JP6469371B2 - 人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 - Google Patents
人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6469371B2 JP6469371B2 JP2014132622A JP2014132622A JP6469371B2 JP 6469371 B2 JP6469371 B2 JP 6469371B2 JP 2014132622 A JP2014132622 A JP 2014132622A JP 2014132622 A JP2014132622 A JP 2014132622A JP 6469371 B2 JP6469371 B2 JP 6469371B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- gene
- ips cells
- foreign
- ips
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 315
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 120
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 title claims description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 65
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 88
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 36
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 35
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 34
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 claims description 33
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 claims description 31
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 claims description 31
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 28
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 26
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 25
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 25
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 23
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 102100035961 Hematopoietically-expressed homeobox protein HHEX Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 claims description 3
- 101001021503 Homo sapiens Hematopoietically-expressed homeobox protein HHEX Proteins 0.000 claims description 3
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 claims description 3
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 21
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 10
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 108010008655 Epstein-Barr Virus Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 101150111463 ID2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150047228 Id3 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 101000574441 Mus musculus Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- DJOWTWWHMWQATC-KYHIUUMWSA-N Karpoxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1(O)C(C)(C)CC(O)CC1(C)O)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)CC(O)CC2(C)C DJOWTWWHMWQATC-KYHIUUMWSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000751119 Mila <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000829388 Mus musculus polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229940126574 aminoglycoside antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000012835 hanging drop method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Description
1)エピソーマルベクターを用いて、iPS細胞に外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
2)外来遺伝子がトランスフェクションされたiPS細胞を、薬剤選択マーカー及び/又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、及び
3)選別されたiPS細胞を、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法を提供する。
