CN114540414A - 一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统、方法及试剂盒 - Google Patents
一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统、方法及试剂盒。为了解决在转染阳性细胞分选中存在的必须在分选标签质粒上进行目的基因克隆构建的问题，本发明提供了一种使用通用分选标签质粒与目的基因质粒共转染的方法，通过细胞分选即可获得目的基因阳性的细胞。经本发明验证，上述使用通用分选标签质粒共转染的方式能够高效富集目的基因阳性细胞，显著提高基因敲低以及基因过表达的水平，获得与单质粒转染体系相当的效果。
Description
技术领域
本发明属于DNA转染技术领域，具体涉及一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统、基因转染方法及试剂盒，还涉及一种提高基因传递效率的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在基因功能研究以及相关的应用领域，通常需要使用基因传递技术将目的基因或者载体导入到细胞中，过表达、敲低或敲除特定基因，或者对特定基因进行基因编辑，来研究其生物学功能，或者使用基因改造的细胞实现疾病治疗等目的。虽然基因传递研究取得了很大的进展，在多种细胞上实现了较高的转染效率，但是在难转染的细胞比如淋巴瘤/白血病细胞以及原代细胞中，较低的基因传递效率依然是亟需解决的关键问题。在基因递送效率难以进一步提高的情况下，通过分子标签分选和富集转染阳性细胞的方法是有效的间接提高基因递送效率的策略。现有的方法主要包括流式细胞荧光分选(FACS)，磁性细胞分选(MACS)以及基于细胞膜表面定位荧光蛋白标签的亲和分选方法等。
FACS方法通过在质粒载体上引入荧光蛋白的表达框，如EGFP,mCherry,RFP,YFP,BFP等，依据转染阳性细胞具有的荧光特性在流式细胞仪上实现阳性细胞的分选。MACS方法则借助磁性微球偶联蛋白抗体和靶细胞表面标记蛋白的相互作用，使转染阳性细胞在外部磁场中实现分离。基于细胞膜表面定位荧光蛋白标签的转染阳性细胞亲和分选方法则是一种新发明的基于亲和标签的阳性细胞分选系统，该系统在增强型绿色荧光蛋白EGFP的N端融合一个Twin-Strep-tag(TST)标签，通过膜定位信号将其定位到细胞膜外表面，使用可与TST高亲和力结合的Magrose Strep-Tactin磁珠，一步操作即可分选富集转染阳性细胞。
然而，在实际应用中不管哪种分选方法都需要在含有分选标签分子的载体上构建带有目标基因的克隆，用于细胞转染，进而进行阳性细胞的分选。即使在很多情况下，已经获得带有目标基因的其他类型克隆载体，仍需要将其重新克隆到带有分选标签分子的克隆载体上。不仅耗费时间长还提高了实验成本，大大限制了各种细胞分选方法的实际应用。
发明内容
本发明报道了一种基于通用质粒的基因转染系统及转染方法，所述方法包括将表达分选标签的通用质粒与含有目的基因的质粒进行共转染，所述通用分选标签质粒中包括膜定位信号肽、荧光蛋白(EGFP)及亲和分选标签。经验证，该通用分选标签质粒能够与目的基因实现高效的共转染效果，并且，转染后阳性细胞可通过膜外荧光被观测或通过亲和分选标签进行快速筛选。
作为示例，本发明的一种实施方式中，所述通用分选标签质粒为GPI膜锚定亲和分选标签的表达质粒TST-EGFP-GPIBY55，将该质粒与任意目的基因质粒共同转染细胞，每个转染细胞中会进入多个共转染质粒，亲和标签质粒和目标质粒表现出显著的共阳性的特征。通过Magrose Strep-Tactin磁性亲和分选，可获得既含有分选标签质粒又含有目的基因质粒的阳性细胞，实现目的基因转染阳性细胞的高效分选和富集。
具体的，本发明还将TST-EGFP-GPIBY55通用质粒与mCherry的普通表达质粒共转染lenti-X 293T细胞和K-562细胞，荧光显微镜观察以及流式细胞分析表明，两种质粒存在显著的共阳性的现象。并且，经过Magrose Strep-Tactin亲和分选获得的阳性细胞中，表达亲和分选标签和mCherry的阳性细胞比例以相似的幅度大大提高。进一步，将TST-EGFP-GPIBY55分选标签质粒分别与基因过表达、shRNA基因敲低质粒共转染K-562细胞，通过Magrose Strep-Tactin亲和分选富集阳性细胞后，也大大提高了基因过表达以及基因敲低的水平，获得了与带有分选标签的单质粒基因过表达以及基因敲低质粒相似的水平。
