DE69029934T2

DE69029934T2 - Aus dem gehirn stammender neurotropher faktor

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Publication number: DE69029934T2
Application number: DE69029934T
Authority: DE
Inventors: Ralph Tarrytown Ny 10591 Alderson; Yves-Alain D-8000 Munich 70 Barde; David Liverpool L18 1Jw Edgar; Bastian D-8032 Grafelfing Hengerer; Magdalena D-8000 Munich 2 Hofer; Andreas D-8000 Munich 70 Hohn; Carolyn Pleasantville Ny 10570 Hyman; Joachim D-8035 Gauting Leibrock; Dan D-8000 Munich 60 Lindholm; Ronald M. Briarcliff Manor Ny 10510 Lindsay; Friedrich D-8021 Neuried Lottspeich; Hans F. E. D-8000 Munich 40 Thoenen; George New York Ny 10032 Yancopoulos; Francisco D-8000 Munich 70 Zafra
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-08-30
Filing date: 1990-08-29
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2010-08-30
Also published as: NO911689D0; SK279668B6; SK422990A3; KR100188189B1; EP0440777B1; CN1052142A; ATE148921T1; IL95512A0; EP0440777A1; LV10725A; KR920701432A; IE903128A1; PT95152B; US5229500A; LV10725B; SG46954A1; PT95152A; NO303584B1; FI912104A0; CA2040412C

Description

1. Einführung

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuresequenzen, die den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) codieren, das im wesentlichen gereinigte Protein, Peptidfragmente oder daraus in großen Mengen hergestellte Derivate und Antikörper, die gegen das BDNF-Protein, Peptidfragmente oder Derivate gerichtet sind. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die wirksame Mengen der BDNF- Genprodukte oder alternativ Antikörper, die gegen BDNF-Genprodukte gerichtet sind, umfassen und die Verwendung von BDNF-Genprodukten und Antikörper in Verfahren zur Diagnose und Behandlung einer Reihe von neurologischen Erkrankungen und Störungen, einschließlich der Alzheimer- und Parkinson-Krankheit. Besonders die erfindungsgemäßen BDNF-Genprodukte haben einen Wert bei der Diagnose und Therapie von Erkrankungen der dopaminergen Neuronen wie der Parkinson-Krankheit sowie von Erkrankungen der sensorischen Neuronen und von degenerativen Krankheiten der Augennetzhaut.

2. Hintergrund der Erfindung

2.1. Neuronaler Zelltod und die Rolle von neurotrophen Faktoren bei der Entwicklung des Nervensystems

In vielen Teilen des Nervensystems von Wirbeltieren sind während der frühen Entwicklung wesentlich mehr Neuronen vorhanden, als im ausgewachsenen Tier gefunden werden. Abschnitte der frühen Entwicklung sind durch Schübe von natürlich auftretendem neuronalem Zelltod charakterisiert (Carr und Simpson, J. Comp. Neurol. 182 (1978), 727-740, und Cowan et al., Science 225 (1984), 1258-1265). Das Überleben, die Differenzierung und die Reifung von sich entwickelnden Neuronen können eher durch Umwelt- oder 'epigenetische' Faktoren als durch ein streng inneres genetisches Programm reguliert werden. Experimentelle Manipulationen von Hühnerembryos zeigten beispielsweise, daß eine Transplantation oder Entfernung von peripheren "Zielbereichen" wie einer Extremitätenanlage oder dem Auge in frühen Phasen der Hühnerentwicklung eine entsprechende Erhöhung bzw. Verringerung der Zahl von sensorischen, sympathischen, parasympathischen oder motorischen Neuronen, die zum vergrößerten oder entfernten Zielbereich benachbart sind (Hamburger, 3. Exp. Zool. 68 (1934), 449, Hollyday und Hamburger, 3. Comp. Neurol., 170 (1976), 311-321, und Landmesser und Pilar, 3. Cell. Biol. 68 (1976), 357-374). Ein Zielbereich kann nur eine begrenzte Neuronenzahl unterstützen, und ein normaler Teil des Entwicklungsprozesses kann die Entfernung einer überschüssigen Zahl von Neuronen zur Angleichung an die "neurotrophe" Kapazität des Zielgewebes sein. Die Entdeckung und Isolierung des Proteins, das heute als Nervenwachstumsfaktor (NGF) bekannt ist, führte zu einer molekularen Hypothese darüber, wie ein Ziel die Zahl der Neuronen, die überleben und dieses Gewebe mit Nervenreizen versorgen, regulieren kann (Levi-Montalcini et al., Physiol. Rev. 48 (1968), 524-569, und Thoenen und Barde, Physiol. Rev. 60 (1980), 1284-1335).
Es ist nun zumindest im peripheren Nervensystem gut bekannt, daß neuronale Zielgewebe begrenzte Mengen von verschiedenen neurotrophen Molekülen, die für das Überleben von spezifischen Arten von Neuronen kritisch sind, synthetisieren und freisetzen (Korsching und Thoenen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 3513-3516, Heumann et al., EMBO J. 3 (1984), 3183-3189, Shelton und Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7051-7955, und Korsching und Thoenen, Neurosci. Lett. 54 (1985), 201-205).

2.2 Nervenwachstumsfaktor

Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist bei weitem das am vollständigsten charakterisierte neurotrophe Molekül, und es wurde in vitro und in vivo gezeigt, daß er für das Überleben von sympathischen und von der Neuralleiste stammenden sensorischen Neuronen während der frühen Entwicklung sowohl von Hühnern als auch von Ratten wesentlich ist (Levi-Montalcini und Angeletti, Develop. Biol. 7 (1963), 653-659, und Levi-Montalcini et al., Physiol. Rev. 48 (1968), 524-569). Es wurde festgestellt, daß Injektionen von gereinigtem NGF in den sich entwickelnden Hühnerembryo eine massive Hyperplasie und Hypertrophie von sensorischen und sympathischen Neuronen des Rückenmarks bewirken (Levi-Montalcini und Booker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46 (1960), 373-384, und Hamburger et al., J. Neurosci. 1 (1981), 60-71). Im Gegensatz dazu war die Entfernung oder die Abgrenzung von endogenem NGF durch eine tägliche Injektion von anti-NGF-Antikörpern in neonatale Ratten mit der praktischen Zerstörung des sympathischen Nervensystems verbunden (Levi-Montalcini und Booker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46 (1960), 384-391, und Levi-Montalcini und Angeletti, Pharmacol. Rev. 18 (1966), 619-628). Es wurde gezeigt, daß eine Exponierung gegen NGF- Antikörper noch früher in der Entwicklung entweder durch Antikörperinjektionen in utero oder durch einen passiven transplazentaren Transfer von maternalen Antikörpern einen signifikanten Verlust von von der Neuralleiste stammenden sensorischen Neuronen wie Spinal- und dorsomediale trigeminale sensorische Neuronen zur Folge hat (Goedert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1580-1584, und Gorin und Johnson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5382-5386). Bis vor kurzem konzentrierten sich beinahe alle Untersuchungen von NGF auf seine Rolle im peripheren Nervensystem, es scheint jedoch jetzt, daß NGF auch die Entwicklung und den Erhalt von spezifischen Populationen von Neuronen im zentralen Nervensystem beeinflußt (Thoenen et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109 (1987), 145-178, und Whittemore und Seiger, Brain Res. Rev. 12 (1987), 439-464).
Durch die glückliche Entdeckung von großen Mengen NGF-Protein in der Unterkieferdrüse der ausgewachsenen männlichen Maus (Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46 (1960), 302-311) und eine frühere Entdeckung von großen NGF-Mengen in Schlangengift (Cohen und Levi-Montalcini, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 42 (1956), 571-574) konnten zufällig ausreichende Mengen NGF erhalten werden, um die Physiologie, Proteinchemie und jüngst die Molekularbiologie von NGF (d.h., molekulare Clonierung von NGF und seines Rezeptors) untersuchen zu können. Die Funktion von großen NGF-Mengen in der Speicheldrüse von ausgewachsenen männlichen Mäusen bleibt unbekannt; es scheint jedoch, daß diese reichliche Quelle von NGF keine Rolle bei der Entwicklung oder dem Erhalt des peripheren oder zentralen Nervensystems spielen muß. Es wurde festgestellt, daß in Zielgeweben, die durch NGF-empfindliche Neuronen innerviert sind (Neuronen, deren Überleben nachweisbar von NGF abhängig ist, die nachweisbar NGF-Rezeptoren mit starker Affinität aufweisen und NGF mit hoher Spezifität nachweisbar internalisieren und rückläufig transportieren), die meßbaren NGF-Mengen im Fließgleichgewicht extrem niedrig sind, im Bereich von Picogramm oder Nanogramm pro Gramm Gewebe, im Vergleich zu den tausendmal größeren Mengen im Speicheidrüsengewebe von ausgewachsenen männlichen Mäusen. NGF wurde nicht in merklichen Mengen im Serum gefünden und ist daher anscheinend kein zirkulierender(s) Wachstumsfaktor oder Hormon (Suda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 4042-4046).
Zusätzlich zum wichtigen Auffinden einer Hauptquelle von NGF-Protein in der Unterkieferdrüse der Maus spielte die Entwicklung von empfindlichen, zuverlässigen und effizienten biologischen Tests bei der Aufklärung der Biologie und Biochemie von NGF eine Hauptrolle. Spinalganglien (DRG) des sich entwickelnden Hühnerembryos waren eine der ersten Neuronenarten, von denen gezeigt wurde, daß sie in vitro auf NGF antworten. Explantatkulturen von E8-E12-Hühner-DRG in einem Plasmaklumpen und jüngst mit dissozuerten Neuronen angereicherte Kulturen von Hühner-DRG erwiesen sich in Biotests auf eine NGF-Aktivität als sehr nützlich (z. B. während der Reinigung) und für In vitro-Untersuchungen der NGF-Biologie (Levi- Montalcini et al., Cancer Res. 4 (1954), 49-57, Levi-Montalcini und Angeletti, Develop. Biol. 1 (1963), 653-659, und Greene, Develop. Biol. 58 (1977), 96, ibid 58, S. 106). Die Tatsache, daß mehr als vierzig DRG durch Sezieren von einem einzigen Hühnerembryo erhalten werden können, führte zur weitverbreiteten Verwendung von NGF-Biotests in vielen Laboratorien.
Zusätzlich zur Verfügbarkeit von großen Mengen NGF-Protein und effizienten NGF-Testsystemen ist ein dritter Hauptfaktor, der zum Verständnis der Biologie von NGF wesentlich beigetragen hat, die relative Leichtigkeit, mit der in Meerschweinchen, Kaninchen, Schafen etc. Antikörper gegen NGF erzeugt werden können; es scheint, daß Maus-NGF stark immunogen ist. Cohen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46 (1960), 302- 311) erzeugte Antikörper gegen NGF, die er aus der Unterkieferdrüse von Mäusen gereinigt hatte, und zeigte, zusammen mit Levi-Montalcini und Booker (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46 (1960), 384-391), daß diese Antikörper die Zerstörung von sympathischen Ganglien, oder "Immunsympathektomie", bewirken, wenn sie täglich an neugeborene Ratten verabreicht wurden (Levi-Montalcini und Angeletti, Pharmacol. Rev. 18 (1966), 619-628).
Durch die große Menge von NGF-Protein konnte die Primärsequenz durch relativ bekannte proteinchemische Verfahren ermittelt werden (Angeletti und Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68 (1971), 2417-2420). Das NGF-Gen wurde nun von vielen Arten wie Maus (Scott et al., Nature 302 (1983), 538-540), Mensch (Ullrich et al., Nature 303 (1983), 821-825), Kuh und Huhn (Meier et al., EMBO J. 5 (1986), 1489-1493) und Ratte (Whittemore et al., J. Neurosci. Res. 20 (1988), 402-410) unter Verwendung von im wesentlichen herkömmlichen molekularbiologischen Verfahren auf der Grundlage der verfügbaren Maus-NGF-Proteinsequenz zur Entwicklung von geeigneten Oligonucleotidsonden doniert. Die Verfügbarkeit von reichlich vorhandenem NGF hat ferner Untersuchungen über den NGF-Rezeptor sehr erleichtert, die schließlich zum molekularen Clonieren des NGF-Rezeptors von Mensch und Ratte führten (Johnson et al., Cell 47 (1986), 545-554, und Radeke et al., Nature 325 (1987), 593-597).
Es ist nun gut bekannt, daß NGF kein universeller neurotropher Faktor ist. Innerhalb des peripheren Nervensystems scheint NGF kein überlebenswichtiger Faktor für parasympathische Neuronen, neurale von der Plakode stammende sensorische Neuronen oder enterische Neuronen zu sein, wie sowohl in In vitro- als auch In vivo-Untersuchungen ermittelt wurde. NGF ist ferner anscheinend kein überlebenswichtiger Faktor für die Entwicklung von motorischen Neuronen (Oppenheim, J. Comp. Neurol. 210 (1982), 174-189), obwohl diese Neuronen anscheinend mindestens eine Form des NGF-Rezeptors mit niedriger Affinität während der Entwicklung exprimieren (Raivich et al., EMBO J. 4 (1985), 637-644). Die fehlende Wirkung von NGF auf diese neuronalen Arten löste die Suche nach anderen neurotrophen Faktoren aus, besonders nach Faktoren, die das Überleben der motorischen Neuronen und/oder parasympathischen Neuronen des Rückenmarks des Ziliarganglions unterstützen.

2.3. Weitere neurotrophe Faktoren

Im letzten Jahrzehnt gab es zahlreiche Berichte über die neurotrophe Aktivität in Extrakten einer Vielzahl von Geweben und im konditionierten Kulturmedium von vielen verschiedenen Zelltypen. In beinahe allen Fällen wurde jedoch der Fortschritt bei der Reinigung und Charakterisierung dieser Aktivitäten durch die Tatsache behindert, daß diese Aktivitäten in extrem kleinen Mengen im Bereich von Picogramm bis Nanogramm pro Gramm Gewebe vorhanden sind.
Während geeignete Biotests für periphere Neuronen etabliert wurden, erwies sich jedoch die Entwicklung von zuverlässigen, reproduzierbaren und spezifischen Tests für das zentrale Nervensystem als problematisch. Während einzelne Arten von peripheren Neuronen als diskrete, leicht sezierbare Ganglien vorhanden sind, sind die Neuronen des zentralen Nervensystems (ZNS) immer stark heterogen in ihrer Verteilung. Spezifische Marker sind daher entweder für die Identifikation oder für die Anreicherung von bestimmten Klassen von ZNS-Neuronen erforderlich. Der Fortschritt bei der Produktion von solchen Markern wie Antikörper, die gegen Zelloberflächen- oder Cytoskelettbestandteile gerichtet waren, oder spezifische histologische Färbemittel war sehr begrenzt. Daher erwies sich die Charakterisierung von neurotrophen Faktoren, die (i) nicht so häufig wie NGF sind, (ii) schwierig zu testen sind und (iii) nicht in ausreichenden Mengen zur Erzeugung einer Antikörperproduktion verfügbar sind, als ein außerordentlich schwieriges Verfahren.

2.3.1. Vergleich eines aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) mit einem Nervenwachstumsfaktor

Die neurotrophe Aktivität, die das Überleben von Spinalganglionneuronen des Hühnerembryos in vitro erhalten kann, wurde in dem "konditionierten Medium" identifiziert, in dem Ratten C-6-Gliomzellen gezüchtet wurden (Barde et al., Nature 274 (1978), 818). Die Aktivität wurde nicht durch Antikörper gegen Maus-NGF neutralisiert, was auf die Gegenwart eines weiteren neurotrophen Faktors in dem konditionierten Medium schließen ließ. Ähnliche Aktivitäten, die durch NGF-Antikörper nicht blockiert werden konnten, wurden anschließend in Kulturen von normalen Sternzellen des Gehirns von ausgewachsenen Ratten (Lindsay, Nature 282 (1979), 80-82, und Lindsay et al., Brain Res. 243 (1982), 329-343) und in Extrakten des sich entwickelnden und ausgewachsenen Rattenhirns (Barde et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1199-1203) und des sich entwickelnden und reifen Rückenmarks von Huhn (Lindsay und Peters, Neurosci. 12 (1984), 45-51) beschrieben. In keinem Fall jedoch wurde(n) der(die) aktive(n) Faktor(en) isoliert oder identifiziert, und es bleibt fraglich, ob die beobachteten Aktivitäten auf den(die) gleichen oder verschiedene Faktoren zurückzuführen waren.
Unter Verwendung eines Schweinehirns als Ausgangsmaterial beschrieben Barde et al. (EMBO J. 1 (1982), 549-553, und DE-A-32 13963) einen Faktor, der hier nachstehend als aus dem Gehirn stammender neurotropher Faktor (BDNF) bezeichnet wird, der anscheinend das Überleben von Spinalganglionneuronen von E10/E11- Hühnerembryonen förderte. Es wurde festgestellt, daß die neurotrophe Aktivität in einem stark basischen Protein (isoelektrischer Punkt, pI > 10,1) liegt, das während einer Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gelelektrophorese als einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 12,3 kd wanderte. Der Reinigungsfaktor wurde auf 1,4 x 10&sup6; geschätzt, die Ausbeute war jedoch mit nur etwa 1 µg aus 1,5 kg Schweinehirn gereinigtem BDNF sehr niedrig. Da der letzte Schritt des Reinigungsverfahrens eine präparative Gelelektrophorese war, konnte ferner die Aktivität von BDNF auch aufgrund der Gegenwart eines SDS-Rückstands nicht vollständig renaturiert werden (Barde und Thoenen, "Hormones and Cell Regulation" Bd. 9 (1985), 385-390, Dumont et al., Hrsg., Elsevier Science Publishers). Es wurde bemerkt, daß die stark basische Natur und die Molekulgröße von BDNF dem NGF-Monomer sehr ähnlich waren. BDNF besitzt jedoch anscheinend Eigenschaften, die sich von den bekannten Eigenschaften von NGF dadurch unterschieden, daß (a) im Biotest mit dem Spinalganglion vom Huhn Antikörper gegen NGF keine offensichtliche Wirkung auf die biologische Aktivität von BDNF aufwiesen und (b) die Wirkungen von BDNF und NGF sich anscheinend ergänzten, und (c) festgestellt wurde, daß BDNF im Unterschied zu NGF keine Wirkung auf das Überleben von sympathischen Neuronen von E12-Hühnern aufwies. Bei früheren Untersuchungen an Himextrakten wurde ferner beobachtet, daß die neurotrophe Aktivität in diesen Quellen auf sensorische Neuronen anscheinend in späteren Phasen der Entwicklung als NGF einwirkt. Unter Verwendung von dissozuerten Kulturen von Hühnerembryoneuronen, die auf einem polykationischen Substrat wie Polylysin oder Polyomithin gezüchtet wurden, wurde festgestellt, daß BDNF das Überleben von mehr als 30 Prozent der Spinalganglionneuronen von E10-11-Embryonen (Tag zehn oder elf der Embryoentwicklung) unterstützt, jedoch anscheinend eine geringe Wirkung auf das Überleben der gleichen Neuronen bei E6-Embryonen aufwies (Barde et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1199-1203, a.a.O.). Unter ähnlichen Bedingungen unterstützte NGF das Überleben von 30 bis 40 Prozent von E6-DRG-Neuronen. Es wurde später interessanterweise festgestellt, daß bei einer Züchtung auf einem Substrat, das mit dem extrazellulären Matrix-Glycoprotein Laminin beschichtet ist, sowohl NGF als auch BDNF das Überleben von etwa 50 Prozent von DRG-Neuronen von Hühnerembryonen im Alter E6-E12 unterstützte (Lindsay et al., Develop. Biol. 112 (1985), 319-328). In der letzten Untersuchung wurde festgestellt, daß sich die Wirkungen von NGF und BDNF ergänzten, wenn beide in Sättigungskonzentrationen vorhanden waren.
Frühere Untersuchungen durch Levi-Montalcini (The Harvey Lectures 60 (1966), 217-259) über die neuronale Spezifität von NGF lassen darauf schließen, daß NGF kein universeller neurotropher Faktor selbst für sensorische Neuronen war, da NGF anscheinend keine Wirkung auf Neuronen von bestimmten sensorischen Schädelganglien des Huhns, besonders des unteren Vagusganglions des zehnten Schädelnervs aufweist. Spätere In vivo-Untersuchungen (Johnson et al., Science 210 (1980), 916-918, und Pearson et al., Develop. Biol. 96 (1983), 32-36) zeigten, daß die Entfernung von NGF während der Embryogenese keine Wirkung auf das Überleben von Neuronen in den meisten sensorischen Schädelganglien der Ratte hatte, während eine ähnliche Behandlung die Neuronenzahl in sensorischen Ganglien, die von der Neuralleiste stammten, stark verringerte. Genauere In vitro-Untersuchungen (Lindsay und Rohrer, Develop. Biol. 112 (1985), 30-48, Davis und Lindsay, Develop. Biol. 111 (1985), 62-72, und Lindsay et al., J. Cell. Sci. Suppl. 3 (1985), 115-129) zeigten deutlich, daß NGF das Überleben der meisten von der Neuralleiste stammenden sensorischen Neuronen unterstützt, jedoch keine erkennbare Wirkung auf das Überleben der sensorischen Neuronen des Schädels, die von neuralen Plakoden stammen, aufweist.
Der erste Nachweis einer neuronalen Spezifität von BDNF, die sich von der von NGF unterscheidet, war der In vitro-Nachweis, daß gereinigtes BDNF das Überleben von 40 bis 50% der sensorischen Neuronen, die sich von neuralen von Plakode stammenden unteren Vagusganglion des Hühnerembryos im Alter von E6, E9 oder E12 abtrennen, unterstützt (Lindsay et al., J. Cell. Sci. Supp. 3 (1985), 115-129). NGF war entweder allein oder zusammen mit BDNF ohne eine offensichtliche Wirkung auf diese Neuronen. Es wurde später in Explantatkultur-Untersuchungen gezeigt, daß BDNF anscheinend das Überleben und das Auswachsen von Neunten von anderen neuralen, von der Plakode stammenden sensorischen Ganglien, einschließlich von dem eunteren Glossopharyngeusganglion und dem ventrolateralen trigeminalen Ganglion unterstützt (Davies et al., J. Neurosci. 6 (1986), 1897-1904), von denen festgestellt wurde, daß keines für NGF empfindlich war. In allen vorstehenden Untersuchungen hatten Antikörper gegen NGF keine Wirkung auf die beobachtete Aktivität von BDNF. Es wurde festgestellt, daß BDNF zusätzlich zu seinen Wirkungen auf gezüchtete Neuronen von peripheren Ganglien das Überleben und die neuronale Differenzierung von Zellen, die von der Neuralleiste der Wachtel gezüchtet wurden, stimulierte (Kalcheim und Gendreau, Develop. Brain Res. 41 (1988), 79-86).
Vor der vorliegenden Erfindung verhinderte die Unfähigkeit zur Produktion ausreichender BDNF-Mengen zur Immunisierung die Erzeugung von anti-BDNF- Antikörpern für einen Vergleich mit anti-NGF-Antikörpern auf ihre Wirkung auf neuronale Populationen und schlossen BDNF/NGF-Kreuzneutralisationsexperimente aus. Zwei kürzliche Untersuchungen mit BDNF (Kalcheim et al., EMBO J. 6 (1987), 2871- 2873, und Hofer und Barde, Nature 331 (1988), 261-262) zeigten jedoch eine physiologische Rolle von BDNF in der Vogel-PNS-Entwicklung. Wenn eine mechanische Barriere in ovo zwischen E3/E4-DRG (Spinalganglien am Tag 3 oder 4 der Embryoentwicklung) und ihrem ZNS-Ziel im Neuralrohr plaziert wurde, wurde beobachtet, daß viele DRG-Neuronen abstarben (Kalcheim und Le Douarin, Develop. Biol. 116 (1986), 451-466). Es wurde angenommen, daß dieser neuronale Tod auf das Fehlen eines vom ZNS (Neuralrohr) stammenden neurotrophen Faktors zurückgeht. Es wurde anschließend beobachtet, daß BDNF, der an eine Laminin-beschichtete Silicongummi- Membran gebunden war, diesen Zelltod verhindern konnte (Kalcheim et al., EMBO J. 6 (1987), 2871-2873). Es wurde festgestellt, daß Injektionen von BDNF in sich entwickelnde Wachteleier den natürlich vorkommenden Zelltod bei den unteren Vagusganglien reduzieren, eine Wirkung, die bei NGF nicht beobachtet wurde (Hofer und Barde, Nature 331 (1988), 261-262). Es wurde festgestellt, daß BDNF zusätzlich zu seiner Wirkung auf periphere sensorische Neuronen, die sowohl von der Neuralleiste als auch der neuralen Plakode stammten, das Überleben der sich entwickelnden ZNS-Neuronen unterstützt. Johnson et al. (J. Neurosci. 6 (1986), 3031-3938) präsentieren Daten, die anzeigen, daß BDNF das Überleben von retinalen Ganglionzellen, die von E17- Rattenembryonen gezüchtet wurden, unterstützt. Dies stimmte mit früheren Untersuchungen überein, die zeigten, daß die konditionierten Medien und Hirnextrakte, die aus den Zielbereichen der retinalen Ganglionzellen hergestellt wurden, anscheinend das Überleben dieser Neuronen unterstützen (Mccaffery et al., Ex. Brain Res. 48 (1982), 37-386, Sarthy et al., J. Neurosci. 3 (1983), 2532-2544, und Turner et al., Dev. Brain Res. 6 (1983), 77-83).
Es wurde gezeigt, daß BDNF zusätzlich zu seiner Wirkung auf das Überleben von sich entwickelnden Neuronen in Kultur eine Wirkung auf gezüchtete ausgewachsene Neuronen des peripheren und zentralen Nervensystems aufweist. Es wurde gezeigt, daß BDNF sowie NGF die axonale Regeneration von ausgewachsenen Ratten-DRG- Neuronen in Kultur stimulieren (Lindsay, J. Neurosci. 8 (1988), 2394-2405), obwohl ausgewachsene sensorische Neuronen anscheinend keine neurotrophen Faktoren zu ihrer Aufrechterhaltung in vitro über 3 oder 4 Wochen benötigen. Es wurde ferner beobachtet, daß BDNF in Kulturen der Netzhaut von ausgewachsenen Ratten sowohl das Überleben als auch die axonale Verlängerung von retinalen Ganglionzellen fördert (Thanos et al., Eur. J. Neurosci. 1 (1989), 19-26). Ein Vergleich der biologischen Wirkung von NGF und BDNF ist in Tabelle I dargestellt. Tabelle I Vergleich der biologischen Aktivitäten von BEDNF und NGF*
*in chronologischer Reihenfolge gemäß dem Datum der Veröffentlichung; Wirkung in vitro getestet.
**Kein Überleben: (-); mäßiges Überleben (+); gutes Überleben (++).

