ES2547700T3 - Nueva línea de células humanas permanente - Google Patents

Abstract

Un método para la producción de una línea de células amniocíticas humanas permanente que comprende: a) transfectar células amniocíticas humanas primarias con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los productos génicos adenovirales E1A y E1B y b) subsiguientemente transfectar la línea de células amniocíticas humanas permanente obtenida en la etapa a) con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1).

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E10721938

18-09-2015

establecidas desde hace varios años, se pueden transfectar a demanda con la molécula de ácido nucleico anteriormente mencionado en una transfección 2.

La presente invención describe una línea de células amniocíticas humanas permanente producida por el método de la presente invención, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos para las funciones génicas adenovirales E1A y E1B y una secuencia de ácidos nucleicos para el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr ( EBV) (EBNA-1). Se describe además una línea de células amniocíticas humanas permanente que comprende la secuencia de ácidos nucleicos para las funciones génicas adenovirales E1A, E1B y pIX y la secuencia de ácidos nucleicos para antígeno T grande de SV40 o antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA 1).

La presente invención describe un método para la expresión transitoria de polipéptidos o proteínas recombinantes mediante el uso de la línea de células amniocíticas humanas permanente producida por el método de la presente invención, que comprende las etapas siguientes:

a) transfectar dicha línea de células amniocíticas humanas permanente con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o proteína recombinante deseados y un sitio de reconocimiento o de unión para el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1),

b) cultivar la línea de células amniocíticas humanas permanente transfectada obtenida en la etapa a) en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido o proteína recombinante deseada, y, subsiguientemente,

c) aislar dicho polipéptido o proteína recombinante deseados de las células o del sobrenadante del cultivo.

Si la línea de células amniocíticas humanas permanente producida de acuerdo con la presente invención contiene una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno T grande de SV40, la línea de células es, p. ej., transfectada con un plásmido de expresión que contiene una casete de expresión o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el transgén que se ha de expresar y el origen de replicación de SV40 (SV40 ori). El antígeno T grande de SV40 que se expresa de forma estable intracelularmente en la línea de células se une al origen de replicación de SV40 del plásmido de expresión que se ha de introducir por transfección en la línea de células y causa una replicación episomal del plásmido de expresión y con ello una amplificación del número de copias del transgén que se ha de expresar. El producto génico deseado codificado por el transgén puede obtenerse a partir de las células o del sobrenadante de cultivo después de que las células han sido cultivadas durante unos pocos días. Así pues, dicho transgén se expresa de forma transitoria.

Si la línea de células humanas permanente producida de acuerdo con la presente invención contiene una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1), la línea de células es p. ej. transfectada con un plásmido de expresión que comprende una casete de expresión o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el transgén que se ha de expresar y el origen de replicación de EBV (EBV oriP) (Durocher et al., Nucleic Acids Research Vol. 30 Nº 2 e9, 2002; Tuvesson et al. Cytotechnology 56: 123 -136, 2008). El EBNA-1 de EBV que se expresa de forma estable intracelularmente en la línea de células se une al origen de replicación oriP del plásmido de expresión que se ha de introducir por transfección en la línea de células y causa una replicación episomal del plásmido de expresión y con ello una amplificación del número de copias del transgén que se ha de expresar. El producto génico deseado codificado por el transgén puede obtenerse a partir de las células o del sobrenadante de cultivo después de que las células han sido cultivadas durante unos pocos días. Así pues, dicho transgén se expresa de forma transitoria.

Las células producidas de acuerdo con la presente invención pueden ser cultivadas bajo condiciones usuales para el cultivo de células eucariotas a aproximadamente 37 °C, 95% de humedad y 8% de CO2. Las células producidas de acuerdo con la presente invención pueden ser cultivadas en medio que contiene suero o medio libre de suero, en cultivo adherente o en cultivo en suspensión. El cultivo en suspensión puede tener lugar en diversos fermentadores, por ejemplo, en reactores de tanque agitado, reactores de onda, en vasos de sacudidora o vasos centrifugadores o en las llamadas botellas rodantes. Por tanto, las células son adecuadas para escalar un proceso a la escala industrial. La transfección de las células para la expresión transitoria puede tener lugar con los diversos métodos de transfección como se mencionaron anteriormente. La transfección y la expresión transitoria pueden también llevarse a cabo en el formato de alta producción y cribado, respectivamente, p. ej. en un formato de 96 o 384 pocillos.

