DE69329031T2

DE69329031T2 - Das dorsalgewebe beeinflussender faktor

Info

Publication number: DE69329031T2
Application number: DE69329031T
Authority: DE
Inventors: M. Harland; C. Smith
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 1993-09-02
Publication date: 2001-03-22
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: EP0662146A1; EP0662146A4; DK0662146T3; GR3034554T3; ATE194658T1; ES2149823T3; DE69329031D1; EP0662146B1; AU5125693A; US5670481A; PT662146E; ZA936478B; WO1994005800A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Wachstumsfaktoren und neurotrophe Faktoren, insbesondere einen löslichen Wachstumsfaktor mit Dorsalwachstum induzierender Aktivität, den Faktor enthaltende Komplexe und DNA- oder RNA-Kodiersequenzen für den Faktor.
Die Erfindung erfolgte mithilfe von staatlichen Zuschüssen seitens des National Institute of Health im Rahmen der Auftragsvergabe Nr. R01-GM-42341. Die Regierung hält bestimmte Rechte an der Erfindung.

Hintergrund der Erfindung.

Wachstumsfaktoren sind Substanzen wie z. B. Polypeptidhormone, die das Wachstum definierter Populationen von Tierzellen in vivo oder in vitro beeinflussen, aber keine Nährstoffsubstanzen sind. Proteine, die am Wachstum und der Differenzierung von Geweben beteiligt sind, können Wachstum und Differenzierung fördern oder hemmen - der allgemeine Ausdruck "Wachstumsfaktor" umfasst somit Zytokine und trophische Faktoren. Unter den derzeit bekannten Wachstums- oder neurotrophen Faktoren finden sich jene, die in die Insulinfamilie eingereiht werden können [Insulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren wie etwa IGF-I und IGF-II, Mamma-stimulierender Faktor (MSF) und Nervenwachstumsfaktor (NGF)]; jene, die in die Epidermiswachstumsfaktor-Familie eingereiht werden können [Epidermis-Wachstumsfaktor (EG F) und transformierende Wachstumsfaktoren (TGFα, TGFß, TGFγ)]; jene, die in die Leukozyten-Wachstumsfaktorfamilie eingereiht werden können [Leukozyten-Wachstumsfaktor (PDGF), Osteosarkom-Wachstumsfaktor (ODGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FG F)]; Neurotrophine [Nervenwachstumsfaktor (NGF), aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktoren (BDNF), Neurotrophine 3, 4, 5 (NT-3, NT-4, NT-5)]; und andere (Kolonie stimulierender Faktor (CSF), T-Zellen-Wachstumsfaktor, Tumorangiogenese-Faktor (TAF), DNA-Synthe se fördernder Faktor (DSF), Tumorwachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FDG F)].
Rezeptoren, die das Wachstum beeinflussen (d. h. Rezeptoren für wachstumsassoziierte Liganden) sind Proteine, die mit Zelloberflächen assoziiert sind, die ihre Wachstumsfaktoren spezifisch als Liganden binden. Wachstumsfaktor-Rezeptoren kommen in verschiedenen klinischen und diagnostischen Anwendungen zum Einsatz.
Die US-A-4.857.637 vom 15. August 1989 (Erfinder: Hammonds et al.) beschreibt ein- Verfahren zur Immunisierung eines Tiers gegen seinen Wachstumshormon-Rezeptor mittels Impfung mit Antikörpern, um das Wachstum der Tiere zu stimulieren.
Die US-A-4.933.294 vom 12. Juni 1990 (Erfinder: Waterfield et al.) beschreibt Studien über strukturelle Veränderungen des Human-EGF-Rezeptors und seines Gens sowie der Tumorgenese-Beziehung für Tests und Therapien unter Einsatz des Human-EGF-Rezeptors. Beispielsweise können solche Tests die Detektion von strukturell verändertem oder abnormal exprimiertem Wachstumsfaktor-Rezeptor und der mRNA-Transkripte sowie der dafür kodierenden Gene umfassen. EGF kann eine Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung spielen, da er die frühe Augenlidöffnung und die Entwicklung der Schneidezähne neugeborener Mäuse induziert.
Die US-A-5.030.576 vom 9. Juli 1991 (Erfinder: Dull et al.) erörtert die Rolle von Rezeptoren, z. B. Wachstumsfaktor-Rezeptoren, bei der Entwicklung von Arzneimitteln durch die pharmazeutische Industrie und offenbart die Verwendung eines Rezeptorhybrids zum Screenen von Arzneimitteln, z. B. in Studien betreffend EGF-Bindungsdomänen.
Die US-A-5.087.616 vom 11. Februar 1992 (Erfinder: Myers und Bichon) beschreibt ein Verfahren zur Zerstörung von Tumorzellen mit einer ein Arzneimittelkonjugat enthaltenden Zusammensetzung. Das Konjugat besitzt einen Wachstumsfaktor als eine Gruppe und einen Polymerträger mit einer zytotoxischen Verbindung als andere Gruppe. Es werden in diesem Patent Zusammensetzungen beschrieben, die sich bevorzugt an Tumorzellen binden, die EGF-Bindungsrezeptoren tragen (z. B. bei Verwendung eines EGF- Wachstumsfaktors als erste Gruppe).
Die US-A-5.098.833 vom 24. März 1992 (Erfinder: Lasky et al.) offenbart ein DNA-Isolat, das an die Epidermiswachstumsfaktor-Domäne hybridisieren kann. Expressionssysteme für die Rekombinations-Produktion werden als nützliche therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen beschrieben.
Einen guten Überblick über einen mit NGF in Zusammenhang stehenden neurotrophen Faktor gibt die WO92/05254 vom 2. April 1992, welche Veröffentlichung auch folgende Methoden des Stands der Technik beschreibt: Herstellen von Aminosäuresequenz- Variationen, stellengerichtete Mutagenese-Techniken, Ligieren kodierender DNA in einen replizierbaren Vektor zwecks weiterer Klonierung oder Expression, die Auswahl von Promotoren für Expressionsvektoren, geeignete Wirtszellen für die Expression, insbesondere Säugetierzellen, Proteinreinigung nach Gewinnung aus Kulturmedium als sekretiertes Protein, Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln zur Vernetzung von Protein mit einer Trägermatrix zur Verwendung mit Antikörpern, Einschluss in Systemen für die Arzneimittelzufuhr, Herstellung therapeutischer Formulierungen und Verabreichungsverfahren. Außerdem wird die Produktion polyklonaler und monoklonaler Antikörper erörtert, die sich für diagnostische Tests eignen. Diese Aspekte der Isolierung, Produktion und Anwendung eines neuartigen neurotrophen Faktors, wie sie in WO92/05254 beschrieben sind, sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Somit sind Wachstumsfaktoren, ihre Rezeptoren sowie DNA- oder RNA-Kodiersequenzen und Fragmente davon für einige therapeutische, klinischer forschungsbezogene, diagnostische und Arzneimittelentwicklungs-Anwendungen geeignet.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt der Erfindung ist ein Peptid, das in im Wesentlichen gereinigter Form vorliegt, durch eine oder mehrere der folgenden stark konservierten Aminosäuresequenzen gekennzeichnet:
QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID Nr. 3);
RFWPRYVKVGSC (SEQ ID Nr. 4);
SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID Nr. 5);
LRWRCQRR (SEQ ID Nr. 6); und,
ISECKCSC (SEQ ID Nr. 7).
Peptide der Erfindung induzieren Dorsalwachstum in Wirbeltieren und können in löslicher, physiologisch aktiver Form für einige therapeutische, klinische und diagnostische Anwendungen gebildet werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Oligonukleotid, z. B. cDNA, bereitgestellt, das starke Ähnlichkeit mit SEQ.-ID Nr. 1 oder SEQ.-ID Nr. 2 aufweist oder identisch damit ist. Dieses Oligonukleotid kann einzel- oder doppelstrangig sein, aus DNA- oder RNA-Basen bestehen und in Bezug auf SEQ.-ID Nr. 1 und 2 in Antisense-Richtung vorliegen. SEQ.-ID Nr. 1 und 2 kodieren jeweils für ein funktionelles Polypeptid, das die Anmelder als "Noggin" bezeichneten und bei Expression die Dorsalentwicklung von Wirbeltieren induzieren kann.
