CN101121939B - siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，该载体以pEGFP-C1载体为基础，包括人巨细胞病毒CMV启动子，增强的绿色荧光蛋白基因EGFP，单纯疱疹病毒HSV胸苷激酶TK多腺苷酸化信号，SV40早期启动子组成元件，在1336-1363增加SSe8387I和NotI两个内切酶位点，其载体大小为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi。本发明通过检测荧光强度可以非常方便快速地鉴定相应siRNA序列的沉默效果，从而筛选出最有效的siRNA序列。
Description
技术领域
本发明属生物医学领域，特别涉及siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体。
现有技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是涉及基因功能、基因治疗、药物靶分子筛选等领域的重要研究手段。其中，筛选具有生物活性的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是RNAi技术应用的关键步骤。目前，商品化的RNAi筛选系统以lac为报告基因，与靶基因序列重组构建融合基因表达载体。
(1)目前有invitrogen公司开发的商品化的RNAi目标筛选系统-------BLOCK-IT RNAi目标筛选系统。该筛选系统工作原理为：从任一Gateway中间载体或Ultimate ORF克隆重组目的基因到pSCREEN-IT/lacZ-DEST Gateway载体，并使用RNAi抑制试剂进行共转染。表达基因将与lacZ融合。通过分析检测β-半乳糖苷酶的活性，将产生的结果与从qRT-PCR获得的结果进行比较。β-半乳糖苷酶水平是目的基因RNAi诱导降解量的指示剂，β-半乳糖苷酶的水平越低，介导RNAi试剂的效果就越好。该筛选系统的不足之处在于：需要的实验步骤与实验试剂过多，不能直接从细胞内检测到筛选效果，而需要单独的半乳糖苷酶量化试剂盒，步骤繁多，而且价格昂贵，不适于大面积推广
(2)Xiu-Min ZHOU，Ju-Sheng LIN，Yi SHI，et al. Establishment of aScreening System for Selection of siRNA Target Sites Directed againstHepatitis B V
发明内容
为了克服上述现有技术不足，本发明的目的就是提供siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，通过检测荧光强度可以非常方便快速地鉴定相应siRNA序列的沉默效果，从而筛选出最有效的siRNA序列。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明包括该载体以pEGFP-C1载体为基础，在1336-1363改造SSe8387I和NotI两个内切酶位点，其载体大小为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi，序列如下：
1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG
61 CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT
121 GACGTCAATA ATGAGGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
181 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC
241 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
301 CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC
361 CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG
421 ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
481 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT
541 ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA
601 CCGGTCGCCA CCATGGTGAG CAAGGGCGAG GAGCTGTTCA CCGGGGTGGT GCCCATCCTG
661 GTCGAGCTGG ACGGCGACGT AAACGGCCAC AAGTTCAGCG TGTCCGGCGA GGGCGAGGGC
721 GATGCCACCT ACGGCAAGCT GACCCTGAAG TTCATCTGCA CCACCGGCAA GCTGCCCGTG
781 CCCTGGCCCA CCCTCGTGAC CACCCTGACC TACGGCGTGC AGTGCTTCAG CCGCTACCCC
841 GACCACATGA AGCAGCACGA CTTCTTCAAG TCCGCCATGC CCGAAGGCTA CGTCCAGGAG
901 CGCACCATCT TCTTCAAGGA CGACGGCAAC TACAAGACCC GCGCCGAGGT GAAGTTCGAG
961 GGCGACACCC TGGTGAACCG CATCGAGCTG AAGGGCATCG ACTTCAAGGA GGACGGCAAC
1021 ATCCTGGGGC ACAAGCTGGA GTACAACTAC AACAGCCACA ACGTCTATAT CATGGCCGAC
1081 AAGCAGAAGA ACGGCATCAA GGTGAACTTC AAGATCCGCC ACAACATCGA GGACGGCAGC
1141 GTGCAGCTCG CCGACCACTA CCAGCAGAAC ACCCCCATCG GCGACGGCCC CGTGCTGCTG
1201 CCCGACAACC ACTACCTGAG CACCCAGTCC GCCCTGAGCA AAGACCCCAA CGAGAAGCGC
1261 GATCACATGG TCCTGCTGGA GTTCGTGACC GCCGCCGGGA TCACTCTCGG CATGGACGAG
