DD287531A5 - Verfahren zur herstellung von humanem wachstumshormon (sth) in tierischen zellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanem Wachstumshormon (STH) in tierischen Zellen. Es werden effektiv synthetisierende und sezernierende Zellinien hergestellt, die in der biotechnologischen Produktion menschlichen Wachstumshormones eingesetzt werden koennen. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dasz zur Herstellung von humanem Wachstumshormon die von Maus-Zellen durch wiederholte Transfektion eines STH-Expressionsvektors pMT1GH (Abb. 1) mit einem Selektionsmarkergen im Kotransfer abgeleiteten Zellinien 211B3 und 213, hinterlegt in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter den Nr. ZIM-0320 und ZIM-0321, eingesetzt werden. Die erfindungsgemaeszen, optimal produzierenden Zellinien besitzen eine Sekretionsleistung, die bei mindestens 18 mg/106 Zellen/24 Stunden liegt.{Humanes Wachstumshormon; Selektionsmarkergen; Maus-Zellen; Kotransfer; Zellinie; Hinterlegung; wiederholte Transfektion; Sekretionsleistung; Expressionsvektor}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von humanem Wachstumshormon mit tierischen Zellinien, die menschliches Wachstumshormon effektiv synthetisieren und sezernieren.

Anwendungsgebiet ist die b'otechnologische Produktion menschlichen Wachstumshormones für therapeutische und diagnostische Zwecke in der Medizin.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Genetisch veränderte tierische Zellinien finden als Wirkstoffproduzenten In der pharmazeutischen Industrie ein neues Anwendungsgebiet. Das Gen für das menschliche Wachstumshormon wurde lokalisiert und Moniert. Das Gen wird an effektive Promotoren gekoppelt, in tierische Zellen mit Methoden des Gentransfers eingebracht. Die Zellen lassen sich durch im Kotransfer aufgenommene Selektionsmarkergene Monieren. Im Folgenden werden Zeilklone auf Expression des STH getestet. Die Etablierung einer Produktionszellinie erfordert umfangreiche Untersuchungen an einer Vielzahl von Einzelkolonien. Die Expressionshärte ist abhängig vom Ort der Integration des transferierten Genes, dem Einfluß der in chromosomalor Nachbarschaft mehr oder weniger effektiv transkribierten zellulären Gene. Sie wird weiterhin wesentlich von der Kopiozahl des Fremdgenes in einem definierten Zeilklon beeinflußt.

Da die Integration nach dem Zufallsprinzip erfolgt, ist der Einfluß zellulärer Regulationsprinzipien nur durch umfangreiche Testungen zu umgehen.

Die Kopiezahl wird erfahrungsgemäß durch Kopplung des STH-Genes (oder anderer) an ein zweites amplifikationsfähiges Gen, oder die Nutzung repükationsfähiger viraler Vektoren, meist des Rioderpapillomviruses, erreicht (Kaufmann & Sharp [1982] J. Mol. Biol. 159,601; Sarver et. al. [1981] Mol. Cell. Bio). 1,486). Auf diese.* Basis sind bisher STH-bildende Zellinien mit einer Sekretionsleistung von 2-10pg/10^e Zeile/Tag beschrieben (Paek & Axel ,'1987] Mol. Cell. Biol. 7,1496). In der Patentschrift WO 84/02534 wird STH-Gewinnung mit einem Rinderpapillomvirus-Vektor und dem Metailothionein-Promoter beschrieben.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Erstellung tierischer Zellinien, die optimale Expressionsparameter aufweisen und menschliches Wachstumshormon (STH) effektiv in das Zellkulturmedium sezernieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, tierische Zellinien mit genügend hoher Kopiezahl des Wachstumshormongens zur Verfügung zu stellen. Erfindungsgemäß wird ein STH-Expressionsvektor mit einem Selektionsmarkergen im Kotransfer in Maus-Zellen transfiziert, eine STH-produzierende Zellinie isoliert, diese ZeIIo zur Erhöhung der Genkopiezahl im Kotransfer von STH-Expressionsvektor und einem, vom ersten verschiedenen Selektionsmarkergen erneut transfiziert und im Ergebnis, vorzugsweise mit immunologischen Methoden, eine Zellinie isoliert, die gegenüber der vorhergehenden durch eine verbesserte Expressionsleistung charakterisiert ist. Dieser Zyklus Gentransfer-Selektion-Testung-Etablierung einer Zellinie kann mehrmals wiederholt werden und wird jeweils mit einem Selektionsmarkergen durchgeführt, das von den vorhergehenden

Selektionsmarkergenen verschieden ist. Als Selektionsmarkergene können eingesetzt werden: das Hygromycinresistenzgen in

der Rekombinente pY3 (Blochlinger & Diggelmann [19841 Mol. Cell. Biol.4,2929), das Neomycinresistenzgen in der

Rekombinante pSV2neo (Southern & Berg [1982] J. Mol. Appl. Genet. 1,327), das Guaninphosphoribosyltransferasegen in

pSV2gpt(Mulligan&Berg[1981)PNAS USA 78,2076), das Thymidinkinasegen von HSV in pSK1 (Strauss etal. [1985] Mol. Gen.

