JP2002524033A - タンパク質発現法およびタンパク質発現用コンストラクト - Google Patents
タンパク質発現法およびタンパク質発現用コンストラクトInfo
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Abstract
Description
ターを使ったタンパク質の製造に関する。
、それを達成するための方法、コンストラクトおよび宿主細胞の領域に関する。
クローン化した遺伝子の同定と特徴づけ、構造機能解析用のタンパク質の大量調
製、および医薬品に使用するためのタンパク質の製造には不可欠な道具である。
on Technology)」Methods in Enzymology
,第185巻(David Goeddelら編,Academic Pres
s社,ロンドン,1991)や、Gene Structure and Ex
pression,第二版,J.D.Hawkins(ケンブリッジ大学出版局
,ロンドン,1991)などの参考書、およびそれらに引用されている文献にみ
られるように、文献に記載されている。単純なタンパク質の発現は適当な大腸菌
発現系を使って型通りに行うことができるが、これらの系は複雑な哺乳類タンパ
ク質の発現には通例、不適切である。タンパク質発現系に使用するための哺乳類
発現系が開発されているが、これらの系は複雑な培養培地要求性を持ち、これら
を大量長期培養系として維持することは極めて難しく、また多大な費用を要する
。
は、例えば米国特許第4,757,005号(その全文を本明細書に援用する)
に記載があるように、目的とするタンパク質産物の最終精製を簡略化する一方法
である。米国特許第5,143,842号、第4,560,655号、第5,0
24,947号、第4,533,637号、第4,767,704号、第4,8
16,401号、第5,631,159号、第5,135,866号(これらの
特許と以下に挙げる特許はすべてその全文を本明細書に援用する)と、例えばH
edlundおよびMiller「4種類の樹立ヒト前立腺癌細胞系の成長を維
持できる無血清合成培地(A Serum−Free Defined Med
ium Capable of supporting growth of
four established human prostatic car
cinoma cell lines)」The Prostate 24:2
21−228(1994)をはじめとする文献には、数多くの改良された栄養培
地および無血清培地が記載されている。哺乳類細胞の培養法も、例えば米国特許
第5,122,469号や文献に記載されている。また、大量培養および大量タ
ンパク質生産の技術と装置も、例えば米国特許第5,081,035号、同第5
,153,131号および文献に記載されている。
ていること、特に大量タンパク質生産に適した無タンパク質哺乳類タンパク質生
産系が必要とされていることは、当技術分野では十分に認識されている。このこ
とは、哺乳類タンパク質栄養剤(特にヒツジおよびウシタンパク質製品)の使用
によるプリオン伝染とその関連疾患が最近になって発見され、それらが懸念され
ていることを考えると、特にそうであると言える。
HS糖タンパク質または哺乳類フェチュインタンパク質を発現するように宿主細
胞を形質転換または同時形質転換することによって、目的のタンパク質の効率の
よいタンパク質発現が起こるように哺乳類宿主細胞を適応させることができると
いう、予想外の発見を記載するものである。
」とは、ヒトアルファ−2−HS糖タンパク質(AHSG)と、ウシ、マウス、
ブタ、ウマおよびラットタンパク質を含む(ただしこれらに限らない)全ての哺
乳類フェチュインタンパク質均等物およびそれらのオルソログならびに誘導体を
意味するものとする。
、ヒトアルファ−2−HS糖タンパク質と相同であることが見出されている(D
ziegielewskaら「アルファ−2−HS糖タンパク質はヒト胎児血漿
および脳脊髄液中に高濃度に発現される(alpha−2−HS−glycop
rotein is expressed at high concentr
ation in human fetal plasma and cere
brospinal fluid)」Fetal Diagn.Ther.8:
22−27,1993)。アルファ−2−HS糖タンパク質は主として肝実質細
胞によって産生され、翻訳後修飾を受けると考えられている(Jahnen−D
echentら「ヒトアルファ−2−HS糖タンパク質(ヒトフェチュイン)の
翻訳後プロセシング(Posttranslational processi
ng of human alpha−2−HS−glycoprotein
(human fetuin))」 Eur.J.Biochem.226:5
9−69,1994)。マウスカウンタートリプシンのシスタチン様ドメインは
トリプシンを阻害することが見出されている(Yoshidaら「哺乳類フェチ
ュインファミリーの一員、マウスカウンタートリプシンのシスタチン様ドメイン
は、トリプシン阻害の原因になっている(Cystatin−like dom
