体的序列如SEQ ID NO.:7所示。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体为基于pAAV-MCS载体进行改造得到的载体。
在另一优选例中,所述改造包括将多克隆位点(pAAV-MCS载体的第1319-1394位)替换为所述第一表达盒,且将氨苄青霉素抗性基因(pAAV-MCS载体的第2970-3827位)替换为卡那霉素抗性基因。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体包含:
(a)pAAV-MCS载体的核酸主链,
(b)替代多克隆位点的所述第一表达盒,以及
(c)替代氨苄青霉素抗性基因的卡那霉素抗性基因。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体从5’端到3’端依次含有以下元件:左ITR序列、启动子(如CMV启动子)、内含子(如人类β-球蛋白内含子)、第一表达盒、右ITR序列、第二表达盒。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:6或15所示。
其中,第1-141位为左ITR序列;
第150-812位为CMV启动子;
第820-1312位为人类β-球蛋白内含子;
第1319-1402位为线粒体靶向肽的编码序列(MTS);
第1403-1599位为多克隆位点(MCS);
第1600-2078位为PolyA;
第2118-2258位为右ITR序列;
第3176-3988位为卡那霉素(Kanamycin)抗性基因。
本发明的第二方面,提供了一种腺相关病毒载体的构建方法,所述方法包括以下步骤:
(1)提供pAAV-MCS载体;
(2)对pAAV-MCS载体进行改造,所述改造包括将多克隆位点(pAAV-MCS载体的第1319-1394位)替换为第一表达盒,且将氨苄青霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因;
其中,所述第一表达盒从5’-3’端具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
Z1为无或第一启动子;
Z2为线粒体靶向肽的编码序列;
Z3为多克隆位点,所述多克隆位点具有如SEQ ID NO.:1所示的序列;
Z4为无或polyA。
在另一优选例中,所述pAAV-MCS载体的序列如SEQ ID NO.:7所示。
本发明的第三方面,提供了如本发明第一方面所述的腺相关病毒载体在基因克隆或表达中的应用。
在另一优选例中,所述的腺相关病毒载体用于制备靶向线粒体融合蛋白的表达载体。
在另一优选例中,所述靶向线粒体融合蛋白具有如下式III结构:
Y1-Y2 (III)
式中,Y1为线粒体靶向肽,Y2为目的蛋白。
在另一优选例中,所述目的蛋白为用于治疗线粒体疾病的蛋白(如治疗眼部疾病的蛋白,如ND1、ND4、ND6)。
在另一优选例中,所述表达载体是在本发明第一方面所述的腺相关病毒载体的多克隆位点插入了外源基因片段的重组腺相关病毒载体。
在另一优选例中,所述表达载体用于治疗线粒体疾病,如恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体用于制备一制剂或组合物,所述制剂或组合物用于治疗线粒体疾病,如恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。
在另一优选例中,所述眼部疾病为视神经退化性疾病。
在另一优选例中,所述眼部疾病为视网膜神经节细胞的局灶性退化。
在另一优选例中,所述眼部疾病为遗传性视神经病变,较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。
本发明的第四方面,提供了一种重组腺相关病毒载体,所述重组腺相关病毒载体是在本发明第一方面所述的腺相关病毒载体的多克隆位点插入了外源基因片段的重组腺相关病毒载体。
在另一优选例中,所述外源基因片段为治疗线粒体疾病的蛋白的基因序列。
本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,所述的细胞含有本发明第四方面所述的重组腺相关病毒载体,或其基因组整合有本发明第四方面所述的重组腺相关病毒载体。
在另一优选例中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述宿主细胞选自下组:HEK293细胞(如HEK293T细胞、HEK293T-17细胞)、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、心肌细胞、肌肉细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述宿主细胞选自下组:视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。较佳地,所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞。
本发明的第六方面,提供了一种药物制剂,所述的制剂含有(a)本发明第四方面所述的重组腺相关病毒载体,以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中,所述药物制剂的剂型选自下组:冻干制剂、液体制剂、或其组合。较佳地,所述药物制剂的剂型为注射剂型。
在另一优选例中,所述药物制剂中载体的含量为1×109-1×1016,较佳地1×1012-1×1013个重组腺相关病毒病毒载体/毫升。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了pAAV-MCS表达载体示意图。
图2显示了本发明pAAV-MTS-MCS表达载体示意图。
图3显示了细胞总蛋白ND4Western blot检测结果。泳道A为rAAV2/2-GFP组,泳道B为rAAV2/2-ND4组,泳道C为rAAV2/2-MTS1-ND4组。
图4显示了线粒体总蛋白ND4Western blot检测结果。泳道A为rAAV2/2-GFP组,泳道B为rAAV2/2-ND4组,泳道C为rAAV2/2-MTS1-ND4组。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,首次开发了一种适用于治疗多种线粒体疾病的载体工具。基于pAAV-MCS腺相关病毒载体,将氨苄青霉素抗性换成卡那霉素抗性,增加多克隆酶切位点(MCS),并在MCS前增加特定的线粒体靶向序列(SEQ ID NO.:2-5),得到本发明的腺相关病毒载体。本发明特定的线粒体靶向序列(MTS)是经过大量筛选获得的,序列长度短(尤其是COX10,仅84bp),可以保留更多的空间以承载更长的目的片段,并且定位非常准确(尤其是优化的COX10编码序列),可以使表达的多种不同蛋白定向转运入线粒体,更有效纠正线粒体基因缺陷。本发明的腺相关病毒载体可用作适用于治疗多种线粒体疾病的通用工具,有效的治疗线粒体疾病。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开,首先定义某些术语。如本申请中所使用的,除非本文另有明确规定,否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成,其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)比较两个对齐的序列,并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地,这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
如本文所用、术语“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况、即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如、如果启动子控制序列的转录、那么它就是可操作地连于编码序列。
如本文所用,“筛选标记基因”指转基因过程中用来筛选转基因细胞或转基因动物的基因,在本发明中,所述筛选标记基因为卡那霉素的抗性基因(NPTII)。
如本文所用,术语“表达”意味着允许或导致基因或DNA序列的信息变得明白,例如通过激活对应基因或DNA序列的转录和翻译中所涉及的细胞功能来产生蛋白质。细胞表达DNA序列,从而形成“表达产物”,例如蛋白质。
如本文所用,术语“表达盒”是指含有待表达基因以及表达所需元件的序列组件的一段多聚核苷酸序列。例如,在本发明中,术语“筛选标记表达盒”指含有编码筛选标记的序列(如卡那霉素抗性基因)以及表达所需元件的序列组件的多聚核苷酸序列。表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外,表达盒(如本发明第一表达盒、筛选标记表达盒)还可以含有或不含有其他序列,包括(但并不限于):增强子、分泌信号肽序列等。
在本发明中,适用于本发明第一表达盒和第二表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子,它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地,该启动子是组成型启动子,例如CMV启动子等其它适用于真核表达的启动子。
如本文所用,术语“哺乳动物启动子”指能够在细胞中启动核酸转录的核酸序列。该哺乳动物启动子可以是来源于植物、微生物(如细菌、病毒)或动物等,或者是人工合成或改造过的启动子。
如本文所用,术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意思是可将DNA或RNA序列(例如外来基因)引入宿主细胞中,以便转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)的运载体。载体典型地包含可传播病原体的DNA,其中通过限制酶技术插入编码蛋白质的外来DNA。
如本文使用的,术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。
线粒体
线粒体是细胞内储存和供给能量的场所,直接影响到细胞生存和增殖。人类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)被称为“第25号染色体”,16569bp的闭合双链环状分子包含13个氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)酶亚单位基因,2个与基因翻译有关的rRNA基因(12SrRNA和16SrRNA)及22个tRNA基因。线粒体拥有1000多种蛋白质,其中98%以上由细胞核编码,少数蛋白质由线粒体基因直接编码。线粒体内膜呼吸链OXPHO酶复合物的63个亚基中有20%由mtDNA编码,其余80%由核基因编码,线粒体及染色体基因编码的OXPHOS酶蛋白各亚单位在线粒体内装配成功能呼吸链,完成细胞OXPHOS,将能量储存于ATP的高能磷酸键中以供生命活动所需。
线粒体的DNA突变最终结果引起线粒体基因编码的线粒体蛋白缺陷。已发现与人类疾病相关联的50多种mtDNA点突变和100多种mtDNA重排。线粒体病的临床表现极为广泛,几乎涉及到所有的组织和器官,属于一类分散的临床征候群。而中枢神经系统、心脏、骨骼肌、内分泌腺等能量消耗较多的组织更易发生病变。由线粒体病引发的常见病征包括肌无力、神经退化、视网膜病、糖尿病、神经性耳聋。
mtDNA突变的种类多且不均一,但最终结果表现在其编码的蛋白质的变异上,造成线粒体呼吸链功能障碍。如果能针对线粒体蛋白质的突变输入相应的正常蛋白,尽管线粒体基因突变形式千变万化,都可达到最终修正线粒体呼吸链功能的效果,有望从根本上纠正基因突变引起的病变。大部分线粒体蛋白质在核糖体上合成时,其N端都带有一信号肽段,或称为引导肽(mitochondrial leading peptide,MLP),或靶向序列(mitochondrialtargeting sequence,MTS),信号肽可将该蛋白导向线粒体。
因此,本发明提供一种适用于治疗多种线粒体疾病的高效的通用工具,所述通用工具为含有特定线粒体靶向序列的腺相关病毒载体。本发明腺相关病毒载体可以将需要表达的目的蛋白,在载体上的线粒体靶向序列编码的线粒体靶向肽的引导下被定向转运至线粒体。
腺相关病毒
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白,rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究,重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解,尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中,rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验);同时作为一种有特点的基因转移载体,还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