Genet. 191,154) und andere. Erfindungsgemäß wird das menschliche Wachstumshormongen (Seeburg [1982] DNA 1.239) an einen heterologen Promoter

gekoppelt, bevorzugt dan Maus-Metallothioneinpromoter (Brinster et al. [1982] Nature 296,39) und die Expressionseinheit mit

Methoden des Gentransfers vorzugsweise der Ca-Phosphat-kopräzipitationstechnik (Graham & van der Eb [1973] Viro1.52,456),

im Kotransfer mit dem Neomycinresistenzgen in tierische Zellen der Linie NIH3T3 oder LTA transfiziert, diese Zellen selektiertund unter den resistenten Kolonien mit Hilfe eines STH-RIA oder -ELISA Wachstumshormon - produzierende Kloneherausgefunden, isoliert und in Zellinien erweitert.

Erfindungswesentlich ist, daß die aus dem immunologischen Test hervorgehende Zellinie, die von allen untersuchten Klonen die

besten Expressionsparameter aufweist, Ausgangspunkt für einen wiederholten Gentransfer ist, im Ergebnis dessen die

Genkopiezahl pro Zelle weiter erhöht wird. Der STH-Expresslonsvektor wird im Kotransfer mit einem zweiten Selektionsmarker,

vorzugsweise» dem Maus-Metallothionein-Gen(pMT-l) (Glanville [1981 ] Nature 292,267) transfiziert, die Zellpopulation selektiertund mit immunologischen Methoden erneut der beste Produzent ermittelt, isoliert und als neue Zellinie etabliert. Dtaresultierende Zellinie unterscheidet sich von der vorhergehenden durch eine zusätzliche Zahl exprimierter STH-Genkopien.

Zur Herstellung des eingesetzten STH-Expressionsvektors sind folgende wesentliche Verfahrensschritte notwendig: Das menschliche Wachstumshormongen wird nach bekannten Methoden isoliert und in den Vektor pUC19 subkloniert. Aus der Rekombinante pUCGH 1 wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI das menschliche STH-Gen präpariert. Das Fragment wird in das durch Bglll/Pvull-Spaltung vorbereitete Plasmid pMKdeltaPvu (Brinster et al. [1982] Nature 296,39), das

den Metallothioneinpromoter der Maus (MT) trägt, Moniert. Im Ergebnis der Ligation und Transformation erhält man den

STH-Expressionsvektor pMT1 GH (Abb. 1). Der STH-Expressionsvektor wird gemeinsam mit dom Neomycinresistenzgen in Form des pSV2 neo, gemischt im Verhältnis

1:10 (pSV2neo/pMT1 GH) in Maus-NIH3T3-Zellen transfiziert und diese Zellen mit Geneticin selektiert. Unter den Geneticinresistenten Kolonien wird mit Hilfe eines kommerziellen STH-RIA der Klon U10 N3 mit 8pg STH/10* Zellen/24 Stunden als derbeste Wachstumshormonproduzent ermittelt. Erfindungsgemäß wird diese Zellinie erneut-wie oben beschrieben-transfiziert,als Selektionsplasmid wird das Maus-Metallothionein-Gen pMT-l im Verhältnis 1:10 zugegeben. Die Zellpopulation wirddaraufhin mit CdSO₄ auf Schwermetallresistenz sol· iVtiert und aus der entstehenden Population schwermetallresistenter

Zollklone erneut der beste Produzent ermittelt. Dies ,st der Klon 211B3. Er wird isoliert und als neue Zellinie etabliert. Die

erfindungsgemäße Zellinie 211B 3 unterscheidet skh von der vorhergehenden Zellinie U10 N 3 durch eine zusätzliche Zahlexprimierter STH-Genkopien. Die Genkopiezahl ist von 3-5 nach der ersten Transfektion (U 10N3) auf 7-10 nach der zweiten

Transfektion (211B3) erhöht worden. Die erfindungsgemäße Zellinie 211B3 weist eine Wachstumshormonsynthese- und

•Sekretionsleistung von ^βμg STH/10'Zellen/24 Stunden auf. Sie wurde in derZIM-Hinterlegungsstelle unter der Nr.ZIM-03020hinterlegt.

Durch erneute Transfektion der gewonnenen Zellinie 211B3 mit einem der o.g. Selektionsmarkergene, außer dem Neomycinresistenzgen und dem Gen pMT-l wird die Zellinie 213, hinterlegt in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter der Nr. ZIM-0321

gewonnen, die gegenüber der Zellinio 211B3 wiederum eine verbesserte Sekretionsleistung besitzt.

Die hergestellten Zellinien liegen mit ihrer Sekretionsleistung über den bisher in der Literatur beschriebenen. Der Vorteil der Erfindung besteht in der durch wiederholte Transfektion relativ gezielten Genkopiezahlerhöhung bei bereits als

gut befundenen Produzenten. Damit sind bessere Voraussetzungen für die Gewinnung einer Hochleistungszellinie gegeben alsbei der Genamplifikation in der Zellpopulation. Mit Standardverfahren gewonnene Wachstumshormonproduzenten könnendurch das erfindungsgemäße Verfahren nachträglich auf eine höhere Produktionsleistung gebracht werden.

