DE69309702T2

DE69309702T2 - Modifizierte ciliare neurotrophische faktoren (cntf)

Info

Publication number: DE69309702T2
Application number: DE69309702T
Authority: DE
Inventors: Nikos Orangeburg Ny 10962 Panayotatos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1997-10-30
Anticipated expiration: 2013-10-09
Also published as: HK1007767A1; ZA937482B; JP2702811B2; US5846935A; US5349056A; JPH07506005A; CA2132954C; EP0666912A1; ATE151460T1; US20030220484A1; WO1994009134A2; CA2132954A1; EP0666912B1; AU5326094A; US6440702B1; IL107213A0; US20030092129A1; ES2099981T3; DK0666912T3; WO1994009134A3

Description

TECHNISCHER HINTERGRUND

Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische CNTF-verwandte Polypeptide, die sich zur Behandlung neurologischer oder anderer Erkrankungen oder Störungen eignen.
Der ziliare neurotrophe Faktor (CNTF) ist ein Protein, das zum Überleben embryonaler Hühner-Ziliarganglionneuronen in vitro erforderlich ist (Manthorpe, et al., J. Neurochem. 34 (1980), 69-75). Das Ziliarganglion befindet sich anatomisch innerhalb der Augenhöhle und liegt zwischen dem Rektus lateralis und den Meningealhüllen des Nervus opticus. Es erhält vom Okulomotorius-Nerv, der den Ziliarmuskel und Pupillenschließer innerviert, parasympathische Nervenfasern.
Neben seiner Fähigkeit, das Überleben von Ziliarganglionneuronen zu unterstützen, hat man CNTF während des letzten Jahrzehnts eine Reihe biologischer Wirkungen zugeschrieben. Man nimmt an, daß CNTF die Differenzierung von bipotentiellen Glia-Vorläuferzellen im Sehnerv und Gehirn perinataler Ratten induziert (Hughes et al., Nature 335 (1988), 70-73). Außerdem hat man festgestellt, daß er das Überleben von sensorischen Neuronen des Spinalganglions von Hühnerembryonen fördert (Skaper und Varon, Brain Res. 389 (1986), 39-46). Außerdem unterstützt CNTF das Überleben und die Differenzierung von Motoneuronen, Hippokampus-Neuronen und präsympathischen Rückenmarks-Neuronen [Sendtner, et al., Nature 345 (1990), 440-441; Ip, et al., J. Neurosci. 11(1991), 3124-3134; Blottner, et al., Neurosci. Lett. 105 (1989), 316-320].
Vor kurzem ist CNTF in bakteriellen Expressionssystemen cloniert und synthetisiert worden, wie von Masiakowski, et al., J. Neurosci. 57 (1991), 1003- 1012, und in der am 4. April 1991 veröffentlichten Internationalen Patentveröffentlichung WO 91/04316, beschrieben.
Der CNTF-Rezeptor (als "CNTFRα" bezeichnet) ist doniert, sequenziert und exprimiert worden [vgl. Davis, et al., Science 253 (1991), 59-63]. CNTF und der als Leukämie-Hemmfaktor (LIF) hämopoietische Faktor wirken auf Nervenzellen über einen gemeinsamen Signal-Stoffwechselweg, der sowohl den IL-6signalübertragenden Bestandteil gp130 als auch einen zweiten β-Bestandteil (als LIFR (3 bekannt) umfaßt. Entsprechend kann der CNTF/CNTF-Rezeptor- Komplex die Signalübertragung in auf LIF reagierenden Zellen oder anderen Zellen initiieren, die die Bestandteile gp130 und LIFRβ enthalten [Ip, et al., Cell 69 (1992), 1121-1132].
Außer menschlichem CNTF sind auch die entsprechenden Gene der Ratte (Stöckli, et al., Nature 342 (1989), 920-923) und des Kaninchens (Un, et al., J. Biol. Chem. 265 (1989), 8942-8947) cloniert worden, wobei sich herausgestellt hat, daß sie Proteine von 200 Aminosäuren codieren, die zu etwa 80% zu dem menschlichen Gen identisch sind. Die rekombinanten Proteine von Mensch und Ratte sind in außerordentlich hohen Mengen (bis zu 70% des Gesamtproteins) exprimiert und fast zur Homogenität aufgereinigt worden.
Trotz ihrer strukturellen und funktionellen Ähnlichkeit unterscheiden sich die rekombinanten CNTF-Proteine von Mensch und Ratte in verschiedener Hinsicht. Die biologische Aktivität von rekombinantem Ratten-CNTF bei der Unterstützung des Überlebens und der Neuritensprossung embryonaler Hühner-Ziliarneuronen in Kultur ist viermal besser als die von rekombinantem menschlichem CNTF [Masiakowski, et al., J. Neurochem. 57 (1991), 1003-1012]. Ferner besitzt Ratten-CNTF eine höhere Affinität zum menschlichen CNTF-Rezeptor als menschlicher CNTF.
Die CNTF-Proteine von Mensch und Ratte, deren Größe identisch ist, unterscheiden sich überraschenderweise in den physikalischen Eigenschaften, d.h. in ihrer Beweglichkeit in SDS-Gelen. Dieses unterschiedliche Verhalten deutet darauf hin, daß in einem der beiden Moleküle ein ungewöhnliches Strukturmerkmal vorkommt, das selbst im denaturierten Zustand fortbesteht (Masiakowski, et al., 1991, id.).
Häufig sind gentechnische Mutagenese-Verfahren verwendet worden, um die strukturelle Organisation der funktionellen Domänen von rekombinanten Proteinen aufzuklären. In der Literatur sind mehrere unterschiedliche Verfahrensweisen zur Durchführung von Deletions- oder Austauschmutagenese-Verfahren beschrieben worden. Das Alanin-"Scanning"- Mutageneseverfahren [Cunningham und Wells, Science 244 (1989), 1081-1085] und das Homolog-" Scanning"-Mutangeneseverfahren [Cunningham und Wells, Science 243 (1989), 1330-11336] scheinen am erfolgreichsten zu sein. Diese Verfahrensweisen haben geholfen, die Rezeptorbindungs-Domänen des Wachstumshormons zu identifizieren und Hybridproteine mit veränderten Bindungseigenschaften gegenüber ihren verwandten Rezeptoren zu erzeugen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger CNTF- verwandter neurotropher Faktoren zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, einschließlich von Motoneuronen-Erkrankungen und degenerativen Muskel-Erkrankungen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von CNTF-verwandten Faktoren, die nicht die in der vorliegenden Erfindung spezifisch beschriebenen sind und verbesserte therapeutische Eigenschaften besitzen.
