CN109628488A - 基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，包括如下步骤:将基因过表达或干扰元件片段、荧光标记片段及抗性筛选片段依次插入到piggyBAC载体的ITR片段之间，构建载体，然后将构建的载体和pBase表达质粒共转染细胞，进行抗性筛选，选取抗性存活细胞，进行Q‑PCR检测，将pBase‑MU质粒转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间序列整体切除，原位点不残余任何序列，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。本发明的方法将基因过表达或干扰元件插入ITR之间，构建piggyBAC稳转载体。没有基因大小的限制，可以对较大的基因或多个基因同时进行过表达操作。

Description

基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法
技术领域
本发明属于生物基因技术领域，具体涉及基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法。
背景技术
研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过表达或者沉默该基因，筛选稳定细胞株。稳转细胞株在基因功能研究、信号通路研究、蛋白或抗体表达、药物开发等方面具有重要的作用。目前主要是通过病毒法构建稳转细胞株，其中最常用的是慢病毒。
慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。利用慢病毒的特性，将外源DNA 克隆到具有某种抗性的慢病毒载体中并感染宿主细胞，利用载体中所含的抗性标志进行筛选，可得到稳定表达或沉默特定基因的细胞株。
构建基因过表达或干扰稳转细胞株模型步骤如下：针对靶基因设计并构建过表达或干扰慢病毒载体；包装慢病毒，检测病毒滴度；慢病毒感染目标细胞，药物筛选富集阳性细胞；Q-PCR验证细胞系过表达或干扰效果。
现有技术的慢病毒转染方法的优点包括：(1)很多细胞系转染困难，慢病毒感染的方式能够实现高效的细胞转染；(2)载体中携带抗性基因，可以通过抗性筛选，去除部分野生型细胞，富集阳性细胞，提高过表达或干扰的效果；(3)慢病毒感染后，整合进细胞基因组，能够长时间稳定的实现过表达或干扰的效果。
但其也存在缺点，包括：
(1)慢病毒可能在基因组中整合多个拷贝，可能会影响到内源基因表达，也可能会造成基因组的不稳定；
(2)病毒感染可能会影响细胞的状态，引起细胞老化；
(3)慢病毒载体承载量有限，较大的基因慢病毒包装滴度低，导致细胞株构建困难；
(4)步骤繁琐：需要构建慢病毒载体，并进行病毒包装，稳转株构建周期很长；
(5)一旦基因整合后，就无法去除。
目前构建基因过表达或干扰稳转株的需求越来越多，急需一种更高效且能够实现去除的稳转株构建方法。
发明内容
针对上述现有技术存在慢病毒转染方法存在的缺陷，本发明提供 piggyBAC稳转株构建系统，实现了高效的进行基因过表达或干扰，并且可以进行切除逆转。
为达到上述目的，本发明提供的技术方案是基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)载体构建:
将基因过表达或干扰元件片段、荧光标记片段及抗性筛选片段依次插入到piggyBAC载体的ITR片段之间，得到载体A；
(2)质粒转染和单克隆
将构建的载体A和pBase表达质粒共转染靶细胞，转染后，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞进行抗性筛选，挑单克隆进行培养； pBase表达后将ITR之间基因过表达或干扰元件片段转座插入基因组中，抗性基因表达使细胞存活，目标基因持续进行过表达或干扰；
(3)阳性克隆鉴定
选前述的单克隆培养细胞进行Q-PCR检测，鉴定目标基因过表达或干扰的效果；
(4)表达元件切除
如需要将基因过表达或干扰元件片段去除时，将pBase-MU质粒电转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间序列整体切除，原位点不残余任何序列，通过Q-PCR验证，确认切除成功，对阳性克隆进行冻存。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述的基因包括小鼠、大鼠和人的所有外显子基因。
所述的荧光标记片段选自GFP、mCherry、CFP、RFP或YFP能被荧光显微镜检测的基因。
所述抗性筛选片段选自嘌呤霉素Puromycin、潮霉素Hygromycin、杀稻瘟菌素或G418抗生素序列片段。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述转染为电转染方式或脂质体转染方式。转染24h后，进行抗性筛选。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述细胞选自哺乳动物细胞，包括ATCC细胞库、中科院细胞库以及基于ATCC细胞库修改后的哺乳动物细胞株。