El antígeno T del virus de simio 40 (SV40) es una fosfoproteína multifuncional que controla tanto la replicación viral como las funciones celulares después de la infección. El antígeno T es un agente de transformación e interfiere en el ciclo celular a través de la interacción con la proteína supresora de tumores p53. Durante la replicación del genoma viral el antígeno T está necesariamente como ADN helicasa para arrancar el genoma de doble cadena. El antígeno T es la única proteína viral que es necesaria para la replicación. Las otras funciones son cumplimentadas por las proteínas celulares. En la primera etapa de la replicación del ADN, 12 moléculas de antígeno T se unen al origen de la replicación del ADN (ori) en el genoma de SV40 en forma de hexámeros dobles. Subsiguientemente, las proteínas celulares necesarias, tales como ADN polimerasa se unen a dicho complejo de helicasa y arrancan y replican el

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10721938

18-09-2015

ADN. El llamado "ori mínimo" consiste en una secuencia núcleo que es de 63 pb de longitud. No tiene lugar ninguna integración en el genoma del huésped en una transfección transitoria de plásmidos circulares en la célula diana. Esto tiene como resultado que la concentración del plásmido disminuye constantemente después de la división celular y la expresión de un gen que está en el plásmido de codificación es sólo temporal. La introducción del fragmento ori de SV40 en el plásmido de expresión y la expresión del antígeno T de SV40 en la línea de células de producción tiene como resultado un aumento del número de copias del plásmido y por tanto un aumento de la eficacia de la expresión.

El método para la expresión transitoria de polipéptidos y proteínas de acuerdo con la presente invención tiene la ventaja de que es más eficaz desde el punto de vista de la cantidad y la calidad del producto génico recombinante y por tanto es también más rentable en la totalidad del proceso de desarrollo industrial de terapias basadas en proteínas que los métodos utilizados hasta ahora. En particular, es ventajoso que se proporciona un sistema de expresión transitoria altamente eficaz sobre la base de una línea celular humana, que en primer lugar modifica las proteínas humanas auténticamente postraduccional en contraste con las células de mamíferos no humanos y células no de mamíferos, y que en segundo lugar sea comparativamente bien adecuado para el establecimiento de líneas de células de producción estables en el proceso de producción industrial. En esto puede asegurarse que en el curso del desarrollo de productos de diagnóstico y terapéuticos las características cualitativas del producto génico después de la expresión transitoria en la etapa temprana de desarrollo y después de la expresión estable en líneas de células de producción permanentes en la fase tardía y la producción industrial tienen la identidad mayor posible, en particular con respecto a diferencias en las características, que pueden ser causadas por la naturaleza de los sistemas de células.

Otra ventaja de la presente invención es que las líneas de células humanas permanentes producidas de acuerdo con la presente invención muestran un alto rendimiento de expresión por la expresión transitoria. Por tanto, se han encontrado rendimientos de producción sorprendentemente altos de hasta 60 mg/litro en el sobrenadante de cultivo en la expresión transitoria en líneas de células amniocíticas que producen antígeno T de SV40 después de la transfección con un vector de plásmido que tiene además de la secuencia que codifica el producto génico deseado un origen de replicación de SV40 (SV40 ori). Dichos rendimientos de producción han sido por encima de 70 veces más altos que en la expresión transitoria en una línea de células amniocíticas que no expresan antígeno T.

Una ventaja más de dicha línea de células humanas permanente producida de acuerdo con la presente invención es que se proporciona un sistema de células humanas basado en amniocitos humanos inmortalizados, que es adecuado tanto para la expresión transitoria de proteínas como para la expresión estable de proteínas en líneas de células de producción permanentes (Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). En comparación con el uso de diferentes sistemas de células para la expresión transitoria (por ejemplo, las variantes HEK293 o HEK293) y la expresión estable (por ejemplo, CHO), se reduce al mínimo el riesgo de que las propiedades estructurales y funcionales de los productos de expresión de la producción transitoria y estable difieran entre sí, si dichas propiedades estructurales y funcionales se basan en la naturaleza del sistema de expresión. Con ello se mejora la planificación del proceso de desarrollo y el proceso de desarrollo exige menos tiempo y es más económico.