2.3.2. Neuronale Ziele des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors

Es wurde festgestellt, daß sensorische Neuronen von peripheren Nervenganglien aus einer von zwei verschiedenen vorübergehenden embryologischen Strukturen hervorgehen, d.h. aus der Neuralleiste und den neuronalen Plakoden. Aus der Neuralleiste gehen anscheinend sowohl Neuronen als auch Satellitenzellen von autonomen Ganglien und sensorischen Ganglien von Rückenmarksnerven, d. h. DRG, hervor. Der Beitrag der Neuralleiste und der neuralen Plakoden zur Bildung von sensonschen Ganglien der Schädelnerven wurde unter Verwendung des Wachtel/Hühner- Chimären-Transplantationssystems, das von Le Douarin entwickelt wurde, untersucht (Le Douarin, Develop. Biol. 20 (1973), 217-222, Noden, Develop. Biol. 67 (1978), 313-329, Narayanan und Narayanan, Anat. Rec. 196 (1980), 71-82, Ayer-Le Lievre und Le Douarin, Develop. Biol. 94 (1982), 291-310, und D'Amico-Maratel und Nodem, Am. J. Anat. 166 (1983), 445-468). Wie von Lindsay et al. zusammengefaßt (J. Cell. Sci. Supp. 3 (1985), 115-129), wird nun zumindest für Vögel angenommen, daß Neuronen der distalen Ganglien der VII., IX. und X. Schädelnerven (Fazialisganglion, Glossopharyngensganglion bzw. unteres Vagusganglion) und Neuronen des vestibubakustischen Komplexes des VIII. Schädelnervs ausschließlich von der neuralen Plakode stammen. Das trigeminale Ganglion des V. Schädelnervs enthält Neuronen sowohl von der Neuralleiste als auch von der Plakode (wobei die von der Plakode stammenden Neuronen im ventrolateralen Pol des maxillomandibulären Lappens vorherrschen), während festgestellt wurde, daß die Satellitenzellen aller Schädelganglien vollständig von der Neuralleiste stammen.
Es wurde in In vitro-Experimenten unter Verwendung von sowohl mit Explantaten als auch mit abgetrennten Neuronen angereicherten Kulturen von sensonschen Neuronen der Rückenmarks- und Schädelnerven festgestellt, daß von der Neuralleiste stammende sensorische Neuronen auf NGF antworten; im Gegensatz dazu wurde beobachtet, daß Neuronen, die von neuralen Plakoden stammen (einschließlich Neuronen des ventrolateralen Teils des trigeminalen Ganglions und der vollständigen neuronalen Population des Scarpa'-Ganglions, Fazialisganglions, unteren Glossopharyngensganglions und des unteren Vagusganglions), während der Embryonalentwicklung im wesentlichen auf NGF nicht antworten. Im Gegensatz zu Unterschieden in der Abhängigkeit nach NGF und der Fähigkeit zur Antwort auf NGF wurde festgestellt (Tabelle I), daß sowohl von der Plakode als auch von der Neuralleiste stammende sensorische Neuronen auf die das Überleben und die Neunten fördernde Aktivität von BDNF antworten (Lindsay et al., J. Cell. Sci. Supp. 3 (1985), 115-129, Lindsay et al., Develop. Biol. 112 (1985), 319-328, Kalcheim und Gendreau, Develop. Brain Res. 41 (1988), 79-86). Tebar und Barde (J. Neurosci. 8 (1988), 3337-3342) untersuchten die Bindungsparameter von radioaktiv-markiertem BDNF an Neuronen von Spinalganglien von Hühnerembryonen; ihre Ergebnisse stimmen mit der Existenz von zwei Klassen von BDNF-Rezeptoren überein, eine mit einer hohen und eine andere mit einer geringen Affinität für BDNF. Es wurden keine Rezeptoren mit hoher Affinität auf sympathischen Neuronen beobachtet.
Die bekannten neuronalen Ziele von BDNF wurden weiter von Barde et al. (Prog. Brain Res. 71 (1987), 185-189) zusammengefaßt. Vor der vorliegenden Erfindung war die Identifizierung von BDNF-synthetisierenden Zellen aufgrund des Fehlens an BDNF-spezifischen Nucleinsäure- oder Antikörpersonden nicht durchführbar. Versuche zur Herstellung entweder von polydonalen oder monodonalen Antikörpern gegen BDNF waren nicht erfolgreich. Dieses Unvermögen zur Erzeugung von Antikörpern verhinderte die molekulare donierung von BDNF, Bestimmung der physiologischen Wirkung in vivo, wenn BDNF den sich entwickelnden Neuronen nicht zur Verfügung steht, Quantifizierung von BDNF in Geweben unter Verwendung eines Immuntests und Lekalisierung von BDNF unter Verwendung der Immuncytochemie.

Tabelle II Überblick über die auf BDNF antwortenden und nicht-antwortenden Neuronen*

* Von Barde et al., Prog. Brain Res. 71 (1987), 185-189
**Vgl. Davies et al., Nature 319 (1986), 497-499

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuresequenzen, die den aus dem Hirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) codieren, das im wesentlichen reine Protein, Peptidfragmente davon und Polypeptide mit BDNF-Aktivität, Antikörper, die gegen dieses BDNF-Protein, Peptidfragmente davon und Polypeptide gerichtet sind. Die vorliegende Erfindung stellt erstmals ausreichende Mengen BDNF bereit, um die Erzeugung von anti-BDNF-Antikörpern zu ermöglichen und um diagnostische und therapeutische Anwendungen von BDNF zu unterstützen.
In verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen BDNF-Nucleinsäuren, Proteine, Peptidfragmente und Polypeptide oder Antikörper in Verfahren zur Diagnose und Behandlung einer Reihe von neurologischen Krankheiten und Störungen und insbesondere zur Diagnose und Behandlung von Kranicheiten der sensorischen Neuronen und der Degeneration der Netzhaut verwendet werden. In spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können BDNF- Nucleinsäuren oder BDNF-Genprodukte ferner zur Diagnose und Behandlung des Neuroblastomtumors, der Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit verwendet werden. BDNF-Genprodukte können ferner zur Erleichterung der Aufnahme von Implantaten in das Nervengewebe oder alternativ zur Förderung der Nervenregeneration nach einer Schädigung durch ein Trauma, einen Infarkt oder eine Infektion oder Postoperativ in weiteren spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die das erfindungsgemäße BDNF- Protein oder -Polypeptid oder alternativ Antikörper, die gegen dieses Protein oder Polypeptid gerichtet sind, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen. Diese können zur Diagnose oder Behandlung einer Reihe von neurologischen Erkrahkungen und Störungen verwendet werden.
Durch Bereitstellung der vollständigen Nucleotidsequenz von BDNF können ferner durch die vorliegende Erfindung BDNF- und NGF-Gene verglichen werden, wobei homologe Bereiche identifiziert und eine BDNF/NGF-Genfamilie definiert wurden.
Die Erfindung liefert daher:
ein im wesentlichen gereinigtes DNA-Moleltül, das eine Sequenz umfaßt, die ein reifes, aus dem menschlichen Hirn stammendes neurotropher Faktor (BDNF)- Protein codiert, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
ein im wesentlichen gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das zu dem vorstehend definierten DNA-Molekül homolog oder komplementär ist, oder eine Subsequenz davon, die ein Polypeptid mit BDNF-Aktivität codiert;
einen Vektor, der eine Nucleinsäure, wie vorstehend definiert, umfaßt;
eine Zelle, die ein DNA-Molekül, wie vorstehend definiert, enthält;
ein Verfahren zur Herstellung des BDNF-Proteins, das die Züchtung einer Zelle umfaßt, wobei das DNA-Molekül in der Wirtszelle exprimiert wird, und die Isolierung des exprimierten BDNF-Proteins;
ein im wesentlichen gereinigtes, isoliertes und nicht-denaturiertes Protein mit einer neurotrophen Aktivität und der folgenden Aminosäuresequenz ein Arzneimittel, das ein im wesentlichen gereinigtes, isoliertes und nicht-denaturiertes Protein, wie vorstehend definiert, oder ein durch ein Verfahren, wie vorstehend definiert, erhaltenes Protein und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt;
einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Derivat davon, der(das) ein wie vorstehend definiertes oder durch ein Verfahren, wie vorstehend definiert, erhaltenes BDNF-Protein oder -Polypeptid, spezifisch erkennt;
einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Derivat davon, wie vorstehend definiert, mit einem nachweisbaren Marker, zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems; und
ein BDNF-Protein, wie vorstehend definiert, oder durch ein Verfahren, wie vorstehend definiert, erhalten, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers wegen einer Krankheit oder Störung des Nervensystems.

3.1. Abkürzungen und Definitionen

BDNF Aus dem Gehirn stammender neurotropher Faktor
hBDNF Menschlicher BDNF
CAT Cholinacetyltransferase
CNS Zentrales Nervensystem
DRG Spinalganglien (Ganglion)
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
NGF Nervenwachstumsfaktor
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerasekettenreaktion
PNS Peripheres Nervensystem
SDS Natriumdodecylsulfat
Tris Tris(hydroxymethyi)aminomethan

4. Beschreibung der Figuren

Figur 1:

Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der Schweine- PräproBDNF-cDNA. Die vollständige Sequenz von zwei überlappenden cDNA-Clonen ist in dieser Figur dargestellt. Die durch Mikrosequenzierung erhaltenen Peptidsequenzen (Tabelle III) sind unterstrichen. Die einzige Consensussequenz für die N-Glycosylierung ist doppelt unterstrichen. Der Beginn der reifen BDNF-Sequenz ist durch einen doppelten Karat markiert.

Figur 2:

Sequenzvergleich zwischen NGF und BDNF. Bereiche mit mehr als zwei an identischen Positionen gefundenen Aminosäuren sind angegeben. Die Sequenzen beginnen mit den ersten Aminosäuren der reifen Proteine und enden mit den letzten Aminosäuren vor den Stopcodons .51 Aminosäuren sind BDNF und den verschiedenen NGFS gemeinsam (Schwarz et al., J. Neurochem. 52 (1989), 1203-1209), einschließlich der 6 Cysteinreste.

Figur 3:

Autoradiogramm von Southern-Blots der mit ³²P-markierten NGF- und BDNF-Sonden hybridisierten, EcoRI-gespaltenen genomischen DNA von Mensch, Affe, Ratte, Maus, Hund, Kuh, Kaninchen, Huhn und Hefe.

Figur 4:

Northem-Blot-Analyse. Von jedem Gewebe wurden 20 µg Gesamt- RNA pro Bahn aufgetragen und mit einer ³²P-markierten cRNA-Maus-BDNF-Sonde hybridisiert. Zu beachten ist, daß ein starkes Signal bei etwa 1,45 kb bei Himgewebe beobachtet werden kann, jedoch kein Signal bei den 7 anderen analysierten Geweben.

Figur 5:

Sequenz von menschlicher BDNF-cDNA und den abgeleiteten Aminosäuresequenz und ein Vergleich von DNA-Sequenzen von Schwein, Ratte und Huhn.

Figur 6:

BDNF-Expressionsplasmid pCMV1-pBDNF.

Figur 7:

(a) Ergebnisse der ELISA-Bestimmung der Bindung von Antiseren an B5-Peptide unter Verwendung von Verdünnungsreihen von Antiseren.
(b) Quantitative Bestimmung der Bindung einer 1: 500-Verdünnung von verschiedenen Antiseren an 50 ng BDNF.

Figur 8:

Ergebnisse der imunhistochemischen Färbung für die Tyrosinhydroxylase in BDNF-behandelten (schraffierte Balken) und Kontroll (einfarbige Balken)-Kulturen des ventralen Mittelhirns.

Figur 9:

Dopamin-Aufnahme durch Kulturen des ventralen Mittelhirns. Mit BDNF versetzte Kulturen sind durch schraffierte Balken angezeigt; Kontrollkulturen sind durch einfarbige Balken wiedergegeben.

Figur 10:

(a) Die Wirkung von BDNF auf eine Reihe von CAT-positiven Zellen in Kulturen von cholinergen Neuronen des Prosencephalons.
(b) Kulturen von cholinergen Neuronen des Prosencephalons bei einer Dichte von 260 000 Zellen pro Vertiefung (einfarbige Balken) oder 150 000 Zellen pro Vertiefung (schraffierte Balken) wurden mit 150 ng/ml NGF behandelt. Die Zahl der CAT-immunpositiven Zellen bei NGF-behandelten und unbehandelten Zellen wurde verglichen.

Figur 11:

Veränderungen des CAT-Enzym-Aktivitätsniveaus in pro Minute katalysiertem Picomol Substrat als Funktion der BDNF-Konzentration in Kulturen von cholinergen Neuronen des Prosencephalons.

Figur 12:

Sternzellkulturen bei einer Konfluenz von etwa 60% wurden entweder mit (a) epidermalem Wachstumsfaktor oder (b) BDNF 42 Stunden behandelt und anschließend mit [³H]-Methylthymidin inkubiert. Die aufgenommene Menge H wurde relativ zur EGF- und BDNF-Konzentration gemessen.

Figur 13:

Southern-Blot von EcoRI-gespaltener Huhn-, Maus- und Ratten- DNA, die mit der BDNF/NGF-Sonde R1B/2C hybridisiert wurde. Die Positionen der genomischen EcoRI-Fragmente von NGF und BDNF sind als N bzw. B angezeigt.

Figur 14:

Sequenzvergleich von NGF und BDNF mit dem neuen Mitglied der BDNF/NGF-Familie, das durch PCR von Maus-DNA mit Box 3/Box 4-Primern identifiziert wurde: Neues Gen [hier als M3/4 bezeichnet], auch als Neurotrophin-3 (NT-3) bekannt, von dem nur die Sequenz des codierenden Strangs gezeigt wird, und die abgeleitete Aminosäuresequenz, die relativ zu reifem Maus-NGF und reifem BDNF von Schwein, Ratte, Maus oder Mensch ausgerichtet ist. Die Pfeile zeigen eine Position an, an der eine Deletion eines Codons in NGF zur Optimierung der Ausrichtung relativ zu BDNF und M3/4 verwendet wurde. Kursivschrift zeigt Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz und/oder konservative Aminosäuresubstitutionen.

Figur 15:

Northern-Blots von RNA von einer Reihe von menschlichen, von Tumoren stammenden Zellinien, die mit einer menschliche BDNF-Sonde hybridisiert wurden.

Figur 16:

Wirkung der Depolarisation von BDNF-mRNA-Niveaus in Hippokampus-Neuronen.
(a) Zeitverlauf der BDNF-mRNA-Expression in primären Kulturen von Hippokampus-Neuronen in Gegenwart von 50 mM KCl. Die gesamte zelluläre RNA wurde aus 0,5 x 10&sup6; Zellen extrahiert, glyoxyliert und durch Elektrophorese auf einem 1,3% Agarosegel analysiert (Biziere, K. und Coyle, T., Neurosci. Lett. 8 (1978), 303, und McGeer et al., Brain Res. 139 (1978), 381). Auf Hybond N-Filter transferierte RNA wurde mit einer ³²P-markierten cRNA-Sonde (spezifische Aktivität: 10&sup9; Cpm/µg) hybridisiert, die für Maus-BDNF spezifisch ist und durch "run-off"-Transkription in vitro hergestellt wird. Die beiden oberen Banden (4 und 1,5 kb) entsprechen der BDNF- mRNA; die beiden Banden für BDNF (4 und 1,5 kb) sind RNAse A-resistent und stellen zwei verschiedene Transkripte dar, die jedoch anscheinend in ähnlicher Weise reguliert werden, und die untere Bande (700 bp) entspricht 10 pg eines kurzen BDNF-mRNA- Ausbeutestandards, der den Proben vor der RNA-Extraktion zugesetzt wurde.
(b) Calciumabhängigkeit. Neuronen wurden 3 Stunden in normalem Kulturmedium (CM), in einem modifizierten Medium ohne Calcium (-Ca) oder in einem Kulturmedium mit 10 µM Nifedipin (NIF) inkubiert. 50 mM KCl wurden bei der Kennzeichnung mit (+K) zugesetzt.

Figur 17:

Erhöhung der NGF-mRNA-Mengen in Hippokampus-Neuronen durch Kalium und Kainsäure. Neuronen wurden 3 Stunden im Kontrollmedium (C) oder in Gegenwart von 50 mM KCl (K+) oder 25 µM Kainsäure (KA) inkubiert. Die RNA wurde extrahiert, und die NGF-mRNA-Mengen wurden durch die quantitative PCR (11) ermittelt. Die Werte sind Durchschnittswerte ± SEM (n=6).

Figur 18:

Dosis-Wirkungs-Kurve der Wirkung der Kainsäure. Hippokampus- Neronen wurden 3 Stunden in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Kainsäure inkubiert. Die RNA wurde extrahiert und, wie in Fig. 16 beschrieben, analysiert. Die Werte stellen Durchschnittswerte ± SEM von drei Experimenten dar.

Figur 19:

Zeitverlauf der Erhöhung der BDNF- und NGF-mRNA-Mengen durch Behandlungen mit Kainsäure. Die gesamte zelluläre RNA wurde, wie in Fig. 16 angezeigt, vom Hippokampus (a) oder Cortex (b) zu den angegebenen Zeiten (in Stunden) nach der intraperitonealen Injektion von Kainsäure (12 mg/kg) extrahiert und analysiert. Eine einzige Dosis Diazepam (10 mg/kg) wurde 90 Minuten nach der Kainsäure injiziert (die beiden Banden für BDNF (4 kb und 1,5 kb) sind RNAse A-resistent und stellen zwei verschiedene Transkripte dar, die jedoch anscheinend in ähnlicher Weise reguliert werden). Werte, die der 1,5 kb BDNF-mRNA (o) und 1,3 kb NGF- mRNA (o) entsprechen, sind dargestellt. Ahnliche Erhöhungen wurden bei der 4 kb BDNF-mRNA beobachtet. Die angegebenen Werte stellen Durchschnittswerte ± SEM von drei bis vier Experimenten dar.

Figur 20:

Wirkung von Antikonvulsiva auf die durch Kainsäure induzierte Expression von BDNF-mRNA. Ratten wurde intraperitoneal Diazepam (10 mg/kg) (DZ), MK-801 (1 mg/kg) (MK) oder Ketamin (20 mg/kg) (KET) 15 Minuten vor der Injektion von Kainsäure (12 mg/kg) (+KA) oder Kochsalzlösung (Kontrollen) injiziert. Drei Stunden später wurde Hippokampus-Gewebe zur Herstellung von Gesamt-RNA, wie in Fig. 16 angegeben, verwendet. Die Werte stellen Durchschnittswerte ± SEM von drei Experimenten dar.

Figur 21:

Septale Zellkulturen.
A-F. Phasenkontrastmikrogramm des Zeitverlaufs des Zellwachstums während der Züchtung. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1,3 x 10&sup5; Zellen/cm² plattiert und in 5 HS/NS, wie im Text beschrieben, gehalten. Die Aufnalhnen wurden nach 1 (A, B), 2 (C, D) und 4 (E, F) Tagen gemacht. Zelltyp-spezifische Marker wurden zur Identifizierung von Zellpopulationen, AChE histochemisch angefärbte Neuronen (G, H) und NGF-Rezeptor immunpositive Neuronen (I), verwendet. Maßstabsbalken = 25 µm.

Figur 22:

Vergleich der Antwort von abgetrennten septalen Zellen auf eine BDNF- oder NGF-Behandlung auf der Basis der AChE-Zellzahlen.
A. Vergleich der Antwort auf BDNF (25 ng/ml), NGF (50 ng/ml) oder die Kombination beider Liganden bei verschiedenen Plattierungsdichten. (B) Vergleich der Antwort von cholinergen Neuronen auf ein Spektrum von BDNF- oder NGF- Konzentrationen (0 bis 50 ng/ml). Die Zellen wurden für diese Ergebnisse über einen Zeitraum von 11 bis 12 Tagen in serumenthaltendem Medium gezüchtet. Die Datenpunkte stellen Durchschnittswerte ± SEM von 6 bis 9 Bestimmungen dar.

Figur 23:

Die Balken zeigen die Wirkung der Verzögerung der Zugabe von BDNF oder NGF zu Kulturen von abgetrennten septalen Zellen. BDNF (50 ng/ml) oder NGF (50 ng/ml) wurde zu Kulturen von abgetrennten Zellen nach einer Verzögerung von 5 bis 6 Stunden (+12), 5 Tagen (-5/+7) oder 7 Tagen (-7/+5) zugesetzt. Die Kulturen wurden 12 Tage gehalten. Die Zellen wurden auf der Basis der AChE-positiven histochemischen Färbung gezählt. Die Ergebnisse sind als Durchschnittswerte ± SEM von 4 bis 5 Messungen ausgedrückt.

Figur 24:

Balkendiagramm, das die Fähigkeit von BDNF oder NGF zur Regulierung der Zahl der NGF-Rezeptor-immunpositiven Zellen zeigt.
Das Immun-"slating" für den NGF-Rezeptor wurde unter Verwendung des monodonalen Antikörpers 192-IgG in einer Verdünnung von 1:1 000 durchgeführt. Die abgetrennten septalen Zellen wurden in einer Dichte von 1,3 x Zellen/cm² plattiert und kontinuierlich über einen Zeitraum von 12 Tagen behandelt. Ein Vergleich wurde zwischen einer Sättigungsdosis von NGF und einem Spektrum von Dosen von BDNF (0 bis 100 ng/ml) durchgeführt. Die dargestellten Ergebnisse sind Durchschnittswerte ± SEM bei n = 4.

Figur 25:

Dosis-Wirkungs-Kurve von septalen cholinergen Neuronen auf CAT-induzierende Aktivitäten von BDNF (A) und NGF (B).
Die Kulturen wurden auf Polyomithin- und Laminin-beschichteten 6 mm- Vertiefungen plattiert und 12 Tage in 5 HS/N3 gehalten. Die Zellen wurden 5 bis 6 Stunden nach der Plattierung gegen BDNF oder NGF exponiert. Die Faktoren wurden alle 3 Tage beim Wechsel des Mediums ausgetauscht. Die dargestellten Ergebnisse geben Durchschnittswerte ± SEM von n = 5 bis 6 Messungen wieder.

Figur 26:

Dosis-Antwort-Wirkung von BDNF und NGF auf die AChE- Enzymaktivität
Septale cholinerge Neuronen von Ratten wurden 12 Tage in Serum-enthaltendem Medium mit hormonalen Zusätzen gezüchtet. Die Zellen wurden mit BDNF (leere Vierecke) und NGF (ausgefüllte Vierecke), wie für Figur 25 beschrieben, behandelt. Die Ergebnisse geben Durchschnittswerte ± SEM von n = 6 bis 9 wieder. Die AChE- Aktivität in den nicht-behandelten Kulturen war 16,4 ± 2 nMol/Std./Vertiefung.

Figur 27:

Zeitverlauf der Erhöhung der durch BDNF induzierten CAT- Enzymaktivität im Vergleich zu NGF.
Die Ermittlung der für die Stimulation der CAT-Aktivität erforderlichen Zeit wurde mit Zellen durchgeführt, die mit einer Dichte von 2,3 x 10&sup5; Zellen/cm² plattiert und über verschiedene Zeiträume in Serum-enthaltendem Medium mit hormonalen Zusätzen und exogenen Faktoren gezüchtet wurden. Die Zellen wurden 5 bis 6 Stunden nach der Plattierung anfänglich gegen BDNF (leere Vierecke) oder NGF (ausgefüllte Vierecke) exponiert. Die Ergebnisse geben die prozentuale Aktivität wider, die in den behandelten Kulturen im Vergleich zu nicht-behandelten Kulturen (n = 6, BDNF 12 Tage n =3) ermittelt wurden.

Figur 28:

Vergleich der Wirkung von Gliazellen auf die Fähigkeit von BDNF zur Induktion der CAT-Enzymaktivität. Septale Zellen wurden mit einer Dichte von 2,3 x 10&sup5; Zellen/cm² plattiert. Nach einem Plattierungszeitraum von 5 bis 6 Stunden wurde das Medium entweder gegen ein serumfreies oder ein serumhaltiges Medium, denen beide 1% N3, wie im Text genauer beschrieben, zugesetzt wurde, ausgetauscht. Cytosinarabinosid (1 µM) wurde 24 Stunden zur weiteren Reduktion der Zahl von Sternzelle zugesetzt. Die Kulturen wurden anschließend 12 Tage gehalten. Die Ergebnisse geben die Durchschnittswerte ± SEM von 4 Messungen wieder.

Figur 29:

Die Balken zeigen die Wirkung der BDNF- oder NGF-Behandlung auf die Menge der Hochaffinitäts-Cholin-Aufnahme. Die Cholinaufnahme wurde mit Zellen durchgeführt, die 11 Tage nach einer Plattierung bei einer Dichte von 1,3 x 10&sup5; Zellen/cm² gehalten wurden. BDNF (50 ng/ml) oder NGF (50 ng/ml) waren während des ganzen Kulturzeitraums vorhanden. Die Meßwerte geben die Durchschnittswerte ± SEM von 5 Messungen für BDNF und 10 für NGF wieder.

Figur 30:

Auftrennung mittels SDS-PAGE von ³&sup5;S-markierten Reaktionsprodukten aus der enzymatischen Spaltung des aus dem menschlichen Gehirn stammenden neurotrophen Faktors durch Trypsin und Endoproteinase Arg-C.

Figur 31:

Graphische Darstellung des DRG-Biotests, in dem der unbehandelte CHO-hBDNF mit dem mit Endoproteinase gespaltenem CHO-hBDNF verglichen wird. Das Auswachsen der Neuriten wird mit 0 und 5 angegeben, wobei die maximale Bioaktivität mit 5 angegeben wird.
Figur 32: Die Phasenkontrast (A)- und Hellfeld-Photomikrogramme (B,C) von abgetrennten Kulturen von ventralen E14-Ratten-Mittelhirnzellen, die nach 9 Tagen in Kultur mit monoclonalen Antikörpern gegen Tyrosinhydroxylase (TH) angefärbt wurden.
A & B. Die Phasenkontrast- und Hellfeld-Photos vom gleichen Feld zeigen ein geringes Vorhandensein von TH+-Neuronen (Pfeile) in diesen Kulturen. Nur ein einziges TH+-Neuron (Pfeile) ist in einem Feld zu sehen, das viele Phasen-helle Neuronen mit langen Neunten enthält. Wenige nicht-neuronale Zellen sind durch ihre Morphologie oder durch GFAP-Anfärbung (nicht dargestellt) sichtbar.
C. Hellfeldphotographie, die zwei TH+-Neuronen (kleine Pfeile) in einem Feld zeigt, das etwa 98 phasenhelle Zellen von neuronaler Morphologie enthält. Maßstabsbalken = 100 1M.

