TWI245048B - Methods and constructs for protein expression - Google Patents
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Description
1245048 五、發明說明（1) 發明範疇 本發明係有關基因表現技術之領域及蛋白質之產生，使 用轉形之宿主細胞和重組DN A載體。 特別地，本發明係有關在轉形之哺乳類宿主細胞中有效 蛋白質製備之領域，及有效如此製備之方法、構件和宿主 細胞。 發明背景 表現選殖基因為蛋白質產物之有效方法為鑑定和特性化 選殖基因、生成大量結構功能分析之蛋白質，及產生用於 醫學醫藥製備物之蛋白質之必要工具。 蛋白質表現系統經述於文獻中，及例如見於如此文獻成 果如基因表現技術，酵素學方法1 8 5卷（編者大衛·哥德 (Goeddel )等人，學術出版社，倫敦，1991 )，基因結構和 表現，第2版，J.D.霍金斯（康橋大學出版社，倫敦， 1991)及其引用之文獻。簡單蛋白質之表現可藉使用合適 之大腸桿菌表現系統例行地完成，然而，此些系統典型地 不適合表現複雜之哺乳類蛋白質。哺乳類表現系統已發展 用於蛋白質表現系統，然而，此些系統具複雜之培養基需 求，及極端困難和耗資以維持大量、長期之培養系統。 蛋白質生成細胞系之調適於低蛋白質或無血清培養基已 為簡單化想要蛋白質產物之最後純化之一種方法，如述於 例如美國專利號4, 7 57, 0 0 5 (以其全體以提及之方式併 入）。許多改進之營養培養基和無血清培養基已述於美國 專利號5, 1 43, 84 2; 4, 56 0, 6 55; 5, 0 24, 947; 4, 53 3, 6 3 7;
第4頁 1245048
4,767’704; 4’816,401; 5,631，159; 5，135,866(此些及 全部其後標明之專利在此以其全體以提及之方式併入）， 及文獻，如於例如海蘭德（H e d 1 u n d )和米勒"能支標4種建 立之人前列腺癌細胞系生長之無血清規定培養基，f前列腺 2 4 : 2 2 1 - 2 2 8 ( 1 9 9 4)。培養哺乳類細胞之方法亦經描述，如 於美國專利號5, 1 2 2, 469及文獻。大量培養物及蛋白質生° 產技術與裝置亦經描述，如於美國專利號5，〇 8丨，〇 3 5和 5，153，131 及文獻。 因此，在技藝中熟知，有著哺乳類蛋白質表現系統和方 法之需求，及特別地適合大量蛋白質生產之無蛋白 乳類蛋白質生產系統。此在使甩哺乳類蛋白質補充物，特 別地綿羊和牛蛋白質產物下最近發現和害怕先前傳送和有 關疾病，係特別真實的。 本發明表達此需求及描述以下之未預期發現，即哺乳類 宿主細胞可經調適以有效蛋白質表現想要之蛋白質，即^ =形=共同轉形宿主細胞以表現附加之蛋白質，該附加^ 史白貝為α-2-HS-醣蛋白，或哺乳類胎球蛋白之蛋白 質0 為簡化，在以下之說明書中，除非另有說明，”胎球蛋 白”應指人2-HS-醣蛋白（AHSG)，及所有哺乳類胎球蛋 =之蛋白質相當物，包括但不限於牛、鼠、豬、馬和大 鼠’其相似物及衍生物。 所胎球蛋白為在牛胎兒血清中特性化之第一個胎兒蛋白 質’及經發現同質於人〇：-2-118-醣蛋白（1)2丨”161^31^等
第5頁 1245048 五、發明說明（3) α-2-HS-醣蛋白在人胎兒血漿和腦脊趙液中 •胎兒診斷治療8:2 2 -2 7 )。α-2-HS-酶蛋 人，1993 ， 以高濃度表現 , ^ ^
白由肝細胞優勢地產生，及被認為經過轉譯後修飾 (Jahnen-Dechent 等人，1994，丨’人 2-HS-醣蛋白（人月A 球蛋白）之轉譯後加工"Eur. J· Biochem. 226:59-69)。 鼠反胰蛋白酶之靜囊素似功能部位經發現抑制胰蛋白酶 (Yoshida等人，1 9 9 6，”鼠反胰蛋白酶之靜囊素似功能部 位5哺乳類胎球蛋白族之成員，負責抑制胰蛋白酶”國於 生物化學和分子生物學39(5) : 1〇 23- 1 0 28 )。胎球蛋白/不 -2-HS-酶蛋白經發現在胚胎生成期間表現及發現能促進°^ 重修復和刺激細胞增殖，以及作為轉形生長因子冷1 (丁 yS 1)之抗增殖作用之拮抗劑（Ο e m e t r ^ 〇 u等人，1 9 9 6，，，妒 球蛋白/ a-2-HS -醣蛋白為轉形生長因子—石第丨丨型 Ώ 擬物及細胞素拮抗劑，，，J. Biol. Chem· 271 (22 127 5 5- 1 27 6 1 )。大鼠磷酸胎球蛋白（磷酸化胎球 白）經發現能調節肝細胞HGF活性（〇hnishi等人，MM，" 磷酸化大鼠胎球蛋白在人肝細胞生長因子 養物中肝細胞生县夕旦，鄕，，r T D. 你卜對初級培 玍長之影響，Eur· J. Biochem 753-76 1 )。 ·⑷· 胎球蛋白，你i + 芙 作為牛胎兒血清之成份，經鑑定為基本培養 土 73如於例如’美國專利號4，7 5 7，0 0 5和 5, 143, 842 。麸而 * 认 ^ 形以表現胎球蛋白’Λ 明’即其發現宿主細胞之轉 蛋白質之有者表議之蛋白質產物允許想要 ^ 及轉形伟主細胞之商化轉移至無血清 1245048 五、發明說明（4) 或降低蛋白質 發明之簡要說 本發明涵蓋 可藉使用亦表 表現胎球蛋白 至無血清，或 胎球蛋白涵蓋 球蛋白之蛋白 大鼠，其相似 本發明涵蓋 效表現’包括 養物、黏附培 別地，本發明 適合用於本 細胞、HeLa細 細胞。本發明 表現胎球蛋白 或调適作如此 修飾以較正常 體之基因操作 發明之哺乳類 循本發明之教 之合適宿主細 現載體，或藉 之培養系統，允許蛋白質之大量生產。 以下之基礎發現，即想要蛋白質 現胎球蛋白之哺乳類宿主細 > : 轉形宿主細胞因此適合調適 低蛋白貝之大I培養蛋白質生產。 人 a-2-HS-醣蛋白τι ^ 質相合物及所有哺乳類胎 貝相田物，包括但不限於牛、 物及衍生物。 "豬、馬及 想要蛋白質在所有哺乳類 但不限於大量、盔^、主 i J口養糸統之有 養物、發酵培養物：少=f、懸浮培 係關於低蛋白質或無血i:;;:表現。特 = 主細胞包括，但不限於⑽ 之哺乳類宿主細胞可為 -,員 ，及經選定作如此表現更：J通常 表現者。如此預存在胎 二現， ;產者表現更高量…蛋：表 或以/或多個合適之表現載體轉带内九源基因 ΐ主:田胞可為通常不表現胎球蛋V:,。及本仿 V ’經轉形以表現胎球蛋白。表現：依 =轉；可藉含外源胎球蛋白基因：合ΐί 调適相主細胞以表現内源胎球蛋白基因= 1245048
