CN103409464A - 一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，具体为一种质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml及其构建方法和应用。该质粒含CMV启动子-RBE元件-TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架。该质粒和rep表达质粒共转染哺乳动物细胞可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。使用该表达质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞一方面正负双重筛选可以防止细胞随机突变导致的非整合细胞耐药对转基因细胞群纯净度的影响，提高表达效率；另一方面可以有效预防插入突变导致的基因突变和癌蛋白表达风险。通过常规分子生物学方法取代人类凝血因子IX表达框架可以构建表达其它基因的具有定点整合以及正负筛选的质粒。

Description

一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒的构建方法和应用。

背景技术

自然界有许多天然的转基因事件，其中有一些事件在进化历程中被证明是安全的。在人类基因组有大量转座子的痕迹和转座子的作用位点。但是，人类基因组最具有意义的是19号染色体有一个AAV病毒的整合位点AAVS1（adeno-associated virus integration site1），其为基因组中AAV病毒基因组的整合位点（Future Virol. 2010 Sep 1;5(5):555-574.）。自然情况下，AAV仅仅整合在AAVS1；在离体选择条件下，超过75%的AAV ITR（inverted terminal repeat）附加的基因可以在rep蛋白指导下整合在AAVS1.

到目前为止我们已知AAV感染不与任何疾病相关，并且最近的研究发现AAV感染的细胞具有一定的抗病毒感染和抗肿瘤发生特性。重要的是这种结论是以成年人大于90%的AAV感染率为前提得出的，具有高度可靠性。

Rep蛋白和介导整合的顺式元件，位于AAV ITR或位于P5启动子内的16bp RBE（rep binding element），已经得到较为深刻的研究，可以构成可靠的定点整合转基因系统（Hum Gene Ther. 2010 ;21(6):728-38. Gene Ther. 2009 ;16(5):589-95.  J Mol Biol. 2006 ;358(1):38-45.）。

发明内容

本发明的目的在于提高一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用。

本发明提供的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒，含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架。具体的，该质粒含有一个由CMV启动子RBE元件TK1基因的筛选标记；RBE元件TK1基因的筛选标记序列采用常规分子生物学方法制备，并插入pN2-EF1α-hFIXml质粒的位点Kpn I和Not I之间，得到pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒，其序列见SEQ.ID.NO5所示。

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒和rep表达质粒pRC（J. Mol. Biol. 2006;385:38-45）共转染哺乳动物细胞，可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。携带有RBE顺式元件可以介导rep蛋白依赖的AAVS1位点整合；Neo正筛选基因可以用G418筛选获获得整合细胞；RBE元件位于TK1基因和启动子之间，用阿昔洛韦筛选可去除没有RBE参与的非定点整合细胞；最后获得定点整合于AAVS1位点稳定表达人凝血因子IX的细胞。

本发明提出的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒的构建方法，具体步骤为：

(1）构建pCMV-TK1重组质粒

将合成的携带XbaI和AflⅡ粘性末端的TK1基因DNA片段，通过DNA重组技术插入经XbaI和AflⅡ双酶切的pcNDA3.1(-)-MYC-HIS载体(Invitrogen)，获得pCMV-TK1质粒；TK1基因DNA片段见SEQ.ID.NO1所示；

(2）扩增“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段

以质粒pCMV-TK1为模板，用含Nhe I-RBE的上游引物（SEQ. ID.NO2）和含Sal I的下游引物（SEQ. ID.NO3）扩增获得Nhe I-RBE-TK1-BGHpA-Sal I  DNA片段；

(3）构建pN2-EF1α-hFIXml重组质粒

合成含启动子EF1α的人凝血因子FIX小基因（下文简称hFIXml）的DNA片段（下文简称“hFIXml双链DNA片段”），其5’ 端增加KpnI粘性酶切位点，在3’ 端增加NotI粘性酶切位点（SEQ.ID.NO4）；合成的携带KpnI和NotI粘性末端的hFIXml双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经KpnI和NotI双酶切的pEGFP-N2（Clontech），得到pN2-EF1α-hFIXml重组质粒；

