CN109321571A - 一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法 - Google Patents

一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109321571A
CN109321571A CN201811083026.1A CN201811083026A CN109321571A CN 109321571 A CN109321571 A CN 109321571A CN 201811083026 A CN201811083026 A CN 201811083026A CN 109321571 A CN109321571 A CN 109321571A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
virus
crispr
cas9
screening
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811083026.1A
Other languages
English (en)
Inventor
徐高原
孙芳
周明光
张华伟
郝根喜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Original Assignee
WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd filed Critical WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority to CN201811083026.1A priority Critical patent/CN109321571A/zh
Publication of CN109321571A publication Critical patent/CN109321571A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16721—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法。本发明利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，向PRV的gE编码区引入荧光蛋白的编码序列，成功筛选到阳性重组病毒后再用同样的技术将荧光蛋白基因替换为一段无关序列(长500bp的LysC序列)，形成插入突变，使PRV的gE蛋白表达缺失。本发明利用荧光蛋白从无到有、再从有到无的可视化筛选，简化了筛选程序，提高了重组病毒构建的效率，缩短了实验周期。并通过在猪伪狂犬病毒(PRV)的gE编码区引入插入突变，使制备的重组病毒可用作PRV减毒疫苗的研发，同时该无关序列可以用作免疫毒和野生毒的鉴别诊断。

Description

一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法。
背景技术
公开号为CN106929485A的中国专利申请，公开了伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用。该技术方案中所用到的噬斑筛选技术为盲目筛选，筛选到重组病毒为纯粹概率事件，筛选后经过病毒扩增培养提取基因组进行PCR检测，工作量较大。
公开号为CN104894075A的中国专利申请，公开了CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用。该技术方案利用两种基因编辑技术，前期构建克隆工作繁琐且工作量大。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，克服现有技术中重组病毒筛选和纯化的过程盲目、繁琐、工作量大的缺点，以及使用两套基因编辑技术，思路和操作都较为复杂，工作量较大的缺点，本发明的目的是提供一种仅使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过先后在PRV的gE编码区插入荧光标记序列和无关序列，以实现操作简便、提高筛选效率的目的。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法。所述方法用于快速构建一个重组猪伪狂犬病毒，使其结构蛋白gE表达缺失。
所述构建思路如图1所示，所述方法包括如下步骤：
(1)利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬病毒基因组gE编码区的特定位置断裂。
(2)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带荧光标记序列的同源重组模板，在断裂位置插入荧光标记序列；
所述荧光标记可以是本领域常用的荧光标记，例如绿色荧光蛋白EGFP、红色荧光蛋白mCherry、黄色荧光蛋白YFP等，本发明以EGFP为例作为示例性说明。
本发明通过加入了荧光标记序列，使得重组成功的病毒会表达EGFP绿色荧光蛋白，在噬斑筛选时只需要挑选有绿色荧光的噬斑直接接种到细胞中进行下一轮纯化即可，该可视化筛选方案大大提高的重组病毒的筛选效率并减少了重组病毒纯化的工作量。
(3)利用噬斑筛选技术，筛选有荧光的噬斑接种到细胞中进行纯化筛选得到荧光序列成功重组的病毒，命名为PRV-EGFP/gE-。
(4)利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬重组病毒PRV-EGFP/gE-基因组在步骤(1)相同的位置再次断裂(与第一次断裂使用同样的sgRNA)。
(5)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带无关序列的同源重组模板，在断裂位置插入无关序列。
(6)筛选无荧光的病毒，所得病毒即为gE蛋白表达缺失的重组病毒。
本发明仅利用CRISPR/Cas9单个基因编辑系统，即可完成伪狂犬病毒基因组的重组。重组病毒筛选和纯化过程均为可视化操作，操作简单，工作量小，适合条件有限的实验室采用。本发明通过采用插入突变而不是直接缺失编码区，可以通过PCR鉴定插入序列，而不用检测gE蛋白的表达，为鉴别诊断提供更简便的方法。
