KR20100059967A - Ｃｈｏ－ｋ１ 세포주 - Google Patents

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에르하르트 코페츠키
울술라 슈와르츠
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 ATCC CCL-61 세포주로서 기탁된 CHO-K1 세포로부터 유도되고, 현탁액 중에서 생장하며, 생장을 위해 배양 배지 중의 글루타민, 인슐린 및 성장 인자를 필요로 하지 않고, ATCC CCL-61 세포주로서 기탁된 CHO-K1 세포와 비교할 때 핵산의 도입, 결실 또는 불활성화에 의해 변경되지 않음을 특징으로 하는 CHO-K1 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 CHO-K1 세포를 수득하는 방법, 및 본 발명에 따른 CHO-K1 세포를 사용하여 이종 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＣＨＯ－Ｋ１ 세포주{CHO-K1 CELL LINE}
본 발명은 폴리펩티드의 제조 분야에 관한 것이다. 보다 정확하게는, 본 발명은 신규 CHO-K1 세포주, 즉 CHO-K1-Gln(-), 이 세포주의 제조, 및 이종 폴리펩티드의 제조에 있어서 상기 세포주의 용도를 개시한다.
재조합 폴리펩티드의 제조를 위한 발효 시스템은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Marino, M. H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159)에 기재되어 있다. 약학 분야에서 사용되는 폴리펩티드는 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, SP2/O 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6(등록상표) 세포 등에서 제조된다. 발현 플라스미드의 필수 요소는 원핵세포의 복제 기점 및 원핵세포의 선별 마커를 포함하는 원핵 플라스미드 증식 유니트, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)용 원핵 플라스미드 증식 유니트; 진핵세포 선별 마커; 및 프로모터, 구조 유전자 및 전사 종결요소(폴리아데닐화 신호를 포함함)를 각각 포함하는, 원하는 구조 유전자의 발현을 위한 1개 이상의 발현 카세트이다. 포유동물 세포에서의 일시적인 발현을 위해, 포유동물의 복제 기점, 예컨대, SV40 Ori 또는 OriP가 포함될 수 있다. 프로모터로는 구조성(constitutive) 프로모터 또는 유도성(inducible) 프로모터가 선택될 수 있다. 최적화된 전사를 위해, 코작(Kozak) 서열이 5' 비번역 영역에 포함될 수 있다. mRNA 프로세싱, 특히 mRNA 스플라이싱 및 전사 종결을 위해서는, 구조 유전자의 조직화(엑손/인트론 조직화)에 따라 mRNA 스플라이싱 신호 및 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다.
오늘날, CHO 세포는 실험실에서의 소규모 또는 생산 공정에서의 대규모로 약학적 폴리펩티드를 발현시키는 데 널리 사용된다. CHO 세포의 넓은 분포 및 용도로 인해, CHO 세포의 특징적인 성질 및 유전적 배경이 잘 공지되어 있다. 따라서, CHO 세포는 인간에게 적용될 치료 단백질의 제조를 위해 규제 관청에 의해 승인받았다.
그러나, 배양 배지와 관련하여 여전히 많은 문제점들이 존재한다. 동물-유래의 성분들을 사용하기 때문에, 인간에게 유해한 물질, 예컨대, 바이러스 또는 프리온 단백질의 오염 위험이 언제나 존재한다. 고비용 및 다운스트림 가공 문제점 이외에, 동물-유래의 성분의 또 다른 문제점은 생성물을 일정한 양 및 질로 수득하기 어렵게 만드는, 천연 물질의 회분(batch)-대-회분 편차로 인한 문제점이다.
이 문제점들을 극복하기 위해서는 배양 시 보다 적은 동물-유래의 성분들을 필요로 하는 생산 세포주가 필요하다.
완전히 정의된 단백질-무함유 조건 하에서 자가분비 생장할 수 있는 수퍼(super) CHO 세포주는 문헌(Pak, S. CO., et al., Cytotechnology 22 (1996) 139-146))에 의해 보고된 바 있다. 이것은 트랜스페린 및 IGF-I을 발현하는 CHO-K1(ATCC CCL 61) 세포주이다. 미국 특허출원 공개 제2005/0170462호(Morris, A.E., et al.)에는 IGF-I 신호전달 경로의 조절을 통해 세포 배양물에서 재조합 단백질을 제조하는 방법이 보고되어 있다. 문헌(Belaus, A., et al., J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 85 (2003) 105-115)의 저자들은 IL-3 의존성 뮤린 BaF/3 세포를 키메라 ErbB2V →E/IGF-I 수용체로 형질감염시켰다.
본 발명은, ATCC CCL-61로서 기탁된 CHO-K1 세포로부터 유도되고, 현탁액 중에서 생장하며, 폴리펩티드-무함유 및 혈청-무함유 배양 배지 중에서 생장하고, 생장을 위해 배양 배지 중의 글루타민, 인슐린 및 성장 인자를 필요로 하지 않고, 모 세포인 CHO-K1 세포(ATCC CCL-61)와 비교할 때 분자생물학적 방법을 통한 핵산의 도입, 결실 또는 불활성화에 의해 유전적으로 변경되지 않음을 특징으로 하는 CHO-K1-Gln(-) 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 CHO-K1-Gln(-) 세포는 생장을 위해 동물-유래의 화합물을 필요로 하지 않는다.
본 발명의 제2 양태는 본 발명에 따른 CHO-K1 세포의 제조 방법으로서,
a) ATCC CCL-61로서 기탁된 CHO-K1 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 CHO-K1 세포를, 글루타민 및 임의적으로 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되고 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및
c) 단계 b)에서 적응된 상기 CHO-K1 세포를, 임의적으로 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되고 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시켜 CHO-K1-Gln(-) 세포를 수득하는 단계
를 기재된 순서대로 포함하고, 상기 CHO-K1-Gln(-) 세포가 글루타민, 인슐린 또는 성장 인자를 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지인 배양 배지 중에서 생장하고 분자 생물학적 방법을 통한 핵산의 도입, 결실 또는 불활성화에 의해 유전적으로 변경되지 않음을 특징으로 하는 제조 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 방법에 의해 수득된 CHO-K1 세포이다.
본 발명의 추가 양태는 이종 폴리펩티드의 재조합 제조 방법으로서,
a) 본 발명에 따른 CHO-K1 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 이종 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 제공하는 단계;
c) 단계 a)의 CHO-K1 세포를 상기 1개 이상의 핵산으로 형질감염시키는 단계;
d) 단계 c)의 상기 형질감염된 CHO-K1 세포를, 글루타민, 인슐린 또는 성장 인자를 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중에서 배양하는 단계;
e) 상기 CHO-K1 세포의 배양 배지 또는 CHO-K1 세포로부터 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계; 및
f) 임의적으로, 상기 이종 폴리펩티드를 1개 이상의 크로마토그래피 단계로 정제하는 단계
를 포함하는 재조합 제조 방법이다.
한 실시양태에서, 상기 이종 폴리펩티드는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린 접합체 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드, 바람직하게는 치료적 활성 폴리펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 배양 배지 중의 암모늄 이온 농도는 배양 과정 동안 0.12 mmol/ℓ 미만이다. 추가 실시양태는 상기 단계 c) 및 d)를 동일한 배지 중에서 수행한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단계 c) 및 d)는 임의적으로 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 합성 배지 중에서 수행하되, 상기 배양 배지는 단리된 화합물로서 또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 일부로서 글루타민을 함유하지 않고 인슐린 및 성장 인자도 함유하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 배양은 유가(fed-batch) 배양으로서 수행되되, 상기 배양에서 사용된 공급원료는 단리된 화합물로서 또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 일부로서 글루타민을 함유하지 않고 인슐린 및 성장 인자도 함유하지 않는다.
[도 1]
a) 3개 배양 각각의 a) CD_CHO_HT_Gln 배지로부터 수득된 생존 세포 밀도, 및 b) CD_CHO_HT 배지로부터 수득된 생존 세포 밀도.
[도 2]
3개 배양 각각의 a) CD_CHO_HT_Gln 배지의 세포 배양 상청액 중의 락테이트 농도, 및 b) CD_CHO_HT 배지의 세포 배양 상청액 중의 락테이트 농도.
[도 3]
3개 배양 각각의 a) CD_CHO_HT_Gln 배지의 세포 배양 상청액 중의 암모늄-이온 농도, 및 b) CD_CHO_HT 배지의 세포 배양 상청액 중의 암모늄-이온 농도.
[도 4]
플라스미드 6311의 해석된 플라스미드 맵.
본 발명을 실시하는 데 유용한 방법 및 기법은 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 이의 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann (ed), Elsevier Science Publishing Company, Chromatography 5th ed 51A, 1992); 문헌(Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)); 문헌(Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)); 문헌(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)); 문헌(Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); 또는 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York)을 참조한다.