ain of mouse countertrypsin,a member
of mammalian fetuin family,is respo
nsible for the inhibition of trypsin
)」Biochemistry and Molecular Biology
International 39(5):1023−1028,1996)
。フェチュイン/アルファ−2−HS糖タンパク質は胚形成中に発現することが
見出されており、また、骨リモデリングを促進し、細胞増殖を刺激することと、
トランスフォーミング成長因子ベータ1(TGF−β1)の抗増殖性作用に対し
てアンタゴニストとして作用することが見出されている(Demetriouら
「フェチュイン/アルファ−2−HS糖タンパク質はトランスフォーミング成長
因子βのII型レセプター模倣体でありサイトカインアンタゴニストである(F
etuin/alpha−2−HS−glycoprotein is a t
ransforming growth factor−β Type II
receptor mimic and cytokine antagoni
st)」J.Bio.Chem.271(22):12755−12761,1
996)。ラットのホスホフェチュイン(リン酸化フェチュイン)は肝細胞HG
F活性を調節することが見出された(Ohnishiら「ヒト肝細胞成長因子の
存在下における初代培養での肝細胞の成長に対するリン酸化ラットフェチュイン
の効果(Effect of phosphorylated rat fet
uin on the growth of hepatocytes in
primary culture in the presence of h
uman hepatocyte−growth factor)」Eur.J
.Biochem.243:753−761,1997)。
,005号や同第5,143,842号に見られるように、基本的培養培地の一
成分として挙げられてきた。しかし、目的のタンパク質産物を発現すると共にフ
ェチュインを発現するように宿主細胞を形質転換することにより、前記目的のタ
ンパク質を効率よく発現させることができ、形質転換された宿主細胞の無血清ま
たは低タンパク質培養系への移行が簡単になり、タンパク質の大量生産が可能に
なることが、本発明によって発見された。
することにより、目的とするタンパク質の効率のよい発現を達成できるという基
礎的発見を包含する。例えば、フェチュインと目的のタンパク質を発現させるそ
のような形質転換宿主細胞は、無血清または低タンパク質大量培養タンパク質生
産への適応に適している。本発明のフェチュインは、ヒトアルファ−2−HS糖
タンパク質(AHSG)と、ウシ、マウス、ブタ、ウマおよびラットタンパク質
を含む(ただしこれらに限らない)全ての哺乳類フェチュインタンパク質均等物
およびそれらのオルソログならびに誘導体を包含する。本発明の好ましい一態様
では、そのフェチュインがヒトまたはウシのフェチュイン、それらのオルソログ
ならびに誘導体である。
タンパク質発現などを含む(ただしこれらに限らない)あらゆる哺乳類細胞培養
系での目的のタンパク質の効率のよい発現を包含する。特に本発明は低タンパク
質または無血清発現系に向けられる。
、および組換えタンパク質の発現に適した他の哺乳類細胞が挙げられるが、これ
らに限るわけではない。本発明の哺乳類宿主細胞は、常態でフェチュインを発現
していて、そのような発現に関して選択された細胞、またはより高い発現に関し
て選択された細胞、またはそのような発現に適応させた細胞であってよい。その
ような既存のフェチュイン発現細胞は、内在するゲノムの遺伝子操作によって、
もしくは1つまたは複数の適当な発現ベクターをトランスフェクトすることによ
って、常態での産生量よりも高レベルのフェチュインを発現させるように改変す
ることができる。本発明の哺乳類宿主細胞は常態ではフェチュインを発現しない
細胞であって、本発明の教示に従ってフェチュインを発現するように形質転換さ
れたものであってもよい。フェチュインを発現させるための適当な宿主細胞の形
質転換は、外因性フェチュイン遺伝子を含有する適当な発現ベクターによる形質
転換によって、あるいは内因性フェチュイン遺伝子を発現させるようにその宿主
細胞を適応させることによって達成できる。
パク質を組み込んで発現させるように宿主細胞ゲノムを操作することによって、
フェチュイン適応宿主細胞から発現させることができる。フェチュインと目的の
タンパク質の両方を発現させる発現ベクターを構築することもできる。そのよう
な場合は、フェチュイン遺伝子と目的タンパク質の遺伝子とを、同じまたは異な
るプロモータ/エンハンサー系の制御下に置くことができる。フェチュイン−目
的タンパク質融合産物を作って発現させることも、本発明の範囲を越えない行為
である。
F2)の改良された哺乳類発現ベクター、そのようなベクターで形質転換された
GGF2細胞系CHO(dhfr−/GGF2)、安定で増加したレベルのGG
F2を分泌することができるCHO(dhfr−/α2HSGP/GGF2)、
