JP3861134B2

JP3861134B2 - タンパク質発現法およびタンパク質発現用コンストラクト

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Publication number: JP3861134B2
Application number: JP2000562495A
Authority: JP
Inventors: シャムユエンチャン、; ヴァン−マイトラン、; シュ−ランチェン、
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1998-07-28
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2019-07-08
Also published as: AR022058A1; CA2337088C; DE69933699D1; CA2337088A1; DE69933699T2; JP2002524033A; WO2000006713A8; ES2275346T3; TWI245048B; EP1144611B1; US6051401A; WO2000006713A2; EP1144611A3; AU4974299A; EP1144611A2; WO2000006713A3

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子発現技術の分野および形質転換宿主細胞と組換えＤＮＡベクターを使ったタンパク質の製造に関する。
【０００２】
特に本発明は、形質転換哺乳類宿主細胞における効率のよいタンパク質生産と、それを達成するための方法、コンストラクトおよび宿主細胞の領域に関する。
【０００３】
（発明の背景）
クローン化した遺伝子をタンパク質産物として発現させる効率のよい手段は、クローン化した遺伝子の同定と特徴づけ、構造機能解析用のタンパク質の大量調製、および医薬品に使用するためのタンパク質の製造には不可欠な道具である。
【０００４】
タンパク質発現系は、例えば「遺伝子発現技術（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻（ＤａｖｉｄＧｏｅｄｄｅｌら編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社，ロンドン，１９９１）や、ＧｅｎｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，第二版，Ｊ．Ｄ．Ｈａｗｋｉｎｓ（ケンブリッジ大学出版局，ロンドン，１９９１）などの参考書、およびそれらに引用されている文献にみられるように、文献に記載されている。単純なタンパク質の発現は適当な大腸菌発現系を使って型通りに行うことができるが、これらの系は複雑な哺乳類タンパク質の発現には通例、不適切である。タンパク質発現系に使用するための哺乳類発現系が開発されているが、これらの系は複雑な培養培地要求性を持ち、これらを大量長期培養系として維持することは極めて難しく、また多大な費用を要する。
【０００５】
タンパク質生産細胞系を低タンパク質培地または無血清培地に適応させることは、例えば米国特許第４，７５７，００５号（その全文を本明細書に援用する）に記載があるように、目的とするタンパク質産物の最終精製を簡略化する一方法である。米国特許第５，１４３，８４２号、第４，５６０，６５５号、第５，０２４，９４７号、第４，５３３，６３７号、第４，７６７，７０４号、第４，８１６，４０１号、第５，６３１，１５９号、第５，１３５，８６６号（これらの特許と以下に挙げる特許はすべてその全文を本明細書に援用する）と、例えばＨｅｄｌｕｎｄおよびＭｉｌｌｅｒ「４種類の樹立ヒト前立腺癌細胞系の成長を維持できる無血清合成培地（ＡＳｅｒｕｍ−ＦｒｅｅＤｅｆｉｎｅｄＭｅｄｉｕｍＣａｐａｂｌｅｏｆｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｇｒｏｗｔｈｏｆｆｏｕｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ）」ＴｈｅＰｒｏｓｔａｔｅ２４：２２１−２２８（１９９４）をはじめとする文献には、数多くの改良された栄養培地および無血清培地が記載されている。哺乳類細胞の培養法も、例えば米国特許第５，１２２，４６９号や文献に記載されている。また、大量培養および大量タンパク質生産の技術と装置も、例えば米国特許第５，０８１，０３５号、同第５，１５３，１３１号および文献に記載されている。
【０００６】
このように、哺乳類タンパク質発現系と哺乳類タンパク質発現法が必要とされていること、特に大量タンパク質生産に適した無タンパク質哺乳類タンパク質生産系が必要とされていることは、当技術分野では十分に認識されている。このことは、哺乳類タンパク質栄養剤（特にヒツジおよびウシタンパク質製品）の使用によるプリオン伝染とその関連疾患が最近になって発見され、それらが懸念されていることを考えると、特にそうであると言える。
【０００７】
本発明はこの必要性に取り組み、追加のタンパク質、すなわちアルファ−２−ＨＳ糖タンパク質または哺乳類フェチュインタンパク質を発現するように宿主細胞を形質転換または同時形質転換することによって、目的のタンパク質の効率のよいタンパク質発現が起こるように哺乳類宿主細胞を適応させることができるという、予想外の発見を記載するものである。
【０００８】
簡潔に記述するために、以下、本明細書では特に断らない限り「フェチュイン」とは、ヒトアルファ−２−ＨＳ糖タンパク質（ＡＨＳＧ）と、ウシ、マウス、ブタ、ウマおよびラットタンパク質を含む（ただしこれらに限らない）全ての哺乳類フェチュインタンパク質均等物およびそれらのオルソログならびに誘導体を意味するものとする。
【０００９】