五、發明說明（7) 現基=之表現轉體轉形 主nm體實施例為由本發明之方法製備之宿 白質之哺’本發明涵蓋在細胞培養物中表現想要蛋 類胎球蛋白ϊ:主：胞’其中該宿主細胞以含可表現哺乳 規莫m &基因之表現載體，及含編碼想要蛋白質之可本 的ί在ί胞2:養表現載體轉形。亦由本發明所預期及涵蓋' 复中兮广士 。養物中表現想要蛋白質之哺乳類宿主細胞， 想要Ϊ:質1田=含可表現哺乳類胎球蛋白基®，及編碼 貝之可表現基因之表現載體轉形。 備，^明，方法亦涵蓋自細胞培養物中想要蛋白質之製 矣相二1該細胞培養物之細胞以含可表現胎球蛋白基因之 ^ 、體轉形，及其中該等細胞亦表現想要之蛋白質。如 t τ ΐ ί涵蓋自宿主細胞中想要蛋白質之製備，其細胞經 ^ 5 、”二處理以增強胎球蛋白表現，及表現想要之蛋白 質。 以期幫助宿主細胞之有效轉形，預期本發明之方法包括 使用含編瑪可選定標記之基因之表現載體。 在特別之樣態中，本發明涵蓋上述之方法和宿主細胞， ”中5亥含胎球蛋白基因之表現載體為表現載體pSV-AHSG。 本發明之特別具體實施例為如上述之方法和宿主細胞，其 亥含編碼想要蛋白質之基因之表現載體為PCMGGF2，及 5亥想要蛋白質為人神經膠質生長因子2(GGF2)。 在特別具體實施例中，本發明涵蓋胎球蛋白調適之宿主 細胞CH0〜dHSGP及其子代或衍生物。，
O:\59\59437.PTD 第10頁 1245048 五、發明說明（8) 因此，在特別樣態中，本發明特定地涵蓋表現載體 pSV-AHSG，及表現載體pCMGGF2之核酸序列。 圖之簡要說明 本發明之具體實施例和構體可參閱以下圖而更瞭解，其 中： 圖1為說明人α-2-HS-醣蛋白（表現SEQ ID N0:5，編碼 人胎球蛋白相似物蛋白質SE Q I D NO : 6 )之表現載體， pSV-AHSG之圖解。 圖2為說明改進GGF2表現載體pcmGGF2之圖解。 圖3為說明GGF2之有效無蛋白製備之圖表，使用連績灌 注發酵槽及以載體PCMGGF2轉形之CH0宿主細胞。 圖4A顯示CMV啟動基因、5,-插入基因序列（MIS)及Hpal 選殖部位之線性圖。平行圖顯示在M丨S序列内丨7 7bp插入基 因之位置。 圖4B顯示MIS之核苷酸序列（SEQ ID N〇:n)。表示的是 自EBV衍生之核苷酸序列（方括弧）及其2個供體部位（左括 弧符號）和1個受體部位（右括弧符號）。2個 bp)經劃底線（細和粗）。 幻Uxn 發明之詳細說明 :發明涵蓋以下之未預期發現，即哺乳類宿主細胞可《 调=以有效蛋白質表現第！個想要之蛋白 1轉形以產生第Μ固蛋白質，其中該第】個蛋白質為“胞 -2:HS-聽蛋白’ J哺乳類胎球蛋白。本發明之方 …細胞係適合在標準小量培養系統中產生想要…
1245048 五、發明說明（9) 質，以及大量之生產系統，包紅7 . 枯但不限於發酵槽李鲚，中 空纖維培養系統、平底杯系統，n a 畔^糸、，无 甲 核酸操作、核酸PCR放大、夺懸斤培―糸統。 用灸白質之轉形細胞拎春物在 技藝中係已知的及可見於多種每3入 ^i 口香物在 只驗室手冊或教科書，通常 見Samb rook等人，1989分子選緒 打曰 ^ ^ ，第2版，冷泉港出版社；
Ausbel等人，1 9 92 ^^i^L實驗計割第2版， 約翰.懷尼氏；基因表現技術，酵素學方法_(編者大 衛.哥德等人，學=出版社，倫敦，1991);基因結構和表 里，第2版，J.D.雈金斯（康橋大學出版社，倫敦， 1991);Ρ_ϋ聲計劃：方法皇指引（因尼斯等人 1 990 ’學術出版社’聖地牙哥’加州）；動物纟^胞之培養 _」_.善礎,I遊手冊’第2版（R.I·夫里斯尼1987，里斯 (Liss)公司，紐約）；全__.子生物(第7卷)，基因轉移 與表現實驗計劃’（編者E· J·墨雷，1991，Humana出版 社，克里頓，紐澤西州）；拉姆謝，Μ ·，酵素人工選殖， 1994 ’Molec. Biotech· 1:181-201;及史密斯等人1990 。 大人工染色體之放大Proc. NaH· Acad. Sci，美國 87:8242-8246 。 ~ 本發明及其許多樣態可藉以下實施例之說明更瞭解。 實施例1 :胎球蛋白表現和宿主細胞 使.用適合哺乳類細胞轉移感染之表現載體，編碼SEQ ID NO : 5之人胎球蛋白基因相似物之核酸序列經操作地插入及 元整之載體轉形入CH0宿主細胞。本發明胎球蛋白表現載
1245048 五、發明說明（10) ' 〜 體之實例為pSV-AHSG(圖1 )。合適之起始表現載體為—種 應適合接受想要胎球蛋白基因之插入者，使其操作地連% 士 至合適啟動基因/促進基因系統。AHSG由逆轉錄酶中介之" PCR(RT-PCR)技術選殖，使用人肝mRNA(克隆德 " (C lone tech，巴羅阿爾托，加州）。PCR引子之序列為 1) 5’-CCT CCA ACC ACC TGC ACG CC(SEQ ID 抑.7)及 2) 5’-GTG GCT ATG TTT TCT GTG CC(SEQ ID N〇|8)。 以期允許穩定轉形之有效選定和維持，較佳之合適李玉 載體可含1或多個可選定標記基因，例如抗生素抗口性基'現 因’或者為在與合適缺乏之宿主細胞配對時之必要代謝 白質。在本發明預期之具體實施例中，合適之表現載體可 含編碼任何合適哺乳類胎球蛋白之核酸，例如牛胎球蛋 白、a胎球蛋白、豬胎球蛋白、馬胎球蛋白或大鼠胎球蛋 白。編碼哺乳類胎球蛋白基因之核酸序列在技藝中係已知 的及可獲自基因庫（GenBank)資料庫，包括人（# 3 63 1 7 )、 大鼠BSP(#89 822 )、大鼠PP63 (# 924 82 )、大鼠胎球蛋白 (#9430 1 )、牛胎球蛋白（# 1 0 1 38 6 )、羊胎球蛋白（#1〇4788 ) 和豬胎球蛋白（# 1 0 8394 )。較佳之胎球蛋白美因為人 (#363 1 7 )(SEQ ID N0:3)及牛胎球蛋白（#1〇1;86)(seq id NO : 1)，其類似物及相似物，例如SEQ ID N〇 : 5之核酸序 列。 合適之哺乳類彳s主細胞然後以胎球蛋白表現載體轉形， 及選定穩定之轉移感染。在較佳之具體實施例中，起始宿 主細胞為CH0細胞，及在轉移感染後具表現型（dnfrV α
1245048 五、發明說明（13) CH0(dhf r / a 2HSGP)細胞中使用改進之載體完成。高生產 細胞之選擇在不同濃度之Τ胺喋呤中完成。無蛋白質之選 殖體由逐漸使細胞斷掉血清蛋白質而衍生。此些選殖體之 比生產力在2 0-3 0微微克/細胞/天之範圍。無蛋白質條件 可定義為在培養基中無實質之全部人和動物血清和血漿衍 生蛋白質，其中該等蛋白質可以微量存在，但仍補充以人 胰島素。較佳地，補充之胰島素為重組之人胰島素。 實施例3 : GGF 2表現載體之構築 為有效轉錄，EBV BMLF-1插入序列（MIS，5’ -插入序列； 5’-IS)經立即插入GGF2 CDNA之上游，及啟動基因之下 游。生成載體如PSM 97之特定方法及實施例係述於美國專 利號XXXXXXXX，（最近允許之申請案號08/807, 415，1997 年2月2 8日申請，其中當專利號已知時，其將取代申請數 據）。 MIS序列由聚合酶鏈反應（pcR)放大自EB病毒（EBV)密碼 稱為BMLF1生成。此MIS序列涵蓋EB病毒自84, 1 0 5至84, 2 62 之DNA序列，包括自B95-8 EBV自84，122至84,2 27之插入 序列（Farirel 1，病毒腫瘤學之進展，8卷，編者G.