AAV是相对较小的DNA病毒,其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响,并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域,其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域:包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分;以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。
AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006,它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述,该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239;美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941,以及欧洲专利No.0488528,它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体,以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备:所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒,和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。
线粒体靶向肽的编码序列
在本发明中,本发明特定的线粒体靶向序列(MTS)是经过大量筛选获得的,序列长度短(尤其是COX10,仅84bp),可以保留更多的空间以承载更长的目的片段,并且定位非常准确,使表达的多种不同蛋白更多地转运入线粒体,更有效纠正线粒体基因缺陷。
在另一优选例中,所述线粒体靶向肽的编码序列包括:COX8的编码序列、COX10的编码序列(包括优化或未优化的COX10编码序列)、OPA1的编码序列、或其组合。
在另一优选例中,所述线粒体靶向肽的编码序列为优化或未优化的COX10的编码序列,更佳地优化的COX10的编码序列。
在另一优选例中,所述COX8的编码序列(87bp)如SEQ ID NO.:2所示。
ATGTCCGTCCTGACGCGCCTGCTGCTGCGGGGCTTGACACGGCTCGGCTCGGCGGCTCCAGTGCGGCGCGCCAGAATCCATTCGTTG(SEQ ID NO.:2)
在另一优选例中,所述未优化的COX10的编码序列(84bp)如SEQ ID NO.:4所示。
ATGGCCGCATCTCCGCACACTCTCTCCTCACGCCTCCTGACAGGTTGCGTAGGAGGCTCTGTCTGGTATCTTGAAAGAAGAACT(SEQ ID NO.:4)
在另一优选例中,所述OPA1的编码序列(266bp)如SEQ ID NO.:5所示。
GTGCTGCCCGCCTAGAAAGGGTGAAGTGGTTGTTTCCGTGACGGACTGAGTACGGGTGCCTGTCAGGCTCTTGCGGAAGTCCATGCGCCATTGGGAGGGCCTCGGCCGCGGCTCTGTGCCCTTGCTGCTGAGGGCCACTTCCTGGGTCATTCCTGGACCGGGAGCCGGGCTGGGGCTCACACGGGGGCTCCCGCGTGGCCGTCTCGGCGCCTGCGTGACCTCCCCGCCGGCGGGATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCTG(SEQ ID NO.:5)
在另一优选例中,所述优化的COX10的编码序列(84bp)如SEQ ID NO.:3所示。相比未优化的COX10的编码序列和其它的线粒体靶向肽编码序列,优化的COX10的编码序列不仅更短,而且定位更准确,更多的目标蛋白转运到线粒体中。
ATGGCCGCCTCTCCACACACACTGAGTAGCAGACTGCTGACCGGCTGTGTTGGCGGCTCTGTGTGGTATCTGGAACGGCGGACA(SEQ ID NO.:3)
本发明的腺相关病毒
在本发明中,提供了一种腺相关病毒载体,所述腺相关病毒载体包含第一表达盒和第二表达盒,
其中,所述第一表达盒从5’-3’端具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
Z1为无或第一启动子;
Z2为线粒体靶向肽的编码序列;
Z3为多克隆位点,所述多克隆位点具有如SEQ ID NO.:1所示的序列;
Z4为无或polyA;
以及,所述的第二表达盒为筛选标记表达盒,所述筛选标记表达盒含有卡那霉素抗性基因。
在另一优选例中,所述线粒体靶向肽的编码序列包括:COX8的编码序列、COX10的编码序列、OPA1的编码序列、或其组合。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体衍生自pAAV-MCS载体。
在另一优选例中,pAAV-MCS腺相关病毒表达载体(原始载体)如SEQ ID NO.:7所示,其中下划线部分为氨苄青霉素抗性基因序列,其结构示意图如图1所示。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTGCCTCGAGCAGCGCTGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTT TTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAAC TGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAG AATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTG CTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGC TTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAAC GACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTC TAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCC GGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCA GATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGA TCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT(SEQ ID NO.:7)
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体为基于pAAV-MCS载体进行改造得到的载体。
在另一优选例中,所述改造包括将多克隆位点(pAAV-MCS载体的第1319-1394位)替换为所述第一表达盒,且将氨苄青霉素抗性基因(pAAV-MCS载体的第2970-3827位)替换为卡那霉素抗性基因。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体包含:
(a)pAAV-MCS载体的核酸主链,
(b)替代多克隆位点的所述第一表达盒,以及
(c)替代氨苄青霉素抗性基因的卡那霉素抗性基因。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体为pAAV-MTS-MCS,其结构示意图如图2所示。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体从5’端到3’端依次含有以下元件:左ITR序列、启动子(CMV启动子)、内含子(如人类β-球蛋白内含子)、第一表达盒、右ITR序列、第二表达盒。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体为pAAV-MTS1-MCS腺相关病毒表达载体(改造后载体),其序列如SEQ ID NO.:6所示。其中线粒体靶向肽的编码序列为COX10(SEQ IDNO.:4),斜体部分为新增的多克隆位点序列,加粗部分为原来的多克隆位点序列。其中,第1-141位为左ITR序列;第150-812位为CMV启动子;第820-1312位为人类β-球蛋白内含子;第1319-1402位为线粒体靶向肽的编码序列(MTS);第1403-1599位为多克隆位点(MCS);第1600-2078位为PolyA;第2118-2258位为右ITR序列;第3176-3988位为卡那霉素(Kanamycin)抗性基因。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体为pAAV-MTS2-MCS腺相关病毒表达载体(改造后载体),其序列如SEQ ID NO.:15所示。pAAV-MTS2-MCS载体除将COX10(SEQ ID NO.:4)替换为优化的COX10(SEQ ID NO.:3),其它均与pAAV-MTS1-MCS(SEQ ID NO.:6)相同。载体中线粒体靶向肽的编码序列为优化的COX10(SEQ ID NO.:3),斜体部分为新增的多克隆位点序列,加粗部分为原来的多克隆位点序列。其中,第1-141位为左ITR序列;第150-812位为CMV启动子;第820-1312位为人类β-球蛋白内含子;第1319-1402位为线粒体靶向肽的编码序列(MTS);第1403-1599位为多克隆位点(MCS);第1600-2078位为PolyA;第2118-2258位为右ITR序列;第3176-3988位为卡那霉素(Kanamycin)抗性基因。
本领域技术人员可以用常规方法,如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得本发明腺相关病毒载体中的各个元件,然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起,就形成了本发明的腺相关病毒载体。
在本发明的一个实施例中,基于pAAV-MCS腺相关病毒载体,将氨苄青霉素抗性替换为卡那霉素抗性,增加多克隆酶切位点(MCS),并在MCS前增加特定的线粒体靶向序列(MTS),得到本发明的腺相关病毒载体。
大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记,包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)、链霉素抗性(Strr)和氯霉素抗性(Cmlr)等。氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)是青霉素的衍生物,通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应,杀死生长的细菌。细菌质粒Amp r基因编码b-内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的b-内酰胺环。卡那霉素(kanamycin,Kana)通过与70S核糖体结合,导致mRNA发生错读。杀死细菌。而Kana编码的氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用。抗生素抗性筛选原理是:不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基(选择培养基)中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后,受体菌才能生长。
在本发明的一个实施例中,本发明腺相关病毒载体中的筛选标记基因为卡那霉素抗性基因。卡那霉素抗性基因相比氨苄青霉素抗性更安全,给病人带来的风险和危害更小。
在本发明的一个实施例中,通过无缝克隆在MCS前添加如SEQ ID NO.:4所示的MTS的步骤如下:
1.合成双链(MTS序列)
ATGGCCGCATCTCCGCACACTCTCTCCTCACGCCTCCTGACAGGTTGCGTAGGAGGCTCTGTCTGGTATCTTGAAAGAAGAACT(SEQ ID NO.:4)