Figur 33:

Stark vergrößerte Mikroaufnahmen von 6 Tage alten Kulturen von ventralen Mittelhirnzellen von E14-Ratten, die die veränderte Morphologie von TH+- Neuronen zeigen, einige mit starkem neuritischem Wachstum und extrem komplizierten Wachstumskegeln (A, B). Kulturen wurden etabliert und gefärbt, wie in der Legende zu Fig. 32 beschrieben. Maßstabsbalken = 25 µM.

Figur 34:

BDNF fördert das Überleben von TH+, dopaminergen Mittelhirnneuronen in Kultur in dosisabhängiger Weise, was in Züchtungszeiträumen von mehr als 3 Tagen erkennbar ist.
A. Vergleich der Zahl von TH+-Neuronen in Kulturen vom ventralen Mittelhirn von E14-Ratten, die mit (ausgefüllte Balken) oder ohne (leere Balken) BDNF gehalten wurden. In den behandelten Kulturen wurde BDNF (50 ng/ml) einmal am Tag 2 der Züchtung zugesetzt. Kein Unterschied zwischen den Kontrollen und den behandelten Kulturen wurde am Tag 3 beobachtet, die Zahl der TH+-Neuronen in BDNF-behandelten Kulturen war 1,8fach höher als in den Kontrollen am Tag 8. Die Werte sind Durchschnittswerte von Zweifachproben.
B. Die Wirkung von BDNF auf die Zunahme des Überlebens von TH+- Neuronen ist von der Dosis abhängig.
Die Zahl an TH+-Neuronen wurde in Zweifachkulturen nach 8 Tagen Züchtung in Abwesenheit von BDNF oder in einem Medium, das am Tag 2 zugesetzte steigende Konzentrationen von BDNF enthielt, ermittelt.
C. NGF besitzt keine Wirkung auf das Überleben von TH+-Neuronen.
Zur Bestinnnung der Spezifität von BDNF wurden die Kulturen auch in Gegenwart oder Abwesenheit von NGF (50 ng/ml) über 8 Tage gezüchtet und auf TH+-Zellen analysiert. Am Tag 2 zugesetztes NGF erhöhte nicht das Überleben von TH+-Neuronen in Kulturen, die entweder am Tag 6 oder am Tag 8 untersucht wurden. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte von Zweifachproben.

Figur 35:

Wiederholte Dosen von BDNF erhöhen ferner das Überleben von TH+-Neuronen bei einem Vergleich mit einer einzigen Zugabe von BDNF am Tag 2.
Die Kulturen wurden, wie im Text beschrieben, hergestellt. Rekombinantes menschliches BDNF wurde aus dem Überstand von COS-M5-Zellen gereinigt. Die Kulturen wurden entweder mit einer einzigen Zugabe (SA; punktierte Balken) von BDNF (50 ng/ml) am Tag 2 oder mit wiederholten Dosen von BDNF (50 ng/ml) an den Tagen 1, 2, 4, 6 und 8 (MA-Mehrfach-Zugaben; einfarbige Balken) oder ohne BDNF (Kontrolle; leere Balken) gezüchtet. Zu den angegebenen Zeiten wurden die Kulturen fixiert und auf eine TH-Immunreaktivität gefärbt. Die mehrfache Zugabe von BDNF bewirkte eine 2,7fach höhere Zahl von TH+-Neuronen am Tag 11 im Vergleich zu den Kontrollen, während die maximale Erhöhung, die bei einer einzigen Zugabe von BDNF beobachtet wurde, nach 11 Tagen etwas weniger als das 2fache war. Die Ergebnisse, die für mehrere Experimente typisch sind, sind Durchschnittswerte von Zweifachproben.

Figur 36:

Eine verspätete Zugabe von BDNF erhöht die Zahl von TH+- Neuronen nicht in dem gleichen Maß, wie es beobachtet wird, wenn BDNF am Tag 2 zugesetzt wird.
Die Kulturen wurden, wie im Text beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme des Zeitpunkts der Zugabe von exogenem BDNF. Alle Kulturen wurden am Tag 2 in serumfreies Medium transferiert, und BDNF (50 ng/ml; BDNF aus Schweinehirn) wurde als einmalige Zugabe entweder am Tag 2, 5 oder 7 (CD2, CD5 oder CD7) zugesetzt. An den Züchtungstagen sechs, acht und zehn wurde die Zahl an TH+-Neuronen in Zweifachkulturen ermittelt. In diesem Experiment bewirkte eine einzige Zugabe von BDNF am Tag 2 eine 3fach höhere Zahl an TH+-Neuronen am Tag 10. Wenn BDNF nach einer Verzögerung am Tag 5 zugesetzt wurde, wurde eine Erhöhung der TH+-Neuronen über die Kontrollen am Tag 10 beobachtet, sie war jedoch weniger als das 2fache, und dieser Unterschied der Zahl der TH+-Zellen zwischen behandelten und Kontrollkulturen vergrößerte sich nicht weiter bei einer längeren Züchtungszeit. Kontrolle: leere Balken; BDNF-Zugabe am Tag 2: punktierte Balken; am Tag 5 zugesetztes BDNF: einfarbige Balken; und am Tag 7 zugesetztes BDNF: diagonal schraffierte Balken.

Figur 37:

Dosisabhängige Wirkung von BDNF auf die Hochaffinitäts-GABA- Aufnahme in Hippokampus-Kulturen. Partiell gereinigter TIBDNF (aus COS-MS- Überständen mit Rotophor gereinigt) wurde den Kulturen in verschiedenen Verdünnungen zugesetzt. Es wurde festgestellt, daß BDNF bei einer Verdünnung von 1 x 10&supmin;² eine maximale Neunten fördernde Aktivität im Spinalganglion von E8-Hühnern aufwies. Die Hochaffinitäts-³H-GABA-Aufnahme wurde nach 8 Tagen BDNF- Behandlung in vitro gemessen.

Figur 38:

BDNF schützt gezüchtete dopaminerge Neuronen der Substantia nigra vor den neurotoxischen Wirkungen von MPP +. Kulturen wurden aus E14- Rattenembryonen hergestellt, wie in Figur 1 beschrieben. Nach 24 Stunden in vitro wurde das Kulturmedium gegen eine serumfreie Formulierung ausgetauscht. Nach 3 Tagen in Kultur wurden die Kulturen in vier Gruppen von sechs 35 mm-Gefäßen aufgeteilt. Eine Gruppe wurde als Kontrollgruppe gehalten und die anderen erhielten entweder (i) den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 10 ng/ml (BFGF aus Rinderhirn; Boehringer-Mannheim); (ii) Maus-NGF, 50 ng/ml, oder (iii) BDNF, 50 ng/ml. Die Kulturen wurden weitere 24 Stunden gehalten, bevor 3 Schalen in jeder Gruppe gegen 1 µM MPP + (Research Biochemicals, Inc., Natick, MA) 48 Stunden exponiert wurden. Am Ende des Experiments nach insgesamt 6 Tagen wurden alle Platten auf eine TH-Immunreaktivität getestet und die Zahl von TH+-Zellen in jeder Gruppe ermittelt. Die dargestellten Ergebnisse geben die Zahl an TH+-Neuronen nach der MPP + -Behandlung wieder, die als Prozentsatz der Zahl von TH+-Neuronen in ähnlichen Kulturen, die nicht gegen MPP + exponiert waren, berechnet wurden. Alle Werte sind Durchschnittswerte ± SEM von dreifachen Kulturen.

5. Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuresequenzen, die den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) sowie das BDNF-Protein, Peptidfragmente und Derivate codieren, die unter Verwendung dieser Nucleinsäuresequenzen in großen Mengen produziert werden. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel und therapeutische Verwendungen von BDNF, dadurch daß zum erstenmal Mittel zur Erzeugung von ausreichenden Mengen von im wesentlichen reinem BDNF zur kliriischen Verwendung bereitgestellt wurde. Die Erfindung betrifft ferner Antikörper, die gegen BDNF oder Fragmente davon gerichtet sind, dadurch daß ein Verfahren zur Erzeugung von ausreichenden Mengen an Immunogen bereitgestellt wird. Durch Ermöglichen eines Vergleichs der Nucleinsäuresequenzen von BDNF und NGF liefert die vorliegende Erfindung ferner die Möglichkeit zur Identifizierung von homologen Bereichen der Nucleinsäuresequenz zwischen BDNF und NGF, wodurch eine BDNF/NGF-Genfamilie definiert wird; die Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von weiteren Mitgliedern dieser Genfamilie bereit.
Zur Erläuterung der Beschreibung und nicht zu ihrer Eingrenzung wird die Erfindung in den folgenden Teilen beschrieben:
(i) Reinigung von BDNF
(ii) BDNF-Biotests
(iii) Mikrosequenzierung des BDNF-Proteins
(iv) Clonierung der BDNF-codierenden DNA
(v) Expression von BDNF
(vi) BDNF-Gene und -Proteine
(vii) Erzeugung von anti-BDNF-Antikörpern
(viii) Identifizierung von weiteren Mitgliedern der BDNF/NGF-Genfamilie
(ix) Verwendung der Erfindung
(x) Arzneimittel

5.1. Reinigung des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors

Zur Identifizierung der BDNF-codierenden Nucleinsäure können Mikrogramm-Mengen von BDNF-Protein aus Gewebe erhalten werden, um die Ermittlung von Aminosäuresequenzen zu ermöglichen, die anschließend zur Entwicklung von Oligonucleotidsonden verwendet werden können. Die extreme Seltenheit des BDNF- Proteins beschränkt praktisch die Menge an Aminosäuresequenz, die zur Ermittlung verwendet werden kann. BDNF kann aus Schweinehirn durch Verfahren, die von Barde et al. (EMBO J. 1 (1982), 549-553) oder Hofer und Barde (Nature 331 (1988), 261- 262) beschrieben werden, hergestellt werden.
BDNF kann vorzugsweise gemäß dem nachstehend genau beschriebenen Protokoll, das erläutern und nicht einschränken soll, hergestellt werden; der Fachmann kann verschiedene Modifikationen verwenden. Aufgrund der Seltenheit von BDNF können vorzugsweise etwa sechs Kilogramm Himgewebe in einem Reinigungsverfahren verwendet werden. Himgewebe kann in Natriumphosphatpuffer mit einer Konzentration von etwa 0,2 M Natriumphosphat und einem pH-Wert von etwa 6, der 1 mM EDTA und 1 mM frisch zugesetztes Phenylmethansulfonylfluorid enthält, so daß das Verhältnis von Himgewebe zu Flüssigkeit etwa 1 kg Hirn zu 2 Liter Puffer ist, homogenisiert werden. Salzsäure kann anschließend zur Einstellung des pH-Werts des Gemisches auf etwa 4 verwendet werden, und das Gemisch kann dann etwa 2 Stunden bei 4ºC gerührt werden. Das Gemisch kann anschließend 25 Minuten bei 20 000 g zentrifugiert werden. Nach der Zentrifugation wird der Überstand gesammelt, unter Verwendung von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von etwa 6,0 eingestellt und anschließend mit etwa 1 Liter vorgequollener Carboxymethylcellulose (pro 6 kg Hirngewebe), die mit 0,1 M Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 6 äquilibriert war, gerührt. Nach mehrmaligem Waschen mit insgesamt etwa 20 Litern von 0,1 M Natriumphosphat, pH 6, kann die Aufschlämmung auf eine Säule gegossen und mit dem gleichen, 0,13 M NaCl enthaltenden Puffer vorzugsweise über Nacht gewaschen werden. Aktive Fraktionen, die durch einen für BDNF empfindlichen Biotest (vgl. Abschnitt 5,2, a.a.O.) identifiziert werden, können anschließend mit 0,5 M NaCl enthaltendem Phosphatpuffer eluiert und dann unter mehrmaligem Wechsel gegen etwa 5 Litern 5 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 6,8 dialysiert werden. Die dialysierten Fraktionen können anschließend auf eine Hydroxyapatitsäule mit einem Bettvolumen von etwa 20 ml für jedes Kilogramm von verarbeitetem Himgewebe aufgetragen werden; die Hydroxyapatitsäule muß mit 5 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 6,8 vor der Verwendung der Probe voräquilibriert werden. Die Säule kann anschließend mit einem linearen Gradienten, der aus 500 ml 5 mM Kaliumphosphat und 500 ml 700 mM Kaliumphosphat, beide bei einem pH-Wert von etwa 6,8, aufgebaut ist, eluiert werden. Die BDNF-Aktivität muß optimalerweise bei etwa 500 mM Kaliumphosphat eluiert werden. Die vereinigten aktiven Fraktionen können anschließend auf eine Endmolarität von etwa 700 mM Kaliumphosphat eingestellt werden und auf eine mit einer Lösung von 700 mM Kaliumphosphat mit einem pH-Wert von 6,8 äquilibrierten Phenylsepharosesäule (mit einem Volumen von etwa 5 ml für jeweils 6 kg verarbeitetes Himgewebe) aufgetragen werden. Nach dem Waschen mit etwa 40 ml des gleichen Puffers kann die BDNF-Aktivität mit 0,1 M Kaliumphosphat, pH 6,8, eluiert werden, und anschließend kann die BDNF-Aktivität gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Material kann anschließend in einem SDS-Gelelektrophorese-Probenpuffer, der 0,1 % SDS, jedoch vorzugsweise kein Mercaptoethanol enthält, aufgenommen und auf ein SDS-Gel, das einen linearen Gradienten von 10 bis 25 % Acrylamid umfaßt, aufgetragen werden. Nach Ende der elektrophoretischen Trennung kann das Gel etwa 10 Minuten mit Coomassie-Blau angefärbt und etwa 20 Minuten entfärbt werden. Eine Bande, die auf der Höhe eines Cytochrom c-Markers wandert, kann ausgeschnitten und elektrophoretisch aus dem Gel eluiert werden. SDS kann im wesentlichen, wie von Weber und Kuter (J. Biol. Chem. 246 (1971), 4504-4509) beschrieben, entfernt werden. Es muß beachtet werden, daß SDS üblicherweise nicht vollständig entfernt wird. Ein Reinigungsverfahren zur Mikrosequenzierung von BDNF wurde gemäß Hofer und Barde (Nature 331 (1988), 261-262) modifiziert und erfordert nicht die Verwendung einer Gelelektrophorese als letzten Reinigungsschritt.

5.2. Biotests auf den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor

Jedes System, das qualitativ oder quantitativ eine BDNF-Aktivität anzeigt, kann erfindungsgemäß verwendet werden. Diese Biotests können zur Identifizierung und/oder Messung der natürlichen oder rekombinanten BDNF-Aktivität verwendet werden.
Jeder im Stand der Technik bekannte Biotest kann verwendet werden. Spinalganglion (DRG)-Neuronen von Hühnerembryonen können beispielsweise in einem BDNF-Test, wie von Barde et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1199-1203) beschrieben, verwendet werden.
Spinalganglien von Hühnerembryonen im Alter von 6 bis 14 Tagen und vorzugsweise Hühnerembryonen im Alter von 10 bis 12 Tagen können beispielsweise unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Sezierverfahren gesammelt werden und sofort einem kleinen Volumen F14-Medium (aus GIBCO F-12-Pulver hergestellt, das gemäß Vogel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 3180-3184, zugesetzt wird) zugesetzt werden, das am Ende der Sezierung gegen eine etwa 0,1 % Trypsin enthaltende, Ca²&spplus;- und Mg²&spplus;-freie, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ausgetauscht wird. Nach etwa 20 Minuten Inkubation bei 37ºC können die Ganglien zentrifugiert und zweimal mit etwa 10% (Vol./Vol.) hitzeinaktiviertes Pferdeserum enthaltendem F14-Medium gewaschen werden. Die Ganglien können dann durch vorsichtiges Zerkleinern (etwa 10 bis 15 Mal ansaugen) unter Verwendung einer silikonbeschichteten Pasteur-Pipette mit kleinem (etwa 1 mm) Durchmesser abgetrennt werden. Zurückbleibende Gewebeklumpen können dann vorzugsweise entfernt werden, indem die Zellsuspension durch ein Nylonsieb mit Poren von etwa 40 µm Größe geleitet wird. Die Zellsuspension kann anschließend etwa 210 Minuten auf einer Gewebekulturschale aus Plastik vorplattiert werden; nach diesem Zeitraum dürften die meisten nicht-neuronalen Zellen an der Plastikoberfläche haften, wobei eine mit Neuronen angereicherte Zellpopulation in der Suspension zurückbleibt. Die Zellen können anschließend auf eine Konzentration von etwa 5 x 10³ Zellen pro Milliliter Plattierungsmedium (vorzugsweise ein F14-Medium, dem 10% (Vol./Vol.) hitzeinaktiviertes Pferdeserum zusammen mit Antibiotika zugesetzt wird) verdünnt und in Gewebekulturschalen, die mit Polyomithin oder vorzugsweise Polyomithin/Laminin beschichtet sind, gegeben werden (vgl. nachstehend).
Alternativ und nicht einschränkend können BDNF-Biotests, die relativ unempfindlich gegen NGF sind, gelegentlich Systemen vorgezogen werden, beispielsweise dem vorstehend beschriebenen DRG-System, die unter bestimmten Bedingungen sowohl auf BDNF als auch NGF antworten. Diese relativ BDNF-spezifischen Systeme schließen retinale Gangliohkulturen ein sowie Kulturen von Neuronen, die von neuralen Plakoden stammen.
Perinatale Retinalzellen können gemäß den von Johnson et al. (J. Neurosci. 6 (1986), 3031-3038) beschriebenen Verfahren gezüchtet werden. Die Retina kann von perinatalen Tieren (bei Ratten betrifft der Begriff "perinatal" hier nachstehend Embryonen im Tag 17 der Embryoentwicklung bis zu postnatalen Jungen 48 Stunden nach der Geburt) entfernt, in Calcium- und Magnesium-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und anschließend in etwa 0,05 % bis 0,1 % Trypsin enthaltendem PBS etwa 15 Minuten bei etwa 37ºC inkubiert werden. Nach der proteolytischen Spaltung kann die Retina in F14-Kulturmedium, das etwa 10% (Vol./Vol.) hitzeinaktiviertes Pferdeserum (F14-HS) enthält, gewaschen werden. Die Retina kann anschließend durch vorsichtiges Pipettieren in einem kleinem Volumen (etwa 1 bis 10 ml) von frischem F14-HS dissoziiert werden. Nicht abgetrenntes Gewebe kann sich absetzen, und die verbleibenden Zellen und das Medium werden zur Züchtung abpipettiert.
Alternativ können BDNF-Biotests, die von der neuralen Plakode stammende Zellen umfassen, erfindungsgemäß verwendet werden. Embryonale Schädelnerven- Explantate von beispielsweise dem ventrolateralen Teil des trigeminalen Ganglions oder dem Scarpa'-Ganglion, dem Fazialisganglion, dem unteren Glossopharyngensganglion oder dem unteren Vagusganglion können in mit Kulturmedium überschichtetem Kollagengel, wie von Davies et al. (J. Neurosci. 6 (1986), 1897-1904) beschrieben, gezüchtet oder gemäß Barde et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1199-1203) abgetrennt werden.
Da beobachtet wurde, daß die Fähigkeit zur Antwort auf BDNF durch Veränderung des Nährsubstrats von Polyomithin zu Laminin-Polyomithin zehnfach erhöht werden kann (Barde et al., Prog. Brain Res. 71 (1987), 185-189), werden BDNF- Tests vorzugsweise mit Laminin-enthaltenden Substraten durchgeführt. Die Kulturoberflächen können beispielsweise durch (i) Beschichten der Kulturoberfläche etwa 8 bis 10 Stunden mit einer sterilen Lösung von Polyomithin, (ii) mehrmaliges Waschen mit sterilem Wasser und (iii) Beschichten der Kulturoberfläche etwa zwei Stunden mit Laminin in einer Konzentration von etwa 25 µg/ml in PBS hergestellt werden (Johnson et al., J. Neurosci. 6 (1986), 3031-3038).
In jedem erfindungsgemäß verwendeten Biotestsystem kann eine BDNF- Dosis-Wirkung-Kurve unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren etabliert werden. Unter Verwendung eines Tests mit abgetrennten sensonschen Ganglien vom Huhn wurde ein halb-maximales Überleben bei einer Konzentration von etwa 5 ng/ml gereinigtem BDNF und ein maximales Überleben bei einer Konzentration von zwischen etwa 10 und 20 ng/ml gereinigtem BDNF beobachtet (Barde et al., Prog. Brain Res. 71 (1987), 185-189).

5.3. Mikrosequenzierung des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktorproteins

Das aus dem Gehirn gewonnene BDNF-Protein kann sequenziert werden; es muß jedoch betont werden, daß es die extreme Seltenheit des Proteins unwahrscheinlich macht, daß ein wesentlicher Anteil der BDNF-Proteinsequenz verläßlich erhalten werden kann. Das Protein kann direkt sequenziert werden oder zunächst durch irgendeine Protease oder eine andere im Stand der Technik bekannte Verbindung, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, Staphylococcus aureus V8, Trypsin und Cyanogenbromid, gespalten werden. Peptide können durch einen automatischen Edman- Abbau unter Verwendung eines Gasphasen-Mikrosequenziergerät gemäß dem Verfahren von Hewick et al. (J. Biol. Chem. 256 (1981), 7990-7997) und Hunkapillar et al. (Methods Enzymol. 91 (1983), 227-236) sequenziert werden. Der Nachweis von Phenylthiohydantoin-Aminosäuren kann anschließend gemäß Lottspeich (Chromatography 326 (1985), 321-327) durchgeführt werden. Überlappende Fragmente der Aminosäuresequenz können ermittelt und zur Ableitung längerer Abschnitte von benachbarten Sequenzen verwendet werden.

5.4. Clonierung von DNA die den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor codiert

Die Seltenheit von BDNF schließt wirksam die Verwendung von Standardstrategien zur Clonierung des BDNF-Gens aus. Wenn beispielsweise verfügbare Proteinsequenzen zur Erzeugung einer komplementären markierten Oligonucleotidsonde verwendet werden und diese Sonde zum Absuchen von cDNA-Banken verwendet wurde, die aus vermutlich BDNF synthetisierendem Gewebe hergestellt werden, ist die Zahl der positiven Clone wahrscheinlich verschwindend gering. Die vorliegende Erfindung betrifft die Clonierung des BDNF-Gens durch eine Kombination von Verfahren, die die Reinigung von geeigneten Mengen BDNF-Protein, Mikrosequenzierung des BDNF-Proteins, Ableitung einer Oligonucleotidsonde, Konstruktion einer cDNA-Bank, Amplifikation auf der Basis der abgeleiteten BDNF- Aminosäuresequenz und schließlich die Selektion auf das BDNF-Gen umfassen. In diesem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet das bevorzugte Amplifikationsverfahren die Amplifikation von Gewebe-Nucleinsäuresequenzen durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science 230 (1985), 1350-1354) zur Vermehrung der Zahl von zur Clonierung verfügbaren BDNF-Sequenzen. Eine genaue Beschreibung des bevorzugten Verfahrens folgt:
Die von gereinigtem BDNF-Protein stammende Aminosäuresequenz kann zur Ableitung der Oligonucleotidprimer zur Verwendung in der Polymerasekettenreaktion verwendet werden. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei mehrere Nucleinsäuretripletts die gleiche Aminosäure spezifizieren, müssen für eine bestimmte Aminosäuresequenz mehrere Oligonucleotide synthetisiert werden, um mehrfache potentielle Nucleotidsequenz-Kombinationen bereitzustellen; die erhaltenen Oligonucleotide werden als degenerierte Primer bezeichnet.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) erfordert Sinnstrang- sowie Anti- Sinnstrang-Primer. Ein der BDNF-Aminosäuresequenz entsprechender degenerierter Oligonucleotidprimer kann daher als Primer für einen DNA-Strang verwendet werden und ein zweiter Primer, der zu einer häufig vorkommenden DNA-Sequenz homolog ist, beispielsweise ein Abschnitt aus Thymidinresten, der durch reverse Transkription des Polyadenosin-Schwanzes von mRNAS erhalten wird, kann als Primer für den zweiten DNA-Strang verwendet werden. Diese Primer können anschließend in der Polymerasekettenreaktion mit einer Nucleinsäure-Matrize verwendet werden, die vermutlich BDNF-codierende Sequenzen enthält, beispielsweise genomische DNA oder vorzugsweise cDNA, die von aus vermutlich BDNF synthetisierendem Gewebe gewonnener mRNA hergestellt wird. Die DNA-Reaktionsprodukte können anschließend durch Elektrophorese analysiert werden, um zu ermitteln, ob das DNA-Reaktionsprodukt eine der erwarteten Größe des BDNF-Gens ähnliche Molekülgröße aufweist, und vorzugsweise durch Nucleotidsequenz-Analyse analysiert werden.
Da jedoch die Verwendung von zwei degenerierten Primern in der PCR die Wahrscheinlichkeit der Amplifikation der kein BDNF codierenden Nucleinsäuresequenzen erhöht, betrifft ein bevorzugtes Verfahren die Verwendung von nur einem degenerierten Primer, wobei der andere Primer der BDNF-Sequenz genau entspricht. Zur Identifizierung der genauen BDNF-Sequenz kann die unter Verwendung des gereinigten BDNF-Proteins ermittelte Aminosäuresequenz zur Entwicklung sowohl von degenerierten Sinn- als auch Anti-Sinn-Oligonucleotidprimem verwendet werden. Das DNA-Reaktionsprodukt, das durch Verwendung dieser Primer in der BDNF-codierenden Nucleinsäure als Matrize verwendenden PCR-Reaktion erhalten wird, muß ein Nucleinsäurefragment sein, das den Abschnitt der Aminosäuren codiert, die zur Entwicklung der Primer verwendet werden, und kann von einer vorhersagbaren Größe sein (z. B. mindestens die Zahl der Aminosäurereste, multipliziert mit dem Faktor drei Basenpaare in der Länge). Die Sequenzanalyse des DNA-Reaktionsproduktes kann mit der ermittelten Aminosäuresequenz verglichen werden, um zu bestätigen, daß die amplifizierte Nucleinsäuresequenz tatsächlich das BDNF-Peptidfragment codieren kann. Obwohl jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren der Nucleinsäuresequenzierung verwendet werden kann, wird vorzugsweise das Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1979), 3918-3921) verwendet. Die Sequenzierung kann unter Verwendung eines gelgereinigten oder vorzugsweise donierten DNA-Reaktionsprodukts erreicht werden. Die Sequenz des DNA- Reaktionsprodukts kann anschließend zur Entwicklung eines Oligonucleotidprimers, der genau der BDNF-codierenden Sequenz entspricht, verwendet werden. Dieser Primer kann anschließend zusammen mit einem zweiten Primer, der degeneriert sein kann, verwendet werden, um die BDNF-Sequenz über die Länge, die durch das anfänglich ermittelte Fragment der genauen Sequenz repräsentiert wird, zu verlängern. Der Sinnstrang-Primer kann beispielsweise, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, der genauen BDNF-Nucleotidsequenz entsprechen, während der Antisinn-Primer ein degenerierter Primer sein kann, der zu einem Sequenzbereich homolog ist, der wahrscheinlich stromabwärts des sequenzierten Fragments, z. B. der in der cDNA revers transkribierte Polyadenosin-Schwanz der mRNA, gefunden wird. Es kann dann die Verwendung eines ähnlichen Verfahrens zur Gewinnung der Sequenz stromaufwärts des sequenzierten Fragments erforderlich sein; der Anti-Sinnstrang-Primer kann beispielsweise genau der BDNF-Nucleotidsequenz entsprechen und der Sinnstrang-Primer kann ein degenerierter Primer sein, der zu einem Bereich der BDNF-Sequenz stromaufwärts des sequenzierten Fragments homolog ist, z.B. ein 5'-Polyadenosin-Schwanz, der dem 5'-Ende der cDNA unter Verwendung der terminalen Desoxynucleotidtransferase angefügt wird. So kann die Sequenz des vollständigen BDNF-Gens oder der mRNA zusammengebaut werden.
Die DNA-Reaktionsprodukte können unter Verwendung von allen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren doniert werden. Zahlreiche auf dem Fachgebiet bekannte Vektor-Wirt-Systeme können verwendet werden. Beispiele für mögliche Vektoren, jedoch ohne Beschränkung darauf, sind Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, das Vektorsystem muß jedoch mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Beispiele für solche Vektoren, jedoch ohne Beschränkung darauf, sind Bakteriophagen wie Lambda-Derivate oder Plasmide wie pBR322-, pUC- oder Bluescript (Stratagene)- Plasmidderivate. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen mittels einer Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation etc. eingeführt werden.
Das BDNF-Gen wird in einen Clonierungsvektor insertiert, der zur Transformation, Tansfektion oder Infektion geeigneter Wirtszellen verwendet werden kann, so daß viele Kopien der Gensequenzen erzeugt werden. Dies kann durch Ligierung des DNA-Fragments in einen Clonierungsvektor, der komplementäre überstehende Enden aufweist, erreicht werden. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen, die zur Fragmentierung der DNA verwendet werden, im Clonierungsvektor nicht vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Es kann sich als vorteilhaft erweisen, Restriktionsendonuclease-Spaltungsstellen in die Oligonucleotidprimer, die in der Polymerasekettenreaktion verwendet werden, zur Erleichterung der Insertion in die Vektoren einzuschließen. Alternativ kann jede gewünschte Stelle durch Ligierung von Nucleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Enden erzeugt werden; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonucleotide, die Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenzen codieren, umfassen. In einem alternativen Verfahren kann der gespaltene Vektor und das BDNF-Gen durch "Homopolymer-Tailing" modifiziert werden.
In spezifischen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die ein isoliertes BDNF-Gen, eine cDNA oder eine synthetisierte DNA-Sequenz einschließen, die Erzeugung von vielen Genkopien. Daher kann das Gen in großen Mengen durch Züchtung von Transformanten, Isolierung der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und gegebenenfalls Wiedergewinnung des insertierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA erhalten werden.
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann nach der Erzeugung eines BDNF-codierenden von cDNA stammenden Clons ein BDNF-codierender genomischer Clon unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren isoliert werden. Eine markierte Nucleinsäuresonde kann beispielsweise vom BDNF-Clon abgeleitet und zur Durchmusterung von genomischen DNA- Banken durch Nucleinsäurehybridisierung unter Verwendung von beispielsweise dem Verfahren, das von Benton und Davies (Science 196 (1977), 180) für Bakteriophagen- Banken und von Grunstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975), 3961- 3965) für Plasmidbanken beschrieben wird, verwendet werden. Gewonnene Clone können anschließend durch Restriktionskartierungs- und den Sequenzierverfahren gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren analysiert werden.
Ferner können weitere cDNA-Clone aus der cDNA-Bank unter Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Sequenzen identifiziert werden.