Klein，拉文（Raven)出版社，紐約，1989;基因庫取存# X00784)。 2 個PCR 引子1)5’ -GGATCGATAACTAGCAGCATTTTCCT-3,（SEQ ID NO:9)及5’-GGGTTAACTTCCAGAATGTGGCTCT-3，（SEQ ID NO·· 10)在5’ 和 3’ 端上分別為ClaI (ATCGAT)和HpaI (GTTAAC)延長限制酵素部位，以放大及其後之引導選殖
第16頁 1245048 五、發明說明（14) Μ I S斷片。當然，其他合適之限制部位可予指定。 使用作為起始構體，表現載體PC IS-F8，在啟動基因下 游及DNA編碼因子VI I I上游具穩定化序列（名為C IS) (EP 0260148，1987年9月17日公佈，以提及之方式併入）、以 Hpal和Clal消化之上述PCR MIS斷片經插入pCIS-F8之 Clal/Hpal部位（在除去因子VIII基因序列後）。生成含mIS 之質體名為PSM 95。此M IS序列（5，-IS)不同於原始EBV序 列’在於具7 1 bp序列之未預期重複段，其含供體部位。 此新穎MIS序列（5’ - IS，229 bp)具2個供體部位及1個受體 部位（見圖4 )。 插入序列C I S自p SM9 5由Sa c I I / C 1 a I消化除去。剩下之主 鏈由克林洛（K1 enow)切成鈍端及再連結。此生成之質體 pSM 97由CMV啟動基因/促進基因（(^“/“、“^、選殖之 獨特Hpal部位、聚A^L息及在含0]：丨和&111口]：基因之質體主鏈 上之SV 40早期啟動基因-dhfr組成。質體pCGIG — HBS5(美 國專利號5, 5 3 0, 1 0 9 )以EcoRI消化釋出重組之人GGF2 、 cDNA，其在獨特Hpal部位上經鈍端連結至載體pSM97。生 成之構體稱為pCMGGF2(圖2)。 實施例4· GGF2細胞選殖體之衍生 轉移感染 CHO (dhfr-)和CHO (dhfr-/a2HSGP)細胞以質體⑽八轉移 感染’使用陽離子脂質D M R I E - C試劑（生命技術 #1 0459-0 1 4)。6格盤之3重複格經用於轉移至CH〇 (dhfr) 或CHO (dhfr-/a2HSGP)之各質體Q簡言之’在6格盤之各
O:\59\59437.PTD 第17頁 1245048 五、發明說明（15) 格中，10微升DMRIEE-C試劑與2 —5微克pCMGGF2麗八在〇 5 宅升無血清D ME Μ - F 1 2培養基中混合。培養盤在室溫下培養 30分以允許脂質-DNA複合物之形成。自一個7_?5毫升燒瓶 之次匯流細胞以在PBS中稀釋之〇 · 5毫升1Χ胰蛋白酶—edta (GibcoBRL #15400-054)胰蛋白酶處理，以5毫升生長培養 基中止，以PBS清洗1次，及再懸浮於無血清MEM_F12培養 基至107個細胞/毫升。然後在〇· 2毫升無血清培養基之 2X106個對數生長細胞經加入各格中，接著在37它下在⑶之 培養箱中培養培養盤4-5小時。在各格中，加入2毫升具5%
規格FBS之生長培養基。細胞在轉移感染48至72小時下由 ELISA分析短暫之表現。 藥物選定及基因放大 轉移感染後2至3天，自每個轉移感染3重複格之細胞經 騰蛋白酶處理’集中及以無血清培養基1次。活菌密度由 錐監排除法測定，然後播種於96格盤之5%透析FBS、5〇毫 莫耳濃度甲胺喋呤選擇培養基中。在ELISA篩選GGF2分泌 =體後’直接選定及放大步驟在增加濃度之甲胺喋呤（1〇〇 笔微莫耳濃度、2 0 〇毫微莫耳濃度、4 0 0毫微莫耳濃度、}
微莫耳濃度）中在4-6週時段下在每格具3毫升選擇培養基 之6格盤中進行。 限制稀釋選殖（LDC) 單細胞選殖體（SCC)由LDC在96格盤之每格20 0微升培養 ，下在含1 %透析FBS之無藥物選擇培養基中之一個細胞獲 得。培養物一週餵一次。2週後，培養盤在EUSA篩選前由
1245048 五、發明說明（16) 椎顯微鏡評定單細胞生長分數。 選擇轉移細胞系之同質蛋白質表現之其他合適方法及構 體經述於文獻中，及例如於美國專利號5, 612, 213。
GGF2 ELISA 在組織培養物上清液中偵測rhGGF2之三明治免疫分析法 經使用標準程序進行。（通常見Sambrook等人，1 98 9分子 遥^，第2版，冷泉港出版社；Ausubel等人，1 9 9 2分子生 進之簡要實驗tLll，第2版，約翰·懷尼氏；洛斯等人，
1 98 6臨床實驗宮免疫學手冊，第3版，美國微生物學會， 為合適之免疫分析法實驗計劃和方法。）在添加受質時’ 抗體抗原-過氧化酶共軛抗體複合物之量可由分光光度法 測定。樣品可對照吸光值對rhGGF2濃度之標準曲線比較。 實施例5. 無蛋白質之調適與細胞選殖體之評估
選定之GGF 2選殖體由步驟式2倍稀釋在振盪燒瓶中自 1%FBS斷絕。選殖體FI 0-B3，具比生產力20微微克/細胞/ 天之最高生產者，在1.5升發酵槽中使用基礎生產培養基 經無蛋白質調適。基礎無蛋白質生產培養基為強化之 DMEM-F 1 2培養基，補充以2毫莫耳濃度麩醯胺酸' 1 〇〇微莫 耳濃度CaC12、250微莫耳濃度與組胺酸、50微莫耳濃度 FeS04/EDTA、2克/升NaHC03、1 0微克/毫升重組之人胰島素 及 0.1% Pluronic F68(表 1)。培養基維持 7.0-7.3 之 pH 範 圍及28 0-3 0 0之滲壓力。
第19頁 1245048 五、發明說明（Π) 表1 GGF2表現載體之轉移感染效力 質體 轉移感染效力 在無蛋白質中之疋 PCDIG-HBS5 1+/1,344 格=0.07% 0.5-1.〇微微克人細逼7^ PCMGGF2 320+/1，776 格=18.00〇/〇 ¢.0-30.0微微克/細胞/天 實施例6 · G G F 2之生產 GGF2之連績無蛋白質生產方法由選殖體F10-B3細胞播牙重 於1 · 5升發酵槽，使用上述之基礎生產培養基發展。發酵 槽之細胞密度經維持在〜2X1 06個細胞/毫升及在〇· 5升/天 之速率下灌注。如示於圖3，細胞繼續產生高量之GGF2經 歷3 4天生產時段。高至2 4 0毫克/升/天之滴定量經見到。 此連續灌注方法可易於調適至裝有細胞滯留裝置如沈降器 之大發酵槽（2 0 0至5 0 0升）。例如，使用1 〇升發酵槽，> 4 〇 克G G F 2可在6 0天時段内製備，使用本發明之方法和構件。 在美國專利號5, 530，109中所述之先前技藝載體 pCDIG-HBS5具極低之轉移感染效力。由此載體生成之 CHO(GGF2)選殖體在無血清條件下不僅具低比生產力 (〇· 5-1· 0微微克/細胞/天），而且為不穩定的。驚人地， 本發明之改進質體PCMGGF2支持GGF2之穩定和高表現，及 在曱胺嗓呤選擇和放大下之有效選定和放大。具改進載體 之衍生選殖體在無蛋白質條件下展現穩定之GGF 2表現及高 比生產力（ 2 0 -3 0微微克/細胞/天）。 不同細胞系之生產力經進一步比較。以下之表2比較在 無血清條件下CH〇和CH〇_ α 2HSGp細胞表現GGF2之生產力。 驚人地，經調適供胎球蛋白表現之無血清選殖體之比生產
O:\59\59437.PTD 第20頁 1245048 五、發明說明（18) 力較正常CH0細胞增加更高2-8倍。 表2在CH0細胞中GGF2之增強製備-胎球蛋白之組成表現 細胞系 GGF2之比生產力(5個選殖之平均） CHO(pCDIG-HBS5) 0.5-1.0微微克/細胞/天 CHO(pCMGGF2) 5-6微微克/細胞/天 CHO-AHSG (pCMGGF2) 20-30微微克/細胞/天 藉全然描述之本發明一些具體實施例，熟諳此技藝者將 瞭解及能構築本發明之不同相當物，而不偏離本發明之精 神或範疇，依照以下之申請專利範圍。
O:\59\59437.PTD 第21頁 1245048 五、發明說明（19) 序列表 1in詹杉Y，. <110> 川萬邁： 鄭淑蘭 <12〇>蛋白質表現之方法及構件 <130> 98064 <140> <141> <160> 11 <170> Patentln Ver. 2.0
<210> 1 <211> 1459 <212> DNA <213> 牛 CDNA <220>
<221> CDS <222> (12)..(1091) <220> <221> <222> (6βΤ··(1088) <400> 1 gtgaagccac c atg aaa tcc ttc gtt ctg etc ttt tgc ctg get cag etc 50 Met Lys Ser Phe Val Leu Leu Phe Cys Leu Ala Gin Leu -15 -10 tgg ggc tgc cac teg ate ccg ett gac ccg gtt gca ggt tat aag gaa 98
Trp Gly Cys His Ser lie Pro Leu Asp Pro Val Ala Gly Tyr Lys Glu -5 -11 5 l〇 ccg gcc tgt gat gac cca gac aca gag caa gca gcc ttg get gee gtg 146