Noggin oder Fragmente davon (können auch durch in vitro-Verfahren synthetisiert werden) können mittels Rekombinations-Expression oder kovalente in vitro-Techniken mit einem immunogenen Polypeptid fusioniert werden, das seinerseits dazu dienen kann, ein Tier zu immunisieren, um Antikörper gegen ein Noggin-Epitop zu bilden. Anti-Noggin kann aus dem Serum immunisierter Tiere gewonnen werden. Alternativ dazu können monoklonale Antikörper in konventioneller Weise aus Zellen des immunisierten Tieres gewonnen werden. Durch routinemäßiges Screening identifizierte Antikörper binden sich an Noggin, gehen aber'~niit "wnt" oder anderen Wachstumsfaktoren im Wesentlichen keine Kreuzreaktionen ein. Immobilisierte Anti-Noggin-Antikörper kommen besonders für die Diagnose (in vitro oder in vivo) oder die Reinigung von Noggin in Frage.
Substitutions-, Deletions- oder Insertionsmutanten von Noggin können durch in vitro- oder Rekombinationsmethoden hergestellt und auf Immuno-Kreuzreaktivität mit Noggin und auf Noggin-Antagonisten- oder -Agonisten-Aktivität gescreent werden.
Noggin kann auch in vitro derivatisiert werden, um immobilisiertes Noggin und markiertes Noggin zu produzieren, insbesondere zwecks Diagnose von Noggin oder seiner Antikörper oder zur Affinitätsreinigung von Noggin-Antikörpern.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Die Anmelder entdeckten einen strukturell einzigartigen Wachstumsfaktor, der in im Wesentlichen reiner löslicher Form allgemein zur Verfügung steht. Das erfindungsgemäße Polypeptid wurde als "Noggin" bezeichnet. Dieser neu isolierte neurotrophe Faktor induziert bei Wirbeltieren Dorsalentwicklung.
Eine früher beschriebene Familie von Proteinen, die auch Dorsalentwicklung induziert, sind die "wnt"-Proteine. Diese bleiben jedoch im Gegensatz zu Noggin hartnäckig an Zelloberflächen gebunden. Die ersten Arbeiten der Anmelder mit Noggin betrafen Xenopus-Embryos; Noggin ist jedoch bei Wirbeltieren stark konserviert, was die Arbeiten der Anmelder mit Mäuse-Noggin bewiesen. Die gemäß dem Stand der Technik bekannte FGF-Wachstumsfaktorfamilie ist bekanntermaßen an der frühen embryonalen Induktion beteiligt, doch sowohl die FGF-Proteine als auch ihre Rezeptoren unterscheiden sich deutlich von Noggin. Noggin modifiziert die Wirkung von FGF (und auch Activin), z. B. durch Potenzieren des Wachstums, und ist deswegen besonders für therapeutische Zusammensetzungen geeignet, die in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren (als therapeutische Adjuvantien) eingesetzt werden, z. B. zur Modifizierung oder Potenzierung ihrer Wirkung.
Die Anmelder klonierten cDNA für Noggin. Die Noggin-cDNA enthält einen einzigen Leserahmen, der für ein 26 kDa-Protein mit hydrophober aminoterminaler Sequenz kodiert. Noggin wird sekretiert. Noggin-cDNA kodiert für das Protein als 26 kDa-Protein, doch man stellte fest, dass Noggin in vivo sekretiert wird, offenbar als dimeres Glykoprotein mit einem scheinbaren anfänglichen Molekulargewicht von etwa 33 kDa (als Untereinheit der Wildform). Im nicht glykosylierten Zustand besitzt die monomere Einheit ein scheinbares Molekulargewicht auf SDS PAGE von etwa 25-30 kDa.
Es konnte biologisch aktives Noggin in drei unterschiedlichen Systemen exprimiert werden. Zwei Expressionssysteme, die erfolgreich zur Expression von biologisch aktivem Noggin vewendet wurden, sind Säugetierzelllinien (COS und Mäuse-293). Ein drittes Expressionssystem ist die Injektion synthetischer mRNA in Xenopus-Oozyten.
Die Expression in diesen unterschiedlichen Systemen zeigt auch den hohen Konservierungsgrad von Noggin. Die Anmelder stellten z. B. substanzielle Sequenzähnlichkeit zwischen Frosch-Noggin und Mäuse-Noggin mit einigen vollständig konservierten Abschnitten fest. Die folgenden Aminosäuresequenzen stellen somit zwischen Frosch-Noggin und Mäuse-Noggin vollkommen konservierte Abschnitte dar:
QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID Nr. 3);
RFWPRYVKVGSC (SEQ ID Nr. 4);
SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID Nr. 5);
LRWRCQRR (SEQ ID Nr. 6); und,
ISECKCSC (SEQ ID Nr. 7).
Es besteht etwa 87% Gesamtkonservierung zwischen den Mäuse- und Froschsequenzen, und es konnte auch eine spezifische Cystein-Verteilung zwischen den beiden beobachtet werden. Es ist zu erwarten, dass Human-Noggin starke Ähnlichkeit mit Mäuse- und Frosch-Noggin aufweist.
Noggin-Nukleinsäuren oder -Oligonukleotide kodieren für ein Noggin-Polypeptid oder hybridisieren an eine derartige DNA, bleiben unter rauen Bedingungen stabil an sie gebunden und besitzen eine Länge von mehr als etwa 10 Basen, mit der Maßgabe jedoch, dass eine solche hybridisierende Nukleinsäure gegenüber Nukleinsäuren des Stands der Technik neuartig und nicht naheliegend ist, einschließlich socher, die für andere Wachstumsfaktoren kodiert oder zu dafür kodierender Nukleinsäure komplementär ist.
Unter "rauen Bedingungen" ist hierin Folgendes zu verstehen: (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur bei der Waschung, z. B. 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat/0,1 NaDodSO&sub4; bei 50ºC, oder (2) die Verwendung eines Denaturierungsmittels wie z. B. Formamid während der Hybridisierung, z. B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/ 0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42ºC.
Unter "substanzieller Ähnlichkeit" in Bezug auf eine Nukleotidsequenz ist die Kreuzhybridisierung von Sequenzen unter mäßig rauen Bedingungen und Einsatz einer Sonde mit einer Länge von mehr als 100 Nukleotiden bei 30ºC in einem Standardpuffer (Wahl et al., PNAS 76, 3683) und Waschlösungen bei 37ºC in 300 mM NaCl, 30 mM Natriumcitrat, 0,2% SDS bei pH 7 zu verstehen. Alternativ dazu kann mittels Polymerase-Kettenreaktion ein für Noggin oder Noggin-Familienmitglieder kodierendes DNA- Fragment isoliert werden, wenn Primer mit degenerierter Sequenz verwendet werden, die für die SEQ.-ID Nr. 3-7 kodieren.
Unter "substanzieller Ähnlichkeit" in Bezug auf Proteine ist zu verstehen, dass Noggin aus unterschiedlichen Spezies oder Noggin-Familienmitglieder innerhalb einer Spezies die Positionen von Cysteinresten an zumindest 80% der Positionen im gesamten Protein beibehält/beibehälfen: Wie die Neurotrophin-Familie ist die Sequenz der reifen Form von Noggin und mit Noggin assoziierter Polypeptide an zumindest 40% der Positionen identisch. Substanzielle Ähnlichkeit auf Proteinebene umfasst die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Proteins, mit Noggin um die Bindung an Rezeptoren und einige (wenn auch nicht alle) monoklonale Antikörper gegen Noggin-Epitope zu konkurrieren.
Die klonierte cDNA für Noggin (von Fröschen stammend) wird hierin als SEQ.-ID Nr. 1 bezeichnet, jene von Mäusen als SEQ.-ID Nr. 2. Die Anmelder verwendeten RNA- Transkripte aus dem SEQ.-ID Nr. 1-Klon, um Embryonen zu bewahren und sie wieder in einen Zustand von im Wesentlichen normaler Entwicklung zu versetzen, wenn die Noggin-RNA in ventralisierte Embryonen injiziert wird. In hohen Dosen führt dies zu exzessiver Kopfentwicklung, weshalb die Anmelder das Protein "Noggin" nannten. Bei der Northern Blot-Analyse hybridisiert die Noggin-cDNA an zwei mRNAS, die sowohl maternal als auch zygotisch exprimiert werden.
Bei Verwendung von Nukleotidsequenzen, die für einen Teil oder die Gesamtheit des Noggins der Erfindung kodieren, sollte die Sequenzlänge zumindest ausreichen, um Hybridisierung mit endogener mRNA für das eigene Noggin des Wirbeltiers durchführen zu können. Typischerweise umfasst eine ausreichende Sequenzgröße (beispielsweise zur Verwendung als diagnostische Sonden) etwa 15 aufeinanderfolgende Basen (DNA oder RNA). In einigen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen ist es gegebenenfalls wünschenswert, Noggin-Nukleotid-Kodiersequenzen (analog zur Gesamtheit oder einem Teil von SEQ.-ID Nr. 1 oder SEQ IDNR. 2) in Antisense-Richtung in Bezug auf SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 zu verwenden.
Die Anmelder schlagen einige bevorzute Primer zur Amplifizierung von Noggin aus anderen Spezies (z. B. Menschen) vor:

5' Primer 1

C A A/G A C N T T C/T T G C/T C C N G T N

5' Primer 2

T T C/T T G G C C N C/A G N T A C/T G T N A A A/G
G T N G G

5' Primer 3

C C N G A A/G G G N A T G G T N T G

3' Primer 1

C A N C/G T/A A/G C A C/T T T A/G C A C/T T C

3' Primer 2

C A N A C C A T N C C C/T T C N G G

3' Primer 3

C G/T N C G/T T/C T G G/A C A N C G/T C CA
worin N ein Gemisch aller vier Nukleotide ist und Gemische zweier Nukleotide durch alternative Buchstaben (z. B. A/G) angezeigt werden.
Obwohl kein Noggin-Transkript im Embryo des Oozyten- oder Teilungsstadiums lokalisiert wird, sind zygotische Transkripte anfänglich auf das präsumptive dorsale Mesoderm beschränkt und erreichen ihre höchsten Werte im Gastrulastadium in der dorsalen Lippe des Blastoporus (Spemann-Organisator). In der Neurula wird Noggin im Notochord und prächordalen Mesoderm transkribiert.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, stellten die Anmelder Hypothesen über die embryologische Wirkung von Noggin auf der Basis seiner Expressionsstelle und über die Wirkung der RNA-Injektion in Embryonen auf. Da Noggin im Spemann- Organisator exprimiert wird, kann man davon ausgehen, dass Noggin ein Mittler der Wirkungen des Spemann-Organisators ist, d. h. der neuralen Induktion und Dorsalisierung des Mesoderm. Da Noggin Im Notochord und Kopf-Mesoderm exprimiert wird, ist man der Ansicht, dass Noggin entweder das dorsal-ventrale Muster oder anterior-posteriore Muster der Neuralplatte beeinflusst. Da Noggin in der Neuralleiste des Schlundbogens exprimiert wird, kann man davon ausgehen, dass es daher beeinflusst, ob Neural leistenzellen Knorpel ablagern, und auch Auswirkungen auf das spätere Wachstum des Schlundbogens und die Ummodellierung hat. Noggin wird in der Neuralleiste der Schwanzflosse exprimiert, und da die Neuralleiste für das Wachstum der Flosse erforderlich ist, kann Noggin als Wachstumsfaktor für die Epidermis oder das Mesenchym dienen.
Obwohl ein Großteil der vorliegenden Experimente die Bewahrung der embryonalen Entwicklung betraf, gehen die Anmelder davon aus, dass Noggin auch als Erwachsenen- Zellfunktion exprimiert wird, da die Expression im Notochord im wachsenden Schwanzkeim fortbesteht und eine diskontinuierliche Linie gefärbter Zellen (zeigt Expression von Noggin an, die an neuen Stellen initiiert wurde) über die Länge der Dorsalplatte des Neuralrohrs verläuft (und auch im Kopf-Mesoderm ersichtlich ist).
Einige Anwendungen für Noggin ergeben sich aus seinen Eigenschaften.
Die Noggin-cDNA sollte sich als diagnostisches Instrument eignen (z. B. mittels Verwendung von Antikörpern in Tests auf Proteine in Zeillinien oder durch Verwendung von Oligonukleotiden als Primer in einem PCR-Test zur Amplifizierung jener mit Sequenzähnlichkeiten mit dem Oligonukleotid-Primer, und um zu ermitteln, wieviel Noggin vorhanden ist, z. B. Primer wie etwa die 5'-Primer 1-3 und 3'-Primer 1-3).
Da Noggin ein Expressionsmuster aufweist, das nahe legt, dass es zur Regulierung der Knorpelproduktion im Embryokopf dient, sind klinische Einsätze von Noggin zur Regulierung von Knorpel- und Knochenwachstum in therapeutischen Zusammensetzungen und insbesondere in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren indiziert (aufgrund der Eigenschaft von Noggin, zumindest einige Wachstumsfaktoren zu potenzieren).
Da Neuralleistenzellen für das Wachstum der Kaulquappenflosse erforderlich sind, scheint Noggin ein Wachstumsfaktor für die Gewebematrix und Epidermis zu sein und dürfte z. B. in Wundheilungszusammensetzungen nützlich sein.
Noggin bietet natürlich den Schlüssel zur Isolierung seines Rezeptors. Da viele Rezeptoren zu zellulären Onkogenen mutieren, dürfte der Noggin-Rezeptor für bestimmte Tumortypen ein wertvolles diagnostisches Instrument darstellen. Wenn man Noggin als Ligand in Komplexen betrachtet, enthalten Komplexe der Erfindung an Noggin gebundenen Antikörper, an von Noggin stammende Peptide gebundenen Antikörper, an seinen Rezeptor gebundenes Noggin oder von an seinen Rezeptor gebundenem Noggin stammende Peptide. Mutierte Formen von Noggin, die entweder wirksamere Agonisten oder Antagonisten sind, gelten als klinisch nützlich. Solche Komplexe von Noggin und seinen Bindungsproteinpartnern kommen für eine Reihe von Anwendungen in Frage.
Die Praxis der Erfindung sieht die Verwendung eines Oligonukleotidkonstrukts vor, das eine Sequenz umfasst, die für Noggin und eine Promotorsequenz kodiert, die mit Noggin operabel verbunden ist (in einem Säugetier- oder viralen Expressionsvektor). Expressions- und Kloniervektoren enthalten eine Nukleotidsequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist in Kloniervektoren diese Sequenz in der Lage, den Vektor unabhängig von den Wirtschromosomen zu replizieren, und enthält Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Das allgemein bekannte Plasmid pBR322 eignet sich für die meisten gramnegativen Bakterien, und der 2,u-Plasmidursprung für Hefe sowie verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyom-, Adenovirus, VSV oder BPV) eignen sich für Kloniervektoren in Säugetierzellen.
Expressions- und Kloniervektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typischerweise handelt es sich um ein Gen, das für ein Protein kodiert, das für das Überleben oder die Vermehrung einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erforderlich ist. Die Präsenz dieses Gens stellt sicher, dass jede Wirtszelle, die den Vektor deletiert, keinen Vorteil hinsichtlich der Vermehrung oder Reproduktion gegenüber transformierten Wirten erzielt. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren.
Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-Reductase (DHFR) oder Thymidin-Kinase. Solche Marker ermöglichen die Identifizierung von Zellen, die kompetent waren, die Noggin-Nukleinsäuren aufzunehmen. Die Säugetierzellen-Transformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, dem nur die Transformanten aufgrund der Tatsache, dass sie den Marker aufgenommen haben, standhalten können. Der Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen, unter denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium allmählich geändert wird, angelegt. Die Amplifikation ist jenes Verfahren, durch das Gene, nach denen zur Produktion eines für das Wachstum entscheidenden Proteins stärkere Nachfrage besteht, innerhalb der Chromosomen aufeinanderfolgender Generationen rekombinierter Zellen in Tandem wiederholt werden. Es können daher größere Mengen an Noggin ausgehend von der amplifizierten DNA synthetisiert werden.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält, identifiziert. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die China-Hamster-Eierstock-Zelllinie (CHO-Zelllinie) mit DHFR-Aktivitäts-Defizienz, die gemäß dem Verfahren von Urlaub und Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci. 77, 4216 (1980), hergestellt und vermehrt wird. Die transformierten Zellen werden dann größeren Mengen an Mtx ausgesetzt. Dies führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrerer Kopien anderer DNA, die Expressionsvektoren wie etwa für Noggin kodierende DNA umfasst. Alternativ dazu können Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, der für Noggin und Aminoglykosid- 3'-Phosphotransferase-(APH-)Protein kodiert, durch Zeilvermehrung in Medium selektiert werden, das ein Aminoglykosid-Antibiotikum wie etwa Kanamycin, Neomycin oder G418 enthält. Da eukaryotische Zellen normalerweise keine endogene APH-Aktivität exprimieren, können für APH-Protein kodierende Gene, die man üblicherweise als neo resistente Gene bezeichnet, als dominante selektierbare Marker in einer Vielzahl eukaryotischer Wirtszellen verwendet werden, wodurch die mit dem Vektor transformierten Zellen problemlos identifizierbar sind.
Expressionsvektoren sollten im Gegensatz zu Kloniervektoren einen Promotor enthalten, der vom Wirtorganismus erkannt wird und mit der Noggin-Nukleinsäure operabe) verbunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromauf vom Startcodon eines Strukturgens liegen (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1000 bp) und die Transkription und Translation von unter ihrer Kontrolle stehender Nukleinsäure regulieren. Sie können typischerweise in zwei Klassen eingeteilt werden - induzierbar und konstitutiv. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktion auf eine Veränderung der Kulturbedingungen, z. B. als Reaktion auf die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder auf eine Temperaturveränderung, ein höheres Ausmaß an Transkription aus unter ihrer Kontrolle stehender DNA initiieren. Zum jetzigen Zeitpunkt sind viele Promotoren bekannt, die von einer große Zahl potenzieller Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden mit für Noggin kodierender DNA operabel verbunden, indem sie mittels Restriktionsenzym-Spaltung aus ihrem Ursprungsgen entfernt werden, gefolgt von Insertion 5' vom Startcodon für Noggin.
Nukleinsäure wird operabel verbunden, wenn sie in funktionelle Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader mit DNA für ein Polypeptid operabel verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer Kodiersequenz operabel verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder es ist eine Ribosomen-Bindungsstelle mit einer Kodiersequenz operabel verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel verbunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend und - im Fall eines Sekretionsleaders - zusammenhängend und in Lesephase positioniert sind. Die Verbindung wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen vorgenommen. Wenn solche Stellen nicht exis tieren, werden gemäß konventionellen Techniken synthetische Oligonukleotid-Adaptoren oder -Linker eingesetzt.
Die Transkription von für Noggin kodierender DNA in Säugetier-Wirtszellen wird durch Promotoren gesteuert, die aus Genomen von Viren wie etwa Polyom-, Zytomegalie-Virus, Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und am bevorzugtesten Affenvirus 40 (SV40) oder aus heterologen Säugetier-Promotoren, z. B. dem Actin-Promotor, erhalten werden. Natürlich kommen auch Promotoren für die Wirtszelle oder verwandte Spezies in Frage.
Man geht davon aus, dass sich Noggin als Mittel eignet, mit dem das Überleben gefördert und die Vermehrung von Nerven- und Muskelzellen induziert wird,. Es ist daher bei der Therapie degenerativer Störungen des Nervensystems ("neurodegenerative Krankheiten") indiziert; Beispiele sind die Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea, ALS, periphere Neuropathien und andere Zustände, die von Nekrosen oder Verlust an Neuronen gekennzeichnet sind (zentrale, periphere oder motorische Neuronen). Außerdem kann es sich zur Behandlung geschädigter Nervenzellen eignen, z. B. von Nerven, die durch traumatische Zustände wie etwa Verbrennungen und Wunden, Diabetes, Nierendysfunktion und die toxischen Effekte von Chemotherapeutika zur Behandlung von Krebs und AIDS geschädigt sind. Ferner kommt Noggin als Komponente von Kulturmedien zum Kultivieren von Nervenzellen in vitro in Frage.
Die Praxis der Erfindung umfasst die Herstellung und Verwendung eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels, das eine Nukleotidsequenz von zumindest etwa 15 DNA- oder RNA-Basen umfasst (analog zur Gesamtheit oder einem Teil der SEQ.-ID Nr. 1 oder 2). Noggin-Präparate eignen sich somit als Standards in Tests auf Noggin und in kompetitiven Rezeptor-Bindungstests (bei Markierung mit Radioiod, Enzymen, Fluorophoren, Spinmarkern und dergleichen): Therapeutische Formulierungen von Noggin werden durch Vermischen von Noggin mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren in Form von lyophilisiertem Kuchen oder wässrigen Lösungen für die Lagerung vorbereitet. Annehmbare Träger, Exzipienen oder Stabilisatoren sind für Empfänger in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch und umfassen Puffer wie etwa Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien wie etwa Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine wie etwa Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline. Andere Komponenten sind z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate wie etwa Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie etwa EDTA; Zuckeralkohole wie etwa Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie etwa Natrium; und/oder nicht-ionogene Tenside wie etwa Tween, Pluronics oder PEG.
Komplexe der Erfindung umfassen einen Liganden, der durch eine oder mehrere der SEQ.-ID Nr. 3-7 gekennzeichnet ist. Der Ligand kann an ein Protein, wie z. B. einen Antikörper gebunden sein. Solche Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein.
Polyklonale Antikörper gegen Noggin werden in Tieren im Allgemeinen durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen von Noggin und einem Adjuvans hervorgerufen. Es kann sinnvoll sein, Noggin oder ein die Ziel-Aminosäuresequenz enthaltendes Fragment an ein Protein, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, unter Einsatz eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels zu binden, z. B. Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl&sub2; oder R¹N = C = NR.
Tiere können gegen immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert werden, indem 1 mg oder 1 ug Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina vollständigem Freund-Adjuvans kombiniert wird und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später erhalten die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Konjugat in vollständigem Freund-Adjuvans eine Auffrischung durch sc-Injek tion an mehreren Stellen. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und Serum auf Anti-Noggin-Titer getestet. Tiere erhalten Auffrischungen, bis der Titer abflacht. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat des gleichen Noggin-Polypeptids aufgefrischt, das aber an ein anderes Protein und/oder über einen anderen Vernetzer konjugiert ist. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen erzeugt werden. Aggregationsmittel wie etwa Alaun dienen dazu, die Immunreaktion zu verstärken.
Monoklonale Antikörper werden durch Gewinnen von Milzzellen aus immunisierten Tieren und herkömmliches Immortalisieren der Zellen hergestellt, z. B. mittels Fusion mit Myelomzellen oder durch EB-Virus-Transformation und Screenen auf Klone, die den gewünschten Antikörper exprimieren.
Noggin-Antikörper eignen sich für diagnostische Tests auf Noggin oder dessen Antikörper. In einer Ausführungsform eines Rezeptor-Bindungstests wird eine Antikörper-Zusammensetzung, die sich an alle einer ausgewählten Vielzahl von Mitgliedern der Noggin-Familie bindet, auf einer unlöslichen Matrix immobilisiert, die Testprobe wird mit der immobilisierten Antikörper-Zusammensetzung in Kontakt gebracht, um alle Noggin- Familienmitglieder zu adsorbieren, und dann werden die immobilisierten Familienmitglieder mit einer Vielzahl an für jedes Mitglied spezifischen Antikörpern in Kontakt gebracht, wobei jeder Antikörper einzeln als für ein vorbestimmtes Familienmitglied spezifisch identifizierbar ist, z. B. durch charakteristische Marker wie etwa diskrete Fluorophore oder dergleichen. Durch Bestimmen der Gegenwart und/oder Menge jedes charakteristischen Markers können der relative Anteil und die Menge jedes Familienmitglieds ermittelt werden.
Noggin-Antikörper sind auch bei der Affinitätsreinigung von Noggin aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich. Noggin-Antikörper, die mit anderen Wachstumsfaktoren nicht detektierbar kreuzreagieren, können zur Reinigung von Noggin von diesen anderen Familienmitgliedern herangezogen werden.
Es folgt eine Veranschaulichung von Aspekten der Erfindung anhand von Beispielen.

