KR101280704B1 - 다수의 핵산으로부터의 단백질 발현 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CHO 세포에서 분비되는 이종 면역글로불린을 재조합적으로 제조하는 방법으로서, 하기 단계 i) 내지 v)를 포함하는 방법을 개시한다:
i) 현탁 배양물 중에서 생장하도록 적응되고, 혈청-무함유 배지 중에서 생장하도록 적응되고, 마이코플라즈마 및 바이러스를 함유하지 않는 CHO 세포를 제공하는 단계;
ii) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열, 및 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계;
iii) 상기 제공된 CHO 세포를, 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는 방법으로 형질감염시키는 단계:
a) 상기 CHO 세포를, 제1 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산을 포함하는 상기 벡터로 형질감염시키는 단계,
b) CHO 세포를, 상기 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 생장시킴으로써 선별하는 단계,
c) 선별된 CHO 세포를, 제1 진핵 선별제와 상이한 제2 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산을 포함하는 상기 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
d) CHO 세포를, 제1 진핵 선별제 및 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계;
iv) 형질감염된 CHO 세포를, 상기 제2 핵산 및/또는 제3 핵산의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 제1 진핵 선별제 및 상기 제2 진핵 선별제의 존재 하에서 배지 중에서 배양하는 단계; 및
v) 분비된 이종 면역글로불린을 배양 배지로부터 회수하는 단계.

Description

다수의 핵산으로부터의 단백질 발현{PROTEIN EXPRESSION FROM MULTIPLE NUCLEIC ACIDS}
본 발명은 폴리펩티드 제조 분야에 관한 것이다. 보다 정확하게는, 본 발명은 원하는 면역글로불린에 대한 발현 카세트를 각각 포함하는 여러 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시켜 상기 포유동물에서 면역글로불린을 제조하는 방법에 관한 것이다.
재조합 폴리펩티드의 제조를 위한 발효 시스템은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Marino, M. H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159)에 기재되어 있다. 약학 분야에서 사용되는 폴리펩티드는 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, SP2/O 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6(등록상표) 세포 등에서 제조된다. 발현 플라스미드의 필수 요소는 원핵세포의 복제 기점 및 원핵세포의 선별 마커를 포함하는 원핵 플라스미드 증식 유니트, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)용 원핵 플라스미드 증식 유니트; 진핵세포 선별 마커; 및 프로모터, 구조 유전자 및 전사 종결요소(폴리아데닐화 신호를 포함함)를 각각 포함하는, 원하는 구조 유전자의 발현을 위한 1개 이상의 발현 카세트이다. 포유동물 세포에서의 일시적인 발현을 위해, 포유동물의 복제 기점, 예컨대, SV40 Ori 또는 OriP가 포함될 수 있다. 프로모터로는 구조성(constitutive) 프로모터 또는 유도성(inducible) 프로모터가 선택될 수 있다. 최적화된 전사를 위해, 코작(Kozak) 서열이 5' 비번역 영역에 포함될 수 있다. mRNA 프로세싱, 특히 mRNA 스플라이싱 및 전사 종결을 위해서는, 구조 유전자의 조직화(엑손/인트론 조직화)에 따라 mRNA 스플라이싱 신호 및 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다.
유전자의 발현은 일시적 발현 또는 영구적 발현으로서 수행한다. 원하는 폴리펩티드는 일반적으로 분비되는 폴리펩티드이므로, 세포벽을 통해 세포외 배지로 분비되는 폴리펩티드의 수송/분비에 필요한 N-말단 연장부(신호 서열로도 공지되어 있음)를 함유한다. 일반적으로, 신호 서열은 분비되는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자로부터 유래될 수 있다. 이종 신호 서열이 사용되는 경우, 바람직하게는 상기 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 가공되는(즉, 신호 펩티데이즈에 의해 절단되는) 신호 서열이다 효모에서의 분비를 위해, 발현시킬 이종 유전자의 천연 신호 서열을, 분비되는 유전자로부터 유래된 동종 효모 신호 서열, 예컨대, 효모 인버테이즈(invertase) 신호 서열, 알파-인자 리더(사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia) 및 한세뉼라(Hansenula) α-인자 리더(미국 특허 제5,010,182호에서 두 번째로 기재됨)를 포함함), 산 포스파테이즈 신호 서열, 또는 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀레이즈 신호 서열(유럽 특허 제0 362 179호)로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 다른 포유동물 신호 서열, 예컨대, 인간 또는 뮤린-유래의 면역글로불린의 경우 동일한 또는 관련된 종의 분비되는 폴리펩티드로부터 유래된 신호 서열이 적합할 수 있고 바이러스 분비 신호 서열, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 당단백질 D 신호 서열도 적합할 수 있지만 원하는 단백질의 천연 신호 서열이 만족스럽다. 이러한 예비분절을 코딩하는 DNA 단편은 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편에 인 프레임으로 라이게이션된다.
오늘날, CHO 세포는 실험실에서의 소규모 또는 생산 공정에서의 대규모로 약학적 폴리펩티드를 발현시키는 데 널리 사용된다. CHO 세포의 넓은 분포 및 용도로 인해, CHO 세포의 특징적인 성질 및 유전적 배경이 잘 공지되어 있다. 따라서, CHO 세포는 인간에게 적용될 치료 단백질의 제조를 위해 규제 관청에 의해 승인받았다.
유럽 특허 제0 569 678호에는 종양 전이의 면역예방용 세포 백신으로서 MHC 유전자의 이중 형질감염체가 보고되어 잇다. 국제 특허출원 공개 제WO 97/08342호에는 레포터 유전자를 사용하여 포유동물 세포에서 프로모터 서열의 활성을 측정하는 개선된 방법이 보고되어 있다. RhoA 또는 RhoC 합성을 특이적으로 억제하기 위한 항-RhoA 및 항-RhoC siRNA의 용도는 국제 특허출원 공개 제WO 2005/113770호에 보고되어 있다. 효모 세포에서 진핵 알칼리성 포스파테이즈 돌연변이체를 재조합적으로 제조하거나 발현하는 방법은 미국 특허 제7,202,072호에 기재되어 있다. 국제 특허출원 공개 제WO 2001/038557호에는 형광 단백질의 바이시스트론닉(bicistronic) 발현을 이용하여 다중 형질전환된 세포를 스크리닝하는 방법이 기재되어 있다. 원하는 다수의 단백질 또는 RNA를 발현하는 재조합 진핵 세포주를 제조하는 방법은 국제 특허출원 공개 제WO 1999/47647호에 기재되어 있다. 코딩된 담체를 사용하여 형질감염 물질로 세포를 형질감염시키는 방법, 조성물 및 키트를 포함하는 시스템은 국제 특허출원 공개 제WO 2003/076588호에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,089,397호에는 인간 메탈로티오네인-II 프로모터의 조절 하에 놓인 원하는 단백질 코딩 서열을 가진 DNA 서열로 형질전환된 CHO 세포를 포함하는, 원하는 단백질의 재조합 제조용 발현 시스템이 보고되어 있다. 재조합 단백질의 제조 방법은 미국 특허출원 공개 제2003/0040047호에 보고되어 있다. 문헌(Lamango, N. S., et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 238-250)에는 전구호르몬 전환효소(convertase) 2의 제조가 뉴로엔도크린 폴리펩티드 7B2의 존재에 의존함이 보고되어 잇다. 불완전한 복제 BPV-1 게놈을 보유하는 세포 내로의 BPV-1-기재 발현 벡터의 형질감염은 문헌(Waldenstroem, M., et al., Gene 120 ( 1992) 175-181)에 기재되어 있다. 미국 특허 제4,912,038호에는 개 및 인간 32K 폐포 계면활성제 단백질을 수득하는 방법 및 벡터가 보고되어 있다. 국제 특허출원 공개 제WO 89/10959호에는 재조합 DNA 기법, 및 유전적으로 개조된 진핵 세포에서의 포유동물 폴리펩티드의 발현이 보고되어 있다. 인간 성장 호르몬용 발현 벡터 및 선별 마커 유전자용 발현 벡터의 동시-전달은 DD 287531에 기재되어 있다.
본 발명의 제1 양태는, CHO 세포에서 배양 배지로 분비되는 이종 면역글로불린을 재조합적으로 제조하는 방법으로서, 하기 단계 a) 내지 e)를 포함하는 방법이다:
a) 현탁 배양물 중에서 생장하도록 적응되고, 혈청-무함유 배지 중에서 생장하도록 적응되고, 마이코플라즈마를 함유하지 않으며, 임의적으로 바이러스를 함유하지 않는 CHO 세포를 제공하는 단계;
b) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 및/또는 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하고, 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산 및/또는 상기 제3 핵산을 포함하는 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제1 형질감염 벡터를 제공하고, 상기 제1 형질감염 벡터에 포함된 상기 제공된 핵산에서와 동일한 제1 핵산 및 제2 핵산 및/또는 제3 핵산을 포함하는 상기 제공된 핵산, 및 상기 제1 진핵 선별제와 상이한 제2 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하고 상기 제1 형질감염 벡터 내의 추가의 핵산 서열과 상이한 추가의 핵산 서열을 포함하는 제2 형질감염 벡터를 제공하는 단계;
c) 상기 제공된 CHO 세포를 형질감염시키고 형질감염된 CHO 세포를 단계 b)의 형질감염 벡터로 선별하는 단계로서, 상기 형질감염 및 선별이 하기 단계 (i) 내지 (iv)를 하기 순서대로 포함하는, 단계:
(i) 상기 CHO 세포를 상기 제1 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계,
(ii) 상기 (i)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 상기 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
(iii) 단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포를 상기 제2 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
(iv) 단계 (iii)에서 형질감염된 CHO 세포를, 상기 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 상기 제1 진핵 선별제 및 상기 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 상기 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계;
d) 단계 c)의 형질감염되고 선별된 CHO 세포를, 상기 제2 핵산 및/또는 제3 핵산의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 제1 진핵 선별제 및 상기 제2 진핵 선별제를 함유하는 배지 중에서 배양하는 단계; 및
e) 배양 배지로 분비된 이종 면역글로불린을 상기 배양 배지로부터 회수하여 CHO 세포에서 이종 면역글로불린을 제조하는 단계.
본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 상기 CHO 세포는 CHO-K1 세포, CHO DG44 세포, CHO XL99 세포, CHO DXB11 세포 또는 CHO DP12 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 핵산 및 상기 제3 핵산의 전사에 사용되는 프로모터는 상기 추가의 핵산의 전사에 사용되는 프로모터와 상이하다. 추가 실시양태에서, 상기 제2 핵산의 전사에 사용되는 프로모터와 상기 제3 핵산의 전사에 사용되는 프로모터가 동일하다. 한 실시양태에서, 상기 제2 핵산 및 제3 핵산의 전사에 사용되는 프로모터는 CMV 프로모터이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 추가의 핵산의 전사에 사용되는 프로모터는 SV40 프로모터이다. 한 실시양태에서, 상기 이종 면역글로불린은 항-Aβ 항체이다. 항-Aβ 항체의 예는 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 2003/070760호에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 단계 c)의 단계 (ii) 및/또는 (iv)에서 형질감염된 CHO 세포의 선별은 선별제를 함유하지 않은 배양 배지 중에서 10 내지 72시간 동안 생장시킨 후 단계 (ii)의 경우 상기 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지, 또는 단계 (iv)의 경우 상기 제1 진핵 선별제 및 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 달성된다.
추가 실시양태에서, 상기 제2 핵산 및 제3 핵산의 코돈 사용은 CHO 세포 내에서의 번역을 위해 최적화된다. 한 실시양태에서, 상기 제2 핵산 및/또는 제3 핵산은 인트론 핵산 서열을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 형질감염 벡터 및 상기 제2 형질감염 벡터는 상기 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 즉 상기 추가의 핵산에서만 서로 상이하고 핵산 서열을 기초로 할 때 95% 이상 동일함을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 형질감염 벡터는 제1 진핵 선별제, 제2 진핵 선별제 및 제3 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산에서만 서로 상이하다.
한 실시양태에서, 상기 방법은
단계 b) 후에 하기 단계 b1)을 추가로 포함하고:
b1) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 및/또는 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하고, 제1 형질감염 벡터 및 제2 형질감염 벡터에 포함된 상기 제공된 핵산에서와 동일한 제1 핵산 및 제2 핵산 및/또는 제3 핵산을 포함하는 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제 및 제2 진핵 선별제와 상이한 제3 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하고 상기 제1 형질감염 벡터 및 제2 형질감염 벡터 내의 추가의 핵산 서열과 상이한 추가의 핵산 서열을 포함하는 제3 형질감염 벡터를 제공하는 단계;
단계 c)의 단계 (iv) 후에 하기 단계 (v) 및 (vi)을 추가로 포함하며:
(v) 단계 (iv)에서 선별된 상기 CHO 세포를 상기 제3 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
(vi) 단계 (v)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제, 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제2 진핵 선별제, 및 제3 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제3 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계;
단계 d)에서 상기 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 데 사용되는 배지는 상기 제1 진핵 선별제, 제2 진핵 선별제 및 제3 진핵 선별제를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 c)의 단계 (vi)에서 형질감염된 CHO 세포의 선별은 선별제를 함유하지 않은 배양 배지 중에서 10 내지 72시간 동안 생장시킨 후 상기 제1 진핵 선별제, 제2 진핵 선별제 및 제3 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 달성된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 추가 단계인 단계 f)를 포함한다:
f) 단계 e)의 상기 재조합적으로 제조되고 회수된 이종 면역글로불린을 1개 이상의 크로마토그래피 단계로 정제하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 단계 c) 및 d)는 동일한 배지 중에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 배지는 혈청-무함유 배지, 정의된 동물-유래의 성분으로 보충된 혈청-무함유 배지, 동물-유래의 성분-무함유 배지, 단백질-무함유 배지, 화학적으로 정의된 배지 또는 정의된 단백질-무함유 배지이다. 추가 실시양태에서, 상기 단계 d)에서 배양은 500 ℓ 미만의 부피로 상기 진핵 선별제의 존재 하에서 수행되고, 상기 배양은 500 ℓ 이상의 부피로 상기 진핵 선별제의 부재 하에서의 수행되며, 이때 상기 분비되는 이종 면역글로불린은 상기 진핵 선별제 없이 배양 배지로부터 회수된다. 추가 실시양태에서, 상기 단계 d)에서의 배양은 미리 설정된 최종 배양 부피까지 배양 부피를 증가시키면서 순차적 배양을 수행함을 포함하고, 이때 상기 순차적 배양은 최종 배양의 배양 부피의 1%(부피/부피) 이하의 배양 부피로 상기 진핵 선별제의 존재 하에서 수행하고, 최종 배양의 배양 부피의 1%(부피/부피) 초과의 배양 부피로 상기 진핵 선별제의 부재 하에서 수행한다.