Pro Ala Cys Asp Asp Pro Asp Thr Glu Gin Ala Ala Leu Ala Ala Val 15 20 25 gac tac ate aac aag cac ett cct egg ggc tac aag cac acc ttg aac 194
Asp Tyr lie Asn Lys His Leu Pro Arg Gly Tyr Lys His Thr Leu Asn 30 35 40 cag att gac agt gtg aag gtg tgg ccg agg egg ccc aeg gga gag gtg 24 2
Gin lie Asp Ser Val Lys Val Trp Pro Arg Arg Pro Thr Gly Glu Val 45 50 55 tat gac att gaa ata gat acc ctg gaa acc acc tgc cac gta ctg gac 290
Tyr Asp lie Glu He Asp Thr Leu Glu Thr Thr Cys His Val Leu Asp 60 65 70 75 1245048 ——---五、發明說明（20) ccc acg ccc ctg gcg aac tgc age gtg agg cag cag aeg cag cac geg Pro Thr Pro Leu Ala Asn Cys Ser Val Arg Gin Gin Thr Gin His Ala 8〇 85 90 gtg gaa gga gac tgc gat ate cac gtg ctg aaa caa gat ggc cag ttt Val Glu Gly Asp Cys Asp He His Val Leu Lys Gin Asp Gly Gin Phe 95 100 l〇5 tee gtg ctg ttt aca aaa tgt gat tee agt cca gat tee gee gag gac Ser Val Leu Phe Thr Lys Cys Asp Ser Ser Pro Asp Ser Ala Glu Asp 110 115 120 gtg ege aag ttg tgc cca gac tgc ccc ctg ctg gcg cca etc aac gac Val Arg Lys Leu Cys Pro Asp Cys Pro Leu Leu Ala Pro Leu Asn Asp 125 130 135 age egg gtg gtg cac gca gtg gag gtc gcg ctg get acc ttc aat gee Ser Arg Val Val His Ala Val Glu Val Ala Leu Ala Thr Phe Asn Ala 140 145 150 155 gag age aac ggc tee tac tta cag ctg gtg gaa att tet egg get caa Glu Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Gin Leu Val Glu lie Ser Arg Ala Gin 160 165 170 ttt gtg cct ett cca gtt tet gtc tet gtg gag ttt gca gtg get get Phe Val Pro Leu Pro Val Ser Val Ser Val Glu Phe Ala Val Ala Ala 175 180 185 act gac tgt att get aaa gaa gtc gta gat cca acc aag tgc aac eta Thr Asp Cys lie Ala Lys Glu Val Val Asp Pro Thr Lys Cys Asn Leu 190 195 200 ctg gca gaa aag caa tat ggc ttc tgt aag ggg tea gtc att cag aaa Leu Ala Glu Lys Gin Tyr Gly Phe Cys Lys Gly Ser Val lie Gin Lys 205 210 215 get ett ggt ggg gag gac gtc aga gtg act tgc acg ttg ttc caa acg Ala Leu Gly Gly Glu Asp Val Arg Val Thr Cys Thr Leu Phe Gin Thr 220 225 230 235 cag cct gtg att ccg cag ccc cag ccc gac ggc gee gag get gag gee Gin Pro Val lie Pro Gin Pro Gin Pro Asp Gly Ala Glu Ala Glu Ala 240 245 250 cca age get gtg ccg gac gca get ggg cct acg cct tet gca get ggc Pro Ser Ala Val Pro Asp Ala Ala Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ala Gly 255 260 265 ccg ccc gtg gee tee gtg gtg gtg ggg cca age gtg gta gca gtt ccc Pro Pro Val Ala Ser Val Val Val Gly Pro Ser Val Val Ala Val Pro 270 275 280 338 386 434 482 530 578 626 674 722 770 818 866 914 第23頁 1245048 五、發明說明（21) ctg ccg ctg cac cga gca cac tac gac ttg cgc cac act ttc tcc ggg 962
Leu Pro Leu His Arg Ala His Tyr Asp Leu Arg His Thr Phe Ser Gly 285 290 295 gtg gcc tea gtg gag tea tcc teg gga gaa geg ttc cac gtg ggc aaa 1010
Val Ala Ser Val Glu Ser Ser Ser Gly Glu Ala Phe His Val Gly Lys 300 305 310 315 aca ccc ata gtg ggg cag cct age att cct gga ggt cca gtc cgc ett 1058
Thr Pro lie Val Gly Gin Pro Ser lie Pro Gly Gly Pro Val Arg Leu 320 325 330 tgc cca ggg aga ate aga tac ttc aag ate tag aagatggtcg gagatgagat 1111 Cys Pro Gly Arg lie Arg Tyr Phe Lys lie 335 340
ggtttggcac agagaataca gctatcattt tgtccaagtc atgggtatgg gtaggggctt 1171 tgtctgctct ggaagcaagt gctgcctatg gtetagatta atgtcaggtc ttgagtccca 1231 acttctcatc cttccaagga caggagcaga ggaggtgcta gtgatgtttg atggaacata 1291 aagtcagcag cttgattgtc atggctttga tgtaagccac caccactgtg ttctctacct 1351 tctcttgacc tcacaaaagt aattggaact gtgactttga aaggtgctct tgccaagttt 1411 atatetaett gtcattaaaa atgetetaat aaagaaggtt etaagetg 1459 <210> 2 <211> 359
<212> PRT
<213 > 牛 CDNA <400> 2
Met Lys Ser Phe Val Leu Leu Phe Cys Leu Ala Gin Leu Trp Gly Cys 1 5 10 15
His Ser lie Pro Leu Asp Pro Val Ala Gly Tyr Lys Glu Pro Ala Cys 20 25 30
Asp Asp Pro Asp Thr Glu Gin Ala Ala Leu Ala Ala Val Asp Tyr lie 35 40 45
Asn Lys His Leu Pro Arg Gly Tyr Lys His Thr Leu Asn Gin lie Asp 50 55 60
Ser Val Lys Val Trp Pro Arg Arg Pro Thr Gly Glu Val Tyr.Asp lie 65 70 75 80
Glu lie Asp Thr Leu Glu Thr Thr Cys His Val Leu Asp Pro Thr Pro 85 90 95 画_國 1245048 五、發明說明（22)