作为优选，所述sgRNA的靶向序列为GGATCTGGACGTTCCTGCCC。经实验研究发现，该sgRNA具有较高的打靶效率、较低的脱靶效应。
可选的，本发明所述无关序列采用如SEQ ID NO.1所示的LysC序列，并将筛选无荧光的病毒，命名为PRV-LysC/gE-。
本领域技术人员应当理解，所述荧光标记序列的上游带有启动子。
作为优选，所述荧光标记序列的上游带有CMV增强子和启动子。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，向PRV的gE编码区引入荧光蛋白的编码序列，成功筛选到阳性重组病毒后再用同样的技术(基因编辑技术CRISPR/Cas9)将荧光蛋白基因替换为一段无关序列(长500bp的LysC序列)，形成插入突变，使PRV的gE蛋白表达缺失。
本发明利用荧光蛋白从无到有、再从有到无的可视化筛选，简化了筛选程序，提高了重组病毒构建的效率，缩短了实验周期。并通过在猪伪狂犬病毒(PRV)的gE编码区引入插入突变，使制备的重组病毒可用作PRV减毒疫苗的研发，同时该无关序列可以用作免疫毒和野生毒的鉴别诊断。
本发明还利用病毒与细胞生物学中的噬斑筛选技术，纯化出高纯度的重组病毒。
附图说明
图1为本发明所述方法的简要示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
实验材料：ST细胞为猪睾丸细胞系(ATCC ID:CRL-1746)；同源重组模板载体FLAG-HA-pcDNA3.1(Addgene ID 52535以下简称pcDNA3.1)，PCR预混体系primestar购自Takara(R045)；T4连接酶及缓冲液购自全式金生物公司(FL101)；核酸分子量MarkerDM1000购自康为世纪(CW0634)；质粒小提试剂盒购自OMEGA(D6943-02)；DNA凝胶回收试剂盒OMEGA(D2500-02)；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司(1803716)，所有的核酸内切酶购自大连宝生物。
同源重组模板以FLAG-HA-pcDNA3.1为载体，由以下三部分组成：上游同源臂gE1，带有CMV增强子和启动子的EGFP，下游同源臂gE2。
上游同源臂gE1如SEQ ID NO.2所示，序列长度为861bp，序列组成为：gI编码序列3’端434bp，gI与gE编码序列之间的105bp非编码序列，gE编码区的第1-324bp。
带有CMV增强子和启动子的EGFP如SEQ ID NO.3所示，：CMV增强子和启动子的序列为552bp，EGFP序列长度为720bp。
下游同源臂gE2如SEQ ID NO.4所示，序列长度为876bp，由gE编码区的第325-1200bp组成。
所述gE编码区如SEQ ID NO.5所示。
1、基因编辑所需相关质粒构建。
sgRNA及其引物序列：
sgRNA-F：5’-CACCGGGGCAGGAACGTCCAGATCC-3’；
sgRNA-R：5’-AAACGGATCTGGACGTTCCTGCCCC-3’。
sgRNA和Cas9表达载体为pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)(AddgeneID 42335以下简称pX335-Cas9n)；构建的打靶载体为pX335-Cas9-sggE。
该sgRNA与PRV基因组中gE编码区的第323-343位碱基互补配对，Cas9在sgRNA的引导下将PRV基因组gE编码区的第325-326位碱基之间“剪断”。
1.1 pX335-Cas9-sggE的构建方法
1.1.1退火：
sgRNA-F 3.5μL(10umol)
sgRNA-R 3.5μL(10umol)
T4连接酶 2μL
水 11μL
退火条件：37℃ 30min，
95℃ 5min，
每5min降低5℃，直至25℃。
1.1.2酶切：
pX335-Cas9 2μg
Bbs1(Bpil) 1μL
Green buffer 2μL
水 将体系总体积补充至20μL
酶切条件：37℃水浴消化1h。
酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，操作步骤按照胶回收试剂盒的标准步骤进行操作。
1.1.3连接：
连接条件：22℃2h。
1.1.4转化：
将连接产物加入到100μL DH5α感受态细胞中，冰浴25min，42℃热激1min，再放回到冰上冰浴2min，加入500μL SOC培养液，置于37℃摇床复苏1h后，将培养物均匀涂于带氨苄抗性的细菌培养平板上，37℃培养过夜。
挑取单克隆菌落，接至5ml无菌氨苄抗性的LB培养基中，37℃摇床摇10h左右，用质粒提取试剂盒抽提质粒，抽提步骤详见试剂盒说明书。
将抽提的质粒送至测序公司测序。
1.2同源臂重组模板的构建方法
PCR分别扩增上游同源臂、EGFP、LysC500、下游同源臂。
EGFP上游同源臂扩增引物为：
UP-XbaI-F：5’-GCTCTAGACCGGCGCCACCCCCGAGCCCCGAT-3’；
UP EGFP-R：
5’-TCCTCGCCCTTGCTCACCATCCCGGCCAGCACGGCGCCGT-3’；
EGFP扩增引物为：
EGFP-F：5’-ACGGCGCCGTGCTGGCCGGGCGTTACATAACTTACGGTAA-3’；
EGFP-R：5’-ACGGGCAGGAACGTCCAGATCTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’；
EGFP下游同源臂的扩增引物为：
Down-GFP-F：
5’-TGGACGAGCTGTACAAGTAGATCTGGACGTTCCTGCCCGT-3’；
Down-R：5’-CCCAAGCTTGCCGCCGCCGGGGCCCCA-3’；
LysC500上游同源臂扩增引物为：
UP-F：5’-GCTCTAGACCGGCGCCACCCCCGAGCCCCGAT-3’；
UP-LysC500-R：5’-CACAATATCA GCGCTGCGGTCCCGGCCAGC
ACGGCGCCGT-3’；
LysC500扩增引物为：
LysC500-F：5’-ACGGCGCCGT GCTGGCCGGG ACCGCAGCGC TGATATTGTG-3’；