1321 CTGTACAAGT CCGGACCTGC AGGGAATTCC TCGAGGCGGC CGCATTCTAG ATAACTGATC
1381 ATAATCAGCC ATACCACATT TGTAGAGGTT TTACTTGCTT TAAAAAACCT CCCACACCTC
1441 CCCCTGAACC TGAAACATAA AATGAATGCA ATTGTTGTTG TTAACTTGTT TATTGCAGCT
1501 TATAATGGTT ACAAATAAAG CAATAGCATC ACAAATTTCA CAAATAAAGC ATTTTTTTCA
1561 CTGCATTCTA GTTGTGGTTT GTCCAAACTC ATCAATGTAT CTTAACGCGT AAATTGTAAG
1621 CGTTAATATT TTGTTAAAAT TCGCGTTAAA TTTTTGTTAA ATCAGCTCAT TTTTTAACCA
1681 ATAGGCCGAA ATCGGCAAAA TCCCTTATAA ATCAAAAGAA TAGACCGAGA TAGGGTTGAG
1741 TGTTGTTCCA GTTTGGAACA AGAGTCCACT ATTAAAGAAC GTGGACTCCA ACGTCAAAGG
1801 GCGAAAAACC GTCTATCAGG GCGATGGCCC ACTACGTGAA CCATCACCCT AATCAAGTTT
1861 TTTGGGGTCG AGGTGCCGTA AAGCACTAAA TCGGAACCCT AAAGGGAGCC CCCGATTTAG
1921 AGCTTGACGG GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGAGC
1981 GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT CACGCTGCGC GTAACCACCA CACCCGCCGC
2041 GCTTAATGCG CCGCTACAGG GCGCGTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC
2101 CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC
2701 CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT
2761 GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG
2821 CGCAGCTGTG CTCGACGTTG TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT
2881 GCCGGGGCAG GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC
2941 TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG ACCACCAAGC
3001 GAAACATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC GGTCTTGTCG ATCAGGATGA
3061 TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG
3121 CATGCCCGAC GGCGAGGATC TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT
3181 GGTGGAAAAT GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG
3241 CTATCAGGAC ATAGCGTTGG CTACCCGTGA TATTGCTGAA GAGCTTGGCG GCGAATGGGC
3301 TGACCGCTTC CTCGTGCTTT ACGGTATCGC CGCTCCCGAT TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA
3361 TCGCCTTCTT GACGAGTTCT TCTGAGCGGG ACTCTGGGGT TCGAAATGAC CGACCAAGCG
3421 ACGCCCAACC TGCCATCACG AGATTTCGAT TCCACCGCCG CCTTCTATGA AAGGTTGGGC
3481 TTCGGAATCG TTTTCCGGGA CGCCGGCTGG ATGATCCTCC AGCGCGGGGA TCTCATGCTG
3541 GAGTTCTTCG CCCACCCTAG GGGGAGGCTA ACTGAAACAC GGAAGGAGAC AATACCGGAA
3601 GGAACCCGCG CTATGACGGC AATAAAAAGA CAGAATAAAA CGCACGGTGT TGGGTCGTTT
3661 GTTCATAAAC GCGGGGTTCG GTCCCAGGGC TGGCACTCTG TCGATACCCC ACCGAGACCC
3721 CATTGGGGCC AATACGCCCG CGTTTCTTCC TTTTCCCCAC CCCACCCCCC AAGTTCGGGT
3781 GAAGGCCCAG GGCTCGCAGC CAACGTCGGG GCGGCAGGCC CTGCCATAGC CTCAGGTTAC
3841 TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG
3901 ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG
3961 TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC CTTTTTTTCT GCGCGTAATC
4021 TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG
4081 CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG CGCAGATACC AAATACTGTC
4141 CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC
4201 CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC
4261 GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT
4681 ATTACCGCCA TGCAT
所述的pEGFP-RNAi载体1336-1343为SSe8387I内切酶位点CCTGCAGG，pEGFP-RNAi载体1356-1363为NotI内切酶位点GCGGCCGC。
本发明对pEGFP-C1载体进行了改造(命名为pEGFP-RNAi)，增加了人类基因组中罕见的内切酶位点：SSe8387I和NotI酶切位点。该设计将保证新型pEGFP-RNAi载体在人类基因组siRNA设计中的通用性。同时，设计了与之配套的携带SSe8387I和NotI酶切位点上、下游引物的接头，保证siRNA靶基因片段方便地插入新型pEGFP-RNAi载体。
本发明构建的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，可以通过检测荧光强度非常方便快速地鉴定相应siRNA序列的沉默效果，从而筛选出最有效的siRNA序列。本发明在成功构建通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体后，用一条针对MAPK基因的siRNA来验证该载体是否能正常工作。结果显示：不同浓度siRNA与通用性绿色荧光蛋白融合MAPK基因表达载体共转染后，用激光共聚焦显微镜检测到在各siRNA浓度组，细胞内MAPK-GFP融合蛋白的表达量均有不同程度的下降。证实该通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体可以成为siRNA的筛选系统。
附图说明
图1是通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体示意图及其内切酶位点详细序列(插入的两个新的内切酶位点位置在1336-1360)；
图2(A)为MAPK的PCR产物；
图2(B)为pMAPK-EGFP的双酶切结果；
图3是具体实施例中对照组及通用性绿色荧光蛋白融合MAPK表达载体与siRNA共转染各组激光共聚焦图像；
图3(A)荧光对照组；图3(B)siRNA 5nM组；
图3(C)siRNA 10nM组；图3(D)siRNA 25nM组；
图3(E)siRNA 50nM组。
图4是具体实施例中流式细胞荧光检测结果；
图4(A)细胞空白组；图4(B)细胞荧光对照组；
图4(C)siRNA 50nM组；图4(D)siRNA 25nM组；
图4(E)siRNA 10nM组；图4(F)siRNA 5nM组。
下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。
具体实施方式
siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，包括通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体、感受态细菌、质粒提取试剂盒、HEK293细胞。
参照图1所示，包括通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，该载体以pEGFP-C1载体为基础，包括人巨细胞病毒CMV启动子，增强的绿色荧光蛋白基因EGFP，单纯疱疹病毒HSV胸苷激酶TK多腺苷酸化信号，SV40早期启动子组成元件，在1336-1363增加SSe8387I和NotI两个内切酶位点，其载体大小为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi。
siRNA筛选流程：
1)设计目标基因的PCR引物：针对pEGFP-RNAi载体的SSe8387I和NotI酶切位点，设计靶基因PCR引物。在上游引物5’端增加CCTGCAGG(SSe8387I酶切位点)，下游引物5’端增加GCGGCCGC(NotI酶切位点)。
2)PCR扩增靶基因片断。
3)通过TA克隆，把目的基因连接到T载体，测序确认。
4)双酶切重组T载体及pEGFP-RNAi，电泳分离并提取靶基因和线型pEGFP-RNAi，连接靶基因和线型pEGFP-RNAi，绿色荧光报告-靶基因载体(融合基因载体)，测序确认。
5)将融合基因载体转染HEK293细胞，形成siRNA筛选系统(靶基因与GFP融合蛋白的表达率与siRNA的有效率成反比)。
6)根据siRNA设计原则(遗传2006，28(11)：1457-61)设计多条siRNA序列，化学合成或体外转录后备用。
7)应用筛选出的有效siRNA转染融合基因载体-HEK293细胞，以激光共聚焦显微镜、荧光显微镜或流式细胞仪检测siRNA沉默效果。
MAPK-EGFP荧光报告载体构建及有效siRNA的筛选验证
实验目的：构建MAPK-EGFP荧光报告载体并利用此系统快速筛选验证有效的siRNA序列。
实验步骤：
1)MAPK基因片断的获取
提取正常人小肠组织总RNA，逆转录为cDNA，根据NCBI数据库提供的MAPK基因序列(NM_002745)设计引物，序列为sense：5’gcgcctgcagggggtgtagaggtaaccagtagc 3’(含SSe8387I酶切位点)，antisense：5’cccgcggccgcgttcaggaggatgaggagatg 3’(含NotI酶切位点)；PCR后将产物连入pMD19-T载体并酶切鉴定阳性克隆。
2)pMAPK-EGFP荧光报告载体构建及鉴定
将MAPK重组T载体及pEGFP-RNAi分别用SSe8387I及NotI双酶切，凝胶电泳后分别回收纯化酶切片断，通过T4连接酶16℃连接过夜后，将连接产物转化入大肠杆菌TOP10菌株中扩增，筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定重组子并测序确认。
3)针对MAPK基因的siRNA序列的设计与合成
综合最新的各种有效siRNA序列的设计原则，通过siRNA设计系统软件选择针对MAPK基因的特异性干扰区域(目标区域为MAPK cDNA：5’GGCACCTGACTTGTAAAAA 3’)，再根据Ambion公司的SilencerTM siRNA转录试剂盒说明书合成siRNA转录模板，序列为：sense，5’aatttttacaagtcaggtgcccctgtctc 3’，antisense，5’aaggcacctgacttgtaaaaacctgtctc 3’。
4)荧光报告载体与siRNA共转染入HaLa细胞