基于上述研究结果，本发明第一方面提供一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统及目的基因转染方法。基于上述方法和系统，本发明一方面避免了实际应用中需要在分选标签质粒上重新构建克隆的问题，直接将通用分选标签质粒与任何现有目的质粒共转染细胞，即可高效分选目的基因转染阳性细胞，节省了重新构建质粒的时间，节约了成本。另一方面，将分选标签放在单独的表达质粒上，可大大减小克隆目标基因质粒的大小，增加质粒的克隆容量，并且降低基因克隆操作的难度。本发明报道的方法在基因功能研究和相关的应用领域有巨大的潜力。上述基因转染方法，所述的方法具有非常广泛的应用领域，不仅可以用于基因过表达、基因敲低研究，还可以用于基因敲除分析以及基因编辑研究，以及其他涉及到细胞转染、转化和感染的实验。基于通用型分选标签质粒表达的膜荧光蛋白及磁分选标签，本发明不仅适用于示例的基于细胞膜表面定位荧光蛋白亲和标签的转染阳性细胞亲和分选体系，同样也广泛适用于其他FACS以及MACS分选系统。
本发明所述基于通用分选标签质粒的基因转染系统和方法具有多方面的优点：
(1)避免了在分选标签载体上重新构建目的基因质粒带来的麻烦，使用通用的分选标签质粒与任何现有的质粒共转染即可实现阳性细胞的亲和分选，节约了时间和人力，降低了成本；
(2)将分选标签的表达单元放在单独的通用质粒上，可大大降低目的基因克隆载体的大小，为克隆更大的目的基因留出更多的空间；
(3)使用较小的克隆载体通常会提高质粒的转染效率。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为分选标签质粒与mCherry质粒共转染的荧光显微成像分析；
a为TST-EGFP-GPIBY55表达质粒与mCherry质粒共转染Lenti X-293T细胞，48小时后通过激光共聚焦显微镜进行成像分析；
b为荧光显微镜成像分析的荧光阳性细胞统计，绿色代表单EGFP荧光细胞，红色表示单mCherry荧光细胞，棕色表示双荧光细胞，灰色表示阴性细胞。统计数据来自三次独立重复。
图2为分选标签质粒与mCherry质粒共转染的流式分析；
a为TST-EGFP-GPIBY55表达质粒与mCherry质粒共转染K-562细胞的流式细胞分析散点图，转染48小时后通过Magrose Strep-Tactin磁珠亲和分选阳性细胞，未转染的K-562细胞为空白对照，单独转染TST-EGFP-GPIBY55质粒和mCherry质粒的细胞作为单阳性对照，并进行荧光补偿；横坐标表示绿色荧光强度，纵坐标表示红色荧光强度，方框外的直方图表示Q1-Q4区域的细胞比例；
b为共转染细胞亲和分选的直方图展示；
c为共转染细胞亲和分选阳性率的柱状图展示，数据来自三次生物学重复的流式分析结果。
图3为目的基因质粒与通用分选标签质粒共转染的亲和分选；
a为TST-EGFP-GPIBY55标签表达质粒分别与靶向ABL基因的两个pLKO.1-shRNA质粒共转染K-562细胞，使用Magrose Strep-Tactin磁珠分选阳性细胞后通过RT-qPCR检测靶基因表达水平；
b为ABL基因两个shRNA的pLKO.1-GPIBY55质粒单独转染K-562细胞经过亲和分选后的靶基因表达水平；
c为TST-EGFP-GPIBY55标签质粒分别与过表达CEBPB和CTCF基因的pcDNA3.1载体共转染K-562细胞经过亲和分选之后的目的基因表达水平；
d为CEBPB,CTCF基因的pcDNA3.1-GPIBY55过表达质粒分别转染K-562细胞经亲和分选后的目的基因表达水平；双尾t检验，结果以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，目前的基因传递技术中还存在基因转染效率低、构建含有目的基因的转染质粒较为繁琐等缺陷，为了解决在转染阳性细胞分选中存在的必须在分选标签质粒上进行目的基因克隆构建的问题，本发明了一种使用通用分选标签质粒与目的基因质粒共转染的方法，通过细胞分选即可获得目的基因阳性的细胞。
本发明第一方面，提供一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统，所述转染系统中包括通用分选标签质粒及含有目的基因的质粒；