Las secuencias de ácidos nucleicos para la expresión de al menos un polipéptido recombinante están contenidas en al menos una casete de expresión. Dichas casetes de expresión contienen promotores y secuencias de terminación transcripcional. El promotor CMV (citomegalovirus) (Makrides, 9 -26 en: Makrides (Hrsg), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells Elsevier, Amsterdam, 2003), el promotor EF-1α (Kim et al, Gene 91: 217 -223, 1990), el promotor CAG (un promotor híbrido del potenciador inmediato-temprano del citomegalovirus humano y un promotor de β-actina de pollo modificado con primer intrón) (Niwa et al, Gene 108: 193 -199, 1991), el promotor de pgk (fosfoglicerato quinasa) humano o murino (Adra et al., Gene 60: 65 -74, 1987), el promotor RSV (virus del sarcoma de Rous) (Makrides, 9 -26 en: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) o el promotor SV40 (virus de simio 40) (Makrides, 9 -26 en: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) pueden servir, por ejemplo, como promotores. Las secuencias de poliadenilación del antígeno T grande de SV40 (GenBank nº de entrada J02400) o el gen del G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos) humano (Mizushima und Nagata, Nucl. Acids Res.

18: 5322, 1990) pueden servir por ejemplo como sitios de poliadenilación.

La presente invención describe el polipéptido o proteína obtenidos mediante el uso del método de acuerdo con la presente invención.

El polipéptido recombinante del método de acuerdo con la presente invención puede ser una proteína terapéutica, tal como alfa 1-antitripsina o factores de crecimiento humano tales como eritropoyetina o interleucina-2. La antitripsina alfa 1 humana (hAAT) es un inhibidor de proteinasa que inhibe la elastasa y otras proteinasas y que es terapéuticamente activo en el caso de la deficiencia de hAAT heredada que conduce a graves daños de pulmón y de hígado. La eritropoyetina es un factor importante para el crecimiento para los eritrocitos (glóbulos rojos) que tiene una actividad de formación de sangre en el caso de anemia, así como en el caso de pacientes de un trasplante. La interleucina-2 (Il-2) es un mensajero celular del sistema inmunitario y es de importancia significativa en la activación de la respuesta inmunitaria celular, por ejemplo en el caso de enfermedades tumorales. Los factores de coagulación sanguínea, como el factor VIII y IX usados en el caso de pacientes con hemofilia que tienen trastornos de coagulación de la sangre, también pertenecen a los polipéptidos terapéuticamente activos. El polipéptido

imagen6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E10721938

18-09-2015

expresa dentro de la línea celular y es el componente enzimático o estructural necesario para la producción de los vectores de transferencia génica, el cual componente no está codificado en la molécula de ácido nucleico del vector de transferencia de genes. En tales vectores de transferencia génica ciertas funciones génicas virales son usualmente borradas por razones de seguridad. Vectores de transferencia de genes, cuyos factores de complementación pueden ser codificados por el transgén introducido por el método descrito, son, por ejemplo, los vectores que están basados en adenovirus, virus asociado en adenovirus (AAV), retrovirus o lentivirus o virus herpes. El factor de complementación expresado dentro de la línea celular también puede complementar virus borrados o recombinantes durante su producción, los cuales virus no contienen un gen a transferir y de este modo no actúan como vector de transferencia génica, sino que se usan, por ejemplo, como vacuna.

El polipéptido que es expresado transitoriamente por el presente método también puede ser un polipéptido receptor que está localizado en particular en la superficie de la célula y que es responsable de la infección de la célula por un virus y la transducción de la célula por un vector de transferencia génica viral, respectivamente. Como receptor viral para la etapa inicial de la infección de las células con el adenovirus serotipo 2 o 5, del que se derivan la mayor parte de los vectores adenovirales convencionales, fue identificado el llamado receptor de Coxsackie y adenovirus, CAR (Bergelson et al., Science 275 : 1320 -1323, 1997). La expresión suficiente de CAR en la superficie es un requisito previo de que una célula es adecuada para ser una célula de producción de vectores de transferencia génica adenovirales. En una realización preferida el polipéptido recombinante es el receptor de Coxsackie y adenovirus (CAR). La sobreexpresión del polipéptido receptor puede mejorar significativamente la infecciosidad y, por tanto la eficiencia de producción de estas células en relación con los vectores adenovirales. Además, la molécula de ácido nucleico puede codificar, además de CAR, los receptores secundarios o receptores de internalización tales como ciertas integrinas que median en la absorción del virus y del vector de transferencia de genes, respectivamente, en la célula y cuya expresión adicional es ventajosa en la producción de células de producción para los vectores adenovirales.