および発酵槽で本発明の細胞を連続的に灌流させることによるGGF2の無タン
パク質製造法を包含する。
ンパク質を生産する方法であって、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有
する発現ベクターで哺乳類宿主細胞を形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を目的の
タンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換
し、前記形質転換宿主細胞を培養増殖し、前記培養から前記目的のタンパク質を
単離することからなる方法を包含する。さらに本発明では、発現可能な哺乳類フ
ェチュイン遺伝子を含有する上記ベクターまたは目的のタンパク質をコード化す
る発現可能な遺伝子を含有する上記発現ベクターが選択可能マーカーをコード化
する遺伝子も含有する上記の方法が考えられる。また、発現可能な哺乳類フェチ
ュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが、目的のタンパク質をコード化する
発現可能な遺伝子をも含有する態様も考えられる。本発明は、プロモータ、前記
プロモータに機能可能な形で結合しているフェチュインのコード配列、前記プロ
モータの下流かつ前記フェチュインコード配列の上流にあって2つの同じ供与部
位と1つの受容部位とを含んでいるイントロン配列、およびプロモータに機能可
能な形で結合している異種タンパク質のコード配列を含んでなる発現ベクターを
包含する。
哺乳類宿主細胞が、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクタ
ーで最初に形質転換されるような順序であってもよいと考えられる。したがって
本発明では、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する発現
ベクターでまず標的宿主細胞を形質転換することが考えられる。
のタンパク質を生産するための形質転換哺乳類宿主細胞を作出する方法であって
、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで哺乳類宿主細
胞を形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を、目的のタンパク質をコード化する発現
可能な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換することからなる方法を包含す
る。また、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記ベクターまたは
目的タンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する上記発現ベクターが
、選択可能マーカーをコード化する遺伝子も含有する、上述のような方法も考え
られる。
伝子を含有する上記発現ベクターが、目的タンパク質をコード化する発現可能な
遺伝子をも含有し、該発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子を
含有する、本発明宿主細胞の作出方法が考えられる。本発明の形質転換宿主細胞
作出法では、該哺乳類宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有す
る発現ベクターでまず形質転換される方法、または該哺乳類宿主細胞が目的のタ
ンパク質をコード化する発現可能遺伝子を含有する発現ベクターでまず形質転換
される方法が考えられる。
細胞である。特に本発明は、細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるための
哺乳類宿主細胞であって、該宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を
含有する発現ベクターおよび目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子
を含有する第二の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする宿主細胞を包
含する。本発明では、細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるための哺乳類
宿主細胞であって、該宿主細胞が、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子と、目
的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子とを含有する発現ベクターで形
質転換されることを特徴とする宿主細胞も考えられ、そのような宿主細胞も本発
明に包含される。
養の細胞が発現可能なフェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換さ
れていて、該細胞が目的のタンパク質も発現させる生産も包含する。このような
