ES2695999T3

ES2695999T3 - Expresión de proteínas a partir de múltiples ácidos nucleicos

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Publication number: ES2695999T3
Application number: ES12191535T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Goepfert; Hendrik Knoetgen; Erhard Kopetzki; Anne Stern
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2028-10-09
Also published as: AU2008309934B2; MX2010003622A; EP2592148A1; CN101815786A; WO2009046978A1; IL203902A0; EP2592148B1; BRPI0818165B1; US20100221781A1; EP2207882A1; PL2592148T3; CN101821394A; JP2011500009A; DK2592148T3; AU2008309934A1; BRPI0818165B8; IL203900A; HUE039950T2; AU2008309881A1; SI2592148T1

Abstract

Procedimiento para la producción recombinante de una inmunoglobulina heteróloga en una célula CHO que se secreta al medio de cultivo que comprende: a) proporcionar una célula CHO, que está - adaptada al crecimiento en cultivo en suspensión. - adaptada al crecimiento en medio sin suero, - sin micoplasmas, b) proporcionar un ácido nucleico que comprende - un origen de replicación procariótico, - una primera secuencia de ácido nucleico que confiere resistencia a un agente de selección procariótico, - una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heteróloga, y/o - una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heteróloga, de manera que se proporciona un primer vector de transfección que comprende dicho ácido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de ácido nucleico adicional que confiere resistencia a un primer agente de selección eucariótico, de manera que se proporciona un segundo vector de transfección que comprende dicho ácido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de ácido nucleico adicional que confiere resistencia a un segundo agente de selección eucariótico, de manera que dicho segundo agente de selección eucariótico sea diferente de dicho primer agente de selección eucariótico, b1) proporcionar un ácido nucleico que comprende - un origen de replicación procariótico, - una primera secuencia de ácido nucleico que confiere resistencia a un agente de selección 40 procariótico, - una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heteróloga, y/o una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heteróloga, de manera que se proporciona un tercer vector de transfección que comprende dicho ácido nucleico proporcionado y una secuencia adicional de un cuarto ácido nucleico que confiere resistencia a un tercer agente de selección eucariótico, de manera que dicho tercer agente de selección eucariótico es diferente de dicho primer agente de selección eucariótico y también es diferente de dicho segundo agente de selección eucariótico, c) transfectar dicha célula CHO, en la que dicha transfección comprende las siguientes etapas en el siguiente orden: (i) transfectar dicha célula CHO con dicho primer vector de transfección, (ii) seleccionar una célula CHO transfectada en (i) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene un primer agente de selección eucariótico al que el primer vector de transfección confiere resistencia, (iii) transfectar dicha célula CHO seleccionada en (ii) con dicho segundo vector de transfección, (iv) seleccionar una célula CHO transfectada en (iii) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de selección eucariótico al que el primer vector de transfección confiere resistencia y dicho segundo agente de selección eucariótico al que el segundo vector de transfección confiere resistencia, (v) transfectar dicha célula CHO seleccionada en (iv) con dicho tercer vector de transfección, (vi) seleccionar una célula CHO transfectada en (v) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de selección eucariótico al que el primer vector de transfección confiere resistencia y dicho segundo agente de selección eucariótico al que el segundo vector de transfección confiere resistencia y dicho tercer agente de selección eucariótico al que el tercer vector de transfección confiere resistencia, d) cultivar dicha célula CHO transfectada en un medio en presencia de dicho primer y dicho segundo y dicho tercer agente de selección eucariótico, en condiciones adecuadas para la expresión de dicho primer, segundo y/o tercer ácido nucleico, e) recuperar dicha inmunoglobulina heteróloga secretada del medio de cultivo y producir así una inmunoglobulina heteróloga en una célula CHO que se secreta al medio de cultivo, en el que el primer, segundo y tercer vector de transfección difieren cada uno solo en el ácido nucleico que confiere resistencia a dicho primero, segundo y tercer agente de selección eucariótico.

Description

DESCRIPCION

Expresion de protefnas a partir de multiples acidos nucleicos

La presente invencion se encuentra en el campo de la produccion de polipeptidos. Mas precisamente, se informa de la produccion de una inmunoglobulina en una celula de mamffero, de manera que la celula de mamffero se transfecta con diferentes vectores, cada uno de los cuales comprende un casete de expresion para la inmunoglobulina de interes.

Antecedentes de la invencion

Los sistemas de expresion para la produccion de polipeptidos recombinantes son bien conocidos en el estado de la tecnica y los describen, por ejemplo, Marino, Mh , Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., y Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159. Los polipeptidos para uso en aplicaciones farmaceuticas se producen preferentemente en celulas de mamffero tales como celulas CHO, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas COS, celulas HEK, celulas BHK, celulas PER.C6® o similares. Los elementos esenciales de un plasmido de expresion son una unidad de propagacion de plasmidos procariotas, por ejemplo, para E. coli, que comprende un origen de replicacion procariotico, y un marcador de seleccion, un marcador de seleccion eucariotico y uno o mas casetes de expresion para la expresion del gen o genes estructurales de interes, comprendiendo cada uno un promotor, un gen estructural y un terminador de la transcripcion que incluye una senal de poliadenilacion. Para la expresion transitoria en celulas de mamffero se puede incluir un origen de replicacion de mamffero, tal como el SV40 Ori u OriP. Como promotor, se puede seleccionar un promotor constitutivo o inducible. Para la transcripcion optimizada, se puede incluir una secuencia de Kozak en la region no traducida 5'. Para el procesamiento de ARNm, en particular el corte y empalme de ARNm y la terminacion de la transcripcion, pueden incluirse senales de corte y empalme de ARNm, dependiendo de la organizacion del gen estructural (organizacion de exones e intrones), asf como una senal de poliadenilacion.

La expresion de un gen se realiza como expresion transitoria o como permanente. El polipeptido o polipeptidos de interes son en general polipeptidos secretados y, por lo tanto, contienen una extension N-terminal (tambien conocida como secuencia senal) que es necesaria para el transporte/secrecion del polipeptido a traves de la celula hacia el medio extracelular. En general, la secuencia senal puede derivarse de cualquier gen que codifique un polipeptido secretado. Si se usa una secuencia senal heterologa, preferentemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa senal) por la celula huesped. Para la secrecion en levadura, por ejemplo, la secuencia senal nativa de un gen heterologo que debe expresarse puede sustituirse por una secuencia senal de levadura homologa derivada de un gen secretado, como la secuencia senal de invertasa de levadura, Ifder del factor alfa (incluyendo los Ifderes del factor a de Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Hansenula, el segundo descrito en el documento US 5.010.182), la secuencia senal de fosfatasa acida o la secuencia senal de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 0362179). En la expresion de celulas de mamfferos, la secuencia senal nativa de la protefna de interes es satisfactoria, aunque otras secuencias senal de mamfferos pueden ser adecuadas, tales como las secuencias senal de polipeptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, por ejemplo, para inmunoglobulinas de origen humano o murino, asf como secuencias senal secretoras vfricas, por ejemplo, la secuencia senal de la glucoprotefna D del herpes simple. El fragmento de ADN que codifica un presegmento de este tipo esta ligado en marco al fragmento de ADN que codifica un polipeptido de interes.

En la actualidad, las celulas CHO se utilizan ampliamente para la expresion de polipeptidos farmaceuticos, ya sea a pequena escala en el laboratorio o a gran escala en los procesos de produccion. Debido a su amplia distribucion y uso, las propiedades caracterfsticas y el acervo genetico de las celulas CHO son bien conocidos. Por lo tanto, las celulas CHO estan aprobadas por las autoridades reguladoras para la produccion de protefnas terapeuticas para la aplicacion en seres humanos.

En el documento EP 0569678 se describen dobles transfectantes de genes MHC como vacunas celulares para la inmunoprevencion de la metastasis tumoral. El documento WO 97/08342 informa de un procedimiento mejorado para medir la actividad de una secuencia promotora en una celula de mamffero utilizando un gen indicador. En el documento WO 2005/113770 se informa del uso de los ARNip anti-RhoA y anti-RhoC para inhibir especfficamente la sfntesis de RhoA o RhoC. En el documento US 7.202.072 se informa de un procedimiento para la produccion o expresion recombinante de mutante de fosfatasa alcalina eucariotica en celulas de levadura. El documento WO 2001/038557 informa de un procedimiento de cribado de celulas transformadas de manera multiple utilizando la expresion bicistronica de protefnas fluorescentes. En el documento WO 1999/47647 se informa de un procedimiento para producir lfneas celulares eucarioticas recombinantes que expresan multiples protefnas o ARN de interes. En el documento WO 2003/076588 se informa de sistemas, incluidos procedimientos, composiciones y kits, para la transfeccion de celulas con materiales de transfeccion utilizando vehfculos codificados. En el documento US 5.089.397 se informa de un sistema de expresion para la produccion recombinante de una protefna deseada que comprende celulas CHO transformadas con una secuencia de ADN que tiene la secuencia codificante de la protefna deseada bajo el control del promotor de la metalotionefna II humana. En el documento US 2003/0040047 se informa de un procedimiento para producir protefnas recombinantes. Lamango et al. (Lamango, NS, et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 238-250) informan de la dependencia de la produccion de prohormona convertasa 2 de la presencia del polipeptido neuroendocrino 7B2. En Waldenstroem, M., et al., Gene 120 (1992) 175-181 se informa de la transfeccion de un vector de expresion basado en BPV-1 en celulas que albergan genomas de BPV-1 replicantes no integrados. El documento US 4.912.038 informa de procedimientos y vectores para obtener protefna tensioactiva alveolar 32K humana y canina. En el documento WO 89/10959 se informa de tecnicas de ADN recombinante y la expresion de polipeptidos de mamfferos en celulas eucarioticas modificadas geneticamente. En el documento DD 287531 se informa de una cotransferencia repetida de un vector de expresion para la hormona de crecimiento humana y un vector de expresion para un gen marcador de seleccion.

El documento WO 93/01296 informo de la produccion de anticuerpos en celulas infectadas por el virus de la vaccinia. En el documento WO 95/17513 se informa de la retransformacion de hongos filamentosos. El documento US 2003/096341 informo de la expresion de fosfatasa alcalina en levaduras. En el documento WO 2007/113172 se informa de los anticuerpos contra el peptido amiloide beta.

Moretto, N., et al. informaron de anticuerpos sensibles a la conformacion contra el amiloide beta de la enfermedad de Alzheimer por vacunacion con un peptido epitopico de linfocitos B restringido a tiorredoxina (J. Biol. Chem. 282 (2007) 11436-11445).

El documento US-A-5852 175 informo de anticuerpos bloqueantes del ligando de glucoprotefna P-selectina. En el documento WO 94/25067 se informa de los anticuerpos contra la P-selectina y sus usos.

Sumario de la invencion

La invencion se define en las reivindicaciones.

Un primer aspecto de la presente invencion es un procedimiento para la produccion recombinante de una inmunoglobulina heterologa que se secreta al medio de cultivo en una celula CHO que comprende:

a) proporcionar una celula CHO, que esta

- adaptada al crecimiento en cultivo en suspension.

- adaptada al crecimiento en medio sin suero,

- sin micoplasmas, y

- opcionalmente sin virus,

b) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

- una primera secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion procariotico,

- una segunda secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa, y/o una tercera secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa,

de manera que se proporciona un primer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado, que comprende dicho primer asf como dicho segundo y/o tercer acido nucleico, y una secuencia adicional de un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un primer agente de seleccion eucariotico, y

de manera que se proporciona un segundo vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado, que comprende el primer asf como el segundo y/o tercer acido nucleico identico al del/al de los contenido(s) en dicho acido nucleico proporcionado contenido en el primer vector de transfeccion, y una secuencia adicional de un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un segundo agente de seleccion eucariotico, que es diferente del cuarto acido nucleico en dicho primer vector de transfeccion, de manera que dicho segundo agente de seleccion eucariotico es diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico,

b1) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

de manera que se proporciona un tercer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una secuencia adicional de un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un tercer agente de seleccion eucariotico, de manera que dicho tercer agente de seleccion eucariotico es diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico y tambien es diferente de dicho segundo agente de seleccion eucariotico,

c) transfectar dicha celula CHO proporcionada y seleccionar dicha celula CHO transfectada con dichos vectores de transfeccion de la etapa b), en la que dicha transfeccion y seleccion comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(i) transfectar dicha celula CHO con dicho primer vector de transfeccion,

(ii) seleccionar una celula CHO transfectada en (i) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia,

(iii) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (ii) con dicho segundo vector de transfeccion,

(iv) seleccionar una celula CHO transfectada en (iii) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico, al que dicho primer vector de transfeccion confiere resistencia, y que contiene dicho segundo agente de seleccion eucariotico, al que dicho segundo vector de transfeccion confiere resistencia,

(v) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (iv) con dicho tercer vector de transfeccion,

(vi) seleccionar una celula CHO transfectada en (v) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia y dicho segundo agente de seleccion eucariotico al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia y dicho tercer agente de seleccion eucariotico al que el tercer vector de transfeccion confiere resistencia,

d) cultivar dicha celula CHO transfectada y seleccionada de la etapa c) en un medio que contiene dicho primer y segundo y dicho tercer agente de seleccion eucariotico en condiciones adecuadas para la expresion de dicho segundo y/o tercer acido nucleico,

e) recuperar dicha inmunoglobulina heterologa secretada del medio de cultivo y producir asf una inmunoglobulina heterologa en una celula CHO, secretandose dicha inmunoglobulina al medio de cultivo.

En un modo de realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, dicha celula CHO es una celula CHO K1, o una celula CHO DG44, o una celula CHO XL99, o una celula CHO DXB11, o una celula CHO DP12. En otro modo de realizacion, el promotor empleado para la transcripcion de dichos segundo y tercer acidos nucleicos es diferente del promotor empleado para la transcripcion de dicho cuarto acido nucleico. Otro modo de realizacion es que el promotor empleado para la transcripcion de dichos segundo y tercer acidos nucleicos es el mismo. En un modo de realizacion, dicho promotor empleado para la transcripcion de dicho segundo y tercer acido nucleico es el promotor de CMV. En otro modo de realizacion, dicho promotor empleado para la transcripcion de dicho cuarto acido nucleico es el promotor de SV40. En un modo de realizacion, dicha inmunoglobulina heterologa es un anticuerpo anti-Ap. En el documento WO 2003/070760, por ejemplo, se informa de anticuerpos anti-Ap ejemplares.

En un modo de realizacion, dicha seleccion de una celula CHO transfectada en la etapa c) (ii) y/o (iv) es mediante el crecimiento en un medio de cultivo sin un agente de seleccion durante 10 a 72 horas, seguido de crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico en el caso de (ii) o dicho primer y segundo agente de seleccion eucariotico en el caso de (iv).

En otro modo de realizacion mas, el uso de codones de dicho segundo y tercer acido nucleico se optimiza para la traduccion en celulas CHO. Tambien es un modo de realizacion que dicho segundo y/o tercer acido nucleico contiene una secuencia de acido nucleico intronica. Otro modo de realizacion comprende que dicho primer vector de transfeccion y dicho segundo vector de transfeccion difieren solamente en el acido nucleico que confiere resistencia a dicho agente de seleccion eucariotico, es decir, en dicho cuarto acido nucleico, y, por lo demas, son al menos un 95 % identicos segun la secuencia de acido nucleico. En otro modo de realizacion, dichos vectores de transfeccion difieren cada uno solo en el acido nucleico que confiere resistencia a dicho primer, segundo y tercer agente de seleccion eucariotico.

En un modo de realizacion, dicha seleccion de una celula CHO transfectada en la etapa c) (vi) es mediante crecimiento en un medio de cultivo sin un agente de seleccion durante 10 a 72 horas, seguido de crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer y segundo y tercer agentes de seleccion eucarioticos.