フェチュインはウシ胎仔血清中に特徴づけられた最初の胎仔タンパク質であり、ヒトアルファ−２−ＨＳ糖タンパク質と相同であることが見出されている（Ｄｚｉｅｇｉｅｌｅｗｓｋａら「アルファ−２−ＨＳ糖タンパク質はヒト胎児血漿および脳脊髄液中に高濃度に発現される（ａｌｐｈａ−２−ＨＳ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｆｅｔａｌｐｌａｓｍａａｎｄｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄ）」ＦｅｔａｌＤｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．８：２２−２７，１９９３）。アルファ−２−ＨＳ糖タンパク質は主として肝実質細胞によって産生され、翻訳後修飾を受けると考えられている（Ｊａｈｎｅｎ−Ｄｅｃｈｅｎｔら「ヒトアルファ−２−ＨＳ糖タンパク質（ヒトフェチュイン）の翻訳後プロセシング（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆｈｕｍａｎａｌｐｈａ−２−ＨＳ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｈｕｍａｎｆｅｔｕｉｎ））」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：５９−６９，１９９４）。マウスカウンタートリプシンのシスタチン様ドメインはトリプシンを阻害することが見出されている（Ｙｏｓｈｉｄａら「哺乳類フェチュインファミリーの一員、マウスカウンタートリプシンのシスタチン様ドメインは、トリプシン阻害の原因になっている（Ｃｙｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｏｆｍｏｕｓｅｃｏｕｎｔｅｒｔｒｙｐｓｉｎ，ａｍｅｍｂｅｒｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｆｅｔｕｉｎｆａｍｉｌｙ，ｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｒｙｐｓｉｎ）」ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ３９（５）：１０２３−１０２８，１９９６）。フェチュイン／アルファ−２−ＨＳ糖タンパク質は胚形成中に発現することが見出されており、また、骨リモデリングを促進し、細胞増殖を刺激することと、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）の抗増殖性作用に対してアンタゴニストとして作用することが見出されている（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕら「フェチュイン／アルファ−２−ＨＳ糖タンパク質はトランスフォーミング成長因子βのＩＩ型レセプター模倣体でありサイトカインアンタゴニストである（Ｆｅｔｕｉｎ／ａｌｐｈａ−２−ＨＳ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｉｓａｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−β ＴｙｐｅＩＩｒｅｃｅｐｔｏｒｍｉｍｉｃａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７１（２２）：１２７５５−１２７６１，１９９６）。ラットのホスホフェチュイン（リン酸化フェチュイン）は肝細胞ＨＧＦ活性を調節することが見出された（Ｏｈｎｉｓｈｉら「ヒト肝細胞成長因子の存在下における初代培養での肝細胞の成長に対するリン酸化ラットフェチュインの効果（Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｒａｔｆｅｔｕｉｎｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：７５３−７６１，１９９７）。
【００１０】
ウシ胎仔血清の一成分としてのフェチュインは、例えば米国特許第４，７５７，００５号や同第５，１４３，８４２号に見られるように、基本的培養培地の一成分として挙げられてきた。しかし、目的のタンパク質産物を発現すると共にフェチュインを発現するように宿主細胞を形質転換することにより、前記目的のタンパク質を効率よく発現させることができ、形質転換された宿主細胞の無血清または低タンパク質培養系への移行が簡単になり、タンパク質の大量生産が可能になることが、本発明によって発見された。
【００１１】
（発明の簡単な説明）
本発明は、フェチュインタンパク質をも発現させている哺乳類宿主細胞を使用することにより、目的とするタンパク質の効率のよい発現を達成できるという基礎的発見を包含する。例えば、フェチュインと目的のタンパク質を発現させるそのような形質転換宿主細胞は、無血清または低タンパク質大量培養タンパク質生産への適応に適している。本発明のフェチュインは、ヒトアルファ−２−ＨＳ糖タンパク質（ＡＨＳＧ）と、ウシ、マウス、ブタ、ウマおよびラットタンパク質を含む（ただしこれらに限らない）全ての哺乳類フェチュインタンパク質均等物およびそれらのオルソログならびに誘導体を包含する。本発明の好ましい一態様では、そのフェチュインがヒトまたはウシのフェチュイン、それらのオルソログならびに誘導体である。
【００１２】
本発明は、大量、無血清、中空糸、懸濁培養、付着培養、発酵培養および少量タンパク質発現などを含む（ただしこれらに限らない）あらゆる哺乳類細胞培養系での目的のタンパク質の効率のよい発現を包含する。特に本発明は低タンパク質または無血清発現系に向けられる。
【００１３】
本発明での使用に適した哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、および組換えタンパク質の発現に適した他の哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限るわけではない。本発明の哺乳類宿主細胞は、常態でフェチュインを発現していて、そのような発現に関して選択された細胞、またはより高い発現に関して選択された細胞、またはそのような発現に適応させた細胞であってよい。そのような既存のフェチュイン発現細胞は、内在するゲノムの遺伝子操作によって、もしくは１つまたは複数の適当な発現ベクターをトランスフェクトすることによって、常態での産生量よりも高レベルのフェチュインを発現させるように改変することができる。本発明の哺乳類宿主細胞は常態ではフェチュインを発現しない細胞であって、本発明の教示に従ってフェチュインを発現するように形質転換されたものであってもよい。フェチュインを発現させるための適当な宿主細胞の形質転換は、外因性フェチュイン遺伝子を含有する適当な発現ベクターによる形質転換によって、あるいは内因性フェチュイン遺伝子を発現させるようにその宿主細胞を適応させることによって達成できる。
