CN110607324A - 奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种奶牛溶菌酶基因（Lyz）乳腺特异性表达质粒及其构建方法和应用。具体地，PCR扩增Lyz基因的编码序列，将其插入到携带增强的绿色荧光蛋白基因的通用表达载体pEGFP‑N1的多克隆位点中。通用表达载体pEGFP‑N1经Ase I+Hind III双酶切，去除CMV启动子，克隆奶牛乳腺特异性表达β‑乳球蛋白基因（BLG）启动子序列并取代Ase I和HindIII酶切位点，构建奶牛溶菌酶基因（Lyz）乳腺特异性表达质粒。采用上述重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞,得到的细胞系可用于分泌具有生物活性的奶牛溶菌酶，用于奶牛乳腺组织免疫机制研究；该重组质粒还可应用于基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发。

Description

奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用，属于基因重组和分子克隆技术领域。
背景技术
奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病，随着奶牛乳腺炎发病率上升,大大降低奶牛产奶量，并严重影响原料奶质量。因此，奶牛乳房炎的治疗越来越受重视。目前主要治疗手段是抗生素、中药制剂的药物治疗，而抗生素的使用，耐药菌株产生及乳中药物残留严重危害到消费者的健康，因此奶牛乳房炎的治疗以成为世界难题。少用或不用抗生素，有效控制药物残留，保证原料奶安全及奶牛产奶量是奶牛乳腺炎防控的主要目标。
溶菌酶(lysozyme,Lyz)又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。具有抗菌、消炎、组织修复及提高免疫力等多方面的功能。目前，滥用抗生素带来的负效应日益凸显，细菌、真菌对抗生素的抗药性正逐渐增强，由于溶菌酶其只作用于细菌细胞壁，又是生物体内天然的抗菌物质，对动物机体无毒无害，因此有望成为新型抗生素的替代品。研究发现，在高等反刍动物(如牛、羊和鹿等)基因组中存在大概10种溶菌酶相似基因，反刍动物虽然有多种溶菌酶基因，但奶牛溶菌酶在乳腺中的表达水平较低，仅为0.05～0.13mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表达量可比其高2000～4000倍。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，构建一种奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒，在该质粒5’端构建乳腺特异性表达调控区，靶基因可以在乳腺组织中特异性表达，通过提高奶牛乳腺中溶菌酶这种天然抗菌物质的表达水平，为防治奶牛乳腺炎提供重要材料。
为实现上述发明目的，本发明提供一种奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒，Lyz基因插入至增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1质粒的HindIII和SacII多克隆位点处，且pEGFP-N1质粒的CMV启动子序列替换为BLG基因启动子序列；所述的Lyz基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的BLG基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
采用HindIII和SacII对pEGFP-N1质粒进行双酶切，将酶切后的pEGFP-N1质粒通过同源重组和Lyz基因进行连接，得到重组后的质粒pEGFP-N1-Lyz；
对重组质粒pEGFP-N1-Lyz进行AseI+HindIII双酶切，切除pEGFP-N1载体原有的CMV启动子序列，取BLG启动子基因序列同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点，构建奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz。
进一步地，所述Lyz基因的制备方法包括：
提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA；
将奶牛乳腺上皮细胞总RNA反转录成cDNA；
以奶牛乳腺上皮细胞cDNA为模板，以P1、P2为奶牛Lyz引物，RT-PCR扩增Lyz基因编码序列；
其中，所述P1引物具有序列表中SEQ ID No:4所示的核苷酸序列；
所述P2引物具有序列表中SEQ ID No:5所示的核苷酸序列。
进一步地，所述RT-PCR扩增体系为：模板cDNA为1μl，P1、P2引物各1μl，TakaraprimeSTAR MIX为10μl，ddH2O补足至20μl；P1、P2引物的浓度均为0.1nmol/μl；
所述RT-PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸7min。
进一步地，所述BLG启动子基因的制备方法包括：
提取奶牛血液基因组DNA；
以奶牛血液基因组DNA为模板，以P3、P4为奶牛BLG引物，PCR扩增BLG启动子基因；
其中，所述P3引物具有序列表中SEQ ID No:6所示的核苷酸序列；
所述P4引物具有序列表中SEQ ID No:7所示的核苷酸序列。
进一步地，所述PCR扩增体系为：模板DNA为1μl，P3、P4引物各1μl，TakaraprimeSTAR MIX为10μl，dH2O补足至20μl，P3、P4引物的浓度均为0.1nmol/μl；
所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min。
本发明还提供一种上述的重组质粒在奶牛乳腺组织免疫机制研究中的应用。
进一步地，将上所述的重组质粒或上述的构建方法得到的重组质粒转染至乳腺细胞，通过绿色荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因表达情况，检测奶牛溶菌酶基因的表达情况。
本发明还提供一种上述的重组质粒或上述的构建方法得到的重组质粒在基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发中应用。