VERSUCHSVERFAHREN

Produktion von Xenopus-Embryos

Xenopus-Embryos wurden gemäß der Arbeitsvorschrift von Condie und Harland (Development 101, 93-105 (1987)) hergestellt. Embryonen wurden gemäß der Tabelle von Nieuwkoop und Faber ("Normal Table of Xenopus laevis" (Daubin), Amsterdam: North Holland, 1967) in Stadien eingeteilt. Ventralisierte Embryonen wurden durch UV-Bestrahlung mit einem Statalinker (Stratagene) produziert und dorsalisierte Embryonen durch Behandlung mit LiCI produziert; siehe die Arbeit der Anmelder über bestimmte "wnt"-Proteine (als "Xwnt-8" bezeichnet; Smith und Harland, Cell 67, 753-765 (1991); durch Verweis aufgenommen und nachstehend gelegentlich als "S&H, s.o." bezeichnet).

BEISPIEL 1

Isolation und Sequenzieren von Noggin-cDNA

Die Konstruktion der größenselektierten Plasmid-cDNA-Bibliothek aus mit LiCl behandelten Embryonen aus Stadium 11 lief wie folgt ab. 60 pg poly(A)+-RNA aus mit LiCI behandelten Embryonen aus Stadium 11 wurden auf einem 10-30% -Saccharose-Gradienten in Gegenwart von Methylquecksilberhydroxid größenfraktioniert. cDNA des ersten Strangs wurde aus 2 ug der größenfraktionierten poly(A)&spplus;-RNAs synthetisiert, die mit Oligo(dT)-Oligonukleotid geprimt waren, das die Erkennungsstelle für Notl enthielt. Nach der Synthese des zweiten Strangs wurden cDNAs mit EcoRl-Methylase behandelt, mit EcoRI-Linkern ligiert, mit EcoRl und Notl gespalten und schließlich an 125 ng modifiziertes pGEM-5Zf(-) (Promega) ligiert. Das hier verwendete pGEM-5Zf(-) wurde durch Addition eines Oligonukleotids an die Nsil-Stelle modifiziert, um eine EcoRl-Stelle zu erzeugen. Der Vektor wurde mit alkalischer Phosphatase behandelt, doch die ausgeschnittene Polylinker-Sequenz wurde auf einer Sepharose-4BCL-Säule entfernt. Die ligierten Produkte dienten dazu, XL-I Blue-Zellen (Stratagene) zu transformieren, und wurden ausplattiert, um 100.000 Kolonien pro 1 S cm-Platte zu ergeben. Plasmid-DNAs wurden nach einer Arbeitsvorschrift von alkalischer Lyse und Polyethylenglykol-Fällung aus Plattenkulturen isoliert.
Dorsalisierende Aktivität in der Bibliothek wurde durch Injizieren von RNA-Transkripten aus gepoolter Plasmid-DNA untersucht. Einzelklone wurden durch einen Prozess der "Sib Selection" isoliert. Dabei wurde die Plasmidbibliothek auf 12 Platten mit 10fach weniger Kolonien pro Platte neu ausplattiert. RNA wurde aus gepoolten Plasmid-DNAs synthetisiert, die aus jeder Platte isoliert und durch Injektion in UV-ventralisierte Embryonen auf dorsalisierende Aktivität getestet worden waren. Diese Pools mit dorsalisierender Aktivität wurden - wie oben beschrieben - neu ausplattiert und gescreent. Dieser Prozess wurde wiederholt, bis einzelne Klone isoliert waren.
In vitro RNA-Synthese, Injektionstest für Dorsalachsen-Bewahrung und Sib Selections wurden ebenfalls durchgeführt (wie bei S&H, s.o., beschrieben).
Die Nukleotidsequenz beider Stränge des isolierten Noggin-cDNA-Klons wurde nach dem Didesoxy-Terminationsverfahren unter Einsatz modifizierter T7 DNA-Polymerase (US Biochem) determiniert. Deletionen wurden durch Restriktionsenzym- und Exonuklease III-Spaltung in Sequenzierungstemplaten vorgenommen (Henikoff, Meth. Enzymol. 155, 156-165 (1987)).