【００１４】
目的のタンパク質産物は、標準的な発現ベクターを使って、または目的のタンパク質を組み込んで発現させるように宿主細胞ゲノムを操作することによって、フェチュイン適応宿主細胞から発現させることができる。フェチュインと目的のタンパク質の両方を発現させる発現ベクターを構築することもできる。そのような場合は、フェチュイン遺伝子と目的タンパク質の遺伝子とを、同じまたは異なるプロモータ／エンハンサー系の制御下に置くことができる。フェチュイン−目的タンパク質融合産物を作って発現させることも、本発明の範囲を越えない行為である。
【００１５】
本発明は、その特定の一実施態様として、組換えヒトグリア成長因子２（ＧＧＦ２）の改良された哺乳類発現ベクター、そのようなベクターで形質転換されたＧＧＦ２細胞系ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻／ＧＧＦ２）、安定で増加したレベルのＧＧＦ２を分泌することができるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻／α２ＨＳＧＰ／ＧＧＦ２）、および発酵槽で本発明の細胞を連続的に灌流させることによるＧＧＦ２の無タンパク質製造法を包含する。
【００１６】
例えば本発明は、哺乳類宿主細胞中で組換えＤＮＡ発現ベクターから目的のタンパク質を生産する方法であって、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで哺乳類宿主細胞を形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換し、前記形質転換宿主細胞を培養増殖し、前記培養から前記目的のタンパク質を単離することからなる方法を包含する。さらに本発明では、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記ベクターまたは目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する上記発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子も含有する上記の方法が考えられる。また、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子をも含有する態様も考えられる。本発明は、プロモータ、前記プロモータに機能可能な形で結合しているフェチュインのコード配列、前記プロモータの下流かつ前記フェチュインコード配列の上流にあって２つの同じ供与部位と１つの受容部位とを含んでいるイントロン配列、およびプロモータに機能可能な形で結合している異種タンパク質のコード配列を含んでなる発現ベクターを包含する。
【００１７】
２つの発現ベクターを使用する場合、標的宿主細胞の形質転換の順序は、その哺乳類宿主細胞が、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで最初に形質転換されるような順序であってもよいと考えられる。したがって本発明では、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する発現ベクターでまず標的宿主細胞を形質転換することが考えられる。
【００１８】
したがって本発明は、哺乳類宿主細胞中で組換えＤＮＡ発現ベクターから目的のタンパク質を生産するための形質転換哺乳類宿主細胞を作出する方法であって、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで哺乳類宿主細胞を形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換することからなる方法を包含する。また、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記ベクターまたは目的タンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する上記発現ベクターが、選択可能マーカーをコード化する遺伝子も含有する、上述のような方法も考えられる。
【００１９】
本発明のさらにもう一つの実施態様として、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが、目的タンパク質をコード化する発現可能な遺伝子をも含有し、該発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子を含有する、本発明宿主細胞の作出方法が考えられる。本発明の形質転換宿主細胞作出法では、該哺乳類宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターでまず形質転換される方法、または該哺乳類宿主細胞が目的のタンパク質をコード化する発現可能遺伝子を含有する発現ベクターでまず形質転換される方法が考えられる。
【００２０】
本発明のさらにもう一つの実施態様は、本発明の方法によって作出される宿主細胞である。特に本発明は、細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるための哺乳類宿主細胞であって、該宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターおよび目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する第二の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする宿主細胞を包含する。本発明では、細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるための哺乳類宿主細胞であって、該宿主細胞が、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子と、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子とを含有する発現ベクターで形質転換されることを特徴とする宿主細胞も考えられ、そのような宿主細胞も本発明に包含される。