(4）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒

 “NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经NheⅠ和SalⅠ双酶切的pN2-EF1α-hFIXml重组质粒，获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒（SEQ.ID.NO5）； 

上述构建的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒可以作进一步的应用：

（5）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒用Apl I消化，补平后连接获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS质粒，可用于在MCS位点插入重组基因； 

（6）建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系

合成的hFIX表达质粒pN2-EF1α-hFIXml-CMV-RBE-TK1和pRC质粒共同转染原代培养的成细胞，使用阿昔洛韦（aciclovir，ACV）和G418共同筛选，得到定点整合hFIX的亚细胞系。

使用该表达质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞，一方面正负双重筛选可以防止细胞随机突变导致的非整合细胞耐药对转基因细胞群纯净度的影响，提高表达效率；另一方面可以有效预防插入突变导致的基因突变和癌蛋白表达风险。通过常规分子生物学方法取代人类凝血因子IX表达框架可以构建表达其它基因的具有定点整合以及正负筛选的质粒。

本发明在筛选基因表达序列和启动子之间设计插入RBE整合元件；使用pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒和pRC共转染人类细胞，通过G418和阿昔洛韦双重筛选不仅可以去除非整合适应突变细胞，还可以去除非定点整合细胞。非定点整合细胞因为表达TK1而被阿昔洛韦杀死，通过RBE介导定点整合的细胞因为整合破坏了CMV启动子与TK1的连接关系，不表达TK1，不受阿昔洛韦影响。 

本发明的构建方法，采用常规分子生物学方法，所有中间产物和最后产品均已DNA测序认定。采用pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml与pRC共转染HEK293细胞，经过G418和阿昔洛韦筛选，可以获得定点整合于AAVS1位点，稳定表达hFIX的细胞系。

附图说明

图1：质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml结构示意图。质粒全长：9361 bp，主要元件：CMV启动子（1-585），RBEitr 整合元件（597-612），TK1基因（613-1743），EF1a启动子（2010-3196），hFIXml基因（3510-6027），Neomycin基因（7257-8051）。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。

实施例1：pCMV-TK1重组质粒的构建

1. 1 TK1基因扩增（PCR）及纯化

根据TK1 CDS序列（GenBank: V00470.1 ，310..1440，1131bp）设计特异性引物（见附录），同时，在5'和3'端分别加入酶切位点BamHI和HindⅢ。以HSV基因组为模板，两步法扩增出目的条带。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于克隆TK1 CDS的DNA序列： 

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

    使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收TK1 DNA片段。

1. 2 pCMV-TK1重组质粒构建

将扩增出的TK1片段酶切连接到pcDNA3.1(-)-MYC-HIS载体上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。

A. 双酶切反应

按照下表所示配制酶切体系，用于双酶切1. 1中扩增出的TK1 DNA序列： 

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段，并测量其浓度：载体片段浓度为47ng/μl，TK1基因片段浓度为188ng/μl。

B. 酶切后连接

按照下表所示配制连接体系，用于双酶切后目的片段与载体的连接： 

将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。

C.  转化感受态菌及涂板筛选

使用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌。

将连接液转化感受态大肠杆菌，于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

D. 纯化菌落鉴定

挑取C中30个菌落划线于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

E.  pCMV-TK1重组质粒小量制备及双酶切鉴定

挑取D中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测得浓度为574ng/μl。重组质粒pCMV_TK1为6549bp。

按照下表所示配制酶切体系，用于双酶切鉴定重组质粒pCMV_TK1：

 将上述体系放置在37℃烘箱中酶切40 min。

配制浓度为0.8%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

F.  pCMV_TK1重组质粒测序

送10ul质粒于Invitrogen公司测序。

实施例2：“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段扩增

根据重组质粒pCMV-TK1序列设计特异性引物（见附录），以扩增出-TK1-BGH poly A-片段，同时，在5' 端加入NheI酶切位点和16bp的RBE序列，在3' 端加入SalI酶切位点。以重组质粒pCMV-TK1为模板，两步法扩增出目的条带。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于扩增-Nhe