1)エピソーマルベクターに、
(i) 外来遺伝子、
(ii) G418(登録商標)又はハイグロマイシンBに対する薬剤選択マーカー、及び、
(iii) EGFPをコードする核酸配列(配列番号7)又はCherryPicker(登録商標)をコードする核酸配列(配列番号8)を有するレポーター遺伝子
の(i)ないし(iii)を組み合わせて組み込んだ複数の種類のエピソーマルベクター構築物を作製する工程、
2)複数のエピソーマルベクター構築物を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてiPS細胞にトランスフェクションすることにより、複数の外来遺伝子をiPS細胞にトランスフェクションする工程、
3) (i)ないし(iii)の組み合わせに対応して、
G418及び/又はハイグロマイシンBの添加により薬剤選択マーカーを用いて、及び/又は、
緑色及び/又は赤色の蛍光を指標としてレポーター遺伝子を用いて、
前記複数の外来遺伝子が導入されたiPS細胞を選別する工程、並びに、
4)選別されたiPS細胞を、1.6から160×103個/mLの細胞濃度で、回転速度2.5から9.9rpmの回転培養法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法を提供する。
1)エピソーマルベクターを用いて、iPS細胞に該外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
2)該外来遺伝子がトランスフェクションされたiPS細胞を、薬剤選択マーカー及び/又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、及び、
3)選別されたiPS細胞を、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法を提供する。
細胞培養
ヒトiPS細胞株201B7(理研細胞バンク、つくば)を、マトリゲル(ベクトン・ディッキンソン、米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス)の薄層コーティングを伴うプレート又はディッシュ(アサヒテクノグラス、船橋)においてReproFF培地(ReproCELL、横浜)でフィーダー細胞なしで培養した。加湿チャンバーにおいて5%CO2下、37°Cに保たれ、アキュターゼ(イノベーティブ セル テクノロジーズ社、米国サンディエゴ)を用いて細胞を採取した。この細胞を、それぞれ、メトリディアルシフェラーゼ(MetLuc)アッセイを実施するために24ウェル及び96ウェルプレートに播種した。これらのディッシュ及びプレートに対して、マトリゲル(0.3mL)及びDMEM−F12培地(8.7mL)の混合物を塗布することによって薄くコーティングした。このディッシュを室温で3時間インキュベーションした。前記細胞の形態学的特徴をCKX41N−31PHP顕微鏡(オリンパス、東京)で観察した。選択条件を決定するために、G418(和光純薬株式会社、大阪)及び/又はハイグロマイシンB(和光純薬株式会社)を培地に添加し、7時間後に顕微鏡下で細胞を観察した。2重トランスフェクションした細胞を選択するために、G418(200μg/mL)及びハイグロマイシンB(300μg/mL)を、それぞれ、トランスフェクション4日ないし6日後に添加した。トリパンブルーで染色し、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。
細胞(1.6×103、×104及び×105細胞/mL)を、10μmol/L Y−27632(和光純薬)を添加したReproFF培地に懸濁し、CSM03020マイルド細胞振盪機(タイテック、越谷)を用いて加湿チャンバーにおいて5%CO2下、37°Cで24時間、回転培養した。50μL、100μL、300μL及び500μLの細胞懸濁液を、それぞれ、96ウェル、24ウェル、12ウェル及び6ウェルプレートのウェルに加えた。1mL、5mL及び5mLの細胞懸濁液を、それぞれ、6cm及び10cmの組織培養ディッシュ及び10cmペトリ皿に加えた。Y−27632を、Rho関連コイルドコイルフォーミングキナーゼ(Rho-associated coiled-coil forming kinase)を阻害し、201B7細胞のアポトーシスを回避するために添加した(Watanabe Kら、Nat Biotechnol.25:681-6;2007)。至適細胞固定及び増殖について表面処理の効果を比較するために、10cm組織培養ディッシュ及び10cmペトリ皿を比較した。回転速度は、回転速度の効果を解析するために9.9rpm又は2.5rpmに設定した。胚様体のサイズ及び形状を解析するために長さ(長径)及び幅(短径)を測定した。
EGFPをコードする配列(配列番号7:クロンテック、カリフォルニア州マウンテンビュー)を有するポリヌクレオチドをLA PCR Kit Ver.2.1(タカラ、京都)を用いてpEGFP−N1から増幅し、pBlue/EGFPを作製するためにpBluescript II SK(−)(アジレント・テクノロジー株式会社、カリフォルニア州サンタクララ)の5’−KpnI−XbaI−3’部位にサブクローニングした。EGFP配列をバリデーションした(株式会社バイオマトリックス研究所、流山)。CherryPicker(登録商標:CherryPicker1)(クロンテック)のコーディング領域(配列番号8)をLA PCR Kit Ver.2.1を用いて増幅し、pBlue/Cherryを作製するためにpBluescript II SK(−)の5’−KpnI−XbaI−3’部位にサブクローニングした。前記コーディング領域の配列をバリデーションした(株式会社バイオマトリックス研究所)。
(配列番号1) 5’-ATCGTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’
(配列番号2) 5’-ATCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’
CherryPickerのクローニングに使用したフォワードプライマー(配列番号3)及びリバースプライマー(配列番号4)は、それぞれ、以下のとおりである。
(配列番号3) 5’-ATCGTCTAGAATGATGGTGGACGGCGACAA-3’
(配列番号4) 5’-ATCGGGTACCTCATTTGTACAGCTCGTCCA-3’
(1)98°Cで変性反応20秒間
(2)60°Cでアニーリング及び伸長反応3分間
(1)及び(2)を30サイクル
(配列番号5)5’-AGCGGCCGCGAGCTCGGTACCTA-3’
(配列番号6)5’-GGCCTAGGTACCGAGCTCGCGGCCGCTGTAC-3’