【００２１】
本発明の方法は、細胞培養からの目的のタンパク質の生産であって、該細胞培養の細胞が発現可能なフェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換されていて、該細胞が目的のタンパク質も発現させる生産も包含する。このような方法は、フェチュイン発現量が増加するように選択または他の方法で操作されていて、目的のタンパク質を発現させている宿主細胞からの目的タンパク質の生産も包含する。
【００２２】
宿主細胞の効率のよい形質転換を助けるために、本発明の方法は選択可能マーカーをコード化する遺伝子をも含有する発現ベクターの使用を包含すると考えられる。
【００２３】
特定の一側面として、本発明は、フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが発現ベクターｐＳＶ−ＡＨＳＧである上述の方法および宿主細胞を包含する。本発明の特定の一実施態様は、目的のタンパク質をコード化する遺伝子を含有する上記発現ベクターがｐＣＭＧＧＦ２であり、該目的タンパク質がヒトグリア成長因子２（ＧＧＦ２）である、上述のような方法および宿主細胞である。
【００２４】
特定の一実施態様として、本発明は、フェチュイン適応宿主細胞ＣＨＯ−α２ＨＳＧＰおよびその子孫または誘導体を包含する。
【００２５】
したがって本発明は、特定の一側面として、特に、発現ベクターｐＳＶ−ＡＨＳＧの核酸配列および発現ベクターｐＣＭＧＧＦ２の核酸配列を包含する。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質または哺乳類フェチュインである第一のタンパク質を産生するように宿主細胞を形質転換することにより、哺乳類宿主細胞を、第一の目的タンパク質の効率のよいタンパク質発現に適応させることができるという予想外の発見を包含する。本発明の方法、コンストラクトおよび宿主細胞は、発酵槽系、中空糸培養系、タンブラー系および懸濁培養系など（ただしこれらに限らない）の大量生産系だけでなく、標準的な少量培養系での目的のタンパク質の生産にも適している。
【００２７】
核酸の操作、核酸のＰＣＲ増幅、発現ベクターの構築、宿主細胞の形質転換および形質転換細胞の培養によるタンパク質の生産に関するプロトコルと方法は、当技術分野では知られており、様々な実験マニュアルや教科書に見出すことができる。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，第二版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第二版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ社，１９９２、「遺伝子発現技術（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８５巻（ＤａｖｉｄＧｏｅｄｄｅｌら編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社，ロンドン，１９９１）、ＧｅｎｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ第二版，Ｊ．Ｄ．Ｈａｗｋｉｎｓ（ケンブリッジ大学出版局，ロンドン，１９９１）、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら，１９９０，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社，カリフォルニア州サンディエゴ）、ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ第二版（Ｒ．ＩＦｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７，Ｌｉｓｓ社，ニューヨーク州ニューヨーク）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（第７巻）「遺伝子導入および遺伝子発現プロトコル（ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，１９９１，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ社，ニュージャージー州クリフトン）、Ｒａｍｓａｙ，Ｍ．「酵母人工クローニング（ＹｅａｓｔＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣｌｏｎｉｎｇ）」Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：１８１−２０１，１９９４、およびＳｍｉｔｈら「大きい人工染色体の増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌａｒｇｅａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８２４２−８２４６，１９９０を参照されたい。
【００２８】
本発明と、その諸相の多くは、一例として、下記の実施例で、よりよく理解することができる。
【００２９】
（実施例１．フェチュイン発現と宿主細胞）