5.5. Expression des Gens des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors

Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können in einen geeigneten Expressionsvektor, d. h. einen Vektor, der die für die Transkription und Transiation der insertierten Protein-codierenden Sequenz erforderlichen Elemente enthält, insertiert werden. Die erforderlichen Transkriptions- und Translationssignale können auch durch das native BDNF-Gen und/oder seine flankierenden Bereiche geliefert werden. Eine Vielzahl von Wirt-Vektor-Systemen kann zur Expression der Protein-codierenden Sequenz verwendet werden. Diese schließen Säugerzeilsysteme ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die mit einem Virus (z. B. Vaccinia-Virus, Adenovirus etc.) infiziert sind, Insektenzeilsysteme, die mit einem Virus (z. B. Baculovirus) infiziert sind, Mikroorganismen wie Hefe, die Hefevektoren enthalten, oder Bakterien, die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. Je nach verwendetem Wirt-Vektorsystem kann eines einer Reihe von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
Alle zuvor beschriebenen Verfahren zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor können zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die ein chimäres Gen enthalten, das aus geeigneten Transkriptions/Translations- Kontrollsignalen und den Protein-codierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA und synthetische Verfahren und In vivo- Rekombinationen (genetische Rekombinationen) einschließen. Die Expression der das BDNF-Protein oder -Peptidfragment codierenden Nucleinsäuresequenz kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, so daß das BDNF-Protein oder -Peptid in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. Die Expression von BDNF kann beispielsweise durch jedes im Stand der Technik bekannte Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden. Promotoren, die zur Kontrolle der BDNF-Expression verwendet werden können, umfassen, jedoch ohne Beschränkung darauf, den frühen Promotorbereich von SV40 (Bemoist und Chambon, Nature 290 (1981), 304-310), den Promotor, der in der langen terminalen Wiederholung ("long terminal repeat") im 3'-Bereich des Rous-Sarkom-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., Cell 22 (1980), 787-797), den Herpes-Thymidin-Kinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 144-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioningens (Brinster et al., Nature 296 (1982), 39-42), prokaryontische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 3727-3731) oder den tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25), vgl. ferner "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American 242 (1980), 74-94; Pflanzen-Expressionsvektoren, die den Nopalin-Synthetase-Promotorbereich (Herrera-Estrella et al., Nature 303, S.209- 213), oder den 35S-RNA-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (Gardner et al., Nucl. Acids Res. 9 (1981), 2871) und den Promotor für das Photosynthese Enzym Ribulosebiphosphat-Carboxylase (Herrera-Estrella et al., Nature 310 (1984), 115-120) umfassen, Promotorelemente von Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal 4-Promotor, den ADC (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, den PGK (Phosphoglycerinkinase)- Promotor und den alkalischen Phosphatase-Promotor und die nachstehenden tierischen Transkriptions-Kontrollregionen, die eine Gewebespezifit;;t zeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden: den Elastase I-Genkontrollbereich, der in Acinuszellen des Pankreas aktiv ist (Swift et al., Cell 38 (1984), 639-646, Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 (1986), 399-409, und Macdonald, Hepatology 7 (1987), 425-515); den Insulin-Genkontrollbereich, der in Pankreas-beta-Zellen aktiv ist (Hanahan, Nature 315 (1985), 115-122), den Immunglobulin-Genkontrollbereich, der in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., Cell 38 (1984), 647-658, Adames et al., den Kontrollbereich des Brust-Tumor-Virus der Maus, der in testiculären, Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., Cell 45 (1986), 485-495), Albumin- Genkontrollbereich, der in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., Genes and Devel. 1 (1987), 268-276), den Genkontrollbereich des alpha-Fetoproteins, der in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 1639-1648, und Hammer et al., Science 235 (1987), 53-58), den alpha-1-Antitrypsingen-Kontrollbereich, der in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., Genes and Devel. 1 (1987), 161-171), den beta-Globingen- Kontrollbereich, der in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., Nature 315 (1985), 338-340, und Kollias et al., Cell 46 (1986), 89-94), den basischen Myelin-Proteingen- Kontrollbereich, der in Oligodendrocytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., Cell 48 (1987), 703-712), den Kontrollbereich für das Gen der Myosin-leichten Kette-2, der im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, Nature 314 (1985), 283-286) und den Gen- Kontrollbereich des Gonadotropin-freisetzenden Hormons, der im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., Science 234 (1986), 1372-1378).
Expressionsvektoren, die BDNF-Geninsertionen enthalten, können durch drei allgemeine Verfahren identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Gegenwart oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) Expression von insertierten Sequenzen. Im ersten Verfahren kann die Gegenwart eines in einen Expressionsvektor insertierten Fremdgens durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die zu einem insertierten BDNF-Gen homologe Sequenzen umfassen, nachgewiesen werden. Im zweiten Verfahren kann das rekombinante Vektor/Wirt-System auf der Basis der Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter "Marker" gen-Funktionen (z. B. Thymidinkinase-Aktivität, Antibiotikaresistenz, Transformationsphänotyp, Bildung von Einschlußkörpem (occlusion body) in Baculoviren etc.), die durch Insertion von Fremdgenen in den Vektor verursacht werden, identifiziert und selektiert werden. Bei Insertion des BDNF-Gens in der Markergensequenz des Vektors können beispielsweise die die BDNF-Insertion enthaltenden Rekombinanten durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Im dritten Verfahren können die rekombinanten Expressionsvektoren durch einen Test auf das durch die Rekombinante exprimierte Fremdgenprodukt identifiziert werden. Diese Tests können beispielsweise auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des BDNF-Genprodukts in Biotestsystemen, wie vorstehend in Abschnitt 5.2. beschrieben, beruhen.
Nach der Identifizierung und Isolierung eines bestimmten rekombinanten DNA-Moleküls können mehrere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zu seiner Vermehrung verwendet werden. Nach der Etablierung eines geeigneten Wirtssystems und von geeigneten Wachstumsbedingungen können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in Mengen hergestellt werden. Wie vorstehend beschrieben schließen die verwendbaren Expressionsvektoren, jedoch ohne Beschränkung darauf, die nachstehenden Vektoren oder ihre Derivate ein: menschliche oder tierische Viren wie das Vaccinia- Virus oder das Adeno-Virus, Insekten-Viren wie das Baculo-Virus, Hefevektoren, Bakteriophagen-Vektoren (z. B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
Ferner kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Genprodukt in der gewünschten spezifischen Weise prozessiert. Die Expression, ausgehend von bestimmten Promotoren, kann in Gegenwart von bestimmten Induktoren erhöht werden; die Expression des gentechnisch konstruierten BDNF-Proteins kann daher kontrolliert werden. Ferner haben verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationale und posttranslationale Prozessierung und Modifikation (z. B. Glycosylierung und Spaltung) der Proteine. Geeignete Zellinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdgens sicherzustellen. Die Expression in einem bakteriellen System kann beispielsweise zur Produktion eines nicht-glycosylierten Kernproteinprodukts verwendet werden. Die Expression in Hefe produziert ein glycosyliertes Produkt. Eine Expression in Säugerzellen kann verwendet werden, um eine "native" Glycosylierung des heterologen BDNF-Proteins sicherzustellen. Verschiedene Vektor/Wirt-Expressionssysteme können ferner Prozessierungsreaktionen wie eine proteolytische Spaltung in unterschiedlichem Maß bewirken.
In einer spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann PräproBDNF codierende DNA in das pCMV-Plasmid doniert, amplifiziert und anschließend zur Transfektion von COS-Zellen durch das Calciumphosphatverfahren verwendet werden (Chen und Okayama, Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 2745-2752); die BDNF-Aktivität kann anschließend aus dem Zellkulturmedium gewonnen werden (vgl. beispielsweise den nachstehenden Abschnitt 10).

5.5.1. Identifizierung und Reinigung des exprimierten Genprodukts

Nach der Identifizierung einer das BDNF-Gen exprimierenden Rekombinante muß das Genprodukt analysiert werden. Dies kann durch Tests, die auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Produkts beruhen, erreicht werden.
Nach seiner Identifizierung kann das BDNF-Protein durch Standardverfahren wie Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und nach Größe trennender Säulenchromatographie), Zentrifugation oder differentielles Lösen oder durch ein beliebiges anderes Standardverfahren zur Reinigung von Proteinen isoliert und gereinigt werden. Die funktionellen Eigenschaften können unter Verwendung eines beliebigen bekannten BDNF-Tests ermittelt werden, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, Spinalganglien von Hühnerembryonen, retinaler Zellen von perinatalen Ratten oder neuraler von der Plakode stammender Neuronen.
Wichtig ist, daß Verfahren, die zur Herstellung von BDNF aus Himgewebe verwendet werden, da sie als letzten Schritt die präparative Gelelektrophorese enthalten, BDNF produzieren würden, das aufgrund der Gegenwart von restlichem SDS nicht vollständig aktiv ist (Barde und Thoenen, "Hormones and Cell Regulation" Bd. 9 (1985), 385-390, Dumont et al., Hrsg., Elsevier Science Publishers). Im Gegensatz dazu erlaubt die vorliegende Erfindung die Isolierung von BDNF, das von rekombinanten Nucleinsäuremolekülen hergestellt wird und frei von SDS ist und daher die vollständige Aktivität aufweist. Die erfindungsgemäßen anti-BDNF-Antikörper (wie der Antikörper, der gegen das B5-33-Aminosäurefragment von Schweine-BDNF gerichtet und nachstehend in Abschnitt 11 beschrieben ist) können beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, zur Gewinnung von rekombinantem BDNF durch Immunpräzipitation oder Affinitätschromatographie verwendet werden, wodurch Detergens-freies, vollständig aktiver BDNF produziert wird.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann PräproBDNF unter Verwendung von beispielsweise Endoproteinase Arg-C in aktiven reifen BDNF enzymatisch umgewandelt werden (vgl. beispielsweise nachstehenden Abschnitt 17).

5.6. Aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktorproteine und -gene

Unter Verwendung der vorstehend und in den Beispielabschnitten 6 und 9, nachstehend, genau beschriebenen Verfahren wurden die folgenden Nucleinsäuresequenzen ermittelt und ihre entsprechenden Aminosäuresequenzen abgeleitet. Die Schweine-BDNF-cDNA-Sequenz wurde ermittelt und ist in Figur 1 dargestellt. Die menschliche genomische cDNA-BDNF-Sequenz wurde ermittelt und ist in Figur 5 dargestellt, die ferner DNA-Sequenzen vom Schwein, von der Ratte und vom Huhn zeigt. Jede dieser Sequenzen oder ihre funktionellen Äquivalente können erfindungsgemäß verwendet werden. Die Erfindung betrifft ferner BDNF-Gene und - Proteine, die aus Schwein, Rind, Katze, Vogel, Pferd oder Hund sowie Primatenquellen und jeder anderen Art, in der eine BDNF-Aktivität vorkommt, isoliert werden. Die Erfindung betrifft ferner Subsequenzen von mindestens zehn Nucleotide umfassenden BDNF-Nucleinsäuren, wobei diese Subsequenzen hybridisierbare Teile der BDNF- Sequenz umfassen, die z. B. in Nucleinsäure-Hybridisierungstests und Southern- und Northern-Blot-Analysen etc. verwendet werden. Die Erfindung betrifft ferner das BDNF-Protein und Fragmente und Derivate davon gemäß den Aminosäuresequenzen, die in den Figuren 1 und 5 dargestellt sind, oder ihren funktionellen Äquivalenten. Die Erfindung stellt ferner Fragmente oder Derivate von BDNF-Proteinen bereit, die (eine) antigene Determinante(n) umfassen oder funktionell aktiv sind. Wie hier verwendet meint funktionell aktiv den Besitz einer positiven Aktivität in Tests auf eine bekannte BDNF-Funktion, z.B. in Hühnerembryo-DRG-Tests.
Die in den Figuren 1 und 5 dargestellten Nucleinsäuresequenzen können beispielsweise durch funktionell äquivalente Moleküle liefernde Substitutionen, Additionen oder Deletionen verändert werden. Aufgrund der Degeneration der Nucleotide codierenden Sequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz, wie in den Figuren 1 und 5 dargestellt, codieren, zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Nucleotidsequenzen ein, die die vollständigen oder Teile der in den Figuren 1 und 5 dargestellten BDNF-Gene umfassen, und die durch Substitution von verschiedenen Codons, die einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest innerhalb der Sequenz codieren, verändert sind, wodurch eine stille Veränderung erhalten wird. In ähnlicher Weise schließen die erfindungsgemäßen BDNF-Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, jedoch ohne Beschränkung darauf, diejenigen ein, die als primäre Aminosäuresequenz die vollständige oder einen Teil der Aminosäuresequenz, die im wesentlichen wie in den Figuren 1 und 5 dargestellt ist, enthalten, einschließlich der veränderten Sequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste innerhalb der Sequenz eingetauscht werden, wodurch eine stille Veränderung erhalten wird. Eine oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz können beispielsweise durch eine andere Aminosäure mit einer ähnlichen Polarität substituiert werden, die als ein funktionelles Äquivalent wirkt, wodurch eine stille Veränderung erhalten wird. Die eingetauschten Aminosäuren für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können von anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren schließen beispielsweise Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Auch in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen sind BDNF-Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, die während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziert werden, z. B. durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden etc.
Ein bestimmter BDNF kann ferner in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu erzeugen und/oder zu zerstören oder um Variationen in codierenden Bereichen zu erzeugen und/oder neue Restriktionsstellen zu bilden oder zuvor existierende zu zerstören, um eine weitere In vitro-Modifikation zu erleichtern. Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Mutageneseverfahren kann verwendet werden, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, der ortsspezifischen In vitro-Mutagenese (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253 (1978), 6551), der Verwendung von TAB -Linkern (Pharmacia) etc.

5.7. Erzeugung von Antikörpern. die gegen den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor gerichtet sind

Das erfindungsgemäße BDNF-Protein, -Peptidfragmente oder -Polypeptide können erfindungsgemäß als Immunogene zur Erzeugung von anti-BDNF-Antikörpern verwendet werden. Frühere Versuche zur Produktion einer anti-BDNF-Immunantwort waren nicht erfolgreich, möglicherweise aufgrund der kleinen Mengen an verfügbarem gereinigtem BDNF. Durch Bereitstellung der Produktion von relativ großen Mengen an BDNF-Protein unter Verwendung von Rekombinationsverfahren zur Proteinsynthese (auf der Basis der erfindungsgemäßen BDNF-Nucleinsäuresequenzen) wurde das Problem von unzureichenden Mengen von BDNF beseitigt.
Zur weiteren Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Erzeugung einer anti- BDNF-Immunantwort kann die Aminosäuresequenz von BDNF analysiert werden, um Teile des Moleküls zu identifizieren, die mit erhöhter Immunogenität assoziiert sind. Die Aminosäuresequenz kann beispielsweise einer Computeranalyse unterzogen werden, um Oberflächenepitope zu identifizieren, gemäß dem Verfahren von Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 3824-3828), das zur Identifizierung der antigenen Peptide des Hepatitis B-Oberflächenantigens erfolgreich verwendet wurde. Alternativ könnten die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von BDNF von verschiedenen Spezies verglichen und relativ nicht-homologe Bereiche identifiziert werden; es ist wahrscheinlicher, daß diese nicht-homologen Bereiche für verschiedene Spezies immunogen sind.
Zur Herstellung von gegen BDNF gerichteten monodonalen Antikörpern kann jedes Verfahren, das die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur bereitstellt, verwendet werden. Das Hybridomverfahren, das ursprunglich von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495-497) entwickelt wurde, sowie das Triomverfahren, das menschliche B-Zell-Hybridomverfahren (Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72) und das EBV-Hybridomverfahren zur Produktion von menschlichen monodonalen Antikörpern (Cole et al., "Monodonal Antibodies and Cancer Therapie", Alan R. Liss, Inc., (1985), S. 77-96) und ähnliche sind im Schutzbereich der Erfindung.
Die monodonalen Antikörper zur therapeutischen Verwendung können menschliche monodonale Antikörper oder chimäre monodonale Mensch-Maus (oder andere Arten)-Antikörper sein. Die menschlichen monodonalen Antikörper können durch ein beliebiges der auf dem Fachgebiet bekannten zahlreichen Verfahren hergestellt werden (z. B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 7308-7312, Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72-79, und Olsson et al., Meth. Enzymol. 92 (1982), 3- 16). Chimäre Antikörpermoleküle, die eine Maus-Antigen-bindende Domäne mit menschlichen konstanten Bereichen enthalten, können hergestellt werden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851, und Takada et al., Nature 314 (1985), 452).
Verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Produktion von polydonalen Antikörpern gegen Epitope von BDNF verwendet werden. Zur Produktion des Antikörpers können verschiedene Wirtstiere, einschließlich Kaninchen, Mäuse, Ratten etc., jedoch ohne Beschränkung darauf, durch Injektion von BDNF- Protein oder Fragmenten oder Derivaten davon immunisiert werden. Verschiedene Adjuvantien können zur Erhöhung der Immunantwort je nach Wirtsart verwendet werden, einschließlich (vollständigem oder unvollständigem) Freundschem-Adjuvans, Mineralgelen wie Aluminiumhydroxid, grenzflächenaktiven Mitteln wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, KLH ("keyhole limpet"- Hämocyanine), Dinitrophenol und potentiell nützliche menschliche Adjuvanzien wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum, jedoch ohne Beschränkung darauf.
Ein molekülarer Clon eines Antikörpers gegen ein BDNF-Epitop kann durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Das DNA-Rekombinationsverfahren (vgl. z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) kann zur Konstruktion von Nucleinsäuresequenzen, die ein Molekül eines monoclonalen Antikörpers oder einen Antigen-bindenden Bereich davon codieren, verwendet werden.
Antikörpermoleküle können durch bekannte Verfahren, z. B. Immunabsorptions- oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) oder eine Kombination davon etc., gereinigt werden.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Verfahren erzeugt werden. Diese Fragmente schließen beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, ein: das F(ab')&sub2;-Fragment, das durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls produziert werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments erzeugt werden können, und die 2 Fab oder Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
Beispielabschnitt 11 beschreibt die Herstellung von polydonalen Antiseren, die gegen das B5-33-Peptidfragment des BDNF-Proteins gerichtet sind.

5.8. Nutzen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Nucleinsäuresequenz von BDNF und das im wesentlichen reine Protein, Peptidfragmente davon oder davon hergestellte Polypeptide mit einer BDNF-Aktivität. BDNF kann erstmals in für diagnostische und therapeutische Verwendungen ausreichenden Mengen produziert werden. In ähnlicher Weise können anti-BDNF-Antikörper, die ebenfalls erstmals als Konsequenz der Erfindung verfügbar sind, und BDNF-Nucleinsäuresonden zu diagnostischen und therapeutischen Verwendungen verwendet werden. Für die meisten Zwecke wird die Verwendung von BDNF-Genen oder Genprodukten von der gleichen Art für diagnostische oder therapeutische Zwecke bevorzugt, obwohl die Verwendung von BDNF in anderen Arten in spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen nützlich sein kann.

5.8.1. Diagnostische Verwendungen

Die vorliegende Erfindung, die Nucleinsäuren, die BDNF codieren und Proteine, Peptidfragmente oder daraus hergestellte Polypeptide mit einer BDNF- Aktivität, sowie gegen sie gerichtete Antikörper können zur Diagnose von Krankheiten und Störungen des Nervensystems verwendet werden, die mit Veränderungen des Musters der BDNF-Expression zusammenhängen können.
In verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können BDNF- Gene und verwandte Nucleinsäuresequenzen und Subsequenzen, die komplementäre Sequenzen einschließen, für diagnostische Hybridisierungstests verwendet werden. Die BDNF-Nucleinsäuresequenzen oder Subsequenzen davon, die etwa 15 Nucleotide umfassen, können als Hybridisierungssonden verwendet werden. Hybridisierungstests können zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder Überwachung von Zuständen, Störungen oder Erkrahkungszuständen im Zusammenhang mit Veränderungen der BDNF-Expression verwendet werden, die besonders Zustände einschließen, die eine Schädigung von sensorischen Neuronen und eine Degeneration von retinalen Neuronen bewirken. Diese Krankheiten und Zustände schließen ZNS-Trauma, Infarktbildung, Infektion, degenerative Nervenkrankheit, Malignität oder postoperative Veränderungen, die jedoch ohne Beschränkung darauf die Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea und degenerative Erkrahkungen der Netzhaut einschließen, ein, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein. Die Gesamt-RNA in einer Gewebeprobe eines Patienten kann beispielsweise auf die Gegenwart von BDNF-mRNA getestet werden, wobei die Abnahme der Menge von BDNF-mRNA die neuronale Degeneration anzeigt. Relativ große Mengen an BDNF-mRNA wurden in Neuroblastom-Tumorzellen identifiziert (nachstehend in Abschnitt 14 genau beschrieben); in einer spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann daher der Nachweis von erhöhten Mengen an mRNA unter Verwendung von BDNF-Nucleinsäuresonden zur Diagnose des Neuroblastomtumors verwendet werden. Die extrem geringen Mengen an BDNF, die von den meisten Geweben synthetisiert werden, machen BDNF-mRNA zu einem besonders nützlichen Tumormarker.
In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Antikörper, die gegen das BDNF-Protein, Peptidfragmente oder Derivate gerichtet sind, zur Diagnose von Krankheiten und Störungen des Nervensystems, einschließlich besonders der sensorischen Störungen und degenerativen Krankheiten der Retina sowie der vorstehend aufgeführten Störungen und Krankheiten, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper können beispielsweise in In situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Gewebeproben, die von einem diese Untersuchung benötigenden Patienten erhalten werden, verwendet werden. In einem weiteren Beispiel können die erfindungsgemäßen Antikörper in ELISA-Verfahren zum Nachweis und/oder zur Messung der in Gewebe- oder Flüssigkeitsproben vorhandenen BDNF-Mengen verwendet werden; in ähnlicher Weise können die erfindungsgemäßen Antikörper in einer Western-Blot-Analyse zum Nachweis und/oder zur Messung von in Gewebe- oder Flüssigkeitsproben vorhandenem BDNF verwendet werden. Ein erfindungsgemäßer Antikörper, der im ELISA und in Western-Blots an BDNF bindet, ist nachstehend in Abschnitt 11 beschrieben.
In weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen können das BDNF- Protein, Peptidfragmente oder erfindungsgemäße Polypeptide zur Diagnose von Krankheiten und Störungen des Nervensystems verwendet werden. In einer besonderen Ausführungsform, jedoch ohne Beschränkung darauf, können das markierte BDNF- Protein oder markierte Peptidfragmente zur Identifizierung von Geweben oder Zellen verwendet werden, die den BDNF-Rezeptor exprimieren, um Fehler der BDNF- Rezeptorexpression und damit potentielle Abnormalitäten in der Gewebe- oder Zellantwort auf BDNF zu identifizieren.