进一步地，将上述的重组质粒或上述的构建方法得到的重组质粒转染至哺乳动物体内，重组质粒在哺乳动物体内表达奶牛溶菌酶基因，表达产物具有抗菌效果。
本发明所达到的有益效果：
1、本发明构建了一种含BLG基因启动子、奶牛溶菌酶基因(Lyz)和增强的绿色荧光蛋白基因的乳腺特异性表达奶牛溶菌酶基因的重组质粒，可用于奶牛乳腺组织免疫机制研究和基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发。
2、本发明构建重组质粒采用的是BLG基因启动子，并选取了特定的启动子序列，基于该方法所构建的重组质粒具有高特异性、高灵敏度和高准确度，可使奶牛溶菌酶基因在乳腺细胞中特异性高表达。
3、本发明使用重组质粒转染至泌乳高峰期ICR小鼠体内，重组质粒在体内乳腺组织特异性表达奶牛溶菌酶基因，表达产物具有抗菌效果。应用于基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发，进而代替常规抗生素等药物，使用后可大大提高乳腺组织及牛乳中溶菌酶表达量，不仅可以直达病灶杀死病原菌，起到治疗治疗牛乳房炎的效果，还会切断病源菌从乳头管进入乳房的通道，减少乳房炎的感染途径，达到治疗和预防乳房炎的目的，同时因不用抗生素，不产生耐药性问题，牛乳中溶菌酶含量的提升还会使牛乳不易变质，更加健康。
4、本发明在研发新型可替代抗生素产品方面有广泛的应用前景。
附图说明
图1.实施例1中，Lyz基因PCR扩增图。M：100bp DNA Ladder；1-5：Lyz片段扩增；6：ddH2O。注：488bp是444bpLyz+22bp上游同源臂+22bp下游同源臂。
图2.实施例1中，增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1结构示意图。
图3.实施例1中，Lyz重组载体菌液PCR检测图。M：100bp DNA Ladder；1-5：菌液PCR检测。注：其中1、2、4号检测到目的条带。
图4.实施例1中，BLG启动子PCR扩增图。M：DL5000，DNAMarker；1-5：启动子片段扩增。注：2358bp是2318bp启动子+20bp上游同源臂+20bp下游同源臂。
图5.实施例1中，BLG启动子元件分析图。注：在第887bp-892bp、1188bp-1191bp、2080-2085bp位置存在GC-box、CAAT-box和TATA-box的启动子元件。
图6.实施例1中，Lyz基因乳腺特异性表达质粒的构建。注：pEGFP-N1载体插入Lyz基因，并替换CMV启动子。
图7.实施例1中，pBLG-EGFP-N1-Lyz在原代乳腺上皮细胞中的特异性表达图。A.bPMEC细胞(×100)；B.pBLG-EGFP-N1-Lyz转染bPMEC细胞(×100)；
C.HEK293T细胞(×100)；D.pBLG-EGFP-N1-Lyz转染的HEK293T细胞(×100)。
图8.实施例2中，重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz在小鼠各组织中的相对表达水平图。1.空白组不注射任何试剂；2.对照组注射小鼠体内转染试剂；3.注射pBLG-EGFP-N1-Lyz及小鼠体内转染试剂后乳腺组织Lyz基因表达水平；4-8.注射pBLG-EGFP-N1-Lyz及小鼠体内转染试剂后心、肝、脾、肺、肾组织Lyz基因表达水平。注：3相对于1，2差异极显著；4-8相对于1，2差异不显著。
图9.实施例2中，western blot检测结果图。注：左侧三个条带为转染了重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz的小鼠乳腺组织western blot检测结果，右侧三个条带为未转染的对照组小鼠乳腺组织western blot检测结果。
具体实施方式
本发明根据GenBank中奶牛Lyz基因cDNA序列(GenBank号：NM_180999.1)设计引物，从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列，将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经AseI+HindIII双酶切除CMV启动子，将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点，构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz。采用脂质体法转染原代奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、293T细胞，荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，从而检测奶牛溶菌酶基因在原代奶牛乳腺上皮细胞的特异性表达情况，进而应用于奶牛乳腺组织免疫机制研究领域。
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1、引物设计与合成
根据GenBank中奶牛Lyz基因cDNA序列(GenBank号：NM_180999.1)与β-乳球蛋白(BLG)基因序列(GenBank号：X14710.1)采用Oligo6.0分别设计奶牛Lyz基因引物P1、P2，和β-乳球蛋白基因(BLG)启动子基因引物P3、P4，引物均由北京擎科新业生物科技有限公司合成。其序列分别为(下划线为同源臂)：
P1:CTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCATGAAGGCTCTCCTCATT
P2:CATGGTGGCGACCGGTGGATCCCACTCCACAACCCTGAAT
P3:GCCATGCATTAGTTATTAATAGGTGCTTTATTTCCGTCTC
P4:TGAGGAGAGCCTTCATAAGCTTACAGCCTCCCTTGGTCTC
2、基因克隆模板获取
(1)奶牛血液基因组DNA提取
取9ml新鲜健康中国荷斯坦奶牛血样，按照全血基因组DNA提取试剂盒(购自北京君诺德生物技术有限公司)说明书的操作方法提取奶牛血液基因组DNA，-20℃保存备用。
(2)奶牛乳腺上皮细胞总RNA提取