Leu Ala Asn Cys Ser Val Arg Gin Gin Thr Gin His Ala Val Glu Gly 100 105 110
Asp Cys Asp lie His Val Leu Lys Gin Asp Gly Gin Phe Ser Val Leu 115 120 125
Phe Thr Lys Cys Asp Ser Ser Pro Asp Ser Ala Glu Asp Val Arg Lys 130 135 140
Leu Cys Pro Asp Cys Pro Leu Leu Ala Pro Leu Asn Asp Ser Arg Val 145 150 155 160
Val His Ala Val Glu Val Ala Leu Ala Thr Phe Asn Ala Glu Ser Asn 165 170 175
Gly Ser Tyr Leu Gin Leu Val Glu lie Ser Arg Ala Gin Phe Val Pro 180 185 190
Leu Pro Val Ser Val Ser Val Glu Phe Ala Val Ala Ala Thr Asp Cys 195 200 205 工le Ala Lys Glu Val Val Asp Pro Thr Lys Cys Asn Leu Leu Ala Glu 210 215 220
Lys Gin Tyr Gly Phe Cys Lys Gly Ser Val lie Gin Lys Ala Leu Gly 225 230 235 240
Gly Glu Asp Val Arg Val Thr Cys Thr Leu Phe Gin Thr Gin Pro Val 245 250 255 lie Pro Gin Pro Gin Pro Asp Gly Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ser Ala 260 265 270
Val Pro Asp Ala Ala Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ala Gly Pro Pro Val 275 280 285
Ala Ser Val Val Val Gly Pro Ser Val Val Ala Val Pro Leu Pro Leu 290 295 300
His Arg Ala His Tyr Asp Leu Arg His Thr Phe Ser Gly Val Ala Ser 305 310 315 320
Val Glu Ser Ser Ser Gly Glu Ala Phe His Val Gly Lys Thr Pro lie 325 330 335
Val Gly Gin Pro Ser lie Pro Gly Gly Pro Val Arg Leu Cys Pro Gly 340 345 350
Arg lie Arg Tyr Phe Lys lie 355 ΙΙΗΗ 1245048 五、發明說明（23)
<210> 3 <211> 1538 <212> DNA <213> K <220>
<221> CDS <222> (49)..(1149) <400> 3 cctccaacca cctgcacgcc tgcctgccag ggcctctctg gggcagcc atg aag tcc 57
Met Lys Ser 1 etc gtc ctg etc ett tgt ett get cag etc tgg ggc tgc cac tea gee 105
Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gin Leu Trp Gly Cys His Ser Ala 5 10 15 cca cat ggc cca ggg ctg att tat aga caa ccg aac tgc gat gat cca 153
Pro His Gly Pro Gly Leu lie Tyr Arg Gin Pro Asn Cys Asp Asp Pro 20 25 30 35 gaa act gag gaa gca get ctg gtg get ata gac tac ate aat caa aac 201
Glu Thr Glu Glu Ala Ala Leu Val Ala lie Asp Tyr lie Asn Gin Asn 40 45 50 ett cct tgg gga tac aaa cac acc ttg aac cag att gat gaa gta aag 249
Leu Pro Trp Gly Tyr Lys His Thr Leu Asn Gin lie Asp Glu Val Lys 55 60 65 gtg tgg cct cag cag ccc tec gga gag ctg ttt gag att gaa ata gac 297
Val Trp Pro Gin Gin Pro Ser Gly Glu Leu Phe Glu lie Glu lie Asp 70 75 80 acc ctg gaa acc acc tgc cat gtg ctg gac ccc acc cct gtg gca aga 345
Thr Leu Glu Thr Thr Cys His Val Leu Asp Pro Thr Pro Val Ala Arg 85 90 95 tgc age gtg agg cag ctg aag gag cat get gtc gaa gga gac tgt gat 393
Cys Ser Val Arg Gin Leu Lys Glu His Ala Val Glu Gly Asp Cys Asp 100 105 110 115 ttc cag ctg ttg aaa eta gat ggc aag ttt tec gtg gta tac gca aaa 441
Phe Gin Leu Leu Lys Leu Asp Gly Lys Phe Ser Val Val Tyr Ala Lys 120 125 130 tgt gat tec agt cca gac tea gee gag gac gtg ege aag gtg tgc caa 489
Cys Asp Ser Ser Pro Asp Ser Ala Glu Asp Val Arg Lys Val Cys Gin 135 140 145
第26頁 1245048 丨五、發明說明（24)
I gac tgc ccc ctg ctg gcc ccg ctg aac gac acc agg gtg gtg cac gcc 537
Asp Cys Pro Leu Leu Ala Pro Leu Asn Asp Thr Arg Val Val His Ala 150 155 160 gcg aaa get gcc ctg gcc gcc ttc aac get cag aac aac ggc tee aat 585
Ala Lys Ala Ala Leu Ala Ala Phe Asn Ala Gin Asn Asn Gly Ser Asn 165 170 175 ttt cag ctg gag gaa att tee egg get cag ett gtg ccc etc cca cct 633
Phe Gin Leu Glu Glu lie Ser Arg Ala Gin Leu Val Pro Leu Pro Pro 180 185 190 195 tet acc tat gtg gag ttt aca gtg tet ggc act gac tgt gtt get aaa 681
Ser Thr Tyr Val Glu Phe Thr Val Ser Gly Thr Asp Cys Val Ala Lys 200 205 210 gag gcc aca gag gca gcc aag tgt aac ctg ctg gca gaa aag caa tat 729
Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Cys Asn Leu Leu Ala Glu Lys Gin Tyr
215 " 220 225 ggc ttt tgt aag gca aca etc agt gag aag ett ggt ggg gca gag gtt 777
Gly Phe Cys Lys Ala Thr Leu Ser Glu Lys Leu Gly Gly Ala Glu Val 230 235 240 gca gtg acc tgc aeg gtg ttc caa aca cag ccc gtg acc tea cag ccc 825
Ala Val Thr Cys Thr Val Phe Gin Thr Gin Pro Val Thr Ser Gin Pro 245 250 255 caa cca gaa ggt gcc aat gaa gca gtc ccc acc ccc gtg gtg gac cca 873