5.8.2. Therapeutische Verwendungen

Die vorliegende Erfindung, die BDNF-codierende Nucleinsäuren und BDNF- Protein, Peptidfragmente davon und daraus hergestellte Polypeptide mit BDNF-Aktivität sowie gegen sie gerichtete Antikörper betrifft, kann zur Behandlung von Krankheiten und Störungen des Nervensystems, die mit Veränderungen im Muster der BDNF- Expression zusammenhängen oder von der Exposition gegen BDNF oder anti-BDNF- Antikörpern profitieren, verwendet werden.
In verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen können das BDNF- Protein, Peptidfragmente oder Derivate an Patienten verabreicht werden, bei denen das Nervensystem durch ein Trauma, Operation, Ischämie, Infektion, metabolische Erkrahkung, Nährstoffmangel, Malignität oder toxische Wirkstoffe beschädigt wurde.
Die Erfindung kann besonders zur Behandlung von Zuständen, in denen sensorische Neuronen oder retinale Ganglionzellen geschädigt wurden, durch Verabreichung von wirksamen therapeutischen Mengen von BDNF-Protein, Peptidfragmenten oder Derivaten verwendet werden. BDNF kann den geschädigten sensorischen Neuronen lokal verabreicht werden, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, der Neuronen der Spinalganglien oder in einem der folgenden Gewebe: dem Fazialisganglion, dem unteren Glossopharyngensganglion, dem unteren Vagusganglion, dem vestibuloaküstischen Komplex des VIII. Schädelnervs, dem ventrolateralen Pol des maxillomandibulären Lappens des trigeminalen Ganglions und dem oberen Trigeminuskem. Es kann wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen BDNF-verwandten Peptide und Polypeptide oder das BDNF-Protein durch Adsorption an eine Membran, z. B. eine Silicongummi- Membran, die in der Nähe des geschädigten Nervs implantiert werden könnte, zu verabreichen. Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise auch zur Beschleunigung der Genesung von Patienten, die an diabetischen Neuropathien, z. B. Mononeuropathiemultiplex, leiden, verwendet werden. In weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen können das BDNF-Protein, Peptidfragmente oder erfindungsgemäße Polypeptide zur Behandlung von kongenitalen Zuständen oder neurodegenerativen Störungen verwendet werden, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krabkheit, Parkinson-Plus-Syndrome (bei denen die Parkinson-Symptome durch die Degeneration der dopaminergen Neuronen bewirkt werden) wie der Progressiven Supranucleären-Lähmung (Steele-Richardson-Oiszewski- Syndrom), olivopontozerebellären Atrophie (OPCA), Shy-Drager-Syndrom (Mehrfachsystem-Atrophie), der Guamanian-Parkinsonismus-Demenz-Komplex und Huntington- Chorea; die Erfindung kann besonders zur Behandlung von kongenitalen oder neurodegenerativen Störungen verwendet werden, die mit einer sensorischen Nervenfunktionsstörung und degenerativen Erkrankungen der Retina zusammenhängen. Das BDNF-Protein, Peptidfragmente und erfindungsgemäße Polypeptide können beispielsweise zur Behandlung von erblicher spastischer Paraplegie mit retinaler Degeneration (Kjellin und Barnard-Scholz-Syndrome), Retinitis pigmentosa, Stargardt- Krankheit, Usher-Syndrom (Retinitis pigmentosa mit kongenitalem Höhrverlust) und dem Refsum-Syndrom (Retinitis pigmentosa, erblicher Hörverlust und Polyneuropathie), um nur einige zu nennen, verwendet werden. Es ist möglich, daß ein Defekt in der BDNF-Synthese oder -Reaktionsfähigkeit die zugrundeliegende Ätiologie für Syndrome sein kann, die durch eine Kombination von retinaler Degeneration und einer anderen sensorischen Funktionsstörungen charakterisiert sind.
Das BDNF-Protein, Peptidfragmente oder erfindungsgemäße Polypeptide können zusammen mit einer chirurgischen Gewebeimplantation zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und/oder Parkinson-Krankheit verwendet werden. Wie nachstehend in den Abschnitten 12 und 18 beschrieben kann BDNF zur Förderung des Überlebens von dopaminergen Substantia nigra-Neuronen in einer dosisabhängigen Weise (Figur 34) verwendet werden, was die Verwendung von BDNF zur Behandlung von Krankheiten von dopaminergen ZNS-Neuronen unterstützt, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, der Parkinson-Krankheit [besonders angesichts von Daten, die nachstehend in Abschnitt 21 dargestellt werden und zeigen, daß BDNF zur Verhinderung der Neurotoxizität, die durch MPP verursacht wird, einem Toxin, das mit der Induktion eines Parkinson-Krankheit-ähnlichen Syndroms zusammenhängt, verwendet werden kann]. Ferner wurde beobachtet, daß BDNF das Überleben von cholinergen ZNS-Neuronen (nachstehende Abschnitte 12 und 16) und besonders von cholinergen Neuronen des basalen Prosencephalons unterstützt, was anzeigt, daß BDNF zur Behandlung von Störungen der cholinergen Neuronen, einschließlich der Alzheimer- Krankheit, jedoch ohne Beschränkung darauf, verwendet werden kann. Es wurde gezeigt, daß etwa 35 % der Patienten mit der Parkinson-Krankheit an einer Alzheimer-artigen Demenz leiden; erfindungsgemäß produziertes BDNF kann sich für eine Einzelwirkstofftherapie für diesen Krankheitskomplex als nützlich erweisen. In ähnlicher Weise kann erfindungsgemäß produziertes BDNF therapeutisch zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit in Verbindung mit dem Down-Syndrom verwendet werden. Erfindungsgemäß produziertes BDNF kann zur Behandlung einer Reihe von Demenz- Erkrahkungen sowie von kongenitalen Lemstörungen verwendet werden. Es wurde ferner festgestellt, daß BDNF anscheinend die Proliferation von Sternzellen unterdrückt, was die Verwendung von BDNF zur Verminderung der Narbenbildung im ZNS (beispielsweise nach einer Operation, einem Trauma oder Infarkt) sowie die Verwendung von BDNF zur Behandlung von von Sternzellen stammenden ZNS- Tumoren unterstützt. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann BDNF verwendet werden, um die Expression des NGF-Rezeptors hochzuregulieren und kann dadurch vorteilhaft vor oder gleichzeitig mit NGF einem Patienten, der diese Behandlung benötigt, verabreicht werden.
Wie nachstehend in Abschnitt 15 beschrieben, kann durch Verabreichung von Kainsäure eine Erhöhung der BDNF-Expression (und in geringerem Umfang der NGF- Expression) in Neuronen wie Hippokampus- sowie corticalen Neuronen induziert werden. Es wurde beobachtet (nachstehender Abschnitt 15), daß die Inhibition von Non- NMDA-Rezeptoren diese Kainsäure-vermittelte Erhöhung der BDNF-Expression blockierte. Daher kann die Expression von BDNF und erfindungsgemäßen BDNF-verwandten Peptiden und Polypeptiden in vitro oder in vivo durch Verabreichung von Kainsäure oder verwandten Verbindungen oder von Carbachol, Histamin oder Bradykinin oder verwandten Verbindungen davon, von denen festgestellt wurde, daß sie ähnliche Wirkungen in vitro oder in vivo aufweisen, oder durch Agonisten von Non-NMDA- Glutamatrezeptoren oder anderen Arzneimitteln, die die Wirkung von Acetylcholin, Histamin oder Bradykinin vergrößern oder nachahmen, induziert werden. Die Induktion der NGF-Expression kann ferner durch Verabreichung von Kainsäure oder verwandten Molekülen oder von Agonisten von Non-NMDA-Rezeptoren erreicht werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können das BDNF- Protein, Fragmente oder Derivate zusammen mit anderen Cytokinen verwendet werden, um eine gewünschte neurotrophe Wirkung zu erreichen. BDNF kann beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, erfindungsgemäß zusammen mit NGF oder mit einem Skelettmuskelextrakt verwendet werden, um eine synergistische stimulatorische Wirkung auf das Wachstum von sensorischen Neuronen zu erreichen, wobei mit Synergie gemeint ist, daß die Wirkung der Kombination von BDNF-Protein, Peptidfragment oder Derivat mit einem zweiten Mittel eine Wirkung erreicht, die größer als die bei der gleichen Menge von jeder einzeln verwendeten Substanz ist. Es wird angenommen, daß BDNF mit anderen vom ZNS stammenden Peptidfaktoren, die noch vollständig charakterisiert werden müssen, synergistisch auf das Wachstum, die Entwicklung und das Überleben eines weiten Spektrums von neuronalen Subpopulationen im zentralen Nervensystem einwirkt.
In noch weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Antikörper, die gegen das BDNF-Protein, Peptidfragmente und erfindungsgemäße Polypeptide gerichtet sind, an Patienten, die an einer Reihe von neurologischen Störungen und Krankheiten leiden und eine solche Behandlung benötigen, verabreicht werden. Patienten, die an einer übergroßen Produktion von BDNF leiden, können beispielsweise eine solche Behandlung benötigen. Anti-BDNF-Antikörper können zur Verhinderung einer fehlerhaften Regeneration von sensorischen Neuronen (z. B. postoperativ) oder, wie vorstehend beschrieben, zur Behandlung von chronischen Schmerzsyndromen verwendet werden. In Anbetracht der in Neuroblastomgewebe gefundenen großen Mengen an BDNF-mRNA ist es möglich, daß BDNF als ein autokriner Tumorwachstumsfaktor für Neuroblastome dient; daher können anti-BDNF-Antikörper therapeutisch verabreicht werden, um eine Tumorregression in einer spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsform zu erreichen.

5.9. Arzneimittel

Die erfindungsgemäßen aktiven Zusammensetzungen, die das BDNF-Protein, Peptidfragmente oder erfindungsgemäßen Polypeptide oder die erfindungsgemäßen Antikörper oder eine Kombination von BDNF und einem zweiten Wirkstoff wie NGF oder einem Skelettmuskelextrakt umfassen können, können in einem beliebigen sterilen biokompatiblen pharmazeutischen Träger wie Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser, jedoch ohne Beschränkung darauf, verabreicht werden.
Das BDNF-Protein, Peptidfragmente oder erfindungsgemäße Polypeptide mit BDNF-Aktivität können eine Aminosäuresequenz oder Subsequenz davon, im wesentlichen wie in Figur 1 oder 5 dargestellt, umfassen; gegebenenfalls kann die Verwendung eines BDNF-Proteins bevorzugt sein, das besonders die vollständige oder einen Teil der Aminosäuresequenz etwa von Aminosäure 134 bis etwa 252, wie in Figur 1 dargestellt, oder eine funktionell äquivalente Sequenz umfaßt, da angenommen wird, daß diese Subsequenz den funktionellen Teil des BDNF-Moleküls umfaßt. BDNF kann von Sequenzen stammen, die den BDNF-Genen von einer beliebigen geeigneten Art wie Mensch, Schwein, Ratte, Huhn, Kuh, Hund, Schaf, Ziege, Katze, Kaninchen etc., jedoch ohne Beschränkung darauf, entsprechen.
Die Menge an BDNF-Protein, Peptidfragment, Derivat oder Antikörper, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustands wirksam sind, hängt von der Natur der --Krankheit oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardverfahren ermittelt werden. Wenn möglich, ist es wünschenswert, die Dosis- Wirkungs-Kurve und die erfindungsgemäßen Arzneimittel zuerst in vitro, z. B. in den vorstehend beschriebenen BDNF-Biotestsystemen, und anschließend in nützlichen Tiermodellsystemen vor- dem Test an Menschen zu ermitteln. Auf der Basis von In vitro-Daten kann in einer spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsform ein Arzneimittel, das eine Erhöhung des Überlebens von sensorischen Neuronen bewirkt, eine lokale BDNF-Proteinkonzentration von zwischen etwa 5 und 25 ng/ml und vorzugsweise zwischen 10 und 20 ng/ml BDNF bereitstellen. In einer weiteren spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann ein Arzneimittel, das die Förderung des Wachstums und Überlebens von dopaminergen oder cholinergen Neuronen bewirkt, eine lokale BDNF-Proteinkonzentration von zwischen etwa 10 ng/ml und 100 ng/ml bereitstellen.
Verfahren zur Einführung schließen, jedoch ohne Beschränkung darauf, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, orale und intranasale Verfahren ein. Es kann ferner die Einführung der erfindungsgemäßen Arzneimittel in das zentrale Nervensystem auf jedem geeigneten Weg wie durch intraventrikuläre und intrathekale Injektion wünschenswert sein; die intraventrikuläre Injektion kann durch einen intraventrikulären Katheter, beispielsweise mit einem Reservoir wie einem Ommaya-Reservoir verbunden, erleichtert werden.
Es kann ferner. die Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel lokal an den zu behandelnden Bereich wünschenswert sein; dies kann beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, durch lokale Infüsion während der Operation, durch Injektion, mittels eines Katheters oder mittels eines Implantats erreicht werden, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht-porösen oder gelatinösen Material wie Membranen, beispielsweise Silicongummi-Membranen, oder Fasern besteht.
Die Erfindung betrifft ferner erfindungsgemäße Arzneimittel, die über Liposomen, Mikropartikel oder Mikrokapseln verabreicht werden können. In verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann es nützlich sein, solche Zusammensetzungen zu verwenden, um eine verzögerte Freisetzung von BDNF und BDNF-verwandten Produkten zu erreichen.
Es wird angenommen, daß es möglich ist, Zellen, die BDNF, BDNF-verwandte Substanzen oder BDNF-Antagonisten aktiv produzieren, oder anti-BDNF- Antikörper in Bereiche einzuführen, die erhöhte oder verringerte BDNF- Konzentrationen benötigen.

6. Beispiel: Molekulare Clonierung und Charakterisierung von cDNA des aus dem Schweinehirn stammenden neurotrophen Faktors

Die extreme Seltenheit des BDNF-Proteins in Geweben schloß die Verwendung von Standardverfahren zur Clonierung des BDNF-Gens aus. Stattdessen wurde eine begrenzte Menge einer Proteinsequenz unter Verwendung eines DNA- Amplifikationsverfahren, wie folgt, vermehrt:
(i) Mikrogramm-Mengen BDNF wurden aus Kilogramm-Mengen Schweinehirn gereinigt.
(ii) Gereinigtes BDNF wurde durch Proteinmikrosequenzierverfahren analysiert und die Aminosäuresequenz eines Abschnitts von 36 Aminosäureresten ermittelt.
(iii) Auf der Basis der in (ii) ermittelten Aminosäuresequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert und anschließend als Primer in der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von cDNA des Colliculus superior vom Schwein als Matrize zur Amplifikation der das definierte Aminosäurefragment codierenden DNA verwendet.
(iv) Das DNA-Reaktionsprodukt von (iii) wurde sequenziert, und
(v) die entsprechenden Oligonucleotidprimer wurden synthetisiert und in der Polymerasekettenreaktion mit cDNA des Colliculus superior vom Schwein verwendet, um überlappende DNA-Fragmente zu erzeugen, die BDNF-mRNA stromaufwärts sowie stromabwärts von Sequenzen, die das ursprüngliche Aminosäurefragment von 36 Aminosäuren codieren, darstellen. Der vollständige codierende Bereich für Schweine- BDNF wurde so in zwei überlappenden Fragmenten molekülar cloniert.
Die Details aller dieser Schritte sowie die weitere Charakterisierung des BDNF-Gens sind nachstehend beschrieben.

6.1. Materialien und Verfahren

6.1.1. Reinigung von BDNF aus Schweinehirn

Die Reinigung von BDNF aus Schweinehirn wurde durch das Verfahren, das im wesentlichen von Hofer und Barde (Nature 331 (1988), 261-262) beschrieben wurde, durchgeführt.
6 kg Schweinehirn wurden mit einem Ultra-Turrax-Homogenisiergerät in 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, der 1 mM EDTA und frisch zugesetztes Phenylmethansulfonylfiuorid (1 mM) enthielt, in einem Verhältnis von 1 kg Gehirn zu 2 Litern Puffer homogenisiert. Der pH-Wert des Überstandes wurde mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 4,0 gebracht und es wurde 2 Std. bei 4ºC gerührt. Nach der 25- minütigen Zentrifugation bei 20 000 x g wurden die kombinierten Überstände (mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt), die 3 kg Gehirn entsprechen, 2 Std. mit 1 Liter vorgeqwollener Carboxymethylcellulose, die mit 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0, äquilibriert war, gerührt. Nach zweimaligem Waschen mit insgesamt 20 Litern 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,0, wurde die Aufschlämmung auf eine Säule gegossen und über Nacht im gleichen 0,13 M NaCl enthaltenden Puffer gewaschen. Die aktiven Fraktionen wurden mit 0,5 M NaCl enthaltendem Phosphatpuffer eluiert und anschließend gegen 2 x 5 Liter 5 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, dialysiert. Die dialysierten Fraktionen, die durch Verarbeitung von 2 x 3 kg Ausgangsmaterial erhalten wurden, wurden auf eine zuvor mit 5 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, äquilibrierte Hydroxyapatitsäule mit einem Bettvolumen von 130 ml aufgetragen. Die Säule wurde anschließend mit einem linearen Gradienten, der aus 500 ml 5 mM und 500 ml 700 mM Kaliumphosphat, beide pH 6,8, bestand, eluiert, wobei die BDNF-Aktivität bei etwa 500 mM Kaliumphosphat eluiert wurde (vgl. Barde et al., EMBO J. 1 (1982), 549-553). Durch Zugabe von 1,0 M Kaliumphosphat wurden die vereinigten aktiven Fraktionen auf eine Endmolarität von 700 mM Kaliumphosphat eingestellt und auf eine 5 ml Phenyl-Sepharosesäule, die mit 700 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, äquilibriert war, aufgetragen. Nach dem Waschen mit 40 ml des gleichen Puffers wurde die BDNF-Aktivität mit 0,1 M Kaliumphosphat, pH 6,8, eluiert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde in einem SDS- Gelelektrophorese-Probenpuffer, der 0,1 % SDS und kein Mercaptoethanol enthielt, wie von Barde et al. (EMBO J. 1 (1982), 549-553) beschrieben, aufgenommen, bevor es auf ein SDS-Gel aufgetragen wurde, das aus einem linearen (statt exponentiellen) Gradienten aus 10 bis 25 % Acrylamid bestand. Nach Abschluß der elektrophoretischen Trennung wurde das Gel kurz (10 min.) mit Coomassie-Blau angefärbt, 20 min. entfärbt und eine Bande, die auf der Höhe von Cytochrom c wanderte, wurde ausgeschnitten und elektrophoretisch aus dem Gel eluiert. Das SDS wurde entfernt, wie von Barde et al. (EMBO J. 1 (1982), 549-553) beschrieben. Das Reinigungsverfahren, das schließlich zur Mikrosequenzierung von BDNF führte, wurde modifiziert (gemäß Hofer und Barde, Nature 331 (1988), 261-262) und enthielt keine Gelelektrophorese als letzten Reinigungsschritt.

6.1.2. Proteinsequenzierung

BDNF wurde entweder direkt sequenziert (55 pmol, wie durch Aminosäureanalyse ermittelt, mit einer anfänglichen Ausbeute von 40 pmol an aminoterminalem Histidin) oder, wie nachstehend beschrieben, gespalten: 5 bis 10 µg BDNF (von 5 unterschiedlichen Präparationen) wurden gemäß den nachstehenden Verfahren gespalten. V8: 1 µg S. aureus V8 (Miles) wurde zu 5 µg BDNF in 0,2 M NH&sub4;CO&sub3;, pH 8,0, das 10% Acetonitril enthielt, gegeben (Gesamtvolumen: 50 µl ) und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Trypsin: 1 µg TPCK-behandeltes Trypsin (Rinderpankreas, Sigma Typ XIII) wurde zu 8 µg BDNF in Tris-HCl (0,1 M, pH 8,0), das 10 mM CaCl&sub2; enthielt, zugesetzt (Gesamtvolumen: 40 µl) und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Cyanogenbromid (CNBr): 10 µg BDNF wurden 3 Stunden bei Raumtemperatur (Gesamtvolumen: 60 µl) mit 10% (Gew./Vol.) CNBr in 70% (Vol./Vol.) Ameisensäure (Endkonzentrationen) inkubiert. Nach der Zugabe von 500 µl H&sub2;O am Ende der Reaktion wurde die Probe in einem "speed-vac"-Gerät auf 50 µl konzentriert. 50 µl Tris-HCl (1,0 M, pH 8,0) wurden zusammen mit 5 µl β- Mercaptoethanol zugesetzt und die Probe wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert. Nach Zugabe von 5 µl Iodmethan wurde die Probe mit einem "speed-vac"-Gerät zur Trockne eingedampft. Es wurde festgestellt, daß eine Reduktion und Alkylierung von BDNF nach der CNBr-Spaltung erforderlich war: ohne Reduktion wurden keine Fragmente erhalten, wie durch HPLC und Swank-Munkres-SDS-Gelelektrophorese (Swank und Munkres, Anal. Biochem. 39 (1971), 462-477) gezeigt wurde. Dies zeigt, daß Disulfidbrücken in BDNF vorhanden und so angeordnet sind, daß durch keine der Spalwngen freie Peptide erhalten werden können. Nach allen Spaltungen wurden die getrockneten Proben in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) resuspendiert und auf eine Umkehrphasen C8-Mikrobore-HPLC-Säule (Applied Biosystems) aufgetragen und die Peptide mit 0,1 ml/min unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 60% Acetonitril in 0,1 % TFA 60 min eluiert. Der Nachweis wurde bei 214 nm mit einem Waters-441-UV-Detektor durchgeführt. Die Peptide wurden durch automatischen Edman-Abbau mit einem Gasphasen-Mikrosequenziergerät (Modell 470A Applied Biosystems) gemäß Hewick (3. Biol. Chem. 256 (1981), 7990-7997) und Hunkapillar (Methods Enzymol. 91 (1983), 227-236) sequenziert. Der Nachweis der PTH- Aminosäuren war, wie von Lottspeich (3. Chromatogr. 326 (1985), 321-327) beschrieben.

6.1.3. Herstellung der DNA-Matrizen

Genomische DNA vom Schwein wurde gemäß dem Verfahren von Herrmann und Frischauf (Methods Enzymol. 152 (1987), 180-183) isoliert.
Zur Herstellung von cDNA wurde die vollständige RNA aus einer Probe von 6 g des Colliculus superior aus Schweinehim erhalten. Die Gewebeprobe wurde erhalten, seziert und in flüssigem Stickstoff in einem ortsansässigen Schlachthof eingefroren. Standardverfahren (Okayama et al., Methods Enzymol. 154 (1987), 3-28) wurden zur Extraktion der RNA verwendet. 80 µg Gesamt-RNA wurde mit der reversen Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus (BRL, gemäß der Anleitung des Herstellers, ausgenommen der Zugabe von 1 µl RNasin und Weglassen von Actinomycin D) unter Verwendung des Primergemisches CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTT mit A, C oder G als terminalem 3'- Nucleotid (oligo3, das entwickelt wurde, um einem 3'-poly-A-Abschnitt zu entsprechen, und das die Erkennungsstellen für BamHI, EcoRI und PstI enthielt) transkribiert.

6.1.4. Polvmerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde gemäß dem von Saiki et al. (Science 230 (1985), 1350-1354) beschriebenen Verfahren durchgeführt.

6.2. Ergebnisse und Diskussion

6.2.1. Ergebnisse der Proteinmikrosequenzierung

Die Ergebnisse der Proteinmikrosequenzierung sind in Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV Experimentell ermittelte Peptidsequenz von BDNF
Kombinierte Sequenz: VTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYE Die unterstrichenen Aminosäuren stellen Sequenzen dar, die durch die für die PCR verwendeten Oligonucleotidprimer codiert werden; vgl. Abschnitt 6.1.2.
Vier benachbarte Abschnitte von Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung des Edman-Abbaus ermittelt, die wiederum zur Ableitung einer Sequenz von 36 Aminosäuren, die etwa ein Drittel der vollständigen Aminosäuresequenz darstellen, verwendet werden konnte.

6.2.2. Synthese von Oligonucleotiden und Verwendung der PCR zum Erhalt von ein Aminosäurefragment codierender DNA

Zwei vollständig degenerierte 17-mer-Oligonucleotidprimer wurden auf der Basis der codierenden Sequenzen für Abschnitte mit sechs Aminosäuren nahe dem Amino- bzw. Carboxyterminus des vorstehend in Abschnitt 6.2.1. beschriebenen Fragments von 36 Aminosäureresten chemisch synthetisiert. Insbesondere wurden zwei getrennte Gemische von 17-mer-Oligonucleotiden (die allen möglichen Codons entsprachen und als Oligol und Oligo2 bezeichnet wurden) auf der Basis der Sequenz AADKKT (Sinn) und KQYFYE (Antisinn) (in Tabelle III unterstrichen) chemisch synthetisiert und 150 pmol jedes Primers zu 1 µg Matrize aus genomischer DNA vom Schwein zugesetzt. 35 Amplifikationszyklen wurden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) gemäß der Anleitung des Herstellers (GeneAmp , Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt. Die Denaturierung dauerte eine Minute bei 94ºC, die Primer-Anlagerung 2 min. bei 45ºC und die Primerverlängerung 2 min. bei 72ºC. Eine DNA-Bande der vorhergesagten Größe (101 bp) wurde aus dem 3% Agarosegel (mit Ethidiumbromid angefärbt) ausgeschnitten und, wie von Innis et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9436-9440) beschrieben, mit einem 100fachen Überschuß entweder von Oligo1 oder Oligo2 asymmetrisch amplifiziert.

6.2.3. Nucleotidsequenz des cDNA-Fragments

Die erhaltenen Sinn- und Antisinn-DNA-Fragmente wurden durch das Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1979), 3918-3921) unter Verwendung der mit ³²P terminal markierten Oligonucleotide 1 und 2 als Primer sequenziert. Die ermittelte Nucleotidsequenz enthielt nur einen offenen Leserahmen, der nicht durch ein Kettenterminationscodon unterbrochen war. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für diesen offenen Leserahmen stimmte vollständig mit der tatsächlichen Aminosäuresequenz, die für diesen Bereich von Schweine-BDNF ermittelt wurde, überein.