取一培养瓶长满贴壁的乳腺上皮细胞，移去细胞中的培养液，用预冷的PBS冲洗细胞3遍。12孔板每孔中加入TRIzol，使用移液枪反复吹打细胞至贴壁细胞全部裂解。室温静置5～10min后移入1.5ml离心管中。向离心管中加入氯仿(为TRIzol体积的1/5)，剧烈振荡15s，待液体充分乳化后，冰上静置5min。4℃，12000rpm，离心15min。吸取上清液转至另一新离心管中。向上清中加入与上清等体积异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min。4℃，12000rpm，离心10min，弃去上清，加入1ml 75％冷乙醇，洗涤沉淀。4℃，12000rpm，离心5min，弃去乙醇。室温干燥沉淀2～5min，待乙醇挥发完全，加入适量无RNase的DEPC水溶解沉淀。利用Nano Drop 1000分光光度计测定质粒RNA的浓度、纯度与盐离子含量。
按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(购自Takara，货号：RR047A)说明书，将奶牛乳腺上皮细胞总RNA反转录成cDNA,-70℃保存备用。
3、Lyz基因编码序列的克隆与鉴定
将上述制备的奶牛乳腺上皮细胞cDNA为模板，以P1、P2为奶牛Lyz引物，RT-PCR扩增Lyz基因编码序列。PCR反应体系为：模板cDNA为1μl，上、下游引物(P1、P2引物)各1μl，上、下游引物(P1、P2引物)的浓度分别为0.1nmol/μl，Takara primeSTAR MIX为10μl，ddH2O补足至20μl。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火20s,72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸7min。将产物用15g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，琼脂糖凝胶电泳显示通过PCR扩增出488bp的条带，这与预期的片段长度一致(如图1)，RT-PCR产物经普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化。取纯化的目的片段与增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1(购自武汉淼灵生物科技有限公司)连接(载体结构如图2，载体序列如SEQ ID NO:1所示)，构建重组质粒pEGFP-N1-Lyz，将其转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取单个白色菌落扩大培养，进行菌液PCR检测，显示目的片段已连接至pEGFP-N1中(如图3)。经鉴定的质粒进行测序，并对得到的序列进行BLAST比对，纯化质粒存在与数据库中Lyz基因序列相似性99％的片段(片段序列如SEQ ID NO:2所示)。
4、BLG启动子基因序列的克隆与鉴定
以基因组DNA为模板,PCR扩增β-乳球蛋白基因(BLG)启动子序列。PCR反应体系为20μl：模板cDNA为1μl，上、下游引物(P3、P4引物)各1μl，上、下游引物(P3、P4引物)的浓度分别为0.1nmol/μl，Takara primeSTAR MIX为10μl，ddH2O补足至20μl。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s,72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min。将产物用20g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，琼脂糖凝胶电泳显示通过PCR扩增出预期片段长度2358bp的条带(如图4)，PCR产物经普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)纯化，将纯化产物送至北京擎科新业生物科技有限公司进行测序，并对得到的序列进行BLAST比对，克隆的启动子序列与数据库中该基因5’上游相似性达100％。分析该片段(片段序列如SEQ ID NO:3所示)，分别在第887bp-892bp、1188bp-1191bp、2080-2085bp位置存在GC-box、CAAT-box和TATA-box的启动子元件，表明所选片段为BLG基因的启动子片段(如图5)。
5、Lyz基因乳腺特异性表达质粒的构建
载体构建过程如图6所示。对重组质粒pEGFP-N1-Lyz进行AseI+HindIII双酶切，切除pEGFP-N1载体原有CMV启动子序列，取纯化的BLG启动子基因序列同源重组到切除CMV启动子的pEGFP-N1-Lyz序列上，构建乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-N1-Lyz，将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行菌液PCR检测，PCR产物经普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将纯化产物送至北京擎科新业生物科技有限公司进行测序，并对得到的序列进行BLAST比对，测序结果显示与目的片段长度相符，目的基因阅读框是正确的，未发现错误位置。
6、效果测定
本发明用研制的奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达型质粒进行多次乳腺特异性转染效果试验，将Lyz基因乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-N1-Lyz转染至bPMEC细胞和HEK293T细胞,培养48小时后，在倒置荧光显微镜下观察，bPMEC细胞观察到绿色荧光(图7B),HEK293T细胞未观察到绿色荧光(图7D)。表明pBLG-EGFP-N1-Lyz在bPMEC细胞中特异表达。
实施例2
1、金黄色葡萄球菌株(S.aureus)培养和计数
对冻存的金黄色葡萄球菌进行复苏，用接种环接种于LB培养基中，放入37℃恒温生化培养箱中过夜培养；在LB培养基中挑取单个菌落接种于LB培养基中，放入37℃恒温气浴摇床中过夜培养。收集菌株，用DMEM高糖培养基重悬细菌制成细菌悬液，将细菌悬液的浓度调至2×108cfu/mL。
2、S.aureus攻毒体外培养的奶牛乳腺上皮细胞抗菌效果
(1)实验分组
将原代培养的奶牛乳腺上皮细胞接种于6孔细胞培养板中，放入CO2恒温培养箱中培养，待细胞生长至80％汇合时，进行实验分组，每个6孔细胞培养板做2个处理，每个处理3个重复，共两板细胞分成A、B、C、D四个组。
A组为实验组：先用Lyz重组质粒转染奶牛原代乳腺上皮细胞48h后，再将已经调好浓度的细菌悬液以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为100∶1的感染比例，感染转染后的奶牛原代乳腺上皮细胞；
