JP2008522589A - 組換えタンパク質の発現のための方法及び材料 - Google Patents

組換えタンパク質の発現のための方法及び材料 Download PDF

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Abstract

軽鎖３’ＵＴＲ及びエプスタイン−バーウイルス複製起点を含む組換え発現ベクターが提供される。そのようなベクターを含む宿主細胞及びそのようなベクターで組換えタンパク質を生産する方法もまた提供される。組換えタンパク質を生産するさらなる方法は、細胞と、第１および第２ベクターとを接触させることを含み、ベクターの各々は異なるポリペプチド鎖をコードし、第２ベクターは第１ベクターの約１．５から２．５倍量で存在する。細胞はまた、タンパク質をコードする組換え一過性発現ベクターでトランスフェクトされ得、膜増幅培養容器中の培地で培養され、組換えタンパク質を産生する。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、組換えタンパク質及び組換え発現ベクターの作製方法並びにその中で用いるための宿主細胞に関する。
（発明の背景）
組換えタンパク質の大規模一過性発現は、数ミリグラム量のタンパク質を生産するための安定細胞株の開発に替わる又は先駆として、過去数年で急速に発達した分野である(Ｗｕｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：１５６−１５９（１９９９））。ヒト胎児腎臓(ＨＥＫ２９３）細胞は、一過性発現のために最も広汎に用いられる細胞株の１つであり、培養のスケールアップ促進の一助となるべく浮遊増殖に上手く適応されている。最近の報告では、可溶性ポリペプチド、膜貫通タンパク質、及びヒト抗体を含む組換えタンパク質を生産するために、１〜３Ｌの培養液中で、一過性発現する浮遊適応したHEK293細胞の使用法が上手く実証されている(Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：１−９（２００２）；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５：１９７−２０３（２０００）；及びＣｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｅｎｇ．５９：５６７−５７５（１９９８）)。
具体的には、Ｄｕｒｏｃｈｅｒらは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の核内抗原−１タンパク質（ＥＢＮＡｌ）を発現するＨＥＫ２９３Ｅ細胞が、カチオン性ポリマートランスフェクション試薬である、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、複数の異なる組換えタンパク質を、通常１０ｍｇ／Ｌを超えて生産することができたことを示した（Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：７２９７−７３０１（１９９５）；及びＭｉｓｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１２３４９−１２３５４（１９９６）)。
これらの利点にも関わらず、時間効率および費用効率が高い、組換えタンパク質の生産のための、最適化された一過性トランスフェクションシステムを含む、改良された発現システムのためのニーズが当該分野においていまだに存在する。本発明は、組換えタンパク質生産のそのような最適化された方法を提供する。本発明のこれら及び他の利点は、さらなる発明の特徴と同様に、本明細書で提供される発明の説明から明らかになるだろう。
（発明の概要）
本発明は、組換えタンパク質を生産する方法に有用な組換え発現ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターの１つは、軽鎖遺伝子の３'非翻訳領域(ＵＴＲ)を含む。本明細書で提供されるもう１つの組換え発現ベクターは、３'ＵＴＲ及びエプスタイン-バーウイルスの複製起点を含む。任意の本発明の組換え発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本明細書で提供される。
本発明はさらに、組換えタンパク質を生産する方法を提供する。第一方法では、組換えタンパク質は、ヘテロ２量体又はヘテロ多量体タンパク質であり、そのどちらかは、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含み、第１ポリペプチド鎖は第２ポリペプチド鎖と異なる。該方法は、細胞と、第１ベクター及び第２ベクターとを培地中で接触させることを含み、第１ベクターは第１ポリペプチド鎖をコードし、第２ベクターは第２ポリペプチド鎖をコードしており、かつ、第２ベクターは、第１ベクターの約１．５から約２．５倍量で培地中に存在している。
組換えタンパク質を生産する第二方法では、該方法は、タンパク質をコードする組換え一過性発現ベクターと接触させた細胞を、膜増幅培養容器中の培地において培養することを含み、組換えタンパク質が生産される。あるいは、第二方法は、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の培地において、タンパク質をコードする組換え一過性発現ベクターと接触させた細胞を培養することを含む。
第三方法では、組換えタンパク質は、細胞と、本明細書で記載される本発明の組換え発現ベクターの少なくとも一つとを接触させることで、生産される。第四方法では、組換えタンパク質は、本明細書で記載される本発明の組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を培養することで、生産される。
（発明の詳細な説明）
本発明は、組換えタンパク質を生産する方法に有用な組換え発現ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターの一つは、軽鎖遺伝子の３'非翻訳領域(ＵＴＲ)を含む。本明細書で提供されるもう一つの組換え発現ベクターは、３'ＵＴＲ及びエプスタイン-バーウイルスの複製起点(ｏｒｉＰ)を含む。本発明の組換え発現ベクターは、ｐＵＣ１９複製起点(ｐＵＣ１９ｏｒｉ)を含んでいてもよい。
本明細書での目的のために、用語「組換え発現ベクター」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、細胞内でタンパク質を発現させるのに充分な条件下で細胞と接触される時、細胞内でタンパク質を生産できる、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）コンストラクトを意味する。発現ベクターは組換え体であるので、本発明のベクターは、全体としては天然物ではない。しかし、ベクターの一部分は天然物でありうる。
組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない、一本鎖または二本鎖であり得、合成または自然源から部分的に得られ得、かつ天然または非天然または改変されたヌクレオチドを含み得る、任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターを作製するために用いられ得る非天然または改変されたヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。
組換え発現ベクターは、非修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるようなホスホジエステル結合の代わりに、ホスホロアミデート結合若しくはホスホロチオエート結合のような、天然若しくは非天然のヌクレオチド間結合、又は両タイプの結合を含み得る。好ましくは、非天然または改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、ベクターの転写または複製をいかなる様式においても阻害しない。
組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適当な宿主を形質転換またはトランスフェクトするために用いられ得る。例えば、形質転換またはトランスフェクションとは、例えば、ＤＮＡのような外因性核酸が細胞に導入される過程であり、該形質転換またはトランスフェクション過程が、細胞と本明細書で記載されている組換え発現ベクターのような外因性核酸とを接触させることを含むことを、当業者は理解する。適当なベクターには、伝播および増殖のため若しくは発現のため、又はその両方のために設計された、プラスミド及びウイルスのような、ベクターが含まれる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ(Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ)、ｐＥＴシリーズ(Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ)、ｐＧＥＸシリーズ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ)、及びｐＥＸシリーズ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ)からなる群より選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９のようなバクテリオファージベクターもまた用いられ得る。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。好適な組換え発現ベクターには、図１Ａ〜１Ｃに示されるような、ｐＭＸＴベクターが含まれる。
組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記述されているような標準的組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。
望ましくは、組換え発現ベクターは、必要に応じて、転写及び翻訳の開始及び終結コドンのような、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な制御配列を含み、ベクターがＤＮＡベースかＲＮＡベースかを考慮する。
組換え発現ベクターのコンストラクトは、環状であれ線状であれ、原核生物または真核生物の宿主細胞中で機能する複製システムを含むよう調製されうる。複製システムは、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどが由来でありうる。本発明の組換え発現ベクターは、ｏｒｉＰを含む複製システムを含みうる。好ましくは、本発明の組換え発現ベクターは、ｏｒｉＰを含み、エプスタイン−バーウイルス核内抗原（ＥＢＶＮＡ）を含まず、ＥＢＶＮＡはｏｒｉＰを活性化することが知られている。
本明細書で用いる場合、用語「ｏｒｉＰ」または「エプスタイン−バーウイルス複製起点」は、エプスタイン−バーウイルス複製起点と実質的同一のヌクレオチド配列をさし、配列番号１のヌクレオチド２５６１〜４５５０のヌクレオチド配列を持つ。このヌクレオチド配列中には、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換が存在しないことが好ましい。しかし、配列番号１のヌクレオチド２５６１〜４５５０のヌクレオチド配列は、高コピー数のエピソームプラスミドの複製を促進するヌクレオチド配列の機能に悪影響を与えないであろう、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を有しうることを、当業者は理解する。そのような高コピー数のエピソームプラスミドの複製が哺乳動物細胞中で起こることを、当業者はさらに理解する。
組換え発現ベクターは、好ましくは、ｐＵＣ１９複製起点を含む。本明細書で用いる場合、用語「ｐＵＣ１９複製起点」は、Ｆｅｍｉｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されており、配列番号１のヌクレオチド４５５１〜５２２０のヌクレオチド配列を有する、ｐＵＣ１９ベクター由来の複製起点のヌクレオチド配列を指す。このヌクレオチド配列中には、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換が存在しないことが好ましい。しかし、配列番号１のヌクレオチド４５５１〜５２２０は、高コピー数のエピソームプラスミドの複製を促進するヌクレオチド配列の機能に悪影響を与えないであろう、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を有しうることを、当業者は理解する。そのような高コピー数のエピソームプラスミドの複製が細菌細胞中で起こることを、当業者はさらに理解する。