2.对载体进行线性化处理,使用EcoRI限制性内切酶处理,对载体进行线性化处理。
3.使用无缝克隆的重组酶进行片段的替换,进行大肠杆菌热激转化。
4.使用卡那霉素平板进行筛选。
5.挑选长出来的单克隆进行测序。测序验证正确的即为添加MTS序列成功的质粒。
本发明特定的线粒体靶向序列作为载体的一部分,序列长度短(尤其是COX10,仅84bp),可以保留更多的空间以承载更长的目的片段,并且定位非常准确(尤其是COX10),可以使表达的多种不同蛋白定向转运入线粒体,更有效纠正线粒体基因缺陷。
在本发明的一个实施例中,通过无缝克隆添加酶切位点的步骤如下:
1.通过一些列研究分析,可以添加的酶切位点有9个:AatⅠ,EcoRⅤ,HpaⅠ,KpnⅠ,Nhel,PacⅠ,SpeⅠ,StuⅠ,XcaⅠ。
本次添加的多克隆位点为:
Kpn I-GGGGTACCCC Spe I-GGACTAGTCC Nhe I-CGGCTAGCCG
Stu I-GAAGGCCTTC Pac I-GTTAATTAAC Aatl-GCAGGCCTCG
EcoRV-GCGATATCGC HpaI-GCGTTAACGC XcaI-GCGTATACGC
2.合成下面双链序列,其中,斜体部分为添加的多克隆位点序列,加粗部分为原先的多克隆位点序列。
3.对上述验证成功的载体进行线性化处理,用EcoRI进行线性化处理。
4.使用无缝克隆的重组酶进行片段的替换,并且进行大肠杆菌的热激转化。
5.使用卡那霉素平板进行筛选。
6.挑选单克隆菌株进行测序,测序验证正确的即为多克隆位点添加成功的菌株。
通过提供的序列信息,熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的腺相关病毒载体。
优选地,病毒载体是复制缺陷的(replication defective),尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。
病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如,AAV中,病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV,没有辅助病毒诸如腺病毒的存在,复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒,优选地,复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中),并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体,同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。
病毒载体具有进入细胞的能力。然而,非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地,递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用,并且优选地适于在人类中使用。
本发明载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记,例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在靶细胞中的表达。
“可操作地连接”意指,核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关,以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如,与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。
启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达,或神经元特异的表达。在后一种情况中,启动子可以指导细胞类型特异的表达,例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如,合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向,例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体,Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达,其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡肌动蛋白启动子的融合体。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而,也可使用其他组成型启动子序列,包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子,诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地,本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关,其能够当这样的表达是期望的时,打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达,或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
制剂和组合物
本发明提供一种制剂或组合物,所述制剂或组合物含有(a)本发明第四方面所述的载体,以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中,所述药物制剂用于治疗线粒体疾病,如恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。
在另一优选例中,所述眼部疾病为视神经退化性疾病。在另一优选例中,所述眼部疾病为视网膜神经节细胞的局灶性退化。在另一优选例中,所述眼部疾病为遗传性视神经病变,较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。
本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明第四方面所述的载体(vector)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗线粒体疾病。“安全有效量”指的是:活性成分的量足以明显改善病情或症状,而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是:一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质,它们适合于人使用,而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和,而不明显降低活性成分的药效。
组合物可以是液体或固体,例如粉末、凝胶或糊剂。优选地,组合物是液体,优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
在本发明的一个实施方式中,所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中,优选地,载体作为可注射液体被提供。优选地可注射液体作为胶囊或注射器被提供。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液,和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明的主要优点包括:
1.本发明将原载体上的氨苄青霉素抗性被替换成卡那霉素抗性,减少了载体对病人带来的风险和危害。因此,本发明的载体更安全,毒性小。
2.原载体上只有7个酶切位点,且超过一半为不常用酶切位点,在构建融合表达或多基因表达载体时极不方便。经过对载体序列的分析,本发明又增加了9个多克隆酶切位点,增加的酶切位点可以为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案,使载体构建更加方便。
3.本发明在MCS区的前面增加线粒体靶向肽编码序列(MTS)作为载体的一部分,可以表达多种不同的蛋白质定向转运入线粒体,比没有MTS标签的载体更有效纠正线粒体基因缺陷,有望从根本上解决基因突变引起的线粒体病变。
4.本发明的线粒体靶向肽编码序列(SEQ ID NO.:2-5)作为载体的一部分,序列长度短,尤其是优化和未优化的COX10序列(84bp)和COX8序列(87bp),可以保留更多的空间以承载更长的目的片段,载体容量大,适用性更广,可作为一种用于治疗多种线粒体疾病的通用工具,更简便经济。
5.相比其它线粒体靶向序列,本发明的线粒体靶向肽编码序列(尤其是优化的COX10序列)能够更准确地定位至线粒体,可以使表达的目标蛋白准确地定向转运入线粒体,有更多的目标蛋白转染到在线粒体中,更有效纠正线粒体基因缺陷。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。
实施例1 pAAV-MTS1-MCS载体的构建
1.大肠杆菌StbI3感受态的制备
(1)从37℃过夜培养的平皿中挑取一个单菌落,把这个单菌落接到一个含有5mL的LB培养基中37℃,220rpm过夜培养。
(2)将过夜培养的大肠杆菌液体取2mL于100mL的三角瓶中37℃,220rpm培养至对数生长期前期(OD600约为0.3)。
(3)将培养好的的菌液室温下4000rpm,离心5min,注意离心管的配平,倒去上清液,收集沉淀。
(4)加入50mL预冷的ddH2O重悬菌体,再次4000rpm离心5min。倒去上清液体,收集沉淀。
(5)加入10mL预冷的氯化钙溶液(0.1mol/L),轻轻混匀细菌。
(6)4℃,4000rpm离心10分钟收集沉淀。
(7)加入5mL预冷的氯化钙溶液(0.1mol/L),轻微摇匀,并在冰上放置1h。
(8)加入甘油进行分装-80℃冻存备用。
2.质粒转化与扩增
(1)取装有大肠杆菌感受态细胞的离心管于冰上,向离心管中加入需要转化的pAAV-MCS腺相关病毒表达载体质粒,(需要无菌操作)并在冰上放置30min。
(2)取离心管至42℃恒温水浴锅中准确水浴90S,快速将水浴锅中的离心管转移至冰上放置2-3min。
(3)向离心管中加入1ml的LB培养基,37℃,100rpm复苏1h以上。
5000rpm,5min离心,取沉淀涂布在含有氨苄青霉素的LB固体平板上,于37℃倒置培养平板,12h以后就能看到长出来的单克隆菌株。挑取转化成功的菌株进行摇菌培养。
3.质粒的提取和酶切
使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提,并采用EcoRI对质粒进行单酶切进行线性化,单酶切反应体系如下:
酶切8h,加入DNA loading进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收单酶切的片段。回收建议采用胶回收试剂盒进行回收。
4.质粒和DNA片段的重组交换
根据无缝克隆重组酶要求,将卡那霉素抗性基因和线性化载体混合在离心管中,37℃反应30min。
5.重组片段的转化
(1)取装有大肠杆菌感受态细胞的离心管于冰上,向离心管中加入重组完成的质粒(需要无菌操作)并在冰上放置30min。
(2)取离心管至42℃恒温水浴锅中准确水浴90S,快速将水浴锅中的离心管转移至冰上放置2-3min。
(3)向离心管中加入1ml的LB培养基,37℃,100rpm复苏1h以上。5000rpm,5min离心,取沉淀涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上,于37℃倒置培养平板,12h以后就能看到长出来的单克隆菌株。挑取转化成功的菌株进行测序验证,验证成功的,即成功将氨苄青霉素抗性替换为卡那霉素抗性,得到质粒pAAV-MCS-Km。
6.将验证成功的菌株进行扩增培养及质粒抽提
本次质粒抽提的方法是使用试剂盒,具体步骤见Tianprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒试剂盒说明书。
7.片段线性化
使用质粒提取试剂盒进行质粒抽提,并采用EcoRI对质粒进行单酶切进行线性化,单酶切反应体系如下:
酶切8h,加入DNA loading进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收单酶切的片段。回收建议采用胶回收试剂盒进行回收。
8.质粒和DNA片段的重组交换
根据无缝克隆重组酶要求,将MTS序列和多克隆位点序列片段(即SEQ ID NO.:6中第1319-1599位)和线性化载体混合在离心管中,37℃反应30min。