Gin Pro Glu Gly Ala Asn Glu Ala Val Pro Thr Pro Val Val Asp Pro 260 265 270 275 gat gca cct ccg tee cct cca ett ggc gca cct gga etc cct cca get 921
Asp Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Pro Ala 280 285 290 ggc tea ccc cca gac tee cat gtg tta ctg gca get cct cca gga cac 969
Gly Ser Pro Pro Asp Ser His Val Leu Leu Ala Ala Pro Pro Gly His 295 300 305
cag ttg cac egg gcg cac tac gac ctg ege cac acc ttc atg ggt gtg 1017
Gin Leu His Arg Ala His Tyr Asp Leu Arg His Thr Phe Met Gly Val 310 315 320 gtc tea ttg ggg tea ccc tea gga gaa gtg teg cac ccc egg aaa aca 1065
Val Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly Glu Val Ser His Pro Arg Lys Thr 325 330 335 ege aca gtg gtg cag cct agt gtt ggt get get get ggg cca gtg gtt 1113
Arg Thr Val Val Gin Pro Ser Val Gly Ala Ala Ala Gly Pro Val Val 340 345 350 355
第27頁 1245048 五、發明說明（25) cct cca tgt ccg ggg agg ate aga cac ttc aag gtc taggetagae 1159
Pro Pro Cys Pro Gly Arg lie Arg His Phe Lys Val 360 365 atggeagaga tgaggaggtt tggcacagaa aacatagcca ccattttgtc caagcctggg 1219 catgggtggg gggccttgtc tgctggccac gcaagtgtca catgcgatct acattaatat 1279 caagtcttga ctccctactt cccgtcattc ctcacaggac agaageagag tgggtggtgg 1339 ttatgtttga cagaaggcat taggttgaca acttgtcatg attttgacgg taagccacca 1399 tgattgtgtt ctctgcctct ggttgacctt acaaaaacca ttggaactgt gactttgaaa 1459 ggtgctcttg etaagettat atgtgcctgt taatgaaagt gcctgaaaga ccttccttaa 1519 taaagaaggt tetaagetg . 1538 <210> 4 <211> 367 <212> PRT <213> 人 <400> 4
Met Lys Ser Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gin Leu Trp Gly Cys 1 5 10 15
His Ser Ala Pro His Gly Pro Gly Leu lie Tyr Arg Gin Pro Asn Cys 20 25 30
Asp Asp Pro Glu Thr Glu Glu Ala Ala Leu Val Ala lie Asp Tyr lie 35 40 45
Asn Gin Asn Leu Pro Trp Gly Tyr Lys His Thr Leu Asn Gin lie Asp 50 55 60
Glu Val Lys Val Trp Pro Gin Gin Pro Ser Gly Glu Leu Phe Glu lie 65 7 0 75 80
Glu lie Asp Thr Leu Glu Thr Thr Cys His Val Leu Asp Pro Thr Pro 85 90 95
Val Ala Arg Cys Ser Val Arg Gin Leu Lys Glu His Ala Val Glu Gly 100 105 110
Asp Cys Asp Phe Gin Leu Leu Lys Leu Asp Gly Lys Phe Ser Val Val 115 120 125
Tyr Ala Lys Cys Asp Ser Ser Pro Asp Ser Ala Glu Asp Val Arg Lys 130 135 140 第28頁 1245048 五、發明說明（26)
Val Cys Gin Asp Cys Pro Leu Leu Ala Pro Leu Asn Asp Thr Arg Val 145 150 155 160
Val His Ala Ala Lys Ala Ala Leu Ala Ala Phe Asn Ala Gin Asn Asn 165 170 175
Gly Ser Asn Phe Gin Leu Glu Glu lie Ser Arg Ala Gin Leu Val Pro 180 185 ,190
Leu Pro Pro Ser Thr Tyr Val Glu Phe Thr Val Ser Gly Thr Asp Cys 195 200 205
Val Ala Lys Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Cys Asn Leu Leu Ala Glu 210 215 220
Lys Gin Ύγτ Gly Phe Cys Lys Ala Thr Leu Ser Glu Lys Leu Gly Gly 225 230 235 240
Ala Glu Val Ala Val Thr Cys Thr Val Phe Gin Thr Gin Pro Val Thr 245 250 255
Ser Gin Pro Gin Pro Glu Gly Ala Asn Glu Ala Val Pro Thr Pro Val 260 265 270
Val Asp Pro Asp Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu 275 280 285
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Pro Asp Ser His Val Leu Leu Ala Ala Pro 290 295 300
Pro Gly His Gin Leu His Arg Ala His Tyr Asp Leu Arg His Thr Phe 305 310 315 320
Met Gly Val Val Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly Glu Val Ser His Pro 325 330 335
Arg Lys Thr Arg Thr Val Val Gin Pro Ser Val Gly Ala Ala Ala Gly 340 345 350
Pro Val Val Pro Pro Cys Pro Gly Arg lie Arg His Phe Lys Val 355 360 365 第29頁 1245048 五、發明說明（27) <210> 5 <211> 1200 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>人工序列之描述··人相似物 <220>
<221> CDS <222> (49)..(1149) <400> 5 cctccaacca cctgcacgcc tgcctgccag ggcctctctg gggcagcc atg aag tcc 57
Met Lys Ser 1 etc gtc ctg etc ett tgt ett get cag etc tgg ggc tgc cac tea gee 105
Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gin Leu Trp Gly Cys His Ser Ala 5 10 15 cca cat ggc cca ggg ctg att tat aga caa ccg aac tgc gat gat cca 153
Pro His Gly Pro Gly Leu lie Tyr Arg Gin Pro Asn Cys Asp Asp Pro 20 25 30 35 gaa act gag gaa gca get ctg gtg get ata gac tac ate aat caa aac 201