組換え発現ベクターは、形質転換された又はトランスフェクトされた宿主の選抜を可能にする、１つ以上のマーカー遺伝子を含みうる。マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性のような殺生物剤耐性、栄養要求性宿主において、原栄養性を提供する相補性などを含む。本発明の組換え発現ベクターのために適当なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
組換え発現ベクターは、タンパク質をコードする核酸に機能可能に連結された天然または非天然のプロモーターを含みうる。例えば、強、弱、誘導性、組織特異的、及び発生特異的なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。同様に、核酸とプロモーターとを組み合わせることもまた当業者の範囲内である。プロモーターは、ウイルスプロモーターまたは非ウイルスプロモーターでありうる。好ましくは、プロモーターはウイルスプロモーターである。より好ましくは、ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような、強いウイルスプロモーターである。ＣＭＶプロモーターは当該分野で公知であり、配列番号１のヌクレオチド１〜１０３７のヌクレオチド配列を有する。このヌクレオチド配列中には、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換が存在しないことが好ましい。しかし、配列番号１のヌクレオチド１〜１０３７は、組換えタンパク質コード配列の転写を駆動するヌクレオチド配列の機能に悪影響を与えないであろう、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を有しうることを、当業者は理解する。
組換え発現ベクターは、軽鎖遺伝子の３’ＵＴＲを含む。好ましくは、組換え発現ベクターは、エプスタイン−バーウイルスの複製起点（ｏｒｉＰ）と組み合わせて軽鎖遺伝子の３’ＵＴＲを含む。本明細書で用いる場合、用語「３’ＵＴＲ」は、翻訳されず、その遺伝子のコード配列の終止コドンの３’側に位置する、遺伝子のヌクレオチド配列を指す。語句「軽鎖遺伝子」は、免疫グロブリンの軽鎖をコードする遺伝子を指す。このように、本発明に関して、軽鎖遺伝子の３’ＵＴＲは、軽鎖遺伝子中に元々見出され、本発明のベクターに挿入されている、ヌクレオチド配列である。軽鎖遺伝子は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ウマ、ブタなどのような任意の哺乳動物の軽鎖遺伝子でありうる。好ましくは、軽鎖遺伝子は、マウス軽鎖遺伝子である。より好ましくは、マウス軽鎖遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６２〜２５６０のヌクレオチド配列を有する。このヌクレオチド配列中には、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換が存在しないことが好ましい。しかし、配列番号１のヌクレオチド１０６２〜２５６０は、ポリアデニル化のためのシグナルを提供するヌクレオチド配列の機能に影響を与えないであろう、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を有しうることを、当業者は理解する。本発明のベクターに関して、軽鎖遺伝子の３’ＵＴＲは、好ましくは、ベクターのコード配列の終止コドンの直ぐ３’側に位置している。コード配列が存在しない場合、軽鎖遺伝子の３’側ＵＴＲは、好ましくは、マルチクローニング配列及び／又はＣＭＶプロモーターの３’側に位置する。組換え発現ベクターは、単一コピーの３’ＵＴＲ又は複数コピーの３’ＵＴＲを含みうる。好ましくは、組換え発現ベクターは、単一コピーの３’ＵＴＲを含む。
組換え発現ベクターは、好ましくは、５’ＵＴＲイントロンを含む。本明細書で用いる場合、用語「５’ＵＴＲイントロン」は、転写されるが、ＲＮＡスプライシングによって除去され、従って、最終転写産物中には保持されてないヌクレオチド配列を指す。それは、さらに翻訳されず、従って、ベクターによってコードされるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの一部として発現されない。５’ＵＴＲイントロンは、好ましくは、組換え発現ベクターの５’非翻訳領域中のプロモーターの後に位置する。５’ＵＴＲイントロンは、発現増幅を促進する。５’ＵＴＲイントロンは、任意の天然源由来でありえ、または、例えば、異なる源由来のスプライスドナー及びアクセプターの配列から構成されるように、異なる源の一部分から構成されうる。例えば、５’ＵＴＲイントロンは、ＣＭＶイントロンの一部及びＳＶ４０ １６Ｓイントロンの一部を含む。好ましくは、５’ＵＴＲイントロンのためのスプライスドナーは、ウイルスプロモーターからの転写開始の下流の配列由来であり、スプライスアクセプターは、ＳＶ４０ １６Ｓイントロン由来であり、配列番号１のヌクレオチド８８８〜９７４のヌクレオチド配列を有する。このヌクレオチド配列中には、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換が存在しないことが好ましい。しかし、配列番号１のヌクレオチド８８８〜９７４は、組換えタンパク質コード配列の転写を駆動するヌクレオチド配列の機能に影響を与えないであろう、挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を有しうることを、当業者は理解する。
好適な実施形態では、組換え発現ベクターは、３’ＵＴＲ、ｏｒｉＰ、ｐＵＣ１９複製起点、ウイルスプロモーター、及び５’ＵＴＲイントロンを含む。好ましくは、ウイルスプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、５’ＵＴＲイントロンは、ＣＭＶイントロンの一部及びＳＶ４０ １６Ｓイントロンの一部を含み、例えば、配列番号１のヌクレオチド８８８〜９７４を含む。最も好ましくは、組換え発現ベクターは、図１Ａ（ｐＭＸＴ５）で図示されており、配列番号１のヌクレオチド配列（コード配列なし）（図１０）を有する、ベクタープラスミドｐＭＸＴ５である。例えば、図１０に示されているように、ＣＭＶプロモーターは、ヌクレオチド１〜１０３７を含み；５’ＵＴＲイントロンは、ヌクレオチド８８８〜９７４を含み；ＭＣＳは、ヌクレオチド１０３８〜１０６１を含み；ＬＣ３’ＵＴは、ヌクレオチド１０６２〜２５６０を含み；ＯｒｉＰは、ヌクレオチド２５６１〜４５５０を含み；ｐＵＣ１９ ｏｒｉは、ヌクレオチド４５５１〜５２２０を含み；かつＡｐは、ヌクレオチド５２２１〜６３８０を含む。
組換え発現ベクターは、一過性発現又は安定発現を目的として設計されうる。好ましくは、本発明のベクターは、一過性発現を促進する、すなわち、ベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれないものであるような、組換え一過性発現ベクターである。任意の特定の理論に囚われないならば、組換え発現ベクターは、高コピー数のエピソームプラスミドの複製を促進するｏｒｉＰをベクターに組み込むことによって、一過性発現ベクターとなるように作製されうる。
組換え発現ベクターは、ホルモン、増殖因子、抗体、受容体、構造タンパク質、酵素などのような、任意のタンパク質をコードする核酸配列を含みうる。タンパク質は、例えば、治療用タンパク質でありえ、天然または、例えば、融合タンパク質、キメラタンパク質などを含む遺伝子組換えされたタンパク質のような非天然であり得る。好ましくは、組換え発現ベクターは、タンパク質発現のためのそのような核酸を含む。本明細書で用いる場合、用語「タンパク質」は、その一部または断片を含み、従って、任意の長さのポリペプチド及びペプチドがこの用語の意味の範囲内に含まれると理解されるべきである。例えば、ポリペプチドが、例えば、約５０アミノ酸以上を含み、ペプチドが例えば、約８〜４９のアミノ酸を含みうるようなポリペプチドおよびペプチドが含まれる。タンパク質をコードする核酸配列は、例えば、天然から単離、合成的に生成、遺伝子操作された生物から単離などの任意の源から得られうる。組換え発現ベクターに挿入されうる任意のタイプの核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ）が、本発明に関連して用いられうることを当業者は理解する。例えば、タンパク質をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子などの天然でありうる。あるいは、タンパク質をコードする核酸配列は、例えば、任意の生物（例えば哺乳類）にとって天然ではないような、非天然物でありうる。例えば、核酸配列は、コドンが最適化された核酸配列でありえ、「レアコドン」と呼ばれる、宿主細胞の翻訳システムによって通常用いられないコドンである核酸配列内のコドンが、合成されたタンパク質のアミノ酸を変化させることなく、インビトロ突然変異誘発によって、好ましいコドンに変えられている（Ｂｒａｄｅｌ−Ｔｒｅｔｈｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１１１：１４５−１５６（２００３）；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：９１７４−９１８９（２００４））。さらに、タンパク質をコードする核酸配列には、この核酸配列によってコードされるＲＮＡ転写産物の折り畳みが最小になるように、ＲＮＡの折り畳みを改善するために、例えば、コドン最適化のような、さらなる改変がなされうる。いかなるタイプの核酸配列が用いられようとも、核酸配列は、好ましくは、分泌タンパク質をコードする。「分泌される」とは、タンパク質が細胞から細胞外環境に放出されることを意味し、それにより、タンパク質の精製を容易にする。この点について、組換え発現ベクターは、それを発現した細胞からの発現タンパク質の分泌をもたらす、シグナル配列を、好ましくは含む。
好適な実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、軽鎖又は重鎖のような、免疫グロブリン鎖をコードする核酸を含む。免疫グロブリン鎖は、遺伝子操作された、又は合成された任意の源由来の任意の免疫グロブリン鎖でありうる。好ましくは、免疫グロブリン鎖は、γ１重鎖、γ２重鎖、γ４重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖からなる群より選択されるヒト免疫グロブリン鎖である。重鎖定常領域配列の例には、配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号５のアミノ酸配列を含むγ１重鎖定常領域；配列番号６のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号７のアミノ酸配列を含むγ２重鎖定常領域；及び配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号９のアミノ酸配列を含むγ４重鎖定常領域が含まれる。軽鎖定常領域配列の例には、配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番１１のアミノ酸配列を含むκ軽鎖定常領域、及び配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番１３のアミノ酸配列を含むλ軽鎖定常領域が含まれる。抗体の重鎖及び軽鎖の例には、配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＤＰ−０１重鎖、及び配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＤＰ−０１軽鎖が含まれる。ＬＤＰ−０１抗体は、本明細書でＡｂ＃１として示されており、ＷＯ ２００４／０３３６９３（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１０１５４）及び米国特許出願公開番号２００３／０２０３４４７ Ａ１中に記載されている。
この点について、組換え発現ベクターは、細胞外環境への抗体の分泌を促進する抗体シグナル配列を望ましくは含む。適切な抗体シグナル配列は当該分野において公知である。例えば、好ましいシグナル配列は、配列番号２又は配列番号３を含む。