-RBE-TK1-BGHpoly A-Sal

- 片段：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。

送10ul质粒于Invitrogen公司测序。

实施例3：pN2-EF1α-hFIXml重组质粒的构建

3.1 PCR扩增-KpnI-EF1α-hF

-Not I-片段

根据EF1α启动子序列设计上游引物，并在目的片段5’端加上KpnI酶切位点，根据hF

ml序列设计下游引物，并在目的片段3’端加上NotI酶切位点，引物见附录，扩增出Kpn

-EF1α promoter-hF

ml-Not

片段，送测序。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于扩增目的序列：

按照下表所示程序进行PCR反应：

 

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。

送30ul质粒于Invitrogen公司测序。

3.2  pN2-EF1α-hFIXml重组质粒的构建

将扩增出的“-Kpn I-EF1α-hFIXml-Not I-”片段酶切连接到pEGFP-N2载体上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。

A.      pT-EF1α-hFIXml重组质粒构建

由于“-Kpn I-EF1α-hFIXml-Not I-”片段的NotI酶切位点保护碱基仅设计3核苷酸，酶切效率不高，故先连接到T载体上后再做双酶切。

a.      DNA A-Tailing反应

根据下表所示配制加“A”反应液，用于3.1中扩增出的"-Kpn I-EF1α-hFIXml-Not I-"片段3'末端加“A”：

放置72℃水浴锅中反应20min。冰中静置2min。

b.      T载体连接反应

根据下表所示配制T载体连接反应体系，用于A-Tailing DNA的"-Kpn I- EF1α-hFIXml-Not I-"片段与T载体的连接：

加入5ul（等量）的Solution I。16℃保温瓶中反应30min。

c.      转化感受态菌及涂板筛选

使用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌。

将全量（10ul）连接液转化感受态大肠杆菌，于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

d.      纯化菌落鉴定

挑取C中20个菌落划线于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

e.      pT- EF1α-hFIXml重组质粒小量制备

挑取d步骤中菌落PCR鉴定出的阳性克隆5#，于卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测得浓度为398ng/μl。重组质粒pT-EF1α-hFIXml约为6.7kb。

B. pN2-EF 1α-hFIXml重组质粒构建

a. 分步法双酶切反应

按照下表所示配制酶切体系，用于第一步分步双酶切3.1中扩增出的"-Kpn I- EF1α-hFIXml-Not I-"片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切8h。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

按照下表所示配制酶切体系，用于第二步分步双酶切回收产物片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

b. 酶切后连接

按照下表所示配制连接体系，用于双酶切后目的片段与载体的连接：

将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。

c.  转化感受态菌及涂板筛选

使用CaCl2法制备感受态大肠杆菌。

将连接液转化感受态大肠杆菌，于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

d.  纯化菌落鉴定

挑取c中20个菌落划线于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

e.      pN2- EF1α-hFIXml重组质粒小量制备及双酶切鉴定

挑取d步骤中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测定浓度。

实施例4：p CMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml构建

将扩增出的-NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI-片段分步双酶切连接到pN2-EF1α-hFIXml重组质粒上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。

4.1 分步法双酶切反应

按照下表所示配制酶切体系，用于第一步分步实施例2中扩增出的"-Nhe I-RBE-TK1-BGH poly A-Sal I-"片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切8h。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

按照下表所示配制酶切体系，用于第二步分步双酶切回收产物片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