El método descrito puede usarse, entre otros fines, para la producción de polipéptidos terapéuticos, factores de coagulación de la sangre y de crecimiento, hormonas y anticuerpos, así como polipéptidos virales, bacterianos o parasitarios para su uso como vacuna. Además, las células producidas de acuerdo con la presente invención pueden ser usadas para la producción de proteínas de interés para diagnóstico, tales como antígenos virales, bacterianos o parasitarios o los correspondientes anticuerpos específicos. Además, las células producidas de acuerdo con la presente invención pueden ser usadas para la producción de proteínas de interés técnico o industrial, tales como enzimas para la catálisis de procesos técnicos de síntesis o para la degradación de sustancias nocivas. Las células producidas de acuerdo con la presente invención pueden expresar uno o también más polipéptidos recombinantes diferentes. El número de polipéptidos expresables depende de cómo muchas secuencias diferentes de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos recombinantes son transfectadas transitoriamente en las células con el método de acuerdo con la presente invención.

Además, la presente invención se refiere al uso de líneas de células amniocíticas humanas permanentes producidas de acuerdo con el método de la presente invención para la producción de un polipéptido o proteína.

Los ejemplos que siguen ilustran la invención y no han de ser considerados limitantes. A menos que se indique otra cosa, se utilizaron métodos moleculares estándar tal como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.

1. Procedimientos de clonación.

a. Plásmidos para la transformación de amniocitos primarios: pSTK146, pGS119, pGS122.

El plásmido pSTK146 fue descrito en detalle en el documento EP 1230354 B1 y comprende el promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK) murina, secuencias de nucleótidos (nt.) de serotipo 5 de adenovirus (Ad5) 505 a 3522 y la señal de corte y empalme y poliadenilación de SV40. Las secuencias adenovirales en pSTK146 comprenden la región que codifica E1A y E1B, en donde la expresión de E1A está regulada por el promotor de pgk.

El plásmido pGS119 fue descrito con detalle en el documento WO 2007/056994 y contiene el promotor de pgk murina, secuencias Ad5 de nt. 505 -3522 (que comprenden la región E1A y E1B), la señal de corte y empalme y de poliadenilación de SV40, seguido por la región pIX de Ad5 nt. 3485 -4079.

El plásmido pGS122 fue descrito en detalle en el documento WO 2007/056994 y contiene las secuencias adenovirales nt. 1 -4344 que comprenden las regiones E1A, E1B y pIX incluyendo los correspondientes promotor regulador y secuencias de poliadenilación. Las secuencias adenovirales en pGS122 están flanqueadas por sitios de restricción PmeI.

b. Plásmidos de expresión para el antígeno T: pGS158, pGS159, pGS161.

Los plásmidos pGS158, pGS159 y pGS161 contienen todos ellos la casete de expresión para el antígeno T de SV40 (SEC ID Nº: 4) flanqueada por un intrón de SV40 (SEC ID Nº: 6) y un sitio de poliadenilación (SEC ID Nº: 7). Adicionalmente, el pGS158 contiene el promotor CAG (promotor híbrido que consiste en un potenciador de CMV y el

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E10721938

18-09-2015

3. Cultivo de células.

a) Líneas de células.