6.2.4. Clonierung der vollständigen Schweine-BDNF-cDNA

Der vollständige codierende Bereich für Schweine-BDNF wurde in zwei überlappenden Abschnitten molekülar doniert. Zum Erhalt des 3'-Teils (relativ zum Sinnstrang) der BDNF-cDNA wurde ein 30-mer-Oligonucleotidprimer, der 21 Basen der exakten Sinnstrang-BDNF-Sequenz enthielt, von innerhalb des vorstehend beschriebenen Bereichs synthetisiert, um als "Sinnprimer" zu dienen. Die Nucleotidsequenz dieses Primers mit der Bezeichnung Oligo 4 war (5')AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGTCGGG(3') [der unterstrichene Teil zeigt die Sequenz, die dem Sinnstrang von BDNF von den Positionen 643 bis 663 in Figur 1, die die Aminosäuresequenz Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly (die ersten beiden Basen des Gly-Codons) codieren, entspricht]. Die zusätzlichen 9 Nucleotide am 5'-Ende dieses Primers wurden eingeschlossen, um geeignete Restriktionsendonuclease-Spaltstellen für Spei und Sall zur Verwendung beim molekularen Clonieren bereitzustellen. Ein dreifach degenerierter 31-mer-Oligonucleotidprimer wurde so entwickelt, daß er zu einem Abschnitt von poly(A), dem beliebige Nucleotide (T, G oder C) auf dem Sinnstrang der cDNA vorausgehen, komplementär war und Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI, EcoRI und Psti enthielt. Die Sequenz dieses "Antisinn"-Primers (Oligo 3) war (5')CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTTX(3'), wobei X = A, C oder G war. Die synthetischen Oligonucleotidprimer wurden zur PCR-Amplifikation von Sequenzen der vorstehend beschriebenen cDNA-Präparation vom Colliculus superior vom Schwein verwendet. Insbesondere wurde die 3'-amplifizierte DNA unter Verwendung von 10 µl reverser Transkriptions-Reaktionslösung, 150 pmol Sinnprimer (Oligo 4) und 150 pmol Oligo 3 als Antisinnprimer in einer PCR-Reaktion erhalten. Eine Southem-Blot-Analyse wurde mit den amplifizierten DNA-Produkten durchgeführt und die Bande, die mit dem mit ³²P terminal-markierten Oligonucleotid AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG (Oligo 5, das als Antisinnprimer in der nachstehend beschriebenen 5'-Reaktion verwendet wurde und Erkennungssequenzen für BamHI und Psti enthielt) ein Hybridisierungssignal lieferte, wurde ausgeschnitten, unter Verwendung des Glasmilch-Verfahrens (gene clean ) extrahiert, mit EcoRI und SalI gespalten, in ein Bluescript SK&spplus;-Plasmid (Stratagene) doniert und sequenziert.
Zum Erhalt des Restes (stromaufwärts oder der 5'-Teil) der BDNF-codierenden Sequenz wurde cDNA, wie vorstehend beschrieben, hergestellt, und poly(A)- Schwänze wurden unter Verwendung der terminalen Desoxynucleotidtransferase den 5'- Enden angefügt. Das gleiche Gemisch von drei 31-mer-Oligonucleotiden, die jeweils einen Abschnitt von 12 aufeinanderfolgenden T-Resten, wie vorstehend beschrieben, enthielten, wurde verwendet, um einen zu diesen angefügten poly(A)-Schwänzen komplementären Primer zu erhalten. Ein einzigartiger 30-mer-Oligonucleotidprimer, der 17 Basen enthielt, die dem komplementären Strang der BDNF-codierenden Sequenz entsprachen, und Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI und PstI aufwies, wurde synthetisiert. Die Sequenz dieses Primers war (5')AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG(3') (Oligo 5, vorstehend; der unterstrichene Teil zeigt den Bereich, der zum Sinnstrang der codierenden Sequenz von BDNF von den Positionen 709 bis 693 in Figur 1 komplementär ist); dies entspricht dem Abschnitt, der die Aminosäuresequenz Pro(die letzten beiden Basen des Codons)- Val-Ser-Lys-Gly-Gln codiert. Die Primer wurden der cDNA mit dem poly(A)-Schwanz zugesetzt, und die Amplifikation durch PCR wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden mit Psti gespalten, in den Bluescript-Vektor doniert und die Nucleotidsequenz durch das Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren ermittelt.

6.2.5. Nucleotidsequenz der Schweine-BDNF-cDNA

Die aus den überlappenden Schweine-BDNF-cDNA-Clonen ermittelte kombinierte Nucleotidsequenz ist in Figur 1 zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz dargestellt. Die Sequenz umfaßt einen offenen Leserahmen für ein Polypeptid mit 252 Aminosäuren. Die Identifikation des Initiator-Met-Codons (ATG) beruht auf der Gegenwart von zwei benachbarten Kettenterminationscodons (TAG-TGA) im gleichen Leserahmen, beginnend 36 Basenpaare stromaufwärts Der Aminoterminus von Schweine-BDNF, der durch direkte Sequenzanalyse des gereinigten Proteins ermittelt wurde, entspricht dem Rest His 134 dieses Polypeptids. Folglich zeigen die Sequenzdaten, daß reifer BDNF durch Prozessierung eines Vorläufer-Polypeptids erhalten wird. Unmittelbar vor dem Rest His 134 liegt die Sequenz Arg-Val-Arg-Arg. Solchen Sequenzen eines basischen Aminosäurerestes gefolgt von einem neutralen Rest und anschließend zwei weiteren basischen Resten wurde die Rolle der Zielstellen für die proteolytische Prozessierung von Vorläufer-Polypeptiden zugeschrieben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von reifem BDNF sagt ein Protein von 119 Aminosäuren (Molekulargewicht 13 511 Dalton) mit einer basischen Ladung (pI = 9,99) voraus, Eigenschaften, die mit der früheren Charakterisierung von BDNF durch Bestimmung des biologisch aktiven Faktors nach der Fraktionierung durch zweidimensionale Gelelektrophorese übereinstimmen. Die Aminosäuresequenz von Teilen von BDNF, die durch Proteinmikrosequenzierung (insgesamt 64 Aminosäurereste) ermittelt wurde, stimmt vollständig mit der Aminosäuresequenz überein, die von der Nucleotidsequenz von cDNA-Clonen abgeleitet wurde (in Figur 1 unterstrichen). Die Sequenz des Vorläuferpolypeptids stimmt mit der Prozessierung von BDNF in mindestens zwei Schritten überein: Zunächst wird ein Signalpeptid von vielleicht 18 Resten vom Aminoterminus abgespalten, wonach zwischen Arg133 und His134 gespalten wird, um das reife Polypeptid freizusetzen. Wenn dieses Modell stimmt, kann der Vorläufer als PräproBDNF bezeichnet werden.

7. Beispiel: Das BDNF-Gen unterscheidet sich vom NGF-Gen in verschiedenen Wirbeltierarten

7.1. Materialien und Verfahren

7.1.1. Herstellung von NGF- und BDNF-DNA-Sonden

Ein Plasmid, das ein synthetisches Gen enthält, das reifes menschliches NGF codiert, und die normales menschliches NGF codierende Sequenz mit einigen konservativen Codon-Substitutionen zur Einführung geeigneter Restriktionsstellen einschließt, wurde von British Biotechnologies Limited erworben. Ein Paar von 18-mer- Oligonucleotidprimem wurde synthetisiert, um die Amplifikation eines Abschnitts von 270 Basenpaaren dieses Gens, der dem codierenden Bereich für die Aminosäurereste 9 bis 111 entsprach, durch PCR zu ermöglichen. Zum Erhalt einer markierten DNA- Sonde wurde eine PCR-Reaktion von 10 Zyklen mit ³²P-dCTP durchgeführt. Eine BDNF-Sonde wurde durch ähnliche Verfahren erhalten, ausgenommen, daß die Amplifikation unter Verwendung von genomischer DNA vom Schwein als ursprüngliche Matrize durchgeführt wurde, und der amplifizierte Abschnitt entsprach dem codierenden Bereich für die Aminosäuren 28 bis 111 von reifem BDNF. Ein Primer für den komplementären Strang ("Antisinn"), der dem Bereich der Aminosäuren 106 bis 111 entsprach, wurde synthetisiert und wies die Sequenz (5')ACATACACAGGAAGTGTC(3') auf. Ein Oligonucleotidprimer des Sinnstrangs [(5')GCAGTGGACATGTCGGGT(3')] wurde für den Bereich der Aminosäurereste 28-33 hergestellt. Die Southern-Blot- Hybridisiemng (Southem, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-517) mit diesen beiden Sonden wurde unter stringenten Bedingungen in 2 x SSC bei 68ºC durchgeführt.

7.1.2. Sequenzierung der BDNF-Gene von verschiedenen Arten

Die gleichen zwei 18-mer-Oligonucleotide, die den codierenden Bereich für die Aminosäuren 28 bis 111 von reifem Schweine-BDNF, wie vorstehend beschrieben, einschließen, wurden als Primer zur Amplifikation unter PCR-Standardbedingungen von 252 Basenpaaren langen Abschnitten von genomischer DNA von Schwein, Ratte, Huhn und Mensch verwendet und die erhaltenen Reaktionsprodukte durch das Didesoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1979), 3918-3921) sequenziert. In einigen Fällen wurde die Bande mit amplifizierter DNA ausgeschnitten, nach der Agarosegelelektrophorese extrahiert und vor der Sequenzierung erneut amplifiziert. In anderen Fällen war eine erneute Amplifikation nicht erforderlich.

7.2. Ergebnisse und Diskussion

Vor der vorliegenden Erfindung wurde das BDNF-Protein nur vom Schwein gereinigt. Es war von größter Bedeutung, unzweideutig zu zeigen, daß BDNF nicht nur die beta-Untereinheit des Nervenwachstumsfaktors vom Schwein (beta-NGF oder hier nachstehend einfach als NGF bezeichnet) ist, dessen Reinigung und molekulare donierung bisher nicht beschrieben wurde. Dies war besonders kritisch, da die zuvor beschriebenen physikalischen Eigenschaften von Schweine-BDNF mit denen des ß- NGF-Monomers von einer Reihe von Arten praktisch identisch sind. Der Mangel an neutralisierendem Antikörper gegen Schweine-BDNF und der frühere Mangel an Aminosäure- oder Nucleotidsequenzinformation der Schweine-BDNF machte es unmöglich, den genauen Zusammenhang zwischen BDNF und NGF zu ermitteln. Es war vorstellbar, daß die beobachteten Unterschiede in der biologischen Aktivität zwischen BDNF und NGF beispielsweise einfach die Unterschiede im NGF zwischen Schwein und bestimmten anderen Arten (z. B. Maus) wiedergeben oder durch eine unterschiedliche Modifikation des NGF-Proteinmoleküls in verschiedenen Geweben (z. B. Schweinehirn gegen Maus-Speicheidrüse) bewirkt werden oder durch Modifikationen, die in einem Schritt oder in Schritten während der Reinigung vom Schweinehim versehentlich in das Protein eingeführt wurden, bewirkt werden.
Wenn festgestellt würde, daß BDNF sich deutlich von NGF unterschied, war es von großem Interesse zu ermitteln, ob das BDNF-Gen in anderen Arten, nämlich dem Menschen, vorhanden war. Vor der vorliegenden Erfindung war keine Information zu diesem Punkt verfügbar, da BDNF nur von einer Art gereinigt wurde. Die Gegenwart der neurotrophen Aktivität, die sich anscheinend von NGF in einer Reihe von Rohextrakten und konditionierten Medien unterschied, schloß nicht die Existenz einer mit Schweine-BDNF identischen oder im wesentlichen äquivalenten Substanz ein.
Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Schweine-BDNF mit den bekannten Sequenzen von NGF von einer Reihe von Arten (Mensch, Rind, Meerschweinchen, Maus, Huhn und Schlange) zeigte, daß BDNF mit einem beliebigen Wirbeltier-NGF signifikant weniger verwandt ist als die NGFs untereinander (Figur 2). Ein auffälliges Merkmal der Primärstruktur von reifem BDNF ist die Ahnlichkeit mit der von NGF; bei nur 3 Lücken, die zur Optimierung der Angleichung in die NGF- Sequenzen eingeführt wurden, sind 51 Übereinstimmungen den verschiedenen NGFs (von Schlange bis Mensch) und BDNF (Figur 2) gemeinsam. Wichtig ist, daß diese Übereinstimmungen alle 6 Cysteinreste einschließen. Obwohl die exakte Anordnung der Disulfidbrücken im BDNF noch nicht bekannt ist, ist es sicher, daß solche Brücken vorhanden sind (Tabelle III, Legende). Die in BDNF gefundenen 3 Tryptophan- und 2 Phenylalaninreste werden in identischen Positionen in NGF gefunden. Es soll ferner angemerkt werden, daß 6 Asparaginsäurereste (von 7 in BDNF) und 7 Valinreste (von 9) an identischen Positionen in Säuger-NGFs und -BDNF vorhanden sind. Diese 5 Aminosäuren sind für etwa die Hälfte der Aminosäureübereinstimmungen zwischen den 2 Proteinen verantwortlich. Umgekelrrt gibt es einige auffallende Unterschiede zwischen BDNF und allen NGFs: zusätzlich zu den bereits erwähnten 3 Lücken gibt es ferner 21 Positionen, an denen die Aminosäuren in allen NGFs identisch sind, sich bei BDNF jedoch unterscheiden.
Der größte Teil der Vorläufersequenz von BDNF ist mit der von NGF bis auf zwei Ausnahmen nicht verwandt: die mutmaßliche sekretorische Signalsequenz von BDNF zeigt Übereinstimmungen bei 5 Aminosäuren (von 18 Aminosäuren) und eine insgesamt auffallende Verwandtschaft mit der Signalsequenz von Maus-NGF, bei der gezeigt wurde, daß die Spaltung nach einem in Position 18 nach dem Translationsinitiations-Methionin gefundenen Alaninrest erfolgt (Edwards et al.; Mol. Cell Biol. 8 (1988), 2456-2464). Es scheint wahrscheinlich, daß das Alanin, das auch in Position 18 in BDNF gefunden wurde, eine potentielle Spaltstelle zur Entfernung der Signalsequenz von BDNF darstellt. Die andere Ährilichkeit mit NGF beginnt mit der einzigen N-Glykosylierungsconsensussequenz (in Fig. 1 doppelt unterstrichen), die dem Asparagin 126 entspricht. Dieses Asparagin liegt 8 Aminosäuren vor der Spaltstelle, durch die reifes BDNF erhalten wird. Die gleiche Anordnung wird in mehreren NGFs gefunden, sowie die Sequenz Arg-X-basische Aminosäure-Arg als letzte 4 Aminosäuren des Vorläufers (Schwarz et al., 3. Neurochem. 52 (1989), 1203-1209).
Der Nachweis, daß NGF und BDNF in einer Reihe von Wirbeltieren durch verschiedene Gene codiert werden, wurde durch Herstellung von DNA-Sonden aus molekular doniertem menschlichem NGF und Schweine-BDNF und Durchführung einer Southern-Blot-Hybridisierung mit genomischer DNA, die mit der Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten wurde, erhalten. Die genomischen DNAs aus den folgenden Quellen wurden analysiert: Mensch, Affe, Ratte, Maus, Hund, Rind, Kaninchen, Huhn und Hefe. Die DNA wurde mit EcoRI gespalten und nach dem Southern-Blot-Transfer auf Duplikatfilter mit einer ³²P-markierten menschlichen NGF- Sonde und einer Schweine-BDNF-Sonde analysiert. Einzelne Banden wurden bei jeder Sonde in allen getesteten Organismen ausgenommen Hefe beobachtet. In den meisten Fällen wiesen die mit den NGF- und BDNF-Sonden hybridisierenden Banden in allen Organismen eine andere elektrophoretische Mobilität auf, obwohl in einigen Fällen (z. B. Maus-DNA) die mit den NGF- und BDNF-Sonden hybridisierenden EcoRI- Fragmente etwa die gleiche Größe aufwiesen und unter den verwendeten elektrophoretischen Bedingungen nicht aufgelöst werden konnten (Figur 3).
Ein Teil der codierenden Sequenzen für reifes BDNF wurde durch PCR von genomischer DNA von Schwein, Ratte, Huhn und Mensch amplifiziert und die Nucleotidsequenzen ermittelt. Die DNA-Sequenzanalyse des amplifizierten Bereichs von genomischer DNA vom Schwein bestätigte genau die Sequenzergehnisse, die mit molekularen Clonen von Schweinehirn-cDNA erhalten wurden. Die genomischen Sequenzen von BDNF von Ratte, Mensch und Huhn für diesen Abschnitt von 252 Basenpaaren wurden auch ermittelt (Figur 5). Bemerkenswert war, daß in Ratte und Mensch die abgeleitete Aminosäuresequenz für den Bereich von mindestens der Aminosäure 28 bis 111 mit der von Schweine-BDNF identisch war, obwohl eine Reihe von Nucleotidunterschieden (z. B. konservative Austausche in der dritten Position eines Codons) bei verschiedenen Arten beobachtet wurden. Im Huhn wurde eine einzige Aminosäuresubstitution in diesem Bereich beobachtet; Rest 61 des reifen Proteins ist ein Lysin im Huhn verglichen mit einem Methionin in Säuger-BDNFs. Die Sequenzdaten zusammen mit dem vorstehend beschriebenen Southern-Blot-Hybridisierungsexperiment lieferte den eindeutigen Beweis, daß BDNF durch ein hoch konserviertes Gen, das sich von dem NGF-codierenden unterscheidet, codiert wird.

8. Beispiel: Vergleich der Expression von BDNF-RNA in neuronalen und nicht-neuronalen Geweben

8.1. Materialien und Verfahren

8.1.1. Herstellung von RNA

Gesamt-RNA wurde aus Geweben von erwachsenen weiblichen Mäusen gemäß dem Verfahren von Okayama et al. (Methods Enzymol. 154 (1987), 3-28) extrahiert. Kurz gesagt, gefrorenes Gewebe wurde in 5,5 M Guanidiniumthiocyanat homogenisiert, das Lysat zur Entfernung der Trümmer zentrifugiert und der Überstand auf eine auf eine Dichte von 1,51 g/ml eingestellte Schicht aus Cäsiumtrifluoracetat überschichtet. Nach einer 24-stündigen Zentrifugation bei 125 000 x g in einem SW 27 Ausschwing (swinging bucket)-Rotor (Beckmann) wurde die RNA resuspendiert, mit Ethanol und 8 M Ammoniumacetat ausgefällt und bei -70ºC aufbewahrt. Die Elektrophorese wurde gemäß Lehrach et al. (Biochemistry 16 (1977), 4743-4751) auf 1,3 % Agarose-Formaldehydgelen durchgeführt. Die RNA wurde auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham) transferiert und über Nacht bei 62ºC in 1 ml 2 x SSC-Lösung, die 50% Formamid enthielt, mit einer ³²P-cRNA-Maus-BDNF-Sonde (10&sup7; Cpm, siehe unten) hybridisiert. Es wurde 60 min bei 65ºC in 0,1 x SSC gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Blot 60 min bei Raumtemperatur mit 0,1 ijg/ml RNASE A (Pharmacia) inkubiert und der Film bei -70ºC (mit einem Verstärkerschirm) 48 Stunden exponiert.

8.1.2. Herstellung der cRNA-Sonde

Eine Maus-Gehirn-cDNA-Bank wurde mit 2 unabhängigen BDNF- Oligonucleotiden durchmustert. Doppelt positive Clone wurden isoliert und in die EcoRI-Stelle eines Bluescript SK&spplus;-Plasmids (Stratagene) subcloniert. Die den Nucleotiden 350 bis 829 der Schweinesequenz (vgl. Fig. 1) entsprechende Nucleotidsequenz wurde ermittelt. In dieser Sequenz wurden insgesamt nur 4 Aminosäureunterschiede zwischen Maus- und Schweine-BDNF gefunden, was einen bemerkenswerten Grad an Konservierung dieses Bereichs zwischen Schwein- und Maus- BDNF anzeigt. Eine einzeisträngige RNA-Sonde wurde unter Verwendung dieser Matrize und der T3-Polymerase (Promega) hergestellt. Die spezifische Aktivität dieser Sonde war 10&sup8; Cpm/µg.

8.2. Ergebnisse und Diskussion

Die Northern-Blot-Analyse wurde verwendet, um die Expression von BDNF- mRNA in neuronalen im Vergleich zu nicht-neuronalen Geweben zu ermitteln. Die Northern-Blot-Analysen wurden unter Verwendung von Mausgeweben durchgeführt, dies eine schnellere RNA-Extraktion als Schweinegewebe ermöglichen. Eine ³²P- cRNA-Sonde wies ein Signal bei etwa 1,45 kb im Gehirn (Fig. 4) und Rückenmark (Daten nicht dargestellt) nach. Signifikanterweise wurde kein Signal in irgendeinem anderen Gewebe wie Niere, Darm, Lunge, Leber, Milz, Herz und Muskel (Fig. 4) nachgewiesen. Unter der Annahme, daß die Größe der Schweine-mRNA der der Maus ähnlich ist, gibt die in Figur 2 dargestellte cDNA-Sequenz mehr als 80% der vollständigen mRNA-Sequenz wieder.
Eine signifikante Beobachtung bei der Beschreibung der Physiologie von BDNF ist, daß die mRNA, die dieses Protein codiert, nur im zentralen Nervensystem und nicht in 7 Non-ZNS-Geweben gefunden wurde. BDNF-mRNA wurde nicht nur im gesamten Gehirn (Fig. 4), sondern auch im Rückenmark und dem Colliculus superior (die in Figur 1 dargestellte Sequenz stammt vollständig von einer Colliculus superior- cDNA-Matrize) gefunden. Diese Daten stützen die These, daß BDNF ein vom Ziel stammender neurotropher Faktor ist und auf BDNF antwortende Neuronen entweder dem ZNS immanent oder direkt mit ZNS-Strukturen verbunden sind. Alle Neuronen, von denen bisher bekannt ist, daß sie auf BDNF antworten, ragen tatsächlich entweder in das ZNS hinein, beispielsweise die Spinal- oder die sensorischen Schädelganglien (Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319-328, und Davies et al., J. Neurosci. 6 (1986), 1897-1904), oder sind ZNS-Neuronen wie die retinalen Ganglionzellen (Johnson et al., J. Neurosci. 6 (1986), 3031-3038). Natürlich müssen genaue Untersuchungen in bezug auf die genaue Verteilung der Synthesestellen von BDNF im ZNS durchgeführt werden, es ist jedoch schon offensichtlich, daß sich die Verteilung von BDNF-mRNA sehr von der der in vielen Non-ZNS-Geweben gefundenen NGF-mRNA unterscheidet (Heumann et al., EMBO J. 3 (1984), 3183-3189, und Shelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7951-7955).

9. Beispiel: Molekulare Clonierung und Charakterisierung von Mensch- und Ratten- BDNF-Genen

9.1. Materialien und Verfahren

9.1.1. Genom-DNA- und cDNA-Banken

Eine cDNA-Bank aus Retina von erwachsenen Menschen wurde in Lambda- ZAPII von Stratagene erhalten. Eine genomische DNA-Bank aus menschlicher Plazenta in EMBL3/SP6/T7 wurde von Clontech erhalten. Eine cDNA-Bank aus menschlichem fötalem Gehirn in λgt11 wurde von Clontech erhalten. Eine genomische DNA-Bank von Ratte in EMBL3/SP6/T7 wurde von Clontech erhalten. Beide genomische Banken wurden durch partielle Spaltung von genomischer DNA mit der Restriktionsendonuclease Sau3a und Ligierung in die BamHI-Stelle des Vektors hergestellt. Eine Rattenhirn- cDNA-Bank in Lambda-ZAPII wurde von Stratagene erhalten.

9.1.2. Herstellung von BDNF-DNA-Sonden

³²P-markierte BDNF-DNA-Sonden wurden hergestellt, indem die gleichen Oligonucleotidprimer verwendet wurden, die vorstehend in Abschnitt 7.1.1. für die CR-Reaktion mit menschlicher genomischer DNA zur Amplifikation des codierenden Bereichs der Reste 28 bis 111 von menschlicher BDNF beschrieben wurden. Parallel cdazu wurde eine Ratten-BDNF-spezifische P-markierte Sonde unter Verwendung von Ratten-Genom-DNA als Matrize für die PCR erhalten.

9.1.3. Durchmusterung der Banken

Lambda-Phagen-Banken wurden gemäß Standardverfahren (Benton und Davis, Science 196 (1977), 180-182, und Maniatis et al., Cell. 15 (1978), 687-701) durch Hybridisierung in 50% Formaldehyd mit Dextransulfat und Denhardt's-Lösung bei 42ºC durchmustert. Die Filter wurden bei 42ºC in 50% Formamid, 5 x SSCPE, 10% Denhardt's-Lösung, 0,5 mg/ml Lachssperma-DNA, 0,1 % SDS und 10% Dextransulfat vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde im gleichen Puffer durchgeführt, ausgenommen daß die Konzentration der Denhardt's-Lösung 2% und die der Lachssperma-DNA 0,1 mg/ml war und SDS und Dextransulfat weggelassen wurden. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei 68 ºC gewaschen. Die menschliche BDNF-Sonde wurde zur Durchmusterung von menschlicher genomischer DNA- und Retina-cDNA-Banken verwendet; die Ratten-BDNF-Sonde wurde zur Durchmusterung von Ratten-Genom-DNA- und Hirn-cDNA-Banken verwendet. Die Banken wurden ferner mit Mensch- und Ratten-NGF-Sonden durchmustert, die, wie vorstehend in Abschnitt 7.1.1. beschrieben, hergestellt wurden.