組換え発現ベクターは、あるいは、タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列を含みうる。「機能的部分」又は「機能的一部」と同義である用語「機能的断片」は、タンパク質を指すものとして用いられる時は、部分又は断片がその一部であるタンパク質の生物活性を維持している、タンパク質の任意の部分又は断片をさす。機能的断片は、例えば、親タンパク質と同様、同一、又はより高度な程度まで親タンパク質の機能を保持している、タンパク質（親タンパク質）の一部を含む。例えば、タンパク質が免疫グロブリンである場合、その機能断片は、例えば、親免疫グロブリンの抗原と結合する能力を保持する、免疫グロブリンの任意の部分を含みうる。また、例えば、タンパク質が細胞表面受容体である場合、その機能的断片は、例えば、親細胞表面受容体のリガンドに結合する能力を保持する、細胞表面受容体の任意の部分を含みうる。親タンパク質に関して、機能的断片は、例えば、親タンパク質の約１０％、２５％、３０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を含みうる。機能的部分は、その部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又はその両末端にさらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親タンパク質のアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、機能的部分の生物活性を妨げない。
本発明はさらに、本明細書で記載される任意の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書で用いる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターを含みうる任意のタイプの細胞をさす。宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌、若しくは藻類のような真核細胞、又は、例えば、細菌若しくは原生動物のような、原核細胞でありうる。細胞は、培養細胞又は、初代細胞（すなわち、生物（例えば、ヒト）から直接単離された）でありうる。細胞は接着細胞又は、浮遊細胞、すなわち、懸濁液中で増殖する細胞であり得る。適当な宿主細胞は、当該分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが含まれる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、ＤＨ５α細胞である。組換えタンパク質を生産する目的のために、宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。細胞はヒトの体の任意の細胞であり得るが、細胞は、ヒト胎児腎臓細胞であることが好ましい。より好ましくは、ヒト胎児腎臓細胞は、例えば、２９３Ｅ細胞のように、エプスタインバーウイルス核内抗原−１（ＥＢＮＡ−１）タンパク質発現する。
本明細書で用いる場合、用語「哺乳動物」は、マウスおよびハムスターのようなげっ歯目の哺乳動物、並びにウサギのような、ウサギ目の哺乳動物を含むがこれらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ及びイヌを含む、食肉目由来であることが好ましい。哺乳動物は、ウシ及びブタを含む、偶蹄目、又はウマを含む奇蹄目由来であることがより好ましい。哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄ）若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄ）（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
本発明はさらに、組換えタンパク質の生産方法を提供する。第一方法で、組換えタンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ２量体又はヘテロ多量体タンパク質であり、第１ポリペプチド鎖は第２ポリペプチド鎖と異なる。第一方法は、細胞と、第１ベクター及び第２ベクターとを培地中で接触させることを含み、第１ベクターは第１ポリペプチド鎖をコードし、第２ベクターは第２ポリペプチド鎖をコードしており、第２ベクターは、第１ベクターの約１．５から約２．５倍量で培地中に存在しており、組換えタンパク質が生産される。第１及び第２ベクターは、任意の適切なベクターであり得、好ましくは、本明細書で記載される本発明の組換え発現ベクターである。
タンパク質を生産する第一の発明方法の目的のために、第１及び第２ベクターは、独立に任意のタイプのベクターであり得る。すなわち、第１及び第２ベクターは、同一の調節エレメントを有するが、そこに含まれる組換えタンパク質コード配列のみが異なりうる。例としては、第１ベクター及び第２ベクターの両者は、図１Ａで示されるようなｐＭＸＴベクターでありうる。好ましくは、第１ベクター及び第２ベクターの各々は、本明細書で記載される本発明の組換え発現ベクターの一つである。最も好ましくは、第１及び第２ベクターは、ｐＭＸＴベクターである。例えば、第１及び第２ベクターの各々が、組換え一過性発現ベクターであることが好ましい。第１及び第２ベクターの各々が、軽鎖遺伝子の３’ＵＴＲ及びｏｒｉＰを含むこともまた好ましい。第１及び第２ベクターの各々が、ウイルスプロモーター、ｐＵＣ１９複製起点、５’ＵＴＲイントロン、又は前記の任意の組み合わせを含むこともまた好ましい。好ましくは、ウイルスプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり、５’ＵＴＲイントロンは配列番号１のヌクレオチド８８８〜９７４を含む。さらに、第１及び第２ベクターの各々が、抗体シグナル配列を含むことが好ましい。
また、タンパク質生産の第一の発明方法に関して、第２ベクターは第１ベクターの約１．５から約２．５（例えば、１．６、１．７、１．７５、１．８、１．９、２．０、２．１２５、２．２５、２．３、２．４、及び２．５）倍量で培地中に存在する。好ましくは、第２ベクターは第１ベクターの約１．７５から約２．２５倍量で培地中に存在する。より好ましくは、第２ベクターは第１ベクターの約２倍量で培地中に存在する。
本発明はさらに、組換えタンパク質を生産する第二の方法を提供する。第二の方法は、タンパク質をコードする組換え一過性発現ベクターと接触させた細胞を、膜増幅培養容器中の培地の中で培養することを含み、組換えタンパク質が生産される。第二の方法は、あるいは、組換えタンパク質をコードする組換え一過性発現ベクターと接触させた細胞を、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の培地の中で培養することを含み、組換えタンパク質が生産される。組換え一過性発現ベクターは、そのような適切な任意のベクターであり得、好ましくは、本明細書で記載される本発明の組換え発現ベクターである。
第三の方法では、組換えタンパク質は、細胞と、本明細書で記載される少なくとも１つの本発明の組換え発現ベクターとを接触させることで、生産される。第四の方法では、組換えタンパク質は、任意の本明細書で記載される本発明の組換え発現ベクターを含む、任意の本発明の宿主細胞を培養することで、生産される。
細胞がベクターによってコードされるタンパク質を発現するように、細胞と、第１ベクター、第２ベクター、又は組換え発現ベクターとを接触させるために、任意の適当な方法が用いられうる。細胞が特定のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現するように改変されるように、細胞を接触させる方法は、当該分野において周知である。前記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に列挙された参考文献を参照されたい。この目的のために細胞を接触させる適当な方法には、例えば、ウイルスベクターでの感染、リポフェクション試薬、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥ、又はリン酸カルシウムを用いるトランスフェクション、及びエレクトロポレーションが含まれる。
細胞は、適当なカチオン性ポリマーの存在下、第１ベクター、第２ベクター、又は組換え発現ベクターと接触させられうる。細胞をトランスフェクトするために適当なカチオン性ポリマーは、当該分野において公知であり、例えば、ポリリジン及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれる。本発明方法の好適な実施形態では、カチオン性ポリマーはＰＥＩである。ＰＥＩは線状又は分岐鎖であり得、ポリマーを構成する基本単位の数に応じて、分子量が変化しうる。好ましくは、ＰＥＩは線状ＰＥＩである。より好ましくは、線状ＰＥＩは、約２５ｋＤａの分子量を有する。本方法で用いられるＰＥＩの量は任意の量でよいが、線状ＰＥＩは細胞と接触するベクターの約１．５から約４．５（例えば、１．５、１．６、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．６、２．７、２．７５、２．８、２．９、３．０、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．７５、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２５、４．３、４．４、及び４．５）倍量で存在することが好ましい。好ましくは、ＰＥＩは、細胞と接触するベクターの約２．５から約３．５倍量で存在する。より好ましくは、ＰＥＩは、細胞と接触するベクターの約２倍量で存在する。
細胞と、１つより多いベクター（例えば、第１ベクター及び第２ベクター）とを接触させることを含む本発明方法の目的のために、細胞は、逐次方式（例えば、第２ベクターの前に第１ベクターを細胞と接触させる）で、第１ベクター及び第２ベクターと接触されうる。あるいは、細胞は第１ベクター及び第２ベクターと同時に接触されうる。好ましくは、細胞は第１ベクター及び第２ベクターと同時に接触される。例えば、細胞と、１つより多いベクターとを接触させることを含む方法において、細胞は、第２またはさらなるベクターとの前に又は同時に第１ベクターと接触されうる。
本明細書で用いる場合、用語「培養」は、「維持」と同義である。細胞を培養する方法は当該分野において公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｙａｒｍｕｓｈ（ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９９参照）。当業者なら認識しているように、細胞が培養される条件は、細胞のタイプによって変わる。該条件には、環境の温度、細胞を含む培養容器、細胞培養雰囲気又は環境を構成する、様々なガス（例えば、ＣＯ２）の組成、細胞が維持される培地、培地の成分及びｐＨ、細胞が維持される密度、培地を新しい培地に交換することを必要とするスケジュールなどが含まれる。これらのパラメータは当該分野においてはしばしば知られているものであるか、経験的に決定されうる。例えば、細胞が培地（例えば、第１培地、第２培地など）中で培養される本発明方法に関して、細胞に接触させたベクターによりコードされるタンパク質を細胞が発現する（及び、場合によっては、分泌する）ように、任意の方法が細胞を培地中で培養するために用いられうる。
細胞は、望ましくは、膜増幅培養容器中又はＦｅｒｎｂａｃｈフラスコ中で培養される。本明細書での目的のために、用語「膜増幅培養容器」は、少なくとも１枚の膜を付加することによって改善された、細胞培養液を収容する容器を指す。適当な膜増幅培養容器には、膜ベースの細胞培養容器、透析ベースの細胞培養容器、膜ベースの高密度細胞培養容器、及び二室容器が含まれる。本明細書で用いる場合、用語「容器」は、系、反応器、生物反応器、フラスコ、及び装置と同義である。適当な膜増幅培養容器には、例えば、ｍｉｎｉＰｅｒｍ（登録商標）フラスコ、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）フラスコ、及びＣＥＬＬＩＮＥ（商標）ＣＬ１０００（本明細書ではＩｎｔｅｇｒａフラスコ又はＩｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００フラスコを指す）が含まれ、それらはＩＢＳ Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＧＨ（Ｃｈｕｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＯＨ）、ＶＷＲ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、及びＬａｂｍａｔｅ（Ａｓｉａ）のような会社から市販されている。最も好ましくは、膜増幅培養容器は、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００である。例えば、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコのような膜増幅培養容器は、栄養素槽及び培養槽を含んでもよく、栄養素は、栄養素槽中の培地貯留層から、半透膜を通り、細胞を含む培養槽に移り、持続的に栄養素を供給し、そして膜はまた、培養槽外に代謝物を拡散させて細胞と接触させないようにするが、細胞によって生産された組換えタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）が培養槽外に拡散しないようにし、さらに、細胞がまた容器の底部にある別個のシリコーン膜を通じた酸素及び二酸化炭素への接触のような充分なガス交換を行うことは、当業者ならば理解できる。