40 세대 후 상기 CHO 세포의 생산성은 한 실시양태에서 10 세대 동안 분할-회분(split-batch) 배양된 후 생산성의 70% 미만 내지 130% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 60 세대 후 CHO 세포의 생산성은 10 세대 동안 분할-회분 배양된 후 생산성의 50% 미만 내지 150% 이하이다. 추가 실시양태에서, CHO 세포의 생산성은 유가-회분(fed-batch) 배양된 지 21일 이내에 1.5 g/ℓ 이상의 이종 면역글로불린이 생성되는 수준이다.
본 발명의 제2 양태는 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는 방법에 의해 수득된 CHO 세포이다:
a) 현탁 배양물 중에서 생장하도록 적응되고, 혈청-무함유 배지 중에서 생장하도록 적응되고, 마이코플라즈마를 함유하지 않으며, 임의적으로 바이러스를 함유하지 않는 CHO 세포를 제공하는 단계;
b) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 및/또는 iv) 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하고, 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산 및/또는 상기 제3 핵산을 포함하는 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제1 형질감염 벡터를 제공하고, 상기 제1 형질감염 벡터에 포함된 상기 제공된 핵산에서와 동일한 제1 핵산 및 제2 핵산 및/또는 제3 핵산, 및 상기 제1 진핵 선별제와 상이한 제2 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하고 상기 제1 형질감염 벡터 내의 추가의 핵산 서열과 상이한 추가의 핵산 서열을 포함하는 제2 형질감염 벡터를 제공하는 단계; 및
c) 상기 CHO 세포를, 하기 단계 (i) 내지 (iv)를 하기 순서대로 포함하는 방법으로 형질감염시키는 단계:
(i) 상기 CHO 세포를 상기 제1 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계,
(ii) 상기 (i)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
(iii) 단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포를 제2 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
(iv) 단계 (iii)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제 및 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계.
[도 1]
플라스미드 p5128의 해석된 플라스미드 맵.
[도 2]
플라스미드 p5137의 해석된 플라스미드 맵.
[도 3]
플라스미드 p5151의 해석된 플라스미드 맵.
[도 4]
플라스미드 p5057의 해석된 플라스미드 맵.
[도 5]
플라스미드 p5069의 해석된 플라스미드 맵.
[도 6]
(A) 제한 희석을 이용하여 서브클로닝한 후 수득된 클론의 항체 역가, 및 본 발명에 따른 방법을 이용하여 수득한 클론의 항체 역가. X-축: (1) G24, (2) 제한 희석, (3) 본 발명에 따른 방법; Y-축: 면역글로불린 농도[㎍/㎖]. (B) 제한 희석을 이용하여 서브클로닝한 후 수득된 클론의 비생산속도(specific production rate), 및 본 발명에 따른 방법을 이용하여 수득한 클론의 비생산속도; X-축: (1) G24, (2) 제한 희석, (3) 본 발명에 따른 방법; Y-축: 비생산속도[pg/(세포*d)].
[도 7]
항체의 단백질-A HPLC 정제 후 SDS-PAGE. 4종의 샘플 35-45, 37-65, 39-4 및 43-16에 대해 2개의 밴드가 보이고, 상부 밴드는 중쇄이며, 하부 밴드는 경쇄이다. 샘플 25g7은 항체-관련된 부산물(상기 중쇄 및 중쇄와 경쇄 사이)을 가진 대조군 항체이다. 샘플: (1) 분자량 마커, (2) 35-45, (3) 37-65, (4) 39-4, (5) 43-16, (6) 25g7, (7) 기준 항체, (8) 배지 25x.
[도 8]
플라스미드 p6311의 해석된 플라스미드 맵.
[도 9]
플라스미드 p5321의 해석된 플라스미드 맵.
본 발명을 실시하는 데 유용한 방법 및 기법은 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 이의 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann (ed), Elsevier Science Publishing Company, Chromatography 5th ed 51A, 1992); 문헌(Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)); 문헌(Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)); 문헌(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)); 문헌(Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); 또는 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York)을 참조한다.
재조합적으로 재조된 이종 면역글로불린의 정제를 위해, 종종 다양한 컬럼 크로마토그래피 단계의 조합이 이용된다. 일반적으로, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수행한 후, 1 또는 2개의 추가 크로마토그래피 분리 단계를 수행한다. 최종 정제 단계는 미량의 불순물 및 오염물, 예컨대, 응집된 면역글로불린, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스, 및/또는 내독소의 제거를 위한 소위 "연마 단계"이다. 이 연마 단계 후, 종종 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 관통 유동 모드로 사용된다.
다양한 단백질 정제 및 회수 방법, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 모드 이온 교환), 티오친화성 흡착(예를 들어, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용하는 흡착), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용하는 크로마토그래피), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들어, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용하는 크로마토그래피), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 공지되어 있고 널리 이용되고 있다(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 핵산에 의해 직접적으로 코딩될 수 있거나 전구체 형태로 코딩될 수 있는 카복시 α-아미노산으로 구성된 군을 지칭한다. 개개의 아미노산은 소위 코돈 또는 염기-삼중체로 지칭되는 3개의 뉴클레오티드로 구성된 핵산에 의해 코딩된다. 각각의 아미노산은 1개 이상의 코돈에 의해 코딩된다. 상이한 코돈에 의한 동일한 아미노산의 코딩은 "유전적 코드의 축퇴"로서 공지되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 천연 발생 카복시 α-아미노산을 의미하고 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글라이신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "핵산" 또는 "핵산 서열" 은 개개의 뉴클레오티드(염기로도 지칭됨) a, c, g 및 t(RNA의 경우 u)로 구성된 중합체성 분자, 예를 들어, DNA, RNA 또는 이들의 변이체를 지칭한다. 이 폴리펩티드 분자는 천연 발생 폴리뉴클레오티드 분자, 합성 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 1개 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 분자와 1개 이상의 천연 폴리뉴클레오티드 분자의 조합물일 수 있다. 상기 정의는 1개 이상의 뉴클레오티드가 (예를 들어, 돌연변이유발에 의해) 변경되거나, 결실되거나 또는 부가되어 있는 천연 발생 폴리뉴클레오티드 분자도 포함한다. 핵산은 단리된 상태일 수 있거나, 또 다른 핵산, 예를 들어, 발현 카세트, 플라스미드 또는 숙주 세포의 염색체 내에 삽입된 상태일 수 있다. 핵산은 개개의 뉴클레오티드로 구성된 그의 핵산 서열을 특징으로 한다.
예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열을, 이 아미노산 서열을 코딩하는 상응하는 핵산 서열로 전환시키는 절차 및 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 따라서, 핵산은 개개의 뉴클레오티드로 구성된 그의 핵산 서열뿐만 아니라 상기 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 특징으로 한다.
"폴리펩티드"는 천연적으로 제조되든 아니면 합성적으로 제조되는 관계없이 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기로 구성된 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있는 반면, 100개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드 쇄를 하나 이상 포함하는 폴리펩티드는 "단백질"로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 비-아미노산 성분, 예컨대, 탄수화물 기, 금속 이온 또는 카복실산 에스터도 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 단백질을 발현하는 세포에 의해 부가될 수 있고, 세포의 종류에 따라 다를 수 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 골격 구조 또는 그를 코딩하는 핵산 면에서 본원에 정의된다. 탄수화물 기와 같은 추가 기는 일반적으로 명시되어 있지 않지만 존재할 수는 있다.
용어 "면역글로불린"은 완전한 면역글로불린 및 면역글로불린 접합체를 포함하는 다양한 형태의 면역글로불린 구조체를 포괄한다. 본 발명에서 사용되는 면역글로불린은 바람직하게는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 T 세포 항원 고갈 항체이다(예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 98/33523호, 제WO 98/52976호 및 제WO 00/34317호 참조). 항체의 유전적 개조는 예를 들어, 문헌(Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855); 미국 특허 제5,202,238호 및 제5,204,244호; 문헌(Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327); 문헌(Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270); 및 문헌(Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125)에 기재되어 있다. 면역글로불린은 예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일쇄(scFv) 또는 다이아바디도 포함하는 다양한 포맷으로 존재할 수 있다[예를 들어, 문헌(Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426) 및 일반적으로 문헌(Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984) and Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16) 참조].
용어 "완전한 면역글로불린"은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 면역글로불린을 의미한다. 완전한 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 각각은 항원과 상호작용할 수 있는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인(가변 영역)(일반적으로 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 완전한 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 각각은 불변 영역(일반적으로 카복실 말단 부분)을 포함한다. 중쇄의 불변 영역은 항체와 i) Fc 감마 수용체(FcγR)를 보유하는 세포, 예컨대, 식균 세포, 또는 ii) 브람벨(Brambell) 수용체로도 공지되어 있는 선천성 Fc 수용체(FcRn)를 보유하는 세포의 결합을 매개한다. 또한, 상기 불변 영역은 고전적 보체 시스템의 인자, 예컨대, 성분(C1q)을 포함하는 몇몇 인자에의 결합을 매개한다. 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 다양한 분절, 즉 4개의 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(CDR)을 포함한다.
"면역글로불린 접합체"는 펩티드 결합을 통해 다른 폴리펩티드에 접합된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 다른 폴리펩티드는 비-면역글로불린 펩티드, 예컨대, 호르몬, 성장 수용체, 항융합원성 펩티드 또는 보체 인자 등이다. 예시적 면역글로불린 접합체는 국제 특허출원 공개 제WO 2007/045463호에 기재되어 있다.
용어 "이종 면역글로불린"은 포유동물 세포 또는 숙주 세포에 의해 천연적으로 생성되지 않는 면역글로불린을 지칭한다. 본 발명에 다른 방법에 의해 생성된 면역글로불린은 재조합적 방법에 의해 생성된다. 이러한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 진핵 세포 내에서의 단백질 발현 후 이종 면역글로불린의 회수 및 단리, 및 약학적으로 허용가능한 순도까지의 통상적인 정제를 포함한다. 면역글로불린의 제조, 즉 발현을 위해, 경쇄를 코딩하는 핵산 및 중쇄를 코딩하는 핵산을 표준 방법으로 발현 카세트 내로 각각 삽입한다. 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 핵산 및 면역글로불린 중쇄를 코딩하는 핵산은 통상적인 방법을 이용하여 용이하게 단리하고 시퀀싱한다. 하이브리도마 세포는 이러한 핵산의 공급원으로서 사용될 수 있다. 발현 카세트를 발현 플라스미드 내로 삽입한 후, 상기 발현 플라스미드를 면역글로불린을 천연적으로 생성하지 않는 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 발현은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행하고, 면역글로불린은 용해 후 세포로부터 회수하거나 배양물 상청액으로부터 회수한다.
"단리된 폴리펩티드"는 세포 성분들, 예컨대, 탄수화물, 지질, 또는 천연 상태에서 폴리펩티드와 관련되어 있는 단백질성 불순물을 실질적으로 갖지 않는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 단리된 폴리펩티드 제제는 폴리펩티드를 고도로 정제된 형태로, 즉 약 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 95%보다 높은 순도, 또는 99%보다 높은 순도로 함유한다. 특정 단백질 제제가 단리된 폴리펩티드를 함유함을 입증하는 한 방법은 단백질 제제의 SDS-PAGE 및 겔의 코마시에 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 후 단일 밴드가 나타나는 지를 확인하는 것이다. 그러나, 용어 "단리된"은 동일한 폴리펩티드가 다른 물리적 형태, 예컨대, 이량체 또는 글리코실화된 또는 유도체화된 형태로 존재하는 것을 배제하지 않는다.
"이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩티드"는 소정의 숙주 세포 내에서 천연적으로 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩티드, 또는 DNA 분자 집단 또는 폴리펩티드 집단을 지칭한다. 특정 숙주 세포에 대해 이종성을 갖는 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외래 DNA)와 조합되어 있는 한, 숙주 세포 종으로부터 유래된 DNA(즉, 내재 DNA)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 분절에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 비-숙주 DNA 분절을 포함하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자인 것으로 간주된다. 역으로, 이종 DNA 분자는 외래 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 내재 구조 유전자를 포함할 수 있다.
비-숙주 DNA 분자에 의해 코딩된 펩티드 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 핵산, 예를 들어, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염될 수 있거나 형질감염된 세포를 지칭한다. 용어 "세포"는 플라스미드의 증식에 사용되는 원핵 세포, 및 핵산의 발현 및 코딩된 폴리펩티드의 제조에 사용되는 진핵 세포 둘다를 포함한다. 한 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포, 바람직하게는 CHO-K1 세포(ATCC CCL-61 또는 DSM ACC 110), CHO DG44 세포(CHO-DHFRH DSM ACC 126으로도 공지되어 있음), CHO XL99 세포, CHO-T 세포(예를 들어, 문헌(Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963) 참조), CHO-S 세포, 또는 수퍼-CHO 세포(Pak, S. C. O., et al. Cytotechnology. 22 (1996) 139-146)이다. 이 세포들이 혈청-무함유 배지 또는 현탁액 중에서 생장하도록 적응되지 않은 경우, 본 방법에서 사용되기 전에 적응 단계를 수행해야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 대상 세포 및 이의 자손 세포를 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 형질전환 또는 하위배양의 횟수와 관계없이 1차 대상 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 모든 자손세포가 의도적 또는 우발적 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 나타내는 변이체 자손세포도 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "발현"은 세포, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포 내에서 일어나는 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 세포 내에서의 원하는 핵산 서열의 전사 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기초로 하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 원하는 서열로부터 전사된 mRNA는 PCR 또는 노던 혼성화에 의해 정량될 수 있다[상기 샘브룩(Sambrook)의 문헌(1989) 참조]. 원하는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 다양한 방법, 예를 들어, ELISA, 단백질의 생물학적 활성 분석, 또는 상기 활성과 무관한 분석, 예컨대, 폴리펩티드를 인식하여 결합하는 면역글로불린을 사용한 웨스턴 블롯팅 또는 방사선면역분석의 이용에 의해 정량될 수 있다[상기 샘브룩(Sambrook)의 문헌(1989) 참조].
"발현 카세트"는 세포 내에서 적어도 함유된 핵산을 발현하는 데 필요한 조절 요소, 예컨대, 프로모터 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 구축물을 지칭한다.
"형질감염 벡터"는 숙주 세포 내에서 형질감염 벡터 내에 포함된 코딩 핵산/구조 유전자의 발현에 필요한 모든 요소들을 제공하는 핵산(핵산 분자로도 지칭됨)이다. 형질감염 벡터는 원핵 복제 기점 및 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함하는 원핵 플라스미드 증식 유니트, 예를 들어, 이. 콜라이용 플라스미드 증식 유니트를 포함하고, 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 1개 이상의 핵산 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현 카세트 내에 각각 배치함으로써, 각각의 발현 카세트가 프로모터, 코딩 핵산, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결요소를 포함한다. 유전자 발현은 통상적으로 프로모터의 조절 하에 배치하는데, 이때 구조 유전자는 상기 프로모터"에 작동가능하게 연결되어" 있다고 기재된다. 유사하게, 조절 요소와 코어 프로모터는 상기 조절 요소가 상기 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동가능하게 연결되어 있다.
"프로모터"는 이것에 작동가능하게 연결되어 있는 유전자/구조 유전자 또는 핵산의 전사를 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시를 위한 신호를 포함한다. 사용되는 프로모터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현이 예상되는 세포 유형의 숙주 세포 내에서 기능을 발휘할 것이다. 다양한 여러 공급원으로부터의 구성적(constitutive) 프로모터, 유도적(inducible) 프로모터 및 억제적(repressible) 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터가 당업계에 잘 공지되어 있고(진뱅크(BenBank)와 같은 데이터베이스에서 확인할 수도 있음), (예를 들어, ATCC와 같은 기탁기관 및 다른 시판 또는 개별 공급처로부터) 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 요소로서 입수가능하다. "프로모터"는 예를 들어, 작동가능하게 연결된 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시 부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 또는 5'-비번역 영역 내에 위치한다. 전사의 개시에서 기능을 발휘하는 프로모터 내의 서열 요소들은 종종 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 상기 프로모터 요소들은 RNA 중합효소 결합 부위; TATA 서열; CAAT 서열; 분화-특이적 요소(DSE; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-560); CRE; 혈청 반응 요소(SRE; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58); 글루코코티코이드 반응 요소(GRE); 및 다른 전사 인자, 예컨대, CRE/ATF(O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943), AP2(Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728-25734), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264) 및 옥타머 인자[예컨대, 일반적으로 문헌(Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) 및 문헌(Lemaigre, F.P. and Rousseau, G. G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14) 참조]에 대한 결합 부위를 포함한다. 진핵 프로모터 중에서 고도 발현을 위한 강력한 프로모터로서 확인되어 있는 진핵 프로모터는 SV40 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부, 차이니스 햄스터 연장 인자 1 알파(CHEF-1; 예를 들어, 미국 특허 제5,888,809호 참조), 인간 EF-1 알파, 유비퀴틴 및 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 즉시 초기 프로모터(CMV IE)이다.
"프로모터"는 구조성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터만을 사용하였을 때 얻어지는 발현도를 증가시키기 위해 프로모터와 함께 작용하는 인핸서(enhancer)(즉, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 시스-작용 DNA 요소)가 필요할 수 있고, 상기 인핸서는 전사 조절 요소로서 포함될 수 있다. 종종, 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분절은 인핸서 서열도 포함할 것이다(예를 들어, CMV 또는 SV40).
본원에서 사용된 "인핸서"는 이것에 작동가능하게 연결되어 있는 유전자 또는 코딩 서열의 전사를 상승시키는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 배향 및 위치와 비교적 무관하고, 인트론(Banerji, J., et al., Cell, 33 (1983) 729-740)뿐만 아니라 코딩 서열 자체(Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio., 4 (1984) 1293-1305) 내에서도 전사 유니트에 대해 5' 또는 3' 위치에서 발견되어 왔다. 따라서, 인핸서는 전사 개시 부위로부터 업스트림 또는 다운스트림에 위치되어 있을 수 있거나 프로모터로부터 상당히 먼 거리에 위치되어 있을 수 있지만, 실제로 인핸서는 프로모터와 물리적으로 및 기능적으로 중첩되어 있을 수 있다. 다양한 여러 공급원으로부터의 다수의 인핸서가 당업계에 잘 공지되어 있고 (진뱅크와 같은 데이터베이스에서 확인할 수 있으며), (예를 들어, ATCC와 같은 기탁기관 및 다른 시판 또는 개별 공급처로부터) 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 요소로서 입수가능하다. 프로모터 서열(예컨대, 통상적으로 사용되는 CMV 프로모터)을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드가 인핸서 서열도 포함한다. 예를 들어, 전술된 강력한 프로모터들 모두가 강력한 인핸서도 포함할 수 있다[예를 들어, 문헌(Bendig, M.M., Genetic Engineering, 7 (Academic Press, 1988) 91-127) 참조].
"선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산"은 이 핵산을 보유하는 세포가 선별제의 존재 하에서 구체적으로 선별되게 하는 핵산이다. 이러한 핵산은 "선별 마커"로도 지칭된다. 전형적으로, 선별 마커는 숙주 세포 내에서 대사적 결함 또는 이화작용 결함에 대한 선별제(약물) 또는 보상물(compensate)에 대한 내성을 부여할 것이다. 선별 마커는 양성 선별 마커, 음성 선별 마커 또는 이작용성(bifunctional) 선별 마커일 수 있다. 유용한 양성 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 이 선별 마커는 이것으로 형질전환된 세포가 상응하는 선별제의 존재에 대해 양성적으로 선별될 수 있게 하고, 즉 예를 들어, 상응하는 항생제의 존재 하에서 선별적으로 생장될 수 있게 한다. 비-형질전환된 세포는 선별 배양 조건 하에서, 즉 배양물 중의 선별제의 존재 하에서 생장할 수 없거나 생존할 수 없을 것이다. 양성 선별 마커는 이 마커를 보유하는 세포의 선별을 가능하게 하는 반면, 음성 선별 마커는 이 마커를 보유하는 세포가 선별적으로 제거되게 한다. 진핵 세포 선별 마커는 예를 들어, 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼레이즈(APH)[선별제, 예를 들어, 하이그로마이신(hyg), 네오마이신(네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 II, neo) 및 G418에 대한 내성을 부여함]에 대한 유전자, 다이하이드로폴레이트 리덕테이즈(DHFR)(선별제인 메토트렉세이트(MTX)에 대한 내성을 부여함)에 대한 유전자, 타이미딘 카이네이즈(tk)에 대한 유전자, 글루타민 합성효소(GS)에 대한 유전자, 아스파라긴 합성효소에 대한 유전자, 트립토판 합성효소(선별제인 인돌에 대한 내성을 부여함)에 대한 유전자, 히스티다이놀 데하이드로게네이즈(선별제인 히스티다이놀 D에 대한 내성을 부여함)에 대한 유전자, 시스티딘 데아미네이즈에 대한 유전자, 에데노신 데아미네이즈에 대한 유전자, 및 퓨로마이신, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함한다. 추가 선별 마커 유전자는 국제특허출원 공개 제WO 92/08796호 및 제WO 94/28143호에 기재되어 있다. 원핵 선별 마커는 예를 들어, 베타-락타메이즈 유전자(선별제인 앰피실린에 대한 내성을 부여함)를 포함한다.
유전자의 발현은 일시적 발현 또는 영구적 발현으로서 수행한다. 원하는 폴리펩티드는 일반적으로 분비되는 폴리펩티드이므로, 세포벽을 통해 세포외 배지로 분비되는 폴리펩티드의 수송/분비에 필요한 N-말단 연장부(신호 서열로도 공지되어 있음)를 함유한다. 일반적으로, 신호 서열은 분비되는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자로부터 유래될 수 있다. 이종 신호 서열이 사용되는 경우, 바람직하게는 상기 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 가공되는(즉, 신호 펩티데이즈에 의해 절단되는) 신호 서열이다 효모에서의 분비를 위해, 발현시킬 이종 유전자의 천연 신호 서열을, 분비되는 유전자로부터 유래된 동종 효모 신호 서열, 예컨대, 효모 인버테이즈(invertase) 신호 서열, 알파-인자 리더(사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 피키아 및 한세뉼라 α-인자 리더(미국 특허 제5,010,182호에서 두 번째로 기재됨)를 포함함), 산 포스파테이즈 신호 서열, 또는 씨. 알비칸스 글루코아밀레이즈 신호 서열(유럽 특허 제0 362 179호)로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 다른 포유동물 신호 서열, 예컨대, 인간 또는 뮤린-유래의 면역글로불린의 경우 동일한 또는 관련된 종의 분비되는 폴리펩티드로부터 유래된 신호 서열이 적합할 수 있고 바이러스 분비 신호 서열, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 당단백질 D 신호 서열도 적합할 수 있지만 원하는 단백질의 천연 신호 서열이 만족스럽다. 이러한 예비분절을 코딩하는 DNA 단편은 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편에 인 프레임으로 라이게이션된다(즉, 작동가능하게 연결된다).
본 발명의 제1 양태는 분비되는 이종 면역글로불린을 CHO 세포에서 재조합적으로 제조하는 방법으로서, 하기 단계 a) 내지 e)를 포함하는 방법이다:
a) 현탁 배양물 중에서 생장하도록 적응되고, 혈청-무함유 배지 중에서 생장하도록 적응되고, 마이코플라즈마를 함유하지 않는 CHO 세포를 제공하는 단계;
b) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산, 및 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 형질감염 벡터를 제공하는 단계로서, 상기 제1 핵산 서열 내지 추가의 핵산 서열이 발현 카세트 내에 각각 함유되어 있는, 단계;
c) 상기 CHO 세포를 형질감염시키고 선별하는 단계로서, 상기 형질감염 및 선별이 하기 단계 (i) 내지 (iv)를 하기 순서대로 포함하는, 단계:
(i) 제1 핵산 서열 내지 제3 핵산 서열을 포함하고 제1 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 추가로 포함하는 형질감염 벡터로 상기 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
(ii) 상기 (i)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
(iii) 제1 핵산 서열 내지 제3 핵산 서열을 포함하고, 상기 제1 진핵 선별제와 상이한 제2 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하고 상기 단계 (i)에서 사용된 형질감염 벡터 내의 추가의 핵산 서열과 상이한 추가의 핵산 서열을 추가로 포함하는 형질감염 벡터를 사용하여, 단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포를 형질감염시키는 단계, 및
(iv) 단계 (iii)에서 형질감염된 CHO 세포를, 상기 제1 진핵 선별제 및 상기 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계;
d) 상기 단계 c)의 형질감염되고 선별된 CHO 세포를, 상기 제2 핵산 및 제3 핵산의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 제1 진핵 선별제 및 상기 제2 진핵 선별제를 함유하는 배지 중에서 배양하는 단계; 및
e) 분비된 이종 면역글로불린을 상기 배양 배지로부터 회수하여 이종 면역글로불린을 제조하는 단계.
본 발명에 따른 방법은 분비되는 이종 폴리펩티드를 대규모로, 즉 산업적 규모로 제조하는 데 적합하다. 원하는 폴리펩티드를 대규모로 제조하기 위한 세포의 배양은 일반적으로 일련의 개개의 배양으로 구성되는데, 이때 최종 배양, 즉 대규모 배양, 즉 배양 순서에서 가장 마지막 배양을 제외한 모든 배양은 일정한 세포 밀도가 배양 용기 내에서 도달될 때까지 수행된다. 예정된 세포 밀도가 도달된 경우, 전체 배양 또는 이의 분획이 이전 배양의 부피보다 1000배 이하만큼 더 큰 부피의 후속 배양 용기를 접종하는 데 사용된다. 보다 큰 부피의 하나 이상의 추가 배양을 위한 기초로서 작용하는 모든 배양은 시드 트레인(seed train) 발효로서 지칭된다. 대규모 배양, 즉 보다 큰 부피의 추가 배양을 위한 기초로서 작용하지 않는 배양("주 발효"로도 지칭됨)에서만, 배양의 종결점이 배양 배지 중의 생성된 분비된 이종 면역글로불린의 농도 또는 배양 시간에 따라 결정된다. 본원에서 사용된 용어 "대규모"는 산업적 생산 공정의 최종 배양을 의미한다. 바람직하게는, 대규모 배양은 100 ℓ 이상의 부피, 또 다른 실시양태에서는 500 ℓ 이상의 부피, 추가 실시양태에서는 1,000 ℓ 이상 내지 20,000 ℓ의 부피로 수행된다. 한 실시양태에서, 최종, 즉 대규모 배양 배지는 진핵 선별제를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 형질감염된 CHO 세포의 배양은 500 ℓ 미만의 부피로 진핵 선별제의 존재 하에서 수행되고, 형질감염된 CHO 세포의 배양은 500 ℓ 이상의 부피로 진핵 선별제의 부재 하에서 수행되며, 이종 폴리펩티드는 상기 진핵 선별제를 함유하지 않는 배양 배지로부터 회수된다. 추가 실시양태에서, 배양은 배양 부피를 최종 배양 부피가지 증가시키면서 수행하는 순차적 배양을 포함하고, 이때 배양은 최종 또는 주 배양의 배양 부피의 1%(부피/부피)의 배양 부피 이하로 진핵 선별제의 존재 하에서, 및 최종 배양의 배양 부피의 1%(부피/부피) 초과의 배양 부피로 모든 진핵 선별제의 부재 하에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 상기 배양은 배양 부피를 증가시키면서 수행하는 순차적 시드 트레인 배양을 포함하고, 이때 시드 트레인 배양은 진핵 선별제의 존재 하에서 각각 수행되고, 주 발효는 모든 진핵 선별제의 부재 하에서 수행된다. 한 실시양태에서, 상기 형질감염된 CHO 세포의 배양은 시드 트레인 발효에서 진핵 선별제의 존재 하에서 수행되고, 상기 형질감염된 CHO 세포의 배양은 주 발효에서 진핵 선별제의 부재 하에서 수행되며, 이종 폴리펩티드는 진핵 선별제를 함유하지 않는 주 배양 배지로부터 회수된다. 이 실시양태에서, 진핵 선별제는 시드 트레인 배양 과정 동안에 첨가되고 상기 CHO 세포의 생산 주기(주 발효 배양) 동안에는 첨가되지 않는다. 용어 "생산 주기"는 큰 부피로 CHO 세포를 배양하는 것, 즉 주 발효를 의미하고, 상기 주 발효 후에 생성된 이종 폴리펩티드가 회수된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 40 세대 후 CHO 세포의 생산성은 10 세대 동안 분할-회분 배양된 후 생산성의 70% 이상 내지 130% 이하이다. 한 실시양태에서, 60 세대 후 CHO 세포의 생산성은 10 세대 동안 분할-회분 배양된 후 생산성의 50% 이상 내지 150% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포의 생산성은 유가 배양된 지 21일 이내에 1.5 g/ℓ 이상의 이종 면역글로불린이 생성되는 수준이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 수득된 CHO 세포의 비생산성(specific poductivity)은 1 ㎍/106 세포/d 초과, 5 ㎍/106 세포/d 초과, 또는 10 ㎍/106 세포/d 초과이다. 한 실시양태에서, 분비되는 이종 면역글로불린은 완전하게 가공된 분비되는 이종 면역글로불린이다. 용어 "완전하게 가공된 분비되는 이종 면역글로불린"은 i) 배양 배지로 분비되고 그의 신호 서열이 절단된 면역글로불린, ii) 항원 결합 영역을 가진 면역글로불린, 및 iii) 2차적 변경, 예컨대, 부착된 사카라이드 또는 폴리사카라이드, 및/또는 정확하게 형성된 이황화 결합을 가진 면역글로불린을 지칭한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이종 면역글로불린은 항-Aβ 항체-접합체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-Aβ 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1, 2 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-Aβ 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-Aβ 항체는 서열번호 7, 8 및 9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-Aβ 항체는 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이종 면역글로불린은 항-P-셀렉틴(Selectin) 항체이다. 추가 실시양태에서, 상기 항-P-셀렉틴 항체는 서열번호 13, 14 및 15로 구성된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 항-P-셀렉틴 항체는 서열번호 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이종 면역글로불린은 항-IL-13Rα 항체이다. 추가 실시양태에서, 상기 항-IL-13Rα 항체는 서열번호 19, 20, 21, 22 및 23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 항-IL-13Rα 항체는 서열번호 24, 25, 26, 27 및 28로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이종 면역글로불린은 항-CD4 항체-접합체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항-CD4 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열번호 29, 30 및 31로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-CD4 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열번호 32, 33, 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-CD4 항체는 서열번호 35, 36 및 37로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-CD4 항체는 서열번호 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
인간에서 사용될 치료제, 즉 폴리펩티드의 대규모 제조에 사용될 수 있는 포유동물 세포는 명확한 기준을 충족시켜야 한다. 특히, 상기 포유동물 세포는 혈청-무함유 배지, 바람직하게는 비-정의된 포유동물-유래된 성분-무함유 배지 또는 정의된 포유동물-유래의 성분으로 보충된 혈청-무함유 배지 중에서 배양될 수 있어야 한다. 혈청은 다수의 화합물의 혼합물이다. 통상적으로 소 혈청이 포유동물 세포의 배양에 사용되어 왔다. 한 종으로부터 다른 종으로 전염될 수 있는 질환의 발병 문제점 때문에, 혈청 및 다른 비-정의된 포유동물-유래의 성분의 사용은 회피되어야 한다. 본원에서 사용된 용어 "비-정의된 포유동물-유래의 성분"은 포유동물, 특히 바람직하게는 소, 돼지, 양 또는 새끼양으로부터 유래된 성분을 의미하고, 이의 조성은 80%(중량/중량) 미만, 바람직하게는 90%(중량/중량) 미만만큼 특정될 수 있다. "정의된 포유동물-유래의 성분"은 포유동물, 특히 바람직하게는 소, 돼지, 양 또는 새끼양으로부터 수득된 성분이고, 이의 조성은 95%(중량/중량) 초과, 바람직하게는 98%(중량/중량) 초과, 가장 바람직하게는 99%(중량/중량) 초과만큼 특정될 수 있다. 정의된 포유동물-유래의 성분의 예는 양모로부터 유래된 콜레스테롤, 및 소젖으로부터 유래된 갈락토스이다. 한 실시양태에서, 배지는 정의된 또는 비-정의된 비-포유동물-유래의 화합물로 보충될 수 있다. 이러한 비-포유동물-유래의 화합물의 일례는 대구 간유(cod-liver oil)이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 배양에서 사용되는 배지는 혈청-무함유 배지, 정의된 포유동물-유래의 성분으로 보충된 혈청-무함유 배지, 포유동물-유래의 성분-무함유 배지, 단백질-무함유 배지, 정의된 포유동물-유래의 성분으로 보충된 단백질-무함유 배지, 화학적으로 정의된 배지, 포유동물-유래의 성분-무함유 배지, 또는 정의된 단백질-무함유 배지이다. 포유동물-유래의 성분-무함유 배지의 예는 인비트로겐 코포레이션으로부터 시판되는 CD CHO 배지, 또는 깁코로부터 시판되는 ProCHO4이다. 단백질-무함유 배지의 일례는 하이클론으로부터 시판되는 HyQ SFM4CHO이다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 제1 형질감염으로부터 시작되어 분비된 이종 면역글로불린의 회수로 종결되는 방법이 동일한 배지 중에서 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "동일한 배지 중에서"는 제1 형질감염으로부터 시작되어 배양 배지로부터 분비된 이종 면역글로불린의 회수로 종결되는 과정에서 동일한 배지가 사용됨을 의미한다. 이것은 동일한 첨가제가 모든 단계에서 배지에 첨가되어야 함, 즉 본 방법의 상이한 단계에서 배지가 상이한 첨가제로 보충될 수 있음을 의미하는 것은 아니다. 첨가제는 20%(중량/중량) 미만의 총량으로, 한 실시양태에서 15%(중량/중량) 미만의 총량으로, 또 다른 실시양태에서 10%(중량/중량) 미만의 총량으로 배지에 첨가되는 화합물이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 배지는 모든 단계에서 동일한 배지이고 분비된 이종 면역글로불린의 대규모 생산에 적합한 배지이다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 방법을 이용하여 단일 형질감염된 CHO 세포와 비교할 때 유사한 생장 특징 및 개선된 생산성을 나타내는 다중 형질감염된 CHO 세포를 수득할 수 있음을 발견하였다. 용어 "유사한 생장 특징"은 다중 형질감염된 CHO 세포가 단일 형질감염된 CHO 세포와 동일한 시간 내에 50% 이상의 세포 밀도만큼 생장함을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 다중 형질감염된 CHO 세포는 단일 형질감염된 세포와 동일한 시간 이내에 90% 이상의 세포 밀도만큼 생장한다. 추가 실시양태에서, 다중 형질감염된 시간의 배가 시간은 단일 형질감염된 세포의 배가 시간의 150% 이하이다. 한 실시양태에서, 상기 다중 형질감염된 CHO 세포는 2회 또는 3회 형질감염된 CHO 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 다중 형질감염된 세포는 배양 배지에서 개선된 부피 수율(volumetric yield)을 나타낸다. 대규모 발현 과정의 전체 생산성은 부피 수율, 즉 배양물의 단위 부피 당 폴리펩티드의 양에 의해 가장 잘 결정된다. 이 부피 수율은 세포 밀도, 각 세포의 비생산성 및 배양 시간의 각 세포 및 배양 시간의 곱이다. 따라서, 세포 밀도는 낮지만 비생산성이 높은 배양은 동일한 배양 시간 이내에 세포 밀도는 높지만 비생산성은 낮은 배양과 동일한 시간 이내에 동일한 부피 수율을 나타낼 것이다. 따라서, 다중 형질감염된 CHO 세포 및 본 발명에 따른 방법을 이용하여, 단일 형질감염된 CHO 세포에 비해 유사한 생장 특징을 보이면서 개선된 부피 수율/생산성을 나타내는 CHO 세포를 수득할 수 있다.
분비되는 이종 면역글로불린은 당업자에게 공지된 크로마토그래피 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 이종 면역글로불린을 1개 이상의 크로마토그래피 단계로 정제하는 최종 정제 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에서 사용하기에 적합한 벡터는 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산, 및/또는 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산, 및/또는 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산, 및 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산을 포함한다.
포함된 제1 핵산은 배양 배지에 첨가되는 원핵 선별제에 대한 내성을 부여한다. 예시적 원핵 선별제는 예를 들어, 앰피실린, 가나마이신, 클로르암페니콜, 테트라사이클린 또는 에리쓰로마이신이다. 본원에서 사용된 용어 "선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산" 및 이의 문법적 등가어는 상기 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 변형 또는 분해에 의해 상기 선별제를 중화시킬 수 있거나 상기 선별제의 효과에 대한 반대효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함하는 세포는 배양 배지에 존재하는 선별제의 존재 하에서 생존하고 증식할 수 있는 능력을 가진다. 예시적 진핵 선별제는 예를 들어, 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, MTX, 제네티신(등록상표)(G418), 또는 마이코페놀산이다. 선별제는 원핵 선별제 및 진핵 선별제가 금속이 아닌 한 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 따라 제공된 CHO 세포의 형질감염은 형질감염 단계 및 선별 단계를 순차적으로 수행함으로써 달성된다. 본 발명에 따른 방법에 적합한 CHO 세포는 예를 들어, CHO-K1 세포, CHO DG44 세포, CHO XL99 세포, CHO DXB11 세포, CHO DP12 세포 또는 수퍼-CHO 세포이다. 본 발명의 범위 내에서, 형질감염된 세포는 당업계에 공지된 형질감염 방법 중 실질적으로 임의의 종류의 형질감염 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 전기천공 또는 미세주입을 통해 핵산을 세포 내로 도입할 수 있다. 대안적으로, 리포펙션 시약, 예컨대, 퓨진(FuGENE) 6(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재), 엑스-트림진(X-tremeGENE)(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재), 리포펙트아민(LipofectAmine)(인비트로겐 코포레이션, 미국 소재) 및 핵형질감염(아맥스 코포레이션)을 사용할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스를 기초로 한 적절한 바이러스 벡터 시스템을 이용하여 세포 내로 도입할 수 있다(Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314).
형질감염 후, 양성 형질감염된 세포를 선별제의 존재 하에서, 즉 선별 생장을 통해 선별한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 배양된 CHO 세포가 본 발명에 따른 진핵 선별제들에 대한 내성을 부여하는 모든 필요한 상응하는 핵산들로 형질감염된 경우 1종 초과의 선별제들이 생장 및 이종 폴리펩티드 발현을 방해하지 않으면서 배양 배지 중에 존재할 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 CHO 세포가 비-형질감염된 또는 단일 형질감염된 CHO 세포의 배가 시간의 150% 초과 수준만큼 배가 시간을 감소시키지 않으면서 3종의 진핵 선별제의 공존 하에서 배양될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 다중 형질감염된 CHO 세포는 본 발명에 따른 방법의 형질감염 단계 각각에서 상기 CHO 세포에 이미 존재하지 않는, 상이한 진핵 선별제에 대한 새로운 내성을 부여하는 추가의 핵산으로서 이미 형질감염되어 있지 않은 상이한 핵산을 포함하는 핵산들을 포함한다. 따라서, 제2 형질감염 후, 2종의 상이한 진핵 선별제의 공존 하에서의 배양을 이용하여 성공적으로 형질감염된 세포가 선별된다. 제3 형질감염 후, 형질감염된 세포는 3종의 상이한 진핵 선별제의 공존 하에서의 선별을 위해 배양될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에 따른 여러 형질감염 단계에서 사용되는 벡터는 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 즉 추가의 핵산을 제외하고 핵산 서열에서 95% 이상 동일하다.
분비되는 이종 면역글로불린의 발현을 위해, CHO 세포를 형질감염시키는 데 사용되고 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함하는 벡터는 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 핵산 및/또는 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 핵산도 포함한다. 상기 벡터가 상기 면역글로불린의 경쇄 또는 상기 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 핵산만을 포함하는 경우, 상기 CHO 세포는 상기 면역글로불린의 상응하는 다른 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 또 다른 벡터에 의해서도 각 단계에서 형질감염된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 형질감염 벡터에 포함된 제1 핵산 서열 내지 추가의 핵산 서열(즉, 제1, 제2 및 제3 형질감염 벡터)은 발현 카세트 내에 포함되어 있다. "발현 카세트"는 적어도 세포 내에 함유된 핵산의 발현에 필요한 조절 요소, 예컨대, 프로모터 및 폴리아데닐화 부위, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결요소를 포함하는 구축물을 지칭한다. 발현 카세트 내에 함유된 프로모터는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사 수준 및 상기 핵산의 번역 수준을 결정한다. 제2 프로모터와 비교할 때 핵산의 보다 많은 번역을 유도하는 제1 프로모터는 상기 제2 프로모터와 관련하여 "강한 프로모터"로 지칭된다. 선별제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드가 아니라 분비되는 이종 면역글로불린을 제조하고자 하는 것이다. 따라서, 숙주 세포의 전사 기구의 성능과 번역 기구의 성능은 상응하게 분리되어야 한다. 따라서, 한 실사양태에서, 제2 핵산 및 제3 핵산의 전사에 사용되는 프로모터는 추가의 핵산의 전사에 사용되는 프로모터와 구별된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 이종 면역글로불린의 쇄를 코딩하는 제2 핵산 및 제3 핵산의 전사 수준은 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산의 전사 수준보다 크다. 따라서, 제2 핵산 및 제3 핵산의 발현에 사용되는 프로모터는 추가의 핵산의 발현에 사용되는 프로모터보다 강하다. 또 다른 실시양태에서, 제2 핵산의 전사에 사용되는 프로모터는 제3 핵산의 전사에 사용되는 프로모터와 동일하지만 제2 핵산 및 제3 핵산의 전사에 사용되는 프로모터는 추가의 핵산의 프로모터와 구별된다. 한 실시양태에서, 제2 핵산 및 제3 핵산의 발현을 위한 프로모터는 CMV 프로모터 또는 이의 변이체이고, 추가의 핵산의 발현을 위한 프로모터는 SV40 프로모터 또는 이의 변이체이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 제2 핵산 및 제3 핵산의 코돈 사용은 CHO 세포에서의 발현에 대해 최적화되어 있다. 이것은 재조합 CHO 세포에 존재하는 전달-RNA(t-RNA)의 보다 효율적인 사용을 가능하게 한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 핵산 및/또는 제3 핵산은 인트론 핵산 서열을 포함하고, 또 다른 실시양태에서, 상기 인트론 핵산 서열은 마우스/인간 하이브리드 인트론이다. 진핵 세포의 게놈에서, 게놈 DNA 서열은 코딩(엑손) 및 비-코딩(인트론) 핵산 서열을 포함한다. DNA가 전구-mRNA로 전사된 후, 전구-mRNA 또한 인트론 핵산 서열 및 엑손 핵산 서열을 포함한다. 번역 전, 비-코딩 인트론 핵산 서열은 1차 mRNA 전사체가 스플라이싱되어 성숙 mRNA로 프로세싱되는 과정 동안 제거된다. 1차 mRNA의 스플라이싱은 적절하게 공간적으로 분리된 스플라이스 수용 부위와 조합되는 스플라이스 공여 부위에 의해 조절된다. 스플라이스 공여 부위는 5' 말단에 존재하고, 스플라이스 수용 부위는 인트론 서열의 3' 말단에 존재하며, 스플라이스 공여 부위 및 스플라이스 수용 부위는 전구-mRNA 스플라이싱 과정 동안 부분적으로만 제거된다.
분비되는 폴리펩티드를 제조하기 위해, 이종 면역글로불린의 쇄를 코딩하는 핵산은 신호 서열/리더 펩티드를 코딩하는 DNA 분절을 포함한다. 신호 서열은 새로이 합성된 폴리펩티드가 분비되기 위해 거쳐야 하는 소포체(ER) 막으로 향하여 ER 막을 통과하게 한다. 신호 서열은 ER 막을 통과하는 동안 신호 펩티데이즈에 의해 절단된다. 신호 서열의 기능을 위해서는 숙주 세포의 분비 기구의 인식이 필수적이다. 따라서, 사용되는 신호 서열은 숙주 세포의 단백질 및 분비 기구의 효소에 의해 인식되어야 한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 c)에서 제3 형질감염 단계를 포함한다:
(v) 단계 (iv)에서 선별된 상기 CHO 세포를, 제3 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는, 단계 (i) 및 (iii)에서 사용된 형질감염 벡터 내의 추가의 핵산과 상이하며 상기 제1 진핵 선별제 및 제2 진핵 선별제와 상이한 추가의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
(vi) 단계 (v)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 진핵 선별제, 제2 진핵 선별제 및 제3 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계.
이 실시양태에서, 단계 d)에서 상기 형질감염된 CHO 세포의 배양에 사용되는 배양 배지는 제3 진핵 선별제를 추가로 포함한다.
본 발명의 제2 양태는, 하기 단계 a) 내지 e)를 포함하는 재조합 제조 방법 수득된, 분비되는 이종 면역글로불린을 발현하는 CHO 세포이다:
a) 현탁 배양물 중에서 생장하도록 적응되고, 혈청-무함유 배지 중에서 생장하도록 적응되고, 마이코플라즈마를 함유하지 않는 CHO 세포를 제공하는 단계;
b) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 및 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하고서, 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제1 형질감염 벡터를 제공하고, 상기 제공된 핵산, 및 상기 제1 진핵 선별제와 상이한 제2 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하고 상기 제1 형질감염 벡터 내의 추가의 핵산 서열과 상이한 추가의 핵산 서열을 포함하는 제2 형질감염 벡터를 제공하는 단계; 및
c) 상기 CHO 세포를 형질감염시키고 선별하는 단계로서, 상기 형질감염 및 선별이 하기 단계 (i) 내지 (iv)를 하기 순서대로 포함하는, 단계:
(i) 상기 CHO 세포를 상기 제1 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 상기 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
(iii) 단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포를 상기 제2 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
(iv) 단계 (iii)에서 형질감염된 CHO 세포를, 상기 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 상기 제1 진핵 선별제 및 상기 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 상기 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계.
본원에서 사용된 용어 "바이러스-무함유"는 CHO 세포가 배양 과정 동안에 발현되는 경우 다운스트림 처리 공정에서 분리되지 않는, 인간에게 유해한 생성물을 초래하는 임의의 바이러스 핵산을 함유하지 않음을 의미한다.
하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 절차에 대한 변경을 달성할 수 있음을 이해해야 한다.
[실시예]
재료 및 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적 정보는 문헌(Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에 기재되어 있다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링(Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))에 따라 넘버링된다.
재조합 DNA 기법
문헌(Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 기재된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 DNA를 개조하였다. 분자 생물학적 시약들은 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 화학적 합성법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단일 제한 엔도뉴클레이즈 절단 부위에 의해 플랭킹된, 100 내지 600 bp 길이의 유전자 분절을, PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션으로 조립한 후, A-오버행(overhang) 또는 pPCR-Script Amp SK(+) 클로닝 벡터(스트라타진 코포레이션, 미국 소재)를 통해 pCR2.1-TOPO-TA 클로닝 벡터(인비트로겐 코포레이션, 미국 소재) 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
단백질 측정
단백질 농도는 아미노산 서열을 기초로 하여 계산한 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 측정하였다.
항체 역가 측정
항체 역가는, 항-인간 Fc ELISA를 이용하거나 자가 정제된 항체를 기준 항체로서 사용하는 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다.
SDS-PAGE
리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 완충제(4배 농축액(4x)): 4 g 글리세롤, 0.682 g 트라이스-베이스, 0.666 g 트라이스-하이드로클로라이드, 0.8 g LDS, 0.006 g 에틸렌 다이아민 테트라산(EDTA), 물 중의 서바 블루(Serva Blue) G250의 1 중량%(중량/중량) 용액 0.75 ㎖, 및 총 부피 10 ㎖가 되게 하기 위한 물 중의 페놀 레드의 1 중량%(중량/중량) 용액 0.75 ㎖.
분비된 항체를 함유하는 배양 브로쓰를 원심분리하여 세포 및 세포 데브리스를 제거하였다. 정화된 상청액의 분취액을 1/4 부피(부피/부피)의 4x LDS 샘플 완충제 및 1/10 부피(부피/부피)의 0.5 M 1,4-다이티오트레이톨(DTT)과 혼합하였다. 이어서, 샘플을 70℃에서 10분 동안 항온처리하고, 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였다. NuPAGE(등록상표) 프리-캐스트 겔 시스템(인비트로겐 코포레이션)을 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 구체적으로, 10% NuPAGE(등록상표) 노벡스(등록상표) 바이스-트라이스 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 NuPAGE(등록상표) MOPS 런닝 완충제를 사용하였다.
웨스턴 블롯
전달 완충제: 39 mM 글리신, 48 mM 트라이스-하이드로클로라이드, 0.04 중량%(중량/중량) SDS, 및 20 부피%(부피/부피) 메탄올.
SDS-PAGE 후, 분리된 항체 쇄를 문헌(Burnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203)의 "반건조-블롯팅-방법"에 따라 니트로셀룰로스 필터 막(공극 크기: 0.45 ㎛)에 전기영동적으로 전달하였다.
실시예 1
항-Aβ 항체를 발현하는 발현 벡터
본 발명에 따라 발현용 세포주를 사용하여 수득할 수 있는 예시적 (바람직하게는 단일클론) 항체는 아밀로이드 β-A4 펩티드에 대한 항체(항-Aβ 항체)이다. 이러한 항체 및 상응하는 핵산 서열은 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 2003/070760호 또는 미국 특허출원 공개 제2005/0169925호에 기재되어 있거나 서열번호 1 내지 12에 기재되어 있다.
항-Aβ 항체를 발현하는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주는 3회의 연속적인 완전 형질감염 및 선별 과정을 통해 제조하였다.
게놈 인간 κ-경쇄 불변 영역 유전자 분절(C-카파, CL)을 항-Aβ 항체의 경쇄 가변 영역에 부가한 반면, 인간 γ1-중쇄 불변 영역 유전자 분절(CH1-힌지-CH2-CH3)은 항-Aβ 항체의 중쇄 가변 영역에 부가하였다. 그 다음, 완전한 κ-경쇄 및 γ1-중쇄 항체 유전자를 5'-말단에서 HCMV 프로모터와 연결하고, 인간 면역글로불린 폴리아데닐화 신호 서열은 3'-말단에 연결하였다.
a) 중쇄 발현 카세트
항-Aβ 항체 중쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 항체 생식세포주 유전자로부터 유래된 5'-비번역 영역,
- 인간 항체 생식세포주 유전자로부터 유래된 신호 서열을 포함하는 항-Aβ 항체 중쇄 가변 도메인,
- 마우스 Ig 중쇄 인핸서 요소를 포함하는 인간/마우스 중쇄 하이브리드 인트론 2(예를 들어, 문헌(Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378) 참조),
- 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 영역,
- 인간 면역글로불린 γ1-중쇄 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열, 및
- 5'-에 존재하는 단일 제한부위 AscI, 및 3'-말단에 존재하는 단일 제한부위 SgrAI.
b) 경쇄 발현 카세트
항-Aβ 항체 경쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 항체 생식세포주 유전자로부터 유래된 5'-비번역 영역,
- 인간 항체 생식세포주 유전자로부터 유래된 신호 서열을 포함하는 항-Aβ 항체 경쇄 가변 도메인,
- 마우스 Ig χ-경쇄 인핸서 요소를 포함하는 인간/마우스 κ-경쇄 유전자 하이브리드 인트론 2(예를 들어, 문헌(Picard and Schaffner, A lymphocyte-specific enhancer in the mouse immunoglobulin kappa gene. Nature 307(1984) 80-82) 참조),
- 인간 κ-경쇄 유전자 불변 영역(C-카파),
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열, 및
- 5'-에 존재하는 단일 제한부위 Sse8387, 및 3'-말단에 존재하는 단일 제한부위 FseI.
c) 발현 플라스미드 5128, 5137 및 5151
항-Aβ 항체의 발현 및 제조를 위해, 상기 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트를 단일 발현 벡터 상에 배치하였다(시계 방향으로 경쇄의 업스트림에 위치하는 중쇄). 포함되는 선별 마커 유전자, 특히 선별제 네오마이신, 하이그로마이신 또는 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자에서만 상이한 3종의 동일한 발현 벡터를 제조하였다. 상기 벡터는 선별 또는 증폭에 사용되지 않은 마우스 DHFR 유전자도 포함한다.
발현 벡터는 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트 이외에 하기 요소들을 포함한다:
- 선별 마커(네오마이신, 하이그로마이신 또는 퓨로마이신 내성 유전자),
- 이. 콜라이에서 플라스미드가 복제될 수 있게 하는 복제 기점,
- 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타메이즈 유전자, 및
- 마우스로부터 유래된 DHFR 유전자.
하이그로마이신 선별 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터 5128의 플라스미드 벡터는 도 1에 도시되어 있다. 네오마이신 선별 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터 5137의 플라스미드 맵은 도 2에 도시되어 있다. 퓨로마이신 선별 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터 5151의 플라스미드 맵은 도 3에 도시되어 있다.
실시예 2
항-Aβ 항체를 발현하는 CHO 세포의 형질감염 및 선별
8 mM 글루타민 및 1x HT 보충물(깁코/인비트로겐)을 함유하는 동물 성분-무함유 합성 ProCHO4 배지(캡브렉스 코포레이션) 중의 혈청-무함유 현탁 배양물 중에서 생장하도록 미리-적응시킨 CHO-K1 모 세포를 숙주 세포주로서 사용하였다. 상기 보충된 ProCHO4 배지는 이하에서 ProCHO4-완전 배지로서 지칭된다. 부착 생장하는 CHO-K1 모 세포주는 ATCC로부터 ATCC CCL-61로서 분양받았다.
미리-적응된 모 숙주 세포를 표준 습한 조건(95%, 37℃ 및 5% CO2) 하에서 동물 성분-무함유 ProCHO4-완전 합성 배지 중의 현탁액 중에서 증식시켰다. 세포 밀도에 따라 일정한 간격을 두고 세포를 새로운 배지 내로 분할하였다. 기하급수적 성장기에서 세포를 원심분리하여 수거하고 멸균된 포스페이트 완충된 생리식염수(PBS)로 1회 세척하고 멸균된 PBS 중에 재현탁하였다.
형질감염 전에, 항-Aβ 항체를 발현하는 플라스미드를 제한 엔도뉴클레이즈 효소 PvuI 또는 AviII를 사용하여 베타-락타메이즈 유전자(이. 콜라이 앰피실린 내성 마커 유전자) 내에서 절단하였다. 절단된 DNA를 에탄올로 침전시키고 진공 하에서 건조하고 멸균된 PBS에 용해시켰다.
일반적으로, 형질감염을 위해, (모 또는 이미 형질감염된) CHO 세포를 실온에서 PBS 중의 약 107 세포 당 20 내지 50 ㎍의 선형화된 플라스미드 DNA로 전기천공하였다. 전기천공은, 단일 180 V 펄스를 사용하는 정사각형 파 프로토콜을 이용하여 2 mm 갭 큐벳 내에서 진 펄서 엑스셀(Gene Pulser XCell) 전기천공 장치(바이오-라드 레이보레이토리스)로 수행하였다. 형질감염 후, 세포를 96-웰 배양 플레이트 내의 ProCHO4-완전 배지에 플레이팅하였다. 24시간 동안 생장시킨 후, 1종 이상의 선별제를 함유하는 용액을 첨가하였다(ProCHO4-완전 선별 배지; G418: 400 ㎍/㎖; 하이그로마이신: 600 ㎍/㎖; 퓨로마이신: 8 ㎍/㎖). 1주일 후, ProCHO4-완전 선별 배지를 교체하였다. 항-Aβ 항체의 항체 농도를 배양 상청액 중의 인간 IgG1에 대해 특이적인 ELISA 분석을 이용하여 분석하였다.
고수율 항-Aβ 항체 생성 세포주의 선별을 위해, 6-웰 배양 플레이트, T-플라스크 및/또는 삼각 진탕 플라스크 내에서 증식시킨 후 항-인간 IgG1 ELISA 및/또는 분석 단백질 A HPLC를 이용하여 생산성을 ProCHO4-완전 선별 배지 중에서 시험하였다.
2종의 방법, 즉 제한 희석 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 이용하여 서브클론을 수득하였다.
제한 희석
제한 희석을 위해, 세포를 96-웰 배양 플레이트의 웰 당 0.1 ㎖ 배지 당 0.5 내지 2개 세포의 세포 밀도로 ProCHO4-컨디셔닝된 배지(50%(부피/부피) 새로운 ProCHO4-완전 선별 배지 및 50%(부피/부피) ProCHO4-완전 컨디셔닝된 선별 배지(증식될 세포로부터 유래됨)로 구성됨)에 플레이팅하였다. 1주일 후, 배지를 ProCHO4-완전 선별 배지로 교체하였다. 항-Aβ 항체의 항체 농도를 배양 상청액 중의 인간 IgG1에 대해 특이적인 ELISA 분석으로 분석하였다.