Glu Thr Glu Glu Ala Ala Leu Val Ala lie Asp Tyr lie Asn Gin Asn 40 45 50 ett cct tgg gga tac aaa cac acc ttg aac cag att gat gaa gta aag 249
Leu Pro Trp Gly Tyr Lys His Thr Leu Asn Gin lie Asp Glu Val Lys 55 60 65 gtg tgg cct cag cag ccc tec gga gag ctg ttt gag att gaa ata gac 297
Val Trp Pro Gin Gin Pro Ser Gly Glu Leu Phe Glu He Glu He Asp 70 75 80 acc ctg gaa acc acc tgc cat gtg ctg gac ccc acc cct gtg gca aga 345
Thr Leu Glu Thr Thr Cys His Val Leu Asp Pro Thr Pro Val Ala Arg 85 90 95 tgc age gtg agg cag ctg aag gag cat get gtc gaa gga gac tgt gat
Cys Ser Val Arg Gin Leu Lys Glu His Ala Val Glu Gly Asp Cys Asp 100 105 HO 115 ttc cag ctg ttg aaa eta gat ggc aag ttt tec gtg gta tac gca aaa
Phe Gin Leu Leu Lys Leu Asp Gly Lys Phe Ser Val Val Tyr Ala Lys 120 125 130 tgt gat tec agt cca gac tea gee gag gac gtg ege aag gtg tgc caa
Cys Asp Ser Ser Pro Asp Ser Ala Glu Asp Val Arg Lys Val Cys Gin 135 140 145
第30頁 5371245048 I五、發明說明（28) gac tgc ccc ctg ctg gcc ccg ctg aac gac acc agg gtg gtg cac gcc Asp Cys Pro Leu Leu Ala Pro Leu Asn Asp Thr Arg Val Val His Ala 150 155 160 gcg aaa get gcc ctg gcc gcc ttc aac get cag aac aac ggc tee aat Ala Lys Ala Ala Leu Ala Ala Phe Asn Ala Gin Asn Asn Gly Ser Asn 165 170 175 ttt cag ctg gag gaa att tee egg get cag ett gtg ccc etc cca cct Phe Gin Leu Glu Glu lie Ser Arg Ala Gin Leu Val Pro Leu Pro Pro 180 185 190 1S5 tet acc tat gtg gag ttt aca gtg tet ggc act gac tgt gtt get aaa Ser Thr Tyr Val Glu Phe Thr Val Ser Gly Thr Asp Cys Val Ala Lys 200 205 210 gag gcc aca gag gca gcc aag tgt aac ctg ctg gca gaa aag caa tat Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Cys Asn Leu Leu Ala Glu Lys Gin Tyr 215 220 225 ggc ttt tgt aag gca aca etc agt gag aag ett ggt ggg gca gag gtt Gly Phe Cys Lys Ala Thr Leu Ser Glu Lys Leu Gly Gly Ala Glu Val 230 235 240 gca gtg acc tgc atg gtg ttc caa aca cag ccc gtg age tea cag ccc Ala Val Thr Cys Met Val Phe Gin Thr Gin Pro Val Ser Ser Gin Pro 245 250 255 caa cca gaa ggt gcc aat gaa gca gtc ccc acc ccc gtg gtg gac cca Gin Pro Glu Gly Ala Asn Glu Ala Val Pro Thr Pro Val Val Asp Pro 260 265 270 275 gat gca cct ccg tee cct cca ett ggc gca cct gga etc cct cca get Asp Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Pro Ala 280 285 290 ggc tea ccc cca gac tee cat gtg tta ctg gca get cct cca gga cac Gly Ser Pro Pro Asp Ser His Val Leu Leu Ala Ala Pro Pro Gly His 295 300 305 cag ttg cac egg gcg cac tac gac ctg ege cac acc ttc atg ggt gtg Gin Leu His Arg Ala His Tyr Asp Leu Arg His Thr Phe Met Gly Val 310 315 320 gtc tea ttg ggg tea ccc tea gga gaa gtg teg cac ccc egg aaa aca Val Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly Glu Val Ser His Pro Arg Lys Thr 325 330 335 ege aca gtg gtg cag cct agt gtt ggt get get get ggg cca gtg gtt Arg Thr Val Val Gin Pro Ser Val Gly Ala Ala Ala Gly Pro Val Val 585 633 681 729 777 825 873 921 969 1017 1065 1113
_B1I 第31頁 1245048
五、發明說明（29) 340 345 350 355 cct cca tgt ccg ggg agg ate aga cac ttc aag gtc taggetagae Pro Pro Cys Pro Gly Arg lie Arg His Phe Lys Val 360 365 atggeagaga tgaggaggtt tggcacagaa aacatagcca c <210> 6 <211> 367 <212> PRT <213>人工序列 <400> 6
Met Lys Ser Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gin Leu Trp Gly Cys 15 10 15
His Ser Ala Pro His Gly Pro Gly Leu lie iyr Arg Gin Pro Asn Cys 20 25 30
Asp Asp Pro Glu Thr Glu Glu Ala Ala Leu Val Ala lie Asp Tyr lie 35 40 45
Asn Gin Asn Leu Pro Trp Gly Tyr Lys His Thr Leu Asn Gin lie Asp 50 55 60
Glu Val Lys Val Trp Pro Gin Gin Pro Ser Gly Glu Leu Phe Glu lie 65 70 75 80
Glu lie Asp Thr Leu Glu Thr Thr Cys His Val Leu Asp Pro Thr Pro 85 90 95
Val Ala Arg Cys Ser Val Arg Gin Leu Lys Glu His Ala Val Glu Gly 100 105 110
Asp Cys Asp Phe Gin Leu Leu Lys Leu Asp Gly Lys Phe Ser Val Val 115 120 125
Tyr Ala Lys Cys Asp Ser Ser Pro Asp Ser Ala Glu Asp Val Arg Lys 130 135 140
Val Cys Gin Asp Cys Pro Leu Leu Ala Pro Leu Asn Asp Thr Arg Val 145 150 155 160
Val His Ala Ala Lys Ala Ala Leu Ala Ala Phe Asn Ala Gin Asn Asn 165 170 175