LysC500-R：5’-ACGGGCAGGAACGTCCAGATGCTACCGATA AATCCCT-3’；
LysC500下游同源臂的扩增引物为：
Down-LysC500-F：5’-AGGGATTTAT CGGTAGCATC TGGACGTTCC TGCCCGT-3’；
Down-HindIII-R：5’-CCCAAGCTTGCCGCCGCCGGGGCCCCA-3’。
PCR扩增GFP/LysC上游同源臂：
反应体系：
PCR扩增GFP/LysC：
反应体系：
PCR扩增GFP/LysC下游同源臂：
反应体系：
PCR反应程序按照Primestar MaxMix说明书要求进行。
上述三个片段扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
重叠延伸PCR扩增gE1-GFP/LysC-gE2：
PCR反应程序按照Primestar MaxMix说明书要求进行。
琼脂糖电泳回收PCR产物；用XbaI和HindIII酶切回收产物，酶切体系：
酶切质粒载体体系：
37℃消化2h
回收酶切产物。
连接、转化方法同pX335-Cas9-sggE的构建。
2、利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬病毒基因组gE编码区的特定位置断裂；利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带启动子和荧光标记序列的同源重组模板，在断裂位置插入EGFP编码基因。
同源重组模板用高保真酶，以pcDNA3.1-gE1-EGFP-gE2为模板进行PCR来获得。
将同源重组模板gE1-EGFP-gE2、pX335-Cas9-sggE、PRV病毒基因组利用脂质体lipo2000转染的方法共转入6孔板的ST细胞中。转染后48-72h观察病变和绿色荧光，有绿色荧光且有病变的形成的细胞处即为重组成功的PRV-EGFP/gE-病毒。
3、利用噬斑筛选技术，筛选有荧光的噬斑接种到细胞中进行纯化筛选得到荧光序列成功重组的病毒PRV-EGFP/gE-。
细胞病变后将转染物反复冻融两次后接种到6孔板的ST细胞中，进行噬斑筛选试验。步骤如下：使ST细胞在6孔板中长满单层；
取反复冻融后的转染物用无血清DMEM 10倍比稀释，分别稀释到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6；
将6孔板中的培养基吸弃，分别加入1ml稀释好的病毒液；
37℃吸附4h(期间将低熔点琼脂糖70℃熔化后与含2％青霉素-链霉素、6％新生牛血清的2×DMEM1：1混合，置于37℃培养箱保温待用)；
将病毒液吸弃，并用无菌PBS洗细胞一次，没孔加入2ml低熔点琼脂糖和2×DMEM的混合液，4℃静置10min充分凝固；
36-72h内观察细胞病变和绿色荧光，从可以挑出单个空斑的孔中，吸取空斑处的培养物，吹打入500μL无血清、2％双抗的DMEM中，反复冻融两次；
将挑取的空斑培养物接种到12/24孔板的ST中扩大培养，培养物进行下一轮空斑筛选，通过观察病变和荧光直至病毒纯度100％。
筛选有荧光的病毒，命名为PRV-EGFP/gE-。
4、利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬重组病毒PRV-EGFP/gE-基因组在步骤1相同的位置再次断裂(与第一次断裂使用同样的sgRNA)；利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带LysC序列的同源重组模板，在断裂位置插入LysC序列。
同源重组模板用高保真酶，以pcDNA3.1-gE1-LysC-gE2为模板进行PCR来获得。
将同源重组模板gE1-LysC-gE2、pX335-Cas9-sggE、PRV病毒基因组利用脂质体lipo2000转染的方法共转入6孔板的ST细胞中。
5、转染后48-72h观察病变和绿色荧光，无绿色荧光且有病变形成的细胞处即为重组成功的PRV-LysC/gE-病毒。筛选无荧光的病毒(筛选方法同步骤3)，命名为PRV-LysC/gE-，即为本发明预期获得的重组病毒。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法
<141> 2018-07-11
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accgcagcgc tgatattgtg ctttctgatg ccaacgtgcg tttagttgtc ctctcggctt 60
ctgctggtat cactaatctg ctggtcgctt tagctgaagg actggaacct tgcgagcgat 120
tcgaaaaact cgacgctatc cgcaacatcc agtttgccat tctggaacgt ctgcgttacc 180
cgaacgttat ccgtgaagag attgaacgtc tgctggagaa cattactgtt ctggcagaag 240
cggcggcgct ggcaacgtct ccggcgctga cagatgagct ggtcagccac ggcgagctga 300
tgtcgaccct gctgtttgtt gagatcctgc gcgaacgcga tgttcaggca cagtggtttg 360
atgtgcgtaa agtgatgcgt accaacgacc gatttggtcg tgcagagcca gatatagccg 420
cgctggcgga actggccgcg ctgcagctgc tcccacgtct caatgaaggc ttagtgatca 480
cccagggatt tatcggtagc 500
<210> 2
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccggcgccac ccccgagccc cgatcggacg aggaggagga gggtgacgcg gagacgacga 60
cgccgacgct gaccccggca cccgggaccc tggacgcgaa cggcacgatg gtgctgaacg 120