클론의 동정 및 단리를 포함하는 유세포분류에 의한 단일 세포 침착
분비되었지만 여전히 막에 부착된 항체에 결합하는 형광-태깅된 단백질 A를 사용한 세포 표면 표지 기법을 이용하여 안정하게 형질감염된 클론의 동정 및 단리를 수행하였다. 염색된 세포의 형광 강도는 세포 선별에 대한 기준으로서 사용하였다.
형광 활성화된 세포 분류의 경우, 전기천공된 세포 집단을 T-플라스크 내의 ProCHO4-완전 배지 내로 직접 시딩하였다. 적절한 선별제 또는 선별제들(G418, 하이그로마이신 및/또는 퓨로마이신)을 형질감염으로부터 1일 경과 후 배양물에 첨가하고, 형질감염체 풀을 증폭시켰다.
증폭된 형질감염체 풀로부터 얻은 세포를 37℃에서 15분 동안 아큐맥스(PAA 레이보레이토리스)로 먼저 처리한 후 40 μM 나일론 메쉬에 통과시켜 남아있는 큰 세포 응집체를 제거하였다. 세포를 원심분리하여 모으고 5% FCS(깁코/인비트로겐)이 함유된 PBS에 106 내지 107 세포/㎖의 세포 밀도로 재현탁하고, 얼음 위에서 20분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 암실 내에서 얼음 상에서 8 ㎖ FCS-PBS 중의 10 ng/㎖ 단백질 A 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488(몰레큘라 프로브스 인코포레이티드)로 30분 동안 염색하였다. 그 다음, 세포를 5% FCS-PBS로 1회 세척하고 8 mM 울트라 글루타민(캡브렉스 코포레이션), 1x HT 보충물 및 5% FCS가 함유된 ProCHO4 배지로 1회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 세척에 사용된 보충된 ProCHO 배지 중에 106 내지 107 세포/㎖의 세포 밀도로 재현탁하고 BD FACSAAria 세포 분류기(비디 바이오사이언시스)에 옮겼다.
단일 세포를 유세포분류기로 분류하고 ProCHO4-컨디셔닝된 배지를 함유하는 96-웰 배양 플레이트의 웰 내에 침착시켰다. 선별되고 침착된 세포는 게이팅된(gated) 생존 세포의 형광 강도의 상위 10%, 7% 또는 4% 내에 있는 세포를 포함한다. 48시간 후, 적절한 선별제를 2배 농도로 함유하는 ProCHO4 완전 선별 배지를 각 웰에 첨가하였다. 1주일 후, 배지를 ProCHO4-완전 선별 배지로 교체하였다 항-Aβ 항체의 항체 농도를 배양물 상청액 중의 인간 IgG1에 대해 특이적인 ELISA 분석으로 분석하였다.
형질감염 및 선별 단계
제1 형질감염 및 선별 단계를 위해, 플라스미드 5137을 사용하였다. 플라스미드 5137을, ProCHO4-완전 배지 중에서 생장하도록 적응된 모 세포주 내로 전기천공을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 96-웰 플레이트 내에서 700 ㎍/㎖ 이하의 G418로 보충된 ProCHO4-완전 배지 중에서 배양하였다. 배양물 상청액 중의 항체 농도를 항-인간 IgG1 ELISA로 평가하였다. 약 1,000개의 클론을 시험하고, 이들로부터 선별된 클론을 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트 및 이어서 진탕 플라스크 내에서 더 배양하였다. 약 20개의 클론의 생장 및 생산성을 항-인간 IgG1 ELISA 및/또는 분석 단백질 A HPLC로 정적 배양물 및 현탁 배양물에서 평가하였다. 최적 클론(최적 클론은 생산성이 가장 높은 클론을 의미하는 것이 아니라, 후속 단계를 위해 최적 성질을 가진 클론을 의미함)을 700 ㎍/㎖ G418로 보충된 ProCHO4-컨디셔닝된 배지 중에서의 제한 희석을 이용하여 서브클로닝하였다. 선별된 클론은 8C8로 명명하였다.
제2 형질감염 및 선별 단계를 위해, 플라스미드 5128을 사용하였다. 플라스미드 5128을, 700 ㎍/㎖ G418로 보충된 ProCHO4-완전 배지 중에서 배양된 세포주 클론 8C8 내로 전기천공을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 200 ㎍/㎖ G418 및 300 ㎍/㎖ 하이그로마이신로 보충된 ProCHO4-컨디셔닝된 배지(ProCHO4-이중 선별 배지) 중에서 약 2 내지 3주 동안 증폭시켰다. 단백질 A 알렉사 플루오르 접합체를 사용하여 염색한 후의 세포의 형광 강도를 기초로 하여 FACS로 단일 항체 분비 세포를 동정하고 침착시켰다. 침착된 세포를 96-웰 플레이트 내의 ProCHO4-이중 선별 배지 중에서 배양하였다. 배양물 상청액 중의 항체 농도를 항-인간 IgG1 ELISA로 평가하였다. 약 500개의 클론을 시험하고, 이들로부터 선별된 클론을 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트 및 이어서 진탕 플라스크 내에서 더 배양하였다. 약 14개의 클론의 생장 및 생산성을 항-인간 IgG1 ELISA 및/또는 분석 단백질 A HPLC로 정적 배양물 및 현탁 배양물에서 평가하였다. 선별된 클론은 4F5로 명명하였다.
제3 형질감염 및 선별 단계를 위해, 플라스미드 5151을 사용하였다. 플라스미드 5151을, ProCHO4-이중 선별 배지 중에서 배양된 세포주 클론 4F5 내로 전기천공을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 ProCHO4-삼중 선별 배지(200 ㎍/㎖ G418, 300 ㎍/㎖ 하이그로마이신 및 4 ㎍/㎖ 퓨로마이신으로 보충된 ProCHO4-컨디셔닝된 배지) 중에서 약 2 내지 3주 동안 증폭시켰다. 단백질 A 알렉사 플루오르 접합체를 사용하여 염색한 후의 세포의 형광 강도를 기초로 하여 FACS로 단일 항체 분비 세포를 동정하고 침착시켰다. 침착된 세포를 96-웰 플레이트 내의 ProCHO4-삼중 선별 배지 중에서 배양하였다. 배양물 상청액 중의 항체 농도를 항-인간 IgG1 ELISA로 평가하였다. 약 500개의 클론을 시험하고, 이들로부터 선별된 클론을 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트 및 이어서 진탕 플라스크 내에서 더 배양하였다. 약 10개의 클론의 생장 및 생산성을 항-인간 IgG1 ELISA 및/또는 분석 단백질 A HPLC로 정적 배양물 및 현탁 배양물에서 평가하였다. 선별된 클론은 20F2로 명명하였다.
클론 20F2는 ProCHO4-삼중 선별 배지 중에서, 즉 3종의 선별제 G418, 하이그로마이신 및 퓨로마이신의 공존 하에서 유가 현탁 배양물 중에서 생장시킨 후 클론의 생장, 생산성 및 생성물의 질 특성을 기초로 하여 선별되었다.
클론 특징
하기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 3일 동안 배양한 후 배가 시간 및 세포 밀도는 기초 세포주 CHO-K1(야생형)과 선별된 클론을 비교하였을 때 유사하였다.
Figure 112010022737354-pct00001
실시예 3
항-Aβ 항체를 발현하는 클론 20F2의 안정성
생장 및 생성물 형성의 안정성을 선별제의 존재 하에서 및 부재 하에서(항생제-함유 및 항생제-무함유) 60일(약 60 세대)에 걸친 순차적인 세포 하위배양에서 평가하였다. 배양을 하기와 같이 수행하였다.
Figure 112010022737354-pct00002
광범위한(최대 60 세대) 계대배양 후, 항-Aβ 항체 생성 클론 20F2가 3종의 선별제 각각의 존재 또는 부재 하에서의 세포 생장 및 생성물 형성 면에서 불안정함을 입증하는 증거는 전혀 얻지 못하였다.
실시예 4
항-P-셀렉틴 항체를 발현하는 발현 벡터
본 발명에 따라 발현용 세포주를 사용하여 수득할 수 있는 예시적 (바람직하게는 단일클론) 항체는 인간 P-셀렉틴 당단백질에 대한 항체(항-P-셀렉틴 항체)이다. 이러한 항체 및 상응하는 핵산 서열은 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/100402호 또는 미국 특허출원 공개 제2005/0226876호에 기재되어 있거나 서열번호 13 내지 18에 기재되어 있다.
항-Aβ 항체를 발현하는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주는 3회의 연속적인 완전 형질감염 및 선별 과정을 통해 제조하였다.
게놈 인간 κ-경쇄 불변 영역 유전자 분절(C-카파)을 항-P-셀렉틴 항체의 경쇄 가변 영역에 부가한 반면, 인간 γ4-중쇄 불변 영역 유전자 분절(CH1-힌지-CH2-CH3)은 항-P-셀렉틴 항체의 중쇄 가변 영역에 부가하였다. 그 다음, 완전한 κ-경쇄 및 γ4-중쇄 항체 유전자를 5'-말단에서 HCMV 즉시 초기 프로모터 및 인핸서(CMV IE)와 연결하고, 원숭이 바이러스(SV) 40 초기 폴리아데닐화(SV40 초기 폴리 A) 신호 서열은 3'-말단에 연결하였다.
a) 중쇄 발현 카세트
항-P-셀렉틴 항체 중쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조로 신호 펩티드를 포함하는, 항-P-셀렉틴 항체 γ4-중쇄에 대한 코딩 서열, 및
- SV40 초기 폴리 A 신호 서열.
b) 경쇄 발현 카세트
항-P-셀렉틴 항체 경쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조로 항-P-셀렉틴 항체 κ-경쇄에 대한 코딩 서열, 및
- SV40 초기 폴리 A 신호 서열.
c) 발현 플라스미드 5057 및 5069
항-P-셀렉틴 항체의 발현 및 제조를 위해, 상기 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트를 단일 발현 벡터 상에 배치하였다(중쇄의 업스트림에 위치하는 경쇄). 포함되는 선별 마커 유전자, 특히 뮤린 다이하이드로폴레이트 리덕테이즈(DHFR) 유전자 또는 네오마이신 내성 유전자에서만 상이한 2종의 동일한 발현 벡터를 제조하였다.
발현 벡터는 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트 이외에 하기 요소들을 포함한다:
- 선별 마커, SV40 초기 프로모터 및 복제 기점의 조절 하에 있는 뮤린 DHFR 유전자 또는 선별제 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자,
- 이. 콜라이에서 플라스미드가 복제될 수 있게 하는, pUC19로부터 유래된 복제 기점(pUC 복제 기점), 및
- 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타메이즈 유전자.
뮤린 DHFR 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터 5057의 플라스미드 맵은 도 4에 도시되어 있다. 네오마이신 선별 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터 5069의 플라스미드 맵은 도 5에 도시되어 있다.
실시예 5
항-P-셀렉틴 항체를 발현하는 CHO 세포주의 형질감염 및 선별
정의된 동물-유래의 성분(양모 및 대구 간유로부터 유래된 콜레스테롤)으로 보충된 단백질-무함유 HyQ SFM4CHO 배지(하이클론, 카달로그 번호 SH30549) 중의 혈청-무함유 현탁 배양물 중에서 생장하도록 미리-적응시킨 CHO-K1 세포를 숙주 세포주로서 사용하였다. 상기 세포를 표준 습한 조건(95%, 37℃ 및 5% CO2) 하에서 진탕 플라스크 내의 단백질-무함유 HyQ SFM4CHO 배지 중에서 150 rpm/분의 속도로 일정하게 교반하면서 증식시켰다. 세포 밀도에 따라 세포를 새로운 배지 내로 분할하였다.
부착 CHO-K 세포주는 ATCC CCL-61로서 ATCC로부터 입수하였다.
제1 형질감염 및 선별
형질감염 전에, 발현 플라스미드 5057을 제한 엔도뉴클레이즈 효소 PvuI을 사용하여 베타-락타메이즈 유전자 내에서 절단하였다. 절단된 DNA를 제조자의 권고에 따라 퀴아퀵 스핀(QiaQuick spin) 컬럼(퀴아젠)을 사용하여 정제하였다.
형질감염은 진 펄서 엑스셀(바이오-라드 레이보레이토리스) 및 0.2 cm 큐벳(바이오-라드 레이보레이토리스, 카달로그 번호 165-2086)을 사용하는 전기천공으로 수행하였다. 형질감염을 위해, 106 내지 107개의 CHO-K1 세포를 원심분리하여 수거하고 PBS에 재현탁하고 상기 큐벳으로 옮기고 20 내지 50 ㎍의 선형화된 플라스미드 DNA와 혼합하였다. 세포를 단일 정사각형 파 펄스(160 V, 15 ms)에 노출시킨 후 약 4 x 105 세포/㎖의 밀도로 HyQ SFM4CHO 배지에 희석하고 T75 세포 배양 플라스크에 시딩하였다. 선별제의 보충 없이 48시간 동안 증식시킨 후, 세포를 200 nM MTX로 보충된 HyQ SFM4CHO 배지 중에서 104 내지 105 세포/㎖의 밀도로 희석하고 웰 당 3,000 내지 7,000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 약 2주 후, 새로운 배지를 웰마다 첨가하고 추가 2주 후 배양 배지를 새로운 배지로 완전히 교체하였다. 4일 후, 배양 상청액을 항-인간 Fc ELISA로 항체 생성에 대해 시험하였다. 약 총 600개의 클론을 스크리닝하였다.
10 ㎍/㎖보다 높은 항체 역가를 나타내는 45개의 클론을 픽킹하여 48-웰 플레이트로 옮겼다. 클론을 추가 계대배양에 걸쳐 진탕 플라스크 내에서 증폭시킨 후 최종 생산성 평가를 위해 혈청-무함유 생산 배지로 옮겼다. 125 ㎖의 진탕 플라스크를 200 nM MTX로 보충된 배지 중의 105 내지 106 세포/㎖의 세포로 접종하였다. 생존 세포 밀도 및 생존율을 1주에 걸쳐 모니터링하였다. 마지막 날에 단백질 A 크로마토그래피로 항체 역가를 측정하였다. 이 데이터를 기초로 하여 추가 연구를 위해 클론 G24를 선별하였다. G24는 3.3 x 106 세포/㎖의 최대 생존 세포 밀도에 도달하였다. 항체 역가는 402 ㎍/㎖이었다. 평균 비생산속도(SPR)는 28 pg/(세포*d)이었다.