所述通用分选标签质粒的表达框中，具有膜定位信号肽、荧光蛋白(EGFP)及亲和分选标签的编码序列。
上述通用分选标签质粒中：
优选的，所述膜定位信号肽包括GPI类型的膜外定位信号及跨膜结构域等；其中，膜外定位信号肽包括但不限于BY55,DAF,CEAM7中的一种；所述跨膜结构域包括但不限于ITB3,ITA5,ITAV中的一种；进一步优选的，所述膜定位信号肽为膜外定位信号肽，所述膜外定位信号肽通过糖基磷脂酰肌醇分子(GPI)锚定于细胞膜脂质双分子层的外层。
优选的，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(EGFP)、mCherry，dsRed，RFP，YFP或BFP中的一种；进一步优选的，所述荧光蛋白为EGFP。
优选的，所述亲和分选标签为CBP(钙调蛋白结合肽)，MBP(麦芽糖结合蛋白)、HIS-Tag蛋白标签，或Twin-Strep-tag(TST)、GST(glutathione S-transferase)中的一种。
本发明效果较好的一种实施方式，所述通用分选标签质粒中，包括膜外定位信号(跨膜结构域为BY55)、绿色荧光蛋白(EGFP)和Twin-Strep-tag(TST)的编码序列；具体的制备方式如下：通过全基因合成的方式获得所述膜定位信号肽的编码序列，使用多重PCR将其与编码绿色荧光蛋白的阅读框融合，并通过Age I/BglII酶切连接的方式克隆到pEGFP-C2载体中。采用上述方式制备的通用分选标签质粒命名为TST-EGFP-GPIBY55。
所述目的基因质粒中，目的基因为转化至生物体后可以带来预期表型性状的任意序列；包括但不限于过表达基因、shRNA、siRNA、sgRNA中的任意一种。
优选的，所述基因转染系统中，还包括磁选分离模块，所述磁选分离模块包括磁珠及外加磁场，所述磁珠表面具有亲和分选标签的配体蛋白修饰；具体的实例中，所述配体蛋白为Strep-Tactin蛋白，所述磁珠为Magrose Strep-Tactin磁珠。
本发明第二方面，提供一种基于通用分选标签质粒的基因转染方法，所述方法包括将含有目的基因的质粒与通用分选标签质粒进行共转染。
优选的，本发明第二方面提供的基因转染方法，步骤如下：将含有目的基因的质粒与通用分选标签质粒以1：0.8～1.2的比例混合后加入宿主细胞中，转染时间为36～48小时，通过观察细胞中荧光表达的情况或通过磁分选筛选阳性转染细胞。
上述转染方法能够有效提高阳性细胞转染率，应用于难转染的宿主细胞具有良好的应用价值，所述难转染的宿主细胞包括淋巴瘤、白血病细胞或其他原代细胞，本发明证实的实施方式中，所述宿主细胞为293T细胞或K-562细胞。
进一步的，上述转染方法中，所述宿主细胞转染前接种密度为50～70％，采用转染试剂进行转染；具体的实例中，293T细胞采用聚乙烯亚胺试剂，K-562细胞使用Lipofectamine 2000转染试剂。
进一步的，上述转染方法中，所述阳性转染细胞的筛选方式如下：离心收集细胞并清洗，将清洗后的细胞加入缓冲液中重悬并与磁珠混合，转速8～12rpm室温孵育10～20min得到磁珠-细胞复合物，静置待磁珠沉降后弃去缓冲液，再向磁珠中加入完全培养基将阳性细胞进行洗脱。
更进一步的，所述洗脱转速为10～20rpm转速，洗脱时间为4～8min。
本发明第三方面，提供一种基因转染试剂盒，所述基因转染试剂盒中具有通用分选标签质粒、含有目的基因的质粒。
本发明第四方面，提供一种提高基因转染率的方法，所述方法包括将含有目的基因的质粒与通用分选标签质粒共转染宿主细胞。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案，以下实施例中所述涉及的材料及实验方法如下：
质粒构建和基因克隆
为了构建带有分选标签的单质粒目的基因载体，本实施例通过PCR技术从pEGFP-GPIBY55载体中扩增N-sig-TST-EGFP-GPIBY55分选标签的编码序列，经过FastDigest BamHI和KpnI(Thermo Fisher Scientific)双酶切后使用T4 DNA Ligase(Thermo FisherScientific)连接到同样双酶切处理的pLKO.1(Sigma)载体上，获得可表达亲和分选标签的用于U6-shRNA表达载体pLKO.1-GPIBY55。后者将N-sig-TST-EGFP-GPIBY55分选标签的编码序列的PCR产物通过体外同源重组试剂盒(ClonExpress II One-Step Cloning Kit，C112,Vazyme)克隆到pcDNATM3.1/V5-His A载体中，替换新霉素编码序列，获得可表达亲和分选标签的用于基因过表达的亲和分选载体pcDNA3.1-GPIBY55。
将针对ABL基因的shRNA序列合成寡核苷酸片段，退火后直接插入到FastDigestAgeI/EcoRI(Thermo Fisher Scientific)双酶切的pLKO.1-GPIBY55载体中或不含分选标签的pLKO.1载体中，获得了带有分选标签的以及不带分选标签的ABL-shRNA1和ABL-shRNA2的表达质粒。通过PCR的方式从人cDNA样本中扩增出CEBPB和CTCF基因的编码序列，经FastDigest HindIII和XbaI(Thermo Fisher Scientific)双酶切后构建到同样双酶切处理的pcDNA3.1-GPIBY55载体或通用的pcDNA3.1载体。所有转染细胞的质粒均用去内毒素质粒纯化试剂盒(OMEGA)提取，并通过乙醇沉淀进行纯化。
细胞培养和转染
Lenti-X 293T细胞购自Clontech(#632180)并培养于DMEM(Gibco)培养基，K-562细胞购自ATCC(CCL-243)培养于IMDM(Gibco)培养基。所有培养基均添加1％抗生素(青霉素和链霉素，Sigma)和10％胎牛血清(Gibco)。细胞系在37℃、95％湿度、5％CO2条件下培养，一般每2-3天传代一次。所有细胞系均使用
mycoplasma Detector试剂盒定期检测支原体(D101-02,Vazyme)，保证细胞没有支原体污染。
在转染前一天，Lenti-X 293T细胞接种于6孔板，并在完全培养基中生长，使其在转染时达到50-70％的密度。K-562细胞转染前先进行细胞计数，以每个孔3.5×105个细胞接种于6孔板。Lenti-X 293T细胞转染使用聚乙烯亚胺试剂(PEI，#408727，Sigma)，DNA:PEI的比例为1:1.5，转染之前换上不含胎牛血清的DMEM培养基，并在转染4-8小时后替换成DMEM完全培养基。K-562细胞转染使用Lipofectamine 2000(11668-019，Invitgen)转染试剂，按照说明书进行操作，DNA和Lipofectamine 2000比例为1:3。
亲和细胞分选
细胞转染36-48小时后进行细胞分选实验。对于悬浮细胞如K-562直接离心收取细胞，然后用1×PBS溶液清洗细胞两次，取出1/5作为亲和分选前的细胞样品，剩余细胞用750μL室温孵育缓冲液(0.1％BSA的DPBS溶液)重悬，然后与洗涤两次并重悬在750μL孵育缓冲液中的磁珠悬液混合，颠倒混匀后将其置于旋转混匀仪上，以最低转速10rpm室温孵育15分钟。然后于EP管架上静置2分钟直到所有的磁珠-细胞复合物都借助重力自然沉降，弃掉上清后用清洗缓冲液(0.1％BSA的DPBS溶液)轻柔冲洗，重复此步骤两次，注意此过程不要触碰到磁珠。最后在磁珠中加入300μL完全培养基，置于混匀仪上在15rpm转速下室温洗脱5min，置于磁力架上静置，收集含有阳性细胞的上清液。
Lenti-X 293T细胞爬片制作和激光共聚焦显微镜拍照
在生物安全柜中将爬片置入24孔板，转染前一天将Lenti-X 293T细胞接种爬片上使其在转染时达到50-70％的密度。共转染实验中pEGFP-GPIBY55与mCherry质粒按质量1:1的比例混合进行转染，用1×PEI试剂转染Lenti-X 293T细胞，转染4-8小时后更换新鲜的完全培养基。48小时后去除培养基，用1×PBS清洗细胞两遍，再用4％多聚甲醛室温下避光固定10-15分钟，然后再用1×PBS轻柔的冲洗两遍，最后用10μg/ml浓度DAPI试剂染细胞核，并用防猝灭封片剂封片，于避光湿盒中保存。最后使用超高分辨率激光共聚焦显微镜LSM900(蔡司)观察荧光蛋白的表达情况。
流式细胞术
收集经过转染和经过亲和分选的K-562细胞，置于冰上，使用流式细胞仪guavaeasyCyte(MERCK)进行分析。FSC和SSC的探测器增益设定为默认值，而FITC的探测器增益需要根据NTC细胞进行调整，把阴性对照细胞的FITC-H主峰调整位于102-103之间，每次分析至少记录10000个事件。用Flowjo软件进行数据分析并根据单荧光对照对实验组样品进行荧光补偿。在直方图中进行了同组实验中不同样品图层的叠加(归一化处理)，来更加直观的观察亲和分选前后的样品中阳性细胞的比例变化。
RNA提取和反转录
用GeneJET RNA纯化试剂盒(GeneJET RNA Purification Kit,K0732,ThermoScientific)根据说明书从细胞中制备RNA样本，然后使用RapidOut DNA Removal Kit试剂盒(K2981,Thermo Fisher Scientific)去除残留的基因组DNA。按照cDNA逆转录试剂盒High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(4368813,Applied Biosystems)的使用手册使用随机引物将RNA逆转录成cDNA。反应程序设置为25℃10min，37℃120min然后85℃5min。反转录得到的cDNA直接用于后续实验或者存放于在-80℃冰箱。
RT-qPCR和getPCR
采用RT-qPCR对细胞中基因表达水平进行分析，使用基因表达水平的富集倍数来表征分选标签质粒共转染亲和分选富集阳性细胞的能力。在定量基因敲低和基因过表达细胞中目标基因mRNA表达水平时，用内源性ACTB(β-actin)基因表达水平进行归一化处理，并将转染空载体的细胞作为阴性对照。每个基因的表达定量结果来自三次定量PCR分析。定量RT-PCR使用增强型的Taq388酶，在Roche机器上进行。每对PCR引物均进行特异性和扩增效率检测，选择特异性和扩增效率较好的引物进行PCR定量分析。
实施例1 与分选标签质粒共转染可实现目标质粒阳性细胞的亲和分选
为了验证对本发明提供的共转染方法效率进行验证，本实施例中，将表达分选标签TST-EGFP-GPIBY55的质粒与不带分选标签的mCherry表达质粒等比例混合后共转染LentiX-293T细胞，48小时后通过激光共聚焦显微镜观察细胞表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的情况。研究发现，绿色荧光和红色荧光存在显著的共阳性的现象(图1a，b)。EGFP阳性的细胞比例为52％，mCherry阳性的细胞比例为48％，EGFP和mCherry双阳性细胞的比例则达到了44％。在所有转染阳性细胞中，双阳性细胞的比例更是高达88％。进一步，本实施例将上述两个质粒等比例共转染K-562细胞，并通过Magrose Strep-Tactin进行亲和细胞分选，流式细胞分析检测发现，共转染的EGFP和mCherry同样表现出了显著的共阳性特征(图2)。EGFP阳性细胞和mCherry阳性细胞比例分别为36％和32％，双阳性细胞的比例则达到了29％(图2a)。在经过亲和分选富集的细胞中，EGFP阳性、mCherry阳性以及双阳性细胞的比例分别达到93％、90％和86％(图2a,b,c)。有趣的是，在共转染实验中，EGFP单阳性、mCherry单阳性和EGFP/mCherry双阳性细胞的比例大约为1：1：6。按照每个脂质体微滴容纳多个质粒，且大小相近质粒有均等转染机会计算，每个细胞转染了3个质粒的情况下才会产生类似的阳性细胞比例，即1/8:1/8:6/8。因此推测，在这里所涉及的转染条件下，每个细胞中平均转染了3个质粒。上述结果充分表明，本发明中提供的分选标签质粒共转染方法，能够有效的提高细胞阳性转染率，并且能够实现分选标签和目的基因的共同转染。即便是在淋巴瘤/白血病细胞这种难以转染的细胞中也可以实现良好的转染效果。
实施例2 分选标签质粒共转染实现目的基因阳性细胞的亲和分选
本实施例中，将TST-EGFP-GPIBY55表达质粒与靶向ABL基因shRNA的pLKO.1质粒共转染K-562细胞，48小时后进行Magrose Strep-Tactin亲和细胞分选。基因表达定量结果表明，在转染的细胞中两个ABL shRNA均可在一定程度上下调ABL基因的表达水平，敲低效率分别为29％和31％。而在经过亲和分选富集的细胞中，ABL-shRNA1和ABL-shRNA2的敲低效率则分别达到了66％和72％(图3a)。在基于pLKO.1-GPIBY55载体的单质粒转染体系中这两个ABL shRNA的敲低效率分别为15％和12％，经过亲和分选富集的细胞中敲低效率则分别达到了51％和53％(图3b)。因此，分选标签质粒共转染得到了与单质粒转染相当的基因敲低效率。
进一步，本实施例在基因过表达实验中对共转染亲和分选方法进行了尝试，本实施例将TST-EGFP-GPIBY55质粒分别与CEBPB和CTCF基因的pcDNA3.1表达载体共转染K-562细胞，48小时后使用Magrose Strep-Tactin亲和分选阳性细胞，提取RNA后通过RT-qPCR检测目的基因的表达水平。结果表明，在转染细胞中CEBPB和CTCF基因的表达水平分别提高到9倍和5倍，经过亲和分选获得的阳性细胞中CEBPB的表达水平进一步提高到46倍左右，CTCF的表达水平则进一步提高到24倍左右(图3c)。相应的，在基于pcDNA3.1-GPIBY55载体的单转染体系中，转染细胞中CEBPB和CTCF基因的表达水平可分别提高10倍和14倍，在经过亲和分选获得的阳性细胞中CEBPB的表达水平进一步提高到58倍，CTCF基因表达水平则进一步提高到了27倍(图3d)。因此，分选标签质粒共转染与单质粒转染方法都能有效的提高基因的表达水平。
以上结果表明，通用亲和标签质粒共转染后通过亲和细胞分选可高效富集目的基因阳性细胞，显著提高基因敲低以及基因过表达的水平，获得与单质粒转染体系相当的效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于通用分选标签质粒的基因转染系统，其特征在于，所述转染系统中包括通用分选标签质粒及含有目的基因的质粒；
所述通用分选标签质粒的表达框中，具有膜定位信号肽、荧光蛋白及亲和分选标签的编码序列。
2.如权利要求1所述基于通用分选标签质粒的基因转染系统，其特征在于，所述通用分选标签质粒中，所述膜定位信号肽包括但不限于BY55,DAF,CEAM7中的一种；所述跨膜结构域包括但不限于ITB3,ITA5,ITAV中的一种。
3.如权利要求2所述基于通用分选标签质粒的基因转染系统，其特征在于，所述膜定位信号肽为膜外定位信号肽，所述膜外定位信号肽通过糖基磷脂酰肌醇分子锚定于细胞膜脂质双分子层的外层；
或，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白、mCherry，dsRed，RFP，YFP或BFP中的一种；进一步优选的，所述荧光蛋白为EGFP；
或，所述亲和分选标签为CBP，MBP、HIS-Tag蛋白标签，或Twin-Strep-tag、GST中的一种。
4.如权利要求1-3任一项所述基于通用分选标签质粒的基因转染系统，其特征在于，所述通用分选标签质粒中包括BY55跨膜结构域的膜外定位信号肽、绿色荧光蛋白和Twin-Strep-tag的编码序列。
5.如权利要求1所述基于通用分选标签质粒的基因转染系统，其特征在于，所述目的基因质粒中，目的基因为转化至生物体后可以带来预期表型性状的任意序列；包括但不限于过表达基因、shRNA、siRNA、sgRNA中的任意一种。
6.如权利要求1所述基于通用分选标签质粒的基因转染系统，其特征在于，所述基因转染系统中，还包括磁选分离模块，所述磁选分离模块包括磁珠及外加磁场，所述磁珠表面具有亲和分选标签的配体蛋白修饰；具体的实例中，所述配体蛋白为Strep-Tactin蛋白，所述磁珠为Magrose Strep-Tactin磁珠。
7.一种基于通用分选标签质粒的基因转染方法，其特征在于，所述方法包括将含有目的基因的质粒与通用分选标签质粒进行共转染。
8.如权利要求7所述基于通用分选标签质粒的基因转染方法，其特征在于，所述基因转染方法，步骤如下：将含有目的基因的质粒与通用分选标签质粒混合后转染宿主细胞，通过荧光显微镜观察荧光表达的情况并通过亲和分选筛选阳性转染细胞。
9.一种基因转染试剂盒，其特征在于，所述基因转染试剂盒中具有通用分选标签质粒、含有目的基因的质粒。
10.一种提高基因转染率的方法，其特征在于，所述方法包括将含有目的基因的质粒与通用分选标签质粒共同转染宿主细胞。
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- 2022-02-14 CN CN202210133439.6A patent/CN114540414B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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