接着培養法では、播種後24時間の細胞がウェルの底に接着したときに、細胞にトランスフェクションした。懸濁培養法では、細胞をアキュターゼで採取し、ドラフト内において、室温で5分間トランスフェクション試薬に懸濁した後、インキュベーションした。トランスフェクション試薬は、FuGENE HDトランスフェクション試薬(プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン)、リポフェクタミンLTX(ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド)、X−tremeGENEトランスフェクション試薬(ロシュ、スイスバーゼル)、及び、TransIT−2020トランスフェクション試薬(ミラスバイオ、米国ウィスコンシン)を製造者の取扱説明書に従って使用した。
胚様体を6ウェルプレートで201B7細胞から形成させた。胚様体を156×gでの遠心分離によって採取し、上清を除去した。この胚様体を、ReproFF培地に懸濁し、そしてトランスフェクションした。胚様体を2mLのReproFFに懸濁し、FuGENE HDとともに、1.0μgのpEBNK/EGFP−Neo及び1.0μgのpEBNK/Cherry−Hygでトランスフェクションした。
96ウェルプレートでは、ウェルあたり50μLの培地で培養した201B7細胞に100ngのpMetLuc2−レポーターをトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞はメトリディアルシフェラーゼを前記培地中に分泌する。トランスフェクション後、培地を50μLのReproFFで毎日交換した。メトリディアルシフェラーゼの活性を、製造者の取扱説明書に従ってReady−To−Glow分泌型ルシフェラーゼレポーターアッセイ(クロンテック)を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性をモニターするために前記培地を毎日交換した。ルシフェラーゼ活性は、Gene Light(GL−200A)(マイクロテック社、船橋)を用いて測定した。トランスフェクション効率をモニターするために、pSEAP2対照ベクター(クロンテック)を、pMetLuc2−レポーター又はpEBMulti/Met−Hygの10%でトランスフェクションした。転写活性は、製造者の取扱説明書に従って分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)化学発光キット(クロンテック)及びGene Lightを用いて測定した。ルシフェラーゼ活性は、前記メトリディアルシフェラーゼ活性を前記SEAP活性で除算して算出した。
懸濁培養法を用いて、201B7細胞に対してFuGENE HDを用いて1.0μgのpEBNK/EGFP−Neo及び1.0μgのpEBNK/Cherry−Hygをトランスフェクションした後、10μmol/LのY−27632を添加した6ウェルプレートで培養した。G418(200μg/mL)及びハイグロマイシンB(300μg/mL)を、トランスフェクション後4日に添加した。G418及びハイグロマイシンBを、インキュベーション後2日に培地から除去した。
ImageJ 1.42q(アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ)を画像解析で使用した。画像の201B7細胞の領域を輪郭化し、その面積を測定した。ソフトウェアでCherryPickerのシグナル面積を自動的に測定した。この画像を、赤色、緑色及び青色の波長帯域に分離した。この赤色の波長帯域(CherryPicker)をさらなる解析のために選定した。CherryPicker陽性細胞の百分率を算出するために、CherryPickerシグナルの面積を、上記輪郭化された関心領域の面積で除算した。
一元配置分散分析(ANOVA)は、JMP 10.0.2ソフトフェア(SAS Institute Japan株式会社、ノースカロライナ州ケーリー)で行った。p値が0.05未満の場合に、統計学的に有意とした。チューキー−クレーマー(Tukey-Kramer)検定を対の統計学的有意なデータの研究に適用した。
FuGENE HD、リポフェクタミンLTX、X−tremeGENE及びTransIT−2020のトランスフェクション試薬について比較することにより、トランスフェクションの最も効率的な試薬を同定した。接着細胞及び懸濁された細胞におけるメトリディアルシフェラーゼの活性を分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)の活性で除算して、相対ルシフェラーゼ活性によって比較した。トランスフェクション効率における細胞濃度の影響を比較するために、96ウェルプレートに1.8×105及び9.0×105細胞/ウェルで細胞を播種した。実験を3回繰り返した。FuGENE HDを用いる細胞トランスフェクションの懸濁培養法が、1.8×105細胞/ウェル(図1A)及び9.0×105細胞/ウェル(図1B)の両方の細胞濃度で最も効率的であった(P<0.05)。1.8×105細胞/ウェル(図1A)で、FuGENE HDを用いる懸濁培養法又は接着培養法、及び、LTXを用いる接着培養法は、より高い相対ルシフェラーゼ活性を示した(P<0.05)。9.0×105細胞/ウェル(図1C)での、FuGENE HD及びLTXを用いる懸濁培養法又は接着培養法が、最高効率をもたらした(P<0.05)。さらなる研究のために、9.0×105細胞/ウェルで、FuGENE HD又はリポフェクタミンLTXを用いる懸濁培養法を選択した。
さまざまな試薬でのベクターのトランスフェクションの操作は簡単である。ベクターのトランスフェクションで大きく制限されることの1つは、低いトランスフェクション効率である。本発明では、初めに、iPS細胞でより高いトランスフェクション効率を達成する方法を確立するために、FuGENE HD、リポフェクタミンLTX、X−tremeGENE及びTransIT−2020の試薬を比較した。トランスフェクションは、典型的に、プレート又はディッシュで増殖し付着している細胞で実施される。しかし、解離細胞及び懸濁細胞でのアデノウイルスベクターの導入は、接着細胞よりもより効率的であることが示されている(非特許文献3)。接着培養法を用いて、アデノウイルスベクターは、iPS細胞コロニーの周縁部に導入される(非特許文献3)。本発明者は、接着培養法及び懸濁培養法を比較した。上記の結果は、非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬であるFuGENE HDトランスフェクション試薬を用いる懸濁培養法が最も効果的であることを示した。特に、FuGENEは、エレクトロポレーションの場合のように、同一のトランスフェクション効率を達成する(非特許文献19)。したがって、懸濁培養法を用いてのFuGENE HDでのトランスフェクションが、iPS細胞にベクターを導入するのに最も適しているとの結論を得た。
Claims (10)
- ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体にタンパク質をコードする複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