本发明优选的技术方案中，步骤(4)中，pBase-MU质粒来自(SBI， PB220PA-1)；pBase表达质粒来自(SBI，PB210PA-1)。
本发明的构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法的优点包括：
A.将基因过表达或干扰元件插入ITR之间，构建piggyBAC稳转载体。没有基因大小的限制，可以对较大的基因或多个基因同时进行过表达操作。慢病毒载体中有很多病毒元件，载体构建较困难，载体复制中不稳定。而 piggyBAC稳转载体构建简单，且载体稳定复制，质粒提取简单。
B.piggyBAC稳转系统只需要构建稳转载体，不需要进行病毒包装、滴度测定等环节；步骤简单，周期较短。
C.慢病毒感染细胞时可能会影响细胞的状态，造成细胞老化无法持续传代。piggyBAC稳转系统通过电转或脂质体转染的方式，降低对细胞的伤害。慢病毒法构建困难的项目通过piggyBAC稳转系统能够有效的进行细胞株构建。
D.piggyBAC稳转系统将基因整合到基因组中，可以实现长时间持续表达。本公司对piggyBAC稳转系统构建的细胞株传代8代以上，基因整合的拷贝数和表达量没有下降。且当想要去除基因的过表达或干扰时，只需要将突变型的pBase表达质粒转入细胞，就能够高效的实现整合基因的切除，实现基因操作的逆转。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为本发明制备方法构建载体的局部结构示意图。
图2为实施例1，2用piggyBAC法构建过表达稳转株的载体结构示意图。
图3为对照例1，2用慢病毒法构建过表达稳转株的载体结构示意图。
图4为实施例1和对照例1的HCT116细胞两种方法的稳转株的结果对照。
图5为实施例2和对照例2的RAW264.7细胞两种方法的稳转株的结果对照。
图6为实施例3结果示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册(如《分子克隆实验手册》)以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水经Milli-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言：
一.材料
基因过表达或干扰元件片段、荧光标记片段、抗性筛选片段及piggyBAC 载体来自金唯智公司合成。
pBase表达质粒、pBase-MU质粒购自System Biosciences(SBI)。
实施例中涉及的细胞，包括HCT116细胞、RAW264.7细胞、293T细胞、 Human MSC细胞等，都来自ATCC细胞库或中科院细胞库，基因片段从 Origene公司购买。
二.仪器
实施例1.
1.在HCT116细胞中构建基因mCtnnd1[NM_007615.4]过表达稳转株， piggyBAC法构建过表达稳转株。
piggyBAC法稳转株构建步骤:
通过HiFi DNA Assembly(NEB#E5520)连接的方式，依次将基因过表达元件mCtnnd1[NM_007615.4]、荧光标记EGFP、筛选抗性基因嘌呤霉素，克隆至piggyBAC表达载体，载体信息如图2所示。
将稳转载体和pBase表达载体通过Lipo3000方式共转染1×105HCT116 细胞，转染1d后在培养基中添加Puro进行筛选，筛选培养3d后，选取活性细胞进行Q-PCR,观察细胞荧光率，鉴定目标基因过表达或干扰的效果。
对照例1
在HCT116细胞中构建基因mCtnnd1[NM_007615.4]过表达稳转株，采用慢病毒法构建过表达稳转株。
慢病毒法稳转株构建步骤：
通过HiFi DNA Assembly(NEB#E5520)连接的方式，依次将基因过表达元件mCtnnd1[NM_007615.4]、荧光标记EGFP、筛选抗性基因嘌呤霉素Puro，克隆至慢病毒表达载体中，载体信息如图3所示。
在293T细胞中共转染慢病毒表达载体和辅助质粒进行慢病毒包装，48h 后收取细胞培养基，也就是病毒原液。通过Q-PCR测定慢病毒滴度。取 3×105HCT116细胞，MOI 30慢病毒感染目标细胞，3d后在培养基中添加Puro抗性进行筛选。药筛3d后，观察细胞荧光率。
·稳转株构建结果分析
HCT116细胞用慢病毒法构建稳转株，药筛3d后细胞生长较密，荧光偏弱。piggyBAC法通过脂质体转染，药筛3d后，细胞数较少，但荧光率更高，且荧光更强，如图4所示。说明piggyBAC法能够有效的将基因整合到基因组中。
实施例2
在RAW264.7细胞中构建基因mCtnnd1[NM_007615.4]过表达稳转株， piggyBAC法构建过表达稳转株。
piggyBAC法稳转株构建步骤：
通过HiFi DNA Assembly(NEB#E5520)连接的方式，依次将基因过表达元件mCtnnd1[NM_007615.4]、荧光标记EGFP、筛选抗性基因 Puro，克隆至piggyBAC表达载体，载体信息如图2所示。