方法は、フェチュイン発現量が増加するように選択または他の方法で操作されて
いて、目的のタンパク質を発現させている宿主細胞からの目的タンパク質の生産
も包含する。
カーをコード化する遺伝子をも含有する発現ベクターの使用を包含すると考えら
れる。
ターが発現ベクターpSV−AHSGである上述の方法および宿主細胞を包含す
る。本発明の特定の一実施態様は、目的のタンパク質をコード化する遺伝子を含
有する上記発現ベクターがpCMGGF2であり、該目的タンパク質がヒトグリ
ア成長因子2(GGF2)である、上述のような方法および宿主細胞である。
HSGPおよびその子孫または誘導体を包含する。
SGの核酸配列および発現ベクターpCMGGF2の核酸配列を包含する。
る第一のタンパク質を産生するように宿主細胞を形質転換することにより、哺乳
類宿主細胞を、第一の目的タンパク質の効率のよいタンパク質発現に適応させる
ことができるという予想外の発見を包含する。本発明の方法、コンストラクトお
よび宿主細胞は、発酵槽系、中空糸培養系、タンブラー系および懸濁培養系など
(ただしこれらに限らない)の大量生産系だけでなく、標準的な少量培養系での
目的のタンパク質の生産にも適している。
よび形質転換細胞の培養によるタンパク質の生産に関するプロトコルと方法は、
当技術分野では知られており、様々な実験マニュアルや教科書に見出すことがで
きる。一般に、Sambrookら,Molecular Cloning,第
二版,Cold Spring Harbor Press,1989、Aus
ubelら,Short Protocols in Molecular B
iology,第二版,John Wiley&Son社,1992、「遺伝子
発現技術(Gene Expression Technology)」Met
hods in Enzymology 第185巻(David Goedd
elら編,Academic Press社,ロンドン,1991)、Gene
Structure and Expression 第二版,J.D.Ha
wkins(ケンブリッジ大学出版局,ロンドン,1991)、PCR Pro
tocols:A Guide to Methods and Applic
ations(Innisら,1990,Academic Press社,カ
リフォルニア州サンディエゴ)、Culture of Animal Cel
ls:A Manual of Basic Technique 第二版(R
.I Freshney,1987,Liss社,ニューヨーク州ニューヨーク
)、Methods in Molecular Biology(第7巻)「
遺伝子導入および遺伝子発現プロトコル(Gene Transfer and
Expression Protocols)」(E.J.Murray編,
1991,Humana Press社,ニュージャージー州クリフトン)、R
amsay,M.「酵母人工クローニング(Yeast Artificial
Cloning)」Molec.Biotech.1:181−201,19
94、およびSmithら「大きい人工染色体の増幅(Amplificati
on of large artificial chromosomes)」
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8242−8246,
1990を参照されたい。
ることができる。
5のヒトフェチュイン遺伝子オルソログをコード化する核酸配列を機能可能な形
で挿入し、完成したベクターをCHO宿主細胞中に形質転換した。本発明のフェ
チュイン発現ベクターの一例はpSV−AHSG(Fig.1)である。好適な
出発発現ベクターは、適当なプロモータ/エンハンサー系に機能可能な形で結合
されるように所望のフェチュイン遺伝子を挿入するのに適したものである。AH
SGは、ヒト肝臓mRNA(Clonetech社,カリフォルニア州パロアル
ト)を使用し、逆転写酵素によるPCR(RT−PCR)法によってクローン化
した。PCRプライマーの配列は1)5’−CCT CCA ACC ACC
TGC ACG CC(配列番号7)および2)5’−GTG GCT ATG
TTT TCT GTG CC(配列番号8)とした。
ベクターは、例えば抗生物質耐性遺伝子や、適当な欠損宿主細胞と組み合わせた
ときに要求される代謝タンパク質などの、1つまたは複数の選択可能マーカー遺
伝子を含有することができる。考えられる本発明の実施態様として、好適な発現
ベクターは、任意の適当な哺乳類フェチュイン、例えばウシフェチュイン、マウ
スフェチュイン、ブタフェチュイン、ウマフェチュインまたはラットフェチュイ
ンなどをコード化する核酸を含有しうる。哺乳類フェチュイン遺伝子をコード化
する核酸配列は当技術分野では知られており、ヒト(#36317)、ラットB
SP(#89822)、ラットpp63(#92482)、ラットフェチュイン
(#94301)、ウシフェチュイン(#101386)、緬羊(Ovis a
ries)フェチュイン(#104788)およびイノシシ(S.scrofa