4.2 酶切后连接

按照下表所示配制连接体系，用于双酶切后目的片段与载体的连接：

将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。

4.3 转化感受态菌及涂板筛选

根据CaCl₂方法制备感受态大肠杆菌（本实验室大量制备，于-70℃中冻存，可直接取用）。

连接液转化感受态大肠杆菌，于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

4.4纯化菌落鉴定

挑取4.3中20个菌落划线于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。（引物见附录2）

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

4.5 pCMV-TK1-N2-EF1α-hFIXml重组质粒小量制备

挑取4.4中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测定浓度。重组质粒pCMV-TK1-N2-EF1α-hFIXml为9361bp。

4.6 pCMV_TK1-N2-EF1α-hFIXml重组质粒测序

送10ul质粒于Invitrogen公司测序。

实施例5：p CMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS构建

在FIXml基因片段两端经点突变引入新的酶切位点，如Asc I、Pac I、Pvu I、Spe I或SwaI，从而可以替换其他基因片段以供研究应用。

实施例6：hFIX基因定点整合系统修饰细胞系建立

在六孔板中接种HEK293细胞，第二天细胞密度达到90%转染。pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml 2 ug+pRep 0.4 ug/孔，使用invitrogen公司的Lipofecamin Reagent进行转染。转染4小时后清洗细胞，换新鲜培养液。转然后24小时将细胞悬浮起来，进行适当稀释，转移至5cm培养皿中，添加含有600ug/ml 的G418和500ng/ml阿昔洛韦（aciclovir，ACV）的培养液进行筛选，筛选14天后可以得到TK1和Neo基因稳定整合的细胞克隆。

引物

<110>  复旦大学

<120>  一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用

<130>  001

<160>  21   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1131

<212>  DNA

<213>  

<400>  1

atggcttcgt accccggcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc     60

ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc    120

cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg    180

gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac    240

gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc    300

tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta    360

atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct    420

ccccatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc    480

ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc    540

agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc    600

acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc    660

cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg    720

ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga    780

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cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg   1020

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<210>  2

<211>  47

<212>  DNA

<213>  "NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI"片段扩增的上游引物

<400>  2

ttagctagcg agcgagcgag cgcgcatggc ttcgtacccc ggccatc                   47

 

 

<210>  3

<211>  42

<212>  DNA

<213>  "NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI"片段扩增的下游引物

<400>  3

cgcgtcgacc catagagccc accgcatccc cagcatgcct gc                        42

 

 

<210>  4

<211>  4032

<212>  DNA

<213>  KpnI -EF1α-hFIXml -NotI 片段序列

<400>  4

ggtaccgtga ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga     60

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ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg   1020

ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt   1080

ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc   1140

tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaggaattc   1200

ctgcagcccg ggggatccat gcagcgcgtg aacatgatca tggcagaatc accaggcctc   1260

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ttaaaataca ttgagtatgc ttgcctttta gatatagaaa tatctgatgc tgtcttcttc   1380

gctaaatttt gattacatga tttgacagca atattgaaga gtctaacagc cagcacgcag   1440

gttggtaagt actggttctt tgttagctag gttttcttct tcttcatttt taaaactaaa   1500

tagatcgaca atgcttatga tgcatttatg tttaataaac actgttcagt tcatgatttg   1560

gtcatgtaat tcctgttaga aaacattcat ctccttggtt taaaaaaatt aaaagtggga   1620

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taatttttta aattatatat cttcaattta aagttttagt taaaacataa agattaacct   1860

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<213>  

<400>  6

gctctagaat ggcttcgtac cccggccatc                                      30

 

 

<210>  7

<211>  31

<212>  DNA

<213>  

<400>  7

gcccttaagt cagttagcct cccccatctc c                                    31

 

 

<210>  8

<211>  47

<212>  DNA

<213>  

<400>  8

ttagctagcg agcgagcgag cgcgcatggc ttcgtacccc ggccatc                   47

 

 

<210>  9

<211>  42

<212>  DNA

<213>  

<400>  9

cgcgtcgacc catagagccc accgcatccc cagcatgcct gc                        42

 

 