En otro modo de realizacion, el procedimiento de acuerdo con la invencion comprende una etapa adicional. f) purificar dicha inmunoglobulina heterologa producida y recuperada por recombinacion de la etapa e) con una o mas etapas cromatograficas.

Un modo de realizacion es que dicha etapa c) y dicha etapa d) se realizan en el mismo medio. Otro modo de realizacion es que dicho medio es un medio sin suero, o un medio sin suero suplementado con componentes definidos de origen animal, o un medio sin componentes de origen animal, o un medio sin protefnas, o un medio definido qufmicamente, o un medio definido sin protefnas. En otro modo de realizacion en dicha etapa d), dicho cultivo se realiza en presencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en un volumen de menos de 500 litros y dicho cultivo se realiza en ausencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en un volumen de 500 litros o mas, de manera que dicha recuperacion de dicha inmunoglobulina heterologa secretada procede del medio de cultivo sin dichos agentes de seleccion eucarioticos. En otro modo de realizacion, dicho cultivo en dicha etapa d) comprende cultivos secuenciales, cada uno con un volumen de cultivo creciente hasta un volumen de cultivo final preestablecido, de modo que los cultivos se realizan en presencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos hasta un volumen de cultivo de un 1 % (v/v) del volumen de cultivo del cultivo final y en ausencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en un volumen de cultivo de mas de un 1 % (v/v) del volumen de cultivo del cultivo final.

La productividad de dichas celulas CHO es, en un modo de realizacion, durante 40 generaciones, no menos de un 70 % y no mas de un 130 % de la productividad despues de 10 generaciones de cultivo como cultivo discontinuo. En otro modo de realizacion, la productividad de dichas celulas CHO durante 60 generaciones es de no menos de un 50 % y no mas de un 150 % de la productividad despues de 10 generaciones de cultivo como cultivo discontinuo. En otro modo de realizacion mas, la productividad de dicha celula CHO es de al menos 1,5 g/l de dicha inmunoglobulina heterologa en un plazo de 21 dfas como cultivo en regimen discontinuo alimentado.

Un segundo aspecto de la presente invencion es una celula CHO obtenible con el siguiente procedimiento: a) proporcionar una celula CHO, que esta

- adaptada al crecimiento en cultivo en suspension.

- adaptada al crecimiento en medio sin suero,

- sin micoplasmas, y

- opcionalmente sin virus,

b) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

- una segunda secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina heterologa, y/o una tercera secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina heterologa,

de manera que se proporciona un primer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado, que comprende dicho primer asf como segundo y/o tercer acido nucleico, y una secuencia adicional de un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un primer agente de seleccion eucariotico, y de manera que se proporciona un segundo vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado, que comprende el primer asf como el segundo y/o tercer acido nucleico identico al del/al de los contenido(s) en dicho acido nucleico proporcionado contenido en el primer vector de transfeccion, y una secuencia adicional de un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un segundo agente de seleccion eucariotico, que es diferente del cuarto acido nucleico en dicho primer vector de transfeccion, de manera que dicho segundo agente de seleccion eucariotico es diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico,

b1) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

c) transfectar dicha celula CHO, en la que dicha transfeccion comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(i) transfectar dicha celula CHO con dicho primer vector de transfeccion,

(ii) seleccionar una celula CHO transfectada en (i) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene un primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia,

(iv) seleccionar una celula CHO transfectada en (iii) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia y dicho segundo agente de seleccion eucariotico al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia,

(vi) seleccionar una celula CHO transfectada en (v) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia y dicho segundo agente de seleccion eucariotico al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia y dicho tercer agente de seleccion eucariotico al que el tercer vector de transfeccion confiere resistencia.

Descripcion detallada de la invencion

Procedimientos y tecnicas conocidos por un experto en la tecnica, que son utiles para llevar a cabo la presente invencion, se describen, por ejemplo, en Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, volumenes I a III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Los procedimientos cromatograficos generales y su uso son conocidos por un experto en la tecnica. Vease, por ejemplo, Chromatography, 5.a edicion, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; o Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York.

Para la purificacion de inmunoglobulinas heterologas producidas de forma recombinante se emplea a menudo una combinacion de diferentes etapas de cromatograffa en columna. En general, una cromatograffa de afinidad con protefna A va seguida por una o dos etapas de separacion adicionales. La etapa de purificacion final es la llamada “etapa de pulido” para la retirada de contaminantes e impurezas traza, como inmunoglobulinas agregadas, HCP (protefna de la celula huesped) residual, ADN (acido nucleico de la celula huesped), virus o endotoxinas. Para esta etapa de pulido se usa a menudo un material de intercambio anionico en modo de fraccion no adsorbida.

Diferentes procedimientos estan bien establecidos y se usan ampliamente para la recuperacion y purificacion de protefnas, tales como cromatograffa de afinidad con protefnas microbianas (por ejemplo, cromatograffa de afinidad con protefna A o protefna G), cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, intercambio cationico (resinas de carboximetilo), intercambio anionico (resinas de aminoetilo) e intercambio mixto), adsorcion tiofflica (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), cromatograffa de interaccion hidrofoba o adsorcion aromatica (por ejemplo, con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofflicas o acido m-aminofenilboronico), cromatograffa de afinidad por quelatos metalicos (por ejemplo, con material de afinidad por Ni(II) y Cu(II)), cromatograffa de exclusion por tamano y procedimientos electroforeticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

El termino “aminoacido” como se usa en la presente solicitud, denota un grupo de carboxi a-aminoacidos, que directamente o en forma de un precursor pueden ser codificados por un acido nucleico. Los aminoacidos individuales se codifican por acidos nucleicos que consisten en tres nucleotidos, denominados codones o tripletes de bases. Cada aminoacido se codifica por al menos un codon. La codificacion del mismo aminoacido por diferentes codones se conoce como “degeneracion del codigo genetico”. El termino “aminoacido” como se usa en esta solicitud denota los carboxi a-aminoacidos naturales y comprenden alanina (codigo de tres letras: ala, codigo de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), acido aspartico (asp, D), cistefna (cys, C), glutamina (gln, Q), acido glutamico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).

Un “acido nucleico” o una “secuencia de acido nucleico”, que son terminos que se usan indistintamente en esta solicitud, se refiere a una molecula polimerica que consiste en los nucleotidos individuales (tambien denominados bases) a, c, g y t (o u en el ARN), por ejemplo, para ADN, ARN o modificaciones de los mismos. Esta molecula de polinucleotido puede ser una molecula de polinucleotido de origen natural o una molecula de polinucleotido sintetico o una combinacion de una o mas moleculas de polinucleotido de origen natural con una o mas moleculas de polinucleotido sintetico. Tambien se engloban en esta definicion las moleculas de polinucleotido de origen natural en las que se cambian (por ejemplo, mediante mutagenesis), eliminan o anaden uno o mas nucleotidos. Un acido nucleico se puede aislar o integrar en otro acido nucleico, por ejemplo, en un casete de expresion, un plasmido o el cromosoma de una celula hospedadora. Un acido nucleico se caracteriza asimismo por su secuencia de acido nucleico que consiste en nucleotidos individuales.

Un experto en la tecnica conoce bien los procedimientos y tecnicas para convertir una secuencia de aminoacidos, por ejemplo, de un polipeptido, en una secuencia de acido nucleico correspondiente que codifica esta secuencia de aminoacidos. Por lo tanto, un acido nucleico se caracteriza por su secuencia de acido nucleico que consiste en nucleotidos individuales y asimismo por la secuencia de aminoacidos de un polipeptido codificado por el mismo.

Un “polipeptido” es un polfmero que consiste en aminoacidos unidos por enlaces peptfdicos, ya sean producidos natural o sinteticamente. Los polipeptidos de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoacidos se pueden denominar “peptidos”, mientras que las moleculas que consisten en dos o mas polipeptidos o que comprenden un polipeptido de mas de 100 residuos de aminoacidos se pueden denominar “protemas”. Un polipeptido tambien puede comprender componentes no aminoacidos, tales como grupos carbohidrato, iones metalicos o esteres de acido carboxflico. Los componentes no aminoacidos pueden ser anadidos por la celula en la que se expresa el polipeptido, y pueden variar con el tipo de celula. Los polipeptidos se definen en el presente documento en terminos de la estructura de su esqueleto de aminoacidos o del acido nucleico que codifica los mismos. Las adiciones tales como grupos carbohidrato, en general, no se especifican, pero, no obstante, pueden estar presentes.

El termino “inmunoglobulina” engloba las diversas formas de estructuras de inmunoglobulina, incluidas las inmunoglobulinas completas y los conjugados de inmunoglobulina. La inmunoglobulina empleada en la presente invencion es preferentemente un anticuerpo humano, o un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimerico, o un anticuerpo con reduccion de antfgenos de linfocitos T (veanse, por ejemplo, los documentos WO 98/33523, WO 98/52976 y WO 00/34317). La ingenierfa genetica de anticuerpos se describe, por ejemplo, en Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; los documentos US 5.202.238 y US 5.204.244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotecnol. 23 (2005) 1117-1125. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)², asf como cadenas sencillas (scFv) o diacuerpos (por ejemplo, Huston, J.S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; en general, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2.a edicion (1984); y Hunkapiller, T. y Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).

El termino “inmunoglobulina completa” denota una inmunoglobulina que comprende dos de las llamadas cadenas ligeras y dos de las llamadas cadenas pesadas. Cada una de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina completa contiene un dominio variable (region variable) (en general, la porcion aminoterminal de la cadena polipeptfdica) que comprende regiones de union que son capaces de interaccionar con un antfgeno. Cada una de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina completa comprende una region constante (en general, la porcion carboxiterminal). La region constante de la cadena pesada media en la union del anticuerpo i) con las celulas que tienen un receptor Fc gamma (F^cyR), tales como las celulas fagocfticas, o ii) con las celulas que tienen el receptor Fc neonatal (FcRn), tambien conocido como receptor Brambell. Tambien media en la union con algunos factores, incluyendo los factores del sistema del complemento clasico, tales como el componente (C1q). El dominio variable de la cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina comprende, a su vez, segmentos diferentes, es decir, cuatro regiones estructurales (FR) y tres regiones hipervariables (CDR).

El termino “conjugado de inmunoglobulina” denota un polipeptido que comprende al menos un dominio de una cadena pesada o ligera de una inmunoglobulina conjugada a traves de un enlace peptfdico con otro polipeptido. El otro polipeptido es un peptido no inmunoglobulfnico, tal como una hormona o un receptor de crecimiento o un peptido antifusogenico o un factor del complemento o similar. En el documento WO 2007/045463 se informa de conjugados de inmunoglobulina ejemplares.

El termino “inmunoglobulina heterologa” denota una inmunoglobulina que no es producida naturalmente por una celula de mamffero o la celula huesped. La inmunoglobulina producida de acuerdo con el procedimiento de la invencion se produce por medios recombinantes. Dichos procedimientos son ampliamente conocidos en el estado de la tecnica y comprenden la expresion de protefnas en celulas procarioticas con la subsiguiente recuperacion y aislamiento de la inmunoglobulina heterologa, y habitualmente, la purificacion hasta una pureza farmaceuticamente aceptable. Para la produccion, es decir, la expresion, de una inmunoglobulina, se insertan un acido nucleico que codifica la cadena ligera y un acido nucleico que codifica la cadena pesada en un casete de expresion mediante procedimientos estandar. Los acidos nucleicos que codifican cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina se afslan y secuencian facilmente usando procedimientos convencionales. Las celulas de hibridoma pueden servir como fuente de dichos acidos nucleicos. Los casetes de expresion se pueden insertar en uno o mas plasmidos de expresion, que luego se transfectan en celulas huesped, que de lo contrario no producen inmunoglobulinas. La expresion se realiza en celulas huesped procarioticas o eucarioticas apropiadas y la inmunoglobulina se recupera de las celulas despues de la lisis o del sobrenadante del cultivo.

Un “polipeptido aislado” es un polipeptido que esta esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lfpidos u otras impurezas proteinaceas asociadas con el polipeptido en la naturaleza. Tfpicamente, una preparacion de polipeptido aislado contiene el polipeptido en una forma altamente purificada, es decir, al menos aproximadamente un 80 % de pureza, al menos aproximadamente un 90 % de pureza, al menos aproximadamente un 95 % de pureza, mayor que un 95 % de pureza o mayor que un 99 % de pureza. Una forma de demostrar que una preparacion de protefna particular contiene un polipeptido aislado es mediante la aparicion de una unica banda despues de la electroforesis en gel con dodecilsulfato sodico (SDS)-poliacrilamida de la preparacion de protefna y la tincion con azul de Coomassie del gel. Sin embargo, el termino “aislado” no excluye la presencia del mismo polipeptido en formas ffsicas alternativas, tales como dfmeros o, de forma alternativa, en formas glucosiladas o derivadas.

“ADN heterologo” o “polipeptido heterologo” se refiere a una molecula de ADN o a un polipeptido, o a una poblacion de moleculas de ADN o a una poblacion de polipeptidos, que no existen de manera natural dentro de una celula huesped dada. Las moleculas de ADN heterologas con respecto a una celula huesped particular pueden contener ADN derivado de la especie de la celula huesped (es decir, ADN endogeno) siempre que el ADN huesped se combine con ADN no huesped (es decir, ADN exogeno). Por ejemplo, se considera que una molecula de ADN que contiene un segmento de ADN no huesped que codifica un polipeptido unido funcionalmente a un segmento de ADN huesped que comprende un promotor es una molecula de ADN heterologa. Por otro lado, una molecula de ADN heterologa puede comprender un gen estructural endogeno unido funcionalmente a un promotor exogeno.

Un peptido o polipeptido codificado por una molecula de ADN no huesped es un peptido o polipeptido “heterologo”.

El termino “celula” o “celula huesped” se refiere a una celula en la que se puede transfectar o se transfecta un acido nucleico, por ejemplo, que codifica un polipeptido heterologo. El termino “celula” incluye tanto las celulas procarioticas, que se usan para la propagacion de plasmidos, como las celulas eucarioticas, que se usan para la expresion de un acido nucleico y la produccion del polipeptido codificado. En un modo de realizacion, las celulas eucarioticas son celulas de mamffero. En otro modo de realizacion, la celula de mamffero es una celula CHO, preferentemente una celula CHO K1 (ATCC CCL-61 o DSM ACC 110), o una celula CHO DG44 (tambien conocida como CHO-DHFR[-], DSM ACC 126), o una celula CHO XL99, una celula CHO-T (vease, por ejemplo, Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963), o una celula CHO-S o una celula Super-CHO (Pak, S.C.O., et al. Cytotechnology. 22 (1996) 139-146). Si estas celulas no estan adaptadas al crecimiento en un medio sin suero o en suspension, se debe realizar una adaptacion antes del uso en el procedimiento actual. Como se usa en el presente documento, la expresion “celula” incluye la celula del sujeto y su d escendencia. Por tanto, las palabras “transformante” y “celula transformada” incluyen la celula del sujeto primario y cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el numero de transferencias o subcultivos. Tambien se entiende que toda la descendencia puede no ser exactamente identica en cuanto al contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Se incluye la descendencia variante que tiene la misma funcion o actividad biologica para la que se ha realizado el cribado en la celula transformada originalmente.

El termino “expresion” como se usa en el presente documento se refiere a procesos de transcripcion y/o traduccion que se producen dentro de una celula. El nivel de transcripcion de una secuencia de acido nucleico de interes en una celula se puede determinar tomando como base la cantidad de ARNm correspondiente que esta presente en la celula. Por ejemplo, el ARNm transcrito de una secuencia de interes se puede cuantificar mediante RT-PCR o mediante hibridacion Northern (vease Sambrook et al., 1989, supra). Los polipeptidos codificados por un acido nucleico de interes se pueden cuantificar mediante diversos procedimientos, por ejemplo, mediante ELISA, analizando la actividad biologica del polipeptido o empleando ensayos que son independientes de dicha actividad, tales como la inmunoelectrotransferencia o el radioinmunoanalisis, usando inmunoglobulinas que reconocen y se unen al polipeptido (vease Sambrook et al., 1989, supra).