1)前記外来遺伝子毎に該外来遺伝子を挿入したエピソーマルベクターを用いて、iPS細胞の懸濁液を添加して培養するiPS細胞に外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
2)外来遺伝子がトランスフェクションされたiPS細胞を、薬剤選択マーカー及び/又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、及び
3)選別されたiPS細胞を、16から160×10 3 個/mLの細胞濃度で、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法。 - 前記外来遺伝子が2種以上であり、遺伝子毎に異なる薬剤選択マーカー及び/又はレポーター遺伝子を組み合わせてエピソーマルベクター構築物を作製することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記外来遺伝子が2種であり、外来遺伝子毎に異なる薬剤選択マーカー及び/又は配列番号7又は8に記載の配列を有するレポーター遺伝子から選択される核酸を含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記外来遺伝子が、分化を誘導する転写因子より選ばれることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写因子は、FOXA2、GATA4、HEX及びC/EBPαからなる群から選択される2種以上であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記非静的な培養方法は回転培養法であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記回転培養法における培養時の回転速度が2.5から9.9rpmであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成るタンパク質をコードする外来遺伝子が導入された胚様体であって、
1)前記外来遺伝子毎に該外来遺伝子を挿入したエピソーマルベクターを用いて、iPS細胞に外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
2)外来遺伝子がトランスフェクションされたiPS細胞を、薬剤選択マーカー及び/又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、及び
3)選別されたiPS細胞を、16から160×10 3 個/mLの細胞濃度で、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法で製造された胚様体。 - ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体にタンパク質をコードする複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
1)エピソーマルベクターに、
(i) 外来遺伝子、
(ii) G418(登録商標)又はハイグロマイシンBに対する薬剤選択マーカー、及び、
(iii) EGFPをコードする核酸配列(配列番号7)又はCherryPicker(登録商標)をコードする核酸配列(配列番号8)を有するレポーター遺伝子の(i)ないし(iii)を組み合わせて組み込んだ、前記外来遺伝子毎に該外来遺伝子を挿入した複数の種類のエピソーマルベクター構築物を作製する工程、
2)複数のエピソーマルベクター構築物を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてiPS細胞にトランスフェクションすることにより、複数の外来遺伝子をiPS細胞にトランスフェクションする工程、
3) (i)ないし(iii)の組み合わせに対応して、
G418及び/又はハイグロマイシンBの添加により薬剤選択マーカーを用いて、及び/又は、
緑色及び/又は赤色の蛍光を指標としてレポーター遺伝子を用いて、
前記複数の外来遺伝子が導入されたiPS細胞を選別する工程、並びに、
4)選別されたiPS細胞を、16から160×103個/mLの細胞濃度で、回転速度2.5から9.9rpmの回転培養法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法。 - ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成るタンパク質をコードする複数の外来遺伝子が導入された胚様体であって、
1)エピソーマルベクターに、
(i) 外来遺伝子、
(ii) G418(登録商標)又はハイグロマイシンBに対する薬剤選択マーカー、及び、
(iii) EGFPをコードする核酸配列(配列番号7)又はCherryPicker(登録商標)をコードする核酸配列(配列番号8)を有するレポーター遺伝子の(i)ないし(iii)を組み合わせて組み込んだ複数の種類のエピソーマルベクター構築物を作製する工程、
2)前記外来遺伝子毎に該外来遺伝子を挿入した複数のエピソーマルベクター構築物を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてiPS細胞にトランスフェクションすることにより、複数の外来遺伝子をiPS細胞にトランスフェクションする工程、
3) (i)ないし(iii)の組み合わせに対応して、
G418及び/又はハイグロマイシンBの添加により薬剤選択マーカーを用いて、及び/又は、
緑色及び/又は赤色の蛍光を指標としてレポーター遺伝子を用いて、
前記複数の外来遺伝子が導入されたiPS細胞を選別する工程、並びに、
4)選別されたiPS細胞を、16から160×103個/mLの細胞濃度で、回転速度2.5から9.9rpmの回転培養法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法で製造された胚様体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014132622A JP6469371B2 (ja) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | 人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014132622A JP6469371B2 (ja) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | 人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016010330A JP2016010330A (ja) | 2016-01-21 |
JP2016010330A5 JP2016010330A5 (ja) | 2017-08-10 |
JP6469371B2 true JP6469371B2 (ja) | 2019-02-13 |