)フェチュイン(#108394)を含めて、GenBankデータバンクに見
出すことができる。好ましいフェチュイン遺伝子はヒトフェチュイン(#363
17)(配列番号3)およびウシフェチュイン(#101386)(配列番号1
)、それらのホモログならびにオルソログ、例えば配列番号5の核酸配列などで
ある。
なトランスフェクションのために選択する。好ましい一実施態様では、出発宿主
細胞がCHO細胞であって、トランスフェクション後に(dhfr−/α2HS
GP)という表現型を持つ。
らのタンパク質発現の増進が見込める。フェチュインの構成的発現は、フェチュ
イン遺伝子を含有する発現ベクターを宿主細胞に逐次トランスフェクトし、フェ
チュインタンパク質を発現する形質転換細胞をスクリーニングし選択した後、選
択したその細胞(またはその子孫)に、発現させようとする目的のタンパク質(
1つまたは複数)の遺伝子(1つまたは複数)を含有する発現ベクターをトラン
スフェクトすることによって樹立できる。
ベクター(1つまたは複数)が1つまたは複数の目的のタンパク質をコード化す
る個別の発現ベクターによる宿主細胞の同時トランスフェクションを行う。しか
し、1つまたは複数の目的タンパク質をコードしそれを発現させるベクターと同
じベクターからフェチュイン遺伝子を発現させる複合発現ベクターを構築する方
法は、当業者においては分かるだろう。本発明のさらにもう一つの変更態様では
、そのような複合フェチュイン/タンパク質発現ベクターを、1つまたは複数の
目的のタンパク質をコード化する1つまたは複数の追加の発現ベクターと同時ト
ランスフェクトする。
きることは、当業者には理解されるだろう。
ンパク質発現レベル、成長速度、ならびに温度、培地要求性および低タンパク質
培地または無血清培地での成長への適合性などといった培養条件に関して、それ
らの形質転換宿主細胞をさらに選別し、選択することができる。
CHO−α2HSGPと呼ばれるフェチュイン適応宿主細胞(CHO表現型dh
fr−/α2HSGP)を得ることができる。
戦略は、MS病巣の形成を伴う免疫学的事象の調節に基づいてきた(Wauba
nt EL,Oksenberg JRおよびGoodkin DE「多発性硬
化症病巣の病理生理学(Pathophysiology of multip
le sclerosis lesions)」Science&Medici
ne 4:32−41,1997)。ベータインターフェロンは再発型MSの治
療に使用されて成功を収めている免疫調節薬の一つである。乏突起膠細胞の分裂
促進性成長因子などの他の因子も、新たなMSの治療戦略の一つとして挙げられ
ている。これら神経栄養因子の治療能力によって再ミエリン化が促進されると推
測された。組換えヒトグリア成長因子(GGF2)はシュワン細胞と乏突起膠細
胞に対する刺激効果が報告されているそれら因子類の一つである(Mahant
happa NK,Anton ESおよびMatthew WD「可溶性ニュ
ーレグリン、グリア成長因子2は、シュワン細胞の運動性を直接増加させ、神経
突起の伸長を間接的に促進する(Glial growth factor 2
,a soluble neuregulin,directly incre
ases Schwann cell motility and indir
ectly promotes neurite outgrowth)」J.
Neuroscience 16:4673−4683,1996)。末梢神経
系または中枢神経系における神経変性障害および脱髄の治療用にGGF2を製造
する方法は米国特許第5,530,109号(その全文を本明細書に援用する)
に記載されている。
使用して、それらの生産性を評価した。意外なことに、これらの細胞系はかなり
低い比生産性(0.5〜1pg/細胞/日)を持ち、不安定である。次に、我々
はこのベクターを使って高産生細胞系を誘導しようと試みたが、成功しなかった
。トランスフェクション効率が低いので、メトトレキセートでの選択では140
0万細胞からたった一つの形質転換体が得られるに過ぎなかった。
クターを構築した。生産細胞系の誘導は、それらの改良型ベクターを用いて、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞、CHO(dhfr−)およびCHO(dhfr − /α2HSGP)細胞で行った。高産生細胞の選択は様々なメトトレキセート
濃度で行った。細胞を血清タンパク質から徐々に離脱させることによって、無タ
ンパク質クローンを誘導した。これらのクローンの比生産性は20〜30pg/
細胞/日の範囲にある。無タンパク質条件とは、実質的に全てのヒトおよび動物
の血清ならびに血漿由来のタンパク質が培養培地中に存在しない(それらタンパ
ク質は痕跡量では存在してもよい)が、ヒトインシュリンは補われていることと
定義することができる。補充されるインシュリンは組換えヒトインシュリンであ
ることが好ましい。
ントロン配列;5’−IS)をGGF2 cDNAのすぐ上流かつプロモータの
下流に挿入した。pSM97などのベクターの作成に関する具体的な方法と実施
例は、米国特許第XXXXXXX号(1997年2月28日に出願された特許出
願第08/807,415号が最近特許付与されたもので、特許番号が分かり次
第、前記出願情報を特許番号に替える予定)に記載されている。
読み枠から、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって生成した。このMI
S配列は、B95−8EBVの84,122から84,227までのイントロン
配列を含むB95−8エプスタイン・バーウイルスの84,105から84,2
62までのDNA配列を包含する(Farrell,Advances in
Viral Oncology,第8巻,G.Klein編,Raven Pr
ess社,ニューヨーク,1989;GenBankアクセス番号X00784
)。
ATTTCCT−3’(配列番号9)および2)5’−GGGTTAACTTC
CAGAATGTGGCTCT−3’(配列番号10)は、MIS断片の増幅と
それに続く有方向クローニングのために、それぞれ5’および3’端に、伸長さ
れたClaI(ATCGAT)およびHpaI(GTTAAC)の制限酵素部位
を持つ。もちろん他の適当な制限部位をあてることもできる。
ード化するDNAの上流に持つ発現ベクターpCIS−F8(本明細書に援用す
るEP0260148(1987年9月17日公開))を出発コンストラクトと
して使用し、HpaIおよびClaIで消化した上述のPCR MIS断片を、
(第VIII因子遺伝子配列除去後の)pCIS−F8のClaI/HpaI部
位に挿入した。得られたMIS含有プラスミドをpSM95と名付けた。このM
IS配列(5’−IS)は、供与部位を含有する71bp配列が予想外に反復し
ている点で、元のEBV配列とは異なる。この新しいMIS配列(5’−IS、
229bp)は、2つの供与部位と1つの受容部位を持つ(Fig.4参照)。
去した。残った骨格をクレノウで平滑末端化し、再結合した。生成したそのプラ
スミドpSM97は、oriおよびampr遺伝子を含有するプラスミド骨格中
のCMVプロモータ/エンハンサー(CMVe/p)、MIS、クローニング用
のユニークなHpaI部位、ポリAシグナルおよびSV40初期プロモータdh
frからなる。プラスミドpCGIG−HBS5(米国特許第5,530,10
9号)をEcoRIで消化して組換えヒトGGF2 cDNAを遊離させ、それ
をベクターpSM97のユニークなHpaI部位に平滑末端結合させた。得られ
たコンストラクトをpCMGGF2と呼ぶ(Fig.2)。
イオン脂質DMRIE−C試薬(Life Technologies社#10
459−014)を使って、プラスミドDNAをトランスフェクトした。6ウェ
ルプレートのウェルを三つ一組にして、CHO(dhfr−)またはCHO(d
hfr−/α2HSGP)に移入する各プラスミドDNAに使用した。簡単に述
べると、6ウェルプレートの各ウェルで、10μlのDMRIE−C試薬を、無
血清DMEM−F12培地0.5ml中のpCMGGF2 DNA 2〜5μg
と混合した。そのプレートを室温で30分間インキュベートして脂質−DNA複
合体を形成させた。1つのT−75cm2フラスコから得られるサブコンフルエ
ント細胞を、PBSで希釈した1×トリプシン−EDTA(GibcoBRL#
15400−054)0.5mlを使ってトリプシン処理し、5mlの成長培地
で停止し、PBSで1回洗浄し、107細胞/mlになるように無血清DMEM
−F12培地に再懸濁した。次に、無血清培地0.2ml中の対数増殖期細胞2
×106個を各ウェルに加えた後、そのプレートをCO2培養器中、37℃で4
〜5時間インキュベートした。各ウェルに、5%合成FBSを含む2mlの成長
培地を加えた。トランスフェクションの48〜72時間後に一過性発現について
細胞をELISAによって測定した。
組のウェルから得られる細胞をトリプシン処理し、一つにまとめ、無血清培地で
1回洗浄した。生細胞密度をトリパンブルー排除法によって決定した後、96ウ
ェルプレートの5%透析FBS、50nMメトトレキセート選択培地に接種した
。GGF2分泌集団をELISAでスクリーニングした後、各ウェルに3mlの
選択培地を入れる6ウェルフォーマットで4〜6週間ごとにメトトレキセート濃
度を増しながら(100nM、200nM、400nM、1μM)直接選択増幅
段階を行った。
ウェルあたり200μlの培地に1細胞のLDCによって、単一細胞クローン(
SCC)を得た。その培養には1週間に一度、栄養補給した。2週間後に、EL
ISAスクリーニングに先立って、それらのプレートを位相差顕微鏡により単一
細胞成長について採点した。
ンストラクトは、文献と例えば米国特許第5,612,213号などに記載され
ている。
的方法を使って行った(好適な免疫測定のプロトコルおよび方法については、一
般に、Sambrookら,Molecular Cloning,第二版,C
old Spring Harbor Press,1989、Ausubel
ら,Short Protocols in Molecular Biolo
gy,第二版,John Wiley&Son社,1992、Roseら,Ma
nual of Clinical Laboratory Immunolo
gy,第三版,アメリカ微生物学会,1986を参照されたい)。基質を添加す
ると、抗体抗原−ペルオキシダーゼ結合抗体複合体の量を、分光測光法によって
測定することができる。試料は、吸光度対rhGGF2濃度の標準曲線と比較す
ることができる。
BSから離脱させた。20pg/細胞/日の比生産性を持つ最も生産性の高いク
ローンF10−B3を、基礎生産培地を使って、1.5リットル発酵槽で無タン
パク質適応させた。基礎無タンパク質生産培地は、2mMグルタミン、100μ
M CaCl2、250μM L−ヒスチジン、50μM FeSO4/EDT
A、2g/L NaHCO3、10μg/ml組換えヒトインシュリンおよび0
.1%プルロニックF68を補足した強化DMEM−F12培地である(表1)
。この培地は7.0〜7.3のpH範囲と、280〜300の浸透圧範囲を保つ
。
槽に接種することにより、GGF2の連続無タンパク質製造法を開発した。発酵
槽の細胞密度を約2×106細胞/mlに保ち、0.5リットル/日の速度で灌
流した。Fig.3に示すように、細胞は、34日間の生産期間の全体にわたっ
て高レベルのGGF2を産生し続けた。240mg/リットル/日もの力価が観
察された。この連続灌流法は、沈降機などの細胞保持装置を装着した大きい発酵
槽(200〜500リットル)に容易に適応させることができる。例えば10L
の発酵槽を使用すれば、本発明の方法とコンストラクトにより、40gを超える
GGF2を60日間にわたって生産することができる。
S5は極めて低いトランスフェクション効率を持つ。このベクターによって生成
するCHO(GGF2)クローンは、無血清条件下で低い比生産性(0.5〜1
.0pg/細胞/日)を持つばかりでなく、不安定でもある。驚くべきことに、
本発明の改良型プラスミドpCMGGF2は、GGF2の安定な高発現と、メト
トレキセート選択増幅下でのdhfr遺伝子の効率のよい選択および増幅とを支
持する。この改良型ベクターを使って誘導されたクローンは、無タンパク質条件
下で安定なGGF2発現と高い比生産性(20〜30pg/細胞/日)を示す。
F2を発現するCHO細胞とCHO−α2HSGP細胞の生産性を比較する。驚
くべきことに、フェチュイン発現に適応させた無血清クローンの比生産性は、通
常のCHO細胞より2〜8倍高く増加した。
囲に照らして、この開示の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の様々
な均等物を理解し、構築することができるだろう。
ができる。
ェチュインオルソログタンパク質をコード化する配列番号5を発現させる)pS
V−AHSGを表す図。
を用いた効率のよいGGF2の無タンパク質生産を示すグラフ。
ング部位の直線地図を表す。平行に置かれた地図はMIS配列内の177bpイ
ントロンの位置を示している。
ド配列(角括弧内)と、その2つの供与部位(左括弧)および1つの供与部位(
右括弧)が示されている。2つの反復配列(2×71bp)には下線(細い線と
太い線)を引いてある。
Claims (28)
- 【請求項1】 哺乳類宿主細胞から目的のタンパク質を単離する方法であっ
て、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで哺乳類宿主
細胞を形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を、前記目的のタンパク質をコード化す
る発現可能な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換し、前記形質転換宿主細
胞を培養増殖し、前記培養から前記目的のタンパク質を単離することからなる方
法。 - 【請求項2】 発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記ベクタ
ーまたは目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する上記発現
ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子も含有する請求項1に記載の
方法。 - 【請求項3】 発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベ
クターが、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子も含有する請求項
1に記載の方法。 - 【請求項4】 上記発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝子
を含有する請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 上記哺乳類宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子
を含有する発現ベクターでまず形質転換される請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 上記哺乳類宿主細胞が目的のタンパク質をコード化する発現
可能な遺伝子を含有する発現ベクターでまず形質転換される請求項1に記載の方
法。 - 【請求項7】 哺乳類宿主細胞中で組換えDNA発現ベクターから目的のタ
ンパク質を生産するための形質転換哺乳類宿主細胞を作出する方法であって、発
現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する発現ベクターで哺乳類宿主細胞を
形質転換し、同じ哺乳類宿主細胞を、目的のタンパク質をコード化する発現可能
な遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換することからなる方法。 - 【請求項8】 発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記ベクタ
ーまたは目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有する上記発現
ベクターが、選択可能マーカーをコード化する遺伝子も含有する請求項7に記載
の方法。 - 【請求項9】 発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベ
クターが、目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子も含有する請求項
7に記載の方法。 - 【請求項10】 上記発現ベクターが選択可能マーカーをコード化する遺伝
子を含有する請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 上記哺乳類宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝
子を含有する発現ベクターでまず形質転換される請求項7に記載の方法。 - 【請求項12】 上記哺乳類宿主細胞が目的のタンパク質をコード化する発
現可能な遺伝子を含有する発現ベクターでまず形質転換される請求項7に記載の
方法。 - 【請求項13】 細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるための哺乳類
宿主細胞であって、該宿主細胞が発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子を含有す
る発現ベクターおよび目的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子を含有
する第二の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする宿主細胞。 - 【請求項14】 細胞培養中で目的のタンパク質を発現させるための哺乳類
宿主細胞であって、該宿主細胞が、発現可能な哺乳類フェチュイン遺伝子と、目
的のタンパク質をコード化する発現可能な遺伝子とを含有する発現ベクターで形
質転換されることを特徴とする宿主細胞。 - 【請求項15】 フェチュイン遺伝子を含む上記発現ベクターが発現ベクタ
ーpSV−AHSGである請求項2に記載の方法。 - 【請求項16】 目的のタンパク質をコード化する遺伝子を含有する上記発
現ベクターがpCMGGF2である請求項3に記載の方法。 - 【請求項17】 フェチュイン遺伝子を含有する上記発現ベクターが発現ベ
クターpSV−AHSGである請求項13の哺乳類宿主細胞。 - 【請求項18】 目的のタンパク質をコード化する遺伝子を含有する上記発
現ベクターがpCMGGF2である請求項13の哺乳類宿主細胞。 - 【請求項19】 a)プロモータ、 b)前記プロモータに機能可能な形で結合しているフェチュインのコード配列、
c)前記プロモータの下流かつ前記フェチュインコード配列の上流にあって2つ
の同じ供与部位と1つの受容部位とを含んでいるイントロン配列、および d)プロモータに機能可能な形で結合している異種タンパク質のコード配列 を含んでなる発現ベクター。 - 【請求項20】 上記フェチュインコード配列がヒト配列、ウシ配列または
それらのホモログもしくはオルソログである請求項19の発現ベクター。 - 【請求項21】 pSV−AHSGである請求項19の発現ベクター。
- 【請求項22】 pCMGGF2である請求項19の発現ベクター。
- 【請求項23】 請求項1に記載の方法によって製造される単離されたグリ
ア成長因子2タンパク質。 - 【請求項24】 請求項21の発現ベクターによって形質転換された宿主細
胞。 - 【請求項25】 請求項22の発現ベクターによって形質転換された宿主細
胞。 - 【請求項26】 さらに発現ベクターpCMGGF2によって形質転換され
た請求項24の宿主細胞。 - 【請求項27】 請求項25の宿主細胞によって産生される単離されたグリ
ア成長因子2タンパク質。 - 【請求項28】 請求項26の宿主細胞によって産生される単離されたグリ
ア成長因子2タンパク質。
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