Un “casete de expresion” se refiere a una construccion que contiene los elementos reguladores necesarios, tales como promotor y sitio de poliadenilacion, para la expresion de al menos el acido nucleico contenido en una celula.

Un “vector de transfeccion” es un acido nucleico (tambien denominado molecula de acido nucleico) que proporciona todos los elementos requeridos para la expresion del vector de transfeccion que comprende acidos nucleicos/gen o genes estructurales codificantes en una celula huesped. Un vector de transfeccion comprende una unidad de propagacion de plasmido procariotico, por ejemplo, para E. coli, que, a su vez, comprende un origen de replicacion procariotico, y un acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion procariotico; el vector de transfeccion comprende ademas uno o mas acidos nucleicos que confieren resistencia a un agente de seleccion eucariotico, y uno o mas acidos nucleicos que codifican un polipeptido de interes. Preferentemente, los acidos nucleicos que confieren resistencia a un agente de seleccion y el acido o acidos nucleicos que codifican un polipeptido de interes se colocan cada uno dentro de un casete de expresion, de manera que cada casete de expresion comprende un promotor, un acido nucleico codificante y un terminador de la transcripcion que incluye una senal de poliadenilacion. La expresion genica se coloca habitualmente bajo el control de un promotor, y se dice que dicho gen estructural esta “unido funcionalmente al” promotor. De forma similar, un elemento regulador y un promotor mfnimo estan unidos funcionalmente si el elemento regulador modula la actividad del promotor mfnimo.

Un “promotor” se refiere a una secuencia polinucleotfdica que controla la transcripcion de un gen/gen estructural o secuencia de acido nucleico a la que esta unida funcionalmente. Un promotor incluye senales para la union de la ARN polimerasa y la iniciacion de la transcripcion. El promotor o los promotores usados seran funcionales en el tipo celular de la celula huesped en la que se contempla la expresion de la secuencia seleccionada. En la tecnica se conocen bien un gran numero de promotores, incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles de una variedad de fuentes diferentes (y estan identificados en bases de datos tales como GenBank) y estan disponibles como o dentro de polinucleotidos clonados (a partir de, por ejemplo, depositos tales como ATCC, asf como otras fuentes comerciales o individuales). Un “promotor” comprende una secuencia nucleotfdica que dirige la transcripcion de un gen estructural unido funcionalmente. Tfpicamente, un promotor se localiza en la region no codificante o no traducida 5' de un gen, proximal al lugar de inicio de la transcripcion de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que actuan en la iniciacion de la transcripcion a menudo se caracterizan por secuencias nucleotfdicas consenso. Estos elementos promotores incluyen sitios de union a la ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos especfficos de diferenciacion (DSE; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-560), elementos de respuesta al AMP cfclico (Cr E), elementos de respuesta al suero (SRE; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58), elementos de respuesta a los glucocorticoides (GRE) y sitios de union para otros factores de transcripcion, como CRE/ATF (O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943), AP2 (Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728-25734), SP1, protefna de union al elemento de respuesta al ^aM^pc(CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264) y factores de transcripcion de octameros (vease, en general, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4.a ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), y Lemaigre, F.P. y Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14). Entre los promotores eucarioticos que se han identificado como promotores potentes para expresion de alto nivel estan el promotor temprano de SV40, el promotor tardfo principal de adenovirus, el promotor de metalotionefna I murina, la repeticion terminal larga del virus del sarcoma de Rous, el factor 1 alfa de elongacion de hamster chino (CHEF-1, vease, por ejemplo, el documento US 5.888.809), el EF-1 alfa humano, la ubicuitina y el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV IE).

El “promotor” puede ser constitutivo o inducible. Un potenciador (es decir, un elemento de ADN que actua en posicion relativa cis que actua sobre un promotor para aumentar la transcripcion) puede ser necesario para actuar en conjunto con el promotor para aumentar el nivel de expresion obtenido con un promotor solo, y se puede incluir como elemento regulador de la transcripcion. A menudo, el segmento de polinucleotidos que contiene el promotor incluira tambien secuencias potenciadoras (por ejemplo, de CMV o SV40).

Un “potenciador”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia polinucleotidica que potencia la transcripcion de un gen o secuencia codificante a la que esta unida funcionalmente. A diferencia de los promotores, los potenciadores son relativamente independientes de la orientacion y la posicion y se han encontrado en la posicion 5' o 3' (Lusky, M., et al., Mol. Cell Bio., 3 (1983) 1108-1122) con respecto a la unidad de transcripcion, dentro de un intron (Banerji, J., et al., Cell, 33 (1983) 729-740), asf como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio., 4 (1984) 1293-1305). Por lo tanto, los potenciadores se pueden colocar en direccion 5' o 3' respecto al lugar de iniciacion de la transcripcion o a distancias considerables del promotor, aunque en la practica los potenciadores se pueden superponer ffsica y funcionalmente con los promotores. En la tecnica se conocen bien un gran numero de potenciadores, de una variedad de fuentes diferentes (y estan identificados en bases de datos tales como GenBank) y estan disponibles como o dentro de secuencias polinucleotfdicas clonadas (a partir de, por ejemplo, depositos tales como ATCC, asf como otras fuentes comerciales o individuales). Diversos polinucleotidos que comprenden secuencias promotoras (tales como el promotor de CMV comunmente usado) tambien comprenden secuencias potenciadoras. Por ejemplo, todos los promotores potentes enumerados anteriormente tambien pueden contener potenciadores potentes (vease, por ejemplo, Bendig, M., M., Genetic Engineering 7 (Academic Press, 1988) 91 127).

Un “acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion” es un acido nucleico que permite la seleccion especffica a favor o en contra de las celulas que lo portan, en presencia de un agente de seleccion. Dicho acido nucleico tambien se designa como marcador de seleccion. Tfpicamente, un marcador de seleccion conferira resistencia a un agente de seleccion (farmaco) o compensara un defecto metabolico o catabolico en la celula huesped. Un marcador de seleccion puede ser positivo, negativo o bifuncional. Un marcador de seleccion positivo util es un gen de resistencia a antibioticos. Este marcador de seleccion permite que la celula huesped transformada con el mismo se seleccione positivamente en presencia del agente de seleccion correspondiente, es decir, con crecimiento seleccionado en presencia, por ejemplo, del antibiotico correspondiente. Una celula no transformada no es capaz de crecer ni sobrevivir en las condiciones de crecimiento selectivo, es decir, en presencia del agente de seleccion, en el cultivo. Los marcadores de seleccion positivos permiten la seleccion de las celulas que portan el marcador, mientras que los marcadores de seleccion negativos permiten que las celulas que portan el marcador se eliminen selectivamente. Los marcadores de seleccion eucarioticos incluyen, por ejemplo, los genes de la aminoglucosido fosfotransferasa (APH) (que confieren resistencia a los agentes de seleccion tales como, por ejemplo, higromicina (hyg), neomicina (neomicina fosfotransferasa II, neo) y G418), dihidrofolato reductasa (DHFR) (que confiere resistencia al agente de seleccion metotrexato), timidina cinasa (tk), glutamina sintetasa (GS), asparagina sintetasa, triptofano sintetasa (que confiere resistencia al agente de seleccion indol), histidinol deshidrogenasa (que confiere resistencia al agente de seleccion histidinol D), citidina desaminasa, adenosina desaminasa y acidos nucleicos que confieren resistencia a puromicina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, zeocina y acido micofenolico. Por ejemplo, en los documentos WO 92/08796 y WO 94/28143 se informa de otros acidos nucleicos marcadores de seleccion. Los marcadores de seleccion procarioticos incluyen, por ejemplo, el gen de la betalactamasa (que confiere resistencia al agente de seleccion ampicilina).

La expresion de un gen se realiza como expresion transitoria o como permanente. El polipeptido o polipeptidos de interes son en general polipeptidos secretados y, por lo tanto, contienen una extension N-terminal (tambien conocida como secuencia senal) que es necesaria para el transporte/secrecion del polipeptido a traves de la pared celular hacia el medio extracelular. En general, la secuencia senal puede derivarse de cualquier gen que codifique un polipeptido secretado. Si se usa una secuencia senal heterologa, preferentemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa senal) por la celula huesped. Para la secrecion en levadura, por ejemplo, la secuencia senal nativa de un gen heterologo que debe expresarse puede sustituirse por una secuencia senal de levadura homologa derivada de un gen secretado, como la secuencia senal de invertasa de levadura, lfder del factor alfa (incluyendo los lfderes del factor a de Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Hansenula, el segundo descrito en el documento US 5.010.182), la secuencia senal de fosfatasa acida o la secuencia senal de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 0362179). En la expresion de celulas de mamfferos, la secuencia senal nativa de la protefna de interes es satisfactoria, aunque otras secuencias senal de mamfferos pueden ser adecuadas, tales como las secuencias senal de polipeptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, por ejemplo, para inmunoglobulinas de origen humano o murino, asf como secuencias senal secretoras vfricas, por ejemplo, la secuencia senal de la glucoprotefna D del herpes simple. El fragmento de ADN que codifica un presegmento de este tipo esta ligado en marco, es decir, esta unido funcionalmente, al fragmento de ADN que codifica un polipeptido de interes.

En el presente documento se divulga un procedimiento para la produccion recombinante de una inmunoglobulina heterologa secretada en una celula CHO que comprende:

a) proporcionar una celula CHO, que esta adaptada para el crecimiento en cultivo en suspension, adaptada para el crecimiento en medio sin suero, y sin micoplasmas;

b) proporcionar un vector de transfeccion, que comprende los siguientes elementos:

- un origen de replicacion procariotico,

- una segunda secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa, y una tercera secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa,

- una cuarta secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion eucariotico, de manera que cada una de dichas primera a cuarta secuencias de acido nucleico esta contenida en un casete de expresion,

c) transfectar y seleccionar dicha celula CHO, en la que dicha transfeccion y seleccion comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(i) transfectar dicha celula CHO con un vector de transfeccion que comprende dicho primer a tercer acido nucleico y una cuarta secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a un primer agente de seleccion eucariotico,

(ii) seleccionar una celula CHO transfectada en (i) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico,

(iii) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (ii) con un vector de transfeccion que comprende dicho primer a tercer acido nucleico y una cuarta secuencia de acido nucleico diferente de la del vector de transfeccion usada en (i) que confiere resistencia a un segundo agente de seleccion eucariotico diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico,

(iv) seleccionar una celula CHO transfectada en (iii) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer y dicho segundo agente de seleccion eucariotico,

d) cultivar dicha celula CHO transfectada y seleccionada de la etapa c) en un medio de cultivo que contiene dicho primer y segundo agente de seleccion eucariotico, en condiciones adecuadas para la expresion de dicho segundo y tercer acido nucleico,

e) recuperar dicha inmunoglobulina heterologa secretada del medio de cultivo y producir de este modo por recombinacion una inmunoglobulina heterologa.

El procedimiento de acuerdo con la invencion es adecuado para la produccion de una inmunoglobulina heterologa secretada a gran escala, es decir, industrialmente. El cultivo de una celula para la produccion de un polipeptido deseado a gran escala consiste, en general, en una secuencia de cultivos individuales, en los que todos los cultivos excepto el cultivo final, es decir, a gran escala, es decir, el ultimo en la secuencia, se realizan hasta que se alcanza cierta densidad celular en el recipiente de cultivo. Si se alcanza la densidad celular predeterminada, se utiliza todo el cultivo o una fraccion del mismo para inocular el siguiente recipiente de cultivo, que tiene un volumen mayor, hasta 1000 veces el volumen del cultivo precedente. Todos los cultivos que sirven como base para al menos otro cultivo en un volumen mayor se designan como fermentaciones de la serie de siembra. Solo en el cultivo a gran escala, es decir, en el cultivo que no esta destinado a servir como base para otro cultivo en un volumen mayor, que tambien se designa como fermentacion principal, el punto final del cultivo se determina dependiendo de la concentracion de la inmunoglobulina heterologa secretada producida en el medio de cultivo. El termino “gran escala” como se usa en la presente solicitud denota el cultivo final de un proceso de produccion industrial. Preferentemente, un cultivo a gran escala se realiza a un volumen de al menos 100 l, mas preferentemente de al menos 500 l, lo mas preferentemente de al menos 1000 l hasta un volumen de 20000 l. En un modo de realizacion, el medio de cultivo final, es decir, a gran escala, no contiene un agente de seleccion eucariotico.

En un modo de realizacion, el cultivo de dicha celula CHO transfectada se realiza en presencia de dicho agente de seleccion eucariotico en un volumen de menos de 500 litros y el cultivo de dicha celula CHO transfectada se realiza en ausencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en un volumen de 500 litros o mas y dicha recuperacion de dicha inmunoglobulina heterologa secretada procede del medio de cultivo sin dichos agentes de seleccion eucarioticos. En otro modo de realizacion, el cultivo comprende cultivos secuenciales con un volumen de cultivo creciente hasta un volumen de cultivo final, de manera que los cultivos se realizan en presencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos hasta un volumen de cultivo del 1 % (v/v) del volumen de cultivo del cultivo final o principal y en ausencia de todos los dichos agentes de seleccion eucarioticos en un volumen de cultivo de mas de un 1 % (v/v) del volumen de cultivo del cultivo final. En otro modo de realizacion, dicho cultivo comprende cultivos secuenciales de la serie de siembra con un volumen de cultivo creciente, de manera que cada uno de los cultivos de la serie de siembra se realiza en presencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos y la fermentacion principal se realiza en ausencia de todos los dichos agentes de seleccion eucarioticos. En un modo de realizacion, el cultivo de dicha celula CHO transfectada se realiza en presencia de dicho agente de seleccion eucariotico en las fermentaciones de la serie de siembra y el cultivo de dicha celula CHO transfectada se realiza en ausencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en la fermentacion principal y dicha recuperacion de dicha inmunoglobulina heterologa secretada procede del medio de cultivo principal que no contiene dichos agentes de seleccion eucarioticos. En estos modos de realizacion, los agentes de seleccion eucarioticos se anaden durante la fase de crecimiento y se omiten durante la fase de produccion de dicha celula CHO. El termino “fase de produccion” denota el cultivo de una celula CHO en un gran volumen, es decir, la fermentacion principal, despues de lo cual se recupera la inmunoglobulina heterologa producida.

En otro modo de realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, la productividad de dicha celula CHO es durante 40 generaciones de no menos de un 70 % y no mas de un 130 % de la productividad despues de 10 generaciones de cultivo como cultivo discontinuo. En un modo de realizacion, la productividad de dichas celulas CHO es durante 60 generaciones de no menos de un 50 % y no mas de un 150 % de la productividad despues de 10 generaciones de cultivo como cultivo discontinuo. La productividad de dicha celula CHO es de al menos 1,5 g/l de dicha inmunoglobulina heterologa en un plazo de 21 dfas como cultivo en regimen discontinuo alimentado en otro modo de realizacion. En un modo de realizacion, la productividad especffica de la celula CHO obtenida con el procedimiento de acuerdo con la invencion es mas de 1 pg/106 celulas/d, mas de 5 pg/106 celulas/d o mas de 10 pg/106 celulas/d. En un modo de realizacion, la inmunoglobulina heterologa secretada es una inmunoglobulina heterologa secretada completamente procesada. El termino “inmunoglobulina heterologa secretada completamente procesada” denota una inmunoglobulina i) que se secreta al medio de cultivo y cuyas secuencias senal se han escindido, ii) que comprende una region de union a antfgeno, iii) que tiene modificaciones secundarias, tales como sacaridos o polisacaridos unidos, y/o enlaces disulfuro formados correctamente.