Ausführungsbeispiel

1. Das menschliche Wachstumshurmongen wird-wie beschrieben - (Kiessling et al. [1987] WP C 12 N/299,3376) isoliert und in den Vektor pUC 19 subkloniert. Aus der Rekombinante pUCGH 1 wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI, nachfolgender Elektrophorese in 1 % Agarosegel und Elektroelution, das menschliche STH-Gen präpariert. Das Fragment wird in das durch Bglll/Pvull-Spaltung vorbereiteten Plssmid pMKdelta Pvu (Brinster et al. [1982] Nature 296,39), das den Metallothioneinpromoter der Maus (Ml) trägt, Moniert.

Im Ergebnis der Ligation und Transformation von kompetenten Escherichia coli DH1 unter Nutzung von Standardprotokollen (Maniatis et al. [1982] DNA Cloning. A Laboratory Mamial CSH Laboratory, N. Y.; Hanahan [1983] J. Mol. Bio). 166,557) erhält man die Rekombinante pMT 1 GH (Abb. 1).

2. Das STH-Expressionsplasmid wird gemeinsam mit dem Selektionsmarkergen in Form des pSV2 neo (Southern & Berg [1982] J. Mol. Appl. Genet. 1,327), gemischt im Verhältnis 1:10 (pSV2 neo/pMT 1 GH), als Ca-Phosphat/DNA-Kopräzipitat (Graham & van der Eb [1973] Virol. 52,456) in 2 x 10⁵ Maus-NIH3T3 Zellen transfiziert. Die Zellen worden 10-14 Tage mit 400pg/ml Geneticin sele',.:iert und die resultierenden Zeilklone subkloniert und auf Expression des menschlichen Wachstumshormones untersucht. _,

Im Ergebnis der immunologischen Untersuchung derZellkulturüberstände eines Experiments mit Hilfe eines kommerziellen STH-RIA erwies sich aus ca. 150 Bestimmungen der Klon U 1ON 3 mit 8\ig STH/10*Zellen/24 Stunden als der beste Wachstumshormproduzent.

3. Die Zellinie U10N3 wird-wie in Punkt 2 beschriebon-transfiziert, nur, daßzu12pg DNA pro ml PräzipitatpMT-l (Glanville et al. [1981] Nature 292,267) a,s Selektionsplasmid im Verhältnis 1:10zugegeben wurde. Nach 2 Wochen im Medium mit 20μΜ Cd/SO₄ entstehen erneut Kolonien, die subkloniert auf STH-Expression untersucht werden.

In einem typischen Experiment wird der Klon 211B3 isoliert der mit 18μρ STH/10* Zellen/24 Stunden den Spitzenwert der Wachstumshormonsynthese und -Sekretion aufweist.

4. Die Proteinwerte werden durch RNA-Werte bestätigt, die durch Filterhybridisierung, in an sich bekannter Weise (Chromcynski ÄSacchi I1987J Anal. Biochem. 162,156), gewonnen werden.

Tabelle 1 Zellklon STH-RNA/10° Zellen RNA-Moleküle/Zelle U10N3 ca.10ng 15,OxIO³

211B3 ca.25ng 37.5X10³

Die Differenzen zwischen den beschriebenen Klonen auf dem RNA-Niveau widerspiegeln die erhöhte Expression, verursacht durch zusätzliche Genkopien im Ergebnis der zweiten Transfektion. Die Genkopiezahl ist in diesem Fall von 3-5 nach der Neomycinsolektion auf 7-10 nach der Schwermetallselektion erhöht worden. Die Testung der biologischen Aktivität erfolgt mittels Tibia-Test in an sich bekannter Weise. Die biologische Aktivität korreliert mit dem erhöhten Syntheseniveau.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von humanem Wachstumshormon (STH) in tierischen Zellen, gekennzelchnst dadurch, daß von Mi JS-Zellen durch wiederholte Transfektion eines STH-Expressionsvektors mit einem Selektionsmarkergen im Kotransfer abgeleitete Zellinien eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die von Maus-NIH 3T3-Zellen durch zweifache Transfektion des STH-Expressionsvektors pMT1 GH (Abb. 1), in dem das menschliche Wachstumshormongen an den Metallothioneinpromotor der Maus (MT) gekoppelt ist, abgeleitete Zellinie 211B3, hinterlegt in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter der Nr. ZIM-0320, eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die von Maus-NIH 3T3-Zellen durch dreifache Transfektion des STH-Expressionsvektors pMT1 Gh (Abb. 1), in dem das menschliche Wachstümshormongen an den Metallothioneinpromotor der Maus (MT) gekoppelt ist, abgeleitete Zellinie 213, hinterlegt in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter der Nr.ZIM-0321, eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß die wiederholte Transfektion jeweils mit einem Selektionsmarkergen durchgeführt wird, das von den vorhergehenden Selektionsmarkergenen verschieden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2,3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß als erstes Selektionsmarkergen das Neomycinresistenzgen und als zweites Selektionsmarkergen das Maus-Metallothionein-Gen eingesetzt wird.