B组为空白组：为不含菌株的DMEM高糖培养基；
C组为对照组：为不转染和重组质粒，直接用S.aureus感染奶牛原代乳腺上皮细胞。
(2)细胞培养
将上述4组奶牛乳腺上皮细胞放入CO2恒温培养箱中攻毒培养4h后胰酶消化细胞，收集至5ml离心管中，PBS清洗细胞2次。
(3)细胞固定
PBS清洗细胞后离心弃上清，在离心管中加入预冷70％乙醇1ml(先加300μl PBS重悬，然后加700μl无水乙醇，边滴加边涡旋)于4℃固定过夜。
(4)细胞染色
离心收集细胞，1ml PBS清洗细胞2次，加入500μl PI染液(含50μg/ml碘化丙啶(PI)的PBS，100μg/ml RNase A，0.2％Triton X-100)，4℃避光孵育30分钟(PI直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNase A在使用时再添加)。
(5)流式分析
以标准程序用流式细胞仪检测A、B、C、D四组细胞的死亡率和存活率，一般计数1-2万个细胞，结果用细胞周期拟和软件分析。所得全部数据用Excel整理，使用SPSS17.0统计软件进行差异分析。结果显示，Lyz重组质粒转染bPMEC细胞感染金黄色葡萄球菌后，细胞死亡率为0.60％，与对照组未转染重组质粒细胞死亡率7.96％对比极显著下降(P＜0.01)。
实施例3
1、小鼠体内转染Lyz重组质粒
(1)实验分组
24只标准品系ICR怀孕母鼠分成3组，每组8只。饲喂在通风、温暖、清洁级环境下，采用实验小鼠专用营养饲料及清洁水喂养。在泌乳高峰期开展试验(分娩后第7d)，各组处理如下：
实验组：8只注射奶牛溶菌酶乳腺特异性表达质粒稀释液及转染试剂稀释液；
空白组：8只不注射任何试剂；
对照组：8只注射转染试剂稀释液。
(2)尾静脉注射
转染试剂采用英格恩生物公司纳米聚合物转染试剂，该试剂主要用于DNA的体内转染，对动物没有明显炎症反应，对操作者安全。按照转染试剂说明书配制转染试剂复合液，按100μl转染复合物各组分配比组成如下：
质粒稀释液为12.5μg(12.5μl)质粒，12.5μl无菌水，25μl的10％葡萄糖溶液；
转染试剂稀释液为25μl转染试剂，25μl的10％葡萄糖。
并根据说明书指导采用尾静脉注射进行转染，作用时间为24小时，质粒用量、给药体积如1表所示：
表1重组质粒体内转染方法
2、荧光定量PCR分析
(1)样品采集
上述3组24只标准品系ICR怀孕母鼠完成各实验处理后，饲喂24小时待转染复合物充分作用后，对小鼠进行断颈处死，并立即在无菌操作台进行腹腔解剖，采集心、肝、脾、肺、肾脏器组织，并在小鼠的8个乳区中随机选择3个乳区采集乳腺组织，对采集的各脏器组织和乳腺组织根据上述实验分组进行编号，并立刻放入液氮中暂存，采集完成后立即将所有样品放入-70℃超低温冰箱冻存备用。
(2)小鼠乳腺组织RNA提取
①取-70℃冻存小鼠乳腺组织，每30-50mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过TRIzol体积的10％。
②将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
③4℃12000rpm离心10min，取上清。
④每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。
⑤4℃12000rpm离心10-15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μl)转移到新的离心管中。
⑥在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30min。
⑦4℃12000rpm离心10min，去上清。离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
⑧加入1ml 75％乙醇(RNase-Free ddH2O配置)洗涤沉淀。每使用1ml TRIzol至少用1ml75％乙醇对沉淀进行洗涤。
⑨4℃5000rpm离心3min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸到沉淀。
⑩室温放置晾干(不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min即可)，根据实验需要，加入30-100μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
(3)RNA反转录cDNA
①将小鼠乳腺组织全RNA在冰上解冻；5×FastKing-RT SuperMix和RNase-FreeddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
②配制反转录反应体系。根据天根反转录试剂盒FastKing gDNA Dispelling RTSuperMix说明书配置反转录体系，具体如下：
表2反转录体系
③按照表3表所示进行反转录反应。
表3反转录反应条件
(4)荧光定量PCR检测预测靶基因的表达量
以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参基因，通过荧光定量PCR检测Lyz基因相对表达水平，进一步验证目的基因在小鼠乳腺上皮细胞的特异性表达。根据NCBI上奶牛Lyz及内参基因GAPDH的序列，设计荧光定量PCR引物。通过高通量实时荧光定量PCR仪检测基因表达量。所得全部数据都要用Excel有序整理好，使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行方差分析，如果结果为差异显著，则用LDS法进行多重比较，每一组数据用平均数±标准差的方式来表示。结果显示，小鼠乳腺组织中Lyz基因的相对表达量均极显著增加71.46±1.35倍(P<0.01，如图8)。在小鼠心、肝、脾、肺、肾脏器中目的基因的表达水平与空白对照组对比差异不显著(P>0.05，图8)。以上结果表明，本实验所构建的重组质粒可在小鼠的乳腺组织中特异性表达。
3、Western Blot验证
(1)小鼠乳腺组织蛋白提取
①取上述-76℃保存的小鼠乳腺组织，在液氮冷却下用研钵研碎，研磨器械在180℃下灭菌3h，研磨过程中用液氮不断冷却器械，研磨后装入1.5ml离心管，加入1000μl蛋白裂解液。
②加入1ml裂解液(含有PMSF蛋白酶抑制剂)；
③震荡混匀后，在4℃下12000rpm离心10min；
④吸取上清液转移到另一个1.5ml离心管中，然后按上清液:(上清缓冲液+DTT)＝1:1，上清缓冲液:DTT＝4:1的比例加入；