哺乳類細胞のトランスフェクションに適した発現ベクターを用いて、配列番号５のヒトフェチュイン遺伝子オルソログをコード化する核酸配列を機能可能な形で挿入し、完成したベクターをＣＨＯ宿主細胞中に形質転換した。本発明のフェチュイン発現ベクターの一例はｐＳＶ−ＡＨＳＧ（Ｆｉｇ．１）である。好適な出発発現ベクターは、適当なプロモータ／エンハンサー系に機能可能な形で結合されるように所望のフェチュイン遺伝子を挿入するのに適したものである。ＡＨＳＧは、ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，カリフォルニア州パロアルト）を使用し、逆転写酵素によるＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法によってクローン化した。ＰＣＲプライマーの配列は１）５’−ＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣ（配列番号７）および２）５’−ＧＴＧＧＣＴＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣ（配列番号８）とした。
【００３０】
安定な形質転換の効率のよい選択と維持が可能なように、好ましい好適な発現ベクターは、例えば抗生物質耐性遺伝子や、適当な欠損宿主細胞と組み合わせたときに要求される代謝タンパク質などの、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子を含有することができる。考えられる本発明の実施態様として、好適な発現ベクターは、任意の適当な哺乳類フェチュイン、例えばウシフェチュイン、マウスフェチュイン、ブタフェチュイン、ウマフェチュインまたはラットフェチュインなどをコード化する核酸を含有しうる。哺乳類フェチュイン遺伝子をコード化する核酸配列は当技術分野では知られており、ヒト（＃３６３１７）、ラットＢＳＰ（＃８９８２２）、ラットｐｐ６３（＃９２４８２）、ラットフェチュイン（＃９４３０１）、ウシフェチュイン（＃１０１３８６）、緬羊（Ｏｖｉｓａｒｉｅｓ）フェチュイン（＃１０４７８８）およびイノシシ（Ｓ．ｓｃｒｏｆａ）フェチュイン（＃１０８３９４）を含めて、ＧｅｎＢａｎｋデータバンクに見出すことができる。好ましいフェチュイン遺伝子はヒトフェチュイン（＃３６３１７）（配列番号３）およびウシフェチュイン（＃１０１３８６）（配列番号１）、それらのホモログならびにオルソログ、例えば配列番号５の核酸配列などである。
【００３１】
次に、好適な哺乳類宿主細胞をフェチュイン発現ベクターで形質転換し、安定なトランスフェクションのために選択する。好ましい一実施態様では、出発宿主細胞がＣＨＯ細胞であって、トランスフェクション後に（ｄｈｆｒ⁻／α２ＨＳＧＰ）という表現型を持つ。
【００３２】
フェチュインの構成的な発現が起こる好適な宿主細胞系では、発現ベクターからのタンパク質発現の増進が見込める。フェチュインの構成的発現は、フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターを宿主細胞に逐次トランスフェクトし、フェチュインタンパク質を発現する形質転換細胞をスクリーニングし選択した後、選択したその細胞（またはその子孫）に、発現させようとする目的のタンパク質（１つまたは複数）の遺伝子（１つまたは複数）を含有する発現ベクターをトランスフェクトすることによって樹立できる。
【００３３】
好ましい一方法では、一つのベクターがフェチュイン遺伝子をコードし、他のベクター（１つまたは複数）が１つまたは複数の目的のタンパク質をコード化する個別の発現ベクターによる宿主細胞の同時トランスフェクションを行う。しかし、１つまたは複数の目的タンパク質をコードしそれを発現させるベクターと同じベクターからフェチュイン遺伝子を発現させる複合発現ベクターを構築する方法は、当業者においては分かるだろう。本発明のさらにもう一つの変更態様では、そのような複合フェチュイン／タンパク質発現ベクターを、１つまたは複数の目的のタンパク質をコード化する１つまたは複数の追加の発現ベクターと同時トランスフェクトする。
【００３４】
甚だしい実験を行わずに本発明の変更態様をいくつか構築し、それらを使用できることは、当業者には理解されるだろう。
【００３５】
いったん形質転換宿主細胞が樹立されたら、さらなる表現型の特性、例えばタンパク質発現レベル、成長速度、ならびに温度、培地要求性および低タンパク質培地または無血清培地での成長への適合性などといった培養条件に関して、それらの形質転換宿主細胞をさらに選別し、選択することができる。
【００３６】
特に、ＣＨＯ細胞をプラスミドｐＳＶ−ＡＨＳＧで形質転換することにより、ＣＨＯ−α２ＨＳＧＰと呼ばれるフェチュイン適応宿主細胞（ＣＨＯ表現型ｄｈｆｒ⁻／α２ＨＳＧＰ）を得ることができる。
【００３７】
（実施例２．組換えヒトグリア成長因子（ＧＧＦ２））
多発性硬化症（ＭＳ）の病因はまだわかっていないが、この脱髄性疾患の治療戦略は、ＭＳ病巣の形成を伴う免疫学的事象の調節に基づいてきた（ＷａｕｂａｎｔＥＬ，ＯｋｓｅｎｂｅｒｇＪＲおよびＧｏｏｄｋｉｎＤＥ「多発性硬化症病巣の病理生理学（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓｌｅｓｉｏｎｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：３２−４１，１９９７）。ベータインターフェロンは再発型ＭＳの治療に使用されて成功を収めている免疫調節薬の一つである。乏突起膠細胞の分裂促進性成長因子などの他の因子も、新たなＭＳの治療戦略の一つとして挙げられている。これら神経栄養因子の治療能力によって再ミエリン化が促進されると推測された。組換えヒトグリア成長因子（ＧＧＦ２）はシュワン細胞と乏突起膠細胞に対する刺激効果が報告されているそれら因子類の一つである（ＭａｈａｎｔｈａｐｐａＮＫ，ＡｎｔｏｎＥＳおよびＭａｔｔｈｅｗＷＤ「可溶性ニューレグリン、グリア成長因子２は、シュワン細胞の運動性を直接増加させ、神経突起の伸長を間接的に促進する（Ｇｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２，ａｓｏｌｕｂｌｅｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ，ｄｉｒｅｃｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｓＳｃｈｗａｎｎｃｅｌｌｍｏｔｉｌｉｔｙａｎｄｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｓｎｅｕｒｉｔｅｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１６：４６７３−４６８３，１９９６）。末梢神経系または中枢神経系における神経変性障害および脱髄の治療用にＧＧＦ２を製造する方法は米国特許第５，５３０，１０９号（その全文を本明細書に援用する）に記載されている。