Gly Ser Asn Phe Gin Leu Glu Glu lie Ser Arg Ala Gin Leu Val Pro 180 185 190
Leu Pro Pro Ser Thr Tyr Val Glu Phe Thr Val Ser Gly Thr Asp Cys 195 200 205 1·· 第32頁 1159 1200
1245048 五、發明說明（30)
Val Ala Lys Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Cys Asn Leu Leu Ala Glu 210 215 220
Lys Gin Tyr Gly Phe Cys Lys Ala Thr Leu Ser Glu Lys Leu Gly Gly 225 230 235 240
Ala Glu Val Ala Val Thr Cys Met Val Phe Gin Thr Gin Pro Val Ser 245 250 255
Ser Gin Pro Gin Pro Glu Gly Ala Asn Glu Ala Val Pro Thr Pro Val 260 265 270
Val Asp Pro Asp Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu 275 280 285
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Pro Asp Ser His Val Leu Leu Ala Ala Pro 290 295 300
Pro Gly His Gin Leu His Arg Ala His Tyr Asp Leu Arg His Thr Phe 305 310 315 320
Met Gly Val Val Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly Glu Val Ser His Pro 325 330 335
Arg Lys Thr Arg Thr Val Val Gin Pro Ser Val Gly Ala Ala Ala Gly 340 345 350
Pro Val Val Pro Pro Cys Pro Gly Arg He Arg His Phe Lys Val 355 360 365 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>人工序列之描述:胎球蛋白PCR引子 <400> 7 cctccaacca cctgcacgcc
<210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 Sequence <220> <223>人工序列之描述：胎球蛋白PCR引子 第33頁 1245048 五、發明說明（31) <400> 8 ggcacagaaia acatagccac <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述:mispcr引子 <400> 9 ggatcgataa ctagcagcat ttcct
<2ΐ〇> ίο <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 ：· <220> <223>人工序列之描述：mispcr引子 <400> 10 gggttaactt ccagaatgtg gctct
<210> ll <211> 236 <212> DNA <213> 人工序列.al Sequence <220>
<223>人工序列之描述:EBV衍生之MIS <400> 11 cgataactag cagcatttcc tccaacgagg atcccgcagg taagaagcta caccggccag 60 tggccggggc ccgataacta gcagcatttc ctccaacgag gatcccgcag gtaagaagct 120 acaccggcca gtggccgggg ccgtggagcc gggggcatcc ggtgcctgag acagaggtgc 180 tcaaggcagt ctccaccttt tgtctcccct ctgcagagag ccacattctg gaagtt 236 lillli 第34頁
Claims (1)
- 体 94. B. Iu , / 年月⑸正本 j號89101507 今斗年6月 曰 修 1下—” ------ 六、申請專利範圍 1 . 方法 哺乳 表現 等轉 質。2. 類胎 基因 3. 類胎 基因 4. 類胎 5. 胞先6. 胞先 7. 宿主 現所 因之 質之8. 一種自 包括以 類宿主 載體轉 形之宿 如申請 球蛋白 之表現 如申請 球蛋白 〇 如申請 球蛋白 如申請 以含可 如申請 以含編 一種製 細胞在 欲蛋白 表現載 可表現 如申請 哺乳類宿 含可表現 細胞，以 形同一之 主細胞， 專利範圍 基因之載 載體，亦 專利範圍 基因之表 主細胞中分離所欲蛋白質之方法，該 哺乳類胎球蛋白基因之表現載體轉形 含編碼該所欲蛋白質之可表現基因之 哺乳類宿主細胞，在培養物中擴張該 及自該培養物中分離該所欲之蛋白 第1項之方法，其中該含可表現哺乳 體，或該含編碼所欲蛋白質之可表現 含編碼可選定標記之基因。 第1項之方法，其中該含可表現哺乳 現載體亦含編碼所欲蛋白質之可表現 專利 基因 專利 表現 專利 碼所 備轉 該哺 質， 體轉 基因 專利 範圍 之表 範圍 哺乳 範圍 欲蛋 形哺 乳類 該方 形鳴 之表 範圍 第3項之方法 現載體含編碼 第1項之方法 類胎球蛋白基 第1項之方法 白質之可表現 乳類宿主細胞 宿主細胞中自 法包括以含可 乳類宿主細胞 現載體轉形同 第7項之方法 ，其中該含可表現哺乳 可選定標記之基因。 ，其中該哺乳類宿主細 因之表現載體轉形。 ，其中該哺乳類宿主細 基因之表現載體轉形。 之方法，該轉形哺乳類 重組之DNA表現載體表 表現哺乳類胎球蛋白基 ,及以含編碼所欲蛋白 一之哺乳類宿主細胞。 ，其中該含可表現哺乳O:\59\59437-940610.ptc 第36頁 1245048 Ω ( _案號89101507 Η斗年fc月 曰 修正_ 六、申請專利範圍 類胎球蛋白基因之表現載體，或該含編碼所欲蛋白質之可 表現基因之表現載體，亦含編碼可選定標記之基因。 9 .如申請專利範圍第7項之方法，其中該含可表現哺乳 類胎球蛋白基因之表現載體亦含編碼所欲蛋白質之可表現 基因。 1 0 .如申請專利範圍第9項之方法，其中該含可表現哺乳 類胎球蛋白基因之表現載體含編碼可選定標記之基因。 1 1 .如申請專利範圍第7項之方法，其中該哺乳類宿主細 胞先以含可表現哺乳類胎球蛋白基因之表現載體轉形。 1 2 .如申請專利範圍第7項之方法，其中該哺乳類宿主細 胞先以含編碼所欲蛋白質之可表現基因之表現載體轉形。 1 3 . —種在細胞培養物中表現所欲蛋白質之哺乳類宿主 細胞，其中該宿主細胞含可表現哺乳類胎球蛋白基因之表 現載體，及編碼所欲蛋白質之可表現基因之第2個表現載 體。 1 4. 一種在細胞培養物中表現所欲蛋白質之哺乳類宿主 細胞，其中該宿主細胞含表現載體，其包含可表現哺乳類 胎球蛋白基因，及編碼該所欲蛋白質之可表現基因。 1 5 .如申請專利範圍第2項之方法，其中該含可表現哺乳 類胎球蛋白基因之表現載體為表現載體pSV-AHSG。 1 6 .如申請專利範圍第2項之方法，其中該含編碼所欲蛋 白質的可表現基因之表現載體為PCMGGF2。 1 7.如申請專利範圍第1 3項之哺乳類宿主細胞，其中該 含可表現哺乳類胎球蛋白基因之表現載體為表現載體O:\59\59437-940610.ptc 第37頁 1245048 案號89101507 年b月 曰 修正 六、申請專利範圍 pSV-AHSG 。 1 8.如申請專利範圍第1 3項之哺乳類宿主細胞，其中該 含編碼所欲蛋白質的可表現基因之表現載體為pCMGGF 2。 19. 一種表現載體，包括： a)啟動基因 b )編碼胎球蛋白之編碼序列，該編碼序列操作地連結至 啟動基因， c )插入序列，插入序列在啟動基因下游及胎球蛋白編碼 序列上游，插入序列包括2個相同之供體部位及1個受體部 位，及 ， d )編碼所欲蛋白質之編碼序列^該編碼序列操作地連結 至啟動基因。 2 〇 ,如申請專利範圍第1 9項之表現載體，其中該編碼胎 球蛋白之第1編碼序列為人、牛或其同質物或相似物。 21. —種表現裁體，其鑑定為pSV-AHSG，其係寄存於食 品工業發展研究所，編號為CCRC 9 40 2 7 9。 2 2 · —種鑑定為pCMGGF2之表現載體。 2 3 . —種宿主細胞，其係經申請專利範圍第2 1項之表現 載體轉形。 2 4. —種宿主細胞，其係經申請專利範圍第2 2項之表現 載體轉形。 2 5 .如申請專利範圍第2 3項之宿主細胞，進一步由表現 載體PCMGGF2轉形。O:\59\59437-940610.ptc 第38頁
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