Se cultivaron células amniocíticas transformadas (CAP y CAP-T) en medio 293SFMII (Invitrogen nº 11686-029), 0,5% de antimicótico/antibiótico (Invitrogen nº 15240-062), L-glutamina 4 mM (Invitrogen nº 25030-024) a 37 °C, 95% de humedad, 8% de CO2. El medio de cultivo de células CAP-T contenía adicionalmente 5 µg/ml de blasticidina (Invitrogen nº R210-01). Las células se inocularon normalmente con una densidad de comienzo de 2 -4 x 105 células/ml en un volumen de 12 ml en un matraz de agitación y se cultivaron en incubador sacudidor a 100 rpm durante 3 -4 días. A una densidad de 1 -2 x 106 células/ml las células se recolectaron por centrifugación y se siguieron cultivando con la densidad de partida mencionada anteriormente en medio fresco. Las células HEK293, HEK293-T (ATCC nº CRL-11268) y HeLa se cultivaron adherentemente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Advanced D-MEM, Invitrogen nº 12491-015) con 10% de suero de ternera fetal en placas de cultivo celular. Las células HEK293-T fueron adaptadas por etapas al crecimiento en suspensión libre de suero en medio 293-SFMII y se cultivaron en matraces de agitación a 100 rpm, 37 °C, 95% de humedad y 8% de CO2.

b. Amniocitos primarios.

Se obtuvieron amniocitos primarios, siguiendo los correspondientes métodos de rutina, durante una amniocentesis. 1 -2 ml de esta punción se cultivaron con 5 ml de medio F10 de Ham (Invitrogen nº 31550-023), 10% de suero de ternera fetal, 2% Ultroser G (Cytogen GmbH), 1x de antibiótico/antimicótico (Invitrogen nº 15240-062) a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2 en placas de cultivo de células Primaria de 6 cm (Falcon). Al cabo de 4 -6 días los amniocitos empezaron a hacerse adherentes y se añadieron 3 ml de medio fresco más aditivos (véase el conjunto precedente). Tan pronto como las células fueron completamente adherentes, el medio se retiró y se reemplazó por 5 ml de medio fresco más aditivos. Para los posteriores pasajes las células confluentes se lavaron con PBS, se despegaron con tripsina (TrypleSelect, Invitrogen nº 12563011) y se transfirieron a 10 y 25 ml, respectivamente, de medio fresco más aditivos en placas de 10 cm y 15 cm, respectivamente.

4. Transformación de amniocitos primarios.

a. Transfección.

Los amniocitos primarios cultivados (véase 3b) fueron transformados cada uno de ellos mediante la transfección con plásmidos pSTK146, pGS119 o pGS122. De antemano, los plásmidos respectivos se linealizaron mediante digestión con enzimas de restricción adecuadas (pSTK146, pGS119: ScaI; pGS122: PmeI). Antes de la transfección los amniocitos fueron adaptados por etapas al medio Opti-Pro (Invitrogen nº 12309-019) con 2% de Ultroser. Para este propósito se añadió a las células medio F10 de Ham fresco (con aditivos véase 3b), más medio Opti-Pro (con 2% de Ultroser) en una relación de 75:25%, 50:50%, 25:75% y 0:100% cada 2 a 3 días. Para la transfección, las células de una placa de 15 cm de aproximadamente 80% de confluencia se distribuyeron en placas de 6 cm que corresponden a un número de células de 5 a 7 x 105 células por placa. Al día siguiente, las células en 5 placas fueron transfectadas cada una con 2 µg de pSTK146, pGS119 o pGS122 linealizados usando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un disco no fue transfectado y se siguió cultivando. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS, se despegaron con TrypleSelect y se transfectaron a una placa de 15 cm. Las células se cultivaron durante 10 a 15 días más, en los que el medio se reemplazó por medio fresco cada 3 a 4 días. Durante este tiempo se redujo la adición de Ultroser al 1%. Al cabo de aproximadamente 10 a 15 días las células eran confluentes y se transfirieron a placas de 15 cm, como se describió anteriormente.

b. Aislamiento de los clones de células transformadas.

Algunas semanas después de la transfección, se observaron en todas las transfecciones islas de células clonales que son significativamente distintas de los amniocitos no transformados en lo que se refiere a su morfología. Estas islas de células fueron recogidas y transferidas sobre placas de 24 pocillos (correspondientes al paso 1). Además, las células se propagaron y se transfirieron primeramente a placas de 6 cm y más tarde a placas de 15 cm. La expresión de las proteínas E1 en cada una de las líneas de células clonales se detectó en el análisis de transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales (véase 2b).