In vitro-Translation

¹/&sub2; ug in vitro synthetisiertes Noggin, Xwnt-8, und Ziegen-"Coid"-mRNAs wurden in einem mit Nuklease behandelten Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (Promega) mit zugegebenem 3'S-Methionin gemäß den Anweisungen des Herstellers translatiert. Die Transla tionsprodukte wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (12% Gele) visualisiert; gefolgt von Fluorographie. Noggin-Protein wies das anhand des offenen Leserahmens prognostizierte Molekulargewicht auf.

RNA-Isolierung und -Analyse

Voll-RNA wurde gemäß einer in kleinem Maßstab angelegten Arbeitsvorschrift aus Embryonen und Oozyten isoliert (Condie und Harland, s.o.). Dorsallippen wurden aus 30 unfixierten Embryonen des Stadiums 10,5 herausgeschnitten und zur Herstellung von Voll-RNA gepoolt. Proben, die entweder das Voll-RNA-Äquivalent von 2,5 Embryonen oder etwa 2 ug poly A&spplus;-RNA enthielten, wurden durch Northern Blotting analysiert. Willkürlich geprimte DNA-Sonden wurden aus einem 1.323 bp-Fragment von NoggincDNA aus der EcoRI-Stelle an Nukleotid -83 bis zu einer EcoRV-Stelle, die unmittelbar 3' vom Ende der cDNA im Vektor liegt, erhalten.
RNAse-Schutztests erfolgten unter Anwendung der Arbeitsvorschrift von Melton et al. (Nucl. Acids Res. 12, 7035-7056 (1984)), wobei kleine Modifizierungen vorgenommen wurden (C. Kintner, Salk Institute, La Jolla, CA, USA). Ein Noggin-cNDA-Exonuklease III- Deletionskion (siehe SEQ.-ID Nr. 1), jedoch mit einer Deletion vom 3'-Ende bis zu Nukleotid 383, wurde als Templat zum Synthetisieren von RNA-Sonden verwendet. Die Templat-DNA wurde durch EcoRI-Restriktionsenzym-Spaltung linearisiert und eine 463 Basen-Antisense-RNA mit ³²P mit T7 RNA-Polymerase synthetisiert. Eine 387 Basen umfassende Antisense-EFIα-RNA-Sonde diente als Vergleich für die Menge an RNA pro Probe. Die Sonden wurden vor der Verwendung gelgereinigt.

In situ-Hybridisierung

Nach Fixierung und Lagerung wurden die Embryonen kontrolliert, um sicherzustellen, dass Blastozöl und Archenteron punktiert waren. Man achtete darauf, das Restblastozöl von Neurulae und Kaulquappen sowie das Archenteron zu punktieren. Embryonen wur den bei Raumtemperatur in 100% Ethanol 2 Stunden lang erneut gewaschen, um Restlipid zu entfernen. Nach der Hybridisierung wurde die Einfärbung über Nacht entwickeln gelassen, und die Embryonen wurden in Bouin fixiert. Neu eingefärbte Embryonen besitzen einen hohen Hintergrund an Rosafärbung, doch der Großteil davon wird ausgewaschen, sodass die spezifische Färbung zurückbleibt. Nach der Fixierung über Nacht wurden die Embryonen gründlich mit 70 0/0 Ethanol, mit PBS gepuffertem 70. % Ethanol und Methanol gewaschen. Die Embryonen wurden in Murray-Gemisch gereinigt und mit Kodak Ektar 25 Film unter Verwendung eines axioplanen Zeiss-Mikroskops (2,5 oder 5 · Objektiv mit 3 · 12 B Teleskop zur Unterstützung bei der Fokussierung) fotografiert.

Rückverfolgung der Abstammung

Die Rückverfolgung der Abstammung mit mRNA, die für nukleare lokalisierte β-Galactosidase kodiert, erfolgte gemäß S&H, s.o. Ventralisierte Embryonen wurden in Zellstadium 32 mit 0,5 ng β-Galactosidase und 25 pg Noggin AS' mRNAs injiziert. Die Embryonen wurden fixiert und mit X-gal eingefärbt (etwa im Stadium 22).

Noggin-cDNA kodiert für ein neuartiges Polypeptid

Die aus 1833 Nukleotiden bestehende Sequenz des selektierten Klons ist durch SEQ.-ID Nr. 1 dargestellt und wird manchmal auch als "Klon A3." bezeichnet. Die Sequenz enthält einen einzelnen langen offenen Leserahmen, der für ein aus 222 Aminosäuren bestehendes Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 26 kDa kodiert. Am Aminoterminus legt der hydrophobe Abschnitt der Aminosäuren nahe, dass das Polypeptid in den Sekretionsweg eintritt. Es existiert eine einzige potenzielle Stelle für Ngebundene Glykosylierung an Aminosäure 61. Umfangreiche untranslatierte Regionen befinden sich 5' und 3' vom Leserahmen (593 bzw. 573 bpl. Die 3'-untranslatierte Region ist besonders reich an repetierten dA- und dT-Nukleotiden und enthält zusätzlich zu einer Polyadenylierungs-Signalsequenz 24 bp stromauf vom Start des poly A-Schwanzes eine zweite potenzielle Polyadenylierungssequenz (147 bp weiter stromauf).
Sense-RNA, die aus Klon A3 mit SP6 RNA-Polymerase synthetisiert wurde, wurde in einem Kaninchen-Retikulozyten-Lysat-System translatiert. Die 3'S-markierten Produkte wurden auf einem 12 0/0 SDS-Polyacrylamidgel fraktioniert und durch Fluorographie visualisiert. Das Protein-Hauptprodukt zeigte das erwartete Molekulargewicht von etwa 26 kDa.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des vorhergesagten Polypeptids mit dem National Center for Biotechnology Information BLAST-Netz (nicht-redundante Datenbank) lieferte keine ähnliche Sequenz. Somit kodiert dieser Klon für eine neue Art von Protein, die von den Anmeldern als "Noggin" bezeichnet wird; es wird sekretiert und besitzt dorsalinduzierende Aktivität in Xenopus.