9.重组片段的转化
(1)取装有大肠杆菌感受态细胞的离心管于冰上,向离心管中加入重组完成的质粒(需要无菌操作)并在冰上放置30min。
(2)取离心管至42℃恒温水浴锅中准确水浴90S,快速将水浴锅中的离心管转移至冰上放置2-3min。
(3)向离心管中加入1ml的LB培养基,37℃,100rpm复苏1h以上。
5000rpm,5min离心,取沉淀涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上,于37℃倒置培养平板,12h以后就能看到长出来的单克隆菌株。挑取转化成功的菌株进行测序验证,验证成功的即为MTS序列和多克隆位点添加成功的载体(SEQ ID NO.:6),命名为pAAV-MTS1-MCS载体。
实施例2人NADH脱氢酶亚单位4蛋白载体(pAAV-MTS1-ND4)的构建及验证
1.重组载体的构建
1.1质粒制备:获取的人的ND4核苷酸序列(SEQ ID NO.:8),由第三方公司合成。通过酶切在ND4基因上形成粘性末端,并将ND4基因嵌入有酶切位点(多克隆位点区)的腺相关病毒载体pAAV-MTS1-MCS(实施例1中制备的)和pAAV-MCS,分别命名为pAAV-MTS1-ND4和pAAV-ND4。
ATGCTGAAGCTGATCGTGCCCACCATCATGCTGCTGCCTCTGACCTGGCTGAGCAAGAAACACATGATCTGGATCAACACCACCACGCACAGCCTGATCATCAGCATCATCCCTCTGCTGTTCTTCAACCAGATCAACAACAACCTGTTCAGCTGCAGCCCCACCTTCAGCAGCGACCCTCTGACAACACCTCTGCTGATGCTGACCACCTGGCTGCTGCCCCTCACAATCATGGCCTCTCAGAGACACCTGAGCAGCGAGCCCCTGAGCCGGAAGAAACTGTACCTGAGCATGCTGATCTCCCTGCAGATCTCTCTGATCATGACCTTCACCGCCACCGAGCTGATCATGTTCTACATCTTTTTCGAGACAACGCTGATCCCCACACTGGCCATCATCACCAGATGGGGCAACCAGCCTGAGAGACTGAACGCCGGCACCTACTTTCTGTTCTACACCCTCGTGGGCAGCCTGCCACTGCTGATTGCCCTGATCTACACCCACAACACCCTGGGCTCCCTGAACATCCTGCTGCTGACACTGACAGCCCAAGAGCTGAGCAACAGCTGGGCCAACAATCTGATGTGGCTGGCCTACACAATGGCCTTCATGGTCAAGATGCCCCTGTACGGCCTGCACCTGTGGCTGCCTAAAGCTCATGTGGAAGCCCCTATCGCCGGCTCTATGGTGCTGGCTGCAGTGCTGCTGAAACTCGGCGGCTACGGCATGATGCGGCTGACCCTGATTCTGAATCCCCTGACCAAGCACATGGCCTATCCATTTCTGGTGCTGAGCCTGTGGGGCATGATTATGACCAGCAGCATCTGCCTGCGGCAGACCGATCTGAAGTCCCTGATCGCCTACAGCTCCATCAGCCACATGGCCCTGGTGGTCACCGCCATCCTGATTCAGACCCCTTGGAGCTTTACAGGCGCCGTGATCCTGATGATTGCCCACGGCCTGACAAGCAGCCTGCTGTTTTGTCTGGCCAACAGCAACTACGAGCGGACCCACAGCAGAATCATGATCCTGTCTCAGGGCCTGCAGACCCTCCTGCCTCTTATGGCTTTTTGGTGGCTGCTGGCCTCTCTGGCCAATCTGGCACTGCCTCCTACCATCAATCTGCTGGGCGAGCTGAGCGTGCTGGTCACCACATTCAGCTGGTCCAATATCACCCTGCTGCTCACCGGCCTGAACATGCTGGTTACAGCCCTGTACTCCCTGTACATGTTCACCACCACACAGTGGGGAAGCCTGACACACCACATCAACAATATGAAGCCCAGCTTCACCCGCGAGAACACCCTGATGTTCATGCATCTGAGCCCCATTCTGCTGCTGTCCCTGAATCCTGATATCATCACCGGCTTCTCCAGCTGA(SEQ ID NO.:8)
重组子的筛选和鉴定步骤如下:取37℃培养后的LB平板,出现蓝斑和白斑,其中白色为重组克隆。其中pAAV-MTS1-ND4质粒筛选,挑取白色的菌落加入到含有Kana抗性的LB液体培养基中,37℃,200rpm培养8h;pAAV-ND4质粒筛选,挑取白色的菌落加入到含有Amp抗性的LB液体培养基中,37℃,200rpm培养8h。将培养好后取菌液,提取质粒,质粒提取步骤参照Biomiga说明书,使用酶切鉴定。
1.2细胞转染:转染前一天,将HEK293细胞接种于225cm2细胞培养瓶中,接种密度3.0×107个/mL细胞,培养基为DMEM+10%牛血清,置37℃含5%CO2的培养箱中培养过夜。转染当天换液,用新鲜的含10%牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80~90%时,弃去培养基,用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染pAAV-MTS1-ND4和pAAV-ND4载体。转染48h后,收取细胞。
1.3重组腺相关病毒的收集、浓缩与纯化:
1.3.1病毒的收集:1)准备干冰乙醇浴(或液氮)和37℃水浴;2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中;3)1000rpm/min,离心3分钟,分离细胞和上清,将上清另外存放,细胞用1ml PBS重悬;4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移,冻融四次,冻和融各10分钟,每次融解后稍加震荡。
1.3.2病毒的浓缩:1)10,000g离心去除细胞碎片,将离心上清转移到一个新离心管中;2)用0.45μm滤器过滤除杂质;3)加入各1/2体积的1M NaCl、10%PEG8000溶液,混合均匀,4℃过夜;4)12,000rpm离心2h,弃上清,病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解,待完全溶解后用0.22μm滤器过滤除菌;5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖,颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟;6)用0.45μm过滤头过滤,取滤出液,即为浓缩的rAAV2病毒。
1.3.3病毒的纯化:1)向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372);2)将样品加入到超速离心管中,用预先配好的1.41g/ml CsCl溶液将离心管剩余空间填满;3)在175,000g下离心24小时,以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品,取样进行滴度测定。收集富集有rAAV2颗粒的组分;4)重复上述过程一次。将病毒装入100kDa的透析袋,4℃透析脱盐过夜。
至此,获得浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2/2-MTS1-ND4和rAAV2/2-ND4。
2.体外细胞实验证明
HEK293细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium)培养基中贴壁生长,培养在含有5%CO2的37℃恒温培养箱中。将细胞均匀铺板在六孔板中,并分为3组。当细胞生长约80%时转染病毒,分别加入rAAV2/2-GFP(1.0×109)、rAAV2/2-ND4(1.0×109)和rAAV2/2-MTS1-ND4(1.0x109)。转染48小时后,各组分别行荧光定量PCR检测,提取细胞总蛋白进行ND4Western blot检测和提取线粒体内蛋白进行ND4Western blot。
2.1荧光定量PCR检测
分别提取转染腺相关病毒的293细胞的RNA、反转录,利用TRIZOL试剂盒提取总RNA并反转录合成cDNA模板。用NCBI的保守结构域分析软件分析ND4的保守结构,确保所设计引物的扩增片段位于非保守区;然后根据荧光定量PCR的引物设计原则,用primer premier 5设计引物:
β-actin-S:CGAGATCGTGCGGGACAT(SEQ ID NO.:9);
β-actin-A:CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(SEQ ID NO.:10);
ND4-S:CTGCCTACGACAAACAGAC(SEQ ID NO.:11);
ND4-A:AGTGCGTTCGTAGTTTGAG(SEQ ID NO.:12);
荧光定量PCR的反应体系和反应程序:
在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH2O 8μL、引物各1μL,cDNA样品2.5μL,总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因β-actin,各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时,为减小误差,各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕,进行荧光定量PCR。
按照95℃预变性1s,94℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸45s,共40个循环的反应程序进行扩增,并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃~55℃的融解曲线分析。
结果显示转染腺相关病毒后的rAAV2/2-MTS1-ND4组和rAAV2/2-ND4组细胞内ND4mRNA水平明显多于rAAV2/2-GFP(p<0.005);rAAV2/2-MTS1-ND4组ND4mRNA水平与rAAV2/2-ND4相比无明显差别(p>0.05)。
2.2提取细胞总蛋白进行ND4Western blot检测
倒掉HEK 293细胞培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液,加预冷的PBS。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,洗细胞三次以洗去培养液。采用线粒体蛋白提取试剂盒提取3组细胞的总蛋白。经检测蛋白浓度后,各组样本分别取50μg蛋白上样进行电泳,根据蛋白分子量配置12%SDS-PAGE胶电泳,转移到聚偏氟膜上(Bio-Rad,Her-cules,CA,USA),分别孵育一抗和二抗,用于免疫检测。用自动图像分析仪器(Li-Cor;Lincoln,NE,USA)对薄膜上条带进行观察分析,各蛋白带的积分光密度积分,得到样本对应的光学密度值分析。
结果如图3所示,转染腺相关病毒后的rAAV2/2-MTS1-ND4组和rAAV2/2-ND4组细胞内ND4水平明显多于rAAV2/2-GFP组(p<0.005);rAAV2/2-MTS1-ND4组细胞内ND4水平与rAAV2/2-ND4相比无明显差别(p>0.05)。
2.3提取线粒体蛋白进行ND4Western blot检测
线粒体的分离采用:第一,通过机械方法破裂细胞;第二,通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器;第三,通过高速差速离心获得线粒体。
凯基线粒体蛋白提取试剂盒,首先从动物细胞或组织中分离出完整且纯化好的线粒体,然后用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer裂解线粒体得到线粒体总蛋白。
经检测蛋白浓度后,各组样本分别取50μg蛋白上样进行电泳,根据蛋白分子量配置12%PAGE胶电泳,转移到聚偏氟膜上(Bio-Rad,Her-cules,CA,USA),分别孵育一抗和二抗,用于免疫检测。用自动图像分析仪器(Li-Cor;Lincoln,NE,USA)对薄膜上条带进行观察分析,各蛋白带的积分光密度积分,得到样本对应的光学密度值分析。
结果如图4所示,转染腺相关病毒后的rAAV2/2-MTS1-ND4组细胞内ND4水平明显多于rAAV2/2-ND4组和rAAV2/2-GFP组(p<0.005);rAAV2/2-ND4组细胞内ND4水平与rAAV2/2-GFP组相比无明显差别(p>0.05)。