Diese und andere Ziele werden erfindungsgemäß erreicht, wobei Aminosäure-Austausche im menschlichen CNTF-Protein dessen therapeutische Eigenschaften verbessern. In einer Ausführungsform werden Veränderungen in der elektrophoretischen Beweglichkeit verwendet, um anfangs eine Durchmusterung nach potentiell geeigneten modifizierten CNTF-Proteinen durchzuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aminosäure Glutamin an Position 63 des menschlichen CNTF-Proteins durch Arginin oder eine andere Aminosäure ersetzt, die zu einem modifizierten CNTF-Protein mit verbesserter biologischer Aktivität führt.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1. Ausrichtung von CNTF-Proteinsequenzen. A. Sequenzen des menschlichen Proteins (SEQ. ID. No. 1), des Ratten-Proteins (SEQ. ID. No. 2), des Kaninchen-Proteins (SEQ. ID. No. 3), des Maus-Proteins (SEQ. ID. No. 4) und des Hühner-Proteins (SEQ. ID. No. 5) (Leung, et al., Neuron 8 (1992), 1045-1053). Die Punkte zeigen Reste an, die in der menschlichen Sequenz gefunden wurden. Bild B. Modifizierte CNTF-Moleküle (186 [SEQ. ID. No. 6], 187 [SEQ. ID. No. 7], 188 [SEQ. ID. No. 8], 189 [SEQ. ID. No. 9], 192 , 218 [SEQ. ID. No. 11], 219 [SEQ. ID. No. 12], 222 [SEQ. ID. No. 13], 223 und 228 [SEQ. ID. No. 15], die Aminosäurereste vom menschlichen CNTF (Punkte) und Ratten-CNTF (Reste gezeigt) aufweisen. Der Name des gereinigten rekombinanten Proteins, das der jeweiligen Sequenz entspricht, ist links gezeigt.
Figur 2. Beweglichkeit von menschlichen CNTF-Molekülen, Ratten-CNTF- Molekülen und verschiedenen modifizierten CNTF-Molekülen in reduzierenden SDS enthaltenden 15%-igen Polyacrylamid-Gelen. Gereinigte rekombinante Proteien wurden, wie angegeben, aufgetragen. Marker mit den angegebenen Molekulargewichten wurden in der Laufspur M aufgetragen.
Figur 3. Biologische Aktivität von zwei modifizierten CNTF-Molekülen. A. menschlicher CNTF (gefüllte Rhomben), Ratten-CNTF (nicht-ausgefüllte Quadrate) und RPN219 (gefüllte Quadrate). B. menschlicher CNTF (gefüllte Rhomben), Ratten-CNTF (nicht-ausgefüllte Quadrate) und RPN228 (gefüllte Quadrate). Dosis-Reaktion getrennter E8-Hühner-Ziliarneuronen, die bei der angegebenen Protein-Konzentration überleben, als Prozentsatz der Anzahl der Neuronen, die in Gegenwart von 2 ng/ml Ratten-CNTF überleben. Jeder experimentell bestimmte Punkt stellt den Durchschnitt von drei Bestimmungen dar.
Figur 4. Kompetitive Ugandenbindung gegenüber A.) SCG-Neuronen und B.) MG87/huCNTFR- Fibroblasten. Die Standardabweichung vom Durchschnitt aus drei Bestimmungen ist durch vertikale Striche gezeigt.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung neurologischer Erkrankungen und Störungen bei Mensch und Tieren. Dieses Verfahren basiert teilweise auf der anfangs gemachten Beobachtung, daß rekombinanter Ratten-CNTF wirksamer an den menschlichen CNTF-Rezeptor bindet als rekombinanter menschlicher CNTF, sowie auf der nachfolgenden Entdeckung, daß Aminosäure-Austausche, die bewirken, daß menschlicher CNTF Ratten-CNTF stärker ähnelt, zu einer besseren Bindung von modifiziertem CNTF an den menschlichen CNTF-Rezeptor und gleichzeitig zu einer erhöhten biologischen Aktivität führen.
In einer bevorzugten Ausführungsform führt die Veränderung einer einzigen Aminosäure des menschlichen CNTF-Proteins zu einer signifikanten Verbesserung der Fähigkeit des Proteins, das Überleben und die Sprossung von Ziliarganglion-Neuronen zu fördern.
Rekombinante CNTF-Proteine von Mensch und Ratte besitzen die gleiche Anzahl von Aminosäuren (199) und ähnliche Molekulargewichte (nach Entfernung des N-terminalen Methionins MW 22 798 bzw. 22 721). Dennoch wandert rekombinanter menschlicher CNTF in reduzierenden SDS-PAGE-Gelen als Protein mit einem Molekulargewicht von 27 500, während Ratten-CNTF mit der envarteten Beweglichkeit wandert. Außerdem besitzt menschlicher CNTF gegenüber Hühner-Ziliarganglion (CG)-Neuronen eine viermal geringere biologische Aktivität als Ratten-CNTF und das menschliche Protein konkurriert um die Bindung an die auf Zelloberflächen befindlichen Rezeptoren von Mensch oder Ratte viel weniger effizient als Ratten-CNTF.
Die vorstehende Beobachtung führte dazu, daß zielgerichtete Anstrengungen zur Identifizierung des Bereiches auf dem CNTF-Molekül unternommen wurden, der für diese Unterschiede verantwortlich ist. Das Verfahren umfaßte den Austausch von Teilen der menschlichen CNTF-Sequenz gegen die entsprechende Ratten-CNTF-Sequenz und umgekehrt mit Hilfe gentechnischer Verfahren. Um dies zu erreichen, wurden Restriktionsstellen ausgenutzt, die beiden CNTF-Genen gemeinsam sind und in ihren entsprechenden Expressionsvektoren nur einmal vorkommen. Gegebenenfalls wurden solche Stellen in dem einen oder dem anderen der beiden Gene in den Bereichen, die die gleiche Proteinsequenz codieren, gentechnisch erzeugt. Mittels dieser Verfahrensweise wurden für jedes der in Figur 1 gezeigten modifizierten Proteine Expressionsvektoren erhalten. Nach Isolierung der einzelnen Proteine bis zu einer Reinheit von mindestens 60% wurden ihre Eigenschaften im Vergleich zu denen der CNTF-Proteine von Mensch und Ratte bestimmt.
Da sich die elektrophoretischen Beweglichkeiten der CNTF-Proteine von Mensch und Ratte signifikant unterscheiden, wurde die Wirkung jedes Aminosäure-Austausches am Anfang kontrolliert, indem die Wirkung einer solchen Veränderung auf die Proteinbeweglichkeit bestimmt wurde. Wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, zeigten die Daten der elektrophoretischen Beweglichkeit, daß alle der modifizierten menschlichen CNTF-Nloleküle, die bis zur gleichen Position wanderten wie Ratten-CNTF, den Aminosäure-Einzelaustausch Gln63 T Arg (Q63 T R) besaßen.
Modifizierte menschliche CNTF-Proteine, die eine ähnliche elektrophoretische Beweglichkeit wie das Ratten-CNTF-Molekül zeigten, wurden anschließend hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität und Rezeptorbindung untersucht.