【００３８】
米国特許第５，５３０，１０９号に記載の発現ベクターと生産細胞系の両者を使用して、それらの生産性を評価した。意外なことに、これらの細胞系はかなり低い比生産性（０．５〜１ｐｇ／細胞／日）を持ち、不安定である。次に、我々はこのベクターを使って高産生細胞系を誘導しようと試みたが、成功しなかった。トランスフェクション効率が低いので、メトトレキセートでの選択では１４００万細胞からたった一つの形質転換体が得られるに過ぎなかった。
【００３９】
ＧＧＦ２に関して高い生産性を持つ安定な細胞系を誘導するために、改良型ベクターを構築した。生産細胞系の誘導は、それらの改良型ベクターを用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）およびＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻／α２ＨＳＧＰ）細胞で行った。高産生細胞の選択は様々なメトトレキセート濃度で行った。細胞を血清タンパク質から徐々に離脱させることによって、無タンパク質クローンを誘導した。これらのクローンの比生産性は２０〜３０ｐｇ／細胞／日の範囲にある。無タンパク質条件とは、実質的に全てのヒトおよび動物の血清ならびに血漿由来のタンパク質が培養培地中に存在しない（それらタンパク質は痕跡量では存在してもよい）が、ヒトインシュリンは補われていることと定義することができる。補充されるインシュリンは組換えヒトインシュリンであることが好ましい。
【００４０】
（実施例３．ＧＧＦ２発現ベクターの構築）
効率のよい転写のために、ＥＢＶＢＭＬＦ−１介在配列（ＭＩＳ、ａ５’イントロン配列；５’−ＩＳ）をＧＧＦ２ｃＤＮＡのすぐ上流かつプロモータの下流に挿入した。ｐＳＭ９７などのベクターの作成に関する具体的な方法と実施例は、米国特許第ＸＸＸＸＸＸＸ号（１９９７年２月２８日に出願された特許出願第０８／８０７，４１５号が最近特許付与されたもので、特許番号が分かり次第、前記出願情報を特許番号に替える予定）に記載されている。
【００４１】
ＭＩＳ配列は、ＢＭＬＦ１と呼ばれるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）読み枠から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって生成した。このＭＩＳ配列は、Ｂ９５−８ＥＢＶの８４，１２２から８４，２２７までのイントロン配列を含むＢ９５−８エプスタイン・バーウイルスの８４，１０５から８４，２６２までのＤＮＡ配列を包含する（Ｆａｒｒｅｌｌ，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＶｉｒａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，第８巻，Ｇ．Ｋｌｅｉｎ編，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ社，ニューヨーク，１９８９；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ００７８４）。
【００４２】
２つのＰＣＲプライマー、１）５’−ＧＧＡＴＣＧＡＴＡＡＣＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号９）および２）５’−ＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴ−３’（配列番号１０）は、ＭＩＳ断片の増幅とそれに続く有方向クローニングのために、それぞれ５’および３’端に、伸長されたＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）およびＨｐａＩ（ＧＴＴＡＡＣ）の制限酵素部位を持つ。もちろん他の適当な制限部位をあてることもできる。
【００４３】
（ＣＩＳと呼ばれる）安定化配列をプロモータの下流かつ第ＶＩＩＩ因子をコード化するＤＮＡの上流に持つ発現ベクターｐＣＩＳ−Ｆ８（本明細書に援用するＥＰ０２６０１４８（１９８７年９月１７日公開））を出発コンストラクトとして使用し、ＨｐａＩおよびＣｌａＩで消化した上述のＰＣＲＭＩＳ断片を、（第ＶＩＩＩ因子遺伝子配列除去後の）ｐＣＩＳ−Ｆ８のＣｌａＩ／ＨｐａＩ部位に挿入した。得られたＭＩＳ含有プラスミドをｐＳＭ９５と名付けた。このＭＩＳ配列（５’−ＩＳ）は、供与部位を含有する７１ｂｐ配列が予想外に反復している点で、元のＥＢＶ配列とは異なる。この新しいＭＩＳ配列（５’−ＩＳ、２２９ｂｐ）は、２つの供与部位と１つの受容部位を持つ（Ｆｉｇ．４参照）。
【００４４】
ＳａｃＩＩ／ＣｌａＩ消化によってｐＳＭ９５からイントロン配列ＣＩＳを除去した。残った骨格をクレノウで平滑末端化し、再結合した。生成したそのプラスミドｐＳＭ９７は、ｏｒｉおよびａｍｐ^ｒ遺伝子を含有するプラスミド骨格中のＣＭＶプロモータ／エンハンサー（ＣＭＶｅ／ｐ）、ＭＩＳ、クローニング用のユニークなＨｐａＩ部位、ポリＡシグナルおよびＳＶ４０初期プロモータｄｈｆｒからなる。プラスミドｐＣＧＩＧ−ＨＢＳ５（米国特許第５，５３０，１０９号）をＥｃｏＲＩで消化して組換えヒトＧＧＦ２ｃＤＮＡを遊離させ、それをベクターｐＳＭ９７のユニークなＨｐａＩ部位に平滑末端結合させた。得られたコンストラクトをｐＣＭＧＧＦ２と呼ぶ（Ｆｉｇ．２）。
【００４５】
（実施例４．ＧＧＦ２細胞クローンの誘導）
トランスフェクション