ccagcgtcgt gtcgcgcgtc ctgctcgccg ccgccaacgc cacggcgggc gcccggagcc 180
ccgggaagat agccatggtg ctggggccca cgatcgtcgt cctcctgatc ttcctgggcg 240
ggatcgcctg cgtggcccgg cgctgcgcgc ggaatcgcat ctaccggccg cgacccgggc 300
gcggatcggc ggtccatgcg gcgcccccgc ggcgcccgcc ccccaacccc gtcgccgggg 360
cgcccgtccc ccagcccaag atgacgttgg ccgagctgcg ccagaagctc gccaccatcg 420
cagaagaaca ataaaaaggt ggtgtttgca taattttgtg ggtggcgttt tatctccgtc 480
cgcgccgttt taaacctggg cacccccgcg agtctcgcac acaccggggt tgagaccatg 540
cgaccctttc tgctgcgcgc cgcgcagctc ctggcgctgc tggccctggc gctctccacc 600
gaggccccga gcctctccgc cgagacgacc ccgggccccg tcaccgaggt cccgagtccc 660
tcggccgagg tctgggacga cctctccacc gaggccgacg acgatgacct caacggcgac 720
ctcgacggcg acgaccgccg cgcgggcttc ggctcggccc tcgcatccct gagggaggcg 780
cccccggccc atctggtgaa cgtgtccgag ggcgccaact tcaccctcga cgcgcgcggc 840
gacggcgccg tgctggccgg g 861
<210> 3
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 540
ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 600
gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 660
gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 720
ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 780
gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 840
cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 900
ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 960
atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 1020
aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 1080
gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 1140
cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 1200
gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 1260
ctgtacaagt aa 1272
<210> 4
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atctggacgt tcctgcccgt ccgcggctgc gacgccgtgt cggtgaccac ggtgtgcttc 60
gagaccgcgt gccacccgga cctggtgctg ggccgcgcct gcgtccccga ggccccggag 120
atgggcatcg gcgactacct gccgcccgag gtgccgcggc tccggcgcga gccgcccatc 180
gtcaccccgg agcggtggtc gccgcacctg agcgtcctgc gggccacgcc caacgacacg 240
ggcctctaca cgctgcacga cgcctcgggg ccgcgggccg tgttctttgt ggcggtgggc 300
gaccggccgc ccgcgccggc ggacccggtg ggccccgcgc gccacgagcc ccgcttccac 360
gcgctcggct tccactcgca gctcttctcg cccggggaca cgttcgacct gatgccgcgc 420
gtggtctcgg acatgggcga ctcgcgcgag aactttaccg ccacgctgga ctggtactac 480
gcgcgcgcgc ccccgcggtg cctgctgtac tacgtgtacg agccctgcat ctaccacccg 540
cgcgcgcccg agtgcctgcg cccggtggac ccggcgtgca gcttcacctc gccggcgcgc 600
gcgcggctgg tggcgcgccg cgcgtacgcc tcgtgcagcc cgctgctcgg ggaccggtgg 660
ctgaccgcct gccccttcga cgccttcggc gaggaggtgc acacgaacgc caccgcggac 720
gagtcggggc tgtacgtgct cgtgatgacc cacaacggcc acgtcgccac ctgggactac 780
acgctcgtcg ccaccgcggc cgagtacgtc acggtcatca aggagctgac ggccccggcc 840
cgggccccgg gcaccccgtg gggccccggc ggcggc 876