재조합적으로 재조된 이종 면역글로불린의 정제를 위해, 종종 다양한 컬럼 크로마토그래피 단계의 조합이 이용된다. 한 실시양태에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 수행한 후, 1 또는 2개의 추가 크로마토그래피 분리 단계, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행한다. 최종 정제 단계는 미량의 불순물 및 오염물, 예컨대, 응집된 면역글로불린, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스, 및/또는 내독소의 제거를 위한 소위 "연마 단계"이다. 이 연마 단계 후, 종종 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 관통 유동 모드로 사용된다.
다양한 단백질 정제 및 회수 방법, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 모드 이온 교환), 티오친화성 흡착(예를 들어, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용하는 흡착), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용하는 크로마토그래피), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들어, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용하는 크로마토그래피), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 공지되어 있고 널리 이용되고 있다(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 핵산에 의해 직접적으로 코딩될 수 있거나 전구체 형태로 코딩될 수 있는 카복시 α-아미노산으로 구성된 군을 지칭한다. 개개의 아미노산은 소위 코돈 또는 염기-삼중체로 지칭되는 3개의 뉴클레오티드로 구성된 핵산에 의해 코딩된다. 각각의 아미노산은 1개 이상의 코돈에 의해 코딩된다. 상이한 코돈에 의한 동일한 아미노산의 코딩은 "유전적 코드의 축퇴"로서 공지되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 천연 발생 카복시 α-아미노산을 의미하고 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글라이신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "핵산", "핵산 서열" 또는 "핵산 분자"는 개개의 뉴클레오티드(염기로도 지칭됨) a, c, g 및 t(RNA의 경우 u)로 구성된 중합체성 분자, 예를 들어, DNA, RNA 또는 이들의 변이체를 지칭한다. 이 폴리펩티드 분자는 천연 발생 폴리뉴클레오티드 분자, 합성 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 1개 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 분자와 1개 이상의 천연 폴리뉴클레오티드 분자의 조합물일 수 있다. 상기 정의는 1개 이상의 뉴클레오티드가 (예를 들어, 돌연변이유발에 의해) 변경되거나, 결실되거나 또는 부가되어 있는 천연 발생 폴리뉴클레오티드 분자도 포함한다. 핵산은 단리된 상태일 수 있거나, 또 다른 핵산, 예를 들어, 발현 카세트, 플라스미드 또는 숙주 세포의 염색체 내에 삽입된 상태일 수 있다. 핵산은 개개의 뉴클레오티드로 구성된 그의 핵산 서열을 특징으로 한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열을, 이 아미노산 서열을 코딩하는 상응하는 핵산 서열로 전환시키는 절차 및 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 따라서, 핵산은 개개의 뉴클레오티드로 구성된 그의 핵산 서열뿐만 아니라 상기 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 특징으로 한다.
"폴리펩티드"는 천연적으로 제조되든 아니면 합성적으로 제조되는 관계없이 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기로 구성된 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있는 반면, 100개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드 쇄를 하나 이상 포함하는 폴리펩티드는 "단백질"로서 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 비-아미노산 성분, 예컨대, 탄수화물 기, 금속 이온 또는 카복실산 에스터도 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 단백질을 발현하는 세포에 의해 부가될 수 있고, 세포의 종류에 따라 다를 수 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 골격 구조 또는 그를 코딩하는 핵산 면에서 본원에 정의된다. 탄수화물 기와 같은 추가 기는 일반적으로 명시되어 있지 않지만 존재할 수는 있다.
용어 "면역글로불린"은 완전한 면역글로불린 및 면역글로불린 접합체를 포함하는 다양한 형태의 면역글로불린 구조체를 포괄한다. 본 발명에서 사용되는 면역글로불린은 바람직하게는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 T 세포 항원 고갈 항체이다(예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO 98/33523호, 제WO 98/52976호 및 제WO 00/34317호 참조). 항체의 유전적 개조는 예를 들어, 문헌(Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855); 미국 특허 제5,202,238호 및 제5,204,244호; 문헌(Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327); 문헌(Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270); 및 문헌(Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125)에 기재되어 있다. 면역글로불린은 예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일쇄(scFv), 이중특이적 면역글로불린 또는 다이아바디도 포함하는 다양한 포맷으로 존재할 수 있다[예를 들어, 문헌(Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426) 및 일반적으로 문헌(Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984) and Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16) 참조].
용어 "완전한 면역글로불린"은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 면역글로불린을 의미한다. 완전한 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 각각은 항원과 상호작용할 수 있는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인(가변 영역)(일반적으로 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 완전한 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 각각은 불변 영역(일반적으로 카복실 말단 부분)을 포함한다. 중쇄의 불변 영역은 항체와 i) Fc 감마 수용체(FcγR)를 보유하는 세포, 예컨대, 식균 세포, 또는 ii) 브람벨(Brambell) 수용체로도 공지되어 있는 선천성 Fc 수용체(FcRn)를 보유하는 세포의 결합을 매개한다. 또한, 상기 불변 영역은 고전적 보체 시스템의 인자, 예컨대, 성분(C1q)을 포함하는 몇몇 인자에의 결합을 매개한다. 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 다양한 분절, 즉 4개의 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(CDR)을 포함한다.
"면역글로불린 접합체"는 펩티드 결합을 통해 다른 폴리펩티드에 접합된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 다른 폴리펩티드는 비-면역글로불린 펩티드, 예컨대, 호르몬, 성장 수용체, 항융합원성 펩티드 또는 보체 인자 등이다. 예시적 면역글로불린 접합체는 국제 특허출원 공개 제WO 2007/045463호에 기재되어 있다.
용어 "이종 폴리펩티드"는 포유동물 세포 또는 숙주 세포에 의해 천연적으로 생성되지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 다른 방법에 의해 생성된 폴리펩티드는 재조합적 방법에 의해 생성된다. 이러한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 진핵 세포 내에서의 단백질 발현 후 이종 폴리펩티드의 회수 및 단리, 및 약학적으로 허용가능한 순도까지의 통상적인 정제를 포함한다. 폴리펩티드의 제조, 즉 발현을 위해, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 표준 방법으로 발현 카세트 내로 각각 삽입한다. 예를 들어, 하이브리도마 세포가 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산의 공급원으로서 사용될 수 있다. 발현 카세트를 발현 플라스미드 내로 삽입한 후, 상기 발현 플라스미드를 이종 폴리펩티드를 천연적으로 생성하지 않는 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 발현은 적절한 진핵 숙주 세포에서 수행하고, 폴리펩티드는 용해 후 세포로부터 회수하거나 배양물 상청액으로부터 회수한다.
"단리된 폴리펩티드"는 세포 성분들, 예컨대, 탄수화물, 지질, 또는 천연 상태에서 폴리펩티드와 관련되어 있는 단백질성 불순물을 실질적으로 갖지 않는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 단리된 폴리펩티드 제제는 폴리펩티드를 고도로 정제된 형태로, 즉 약 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 95%보다 높은 순도, 또는 99%보다 높은 순도로 함유한다. 특정 단백질 제제가 단리된 폴리펩티드를 함유함을 입증하는 한 방법은 단백질 제제의 SDS-PAGE 및 겔의 코마시에 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 후 단일 밴드가 나타나는 지를 확인하는 것이다. 그러나, 용어 "단리된"은 동일한 폴리펩티드가 다른 물리적 형태, 예컨대, 이량체 또는 글리코실화된 또는 유도체화된 형태로 존재하는 것을 배제하지 않는다.
"이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩티드"는 소정의 숙주 세포 내에서 천연적으로 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩티드, 또는 DNA 분자 집단 또는 폴리펩티드 집단을 지칭한다. 특정 숙주 세포에 대해 이종성을 갖는 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외래 DNA)와 조합되어 있는 한, 숙주 세포 종으로부터 유래된 DNA(즉, 내재 DNA)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 분절에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 비-숙주 DNA 분절을 포함하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자인 것으로 간주된다. 역으로, 이종 DNA 분자는 외래 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 내재 구조 유전자를 포함할 수 있다. 비-숙주 DNA 분자에 의해 코딩된 펩티드 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
본원에서 사용된 용어 "성장 인자"는 배양 배지 중에서의 포유동물 세포의 생장에 대한 긍정적 효과를 나타내는 화합물을 의미한다. 한 실시양태에서, 성장 인자는 아미노산 잔기로 구성되고, 즉 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 예시적 성장 인자는 형질전이 성장 인자 베타(TGF-β), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래의 성장 인자(PDGF), 에리쓰로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 미요스타틴(GDF-8), 성장 분화 인자-9(GDF-9), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF 또는 FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF 또는 FGF-2), 상피 성장 인자(EGF), 간세포 성장 인자(HGF), 악티빈(activin), 골 형태형성 단백질, FLT-3 리간드, 인슐린-유사 성장 인자, 뉴로트로픽 인자, 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) 단백질 및 혈관 내피 성장 인자가 있으나 이들로 한정되지 않는다.