En un modo de realizacion de la invencion, la inmunoglobulina heterologa es un anticuerpo anti-Ap. En otro modo de realizacion, el dominio variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-Ap comprende una CDR3 con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 1, 2 o 3. En otro modo de realizacion, el dominio variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-Ap comprende una CDR3 con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 4, 5 o 6. En otro modo de realizacion, dicho anticuerpo anti-Ap comprende un dominio variable de la cadena pesada con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 7, 8 o 9. En otro modo de realizacion mas, dicho anticuerpo anti-Ap comprende un dominio variable de la cadena ligera con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 10, 11 o 12.

En un modo de realizacion de la invencion, la inmunoglobulina heterologa es un anticuerpo anti-P-selectina. En otro modo de realizacion, dicho anticuerpo anti-P-selectina comprende un dominio variable de la cadena pesada con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 13, 14 o 15. En otro modo de realizacion mas, dicho anticuerpo anti-P-selectina comprende un dominio variable de la cadena ligera con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 16, 17 o 18.

En un modo de realizacion de la invencion, la inmunoglobulina heterologa es un anticuerpo anti-IL-13Ra. En otro modo de realizacion, dicho anticuerpo anti-IL-13Ra comprende un dominio variable de la cadena pesada con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22 o 23. En otro modo de realizacion mas, dicho anticuerpo anti-IL-13Ra comprende un dominio variable de la cadena ligera con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la S^eQ ID NO: 24, 25, 26, 27 o 28.

En un modo de realizacion de la invencion, la inmunoglobulina heterologa es un anticuerpo conjugado anti-CD4. En otro modo de realizacion, el dominio variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-CD4 en dicho conjugado comprende una CDR3 con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 29, 30 o 31. En otro modo de realizacion, el dominio variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-CD4 en dicho conjugado comprende una CDR3 con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 32, 33 o 34. En otro modo de realizacion, dicho anticuerpo anti-CD4 en dicho conjugado comprende un dominio variable de la cadena pesada con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 35, 36 o 37. En otro modo de realizacion mas, dicho anticuerpo anti-CD4 en dicho conjugado comprende un dominio variable de la cadena ligera con una secuencia de aminoacidos seleccionada de la SEQ ID NO: 38, 39 o 40.

Una celula de mamffero utilizable para la produccion a gran escala de productos terapeuticos, es decir, polipeptidos destinados al uso en seres humanos, tiene que cumplir distintos criterios. Entre otros, estan los de poder cultivarse en medio sin suero, preferentemente en medio sin componentes derivados de mamffero no definidos, o en un medio sin suero suplementado con componentes derivados de mamffero definidos. El suero es una mezcla de multitud de compuestos. Normalmente se ha utilizado suero bovino para el cultivo de celulas de mamffero. Con el problema emergente de las enfermedades transmisibles de una especie a otra, debe evitarse el uso de suero y otros compuestos derivados de mairnfero no definidos. El termino “compuesto derivado de mamffero no definido” como se usa en la presente solicitud denota compuestos que se derivan de un mamHfero, especialmente preferente de una vaca, un cerdo, una oveja o un cordero, y cuya composicion se puede especificar en menos de un 80 %, preferentemente en menos de un 90 % (p/p). Un “compuesto derivado de mai^ero definido” es un compuesto que se obtiene de un mai^ero, especialmente preferente de una vaca, un cerdo, una oveja o un cordero, y cuya composicion se puede especificar en mas de un 95 % (p/p), preferentemente en mas de un 98 % (p/p), lo mas preferentemente en mas de un 99 % (p/p). Un ejemplo de un compuesto derivado de mamffero definido es el colesterol derivado de lana ovina, y la galactosa derivada de la leche bovina. En un modo de realizacion, el medio puede suplementarse con compuestos no derivados de mamffero definidos o no definidos. Un ejemplo de dicho compuesto no derivado de mamffero es el aceite de hfgado de bacalao.

Por lo tanto, en un modo de realizacion de la presente invencion, el medio utilizado en el cultivo es un medio sin suero, o un medio sin suero suplementado con componentes derivados de mamffero definidos, o un medio sin componentes derivados de mamffero, o un medio sin protefnas, un medio sin protefnas complementado con componentes derivados de mamffero definidos, o un medio definido qufmicamente, o un medio sin componentes derivados de mamffero, o un medio sin protefnas definidas. Ejemplos de un medio sin componentes derivados de mamffero son el medio CD CHO disponible de Invitrogen Corp., o el ProCHO4 disponible de Gibco. Un ejemplo de un medio sin protefnas es HyQ SFM4CHO disponible de Hyclone.

En otro modo de realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, el procedimiento que comienza con la primera transfeccion y termina con la recuperacion de la inmunoglobulina heterologa secretada se realizada en el mismo medio. El termino “en el mismo medio” denota en la presente solicitud que, comenzando con la primera transfeccion y terminando con la recuperacion de la inmunoglobulina heterologa secretada del medio de cultivo, se usa el mismo medio. Esto no denota que haya que anadir los mismos aditivos al medio en todas las etapas, es decir, el medio se puede suplementar con diferentes aditivos en las diferentes etapas del procedimiento. Los aditivos son compuestos que se anaden a un medio en total en menos de un 20 % (p/p), en un modo de realizacion en menos de un 15 % (p/p), en otro modo de realizacion en menos de un 10 % (p/p). En un modo de realizacion, el medio utilizado en el procedimiento de acuerdo con la invencion es el mismo medio en todas las etapas y es un medio adecuado para la produccion a gran escala de la inmunoglobulina heterologa secretada.

Se ha encontrado sorprendentemente que con el procedimiento de acuerdo con la invencion se puede obtener una celula CHO transfectada multiples veces que tiene caracterfsticas de crecimiento similares y una productividad mejorada en comparacion con una celula CHO transfectada una sola vez. El termino “caractensticas de crecimiento similares” denota que la celula CHO transfectada multiples veces crece hasta al menos un 50 % de la densidad celular en el mismo periodo de tiempo que la celula CHO transfectada de una sola vez. En otro modo de realizacion, dicha celula CHO transfectada multiples veces crece hasta al menos un 90 % de la densidad celular que la celula transfectada una sola vez. En otro modo de realizacion mas, el tiempo de duplicacion de la celula transfectada multiples veces es como maximo un 150 % del de la celula transfectada una sola vez. En un modo de realizacion, dicha celula CHO transfectada multiples veces es una celula CHO transfectada dos o tres veces. En otro modo de realizacion, la celula transfectada multiples veces tiene un rendimiento volumetrico mejorado en un medio de cultivo. La productividad general de un proceso de fermentacion a gran escala se determina mejor por el rendimiento volumetrico, es decir, la cantidad de polipeptido por unidad de volumen del cultivo. Este rendimiento volumetrico es el producto de la densidad celular, la productividad especffica de cada celula y el tiempo de cultivo. Por tanto, un cultivo con baja densidad celular pero alta productividad especffica tendra el mismo rendimiento volumetrico en el mismo periodo de tiempo que un cultivo con alta densidad celular pero baja productividad especffica en el mismo tiempo de cultivo. Por tanto, con la celula CHO transfectada multiples veces y el procedimiento de acuerdo con la invencion, es obtenible una celula CHO con caracterfsticas de crecimiento similares pero un rendimiento volumetrico/productividad mejorados en comparacion con las celulas CHO transfectadas una sola vez.

La inmunoglobulina heterologa secretada se puede recuperar del medio de cultivo con procedimientos cromatograficos conocidos por los expertos en la tecnica. Por lo tanto, en un modo de realizacion, el procedimiento de acuerdo con la invencion comprende la etapa final de purificar dicha inmunoglobulina heterologa con una o mas etapas cromatograficas.

Un vector adecuado para uso en el procedimiento de acuerdo con la invencion comprende un origen de replicacion procariotico, y un primer acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion procariotico, y/o un segundo acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa, y/o un tercer acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa, y un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion eucariotico.

El primer acido nucleico comprendido confiere resistencia a la adicion de un agente de seleccion procariotico al medio de cultivo. Agentes de seleccion procarioticos ejemplares son, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, cloranfenicol, tetraciclina o eritromicina. El termino “un acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion” y los equivalentes gramaticales del mismo denota en la presente solicitud que el polipeptido codificado por dicho acido nucleico puede neutralizar dicho agente de seleccion por modificacion o degradacion o puede contrarrestar el efecto de dicho agente de seleccion. Por tanto, una celula que comprende un acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion tiene la capacidad de sobrevivir y proliferar con el agente de seleccion presente en el medio de cultivo. Agentes de seleccion eucarioticos ejemplares son, por ejemplo, neomicina, higromicina, puromicina, metotrexato, Geneticin® (G418) o acido micofenolico. El agente de seleccion se elige con la condicion de que el agente de seleccion procariotico y el eucariotico no sea un metal.

La transfeccion de la celula CHO proporcionada de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invencion se realiza como etapas secuenciales de transfeccion y seleccion. Las celulas CHO adecuadas en el procedimiento de acuerdo con la invencion son, por ejemplo, una celula CHO K1, o una celula CHO DG44, o una celula CHO XL99, o una celula CHO DXB11, o una celula CHO DP12 o una celula super-CHO. Dentro del alcance de la presente invencion, las celulas transfectadas se pueden obtener con sustancialmente cualquier tipo de procedimiento de transfeccion conocido en la tecnica. Por ejemplo, el acido nucleico se puede introducir en las celulas mediante electroporacion o microinyeccion. De forma alternativa, se pueden usar reactivos de lipofeccion tales como FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), LipofectAmine (Invitrogen Corp., EE. UU.) y nucleotransfeccion (AMAX Corp.). De forma alternativa adicional, el acido nucleico se puede introducir en la celula mediante sistemas de vectores vfricos apropiados basados en retrovirus, lentivirus, adenovirus o virus adenoasociados (Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314).

Despues de la transfeccion, las celulas con transfeccion positiva se seleccionan en presencia de agentes de seleccion, es decir, por crecimiento seleccionado. Se ha encontrado sorprendentemente que mas de un agente de seleccion eucariotico puede estar presente en el medio de cultivo sin interferir con el crecimiento y la expresion de polipeptidos heterologos si la celula CHO cultivada se ha transfectado con todos los acidos nucleicos correspondientes requeridos que confieren resistencia a estos agentes de seleccion eucarioticos de acuerdo con la presente invencion. Tambien se ha encontrado que las celulas CHO se pueden cultivar en la presencia concomitante de tres agentes de seleccion eucarioticos sin una reduccion del tiempo de duplicacion en mas de un 150 % del tiempo de duplicacion de la celula CHO no transfectada o transfectada una sola vez. Por lo tanto, la celula CHO transfectada multiples veces comprende acidos nucleicos, que se encuentran en cada etapa de transfeccion del procedimiento de acuerdo con la invencion que comprende un acido nucleico diferente, no transfectado previamente, como cuarto acido nucleico que confiere una nueva resistencia que no estaba ya presente en dicha celula CHO a un agente de seleccion eucariotico diferente. Por lo tanto, despues de la segunda etapa de transfeccion, una celula transfectada con exito se selecciona por cultivo en la presencia concomitante de dos agentes de seleccion eucarioticos diferentes. Despues de la tercera transfeccion, la celula transfectada se puede cultivar para su seleccion en la presencia concomitante de tres agentes de seleccion eucarioticos diferentes.

Por tanto, el vector empleado en las diferentes etapas de transfeccion de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invencion es al menos un 95 % identico a nivel de acido nucleico, excepto por el acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion eucariotico, es decir, el cuarto acido nucleico.

Para la expresion de una inmunoglobulina heterologa secretada, el vector con el que se transfecta la celula CHO y que comprende un acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion eucariotico tambien comprende un acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa y/o un acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa. Si el vector comprende solo un acido nucleico que codifica bien la cadena ligera de dicha inmunoglobulina o la cadena pesada de dicha inmunoglobulina, dicha celula CHO tambien se transfecta en cada etapa mediante otro vector que comprende un acido nucleico que codifica la otra cadena correspondiente de dicha inmunoglobulina.

En un modo de realizacion, de la primera a la cuarta secuencia de acido nucleico comprendidas en los vectores de transfeccion de acuerdo con la invencion (es decir, el primer, segundo y tercer vector de transfeccion) estan contenidas en un casete de expresion. Un “casete de expresion” se refiere a una construccion que contiene los elementos reguladores necesarios, tales como promotor y sitio de poliadenilacion, para la expresion de al menos el acido nucleico contenido en una celula, por ejemplo, un promotor, un acido nucleico que va a expresarse y un terminador de la transcripcion que incluye una senal de poliadenilacion. El promotor contenido en el casete de expresion determina la cantidad de transcripcion del acido nucleico unido funcionalmente y con ello determina la cantidad de la traduccion de dicho acido nucleico. Un primer promotor que induce una mayor cantidad de traduccion de un acido nucleico en comparacion con un segundo promotor se denomina un “promotor mas potente” con respecto a dicho segundo promotor. Esta destinado a producir la inmunoglobulina heterologa secretada y no el polipeptido que confiere resistencia a un agente de seleccion. Por tanto, la capacidad del mecanismo de transcripcion y traduccion de las celulas huesped tiene que dividirse proporcionalmente. Por lo tanto, en un modo de realizacion, el promotor empleado para la transcripcion de dichos segundo y tercer acidos nucleicos es diferente del promotor empleado para la transcripcion de dicho cuarto acido nucleico. En otro modo de realizacion, la cantidad de transcrito de dicho segundo y tercer acido nucleico que codifica las cadenas de dicha inmunoglobulina heterologa es mayor que la cantidad de transcrito de dicho cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion. Por tanto, el promotor empleado para la expresion de dicho segundo y tercer acido nucleico es mas potente que el promotor empleado para la expresion de dicho cuarto acido nucleico. En otro modo de realizacion, el promotor empleado para la transcripcion de dichos segundo y tercer acidos nucleicos es el mismo pero diferente del promotor de dicho cuarto acido nucleico. En un modo de realizacion, el promotor para la expresion de dicho segundo y tercer acido nucleico es el promotor de CMV o una variante del mismo y el promotor para la expresion de dicho cuarto acido nucleico es el promotor de SV40 o una variante del mismo.

En otro modo de realizacion del procedimiento de acuerdo con la invencion, el uso de codones de dicho segundo y tercer acido nucleico se optimiza para la expresion en celulas CHO. Esto permite un uso mas eficiente de los ARN de transferencia presentes en la celula CHO recombinante. En otro modo de realizacion, dicho segundo y/o tercer acido nucleico comprende una secuencia de acido nucleico intronica; en otro modo de realizacion, el acido nucleico intronico es un intron hfbrido raton/humano. En el genoma de las celulas eucarioticas, las secuencias de ADN genomico contienen secuencias de acido nucleico codificantes (exonicas) y no codificantes (intronicas). Despues de la transcripcion del ADN al pre-ARNm, el pre-ARNm tambien contiene estas secuencias de acido nucleico intronicas y exonicas. Antes de la traduccion, las secuencias de acido nucleico intronicas no codificantes se eliminan durante el procesamiento del ARNm mediante corte y empalme de las mismas del transcrito de ARNm primario para generar el ARNm maduro. El corte y empalme del ARNm primario se controla mediante un sitio donador de corte y empalme en combinacion con un sitio aceptor de corte y empalme espaciado adecuadamente. El sitio donador de corte y empalme se localiza en el extremo 5' y el sitio aceptor de corte y empalme se localiza en el extremo 3' de una secuencia intronica y ambos se eliminan solo parcialmente durante el corte y empalme del pre-ARNm.

Para producir un polipeptido secretado, el acido nucleico o los acidos nucleicos de interes que codifican las cadenas de la inmunoglobulina heterologa incluyen un segmento de ADN que codifica una secuencia senal/peptido lfder. La secuencia senal dirige el polipeptido recien sintetizado hacia y a traves de la membrana del retfculo endoplasmatico (ER) donde el polipeptido se puede enviar para la secrecion. La secuencia senal se escinde mediante una peptidasa senal al cruzar la membrana del ER. En cuanto a la funcion de la secuencia senal, es esencial el reconocimiento por parte del mecanismo de secrecion de la celula huesped. Por lo tanto, la secuencia senal usada tiene que ser reconocida por las protefnas y enzimas de la celula huesped del mecanismo de secrecion.

El procedimiento de acuerdo con la invencion comprende una tercera etapa de transfeccion en la etapa c):

(v) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (iv) con dicho vector que comprende una cuarta secuencia de acido nucleico diferente de la del vector de transfeccion usado en (i) y (iii) que confiere resistencia a un tercer agente de seleccion eucariotico, que es diferente de dicho primero y dicho segundo agente de seleccion eucariotico,

(vi) seleccionar una celula CHO transfectada en (v) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer y dicho segundo y dicho tercer agente de seleccion eucariotico.

El medio de cultivo empleado para el cultivo de dicha celula CHO transfectada en la etapa d) comprende ademas un tercer agente de seleccion eucariotico.

Un segundo aspecto de la presente invencion es una celula CHO que expresa una inmunoglobulina heterologa secretada obtenible con el siguiente procedimiento:

a) proporcionar una celula CHO, que esta

- adaptada al crecimiento en cultivo en suspension.

- adaptada al crecimiento en medio sin suero,

- sin micoplasmas,

b) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

de manera que se proporciona un primer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de acido nucleico adicional que confiere resistencia a un primer agente de seleccion eucariotico,

de manera que se proporciona un segundo vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de acido nucleico adicional diferente del cuarto acido nucleico en dicho primer vector de transfeccion que confiere resistencia a un segundo agente de seleccion eucariotico, de manera que dicho segundo agente de seleccion eucariotico sea diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico,

b1) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

(i) transfectar dicha celula CHO con dicho primer vector de transfeccion,

(iv) seleccionar una celula CHO transfectada en (iii) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico, al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia, y dicho segundo agente de seleccion eucariotico, al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia,

El termino “sin virus” que se usa en la presente solicitud denota que la celula CHO no contiene ningun acido nucleico vfrico que resultana si se expresara durante el cultivo en operaciones de procesamiento posteriores, en productos nocivos no separables para humanos.

Se proporcionan los siguientes ejemplos y figuras para ayudar al entendimiento de la presente invencion, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripcion de las figuras

Figura 1 Mapa plasmfdico con anotaciones del plasmido p5128.

Figura 2 Mapa plasmfdico con anotaciones del plasmido p5137.

Figura 3 Mapa plasmfdico con anotaciones del plasmido p5151.

Figura 4 Mapa plasmfdico con anotaciones del plasmido p5057.

Figura 5 Mapa plasmfdico con anotaciones del plasmido p5069.

Figura 6 (A) Tftulos de anticuerpos de clones obtenidos despues de la subclonacion con dilucion limitada y de clones obtenidos con el procedimiento de acuerdo con la invencion; eje de abscisas: (1) G24, (2) dilucion limitada, (3) procedimiento de acuerdo con la invencion; eje de ordenadas: concentracion de inmunoglobulina [pg/mlj.

(B) Tasas de produccion especfficas de clones obtenidos despues de la subclonacion con dilucion limitada y de clones obtenidos con el procedimiento de acuerdo con la invencion; eje de abscisas: (1) G24, (2) dilucion limitada, (3) procedimiento de acuerdo con la invencion; eje de ordenadas: tasa de produccion especffica [pg/d*celulaj.

Figura 7 SDS-Page despues de la purificacion por HPLC con protefna A del anticuerpo. Para las cuatro muestras 35-45, 37-65, 39-4 y 43-16 son visibles dos bandas, siendo la superior la cadena pesada y siendo la inferior la cadena ligera. La muestra 25g7 es un anticuerpo de control con productos secundarios relacionados con el anticuerpo (por encima de la cadena pesada y entre la cadena pesada y ligera). Muestras: (1) Marcador de peso molecular, (2) 35-45, (3) 37-65, (4) 39-4, (5) 43 16), (6) 25g7, (7) Anticuerpo de referencia, (8) Medio 25x.

Figura 8 Mapa plasmfdico con anotaciones del plasmido p6311.

Figura 9 Mapa plasmfdico con anotaciones del plasmido p5321.

Ejemplos

Materiales y procedimientos

La informacion general sobre las secuencias de nucleotidos de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los aminoacidos de las cadenas de anticuerpos se numeran de acuerdo con la numeracion EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))

Tecnicas de ADN recombinante:

Se usaron procedimientos habituales para manipular el ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biologicos moleculares se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Sfntesis de genes:

Los segmentos genicos deseados se prepararon a partir de oligonucleotidos preparados por sfntesis qufmica. Los segmentos genicos de 100 a 600 pb, que estan flanqueados por sitios singulares de escision de endonucleasas de restriccion, se ensamblaron por hibridacion y ligado de oligonucleotidos, incluida la amplificacion por PCR, y posteriormente se clonaron en el vector de clonacion pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., EE. UU. ) mediante nucleotidos protuberantes A o el vector de clonacion pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene Corp., EE. UU.). La secuencia de ADN de los fragmentos de genes subclonados se confirmo por secuenciacion de ADN.

Determinacion de protefnas:

La concentracion de protefna se determino determinando la densidad optica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extincion molar calculado tomando como base la secuencia de aminoacidos.

Determinacion del tftulo de anticuerpos:

Los tftulos de anticuerpos se determinaron mediante ELISA con anticuerpo anti-Fc humano o mediante cromatograffa con protefna A utilizando el anticuerpo autologo purificado como referencia.

SDS-PAGE

Tampon de muestra de LDS, concentrado cuatro veces (4x): 4 g de glicerol, 0,682 g de TRIS-Base, 0,666 g de TRIS-clorhidrato, 0,8 g de LDS (dodecilsulfato de litio), 0,006 g de EDTA (acido etilendiaminotetracetico), 0,75 ml de una solucion al 1 % en peso (p/p) de Serva Blue G250 en agua, 0,75 ml de una solucion al 1 % en peso (p/p) de rojo de fenol, anadir agua para obtener un volumen total de 10 ml.

El caldo de cultivo que contenfa el anticuerpo secretado se centrifugo para extraer celulas y residuos celulares. Se mezclo una alfcuota del sobrenadante clarificado con 1/4 de volumen (v/v) de tampon de muestra 4 * LDS y 1/10 de volumen (v/v) de 1,4-ditiotreitol (DTT) 0,5 M. Luego se incubaron las muestras durante 10 min. a 70 °C y se separo la protefna por SDS-PAGE. El sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen Corp.) se utilizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se utilizaron geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre Cast (pH 6,4) al 10 % y un tampon de desarrollo NuPAGE® MOPS.

Inmunoelectrotransferencia

Tampon de transferencia: Glicina 39 mM, clorhidrato de TRIS 48 mM, SDS al 0,04 % en peso (p/p) y metanol (v/v) al 20 % en volumen

Despues de SDS-PAGE, las cadenas de anticuerpos separadas se transfirieron electroforeticamente a una membrana de filtro de nitrocelulosa (tamano de poro: 0,45 pm) de acuerdo con el “procedimiento de transferencia semiseca” de Burnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).

Ejemplo 1

Vector de expresion para expresar un anticuerpo anti-Ap

Un ejemplo de anticuerpo (preferentemente monoclonal) para el cual se puede obtener una lfnea celular para la expresion de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo contra el peptido amiloide p-A4 (anticuerpo anti-Ap). En los documentos Wo 2003/070760 o US 2005/0169925, o en la SEQ ID NO: 1 a 12, por ejemplo, se informa de un anticuerpo de este tipo y las correspondientes secuencias de acido nucleico.

El anticuerpo anti-Ap que expresa la lrnea celular del ovario de hamster chino (CHO) se genero mediante tres transfecciones y campanas de seleccion completas sucesivas.

Se anadio un segmento genico de region constante de la cadena ligera ^khumana genomica (C-kappa, C^l) a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-Ap, mientras que se anadio un segmento genico de region constante de la cadena pesada y1 humana (Cm-Bisagra-CH²-CCH³) a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-Ap. Los genes completos de la cadena pesada ^y1 y ligera ^kdel anticuerpo se unieron luego con un promotor de citomegalovirus humano (HCMV) en el extremo 5' y una secuencia senal de poliadenilacion de inmunoglobulina humana en el extremo 3'.

a) Casete de expresion de cadena pesada

La unidad de transcripcion de la cadena pesada del anticuerpo anti-Ap se compone de los siguientes elementos:

- el potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano,

- una region no traducida en direccion 5' derivada de un gen de la lfnea germinal de anticuerpo humano, - el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-Ap que incluye una secuencia senal derivada de un gen de la lfnea germinal de anticuerpo humano,

- un intron 2 hfbrido de la cadena pesada humano/raton que incluye el elemento potenciador de la cadena pesada de Ig de raton (vease, por ejemplo, (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), - la region constante del gen genomico de la cadena pesada ^y1 humana,

- la secuencia senal de poliadenilacion (“poliA”) de la cadena pesada ^y1 de inmunoglobulina humana, - los sitios de restriccion unicos AscI y SgrAI en los extremos 5' y 3', respectivamente.

b) Casete de expresion de cadena ligera

La unidad de transcripcion de la cadena ligera del anticuerpo anti-Ap se compone de los siguientes elementos:

- el potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (HCMV),

- una region no traducida en direccion 5' derivada de un gen de la lfnea germinal de anticuerpo humano, - la region variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-Ap que incluye una secuencia senal derivada de un gen de la lfnea germinal de anticuerpo humano,

- un intron 2 hubrido del gen de la cadena ligera ^khumano/raton que incluye el elemento potenciador de la cadena ligera x de Ig de raton (Picard y Schaffner, A lymphocyte-specific enhancer in the mouse immunoglobulin kappa gene. Nature 307(1984) 80-82),

- la region constante del gen de la cadena ligera ^khumana (C-kappa),

- la secuencia senal de poliadenilacion (“poliA”) de k de inmunoglobulina humana,

- los sitios de restriccion unicos Sse8387 y Fsel en los extremos 5' y 3', respectivamente.

c) Plasmidos de expresion 5128, 5137 y 5151

Para la expresion y produccion del anticuerpo anti-Ap, los casetes de expresion de cadena ligera y pesada se colocaron en un solo vector de expresion (cadena pesada en direccion 5' de la cadena ligera en orientacion horaria). Se generaron tres vectores de expresion identicos que diferfan solo en el gen marcador seleccionable incluido, en particular, en el gen que confiere resistencia al agente de seleccion neomicina, higromicina o puromicina. Los vectores tambien incluyen un gen de DHFR de raton que no se uso para seleccion ni amplificacion.

Los vectores de expresion contienen, junto al casete de expresion de cadena ligera y pesada, los siguientes elementos:

- un marcador seleccionable (un gen de resistencia ya sea a neomicina, higromicina o puromicina), - un origen de replicacion que permite la replicacion del plasmido en E. coli,

- un gen de betalactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli,

- un gen de DHFR derivado de raton.

El mapa plasmfdico del vector de expresion 5128 que contiene un gen marcador seleccionable de resistencia a higromicina se muestra en la figura 1. El mapa plasmfdico del vector de expresion 5137 que contiene un gen marcador seleccionable de resistencia a neomicina se muestra en la figura 2. El mapa plasmfdico del vector de expresion 5151 que contiene un gen marcador seleccionable de resistencia a puromicina se muestra en la figura 3.

Ejemplo 2

Transfeccion y seleccion de una celula CHO que expresa un anticuerpo anti-Ap

Se usaron celulas CHO-K1 progenitoras, previamente adaptadas para el crecimiento en cultivo en suspension sin suero en medio ProCHO4 sintetico sin componentes animales (Cambrex Corp.) que contenfa glutamina 8 mM y suplemento HT 1x (Gibco/lnvitrogen) como lfnea de celula huesped. Este medio ProCHO4 suplementado se designa en adelante medio ProCHO4 completo. La lfnea celular parental CHO-K1 de cultivo adherente se recibio de ATTC como ATCC CCL-61.

Las celulas huesped parentales adaptadas previamente se propagaron en suspension en medio ProCHO4 completo sintetico, sin componentes animales, en condiciones de humidificacion estandar (95 %, 37 °C y 5 % de CO²). A intervalos regulares, dependiendo de la densidad celular, las celulas se dividieron en medio fresco. Las celulas se recogieron por centrifugacion en la fase de crecimiento exponencial, se lavaron una vez en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) esteril y se resuspendieron en PBS esteril.

Antes de la transfeccion, los plasmidos que expresaban el anticuerpo anti-Ap se linealizaron dentro del gen de betalactamasa (gen marcador de resistencia a la ampicilina en E. coli) usando la enzima endonucleasa de restriccion Pvul o Avill. El ADN escindido se precipito con etanol, se seco al vacfo y se disolvio en PBS esteril.

En general, para la transfeccion, las celulas CHO (progenitoras o ya transfectadas) se sometieron a electroporacion con 20-50 pg de ADN plasmfdico linealizado por aproximadamente 10⁷celulas en PBS a temperatura ambiente. Las electroporaciones se realizaron con un dispositivo de electroporacion Gene Pulser XCell (Bio-Rad Laboratories) en una cubeta con ranura de 2 mm, utilizando un protocolo de onda cuadrada con un solo pulso de 180 V. Despues de la transfeccion, las celulas se colocaron en placas en medio ProCHO4 completo en placas de cultivo de 96 pocillos. Despues de 24 h de crecimiento, se anadio una solucion que contenfa uno o mas agentes de seleccion (medio ProCHO4 de seleccion completo; G418: 400 pg/ml; higromicina: 600 pg/ml; puromicina 8 pg/ml Una vez a la semana se reemplazo el medio ProCHO4 de seleccion completo. La concentracion de anticuerpos del anticuerpo anti-Ap se analizo con un ensayo ELISA espedfico para IgG1 humana en los sobrenadantes de cultivo.

Para la seleccion de lfneas celulares de produccion de anticuerpos anti-Ap de alto rendimiento, la productividad se sometio a prueba en medio ProCHO4 de seleccion completo despues de la propagacion en placas de cultivo de 6 pocillos, matraces T y/o matraces Erlenmeyer con un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana y/o HPLC analftica con protefna A.

Se obtuvieron subclones por dos procedimientos, dilucion limitante (LD) y separacion celular activada por fluorescencia (FACS).

Dilucion limitante:

Para la dilucion limitante, las celulas se colocaron en placas en un medio ProCHO4 acondicionado (que consistfa en un 50 % (v/v) de un medio ProCHO4 de seleccion completo fresco y un 50 % (v/v) de un medio ProCHO4 de seleccion acondicionado completo derivado de las celulas que se iban a propagar) a una densidad celular de 0,5 2 celulas por 0,1 ml de medio por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos. Una vez a la semana, el medio era reemplazado por medio ProCHO4 de seleccion completo. La concentracion de anticuerpos del anticuerpo anti-Ap se analizo mediante un ensayo ELISA espedfico para IgG1 humana en los sobrenadantes de cultivo.

Deposito de celulas individuales mediante citometrfa de flujo, incluyendo identificacion y aislamiento de clones:

La identificacion y aislamiento de clones transfectados de manera estable se realizo con la ayuda de una tecnica de marcado de la superficie celular utilizando una protefna A marcada con fluorescencia que se une a anticuerpos secretados pero aun unidos a la membrana. La intensidad de la fluorescencia de las celulas tenidas se uso como criterio para la seleccion de celulas.