La producción de líneas de células que expresan el antígeno T basadas en líneas de células amniocíticas transformadas se describe a continuación a modo de ejemplo para una línea celular obtenida por transfección con pGS119 (dicha línea celular se denomina línea celular de CAP en lo que sigue). Después del aislamiento y la expansión de las islas de células clonales se produjeron líneas de células uniformes genéticas a partir de los clones de células por clonación de células individuales a través del "método de dilución limitada". En resumen una célula del clon que se ha de clonar se sembró en una placa de 96 pocillos y la expansión real de solamente una célula se controló mediante microscopía en el curso de los siguientes días. Las líneas obtenidas a partir de células individuales fueron expandidas por etapas a placas de15 cm. Por dilución en etapas del medio de cultivo OptiPro/1% Ultroser con medio 293SFMII, se adaptaron las células al crecimiento en suspensión en medio libre de suero. Se analizaron las líneas de células individuales en relación con la expresión de proteína estable y transitoria y de alta densidad de crecimiento, se seleccionó un clon con las mejores propiedades y se continuó utilizando en lo que sigue.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E10721938

18-09-2015

5. Producción de grupos de células que expresan el antígeno T.

Cada 1 x 107 células CAP (obtenidas por transfección de amniocitos primarios con plásmido pGS119, adaptadas a crecimiento en suspensión en medio libre de suero) fueron transfectadas con cada 5 µg de ADN de plásmido pGS158-, pGS159-y pGS161 linealizado, y se cultivaron en el matraz de agitación bajo condiciones como las descritas anteriomente. Para la selección de células transfectadas estables se añadieron 5 µg/ml de blasticidina 48 h después de la transfección y las células se siguieron cultivando hasta que se obtuvieron grupos de células en crecimiento estable al cabo de aproximadamente 3 a 4 semanas. Dichos grupos de células se denominaron Z582 (transfección con pGS158, antígeno T expresado por el promotor CAG), Z583 (transfección con pGS159, antígeno T expresado por el promotor RSV) y Z597 (transfección con pGS161, antígeno T expresado por el promotor CMV). Dado que se desconoce si un aumento de la concentración de antígeno T es potencialmente tóxico para las células CAP, se intentó expresar el antígeno T por medio de promotores que tienen una fuerza diferente. Fue posible demostrar que la expresión de una proteína de referencia en las células CAP era la más alta por el uso del promotor CMV, un poco más baja con el promotor CAG y claramente más baja con el promotor RSV. Fue posible generar grupos de células de crecimiento estable con los tres promotores y los tres grupos de células expresaron el antígeno T intracelular.

6. Expresión transitoria de proteínas en células CAP y CAP-T.

El fragmento ori de 359 pb tal como se utiliza en la presente invención contiene en comparación con el ori mínimo que es de 63 pb de longitud, además de dicha secuencia nuclear, también las secuencias repetidas de 21 pb y 72 pb (SEC ID Nº: 11). Estas dos secuencias repetidas son en realidad importantes principalmente para la función del promotor que superpone el ori pero hay indicios de que también aumentan la replicación del DNA de SV40 (Chandrasekharappa y Subramanian, J. Virol. 61, 2973 -2980, 1987).

Para ensayar si la concentración de antígeno T en la célula tiene influencia en la expresión de una proteína de referencia, los tres grupos de células Z582, Z583 y Z597 que expresan el antígeno T bajo promotores de fuerzas diferentes han sido ensayados y comparados con la expresión transitoria en las células CAP que no expresan el antígeno T. Por tanto, 1 x 107 células de cada fueron transfectadas con medios de la tecnología nucleofector (Amaxa/Lonza, programa X-001, Puffer V) con el plásmido circular pGS151 y se cultivaron en un volumen inicial de 12 ml. El medio fue reemplazado tres y seis días después de la transfección, en donde en el día 6 también se aumentó el volumen a 15 ml. Cada alícuota fue tomada comenzando el tercer día hasta e incluyendo el séptimo día después de la transfección y en el noveno día después de la transfección, se determinó el número de células y la expresión de hAAT se determinó mediante el método ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima) utilizando anticuerpos policlonales anti-hAAT (desacoplados y acoplados a HRP; ICN Biomedicals). Se utilizó como control hAAT purificada a partir de plasma humano (ICN Biomedicals).