9.2. Ergebnisse und Diskussion

Mindestens 670 000 Plaques wurden bei jeder Bank durchmustert. Es wurde angenommen, daß positive menschliche Clone die sind, die mit der menschlichen BDNF-Sonde, jedoch nicht mit der vorstehend beschriebenen menschlichen NGF-Sonde hybridisierten. Genomische BDNF-Clone wurden sowohl von Mensch- als auch Ratten- Banken mit einer Häufigkeit, die mit dem Vorhandensein des BDNF-Gens mit einer Kopie pro haploidem Genom übereinstimmt, erhalten. Sowohl in Banken von Ratten- als auch menschlichem Genom wurden etwa eine Million Plaques durchmustert. Drei positive Clone wurden von der genomischen Bank von Ratte und einer von der menschlichen genomischen Bank erhalten. Die positiven Clone von den menschlichen Retina- und Rattenhim-cDNA-Banken wurden mit einer Häufigkeit erhalten, die mit einem in sehr geringen Mengen exprimierten Gen übereinstimmt; in Rattenhim-cDNA wurden 2 positive Clone in 670 000 identifiziert, und in einer menschlichen retinalen cDNA-Bank wurde einer in 670 000 Clonen identifiziert. Keine positiven Clone wurden unter 670 000 Clonen von der kommerziellen, aus menschlichem fötalem Gehirn hergestellten cDNA-Bank nachgewiesen. Die Nucleotidsequenzierung wurde mit menschlicher BDNF-cDNA- und genomischen Clonen unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotidprimern durchgeführt, die die genauen Sequenzen, die innerhalb des menschlichen und Ratten-BDNF-codierenden Bereichs liegen, wie vorstehend in Abschnitt 7.1.2. ermittelt, darstellten. Der längste erhaltene menschliche cDNA-Clon wies eine Insertion von etwa 1,6 bis 1,8 kbp auf und enthielt erwartungsgemäß die genaue Sequenz des Teils des menschlichen BDNF, der nach der direkten Amplifikation von menschlicher genomischer DNA, wie vorstehend in Abschnitt 7.2 beschrieben, ermittelt wurde. Die genaue Sequenzanalyse dieses cDNA (Figur 5)-Clons zeigte einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid von 247 Aminosäuren codiert, die dem Vorläufer in vollständiger Länge für Schweine-BDNF ähnlich sind, ohne jedoch damit identisch zu sein. Innerhalb des Bereichs, der dem reifen BDNF-Polypeptid (z. B. vom Codon für His134 bis zum Kettenterminationscodon) entspricht, wurden keine Unterschiede in der abgeleiteten Aminosäuresequenz festgestellt; alle Nucleotidsubstitutionen zwischen Schwein und Mensch waren in bezug auf die codierende Spezifität konservativ. Der Rest des mutmaßlichen BDNF-Vorläuferpolypeptids zeigte einige Unterschiede der Aminosäuresequenz zwischen Mensch und Schwein, besonders die Abwesenheit von 5 von 6 aufeinanderfolgenden Ser-Codons, die im Schwein beobachtet wird, vom menschlichen BDNF-Gen, was zu einem etwas kürzeren Polypeptid (247 gegenüber 252 Aminosäuren) führt.
Im Vektor EMBL3 hergestellte Banken weisen Insertionen von 10 bis 23 kbp Fremd-DNA auf. Die genaue Größe der Insertion im menschlichen genomischen BDNF-Clon, der genau analysiert wurde, wurde nicht ermittelt. Der Clon enthielt jedoch ein einzelnes EcoRI-Restriktionsendonuclease-Fragment von etwa 4 kb, das mit der zur Durchmusterung der Bank verwendeten markierten BDNF-Sonde hybridisierte. Dieses Fragment hat die erwartete Größe, was auf den Ergebnissen der Southern-Blot- Hybridisierung von menschlicher genomischer DNA mit der vorstehend beschriebenen Schweine-BDNF-Sonde beruhte. Eine Sequenzanalyse wurde mit dem menschlichen Clon unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden, die die cDNA-Sequenz repräsentieren, zum Primen der DNA-Synthese von der Bakteriophagen-DNA-Matrize durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß die codierende Sequenz für den angenommenen menschlichen BDNF-Vorläufer mit der im menschlichen cDNA-Clon identisch war, ausgenommen einer einzigen Nucleotidsubstitution im Präpro-Bereich am Nucleotid 785 in Figur 5, die der einer Aminosäuresubstitution von Methionin (ATG) für Valin (GTG) entsprach. Dieser Austausch kann einen Polymorphismus im menschlichen Genom wiedergeben. Wie im Fall des menschlichen NGF-Gens wurden keine intervenierenden Sequenzen innerhalb der codierenden Sequenz für den mutmaßlichen menschlichen PräproBDNF nachgewiesen. Ratten-cDNA-Sequenz-Daten sind in Figur 5 ebenfalls dargestellt.

10. Beispiel: Expression von rekombinantern BDNF

10.1. Materialien und Verfahren

10.1.1. Herstellung eines BDNF-Expressionsvektors

Die dem Schweine-PräproBDNF entsprechende Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonucleotidprimer (jeweils 150 pmol) ATAATCTAGATGACCATCCTTTTCCTT (Sinn) und ATAATCTAGACTATCTTCCCCTCTTAAT (Antisinn) in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 1 µg genomischer Matrize vom Schwein (jeder Primer weist eine angefügte XbaI-Stelle auf) erhalten. Die Amplifikationsreaktion war wie beschrieben, ausgenommen, daß die Anlagerungstemperatur 50ºC war. Nach der Spaltung mit Xbai wurde die amplifizierte DNA in die XbaI-Stelle des Plasmids pCMV¹ ligiert, um pCMV¹-pBDNF&supmin;¹ (-1 zeigt die Sinnorientierung in Figur 6 an und entspricht COS+ in Tabelle V) zu produzieren, und das Plasmid wurde in XL-1-Bakterien durch Elektroporation eingeführt.

10.1.2. Expression von BDNF in COS-Zellen

pCMV1-pBDNF-Plasmid-DNA von positiven Clonen (durch Hybridisierung mit Oligo 5, Fig. 2, überprüft) wurde sowohl mit XbaI als auch PstI gespalten. Die Größe der erhaltenen Produkte erlaubte die Ermittlung der Orientierung der Insertionen, beide Plasmide wurden zur Transfektion von COS-Zellen durch das Calciumphosphatverfahren (Chen et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 2745-2752) verwendet, und das Wachstumsmedium wurde nach 24 Std. gesammelt. Die BDNF-Aktivität wurde durch einen vorstehend genau beschriebenen Biotest bei dem Spinalganglion von Hühnerembryonen getestet.

10.2. Ergebnisse und Diskussion

Sensorische Neuronen des Rückenmarks von E8-Hühnern wurden plattiert (6 000 pro Vertiefung), 24 Std. inkubiert und nach 24 Std. gezählt (Lindsay et al., Develop. Biol. 112 (1985), 319-328). Die Werte sind Durchschnittswerte von dreifachen Messungen ± Standardabweichung. BDNF und NGF wurden in einer Konzentration von 1 ng/ml verwendet, das ist eine Konzentration, bei der ein maximales Überleben bei jedem Faktor beobachtet wird. COS+ meint Zellen, die mit die BDNF- Insertion in der Sinn-Orientierung enthaltenden Plasmiden transfiziert sind, und COSmeint Zellen, die mit die BDNF-Insertionen in der umgekehrten Orientierung enthaltenden Plasmiden transfiziert sind. COS meint nicht-transfizierte Zellen. Bei Verdünnungen von mehr als 1:20 wurde kein Überleben über die Kontrolle hinaus weder im COS- noch im COS-konditionierten Medium beobachtet. In allen Experimenten ohne NGF wurde ein monodonaler anti-NGF-Antikörper (Korsching et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1988), 3513-3516) in einer Konzentration von 1 µg/ml verwendet.
Wie in Tabelle V dargestellt, bewirkte nur das Medium, das von Kulturen von das pCMV1-pBDNF-Plasmid in der Sinn-Orientierung tragenden COS-Zellen erhalten wurde, eine höhere Überlebensrate von sensorischen Neuronen von Hühnern über die Kontrollwerte hinaus. Daher ist das rekombinante BDNF biologisch aktiv. Die Zugabe von aus Schweinehirn isoliertem BDNF erhöhte ferner die Überlebensrate von sensonschen Neuronen nicht signifikant über die durch rekombinanten BDNF allein erhaltenen Überlebensraten, was anzeigt, daß der rekombinante BDNF BDNF-Rezeptoren sättigen kann. Es wurde ferner beobachtet, daß der rekombinante BDNF eine zusätzliche oder synergistische Wirkung auf die Erhöhung der Überlebensrate von sensorischen Neuronen von Hühnern bei einer gemeinsamen Verwendung mit NGF aufweist. Tabelle V Überleben von gezüchteten sensorischen Neuronen von Hühnern

11. Beispiel: Erzeugung von Antikörpern gegen BDNF

11.1. Materialien und Verfahren

Ein für BDNF spezifisches polydonales Antiserum mit der Bezeichnung Serum 4 wurde in einem weißen NZ-Kaninchen durch Immunisierung mit einem synthetischen Peptid erzeugt.

11.1.1. Peptidsynthese und Kupplung an einen Träger

Ein aus 34 Aminosäureresten bestehendes Peptid mit der Bezeichnung B5 wurde durch übliche Verfahren synthetisiert. Es weist die nachstehende Aminosäuresequenz auf, die 33 Resten von reifem BDNF (Reste 153 bis 185 der in Figur 1 dargestellten vollständigen Schweine-PräproBDNF-Sequenz) mit einem zusätzlichen Cysteinrest am Aminoterminus (in Kursivschrift dargestellt) entsprach, um die Kupplung an ein Trägerprotein unter Verwendung eines m-Maleimidobenzoesäure-N- hydroxysuccinimid (MBS), falls gewünscht, zu ermöglichen:
Das B5-Peptid wurde an Rinderserumalbumin (BSA) unter Verwendung von bis-Diazobenzidin (BDB) gekoppelt. Frisches BDB wurde durch Auflösen von 46 mg Benzidin-HCl (p-Diaminodiphenyl-HCl, von Sigma erhalten) in 9,0 ml 0,2 N HCl hergestellt. 35 mg NaNO&sub2; wurden in 1,0 ml H&sub2;O gelöst, zur Benzidinlösung zugesetzt und 1 Stunde bei 4ºC gerührt. 21 mg BSA wurden in 3,0 ml 0,16 M Borat und 0,13 M NaCl, pH 9,0, gelöst. Etwa 15 mg B5-Peptid wurden in 1,5 ml Borat-NaCl-Puffer, pH 0,0, gelöst. Die Peptidlösung wurde der BSA-Lösung zugesetzt und auf Eis gegeben. 1,0 ml BDB wurde der BSA-Peptidlösung zugesetzt und das Reaktionsgemisch unter Rühren 2 Stunden bei 4ºC gerührt; der pH-Wert wurde überwacht und im Bereich von 9,0 durch Zugabe von kleinen Mengen von 0,5 M NaOH, wie benötigt, gehalten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,2 ml 1 % Phenol-gepufferter Lösung beendet. Überschüssige Reagenzien wurden durch Dialyse gegen eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) entfernt.

11.1.2. Immunisierung

Insgesamt sechs Kaninchen wurden gemäß dem nachstehenden Protokoll immunisiert:
Kaninchen 1 und 4 -- Peptid B5, das mit seinem C-Terminus an BSA unter Verwendung von BDB gekoppelt war;
Kaninchen 2 und 3 -- Peptid B5, das mit seinem N-Terminus an BSA unter Verwendung von MBS gekoppelt war;
Kaninchen 5 und 6 -- Peptid B5, das mit Nitrocellulosepulver vermischt war.
In allen Fällen wurden zur ersten Immunisierung 1 mg Immunogen (100 µg B5/500 µg Nitrocellulose für die Kaninchen 5 und 6) in 0,5 ml PBS und 0,5 ml komplettem Freundschem-Adjuvans verwendet. Dieses Gemisch wurde subcutan in zahlreiche Stellen auf dem Rücken injiziert. Die zweite Immunisierung erfolgte drei Wochen später und war mit der ersten identisch, ausgenommen daß inkomplettes Freundsches- Adjuvans anstelle von komplettem Freundschem-Adjuvans verwendet wurde. Anschließende Auffrischungen erfolgten in Abständen von 4 bis 6 Wochen; Den Kaninchen wurde 1 Woche nach der Immunisierung Blut entnommen und die Antiseren routinemäßig auf eine Bindung an das reine B5-Peptid durch einen enzymverbundenen Immunadsorptionstest (ELISA) überprüft.

11.1.3. Nachweis der Antikörperbindung an BDNF

100 µg Antigen (BS-Peptid) in 1120 wurde den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zugesetzt und über Nacht trocknen gelassen, anschließend kurz mit 1120 gewaschen und mit 100 µg 1 % Gelatine 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend 100 µg Antiseren zugesetzt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden anschließend dreimal in PBS/0,05 % Triton X-100 gewaschen, wonach 100 µg Peroxidasemarkierte anti-Kaninchen-Antikörper in einem Immuntest (1/1 000 Verdünnung) den Vertiefungen zugesetzt und drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Vertiefungen wurden zweimal gewaschen und 100 µg ABTS-Lösung (10 mg ABTS (Sigma), in 10 ml 0,1 M Nacitrat, pH 4,0, und 10 µg H&sub2;O&sub2; gelöst) zugesetzt und etwa 5 Minuten bis zur Farbentwicklung inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µg 1 % NaN&sub3; beendet. Die Proben wurden mit 1120 1:5 verdünnt, und die optische Dichte wurde bei 415 nm gemessen.

11.2. Ergebnisse und Diskussion

Das Antiserum des Kaninchens 4 (Serum 4) zeigte den höchsten Titer (Figur 7a) und wurde in anschließenden Experimenten verwendet. Antikörper des Serums 4 wurden durch Ammoniumsulfat-Präzipitation partiell gereinigt; zu einem Teil des Antiserums wurde eine gleiches Volumen von gesättigtem Ammoniumsulfat unter Rühren langsam zugesetzt, die Lösung weitere 15 Minuten gerührt und anschließend bei 2 000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal in 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gewaschen und anschließend in PBS in einem Volumen, das dem ursprünglichen Volumen des Serums entsprach, erneut gelöst. Das Ammoniumsulfat wurde durch Dialyse gegen mehrfach ausgetauschtes PBS entfernt. Die dialysierte Lösung wurde in Aliquote von 1,0 ml Volumen aufgeteilt und unter Verwendung eines Speed-vac-Geräts gefriergetrocknet. Eine Probe des Serum 4-Antikörpers wurde in 0,5 ml H&sub2;O resuspendiert und auf eine Reaktivität mit dem Peptid B5 im ELISA getestet, und es wurde festgestellt, daß er bis zu einer Verdünnung von 1:4 000 reagiert.
Polydonale Antikörper gegen ein synthetisches Peptid (BS), das einem Fragment aus 33 Aminosäuren von Schweine-BDNF entspricht, wurden durch Immunisierung von Kaninchen, wie vorstehend beschrieben, erzeugt. Das Serum 4, das den höchsten Titer gegen das synthetische Peptid zeigte, zeigte eine Reaktivität mit gereinigtem BDNF von Schweinehirn im ELISA (Figur 7b). Die schwache Reaktivität wurde ferner durch "Immunoblotting" (Daten nicht dargestellt) nachgewiesen. Das Antiserum konnte jedoch die Aktivität von BDNF in biologischen Tests mit sensorischen Neuronen des Spinalganglions von Hühnerembryonen nicht blockieren.

12. Beispiel: Neue biologische Wirkungen von BDNF

Die folgenden Beobachtungen zeigen, daß BDNF (i) das Überleben von dopaminergen ZNS-Neuronen unterstützt und ihren vollständig differenzierten Zustand induziert, (ii) das Überleben von cholinergen ZNS-Neuronen unterstützt und (iii) die Proliferation von Sternzellen unterdrückt. Diese biologischen Wirkungen von BDNF wurde zuvor nicht beschrieben. Da dopaminerge Neuronen, cholinerge Neuronen und Sternzellen jeweils mit neurologischen Krankheiten oder Störungen zusammenhängen können, kann sich BDNF zur Behandlung von neurologischen Krankheiten oder Störungen unter Beteiligung dieser Zellpopulationen als nützlich erweisen.

12.1. Materialien und Verfahren

12.1.1. Verfahren zur Züchtung von dopaminergen Neuronen der Substantia nigra

Das ventrale Mittelhirn wurde aus dem Hirn von Rattenembryonen, die im Alter von 13 bis 15 Tagen der Embryoentwicklung waren, seziert. Zwei Würfe wurden üblicherweise in jedem Experiment verwendet. Die Sezierlösung wies die nachstehende Zusammensetzung auf: 136,8 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na&sub2;HPO&sub4; x 7H&sub2;O, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 6 mg/ml Glucose und 0,1 mg/ml BSA, pH 7,4. Diese Lösung wurde hergestellt und anschließend durch ein Filter mit Poren von 0,2 µM steril futriert. Die Sezierung wurde unter nicht-sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach der Sezierung des Gewebes von allen Gehirnen wurde der Rest des Verfahrens unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Gewebefragmente wurden in eine Kulturschale von 35 mm gegeben und unter Verwendung einer feinen Schere zerteilt. 2 ml F-12-Nährmedium, das 0,125 % Trypsin enthielt, wurde anschließend dem Gewebe zugesetzt und bei 37 ºC inkübiert. Am Ende dieses Ihkubationszeitraums wurde DNAseI der Aufschlämmung zugesetzt, so daß die Endkonzentration 80 ng/ml war. Eine weitere identische Ihkubation wurde durchgeführt und die Gewebeaufschlämmung anschließend zu 8,0 ml Wachstumsmedium zugesetzt, das aus Minimal Essential Medium (MEM) bestand, dem 2 mM Glutamin, 6 mg/ml Glucose, 5 Einheiten/ml Penicillin, 5 mg/ml Streptomycin und 7,5% fötales Kälberserum (FCS) zugesetzt wurden. Die Probe wurde in einer Tischzentrifuge bei 500 Upm bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 5 Minuten zentrifugiert. Das Medium wurde abgesaugt, und 2 ml Wachstumsmedium dem Zellpellet zugesetzt. Eine feuerpolierte Pipette mit einer Öffnung von 1 mm wurde zur achtmaligen Trennung der Zellen verwendet. Man ließ die verbliebenen Gewebefragmente durch Schwerkraft absetzen, und ein kleines Aliquot des Überstandes wurde zur Bestimmung der Zellzahl durch Zählen in einem Hämozytometer verwendet. Nach der Ermittlung der Zelldichte wurden die Zellen in Gewebekülturplatten mit einer Dichte von 50 000/cm² plattiert.
Die Kulturplatten wurden am Tag vor der Sezierung hergestellt. Die Gewebeplatten (24 Vertiefungen, 2 cm²/Vertiefung) wurden zuvor mit 0,5 mg/ml Polyomithin (Molekulargewicht 30 000 bis 70 000 g/mol) 3 Stunden bei Raumtemperatur beschichtet. Die Platten wurden gründlich mit Wasser gewaschen und anschließend mit 5 µg/ml Maus-Laminin 3 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die Platten wurden anschließend, wie vorstehend beschrieben, mit Wasser gewaschen und über Nacht bei 37ºC in einer aus 5% CO&sub2; und 95% Luft bestehenden feuchten Atmosphäre in Gegenwart von Wachstumsmedium inkubiert. Das Medium in den Platten wurde am folgenden Tag entfernt und mit frischem Wachstumsmedium ersetzt.
Nach der Plattierung auf den Kulturplatten wurden die Zellen in einen Inkubator bei 37ºC und 5% CO&sub2;/95% Luft über einen Zeitraum von 24 Stunden gegeben. Das Kulturmedium wurde gegen eine serumfreie Formulierung (SFM) mit der nachstehenden Zusammensetzung ausgetauscht: ein 1:1 (Vol:Vol) Gemisch von Basal Eagle Medium (BEM) und dem Nährgemisch F-12 mit Glucose (33 mM), Glutamin (2 mM), NaHCO&sub3; (15 mM), HEPES (10 mM), dem Insulin (25 µg/ml), Transferrin (100 µg/ml), Putrescin (60 µM), Progesteron (20 nM), Natriumselenit (30 nM), Penicillin (5 E/ml), Streptomycin (5 mg/ml) und T&sub3; (30 nM) zugesetzt wurden. In einigen Experimenten wurde den Kulturen nach dem Austausch der Medien gegen SFM nach 2 Tagen Züchtung gereinigter BDNF zugesetzt.
Die zur Züchtung von dopaminergen Neuronen verwendeten Lösungen wurden unter Verwendung von dem Milli-Q-Reagens-Wassersystem entnommenem Wasser hergestellt. Die Medienformulierungen für Gewebekültur wurden wie das fötale Kälberserum (Artikel-Nr. 43N1086) und das Maus-Laminin von den Gibco-Laboratories (Santa Clara, California) erhalten. Alle anderen Medienbestandteile wurden von Sigma Chemical (St. Louis, MO) erworben und waren von einer für eine Zellkültur geeigneter Qualität. Das Polyomithin und DNAseI wurden auch von Sigma erhalten. Trypsin wurde von Worthington (Freehold, NJ), Artikelnummer 3667, erhalten. Im Handel erhältliche Chemikalien waren von einer analytischen Qualität und wurden von der Baker Chemical (Phillipsburg, NJ) erhalten. Der in diesen Experimenten verwendete BDNF wurde durch Dr. Y.-A. Barde gemäß dem Verfahren von Barde et al. (1982) (a.a.O.) aus Schweinehirn gereinigt.

12.1.2. Verfahren zur immunocytochemischen Anfärbung von Kulturen des ventralen Mittelhirns

Die Fixierlösungen wurden für jedes Experiment frisch hergestellt. Zur Anfärbung der Tyrosinhydroxylase (TH) war das Fixiermittel 4,0% Paraformaldehyd in Sorensons-Phosphatpuffer. Der Sorensons-Phosphatpuffer wurde durch Zugabe einer 0,2 M KH&sub2;PO&sub4;-Lösung zu einer Stammlösung von 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; bis zu einem pH- Wert von 7,3 hergestellt. Das Paraformaldehyd wurde anschließend der Lösung zugesetzt, zur Auflösung kurz erhitzt und vor der Verwendung auf Raumtemperatur abgekühlt.
Zu Beginn des Verfahrens wurde das Kulturmedium aus den Kulturschalen durch vorsichtiges Absaugen entfernt und die geeignete Fixierlösung der Schale vorsichtig zugesetzt. Es wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde dreimal jeweils 5 Minuten unter leichtem Rühren mit Sorensons-Phosphatpuffer gewaschen. Die Zellen wurden anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in einer Abschrecklösung inkubiert. Die Abschrecklösung für die auf TH anzufärbenden Kulturen bestand aus Sorensons-Phosphatpuffer, der 2% normales Pferdeserum enthielt. Die Kulturen wurden anschließend in Permeabilisierungspuffer 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Die Lösung für die auf TH anzufärbenden Kulturen bestand aus Sorensons-Puffer, der 0,2% Saponin und 1,5% normales Pferdeserum enthielt. Nach dem Permeabilisierungsschritt wurden die Kulturen in Gegenwart von primärem Antikörper über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Antikörper gegen Ratten-TH war ein monodonaler Maus-Antikörper des Isotops IgG2a. Er wurde in einer Konzentration von 40 µg/ml in einer Lösung von 10 mM NaPO&sub4;, 50 mM NaCl und 0,2% Saponin, pH 7,5, verwendet. Nach der Ihkubation des primären Antikörpers wurden die Kulturen 5mal 15 Minuten jeweils im geeigneten Permeabilisierungspuffer gewaschen. Die Kulturen wurden anschließend mit einem an Biotin konjugierten sekundären Antikörper inkubiert, das heißt, mit biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG. Diese Ihkubation wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren durchgeführt. Es wurde anschließend, so wie vorstehend beschrieben, gewaschen, und anschließend wurden die Kulturen in Gegenwart eines zuvor gebildeten Avidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-Komplexes (ABC-Reagens, Vector Laboratories, Burlingame, CA), der gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt wurde, inkubiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren wurden die Kulturen, wie vorstehend beschrieben, gewaschen. Die Kulturen wurden anschließend mit 55 mM Tris-Cl-Lösung, pH 7,3, die 0,5 mg/ml Diaminobenzidin und 0,01 % Wasserstoffperoxid enthielt, inkubiert. Die Entwicklung des Reaktionsproduktes konnte 2 bis 5 min fortschreiten, wonach die Lösung entfernt und die Kulturen mehrmals mit eiskaltem PBS gewaschen wurden. Die Zahl von positiven Zellen/cm² wurde anschließend bestimmt.
Das Paraformaldehyd und das Glutaraldehyd wurden von Fluka Chemical erhalten. Vectastain-Kits, die normales Serum (als Blockierungsmittel), biotinyliertes, affinitätsgereinigtes Anti-Immunglobulin, Avidin DH und biotinyliertes HRP-H enthielten, wurden von Vector Laboratories erhalten. Das Diaminobenzidin wurde von BRL (Gaithersberg, MD) erhalten.

12.1.3. Zur Messung der ³H-Dopaminaufnahme in ventralen Mittelhimkulturen verwendete Verfahren

Die ³H-Dopamin (³H-DA)-Aufnahme wurde, wie von Dal Toso et al. (J. Neurosci. 8 (1988), 733-745) beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Der Aufuahmepuffer wies die nachstehende Zusammensetzung auf: 136,8 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na&sub2;HPO&sub4; x 7H&sub2;O, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 5,0 mM Glucose, 1,0 mM CaCl&sub2;, 1,0 mM MgSO&sub4;&sub7; 0,1 mM Ascorbinsäure und 0,1 mM Pargylin, pH 7,4. Falls erforderlich wurden 5,0 µM Benztropinmesylat (BZT) dem Aufnahmepuffer zugesetzt.
Die Zellen wurden einmal mit vorgewärmtem (37ºC) Aufnahmepuffer gewaschen und gegen 0,4 ml Aufnahmepuffer/2 cm² Vertiefung ausgetauscht. Die Kulturen wurden anschließend 5 min. bei 37ºC vorinkubiert. Nach der Präinkubation wurden 0,1 ml ³H-DA in Aufuahmepuffer (250 nM, 40 Ci/mMol) zugesetzt, so daß die Endkonzentration von ³H-DA im Puffer 50 nM war. Die Kulturen wurden 15 min. bei 37ºC inkubiert, wonach viermal bei 4ºC jeweils mit 0,5 ml Aufuahmepuffer gewaschen wurde. Es wurde ferner zwei weitere Male mit eiskaltem PBS (10 mM NaPO&sub4; und 150 mM NaCl, pH 7,6) gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden 0,2 ml/2 cm² Vertiefung 0,5 N NaOH den Zellen zugesetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der NaOH-Extrakt wurde anschließend gesammelt und in einem Scintillationszähler (Packard, LS 500TD) mit 10 ml "Ultimagold"-Scintillationsflüssigkeit gezählt. Die spezifische Aufnahme wurde als die Aufnahme definiert, die in Gegenwart von 5 µM BZT aufgehoben wurde. Dies stellte üblicherweise 70 bis 90% der beobachteten Gesamtaufnahme dar.
³H-DA wurde von NEN (Boston, MA) erhalten. Ascorbat, Pargylin, BZT und Glucose wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten. Die Ultimagold- Scintillationsflüssigkeit wurde von Packard (Sterling, VA) erworben.

12.1.4. Verfahren zur Produktion von Kulturen von cholinergen Neuronen des basalen Prosencephalons

Primäre Kulturen von cholinergen Zellen des basalen Prosencephalons wurden von Rattenembryonen im Alter von 17 Tagen hergestellt. Genauer gesagt, die in dieser Untersuchung verwendeten cholinergen Neuronen stammten vom mittleren septalen Kern und vom Kern des Broca'-Diagonalbands. Diese neuronale Population ragt primär zum Hippokampus. Die abgetrennten gemischten Kulturen (Neuronen und Glia) wurden durch das nachstehende Verfahren hergestellt. Die septale Region wurde durch Sezieren von umliegendem Gewebe befreit und vom fötalen Gehirn entfernt. Die Gewebeteile wurden anschließend vereinigt, mit einer Schere zerteilt und 20 Minuten bei 37ºC mit 12,5 % Trypsin behandelt. Das Trypsin wurde durch Verdünnung in Plattierungsmedium (Dulbeccos-modifiziertem-Eagle-Medium (DMEM), das 1 % Penicillin und Streptomycin, 5 % Pferdeserum und 1 % N3, einem Hormonzusatz, enthielt) inaktiviert. Eine Suspension aus einzelnen Zellen wurde durch Zerkleinern der gespaltenen Gewebefragmente mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette hergestellt. Die abgetrennten Zellen wurden mittels eines Hämocytometers gezählt und in der geeigneten Dichte im Plattierungsmedium plattiert. Die Testliganden wurden den Kulturen fünf bis sechs Stunden nach der Plattierung zugesetzt und die Zellen anschließend in vitro 10 Tage gezüchtet, wobei das Medium alle drei Tage ausgetauscht wurde.