<210>  10

<211>  22

<212>  DNA

<213>  

<400>  10

ctagcgctac cggactcaga tc                                              22

 

 

<210>  11

<211>  22

<212>  DNA

<213>  

<400>  11

gcctggtgat tctgccatga tc                                              22

 

 

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  

<400>  12

gtgaggctcc ggtgcccgtc                                                 20

 

 

<210>  13

<211>  23

<212>  DNA

<213>  

<400>  13

ggccatcttt ccgctcacgc aac                                             23

 

 

<210>  14

<211>  29

<212>  DNA

<213>  

<400>  14

ttaggtaccg tgaggctccg gtgcccgtc                                       29

 

 

<210>  15

<211>  45

<212>  DNA

<213>   

<400>  15

cccgcggccg cttaagtgag ctttgttttt tccttaatcc agttg                     45

 

 

<210>  16

<211>  21

<212>  DNA

<213>  

<400>  16

ctctcccacc cacttccaac g                                               21

 

 

<210>  17

<211>  24

<212>  DNA

<213>  

<400>  17

ggggagaacc gtatataagt gcag                                            24

 

 

<210>  18

<211>  23

<212>  DNA

<213>  

<400>  18

aatcaccagg cctcatcacc atc                                             23

 

 

<210>  19

<211>  22

<212>  DNA

<213>  

<400>  19

ctgcgtgctg gctgttagac tc                                              22

 

 

<210>  20

<211>  22

<212>  DNA

<213>  

<400>  20

accgacgccg ttctggctcc tc                                              22

 

 

<210>  21

<211>  23

<212>  DNA

<213>  

<400>  21

ccggaagggc cccaagcacg atg                                             23

 

 

Claims (3)

1.一种含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架的质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其特征在于该质粒含有一个由CMV启动子RBE元件TK1基因的筛选标记；所述RBE元件TK1基因的筛选标记序列采用常规分子生物学方法制备并插入pN2-EF1α-hFIXml质粒的位点Kpn I和Not I之间得到质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其序列为SEQ.ID.NO5所示。

2.一种如权利要求1所述的质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml的构建方法，其特征在于具体步骤为：

(1）构建pCMV-TK1重组质粒

将合成的携带XbaI和AflⅡ粘性末端的TK1基因DNA片段，通过DNA重组技术插入经XbaI和AflⅡ双酶切的pcNDA3.1(-)-MYC-HIS载体(Invitrogen)，获得pCMV-TK1质粒；TK1基因DNA片段见SEQ.ID.NO1所示；

(2）扩增“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段

以质粒pCMV-TK1为模板，用含Nhe I-RBE的上游引物和含Sal I的下游引物扩增获得Nhe I-RBE-TK1-BGHpA-Sal I  DNA片段；所述上游引物为SEQ. ID.NO2所示，所述下游引物为SEQ. ID.NO3所示；

(3）构建pN2-EF1α-hFIXml重组质粒

合成含启动子EF1α的人凝血因子FIX小基因的DNA片段，其5’端增加KpnI粘性酶切位点，在3’端增加NotI粘性酶切位点；合成的携带KpnI和NotI粘性末端的hFIXml双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经KpnI和NotI双酶切的pEGFP-N2（Clontech），得到pN2-EF1α-hFIXml重组质粒； 

(4）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒

 “NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经NheⅠ和SalⅠ双酶切的pN2-EF1α-hFIXml重组质粒，获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒，其序列为SEQ.ID.NO5所示。

3.如权利要求1所述的质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml在建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系中的应用，其特征在于具体步骤为： 

（1）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒用Apl I消化，补平后连接获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS质粒，用于在MCS位点插入重组基因； 

（2）建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系

合成的hFIX表达质粒pN2-EF1α-hFIXml-CMV-RBE-TK1和pRC质粒共同转染原代培养的成细胞，使用阿昔洛韦和G418共同筛选，得到hFIX基因定点整合系统修饰细胞系。

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