CNTF ist durch seine Fähigkeit charakterisiert, das Überleben getrennter Ziliarneuronen von E8-Hühnerembryonen zu unterstützen. Bei Anwendung dieses Kriteriums ist gereinigter rekombinanter Ratten-CNTF genauso aktiv wie das native Protein aus der Ratte, aber viermal aktiver als rekombinanter menschlicher CNTF [Masiokowski, et al. (1991), id.]. Der gleiche Test wurde zur Bestimmung der biologischen Aktivität der veränderten Moleküle verwendet, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt worden waren. Wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, zeigten alle der modifizierten CNTF- Moleküle, die den Q63 T R-Austausch aufwiesen, im Vergleich zum menschlichen Eltern-C NTF-Protein eine erhöhte Fähigkeit zur Unterstützung des Überlebens von Ziliarganglion-Neuronen. Diese Ergebnisse zeigten eine starke Korrelation zwischen der Veränderung der elektrophoretischen Beweglichkeit und verbesserten biologischen Eigenschaften.
Neben der Bestimmung der biologischen Wirkung der in menschlichem CNTF erzeugten Modifikationen kann auch ein Hinweis auf die potentielle biologische Aktivität jedes der Moleküle erhalten werden, indem die Wirkung jeder Modifikation auf die Fähigkeit der Moleküle zur Bindung an den CNTF- Rezeptor bestimmt wird.
In einer Ausführungsform wurde die Fähigkeit der modifizierten menschlichen CNTF-Moleküle bestimmt, mit Ratten-CNTF um die Bindung an obere Halsganglion-Neuronen (SCGs) der Ratte zu konkurrieren. Wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, verdrängt menschlicher CNTF die Bindung von ¹²&sup5;J-markiertem Ratten-CNTF von diesen Zellen etwa 90fach weniger wirksam als nichtmarkierter Ratten-CNTF. Mehrere der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen modifizierten menschlichen CNTF- Proteine verdrängen jedoch das Ratten-Protein wirksamer als menschlicher CNTF. Alle der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Moleküle, die eine solche erhöhte kompetitive Bindungsfähigkeit aufwiesen, waren Moleküle, die eine veränderte elektrophoretische Beweglichkeit zeigten, wobei die Moleküle in ähnlicher Weise wie Ratten-CNTF wanderten.
In einer anderen Ausführungsform wurden Zellen, wie MG87-Fibroblasten, zur Expression des α-Bestandteils des menschlichen CNTF-Rezeptors gentechnisch verändert. Diese Zellen werden verwendet, um die Fähigkeit der modifizierten Proteine zur Bindung an den menschlichen Rezeptor zu testen. Menschlicher CNTF konkurriert mit ¹²&sup5;J-markiertem Ratten-CNTF um die Bindung an menschlichen CNTF-Rezeptor etwa 12mal weniger wirksam als Ratten-CNTF. Mehrere der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen modifizierten menschlichen CNTF-Moleküle einschließlich derjenigen, deren elektrophoretische Beweglichkeit eher der von Ratten-CNTF ähnelt als der von menschlichem CNTF, konkurrierten wirksamer als menschlicher CNTF mit ¹²&sup5;J- markiertem Ratten-CNTF um die Bindung an die Zellen, die den menschlichen CNTF-Rezeptor exprimierten.
Zur Bestimmung der therapeutischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen modifizierten CNTF- Moleküle kann in einer anderen Ausführungsform ein Tiermodell verwendet werden, dessen Nützlichkeit, Hinweise auf die Fähigkeit bestimmter Wachstumsfaktoren und anderer Faktoren zur Verhinderung der Degeneration von Netzhaut-Photorezeptoren zu liefern, bereits nachgewiesen worden ist. Wie in Beispiel 4 beschrieben, ist die Fähigkeit von hCNTF (Gln63 T Arg) in einem Schädigungs-Modell, in dem es durch Lichtinduktion zur Netzhautdegeneration kommt, die Degeneration von Photorezeptoren zu verhindern, etwa 10fach größer als die von rekombinantem menschlichem CNTF.
Erfindungsgemäß führen daher bestimmte Aminosäure-Austausche im menschlichen CNTF- Protein zu modifizierten menschlichen CNTF-Proteinen, die besser an den menschlichen CNTF-Rezeptor binden, weshalb erwartet werden kann, daß sie verbesserte therapeutische Eigenschaften besitzen.
Die modifizierten CNTF-Moleküle, die sich zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung eignen, können durch Clonierung und Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem hergestellt werden. Das rekombinante Neurotrophin-Gen kann unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Verfahren exprimiert und aufgereinigt werden. Das den Faktor codierende Gen kann in einem bakteriellen Expressionsvektor subcloniert werden, wie z.B. in pCP110, ist aber nicht darauf beschränkt.
Die rekombinanten Faktoren können mit Hilfe eines beliebigen Verfahrens aufgereinigt werden, das anschließend die Bildung eines stabilen, biologisch aktiven Proteins erlaubt. Beispielsweise können die Faktoren aus Zellen entweder als lösliche Proteine oder als Einschlußkörper gewonnen werden, aus denen sie mittels 8 M Gunidiniumhydrochlorid und Dialyse quantitativ extrahiert werden können, sind aber nicht darauf beschränkt. Zur weiteren Aufreinigung der Faktoren können herkömmliche Ionen-Austausch- Chromatographie, auf hydrophoben Wechselwirkungen beruhende Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Gelfiltration verwendet werden.
Erfindungsgemäß können modifizierte CNTF-Moleküle, die, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, hergestellt wurden, oder ein Hybrid oder eine Mutante davon verwendet werden, um in vitro oder in vivo die Differenzierung, Proliferation oder das Überleben von auf CNTF reagierenden Zellen zu fördern, einschließlich Zellen, die Rezeptoren der CNTF/IL-6/LIF- Rezeptorfamihe exprimieren, oder beliebiger Zellen, die einen geeigneten signalübertragenden Bestandteil exprimieren, wie z.B. in Davis et al. in Cell 69 (1992), 1121-1132, beschrieben. In einer anderen Ausführungsform können Mutanten oder Hybride der Zelldifferenzierung oder dem Überleben entgegenwirken.
Die vorliegende Erfindung kann zur Behandlung von Störungen beliebiger Zellen verwendet werden, die auf CNTF oder den CNTF/CNTF-Rezeptor-Komplex ansprechen. In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen lassen sich entsprechend diesen Verfahren Störungen von Zellen behandeln, die Vertreter der CNTF/Il-6/LIF-Rezeptorfamilie exprimieren. Beispiele solcher Störungen umfassen Störungen folgender Zellen: Leukämie-Zellen, Blutstammzellen, Megakaryozyten und ihre Vorläufer, DA1-Zellen, Osteoklasten, Osteoblasten, Leberzellen, Fettzellen, Nierenepithelzellen, embryonale Stammzellen, Nieren-Mesangiumzellen, T-Zellen, B-Zellen, usw., sind aber nicht darauf beschränkt.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, bei denen ein Patient, der an einer mit CNTF im Zusammenhang stehenden neurologischen oder Differenzierungs-Störung oder -Erkrankung oder Nervenschädigung leidet, mit einer wirksamen Menge eines modifizierten CNTF oder eines Hybrids oder einer Mutante davon behandelt wird. Die modifizierten CNTF-Moleküle können zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen verwendet werden, wie für CNTF in der am 4. April 1991 von Masiakowski et al. veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung W091/043 16 und für den CNTF/CNTFR-Komplex in der am 12. Dezember 1991 von Davis et al. veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung WO91/19009 beschrieben.