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）およびＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻／α２ＨＳＧＰ）細胞に、陽イオン脂質ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社＃１０４５９−０１４）を使って、プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。６ウェルプレートのウェルを三つ一組にして、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）またはＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻／α２ＨＳＧＰ）に移入する各プラスミドＤＮＡに使用した。簡単に述べると、６ウェルプレートの各ウェルで、１０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬を、無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地０．５ｍｌ中のｐＣＭＧＧＦ２ＤＮＡ２〜５μｇと混合した。そのプレートを室温で３０分間インキュベートして脂質−ＤＮＡ複合体を形成させた。１つのＴ−７５ｃｍ^２フラスコから得られるサブコンフルエント細胞を、ＰＢＳで希釈した１×トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１５４００−０５４）０．５ｍｌを使ってトリプシン処理し、５ｍｌの成長培地で停止し、ＰＢＳで１回洗浄し、１０^７細胞／ｍｌになるように無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に再懸濁した。次に、無血清培地０．２ｍｌ中の対数増殖期細胞２×１０^６個を各ウェルに加えた後、そのプレートをＣＯ_２培養器中、３７℃で４〜５時間インキュベートした。各ウェルに、５％合成ＦＢＳを含む２ｍｌの成長培地を加えた。トランスフェクションの４８〜７２時間後に一過性発現について細胞をＥＬＩＳＡによって測定した。
【００４６】
薬剤選択と遺伝子増幅
トランスフェクションの２〜３日後に、１トランスフェクションにつき三つ一組のウェルから得られる細胞をトリプシン処理し、一つにまとめ、無血清培地で１回洗浄した。生細胞密度をトリパンブルー排除法によって決定した後、９６ウェルプレートの５％透析ＦＢＳ、５０ｎＭメトトレキセート選択培地に接種した。ＧＧＦ２分泌集団をＥＬＩＳＡでスクリーニングした後、各ウェルに３ｍｌの選択培地を入れる６ウェルフォーマットで４〜６週間ごとにメトトレキセート濃度を増しながら（１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、１μＭ）直接選択増幅段階を行った。
【００４７】
限界希釈クローニング（ＬＤＣ）
１％透析ＦＢＳを含有する薬剤不含選択培地で、９６ウェルフォーマットの１ウェルあたり２００μｌの培地に１細胞のＬＤＣによって、単一細胞クローン（ＳＣＣ）を得た。その培養には１週間に一度、栄養補給した。２週間後に、ＥＬＩＳＡスクリーニングに先立って、それらのプレートを位相差顕微鏡により単一細胞成長について採点した。
【００４８】
異種タンパク質発現用の形質転換細胞系を選択するための他の適当な方法とコンストラクトは、文献と例えば米国特許第５，６１２，２１３号などに記載されている。
【００４９】
ＧＧＦ２ＥＬＩＳＡ
組織培養上清中のｒｈＧＧＦ２を検出するためのサンドイッチ免疫測定は標準的方法を使って行った（好適な免疫測定のプロトコルおよび方法については、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，第二版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第二版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ社，１９９２、Ｒｏｓｅら，ＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第三版，アメリカ微生物学会，１９８６を参照されたい）。基質を添加すると、抗体抗原−ペルオキシダーゼ結合抗体複合体の量を、分光測光法によって測定することができる。試料は、吸光度対ｒｈＧＧＦ２濃度の標準曲線と比較することができる。
【００５０】
（実施例５．細胞クローンの無タンパク質適応と評価）
選択したＧＧＦ２クローンを振盪フラスコでの段階的２倍希釈によって１％ＦＢＳから離脱させた。２０ｐｇ／細胞／日の比生産性を持つ最も生産性の高いクローンＦ１０−Ｂ３を、基礎生産培地を使って、１．５リットル発酵槽で無タンパク質適応させた。基礎無タンパク質生産培地は、２ｍＭグルタミン、１００μＭＣａＣｌ_２、２５０μＭＬ−ヒスチジン、５０μＭＦｅＳＯ_４／ＥＤＴＡ、２ｇ／ＬＮａＨＣＯ_３、１０μｇ／ｍｌ組換えヒトインシュリンおよび０．１％プルロニックＦ６８を補足した強化ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地である（表１）。この培地は７．０〜７．３のｐＨ範囲と、２８０〜３００の浸透圧範囲を保つ。
【００５１】
【表１】

（実施例６．ＧＧＦ２の製造）
上記の基礎生産培地を使ってクローンＦ１０−Ｂ３細胞を１．５リットル発酵槽に接種することにより、ＧＧＦ２の連続無タンパク質製造法を開発した。発酵槽の細胞密度を約２×１０^６細胞／ｍｌに保ち、０．５リットル／日の速度で灌流した。Ｆｉｇ．３に示すように、細胞は、３４日間の生産期間の全体にわたって高レベルのＧＧＦ２を産生し続けた。２４０ｍｇ／リットル／日もの力価が観察された。この連続灌流法は、沈降機などの細胞保持装置を装着した大きい発酵槽（２００〜５００リットル）に容易に適応させることができる。例えば１０Ｌの発酵槽を使用すれば、本発明の方法とコンストラクトにより、４０ｇを超えるＧＧＦ２を６０日間にわたって生産することができる。
【００５２】