포유동물 세포 발현에 적합한 또는 바람직한 임의의 치료적 단백질은 본 발명에 따른 CHO-K1-Gln(-) 세포를 사용하여 세포 배양물 중에서 제조할 수 있다. 이러한 단백질의 비-제한적 예는 사이토카인, 수용체, 가용성 수용체, 인터루킨, 성장 인자, 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린 접합체 등을 포함한다.
용어 "세포 배양물"은 롤러 병, 플라스크, 유리 또는 스테인레스 스틸 배양 용기 등에서 현탁액 중에서 생장하거나 부착된 상태로 생장하는 세포를 지칭한다. 대규모 용기, 예컨대, 생물반응기도 상기 "세포 배양물"에 포함된다. 폴리펩티드의 대규모 제조 및 소규모 제조 둘다를 위한 세포 배양 방법은 본 발명에 포함된다. 유동화된 층 생물반응기, 진탕 플라스크 배양 또는 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는 방법이 사용될 수 있고 상기 방법은 회분식, 분할-회분식, 유가 배양식 또는 관주식으로 작동될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 포유동물 세포의 생장을 위해 사용되는 영양분 용액을 의미한다. 이러한 영양분 용액은 일반적으로 세포의 생장 및 세포 환경의 유지에 필요한 다양한 인자를 포함한다. 예를 들어, 전형적인 영양분 용액은 기본 배지 제제, 배양 종류에 따른 다른 다양한 보충물, 및 종종 선별제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 임의의 적절한 세포 배양 배지가 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있되, 상기 배지는 폴리펩티드, 글루타민, 인슐린 또는 임의의 성장 인자를 함유하지 않는다.
본 발명의 세포 또는 방법을 이용하여 제조할 수 있는 단백질은 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호로몬, 갑상선 호르몬-방출 호르몬, 소마토스타틴, 프로락틴, 아드레노코르티코트로픽 호르몬, 멜라닌 형성 세포-자극 호르몬, 바소프레신 및 이의 유도체, 예를 들어, 데스모르페신, 옥시토신, 칼시토닌, 갑상선 호르몬(PTH) 또는 이의 단편(예를 들어, PTH(1-43)), 가스트린, 세크레틴, 판크레오자이민, 콜레사이스토키닌, 안지오텐신, 인간 태반 락토겐, 인간 융모막 고나도트로핀(HCG), 캐룰레인 및 모틸린과 같은 호르몬; 엔케팔린 및 이의 유도체(미국 특허 제4,277,394호 및 유럽 특허 제0 031 567호 참조), 엔도르핀, 다이노르핀 및 카이오토르핀과 같은 진통제; 예를 들어, 봄베신, 뉴로텐신, 브래디키닌 및 물질 P와 같은 효소; 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, EPO, 지단백질, 알파-1-안티트립신, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 글루카곤, 항-응고 인자, 예컨대, 단백질 C, 심방성 나트륨이뇨 인자, 폐 계면활성제, 플라스미노겐 활성화제, 예컨대, 유로키네이즈 또는 인간 소변 또는 조직-특이적 플라스미노겐 활성화제(t-PA), 트롬빈, 엔케팔리네이즈, RANTES, 인간 마크로파지 염증 단백질(MIP-1-알파), 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 뮬레리안-억제 물질, 릴랙신(relaxin) A-쇄, 릴랙신 B-쇄, 프로릴랙신, 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드, 미생물 단백질, 예컨대, 베타-락타메이즈, DNAse, 인히빈, 액티빈, 레닌, 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마티스성 인자, 뉴로트로픽 인자, 예컨대, 골-유래의 뉴로트로픽 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, CD 단백질(분화 단백질 클러스터), 예컨대, CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19, 골유도성 인자, 면역독소, 사이토카인 수용체, 인터페론, 예컨대, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인터루킨(IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10, 수퍼록사이드 디스뮤테이즈, T-세포 수용체, 표면 막 단백질, 부패 촉진 인자, 바이러스 항원, 예컨대, ADIS 외피의 일부, 수송 단백질, 귀향(homing) 수용체, 어드레신, 조절제 단백질, 면역글로불린, 키메라 단백질, 예컨대, 면역어드헤신, 및 상기 나열된 단백질들 중 임의의 단백질의 단편이다.
용어 "CHO-K1 세포" 또는 "CHO-K1" 및 이의 문법적 등가어뿐만 아니라 상기 용어를 포함하는 조성물은 핵산, 예를 들어, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 도입될 수 있거나 도입되는 CHO-K1 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "세포"는 대상 세포 및 이의 자손세포를 포함한다. 따라서, 용어 "형질감염체" 및 "형질감염된 세포"는 1차 대상 세포, 및 세포 계대 수(분할 수) 또는 세포 하위배양 수를 고려하지 않고 상기 1차 대상 세포로부터 유래된 배양물을 포함한다. 의도적 또는 우발적 돌연변이로 인해 모든 자손세포가 DNA 함량에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해해야 한다. 최초로 형질감염된 세포에서 스크리닝될 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 나타내는 변이체 자손세포도 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "발현"은 세포, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포 내에서 일어나는 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 세포 내에서의 원하는 핵산 서열의 전사 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기초로 하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 원하는 서열로부터 전사된 mRNA는 PCR 또는 노던 혼성화에 의해 정량될 수 있다[상기 샘브룩(Sambrook)의 문헌(1989) 참조]. 원하는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 다양한 방법, 예를 들어, ELISA, 단백질의 생물학적 활성 분석, 또는 상기 활성과 무관한 분석, 예컨대, 폴리펩티드를 인식하여 결합하는 면역글로불린을 사용한 웨스턴 블롯팅 또는 방사선면역분석의 이용에 의해 정량될 수 있다[상기 샘브룩(Sambrook)의 문헌(1989) 참조].
"발현 카세트"는 세포 내에서 적어도 함유된 핵산을 발현하는 데 필요한 조절 요소, 예컨대, 프로모터 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 구축물을 지칭한다.
"형질감염 벡터"는 숙주 세포 내에서 형질감염 벡터 내에 포함된 코딩 핵산/구조 유전자의 발현에 필요한 모든 요소들을 제공하는 핵산(핵산 분자로도 지칭됨)이다. 형질감염 벡터는 원핵 복제 기점 및 원핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함하는 원핵 플라스미드 증식 유니트, 예를 들어, 이. 콜라이용 플라스미드 증식 유니트를 포함하고, 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 1개 이상의 핵산 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현 카세트 내에 각각 배치함으로써, 각각의 발현 카세트가 프로모터, 코딩 핵산, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결요소를 포함한다. 유전자 발현은 통상적으로 프로모터의 조절 하에 배치하는데, 이때 구조 유전자는 상기 프로모터"에 작동가능하게 연결되어" 있다고 기재된다. 유사하게, 조절 요소와 코어 프로모터는 상기 조절 요소가 상기 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동가능하게 연결되어 있다.
"프로모터"는 이것에 작동가능하게 연결되어 있는 유전자/구조 유전자 또는 핵산의 전사를 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시를 위한 신호를 포함한다. 사용되는 프로모터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현이 예상되는 세포 유형의 숙주 세포 내에서 기능을 발휘할 것이다. 다양한 여러 공급원으로부터의 구성적(constitutive) 프로모터, 유도적(inducible) 프로모터 및 억제적(repressible) 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터가 당업계에 잘 공지되어 있고(진뱅크(BenBank)와 같은 데이터베이스에서 확인할 수도 있음), (예를 들어, ATCC와 같은 기탁기관 및 다른 시판 또는 개별 공급처로부터) 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 요소로서 입수가능하다. "프로모터"는 예를 들어, 작동가능하게 연결된 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시 부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 또는 5'-비번역 영역 내에 위치한다. 전사의 개시에서 기능을 발휘하는 프로모터 내의 서열 요소들은 종종 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 상기 프로모터 요소들은 RNA 중합효소 결합 부위; TATA 서열; CAAT 서열; 분화-특이적 요소(DSE; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-560); CRE; 혈청 반응 요소(SRE; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58); 글루코코티코이드 반응 요소(GRE); 및 다른 전사 인자, 예컨대, CRE/ATF(O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943), AP2(Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728-25734), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264) 및 옥타머 인자[예컨대, 일반적으로 문헌(Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) 및 문헌(Lemaigre, F.P. and Rousseau, G. G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14) 참조]에 대한 결합 부위를 포함한다. 진핵 프로모터 중에서 고도 발현을 위한 강력한 프로모터로서 확인되어 있는 진핵 프로모터는 SV40 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부, 차이니스 햄스터 연장 인자 1 알파(CHEF-1; 예를 들어, 미국 특허 제5,888,809호 참조), 인간 EF-1 알파, 유비퀴틴 및 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터(CMV IE)이다. "프로모터"는 구조성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터만을 사용하였을 때 얻어지는 발현도를 증가시키기 위해 프로모터와 함께 작용하는 인핸서(enhancer)(즉, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 시스-작용 DNA 요소)가 필요할 수 있고, 상기 인핸서는 전사 조절 요소로서 포함될 수 있다. 종종, 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분절은 인핸서 서열도 포함할 것이다(예를 들어, CMV 또는 SV40).