Solche Erkrankungen oder Störungen umfassen degenerative Erkrankungen, wie Netzhautdegenerationen, Erkrankungen oder Störungen, die das Rückenmark, cholinerge Neuronen oder Hippokampus-Neuronen umfassen, oder Erkrankungen oder Störungen, die Motoneuronen umfassen, wie amyotrophe Lateralsklerose oder die des Nervus facialis, wie Facialisparese. Andere Erkrankungen oder Störungen, die behandelt werden können, umfassen periphere Neuropathie, Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit, Chorea Huntington oder Muskelatropie, die beispielsweise von Denervierung, chronischem Mißbrauch, Stoffwechselbelastung und Mangelernährung oder einem Zustand, wie Muskeldystrophiesyndrom, angebotener Myopathie, einer entzündlichen Muskelerkrankung, toxischer Myopathie, Nerventrauma, peripherer Neuropathie, Arzneistoff- oder Toxin-induzierter Schädigung oder Motoneuropathie, resultieren.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Erkrankungen oder Störungen, die von einer Schädigung des Nervensystems resultieren, wobei eine solche Schädigung durch ein Trauma, einen chirurgischen Eingriff, einen Infarkt, eine Infektion und Malignität oder durch Einwirken eines toxischen Mittels verursacht werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die ein vorstehend beschriebenes modifiziertes CNTF-Molekül oder ein Hybrid oder eine Mutante davon als einziges therapeutisches Mittel oder in einem Komplex mit dem CNTF-Rezeptor in einem geeigneten pharmakologischen Träger umfassen.
Der Wirkstoff, der den modifizierten CNTF, einen stabilen Komplex aus modifiziertem CNTF und CNTF-Rezeptor oder ein Hybrid oder eine Mutante davon umfaßt, sollte zur systemischen oder lokalen Verabreichung in vivo über einen beliebigen geeigneten Verabreichungsweg, einschließlich Injektion (z.B. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subcutan, endoneural, perineural) intraspinal, intraventrikulär, intravitreal, intrathekal, usw.), Absorption durch Epithel- oder Schleimhautauskleidungen (z.B. Mundschleimhaut, Rektal- und Intestinalmukosa) oder Implantate mit verzögerter Wirkstoffabgabe, wozu Zell- oder Gewebe-Implantate gehören, wobei der Verabreichungsweg aber nicht darauf beschränkt ist, in einem geeigneten pharmazeutischen Träger formuliert werden.
Je nach Darreichungsform kann der Wirkstoff in einem flüssigen Träger, wie physiologischer Kochsalzlösung, formuliert, in Liposomen, Mikrokapseln oder Präparaten auf Polymer- oder Wachs-Basis und mit kontrollierter Wirkstoffabgabe eingeschlossen oder in Tabletten-, Pillen- oder Kapselform formuliert werden.
Die Konzentration des in dem Präparat verwendeten Wirkstoffs hängt von der erforderlichen Effektivdosis und der angewendeten Darreichungsform ab. Die Dosis sollte ausreichen, um wirksame, sich im Kreislauf befindliche Plasma- Konzentrationen des Wirkstoffes zu erreichen. Effektivdosen können aus Dosis- Wirkungs-Kurven extrapoliert werden, die aus in vitro-Testsystemen oder Tiermodell-Testsystemen erhalten werden.
Wie in der vorliegenen Erfindung beschrieben, haben die Anmelder festgestellt, daß eine veränderte elektrophoretische Beweglichkeit ein verläßliches Verfahren zum Durchmustern auf Proteine mit erhöhter biologischer Aktivität oder erhöhter Fähigkeit zur Ligandenbindung bietet. Dementsprechend kann das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren allgemein zum Durchmustern auf neuartige therapeutische Proteine angewendet werden. Ein solches Verfahren würde die Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit eines menschlichen Wildtyp-Proteins, die Einführung von Aminosäure-Austauschen in das menschliche Wildtyp-Protein und die Identifizierung von Proteinen mit Aminosäureaustauschen, deren elektrophoretische Beweglichkeit im Vergleich zu der des Wildtyp-Proteins verändert ist, als potentielle Kandidaten umfassen. Solche Proteine mit Aminosäureaustauschen könnten zur Bestimmung ihrer biologischen Aktivität und/oder Bindungsaffinität weiter getestet werden. Potentielle Aminosäure- Austausche könnten beispielsweise auf vergleichbaren Sequenzen homologer Proteine aus nicht-menschlichen Arten basieren.
Der Fachmann erkennt, daß andere Veränderungen der CNTF- Aminosäuresequenz dem Molekül verbesserte Eigenschaften verleihen können. Der Fachmann erkennt auch, daß auch CNTF-Homologe aus anderen Arten, nämlich Maus, Kaninchen und Huhn, verbesserte Eigenschaften zur Behandlung menschlicher Erkrankungen oder Störungen besitzen können. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Identifizierung neuartiger neurotropher Faktoren, wobei neurotrophe Faktoren aus anderen Arten als dem Nienschen identifiziert und sowohl hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bindung an den menschlichen Rezeptor als auch hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität in menschlichen Zellinien und in in vivo-Systemen getestet werden. Bei der Identifizierung neurotropher Faktoren aus Tierarten, die neuartige Eigenschaften besitzen, können auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, wie die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen, verwendet werden, um Teile des menschlichen Faktors gegen Teile des aus Tieren stammenden Faktors zur Erzeugung neuartiger neurotropher Faktoren mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften auszutauschen.