El resultado de este experimento se muestra gráficamente en la Fig. 3. En todos los grupos celulares de CAP-T se obtuvo una expresión transitoria más alta en comparación con las células CAP. La expresión transitoria en Z582 es 8 veces, en Z583 es 25 veces y en Z597 es 70 veces más alta que en las células CAP. También un segundo grupo de células CAP-T que expresan el antígeno T por el promotor CMV tiene como resultado una alta expresión comparable a la expresión obtenida con Z597.

Dichos datos demuestran que tanto la expresión permanente de antígeno T en células CAP como el nivel de expresión de antígeno T tienen influencia sobre el nivel de expresión transitoria.

En otro experimento se determinó el nivel de la expresión transitoria de hAAT en el grupo de células Z597 después de la transfección transitoria del plásmido pGS116 y pGS151, respectivamente. Ambos plásmidos difieren entre sí sólo por la presencia del fragmento de SV40-ori en pGS151. La transfección y el análisis cuantitativo de hAAT se realizaron como se describió anteriormente, en donde tanto el nivel de expresión de hAAT como el desarrollo del número de células vivas se determinaron a lo largo de un intervalo de tiempo de 9 días. El resultado de dicho ensayo se muestra gráficamente en la Fig. 4. La presencia del fragmento SV40-ori en el plásmido de expresión conduce a un aumento de la expresión transitoria que es 30 veces más alta. En total pudieron expresarse 2,5 mg de hAAT por transfección de 1 x 107 células CAP-T en un volumen de 40 ml dentro de los 9 días. Esto está en correspondencia con una eficiencia de expresión de alrededor de 60 mg/L y de hasta 40 pg/célula /día. El crecimiento celular se inicia aproximadamente 3 días después de la transfección, la vitalidad de las células sigue permaneciendo a lo largo de todo el margen de tiempo de la prueba por encima del 80%.

Para demostrar que dicha eficiencia de expresión transitoria no es específica para hAAT, otra proteína glicosilada eritropoyetina (Epo) fue expresada transitoriamente en células CAP-T. Como se describió para hAAT, 1 x 107 células CAP-T del grupo de células Z597 fueron transfectadas con plásmidos pGS177 (que contienen el casete de expresión para Epo y el fragmento SV40-ori) y Epo se cuantificó en el sobrenadante de las células por medio de ELISA (R & D Systems, Quantikine IVD, Human Epo Immunoassay, DEP00). Pudieron expresarse 0,73 mg de Epo con una eficacia de expresión de 32 mg/L en un intervalo de tiempo de ensayo de 7 días.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E10721938

18-09-2015

7. Comparación con la expresión transitoria en otros sistemas celulares.

Una línea de células humanas ya descrita con anterioridad, la llamada línea celular HEK293-T, expresa el antígeno T de SV40 de forma estable y está basada en la línea celular HEK293 humana transformada con adenovirus (DuBridge et al., Mol. Cell. Biol. 7, 379 -387, 1987). De forma comparable con Z597, 1 x 107 células HEK293-T (medio libre de suero, cultivo en suspensión) fueron transfectadas con 5 µg de plásmido circular pGS151 por medio de la tecnología nucleofector Amaxa según el protocolo del fabricante (programa X-001, Puffer V) y se cultivaron. El resultado de dicho experimento se muestra gráficamente en la Fig. 5. Aunque el número de células de 293-T fue claramente mayor que el de CAP-T en el día 9 la expresión transitoria en CAP-T es, en comparación con la de 293-T, aproximadamente 40 veces mayor.