Noggin-mRNA kann eine vollständige dorsal-ventrale Achse wiederherstellen

Die Injektion von Noggin-RNA in ein einzelnes Blastomer eines vierzelligen UV-ventrafisierten Embroys kann das vollständige Spektrum dorsaler Strukturen wiederherstellen. Der Grad an Achsen-Wiederherstellung hing von der Menge injizierter RNA ab, wobei Embryonen, die niedrige Dosen verabreicht bekamen, nur hintere dorsale Strukturen aufwiesen, während Embryonen, die höhere Dosen verabreicht bekamen, überschüssiges dorsal-anteriores Gewebe aufwiesen. RNA-Transkripte aus zwei Noggin-Plasmiden wurden getestet. Das erste enthielt Voll-cDNA. Das zweite (pNogginä5') besaß eine Deletion, welche die ersten 513 Nukleotide der 5'-untranslatierten Region bis zur EcoRl- Stelle entfernte. Die aus der Injektion von RNA-Transkripten dieser beiden Plasmide, sowie zu Vergleichszwecken Xwnt-8-RNA, resultierenden Embryonen wurden gemäß der dorso-anterioren Indexskala (DAI) von Kao und Elinson (Dev. Biol. 127, 64-77 (1988)) gelagert. Bei dieser Skala wird ein vollständig ventralisierter Embryo als null eingestuft, ein normaler Embryo wird als 5 eingestuft, und die am stärksten dorsoanteriorisierten Embryonen (jene mit radialen dorso-anterioren Strukturen) wurden als 10 eingestuft. Aus pNogginΔ5' synthetisierte RNA (NbgginΔ5'-mRNA) lieferte wiederholt eine höhere DAI als die gleiche Menge an aus Voll-cDNA synthetisierter mRNA. Die Dosisabhängigkeit der Achsen-Wiederherstellung durch NogginΔS'-mRNA zeigte starke Ähnlichkeit mit,jener von Xwnt-8-mRNA.
UV-behandelten Embryonen wurden auch höhere Dosen (1.000 pg) der Noggin-mRNAs injiziert. Die Injektion dieser Dosis Noggin-mRNA in ein Blastomer im vierzelligen Stadium führte zu Embryonen mit sehr starker Hyperdorsalisierung (DAI > 7). Die meisten dieser Embryonen starben jedoch im späten Gastrula-/frühen Neurulastadium. Offensichtlich führten übermäßig starke Gastrulationsbewegungen zur Ausdünnung und zum Durchbrechen des Blastozöldachs. Die Anmelder beobachteten dieses Phänomen auch bei hohen Dosen injizierter Xwnt-8-mRNA.
Die Wiederherstellung dorsaler Entwicklung durch NogginΔ5'- und Xwnt-8-mRNAs folgte einem konsistenten Muster, in dem größere Mengen an mRNAs zur Wiederherstellung immer mehr anteriorer Strukturen führen. Beispielsweise wurden bei Embryonen, die 1 pg der RNAs erhielten, vor allem die posterioren und rumpfdorsalen Strukturen wiederhergestellt; die meisten dieser Embryonen besaßen keine Kopfstrukturen. Höhere Dosen (10 oder 100 pg) beider RNAs führten zu Embryonen mit stärkerer anteriorer Entwicklung, wobei viele entweder fast normale oder hyperdorsalisierte Phenotypen aufwiesen.

Noggin-injizierte Blastomere wirken als Nieuwkoop-Zentrum

Es wurde die Wirkung des Variierens der Stelle der Noggin-mRNA-Injektion untersucht. UV-behandelte Embryonen im 32-Zell-Stadium wurden entweder 0,5 ng β-Galactosidase-mRNA alleine oder 0,5 ng β-Galactosidse vermischt mit 25 pg NogginΔ5'-mRNA injiziert. Die Injektion von Noggin-mRNA in Blastomere des vegetalen Tiers lieferte die am stärksten dorsoanteriorisierten Embryonen. In beiden vegetal injizierten Embryonen wur de die nukleare X-Gal-Einfärbung fast ausschließlich im Endoderm festgestellt (die mRNA kodiert für β-Galactosidase, die zum Kern transloziert, wodurch Unterscheidung von der diffusen Hintergrundfärbung möglich ist). Einer der gezeigten Embryonen war stark hyperdorsalisiert (DAI etwa 7), was auf die Noggin-mRNA-lnjektion zurückzuführen war, und besaß einen deutlich abgestumpften Schwanz und vergrößerte Kopfstrukturen. Embryonen wurden auch durch Noggin-mRNA-Injektionen in die Marginalzone wiederhergestellt. In diesen Embryonen wurde β-Galactosidase-Einfärbung vor allem im axialen und Kopfmesoderm festgestellt. Die Injektion von Noggin-mRNA in den Tierpol übte einen sehr geringen Einfluss auf die Achsenbildung aus. Ebenso war β-Galactosidase-mRNA alleine wirkungslos.

Noggin-mRNA wird sowohl maternal als auch zygotisch exprimiert

Bei der Northern Blot-Analyse von RNA aus Xenopus-Embryonen wurden zwei NogginmRNA-Spezies einer Größe von etwa 1,8 und 1,4 kb beobachtet Eine relativ geringe Menge an Noggin-mRNA wurde in Oozyten detektiert. Im Stadium 11 war der Wert an Noggin-mRNA deutlich höher, was auf zygotische Transkription schließen lässt (im Gegensatz zu den maternal abgelagerten Transkripten in Oozyten). Die Noggin-mRNA- Mengen blieben bis zum spätesten untersuchten Stadium (Stadium 45) hoch.
Die Anmelder erwarten, dass die primäre dorsalisierende RNA in der vorliegenden Bibliothek eine große Menge an mit LiCl behandelten Embryonen im Vergleich zu normalen oder UV-behandelten Embryonen aufweist. Die Lithiumionen-Behandlung führte zu einer deutlichen Zunahme der Menge an exprimierter Noggin-mRNA im Verhältnis zu unbehandelten Embryonen. UV-Behandlung zeigte die entgegengesetzte Wirkung. Die Noggin-mRNA-Expression war in Voll-RNA-Proben aus diesen Embryonen im Wesentlichen nicht nachweisbar. Somit geht ein Überfluss an Noggin-mRNA in manipulierten Embryonen mit Wiederherstellungsaktivität einher.
Die Anmelder analysierten die Verteilung von Noggin-mRNA in Oozyten und Embryonen im Teilungsstadium. Da die Menge an maternal abgelagerter Noggin-RNA zu niedrig ist, als dass in situ-Hybridisierung gegenüber dem Hintergrund detektiert werden könnte, wurde ein RNAse-Schutztest durchgeführt. Oozyten wurden in tierische und pflanzliche Hälften zerteilt. In beiden Hemisphären wurden im Verhältnis zur Oozyten- Voll-RNA keine Anreicherung an Noggin-mRNA beobachtet. Vierzellige Embryonen wurden in dorsale und ventrale Hälften sowie in tierische und pflanzliche Hälften zerschnitten. Noggin-Transripte stellten sich als zwischen dorsalen und ventralen Hemisphären sowie tierischen und pflanzlichen Hemisphären gleichmäßig verteilt heraus. Das gleiche Ergebnis wurde mit Embryonen erzielt, die unmittelbar nach der Befruchtung um 90º geneigt und dann auf ihrer obersten Seite mit einem Vitalfarbstoff markiert wurden, um die zukünftige dorsale Seite anzuzeigen. Ältere Blastula-Embryonen (32- Zellen-Stadium) wurden ebenfalls in dorsal-ventale und tierisch-pflanzliche Hälften zerschnitten. Keine Anreicherung an Noggin-mRNA wurde in den Hemisphären im Verhältnis zum Gesamtembryo festgestellt. Darüber hinaus änderte die UV-Behandlung den Überfluss an maternal abgelagerter Noggin-RNA nicht, was auf ein Fehlen an bevorzugtem Abbau in Ventralgeweben schließen lässt. Proben mit bekannten Mengen an in vitro-synthetisierter Noggin-mRNA wurden im RNAse-Schutztest verwendet. Aus diesen und anderen Daten zogen die Anmelder den Schluss, dass es etwa 0,1 pg NogginmRNA pro Embryo im Blastula-Stadium und 1 pg pro Embryo im Gastrula-Stadium gibt.
Die Lokalisierung von Noggin-Transkripten wurde in Embryonen im frühen Gastrula-Stadium untersucht. Dorsallippen wurden aus Embryonen des Stadiums 10,5 herausgeschnitten. Ein Northern Blot gleicher Mengen an Voll-RNA aus intakten Embryonen, herausgeschnittenen Dorsallippen und aus dem übrigen Embryo nach dem Herausschneiden der Dorsallippe wurde mit einer Noggin-Sonde hybridisiert und dann mit einer EFIα-Sonde erneut hybridisiert (als Vergleich für die Menge an pro Probe geladener RNA). Das Autoradiogramm des Blots zeigte, dass Noggin-mRNA in diesem Stadium in der Dorsallippe angereichert ist.