제2 형질감염 및 선별
클론 G24에 대해 제2 형질감염을 수행하였다. 제2 형질감염을 위해, 플라스미드 5069를 사용하였다. 상기 플라스미드의 선형화 및 정제뿐만 아니라 G24의 전기천공은 제1 형질감염에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 선별제의 부재 하에서 48시간 동안 증식시킨 후, 세포를 200 nM MTX 및 400 ㎍/㎖ G418로 보충된 HyQ SFM4CHO 배지 중에서 103 내지 104 세포/㎖의 밀도로 희석하고 웰 당 500개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 약 2주 후, 새로운 배지를 웰마다 첨가하고 추가 2주 후 배양 배지를 새로운 배지로 완전히 교체하였다. 4일 후, 배양 상청액을 항-인간 Fc ELISA로 항체 생성에 대해 시험하였다. 약 총 220개의 클론을 스크리닝하였다.
150 ㎍/㎖보다 높은 항체 역가를 나타내는 13개의 클론을 픽킹하여 24-웰 플레이트로 옮겼다. 클론을 추가 계대배양에 걸쳐 진탕 플라스크 내에서 증폭시킨 후 최종 생산성 평가를 위해 혈청-무함유 생산 배지로 옮겼다. 진탕 플라스크를 200 nM MTX 및 400 ㎍/㎖ G418로 보충된 50 ㎖ 배지 중의 105 내지 106 세포/㎖의 세포로 접종하였다. 생존 세포 밀도 및 생존율을 1주에 걸쳐 모니터링하였다. 마지막 날에 단백질 A 크로마토그래피로 항체 역가를 측정하였다. 이 데이터를 기초로 하여 클론 G24_x6을 최적 클론으로서 간주하였다. G24_x6은 3.0 x 106 세포/㎖의 최대 생존 세포 밀도에 도달하였다. 항체 역가는 685 ㎍/㎖이었다. 평균 SPR은 48 pg/(세포*d)이었다.
제한 희석
생산성에 대한 효과 면에서 본 발명에 따른 방법과 단순 서브클로닝을 비교하기 위해, 본 발명자들은 96-웰 플레이트 내에서 클론 G24에 대해 제한 희석 또는 단일 세포 침착을 수행하였다.
제한 희석을 위해, 세포를 96-웰 플레이트 내의 50%(부피/부피) 컨디셔닝된 배지, 10% FCS 및 200 nM MTX로 보충된 HyQ SFM4CHO 배지 중에 0.5 세포/웰로 시딩하였다. 대안적으로, 1 세포/웰을 FACS로 96-웰 플레이트 내에 침착시켰다. 10일 후, 새로운 FCS 없이 200 nM MTX로 보충된 새로운 HyQ SFM4CHO 배지를 웰마다 첨가하고, 추가 1주일 후 배양 배지를 200 nM MTX로 보충된 HyQ SFM4CHO 배지로 완전히 교체하였다. 4일 후, 배양 상청액을 항-인간 Fc ELISA로 항체 생성에 대해 시험하였다. 총 약 230개 클론을 스크리닝하였다.
130 ㎍/㎖보다 높은 항체 역가를 나타내는 11개의 서브클론을 픽킹하여 24-웰 플레이트로 옮겼다. 클론을 6-웰 플레이트에서 계대배양한 후 진탕 플라스크로 옮기고, 이어서 후 최종 생산성 평가를 위해 혈청-무함유 생산 배지로 옮겼다. 진탕 플라스크를 200 nM MTX로 보충된 배지 중의 105 내지 106 세포/㎖의 세포로 접종하였다. 생존 세포 밀도 및 생존율을 1주에 걸쳐 모니터링하였다. 마지막 날에 단백질 A 크로마토그래피로 항체 역가를 측정하였다. 이 데이터를 기초로 하여 클론 G24_13을 최적 클론으로서 간주하였다. G24_13은 3.6 x 106 세포/㎖의 최대 생존 세포 밀도에 도달하였다. 항체 역가는 472 ㎍/㎖이었다. 평균 SPR은 31 pg/(세포*d)이었다.
표 3에는 본 발명의 방법에 따라 수득된 최적 서브클론 G24_13 및 G24_x6의 생산성을 상기 클론들의 모 클론인 G24의 생산성과 비교하여 얻은 데이터가 요약되어 있다. 본 발명의 방법을 이용한 경우 부피 생산성 및 비생산성이 50%를 초과하는 정도까지 증가된 클론이 수득될 수 있는 반면, 서브클로닝 후에는 상기 두 파라미터의 미미한 증가만이 관찰되었다.
도 6은 진탕 플라스크에서 조사된 G24의 모든 서브클론들의 부피 생산성(A) 및 비생산성(B)을 전체적으로 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 수득된 클론의 평균 부피 생산성 및 비생산성은 서브클로닝 후보다 훨씬 더 높았다.
Figure 112010022737354-pct00003
클론 특징
하기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 3일 동안 배양한 후 배가 시간 및 세포 밀도는 단일 형질감염된 세포주 G24와 선별된 클론들을 비교한 경우 유사하였다.
Figure 112010022737354-pct00004
실시예 6
항-P-셀렉틴 항체를 발현하는 CHO 세포주의 형질감염 및 선별
단백질-무함유 HyQ SFM4CHO 배지(하이클론, 카달로그 번호 SH30549) 중의 혈청-무함유 현탁 배양물 중에서 생장하도록 미리-적응시킨 CHO-DG44 세포를 숙주 세포주로서 사용하였다. 상기 숙주 세포를 형질감염, 스크리닝 및 서브클로닝 단계에서 시판되는 배지인 HyQ SFM4CHO 배지(하이클론, 카달로그 번호 SH30516) 중에서 배양하였다.
제1 형질감염 및 선별
형질감염 전에, 발현 플라스미드 5057(도 4)를 제한효소 PvuI을 사용하여 베타-락타메이즈 유전자 내에서 선형화시켰다.
상기 숙주 세포주의 형질감염은 아맥사(뉴클레오펙터 키트 T, 카달로그 번호 VCA-1002, 형질감염 프로그램 U-17)에 의해 제공된 핵형질감염(nucleotrasfection)으로 수행하였다. 형질감염 후, 세포를 10% FCS(태아소 혈청)로 보충된 배지 중에서 48시간 동안 배양하였다.
형질감염된 세포를 40 nM의 MTX의 존재 하에서 10% FCS로 보충된 배지가 함유된 96-웰 플레이트 상에 웰 당 1,000개 세포로 플레이팅하고 약 3주 동안 항온처리하였다.
상기 96-웰 플레이트의 상청액 중의 항체 농도를 ELISA로 측정하였다. 약 400개의 1차 클론들을 스크리닝하였다. 항체 생산성이 가장 높은 24개의 클론을 24-웰 플레이트로 옮기고 선별제의 존재 하에서 FCS를 보충하지 않고 배양하였다.
생성물의 질은 웨스턴 블롯팅으로 경쇄 및 중쇄를 검출하여 분석하였다. 생산성이 가장 높고 검출가능한 수준의 항체-유래의 부산물 없이 항체를 발현하는 9개의 클론(웨스턴 블롯)을 진탕 플라스크 내에서 증폭시켰다.
생산성은 7일 및 10일 동안의 항온처리 후 회분 진탕 플라스크 내에서 분석하였다. 생성물의 질은 단백질 A HPLC 정제 후 SDS-PAGE로 평가하였다(도 7). 클론 43-16에서 최적의 생성물 농도가 도달되었다. 세포 당 최적의 비생산성은 클론 35-45에서 달성되었다. 제한 희석을 이용하여 서브클로닝을 위해 상기 두 클론들을 선택하였다.
20 nM MTX의 존재 하에서 5%(부피/부피) 태아소 혈청으로 보충된 시판되는 HyQ 배지가 함유된 96-웰 플레이트 상에서 모 클론 35-45 및 43-16을 제한 희석하여 서브클로닝하였다. 20일 동안의 항온처리 후, 항체 생성을 ELISA로 스크리닝하였다. 최적 생산성을 보이는 서브클론을 진탕 플라스크 내에서 증폭시킨 후 최종 생산성 평가를 위해 혈청-무함유 배지로 옮겼다. 모 클론 35-45 및 43-16의 2개의 최적 서브클론인 35-45-F2 및 43-16-A10을 표준 회분 진탕 플라스크 분석에서 평가하였다. 생산성은 7일 후 270 ㎍/㎖ 및 185 ㎍/㎖이었고 10일 후 337 ㎍/㎖ 및 343 ㎍/㎖이었다.
제2 형질감염 및 선별
서브클론 43-16-A10을 핵형질감염 방법(아맥사 뉴클레오펙터 키트 T, VCA-1002, 형질감염 프로그램 U-17)을 이용하여 발현 벡터 p5069(도 5)로 형질감염시켰다. 제2 형질감염을 하이클론 배지(10% FCS 및 20 nM MTX로 보충된 HyQ SFM4CHO-유틸리티(카달로그 번호 SH30516)) 중에서 수행하였다. 제2 형질감염으로부터 2일이 경과된 후, 세포를 웰 당 1,000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트로 옮겼다. 250 ㎍/㎖의 G418을 제2 선별제로서 첨가하였다.
배양 후, 항-인간 Fc ELISA로 항체 역가를 측정함으로써 2주 동안 2,000개 초과의 1차 웰을 스크리닝하였다. 생산성이 가장 높은 50개의 클론을 24-웰 플레이트로 옮기고 3일 후 항-인간 Fc ELISA로 다시 스크리닝하였다. 모든 클론들을 6-웰 플레이트로 옮기고 3일 후 항-인간 Fc ELISA로 스크리닝하였다. 최적 생산성을 보이는 6개의 클론을 6-웰 플레이트 단계로부터 직접 서브클로닝하였다.
제한 희석
제2 형질감염 및 선별로부터 얻은 최적 모 클론인 43-16A1O_S1, 43-16A10_S13, 43-16A10_S14, 43-16A10_S19, 43-16A10_S24, 43-16A10_S43을 제한 희석으로 서브클로닝하였다. 12개의 최적 서브클론의 생성물의 질을 24-웰 단계로부터의 SDS-PAGE 및 웨스턴-블롯팅에서 평가하였다. 원치 않는 항체 관련 부산물은 검출되지 않았다.
진탕 플라스크 내에서의 증폭을 위해 6-웰 플레이트 내에서의 생산성을 기준으로 3개의 서브클론을 선별하였다. 상기 서브클론을 최종 생산성 평가를 위해 혈청-무함유 생산 배지로 옮겼다. 상기 서브클론의 생산성은 제1 형질감염 후 얻은 서브클론 43-16-A10과 비교되었다. 제2 형질감염 및 선별 후 수득된 클론 43-16-A10-S1-16 및 43-16-A10-S24-11의 생산성은 221 ㎍/㎖이었지만 회분 진탕 플라스크에서 7일 동안 배양한 후 각각 436 ㎍/㎖ 및 407 ㎍/㎖로 증가하였는데, 이는 제2 형질감염 및 선별 후 수득한 상기 두 클론의 생산성이 2배 증가하였음을 의미한다. 회분 진탕 플라스크 내에서 10일 동안 항온처리한 후, 상기 두 클론의 생산성은 306 ㎍/㎖에서 각각 683 ㎍/㎖ 및 446 ㎍/㎖로 증가하였다.
세포 당 비생산성은 제1 형질감염 후 수득된 클론 43-16-A10의 경우 17 pg/세포/일이었지만 제1 형질감염된 클론 43-16-A10-S1-16의 경우 40 pg/세포/일로 증가하였고 제2 형질감염된 클론 43-16-A10- S24-11의 경우 33 pg/세포/일로 증가하였다. 배가 시간은 제2 형질감염에 의해 영향을 받지 않았다. 제1 형질감염 후 클론 43-16-A10에 대한 배가 시간은 33시간이었고 43-16-A10-S1-16 및 43-16-A10-S24-11 둘다의 경우 배가 시간은 32시간이었다.
실시예 7
항-IL-13Rα 항체를 발현하는 발현 벡터
본 발명에 따라 발현용 세포주를 사용하여 수득할 수 있는 예시적 (바람직하게는 단일클론) 항체는 IL-13 수용체 알파 1에 결합하는 항체(항-IL-13Rα1 항-IL-13Rα 항체)이다. 이러한 항체 및 상응하는 핵산 서열은 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/072564호에 기재되어 있거나 서열번호 19 내지 28에 기재되어 있다.
게놈 인간 κ-경쇄 불변 영역 유전자 분절(C-카파)을 항-IL-13Rα 항체의 경쇄 가변 영역에 부가한 반면, 인간 γ1-중쇄 불변 영역 유전자 분절(CH1-힌지-CH2-CH3)은 항-IL-13Rα 항체의 중쇄 가변 영역에 부가하였다. 발현 플라스미드 5321은 항-IL-13Rα 항체 γ-중쇄에 대한 발현 카세트, 항-IL-13Rα 항체 κ-경쇄에 대한 발현 카세트 및 뮤린 DHFR 유전자를 코딩하는 핵산에 대한 발현 카세트를 포함한다. 해석된 플라스미드 맵은 도 9에 도시되어 있다.
a) 중쇄 발현 카세트
항-IL-13Rα 항체 접합체 중쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조로 신호 펩티드를 포함하는, 항-IL-13Rα 항체 γ1-중쇄에 대한 코딩 서열, 및
- 인간 면역글로불린 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 신호 서열.
b) 경쇄 발현 카세트
항-IL-13Rα 항체 경쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조로 항-IL-13Rα κ-경쇄에 대한 코딩 서열, 및
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 신호 서열.
c) 발현 플라스미드
항-IL-13Rα 항체 접합체의 발현 및 제조를 위해, 상기 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트를 단일 발현 벡터 상에 배치하였다(중쇄의 업스트림에 위치하는 경쇄). 포함되는 선별 마커 유전자, 특히 뮤린 DHFR 유전자 또는 하이그로마이신 내성 유전자에서만 상이한 2종의 동일한 발현 벡터를 제조하였다.
발현 벡터는 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트 이외에 하기 요소들을 포함한다:
- 이. 콜라이에서 플라스미드가 복제될 수 있게 하는 복제 기점(pUC19 복제 기점), 및
- 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타메이즈 유전자.