BEISPIELE

Beispiel 1. Elektrodhoretische Beweglichkeit modifizierter menschlicher CNTF- Moleküle

Materialien und Verfahren

Herstellung modifizierter CNTF-Moleküle

Bakterienstämme und Plasmide

E. coli K-12 RFJ26 ist ein Stamm, der den Repressor des Lactose-Operons überproduziert.
Die Expressionsvektoren pRPN33, der das menschliche CNTF-Gen enthält, und pRPN110, der das Ratten-CNTF-Gen enthält, sind nahezu identisch (Masiakowski, et al., 1991, id.).
Das Plasmid pRPN219 wurde konstruiert, indem zuerst pRPN33 mit den Restriktionsenzymen NheI und HindIII gespalten und das 4081 bp große Fragment über ein Gel gereinigt wurde. Das zweite, viel kleinere Fragment, das einen Teil des menschlichen CNTF-Gens codiert, wurde anschließend durch ein 167 bp großes NheI-HindIII-Fragment ersetzt, das durch PCR-Amplifikation des Ratten-Gens unter Verwendung der Primer RAT-III-dniH (SEQ. ID. No. 16): 5'-ACGGTAAGCT TGGAGGTTCTC-3' und RAT-Nhe-I-M (SEQ. ID. No. 17): 5,-TCTATCGGGC TAGCAAGGAA GATTCGTTCA GACCTGACTG CTCTTACG-3' erhalten wurde.
Das Plasmid pRPN228 wurde in gleicher Weise wie pRPN219 konstruiert, wobei allerdings das zum Austausch verwendete 167 bp große Fragment unter Verwendung der DNA-Primer Rat-III-dniH-L-R- (SEQ. ID. No. 18):
5'-AAG GTA CGA TAA GCT TGG AGG TTC TCT TGG AGT CGC TCT GCC TCA GTC AGC TCA CTC CAA CGA TCA GTG-3' und Rat-Nhe-I (SEQ. ID. No. 19):
5'-TCT ATC TGG CTA GCA AGG AAG-3'
amplifiziert wurde.
Die Plasmide pRPN186, pRPN187, pRPN188, pRPN189, pRPN192, pRPN218 und pRPN222 wurden mit ähnlichen Mitteln oder durch direkten Austausch von DNA-Fragmenten unter Verwendung der in Figur 1 gezeigten, nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen erzeugt.
Die Identität aller Plasmide wurde durch Restriktionsanalyse und DNA- Sequenzierung bestätigt.

Proteinaufreinigung

Die Induktion der Proteinsynthese, selektive Extraktion, Solubilisierung und Aufreinigung aus Einschlußkörpern wurden durchgeführt, wie für CNTF von Ratte und Mensch beschrieben (Masiakowski, et al., 1991, id.), wobei allerdings anstelle von Ionenaustausch-Chromatographie oder zusätzlich dazu gelegentlich eine Gelfiltration verwendet wurde. In einer anderen Ausführungsform wurden, wie für andere Proteine beschrieben (Panayotatos, et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 15066-15069), Proteine aus Zellysat-Überständen unter Verwendung von Streptomycin und der Ammoniumsulfat-Fraktionierung und nachfolgende Säulenchromatographie aufgereinigt. Alle Proteine wurden bis zu einer Reinheit von mindestens 60% isoliert.
Die Bedingungen für Enzymreaktionen, DNA-Eiektrophorese und andere in den Untersuchungen angewandte Verfahren sind in Einzelheiten beschrieben worden (Panayotatos, N., Engineering an Efficient Expression System in Plasmids: A Practical Approach (Herausgeber Hardy, K. G.) (1987), S.163-176, IRL Press, Oxford, UK).

Ergebnisse

Die Beweglichkeiten der CNTF-Moleküle von Mensch und Ratte und mehrerer chimärer CNTF-Moleküle in reduzierenden SDS-Polyacrylamid-Gelen sind in Figur 2, gezeigt. Die chimären Moleküle RPN186, RPN189, RPN218 und RPN228 zeigen Beweglichkeiten, die der von Ratten-CNTF vergleichbar sind, während RPN187, RPN188, RPN192 und RPN222 Beweglichkeiten aufweisen, die der von menschlichem CNTF vergleichbar sind. Ein Querverweis dieser Ergebnisse zu den zueinander ausgerichteten Sequenzen dieser Proteine in Figur 1 offenbart, daß alle Proteine, die an Position 63 einen Arginin-Rest (R63) enthalten, die Beweglichkeit von Ratten-CNTF zeigen. Im Fall von RPN2 28 reicht dieser einzige Aminosäure-Austausch (Q63 T R) aus, um menschlichem CNTF die normale Beweglichkeit von Ratten-CNTF zu verleihen.
Anhand Figur 2 kann die Reinheit der verschiedenen rekombinanten Proteine bestimmt werden. Aufgrund einer visuellen Überprüfung ist zu erkennen, daß die Reinheit zwischen 60% für RPN189 und mehr als 90% für RPN228 schwankt.

Beispiel 2. Bestimmung der Bindungsaktivität modifizierter CNTF-Moleküle

Materialien und Verfahren

Herstellung von ¹²&sup5;-J-CNTF

Rekombinanter Ratten-CNTF (28 µg) in 37 µl 0,2 M Natriumboratpuffer, pH 8,5, wurde in ein Gefäß überführt, das 4 mCi (2000 Ci/mMol; NEN) ¹²&sup5;J und ein Reagens (Bolton und Hunter, Biochem. J. 133 (1973), 529-539) enthielt, das unter einem schwachen Stickstoffstrom getrocknet worden war. Die Reaktionen wurden 45 min bei 0ºC und anschließend 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und durch Zugabe von 30 ml 0,2 M Glycin-Lösung beendet. Nach 15 min wurden auch 0,2 ml 0,08% Gelatine enthaltende PBS zugegeben. Zur Abtrennung der markierten CNTF-Monomere von dimeren und anderen multimeren Derivaten ließ man das Gemisch durch eine Superdex-75-Säule (Pharmacia) laufen. Der Prozentsatz des Einbaus lag typischerweise bei 20%, wie durch Dünnschicht- Chromatographie bestimmt wurde, und die spezifische Aktivität lag typischerweise bei etwa 1000 Ci/mMol. Monomerer ¹²&sup5;J-CNTF wurde bei 4ºC aufbewahrt und bis zu einer Woche nach Herstellung verwendet. Um die Unversehrtheit der Struktur und Konformation zu testen, wurde ¹²&sup5;J-CNTF (etwa 10 000 CpM) mit 5 µg unmarkiertem CNTF gemischt und mittels nativer Gelelektrophorese analysiert. Mittels Coomassie-Färbung oder Autoradiographie wurde eine Hauptbande sichtbar. ¹²&sup5;J-CNTF zeigte gegenüber nativem CNTF eine vergleichbare Aktivität bei der Unterstützung des Uberlebens von E8-Hühner-Ziliarneuronen in Kultur.

Gewebekultur-Verfahren

Obere Halsganglia (SCG) neugeborener Ratten wurden mit Trypsin (0,1%) behandelt, mechanisch getrennt und auf einem Polyornithin-Nährboden (30 µg/ml) ausplattiert. Das Wachstumsmedium bestand aus dem Nährstoffgemisch F12 nach Ham, das 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (Hyclone), Nervenwachstumsfaktor (NGF) (100 ng/ml), Penicillin (50 E/ml) und Streptomycin (50 µg/ml) enthielt. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO&sub2; gehalten. Nichtneuronale Ganglion-Zellen wurden durch Behandlung mit araC (10 µM) am 1. und 3.Tag der Kultur beseitigt. Den Kulturen wurden dreimal pro Woche Nährstoffe zugeführt. Sie wurden in einem Zeitraum von zwei Wochen routinemäßig für Bindungstests verwendet.
MG87/CNTFR ist eine Fibroblasten-Zellinie, die mit dem menschlichen CNTFA-Rezeptor-Gen transfiziert wurde (Squinto, et al., Neuron 5 (1990), 757- 766; Davis, et al., Science 253 (1991), 59-63).

Bindungstests

Bindungen wurden direkt an einzelligen Schichten durchgeführt. Die Zellen in den Kulturplatten-Vertiefungen wurden einmal mit Testpuffer gewaschen, der aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4), 0,1 mM Bacitracin, 1 mM PMSF, 1 µg/ml Leupeptin und 1 mg/ml BSA bestand. Nach 2- stündiger Inkubation mit ¹²&sup5;J-CNTF bei Raumtemperatur wurden die Zellen schnell zweimal mit Testpuffer gewaschen, mit 1% SDS enthaltender PBS lysiert und die Anzahl radioaktiver Impulse wurde in einem Packard-Gamma-Zähler bestimmt. Unspezifische Bindung wurde in Gegenwart eines 1000fachen Überschusses an unmarkiertem CNTF bestimmt. Die spezifische Bindung gegenüber MG87/CNTFR betrug 80% - 90%. Die Daten wurden unter Verwendung des GRAPHPAD-Programms (ISI, Philadelphia, PA) analysiert.

Ergebnisse

In Figur 4a sind Kurven zur kompetitiven Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;J- Ratten-CNTF an Ratten-SCG-Neuronen durch gereinigte rekombinante CNTF- Proteine von Mensch und Ratte sowie CNTF RPN219 gezeigt. Sowohl Ratten-CNTF als auch menschlicher CNTF konkurrieren mit Ratten-¹²&sup5;J-CNTF um die Bindung an SCG-Neuronen, wobei menschlicher CNTF (HK&sub5;&sub0; = 25 nM) bei der Verdrängung von Ratten-¹²&sup5;-J-CNTF von der Bindung jedoch 90mal weniger wirksam ist als unmarkierter Ratten-CNTF (HK&sub5;&sub0; = 0,28 nM). Im Gegensatz dazu ist RPN219 fast genauso wirksam wie Ratten-CNTF und deutlich wirksamer als menschlicher CNTF (HK&sub5;&sub0; = 0,3 nM).
Ähnliche Ergebnisse wurden bei Kompetitionsexperimenten mit Maus- Fibroblasten erhalten, die mit einem Plasmid transfiziert worden waren, das die Expression des menschlichen CNTF-Rezeptors steuert (Figur 4b). Sowohl CNTF von Ratte und Mensch als auch RPN228 konkurrieren mit Ratten-¹²&sup5;J-CNTF um die Bindung an MG87/CNTFR-Zellen. Menschlicher CNTF (HK&sub5;&sub0; = 30 nM) ist 12mal weniger wirksam als Ratten-CNTF (HK&sub5;&sub0; = 2,8 nM), während RPN228 deutlich wirksamer ist als das menschliche Protein (HK&sub5;&sub0; = 5,6 nM).
In Figur 1 gezeigte Kompetitions-Bindungsexperimente mit den anderen modifizierten CNTF-Proteinen zeigten auch, daß Proteine mit R63 die biologische Aktivität von Ratten-CNTF aufwiesen, während Proteine mit Q63 die Bindungseigenschaften von menschlichem CNTF besaßen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, daß der einzige Aminosäure-Austausch (Q63 T R) ausreicht, um menschlichem CNTF die für Ratten-CNTF charakteristischen Rezeptorbindungs-Eigenschaften zu verleihen.

Beispiel 3. Bestimmung der biologischen Aktivität modifizierter CNTF-Moleküle

Materialien und Verfahren

Rekombinanter CNTF wurde wie beschrieben (Masiakowski, et al., 1991, id.), an Kulturen von getrennten Hühner-Ziliarganglion (CG)-Neuronen getestet, wobei allerdings überlebende Zellen mit MTT angefärbt wurden (Mosmann, T., J. Immunol. Methods 65 (1983), 55-63).

Ergebnisse

Figur 3 zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven von mit Neuronen angereicherten Kulturen von getrennten E8-Hühnerembryo-Ziliarganglien für aufgereinigte rekombinante CNTF-Proteine von Mensch und Ratte sowie die modifizierten CNTF-Proteine RPN219 und RPN228. In diesem Test läßt sich die biologische Aktivität der chimären Proteine nicht von der von aufgereinigtem Ratten-CNTF unterscheiden und ist deutlich höher als die von rekombinantem menschlichem CNTF. Ein Vergleich der Dosis-Wirkungs-Kurven in Figur 3 zeigt auch, daß die mit RPN219, RPN228 oder Ratten-CNTF erhaltenen maximalen Mengen überlebender Neuronen größer sind als die mit menschlichem CNTF erhältenen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß RPN219 und RPN228 wie Ratten-CNTF gegenüber einer größeren Neuronen-Population aktiv sind als menschlicher CNTF. In parallel durchgeführten Experimenten wurde die biologische Aktivität der anderen in Figur 1 gezeigten modifizierten CNTF- Proteine untersucht. In jedem Fall zeigten modifizierte CNTF-Proteine, die den (Q63 T R)-Austausch enthielten, die biologische Aktivität von Ratten-CNTF, während Proteine mit Q63 die Aktivität von menschlichem CNTF zeigten (Daten nicht gezeigt).
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, daß der einzige Aminosäure-Austausch (Q63 T R) ausreicht, um menschlichem CNTF die biologische Aktivität von Ratten-CNTF zu verleihen.

Beispiel 4. Verwendung modifizierter CNTF-Proteine zur Verhinderung lichtinduzierter Photorezeptor-Schädigungen

Es wurden 2 - 5 Monate alte Albino-Ratten vorn F344- oder vom Sprague- Dawley-Stamm verwendet. Die Ratten wurden 9 oder mehr Tage in einer Umgebung mit zyklischem Lichtregime (12 h angeschaltet: 12 h ausgeschaltet bei einer Beleuchtungsstärke im Käfig von weniger als 25 ft-c) gehalten, bevor sie ständigem Licht ausgesetzt wurden. Die Ratten wurden 1 bis 2 Wochen ständigem Licht bei einer Beleuchtungsstärke von 115 - 200 ft-c ausgesetzt (die meisten Ratten erhielten 125 - 170 ft-c), das von zwei "General Electric"-40 Watt-Fluoreszenzglühbirnen mit "kühlem weißen" Licht und einem weißen Reflektor geliefert wurde, der 60 cm über dem Käfigboden aufgehängt war. Während der Lichtbestrahlung wurden die Ratten in lichtdurchlässigen Polycarbonat-Käfigen mit Drahtstangenabdeckungen aus nichtrostendem Stahl gehalten.
Zwei Tage vor der ständigen Lichtbestrahlung wurde den mit einem Ketamin-Xylazin-Gemisch narkotisierten Ratten 1 µl Ratten-CNTF, menschlicher CNTF oder modifizierter CNTF [hCNTF (Q63 T R)], der in einer Konzentration von 0,1 ng/µl bis 500 ng/µl in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst worden war, intravitreal injiziert. Die Injektionen erfolgten durch Einführung einer 32 Gauge-Nadel durch die Lederhaut, Aderhaut und Netzhaut hindurch etwa in die Mitte zwischen Ora serrata und Augapfeläquator. In allen Fällen erfolgten die Injektionen in die obere Hälfte des Auges.
Unmittelbar nach der ständigen Lichtbestrahlung wurden die Ratten durch eine Überdosis Kohlendioxid getötet. Unmittelbar danach erfolgte eine Vaskularperfusion mit einem Aldehyd-Gemisch. Die Augen wurden in Epoxid- Harz zur Gewinnung von Schnitten mit einer Dicke von 1 µm eingebettet, wobei Schnitte der vollständigen Netzhaut entlang des vertikalen Augenmeridians bereitgestellt wurden. Das Ausmaß der lichtinduzierten Netzhaut- Degeneration wurde durch Beurteilung des Ausmaßes der Rettung des Photorezeptors anhand einer von Pathologen verwendeten Rettungs-Skala von 0 - 4+ quantitativ bestimmt, wobei 4+ maximale Rettung und eine fast normale Netzhaut- Erhaltung bedeutet. Das Ausmaß der Rettung des Photorezeptors in jedem Schnitt, das auf einem Vergleich mit dem Kontrollauge der gleichen Ratte basierte, wurde von vier Personen ausgewertet. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß nicht nur die Dicke der äußeren Körnerschicht (outer nuclear layer, ONL) berücksichtigt wird, sondern auch feinere degenerative Veränderungen in den Innen- und Außenbereichen der Photorezeptoren, ebenso wie räumliche degenerative Gradienten innerhalb des Auges. Zur Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve wurden für jeden Zeitpunkt drei Augen untersucht.

Ergebnisse

Das Ausmaß der Rettung wurde für CNTF-Proteine von Mensch und Ratte sowie hCNTF (Q63 T R) bestimmt. Die Daten zeigten, daß sowohl Ratten-CNTF als auch hCNTF (Q63 T R) eine 10mal höhere Fähigkeit als rekombinanter menschlicher CNTF aufwiesen, im Lichtschädigungs-Modell Photorezeptoren zu retten.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION.
(i) ANMELDER: Panayotatos, Nikos
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Modifizierte ziliare neurotrophe Faktoren
(iii) ANZAHL VON SEQUENZEN. 19
(iv) ANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
(B) STRASSE: 777 Old Saw Mill River Road
(C) STADT: Tarrytown
(D) STAAT: New York
(E) LAND:USA
(F) POSTLEITZAHL 10591
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) TRÄGER-TYP: Diskette
(B) COMPUTER: 1M8-PC-kompatibel
(C) BFTRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Version #1,25
(vi) DERZEITIGE ANMELDUNGS-DATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/959,284
(B) DATUM DER EINREICHUNG: 09. Oktober 1992
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ZUM PATENTANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Dr. Kempler, Gail M.
(B) REGISTRIERNUMMER: 32,143
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
(A) TELEFON: 914-347-7000
(B) TELFAX: 914-347-2113
(2) INFORMATION ZU SEQ. ID. No. 1:
(i) SEQUENZ-MERKMALE
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(ii) MOLEKÜL-TYP: Protein
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(2) INFORMATION ZU SEQ. ID. No. 2:
(i) SEQUENZ-MERKMALE:
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(i) SEQUENZ-MERKMALE:
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(D) TOPOLOGIE: unbekannt
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(2) INFORMATION ZU SEQ. ID. No. 16:
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ACGGTAAGCT TGGAGGTTCT C
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(xi) SEQUENZBESCHRHBUNG: SEQ. ID. No. 17:
TCTATCTGGC TAGCAAGGAA GATTCGTTCA GACCTGACTG CTCTTACG
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(i) SEQUENZ-MERKMALE
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(i) SEQUENZ-MERKMALE:
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(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. No. 19:
TCTATCTGGC TAGCAAGGAA G

Claims

1. Menschlicher ziliarer neurotropher Faktor (CNTF) mit der Modifikation Gln63 T Arg.

2. Modifizierter menschlicher ziliarer neurotropher Faktor (CNTF) nach Anspruch 1, ausgewählt aus RPN 186 (SEQ. ID. No. 6), RPN 189 (SEQ. ID. No. 9), RPN 218 (SEQ. ID. No. 11), RPN 219 (SEQ. ID. No. 12) und RPN 228 (SEQ. ID. No. 15).

3. Isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, das den modifizierten menschlichen CNTF nach Anspruch 1 codiert.

4. Isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, das den modifizierten menschlichen CNTF nach Anspruch 2 codiert.

5. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 3, funktionell verknüpft mit einer Expressionskontrollsequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül.

6. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 4, funktionell verknüpft mit einer Expressionskontrollsequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül.

7. Einzelliger Wirt, transformiert mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6.

8. Einzelliger Wirt nach Anspruch 7, ausgewählt aus Bakterien, Hefen und anderen Pilzen, tierischen Zellen und Pflanzenzellen.

9. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten CNTF-Moleküls, umfassend die Züchtung eines rekombinanten Wirts, der das DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6 enthält, so daß das DNA-Molekül vom Wirt exprimiert wird, und Isolierung des exprimierten ziliaren neurotrophen Faktor- Proteins.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Wirt eine eukaryontische Zelle ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Wirt eine prokaryontische Zelle ist.

12. Arzneimittel, umfassend einen modifizierten menschlichen CNTF nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger.

13. Modifizierter menschlicher CNTF nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren am menschlichen oder tierischen Körper zur Behandlung einer Erkrankung oder einer Störung des Nervensystems.

14. Modifizierter CNTF nach Anspruch 13, wobei die Erkrankung oder Störung eine degenerative Erkrankung ist.

15. Modifizierter CNTF nach Anspruch 13, wobei die Erkrankung oder Störung das Rückenmark betrifft.

16. Modifizierter CNTF nach Anspruch 13, wobei die Erkrankung oder Störung Motoneuronen betrifft.

17. Modifizierter CNTF nach Anspruch 16, wobei die Erkran kung oder Störung Motoneuronen des Nervus facialis betrifft, wie Facialisparese.

18. Modifizierter CNTF nach Anspruch 14, wobei die degenerative Erkrankung amyotrophe Lateralsclerose ist.

19. Modifizierter CNTF nach Anspruch 14, wobei die degenerative Erkrankung ausgewählt ist aus peripherer Neuropathie, Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit oder Chorea Huntington.

20. Modifizierter CNTF nach Anspruch 13, wobei die Erkrankung oder Störung des Nervensystems eine Schädigung des Nervensystems umfaßt.

21. Modifizierter CNTF nach Anspruch 20, wobei die Schädigung durch ein Trauma, einen chirurgischen Eingriff, einen Infarkt, eine Infektion oder Malignität verursacht wird.

22. Modifizierter CNTF nach Anspruch 20, wobei die Schädigung durch Einwirkung eines toxischen Mittels verursacht wird.

23. Modifizierter CNTF nach Anspruch 13, wobei die Erkrankung oder Störung des Nervensystems cholinerge Neuronen betrifft.

24. Modifizierter CNTF nach Anspruch 13, wobei die Erkrankung oder Störung Muskelatrophie umfaßt.

25. Modifizierter CNTF nach Anspruch 24, wobei die Atrophie von einer Denervierung, chronischem Mißbrauch, Stoffwechselbelastung oder Mangelernährung resultiert.

26. Modifizierter CNTF nach Anspruch 24, wobei die Atrophie vom Muskeldystrophiesyndrom, angeborener Myopathie, einer entzündlichen Erkrankung des Muskels oder toxischer Myopathie resultiert.

27. Modifizierter CNTF nach Anspruch 24, wobei die Atrophie von einem Nerventrauma, peripherer Neuropathie, einer Arzneistoff- oder Toxin-induzierten Schädigung oder einer Motorneuronopathie resultiert.

28. Modifizierter CNTF nach Anspruch 13, wobei die Erkrankung oder Störung Zellen des Hippocampus betrifft.

29. Verfahren zum Absuchen für ein menschliches Protein mit erhöhter biologischer Aktivität und/oder Bindungsaffinität, umfassend:

Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit des Wildtyps des menschlichen CNTF-Proteins bei einer SDS- PAGE,

Einführung von Aminosäuresubstitutionen in den Wildtyp des menschlichen CNTF-Proteins,

Vergleich der elektrophoretischen Beweglichkeit des substituierten Proteins mit der elektrophoretischen Beweglichkeit des Wildtyps des CNTF-Proteins, Identifizierung eines substituierten Proteins mit geänderter elektrophoretischer Beweglichkeit verglichen mit der elektrophoretischen Beweglichkeit des Wildtyp-Proteins,

Bestimmung der biologischen Aktivität und/oder Bindungs affinität des identifizierten Proteins.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Aminosäuresequenz, die im Wildtyp des menschlichen Proteins substituiert istl der Aminosäuresequenz eines homologen Proteins einer unterschiedlichen Tierart entspricht.

31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei die Aminosäuresubstituion, die in den Wildtyp des menschlichen CNTF- Proteins eingeführt wird, Gln63 T Arg 63 entspricht.