<210> 5
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcgaccct ttctgctgcg cgccgcgcag ctcctggcgc tgctggccct ggcgctctcc 60
accgaggccc cgagcctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt 120
ccctcggccg aggtctggga cgacctctcc accgaggccg acgacgatga cctcaacggc 180
gacctcgacg gcgacgaccg ccgcgcgggc ttcggctcgg ccctcgcatc cctgagggag 240
gcgcccccgg cccatctggt gaacgtgtcc gagggcgcca acttcaccct cgacgcgcgc 300
ggcgacggcg ccgtgctggc cgggatctgg acgttcctgc ccgtccgcgg ctgcgacgcc 360
gtgtcggtga ccacggtgtg cttcgagacc gcgtgccacc cggacctggt gctgggccgc 420
gcctgcgtcc ccgaggcccc ggagatgggc atcggcgact acctgccgcc cgaggtgccg 480
cggctccggc gcgagccgcc catcgtcacc ccggagcggt ggtcgccgca cctgagcgtc 540
ctgcgggcca cgcccaacga cacgggcctc tacacgctgc acgacgcctc ggggccgcgg 600
gccgtgttct ttgtggcggt gggcgaccgg ccgcccgcgc cggcggaccc ggtgggcccc 660
gcgcgccacg agccccgctt ccacgcgctc ggcttccact cgcagctctt ctcgcccggg 720
gacacgttcg acctgatgcc gcgcgtggtc tcggacatgg gcgactcgcg cgagaacttt 780
accgccacgc tggactggta ctacgcgcgc gcgcccccgc ggtgcctgct gtactacgtg 840
tacgagccct gcatctacca cccgcgcgcg cccgagtgcc tgcgcccggt ggacccggcg 900
tgcagcttca cctcgccggc gcgcgcgcgg ctggtggcgc gccgcgcgta cgcctcgtgc 960
agcccgctgc tcggggaccg gtggctgacc gcctgcccct tcgacgcctt cggcgaggag 1020
gtgcacacga acgccaccgc ggacgagtcg gggctgtacg tgctcgtgat gacccacaac 1080
ggccacgtcg ccacctggga ctacacgctc gtcgccaccg cggccgagta cgtcacggtc 1140
atcaaggagc tgacggcccc ggcccgggcc ccgggcaccc cgtggggccc cggcggcggc 1200
gacgacgcga tctacgtgga cggcgtcacg acgccggcgc cgcccgcgcg cccgtggaac 1260
ccgtacggcc ggacgacgcc cgggcggctg tttgtgctgg cgctgggctc cttcgtgatg 1320
acgtgcgtcg tcgggggggc catctggctc tgcgtgctgt gctcccggcg ccgggcggcc 1380
tcgcggccgt tccgggtgcc gacgcgggcg cggacgcaca tgctctctcc ggtgtacacc 1440
agcctgccca cgcacgagga ctactacgac ggcgacgacg acgacgacga ggaggcgggc 1500
gtcatccgcc ggcggcccgc ctcccccggc ggagacagcg gctacgaggg gccgtacgcg 1560
agcctggacc ccgaggacga gttcagcagc gacgaggacg acgggctgta cgtgcgcccc 1620
gaggaggcgc cccgctccgg cttcgacgtc tggttccgcg atccggagaa accggaagtg 1680
acgaatggac ccaactatgg cgtgaccgcc aaccgcctgt tgatgtcccg ccccgcttaa 1740
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccggggca ggaacgtcca gatcc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacggatct ggacgttcct gcccc 25
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctctagacc ggcgccaccc ccgagccccg at 32
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcctcgccct tgctcaccat cccggccagc acggcgccgt 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acggcgccgt gctggccggg cgttacataa cttacggtaa 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgggcagga acgtccagat ctacttgtac agctcgtcca 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggacgagct gtacaagtag atctggacgt tcctgcccgt 40