실시예 8
항-IL-13Rα 항체를 발현하는 CHO 세포주의 형질감염 및 선별
제1 형질감염 및 선별 단계를 위해, 플라스미드 5321을 사용하였다. 플라스미드 5321을 ProCHO4-완전 배지 중에서 생장하도록 적응시킨 모 세포주 내로 전기천공을 통해 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 플레이트에서 200 nM 이하의 MTX로 보충된 HyQSFMCHO-배지(하이클론) 중에서 배양하였다. 배양물 상청액 중의 항체 농도를 항-인간 IgG1 ELISA로 평가하였다. 클론을 시험하고 이들로부터 선별된 클론을 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트 및 이어서 진탕 플라스크 내에서 더 배양하였다. 생장 및 생산성을 항-인간 IgG1 ELISA 및/또는 분석 단백질 A HPLC로 정적 배양물 및 현탁 배양물에서 평가하였다. 최적 클론(최적 클론은 생산성이 가장 높은 클론을 의미하는 것이 아니라, 후속 단계를 위해 최적 성질을 가진 클론을 의미함)을 선별하였다. 선별된 클론은 200_019로 명명하였다. 7일 동안 배양한 후 얻은 생산성은 90 ㎍/㎖이었고 평균 비생산속도는 7 pg/(세포*d)이었다.
제2 형질감염 및 선별 단계를 위해, DHFR 및 하이그로마이신 내성 유전자를 가진 플라스미드를 사용하였다. 상기 플라스미드를, 200 nM 이하의 MTX로 보충된 HyQSFMCHO-배지(하이클론) 중에서 배양된 선별된 세포주 내로 전기천공으로 형질감염시켰다. 상기 이중 선별 배지는 300 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B를 추가로 함유하였다. 단백질 A 알렉사 플루오르 접합체로 염색한 후 그들의 형광 강도를 기초로 하여 상기 세포를 FACS로 단일 항체 분비 세포를 동정하고 침착시켰다. 선별된 클론은 5_17_35이었다. 7일 동안 배양한 후 얻은 생산성은 150 ㎍/㎖이었고 평균 비생산속도는 10 pg/(세포*d)이었다.
실시예 9
항-CD4 항체 접합체를 발현하는 발현 벡터
본 발명에 따라 발현용 세포주를 사용하여 수득할 수 있는 예시적 (바람직하게는 단일클론) 항체는 2 내지 8개의 항융합원성 펩티드에 접합된 인간 CD4 표면 수용체에 대한 항체(항-CD4 항체)이다. 이러한 항체 및 상응하는 핵산 서열은 예를 들어, 국제 특허출원 제PCT/EP2008/005894호에 기재되어 있거나 서열번호 29 내지 40에 기재되어 있다.
게놈 인간 κ-경쇄 불변 영역 유전자 분절(C-카파)을 서열번호 39의 항-CD4 항체의 경쇄 가변 영역에 부가한 반면, 인간 γ1-중쇄 불변 영역 유전자 분절(CH1-힌지-CH2-CH3)은 서열번호 36의 항-CD4 항체의 중쇄 가변 영역에 부가하였다. 발현 플라스미드 6311은 서열번호 42의 펩티드성 글리신-세린 링커를 통해 결합된 서열번호 41의 항융합원성 펩티드를 코딩하는 핵산, 항-CD4 항체 κ-경쇄 및 선별 마커 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 핵산과 함께, 마지막 1개의 C-말단 아미노산에 연결된 항-CD4 항체 γ1-중쇄를 포함한다. 해석된 플라스미드 맵은 도 8에 도시되어 있다.
a) 중쇄 발현 카세트
항-CD4 항체 접합체 중쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조로 신호 펩티드를 포함하는, 항-CD4 항체 γ1-중쇄에 대한 코딩 서열, 및
- SV40 초기 폴리 A 신호 서열.
b) 경쇄 발현 카세트
항-CD4 항체 접합체 경쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- HCMV로부터 유래된 즉시 초기 인핸서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5'-UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조로 항-CD4 κ-경쇄에 대한 코딩 서열, 및
- SV40 초기 폴리 A 신호 서열.
c) 발현 플라스미드
항-CD4 항체 접합체의 발현 및 제조를 위해, 상기 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트를 단일 발현 벡터 상에 배치하였다(중쇄의 업스트림에 위치하는 경쇄). 포함되는 선별 마커 유전자, 특히 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 및 하이그로마이신 내성 유전자에서만 상이한 3종의 동일한 발현 벡터를 제조하였다.
발현 벡터는 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트 이외에 하기 요소들을 포함한다:
- 이. 콜라이에서 플라스미드가 복제될 수 있게 하는, pUC18로부터 유래된 복제 기점(pUC 복제 기점), 및
- 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타메이즈 유전자.
실시예 10
항-CD4 항체 접합체를 발현하는 CHO 세포주의 형질감염 및 선별
형질감염 및 선별 단계
제1 형질감염 및 선별 단계를 위해, 플라스미드 6311을 사용하였다. 플라스미드 6311을 ProCHO4-완전 배지 중에서 생장하도록 적응시킨 모 세포주 내로 전기천공을 통해 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 96-웰 플레이트에서 700 ㎍/㎖ 이하의 G418로 보충된 ProCHO4-완전 배지 중에서 배양하였다. 배양물 상청액 중의 항체 농도를 항-인간 IgG1 ELISA로 평가하였다. 약 5,000개의 클론을 시험하고 이들로부터 선별된 클론을 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트 및 이어서 진탕 플라스크 내에서 더 배양하였다. 약 15개의 클론의 생장 및 생산성을 항-인간 IgG1 ELISA 및/또는 분석 단백질 A HPLC로 정적 배양물 및 현탁 배양물에서 평가하였다. 최적 클론(최적 클론은 생산성이 가장 높은 클론을 의미하는 것이 아니라, 후속 단계를 위해 최적 성질을 가진 클론을 의미함)을 700 ㎍/㎖의 G418로 보충된 ProCHO4-컨디셔닝된 배지 중에서 제한 희석으로 클로닝하였다.
2종의 방법, 즉 제한 희석 및 FACS를 이용하여 서브클론을 수득하였다.
제한 희석
제한 희석을 위해, 세포를 96-웰 배양 플레이트의 웰 당 0.1 ㎖ 배지 당 0.5 내지 2개 세포의 세포 밀도로 ProCHO4-선별 배지에 플레이팅하였다.
클론의 동정 및 단리를 포함하는 유세포분류에 의한 단일 세포 침착
형광 활성화된 세포 분류의 경우, 전기천공된 세포 집단을 T-플라스크 내의 ProCHO4-완전 배지 내로 직접 시딩하였다. 적절한 선별제 또는 선별제들(G418, 하이그로마이신 및/또는 퓨로마이신)을 형질감염으로부터 1일 경과 후 배양물에 첨가하고, 형질감염체 풀을 증폭시켰다. 약 112개의 클론의 생장 및 생산성을 항-인간 IgG1 ELISA 및/또는 분석 단백질 A HPLC로 정적 배양물 및 현탁 배양물에서 평가하였다. 선별된 클론은 I-17로 명명하였다.
제2 형질감염 및 선별 단계를 위해, 하이그로마이신 내성 유전자를 가진 플라스미드를 사용하였다. 상기 플라스미드를, 700 ㎍/㎖ G418로 보충된 ProCHO4-완전 배지 중에서 배양된 세포주 클론 I-178 내로 전기천공을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 200 ㎍/㎖ G418 및 300 ㎍/㎖ 하이그로마이신로 보충된 ProCHO4-컨디셔닝된 배지(ProCHO4-이중 선별 배지) 중에서 약 2 내지 3주 동안 증폭시켰다. 단백질 A 알렉사 플루오르 접합체를 사용하여 염색한 후의 세포의 형광 강도를 기초로 하여 FACS 분석으로 단일 항체 분비 세포를 동정하고 침착시켰다. 침착된 세포를 96-웰 플레이트 내의 ProCHO4-이중 선별 배지 중에서 배양하였다. 배양물 상청액 중의 항체 농도를 항-인간 IgG1 ELISA로 평가하였다. 선별된 클론은 24_16으로 명명하였다.
제3 형질감염 및 선별 단계를 위해, 퓨로마이신 내성 유전자를 가진 플라스미드를 사용하였다. 상기 플라스미드를, ProCHO4-이중 선별 배지 중에서 배양된 세포주 클론 24_16 내로 전기천공을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 ProCHO4-삼중 선별 배지(200 ㎍/㎖ G418, 300 ㎍/㎖ 하이그로마이신 및 4 ㎍/㎖ 퓨로마이신으로 보충된 ProCHO4-컨디셔닝된 배지) 중에서 약 2 내지 3주 동안 증폭시켰다. 단백질 A 알렉사 플루오르 접합체를 사용하여 염색한 후의 세포의 형광 강도를 기초로 하여 FACS로 단일 항체 분비 세포를 동정하고 침착시켰다. 침착된 세포를 96-웰 플레이트 내의 ProCHO4-삼중 선별 배지 중에서 배양하였다. 배양물 상청액 중의 항체 농도를 항-인간 IgG1 ELISA로 평가하였다. 선별된 클론은 1_24로 명명하였다.
클론 특징
하기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 3일 동안 배양한 후 배가 시간 및 세포 밀도는 기초 세포주 CHO-K1(야생형)과 선별된 클론을 비교하였을 때 유사하였다.
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서열목록 전자파일 첨부

Claims (21)

  1. CHO 세포에서 배양 배지로 분비되는 이종 면역글로불린을 재조합적으로 제조하는 방법으로서, 하기 단계 a) 내지 e)를 포함하는 방법:
    a) 현탁 배양물 중에서 생장하도록 적응되고, 혈청-무함유 배지 중에서 생장하도록 적응되고, 마이코플라즈마를 함유하지 않는 CHO 세포를 제공하는 단계;
    b) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 및 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하고; 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제1 형질감염 벡터를 제공하고; 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제와 상이한 제2 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제2 형질감염 벡터를 제공하는 단계;
    b1) 원핵 복제 기점; 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열; 및 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열, 또는 이들 둘다를 포함하는 핵산을 제공하고; 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제 및 제2 진핵 선별제와 상이한 제3 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제3 형질감염 벡터를 제공하는 단계;
    c) 상기 CHO 세포를, 하기 단계 (i) 내지 (vi)를 하기 순서대로 포함하는 방법으로 형질감염시키는 단계:
    (i) 상기 CHO 세포를 상기 제1 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계,
    (ii) 상기 (i)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
    (iii) 단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포를 상기 제2 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계,
    (iv) 단계 (iii)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제 및 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
    (v) 단계 (iv)에서 선별된 CHO 세포를 상기 제3 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
    (vi) 단계 (v)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제, 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제2 진핵 선별제, 및 제3 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제3 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계;
    d) 상기 형질감염된 CHO 세포를, 상기 제1 진핵 선별제, 상기 제2 진핵 선별제 및 상기 제3 진핵 선별제의 존재 하에서 배지 중에서 배양하는 단계; 및
    e) 분비된 이종 면역글로불린을 배양 배지로부터 회수하여 CHO 세포에서 배양 배지로 분비되는 이종 면역글로불린을 제조하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    CHO 세포가 CHO-K1 세포, CHO DG44 세포, CHO XL99 세포, CHO DXB11 세포 또는 CHO DP12 세포임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    제2 핵산, 제3 핵산, 또는 이들 둘다가 하이브리드 인트론 핵산 서열을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    제1 형질감염 벡터와 제2 형질감염 벡터가 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산에서만 서로 상이함을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    단계 c) 및 단계 d)를 동일한 배지 중에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    배지가 혈청-무함유 배지, 동물-유래의 성분으로 보충된 혈청-무함유 배지, 동물-유래의 성분-무함유 배지, 단백질-무함유 배지, 동물-유래의 성분으로 보충된 단백질-무함유 배지, 또는 화학적으로 정의된 배지임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계 d)에서 배양을 500 ℓ 미만의 부피로 진핵 선별제의 존재 하에서 수행하고 상기 배양을 500 ℓ 이상의 부피로 진핵 선별제의 부재 하에서 수행하며, 분비되는 이종 면역글로불린을 상기 진핵 선별제 없이 배양 배지로부터 회수함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    40 세대 후 CHO 세포의 생산성이 10 세대 동안 분할-회분(split-batch) 배양된 후 생산성의 70% 이상 내지 130% 이하임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    CHO 세포의 생산성이 유가-회분(fed-batch) 배양된 지 21일 이내에 1.5 g/ℓ 이상의 이종 면역글로불린이 생성되는 수준임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    f) 이종 면역글로불린을 1개 이상의 크로마토그래피 단계로 정제하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    단계 c)의 형질감염된 CHO 세포의 배가 시간(doubling time)이 하위단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포의 배가 시간의 150% 이하이고, 단계 c)의 형질감염된 CHO 세포의 부피 수율(volumetric yield)이 하위단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포의 부피 수율의 125% 이상임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 면역글로불린이 항-Aβ 항체임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 면역글로불린이 항-P-셀렉틴(Selectin) 항체임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 면역글로불린이 항-IL-13Rα 항체임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 면역글로불린이 항-CD4 항체 접합체임을 특징으로 하는 방법.
  17. 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는 방법에 의해 수득된 CHO 세포:
    a) 현탁 배양물 중에서 생장하도록 적응되고, 혈청-무함유 배지 중에서 생장하도록 적응되고, 마이코플라즈마를 함유하지 않는 CHO 세포를 제공하는 단계;
    b) 원핵 복제 기점, 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열, 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 및 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하고; 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제1 형질감염 벡터를 제공하고; 상기 제공된 핵산, 및 상기 제1 진핵 선별제와 상이한 제2 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제2 형질감염 벡터를 제공하는 단계;
    b1) 원핵 복제 기점; 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 제1 핵산 서열; 및 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열, 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열, 또는 이들 둘다를 포함하는 핵산을 제공하고; 상기 제공된 핵산, 및 제1 진핵 선별제 및 제2 진핵 선별제와 상이한 제3 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 제3 형질감염 벡터를 제공하는 단계; 및
    c) 상기 CHO 세포를, 하기 단계 (i) 내지 (vi)를 하기 순서대로 포함하는 방법으로 형질감염시키는 단계:
    (i) 상기 CHO 세포를 상기 제1 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계,
    (ii) 상기 (i)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
    (iii) 단계 (ii)에서 선별된 CHO 세포를 상기 제2 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계,
    (iv) 단계 (iii)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제 및 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제2 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계,
    (v) 단계 (iv)에서 선별된 CHO 세포를 상기 제3 형질감염 벡터로 형질감염시키는 단계, 및
    (vi) 단계 (v)에서 형질감염된 CHO 세포를, 제1 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제1 진핵 선별제, 제2 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제2 진핵 선별제, 및 제3 형질감염 벡터가 내성을 부여하는 제3 진핵 선별제를 함유하는 배양 배지 중에서 선별 생장시킴으로써 선별하는 단계.
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