본원에서 사용된 "인핸서"는 이것에 작동가능하게 연결되어 있는 유전자 또는 코딩 서열의 전사를 상승시키는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 배향 및 위치와 비교적 무관하고, 인트론(Banerji, J., et al., Cell, 33 (1983) 729-740)뿐만 아니라 코딩 서열 자체(Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio., 4 (1984) 1293-1305) 내에서도 전사 유니트에 대해 5' 또는 3' 위치에서 발견되어 왔다. 따라서, 인핸서는 전사 개시 부위로부터 업스트림 또는 다운스트림에 위치되어 있을 수 있거나 프로모터로부터 상당히 먼 거리에 위치되어 있을 수 있지만, 실제로 인핸서는 프로모터와 물리적으로 및 기능적으로 중첩되어 있을 수 있다. 다양한 여러 공급원으로부터의 다수의 인핸서가 당업계에 잘 공지되어 있고 (진뱅크와 같은 데이터베이스에서 확인할 수 있으며), (예를 들어, ATCC와 같은 기탁기관 및 다른 시판 또는 개별 공급처로부터) 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 요소로서 입수가능하다. 프로모터 서열(예컨대, 통상적으로 사용되는 CMV 프로모터)을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드가 인핸서 서열도 포함한다. 예를 들어, 전술된 강력한 프로모터들 모두가 강력한 인핸서도 포함할 수 있다[예를 들어, 문헌(Bendig, M.M., Genetic Engineering, 7 (Academic Press, 1988) 91-127) 참조].
"선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산"은 이 핵산을 보유하는 세포가 선별제의 존재 하에서 구체적으로 선별되게 하는 핵산이다. 이러한 핵산은 "선별 마커"로도 지칭된다. 전형적으로, 선별 마커는 숙주 세포 내에서 대사적 결함 또는 이화작용 결함에 대한 선별제(약물) 또는 보상물(compensate)에 대한 내성을 부여할 것이다. 선별 마커는 양성 선별 마커, 음성 선별 마커 또는 이작용성(bifunctional) 선별 마커일 수 있다. 유용한 양성 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 이 선별 마커는 이것으로 형질전환된 세포가 상응하는 선별제의 존재에 대해 양성적으로 선별될 수 있게 하고, 즉 예를 들어, 상응하는 항생제의 존재 하에서 선별적으로 생장될 수 있게 한다. 비-형질전환된 세포는 선별 배양 조건 하에서, 즉 배양물 중의 선별제의 존재 하에서 생장할 수 없거나 생존할 수 없을 것이다. 양성 선별 마커는 이 마커를 보유하는 세포의 선별을 가능하게 하는 반면, 음성 선별 마커는 이 마커를 보유하는 세포가 선별적으로 제거되게 한다. 진핵 세포 선별 마커는 예를 들어, 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼레이즈(APH)[선별제, 예를 들어, 하이그로마이신(hyg), 네오마이신(네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈 II, neo) 및 G418에 대한 내성을 부여함]에 대한 유전자, 다이하이드로폴레이트 리덕테이즈(DHFR)(선별제인 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함)에 대한 유전자, 타이미딘 카이네이즈(tk)에 대한 유전자, 글루타민 합성효소(GS)에 대한 유전자, 아스파라긴 합성효소에 대한 유전자, 트립토판 합성효소(선별제인 인돌에 대한 내성을 부여함)에 대한 유전자, 히스티다이놀 데하이드로게네이즈(선별제인 히스티다이놀 D에 대한 내성을 부여함)에 대한 유전자, 시스티딘 데아미네이즈에 대한 유전자, 에데노신 데아미네이즈에 대한 유전자, 및 퓨로마이신, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함한다. 추가 선별 마커 유전자는 국제특허출원 공개 제WO 92/08796호 및 제WO 94/28143호에 기재되어 있다. 원핵 선별 마커는 예를 들어, 베타-락타메이즈 유전자(선별제인 앰피실린에 대한 내성을 부여함)를 포함한다.
유전자의 발현은 일시적 발현 또는 영구적 발현으로서 수행한다. 원하는 폴리펩티드는 일반적으로 분비되는 폴리펩티드이므로, 세포벽을 통해 세포외 배지로 분비되는 폴리펩티드의 수송/분비에 필요한 N-말단 연장부(신호 서열로도 공지되어 있음)를 함유한다. 일반적으로, 신호 서열은 분비되는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자로부터 유래될 수 있다. 이종 신호 서열이 사용되는 경우, 바람직하게는 상기 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 가공되는(즉, 신호 펩티데이즈에 의해 절단되는) 신호 서열이다 효모에서의 분비를 위해, 발현시킬 이종 유전자의 천연 신호 서열을, 분비되는 유전자로부터 유래된 동종 효모 신호 서열, 예컨대, 효모 인버테이즈(invertase) 신호 서열, 알파-인자 리더(사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia) 및 한세뉼라(Hansenula) α-인자 리더(미국 특허 제5,010,182호에서 두 번째로 기재됨)를 포함함), 산 포스파테이즈 신호 서열, 또는 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀레이즈 신호 서열(유럽 특허 제0 362 179호)로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 다른 포유동물 신호 서열, 예컨대, 인간 또는 뮤린-유래의 면역글로불린의 경우 동일한 또는 관련된 종의 분비되는 폴리펩티드로부터 유래된 신호 서열이 적합할 수 있고 바이러스 분비 신호 서열, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 당단백질 D 신호 서열도 적합할 수 있지만 원하는 단백질의 천연 신호 서열이 만족스럽다. 이러한 예비분절을 코딩하는 DNA 단편은 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편에 인 프레임으로 라이게이션된다(즉, 작동가능하게 연결된다).
본 발명의 제1 양태는 배양 배지 중의 글루타민, 인슐린 및 성장 인자를 필요로 하지 않는, CHO-K1-Gln(-)으로서 명명된 CHO-K1 세포이다.
본 발명에 따른 CHO-K1 세포는 다음과 같이 수득된다:
ATCC CCL-61로서 기탁된 CHO-K1 세포를 제공하고; 상기 CHO-K1 세포를, 글루타민 및 임의적으로 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되고 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시키고; 전 단계에서 적응된 CHO-K1 세포를 임의적으로 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되고 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시킴.