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gccgccgccg gggcccca 18
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccggcgccac ccccgagccc cgat 24
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cacaatatca gcgctgcggt cccggccagc acggcgccgt 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acggcgccgt gctggccggg accgcagcgc tgatattgtg 40
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgggcagga acgtccagat gctaccgata aatccct 37
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agggatttat cggtagcatc tggacgttcc tgcccgt 37
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cccaagcttg ccgccgccgg ggcccca 27

Claims (7)

1.一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)利用CRISPR/Cas9系统使猪伪狂犬病毒基因组gE编码区的特定位置发生断裂；
(2)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带荧光标记序列的同源重组模板，在断裂位置插入荧光标记序列；
(3)利用噬斑筛选技术，筛选有荧光的噬斑，接种到细胞中进行纯化，筛选得到荧光标记序列成功重组的病毒；
(4)利用CRISPR/Cas9系统使步骤(3)所得的病毒的基因组在与步骤(1)所述特定位置相同的位置再次发生断裂；
(5)利用细胞内同源重组的基因修复系统，向细胞提供带无关序列的同源重组模板，在断裂位置插入无关序列；
(6)利用噬斑筛选技术，筛选无荧光的噬斑接种到细胞中进行纯化，得到无关序列成功重组、gE蛋白表达缺失的重组猪伪狂犬病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(4)的CRISPR/Cas9系统采用相同的sgRNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶向序列为GGATCTGGACGTTCCTGCCC。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述无关序列为如SEQ ID NO.1所示的LysC序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记序列选自绿色荧光EGFP、红色荧光mCherry、或黄色荧光YFP。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记序列的上游带有启动子。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记序列上游带有CMV增强子和启动子。
CN201811083026.1A 2018-09-17 2018-09-17 一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法 Pending CN109321571A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811083026.1A CN109321571A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811083026.1A CN109321571A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109321571A true CN109321571A (zh) 2019-02-12

Family

ID=65266217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811083026.1A Pending CN109321571A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109321571A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110331171A (zh) * 2019-07-11 2019-10-15 华中农业大学 一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法
CN111117974A (zh) * 2019-12-20 2020-05-08 华南农业大学 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法
CN111500633A (zh) * 2020-04-07 2020-08-07 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法
CN112280753A (zh) * 2020-10-23 2021-01-29 武汉科前生物股份有限公司 一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894075A (zh) * 2015-05-28 2015-09-09 华中农业大学 CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用
CN106929485A (zh) * 2017-03-31 2017-07-07 中国农业科学院上海兽医研究所 伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用