En el caso de la separacion celular activada por fluorescencia, la poblacion de celulas electroporadas se sembro directamente en matraces T en medio ProCHO4 completo. El agente o agentes de seleccion apropiados (G418, higromicina y/o puromicina) se anadio/anadieron al cultivo un dfa despues de la transfeccion y se propago el grupo de celulas transfectadas.

Las celulas del grupo transfectado se trataron primero con Accumax (PAA Laboratories) durante 15 minutos a 37 °C y luego se pasaron a traves de una malla de nailon de 40 pM para extraer los agregados celulares grandes restantes. Las celulas se recogieron por centrifugacion, se resuspendieron en PBS que contenfa FCS al 5 % (Gibco/lnvitrogen) a una densidad celular de 10⁶a 10⁷celulas/ml y se incubaron durante 20 minutos en hielo. A continuacion, las celulas se tineron con 10 ng/ml de protefna A Alexa Fluor 488 (Molecular Probes Inc.) en un volumen de 8 ml de FCS-PBS durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Posteriormente, las celulas se lavaron una vez con FCS-PBS al 5 % y una vez con medio ProCHO4 que contenfa Ultra Glutamine 8 mM (Cambrex Corp.), suplemento de HT 1x y FCS al 5 %. Finalmente, las celulas se resuspendieron en el medio ProCHO suplementado utilizado para el lavado a una densidad celular de 10⁶a 10⁷celulas/ml y se transfirieron a un separador celular BD FACSAria (BD Biosciences).

Las celulas individuales se separaron por citometrfa de flujo y se depositaron en pocillos de placas de cultivo de 96 pocillos que contenfan medio ProCHO4 acondicionado. Las celulas seleccionadas y depositadas englobaban celulas con un maximo de un 10 %, 7 % o 4 % de intensidad de fluorescencia superior de las celulas vivas seleccionadas. Despues de 48 horas, se anadio a cada pocillo medio ProCHO4 de seleccion completo que contenfa el agente de seleccion apropiado en una concentracion dos veces mayor. Una vez a la semana, el medio era reemplazado por medio ProCHO4 de seleccion completo. La concentracion de anticuerpos del anticuerpo anti-Ap se analizo con un ensayo ELISA espedfico para IgG1 humana en los sobrenadantes de cultivo.

Etapas de transfeccion y seleccion:

Para la primera etapa de transfeccion y seleccion, se ha utilizado el plasmido 5137. El plasmido 5137 se ha transfectado con electroporacion en la lfnea de celulas progenitoras adaptada para el crecimiento en medio ProCHO4 completo. Las celulas transfectadas se cultivaron en medio ProCHO4 completo suplementado con hasta 700 pg/ml de G418 en placas de 96 pocillos. La concentracion de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se evaluo mediante un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana. Se han sometido a prueba aproximadamente 1000 clones y los seleccionados se cultivaron ademas en placas de 24 pocillos, placas de 6 pocillos y posteriormente en matraces Erlenmeyer. El crecimiento y productividad de aproximadamente 20 clones se evaluo en cultivos estaticos y en suspension mediante ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana y/o HPLC analftica con protefna A. El mejor clon (el mejor clon no denota el clon mas productivo; denota el clon con las mejores propiedades para las otras etapas) se subclono por dilucion limitada en medio ProCHO4 acondicionado suplementado con 700 pg/ml de G418. El clon seleccionado recibio el nombre de 8C8.

Para la segunda etapa de transfeccion y seleccion, se ha utilizado el plasmido 5128. El plasmido 5128 se ha transfectado con electroporacion en el clon de lfnea celular 8C8 cultivado en medio ProCHO4 completo suplementado con 700 pg/ml de G418. Las celulas transfectadas se expandieron durante aproximadamente dos a tres semanas en medio ProCHO4 acondicionado suplementado con 200 pg/ml de G418 y 300 pg/ml de higromicina (medio ProCHO4 de seleccion doble). Se identificaron y depositaron celulas secretoras de anticuerpos individuales en funcion de su intensidad de fluorescencia despues de la tincion con un conjugado de protefna A Alexa Fluor mediante analisis FACS. Las celulas depositadas se cultivaron en medio ProCHO4 de seleccion doble en placas de 96 pocillos. La concentracion de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se evaluo mediante un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana. Se han sometido a prueba aproximadamente 500 clones y los seleccionados se cultivaron ademas en placas de 24 pocillos, placas de 6 pocillos y posteriormente en matraces Erlenmeyer. El crecimiento y productividad de aproximadamente 14 clones se evaluo en cultivos estaticos y en suspension mediante ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana y/o HPLC analftica con protefna A. El clon seleccionado recibio el nombre de 4F5.

Para la tercera etapa de transfeccion y seleccion, se ha utilizado el plasmido 5151. El plasmido 5151 se ha transfectado con electroporacion en el clon de lfnea celular 4F5 cultivado en medio ProCHO4 de seleccion doble. Las celulas transfectadas se expandieron durante aproximadamente dos a tres semanas en medio ProCHO4 de seleccion triple (medio ProCHO4 acondicionado suplementado con 200 pg/ml de G418 y 300 pg/ml de higromicina y 4 pg/ml de puromicina). Se identificaron y depositaron celulas secretoras de anticuerpos individuales en funcion de su intensidad de fluorescencia despues de la tincion con un conjugado de protefna A Alexa Fluor mediante analisis FACS. Las celulas depositadas se cultivaron en medio ProCHO4 de seleccion triple en placas de 96 pocillos. La concentracion de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se evaluo mediante un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana. Se han sometido a prueba aproximadamente 500 clones y los seleccionados se cultivaron ademas en placas de 24 pocillos, placas de 6 pocillos y posteriormente en matraces Erlenmeyer. El crecimiento y productividad de aproximadamente 10 clones se evaluo en cultivos estaticos y en suspension mediante ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana y/o HPLC analftica con protefna A. El clon seleccionado recibio el nombre de 20F2.

El clon 20F2 se ha seleccionado en funcion de sus caracterfsticas de crecimiento, productividad y calidad del producto despues del crecimiento en cultivo en suspension en regimen discontinuo alimentado en medio ProCHO4 de seleccion triple, es decir, en presencia concomitante de los tres agentes de seleccion G418, higromicina y puromicina.

Caracterfsticas de los clones:

Como puede verse en la siguiente tabla, el tiempo de duplicacion y la densidad celular despues de tres dfas de cultivo eran similares cuando se comparan la lfnea celular basica CHO-K1 (de tipo natural) y los clones seleccionados.

Tabla 1: Caracterfsticas de crecimiento

Ejemplo 3

Estabilidad del clon 20F2 que expresa un anticuerpo anti-Ap

La estabilidad del crecimiento y la formacion del producto se evaluo en un subcultivo celular secuencial durante un penodo de tiempo de 60 dfas (aproximadamente 60 generaciones) en presencia y ausencia de los agentes de seleccion (con y sin antibioticos). El cultivo se realizo como se describe anteriormente.

Tabla 2: Caracterfsticas del clon 20F2.

Despues de una prolongada tanda de pases (hasta la generacion 60), no se obtuvo evidencia que indicara que el clon 20F2 que produce el anticuerpo anti-Ap era inestable en lo que respecta al crecimiento celular y la formacion de producto en presencia o ausencia de los tres agentes de seleccion, respectivamente.

Ejemplo 4

Vector de expresion para expresar un anticuerpo anti-P-selectina

Otro ejemplo de anticuerpo (preferentemente monoclonal) para el cual se puede obtener una lmea celular para la expresion de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo contra la glucoprotema P-selectina humana (anticuerpo anti-P-selectina). Un anticuerpo de este tipo y las correspondientes secuencias de acido nucleico se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2005/100402, o US 2005/0226876 o la SEQ ID NO: 13 a 18.

El anticuerpo anti-P-selectina que expresa la lmea celular del ovario de hamster chino se genero mediante dos transfecciones y campanas de seleccion de clones completas sucesivas.

Se anadio un segmento genico de region constante de la cadena ligera kappa humana genomica (C-kappa) a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-P-selectina, mientras que se anadio un segmento genico de region constante de la cadena pesada gamma 4 humana (Cm-Bisagra-C^hK-C^cm) a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-P-selectina. Los genes completos del anticuerpo de cadena ligera kappa y pesada gamma 4 se unieron a continuacion con un promotor y potenciador temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV IE) en el extremo 5' y la secuencia senal de poliadenilacion temprana del papovavirus SV40 (poliA temprana de SV40) en el extremo 3'.

a) Casete de expresion de cadena pesada

La unidad de transcripcion de la cadena pesada del anticuerpo anti-P-selectina se compone de los siguientes elementos:

el potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV IE),

una region no traducida 5' (5' UTR),

la secuencia codificante de la cadena pesada gamma 4 del anticuerpo anti-P-selectina que incluye un peptido senal en la estructura genica de intrones y exones,

la secuencia senal de poliA temprana de SV40.

b) Casete de expresion de cadena ligera

La unidad de transcripcion de la cadena ligera del anticuerpo anti-P-selectina se compone de los siguientes elementos:

- el potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV IE),

- una region no traducida 5' (5' UTR),

- la secuencia codificante de la cadena ligera kappa del anticuerpo anti-P-selectina en una estructura genica de intrones y exones,

- la secuencia senal de poliA temprana de SV40.

c) Plasmidos de expresion 5057 y 5069.

Para la expresion y produccion del anticuerpo anti-P-selectina, los casetes de expresion de las cadenas ligera y pesada se colocaron en un solo vector de expresion (cadena ligera en direccion 5' de la cadena pesada). Se generaron dos vectores de expresion identicos que diferfan solo en el gen marcador seleccionable incluido, en particular, el gen de la dihidrofolato reductasa murina (DHFR) o un gen de resistencia a la neomicina.

- un marcador seleccionable, ya sea el gen de la DHFR murina o un gen que confiere resistencia al agente de seleccion neomicina bajo el control del promotor temprano de SV40 y su origen,

- un origen de replicacion que permite la replicacion del plasmido en E. coli tomado de pUC19 (origen de pUC),

- un gen de betalactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.

El mapa plasmfdico del vector de expresion 5057 que contiene el gen marcador de la DHFR murina se muestra en la figura 4. El mapa plasmfdico del vector de expresion 5069 que contiene un gen marcador seleccionable para neomicina se muestra en la figura 5.

Ejemplo 5

Transfeccion y seleccion de una linea celular CHO que expresa un anticuerpo anti-P-selectina

Celulas CHO-K1, adaptadas previamente para crecimiento en un cultivo en suspension sin suero en medio HyQ SFM4CHO sin protefnas (Hyclone, n.° de cat. SH30549) suplementado con componentes de origen animal definidos (colesterol derivado de lana ovina y aceite de hfgado de bacalao) se utilizaron como linea de celulas huesped. Las celulas se propagaron en matraces Erlenmeyer en medio HyQ SFM4CHO sin protefnas en condiciones de humidificacion estandar (95 %, 37 °C, y 5 % de CO²) y bajo agitacion constante a 150 rpm/min. Dependiendo de la densidad celular, las celulas se dividieron en medio fresco.

Las lfneas celulares CHO-K1 adherentes se habfan obtenido de la American Type Culture Collection como ATCC CCL-61.

Primera transfeccion y seleccion

Antes de la transfeccion, el plasmido de expresion 5057 se linealizo dentro del gen de betalactamasa usando la enzima de restriccion Pvul. El ADN escindido se purifico utilizando columnas de centrifugacion QiaQuick (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

La transfeccion se llevo a cabo por electroporacion utilizando Gene Pulser XCell (BIO-RAD) y cubetas de 0,2 cm (BIO-RAD, n.° de cat. 165-2086). Para la transfeccion, se recogieron 106 a 107 celulas CHO-K1 mediante centrifugacion, se resuspendieron en PBS, se transfirieron a la cubeta y se mezclaron con 20-50 pg de ADN plasmfdico linealizado. Las celulas se expusieron a un solo pulso de onda cuadrada (160 V, 15 ms) y posteriormente se diluyeron en medio HyQ SFM4CHO a una densidad de aprox. 4 x 105 celulas/ml y se sembraron en un matraz de cultivo de celulas T75. Despues de 48 horas de propagacion sin la suplementacion de un agente de seleccion, las celulas se diluyeron en medio HyQ SFM4CHO suplementado con MTX 200 nM a una densidad de 104 a 105 celulas/ml y se sembraron en placas de 96 pocillos con 3-7000 celulas por pocillo. Despues de aprox. dos semanas, se anadio medio fresco por pocillo y, despues de dos semanas adicionales, el medio de cultivo se reemplazo completamente por medio fresco. Cuatro dfas despues, los sobrenadantes de cultivo se sometieron a prueba para determinar la produccion de anticuerpos mediante ELISA con anticuerpo anti-Fc humano. En total se cribaron aproximadamente 600 clones.

Se seleccionaron 45 clones con tftulos de anticuerpos de mas de 10 pg/ml y se transfirieron a placas de 48 pocillos. Los clones se expandieron a matraces Erlenmeyer en pases adicionales y posteriormente se transfirieron a un medio de produccion sin suero para la evaluacion final de la productividad. Se inoculo un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 105 a 106 celulas/ml en medio suplementado con MTX 200 nM. Se controlaron durante una semana la densidad celular viable y la viabilidad. Se midieron los tftulos de anticuerpos mediante cromatograffa con protefna A en el ultimo dfa. Tomando como base estos datos, se selecciono el clon G24 para su posterior desarrollo. G24 alcanzo una densidad celular viable maxima de 3,3 * 106 celulas/ml. El tftulo de anticuerpos fue de 402 pg/ml. La tasa de produccion especffica (SPR) promedio fue de 28 pg/(celula*d).

Segunda transfeccion y seleccion:

El clon G24 se sometio a una segunda transfeccion. Para la segunda transfeccion se utilizo plasmido 5069. La linealizacion y purificacion del plasmido asf como la electroporacion de G24 se realizaron como se describe para la primera transfeccion. Despues de 48 horas de propagacion sin presion de seleccion, las celulas se diluyeron en medio HyQ SFM4CHO suplementado con MTX 200 nM y 400 pg/ml de G418 a una densidad de 103 a 104 celulas/ml y se sembraron en placas de 96 pocillos con 500 celulas por pocillo. Despues de aprox. dos semanas, se anadio medio fresco por pocillo y, despues de una semana adicional, el medio de cultivo se reemplazo completamente por medio fresco. Cuatro dfas despues, los sobrenadantes de cultivo se sometieron a prueba para determinar la produccion de anticuerpos mediante ELISA con anticuerpo anti-Fc humano. En total se cribaron aproximadamente 220 clones.

Luego se seleccionaron 13 clones con tftulos de anticuerpos de mas de 150 pg/ml y se transfirieron a placas de 24 pocillos. Los clones se expandieron a matraces Erlenmeyer en pases adicionales y posteriormente se transfirieron a un medio de produccion sin suero para la evaluacion final de la productividad. Se inoculo un matraz Erlenmeyer con 105 a 106 celulas/ml en 50 ml de medio suplementado con MTX 200 nM y 400 pg/ml de G418. Se controlaron durante una semana la densidad celular viable y la viabilidad. Se midieron los tftulos de anticuerpos mediante cromatograffa con protefna A en el ultimo dfa. Tomando como base estos datos, el clon G24_x6 se considero el mejor clon. G24_x6 alcanzo una densidad celular viable maxima de 3,0 * 106 celulas/ml. El tftulo de anticuerpos fue de 685 pg/ml. La tasa de produccion especffica (SPR) promedio fue de 48 pg/(celula*d).

Dilucion limitante:

Para comparar el procedimiento de acuerdo con la invencion con una subclonacion simple en lo que respecta a su efecto en la productividad, el clon G24 se sometio a dilucion limitada o deposito de celulas individuales en placas de 96 pocillos.