结果表明,与pAAV-ND4比较,pAAV-MTS1-ND4包装出来的腺相关病毒(rAAV2/2-MTS1-ND4)可以携带ND4蛋白进入线粒体内,进行基因治疗。rAAV2/2-MTS1-ND4基因治疗G11778A位点突变Leber遗传性视神经病变的疗效显著。
实施例3人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的载体(pAAV-MTS1-ND1)的构建及其验证
方法同实施例2,其中将ND4序列(SEQ ID NO.:8)替换为ND1序列(SEQ ID NO.:13),构建得到pAAV-MTS1-ND1重组载体并验证其效果。
ATGGCCAACCTCCTACTCCTCATTGTACCCATTCTAATCGCAATGGCATTCCTAATGCTTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATATGCAACTACGCAAAGGCCCCAACGTTGTAGGCCCCTACGGGCTACTACAACCCTTCGCTGACGCCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACCTTAGCTCTCACCATCGCTCTTCTACTATGGACCCCCCTCCCCATGCCCAACCCCCTGGTCAACCTCAACCTAGGCCTCCTATTTATTCTAGCCACCTCTAGCCTAGCCGTTTACTCAATCCTCTGGTCAGGGTGGGCATCAAACTCAAACTACGCCCTGATCGGCGCACTGCGAGCAGTAGCCCAAACAATCTCATATGAAGTCACCCTAGCCATCATTCTACTATCAACATTACTAATGAGTGGCTCCTTTAACCTCTCCACCCTTATCACAACACAAGAACACCTCTGGTTACTCCTGCCATCATGGCCCTTGGCCATGATGTGGTTTATCTCCACACTAGCAGAGACCAACCGAACCCCCTTCGACCTTGCCGAAGGGGAGTCCGAACTAGTCTCAGGCTTCAACATCGAATACGCCGCAGGCCCCTTCGCCCTATTCTTCATGGCCGAATACACAAACATTATTATGATGAACACCCTCACCACTACAATCTTCCTAGGAACAACATATGACGCACTCTCCCCTGAACTCTACACAACATATTTTGTCACCAAGACCCTACTTCTAACCTCCCTGTTCTTATGGATTCGAACAGCATACCCCCGATTCCGCTACGACCAACTCATGCACCTCCTATGGAAAAACTTCCTACCACTCACCCTAGCATTACTTATGTGGTATGTCTCCATGCCCATTACAATCTCCAGCATTCCCCCTCAAACCTAA(SEQ ID NO.:13)
结果表明,在细胞质内,rAAV2/2-MTS1-ND1和rAAV2/2-ND1均表达无明显差异;在线粒体内rAAV2/2-MTS1-ND1表达水平明显高于rAAV2/2-ND1表达量(P<0.05)。
实施例4人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的载体(pAAV-MTS1-ND6)的构建及其验证
方法同实施例2,其中将ND4序列(SEQ ID NO.:8)替换为ND6序列(SEQ ID NO.:14),构建得到pAAV-MTS1-ND6重组载体并验证其效果。
ATGATGTATGCTTTGTTTCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAATGGGGTTTGTGGGGTTTTCTTCTAAGCCTTCTCCTATTTATGGGGGTTTAGTATTGATTGTTAGCGGTGTGGTCGGGTGTGTTATTATTCTGAATTTTGGGGGAGGTTATATGGGTTTAATGGTTTTTTTAATTTATTTAGGGGGAATGATGGTTGTCTTTGGATATACTACAGCGATGGCTATTGAGGAGTATCCTGAGGCATGGGGGTCAGGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTGTTTTAGTGGGGTTAGCGATGGAGGTAGGATTGGTGCTGTGGGTGAAAGAGTATGATGGGGTGGTGGTTGTGGTAAACTTTAATAGTGTAGGAAGCTGGATGATTTATGAAGGAGAGGGGTCAGGGTTGATTCGGGAGGATCCTATTGGTGCGGGGGCTTTGTATGATTATGGGCGTTGGTTAGTAGTAGTTACTGGTTGGACATTGTTTGTTGGTGTATATATTGTAATTGAGATTGCTCGGGGGAATTAG(SEQ ID NO.:14)
结果表明,在细胞质内,rAAV2/2-MTS1-ND6和rAAV2/2-ND6均表达无明显差异;在线粒体内rAAV2/2-MTS1-ND6表达水平明显高于rAAV2/2-ND6表达量(P<0.05)。
实施例5pAAV-MTS2-MCS载体的构建及验证
采用与实施例1相同的构建方法,其中将COX10编码序列(SEQ ID NO.:6中第1319-1402位)替换为优化的COX10编码序列(SEQ ID NO.:3)构建得到pAAV-MTS2-MCS载体,序列如SEQ ID NO.:15。对pAAV-MTS2-MCS载体的功能进行验证。
方法同实施例2,将ND4基因序列分别插入到载体pAAV-MTS2-MCS中,得到pAAV-MTS2-ND4。其中将pAAV-MTS1-ND4载体替换为pAAV-MTS2-ND4载体,制备得到重组腺相关病毒rAAV2/2-MTS2-ND4并进行体外细胞实验。
在细胞质内,rAAV2/2-MTS2-ND4和rAAV2/2-ND4均表达无明显差异;在线粒体内rAAV2/2-MTS2-ND4表达水平明显高于rAAV2/2-ND4表达量(P<0.05)。
结果表明,与pAAV-ND4比较,pAAV-MTS2-ND4载体包装出来的腺相关病毒(rAAV2/2-MTS2-ND4)可以携带ND4蛋白更多地进入线粒体内,进行基因治疗,治疗Leber遗传性视神经病变的疗效显著。并且结果还表明,相比含未优化的COX10编码序列的pAAV-MTS1-ND4载体,含有优化的COX10编码序列的pAAV-MTS2-ND4载体定位更准确,线粒体中的ND4蛋白量更多。
实施例6 pAAV-MTS3-MCS载体和pAAV-MTS4-MCS载体的构建及验证
采用与实施例1相同的构建方法,其中将COX10序列(SEQ ID NO.:6中第1319-1402位)分别替换为COX8序列(SEQ ID NO.:2)和OPA1序列(SEQ ID NO.:5),分别构建得到pAAV-MTS3-MCS载体和pAAV-MTS4-MCS载体。
对上述pAAV-MTS3-MCS载体和pAAV-MTS4-MCS载体的功能进行验证。
方法同实施例2,将ND4基因序列分别插入到重组腺相关病毒载体pAAV-MTS3-MCS和pAAV-MTS4-MCS中,得到pAAV-MTS3-ND4和pAAV-MTS4-ND4。其中将pAAV-MTS1-ND4载体替换为pAAV-MTS3-ND4载体和pAAV-MTS4-ND4载体,制备得到rAAV2/2-MTS3-ND4、rAAV2/2-MTS4-ND4并进行体外细胞实验。
在细胞质内,rAAV2/2-MTS3-ND4、rAAV2/2-MTS4-ND4和rAAV2/2-ND4均表达无明显差异;在线粒体内rAAV2/2-MTS3-ND4、rAAV2/2-MTS4-ND4表达水平明显高于rAAV2/2-ND4表达量(P<0.05)。
结果表明,与pAAV-ND4比较,pAAV-MTS3-ND4载体和pAAV-MTS4-ND4包装出来的腺相关病毒(rAAV2/2-MTS3-ND4、rAAV2/2-MTS3-ND4)可以携带ND4蛋白更多地进入线粒体内,进行基因治疗,治疗Leber遗传性视神经病变的疗效显著。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司
<120> 含线粒体靶向序列的载体及其构建方法和应用
<130> P2018-1518
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
cggggatcct ctagaggggt accccggact agtcccggct agccggaagg ccttcgttaa 60
ttaacgcagg cctcggcgat atcgcgcgtt aacgcgcgta tacgcgtcga cctgcagaag 120
ctatcgattg aattccccgg ggatcctcta gagtcgacct gcagaagctt gcctcgagca 180
gcgctgctcg agagatc 197
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atgtccgtcc tgacgcgcct gctgctgcgg ggcttgacac ggctcggctc ggcggctcca 60
gtgcggcgcg ccagaatcca ttcgttg 87
<210> 3
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
atggccgcct ctccacacac actgagtagc agactgctga ccggctgtgt tggcggctct 60
gtgtggtatc tggaacggcg gaca 84
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60
gtctggtatc ttgaaagaag aact 84
<210> 5
<211> 266
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60
tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120
cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180
acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240
cgactacgtc gggccgctgt ggcctg 266
<210> 6
<211> 4811
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720
cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780
ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840
gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900
ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960
tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020
attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080
aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140
caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200
ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260
ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320
ggccgcatct ccgcacactc tctcctcacg cctcctgaca ggttgcgtag gaggctctgt 1380
ctggtatctt gaaagaagaa ctcggggatc ctctagaggg gtaccccgga ctagtcccgg 1440
ctagccggaa ggccttcgtt aattaacgca ggcctcggcg atatcgcgcg ttaacgcgcg 1500
tatacgcgtc gacctgcaga agctatcgat tgaattcccc ggggatcctc tagagtcgac 1560