CN107129999A (zh) * 2017-05-09 2017-09-05 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894075A (zh) * 2015-05-28 2015-09-09 华中农业大学 CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用
CN106929485A (zh) * 2017-03-31 2017-07-07 中国农业科学院上海兽医研究所 伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用
CN107129999A (zh) * 2017-05-09 2017-09-05 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REN LIN-ZHU等: "《Subculturing cells have no effect on CRISPR/Cas9-mediated cleavage of UL30 gene in pseudorabies virus》", 《ANIMAL MODELS AND EXPERIMENTAL MEDICINE》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110331171A (zh) * 2019-07-11 2019-10-15 华中农业大学 一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法
CN111117974A (zh) * 2019-12-20 2020-05-08 华南农业大学 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法
CN111117974B (zh) * 2019-12-20 2022-02-22 华南农业大学 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法
CN111500633A (zh) * 2020-04-07 2020-08-07 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法
CN112280753A (zh) * 2020-10-23 2021-01-29 武汉科前生物股份有限公司 一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用
CN112280753B (zh) * 2020-10-23 2022-07-19 武汉科前生物股份有限公司 一种伪狂犬病病毒TK、gE、gI和gG基因缺失株及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109321571A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9制备重组猪伪狂犬病毒的方法
WO2015100929A1 (zh) 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法
CN110295149B (zh) 一种突变株3型鸭甲肝病毒ch-p60-117c株及构建方法
CN112961219B (zh) 重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用
CN112029736B (zh) 一种预防非洲猪瘟重组伪狂犬病病毒活疫苗及其制备方法
CN114350615B (zh) Stat2基因缺失细胞株及其制备方法和应用
CN110218732B (zh) 一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用
CN114369619A (zh) 基因敲除用报告载体和载体系统及应用
CN106591366A (zh) 一种快速筛选sgRNA的基因敲除试剂盒及方法
CN101121939B (zh) siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体
CN109456991B (zh) 原儿茶酸调控的开关系统及其调控方法和应用
CN113549656A (zh) 一种用于多基因转化的慢病毒载体表达系统
CN110295180B (zh) 一种3型鸭甲肝病毒突变基因isa-a117c-c4334a及构建方法
CN110684781B (zh) 一种3型鸭甲肝病毒突变基因isa-a117c-t1142a及构建方法
CN103131709B (zh) zfx基因的RNA干扰片段及其控制小鼠性别的应用
CN110747232A (zh) 一种长效稳定表达的杆状病毒载体及其构建方法
CN109371167A (zh) 用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用
CN109456992B (zh) 原儿茶酸调控的多功能基因表达平台及其应用
CN114395017A (zh) SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法及其应用
CN110484546B (zh) 一种3型鸭甲肝病毒突变基因isa-c4334a及构建方法
CN110283835B (zh) 一种3型鸭甲肝病毒突变基因isa-t1142a-c4334a及构建方法
CN110295148A (zh) 一种快速构建3型鸭甲肝病毒反向遗传株的方法
CN103409464B (zh) 一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用
CN104195153A (zh) 一种双顺反子共表达基因转移体及制备方法
CN110283836B (zh) 一种3型鸭甲肝病毒突变基因isa-t1142a及构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190212

RJ01 Rejection of invention patent application after publication