待细胞进入对数增殖期，通过脂质体2000把pMAPK-EGFP重组质粒及siRNA共转染入HaLa细胞，siRNA干扰组设4个浓度：5nM，10nM，25nM及50nM。转染后24小时检测荧光强度变化。
5)激光共聚焦检测荧光强度
置爬片于24孔板内并种植Hala细胞，24小时后用脂质体2000共转染荧光报告载体及siRNA，4小时后换全培养基继续培养24小时，PBS洗涤细胞2次后取出爬片于激光共聚焦显微镜下观测荧光强度。
6)流式细胞仪检测荧光强度
种植HaLa细胞于6孔板内，24小时后用脂质体2000共转染荧光报告载体及siRNA，4小时后换全培养基继续培养24小时，胰酶消化并用PBS洗涤细胞2次，用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达情况。
实验结果
1)荧光报告系统pMAPK-EGFP载体的构建
参照图2(A)、图2(B)所示，采用RT-PCR成功地从人小肠组织扩增出MAPK基因片断，大小约为1.2kb。PCR产物连接于pMD-T载体后双酶切，再与pEGFP-RNAi连接，双酶切鉴定显示重组成功测序结果亦显示与NCBI上的序列一致。
2)激光共聚焦结果
参照图3所示，共转染后24小时取出爬片检测，以荧光对照组为标准，固定激光共聚焦各个参数，每组各取细胞10个左右，方差分析显示RNA干扰各组荧光强度明显下降，在10nM浓度组达最高降幅70％。
3)流式细胞结果
参照图4所示，以正常细胞为标准调节各参数后，每组各获取10000个细胞并计数，结果显示正常细胞有微弱荧光，荧光对照组有强荧光表达，而各个RNA干扰组荧光表达均有明显的下降，其中10nM及25nM具有最高荧光下调率达60％。
上述实施例证明该系统可以很好的评价siRNA的干扰效果。该荧光筛选系统亦可作为研究有效siRNA设计原则的良好工具。
序列表
1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG
61 CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT
121 GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
181 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC
241 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
301 CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC
361 CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG
421 ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
481 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT
541 ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA
601 CCGGTCGCCA CCATGGTGAG CAAGGGCGAG GAGCTGTTCA CCGGGGTGGT GCCCATCCTG
661 GTCGAGCTGG ACGGCGACGT AAACGGCCAC AAGTTCAGCG TGTCCGGCGA GGGCGAGGGC
721 GATGCCACCT ACGGCAAGCT GACCCTGAAG TTCATCTGCA CCACCGGCAA GCTGCCCGTG
781 CCCTGGCCCA CCCTCGTGAC CACCCTGACC TACGGCGTGC AGTGCTTCAG CCGCTACCCC
841 GACCACATGA AGCAGCACGA CTTCTTCAAG TCCGCCATGC CCGAAGGCTA CGTCCAGGAG
901 CGCACCATCT TCTTCAAGGA CGACGGCAAC TACAAGACCC GCGCCGAGGT GAAGTTCGAG
961 GGCGACACCC TGGTGAACCG CATCGAGCTG AAGGGCATCG ACTTCAAGGA GGACGGCAAC
1021 ATCCTGGGGC ACAAGCTGGA GTACAACTAC AACAGCCACA ACGTCTATAT CATGGCCGAC
1081 AAGCAGAAGA ACGGCATCAA GGTGAACTTC AAGATCCGCC ACAACATCGA GGACGGCAGC
1141 GTGCAGCTCG CCGACCACTA CCAGCAGAAC ACCCCCATCG GCGACGGCCC CGTGCTGCTG
1201 CCCGACAACC ACTACCTGAG CACCCAGTCC GCCCTGAGCA AAGACCCCAA CGAGAAGCGC
1261 GATCACATGG TCCTGCTGGA GTTCGTGACC GCCGCCGGGA TCACTCTCGG CATGGACGAG
1321 CTGTACAAGT CCGGACCTGC AGGGAATTCC TCGAGGCGGC CGCATTCTAG ATAACTGATC
1381 ATAATCAGCC ATACCACATT TGTAGAGGTT TTACTTGCTT TAAAAAACCT CCCACACCTC
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1501 TATAATGGTT ACAAATAAAG CAATAGCATC ACAAATTTCA CAAATAAAGC ATTTTTTTCA
1561 CTGCATTCTA GTTGTGGTTT GTCCAAACTC ATCAATGTAT CTTAACGCGT AAATTGTAAG
1621 CGTTAATATT TTGTTAAAAT TCGCGTTAAA TTTTTGTTAA ATCAGCTCAT TTTTTAACCA
1681 ATAGGCCGAA ATCGGCAAAA TCCCTTATAA ATCAAAAGAA TAGACCGAGA TAGGGTTGAG
1741 TGTTGTTCCA GTTTGGAACA AGAGTCCACT ATTAAAGAAC GTGGACTCCA ACGTCAAAGG
1801 GCGAAAAACC GTCTATCAGG GCGATGGCCC ACTACGTGAA CCATCACCCT AATCAAGTTT