本明細書で用いる場合、用語「Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ」は、Ｆｅｒｎｂａｃｈ設計を有する、市販のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ポリカーボネートＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを指す。そのようなフラスコは、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような会社から市販されている。
特定の理論に縛られずに、膜増幅フラスコ（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）フラスコ、及びｍｉｎｉＰｅｒｍ（登録商標）フラスコ）及びＦｅｒｎｂａｃｈフラスコは、これらの装置は細胞と環境（例えば、最適な細胞増殖及び組換えタンパク質の生産を可能にするインキュベーター環境）、の間で充分なガス交換を可能にするので、トランスフェクトされた細胞、例えば、一過性にトランスフェクトされた細胞を培養するために特に適当である。特定の条件下では、攪拌フラスコもまた、最適な細胞増殖及び組換えタンパク質の生産のために細胞が培養されうる、適当な培養容器でありうる。細胞と環境との間で充分なガス交換を可能にする任意のフラスコ又は培養容器は、本発明の範囲に含まれ、前記のフラスコ及び培養容器のみに限られないことを理解すべきである。
細胞を培養することを含む本発明方法において、培地は、当該分野において公知の、細胞を培養するのに適当な任意の培地であり得る。培地は、例えば、１％低免疫グロブリン（Ｉｇ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培養培地でありうる。あるいは、培地は、例えば、ＩＳ２９３（商標）培地のような、無血清細胞培養培地であり得る。ある場合には、培地は、好ましくは、無血清ＩＳ２９３（商標）培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）である。
本発明方法の細胞培養は、任意の適当な細胞密度で始められ又は播かれうる。当業者ならば認識するように、播種密度は、細胞タイプ、培養条件、及び細胞培養液から組換えタンパク質を回収または精製するために選択された日数のような様々な要因による。望ましくは、細胞密度は、約１．０×１０６から約２．０×１０７の範囲内（例えば、約１．０×１０６から約１．５×１０７）である。より好ましくは、細胞培養の開始播種細胞密度は、約３．０×１０６から約１．０×１０７である。特定の理論に縛られずに、タンパク質をコードするベクターで一過性にトランスフェクトされた細胞の播種密度は、組換えタンパク質の効率的な生産を獲得する要因であると考えられる。
本発明方法の目的のために、培養されるか、又は第１ベクター、第２ベクター、若しくは組換え発現ベクターと共に接触される細胞は、「宿主細胞」として本明細書で記載されるような、任意の細胞であり得る。例えば、培養されるか、及び／又は１つ以上の組換え発現ベクターと接触される細胞は、任意の宿主細胞でありうる。好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞であり、より好ましくは、細胞はヒト細胞である。細胞は、望ましくは、ヒト胎児腎臓細胞である。もっとも好適な実施形態では、ヒト胎児腎臓細胞は、例えば２９３Ｅ細胞のような、エプスタイン−バーウイルス核内抗原−１（ＥＢＮＡ−１）タンパク質を発現する。
組換え一過性発現ベクターに接触された細胞は、本明細書で記載されたものを含む、該分野において公知の任意の方法によって、細胞を一過性にトランスフェクトすることによって得られる。組換え一過性発現ベクターは当該分野において公知であり、例えば、ｐＣＥＰ４、ｐｃＤＮＡ３、及びｏｒｉＰを含む本明細書で記載される任意の組換え発現ベクターが含まれる。好ましくは、組換え一過性発現ベクターは、ｐＭＸＴベクターである。例えば、ベクターは、本明細書で記載される任意の本発明の組換え発現ベクターであり得る。
組換えタンパク質を生産する第１方法（例えば、細胞と第１ベクター及び第２ベクターとを接触させることを含む）に関して、該方法は更に、組換えタンパク質を生産する第２の発明方法を含みうる。すなわち、組換えタンパク質を生産する方法はさらに、第１ベクター及び第２ベクターと接触させた細胞を、膜増幅培養容器（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）フラスコ、ｍｉｎｉＰｅｒｍ（登録商標）フラスコ）、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコなどのフラスコ中の第２培地において、培養する工程を含みうる。そのような実施形態において、第２培地は、第１及び第２ベクターが存在する培地と異なりうる。膜増幅培養容器、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ、又は同様のフラスコ中で細胞を培養することを含む該方法の目的のために、そのような容器又はフラスコ中での使用に適当な培地は、例えば、ＩＳ２９３培地のような無血清細胞培養培地でありうる。好ましくは、培地は、無血清ＩＳ２９３培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）である。
組換えタンパク質を生産する第２の発明方法に関して、該方法は、組換えタンパク質を生産する第１の発明方法を含みうる。本明細書で記載される方法は、該方法の全ての制限が満たされるようなやり方で組み合わせられうることは、当業者なら認識できる。そのように組み合わせられた方法は本発明の範囲内である。
例えば、膜増幅培養容器、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ、又は同様のフラスコ中で細胞を培養することを含む任意の本発明方法に関して、該方法は更に、例えば無血清培地のような培地から組換えタンパク質を精製又は単離することを含みうる。本明細書で用いる場合、用語「精製」及び「単離」は、部分的に精製され又は部分的に単離されたタンパク質が有用又は価値がありうると当業者が理解する通り、必ずしも完全な精製又は単離を指すものではない。
混合物からタンパク質を精製する方法は、当該分野において公知である。適当な精製方法には、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動などが含まれる。ポリペプチドを精製する適当なクロマトグラフィー方法には、例えば、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが含まれる。好ましくは、精製は、カチオン性樹脂、アニオン性樹脂、及びアフィニティー樹脂のような樹脂を通じて、培地をクロマトグラフすることを含む。ポリペプチドが免疫グロブリン鎖である場合、精製は、好ましくは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する細菌生産タンパク質である黄色ブドウ球菌プロテインＡを含む樹脂の使用を含む。より好ましくは、精製は、例えばプロテインＡスピンカラム（Ｐｒｏ−Ｃｈｅｍから市販）を通じて培地を遠心分離するなど、プロテインＡを含むカラムを通じて培地を遠心分離することを含む。
精製は、ベクターに接触された細胞を培養した後の任意の時点で行いうる。ある場合には、約３日間の培養後（例えば、約３、４、５、６又はそれ以上の日数後）に精製することが好ましい。またある場合には、約７日間の培養後（例えば、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の日数後）に精製することが好ましい。
本発明は、素早くかつ効率的な、高レベルの組換えタンパク質を生産する方法を提供する。ある場合には、少なくとも３００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が３日間の培養後に生産される。またある場合には、少なくとも５００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が３日間の培養後に生産される。ある好ましい場合には、少なくとも７００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が３日間の培養後に生産される。
本明細書で用いる場合、用語「組換えタンパク質」は、遺伝子操作された生物によって生産される任意のタンパク質又はその一部を指す。例えば、組換えタンパク質は、本明細書で記載される任意のタンパク質であり得る。
組換えタンパク質を生産する第１方法の目的のために、組換えタンパク質は、ヘテロ２量体タンパク質、又は２コピーの２つの異なるポリペプチド鎖を含むテトラマーのような、ヘテロ多量体タンパク質である。そのようなタンパク質は当該分野において公知であり、例えば、ヘモグロビン、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、及びＢ細胞受容体などが含まれる。第１の発明方法の好適な実施形態において、組換えタンパク質はヘテロ４量体タンパク質である。望ましくは、ヘテロ４量体タンパク質は免疫グロブリンである。この場合、第１ベクターは免疫グロブリンの重鎖又はその一部をコードし、第２ベクターは免疫グロブリンの軽鎖又はその一部をコードすることが好ましい。重鎖は、本明細書で記載されているように、任意の免疫グロブリンの任意の重鎖でありうる。軽鎖は、本明細書で記載されているように、任意の免疫グロブリンの任意の軽鎖でありうる。抗体重鎖及び軽鎖の例：配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＤＰ−０１重鎖、及び配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＤＰ−０１軽鎖。ＬＤＰ−０１抗体は、本明細書でＡｂ＃１として示されており、ＷＯ ２００４／０３３６９３（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１０１５４）及び米国特許出願公開番号２００３／０２０３４４７ Ａ１中に記載されている。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するものであるが、もちろん、決してその範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
実施例１
この実施例は、本発明の組換え発現ベクターの構築を示している。
任意の遺伝子を発現するための一過性発現ベクターを、ＣＭＶプロモーターの３’端とマウス軽鎖３’非翻訳領域の５’端との間に位置する独自の制限部位を含むマルチリンカー部位を用いて構築した。ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））及びマウス軽鎖３’非翻訳領域（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３８３８−３８４５（１９８６））の制御の下、軽鎖κ若しくはλ遺伝子又は重鎖γ１、γ２、若しくはγ４遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む一過性発現ベクターを構築した。独自の制限部位は、所望の同種の定常領域に隣接する任意の新しいＶ領域のクローニングのために、Ｖ領域の５’端（例えば、ＳａｌＩ）と、Ｖ領域と定常領域の間との連結領域中（重鎖についてＢｌｐＩ、κ軽鎖についてＢｓｉＷＩ及びλについてＡｖｒＩＩ）とに位置した。ベクターはまた、２９３Ｅ細胞中におけるエピソームプラスミド複製のためのエプスタインバーウイルスｏｒｉＰ配列（Ｒｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１８２２−１８３２（１９８５））、ベクターｐＵＣ１９由来の複製起点、及び大腸菌中における形質転換体の選抜のためのアンピシリン耐性をコードする遺伝子を含んだ。マルチリンカー部位、重鎖、及び軽鎖を含む一過性発現ベクターは、図１Ａ〜１Ｃに示される。