米国特許第５，５３０，１０９号に記載の先行技術ベクターｐＣＤＩＧ−ＨＢＳ５は極めて低いトランスフェクション効率を持つ。このベクターによって生成するＣＨＯ（ＧＧＦ２）クローンは、無血清条件下で低い比生産性（０．５〜１．０ｐｇ／細胞／日）を持つばかりでなく、不安定でもある。驚くべきことに、本発明の改良型プラスミドｐＣＭＧＧＦ２は、ＧＧＦ２の安定な高発現と、メトトレキセート選択増幅下でのｄｈｆｒ遺伝子の効率のよい選択および増幅とを支持する。この改良型ベクターを使って誘導されたクローンは、無タンパク質条件下で安定なＧＧＦ２発現と高い比生産性（２０〜３０ｐｇ／細胞／日）を示す。
【００５３】
様々な細胞系の生産性をさらに比較した。下記の表２に、無血清条件下でＧＧＦ２を発現するＣＨＯ細胞とＣＨＯ−α２ＨＳＧＰ細胞の生産性を比較する。驚くべきことに、フェチュイン発現に適応させた無血清クローンの比生産性は、通常のＣＨＯ細胞より２〜８倍高く増加した。
【００５４】
【表２】

本発明の一定の実施態様を詳しく説明したので、当業者は、上記特許請求の範囲に照らして、この開示の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の様々な均等物を理解し、構築することができるだろう。
【図面の簡単な説明】
本発明の態様とコンストラクトは添付の図面を参照してよりよく理解することができる。
【図１】ヒトアルファ−２−ＨＳ糖タンパク質用の発現ベクター（配列番号６のヒトフェチュインオルソログタンパク質をコード化する配列番号５を発現させる）ｐＳＶ−ＡＨＳＧを表す図。
【図２】改良型ＧＧＦ２発現ベクターｐＣＭＧＧＦ２を表す図。
【図３】連続灌流発酵槽とベクターｐＣＭＧＧＦ２で形質転換されたＣＨＯ宿主細胞とを用いた効率のよいＧＧＦ２の無タンパク質生産を示すグラフ。
【図４Ａ】ＣＭＶプロモータ、５’−イントロン配列（ＭＩＳ）およびＨｐａＩクローニング部位の直線地図を表す。平行に置かれた地図はＭＩＳ配列内の１７７ｂｐイントロンの位置を示している。
【図４Ｂ】ＭＩＳのヌクレオチド配列（配列番号１１）を表す。ＥＢＶ由来のヌクレオチド配列（角括弧内）と、その２つの供与部位（左括弧）および１つの供与部位（右括弧）が示されている。２つの反復配列（２×７１ｂｐ）には下線（細い線と太い線）を引いてある。
【配列表】

Claims

哺乳類宿主細胞から目的のタンパク質を単離する方法であって、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで哺乳類宿主細胞を形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を、前記目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換し、前記形質転換宿主細胞を培養増殖し、前記培養から前記目的のタンパク質を単離することからなる方法。
発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記ベクターまたは目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する上記発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子も含有する請求項１に記載の方法。
発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子も含有する請求項１に記載の方法。
上記発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子を含有する請求項３に記載の方法。
上記哺乳類宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターでまず形質転換される請求項１に記載の方法。
哺乳類宿主細胞中で組換えＤＮＡ発現ベクターから目的のタンパク質を生産するための形質転換哺乳類宿主細胞を作出する方法であって、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで哺乳類宿主細胞を形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換することからなる方法。
発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記ベクターまたは目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する上記発現ベクターが、選択可能マーカーをコード化する遺伝子も含有する請求項６に記載の方法。
発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子も含有する請求項６に記載の方法。
上記発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子を含有する請求項８に記載の方法。
上記哺乳類宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターでまず形質転換される請求項６に記載の方法。
細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるための哺乳類宿主細胞であって、該宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換されたのち、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する第二の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする宿主細胞。
フェチュイン遺伝子を含む上記発現ベクターが発現ベクターｐＳＶ−ＡＨＳＧである請求項２に記載の方法。
フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが発現ベクターｐＳＶ−ＡＨＳＧである請求項１１の哺乳類宿主細胞。
目的のタンパク質をコード化する遺伝子を含有する上記発現ベクターがｐＣＭＧＧＦ２である請求項１１の哺乳類宿主細胞。