⑤煮沸10min，分装，-80℃保存。
(2)BCA检测蛋白质浓度
①将BSA稀释为0.5mg/mL的工作液，使其浓度为(l0μL 25mg/mL BSA+490μL PBS)。
②根据样品数量，试剂A与试剂B按50:1比例配置适量的BCA工作液。
③将标准品按照每孔0，1，2，4，8，12，16，20μl加入96孔板，每孔再加PBS补足到20μl。
④取冻存蛋白样品迅速解冻后，在样品孔中加入2μl蛋白，再补18μl PBS，使总体积为20μl。
⑤各孔加入200μl BCA工作液，37℃水浴30分钟。
⑥酶标仪在A570nm处测定OD值。绘制标准曲线，根据标准曲线计算出所测样品的蛋白浓度。
(3)蛋白质变性
根据BCA蛋白浓度检测法计算出的蛋白浓度，把每个样品的浓度调整到合适上样的浓度，并按蛋白体积和上样缓冲液体积3:1的比例将两者混合。95℃水浴煮10-15min使得蛋白样品变性。
(4)蛋白质电泳
按表4配制SDS-PAGE浓缩胶和分离胶。
表4SDS-PAGE配方
装好垂直板电泳槽模具，将制备好的分离胶加入两玻璃板之间，之后用异丙醇1.5ml封液面压平。静置30min待分离胶完全凝固，弃去上层异丙醇，双蒸水冲洗干净，滤纸吸干胶面及玻璃板之间剩余水分。浓缩胶混合后加入两玻璃板中间，迅速插入梳子。室温放置30min,待胶凝固后，将胶板装入垂直板电泳槽，拔掉梳子，拔梳子的过程中要注意用力均匀，防止胶孔变形，灌入电泳缓冲液，淹没中间室，并漫过点样孔。拔掉梳子，将胶齿拔整齐，并用缓冲液冲洗胶孔。根据测定的蛋白质浓度上样，上样的蛋白质最低量不低于20μg，胶两侧上样孔各加5μl预染的彩色蛋白Marker。80V电压电泳，待样品进入分离胶后，调电压至120V，这一过程中容易产热，事先准备好冰盒，在冰盒中进行。待样品中溴酚蓝迁移至凝胶最下端时，电泳完毕，关闭电泳仪，拆掉胶板，回收电泳液。
(5)转膜、封闭
将胶板从电泳槽中拆下，小心取出凝胶，装配转移装置。戴上手套剪切滤纸和PVDF膜，将切好的PVDF膜置于甲醇中浸泡2min以活化，从转移夹负极开始，依次按照海绵、滤纸(3层)、凝胶、PVDF膜、滤纸(3层)、海绵的顺序组装转移夹。将转移夹放入电泳槽中，200mA转移2.5h，由于转移过程中会产生大量的热量，因此要进行冰浴。拆下转移装置，取出PVDF膜，做好标记，放入TBST溶液洗10min。封闭液封闭膜2h。TBST溶液漂洗膜3次，每次10min。将一抗EGFP抗体和β-actin抗体按说明书用抗体稀释液稀释至相应的比例，之后将膜封入自封袋中，4℃摇床上孵育过夜。回收抗体，摇床上TBST溶液洗膜3次，每次10min。加入稀释好的二抗，室温孵育2小时。TBST溶液漂洗膜3次，每次10min。
(6)WB图像分析及数据采集
将ECL试剂盒(购自Biovision公司)中的A液和B液按1:1比例混合，均匀滴加在转印膜上，反应30s后放入成像系统进行图像采集。其结果如图9所示，转染重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz的小鼠乳腺组织检测到目标蛋白，未转染重组质粒的条带较β-actin对照组颜色明显变浅，几乎无条带。结果表明，重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz在小鼠乳腺组织中表达了相应的蛋白质产物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4733
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg 660
gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 720
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 780
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 840
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 900
taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 960
caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 1020
ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 1080
ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1140
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 1200
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 1260
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 1320
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 1380
gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac tctagatcat aatcagccat accacatttg 1440
tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 1500
tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 1560
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 1620
ccaaactcat caatgtatct taaggcgtaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 1680
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 1740
ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 1800
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 1860
gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 1920