実施例２
この実施例は、組換えタンパク質を生産するために、細胞を一過性にトランスフェクトする方法を示している。
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン、及び２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８抗生剤（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、ダルッベコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、付着性培養液として２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒ６２０−０７）を維持した。浮遊培養での増殖のために、以下の無血清培地処方に細胞を適応させた：ＩＳ２９３（商標）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＩＳ２９３−Ｖ（商標）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２９３ ＳＦＭ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｈ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＨＹＱ（登録商標）ＰＦ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）。最初、１０％低ＩｇＧ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び２ｍＭグルタミンを細胞に補充し、数週間かけて１％低ＩｇＧ ＦＢＳにまで徐々に引き下げた。１％低ＩｇＧ ＦＢＳ中になった時点で、浮遊増殖に持続的な適応をさせるために振とうフラスコに細胞を移した。ＶＩＣＥＬＬ（商標） ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、増殖率と生存率をモニターした。
全てのプラスミドをＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、エンドトキシンを含まないプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて精製した。６穴プレート中におけるトランスフェクションのために、５×１０５細胞／ｍｌで細胞２ｍｌを１穴ごとに播種した。振とうフラスコ培養液中におけるトランスフェクションのために、トランスフェクション前に、適切な容量で８×１０５細胞／ｍｌで播種した。細胞に添加する前に、室温で１０分間、濃度４μｇ／ｍｌの線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５ｋＤａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）をプレインキュベートした。次いで、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を細胞に添加し、ＤＮＡ／ＰＥＩと共に細胞を振とうフラスコ中で維持するか、又はＩｎｔｅｇｒａフラスコに移した。
実施例３
この実施例は、一過性トランスフェクションのための最適なＰＥＩ：ＤＮＡ比の決定を示している。
６穴プレート中において、１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ中で増殖した付着性２９３Ｅ細胞を、実施例２に記載されているように、線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、ｐＱＢＩ−ｐＧＫ（ＧＦＰ発現プラスミド、Ｑ−ｂｉｏｇｅｎｅ）でトランスフェクトした。細胞に添加する前に、室温で１０分間、線状ＰＥＩ（１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、又は２５μｇ／ｍｌ）と共にＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、又は５μｇ／ｍｌ）をプレインキュベートし、次いで、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物を細胞に添加し、細胞を振とうフラスコ中又はＩｎｔｅｇｒａフラスコで維持した。
Ｃｙｔｅｋ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＭＳ）９６穴プレートリーダーを備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて、ＧＦＰ発現をトランスフェクションの２４時間後にモニターした。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて、フローデータを解析した。細胞生存率を測るために、細胞をまた、１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で対比染色した。ＶＩＣＥＬＬ（商標） ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、トランスフェクション後の細胞の増殖及び生存率をモニターした。１μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び１μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ａ）；２μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び２μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｂ）；５μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び５μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｃ）；１μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び２μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｄ）；２μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び４μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｅ）；５μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び１０μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｆ）；１μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び５μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｇ）；２μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び１０μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｈ）；並びに５μｇ／ｍｌ ＤＮＡ及び２５μｇ／ｍｌ ＰＥＩ（図２Ｉ）でトランスフェクトした細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現（Ｘ軸）及びＰＩ染色（Ｙ軸）について測り、得られたデータを、図２Ａ〜２Ｉの一連のグラフにプロットした。
図２Ａ〜２Ｉに示されているように、ＰＥＩ：ＤＮＡ比２：１で、ＤＮＡ濃度１μｇ／ｍｌが、トランスフェクションの２４時間後に比較的低い細胞毒性で、ＧＦＰ発現する細胞を最も高い割合で与えた。
この実施例の結果は、組換えタンパク質の生産を示し、一過性トランスフェクションのための最適ＰＥＩ：ＤＮＡ比が２：１であることが確認された。
実施例４
この実施例は、一過性にトランスフェクトされた細胞を培養するための最適培地の決定を示している。
実施例２に記載されているように、２９３Ｅ細胞を増殖させ、６穴プレート及び振とうフラスコ中で１％低ＩｇＧ血清の存在下トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、５つの異なる無血清培地処方（ＩＳ２９３（商標）、Ｈ−ＳＦＭ、ＩＳ２９３Ｖ（商標）、ＳＦＭＩＩ又はＨＹＱ（登録商標）ＰＦ２９３）のうちの１つ又は実施例２のように血清含有培地処方（ＤＭＥＭ）中で、２９３Ｅ細胞を浮遊増殖に適応させた。
２４時間から４８時間後、実施例３に記載されているように、トランスフェクトされた細胞によるＧＦＰ発現を測定した。細胞生存率を測るために、細胞をまた、１μｇ／ｍｌのＰＩで対比染色した。ＶＩＣＥＬＬ（商標） ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、トランスフェクション後の細胞の増殖及び生存率をモニターした。ＧＦＰ発現（バー）及びＰＩ染色（×）から得られたデータをプロットして図３のグラフを作成した。
図３に示されているように、ＩＳ２９３（商標）培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、振とうフラスコ中において最小の細胞毒性で、ＧＦＰ発現する細胞を最も高い割合で与えた；値は、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した付着性２９３Ｅ細胞で得られた値に匹敵した。
この実施例の結果は、ＩＳ２９３（商標）培地が、組換えタンパク質を生産するために一過性にトランスフェクトされた細胞と共に用いられる最適な無血清培地であることを示した。
実施例５
この実施例は、最大の抗体生産性のために最適な重鎖および軽鎖プラスミド比の決定を示している。
様々な比のｐＭＸＴ（重鎖（ＨＣ））：ｐＭＸＴ（軽鎖（ＬＣ））（実施例１参照）又はｐＣＥＰ４（ＨＣ）：ｐＣＥＰ４（ＬＣ）を、振とうフラスコ中の１％低ＩｇＧ血清を補充したＩＳ２９３（商標）培地中で増殖させた細胞中において、抗体生産性に対する効果について試験した。Ａｂ＃１重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を含むｐＣＥＰ４ベクターを、ＫｐｎＩ及びＸｈｏ部位にコード配列をクローニングすることで構築した。Ａｂ＃１軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を含むｐＣＥＰ４ベクターを、Ｎｈｅ及びＸｈｏ部位にコード配列をクローニングすることで構築した。Ａｂ＃１のコードされた重鎖及び軽鎖は、配列番号１５および１７としてそれぞれ示される。全てのプラスミドを実施例２に記載されているようにＤＨ５α細胞に形質転換することにより増幅し、精製した。実施例２に記載されているように、２９３Ｅ細胞を一過性にトランスフェクトした。７〜１０日間振とうフラスコ中のＩＳ２９３（商標）培地にトランスフェクトされた細胞を移した。ベクターがｐＭＸＴ又はｐＣＥＰ４で、１：１、１：２又は２：１のＨＣをコードするベクター：ＬＣをコードするベクターの比でトランスフェクトした細胞による抗体発現を、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定し、データをＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ）で解析した。得られたデータをプロットして図４のグラフを作成した。
図４に示されるように、１：２のＨＣ：ＬＣ比により最高の抗体生産性が生じ、７〜１０日後にＡｂ＃１が６０〜７０μｇ／ｍｌの水準に達した。ｐＭＸＴにおけるＡｂ＃１（ＬＤＰ−０１）の最も高い生産性は、ｐＣＥＰ４を用いて得られた最高の結果より約３倍高かった。
この実施例の結果は、異なるポリペプチド鎖をコードするベクターを１：２の比で細胞に同時トランスフェクトするには、ｐＭＸＴベクターが最適であることを示した。
実施例６
この実施例は、膜増幅培養容器中でトランスフェクション後に培養された一過性にトランスフェクトされた細胞による抗体生産水準が、振とうフラスコ中でトランスフェクション後に培養されたトランスフェクトされた細胞によって達成される抗体生産水準に匹敵することを示している。