Para dilucion limitante, se sembraron las celulas en placas de 96 pocillos en medio HyQ SFM4CHO suplementado con medio acondicionado al 50 % (v/v), FCS al 10 % y MTX 200 nM a 0,5 celulas/pocillo. De forma alternativa, se deposito 1 celula/pocillo en placas de 96 pocillos mediante FACS. Despues de 10 dfas, se anadio medio HyQ SFM4CHO fresco, MTX 200 nM sin FCS por pocillo y, despues de una semana adicional, el medio de cultivo se reemplazo completamente por medio HyQ SFM4CHO, MTX 200 nM. Cuatro dfas despues, los sobrenadantes de cultivo se sometieron a prueba para determinar la produccion de anticuerpos mediante ELISA con anticuerpo anti-Fc humano. En total se cribaron aproximadamente 230 clones.

Once subclones con tftulos de anticuerpos de mas de 130 pg/ml se transfirieron a placas de 24 pocillos. Despues de pases en placas de 6 pocillos, los clones se transfirieron a matraces Erlenmeyer y posteriormente se transfirieron a un medio de produccion sin suero para la evaluacion final de la productividad. Se inoculo un matraz Erlenmeyer con 105 a 106 celulas/ml en medio suplementado con MTX 200 nM. Se controlaron durante una semana la densidad celular viable y la viabilidad. Se midieron los tftulos de anticuerpos mediante cromatograffa con protefna A en el ultimo dfa. Tomando como base estos datos, G24_13 se considero el mejor clon. G24_13 alcanzo una densidad celular viable maxima de 3,6 * 106 celulas/ml. El tftulo de anticuerpos fue de 472 pg/ml. La tasa de produccion especffica (SPR) promedio fue de 31 pg/(celula*d).

La tabla 3 resume los datos de productividad del subclon con mejor rendimiento G24_13 y el clon con mejor rendimiento G24_x6 obtenido con el procedimiento de acuerdo con la invencion en comparacion con su clon parental G24. Con el procedimiento de acuerdo con la invencion se puede obtener un clon con productividad volumetrica y especffica aumentada en mas de un 50 %, mientras que despues de la subclonacion solo se observo un aumento menor de ambos parametros.

La figura 6 muestra una vision general de las productividades volumetricas (A) y especfficas (B) de todos los subclones de G24 que se habfan investigado en matraces Erlenmeyer. Como puede verse, la productividad volumetrica y especffica promedio de los clones obtenidos con el procedimiento de acuerdo con la invencion fue significativamente mayor que despues de la subclonacion.

Tabla 3: Productividad de los mejores clones productores en comparacion con el clon parental G24.

Caracterfsticas de los clones:

Como puede verse en la siguiente tabla, el tiempo de duplicacion y la densidad celular despues de tres dfas de cultivo fueron similares cuando se compararon la lfnea celular G24 transfectada una sola vez y los clones seleccionados.

Tabla 4: Caracterfsticas de crecimiento

Ejemplo 6

Transfeccion y seleccion de una lfnea celular CHO que expresa un anticuerpo anti-P-selectina Celulas CHO-DG44 adaptadas previamente para crecimiento en un cultivo en suspension sin suero en medio HyQ SFM4CHO sin protefnas (Hyclone, n.° de cat. SH30549) se utilizaron como lfnea de celulas huesped. La lfnea de celulas huesped se cultivo en medio comercial HyQ SFM4CHO-utility (Hyclone, n.° de cat. SH30516) durante las etapas de transfeccion, cribado y subclonacion.

Primera transfeccion y seleccion

Antes de la transfeccion, el plasmido de expresion 5057 (figura 4) se linealizo dentro del gen de betalactamasa usando la enzima de restriccion Pvul.

La transfeccion de la lfnea de celulas huesped se realizo mediante una nucleotransfeccion proporcionada por AMAXA (Nucleofector Kit T, n.° de cat. VCA-1002, Programa de transfeccion U-17). Se cultivaron celulas en medio suplementado con suero de ternera fetal al 10 % durante 48 h despues de la transfeccion.

Se colocaron celulas transfectadas en placas de 96 pocillos con 1000 celulas por pocillo en medio suplementado con suero de ternera fetal al 10 % en presencia de metotrexato (MTX) 40 nM como agente de seleccion y se incubaron durante aprox. tres semanas.

Se determino la concentracion de anticuerpos mediante ELISA en el sobrenadante de las placas de 96 pocillos. Se cribaron cerca de 400 clones primarios. Veinticuatro clones con la maxima productividad de anticuerpos se transfirieron a placas de 24 pocillos y se cultivaron en presencia del agente de seleccion sin suplementacion con suero de ternera fetal. Se analizo la calidad del producto mediante inmunoelectrotransferencia detectando cadenas de anticuerpo ligeras y pesadas. Nueve clones que mostraron la maxima productividad y que expresaron anticuerpos sin productos secundarios derivados de anticuerpos detectables (inmunoelectrotransferencia) se expandieron en matraces Erlenmeyer.

Se analizo la productividad en matraces Erlenmeyer con regimen discontinuo despues de 7 y 10 dfas de incubacion. Se evaluo la calidad del producto mediante SDS-PAGE despues de la purificacion por HPLC con protefna A (figura 7). La mejor concentracion de producto se alcanzo con el clon 43-16. La mejor productividad especffica por celula se logro con el clon 35-45. Ninguno de los dos clones mostro productos secundarios detectables en la SDS-PAGE. Ambos clones se seleccionaron para subclonacion por dilucion limitante.

Se subclonaron los clones parentales 35-45 y 43-16 mediante dilucion limitante en placas de 96 pocillos en medio comercial HyQ suplementado con suero de ternera fetal al 5 % (v/v) en presencia de MTX 20 nM. Despues de 20 dfas de incubacion, la produccion de anticuerpos se cribo mediante ELISA. Los mejores subclones en terminos de productividad se expandieron a matraces Erlenmeyer y posteriormente se transfirieron a un medio de produccion sin suero para la evaluacion final de la productividad. Los dos mejores subclones, 35-45-F2 y 43-16-A10, de los clones parentales 35-45 y 43-16 se evaluaron en un ensayo en matraz Erlenmeyer con regimen discontinuo estandar. La productividad fue 270 pg/ml y 185 pg/ml despues de 7 dfas y 337 pg/ml y 343 pg/ml despues de 10 dfas, respectivamente.

Segunda transfeccion y seleccion:

El subclon 43-16-A10 se transfecto con el vector de expresion p5069 (figura 5) utilizando el procedimiento de nucleofeccion (Amaxa Nucleofector Kit T, VCA-1002, Programa de transfeccion U-17). La segunda transfeccion tambien se llevo a cabo en medio Hyclone: HyQ SFM4CHO-utility (n.° de cat. SH30516) suplementado con suero de ternera fetal al 10 % y MTX 20 nM. Dos dfas despues de la segunda transfeccion, las celulas se transfirieron a placas de 96 pocillos con 1000 celulas por pocillo. Como segundo agente de seleccion, se anadieron 250 pg/ml de G418.

Despues del cultivo durante dos semanas, se cribaron mas de 2000 pocillos primarios mediante determinacion de tftulos de anticuerpos por ELISA con anticuerpo anti-Fc humano. Cincuenta clones con la maxima productividad se transfirieron a placas de 24 pocillos y se cribaron una segunda vez mediante ELISA con anticuerpo anti-Fc humano tres dfas despues. Todos los clones se transfirieron a placas de 6 pocillos y se cribaron mediante ELISA con anticuerpo anti-Fc humano tres dfas despues. Los seis clones con la mejor productividad se subclonaron directamente desde la etapa de placa de 6 pocillos.

Dilucion limitante:

Los mejores clones parentales de la segunda ronda de transfeccion y seleccion 43-16A10_S1, 43-16A10_S13, 43-16A10_S14, 43-16A10_S19, 43-16A10_S24, 43-16A10_S43 se subclonaron por dilucion limitante. La calidad del producto de los doce mejores subclones se evaluo en SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia desde la etapa de 24 pocillos. No se detectaron productos secundarios relacionados con anticuerpos no deseados.

Se seleccionaron tres subclones, 43-16-A10-S1-16, 43-16-A10-S24-11 y 43-16-A10-S43-14, de acuerdo con su productividad en placas de 6 pocillos para la expansion en matraces Erlenmeyer. Se transfirieron a un medio de produccion sin suero para la evaluacion final de la productividad. Su productividad se comparo con el subclon despues de la primera transfeccion, el clon 43-16-A10. La productividad se multiplico por dos para dos de los clones despues de la segunda transfeccion y seleccion, 43-16-A10-S1-16 y 43-16-A10-S24-11, de 221 pg/ml despues de 7 dfas en el matraz Erlenmeyer en regimen discontinuo a 436 pg/ml y 407 pg/ml, respectivamente. Despues de 10 dfas de incubacion en el matraz Erlenmeyer en regimen discontinuo, la productividad aumento de 306 pg/ml a 683 pg/ml y 446 pg/ml, respectivamente.

La productividad especffica por celula aumento tambien de 17 pg/celula/dfa para el clon 43-16-A10 despues de la primera transfeccion a 40 pg/celula/dfa para el primer clon transfectado 43-16-A10-S1-16 y a 33 pg/celula/dfa para el segundo clon transfectado 43-16-A10-S24-11. El tiempo de duplicacion no se vio afectado por la segunda transfeccion. El tiempo de duplicacion para el clon 43-16-A10 despues de la primera transfeccion fue de 33 h y fue de 32 h para ambos clones 43-16-A10-S1-16 y 43-16-A10-S24-11.

Ejemplo 7

Vector de expresion para expresar un anticuerpo anti-IL-13Ra

Otro ejemplo de anticuerpo (preferentemente monoclonal) para el cual se puede obtener una lfnea celular para la expresion de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo que se une al receptor alfa 1 de IL-13 (anticuerpo anti-IL-13Ra1 anti-IL-13Ra). Un anticuerpo de este tipo y las correspondientes secuencias de acido nucleico se describen, por ejemplo, en el documento WO 2006/072564 o SEQ ID NO: 19 a 28.

Se anadio un segmento genico de region constante de la cadena ligera kappa humana genomica (C-kappa) a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-13Ra mientras que se anadio un segmento genico de region constante de la cadena pesada gamma 1 humana (Cm-Bisagra-CH²-CcH³) a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-13Ra. El plasmido de expresion 5321 comprende un casete de expresion para la cadena pesada y1 del anticuerpo anti-IL-13Ra, y la cadena ligera k del anticuerpo anti-IL-13Ra, y un acido nucleico que codifica el gen de la DHFR murina. En la figura 9 se muestra un mapa plasmfdico con anotaciones.

a) Casete de expresion de cadena pesada

La unidad de transcripcion de la cadena pesada del anticuerpo conjugado anti-IL-13Ra se compone de los siguientes elementos:

- una region no traducida 5' (5' UTR),

- la secuencia codificante del conjugado con la cadena pesada gamma 1 del anticuerpo anti-IL-13Ra que incluye un peptido senal en la estructura genica de intrones y exones,

- la secuencia senal de poliadenilacion de la inmunoglobulina gamma 1 humana.

b) Casete de expresion de cadena ligera

La unidad de transcripcion de la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-13Ra se compone de los siguientes elementos:

- una region no traducida 5' (5' UTR),

- la secuencia codificante de la cadena ligera kappa del anticuerpo anti-IL-13Ra en una estructura genica de intrones y exones,

- la secuencia senal de poliadenilacion de kappa de inmunoglobulina humana.

c) Plasmidos de expresion

Para la expresion y produccion del anticuerpo conjugado anti-IL-13Ra, los casetes de expresion de las cadenas ligera y pesada se colocaron en un solo vector de expresion (cadena ligera en direccion 5' de la cadena pesada). Se generaron dos vectores de expresion identicos que diferfan solo en el gen marcador seleccionable incluido, en particular, el gen de DHFR murina y tanto el gen de DHFR murina como un gen de resistencia a la higromicina.

un origen de replicacion que permite la replicacion del plasmido en E. coli (origen de pUC), un gen de betalactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.

Ejemplo 8

Transfeccion y seleccion de una linea celular CHO que expresa un anticuerpo anti-IL-13Ra

Para la primera etapa de transfeccion y seleccion, se ha utilizado el plasmido 5321. El plasmido 5321 se ha transfectado con electroporacion en la linea de celulas progenitoras adaptada para el crecimiento en medio ProCHO4 completo. Las celulas transfectadas se cultivaron en medio HyQSFMCHO (HyClone) suplementado con metotrexato hasta 200 nM en placas. La concentracion de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se evaluo mediante un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana. Los clones se han sometido a prueba y los seleccionados se cultivaron ademas en placas de 24 pocillos, placas de 6 pocillos y posteriormente en matraces Erlenmeyer. El crecimiento y productividad se evaluo en cultivos estaticos y en suspension mediante ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana y/o HPLC analitica con proteina A. Se selecciono el mejor clon (el mejor clon no denota el clon mas productivo; denota el clon con las mejores propiedades para las otras etapas). El clon seleccionado recibio el nombre de 200_019. La productividad fue 90 pg/ml con una tasa de produccion especifica promedio de 7 pg/celula*d despues de 7 dias de cultivo.

Para la segunda etapa de transfeccion y seleccion se ha utilizado un plasmido con un gen de DHFR y de resistencia a la higromicina. El plasmido se ha transfectado con electroporacion en la lmea celular seleccionada cultivada en medio HyQSFMCHO (HyClone) suplementado con metotrexato hasta 200 nM. El medio de seleccion doble contema ademas 300 pg/ml de higromicina B. Se identificaron y depositaron celulas secretoras de anticuerpos individuales en funcion de su intensidad de fluorescencia despues de la tincion con un conjugado de protema A Alexa Fluor mediante analisis FACS. El clon seleccionado recibio el nombre de 5_17_35. La productividad fue 150 pg/ml con una tasa de produccion espedfica promedio de 10 pg/celula*d despues de 7 dfas de cultivo.

Ejemplo 9

Vector de expresion para expresar un anticuerpo conjugado anti-CD4

Otro ejemplo de anticuerpo (monoclonal) para el que se puede obtener una lmea celular para expresion de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo contra el receptor de superficie CD4 humano (anticuerpo anti-CD4) que se conjuga con dos a ocho peptidos antifusogenicos. En el documento WO 2009/012944 o en la SEQ ID NO: 29 a 40, por ejemplo, se informa de un anticuerpo de este tipo y las correspondientes secuencias de acido nucleico.

Se anadio un segmento genico de region constante de la cadena ligera kappa humana genomica (C-kappa) a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD4 de SEQ ID NO: 39, mientras que se anadio un segmento genico de region constante de la cadena pesada gamma 1 humana (C^m-Bisagra-C^H2-C^oH3) a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD4 de SEQ ID NO: 36. El plasmido de expresion 6311 comprende una cadena pesada y1 del anticuerpo anti-CD4, que se une en el penultimo aminoacido C-terminal, es decir, se elimina el residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada, con un acido nucleico que codifica un peptido antifusogenico de SEQ ID NO: 41 a traves del conector glicina-serina peptfdico de SEQ ID NO: 42, y una cadena ligera k del anticuerpo anti-CD4, y un acido nucleico que confiere resistencia al marcador seleccionable neomicina. En la figura 8 se muestra un mapa plasirndico con anotaciones.

a) Casete de expresion de cadena pesada

La unidad de transcripcion de la cadena pesada del anticuerpo conjugado anti-CD4 se compone de los siguientes elementos:

- una region no traducida 5' (5' UTR),

- la secuencia codificante del conjugado con la cadena pesada gamma 1 del anticuerpo anti-CD4 que incluye un peptido senal en la estructura genica de intrones y exones,

- la secuencia senal de poliA temprana de SV40.

b) Casete de expresion de cadena ligera

La unidad de transcripcion de la cadena ligera del anticuerpo conjugado anti-CD4 se compone de los siguientes elementos:

- una region no traducida 5' (5' UTR),

- la secuencia codificante de la cadena ligera kappa del anticuerpo anti-CD4 en una estructura genica de intrones y exones,

- la secuencia senal de poliA temprana de SV40.

c) Plasmidos de expresion

Para la expresion y produccion del anticuerpo conjugado anti-CD4, los casetes de expresion de las cadenas ligera y pesada se colocaron en un solo vector de expresion (cadena ligera en direccion 5' de la cadena pesada). Se generaron tres vectores de expresion identicos que difenan solo en el gen marcador seleccionable incluido, en particular, un gen de resistencia a la neomicina, un gen de resistencia a la puromicina y un gen de resistencia a la higromicina.