ctgcagaagc ttgcctcgag cagcgctgct cgagagatct acgggtggca tccctgtgac 1620
ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc 1680
ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg 1740
tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg 1800
gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc 1860
tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc 1920
atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc 1980
aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg 2040
ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttgta ggtaaccacg 2100
tgcggaccga gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 2160
ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 2220
cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc 2280
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc 2340
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 2400
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 2460
cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 2520
acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 2580
ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 2640
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat 2700
tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 2760
ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 2820
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 2880
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 2940
tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 3000
atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 3060
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 3120
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 3180
ccatattcaa cgggaaacgt cttgctctag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 3240
tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 3300
attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 3360
caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 3420
gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc 3480
cgggaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga 3540
tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa 3600
cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga 3660
tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat 3720
gcataaactt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga 3780
taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat 3840
cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 3900
attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca 3960
gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta actgtcagac caagtttact catatatact 4020
ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 4080
taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 4140
agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 4200
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 4260
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 4320
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 4380
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 4440
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 4500
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 4560
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 4620
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 4680
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 4740
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 4800
tgctcacatg t 4811
<210> 7
<211> 4650
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720
cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780
ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840
gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900
ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960
tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020
attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080
aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140
caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200
ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260
ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320
cgattgaatt ccccggggat cctctagagt cgacctgcag aagcttgcct cgagcagcgc 1380
tgctcgagag atctacgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct 1440
ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt 1500
gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg 1560
gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc 1620
agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc 1680
tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt 1740
tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact cctaatctca 1800
ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc 1860
cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc 1920
ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 1980
ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 2040
agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 2100
caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 2160
gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 2220
tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 2280
gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 2340
atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 2400
cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 2460
ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 2520
aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa 2580
ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 2640
acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 2700
gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 2760
aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 2820
taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 2880
gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 2940
tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 3000
ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 3060
taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 3120
gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 3180
aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 3240
gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 3300
ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 3360
ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 3420
acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 3480
taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 3540
tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 3600
cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 3660
ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 3720
gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 3780
gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 3840
aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 3900
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 3960
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 4020
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 4080
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 4140
atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 4200
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 4260
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 4320
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 4380
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 4440
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 4500
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 4560
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 4620
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4650
<210> 8
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
atgctgaagc tgatcgtgcc caccatcatg ctgctgcctc tgacctggct gagcaagaaa 60
cacatgatct ggatcaacac caccacgcac agcctgatca tcagcatcat ccctctgctg 120
ttcttcaacc agatcaacaa caacctgttc agctgcagcc ccaccttcag cagcgaccct 180
ctgacaacac ctctgctgat gctgaccacc tggctgctgc ccctcacaat catggcctct 240
cagagacacc tgagcagcga gcccctgagc cggaagaaac tgtacctgag catgctgatc 300
tccctgcaga tctctctgat catgaccttc accgccaccg agctgatcat gttctacatc 360
tttttcgaga caacgctgat ccccacactg gccatcatca ccagatgggg caaccagcct 420
gagagactga acgccggcac ctactttctg ttctacaccc tcgtgggcag cctgccactg 480
ctgattgccc tgatctacac ccacaacacc ctgggctccc tgaacatcct gctgctgaca 540
ctgacagccc aagagctgag caacagctgg gccaacaatc tgatgtggct ggcctacaca 600
atggccttca tggtcaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc taaagctcat 660
gtggaagccc ctatcgccgg ctctatggtg ctggctgcag tgctgctgaa actcggcggc 720
tacggcatga tgcggctgac cctgattctg aatcccctga ccaagcacat ggcctatcca 780
tttctggtgc tgagcctgtg gggcatgatt atgaccagca gcatctgcct gcggcagacc 840
gatctgaagt ccctgatcgc ctacagctcc atcagccaca tggccctggt ggtcaccgcc 900
atcctgattc agaccccttg gagctttaca ggcgccgtga tcctgatgat tgcccacggc 960
ctgacaagca gcctgctgtt ttgtctggcc aacagcaact acgagcggac ccacagcaga 1020
atcatgatcc tgtctcaggg cctgcagacc ctcctgcctc ttatggcttt ttggtggctg 1080
ctggcctctc tggccaatct ggcactgcct cctaccatca atctgctggg cgagctgagc 1140
gtgctggtca ccacattcag ctggtccaat atcaccctgc tgctcaccgg cctgaacatg 1200
ctggttacag ccctgtactc cctgtacatg ttcaccacca cacagtgggg aagcctgaca 1260
caccacatca acaatatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcat 1320
ctgagcccca ttctgctgct gtccctgaat cctgatatca tcaccggctt ctccagctga 1380
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
cgagatcgtg cgggacat 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
caggaaggag ggctggaac 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
ctgcctacga caaacagac 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
agtgcgttcg tagtttgag 19
<210> 13
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
atggccaacc tcctactcct cattgtaccc attctaatcg caatggcatt cctaatgctt 60
accgaacgaa aaattctagg ctatatgcaa ctacgcaaag gccccaacgt tgtaggcccc 120
tacgggctac tacaaccctt cgctgacgcc ataaaactct tcaccaaaga gcccctaaaa 180
cccgccacat ctaccatcac cctctacatc accgccccga ccttagctct caccatcgct 240
cttctactat ggacccccct ccccatgccc aaccccctgg tcaacctcaa cctaggcctc 300
ctatttattc tagccacctc tagcctagcc gtttactcaa tcctctggtc agggtgggca 360
tcaaactcaa actacgccct gatcggcgca ctgcgagcag tagcccaaac aatctcatat 420
gaagtcaccc tagccatcat tctactatca acattactaa tgagtggctc ctttaacctc 480
tccaccctta tcacaacaca agaacacctc tggttactcc tgccatcatg gcccttggcc 540
atgatgtggt ttatctccac actagcagag accaaccgaa cccccttcga ccttgccgaa 600
ggggagtccg aactagtctc aggcttcaac atcgaatacg ccgcaggccc cttcgcccta 660
ttcttcatgg ccgaatacac aaacattatt atgatgaaca ccctcaccac tacaatcttc 720
ctaggaacaa catatgacgc actctcccct gaactctaca caacatattt tgtcaccaag 780
accctacttc taacctccct gttcttatgg attcgaacag catacccccg attccgctac 840
gaccaactca tgcacctcct atggaaaaac ttcctaccac tcaccctagc attacttatg 900
tggtatgtct ccatgcccat tacaatctcc agcattcccc ctcaaaccta a 951
<210> 14
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
atgatgtatg ctttgtttct gttgagtgtg ggtttagtaa tggggtttgt ggggttttct 60
tctaagcctt ctcctattta tgggggttta gtattgattg ttagcggtgt ggtcgggtgt 120
gttattattc tgaattttgg gggaggttat atgggtttaa tggttttttt aatttattta 180
gggggaatga tggttgtctt tggatatact acagcgatgg ctattgagga gtatcctgag 240
gcatgggggt caggggttga ggtcttggtg agtgttttag tggggttagc gatggaggta 300
ggattggtgc tgtgggtgaa agagtatgat ggggtggtgg ttgtggtaaa ctttaatagt 360
gtaggaagct ggatgattta tgaaggagag gggtcagggt tgattcggga ggatcctatt 420
ggtgcggggg ctttgtatga ttatgggcgt tggttagtag tagttactgg ttggacattg 480
tttgttggtg tatatattgt aattgagatt gctcggggga attag 525
<210> 15
<211> 4811
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540
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ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720
cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780
ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840
gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900
ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960
tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020
attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080
aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140
caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200
ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260
ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320
ggccgcctct ccacacacac tgagtagcag actgctgacc ggctgtgttg gcggctctgt 1380
gtggtatctg gaacggcgga cacggggatc ctctagaggg gtaccccgga ctagtcccgg 1440
ctagccggaa ggccttcgtt aattaacgca ggcctcggcg atatcgcgcg ttaacgcgcg 1500
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ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc 1680
ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg 1740
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gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc 1860
tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc 1920
atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc 1980
aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg 2040
ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttgta ggtaaccacg 2100
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ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 2640
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat 2700
tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 2760
ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 2820
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 2880
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 2940
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gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 3120
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 3180
ccatattcaa cgggaaacgt cttgctctag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 3240
tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 3300
attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 3360
caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 3420
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taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat 3840
cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 3900
attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca 3960
gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta actgtcagac caagtttact catatatact 4020
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agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 4200
aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 4260
ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 4320
gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 4380
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 4440
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 4500
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 4560
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 4620
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 4680
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 4740
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 4800
tgctcacatg t 4811
Claims (7)
1.一种重组腺相关病毒载体,其特征在于,所述重组腺相关病毒载体是在腺相关病毒载体的多克隆位点插入了外源基因片段,所述腺相关病毒载体包含第一表达盒和第二表达盒,
其中,所述第一表达盒从5’-3’端具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
Z1为无或第一启动子;
Z2为线粒体靶向肽的编码序列,所述线粒体靶向肽的编码序列如SEQ ID NO.:3所示;
Z3为多克隆位点,所述多克隆位点具有如SEQ ID NO.:1所示的序列;
Z4为无或polyA;
以及,所述的第二表达盒为筛选标记表达盒,所述筛选标记表达盒含有卡那霉素抗性基因;
所述腺相关病毒载体为基于pAAV-MCS载体进行改造得到的载体,所述改造包括将pAAV-MCS载体中的多克隆位点替换为所述第一表达盒,且将氨苄青霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因;其中所述pAAV-MCS载体的序列如SEQ ID NO.:7所示;
并且,所述外源基因片段为治疗线粒体疾病的蛋白的基因序列,其选自SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:13或SEQ ID NO.:14。
2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,所述第二表达盒从5’-3’端具有式II结构:
X1-X2-X3 (II)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
X1为无或第二启动子;
X2为卡那霉素抗性基因;
X3为终止子。
3.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,所述腺相关病毒载体从5’端到3’端依次含有以下元件:左ITR序列、启动子、内含子、第一表达盒、右ITR序列、第二表达盒。
4.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体,其特征在于,所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:6或15所示。
5.一种宿主细胞,其特征在于,所述的细胞含有权利要求1所述的重组腺相关病毒载体,或其基因组整合有权利要求1所述的重组腺相关病毒载体。
6.如权利要求5所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞选自下组:HEK293细胞、感光细胞、其他视觉细胞、视神经细胞、心肌细胞、肌肉细胞、或其组合。
7.一种药物制剂,其特征在于,所述的制剂含有(a)权利要求1所述的重组腺相关病毒载体,以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
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WO2017093566A1 (en) * | 2015-12-04 | 2017-06-08 | Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Promoters and uses thereof |
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AAV2介导ND4基因治疗LHON不同免疫抑制方案的比较研究;高晶等;《华中科技大学学报(医学版)》;20130430;第42卷(第2期);第1187-191页 * |
Construction and detection of a novel type of recombinant human rAAV2/2-ND4;Han Pei等;《Eye Sci》;20130630;第28卷(第2期);第55-59页 * |
Efficacy and Safety of rAAV2-ND4 Treatment for Leber"s Hereditary Optic Neuropathy;Xing Wan等;《Sci Rep》;20160219;第1-10页 * |
Gene delivery to mitochondria by targeting modified adenoassociated virus suppresses Leber’s hereditary optic neuropathy in a mouse model;Hong Yu等;《Proc Natl Acad Sci U S A》;20120515;第109卷(第20期);第E1238–E1247页 * |
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