実施例２に記載されているように、振とうフラスコ中で２９３Ｅ細胞を一過性にトランスフェクトした。細胞を振とうフラスコ中に維持するか、又は１５ｍｌの培地に移してＩｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００フラスコ中に置いた。７〜１０日後に、細胞培養液上清を回収し、澄まし、細胞を振とうフラスコで培養した場合には標準的プロテインＡカラムを用い、細胞をＩｎｔｅｇｒａフラスコで培養した場合にはプロテインＡスピンカラムを用いて、抗体を精製した。トランスフェクション後０、４、７、及び１４日後の両細胞の細胞生存率及び抗体生産を、それぞれ実施例４および５に記載されているように検査した。Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００フラスコを用いた抗体発現のために、トランスフェクトされた２９３Ｅ細胞２００ｍｌを、１％低ＩｇＧ ＦＢＳ及び２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８抗生剤を補充したＩＳ２９３（商標）培地１５ｍｌに再懸濁し、膜区画に移した。ＩＳ２９３（商標）培地１リットルを上部培地槽に加えた。
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ中に維持されたトランスフェクトされた細胞の細胞生存率（×）及び抗体生産量（●）が図５Ａに示されており、一方振とうフラスコ中又はＩｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００フラスコ中に維持された細胞によるＡｂ＃１抗体生産水準は図５Ｂに示されている。
図５Ａに示されているように、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ中で培養された細胞の抗体生産は７日目に最高になり、１ｍｇ／ｍｌを越える抗体を生産した。この水準は、図５Ｂに示されているような振とうフラスコ中で培養された一過性にトランスフェクトされた細胞の抗体生産水準に匹敵する。
この実施例の結果は、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコが、少容量の一過性にトランスフェクトされた細胞を維持するために適した培養容器であることを明らかにした。少容量ならば、細胞培養液上清からの抗体の精製を容易にする、プロテインＡスピンカラムの使用が可能である。
実施例７
この実施例は、最適化された播種密度で膜増幅培養容器中において抗体を生産する方法を示している。
浮遊適応したＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、１％低ＩｇＧ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８抗生剤（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＩＳ２９３（商標）培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で維持した。トランスフェクションのために、トランスフェクション前に、適切な容量で振とうフラスコ中に８×１０５細胞／ｍｌで細胞を播いた。細胞に添加する前に、最適化された条件（例えば、実施例３参照；例えばＨａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ポスター発表＃１９３７（２００４）もまた参照）で、Ａｂ＃１又はＡｂ＃２（Ａｂ＃１とは異なる）をコードするＤＮＡを、線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５ｋＤａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にプレインキュベートした。Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００フラスコを用いた抗体発現のために、１％低ＩｇＧ ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、及び２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８抗生剤を補充したＩＳ２９３（商標）培地３０ｍｌ中に以下の播種密度で細胞を再懸濁し、培養槽に移した：１．３×１０６（Ｉ−５０）、２．７×１０６（Ｉ−１００）、５．３×１０６（Ｉ−２００）、及び１．１×１０７（Ｉ−４００）。比較のために、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中に８×１０５細胞（Ｅ−２００）を播いた。全てのフラスコを、トランスフェクション後３、５、７、又は１０日間インキュベートした。Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００フラスコの栄養槽及び培養槽から１ｍｌの試料をとり、トランスフェクション後３、５、７、又は１０日目に解析した。
ＶＩＣＥＬＬ（商標） ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、増殖及び生存率をモニターした。異なる播種密度でトランスフェクトした細胞について、トランスフェクションの１、３、５、７、及び１０日後の生存細胞の割合が図６Ａ及び図６Ｂに示されている。異なる播種密度でトランスフェクトした細胞について、トランスフェクションの０、１、３、５、７、及び１０日後の細胞の生存細胞数が図７Ａ及び図７Ｂに示されている。
図６Ａ（Ａｂ＃１）、図６Ｂ（Ａｂ＃２）、図７Ａ（Ａｂ＃１）及び図７Ｂ（Ａｂ＃２）に示されているように、細胞生存率はフラスコ間で変わらなかったが、生存細胞の増殖は、試験した全ての播細胞密度についてＩｎｔｅｇｒａフラスコにおいて改善された。最大密度３〜５×１０７細胞／ｍｌには、１０日間の分析期間で全条件について達した。
ＢＩＯＰＲＯＦＩＬＥ（商標） Ｃｈｅｍｉｓｔｉｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、トランスフェクションの３、５、７、及び１０日後の試料の分析物、ガス、及びｐＨを測定した。Ａｂ＃１を生産する細胞を含む培地又は細胞を含まない培地（培地のみ）の、選択された栄養素及び代謝物のデータを表１に示す。
Figure 2008522589
得られたデータに示されているように、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００フラスコの培養槽中の３０ｍｌ培地中で維持した一過性にトランスフェクトされた細胞は、３〜５×１０７生存細胞／ｍｌ（例えば、４．５×１０７）までの細胞密度に達しうる。栄養素は、栄養素槽中の培地貯留層から半透膜を通り、培養槽に移り、必須栄養素を持続的に供給する。膜はまた、培養槽外に代謝物を拡散させて細胞と接触させない。細胞はまた、フラスコの底部にある別個のシリコーン膜を通じて、酸素及び二酸化炭素に充分接触する。
培養槽からのＩｎｔｅｇｒａ上清は、振とうフラスコよりも高いグルコース水準を有したが、グルタミン水準はより低かった。乳酸水準は２つの培養液間で同じようであった。Ｉｎｔｅｇｒａ培養液中で乳酸と比較してグルコース水準が高いことは、解糖系からＴＣＡサイクルへのピルビン酸の進入を充分に促進することにより、細胞がより多くのＡＴＰを生産していることを示しえた。
ＥＡＳＹ−ＴＩＴＥＲ（商標） Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、異なる播種密度でＩｎｔｅｇｒａフラスコ又は振とうフラスコ中に置いたトランスフェクトされた細胞の抗体価を、トランスフェクションの０、３、５、７、及び１０日後に測定した。抗体価の濃度（μｇ／ｍｌ）として表したデータが、図８Ａ（Ａｂ＃１）及び８Ｂ（Ａｂ＃２）で示され、一方、総抗体生産量（ｍｇ）として表したデータが表２に示されている。
Figure 2008522589
図８Ａ及び８Ｂに示されているように、試験した二つの抗体、Ａｂ＃１及びＡｂ＃２の抗体生産性は、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコでは異なった。Ａｂ＃１は５日目で早期に最高に達し（約７０μｇ／ｍｌ）、その後抗体濃度は低下した。Ａｂ＃２は全１０日に亘ってゆっくりかつ着実な生産性を示し、約４０μｇ／ｍｌの最大抗体生産量に達した。Ａｂ＃１及びＡｂ＃２の両方について、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコにおける抗体生産性は、１０日間に亘って一定水準のＡｂ生産性の増加を達成した。例外は、７日目および１０日目に生産性のわずかな減少を示したＡｂ＃１の試料Ｉ−４００であったが、その減少は試料Ｅ−２００のそれと比較してずっと小さかった。
表２に示されるように、Ｅ−２００培養液中のＡｂ＃１の最大生産量は、５日目の約１５ｍｇであった。Ｉ−２００培養液及びＩ−４００培養液中で同様に５日目で匹敵する水準（Ｅ−２００最大量の９０％以上）を得て、Ｉ−１００及びＩ−２００で１０日後により高い総生産量、即ち、それぞれ１６６％（２４ｍｇ）及び１３１％（１９ｍｇ）が得られた。
表２でまた示されるように、Ｅ−２００培養液中のＡｂ＃２の最大生産量は、１０日目の約８ｍｇであった。Ｉ−４００で３日目（約１１ｍｇ）、Ｉ−１００及びＩ−２００で５日目（それぞれ、約８ｍｇ及び約１３ｍｇ）、Ｉ−５０で７日目（約８ｍｇ）の早さで、匹敵する水準（Ｅ−２００最大量の９０％以上）が得られた。Ｉ−１００、Ｉ−２００、及びＩ−４００で１０日後により高い生産量、即ち、それぞれ１５７％（１３ｍｇ）、２６８％（２２ｍｇ）、及び２６８％（２２ｍｇ）が得られた。
この実施例の結果は、短期間内でのＩｎｔｅｇｒａフラスコ中での高水準の抗体生産を示した。１．０×１０６及び１．５×１０７の細胞密度が、高水準の抗体生産のための最適な密度の例であった。本明細書で示されるように、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコのような膜増幅培養容器中で、例えば、２９３Ｅ細胞のような一過性にトランスフェクトされた細胞は、振とう培養液における抗体生産水準に関わらず、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で培養された細胞を上回る高い総抗体生産量を生じた。Ｉｎｔｅｇｒａフラスコのような膜増幅培養容器中の一過性発現抗体は、培地の枯渇の際にも抗体安定性をより維持したようであった。
本明細書で得られた結果に示されるように、一過性にトランスフェクトされた２９３Ｅ細胞からの総抗体生産量は、標準的なＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに対してＩｎｔｅｇｒａフラスコ中で培養した場合、著しく増加する。Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ中に播種されたトランスフェクトされた細胞の数を増加させることは、最大抗体生産量に達する時間を著しく減少させうる一方、播種密度を減じることは、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で通常条件下で細胞画分を用いた数ｍｇの抗体生産を可能とする。Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ中で一過性に発現された抗体を生産することはまた、より長い期間に亘って抗体価をより良好に維持し、従って、抗体の有意な損失なしに培養液を消衰まで進行させる、より高い信頼性を可能にする。有利なことに、抗体生産のような一過性タンパク質生産のための、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコのような膜増幅培養容器の使用は、総生産量の増大、より多くの細胞を使用することによるより速い生産、及び／又はより少ない細胞を使用することによる細胞の維持を可能とする一方、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコのような非膜培養容器に匹敵する生産性を維持する。
個々の参考文献が参照することによって含まれると個別かつ具体的に示され、かつその全てが本明細書に示されている場合と同程度まで、出版物、特許出願、および特許を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、参照することによって本明細書に含まれる。