Family
ID=55227519
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014132622A Active JP6469371B2 (ja) | 2014-06-27 | 2014-06-27 | 人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6469371B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190141218A (ko) * | 2017-04-26 | 2019-12-23 | 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 | 사용 준비된 냉동보존 세포 |
CN107164527B (zh) * | 2017-06-29 | 2018-04-20 | 杭州观梓健康科技有限公司 | 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法 |
CN111139218A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-12 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 用诱导多能干细胞或胚胎干细胞快速高效制备拟胚体的方法 |
-
2014
- 2014-06-27 JP JP2014132622A patent/JP6469371B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016010330A (ja) | 2016-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230272346A1 (en) | Compositions and methods for increasing the culture density of a cellular biomass within a cultivation infrastructure | |
CN107828738A (zh) | 一种dna甲基转移酶缺陷型cho细胞系及其制备方法及应用 | |
Kouprina et al. | A new generation of human artificial chromosomes for functional genomics and gene therapy | |
US20230068547A1 (en) | Compositions and methods for compartment-specific cargo delivery | |
CN106893739A (zh) | 用于靶向基因操作的新方法和系统 | |
BR112020016570A2 (pt) | Composições e métodos para liberação de proteína de membrana | |
WO2019214290A1 (zh) | 一种生产嵌合抗原受体修饰的γδT细胞的方法 | |
Di Matteo et al. | PiggyBac toolbox | |
EP1559782A1 (en) | Human artificial chromosome (hac) vector | |
CN104471060A (zh) | 用于建立人工多能干细胞的高效方法 | |
KR20160145814A (ko) | 세포 생산성을 향상시키는 마이크로rna | |
ES2547700T3 (es) | Nueva línea de células humanas permanente | |
WO2013079670A1 (en) | Haploid cells | |
CN107893073A (zh) | 一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型hek293细胞株的方法 | |
US20070072172A1 (en) | Liver specific chimeric regulatory sequence and use thereof | |
JP6469371B2 (ja) | 人工多能性幹細胞(iPS細胞)から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 | |
CN103923942B (zh) | 一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体及其构建方法与在建立猪永生化细胞系中的应用 | |
KR102428606B1 (ko) | 향상된 유전자 전달 방법 | |
Sauter et al. | Induced neurons for the study of neurodegenerative and neurodevelopmental disorders | |
Grossi et al. | Generation of knockout human primary keratinocytes by CRISPR/Cas9 | |
CN109868286A (zh) | 一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 | |
WO2022243320A1 (en) | Method for producing a biomolecule by a cell | |
CN102533764A (zh) | Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用 | |
JP2021048875A (ja) | 膵内分泌細胞の製造方法、及び分化転換剤 | |
CN115948472B (zh) | 诱导过表达的runx1在构建耗竭t细胞模型中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170623 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170623 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180626 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180820 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181225 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190116 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6469371 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |