JP4723185B2 - 組換えポリペプチドの生産方法 - Google Patents

Description

本発明はヒトエリスロポエチン等の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞の生産方法と、前記ポリペプチドの生産方法に関する。特に、本発明は多様な選択マーカーを含む２ベクター発現系と、前記系の使用方法に関する。

赤血球産生の調節は１９７７年に発見された糖蛋白ホルモンの１種であるエリスロポエチン（Ｅｐｏ）より主に行われる。当初、Ｅｐｏの単離精製は出発材料である再生不良性貧血患者の尿が比較的不足しているため、困難であった。マイクログラム以下の量の精製ホルモンしか試験に利用できなかった。

最初の精製アプローチは１９７０年代後期にアフィニティーカラムでアガロースに固定化したレクチンを使用して行われた。小麦胚芽及びフィトヘマグルチニンに結合したエリスロポエチンと粗尿調製物のＥｐｏを１００倍まで増加することが可能になった。

１９８０年代初期までにヒトエリスロポエチンのＤＮＡ配列はシーケンシングされ、クローニングされた。エリスロポエチンは分子量約３０〜３４ｋＤａの単鎖糖蛋白である。夫々Ｃｙｓ７及びＣｙｓ１６１間とＣｙｓ２９及びＣｙｓ３３間に２個の鎖内ジスルフィド結合を形成する４個のシステイニル残基を含む。Ｃｙｓ７及びＣｙｓ１６１間のジスルフィド 結合は生体活性に不可欠であることが示されている。エリスロポエチンは高度にグリコシル化されており、その分子量の約３５〜４０％は炭水化物から構成される。炭水化物の量は尿調製物間で変動し得るので、この不均一は腎臓による分泌直後の状態ではなく、尿から調製後のＥｐｏ分子を反映し、使用する製造方法の影響を受ける。エリスロポエチンの循環血漿形は単離されていないので、そのオリゴ糖構造はまだ決定されていない。エリスロポエチンはＮ−グリコシル化部位を提供する３個のアスパラギン（Ａｓｎ３８，Ａｓｎ２４及びＡｓｎ８３）と、Ｏ結合グリコシル化のための１個のセリン（Ｓｅｒ１２９）をもつ。

組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ）はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞及びＨｅＬａ細胞等の多数の哺乳動物系で発現されている。これらの種々の細胞型で発現されたｒｈＥｐｏのグリコシル化パターンは異なる（ＴａｋｅｕｃｈｉとＫｏｂａｔａ，１９９１，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １（４）：３３７−３４６）。ｒｈＥｐｏの商業的生産にはｉｎ ｖｉｖｏ活性をもつ蛋白質の高レベル発現が必要である。発現レベルを上げる技術の１例はヒトＥｐｏ遺伝子に加えてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含むベクターをｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞に導入する方法である（Ｌｅｅら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ６９：８５−９３）。メトトレキセート（ＭＴＸ）を培地に加えると、ｄｈｆｒ遺伝子が増幅し、連結したＥｐｏ遺伝子も増幅する。

本発明はヒトエリスロポエチン等の組換えポリペプチドを発現する宿主細胞株の改善生産方法をする。いずれも宿主細胞でｒｈＥｐｏ等の組換えポリペプチドの発現を誘導する発現カセットを含み、一方が選択物質（例えばｄｈｆｒ）に応答して増幅される遺伝子を含み、他方が選択マーカー（例えばネオマイシン耐性遺伝子）を含む以外は本質的に同一の２種のベクターを宿主細胞に導入すると、組換えポリペプチドの発現に関して望ましい特性をもつ宿主細胞を作製及び選択できることが判明した。

従って、第１の側面において本発明は目的組換えポリペプチドを発現する形質転換真核宿主細胞の生産方法を提供し、前記方法は、
（ａ）（ｉ）目的組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）選択マーカーをコードし、宿主細胞を選択物質と接触させると増幅される第２のヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドベクターと、
（ｂ）第２のヌクレオチド配列が別の選択マーカーをコードする第３のヌクレオチド配列で置換されている以外は第１のポリヌクレオチドベクターと本質的に同一のヌクレオチド配列をもつ第２のポリヌクレオチドベクターは真核宿主細胞に導入することを含み、第１のポリヌクレオチドベクターと第２のポリヌクレオチドベクターは宿主細胞のゲノムに組込まれている。

第１及び第２のポリヌクレオチドベクターを同時に宿主細胞に導入すると有利であり、好ましい。あるいは、第１及び第２のポリヌクレオチドベクターを宿主細胞に連続して導入する。

宿主細胞は哺乳動物細胞が好ましく、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞がより好ましい。

選択物質は宿主細胞をこのような選択物質と接触させると第２のヌクレオチド配列の増幅を誘導することが可能な任意化合物又は組成物とすることができる。第２のヌクレオチド配列はジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドをコードし、選択物質はメトトレキセートであることが好ましい。目的組換えポリペプチドはヒトエリスロポエチンが好ましい。

一般に，第３のヌクレオチド配列はＧ−４１８やネオマイシン等の抗生物質に対する耐性をコードする（即ち第３のヌクレオチド配列はネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする）。当業者に自明の通り、ネオマイシン群の各種抗生物質も使用できる。

１特定態様では、本発明はヒトエリスロポエチンを発現する形質転換真核宿主細胞の生産方法を提供し、前記方法は、
（ａ）（ｉ）ヒトエリスロポエチンをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする第２のヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドベクターと、
（ｂ）ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするヌクレオチド配列がＧ−４１８、ネオマイシン又はネオマイシン群の別の抗生物質に対する耐性を付与するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードする第３のヌクレオチド配列で置換されている以外は第１のポリヌクレオチドベクターと本質的に同一のヌクレオチド配列をもつ第２のポリヌクレオチドベクターをＣＨＯ宿主細胞に導入することを含み、第１のポリヌクレオチドベクターと第２のポリヌクレオチドベクターは宿主細胞のゲノムに組込まれている。

本明細書に開示する本発明の全方法に関して、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列及び第３のヌクレオチド配列は強力プロモーター、一般にはＳＶ４０初期プロモーター等のウイルスプロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。３種のヌクレオチド配列は各々独立してこのような強力プロモーター、好ましくはＳＶ４０初期プロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。しかし、夫々のポリシストロン発現単位を使用することも可能である。

同様に、本明細書に開示する本発明の全方法に関して、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列及び第３のヌクレオチド配列は転写終結制御配列等の他の制御因子に機能的に連結されていることも好ましい。その１好適態様では、前記制御因子はＳＶ４０ラージＴポリアデニル化シグナルをコードする配列である。前記ＳＶ４０ラージＴポリアデニル化シグナルは既知天然介在配列を含むことが好ましい。

本発明の第２の側面において、本発明は本発明の第１の側面の方法により生産された真核宿主細胞を提供する。宿主細胞により発現される目的組換えポリペプチドはエリスロポエチン、一般にｈＥｐｏが好ましい。宿主細胞は哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。

第３の側面において、本発明は、
（ａ）（ｉ）目的組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）選択マーカーをコードし、宿主細胞を選択物質と接触させると増幅される第２のヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドベクターと、
（ｂ）第２のヌクレオチド配列が別の選択マーカーをコードする第３のヌクレオチド配列で置換されている以外は第１のポリヌクレオチドベクターと本質的に同一のヌクレオチド配列をもつ第２のポリヌクレオチドベクターをその染色体の１個以上に組込んでなる形質転換真核宿主細胞を提供する。宿主細胞により発現される目的組換えポリペプチドはエリスロポエチン、一般にｈＥｐｏが好ましい。宿主細胞は哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。

１好適態様において、第２のヌクレオチド配列はジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドをコードする。目的組換えポリペプチドは、エリスロポエチンン、一般にｈＥｐｏが好ましい。

特定態様において、本発明は（ａ）ジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドとエリスロポエチンをコードするポリヌクレオチド配列と、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と異なり、エリスロポエチンと抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をその染色体の１個以上に組込み、特に安定的に組込んでなる哺乳動物宿主細胞を提供する。

宿主細胞はＣＨＯ細胞が好ましい。抗生物質はＧ−４１８、ネオマイシン又はネオマイシン群の別の（但し類似の）抗生物質が好ましい。

第４の側面において、本発明は目的組換えポリペプチドの生産方法として、第１のヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で本発明の第２又は第３の側面による宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一般に第１のヌクレオチド配列の増幅を誘導する選択物質の存在下に宿主細胞を培養する。第２のヌクレオチド配列はジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドをコードし、選択物質はメトトレキセートであることが好ましい。

１好適態様において、目的組換えポリペプチドはヒトＥｐｏである。

組換えポリペプチドは培地に分泌させることが好ましい。一般に、前記方法は発現された目的組換えポリペプチドを培地から回収することを更に含む。しかし、代法又は付加法として組換えポリペプチドを形質転換宿主細胞から回収することもできる。

更に、本明細書には本発明の第４の側面により生産されたグリコシル化組換えヒトエリスロポエチンを含む組成物も記載する。

第５の側面において、本発明は、
（ａ）（ｉ）目的組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）選択マーカーをコードし、ヌクレオチド配列の増幅を誘導することが可能な選択物質と宿主細胞を接触させると増幅される第２のヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドベクターと、
（ｂ）第２のヌクレオチド配列が別の選択マーカーをコードする第３のヌクレオチド配列で置換されている以外は第１のポリヌクレオチドベクターと本質的に同一のヌクレオチド配列をもつ第２のポリヌクレオチドベクターを含む組成物を提供する。目的組換えポリペプチドはヒトエリスロポエチンが好ましい。第２のヌクレオチド配列はジヒドロ葉酸レダクターゼをコードすることが好ましい。第３のヌクレオチド配列はネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードすることが好ましい。

本発明は更に目的組換えポリペプチドを発現する真核宿主細胞の生産方法における前記組成物の使用も提供する。

本発明に関して本明細書に記載する好適又は特定態様は相互に組合せて更に好適な態様とすることができる。

特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は（例えば細胞培養、分子ジェネティクス、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学分野における）当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。分子、遺伝子及び生化学的方法（一般に、参照により本明細書に組込むＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．並びに完全版Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ参照）と化学的方法には標準技術を使用する。

定義
本明細書で真核宿主細胞と言う場合には初代細胞であるか株化不死化細胞であるかを問わず真核起源の任意細胞とすることができ、異種ポリペプチドの発現に適応させたものでもよい。従って、この用語はその最も広い態様では初代培養細胞、臓器培養組織及び臓器、組織移植片、完全生物並びに樹立細胞株を含む。１好適態様では、この用語はＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ及びＨｅＬａ細胞等の樹立細胞株に由来する培養細胞を意味する。

本明細書で発現と言う場合には核酸をコードする配列からポリペプチド産生物が産生されることであり、一般に配列の転写／翻訳を介する。発現されたポリペプチドは宿主細胞から分泌させてもよいし、宿主細胞に蓄積してもよいが、本発明による発現は細胞からのポリペプチドの分泌を含むことが好ましい。発現レベルは変動し得るが、高レベルが有利であり、発現される目的ポリペプチドは細胞により産生される合計蛋白質の約１％、好ましくは１０％、２５％又は５０％あるいはそれ以上とすることができる。

「組換えポリペプチド」は組換え核酸技術により生産することが所望される任意ポリペプチドとすることができる。本明細書で使用する「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語はモノマーがアミノ酸であり、ペプチド結合又はジスルフィド結合により相互に結合しているポリマーを意味する。ポリペプチドは全長天然アミノ酸鎖又は目的ポリペプチドの選択領域等の「そのフラグメント」もしくは「ペプチド」を意味するか、あるいはアミノ酸ポリマー又は部分的もしくは完全に非天然のそのフラグメントもしくはペプチドを意味する。従って、「そのフラグメント」とは全長ポリペプチドの一部である約８及び約５００アミノ酸長、好ましくは約８〜約３００、より好ましくは約８〜約２００アミノ酸、更に好ましくは約１０〜約５０又は１００アミノ酸長のアミノ酸配列を意味する。ポリペプチドがＥｐｏである場合には、そのフラグメントは約８〜約１５０アミノ酸長が有利であり、約１５、２０又は３０〜約５０、１００又は１３０アミノ酸長が好ましい。「ペプチド」とは１０〜４０アミノ酸長、好ましくは１０〜３５アミノ酸の短いアミノ酸配列を意味する。更に例えばβ−アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニン等の非天然アミノ酸でもよい。遺伝子によりコードされない普通アミノ酸も本発明で使用することができる。本発明で使用する全アミノ酸はＤ又はＬ−光学異性体とすることができる。Ｌ−異性体が好ましい。更に、例えば本発明のポリペプチドのリンカー配列では他のペプチド模擬体も有用である（Ｓｐａｔｏｌａ，１９８３，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７参照）。

利用可能な組換えポリペプチドとしては医薬的に有用な蛋白質が挙げられ、例えばＥｐｏ、凝固因子（例えばＶＩＩＩ因子及びＩＸ因子）、凝固剤（例えばヒルジン）、ホルモン（例えばインスリン、ヒト及び動物成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン）、他の治療用蛋白質（例えば抗体及び他の免疫グロブリン、α−グロビン、β−グロビン、γ−グロビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、肥満細胞増殖因子、腫瘍サプレッサーｐ５３、網膜芽細胞腫、インターフェロン、メラノーマ関連抗原又はＢ７）及び特に大量の発現が所望される他の任意蛋白質が挙げられる。

「ポリヌクレオチドベクター」は核酸をコードする配列を細胞のゲノムに組込むように送達するために使用することができる核酸ベクターである。宿主細胞ゲノムへの組込みは（エピソームベクター維持に通常結び付けられる一過性形質転換とは対照的に）宿主細胞の安定的な形質転換をもたらすので、「安定的組込み」と言うことができる。ポリヌクレオチドベクターについては以下に詳述するが、プラスミド、感染物質（ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルス核酸）、コスミド、ファージミド、トランスポゾン、バッケージドＤＮＡ又は細胞送達に適した他の任意形態の核酸とすることができる。一般に、使用し易く、当分野でよく知られており、ウイルス等の感染物質に要求される法的規制がないことからプラスミドが使用される。「組込み」又は「安定的組込み」とはベクターの核酸配列の少なくとも一部を宿主細胞のゲノムに組込むか又は人工染色体に保持することを意味し、少なくとも第１及び第２／第３のヌクレオチド配列を宿主細胞ゲノムに組込むことが好ましい。ベクターの完全配列を宿主細胞ゲノムに組込むと有利である。

本明細書において「形質転換」とは遺伝子材料が細胞内で発現される（「形質転換」されると言う）ように遺伝子材料を細胞に導入することを言う。曖昧さを避けるために、「形質転換」は癌遺伝子又は発癌ウイルス等の不死化は意味しない。

「増幅」とは選択圧に応答してコーディング配列のコピー数が増加することを意味する。例えば、ＭＴＸを使用する選択に応答して異種ｄｈｆｒ遺伝子が増幅され、宿主細胞ゲノムに組込まれる遺伝子座のコピー数が増加することは知られている。ｄｈｆｒ遺伝子に連結した配列（即ちその物理的に近位の配列）もｄｈｆｒ遺伝子と共に増幅される。この結果、目的配列のコピー数が増加し、その配列によりコードされる遺伝子産物の発現が増加する。

「選択物質」は一般に、選択物質の効果を軽減する所定遺伝子産物が細胞に存在しない限り、細胞にストレス又は他の競合的不都合を与える物質である。例えば、メトトレキセートは細胞毒性であるが、ｄｈｆｒ遺伝子の遺伝子産物であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）により中和される。一般的な増幅可能系としてはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）−メトトレキセート（ＭＴＸ）、（ミコフェノール酸耐性を媒介する）細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素、及び正常機能遺伝子の存在下の増幅（例えばメチオニンスルホキシミン［ＭＳＸ］の存在下に増幅するグルタミンシンテターゼ）が挙げられる。このような系は核酸自体がコグネイト物質により加えられる選択圧に応答して増幅するという意味でそれ自体増幅可能である。

通常はそれ自体増幅可能であるとみなされない系としては例えばアンピシリン又はＧ−４１８／ネオマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする抗生物質耐性遺伝子か挙げられる。

本発明によるベクターは選択マーカー以外に相互に類似する複数の配列をもつ。第１の選択マーカーは増幅可能な遺伝子であり、第２の配列は増幅可能である必要はない。本明細書で使用する「本質的に同一」とは選択マーカー配列以外のベクターの配列が同一又はほぼ同一であることを意味する。実際に、２種のベクターは一般に同一出発ベクターに由来し、選択マーカー遺伝子を置換したものである。従って、残りの配列は自然変異を除いて同一である。夫々の制御領域を含むマーカー遺伝子以外の配列は一致度＞８５％が有利であり、９０％が有利であり、少なくとも９５％、９８％、９９％又は完全に一致していることが好ましい。

Ａ．ポリヌクレオチドベクター
本発明の宿主細胞生産方法は一方のベクターが宿主細胞染色体に組込まれている場合に選択に応答して増幅される遺伝子をコードする配列を含み、他方のベクターが別の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）をコードするヌクレオチド配列を含む点が本質的に相違する２種の実質的に同一のベクターを導入する。

第２の選択マーカーはそれ自体増幅可能でないことが好ましい。

ベクターは一般に環状プラスミドであるが、線状でもよく、一般にＤＮＡ分子である。ベクターは大腸菌等の細菌細胞で増殖できるように原核複製起点を含むと好都合である。

第１のベクターは本質的に真核宿主細胞、一般に哺乳動物細胞でＥｐｏ等の目的組換えポリペプチド（ＰＯＩ）の発現を誘導することが可能であるか／誘導する発現カセットである第１のヌクレオチド配列を含む。従って、この第１の発現カセットは宿主細胞によるコーディング配列の発現を提供することが可能な制御配列に機能的に連結されたＰＯＩの実際のコーディング配列を含む。「機能的に連結」なる用語は記載する成分がその所期様式で機能できるような関係にあることを意味する。コーディング配列に「機能的に連結」した調節配列はコーディング配列の発現が制御配列に適合可能な条件下で行われるようにライゲートされている。

ＰＯＩをコードする配列に機能的に連結した制御配列としてはプロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナル（例えば転写ターミネーター）が挙げられる。これらの制御配列は発現ベクターを使用しようとする宿主細胞と適合可能となるように選択することができる。「プロモーター」なる用語は当分野で周知であり、最小プロモーターから上流エレメントを含むプロモーターやエンハンサーに至るサイズと複雑さの異なる核酸領域を意味する。

プロモーターは一般に哺乳動物細胞で機能的なプロモーターから選択される。プロモーターは一般にウイルス又は真核遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えば、発現を生じさせようとする細胞のゲノムに由来するプロモーターとすることができる。ウイルスプロモーターは一般に高レベルの転写を誘導するので有利に使用できる。例としてはＳＶ４０初期プロモーターとその活性フラグメント、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター又はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターが挙げられる。

ベクターの複製は大腸菌で行うと簡便であるので、大腸菌遺伝子マーカーと大腸菌複製起点を加えると有利である。これらは大腸菌複製起点とアンピシリン等の抗生物質に対する耐性を付与する大腸菌遺伝子マーカーを含む大腸菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター又はｐＵＣプラスミド（例えばｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９）から入手することができる。

細胞の寿命中にＰＯＩの発現レベルを調節できるようにプロモーターが誘導性であると有利な場合もある。誘導性とはプロモーターを使用して得られる発現レベルを調節できることを意味する。

制御配列は制御配列により誘導される転写レベルの転写モジュレーター応答性を高めるように例えば付加的転写調節因子（例えばエンハンサー配列）の付加により修飾してもよい。２種以上の異なる上記プロモーターに由来する配列エレメントを含むキメラプロモーターを使用してもよい。

好適態様では、ＰＯＩはエリスロポエチン、特にヒトＥｐｏである。ヒトＥｐｏの配列はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ １１３１９．１に示されている。他方、米国特許第５，８５６，２９８号に記載されているように［Ａｓｎ６０］Ｅｐｏ、［Ａｓｎ１２５，Ｓｅｒ１２７］Ｅｐｏ、［Ｔｈｒ１２５］Ｅｐｏ及び［Ｐｒｏ１２４，Ｔｈｒ１２５］Ｅｐｏ等の１個以上の付加炭水化物結合部位を導入するようにヒトＥｐｏの配列を修飾すると望ましい場合もある。第１のベクターは本質的に宿主細胞ゲノムに組込まれている場合にヌクレオチド配列の増幅を誘導する選択物質と宿主細胞を接触させると増幅される発現カセットである第２のヌクレオチド配列も含む。真核細胞、特に、哺乳動物細胞は選択圧、一般に酵素阻害剤に応答して所定遺伝子を増幅することができ、その結果、前記遺伝子のコピー数が増し、ひいては遺伝子の発現レベルが上がる。付加遺伝子コピーは染色体内に維持することもできるし、微小染色体等の染色体外遺伝子材料の形態でもよい（詳細についてはＧｅｎｅｓ ＶＩ，Ｌｅｗｉｎ，１９９７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｋ．，ｐｐ９７５−９７８参照）。十分に特性決定されている１例はメトトレキセート（ＭＴＸ）に応答して増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子である。他の例としてはトランスカルバミラーゼ阻害剤に応答して増幅されるＣＡＤ遺伝子（ＵＭＰ合成の最初の３段階に関与する蛋白質をコードする）や、メチオニンスルホキシミンに応答して増幅されるグルタミンシンテターゼ（Ｗ０８７／０４４６２参照）が挙げられる。

この第２の発現カセットは第１の発現カセットの場合と同様に宿主細胞によるコーディング配列の発現を提供することが可能な制御配列に機能的に連結された増幅可能な遺伝子の実際のコーディング配列を含む。利用可能な制御配列は上記の通りである。第１及び第２のヌクレオチド配列の制御配列は同一でも異なっていてもよい。

第２のベクターは選択圧（例えばｄｈｆｒ）に応答して増幅される遺伝子をコードするコーディング配列が選択マーカー、一般に抗生物質耐性を提供するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列）で置換されている以外は第１のベクターと本質的に同一である。他の抗生物質耐性遺伝子としてはピューロマイシン又はハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子が挙げられる。

本発明の重要な特徴の１つは２種のベクターが本質的に第２又は第３のヌクレオチド配列をもつ点のみが異なることにある。理論に拘束する意図はないが、２種のベクター間の実質的一致により目的組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列の増幅が容易になると考えられる。選択マーカーをコードする第３のヌクレオチド配列は培養一次選択用マーカーとして機能し、選択圧に応答して増幅される第２のヌクレオチド配列は目的組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む組込み配列の増幅を生じる。

しかし、低度の差異は許容できるので、第２／第３のヌクレオチド配列の外側のベクター領域が１００％一致する必要はない。例えば、第２／第３のヌクレオチド配列以外の２種のベクターの配列は一般に少なくとも９５％、９８％又は９９％一致すべきである。

他方、実際には第１及び第２のベクターのクローニング基盤として同一ベクターを使用するので、第２／第３のヌクレオチド配列の外側が一致しているベクターを使用すると簡便である。例えば、第２及び第３のヌクレオチド配列を欠失するが、適当なクローニング部位を含むベクターを使用し、第２又は第３の選択ヌクレオチド配列を挿入できるクローニングベクターを作製することができる。

Ｂ．目的組換え蛋白質を発現する宿主細胞の生産
第１及び第２のポリヌクレオチドベクターは適当な任意技術を使用して適当な宿主細胞に導入することができる。例えば、数種の公知トランスフェクション技術（例えばエレクトロポレーション又はトランスフェクション剤の使用を含む技術）により哺乳動物細胞による核酸取込みを増加する。これらのトランスフェクション剤の例としてはカチオン物質（例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン）及びリポフェクタント（例えばｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ（登録商標）及びｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））が挙げられる。一般に、ベクターをトランスフェクション剤と混合して組成物とする。第１のベクターに対して過剰の第２のベクターを使用することが望ましい場合もある。例えば、第１及び第２のベクターを１：５〜１：１００（第１：第２）、より特定的には１：１０〜１：５０の比で混合することができる。

好適宿主細胞は齧歯類又はヒト細胞等の哺乳動物細胞であり、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ及びＨｅＬａ細胞が挙げられる。特に好ましい細胞はＣＨＯ細胞である。１好適態様では、宿主細胞は第２のヌクレオチド配列に存在する遺伝子（例えばｄｈｆｒ）を元々欠損する。ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞はＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ，１９８０，ＰＮＡＳ ７７：４２１６−４２２０に記載されており、ＡＴＣＣから寄託株ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６として入手することができる。前記細胞はブダペスト条約に従い、２００１年８月２９日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２，米国に寄託登録番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３６７２で寄託されている。ＤＮＡ構築物及び本発明の方法と併用可能な不死化ヒト細胞株の例としては限定されないが、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１）、ＨｅＬａ細胞及びＨｅＬａ細胞誘導体（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２，２．１及び２．２）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ ＢＴＨ ２２）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）、ＫＢ癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７）、２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋ，Ａ．Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４８：５９２７−５９３２（１９８８））、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＷｉＤｒ結腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１８）、ＳＷ６２０結腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２７）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４０）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）、ＲＰＭＩ ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）、ボーズメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９６０７）、ＷＩ−３８ＶＡ１３サブライン２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＬＬ ７５．１）及びＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８２）、並びにヒト細胞と別種の細胞の融合により生産されるヘテロハイブリドーマ細胞が挙げられる。ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）やＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）等の二次ヒト繊維芽細胞株を使用してもよい。

トランスフェクションはマイクロタイタープレートで実施すると簡便であるが、他の培養容器を使用してもよい。トランスフェクション後に細胞を一般に選択培地（即ち選択マーカーを発現する細胞を選択する培地）でコンフルエントまで培養した後に、第２のヌクレオチド配列の増幅を誘導する選択物質（例えばＭＴＸ）を含む増幅培地で培養する。一般に、ＭＴＸの場合には、選択物質濃度は約４８ｎＭ（４．８ｘ１０^−８Ｍ）とする。

次に、一般に同一又は類似濃度の選択物質中で増殖させたクローンを選択し、例えばＥＬＩＳＡ及び／又は免疫蛍光により組換え蛋白質の産生についてスクリーニングする。次に、スクリーニングの結果に基づいて最高産生クローンを選択する。

その後、選択したクローンを更に試験し、その増殖特性、染色体安定性、組換え蛋白質産生能及び組換え蛋白質活性を測定すると理想的である。

染色体安定性は例えば細胞形態を観察するか及び／又はコールターカウンター核ＤＮＡ分析等のＤＮＡ含量分析を実施することにより測定できる。一般に、大きい核をもつクローンのほうが二倍体染色体補体よりも大きい。これらのクローンは不安定な傾向があるので一般に廃棄する。好適クローンはトランスフェクション及び選択前の親宿主細胞と実質的に同一の核ＤＮＡ含量をもつものである。

組換え蛋白質産生能は細胞及び／又は（Ｅｐｏの場合のように）蛋白質が分泌される培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットにより試験することができる。試験は一連のＭＴＸ（又は他の適当な選択物質）で実施することができる。蛋白質量だけでなく（特にＥｐｏの場合のように差別的グリコシル化アイソフォーム等の多重アイソフォームが産生される場合には）蛋白質パターンも考慮することが望ましい場合もある。

本発明の方法は１以上のサブクローニング段階を更に含むことが好ましく、第２のヌクレオチド配列の増幅を誘導する選択物質の濃度を増加しながら選択したクローンと接触させる。ｄｈｆｒとＭＴＸの場合には、一般に初期クローニング段階で１０^−８Ｍ濃度のＭＴＸを使用し、１０^−６Ｍまで増加する。

例えば、付加サブクローニング段階では、細胞クローンを一定範囲の濃度の選択物質（例えばＭＴＸ）の存在下に試験培養し、組換え蛋白質力価を測定する。その場合、細胞クローンがそれ以下の濃度に比較して蛋白質産生の有意増加を示さない濃度以上の選択物質濃度でサブクローニングを行うことが好ましい。ＥｐｏとＣＨＯ細胞の場合、この濃度は約３８０ｎＭ（３．８ｘ１０^−７Ｍ）である。１好適態様では選択物質濃度を所望最高濃度まで漸増させながら細胞を培養する。

その後、サブクローンを更に試験し、上記のようなその性質を測定してもよい。場合により、一般に選択物質（例えばＭＴＸ）濃度を上げて付加サブクローニング段階を実施してもよい。実施例では、１．５４μＭ（１．５４ｘ１０^−６Ｍ）ＭＴＸの存在下にサブクローニング段階を実施する。場合により、ＭＴＸ濃度を１０μＭ（１ｘ１０^−５Ｍ）以上に増加してもよい。

Ｅｐｏを発現する本発明の選択宿主細胞は７．７ｘ１０^−７Ｍ又は１．５４ｘ１０^−６ＭのＭＴＸ濃度で１０μｇ／１０^６細胞／日を上回る率でＥｐｏを発現することが好ましく，＞２０、２５又は３０μｇ／１０^６細胞／日がより好ましい。本発明の宿主細胞はトランスフェクション前の親宿主細胞（例えばＣＨＯｄｈｆｒ⁻細胞）と実質的に同一の核ＤＮＡ含量をもつことも好ましい。

一般に最終サブクローニング段階後に本発明の宿主細胞を無血清媒体に適応させることも望ましい場合がある。これは播種した細胞をコンフルエントまで培養し、増殖培地を無血清培地に置換するか又は数回の継代で血清濃度をゼロまで漸減させることにより実施することができる。細胞を懸濁培養としての増殖に適応させることも好ましい。

選択した宿主細胞株は標準技術を使用して液体窒素で低温保存することができる。

Ｃ．蛋白質産生
本発明の宿主細胞はｒｈＥｐｏ等の目的組換え蛋白質を発現させるために使用することができる。トランスフェクトした宿主細胞を使用してポリペプチドを発現させる方法は当分野で公知である。培養条件は第１のヌクレオチド配列から目的ポリペプチドを発現できるように選択する。本発明によると、懸濁培養法又はローラーボトル培養法を使用することが好ましい。目的ポリペプチドを発現させる目的で宿主細胞を培養するには選択物質（即ちＭＴＸ又は適当な等価物）の存在下でも不在下でも実施できる。宿主細胞を無血清培地で培養することが好ましい。

組換え蛋白質は適宜培養上清又は培養細胞のペレットから（Ｅｐｏ発現の場合には培養上清から）回収することができる。次に、組換え蛋白質を一般にアフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィー等の１以上の精製段階にかける（例えばＢｒｏｕｄｙら，１９８８，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２６５：３２９−３３６；Ｇｈａｎｅｍら，１９９４，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４（２）：１２７−１４２参照）。

本発明の宿主細胞から発現精製された組換えポリペプチド、特にＥｐｏを含む組成物において、組換えポリペプチドは実質的に純粋であることが好ましく、例えば少なくとも純度９０％、９５％又は９９％である。

精製蛋白質の生体活性はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ測定することができる。適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験はＨａｍｍｅｒｉｎｇら，１９９６，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １４（１１）：１４５５−６９に記載されており、赤血球細胞株の増殖刺激を試験する。適当なｉｎ ｖｉｖｏ試験はＧｈａｎｅｍら，１９９４，前出に記載されており、多血症マウスの赤血球細胞への^５９Ｆｅの取込みを測定する。

１好適態様では、本発明は（ａ）目的組換えポリペプチドをコードし且つ宿主細胞で目的組換えポリペプチドの発現を誘導するヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供し、（ｂ）（ｉ）水、植物由来ペプトン、浸透圧調節剤、緩衝液、エネルギー源、アミノ酸、脂質源又は前駆体、鉄源、非鉄金属イオン並びに１種以上のビタミン及び補因子を含み、（ｉｉ）全長ポリペプチドを含まない無血清培地を提供し、（ｃ）目的組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下にて宿主細胞を培地で培養することにより培養された細胞を利用する。

目的組換えポリペプチドはヒトエリスロポエチンが好ましい。宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とすることができる。このような技術は本明細書の実施例の項に記載する。

エリスロポエチンは、（ａ）ディスクスタックセパレーターを使用する遠心後に深層濾過段階により細胞培地から宿主細胞、細胞成分及び破片を除去し、清澄化培地上清を得、（ｂ）上清の導電率を５ｍＳ／ｃｍ以下、ｐＨを約７．０〜８．０に調節し、（ｃ）アニオン交換クロマトグラフィー媒体を充填したカラムに段階（ｂ）からの上清をアプライし、カラムを洗浄し、カラムからｒｈＥｐｏを溶出させ、ｒｈＥｐｏを含むピークフラクションを集め、（ｄ）中圧（＜１０ｂａｒ）下に運転可能であり且つ高濃度ＮａＯＨに耐性の樹脂を使用して段階（ｃ）からのピークフラクション全体を逆相クロマトグラフィー段階にかけ、有機溶媒の直線勾配を使用してｒｈＥｐｏを溶出させ、（ｅ）アニオン交換クロマトグラフィー媒体を充填したカラムに段階（ｄ）で溶出したｈＥｐｏを含む１以上のフラクションをアプライし、カラムを洗浄し、直線塩勾配を使用してｒｈＥｐｏを溶出させ、（ｆ）段階（ｅ）で溶出したｒｈＥｐｏを含む１以上のフラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択し、（ｇ）段階（ｆ）で溶出したｒｈＥｐｏを含む１以上のフラクションを、ゲル濾過媒体を使用して１以上のサイズ排除クロマトグラフィー段階にかけ、潜在的ダイマー以上の凝集物を除去し、ｒｈＥｐｏを含む溶出液を採取することにより細胞培養から精製することができる。

段階（ｃ）で使用するアニオン交換媒体はＢｉｏＳｅｐｒａから入手可能なセラミックイオン交換媒体Ｑ−ＨｙｐｅｒＤＦ（登録商標）を使用すると有利である。段階（ｄ）で使用するポリスチレン樹脂はＳｏｕｒｃｅ３０ＲＰＣ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が有利であり、段階（ｅ）で使用するアニオン交換媒体はＰｈａｒｍａｃｉａ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（登録商標）が好ましい。段階（ｇ）で使用するゲル濾過媒体はＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（登録商標）が好ましい。

このような方法は本明細書の実施例に記載する。

以下、実施例により本発明を更に記載するが、以下の実施例は単に例証を目的とし、発明を限定するものではない。特に、実施例は本発明の好適態様に関する。

（実施例）
材料
宿主細胞株
ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）。前記細胞はブダペスト条約に従い、２００１年８月２９日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２，米国に寄託登録番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３６７２で寄託されている。

細胞培地
培養培地：ＤＭＥＭに４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、ＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン）を添加、１ｘ。
選択培地：ＤＭＥＭに４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％透析ＦＣＳ及び０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を添加。
増加培地：ＤＭＥＭに４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％透析ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８及び４．８ｘ１０^−８Ｍ〜１．５４ｘ１０^−６Ｍ ＭＴＸ（メトトレキセート）を添加。
凍結培地：ＤＭＥＭに４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを添加。
組換え細胞株用無血清適応培地：１：１ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２に６ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．２５％大豆ペプトン／ＵＦ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１ｘ）、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８、１．５４ｘ１０^−６Ｍ ＭＴＸを添加。
無血清産生培地：１：１ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２に０．２５％大豆ペプトン／ＵＦ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１ｘ）、０．１％Ｌｕｔｒｏｌ、１．５４ｘ１０^−６Ｍ ＭＴＸ、１ｇ／ｌグルコース、２．５ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ_３を添加。
組換え細胞株無血清凍結培地：ＰＢＳ、２０％ＰＶＰ−１０、５％ＤＭＳＯ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００ｘ）、２．５ｘ１０^−３Ｍエタノールアミン、２．５ｘ１０^−２Ｍクエン酸第二鉄、２．０ｘ１０^−３Ｍ Ｌ−アスコルビン酸、５．０ｘ１０^−６Ｍ亜セレン酸ナトリウム。

プラスミド構築物
ｐＥｐｏ／ｎｅｏ
このプラスミドは各々ＳＶ４０初期プロモーター／ターミネーター配列の制御下に２個の異なる発現カセットとしてＥｐｏのコーディング領域とネオマイシン耐性遺伝子をコードする。構築の詳細については実施例１に記載する。
ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ
このプラスミドは各々ＳＶ４０初期プロモーター／ターミネーター配列の制御下に２個の異なる発現カセットとしてＥｐｏのコーディング領域とｄｈｆｒをコードする。構築の詳細については実施例２に記載する。

細胞培養方法
ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻の増殖
ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，ＰＮＡＳ ７７（７）：４２１６−４２２０）（ＣＨＯｄｈｆｒ⁻と言う）をＤＭＥＭ培養培地にて週２回分割比１：１０で培養する。

ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
リポフェクチントランスフェクションを実施する前日に細胞１〜５ｘ１０^４個／ｃｍ^２を２５ｃｍ^２Ｔフラスコびん又は９６ウェルプレートに播種する。対応するプラスミドを適当な比で混合し、リポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を製造業者のプロトコール（０．５〜１μｌ／ｃｍ^２）に従って添加する。次に、無血清ＤＭＥＭ中で細胞にトランスフェクションカクテルを４時間〜１６時間重層させた後、ＤＮＡ含有培地を培養培地に置換する。血清含有培地で２４〜４８時間培養後に細胞を選択培地に交換する。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地でコンフルエントまで培養した後、増幅培地（４．８ｘ１０^−８Ｍ ＭＴＸ）で培養し、その後、細胞培養上清のＥｐｏ産生をＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。最高産生細胞を選択し、ＭＴＸ濃度を２倍にし、最良産生細胞を使用して更に培養する。

分析方法
種々のマトリックス中でＥｐｏを検出するＥＬＩＳＡ
抗体
ポリクローナル血清：ウサギ抗Ｅｐｏビオチン化（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔａｌｏｇ ＃；ＡＢ−２８６−ＮＡ）。
モノクローナル抗体：マウス抗Ｅｐｏ（Ｇｅｎｅｚｙｍｅ；Ｃａｔ．ｃｏｄｅ ＡＥ７Ａ５）。

ＥＬＩＳＡ緩衝液
コーティング用緩衝液：８．４ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ_３，４．２ｇ／ｌ Ｎａ_２ＣＯ_３，ｐＨ９．６−９．８。
洗浄用緩衝液：０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ，１．１５ｇ／ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｘ２Ｈ_２Ｏ，０．２ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４，８ｇ／ｌ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０。
希釈用緩衝液：洗浄用緩衝液中２％ ＰＶＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＶＰ−４０Ｔ）。
サンプル緩衝液：希釈用緩衝液中０．５％αモノチオグリセロール。
染色用緩衝液：７．３ｇ／ｌクエン酸ｘ２Ｈ_２Ｏ，１１．８６ｇ／ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｘ２Ｈ_２Ｏ，ｐＨ４．８−５．０。
染色用溶液：１００μｌＯＰＤ溶液／１０ｍｌ染色用緩衝液，５μｌＨ_２Ｏ_２／１０ｍｌ染色用緩衝液。
ＯＰＤストック溶液：ＰＰ：Ｌ００１７。

方法
使用するＥＬＩＳＡ法はＥｐｏをｎｇ／ｍｌ濃度範囲で検出し、特に５００ｎｇ／ｍｌから出発して２倍希釈を８回繰返して検出限界約１０ｎｇ／ｍｌとする。Ｅｐｏの最初から２６個のアミノ酸に対するモノクローナル抗体はＥｐｏに結合するコーティング層として機能する。次段階ではＥｐｏを捕獲抗体に特異的に結合させる。ビオチン化Ｅｐｏ認識ウサギ抗血清中で検出を行う。プレートにストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合後にＯＰＤ染色により可視化を行う。

免疫蛍光
６ウェルプレートのカバースリップにＥｐｏを発現するＣＨＯ細胞５ｘ１０^４個／２００μｌを接種し、２４〜７２時間インキュベートする。接着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、−２０℃メタノールで５分間固定した後、風乾し、その後、再びＰＢＳに浸漬する。ＰＢＳ中２０％ＦＣＳと共に１５分間インキュベートして非特異的蛋白質を飽和させた後に、抗Ｅｐｏを１時間インキュベートする。ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧで反応を可視化する。励起波長４８８ｎｍ及び発光波長＞５１５ｎｍで共焦点顕微鏡により蛍光を検出する。

核サイズ測定
材料
コールターカウンターＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ ＺＭ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）。
コールターチャネライザーＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ ２５６。
インキュベーション溶液：０．１Ｍクエン酸，２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００。
電解液Ｉｓｏｔｏｎ ＩＩ（Ｋａｔ−Ｎｏ．８４４ ８０１１；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｕｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ）。

コールターカウンターは導電性液体に懸濁した粒子のサイズと個数を定量する。 キャピラリーの両端に電極を付けて液体を減圧吸引する。抵抗が変化すると電圧パルスが誘導され、コールターチャネライザーによりディジタル化することができる。核サイズは細胞のＤＮＡ含量に相関するので、染色体の２倍体と倍数体を区別することができる。

方法
ＣＨＯ細胞約１Ｘ１０^６個をＰＢＳで１回洗浄し、インキュベーション溶液２ｍｌに再懸濁し、４〜５時間放置する。その後の段階はコールターカウンターについて記載した通りである。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッティング
材料
ＳＤＳゲル：Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ４−２０％。
サンプル緩衝液：Ｔｒｉｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ ２ｘ（Ｎｏｖｅｘ ＬＣ ２６７６）。
泳動用緩衝液：Ｔｒｉｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ（Ｎｏｖｅｘ ＬＣ ２６７５）。
ブロッティング緩衝液：５０ｍＭ Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７Ｘ１０Ｈ_２Ｏ，０．１％ＳＤＳ，２０％メタノール。
ブロッティングマトリックス：ＰＶＤＦイモビロンＰ ０．４５μＭ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｋ８ＪＭ８２３８Ｈ。
洗浄用緩衝液：ＥＬＩＳＡ洗浄用緩衝液参照。
希釈用緩衝液：洗浄用緩衝液中１％粉乳。
検出用緩衝液：０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５。

方法
Ｅｐｏ含有サンプルを１％α−ＭＴＧで１ｘサンプル緩衝液中３０ｎｇ／２０μｌに調整し、ＳＤＳゲルにアプライする。泳動後に蛋白質をＰＶＤＦイモビロン膜に２時間ブロットした後、Ｅｐｏの最初から２６個のアミノ酸を検出するモノクローナル抗体でＥｐｏを特異的に染色する。アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧとＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色で可視化を行う。

等電点電気泳動
材料
システム：Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ。
ＩＰＧゲル：ｐＨ２．５−７。
再膨潤用緩衝液：尿素９ｇ，ＣＨＡＰＳ０．５ｇ，ＤＴＥ０．０４ｇ，分解液（ｐＨ３．５−１０）０．５ｍｌ，ブロモフェノールブルー（０．１％）１０μｌをＨ_２Ｏで２５ｍｌに調整。
サンプル緩衝液：Ｈ_２Ｏ６２５μｌ中ＩＰＧサンプル緩衝液ｐＨ３−１０，２５μｌ。
ブロッティング緩衝液：グリシン２．９３ｇ，Ｔｒｉｓ ５．８１ｇ，メタノール２０ｍｌ，ＳＤＳ０．３７５ｇをＨ_２Ｏで１０００ｍｌに調整。
ブロッティングマトリックス：ＰＶＤＦイモビロンＰ ０．４５μＭ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｋ８ＪＭ８２３８Ｈ。
洗浄用緩衝液：ＥＬＩＳＡ洗浄用緩衝液参照。
希釈用緩衝液：洗浄用緩衝液中１％粉乳。
検出用緩衝液：０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５。

方法
Ｅｐｏ含有サンプルを５００〜１０００ｎｇ／５０μｌに調整し、脱塩し、サンプル緩衝液で１：１に希釈し、再膨潤したＩＰＧゲルにアプライする。泳動条件は最初の１分間を３００Ｖとし、その後、３５００Ｖまで直線的に増加し、１時間後に３５００Ｖとする。全フォーカシング工程中、１０ｍＡ及び１０Ｗを限界とする。その後、一晩拡散又はエレクトロブロットにより蛋白質をＰＶＤＦイモビロン膜にブロットした後、Ｅｐｏの最初から２６個のアミノ酸を検出するモノクローナル抗体でＥｐｏを特異的に染色する。ＡＰ標識抗マウスＩｇＧとＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色で可視化を行う。

ＤＮＡ含量の測定
組換え細胞株のＤＮＡ含量をＦＡＣＳ分析によりＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻宿主細胞株と比較する。

材料
洗浄用緩衝液：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００。
染色用緩衝液：洗浄用緩衝液中０．３μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。

方法
細胞５ｘ１０^５個をＰＢＳで洗浄し、氷冷７０％エタノールで固定する。その後、細胞を洗浄用緩衝液で２回洗浄した後、染色用緩衝液中室温で３０分間インキュベートする。ＤＮＡ含量をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で励起波長３５９ｎｍ及び発光波長４５０ｎｍにて測定する。

ｉｎ−ｖｉｔｒｏ特異性試験
ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）はＩＬ３又はｈＧＭ−ＣＳＦに増殖依存性である。これらのサイトカインは増殖に相乗効果を示すが、Ｅｐｏは生存をしばらく維持することができる。ＧＭ−ＣＳＦとＥｐｏを含有する培養培地で細胞を常法で増殖させる。

試験上清
培養培地：ＲＰＭＩ１６４０に４ｍＭ Ｇｌｎ，１０％ＦＣＳ，２０μｇ／ｍｌトランスフェリン，１０μＭβ−メルカプトエタノール，１２ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ，３Ｕ／ｍｌ ｒｈＥｐｏを添加。
試験培地：ＲＰＭＩ１６４０に４ｍＭ Ｇｌｎ，１００μｇ／ｍｌトランスフェリン，２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを添加。

方法
ＭＴＴ生存性試験として９６ウェルプレートで機能性試験を実施する（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，１９９６，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １４（１１）：１４５５−６９）。試験培地中Ｅｐｏ１００ｎｇ／ｍｌから開始してサンプルの２倍希釈を８回繰返す。各サンプル希釈液、標準希釈液又はブランク５０μｌを９６ウェル試験プレートに移す。ＴＦ−１細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、試験培地中２ｘ１０^５細胞／ｍｌに調整する。９６ウェル試験プレートの各ウェルに細胞懸濁液５０μｌを重層し、これらの細胞をＣＯ_２インキュベーターに７２時間放置する。その後、ＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中６ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを加え、３７℃で４時間インキュベートする。暗所で色素をＳＤＳ／ＨＣｌ（０．１Ｍ ＨＣｌ中１０％ＳＤＳ）１００μｌに更に４時間溶かし、Ｅｐｏ依存生存性を５５０／６９０ｎｍで分光測定する。

プラスミドＥｐｏ／ｎｅｏの構築
１．ｐ２−ｎｅｏの構築
１．１ ＳＶ４０初期プロモーターを含むｐＳＶ２ｎｅｏからのベクターフラグメントの作製
ベクター構築の基盤はｐＳＶ２ｎｅｏに含まれるｐＢＲ３２２プラスミドバックボーンである。小さいＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ制限フラグメントはこのｐＢＲ３２２バックボーンを含み、隣接するＳＶ４０由来ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントはＳＶ４０初期プロモーターの対応フラグメントを含む。

プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１４９）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断する。得られた２個のフラグメントは３０９２ｂｐ及び２６３７ｂｐのサイズである。２６３７ｂｐフラグメントはｐＢＲ３２２バックボーンを含むＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ制限フラグメントとＳＶ４０初期プロモーターのフラグメントを含む隣接するＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントから構成される。２６３７ｂｐを作製し、ゲル電気泳動により精製する。

１．２ ネオマイシン耐性遺伝子の作製
ｎｅｏ遺伝子はｐＳＶ２ｎｅｏのトランスポゾンＴｎ５に由来するものを使用する。遺伝子のコーディング領域のみを含むフラグメントとしてこの遺伝子を増幅する。クローニングストラテジーの一部として、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を両端に導入する。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を上流増幅プライマーに作製し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位を下流プライマーに作製する。増幅領域はｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０２４３４）の配列のヌクレオチド２８４６〜１９３８に対応する。オリゴヌクレオチドは以下のように設計する。

Ｐｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲによりプライマー２００４−０１及び２００４−０２の増幅産物を作製する。プロセスパラメーターは供給緩衝液中ｐＳＶ２ｎｅｏ ２０ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ１０ｍｍｏｌ、Ｐｗｏポリメラーゼ２．５Ｕで総容量５０μｌとし、温度プロフィルは５分間９５℃、３５サイクル（３０秒９５℃、２０秒６５℃、９０秒７２℃）、３分間７２℃、後期使用時まで４℃で冷却とする。

得られた９３５ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＮＡ単離カラム（Ｍｉｎｉ，Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ）で精製し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲルで精製し、スピンカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して溶出させる。

１．３ ｐ１−ｎｅｏの構築
増幅したＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｎｅｏ遺伝子フラグメントをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりｐＳＶ２−ｎｅｏからのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントにライゲートし、大腸菌宿主（大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質転換する。５０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地での増殖により形質転換細胞を選択する。

プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩとＮｃｏＩ（夫々２５２７ｂｐ、７８０ｂｐ及び２５１ｂｐの３フラグメント）を使用して制限分析によりチェックする。構築物の対応部分のシーケンシングにより予想フラグメントを示すプラスミドＤＮＡを更にチェックする。確証されたＳＶ４０初期プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをｐ１−ｎｅｏと命名する。

１．４ ＳＶ４０終結領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの作製
ｐＳＶ２ｎｅｏに存在するＳＶ４０終結領域のフラグメント（ヌクレオチド７５１〜１５９８）を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計する。上流プライマーは更にＳｐｅＩの制限部位を含む。ｐＳＶ２−ｎｅｏの７５１位に既に含まれるＢａｍＨＩ部位に加え、ＢａｍＨＩから６ヌクレオチドスペーシング領域隔てた下流プライマーにＥｃｏＲＩ部位を導入する。２種のプライマーの配列は以下の通りである。

上述のようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲによりプライマー２００４−０５＋２００４−０６の増幅産物を作製する。得られた８７３ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＮＡ単離カラムで精製し、ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで消化し、ゲル精製する。

１．５ ｐ２−ｎｅｏの作製
ＥｃｏＲＩ＋ＳｐｅＩを使用してｐ１−ｎｅｏプラスミドＤＮＡを消化する。得られた直鎖化フラグメントを精製し、ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含む増幅フラグメントとライゲートし、大腸菌宿主に形質転換する。５０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地での増殖により形質転換細胞を選択する。

プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ（４４１１ｂｐの１フラグメント）とＮｃｏＩ（サイズ３６３１ｂｐと７８０ｂｐの２フラグメント）とＳｐｈＩ（サイズ３４９９ｂｐ、８４０ｂｐ及び７２ｂｐの３フラグメント）を使用して制限分析によりチェックする。構築物の対応部分のシーケンシングにより予想フラグメントを示すプラスミドＤＮＡを更にチェックする。確証されたＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含むプラスミドＤＮＡをｐ２−ｎｅｏと命名する。

２．プラスミドｐ３の構築
２．１ ＳＶ４０初期プロモーターフラグメントの作製
プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏをＳＶ４０初期プロモーターフラグメントのソースとして使用する。フラグメントサイズはｐ２プラスミドの構築に使用したサイズとほぼ同一である。但し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩの認識部位を導入するようにフラグメントの両端を修飾する。プロモーターを増幅するために使用するオリゴヌクレオチドプライマーは以下のように設計する。

上述のようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲによりプライマー２００４−０７＋２００４−０８の増幅産物を作製する。得られた３６５ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＮＡ単離カラムにより精製し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化し、ゲル精製する。

２．２ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター部分の作製
夫々ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ＤＮＡを順次制限消化する。アルカリホスファターゼを使用してＤＮＡを脱リン酸化する。ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩフラグメントをライゲーション前にアガロースゲル電気泳動により小フラグメントから精製する。

２．３ プラスミドｐ３の作製及び確証
作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ベクターにＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ）を使用してＳＶ４０初期プロモーターを含む増幅ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントをライゲートする。１００ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地で大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡをコロニーから単離精製する。

得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＮｃｏＩ（サイズ３０３９ｂｐ及び２５３ｂｐの２フラグメント）で制限分析によりチェックする。

予想フラグメントを示す２個のプラスミドＤＮＡをシーケンシングにより更にチェックする。各位置を確証できるようにＳＶ４０初期プロモーターの両鎖をシーケンシングする。プラスミドをｐ３と命名する。

３．ヒトＥｐｏｃＤＮＡの単離
３．１ ＴＲＩＺｏｌ（登録商標）試薬による全ＲＮＡの単離
ヒト腎組織（Ｌａｉｎｚｅｒ Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓ病院から入手）からＥｐｏ ＲＮＡの単離に使用したＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬はフェノールとイソチオシアン酸グアニジンの単相溶液である。細胞溶解中にイソチオシアン酸グアニジンは細胞が分裂する間にＲＮＡと水溶性複合体を形成する。クロロホルム添加後に遠心し、ＲＮＡを含む水相と有機相に溶液を分離する。水相の分離後にＲＮＡをイソプロピルアルコールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、風乾し、ＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁する。

ヒト腎組織フラグメントを小片に細断し、１００μｍセルストレーナーに通し、遠心し（１７９ｘｇ／１０分）、得られたペレットをＰＢＳで３回洗浄する。次にペレットをＰＢＳに再懸濁し、滅菌管に分注し、−１９６℃まで凍結し、後期使用時まで−８０℃で保存する。

ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬１ｍｌを加えて凍結組織を溶解させ、ホモジナイズし、１５〜３０℃で５分間インキュベートして完全に解離させる。クロロホルム２００μｌを添加し、管を振盪し、２〜３分間１５〜３０℃でインキュベーション後に管を１２０００ｘｇで１０分間遠心する。遠心後に上部水相を注意深く新しい管に移し、イソプロピルアルコール５００μｌと混合し、１５〜３０℃で１０分間インキュベートする。沈殿したＲＮＡを遠心（１２０００ｘｇ，１０分）し、ペレットをエタノールで洗浄し、再び遠心し、風乾し、ＲＮＡｓｅを含まないＤＥＰＣ水に溶かす。総ＲＮＡ含量を２６０ｎｍで分光測定する。
１ＯＤ_{２６０ｎｍ}＝ＲＮＡ４０μｇ／ｍｌ。

ＯＤ_{２６０ｎｍ}とＯＤ_{２８０ｎｍ}（蛋白質の最大吸光度）の比を評価することにより、ＲＮＡ単離の純度を予測することができる。純度は１．６〜１．８であると思われる。

３．２ ダイナビーズオリゴ（ｄＴ）２５によるｍＲＮＡ単離
ダイナビーズオリゴ（ｄＴ）_２５ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴキットは真核ｍＲＮＡのポリアデノシンテールＲＮＡとデオキシチミジル酸の２５ヌクレオチド長鎖をその表面に共有結合した超磁性ポリスチレン粒子のハイブリダイゼーションを利用している。磁性ビーズに結合したｍＲＮＡはＤｙｎａｌ磁性粒子コンセントレーター（ＤｙｎａｌＭＰＣ（登録商標））を使用して分離することができる。

洗浄用緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；０．１５ｍＭ ＬｉＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ。
２ｘ結合用緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１ｍＭ ＬｉＣｌ；２ｍＭ ＥＤＴＡ。

全ＲＮＡ１０μｇにつき、ダイナビーズオリゴ（ｄＴ）_２５１００μｌをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）で分離し、２ｘ洗浄用緩衝液で２回洗浄する。この間に全ＲＮＡを１ｘ洗浄用緩衝液で容量２００μｌに調整し、６５℃で４分間インキュベーションにより変性させる。次に、ＲＮＡをビーズと混合し、室温で５分間インキュベートし、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）で分離する。ビーズを１ｘ洗浄用緩衝液で２回洗浄する。溶出用緩衝液（２ｘ１０μｌ）を加えて４分間６５℃でインキュベーションによりポリアデニル化ＲＮＡをダイナビーズオリゴ（ｄＴ）_２５から溶出させる。ダイナビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）で分離し、ＲＮＡｓｅを含まない新しいマイクロ遠心管に上清をすぐに移す。溶出液を逆転写に直接使用する。

３．３ 逆転写
Ｅｐｏの特異的プライマーを８０℃で４分間インキュベーションにより変性させ、ｍＲＮＡを６５℃で５分間インキュベーションにより変性させる。以下の成分を氷上の１．５ｍｌ滅菌マイクロ遠心管に加える。

３．４ ポリメラーゼ連鎖反応
以下の成分を４℃で１．５ｍｌ滅菌マイクロ遠心管に加える。ＰＣＲ条件は下記の通りとする。

ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析する。

３．５ アガロースゲル電気泳動
６ｘＢＸ緩衝液：０．２５％ブロモフェノールブルー；０．２５％キシレンシアノール，３０％グリセロール。
ＴＡＥ緩衝液：Ｔｒｉｓベース２４２ｇ；氷酢酸５７．１ｍｌ；ＥＤＴＡ（０．５Ｍ，ｐＨ８．０）１００ｍｌにＨ_２Ｏを加えて１０００ｍｌとする。
λマーカーＩＩＩ：バクテリオファージλ野生型Ｄａｎｎ１０μｇ（ＨｉｎｄＩＩＩ２．５μｌ＋ＥｃｏＲＩ２．５μｌ＋緩衝液Ｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）２０μｌにＨ_２Ｏを加えて２００μｌとし、１時間３７℃で消化し、２０分間６５℃で不活化し、ＢＸローディング緩衝液４０μｌを加える）。

アガロース１ｇと１ｘＴＡＥ緩衝液９９ｇを電子レンジで溶かし、約６０℃まで冷却し、臭化エチジウムストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３μｌを加える。分離しようとするＤＮＡフラグメント長に応じてゲルを１ｘＴＡＥ緩衝液中で１００〜３００Ｖにて約３０分間泳動させる。各レーンは６ｘＢＸ緩衝液２μｌと混合したサンプル１０μｌを含む。ＤＮＡフラグメントの同定はλ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化産物分子量標準との比較に基づく。

３．６ ＰＣＲ産物とライゲーション用ベクターの作製
３．６．１ 付着末端クローニング用ベクターＤＮＡ及びインサートの制限
制限酵素１０ｕと適当な制限緩衝液を製造業者の指示に従って１μｇベクターＤＮＡ及びインサートと混合する。使用する酵素、ベクター及びインサートに応じて混合物を３７℃（ＳｍａＩは３０℃）で３０〜６０分間インキュベートする。次に、６５℃まで１０分間加熱することにより酵素を不活化し、反応混合物をアガロースゲル電気泳動により分析する。

３．６．２ ライゲーション
ｐＩＲＥＳｎｅｏＳＶ４０ベクター
ｐＩＲＥＳｎｅｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は１個のメッセンジャーＲＮＡから２個のオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）の内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ｐＩＲＥＳｎｅｏの発現カセットはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要極初期プロモーター／エンハンサー、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、ＥＣＭＶ ＩＲＥＳ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを順に含む。このベクターでは、ＣＭＶプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターで置換されている。

ベクターとＰＣＲ産物をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートする。最適ライゲーション には、（鎖長によるが）ベクター約２０ｎｇとインサート２００ｎｇをモル比約１：１０で使用し、総容量１０μｌのＨ_２Ｏ中で以下の試薬と混合する。インキュベーションは１５℃で一晩と室温で３時間行う。その後、リガーゼを６５℃で１０分間インキュベーションにより熱不活化する。

３．６．３ 細菌及び培地
ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）。
ＬＢ培地：カゼイン由来ペプトン１０ｇ；酵母エキス５ｇ；ＮａＣｌ１０ｇにＨ_２Ｏを加えて１０００ｍｌとし、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整。
ＬＢ寒天：ＬＢ培地１０００ｍｌ中寒天１５ｇ。
ＬＢ−Ａｍｐ：ＬＢ培地１０００ｍｌ中アンピシリン１００μｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）。
ＳＯＣ培地：バクトトリプトン２０ｇ；酵母エキス５ｇ；ＮａＣｌ１０ｍＭ；ＫＣｌ ３ｍＭ；ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ；グルコース２０ｍＭ，ＭｇＳＯ_４１０ｍＭ。

３．６．４ ＣａＣｌ_２を使用する形質転換
コンピテント細菌（ＪＭ１０９）の作製
ＬＢ培地１０ｍｌに大腸菌（ＪＭ１０９）を接種し、一晩３７℃で増殖させる。細菌培養液４ｍｌをＬＢ培地で１００倍に希釈し、ＯＤ_{２６０ｎｍ}が０．８に達するまで増殖させる。細菌を４５００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心し、使用する細菌懸濁液５０ｍｌ当たり１０ｍｌの０．１Ｍ ＣａＣｌ_２（４℃）に細胞ペレットを再懸濁する。細胞を遠心し、ペレットを０．１Ｍ ＣａＣｌ_２ ２ｍｌに再懸濁し、総容量１００μｌまで分注し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存する。

形質転換
予め冷却した１７ｘ１００ｍｍポリプロピレン培養管でプラスミドＤＮＡ５〜１０ｎｇをＪＭ１０９コンピテント細菌に加え、静かに混合し、３０分間氷上におく。次に、細胞を振盪せずに厳密に４２℃の水浴で４５秒間熱ショックを与え、すぐに氷上に２分間おく。次にＳＯＣ培地９００μｌを管に加え、３０分間３７℃でインキュベートした後に細菌懸濁液１００μｌをＬＢ−Ａｍｐプレートにプレーティングする。

３．６．５ スクリーニングとグリセリン培養液の調製
アンピシリン耐性コロニーの挿入ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法によりスクリーニング する。アンピシリン耐性コロニー数個をＰＣＲ反応混合物及びクローニングしたＤＮＡフラグメントに対して特異的なプライマー（下記参照）と混合する。陽性コロニーはアガロースゲル電気泳動でＰＣＲ増幅ＤＮＡバンドを示す。次にこれらのコロニーを更に分析及びプラスミド精製するためにＬＢ−Ａｍｐ培地で増殖させる。後期使用と保存に備え、所望細菌培養液１ｍｌをグリセリン（８７％）５００μｌと混合し、−８０℃で保存する。

３．６．６ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ 精製システム
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００μｇ／ｍｌＲＮａｓｅ Ａ。
細胞溶解溶液：０．２Ｍ ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ。
中和溶液：４．０９Ｍ塩酸グアニジン，０．７５９Ｍ酢酸カリウム；２．１２Ｍ 氷酢酸，ｐＨ４．２
カラム洗浄溶液：６０ｍＭ酢酸カリウム，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；６０％エタノール。

ＬＢ−Ａｍｐ培地２〜３ｍｌに単コロニーを接種し、３７℃で一晩インキュベートする。溶液を遠心し（１２０００ｘｇ，５分）、得られたペレットを再懸濁溶液２５０μｌ、次いで細胞溶解溶液２５０μｌに十分に再懸濁し、管を４回反転して混合し、室温で１〜５分間インキュベートする。その後、アルカリホスファターゼ溶液１０μｌ（室温で５分間インキュベート）と中和溶液３５０μｌを加えた。管を４回反転してすぐに混合し、細菌溶解液を１２０００ｘｇで１０分間室温にて遠心する。清澄化した溶解液をスピンカラムに移して遠心し（１２０００ｘｇ，５分）、カラムを洗浄用溶液（７５０μｌ／２５０ μｌ）で２回洗浄する。ヌクレアーゼを含まない水１００μｌでＤＮＡを溶出させる。

３．６．７ プラスミドのシーケンシング
挿入された配列を特異的プライマーでＩＢＬ（Ｇｅｒａｓｄｏｒｆ，オーストリー）とＧｅｎＸｐｒｅｓｓ（Ｍａｒｉａ Ｗｏｒｔｈ，オーストリー）によりシーケンシングする。Ｅｐｏ及びのＳＶ４０初期プロモーターの増幅と配列分析に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。

４．プラスミドｐ５の構築
４．１ Ｅｐｏ遺伝子フラグメントの作製
ｐＳＶＧＰＩＲＮＥＯを鋳型ＤＮＡとして使用してＥｐｏ（ヒトエリスロポエチン）の構造遺伝子をＰＣＲ増幅する。Ｅｐｏの配列はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ １１３１９．１に示されている。ＮｏｔＩとＫｓｐＩの認識部位を夫々上流及び下流プライマーに導入する。プライマーは以下のように設計する。

上述のようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲによりプライマー２００４−０９＋２００４−１０の増幅産物を作製する。得られた６０４ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＮＡ単離カラムにより精製し、ＫｓｐＩとＮｏｔＩで消化し、ゲル精製する。得られた５９２ｂｐ ＫｓｐＩ／ＮｏｔＩフラグメントを下記三重ライゲーションで使用する。

４．２ 終結領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの作製
プライマーを種々の制限エンドヌクレアーゼ認識部位で指定し、ＫｓｐＩ（＝ＳａｃＩＩ）の部位を上流プライマーに加え、ＳａｃＩとＥｃｏＲＩの部位を下流プライマーに加える以外はセクション１．４にｐ２−ｎｅｏの構築について記載したと同様にＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの終結領域をｐＳＶ２ｎｅｏからＰＣＲにより再クローニングする。

上述のようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲによりプライマー２００４−１１＋２００４−１２の増幅産物を作製する。得られた８７３ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＮＡ単離カラムにより精製し、ＫｓｐＩとＳａｃＩで消化する。次に、得られた８５８ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲル精製する。

４．３ ｐ３ベクター部分の作製
夫々ＮｏｔＩとＳａｃＩを使用してｐ３プラスミドＤＮＡを順次消化する。ＤＮＡをアルカリホスファターゼで処理し、ベクターフラグメントをゲル精製する。

４．４ 三重ライゲーションとプラスミドｐ５の単離
プラスミドｐ３のＮｏｔＩ／ＳａｃＩベクター部分と、ＫｓｐＩ／ＮｏｔＩ Ｅｐｏ遺伝子と、ＫｓｐＩ／ＳａｃＩ終結領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳをライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でライゲートする。１００ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地で形質転換細胞を選択する。

２つの増幅フラグメント２００４−０９／２００４−１０及び２００４−１１／２００４−１２を標識プローブとして使用して、２つのフラグメントが挿入された陽性形質転換細胞をコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングする。両者プローブで陽性ハイブリダイゼーションシグナルを与える１０個のクローンを「中」規模プラスミド作製（Ｑｉａｇｅｎ）に選択する。

酵素ＢａｍＨＩ（４７２３ｂｐの１フラグメント）、ＥｃｏＲＩ（２９１３，１８１０ｂｐの２フラグメント）及びＰｖｕＩＩ（２５１３，１２０４，９０３，１０３ｂｐの４フラグメント）を使用して制限分析を行う。正しい制限フラグメントを示す２個のクローンを選択し、シーケンシングによりチェックする。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋にクローニングした完全カセットをシーケンシングし、予想ヌクレオチド配列と比較する。全単ヌクレオチドを確証できた。プラスミドをｐ５と命名する。

５．ｐＥｐｏ／ｎｅｏの構築
５．１ ｐＥｐｏ／ｎｅｏ １２−１の構築
ｐ５プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、得られた１７９２ｂｐフラグメント（ＳＶ４０プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ターミネーターのカセットに相当）をゲル精製する。プラスミドｐ２−ｎｅｏもＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、直鎖化ベクターをゲル精製する。更に、ＤＮＡをアルカリホスファターゼで脱リン酸化し、Ａｍｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ脱酵素剤で精製する。

４４１１ｂｐ ｐ２−ｎｅｏベクターとｐ５由来１７９２ｂｐカセットの２つのフラグメントをライゲート（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）し、大腸菌ＳＵＲＥに形質転換する。７０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地で増殖させた種々の形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩを使用して消化により分析する。

予想フラグメント（ＥｃｏＲＩ：６１９１ｂｐ，ＮｃｏＩ：４０８５，１３２６及び７８０ｂｐ，ＰｖｕＩＩ：３２７３，２１３０，６８５及び１０３ｂｐ）を示すクローンを選択し、ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２と命名する。

更に精製するために、ＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ（上記参照）に再形質転換し、単コロニー（ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１）を接種した培養液から「Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ」法（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを作製する。以下の酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを使用して制限分析を実施する。予想フラグメント及びサイズを検出でき、クローンは正しいｐＥｐｏ／ｎｅｏクローンであることが確証される。

５．２ ｐＥｐｏ／ｎｅｏの最終構築
開始コドンＡＴＧから−３位のｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１のＥｐｏ遺伝子の上流領域を変異させる。付加ヌクレオチドＡを導入し、開始コドンＡＴＧから−３位をプリン塩基Ｇとする。この位置をプリンにすると、遺伝子の発現レベルを改善することができる。そのために、適応上流プライマー２００４−０９−ａ：

を使用してＥｐｏ遺伝子を再増幅する。

上述のようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲによりプライマー２００４−０９−ａ＋２００４−１０の増幅産物を作製する。得られた６０５ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＮＡ単離カラムにより精製し、ＫｓｐＩとＮｏｔＩで消化する。次に、得られた５９３ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲル精製する。

ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１プラスミドＤＮＡを夫々ＫｓｐＩとＮｏｔＩで消化し、Ｅｐｏ遺伝子を除去する。次に、５５９９ｂｐフラグメントをゲル精製する。作製した両者ＤＮＡを相互にライゲートする（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。７０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地でコロニーから形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡを単離し精製する。第１のスクリーニングではＮｃｏＩを使用する制限によりＤＮＡを分析する。

陽性クローンを選択し、「Ｍｉｄｉ ｐｒｅｐ」法（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを単離する。ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを使用して拡張制限分析を行う。予想フラグメント及びサイズを検出でき、クローンは正しいｐＥｐｏ／ｎｅｏであることが確証される。ｐＢＲ３２２ベクター部分に挿入された完全カセット（ＳＶ４０初期プロモーター−ｎｅｏ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ−ＳＶ４０初期プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ）の全単ヌクレオチドもシーケンシングにより確認する。

プラスミドＥｐｏ／ｄｈｆｒの構築
１．ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの構築
１．１ ｄｈｆｒ遺伝子の作製
ベクター構築に使用するｄｈｆｒ遺伝子はプラスミドｐＬＴＲｄｈｆｒ２６（ＡＴＣＣ ３７２９５）に存在するマウスｃＤＮＡに由来するものを使用する。マウスｄｈｆｒｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＭＵＳＤＨＦＲ）はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ２６３１６として入手可能である。

５６位の開始コドンＡＴＧから６１９位の停止コドンＴＡＡまでのコーディング領域を含むフラグメントを生成するように設計したプライマーを使用してｐＬＴＲｄｈｆｒ２６からｄｈｆｒを増幅する。上記ネオマイシン耐性遺伝子の増幅と同様に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩ部位を夫々上流及び下流増幅プライマーに導入する。リバースプライマーにはＳｐｅＩ部位以外にＥｃｏＲＩ部位も導入する。オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。

上述のようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲによりプライマー２００４−１３＋２００４−１４の増幅産物を作製する。得られた５８８ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＮＡ単離カラムにより精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製する。

１．２ ｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの作製
増幅したＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｈｆｒ遺伝子フラグメントをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりｐＳＶ２−ｎｅｏ由来ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントにライゲートし、大腸菌宿主に形質転換する。５０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地での増殖により形質転換細胞を選択する。５０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地でコロニーから形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡを単離精製する。

プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ＋ＳｃａＩ（サイズ２２２５ｂｐ，５１４ｂｐ及び４７３ｂｐの３フラグメント）を使用する制限分析によりチェックする。

構築物の対応部分のシーケンシングにより予想フラグメントを示すプラスミドＤＮＡを更にチェックする。確証されたＳＶ４０初期プロモーターとジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳと命名する。配列を分析した処、ＭＵＳＤＨＦＲに公開されている配列とｄｈｆｒ遺伝子内に１カ所相違していることが判明し、具体的には、ＭＵＳＤＨＦＲ配列の４５１位がＴからＣに置換していた。引き続きシーケンシングした処、この置換はソースプラスミドにも存在することが分かった。しかし、ＣＴＴとＣＴＣはいずれもロイシンをコードするので、得られる変異はヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に変異を生じない。

１．３ ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの作製
ＥｃｏＲＩ＋ＳｐｅＩを使用してｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳプラスミドＤＮＡを消化する。得られた直鎖化フラグメントを精製し、ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ（上記参照）を含む増幅フラグメントとライゲートする。形質転換と選択後に得られるプラスミドをＡｃｃＩ（２９９４、８５５及び２１６ｂｐの３フラグメント）で制限分析する。数個を選択し、ＨｉｎｃＩＩ（夫々３４６６ｂｐ及び５９９ｂｐの２フラグメント）、ＡｆｌＩＩＩ（夫々２８７２ｂｐ及び１１９３ｂｐの２フラグメント）及びＢｇｌＩ（夫々２３７１ｂｐ及び１６９４ｂｐの２フラグメント）を使用して更に分析する。

正しいサイズの全予想フラグメントを示すプラスミドＤＮＡをシーケンシングにより更にチェックする。確証されたプラスミドをｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳと命名する。

２．ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒの構築
２．１ ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ２１の作製
ｐ５プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、得られた１７９２ｂｐフラグメント（ＳＶ４０プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ターミネーターのカセットに相当）をゲル精製する。

プラスミドｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳもＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、直鎖化ベクターをゲル精製し、Ｓｕｐｅｌｃｏスピンカラムを使用して溶出させる。更に、アルカリホスファターゼを使用してＤＮＡを脱リン酸化し、Ａｍｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ脱酵素剤で精製する。

４０５３ｂｐのｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳベクターとｐ５由来１７９２ｂｐカセットの両者フラグメントライゲートし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌ＳＵＲＥに形質転換する。７０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地で形質転換コロニーを増殖させ、Ｅｐｏ遺伝子（ＰＣＲ産物）をプローブとして使用してハイブリダイズする。プラスミドＤＮＡを種々の陽性クローンから単離し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩを使用する消化により分析する。

予想フラグメント（ＮｃｏＩ：４０８５ｂｐ及び１７６０ｂｐ）を示すクローン１個を選択し、ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１と命名する。更に精製するために、ＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ（上記参照）に再形質転換し、単コロニー（ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１−１）を接種した培養液から「Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ」法（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを作製する。

以下の酵素：ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを使用して制限分析を実施する。全予想フラグメント及びサイズを検出でき、クローンは正しいｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１であることが確証される。

２．２ ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒの最終構築
ｐＥｐｏ／ｎｅｏと同様に、開始コドンＡＴＧから−３位のＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１のＥｐｏ遺伝子の上流領域を変異させる。付加ヌクレオチドＡを導入し、開始コドンＡＴＧから−３位をプリン塩基Ｇとする。Ｅｐｏ遺伝子を実施例１のセクション４．２に記載したように再増幅する。

ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１プラスミドＤＮＡをＫｓｐＩとＮｏｔＩで消化し、Ｅｐｏ遺伝子を除去する。次に５２５９ｂｐフラグメントをゲル精製する。

作製した両者ＤＮＡを相互にライゲートする（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。７０ｍｇ／ｌアンピシリンを加えたＬＢ培地でコロニーから形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡを単離精製する。第１のスクリーニングではＮｃｏＩを使用する制限によりＤＮＡを分析する。

陽性クローンを選択し、「Ｍｉｄｉ ｐｒｅｐ」法（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを単離する。ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを使用して拡張制限分析を実施する。予想フラグメント及びサイズを検出でき、クローンは正しいｐＥｐｏ／ｄｈｆｒであることが確証される。

ｐＢＲ３２２ベクター部分に挿入された完全カセット（ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ−ＳＶ４０初期プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ）の全単ヌクレオチドもシーケンシングにより確認する。

ｐＥｐｏ／ｎｅｏとｐＥｐｏ／ｄｈｆｒから作製した組換えＣＨＯ細胞
リポフェクチントランスフェクションを実施する前日に細胞１〜５ｘ１０^４個／ｃｍ^２を２５ｃｍ^２Ｔフラスコびん又は９６ウェルプレートに播種する。２種のプラスミドを５０：１＝Ｅｐｏ／ｎｅｏ：Ｅｐｏ／ｄｈｆｒの比で混合し、製造業者のプロトコールに従ってリポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に吸着させる。

要約すると、ＤＮＡ０．２５μｇ／ｃｍ^２とリポフェクチン試薬１．５μｌ／ｃｍ^２を使用し、このＤＮＡ／脂質カクテルを２００μｌ／ｃｍ^２細胞層に調整した。次に、無血清ＤＭＥＭ中で細胞にトランスフェクションカクテルを４時間重層した後、ＤＮＡ含有培地を培養培地に置換する。血清含有培地で２４時間培養後に選択培地に交換した。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地でコンフルエントまで培養した後に増幅培地（４．８ｘ１０^−８Ｍ ＭＴＸ）で培養し、その後、細胞培養上清のＥｐｏ産生をＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。最高産生細胞を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍にし、最良産生細胞を使用して更に培養する。７個の組換え細胞プールを選択し、増殖特性、Ｅｐｏ産生能、蛋白質パターン（ウェスタンブロット分析による）、Ｅｐｏ機能性及び染色体安定性を比較する。

Ｔ２５フラスコ当たりｐＥｐｏ／ｎｅｏ２．５μｇ、ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ０．０５μｇ及びリポフェクチン１５μｌ（０９／Ｔ２５／１及び０９／Ｔ２５／２）と、Ｔ２５フラスコ当たりｐＥｐｏ／ｎｅｏ２μｇ、ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ０．４μｇ及びリポフェクチン１５μｌ（０９／Ｔ２５／３及び０９／Ｔ２５／４）を使用してＴ２５フラスコでトランスフェクションを実施する。

更にプレート５枚にｐＥｐｏ／ｎｅｏ１０μｇ、ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ０．２μｇ及びリポフェクチン６０μｌ／プレート（０９／９６／１−０９／９６／５）をトランスフェクトし、プレート５枚にｐＥｐｏ／ｎｅｏ８μｇ、ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ１．６μｇ及びリポフェクチン６０μｌ／プレート（０９／９６／６−０９／９６／１０）をトランスフェクトする。プレート１１及び１２にはｐＥｐｏ／ｎｅｏ６．２５μｇ、ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ０．０８μｇ及びリポフェクチン３７．５μｌを各々トランスフェクトする。

要約すると、ＤＮＡ０．２５μｇ／ｃｍ^２とリポフェクチン試薬１．５μｌ／ｃｍ^２を使用し、このＤＮＡ／脂質カクテルを２００μｌ／ｃｍ^２細胞層に調整した。

従来の実験によると１培養単位当たりのクローン数は最大３〜５であるので、一連のトランスフェクションは主にマイクロタイタープレートで実施する。つまり、Ｔフラスコで数百のクローンから単離するよりもモノクローナルトランスフェクト細胞を単離するほうが容易である。表１は９６ウェルプレート当たりのクローン数と増幅圧の存在下及び不在下のＥＬＩＳＡ力価を示す。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地でコンフルエントまで培養した後に増幅培地（４．８ｘ１０^−８Ｍ ＭＴＸ）で培養し、その後、細胞培養上清のＥｐｏ産生をＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。約１０００個の増殖ウェルをスクリーニングし、５０個のこのような培養液のＭＴＸ濃度を上げて特異的Ｅｐｏ産生能を試験する。最高産生細胞を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍にし、最良産生細胞を使用して更に培養する。

選択及び第１の増幅段階は９６ウェルプレートで実施し、４．８ｘ１０^−８Ｍ ＭＴＸで増殖する全クローンのスクリーニング後に７個のクローンを選択し、０９／９６／１Ｆ５、０９／９６／３Ｄ５、０９／９６／３Ｈ５、０９／９６／５Ｄ４、０９／９６／５Ｈ１、０９／９６／６Ｃ５及び０９／９６／７Ｅ６と命名し、その増殖特性、Ｅｐｏ産生能、ウェスタンブロットによる蛋白質パターン、Ｅｐｏ機能性試験及び染色体安定性を比較する。

細胞倍加時間は全クローンで同一であると思われ、週２回１：２〜１：５に分割することができる。ＭＴＸ濃度を９．６ｘ１０^−８Ｍから１．９ｘ１０^−７Ｍに上げても産生能は改善するが、ＭＴＸ濃度を更に倍加してもＥＬＩＳＡ値は変わらない。従って、サブクローニングは３．８ｘ１０^−７Ｍ ＭＴＸで実施する。単培養に有意差がない場合には１．９ｘ１０^−７Ｍ ＭＴＸで免疫蛍光を分析する。

光学顕微鏡とコールターカウンター核ＤＮＡ分析により細胞形態を比較する。クローン０９／９６／７Ｅ９、０９／９６／６Ｃ５、０９／９６／５Ｈ１、０９／９６／５Ｄ４及び０９／９６／３Ｄ５は宿主細胞株ＣＨＯ−ＤＨＦＲ⁻と同一の核サイズ分布を示す。他方、細胞株０９／９６／１Ｆ５及び０９／９６／３Ｈ５は核が大きい。従来の実験によると、これは染色体数が多いためであることが分かっている。従って、クローン０９／９６／３Ｄ５を使用して更に安定化させることに決定する。

ＴＦ−１細胞におけるＥｐｏの機能性試験によると、組換え医薬製品に比較して全７種の培養上清は同一の傾きである。

組換え蛋白質を各ＭＴＸ濃度でＳＤＳ ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングにより試験すると、組換え培養上清にはほんの小さい変異が認められる。クローンはＥｐｏを産生する。

要約と考察
真核発現ベクターの構築から哺乳動物細胞のトランスフェクションとポリクローナルＥｐｏを発現する細胞プールの単離に至るまで、Ｅｐｏを発現する組換えＣＨＯ細胞株の選択について記載する。分析基準は主にＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ウェスタンブロット及びｉｎ ｖｉｔｒｏ機能性試験に基づく。これらの全方法はｎｇ／ｍｌ量程度の低産生細胞プール培養上清とより安定化した組換え細胞をスクリーニングすることが可能な濃度範囲で実施する。

３．８ｘ１０^−７Ｍ ＭＴＸまで遺伝子コピー数を段階的に増幅した組換えＣＨＯプールを作製する。これらの細胞は週２回１：３〜１：４に分割することができ、その都度高レベルのＥｐｏがＥＬＩＳＡで検出される。

組換え細胞株の詳細選択
組換え細胞プール０９／９６／３Ｄ５を使用して更に安定化させる。ＭＴＸ濃度を０．３８μＭ ＭＴＸまで段階的に増加する。この増幅レベルで組換え３Ｄ５細胞１０及び２０個／ウェルをサブクローニングする。単クローンのウェルの培養上清のスクリーニングをＥＬＩＳＡにより行う。表２はサブクローニング条件と０．３８μＭ ＭＴＸの存在下の組換え細胞プール３Ｄ５の効率を示す。単クローンの上清３００個を試験する。継代から４日後にＥｐｏ力価の高いクローンを２４ウェルプレートにて０．７７μＭ ＭＴＸで選択する。

これらのクローンの７個を液体窒素に保存し、ＭＴＸ濃度を１．５４μＭまで増加することにより遺伝子コピー数が更に増幅するものを選択する。

表３はプレーティング条件と第２回目の安定化の効率をまとめた。ここではクローン０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９及び０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５を最終的に１．５４μＭ ＭＴＸでサブクローニングする。ウェル当たりの細胞数は４個に減らす。２６０個の単クローンをスクリーニングし、そのうち各サブ培養の２０個を上回るクローンをＴフラスコに移し、特異的産生能をスクリーニングする。特異的発現率、増殖条件及び核サイズ分布等の基準により最終産生クローンを決定する。四倍性を示すクローンはバイオリアクターで複雑な増殖パターンを示す傾向があることが実験から分かっているので廃棄する。スクリーニング後に０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／４Ｃ２、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｃ２、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｄ４、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／１５Ｂ４、０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５／７Ａ６、０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５／１５Ｃ３の６個のサブクローン（１Ｈ９サブクローン４個と１８Ｅ５サブクローン２個）を選択し、液体窒素で凍結させる。

無血清培養培地への適応
実施例４からの６個の最終組換え細胞株を選択し、最終サブクローニング段階後に無血清培養条件に適応させる。

サブクローニング後７〜１２継代で細胞約５ｘ１０^４個／ｃｍ^２をＴ２５フラスコに播種し、３〜４日間コンフルエントまで培養する。この時点で培地を無血清適応培地に完全に置換し、その後、培地の８０％を毎日交換する。全懸濁細胞を培養に戻す。適応時間後にほぼ全細胞が懸濁増殖したらクローンを週２回継代し、懸濁培養として培養する。

クローンを無血清適応培地で１１〜１３継代培養後に低温保存する。アンプル６本に全細胞株各々５ｘ１０^６細胞を入れて無血清凍結培地で液体窒素にて凍結する。融解後、クローンを無血清産生培地で培養する。融解後第２又は第３継代の上清で産生クローンを選択する分析特性決定を行う。

分析試験は以下の試験を行った。
特異的増殖率［μ］−（μ＝（Ｘ_２／Ｘ_１）／日数）、
特異的産生能［ｑ_ｐ］−（Ｑ_ｐ＝産生物産生ｘ１０^６／（細胞数ｘ日数））、
ウェスタンブロット、
等電点電気泳動、
ＤＮＡ含量及び安定性、
クローン安定性。

全６個の細胞株は無血清増殖培地で増殖することができ、週２回分割する。無血清で低温保存も実施し、融解後に培養培地を無血清産生培地に交換する。この培地の組成はグルコースとアミノ酸の濃度を高くする。

５継代後に種々の蛋白質及び細胞パラメーターを測定し、１個の産生クローン（０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｃ２；略称６Ｃ２）と１個の予備クローン（０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／４Ｃ２；略称４Ｃ２）を選択する。

組換え細胞株の比較
培養細胞数と継代中の分割比を測定することにより、実施例４及び５からの６個の細胞株の増殖特性を数週間にわたって計算する。Ｅｐｏ産生能をＥＬＩＳＡにより試験する。このデータから上記のような特異的産生能と特異的増殖率を計算する。

表４は３日間培養後に分割比１：３で標準培養条件下に得られたデータを要約する。

分割後と更に３日後の細胞数（コールターカウンターにより測定）を示す。

還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
６種の細胞株の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分子量の差を比較する。６個の上清はこのような高グリコシル化蛋白質に共通して見られるバンドを含む同一のＳＤＳパターンを示す（データは示さず）。

同等の市販製品はより明白なバンドとして移動するが、これは恐らく下流方向プロセシング中に分離する明白なバンドに起因すると思われる。

ＩＥＦ−ウェスタンブロット
ＩＥＦ−ウェスタンブロット分析は糖蛋白質の潜在的微小不均一性を反映すると考えられる。ゲルにロードする蛋白質の量に従って、１４個までのバンドが現れる。ウェスタンブロットではゲルのほぼ中央に１個の特徴的な二重バンドが認められ、この二重バンドの下の次のバンドをバンド番号１とすると、ゲルのこの酸性部分には９〜１０個のバンドが現れる。同等の市販製品は異種産生物でバンド番号６〜９に対応する４個の主要バンドを示した。

組換え細胞のＤＮＡ含量
ＤＮＡ含量は細胞株の染色体数に比例する。組換え細胞株の安定性は染色体数によっても変化し、ＤＮＡ含量は宿主細胞株（ＣＨＯｄｈｆｒ⁻）との比較により確認される。

要約と考察
ここではＥｐｏを発現する組換えＣＨＯ細胞株の単離について記載する。２回サブクローニング後に１個の最終産生クローンを指定するための基準として細胞株６個の示差特性を比較する。分析の基準は主にＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及びＩＥＦ試験とＦＡＣＳ分析によるＤＮＡ測定である。

組換え培養上清のウェスタンブロットパターンは市販精製蛋白質に比較して数個の付加的な低分子量バンドを示す。１つの理由としてこれらの付加バンドは比較する市販製品となるまでの下流方向プロセシング中に除去されるアイソフォームに相当すると考えられる。また、ＳＤＳ取込みが不完全であるために人工バンドが検出されるとも考えられる。等電点電気泳動では、全細胞培養上清でそのＱｐに関係なく同一のアイソフォーム分布が得られる。

処理が最も簡単な最良産生クローンは産生クローンとして選択されるクローン６Ｃ２である。予備クローンとして４Ｃ２を選択する。どちらのクローンもローラーボトルで増殖できる。

ＴフラスコでのＣＨＯ細胞培養
Ｔフラスコで無血清条件下にチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）で組換えヒトエリスロポエチンを産生させる。培地に細胞２．６７ｘ１０^５個／ｍＬを播種する。３日間のインキュベーション期間後に最終細胞密度９．３５ ｘ１０^５細胞／ｍＬに達する（＝＞μ＝０．４２日^−１）。

実施例１〜６はＥｐｏを発現する多数のＣＨＯクローンの作製に関する。実施例４及び５で得られた６個のクローンのうち、細胞特異的産生能と特異的増殖率が高いことからクローンＣＨＯ６Ｃ２を選択する。

バイオリアクターでのＣＨＯ細胞培養
１５０Ｌバイオリアクターでバッチ供給（Ｔ４３Ｃ６Ｃ２）モードにてＣＨＯ細胞株６Ｃ２を培養する。アミノ酸添加５０：５０ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ Ｆ１２に０．２５％植物ペプチド、０．１％ ｌｕｔｒｏｌ、１．５４μＭメトトレキセート（ＭＴＸ）、４ｇ／Ｌグルコース、２．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、アスコルビン酸及び亜セレン酸ナトリウムを加えた細胞培地を使用する。培地に高価な機能性蛋白質（組換え又は天然由来）は加えなかった。動物由来成分を加える。培地５６Ｌ中細胞約５ｘ１０^５個／ｍＬを播種する。ｐＯ_２を５０％空気飽和に設定し、温度３７℃、ｐＨ７．０とし、発酵工程中一定に維持する。

グルコース濃度は＞１ｇ／Ｌに維持する。４日後にリアクターに新鮮培地を１５０Ｌまで充填する。９日後にアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含む栄養濃縮液１８７５ｍＬを加えることによりバッチを持続する。１０日後に栄養濃縮液を更に１８７５ｍＬ加える。２日後（１２日目）にエリスロポエチンを含む上清を回収する。

メトトレキセート不在下のバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
５Ｌバイオリアクターでバッチ供給（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−１及び２）モードにてＣＨＯ細胞株６Ｃ２を培養する。培地は実施例９に記載した通りである。第１のバイオリアクター（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−１）を培地中１．５４μＭ ＭＴＸに設定し、第２のバイオリアクター（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−２）にはＭＴＸを加えない。

グルコース濃度は＞１ｇ／Ｌに維持する。培地１２５０ｍＬ中細胞約５ｘ１０^５個／ｍＬを播種する。ｐＯ_２を５０％空気飽和に設定し、温度３７℃、ｐＨ７．０とし、発酵工程中一定に維持する。２日後にリアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後にアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含む栄養濃縮液５０〜１２２ｍＬを加えることによりバッチを持続する。１１日目にエリスロポエチンを含む上清を回収する。

メトトレキセート不在下の培養はグリコシル化パターンが良好になるので優れていることが分かった。

栄養強化培地によるバイオリアクターでのエリスロポエチンの産生
５Ｌバイオリアクターでバッチ供給（Ｋａｍｐ １１ Ｂ５−１及び２）モードにてＣＨＯ細胞株６Ｃ２を培養する。バイオリアクター１は実施例１０（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−２）と同様に運転する。バイオリアクター２では強化アミノ酸添加５０：５０ＤＭＥＭ／ＨａｍｓＦ１２に０．３２５％植物ペプチド、０．１％ ｌｕｔｒｏｌ、６．４ｇ／Ｌグルコース、２．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、アスコルビン酸及び亜セレン酸ナトリウムを加え、更に０．６ｇ／Ｌリン酸塩を加えた細胞培地を使用する。培地１２５０ｍＬ中細胞約５ｘ１０^５個／ｍＬを播種する。ｐＯ_２を５０％空気飽和に設定し、温度３７℃とする。ｐＨは開始時に７．１に設定する。発酵工程中に段階的に６．９まで下げる。

培養工程を通してバイオリアクター２のグルコース濃度は３〜４ｇ／Ｌに維持する。２．５日後にリアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後にアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含む強化栄養濃縮液を加えることによりバッチを持続する。１１日目にＥｐｏを含む上清を回収する。

栄養強化培地（アミノ酸、グルコース、植物ペプトン及びリン酸塩）を使用すると共にｐＨを７．１から６．９まで変化させて培養すると、同等のグリコシル化プロフィルで最終Ｅｐｏ濃度が２倍以上になることが分かった。

動物由来成分を加えないバイオリアクターでのエリスロポエチンの産生
５Ｌバイオリアクターでバッチ供給（Ｋａｍｐ １７ Ｂ５−１及び３）モードにてＣＨＯ細胞株６Ｃ２を培養する。特に記載しない限り、全パラメーターは実施例１０（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−２）と同様に設定する。バイオリアクター２では、動物由来成分を含まない細胞培地を使用する。例えば、一般に動物（例えばサケ又はヒト毛髪）に由来するアミノ酸チロシン又はシステインを合成アミノ酸で置換している。

２．５日後にリアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。５、６、７、８及び９日後にアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含む栄養濃縮液を加えることによりバッチを持続する。９〜１０日目にエリスロポエチンを含む上清を回収する。

動物由来成分を含まない培地は同等最終Ｅｐｏ濃度となることが分かった。しかし、培養液の増殖は遅く、更に栄養濃縮液を加える必要がある。

栄養強化培地（ビタミン、微量元素）によるバイオリアクターでのエリスロポエチンの産生
１０Ｌバイオリアクターでバッチ供給（Ｋａｍｐ １２Ｃ）モードにてＣＨＯ細胞株６Ｃ２を培養する。強化アミノ酸添加５０：５０ＤＭＥＭ／ＨａｍｓＦ１２に０．３２５％植物ペプチド、０．１％ｌｕｔｒｏｌ、６．４ｇ／Ｌグルコース、２．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、ビタミン、微量元素及び亜セレン酸ナトリウムを加え、更に０．６ｇ／Ｌリン酸塩を加えた細胞培地を使用する以外は実施例１１（Ｋａｍｐ １１ Ｂ５−２）と同様にバイオリアクターを運転する。濃縮液含量を倍加し、ビタミンを加える。

培地４５００ｍＬ中細胞約５ｘ１０^５個／ｍＬを播種する。ｐＯ_２を５０％空気飽和に設定し、温度３７℃とする。ｐＨは開始時に７．１に設定する。発酵工程中に段階的に６．９まで下げる。

培養工程を通してバイオリアクター内のグルコース濃度は３〜４ｇ／Ｌに維持する。３ 日後にリアクターに新鮮培地を１０Ｌまで充填する。６、７、８、９、１０、１１及び１２日後に強化栄養濃縮液を加えることによりバッチを持続する。１３日目にエリスロポエチンを含む上清を回収する。

Ｅｐｏの単離
細胞分離
不連続バッチ供給発酵により無血清条件下にチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）で組換えヒトエリスロポエチンを産生させる。発酵（２個の別個のバイオリアクターで４ｘ約１＋２バッチモード増殖段階）後にｒｈＥｐｏ約２００〜３００ｍｇ／Ｌを含むブロスを回収し、２〜８℃まで冷却し、暫定保存期間を介さずにまずディスクスタックセパレーターで遠心した後に深層（Ｓｅｉｔｚ Ｂｉｏ１０又はＣｕｎｏＡ９０Ｍ０８，スループット約３００Ｋ／ｍ^２フィルター面積）及び０．２μ濾過（ＰＰ Ｐｏｌｙｇａｒｄ ０．１μｍ，Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ又はＤｕｒｏｐｏｒｅ ０．２２μ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により清澄化する。過度の細胞溶解を避け、従ってＨＣＰ（宿主細胞蛋白質）による過度の産生物汚染を避けるためには、第１に最適時点（酸素消費量が停滞する主培養の約１２日）に回収し、第２に脆弱な真核細胞を分離するように特別に設計した細胞分離装置を使用することであり、例えば水密供給口を備えるＣＳＣ６（６０００ｍ^２ＥＣＡ，１５５００ｘｇ，約２００Ｌ／時，Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）や温和なディスク状入口と針状出口を備えるＢＴＰＸ２５０（１１０００ｍ^２ＥＣＡ，１３０００ｘｇ，３００Ｌ／時，Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ）が挙げられる。タンジェンシャルフロー濾過及び遠心を含む種々の分離技術を比較すると、剪断応力（細胞内マーカー酵素ＬＤＨの放出により測定）による細胞溶解に差がある。遠心は最も温和な分離（＜３Ｕ ＬＤＨ／ｍｇ ｒｈＥｐｏ）であり、好適であると考えられる。

代法では、上記のようなディスクスタックセパレーターによる遠心のみ（深層濾過段階なし）を細胞分離段階に使用する。別の代法では、上記のような深層濾過段階（遠心段階なし）を使用する。

アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによる捕獲
清澄化後に粗上清を約３倍容量の水で希釈し、最終導電率を５ｍＳ／ｃｍ以下とし、ＴｒｉｓベースでｐＨ７．５に調整した後にＡＥＸ捕獲樹脂にアプライする。

使用するＡＥＸカラムはベッド高約１０〜２０ｃｍとし、良好な流動特性をもつＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）を充填する。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５及び５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化する。次に、希釈細胞上清（ｒｈＥｐｏ１０〜１５ｍｇ／ｍＬ樹脂）をカラムに流速４〜８ｃｍ／分でロードし、カラムを平衡化緩衝液１０〜１５カラム容量（ＣＶ）で洗浄する。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５に１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた導電率の高い緩衝液に交換することにより産生物を段階溶出により溶出させる。ピークフラクションをプールし、収率約５０〜６０％を得る。

代法では、フラクションプールを限外濾過により濃縮して中間容量を減らすと共に下記沈殿条件を標準化する。５〜１０ｋＤａカットオフ膜を使用し、ターゲット産生物濃度を約２０ｍｇ／ｍｌに調整することが好ましい。

硫安沈殿
一般に汚染性宿主細胞蛋白質を２．４Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で沈殿させることにより前段階からの捕獲プールを更に精製する。このＡＳ濃縮で沈殿中に産生物は殆ど検出されず、ＨＣＰを含まない純粋な上清が残り、下記ＲＰＣ精製前にＲＰＣロード中＜２４０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４まで希釈すべきである。

捕獲プール１容量に硫安ストック溶液（４Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５）１．５容量を加えて３０分間１０〜１５℃でインキュベーションすることにより沈殿させ、深層（Ｓｅｉｔｚ Ｂｉｏ１０又はＣｕｎｏ Ａ９０Ｍ０８）及び０．２μ濾過（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ又はＤｕｒｏｐｏｒｅ ０．２２μ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により沈殿を分離する。高溶出容量＝希ｒｈＥｐｏ溶出プール（ｒｈＥｐｏ＜５ｍｇ／ｍｌ）の場合には、任意段階であるＵＦ濃縮段階（１０ｋＤａカットオフ）によりＨＣＰ沈殿を実施することができる。

硫安沈殿は疎水性相互作用クロマトグラフィーよりも有効である。

前段階の沈殿からの硫安含量を減らすためには、産生物を含む上清を上述のように希釈すべきである。代法は限外濾過／透析濾過段階である。５〜１０ｋＤａカットオフ膜を使用し、ターゲット硫安濃度を２４０ｍＭ未満、産生物濃度を約３０ｍｇ／ｍｌに調整することが好ましい。透析濾過段階に使用する緩衝液は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．０である。

逆相クロマトグラフィー
次の精製段階は逆相クロマトグラフィーであり、ａ）種々のアイソフォームがその糖主鎖に従って良好に分離され（低グリコシル化／シアリル化形態の前に高グリコシル化／シアリル化形態が溶出）、ｂ）この高性能クロマトグラフィーでは残留宿主細胞蛋白質が除去され、ｃ）このクロマトグラフィーは有機溶媒によるウイルス除去とウイルス不活化に耐性の段階であるなどのいくつかの点で有用である。ソース３０ＲＰＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）はａ）中圧（＜１０ｂａｒ）で運転でき、ｂ）高濃度ＮａＯＨで消毒できるポリマー樹脂である。好適ベッド高は約１０〜１５ｃｍであり、推奨ロード範囲はｒｈＥｐｏ ８〜１２ｍｇ／ｍｌ充填樹脂である。

ＲＰＣ段階前に、産生物を含有する上清を０．２４Ｍ未満の硫酸アンモニウム最終濃度に調節する必要がある。この調節は、ａ）ＲＰＣローディング中の後続オンライン希釈段階（ｒｈＥｐｏ−上清１容量＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）４容量＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中５０ｖｖ％ＡＣＮ５容量）又は多量の有機溶媒を節約するようにローディング段階前に好ましくは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．０で再び透析濾過／濃縮（１０ｋＤａカットオフのＵＦ）することにより実施できる。カラムを予め平衡化し、ロード後に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）中２５ｖｖ％アセトニトリル（ＡＣＮ）で洗浄する。産生物は２５％→５０％ＡＣＮの直線勾配で溶出させ、溶媒が濃縮すると凝集を誘導して後期ＡＥＸクロマトグラフィーを妨げる恐れがあるので溶媒濃縮をすぐに緩和できるように希釈用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０）４容量を予め加えておいた小フラクション（特に約０．２ＣＶ、あるいは約０．３〜０．５ＣＶ）で集める。溶出ピークのほぼ前半のフラクションをプールしてＲＰＣプールとし、更に処理する。このプールは好ましい高グリコシル化度のアイソフォームを含む。この分画段階により、細胞培養では２０％までの濃度で存在しているＳｅｒ１２６位Ｏ−グリカンを欠失する脱Ｏ−グリコシル化ｒｈＥｐｏ産生物が除去される。

代法では、有機溶媒暴露によりウイルス不活化を誘導するために、上記のように４容量ではなく０．５容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）をフラクションに予め加え、２０〜４０分間又はそれ以上インキュベートする。このインキュベーション段階後に元の未希釈フラクション容量に対して更に３．５容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）を加え、こうしてウイルス不活化を停止する。

ウイルス不活化を行ったフラクション又は行わないフラクションを更に精製するためにプールする。プールは通常は上昇部位で最大ＯＤの５０〜１００％から開始し、下降部位で約７０〜８０％を上回るフラクションで終了する。初期溶出フラクションは宿主細胞蛋白質を含む可能性があり、後期溶出フラクションは低シアリル化低活性アイソフォームを含む。更に、ＣＺＥ分析を実施して所定アイソフォームのプールを確認することができる。

アニオン交換クロマトグラフィー
次に、同様に特異的アイソフォームを選択して宿主細胞蛋白質を除去するのに役立つ高性能ＡＥＸカラムに希釈ＲＰＣ−プールをロードする。今回は、アイソフォームを等電点、即ちグリコシル化度に比例するシアリル酸数に従って分離する。優れた分離効率を示す高性能樹脂であるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する。ベッド高は１５〜２０ｃｍとする。産生物濃度が高いと、溶媒による産生物凝集により溶出中に有意ポストピークが生じるので、ロード、勾配及びベッド高等の全条件は産生物濃度をある程度低く保つように決定する。

２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰにＲＰＣプールをＥｐｏ２〜４ｍｇ／ｍＬ樹脂でロードする。平衡化緩衝液による洗浄段階後に平衡化緩衝液中０→３００ｍＭ ＮａＣｌの１０ＣＶ直線塩勾配で産生物を溶出させる。溶出ピークを０．１ＣＶ又は０．２５ＣＶフラクションで集め、分析プールをＣＺＥにより分析すると、所望エリスロポエチンアイソフォームを含む正しいフラクションプールであることが分かった。ＡＥＸプールは一般に高グリコシル化及びシアリル化アイソフォームが溶出する後半の溶出ピークから構成される。

工程管理としてキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を使用することにより、原料が高シアリル化アイソフォームを少数しか含まない場合であっても発酵条件又は宿主システムの相違によりエリスロポエチンアイソフォームの厳密に定義された混合物を産生することが可能である。

ＣＺＥは異なる電荷のアイソフォームを分離することが可能な高分解法である。この方法は各フラクションで全単アイソフォームの定量的結果が得られる。この情報からバッチ間の一致アイソフォームプロフィルを示す特異的フラクションをプールすることができる。一般に、後期溶出フラクションのみをプールすることにより、初期に溶出する低シアリル化アイソフォームを除外する。

サイズ排除クロマトグラフィー
最終クロマトグラフィー段階では、ＡＥＸプールをサイズ排除により精製し、潜在的ダイマー以上の凝集体を除去し、最終処方に合わせた緩衝液交換を実施する。この段階で使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）はカラム容量の１５％までの高ロード容量でも分解能が良好である。好適ベッド高は６０〜８０ｃｍである。

ＡＥＸプールで高い産生物濃度に達するように前段階のＡＥＸクロマトグラフィーを行うことはできないので、ゲル濾過の前にプールを濃縮する必要がある。これは１０ｋＤａ ＵＦ膜を使用する限外濾過段階により実施され、エリスロポエチン約１０ｍｇ／ｍＬを含有する約１０倍濃縮ＵＦ保持液が得られる。

２０ｍＭ リン酸Ｎａ ｐＨ７．０，７５ｍＭＮａＣｌで予め平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムに約３〜７ＣＶ％のＵＦ保持液を直接ロードする。約１〜１．５ＣＶ後に産生物はカラムから溶出し始め、溶出ピークを集めてＳＥＣプールを得る。

ナノ濾過
潜在的ウイルスロードを除去するために、デッドエンド（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）ウイルス濾過段階を実施する。この濾過はＰｌａｎｏｖａ １５Ｎ（Ａｓａｈｉ）等の１５ｎｍ程度の小粒子を除去するように設計された特殊膜で実施される。デッドエンドナノ濾過装置はＰＡＬＬ Ｕｌｔｉｐｏｒ ＶＦ Ｇｒａｄｅ ＤＶ２０又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰカートリッジもしくはカプセルである。特にエンベロープをもたない小ウイルス（例えばパルボウイルス）には他のウイルス除去又は不活化ツールは殆どない。

適当な膜を備えるデッドエンドフィルターに滅菌濾過ＳＥＣ−プールを通し、濾液を最終バルク薬剤とする。あるいは、ＵＦ濃縮とサイズ排除クロマトグラフィーの間にナノ濾過を挿入することもできる。

本明細書に引用した全刊行物は参照として本明細書に組込む。記載した本発明の方法とシステムの各種変更及び変形も本発明の範囲と趣旨から逸脱しない限りにおいて当業者に自明である。以上、特定好適態様について本発明を記載したが、当然のことながら特許請求の範囲に記載する発明はこのような特定態様に不当に限定されない。実際に、記載した本発明の実施態様の種々の変形が分子生物学又は関連分野の当業者に自明であり、特許請求の範囲に記載する範囲に含むものとする。

Claims (14)

1. （ａ）（ｉ）ヒトエリスロポエチンをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドをコードし、宿主細胞をメトトレキセートと接触させると増幅される第２のヌクレオチド配列とを含む第１のポリヌクレオチドベクターと、
   （ｂ）第２のヌクレオチド配列がネオマイシン又はネオマイシン群の別の抗生物質に対する耐性をコードする第３のヌクレオチド配列で置換されている以外は第１のポリヌクレオチドベクターと本質的に同一のヌクレオチド配列をもつ第２のポリヌクレオチドベクターを真核宿主細胞に導入することを含み、
   第１のポリヌクレオチドベクターと第２のポリヌクレオチドベクターは宿主細胞のゲノムに組込まれている、ヒトエリスロポエチンを発現する形質転換真核宿主細胞の生産方法。
2. 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項１に記載の方法。
3. （ａ）（ｉ）ヒトエリスロポエチンをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドをコードし、宿主細胞をメトトレキセートと接触させると増幅される第２のヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドベクターと、
   （ｂ）第２のヌクレオチド配列がネオマイシン又はネオマイシン群の別の抗生物質に対する耐性をコードする第３のヌクレオチド配列で置換されている以外は第１のポリヌクレオチドベクターと本質的に同一のヌクレオチド配列をもつ第２のポリヌクレオチドベクターを１個以上の染色体に組込んでなる形質転換真核宿主細胞。
4. ＣＨＯ細胞である請求項３に記載の宿主細胞。
5. 第１のヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で請求項３から４のいずれか一項に記載の形質転換宿主細胞を培養することを含む、ヒトエリスロポエチンの生産方法。
6. 第２のヌクレオチド配列の増幅を誘導する選択物質の存在下に宿主細胞を培養する請求項５に記載の方法。
7. 発現されたヒトエリスロポエチンを培地に分泌させる請求項５に記載の方法。
8. 発現されたヒトエリスロポエチンを培地から回収することを更に含む請求項７に記載の方法。
9. （ａ）ジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドとヒトエリスロポエチンをコードするポリヌクレオチド配列と、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列と異なる、ヒトエリスロポエチンとネオマイシン又はネオマイシン群の別の抗生物質に対する耐性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を１個以上の染色体に安定的に組込んでなる形質転換哺乳動物宿主細胞。
10. ヒトエリスロポエチンをコードするポリヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養することを含む、組換えヒトエリスロポエチンの生産方法。
11. メトトレキセートの存在下に宿主細胞を培養する請求項１０に記載の方法。
12. 発現されたヒトエリスロポエチンを培地に分泌させる請求項１０に記載の方法。
13. 発現されたヒトエリスロポエチンを培地から回収することを更に含む請求項１２に記載の方法。
14. （ａ）（ｉ）ヒトエリスロポエチンをコードする第１のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列であって、宿主細胞ゲノムに組込まれている場合に、ヌクレオチド配列の増幅を誘導するメトトレキセートと宿主細胞を接触させると増幅される第２のヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドベクターと、
    （ｂ）第２のヌクレオチド配列がネオマイシン又はネオマイシン群の別の抗生物質に対する耐性をコードする第３のヌクレオチド配列で置換されている以外は第１のポリヌクレオチドベクターと本質的に同一のヌクレオチド配列をもつ第２のポリヌクレオチドベクターを含む組成物。