本発明を記載する文脈中において（特に添付の特許請求の範囲の文脈中において）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の指示対象の使用は、本明細書中にその他の意味であると示されているかまたは明らかに文脈によって矛盾するものでなければ、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、その他であると言及されていなければ、非限定用語（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、それに限られない」）として解釈されるべきである。本明細書中に値の範囲を列挙することは、本明細書中にそれ以外であると示されていなければ、その範囲内にある各個別の値にそれぞれ言及する速記法としての役目を果たす意図にすぎず、各個別の値はそれぞれが本明細書中に引用されたかのように本明細書中に含まれる。本明細書中に記載されている全ての方法は、本明細書中にその他であると示唆されているまたは明らかに文脈によって矛盾するのでなければ、任意の適切な順番で実施されうる。本明細書中に提供されるいかなるおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより明らかにする意図にすぎず、その他であると主張されているのでなければ、本発明の範囲の限定を提示するものではない。本明細書中の言葉は、特許請求されていない任意の要素が本発明の実施に必要不可欠であることを示すと解釈されるべきではない。
本発明の好適な実施形態は本明細書中に記載され、本発明を実施するために、本発明者らにとって既知の最良の形態を含む。それら好適な実施形態のバリエーションは、上述の記載を読めば当業者にとって明らかとなろう。本発明者らは、当業者がそのようなバリエーションを必要に応じて用いることを予期しており、本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されている以外の他の方法で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲中に列挙されている対象の全ての改変物および均等物を含む。さらに、可能な全てのそのバリエーション中の上記要素のいかなる組み合わせも、本明細書中にそれ以外のものであるとして示され又は文脈によって明らかに矛盾するものでなければ、本発明によって包含される。
図１Ａは、いかなる組換えタンパク質をコードする配列も有さないｐＭＸＴ組換え発現ベクターのイラストである。以下の略語が、図１Ａ〜１Ｃで用いられている：Ａｐ，アンピシリン耐性マーカー；ＣＭＶプロモーター，サイトメガロウイルスプロモーター；ＭＣＳ，マルチクローニング配列；５’ＵＴイントロン，５’非翻訳領域イントロン；ＳＰ，シグナルペプチド；Ｖ，可変領域；Ｃ，定常領域；ＬＣ３’ＵＴ，軽鎖３’非翻訳領域，ＯｒｉＰ，エプスタイン−バーウイルス複製起点；ｐＵＣ１９ｏｒｉ，ｐＵＣ１９プラスミド由来の複製起点。 図１Ｂは、ヒトγ２重鎖をコードするｐＭＸＴベクターのイラストである。以下の略語が、図１Ａ〜１Ｃで用いられている：Ａｐ，アンピシリン耐性マーカー；ＣＭＶプロモーター，サイトメガロウイルスプロモーター；ＭＣＳ，マルチクローニング配列；５’ＵＴイントロン，５’非翻訳領域イントロン；ＳＰ，シグナルペプチド；Ｖ，可変領域；Ｃ，定常領域；ＬＣ３’ＵＴ，軽鎖３’非翻訳領域，ＯｒｉＰ，エプスタイン−バーウイルス複製起点；ｐＵＣ１９ｏｒｉ，ｐＵＣ１９プラスミド由来の複製起点。 図１Ｃは、ヒトκ軽鎖をコードするｐＭＸＴベクターのイラストである。以下の略語が、図１Ａ〜１Ｃで用いられている：Ａｐ，アンピシリン耐性マーカー；ＣＭＶプロモーター，サイトメガロウイルスプロモーター；ＭＣＳ，マルチクローニング配列；５’ＵＴイントロン，５’非翻訳領域イントロン；ＳＰ，シグナルペプチド；Ｖ，可変領域；Ｃ，定常領域；ＬＣ３’ＵＴ，軽鎖３’非翻訳領域，ＯｒｉＰ，エプスタイン−バーウイルス複製起点；ｐＵＣ１９ｏｒｉ，ｐＵＣ１９プラスミド由来の複製起点。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ａでは、細胞を１μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び１μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｂでは、細胞を２μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び２μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｃでは、細胞を５μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び５μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｄでは、細胞を１μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び２μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｅでは、細胞を２μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び４μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｆでは、細胞を５μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び１０μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｇでは、細胞を１μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び５μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｈでは、細胞を２μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び１０μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図２Ａ〜２Ｉは、異なるトランスフェクション条件下、特に、ＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の異なる濃度下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光レベル水準を描写した、フローサイトメトリーデータグラフである。図２Ｉでは、細胞を５μｇ／ｍｌのＤＮＡ及び２５μｇ／ｍｌのＰＥＩでトランスフェクトした。 図３は、異なる無血清培地中での浮遊増殖に適応し、トランスフェクションに最適化された％細胞生存（×）及び％ＧＦＰ陽性２９３Ｅ細胞（■）を示すグラフである。２９３Ｅ細胞の対照セットはＤＭＥＭ中で増殖させた。 図４は、異なるベクター型の異なる重鎖（ＨＣ）：軽鎖（ＬＣ）比で同時トランスフェクトされた細胞による抗体生産を示すグラフである。 図５Ａは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ中の一過性トランスフェクトされた２９３Ｅ細胞の抗体生産（●）及び細胞生存率（×）を示すグラフである。 図５Ｂは、トランスフェクションの７日後のトランスフェクトされた細胞培養液による、振とうフラスコ対Ｉｎｔｅｇｒａフラスコ中の抗体生産を示すグラフである。 図６Ａは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃１をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた生存細胞の割合のグラフである。図６Ａ及び図６Ｂ中で、■はＩ−５０；▲はＩ−１００；●はＩ−２００；◆はＩ−４００；及び×はＥ−２００である。 図６Ｂは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃２をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた生存細胞の割合のグラフである。図６Ａ及び図６Ｂ中で、■はＩ−５０；▲はＩ−１００；●はＩ−２００；◆はＩ−４００；及び×はＥ−２００である。 図７Ａは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃１をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた生存細胞の数のグラフである。図７Ａ及び図７Ｂ中で、■はＩ−５０；▲はＩ−１００；●はＩ−２００；◆はＩ−４００；及び×はＥ−２００である。 図７Ｂは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃２をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた生存細胞の数のグラフである。図７Ａ及び図７Ｂ中で、■はＩ−５０；▲はＩ−１００；●はＩ−２００；◆はＩ−４００；及び×はＥ−２００である。 図８Ａは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃１をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞によって生産された抗体の濃度のグラフである。図８Ａ及び図８Ｂ中で、■はＩ−５０；▲はＩ−１００；●はＩ−２００；◆はＩ−４００；及び×はＥ−２００である。 図８Ｂは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃２をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞によって生産された抗体の濃度のグラフである。図８Ａ及び図８Ｂ中で、■はＩ−５０；▲はＩ−１００；●はＩ−２００；◆はＩ−４００；及び×はＥ−２００である。 図９Ａは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃１をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞によって生産された総抗体のグラフである。 図９Ｂは、トランスフェクション後の時間の関数としての、Ａｂ＃２をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞によって生産された抗体の総生産量のグラフである。 図１０は、いかなるコード配列も有さないｐＭＸＴ５（図１Ａ）のヌクレオチド配列である、配列番号１を示す。制限酵素部位は、部位の位置の上に、酵素の名前で表示されている。ＣＭＶプロモーターは、ヌクレオチド１〜１０３７を含む；５’ＵＴＲイントロンは、ヌクレオチド８８８〜９７４を含む；ＭＣＳは、ヌクレオチド１０３８〜１０６１を含む；ＬＣ３’ＵＴは、ヌクレオチド１０６２〜２５６０を含む；ＯｒｉＰは、ヌクレオチド２５６１〜４５５０を含む；ｐＵＣ１９ｏｒｉは、ヌクレオチド４５５１〜５２２０を含む；及びＡｐは、ヌクレオチド５２２１〜６３８０を含む。 図１０は、いかなるコード配列も有さないｐＭＸＴ５（図１Ａ）のヌクレオチド配列である、配列番号１を示す。制限酵素部位は、部位の位置の上に、酵素の名前で表示されている。ＣＭＶプロモーターは、ヌクレオチド１〜１０３７を含む；５’ＵＴＲイントロンは、ヌクレオチド８８８〜９７４を含む；ＭＣＳは、ヌクレオチド１０３８〜１０６１を含む；ＬＣ３’ＵＴは、ヌクレオチド１０６２〜２５６０を含む；ＯｒｉＰは、ヌクレオチド２５６１〜４５５０を含む；ｐＵＣ１９ｏｒｉは、ヌクレオチド４５５１〜５２２０を含む；及びＡｐは、ヌクレオチド５２２１〜６３８０を含む。

Claims (94)

  1. 軽鎖遺伝子の３’ＵＴＲ及びエプスタイン−バーウイルス複製起点（ｏｒｉＰ）を含む、組換え発現ベクター。
  2. 軽鎖遺伝子がマウス軽鎖遺伝子である、請求項１の組換え発現ベクター。
  3. ３’ＵＴＲが配列番号１のヌクレオチド１０６２〜２５６０のヌクレオチド配列を含む、請求項２の組換え発現ベクター。
  4. 組換え発現ベクターが組み換え一過性発現ベクターである、請求項１から３のいずれかの組換え発現ベクター。
  5. ｐＵＣ１９複製起点、ウイルスプロモーター、５’ＵＴＲイントロン、又は前記のいずれかの組合せを更に含む、請求項１から４のいずれかの組換え発現ベクター。
  6. ｐＵＣ１９複製起点、ウイルスプロモーター、及び５’ＵＴＲイントロンを更に含む、請求項５の組換え発現ベクター。
  7. ウイルスプロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項５又は６の組換え発現ベクター。
  8. ５’ＵＴＲイントロンが配列番号１のヌクレオチド８８８〜９７４を含む、請求項５から７のいずれかの組換え発現ベクター。