8. Ensayo de replicación.

Debe demostrarse en un ensayo de replicación, si la expresión de antígeno T en células CAP-T produce un mayor número de copias del plásmido de expresión que contiene ori – lo que por tanto explicaría que la expresión transitoria de la proteína sea claramente superior. Por consiguiente, las células Z597-y HEK293-T, respectivamente, fueron transfectadas con los plásmidos pGS116 y pGS151, respectivamente, y cultivadas como se describió anteriormente. Después de 6, 12, 24, 48, 72 y 96 horas se tomaron 1 x 105 células, se centrifugaron, se recogieron en PBS y se lisaron mediante la adición del mismo volumen de NaOH 0,8 N. Los lisados celulares fueron transferidos en un aparato SlotBlot en una membrana de nilón cargada positivamente (GE Healthcare, Hybond-N+). Se añadieron cantidades crecientes de plásmidos pGS116 y pGS151 a 1 x 105 células Z597 como testigo, se lisaron y se transfirieron como se describió anteriormente. Dicho patrón corresponde a 1000, 2500, 5000, 10000 y 15000 copias por célula. El ADN se fijó mediante la incubación de la membrana a 120 °C durante 30 minutos y se visualizó por medio de una sonda de PCR no radioactiva compuesta por hAAT-cDNA de acuerdo con el protocolo del fabricante (AlkPhos Direct Labeling and Detection System, GE Healthcare, RPN 3680 y 3682). El número de copias en las células transfectadas con pGS116 y pGS151 se cuantificó por medio de la concentración conocida del plásmido patrón. El resultado de dicho ensayo de replicación se muestra gráficamente en la Fig. 6. Como era de esperar, solamente pGS151 pero no pGS116 se replica en CAP-T Z597. El número de copias de pGS151 aumenta de aproximadamente 1500 copias/célula 6h después de la transfección a casi 7000 copias/célula 72 h después de la transfección, por lo cual el número de células se mantiene igual. En cambio, el número de copias de pGS151 permanece constante en HEK293-T durante más de 96 horas. Dado que el número de células 293-T se ha duplicado en dicho intervalo de tiempo, se puede suponer una baja replicación de pGS151 en dichas células, sin embargo, está claramente por debajo de la tasa de replicación de Z597.

La detección de la expresión del antígeno T en líneas de células amniocíticas y células HEK293-T se realizó mediante el análisis de transferencia Western. A partir de los tres grupos de células CAP-T y células HEK293-T se recogieron 1 x 106 células de cada uno en 50 µl de Tris/HCl 50 mM pH 8, NaCl 140 mM, 0,5% de NP40, EDTA 4 mM, EGTA 2 mM, PMSF 0,5 mM , 5% de glicerol, y se incubaron durante 30 min en hielo. La mezcla de proteínas se centrifugó durante 10 min a 13000 rpm y la concentración de proteína se determinó en el sobrenadante mediante un kit de detección de proteínas (Coomassie, Bradford, Thermo Life Science nº 23200). En un gel de poliacrilamida SDS 12% se separaron 10 µg de proteína, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) y se visualizaron por medio de un anticuerpo específico del antígeno T (Abcam, antígeno T Anti-SV40 ab16879) . Se pudo demostrar por este experimento que se expresa más antígeno T en Z597 que en los otros dos grupos y en las células HEK-293-T.

9. Transfección con polietilenimina.

Dado que el método de transfección descrito anteriormente es escalable solamente de una manera limitada, se ha ensayado otro reactivo de transfección, polietilenimina (PEI, Polysciences, nº 23966) que se describe en particular para transfecciones en gran escala. Se disolvió PEI linear (PM = 25.000) de acuerdo con el protocolo del fabricante con una concentración de 1 mg/ml y se usó en una relación de ADN: PEI = 1:3. Para la transfección se mezclaron 10 µg de pGS151 con 30 µg de PEI, se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente y se añadieron a 1 x 107 células CAP-T Z597 en 6 ml de medio FreeStyle (Invitrogen nº 12338-018). Se añadieron 6 ml de medio 293-SFMII al cabo de 5h y las células se incubaron durante 7 días. Tres días después de la transfección el medio fue reemplazado con 293-SFMII y en vista del fuerte crecimiento celular se aumentó el volumen hasta 30 ml. El resultado de dicho experimento se muestra en la Fig. 7. Por la transfección con PEI se logró una alta expresión transitoria de proteínas en CAP-T. Sin embargo, el rendimiento máximo de proteína fue de unas 2 veces por debajo de la expresión lograda con nucleofección. Es digno de señalar que las células crecen con una rapidez claramente mayor y con más fuerza después de la transfección con PEI y que logran un número de células que es aproximadamente 10 veces mayor en comparación con la nucleofección al cabo de 7 días.

Claims (1)

1. imagen1