1861 TTTGGGGTCG AGGTGCCGTA AAGCACTAAA TCGGAACCCT AAAGGGAGCC CCCGATTTAG
1921 AGCTTGACGG GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGAGC
1981 GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT CACGCTGCGC GTAACCACCA CACCCGCCGC
2041 GCTTAATGCG CCGCTACAGG GCGCGTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC
2101 CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC
2701 CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT
2761 GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG
2821 CGCAGCTGTG CTCGACGTTG TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT
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3061 TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG
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3721 CATTGGGGCC AATACGCCCG CGTTTCTTCC TTTTCCCCAC CCCACCCCCC AAGTTCGGGT
3781 GAAGGCCCAG GGCTCGCAGC CAACGTCGGG GCGGCAGGCC CTGCCATAGC CTCAGGTTAC
3841 TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG
3901 ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG
3961 TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC CTTTTTTTCT GCGCGTAATC
4021 TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG
4081 CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG CGCAGATACC AAATACTGTC
4141 CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC
4201 CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC
4261 GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT
4681 ATTACCGCCA TGCAT
Claims (1)
1.2701 CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT
2761 GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG
2821 CGCAGCTGTG CTCGACGTTG TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT
2881 GCCGGGGCAG GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC
2941 TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG ACCACCAAGC
3001 GAAACATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC GGTCTTGTCG ATCAGGATGA
3061 TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG
3121 CATGCCCGAC GGCGAGGATC TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT
3181 GGTGGAAAAT GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG
3241 CTATCAGGAC ATAGCGTTGG CTACCCGTGA TATTGCTGAA GAGCTTGGCG GCGAATGGGC
3301 TGACCGCTTC CTCGTGCTTT ACGGTATCGC CGCTCCCGAT TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA
3361 TCGCCTTCTT GACGAGTTCT TCTGAGCGGG ACTCTGGGGT TCGAAATGAC CGACCAAGCG
3421 ACGCCCAACC TGCCATCACG AGATTTCGAT TCCACCGCCG CCTTCTATGA AAGGTTGGGC
3481 TTCGGAATCG TTTTCCGGGA CGCCGGCTGG ATGATCCTCC AGCGCGGGGA TCTCATGCTG
3541 GAGTTCTTCG CCCACCCTAG GGGGAGGCTA ACTGAAACAC GGAAGGAGAC AATACCGGAA
3601 GGAACCCGCG CTATGACGGC AATAAAAAGA CAGAATAAAA CGCACGGTGT TGGGTCGTTT
3661 GTTCATAAAC GCGGGGTTCG GTCCCAGGGC TGGCACTCTG TCGATACCCC ACCGAGACCC
3721 CATTGGGGCC AATACGCCCG CGTTTCTTCC TTTTCCCCAC CCCACCCCCC AAGTTCGGGT
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