  9. ｐＵＣ１９複製起点が配列番号１のヌクレオチド４５５１〜５２２０のヌクレオチド配列を含む、請求項５から８のいずれかの組換え発現ベクター。
  10. 抗体シグナル配列を更に含む、請求項１から９のいずれかの組換え発現ベクター。
  11. 組換え発現ベクターが抗体シグナル配列を含まない、請求項１から９のいずれかの組換え発現ベクター。
  12. タンパク質又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項１から１１のいずれかの組換え発現ベクター。
  13. ヌクレオチド配列が免疫グロブリン鎖をコードする、請求項１２の組換え発現ベクター。
  14. 免疫グロブリン鎖がγ１重鎖、γ２重鎖、γ４重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖からなる群より選択される、請求項１３の組換え発現ベクター。
  15. 細胞と、請求項１から１４のいずれかの組換え発現ベクターとを接触させ、組換えタンパク質が生産されることを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
  16. 請求項１から１４のいずれかの組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
  17. 宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６の宿主細胞。
  18. 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１７の宿主細胞。
  19. ヒト細胞がヒト胎児腎臓細胞である、請求項１８の宿主細胞。
  20. ヒト胎児腎臓細胞がエプスタインバーウイルス核内抗原−１（ＥＢＮＡ−１）タンパク質を発現する、請求項１９の宿主細胞。
  21. 宿主細胞が２９３Ｅ細胞である、請求項２０の宿主細胞。
  22. 請求項１６から２１のいずれかの宿主細胞を培養し、組換えタンパク質が生産されることを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
  23. 組換えタンパク質を生産する方法であって、細胞と、第１ベクター及び第２ベクターとを培地中で接触させることを含み、第１ベクターは第１ポリペプチド鎖をコードし、第２ベクターは第２ポリペプチド鎖をコードしており、第１ポリペプチド鎖は第２ポリペプチド鎖と異なり、かつ第２ベクターは、第１ベクターの約１．５から２．５倍量で培地中に存在しており、組換えヘテロ２量体またはヘテロ多量体のタンパク質が生産される、方法。
  24. 第２ベクターが、第１ベクターの約１．７５から２．２５倍量で培地中に存在している、請求項２３の方法。
  25. 第２ベクターが、第１ベクターの２倍量で培地中に存在している、請求項２４の方法。
  26. 組換えタンパク質がヘテロ４量体タンパク質である、請求項２３から２５のいずれかの方法。
  27. ヘテロ４量体タンパク質が免疫グロブリンである、請求項２６の方法。
  28. 第１ベクターが免疫グロブリンの重鎖、又はその機能的断片をコードし、かつ第２ベクターが免疫グロブリンの軽鎖、又はその機能的断片をコードする、請求項２７の方法。
  29. 重鎖がヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖、又はヒトγ４重鎖である、請求項２８の方法。
  30. 軽鎖がヒトκ軽鎖又はλ軽鎖である、請求項２８又は２９の方法。
  31. 第１ベクター及び第２ベクターの各々が組換え一過性発現ベクターである、請求項２３から３０のいずれかの方法。
  32. 第１ベクター及び第２ベクターの各々が軽鎖遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびｏｒｉＰを含む、請求項２３から３１のいずれかの方法。
  33. 第１ベクター及び第２ベクターの各々がウイルスプロモーター、ｐＵＣ１９複製起点、５’ＵＴＲイントロン、又は前記のいずれかの組合せを含む、請求項２３から３２のいずれかの方法。
  34. ウイルスプロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項３３の方法。
  35. ５’ＵＴＲイントロンが配列番号１のヌクレオチド８８８〜９７４を含む、請求項３３又は３４の方法。
  36. 第１ベクター及び第２ベクターの各々が抗体シグナル配列を含む、請求項２３から３５のいずれかの方法。
  37. 細胞が第１ベクター及び第２ベクターに同時に接触される、請求項２３から３６のいずれかの方法。
  38. 細胞がカチオン性ポリマー存在下で第１ベクター及び第２ベクターに接触される、請求項２３から３７のいずれかの方法。
  39. カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項３８の方法。
  40. ＰＥＩが線状ＰＥＩである、請求項３９の方法。
  41. 線状ＰＥＩが第１ベクター及び第２ベクターの約１．５から４．５倍量で存在する、請求項４０の方法。
  42. 線状ＰＥＩが第１ベクター及び第２ベクターの約２．５から３．５倍量で存在する、請求項４１の方法。
  43. 線状ＰＥＩが第１ベクター及び第２ベクターの２倍量で存在する、請求項４２の方法。
  44. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項２３から４３のいずれかの方法。
  45. 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４４の方法。
  46. ヒト細胞がヒト胎児腎臓細胞である、請求項４５の方法。
  47. ヒト胎児腎臓細胞がエプスタイン−バーウイルス核内抗原−１タンパク質（ＥＢＮＡ−１）を発現する、請求項４６の方法。
  48. 細胞が２９３Ｅ細胞である、請求項４７の方法。
  49. 培地から細胞を単離し、膜増幅培養容器中の、該培地とは異なる第２培地において細胞を培養することを更に含む、請求項２３から４８の方法。
  50. 第２培地が無血清細胞培養培地である、請求項４９の方法。
  51. 第２培地がＩＳ２９３（商標）培地である、請求項５０の方法。
  52. 膜増幅培養容器がＩｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００である、請求項４９から５１のいずれかの方法。
  53. 第２培地から組換えタンパク質を精製することを更に含む、請求項４９から５２のいずれかの方法。
  54. 精製がプロテインＡを含むカラムを通して第２培地を遠心分離することを含む、請求項５３の方法。
  55. 第２培地中で細胞を３日間培養した後に精製を行う、請求項５３又は５４の方法。
  56. 第２培地中で細胞を７日間培養した後に精製を行う、請求項５３又は５４の方法。
  57. 第２培地中で少なくとも３００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が生産される、請求項５５又は５６の方法。
  58. 第２培地中で少なくとも５００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が生産される、請求項５７の方法。
  59. 第２培地中で少なくとも７００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が生産される、請求項５８の方法。
  60. 培養が約１．０×１０６と２．０×１０７細胞／ｍｌとの間の細胞密度で、第２培地中に細胞を播くことを含む、請求項４９から５９のいずれかの方法。
  61. 細胞密度が約３．０×１０６から約１．０×１０７細胞／ｍｌである、請求項６０の方法。
  62. 組換えタンパク質をコードする組換え一過性発現ベクターと接触させた細胞を、膜増幅培養容器中の培地で培養し、組換えタンパク質が生産されることを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
  63. 膜増幅培養容器がＩｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００である、請求項６２の方法。
  64. 組換えタンパク質をコードする組換え一過性発現ベクターと接触させた細胞を、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の培地で培養し、組換えタンパク質が生産されることを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
  65. 培地が無血清細胞培養培地である、請求項６２から６４のいずれかの方法。
  66. 無血清培地がＩＳ２９３（商標）培地である、請求項６５の方法。
  67. 培地からタンパク質を精製することを更に含む、請求項６２から６６のいずれかの方法。
  68. 精製がプロテインＡを含むカラムを通して培地を遠心分離することを含む、請求項６７の方法。
  69. 培地中で細胞を３日間培養した後に精製を行う、請求項６７又は６８の方法。
  70. 培地中で細胞を７日間培養した後に精製を行う、請求項６７又は６８の方法。
  71. 培地中で少なくとも３００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が生産される、請求項６９又は７０の方法。
  72. 培地中で少なくとも５００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が生産される、請求項７１の方法。
  73. 培地中で少なくとも７００μｇ／ｍｌの組換えタンパク質が生産される、請求項７２の方法。
  74. 培養が約１．０×１０６と２．０×１０７細胞／ｍｌとの間の細胞密度で、培地中に細胞を播くことを含む、請求項６２から７３のいずれかの方法。
  75. 細胞密度が約３．０×１０６から約１．０×１０７細胞／ｍｌである、請求項７４の方法。
  76. 組換え一過性発現ベクターが軽鎖遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびｏｒｉＰを含む、請求項６２から７５のいずれかの方法。
  77. 組換え一過性発現ベクターがｐＵＣ１９複製起点、ウイルスプロモーター、５’ＵＴＲイントロン、又は前記のいずれかの組合せを含む、請求項６２から７６のいずれかの方法。
  78. ウイルスプロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項７７の方法。
  79. ５’ＵＴＲイントロンが配列番号１のヌクレオチド８８８〜９７４を含む、請求項７７又は７８の方法。
  80. 細胞がカチオン性ポリマー存在下で組換え一過性発現ベクターに接触されたものである、請求項６２から７９のいずれかの方法。
  81. カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項８０の方法。
  82. ＰＥＩが線状ＰＥＩである、請求項８１の方法。
  83. ＰＥＩが組換え一過性発現ベクターの約１．５から４．５倍量で存在する、請求項８２の方法。
  84. ＰＥＩが組換え一過性発現ベクターの約２．５から約３．５倍量で存在する、請求項８３の方法。
  85. ＰＥＩが組換え一過性発現ベクターの２倍量で存在する、請求項８４の方法。
  86. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項６２から８５のいずれかの方法。
  87. 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項８６の方法。
  88. ヒト細胞がヒト胎児腎臓細胞である、請求項８７の方法。
  89. ヒト胎児腎臓細胞がエプスタイン−バーウイルス核内抗原−１タンパク質（ＥＢＮＡ−１）を発現する、請求項８８の方法。
  90. 細胞が２９３Ｅ細胞である、請求項８９の方法。
  91. タンパク質が免疫グロブリン鎖又はその機能的断片である、請求項６２から９０のいずれかの方法。
  92. 免疫グロブリン鎖が重鎖又は軽鎖である、請求項９１の方法。
  93. 免疫グロブリン鎖が重鎖であり、かつ該重鎖がヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖、又はヒトγ４重鎖である、請求項９２の方法。
  94. 免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、かつ該軽鎖がヒトκ軽鎖又はλ軽鎖である、請求項９２の方法。
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