용어 "화학적으로 정의된 배지"는 합성 화합물만을 함유하고 동물-유래의 성분들을 함유하지 않는 배지를 지칭한다. 또한, 용어 "화학적으로 정의된 배지"는 한 실시양태에서 0.1 mM 미만, 또 다른 실시양태에서 0.01 mM 미만, 추가 실시양태에서 0.001 mM 미만의 글루타민을 함유하는 배지를 지칭한다. 한 실시양태에서, 화학적으로 정의된 배지는 글루타민을 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, 화학적으로 정의된 배지는 동물-유래의 성분을 함유하지 않고 식물-유래의 세포 가수분해물도 함유하지 않는다. 화학적으로 정의된 합성 배지의 예는 인비트로겐의 CD CHO 배지; 염화나트륨 3-5 g/ℓ, 염화칼륨 0.2-0.4 g/ℓ, HEPES 5-7 g/ℓ, 글루코스(덱스트로스) 3.5-5.5 g/ℓ, 바이오틴 0.000005-0.000025 g/ℓ, 아스코르브산 0.002-0.004, 판토쎄네이트 0.002-0.006 g/ℓ, 콜린 0.002-0.006 g/ℓ, 폴레이트 0.002-0.006 g/ℓ, 이노시톨 0.005-0.02 g/ℓ, 니아신아마이드 0.002-0.006 g/ℓ, 피리독살 0.002-0.006 g/ℓ, 리보플라빈 0.0002-0.0006 g/ℓ, 티아민 0.002-0.006 g/ℓ, 시아노발라민 0.000005-0.000025 g/ℓ, 옥살로아세트산 0.1-0.4 g/ℓ, 알라닌 0.015-0.035 g/ℓ, 아스파라긴 0.01-0.035 g/ℓ, 아르기닌 0.06-0.10 g/ℓ, 아스파테이트 0.02-0.04 g/ℓ, 시스테인 0.3-0.5 g/ℓ, 시스틴 0.05-0.2 g/ℓ, 글루타메이트 0.06-0.09 g/ℓ, 글리신 0.02-0.04 g/ℓ, 히스티딘 0.03-0.05 g/ℓ, 이소류신 0.05-0.25 g/ℓ, 류신 0.05-0.25 g/ℓ, 라이신 0.05-0.25 g/ℓ, 메티오닌 0.02-0.04 g/ℓ, 페닐알라닌 0.055-0.075 g/ℓ, 프롤린 0.03-0.05 g/ℓ, 세린 0.03-0.055 g/ℓ, 쓰레오닌 0.07-0.15 g/ℓ, 트립토판 0.005-0.025 g/ℓ, 티로신 0.05-0.15 g/ℓ, 발린, 소듐 셀레네이트, 0.0000005-0.000060 g/ℓ, 황산마그네슘 0.05-0.2 g/ℓ, 염화칼륨 0.15-0.45 g/ℓ, 인산나트륨 0.075-0.2 g/ℓ, 질산칼륨 0.00005-0.00009 g/ℓ, 염화칼슘 0.08-0.25 g/ℓ, 피루브산나트륨 0.05-0.4 g/ℓ, 리놀레산 1-100 mg/ℓ, 에탄올아민 5-25 ㎍/ℓ, 중탄산나트륨 1-5 g/ℓ, 시트르산철, 1-10 mg/ℓ, 플루로닉 F68 0.2-2 g/ℓ, 수산화나트륨 0.3-0.9 g/ℓ, 마이코페놀산 0.1-2 mg/ℓ, 하이포잔틴 2-5 mg/ℓ, 잔틴 10-200 mg/ℓ 및 중탄산나트륨 1.5-4.5 g/ℓ로 구성된, 국제 특허출원 공개 제WO 02/066603호에 기재된 배지의 변경된 버전; 시판되는 배지, 예를 들어, 시그마/알드리치로부터 시판되는 배지(제품 번호 S2772, S2897 및 S8284(www. sigma-Aldrich. com)), 라이프 테크놀로지스(미국 매릴랜드주 록빌 소재)(www. lifetech. com)로부터 시판되는 배지, 제이알에이치 바이오사이언시스(미국 칸사스주 레넥사 소재)(www. jrhbio. com)로부터 시판되는 배지를 기초로 하여 본 발명에서 유용한 배지를 제공하기 위해 본 발명의 방법에 따라 변경된 배지; 이소코브스(Iscoves) 변경 배지(Iscove et al., J. Exp. Med. 147 (1978) 923-933; Iscove, et al., Exp. Cell Res. 126 (1980) 121-126); 둘베코스 변경 이글 배지(Dulbecco and Freeman, Virology 8 (1959) 396-397; Smith et al.,, J. D., Freeman, G., Vogt, M. and Dulbecco, R., Virology 12 (1960) 185-196; Morton, In Vitro 6 (1970) 89; Rutzky and Pumper, In Vitro 9 (1974) 468); 또는 햄스 F-12/둘베코스 변경 이글 배지(Barnes and Sato, Analyt. Biochem. 102 (1980) 255-270)이다.
ATCC로부터 입수된 CHO-K1 세포(ATCC CCL-61)는 표준 습한 조건(95% 습도, 37℃ 및 5% CO2) 하에서 2 mM 글루타민 및 10%(부피/부피) 태아소 혈청(FCS)로 보충된, 둘베코스 변형 이글 배지와 햄스 F12 배지의 1:1(중량/중량) 혼합물(DMEM/F12)인 배양 배지 중에서 생장하도록 적응된 부착 생장 세포이다.
제1 단계에서, 세포는 현탁액 중에서 생장하도록 적응된다. 따라서, 세포는 트립신 또는 아큐테이즈를 사용한 효소 처리에 의해 탈착되어 원심분리에 의해 수거된다. 수거된 세포는 하이포잔틴, 티미딘 및 2 mM L-알라닐-L-글루타민을 함유하는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 합성 배지에 시딩된다. 한 실시양태에서, 이러한 배양은 50 내지 250 ml의 배양 용기 부피에서 소규모로 수행된다. 한 실시양태에서, 접종 세포 밀도는 3 x 105 세포/ml이다. 한 실시양태에서, 세포는 3 내지 4 세대마다, 즉 3 내지 5일마다 새로운 배지 내로 분할된다. 한 실시양태에서, 세포는 총 35 내지 60 세대 동안 분할되거나 또는 12 내지 20회 분할된다. 한 실시양태에서, 제1 단계에서 적응된 세포의 배가 시간(doubling time)은 25 내지 30시간이다.
제2 단계에서, 제1 단계로부터 유도된 세포는 하이포잔틴 및 티미딘을 함유하지만 L-알라닐-L-글루타민을 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 합성 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응된다. 따라서, 세포는 25 내지 33 세대 또는 23 내지 35일에 걸쳐 계대배양된다. 제2 단계의 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 합성 배지는 글루타민, 또는 글루타민-함유 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, 제2 단계에서 수득된 세포의 배가 시간은 22 내지 25시간이다. 한 실시양태에서, 제2 단계에서 수득된 세포의 최대 생존 세포 밀도는 6 내지 7 x 106 세포/ml이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명에 따른 CHO-K1-Gln(-) 세포가 모 세포주 ATCC CCL-61에 비해 개선된 성질을 가짐을 발견하였다.
추가로, CHO-K1-Gln(-) 세포의 배양 배지로부터 글루타민을 배제시킨 경우, 배양 과정 동안 암모늄 이온 및 암모니아의 형성이 감소된다. 따라서, 한 실시양태에서, 배양 배지 중의 암모늄 이온 농도는 0.15 mmol/ℓ 미만, 추가 실시양태에서 0.1 mmol/ℓ 미만이다. 또한, 배양 배지 중의 락테이트의 농도는 일정한 수준으로 유지됨을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포의 배양 과정 동안 배양 배지 중의 락테이트 생성/축적이 감소된다. 또 다른 실시양태에서, 배양 배지 중의 락테이트 농도는 2.5 g/ℓ 미만이다. 또한, 본 발명에 따른 세포를 사용하는 경우, 생산 세포주의 제조에 필요한 모든 단계에서, 즉 제1 형질감염부터 대규모 발효까지 동일한 배양 배지를 사용할 수 있다. 사용되는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 합성 배지는 필요한 선별제로 보충되어야만 한다. 따라서, 전체 과정 동안 새로운 배지/상이한 배지에의 적응 단계가 필요하지 않아 시간 및 비용이 절약된다. 또한, 한 실시양태에서, 배양이 유가 배양식으로서 수행되는 경우, 사용되는 공급원료는 글루타민-무함유, 인슐린-무함유, 성장 인자-무함유 및 폴리펩티드-무함유 공급원료이다. 본 발명자들은 놀랍게도 이러한 유용한 세포가 일련의 적응 단계에 의해 수득될 수 있고 예를 들어, 원치않는 독성 대사 부산물을 무해한 화합물로 전환시키기 위한 효소를 코딩하는 추가 유전자의 도입에 의한 세포의 유전적 변경을 필요로 하지 않음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 CHO-K1-Gln(-) 세포를 사용하는 경우, 배양 용기의 pH 값이 pH 6.8 내지 pH 7.2 사이에서 유지됨을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 제2 양태는 CHO-K1-Gln(-) 세포주의 제조 방법으로서, 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 제조 방법이다:
- CHO-K1 세포(ATCC CCL-61)를 제공하는 단계,
- 상기 CHO-K1 세포를, 글루타민으로 보충되고 임의적으로 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되고 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시키는 단계, 및
- 상기 단계에서 적응된 CHO-K1 세포를, 임의적으로 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되고 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시킴으로써 CHO-K1-Gln(-) 세포주를 수득하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 CHO-K1-Gln(-) 세포주에 필요한 배양 배지는 글루타민, 인슐린 및 성장 인자를 함유하지 않고, 분자생물학적 방법에 의한 핵산의 도입, 결실 또는 불활성화, 또는 이종 폴리펩티드의 발현, 2차 변경 또는 분비에 요구되지 않는 효소를 코딩하는 핵산의 도입, 결실 또는 불활성화에 의해 유전적으로 변경되지 않는다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 방법을 이용하여 수득한 CHO-K1 세포이다.
본 발명의 추가 양태는 이종 폴리펩티드의 재조합 제조 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 재조합 제조 방법이다:
- 본 발명에 따른 CHO-K1 세포를 제공하는 단계;
- 상기 이종 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 제공하는 단계;
- 상기 CHO-K1 세포를 상기 1개 이상의 핵산으로 형질감염시키는 단계;
- 단계 c)의 상기 형질감염된 CHO-K1 세포를, 글루타민, 인슐린 또는 성장 인자를 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중에서 배양하는 단계;
- 상기 CHO-K1 세포의 배양 배지 또는 CHO-K1 세포로부터 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계; 및
- 임의적으로, 상기 이종 폴리펩티드를 1개 이상의 크로마토그래피 정제 단계로 정제하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 이종 폴리펩티드는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린 접합체 또는 치료적 활성 폴리펩티드이다.