- un origen de replicacion que permite la replicacion del plasmido en E. coli tornado de pUC18 (origen de pUC),

Ejemplo 10

Transfeccion y seleccion de una linea celular CHO que expresa un anticuerpo conjugado anti-CD4 Etapas de transfeccion y seleccion:

Para la primera etapa de transfeccion y seleccion, se ha utilizado el plasmido 6311. El plasmido 6311 se ha transfectado con electroporacion en la linea de celulas progenitoras adaptada para el crecimiento en medio ProCHO4 completo. Las celulas transfectadas se cultivaron en medio ProCHO4 completo suplementado con hasta 700 pg/ml de G418 en placas de 96 pocillos. La concentracion de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se evaluo mediante un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana. Se han sometido a prueba aproximadamente 5000 clones y los seleccionados se cultivaron ademas en placas de 24 pocillos, placas de 6 pocillos y posteriormente en matraces Erlenmeyer. El crecimiento y productividad de aproximadamente 15 clones se evaluo en cultivos estaticos y en suspension mediante ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana y/o HPLC analitica con proteina A. El mejor clon (el mejor clon no denota el clon mas productivo; denota el clon con las mejores propiedades para las otras etapas) se subclono por dilucion limitada en medio ProCHO4 acondicionado suplementado con 700 pg/ml de G418.

Dilucion limitante:

Para dilucion limitante, se colocaron celulas en placas en un medio ProCHO4 de seleccion a una densidad celular de 0,5-2 celulas por 0,1 ml de medio por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos.

En el caso de la separacion celular activada por fluorescencia, la poblacion de celulas electroporadas se sembro directamente en matraces T en medio ProCHO4 completo. El agente o agentes de seleccion apropiados (G418, higromicina y/o puromicina) se anadio/anadieron al cultivo un dia despues de la transfeccion y se propago la mezcla transfectante. El crecimiento y productividad de aproximadamente 112 clones se evaluo en cultivos estaticos y en suspension mediante ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana y/o HPLC analitica con proteina A. El clon seleccionado recibio el nombre de I-17.

Para la segunda etapa de transfeccion y seleccion se ha utilizado un plasmido con un gen de resistencia a la higromicina. El plasmido se ha transfectado con electroporacion en el clon de linea celular I-17 cultivado en medio ProCHO4 completo suplementado con 700 pg/ml de G418. Las celulas transfectadas se expandieron durante aproximadamente dos a tres semanas en medio ProCHO4 acondicionado suplementado con 200 pg/ml de G418 y 300 pg/ml de higromicina (medio ProCHO4 de seleccion doble). Se identificaron y depositaron celulas secretoras de anticuerpos individuales en funcion de su intensidad de fluorescencia despues de la tincion con un conjugado de proteina A Alexa Fluor mediante analisis FACS. Las celulas depositadas se cultivaron en medio ProCHO4 de seleccion doble en placas de 96 pocillos. La concentracion de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se evaluo mediante un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana. El clon seleccionado recibio el nombre de 24_16. Para la tercera etapa de transfeccion y seleccion se ha utilizado un plasmido con un gen de resistencia a la puromicina. El plasmido se ha transfectado con electroporacion en el clon de linea celular 24_16 cultivado en medio ProCHO4 de seleccion doble. Las celulas transfectadas se expandieron durante aproximadamente dos a tres semanas en medio ProCHO4 de seleccion triple (medio ProCHO4 acondicionado suplementado con 200 pg/ml de G418 y 300 pg/ml de higromicina y 4 pg/ml de puromicina). Se identificaron y depositaron celulas secretoras de anticuerpos individuales en funcion de su intensidad de fluorescencia despues de la tincion con un conjugado de proteina A Alexa Fluor mediante analisis FACS. Las celulas depositadas se cultivaron en medio ProCHO4 de seleccion triple en placas de 96 pocillos. La concentracion de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se evaluo mediante un ELISA con anticuerpo anti-IgG1 humana. El clon seleccionado recibio el nombre de 1 24.

Caracterfsticas de los clones:

Tabla 5: Caracterfsticas de crecimiento

Claims

REIVINDICACIONES

Procedimiento para la produccion recombinante de una inmunoglobulina heterologa en una celula CHO que se secreta al medio de cultivo que comprende:

a) proporcionar una celula CHO, que esta

- adaptada al crecimiento en cultivo en suspension.

- adaptada al crecimiento en medio sin suero,

- sin micoplasmas,

b) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

- una primera secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion procariotico,

- una segunda secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa, y/o

- una tercera secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa,

de manera que se proporciona un primer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de acido nucleico adicional que confiere resistencia a un primer agente de seleccion eucariotico,

de manera que se proporciona un segundo vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de acido nucleico adicional que confiere resistencia a un segundo agente de seleccion eucariotico, de manera que dicho segundo agente de seleccion eucariotico sea diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico,

b1) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

- una primera secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion procariotico,

- una segunda secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa, y/o una tercera secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa,

de manera que se proporciona un tercer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una secuencia adicional de un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un tercer agente de seleccion eucariotico, de manera que dicho tercer agente de seleccion eucariotico es diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico y tambien es diferente de dicho segundo agente de seleccion eucariotico,

c) transfectar dicha celula CHO, en la que dicha transfeccion comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(i) transfectar dicha celula CHO con dicho primer vector de transfeccion,

(ii) seleccionar una celula CHO transfectada en (i) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene un primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia,

(iii) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (ii) con dicho segundo vector de transfeccion, (iv) seleccionar una celula CHO transfectada en (iii) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia y dicho segundo agente de seleccion eucariotico al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia,

(v) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (iv) con dicho tercer vector de transfeccion, (vi) seleccionar una celula CHO transfectada en (v) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia y dicho segundo agente de seleccion eucariotico al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia y dicho tercer agente de seleccion eucariotico al que el tercer vector de transfeccion confiere resistencia,

d) cultivar dicha celula CHO transfectada en un medio en presencia de dicho primer y dicho segundo y dicho tercer agente de seleccion eucariotico, en condiciones adecuadas para la expresion de dicho primer, segundo y/o tercer acido nucleico,

e) recuperar dicha inmunoglobulina heterologa secretada del medio de cultivo y producir asf una inmunoglobulina heterologa en una celula CHO que se secreta al medio de cultivo,

en el que el primer, segundo y tercer vector de transfeccion difieren cada uno solo en el acido nucleico que confiere resistencia a dicho primero, segundo y tercer agente de seleccion eucariotico.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que dicha celula CHO es una celula CHO K1, o una celula CHO DG44, o una celula CHO XL99, o una celula CHO DXB11 o una celula CHO DP12.
3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho segundo y/o tercer acido nucleico contiene una secuencia de acido nucleico intronica hfbrida.
4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el promotor empleado para la transcripcion de dichos segundo y tercer acidos nucleicos es diferente del promotor empleado para la transcripcion de dicho cuarto acido nucleico.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el promotor empleado para la transcripcion de dichos segundo y tercer acidos nucleicos es el mismo.
6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la seleccion de una celula CHO transfectada en la etapa c) (i) y/o (iii) es mediante el crecimiento en medio de cultivo sin un agente de seleccion durante 12 a 72 horas, seguido de crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion en el caso de (ii) o dicho primer y segundo agente de seleccion eucariotico en el caso de (iv).
7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el uso de codones de dicho segundo y tercer acido nucleico esta optimizado para la traduccion en celulas CHO.
8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la etapa c) y la etapa d) se realizan en el mismo medio.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, caracterizado por que dicho medio es un medio sin suero, o un medio sin suero suplementado con componentes de origen animal definidos, o un medio sin componentes de origen animal, o un medio sin protefnas, un medio sin protefnas suplementado con componentes de origen animal definidos, o un medio sin protefnas definidas, o un medio definido qufmicamente.
10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que en dicha etapa d) dicho cultivo es en presencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en un volumen de menos de 500 litros y por que dicho cultivo es en ausencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en un volumen de 500 litros o mas y por que dicha recuperacion de dicha inmunoglobulina heterologa secretada procede del medio de cultivo sin dichos agentes de seleccion eucarioticos.
11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la productividad de dichas celulas CHO es durante 40 generaciones de no menos de un 70 % y no mas de un 130 % de la productividad despues de 10 generaciones de cultivo como cultivo discontinuo.
12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la productividad de dichas celulas CHO durante 60 generaciones es de no menos de un 50 % y no mas de un 150 % de la productividad despues de 10 generaciones de cultivo como cultivo discontinuo.
13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la productividad de dicha celula CHO es de al menos 1,5 g/l de dicha inmunoglobulina heterologa en un plazo de 21 dfas como cultivo en regimen discontinuo alimentado.
14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho procedimiento comprende ademas:

f) purificar dicha inmunoglobulina heterologa con una o mas etapas cromatograficas.
15. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha celula CHO transfectada de la etapa d) tiene

- un tiempo de duplicacion de un 150 % o menos del tiempo de duplicacion de la celula CHO seleccionada en la subetapa (ii),

- un rendimiento volumetrico de al menos un 125 % comparado con el rendimiento volumetrico de la celula CHO seleccionada en (ii).
16. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha inmunoglobulina heterologa es un anticuerpo anti-Ap.
17. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha inmunoglobulina heterologa es un anticuerpo anti-P-selectina.
18. Una celula CHO obtenible con el siguiente procedimiento:

a) proporcionar una celula CHO, que esta

- adaptada al crecimiento en cultivo en suspension.

- adaptada al crecimiento en medio sin suero,

- sin micoplasmas,

b) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

- una primera secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion procariotico,

- una segunda secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa, y/o una tercera secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa,

de manera que se proporciona un primer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de acido nucleico adicional que confiere resistencia a un primer agente de seleccion eucariotico,

de manera que se proporciona un segundo vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una cuarta secuencia de acido nucleico adicional que confiere resistencia a un segundo agente de seleccion eucariotico, de manera que dicho segundo agente de seleccion eucariotico sea diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico,

b1) proporcionar un acido nucleico que comprende

- un origen de replicacion procariotico,

- una primera secuencia de acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion procariotico,

- una segunda secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa, y/o una tercera secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa,

de manera que se proporciona un tercer vector de transfeccion que comprende dicho acido nucleico proporcionado y una secuencia adicional de un cuarto acido nucleico que confiere resistencia a un tercer agente de seleccion eucariotico, de manera que dicho tercer agente de seleccion eucariotico es diferente de dicho primer agente de seleccion eucariotico y tambien es diferente de dicho segundo agente de seleccion eucariotico,

c) transfectar dicha celula CHO, en la que dicha transfeccion comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

(i) transfectar dicha celula CHO con dicho primer vector de transfeccion,

(ii) seleccionar una celula CHO transfectada en (i) mediante crecimiento seleccionado en un medio de cultivo que contiene un primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia,

(iii) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (ii) con dicho segundo vector de transfeccion, (iv) seleccionar una celula CHO transfectada en (iii) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia y dicho segundo agente de seleccion eucariotico al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia,

(v) transfectar dicha celula CHO seleccionada en (iv) con dicho tercer vector de transfeccion, (vi) seleccionar una celula CHO transfectada en (v) mediante crecimiento seleccionado en medio de cultivo que contiene dicho primer agente de seleccion eucariotico al que el primer vector de transfeccion confiere resistencia y dicho segundo agente de seleccion eucariotico al que el segundo vector de transfeccion confiere resistencia y dicho tercer agente de seleccion eucariotico al que el tercer vector de transfeccion confiere resistencia,

en el que el primer, segundo y tercer vector de transfeccion difieren cada uno solo en el acido nucleico que confiere resistencia a dicho primero, segundo y tercer agente de seleccion eucariotico.
19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o celula de acuerdo con la reivindicacion 18, caracterizado por que la inmunoglobulina es un anticuerpo humano, o un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimerico o un anticuerpo con reduccion de antfgenos de linfocitos T.
20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y 19 o celula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, caracterizado por que la celula CHO es una celula CHO K1 (ATCC CCL-61 o DSM ACC 110), o una celula CHO DG44 (tambien conocida como CHO-DHFR[-], DSM ACC 126), o una celula CHO XL99, una celula CHO-T (vease, por ejemplo, Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963), o una celula CHO-S o una celula Super-CHO (Pak, S.C.O., et al. Cytotechnology. 22 (1996) 139-146).
21. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacion 1 a 17 y 19 a 20 o la celula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado por que la cadena pesada y la cadena ligera contienen una extension N-terminal, que es necesaria para el transporte/secrecion del polipeptido a traves de la celula al medio extracelular.
22. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 21, caracterizado por que el procedimiento es adecuado para la produccion de una inmunoglobulina heterologa secretada a gran escala.
23. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 22, caracterizado por que el cultivo se realiza a un volumen de al menos 100 l, mas preferentemente de al menos 500 l, lo mas preferentemente de al menos 1000 l.
24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 23, caracterizado por que el cultivo de dicha celula CHO transfectada se realiza en presencia de dicho agente de seleccion eucariotico en las fermentaciones de la serie de siembra y el cultivo de dicha celula CHO transfectada se realiza en ausencia de dichos agentes de seleccion eucarioticos en la fermentacion principal y dicha recuperacion de dicha inmunoglobulina heterologa secretada procede del medio de cultivo sin dichos agentes de seleccion eucarioticos.
25. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 24, caracterizado por que los agentes de seleccion eucarioticos se anaden durante la fase de crecimiento y se omiten durante la fase de produccion de dicha celula CHO.
26. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 25 o la celula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado por que la productividad especffica de la celula CHO obtenida es mas de 1 pg/106 celulas/d, preferentemente mas de 5 pg/106 celulas/d, mas preferentemente mas de 10 pg/106 celulas/d.
27. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 26 o la celula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 y 26, caracterizado por que la inmunoglobulina heterologa es una inmunoglobulina heterologa secretada completamente procesada.
28. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 27, caracterizado por que el medio utilizado en el cultivo es un medio sin suero, o un medio sin suero suplementado con componentes derivados de mamffero definidos, o medio sin componentes de origen animal, o un medio sin protefnas, un medio sin protefnas suplementado con componentes de origen animal definidos, o un medio definido qufmicamente, o un medio sin componentes derivados de mamfferos, o un medio sin protefnas definidas.
29. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 28, caracterizado por que el medio es el mismo medio en todas las etapas y es un medio adecuado para la produccion a gran escala de la inmunoglobulina heterologa secretada.
30. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 29, caracterizado por que comprende la etapa final de purificar dicha inmunoglobulina heterologa con una o mas etapas cromatograficas.
31. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 1 a 17 y 19 a 30 o la celula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 y 26 a 27 y 30, caracterizado por que el vector con el que se transfecta la celula CHO y que comprende un acido nucleico que confiere resistencia a un agente de seleccion eucariotico tambien comprende un acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicha inmunoglobulina heterologa y un acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicha inmunoglobulina heterologa o si el vector comprende solo un acido nucleico que codifica bien la cadena ligera de dicha inmunoglobulina o la cadena pesada de dicha inmunoglobulina, dicha celula CHO tambien se transfecta por otro vector que comprende un acido nucleico que codifica la otra cadena correspondiente de dicha inmunoglobulina.