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 1980
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2040
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2100
gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 2160
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2220
tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt 2280
gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt 2340
cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2400
atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 2460
cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 2520
ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 2580
taggcttttg caaagatcga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 2640
gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 2700
gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 2760
ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca 2820
gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 2880
actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 2940
tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 3000
acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 3060
cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 3120
ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc 3180
gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 3240
ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 3300
acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 3360
ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 3420
tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 3480
atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 3540
ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccctaggg 3600
ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa 3660
taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt 3720
cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg 3780
tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca 3840
acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct caggttactc atatatactt tagattgatt 3900
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 3960
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 4020
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 4080
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 4140
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 4200
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 4260
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 4320
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 4380
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 4440
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 4500
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 4560
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 4620
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4680
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cat 4733
<210> 2
<211> 447
<212> DNA
<213> 奶牛(Cow)
<400> 2
atgaaggctc tcctcattct ggggcttctc ctcttttcgg tcgctgtcca aggcaaggtc 60
tttgagagat gtgagcttgc cagaagtctg aaaagatttg gaatggataa ctttagggga 120
atcagcctgg caaactggat gtgtttggcc agatgggaaa gcaattacaa cacacaagct 180
acaaactaca atgctggaga ccaaagcact gattatggga tatttcaaat caatagccac 240
tggtggtgca atgatggcaa aaccccagga gcagttaacg cctgtcattt accctgcggt 300
gctttgctgc aagatgacat cactcaagct gtagcatgtg caaagagggt tgtcagtgat 360
ccacaaggca ttagagcatg ggtggcatgg agaagtcatt gtcaaaacca agatctcacg 420
agttacattc agggttgtgg agtgtaa 447
<210> 3
<211> 2318
<212> DNA
<213> 奶牛(Cow)
<400> 3
aggtgcttta tttccgtctc tctctctgga tggtattctc tggaagctga aggttcctgg 60
aagttatgaa tagctttgcc atgaagggca tggtttgtgg tcatggttca caggaacttg 120
ggagaccctg cagctcggac gtcctgaggt tggtggcacc ctgatttcct aagctcgctg 180
gggaacgggg tgctacttct ccctggctga cctccctctg ctctgcatca cccagttctg 240
agagcagagt ggtgctgggg gcacagcctc tcgcatctga cacttgtgtt caaaccaccc 300
atgctggtgt tcggggggcc acctatgggg aaggctcctc actgcagggg tgcccctgtc 360
ccctgagaga tcagaagtcc cagtctggat gtcgaatggc cgagctccct ccagaggctc 420
cagggaggga tccttgcccc ctccgccgcc gcctccagct cctggtgccg cacccttggg 480
cccgatctcg tagacgcctc agtccagtct ctgcctccgt gttcactggc attctcccca 540
tgtcccctct gtgtccccgt tttctctcac aaggacaccg gacataagat tagcccccgt 600
tccagcatca cctgaacagc tcacatctgt aaagacctag attccaaaca agattccatc 660
ctgaagttcc tggtggacgt gagttctgga gcgacgccct tcaaccccat cacagcttgc 720
ggttcatcgc aaaacacgga acctgggatt tatcgtaaaa cccaggttct tcgtgaaaca 780
ctgagcttcg aggcttgttg caagaattaa aggtgctaat acagatcagg gcaaggaccg 840
aagctggcca agcctcctct ttccatcaca ggaaagggag gtctgggggc ggccgggggt 900
ctgctcccgt gggtgggctc tttctggtac agtcaccaac agtctctccg ggaaggaaac 960
cagaggccag agagcaagcc agagctagtc taggagatcc ctgagcctcc acccaagatg 1020
ccgaccaggc cagcgggccc cctggaaaga ccctacagtc taggggggga acaggagccg 1080
acccgccagg cccccgctat caggagacac cccaaccttg ctcctgttcc cctaccccag 1140
tacgcccacc cgacccctga gatgagtggt ttacttgctt agaatgtcaa ttgaaggctt 1200
ttgtaccccc tttgccagtg gcacagggca cccacagccc gctgggtact gatgcccatg 1260
tggactcagc caggaggact gtcctgcgcc ctccctgctc gggccccctc catactcagc 1320
gacacaccca gcaccagcat tcccaccact cctgaggtct gaaggcagct cgctgtggtc 1380
tgagcggtgc ggagggaagt gccctgggag atttaaaatg tgagaggtgg gaggtgggag 1440
gttgggtcct gtaggccttc ccatcccacg tgcctgcacg gagccctagt gctactcagt 1500
catgcccccg cagcaggggt caggtcactt tcccatcctg ggggttatta tgactgttgt 1560
cattgttgtt gccatttttg ctaccctaac tgggcagcgg gtgcttgcag agccctcgat 1620
actgaccagg ttcccccctc ggagctcgac ctgaacccca tgtcaccctc gccccagcct 1680
gcagagggtg gggtgactgc agagatccct ttacccaagg ccacagtcac atggtttgga 1740
ggagatggtg cccaaggcag aagccaccct ccaggacaca cctgccccca gtgctggctc 1800
tgacctgtcc ttgtctaaga ggctgacccc agaagtgttc ctggcgctgg cagccagcct 1860