본 발명에 따른 방법은 분비되는 이종 폴리펩티드를 대규모로, 즉 산업적 규모로 제조하는 데 적합하다. 원하는 폴리펩티드를 대규모로 제조하기 위한 세포의 배양은 일반적으로 일련의 개개의 배양으로 구성되는데, 이때 최종 배양, 즉 대규모 배양, 즉 배양 순서에서 가장 마지막 배양을 제외한 모든 배양은 일정한 세포 밀도가 배양 용기 내에서 도달될 때까지 수행된다. 예정된 세포 밀도가 도달된 경우, 전체 배양 또는 이의 분획이 이전 배양의 부피보다 100배 이하만큼 더 큰 부피의 후속 배양 용기를 접종하는 데 사용된다. 보다 큰 부피의 하나 이상의 추가 배양을 위한 기초로서 작용하는 모든 배양은 "시드 트레인(seed train) 발효"로서 지칭된다. 대규모 배양, 즉 보다 큰 부피의 추가 배양을 위한 기초로서 작용하지 않는 배양("주 발효"로도 지칭됨)에서만, 배양의 종결점이 배양 배지 중의 생성된 분비된 이종 면역글로불린의 농도 또는 배양 시간에 따라 결정된다. 본원에서 사용된 용어 "대규모"는 산업적 생산 공정의 최종 배양을 의미한다. 한 실시양태에서, 대규모 배양은 100 ℓ 이상의 부피, 또 다른 실시양태에서는 500 ℓ 이상의 부피, 추가 실시양태에서는 1,000 ℓ 이상 내지 25,000 ℓ의 부피로 수행된다. 한 실시양태에서, 최종, 즉 대규모 배양 배지는 진핵 선별제를 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 형질감염된 CHO 세포의 배양은 500 ℓ 미만의 부피로 진핵 선별제의 존재 하에서 수행되고, 형질감염된 CHO 세포의 배양은 500 ℓ 이상의 부피로 진핵 선별제의 부재 하에서 수행되며, 이종 폴리펩티드는 상기 진핵 선별제를 함유하지 않는 배양 배지로부터 회수된다. 추가 실시양태에서, 배양은 배양 부피를 최종 배양 부피가지 증가시키면서 수행하는 순차적 배양을 포함하고, 이때 배양은 최종 또는 주 배양의 배양 부피의 1%(부피/부피)의 배양 부피 이하로 진핵 선별제의 존재 하에서, 및 최종 배양의 배양 부피의 1%(부피/부피) 초과의 배양 부피로 모든 진핵 선별제의 부재 하에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 상기 배양은 배양 부피를 증가시키면서 수행하는 순차적 시드 트레인 배양을 포함하고, 이때 시드 트레인 배양은 진핵 선별제의 존재 하에서 각각 수행되고, 주 발효는 모든 진핵 선별제의 부재 하에서 수행된다. 한 실시양태에서, 상기 형질감염된 CHO 세포의 배양은 시드 트레인 발효에서 진핵 선별제의 존재 하에서 수행되고, 상기 형질감염된 CHO 세포의 배양은 주 발효에서 진핵 선별제의 부재 하에서 수행되며, 이종 폴리펩티드는 진핵 선별제를 함유하지 않는 주 배양 배지로부터 회수된다. 이 실시양태에서, 진핵 선별제는 시드 트레인 배양 과정 동안에 첨가되고 상기 CHO 세포의 생산 주기(주 발효 배양) 동안에는 첨가되지 않는다. 용어 "생산 주기"는 큰 부피로 CHO 세포를 배양하는 것, 즉 주 발효를 의미하고, 상기 주 발효 후에 생성된 이종 폴리펩티드가 회수된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 40 세대 후 CHO 세포의 생산성은 10 세대 동안 분할-회분 배양된 후 생산성의 70% 이상 내지 130% 이하이다. 한 실시양태에서, 60 세대 후 CHO 세포의 생산성은 10 세대 동안 분할-회분 배양된 후 생산성의 50% 이상 내지 150% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포의 생산성은 유가 배양으로서 배양된 지 21일 이내에 1.5 g/ℓ 이상의 이종 면역글로불린을 생성하는 수준이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 수득된 CHO 세포의 비생산성(specific poductivity)은 1 ㎍/106 세포/d 초과, 5 ㎍/106 세포/d 초과, 또는 10 ㎍/106 세포/d 초과이다. 한 실시양태에서, 분비되는 이종 면역글로불린은 완전하게 가공된 분비되는 이종 면역글로불린이다. 용어 "완전하게 가공된 분비되는 이종 면역글로불린"은 i) 배양 배지로 분비되고 그의 신호 서열이 절단된 면역글로불린, ii) 항원 결합 영역을 가진 면역글로불린, 및 iii) 2차적 변경, 예컨대, 부착된 사카라이드 또는 폴리사카라이드, 및/또는 정확하게 형성된 이황화 결합을 가진 면역글로불린을 지칭한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이종 면역글로불린은 항-CD4 항체-접합체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-CD4 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1, 2 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-CD4 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 CDR3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-CD4 항체는 서열번호 7, 8 및 9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 접합체에서 상기 항-CD4 항체는 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
인간에서 사용될 치료제, 즉 폴리펩티드의 대규모 제조에 사용될 수 있는 포유동물 세포는 명확한 기준을 충족시켜야 한다. 특히, 상기 포유동물 세포는 혈청-무함유 배지 중에서 배양될 수 있어야 한다. 혈청은 다수의 화합물의 혼합물이다. 통상적으로 소 혈청이 포유동물 세포의 배양에 사용되어 왔다. 한 종으로부터 다른 종으로 전염될 수 있는 질환의 발병 문제점 때문에, 혈청 및 다른 비-정의된 포유동물-유래의 성분의 사용은 회피되어야 한다. 본원에서 사용된 용어 "비-정의된 포유동물-유래의 성분"은 포유동물, 특히 바람직하게는 소, 돼지, 양 또는 새끼양으로부터 유래된 성분을 의미하고, 이의 조성은 80%(중량/중량) 미만, 바람직하게는 90%(중량/중량) 미만만큼 특정될 수 있다. "정의된 포유동물-유래의 성분"은 포유동물, 특히 바람직하게는 소, 돼지, 양 또는 새끼양으로부터 수득된 성분이고, 이의 조성은 95%(중량/중량) 초과, 바람직하게는 98%(중량/중량) 초과, 가장 바람직하게는 99%(중량/중량) 초과만큼 특정될 수 있다. 정의된 포유동물-유래의 성분의 예는 양모로부터 유래된 콜레스테롤, 및 소젖으로부터 유래된 갈락토스이다.
한 실시양태에서, 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지는 인비트로겐 코포레이션으로부터 입수가능한 CD CHO 배지, 또는 깁코로부터 입수가능한 ProCHO4 배지, 또는 하이클론으로부터 입수가능한 단백질-무함유 배지인 HyQ SFM4CHO 배지이다. 한 실시양태에서, 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배양 배지는 이글스 최소 필수 배지(EMEM), 둘베코스 변형 이글 배지(DMEM), RPMI 1640, 이스코브 변형 둘베코스 배지(IMDM), 또는 NCTC 109 배양 배지(모두 론자 인코포레이티드(미국 소재)로부터 시판됨)로부터 유도된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 제1 형질감염으로부터 시작되어 이종 폴리펩티드의 회수로 종결되는 방법이 동일한 배지 중에서 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "동일한 배지 중에서"는 제1 형질감염으로부터 시작되어 주 발효 배양 배지로부터 이종 폴리펩티드의 회수로 종결되는 과정에서 동일한 배지가 사용됨을 의미한다. 이것은 동일한 첨가제가 모든 단계에서 배지에 첨가되어야 함, 즉 본 방법의 상이한 단계에서 배지가 상이한 첨가제로 보충될 수 있음을 의미하는 것은 아니다. 첨가제는 20%(중량/중량) 미만의 총량으로, 한 실시양태에서 15%(중량/중량) 미만의 총량으로, 또 다른 실시양태에서 10%(중량/중량) 미만의 총량으로 배지에 첨가되는 화합물이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 배지는 모든 단계에서 동일한 배지이고 이종 폴리펩티드의 대규모 생산에 적합한 배지이다.
이종 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 크로마토그래피 방법으로 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 이종 폴리펩티드를 1개 이상의 크로마토그래피 단계로 정제하는 최종 단계를 포함한다.
예를 들어, 이종 면역글로불린의 발현을 위해, CHO-K1-Gln(-) 세포를 형질감염시키는 벡터는 진핵 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함하고, 상기 이종 면역글로불린의 경쇄를 코딩하는 핵산 및/또는 상기 이종 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 벡터가 상기 면역글로불린의 경쇄 또는 상기 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 핵산만을 포함하는 경우, CHO 세포는 상기 면역글로불린의 상응하는 다른 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 또 다른 벡터에 의해서도 각 단계에서 형질감염된다.