In situ-Hybridisierung; zygotische Expression von Noggin im Spemann-Organisator

Die Lokalisierung von Noggin-Transkripten in sich entwickelnden Embryonen wurde unter Anwendung von Gesamt-in situ-Hybridisierung im Detail untersucht. Vollständige fixierte Embryonen wurden mit Digoxigenin enthaltenden RNA-Sonden hybridisiert. Hybridisierte RNA-Sonde wurde dann mit Anti-Digoxigenin-Antikörper (an alkalische Phosphatase konjugiert) visualisiert. Die Spezifität der Hybridisierung bei Antisense-Noggin- Sonden wurde dann sowohl durch Hybridisieren von Embryonen mit Sense-Noggin-Sonden als auch unter Verwendung zweier nicht-überlappender Antisense-Sonden getestet. Aufgrund des geringen Expressionsgrads und der Hintergrundfärbung konnte NogginmRNA vor dem späten Blastula-Stadium nicht eindeutig detektiert werden. Die größere Menge an Noggin-mRNA, die durch Northern Blot im Anschluss an Aktivierung zygotischer Transkription detektiert wurde, war in der in situ-Hybridisierung im Stadium 9 als Fleck gefärbter Zellen auf der dorsalen Seite des Embryos sichtbar. Vom pflanzlichen Pol aus betrachtet war dieser Zellenfleck auf einen Sektor von etwa 60º beschränkt. Eine Seitenansicht des gleichen Embryos zeigt, dass sich die eingefärbten Zellen innerhalb der marginalen Zone befanden (d. h. zwischen dem tierischen und pflanzlichen Pol und innerhalb der präsumptiven dorsalen Mesoderm-bildenden Region). Transkripte sind in diesem Stadium größtenteils auf den Kern beschränkt.
Eine Seitenansicht eines Embryos im frühen Gastrula-Stadium (das Stadium von etwa 10,5 zeigt vor allem im involutiven Mesoderm an der Dorsallippe spezifische Hybridisierung). Eine pflanzliche Ansicht des gleichen Embroys (Blastoporuslippe mit Pfeilen versehen) zeigt, dass Noggin-mRNA hauptsächlich auf der dorsalen Seite vorhanden ist, wobei sich aber die Expression auf der unteren Ebene bis zur ventralen Seite des Embryos erstreckt. Wenn die in situ-Hybridisierung bei diesem Verfahren in der dotterreichsten Region von Embryonen keine Transkripte detektiert, kann Expression in pflanzlicheren Regionen als in der Figur daher nicht ausgeschlossen werden. Behandlungen, die bekanntermaßen die Größe der Dorsallippe beeinflussen (LiCI-Behandlung, UV-Bestrahlung) übten einen starken Einfluss auf das Muster der in situ-Noggin-Hybridi sierung aus. In LiCl behandelten Embryonen ist die Färbung in der gesamten marginalen Zone intensiv. UV-Behandlung reduzierte das Hybridisierungssignal auf einen niedrigen Wert. Dieses Resultat stimmt mit Mengen an Noggin-mRNA überein, die durch Northern Blot-Analyse ermittelt werden. Der mit UV behandelte Embryo ist auch ein negativer Vergleich für die Spezifität der Hybridisierung.
Mit Fortschreiten der Gastrulation folgt die Noggin-mRNA-Einfärbung dem involutiven dorsalen Mesoderm und ist im präsumptiven Notochord am stärksten. Bis zum späten Neurula-Stadium (etwa 18) sind Noggin-mRNA exprimierende Zellen im dorsalsten Mesoderm am deutlichsten (vor allem im Notochord, sie erstrecken sich aber auch nach vorne in das prächordale Mesoderm). Die vordere Spitze des Notochords ist mit Pfeilen markiert. Während der Schwanzkeimstadien nimmt die Expression von Noggin im dorsalen Mesoderm ab, obwohl die Expression im Notochord im wachsenden Schwanzkeim weiter besteht. Die Expression von Noggin setzt an mehreren neuen Stellen ein, was immer deutlicher wird, je mehr die Kaulquappe heranreift. Eine diskontinuierliche Linie gefärbter Zellen verläuft über die Länge der Dachplatte des Neuralrohrs. Die Färbung ist auch im Kopfmesoderm offensichtlich, vor allem in den mandibularen und Kiemenbögen. Die Anmelder nehmen an, dass diese Expression mit sekelettbildenden Neuralleistenzellen übereinstimmt. Außerdem exprimieren Untergruppen dieser Zellen Homöobox-Gene, die unterschiedliche anterior-posteriore Mengen der Kopfneuralleiste markieren (z. B. wird En-2 im mandibularen Bogen durch Antikörper-Einfärbung visualisiert). Zellen mit stellarer Morphologie färbten sich durch Noggin-mRNA in der Schwanzflosse ein. Diese stellaren Zellen sind auch wahrscheinlich von der Neuralleiste abgeleitet. Keines dieser Muster wurde bei der Sense-Sonde oder einigen anderen Sonden festgestellt.

BEISPIEL 2

In COS-Zellen transfizierte Noggin-cDNA produziert aktives konditioniertes Medium

Für COS-Zellen wurde die Noggin-cNDA in einen COS-Zellen-Expressionsvektor insertiert. COS-Zellen wurden transfiziert und das Medium geerntet, nachdem die Expression der eingeführten Noggin-Gene ermöglicht wurde. Diese Medium wurde in einem Tier- Cap-Test auf Mesoderm-induzierende oder dorsalisierende Aktivität getestet. Die Anmelder untersuchten zwei Transfektions-Arbeitsvorschriften: eine Standard-Arbeitsvorschrift, bei der Zellen gewonnen und dann in serumfreies Medium übertragen werden, und eine alternative Arbeitsvorschrift, bei der Zellen in ein definiertes Medium übertragen werden, das kein Serum, aber Transferrin, Insulin und BSA enthält. Zellen bleiben im ergänzten Medium gesund, und ein co-transfiziertes β-Galactosidase-Gen liefert 100 Mal mehr Aktivität als im nicht ergänzten Medium. Dies führt zur Behandlung von Zellen mit diesen Medien (siehe Tabelle 1). Tier-Caps wurden aus ventralisierten Tieren entnommen, behandelt und am Ende der Neurulation hinsichtlich der Dehnung bewertet - üblicherweise ein Zeichen, dass Notochord oder neurale Gewebe induziert wurden. Die Dehnung ist in Tabelle 1 mit einem "+" gekennzeichnet, eine sogar noch stärkere Dehnung mit "++". Außerdem werden sie durch Northern Blotting hinsichtlich eines molekularen Markers bewertet.
Wie aus den Daten von Tabelle 1 ersichtlich übt die Noggin-cNDA einen starken Einfluss auf das mit COS-Zellen konditionierte Medium aus. Noggin steht aber wahrscheinlich mit einer anderen Substanz im Medium in Wechselwirkung, da mit COS-Zellen konditioniertes Medium alleine etwas Aktivität aufweist. Es ist möglich, dass Noggin bewirkt, dass die Zellen etwas sekretieren, was sie normalerweise nicht sekretieren würden, doch die Experimente zeigen sehr wohl, dass Noggin sekretiert wird und für einen Teil der Aktivität verantwortlich ist. TABELLE 1 Mit COS-Zellen konditioniertes Medium: Wirkung auf Tier-Caps

In Oozyten injizierte mRNA produziert aktives sekretiertes Noggin-Protein

Eine zweite Möglichkeit zur Untersuchung der Frage, ob das Protein in aktiver Form sekretierbar ist, besteht darin, in Oozyten mRNA zu injizieren und von den Oozyten sekretiertes Material zu gewinnen. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass die injizierte mRNA wirkungsvoll translatiert wird und ein Großteil der Translation der Oozyten von der injizierten mRNA aufgenommen werden kann. Ein neues Protein, dessen Synthese durch injizierte Noggin-mRNA gesteuert wird, wird in das Medium sekretiert. Noggin zeigt deutliche Synergiewirkung mit Activin, um längliche Explantate zu produzieren, die große Mengen an Muskel-Actin exprimieren.

Biochemische Eigenschaften von Noggin

Injizierten Oozyten wird mRNA injiziert und mit ³&sup5;S-Methionin markiert. Ein Großteil des in das Medium sekretierten radioaktiven Proteins stammt aus der injizierten mRNA. Das Noggin-Protein, das fast isotopenrein, kann dann analysiert werden. Anhand dieser Analyse stellten die Anmelder fest, dass Noggin ein dimeres Glykoprotein ist. Unter reduzierenden Bedingungen und behandelt mit N-Glycanase zur Entfernung von Zuckerresten wandert Noggin nur geringfügig langsamer als sein vorhergesagtes Molekulargewicht von 26 kDa. Die Entfernung von Zuckerseitenketten führt zum Verlust von etwa 4 kDa des anfänglichen scheinbaren Moleulargewichts von 33 kDa. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wandert es mit dem Doppelten dieses Werts.
Es ist derzeit noch nicht bekannt, ob das Dimer des 30 kDa-Proteins die aktive Spezies ist oder ob eine proteolytisch verarbeitete und aktive Form existiert. In einem Vergleichsversuch mit Activin-mRNA produzieren Oozyten Activin-Aktivität, doch ein Großteil des radiomarkierten Proteins wandert als Vorläuferform. Nur eine geringe Menge des verarbeiteten Proteins (15 kDa) wurde detektiert. Es ist möglich, dass Noggin-injizierte Oozyten hauptsächlich unverarbeitetes Protein und eine Spur von extrem aktivem verarbeitetem Protein sekretieren, das noch nicht detektiert wurde. Trotz dieser Einschränkungen ist die wesentliche Aussage, die man in Bezug auf die Analyse injizierter Oozyten und transfizierter COS-Zellen machen kann, jene, dass aktives Noggin als frei lösliches sekretiertes Polypeptid erhalten werden kann. Dies unterscheidet es von der anderen Gruppe von Genen mit dorsalisierender Aktivität, den wnt-Genen. Wnt-Proteine waren bislang nicht in löslicher Form erhältlich, was die Analyse ihrer biologischen Aktivitäten und des Rezeptors, der sich an sie bindet, sehr beeinträchtigt hat.