将稳转载体和pBase表达载体通过Lipo3000方式共转染RAW264.7细胞1×105细胞，转染1d后在培养基中添加Puro进行筛选。药筛3d后，观察细胞荧光率。
对照例2
在RAW264.7细胞中构建基因mCtnnd1[NM_007615.4]过表达稳转株，采用慢病毒法构建过表达稳转株。
慢病毒法稳转株构建步骤：
通过HiFi DNA Assembly(NEB#E5520)连接的方式，依次将基因过表达元件mCtnnd1[NM_007615.4]、荧光标记EGFP、筛选抗性基因 Puro，克隆至慢病毒表达载体中，载体信息如图3所示。
在293T细胞中共转染慢病毒表达载体和辅助质粒进行慢病毒包装，48h 后收取细胞培养基，也就是病毒原液。通过Q-PCR测定慢病毒滴度。取 3×105RAW264.7细胞，MOI 30慢病毒感染目标细胞，3d后在培养基中添加Puro抗性进行筛选。药筛3d后，观察细胞荧光率。
·稳转株构建结果分析
在RAW264.7细胞中，慢病毒法构建细胞株时细胞较密，荧光偏弱。piggyBAC法荧光率和慢病毒法相似，但荧光强度比慢病毒法更强，如图5 所示。
piggyBAC法构建的HCT116和RAW264.7细胞稳转株，传代8代以上，荧光率和荧光强度没有降低。说明piggyBAC法将基因整合到基因组中，可以实现长时间持续表达。电转突变型pBase-MU表达质粒，荧光明显降低，说明可以将整合基因切除。
实施例3.
在Human MSC细胞中构建hYWHAH[NM_003405.3]过表达稳转株。
尝试通过piggyBAC法进行稳转株构建：
通过HiFi DNA Assembly(NEB#E5520)连接的方式，依次将基因过表达元件mCtnnd1[NM_007615.4]、荧光标记EGFP、筛选抗性基因嘌呤霉素，克隆至piggyBAC表达载体，将载体分别用Lipo 3000和电转的方式进行Human MSC细胞转染。1d后Puro药筛3d，细胞状态正常，没有出现老化情况。电转转染优于Lipo，细胞存活较多，荧光率>80％，如图6所示。
而慢病毒法在MOI 30感染Human MSC细胞后，出现细胞老化现象，无法进行传代及后续实验，低MOI时感染效率很低。
·证明在慢病毒法影响细胞状态时，piggyBAC法能够更好的进行稳转株的构建。
本发明方法和慢病毒法的区别如下
以上所述具体实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进或替换，这些改进或替换也应当视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)载体构建:
将基因过表达或干扰元件片段、荧光标记片段及抗性筛选片段依次插入到piggyBAC载体的ITR片段之间，得到载体A；
(2)质粒转染和单克隆
将构建的载体A和pBase表达质粒共转染靶细胞，转染后，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，然后挑单克隆进行培养；
(3)阳性克隆鉴定
选前述的单克隆培养细胞进行Q-PCR检测，鉴定目标基因过表达或干扰的效果；
(4)表达元件切除
如需要将基因过表达或干扰元件片段去除时，将pBase-MU质粒转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间序列整体切除，原位点不残余任何序列，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。
2.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的基因包括小鼠、大鼠和人的所有外显子基因。
3.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的荧光标记片段选自GFP、mCherry、CFP、RFP或YFP能被荧光显微镜检测的基因。
4.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗性筛选片段选自嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或G418抗生素序列片段。
5.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述转染为电转染方式或脂质体转染方式。
6.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞选自哺乳动物细胞。
7.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，pBase表达质粒来自SBI公司PB210PA-1产品。
8.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，pBase-MU质粒来自SBI公司PB220PA-1产品。
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