본 발명은 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중에서 배양된 CHO-K1 세포를 추가로 포함한다. 또한, 이러한 세포로부터 발현된 이종 폴리펩티드도 포함된다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 CHO-K1-Gln(-) 세포를 포함하는 조성물이다.
한 실시양태에서, 상기 이종 폴리펩티드는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린 접합체, 가용성 수용체, 경막 단백질, 세포질 단백질, 가용성 단백질, 세포외 단백질, 융합 단백질, 및 이들의 임의의 단편 및 일부로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 상기 형질감염된 CHO-K1-Gln(-) 세포의 배양은 상기 이종 폴리펩티드를 발현하기에 충분한 시간 동안 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 시간은 14 내지 21일이다.
본 발명의 또 다른 측면은 모 CHO-K1 세포, 한 실시양태에서는 CHO-K1 ATCC CCL-61로부터 유도된 CHO-K1 세포이고, 이때 글루타민을 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중에서의 상기 유도된 세포주의 배가 시간은 혈청-함유 및 글루타민-함유 배지 중에서의 상기 모 세포주의 배가 시간의 120% 이하이다.
하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 절차에 대한 변경을 달성할 수 있음을 이해해야 한다.
[실시예]
재료 및 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적 정보는 문헌(Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에 기재되어 있다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링(Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))에 따라 넘버링된다.
실시예 1
재조합 DNA 기법
문헌(Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 기재된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 DNA를 개조하였다. 분자 생물학적 시약들은 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 화학적 합성법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단일 제한 엔도뉴클레이즈 절단 부위에 의해 플랭킹된, 100 내지 600 bp 길이의 유전자 분절을, PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션으로 조립한 후, A-오버행(overhang) 또는 pPCR-Script Amp SK(+) 클로닝 벡터(스트라타진 코포레이션, 미국 소재)를 통해 pCR2.1-TOPO-TA 클로닝 벡터(인비트로겐 코포레이션, 미국 소재) 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
단백질 측정
단백질 농도는 아미노산 서열을 기초로 하여 계산한 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 측정하였다.
항체 역가 측정
항체 역가는, 항-인간 Fc ELISA를 이용하거나 자가 정제된 항체를 기준 항체로서 사용하는 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다.
대사물질의 분석
글루코스, 락테이트, 글루타민 및 암모늄의 농도는 바이오프로파일(Bioprofile) 100 플러스 어날라이저(Analyzer)(노바 바이오메디칼)를 이용하여 분석하였다.
SDS-PAGE
리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 완충제(4배 농축액(4x)): 4 g 글리세롤, 0.682 g 트라이스-베이스, 0.666 g 트라이스-하이드로클로라이드, 0.8 g LDS, 0.006 g 에틸렌 다이아민 테트라산(EDTA), 물 중의 서바 블루(Serva Blue) G250의 1 중량%(중량/중량) 용액 0.75 ml, 및 총 부피 10 ml가 되게 하기 위한 물 중의 페놀 레드의 1 중량%(중량/중량) 용액 0.75 ml.
분비된 항체를 함유하는 배양 브로쓰를 원심분리하여 세포 및 세포 데브리스를 제거하였다. 정화된 상청액의 분취액을 1/4 부피(부피/부피)의 4x LDS 샘플 완충제 및 1/10 부피(부피/부피)의 0.5 M 1,4-다이티오트레이톨(DTT)과 혼합하였다. 이어서, 샘플을 70℃에서 10분 동안 항온처리하고, 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였다. NuPAGE(등록상표) 프리-캐스트 겔 시스템(인비트로겐 코포레이션)을 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 구체적으로, 10% NuPAGE(등록상표) 노벡스(등록상표) 바이스-트라이스 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 NuPAGE(등록상표) MOPS 런닝 완충제를 사용하였다.
웨스턴 블롯
전달 완충제: 39 mM 글리신, 48 mM 트라이스-하이드로클로라이드, 0.04 중량%(중량/중량) SDS, 및 20 부피%(부피/부피) 메탄올.
SDS-PAGE 후, 분리된 항체 쇄를 문헌(Burnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203)의 "반건조-블롯팅-방법"에 따라 니트로셀룰로스 필터 막(공극 크기: 0.45 ㎛)에 전기영동적으로 전달하였다.
실시예 2
CHO-K1-Gln(-) 세포의 제조
모 세포 CHO-K1 세포를 동결된 저장액으로서 ATCC(ATCC CCL-61)로부터 입수하였다. 이 CHO-K1 세포의 제조는 문헌(Puck, T.T., et al. in J. Exp. Med. 108 (1958) 945-956, and Kao, F.T., and Puck, T.T., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60 (1968) 1275-1281)에 기재되어 있다.
상기 기탁된 CHO-K1 세포가 하이포잔틴-티미딘-보충물(11067-030, 인비트로겐 코포레이션, 미국 소재)을 함유하는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유, 동물 성분-무함유 및 글루타민-무함유 CD CHO 배지(10743-011, 인비트로겐 코포레이션, 미국 소재) 중의 현탁액 배양물 중에서 생장하도록 미리-적응시킴으로써 CHO-K1-Gln(-) 숙주 세포를 상기 기탁된 CHO-K1 세포로부터 유도하였다. 이 배지는 이하에서 CD_CHO_HT 배지로서 명명된다.
부착 생장하는 CHO-K1 세포주 ATCC CCL-61을, 표준 습한 조건(95%, 37℃ 및 5% CO2) 하에 T-조직 배양 플라스크 내에서 2 mM 글루타민 및 10% FCS(깁코; 카달로그 번호: 26400; 미국 소재)로 보충된 DMEM/F12 배지(인비트로겐 코포레이션; 둘베코스 변형 이글 배지와 햄스 F12 배지의 1:1 혼합물) 중에서 증폭시켰다.
무척추동물(새우, PAA 레이보레이토리스; 카달로그 번호: L11-007)로부터 수득된 세포 탈착 용액인 아큐테이즈(Accutase)를 사용한 효소적 처리를 통해 세포를 탈착시키고 진탕(110-130 rpm)하면서 125 ml 삼각 플라스 내의 2 mM 울트라-글루타민(L-알라닐-L-글루타민; 캠브렉스; BE17-605E/U1) 함유 CD_CHO_HT 배지에 시딩하였다. 이 배지는 이하에서 CD_CHO_HT_Gln 배지로서 명명된다. 3 또는 4일마다, 세포를 약 60일 동안 새로운 CD_CHO_HT_Gln 배지 내로 분할하였다(접종 농도: 약 3 x 105 세포/ml). 그 후, 세포를 글루타민-무함유 CD_CHO_HT 배지를 이용하여 약 30일에 걸쳐 계대배양하였다.
수득된 세포는 현탁액 배양물 중에서 생장하도록 적응되어 있고 동물-유래의 성분을 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 합성 배양 배지 중에서 글루타민, 인슐린 및 성장 인자의 부재 하에서 생장하도록 적응되어 있다
도 1에서, CD_CHO_HT_Gln 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응된 후의 세포를 사용하여 수득한 생존 세포 밀도, 및 CD_CHO_HT 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응된 후의 세포를 사용하여 수득한 생존 세포 밀도가 표시되어 있다. 글루타민-무함유 배지(도 1b)에서 더 높은 세포 밀도가 수득될 수 있음을 알 수 있다. 7일째 날, CD_CHO_HT_Gln 배양 배지의 pH 값은 6.7인 반면, CD_CHO_HT 배지의 pH 값은 pH 6.8 내지 pH 7.0이다.
도 2에서, CD_CHO_HT_Gln 배지에의 적응 후의 세포를 사용한 배양으로부터 수득된 세포 배양물 상청액 중의 락테이트 농도, 및 CD_CHO_HT 배지에의 적응 후의 세포를 사용한 배양으로부터 수득된 세포 배양물 상청액 중의 락테이트 농도가 표시되어 있다. 글루타민-무함유 배지(도 2b) 중에서 환원된 락테이트의 제조가 관찰될 수 있음을 알 수 있다.
도 3에서, CD_CHO_HT_Gln 배지에의 적응 후의 세포를 사용한 배양으로부터 수득된 세포 배양물 상청액 중의 암모늄 이온 농도, 및 CD_CHO_HT 배지에의 적응 후의 세포를 사용한 배양으로부터 수득된 세포 배양물 상청액 중의 암모늄 이온 농도가 표시되어 있다. 글루타민-무함유 배지(도 3b) 중에서의 환원된 암모늄 이온의 제조가 관찰될 수 있음을 알 수 있다.