ggacccagag cctggacacc ccctgcgccc ccacttctgg ggcgtaccag gaaccgtcca 1920
ggcccagagg gggccttact gcttggcctc gaatggaaga aggcctccta ttgtcctcgt 1980
agaggaagca accccagggc ccaaggatag gccagggggg attcggggaa ccgcgtggct 2040
gggggcccgg cccgggctgg ctggctggcc ctcctcctgt ataaggcccc gagcccgctg 2100
tctcagccct ccactccctg cagagctcag aagcgtgacc ccagctgcag ccatgaagtg 2160
cctcctgctt gccctggccc tcacttgtgg cgcccaggcc ctcattgtca cccagaccat 2220
gaagggcctg gatatccaga aggttcgagg gtgcccgggt gggtggtgag ttgcagggca 2280
ggcaggggag ctgggcctca gagaccaagg gaggctgt 2318
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcagatctc gagctcaagc ttcatgaagg ctctcctcat t 41
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catggtggcg accggtggat cccactccac aaccctgaat 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccatgcatt agttattaat aggtgcttta tttccgtctc 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgaggagagc cttcataagc ttacagcctc ccttggtctc 40

Claims (10)

1. 奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒，其特征是，Lyz基因插入至增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1质粒的HindIII和SacII多克隆位点处，且pEGFP-N1质粒的CMV启动子序列替换为BLG基因启动子序列；所述的Lyz基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的BLG基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
采用HindIII和SacII对pEGFP-N1质粒进行双酶切，将酶切后的pEGFP-N1质粒通过同源重组和Lyz基因进行连接，得到重组后的质粒pEGFP-N1-Lyz；
对重组质粒pEGFP-N1-Lyz进行AseI+HindIII双酶切，切除pEGFP-N1载体原有的CMV启动子序列，取BLG启动子基因序列同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点，构建奶牛溶菌酶基因乳腺特异性表达重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，所述Lyz基因的制备方法包括：
提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA；
将奶牛乳腺上皮细胞总RNA反转录成cDNA；
以奶牛乳腺上皮细胞cDNA为模板，以P1、P2为奶牛Lyz引物，RT-PCR扩增Lyz基因编码序列；
其中，所述P1引物具有序列表中SEQ ID No:4所示的核苷酸序列；
所述P2引物具有序列表中SEQ ID No:5所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征是，所述RT-PCR扩增体系为：模板cDNA为1µl，P1、P2引物各1µl，Takara primeSTAR MIX为10µl，ddH2O补足至20µl；P1、P2引物的浓度均为0.1nmol/µl；
所述RT-PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸7min。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，所述BLG启动子基因的制备方法包括：
提取奶牛血液基因组DNA ；
以奶牛血液基因组DNA为模板，以P3、P4为奶牛BLG引物，PCR扩增BLG启动子基因；
其中，所述P3引物具有序列表中SEQ ID No:6所示的核苷酸序列；
所述P4引物具有序列表中SEQ ID No:7所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是，所述PCR扩增体系为：模板DNA为1μl，P3、P4引物各1μl，Takara primeSTAR MIX为10μl，dH2O补足至20μl，P3、P4引物的浓度均为0.1nmol/µl；
所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min。
7.根据权利要求1所述的重组质粒或权利要求2-6中任一所述的构建方法得到的重组质粒在奶牛乳腺组织免疫机制研究中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，将权利要求1所述的重组质粒或权利要求2-6中任一所述的构建方法得到的重组质粒转染至乳腺细胞，通过绿色荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因表达情况，检测奶牛溶菌酶基因的表达情况。
9.根据权利要求1所述的重组质粒或权利要求2-6中任一所述的构建方法得到的重组质粒在基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发中应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征是，将权利要求1所述的重组质粒或权利要求2-6中任一所述的构建方法得到的重组质粒转染至哺乳动物体内，重组质粒在哺乳动物体内表达奶牛溶菌酶基因，表达产物具有抗菌效果。
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