BEISPIEL 3

Klonieren des Mäuse-Noggin-Homologs

Es ist derzeit unmöglich, zygotische Noggin-Transkription aus sich entwickelnden Xenopus-Embryonen zu eliminieren. Im Gegensatz dazu sollte es möglich sein, homozygote Null-Mutationen in Mäusen vorzunehmen. Die Anmelder klonierten die Mäuse-NoggineDNA (SEQ.-ID Nr. 2). Dies ist für die Erzeugung von Mäusemutanten sinnvoll. Neben der Erzeugung der Sonden und Instrumente zur Produktion von Mäusemutanten sollte ein Vergleich der Noggin-Sequenzen ein nützliches Mittel zur Prognose konservierter Domänen und Funktionen sein. Die C-terminalen 80 Aminosäuren sind zwischen SEQ.- ID Nr. 1 und 2 zu 87% identisch.
Mäuse-Noggin wurde aus einer embryonalen cDNA-Bibliothek durch Sondieren mit einer radiomarkierten Frosch-Noggin-cDNA unter mäßig rauen Bedingungen (Definition siehe oben) isoliert. Anschließend wurde ein genomischer Klon durch Sondieren einer genomischen Bibliothek mit der Mäuse-Noggin-eNDA unter sehr rauen Bedingungen isoliert (wie oben definiert, jedoch bei 42ºC hybridisiert und bei 50ºC in 15 ml NaCl,1,5 mM Natriumcitrat gewaschen).
Man beachte, dass die obige Erfindung zwar in Zusammenhang mit bevorzugten spezifischen Ausführungsformen erörtert wurde, die Beschreibung und Beispiele aber lediglich veranschaulichend sind und den in den beigefügten Patentansprüchen dargelegten Schutzumfang der Erfindung keinesfalls einschränken sollen.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN.
(i) ANMELDER: Harland, Richard M.
Smith, William C.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Das Dorsalgewebe beeinflussender Faktor und Zusammensetzungen
(iii) ANZAHL AN SEQUENZEN: 7
(iv) FIRMENANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Majestic, Parsons, Siebert & Hsue
(B) STRASSE: Four Embarcadero Center, Suite 1450
(C) STADT: San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94111-4121
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release 1.0, Version 1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/939.954
(B) ANMELDUNGSDATUM: 3. September 1992
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION BETREFFEND ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Siebert, J. Suzanne.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 28.758
(C) GESCHÄFTS/AKTENZAHL: 2900.3
(ix) INFORMATION BETREFFEND TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: 001-415-362-5556
(B) TELEFAX: 001-415-362-5418
(C) TELEX: 278638 MGPS
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1834 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGEIGENSCHAFT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein ·
(vi) ANTI-SENSE: ja
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Xenopus laevis
(B) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Gastrula
(X) INFORMATION BETREFFEND VERÖFFENTLICHUNG:
(A) AUTOREN: Smith, William C.
Harland, Richard M.
(B) TITEL: Expressionsklonierung von Noggin, einem neuartigen bei Xenopus-Embryonen im Spemann-Organisator
lokalisierten Dorsalisierungsfaktor
(C) FACHZEITSCHRIFT: Cell
(D) BAND: 70
(F) SEITEN: 829-840
(G) DATUM: 4. September 1992 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 1:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 356 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGEIGENSCHAFT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: ja
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Mus musculus
(B) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Gastrula (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 2:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANG EIGENSCHAFT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 3:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGEIGENSCHAFT: einfach
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 4:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGEIGENSCHAFT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH; nein
(iv) ANTI-SENSE: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 5:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGEIGENSCHAFT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 6:
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID Nr. 7: ·
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGEIGENSCHAFT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 7:

Claims

1. Im Wesentlichen reines Polypeptid, gekennzeichnet durch eine physiologisch aktive, lösliche Form, die eine oder mehrere der folgenden Sequenzen enthält:

QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO : 3);

RFWPRYVKVGSC (SEQ ID NO : 4);

SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO : 5);

LRWRCQRR (SEQ ID NO : 6); Lind,

ISECKCSC (SEQ ID NO : 7),

und fähig ist, bei Wirbeltierembryos Dorsalentwicklung zu induzieren.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, das von einer Tierspezies stammt und aus einem rekombinanten Expressionssystem oder aus der Tierspezies so isoliert ist, dass es frei von verunreinigenden Polypeptiden der Tierspezies ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, das glykosyliert ist.

4. Zusammensetzung, die ein Peptid umfasst, wobei das Peptid biologische Aktivität aufweist und eine oder mehrere der folgenden Sequenzen:

QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO : 3);

RFWPRYVKVGSC (SEQ ID NO : 4);

SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO : 5);

LRWRCQRR (SEQ ID NO : 6); und,

ISECKCSC (SEQ ID NO : 7)[;];

sowie ein oder mehrere therapeutische Adjuvantien und/oder ein physiologisch annehmbares Lösungsmittel umfasst, in dem das Peptid gelöst ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das therapeutische Adjuvans einen neutrotrophen Faktor umfasst.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Peptid an einen Antikörper gebunden ist.

7. Nukleotidsequenz, die für eine oder mehrere der Aminosäuresequenzen:

QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO : 3);

RFWPRYVKVGSC (SEQ ID NO : 4);

SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO : 5);

LRWRCQRR (SEQ ID NO : 6); und,

ISECKCSC (SEQ ID NO : 7).

kodiert.

8. Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, worin die Sequenz ausreichende Größe aufweist, um mit endogener mRNA für ein dorsalwachstuminduzierendes Protein in einem Wirbeltier zu hybridisieren.

9. Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, worin die Aminosäuresequenz ein Polypeptid mit physiologischer Aktivität bei Wirbeltieren umfasst.

10. Nukleotidsequenz nach Anspruch 9, worin die physiologische Aktivität die Induktion von Dorsalentwicklung umfasst.

11. Nukleotidsequenz nach Anspruch 9, worin das Polypeptid in physiologischer Lösung löslich ist.

12. Nukleotidsequenz nach Anspruch 9, worin das Polypeptid aus zumindest einer Gruppe mit einem Molekulargewicht von etwa 25 bis etwa 30 Kilodalton bei SDS-PAGE besteht.

13. Diagnose- oder Therapiemittel, das eine Nukleotidsequenz mit zumindest etwa 15 DNA- oder RNA-Basen umfasst, die fähig ist, unter rauhen Bedingungen an Sequenz- ID-Nr. 1 oder Sequenz-ID-Nr. 2 oder deren Komplementäre Sequenzen zu hybridisieren.

14. Mittei nach Anspruch 13 zum Hemmen der Expression von Polypeptiden, die fähig sind, Dorsalentwicklung bei einem Wirbeltier zu induzieren, worin die Sequenz aus DNA-Basen oder RNA-Basen in Antisense-Richtung in Bezug auf Sequenz-ID-Nr. 1 oder Sequenz-ID-Nr. 2 vorliegt.

1 S. Komplex, der einen Liganden umfasst, der durch eine oder mehrere der folgenden Sequenzen gekennzeichnet ist:

QMWLWSQTFCPVLY (SEQ ID NO : 3);

RFWPRYVKVGSC (SEQ ID NO : 4);

SKRSCSVPEGMVCK (SEQ ID NO : 5);

LRWRCQRR (SEQ ID NO : 6); Und,

ISECKCSC (SEQ ID NO : 7),

wobei der Ligand an ein Protein gebunden ist.

16. Komplex nach Anspruch 15, worin das gebundene Protein ein Antikörper ist.

17. Komplex nach Anspruch 15, worin der Ligand Dorsalwachstum induzierende Aktivität aufweist und das gebundene Protein ein Rezeptor dafür ist.

18. Isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das fähig ist, Dorsalentwicklung bei einem Wirbeltier zu induzieren, und die unter rauhen Bedingungen an Sequenz-ID-Nr. 1 oder Sequenz-ID-Nr. 2 hybridisiert.

19. Verfahren zum Identifizieren von Molekülen, die mit Sequenz-ID-Nr. 1 und Sequenz-ID-Nr. 2 verwandt sind, umfassend:

das Screenen einer Nukleinsäuresammlung auf Klone, die an Abschnitte von Sequenz-ID-Nr. 1 oder Sequenz-ID-Nr. 2 hybridisieren;

das Isolieren und Vermehren von Klonen, die an Sequenz-ID-Nr. 1 oder Sequenz-ID-Nr. 2 hybridisieren; und

das Bestimmen der Sequenz der Klone.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin Abschnitte von Sequenz-ID-Nr. 1 oder Sequenz-ID-Nr. 2, für die hybridisierende Klone gescreent, isoliert und vermehrt werden, für eine oder mehrere der Sequenz-ID-Nr. 3 bis 7 kodieren.

21. Verfahren nach Anspruch 19, worin das Screenen die Verwendung eines oder mehrerer Primer zur Amplifizierung umfasst.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die biologische Aktivität die Induktion von Dorsalentwicklung bei Wirbeltierembryos umfasst.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die biologische Aktivität die Induktion von Neuralentwicklung bei Wirbeltierembryos umfasst.