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실시예 3
항-CD4 항체 접합체를 발현하는 발현 벡터
본 발명에 따른 세포주를 사용하여 발현할 수 있는 예시적 (단일클론) 항체는 2 내지 8개의 항융합원성 펩티드에 접합된 인간 CD4 표면 수용체에 대한 항체(항-CD4 항체)이다. 이러한 항체 및 상응하는 핵산 서열은 예를 들어, 국제 특허출원 제PCT/EP2008/005894호에 기재되어 있거나 서열번호 1 내지 12이다.
게놈 인간 카파-경쇄 불변 영역 유전자 분절(C-카파)을 서열번호 11의 항-CD4 항체의 경쇄 가변 영역에 부가한 반면, 인간 감마 1-중쇄 불변 영역 유전자 분절(CH1-힌지-CH2-CH3)을 서열번호 8의 항-CD4 항체의 중쇄 가변 영역에 부가하였다. 발현 플라스미드 6311은 마지막 1개의 C-말단 아미노산에서(즉, 중쇄의 C-말단 라이신 잔기가 제거되어 있음) 펩티드성 글리신-세린 링커(서열번호 14)를 통해 서열번호 13의 항융합원성 펩티드를 코딩하는 핵산과 연결되어 있는 항-CD4 항체 γ1-중쇄, 항-CD4 항체 κ-경쇄, 및 선별 마커 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 핵산을 포함한다. 해석된 플라스미드 맵은 도 4에 도시되어 있다.
a) 중쇄 발현 카세트
항-CD4 항체 접합체 중쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 즉시 초기 인해서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5' UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조로 신호 펩티드를 포함하는 항-CD4 항체 감마 1-중쇄 접합체에 대한 코딩 서열, 및
- SV40 초기 폴리 A 신호 서열.
b) 경쇄 발현 카세트
항-CD4 항체 접합체 경쇄의 전사 유니트는 하기 요소들로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 즉시 초기 인해서 및 프로모터(CMV IE),
- 5'-비번역 영역(5' UTR),
- 인트론-엑손 유전자 구조의 항-CD4 κ-경쇄에 대한 코딩 서열, 및
- SV40 초기 폴리 A 신호 서열.
c) 발현 플라스미드
항-CD4 항체 접합체의 발현 및 제조를 위해, 상기 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트를 단일 발현 벡터(중쇄의 업스트림에 위치하는 경쇄) 상에 배치하였다. 포함되는 선별 마커 유전자, 특히 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 및 하이그로마이신 내성 유전자에서만 서로 다른 3개의 동일한 발현 벡터를 제조하였다.
발현 벡터는 상기 경쇄 발현 카세트 및 중쇄 발현 카세트 이외에 하기 요소들을 함유한다: 이. 콜라이 내에서 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, pUC 18로부터 유래된 복제 기점(pUC 기점), 및 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타메이즈 유전자.
실시예 4
항-CD4 항체 접합체를 발현하는 CHO 세포의 형질감염 및 선별
실시예 2에서 수득된 세포를, 표준 습한 조건(95%, 37℃ 및 5% CO2) 하에 작업 부피가 공칭 부피의 30 내지 50%인 삼각 플라스크(50 또는 125 ml) 내의 CD_CHO_HT 배지 중에서 진탕하면서(110-130 rpm) 증식하였다. 3 또는 4일마다, 세포를 새로운 배지 내로 분할하였다(접종 농도: 약 3 x 105 세포/ml). 기하급수적 생장기에서 세포를 원심분리하여 수거하고 멸균한 포스페이트 완충 생리식염수(PBS)로 1회 세척하고 멸균한 PBS에 재현탁하였다.
형질감염 전, 제한효소 엔도뉴클레이즈인 PvuI을 사용하여 플라스미드 6311을 β-락타메이즈 유전자(이. 콜라이 앰피실린 내성 유전자) 내에서 절단하였다. 절단된 DNA를 에탄올로 침전시키고, 진공 하에 건조하고 멸균한 PBS에 약 1 ㎍ DNA/㎕의 농도로 용해시켰다. 형질감염 후, CHO 숙주 세포를 실온에서 총 부피 200 내지 300 ㎕ PBS 중의 약 0.9 x 107개 세포 당 20 내지 50 ㎍의 선형화된 플라스미드 DNA로 전기천공하였다. 전기천공은 15 ms 당 단회 160 V 펄스를 이용하는 정사각형 파 프로토콜을 이용하여 2 mm 갭 큐벳 내의 진 펄서 엑스셀(Gene Pulser XCell) 전기천공 장치(바이오-라드 레이보레이토리스)로 수행하였다. 형질감염 후, 세포를 CD_CHO_HT 배지에 플레이팅하였다(96-웰 배양 플레이트의 웰 당 100 ㎕ 배지 당 104개 세포). 24시간 후, 2배 농도의 제네티신(G418: 1400 ㎍/ml)으로 보충된 CD_CHO_HT 100 ㎕를, 원래의 배지 및 플레이트의 교체 없이 각각의 웰에 첨가하였다. 7일마다 CD_CHO_HT_G418 선별 마커를 교체하였다. 2 내지 3주 동안의 항온처리 후, 항체 농도를 배양 상청액 중의 인간 IgG1에 특이적인 ELISA 분석으로 분석하였다.
SEQUENCE LISTING <110> F. 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Claims (11)

  1. a) ATCC CCL-61로서 기탁된 CHO-K1 세포로부터 유도되고, b) 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하고, c) 생장을 위해 배양 배지 중의 글루타민, 인슐린 및 성장 인자를 필요로 하지 않으며, ATCC CCL-61로서 기탁된 CHO-K1 세포와 비교할 때 핵산의 도입, 결실 또는 불활성화에 의해 유전적으로 변경되지 않음을 특징으로 하는 CHO-K1-Gln(-) 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    생장을 위해 동물-유래의 화합물을 필요로 하지 않음을 특징으로 하는 CHO-K1-Gln(-) 세포.
  3. CHO-K1-Gln(-) 세포의 제조 방법으로서,
    a) ATCC CCL-61로서 기탁된 CHO-K1 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 CHO-K1 세포를, 글루타민으로 보충되고 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 적응된 상기 CHO-K1 세포를, 글루타민, 인슐린 및 성장 인자를 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중의 현탁액 중에서 생장하도록 적응시켜 상기 CHO-K1 세포를 수득하는 단계
    를 기재된 순서대로 포함하고, 상기 CHO-K1-Gln(-) 세포가 분자 생물학적 방법을 통한 핵산의 도입, 결실 또는 불활성화에 의해 유전적으로 변경되지 않음
    을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제3항에 따른 방법에 의해 수득된 CHO-K1-Gln(-) 세포.
  5. 이종 폴리펩티드의 재조합 제조 방법으로서,
    a) 제1항 또는 제2항에 따른 CHO-K1-Gln(-) 세포를 제공하는 단계;
    b) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 제공하는 단계;
    c) 단계 a)의 CHO-K1-Gln(-) 세포를 상기 1개 이상의 핵산으로 형질감염시키는 단계;
    d) 단계 c)의 상기 형질감염된 CHO-K1-Gln(-) 세포를, 글루타민을 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중에서 배양하는 단계; 및
    e) 상기 CHO-K1-Gln(-) 세포의 배양 배지 또는 CHO-K1-Gln(-) 세포로부터 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는 재조합 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    이종 폴리펩티드가 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린 접합체 또는 비-면역글로불린 치료 활성 폴리펩티드임을 특징으로 하는 재조합 제조 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    배양 배지 중의 암모늄 농도가 배양 과정 동안 0.12 mmol/ℓ 미만임을 특징으로 하는 재조합 제조 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 c) 및 d)가 동일한 배지 중에서 수행됨을 특징으로 하는 재조합 제조 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 c) 및 d)가 하이포잔틴 및 티미딘으로 보충되거나 보충되지 않은 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 합성 배지 중에서 수행되되, 상기 배지가 단리된 화합물로서 또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 일부로서 글루타민을 함유하지 않고 인슐린 및 성장 인자도 함유하지 않음을 특징으로 하는 재조합 제조 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양이 유가(fed-batch) 배양으로서 수행되되, 상기 배양에서 사용되는 공급원료가 단리된 화합물로서 또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 일부로서 글루타민을 함유하지 않고 인슐린, 성장 인자 및 폴리펩티드도 함유하지 않음을 특징으로 하는 재조합 제조 방법.
  11. 모 CHO-K1 세포로부터 유도된 CHO-K1-Gln(-) 세포로서,
    글루타민을 함유하지 않는 화학적으로 정의된 폴리펩티드-무함유 배지 중에서의 상기 CHO-K1-Gln(-) 세포의 배가 시간(doubling time)이 혈청 및 글루타민을 함유하는 배지 중에서의 상기 모 CHO-K1 세포의 배가 시간의 120% 이하인,
    CHO-K1-Gln(-) 세포.
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