12.1.5. Cholin-Acetyltransferasetests

Nach dem Behandlungszeitraum wurden die Zellen entweder für Cholin- Acetyltransferase (CAT)-Enzymtests verwendet oder für eine immunhistochemische Anfärbung von CAT gemäß dem nachstehenden Protokoll weiterbehandelt. Der monodonale Antikörper gegen CAT wurde von Boehringer Mannheim Biochemical Co. erworben und woanders charakterisiert. Nach dem Versuchszeitraum wurden die Zellen zweimal mit DMEM gespült. Die Kulturen wurden durch ein Zwei Schritt-Verfahren fixiert; 50 µl 4% Paraformaldehyd wurden zu 50 µl DMEM über einen 10 Minuten langen Ihkubationszeitraum zugesetzt. Die Lösung wurde entfernt und gegen 100 µl 4% Paraformaldehyd ausgetauscht und die Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach der Fixierung wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und durch eine 30-minütige Ihkubation mit Saponin (0,5 mg/ml) permeabilisiert. Das Detergens wurde durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt und eine Blockierungslösung von 5 % normalem Kaninchenserum 30 Minuten zugesetzt. Der primäre Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:3 in 1 % normalem Kaninchenserum nach der Entfernung der Blockierungslösung zugesetzt und die Kulturen über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Die den primären Antikörper enthaltende Lösung wurde durch Waschen mit PBS entfernt. Das gebundene Immunglobulin wurde durch das Vectastain-"ABC"-Verfahren nachgewiesen. Diaminobenzidentetrahydrochlond (DAB) wurde als Substrat für die üblicherweise ein bis fünf Minuten lange Peroxidase-Reaktion verwendet. Die Reaktion wurde durch Spülen der Kulturen zweimal mit 0,1 M Tris-HCl, pH 7,2, beendet. Die Kulturen wurden in 50 mM Tris- Puffer, pH 7,6, der 0,15 M NaCl, 42% Glycerin und 0,15% Zephiran (Pierce Chemical Co., Rockville, IL) enthielt, bei 4ºC aufbewahrt.

12.1.6. Verfahren zur Erzeugung von gereinigten Kulturen von Sternzellen

Gereinigte Gliakulturen wurden im wesentlichen durch das Verfahren von McCarthy und Devellis (McCarthy, K. D., und DeVellis, J., 3. Cell Biol. 85 (1980), 890-902) aus dem Hippokampus von postnatalen Ratten im Alter von 1 bis 2 Tagen hergestellt. Der Hippokampus wurden von fünf Jungtieren entfernt und mit einer Schere zerkleinert. Die Gewebeteile wurden anschließend in 2 ml 0,125 % Trypsin 20 Minuten bei 37ºC gespalten. Die Protease wurde durch Verdünnung mit Plattierungsmedium (10% fötales Rinderserum, Gibco, DMEM, 0,5% Penicillin (5 000 mcg/ml) und 0,5% Glutamin) inaktiviert. Eine aus einzelnen Zellen bestehende Suspension wurde durch Durchleiten der gespaltenen Gewebefragmente durch eine eingeengte Pasteur-Pipette hergestellt. Die Zellen wurden durch eine fünfminütige Zentrifugation bei 900 Upm pelletiert, in Plattierungsmedium resuspendiert und anschließend mittels eines Hämocytometers gezählt. Die aus einzelnen Zellen bestehende Suspension wurde in drei 75 cm² Gewebekulturflaschen aufgeteilt, und die Zellen wurden bis zu einer etwa 80%igen Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden anschließend durch ein dem gerade beschriebenen ähnlichen Trypsinisierungsprotokoll subkultiviert. Die Glia-Zellen wurden gezählt und bei einer Dichte von 10 000 Zellen/0,9 cm² plattiert.

12.2. Ergebnisse

12.2.1. Die Wirkung von BDNF auf die in Kulturen des ventralen Mittelhims vorhandene Tyrosinhydroxylase

Die immuncytochemische Anfärbung, wie vorstehend in Abschnitt 12.1.2. beschrieben, wurde zur Messung der Wirkung von BDNF auf die Zahl der Tyrosinhydroxylase (TH)-positiven Zellen (Figur 8) verwendet. Eine maximale Erhöhung von mehr als 200 Prozent der Kontrolle wurde am Tag 8 in BDNF-stimulierten Kulturen von ventralen Mittelhirnzellen beobachtet. Eine sehr geringe Erhöhung wurde so früh wie am Kulturtag 3 in BDNF-stimulierten Kulturen beobachtet.

12.2.2. Die Wirkung von BDNF auf die Dopaminaufuahme durch Kulturen des ventralen Mittelhirns

Die ³H-Dopamin (³H-DA)-Aufnahme wurde, wie von Dal Taso et al. (J. Neurosci. 8 (1988), 733-745) beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen, wie vorstehend in Abschnitt 12.1.3. beschrieben, gemessen. Eine leichte Erhöhung der Dopaminaufnahme wurde bei BDNF-stimulierten Kulturen des ventralen Mittelhims am Tag 8 in Kultur (Figur 9) beobachtet.

12.2.3. Die Wirkung von BDNF auf die Expression der Cholin-Acetyltransferase durch cholinerge Neuronen des Prosencephalons

Figur 10(a) zeigt die Wirkung von BDNF auf die Zahl von CAT-positiven Zellen nach einer Wachstumsperiode von 12 Tagen in vitro. Eine 5,9fache Erhöhung der CAT-positiven Zellzahl wurde bei der Zugabe von 100 ng/ml BDNF beobachtet, während der EC50-Wert als 10 ng/ml berechnet wurde. Als positive Kontrolle wurden die Kulturen bei 260 000 (schwarzer Balken) oder 150 000 (schraffierter Balken) Zellen pro Vertiefung in identischer Weise mit NGF (Figur 10(b)) behandelt. Die Dichte mit 260 000 Zellen pro Vertiefung entspricht der für die BDNF-Untersuchung verwendeten. Diese Erhöhung der Zahl der CAT-immunpositiven Zellen ist der vorstehend beschriebenen ähnlich. Das Einwirkungspotential von BDNF auf cholinerge Neuronen wurde ferner durch Messung der CAT-Enzymaktivität (F. Fonnum, J. Neurochemistry 24 (1975), 407-409) untersucht. Figur 11 zeigt die Veränderungen von CAT, die bei einer BDNF-Behandlung erzeugt werden. In diesem Fall wurde eine 1,8fache Erhöhung mit 100 ng/ml BDNF erreicht und der EC50-Wert als 61 ng/ml berechnet.

12.2.4. Wirkung von BDNF oder EGF auf Kulturen von Sternzellen

Es wurde gezeigt, daß Typ II-Sternzellen Rezeptoren mit hoher Affinität für eine Reihe von Neurotransmittern und Neuropeptiden aufweisen. Sternzellen können daher auf von Neuronen stammende Signale antworten. Aus diesem Grund und da die Typ II-Sternzellen einen zellulären Bestandteil in den primären Kulturen darstellten, wurde eine mögliche direkte Wirkung von BDNF auf Gliazellen getestet. Die Zellen wurden in vitro vier Tage vor der Zugabe von Wachstumsfaktoren gezüchtet, so daß sie eine Konfluenz von etwa 60% erreichen konnten, und wurden anschließend 42 Stunden mit EGF oder BDNF behandelt. Die letzten 18 Stunden der Ihkubation war [³H]- Methylthymidin im Medium vorhanden. Die Wirkung von EGF ist in Figur 12(a) dargestellt. Wie vorstehend beschrieben, wurde festgestellt, daß EGF für Sternzellen mitogen ist. Die maximale Antwort wurde bei 10 ng/ml EGF beobachtet, was eine 5,2fache Erhöhung der Aufnahme von [³H]-Methylthymidin erzeugte. Figur 12(b) zeigt die Wirkung von BDNF auf die Aufnahme von [³H]-Methylthymidin. Die Antwort auf BDNF war anscheinend zweiphasig: sehr geringe Dosen (0,1 ng/ml) erzeugten eine leichte Erhöhung der Thymidinaufnahme; während Dosen von mehr als 1 ng/ml BDNF die Aufnahme von [²H]-Methylthymidin hemmten. BDNF in einer Dosierung von 5 ng/ml erzeugte eine Hemmung von 24%, was den Schluß zuläßt, daß die Proliferationsrate von Gliazellen über den Behandlungszeitraum abnimmt.

12.3. Diskussion

Diese in vitro-Experimente zeigen deutlich, daß BDNF das Überleben von dopaminergen Neuronen der sich entwickelnden Ratten-Substantia nigra unterstützt oder ihren vollständig differenzierten Zustand induziert, wie durch Tyrosinhydroxylase- Anfärbung und Dopamin-Aufnahme in Kulturen dieser vom Mittelhirn von Rattenembryonen stammenden Neuronen gezeigt wurde. Da es sich um bei die Parkinson-Krankheit degenerierte Neuronen handelt, ist es höchst wahrscheinlich, daß BDNF ein therapeutisches Potential bei der Parkinson-Krankheit entweder durch Reduktion des Neuronenverlustes oder durch Erhöhung der Tyrosinhydroxylase-Mengen (das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Dopamin-Synthese) oder möglicherweise durch beides aufweist.
Wie der Nervenwachstumsfaktor (NGF) hat BDNF ferner anscheinend eine Wirkung auf das Überleben von cholinergen Neuronen des basalen Prosencephalons von Ratten, wie durch eine verstärkte Cholin-Acetyltransferase (CAT)-Anfärbung, erhöhte CAT-Aktivität und verstärkte Acetylcholinesterase-Anfärbung in Kulturen des medialen septalen Kerns von Rattenembryos und dem Kern des Broca'-Diagonalbandes gezeigt wurde. Daher kann BDNF allein oder zusammen mit NGF zur Behandlung von Krankheiten oder Störungen verwendet werden, die die cholinergen Neuronen des basalen Prosencephalons betreffen, einschließlich beispielsweise der Alzheimer-Krankheit.

13. Identifizierung eines neuen Gens in der BDNF/NGF-Genfamilie

Das Verfahren zur Identifizierung von neuen Mitgliedern der NGF/BDNF- Genfamilie unter Verwendung der PCR mit degenerierten Oligonucleotiden auf der Basis der konservierten Abschnitte der Aminosäuresequenzen von NGF und BDNF wurde zunächst getestet, indem ermittelt wurde, ob Paare dieser Primer zur Amplifikation sowohl der NGF- als auch der BDNF-Gensequenzen von genomischer DNA von mehreren Spezies verwendet werden können. Dieses Verfahren wurde anschließend zur Identifizierung eines neuen Gens verwendet, das eine Homologie zu NGF und BDNF in allen vier angegebenen Homologie-Boxen aufweist. Vgl. nachstehende Tabelle III. Tabelle III

13.3. Diskussion

Wie vorstehend dargestellt (Figur 13), hybridisierte die DNA-Sonde, die durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primem für die Boxen 1 und 2 mit genomischer DNA von Ratte als Matrize (R1B/2C) erhalten wurde, mit neuen Banden, zusätzlich zu denen, die bekanntermaßen NGF- und BDNF-Gensequenzen in EcoRI-gespaltener DNA von allen getesteten Arten enthielten. Eine ähnliche Analyse wurde unter Verwendung einer radioaktivmarkierten Sonde für das neue Gen, das unter Verwendung von Box 3 und 4-Primem mit genomischer DNA der Maus (M3/4) amplifiziert wurde, durchgefülrrt. In jedem Fall hybridisierte die M3/4-Sonde mit einer einzelnen Hauptbande von EcoRI-gespaltener genomischer DNA, die sich von den Banden unterschied, die bekanntermaßen die BDNF- und NGF-Sequenzen enthielten. Es sollte beachtet werden, daß die EcoRI-Fragmente der genomischen DNA von Maus, Ratte und Huhn, die durch Hybridisierung mit der M3/4-Sonde beobachtet wurden, in jedem Fall mit einer der neuen Banden übereinstimmten, die durch Hybridisierung mit der R1B/2C- Sonde erhalten wurden. Diese sind das 19,0 kb-EcoRI-Fragment von Maus-DNA (Xl in Figur 14), das 7,3 kb-Fragment von Ratten-DNA (X1 in Figur 14) und die 2,6 kb- Bande von Hühner-DNA (X in Figur 14). Dies läßt darauf schließen, daß Teile des gleichen Gens von Ratten-DNA unter Verwendung des 18/2C-Primerpaars und von Maus- DNA unter Verwendung des 3/4-Primerpaars amplifiziert wurden. Mindestens ein neues Gen weist daher anscheinend eine Homologie mit NGF- und BDNF-Genen in allen vier vorstehend beschriebenen Homologie-Boxen auf.
Das Konzept der Homologie-Boxen zwischen NGF, BDNF und weiteren Mitgliedern der Genfamihe (z. B. "M3/4", auch als NT-3 bekannt) wurde hier primär in Form der primären Aminosäuresequenz und in Form von Verfahren zur Identifizierung von neuen Genen in der Familie beschrieben. Es ist jedoch wichtig anzumerken, daß wahrscheinlich auch die Sekundär- und Tertiärstruktur dieser neurotrophen Faktoren, ihre Interaktionen mit spezifischen Rezeptoren und eine rationelle Entwicklung von neuen Molekülen mit einem potentiellen therapeutischen Wert von Bedeutung sind.
Es gibt beispielsweise 6 Cys-Reste im NGF und es wurde gezeigt, daß sie alle an Disulfid-Bindungen beteiligt sind. Aus ihrer Numerierung vom äußersten N- Terminus zum äußersten C-Terminus als Cys1 - Cys6 ist bekannt, daß die Disulfidbrücken zwischen Cys1 - Cys4, Cys2 - Cys5, Cys3 - Cys6 enthalten sind. Die Positionen von allen 6 Cys-Resten sind zwischen NGF und BDNF konserviert, und die Positionen von 3 Cys-Resten in dem bisher sequenzierten Teil von "M3/4" zeigen genau die gleiche Anordnung wie Cys4, Cys5 und Cys6 von NGF und BDNF. Dies läßt darauf schließen, daß die Sekundärstruktur bei allen Mitgliedern der Genfamihe eng verwandt ist und im wesentlichen von den konservierten Cys-Resten bestimmt wird. Es muß angemerkt werden, daß die für BDNF und NGF beschriebenen Homologie-Boxen 5 der 6 Cys-Reste enthalten (Cys1 in Box 1, Cys2 in Box 2, Cys3 und Box 3, Cys5 und Cys6 in Box 4). Dies stützt die Idee, daß diese Cys-Reste und ihre unmittelbaren Nachbarn eine wichtige Rolle bei der Ermittlung der allgemeinen Struktur dieser neurotrophen Faktoren spielen. Die strukturellen Determinanten für eine spezifische Interaktion mit Rezeptoren von hoher Affinität für jeden der neurotrophen Faktoren liegen vermutlich in einmaligen Teilen jedes Moleküls
Daher können neue chimäre Gene durch Rekombination zwischen Familienmitgliedern (z. B. durch in vitro-Rekombination oder direkte Gensynthese) an jeder der bereits beschriebenen vier Homologie-Boxen oder an einer anderen Stelle im Molekül produziert werden. Diese chimären Moleküle weisen wahrscheinlich eine ähnliche Sekundärstruktur aufgrund der Konservierung von Cys-Resten und anderen Aminosäureresten auf, können jedoch neue biologische Eigenschaften besitzen. Ein chimäres BDNF/NGF-Protein kann beispielsweise in bezug auf eine Interaktion sowohl mit BDNF- als auch NGF-Rezeptoren bifunktionell sein. Chimäre Proteine können sich auch von einem parentalen Molekül(en) in bezug auf eine Dimerisierung und andere physikalisch-chemische Eigenschaften unterscheiden. Die chimären Proteine können auch als Antagonisten der parentalen Moleküle wirken.
Die aktiven Fragmente von BDNF/NGF können zur Entwicklung von anderen Familienmitgliedern verwendet werden, wobei von der Kenntnis von kritischen "Kern"- Bereichen für eine geeignete Faltung sowie der Information über für eine artspezifische Interaktion mit Rezeptoren erforderliche Bereiche ausgegangen wird.
Ein Vergleich von neuen Familienmitgliedern (z. B. "M3/4") mit bereits bekannten Familienmitgliedern kann zum Aufzeigen neuer Homologie-Boxen verwendet werden, die bei der Suche nach weiteren Mitgliedern der BDNF/NGF-Genfamilie helfen können. Ein Vergleich von "M3/4" mit BDNF zeigt beispielsweise einige nützliche Homologie-Boxen. Eine von besonderem Interesse umfaßt den vierten konservierten Cys-Rest, dem einzigen, der nicht in den zuvor beschriebenen Boxen 1 bis 4 liegt. Es gibt tatsächlich einen ziemlich langen Abschnltt der Übereinstimmung oder einer von BDNF und "M3/4" geteilten konservierten Aminosäuresubstitution, die diesen Cys-Rest einschließt, nämlich: His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys-(Arg oder Lys)-Thr-(Thr oder Ser)-Gln- (Ser oder Thr)-Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr. Innerhalb dieses Bereichs konnten mindestens zwei Homologie-Boxen zur Synthese von nützlichen degenerierten Oligonucleotidprimern (z. B. His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys erfordert nur eine 96fache Degeneriertheit für einen 18-mer-Primer oder eine 48fache Degeneriertheit für einen 17-mer-Primer; Tyr- Val-Arg-Ala-Leu-Thr wäre auch eine nützliche Box) gewählt werden.

14. Beispiel: Erhöhte Expression von BDNF in Neuroblastomzellen

14.1. Materialien und Verfahren

14.1.1. Zellinien

CHP100, CHP126, CHP134, CHP234, LAN1, LAN5, NB9, SY5Y, Y79, FO1, BU2, HO1, HL60 und COL320 sind im Labor von Dr. Fred Alt gehaltene Zellinien, die die RNA für den in Figur 15 verwendeten Northern-Blot lieferten. Alle Zellinien waren menschliche Tumorzellinien. CHP 100 ist eine Neuroepitheliom- Zellinie; CHP126, CHP134, CHP234, LAN1, LANS, NB9 und SY5Y sind Neuroblastom-Zellinien; Y79 ist eine Retinoblastom-Zellinie; FO1, BU2 und HO1 sind Melanom-Zellinien, HL60 ist eine promyelocytische Leukämie-Zellinie und COL320 ist eine neuroendokrine Dickdarm-Carcinom-Zellinie.

14.1.2. Herstellung von RNA

Die Herstellung der RNA und die Durchführung der Northem-Blots erfolgte im wesentlichen, wie vorstehend in Abschnitt 8.1.1. beschrieben, unter Verwendung einer menschlichen cDNA-Sonde von vollständiger Länge. 10 µg Gesamt-RNA waren in jeder Bahn des Gels, das zur Herstellung des Northern-Blots von Figur 15 verwendet wurde, ausgenommen daß die RNA von LAN1 weniger reichlich aufgetragen war und für SYSY 1 µg poly(A)&spplus;-RNA verwendet wurde.

14.2. Ergebnisse

Figur 15 zeigt die Ergebnisse der Northem-Blot-Analyse der BDNF-Sonde, die mit einer Reihe von RNA-Proben, die von menschlichen Zellinien erhalten wurden, hybridisiert wurde. Eine große Menge RNA, die an eine BDNF-Sonde hybridisierte, wurde in CHP234- und LAN5-Zellinien nachgewiesen, und geringere Mengen wurden in CHP126 und CHP134 festgestellt. Alle positiven Linien stammten von menschlichen Neuroblastomtumoren.

15. Beispiel: Vermittlung der aktivitätsabhängigen Regulation von BDNF- und NGF- mRNAs in Ratten-Hippokampus durch Non-NMDA-Glutamat-Rezeptoren

15.1. Materialien und Verfahren

15.1.1. Behandlung von Ratten mit Kainsäure

Die Ratten erhielten üblicherweise 12 mg/kg Diazepam (Valium) 90 Minuten nach der intraperitonealen Injektion von Kainsäure zur Unterdrückung der Aktivität starker Anfälle. Wie in Fig. 19 dargestellt, störte nach der Kainsäure verabreichtes Valium die weitere Erhöhung der BDNF- und NGF-mRNA-Mengen nicht. Ratten, die kein Valium erhielten, zeigten ähnliche Erhöhungen der BDNF- und NGF-mRNA- Mengen im Hippokampus 3 Stunden nach der Kainsäure im Vergleich zu Tieren, die Kainsäure und anschließend Valium erhielten.

15.1.2. Herstellung von Hippokampus-Kulturen

Hippokampi wurden aus E17-Tage alten Rattenembryonen gewonnen, seziert und 20 Minuten bei 37ºC in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calciumoder Magnesiumionen, jedoch mit 10 mM Glucose, 1 mglml Albumin, 6 µg/ml DNASE und 1 mg/ml Papain inkubiert. Nach dem Waschen mit der Papain-freien Lösung wurden die Hippokampus-Zellen vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteurpipette abgetrennt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit gesammelt, in DMEM resuspendiert, 10% fötales Kälberserum zugesetzt und auf Plastikkulturschalen (0,5 x 10&sup6; Zellen pro 35 mm), die zuvor mit Poly-DL-Ornithin (0,5 mg/ml) und Laminin (5 µg/ml) beschichtet wurden, plattiert. Drei Stunden nach der Plattierung wurde das Medium gegen ein serumfreies Medium ausgetauscht, das die Zusätze, wie von Brewer und Cotman (Brain Res. 497 (1989), 65) beschrieben, enthielt, dem jedoch Glutamat fehlte. Die Neuronen blieben bis zu drei Wochen in Kultur lebensfähig und wurden üblicherweise am Tag 7 nach der Plattierung für Experimente verwendet.

15.1.3. RNA-Amplifikation

Die zelluläre Gesamt-RNA wurde, wie von Chomcynski und Sacci (Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159) beschrieben, von 0,5 x i0&sup6; Zellen nach der Zugabe eines verkürzten NGF-cRNA-Standards für die Ausbeute (30 fg) extrahiert. NGF-mRNA und cRNA wurden in einer kombinierten in einem Rohr erfolgenden reversen Transkription/Polymerasekettenreaktion (RT/PCR), die 1/5 der extrahierten RNA, 1 x RT/PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mg/ml Gelatine, 0,1% Triton X-100), 0,25 mM dNTP, 0,1 µM des 5'- bzw. 3'-Primer, 5 E Rnasin (Promega), 3,2 E AMV-reverse Transkriptase (Life Science) und 2 E Taq- Polymerase (Genofit) in einem Gesamtvolumen von 25 µl enthielt, coamplifiziert. Das Gemisch wurde mit Mineralöl überschichtet, 30 Minuten bei 41 ºC inkubiert, 60 Sekunden auf 92ºC erhitzt, die Primer 60 Sekunden bei 55ºC aneinandergelagert und die Primerextension 60 Sekunden bei 72ºC durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte (203 bp für NGF-mRNA und 153 bp Standard für die Ausbeute) wurden in einem 3 % Nusieve/Agarose (3:1)-Gel (FMC Bioproducts aufgetrennt), mit Alkali-Lösung auf eine Hybond N plus-Membran (Amersham) transferiert und, wie beschrieben (Heumann, R. und Thoenen, H., J. Biol. Chem. 261 (1986), 9246, und Lindhold et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 16348), hybridisiert. Für die absolute quantitative Bestimmung wurden bekannte Mengen von in vitro transkribierter NGF-mRNA und von Standard für die Ausbeute in parallelen Reaktionen coamplifiziert. Kürzlich wurde ein ähnliches Verfahren von Wang et al. (PNAS 86 (1989), 9717-9721) beschrieben.

15.2. Ergebnisse und Diskussion

BDNF und NGF sind Mitglieder einer Genfamihe mit einer etwa 50% Aminosäureübereinstimmung (Leibrock et al., Nature 341 (1989), 149). Die Moleküle zeigen streng konservierte Domänen. In diesen Domänen sind die 6 Cysteinreste enthalten, die höchstwahrscheinlich an der Stabilisierung der für die biologische Aktivität erforderlichen dreidimensionalen Struktur dieser Moleküle beteiligt sind. Es gibt jedoch auch variable Domänen in BDNF und NGF, die ihre unterschiedliche neuronale Spezifität festlegen (Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319, Johnson et al., J. Neurosci. 6 (1986), 3031, Hofer, M. und Barde, Y., Nature 331 (1988), 261, und Rodriguez-Tebar et al., Dev. Biol. 136 (1989), 296). Der Unterschied zwischen diesen beiden neurotrophen Molekülen wird ferner durch den Ort ihrer Synthese angezeigt. NGF wird sowohl im peripheren Nervensystem (Korsching, S. und Thoenen, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 3513, Ebendal et al., Exp. Cell Res. 148 (1983), 311, Heumann et al., EMBO 3.3 (1984), 3183, Dhelton, D. L. und Reichardt, L. F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7951) als auch im zentralen Nervensystem (ZNS) (Korsching et al., EMBO J. 4 (1985), 1389, Shelton, D. L. und Reichardt, L. F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 2714, Whittemore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 817, und Large et al., Science 234 (1986), 352) exprimiert. Die Dichte der Innervation durch auf NGF-antwortende Neuronen gibt die NGF-Mengen in den entsprechenden Zielgeweben wider (Korsching, S. und Thoenen, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 3513, Ebendal et al., Exp. Cell Res. 148 (1983), 311, Heumann et al., EMBO J. 3 (1984), 3183, Dhelton, D. L. und Reichardt, L. F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7951, Korsching et al., EMBO J. 4 (1985), 1389, Shelton, D. L. und Reichardt, L. F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 2714, Whittemore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 817, und Large et al., Science 234 (1986), 352). Im Gegensatz zu NGF wird BDNF hauptsächlich in Neuronen des ZNS exprimiert, und die BDNF-mRNA-Mengen sind wesentlich höher, z. B. etwa Sofach im Hippokampus, als die NGF-mRNA-Mengen. Im peripheren Nervensystem wird NGF durch verschiedene nicht-neuronale Zelltypen synthetisiert (Bandtlow et al., EMBO J. 6 (1987), 891), während es im Gehirn hauptsächlich in Neuronen lokalisiert ist, wie es durch In situ-Hybridisierung gezeigt wird (Rennert, P. D. und Heinrich, G., Biochem. Biophys. Res. Commun. 138 (1986), 813, Ayer-LeLievre et al., Science 240 (1988), 1339, und Whittemore et al., J. Neurosci. Res. 20 (1988), 403). Es wurde jedoch gezeigt, daß gezüchtete Typ-1-Sternzellen ebenfalls signifikante Mengen NGF produzieren (Lindsay, R. M., Nature 282 (1979), 80, und Furukawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (1987), 395). Der relative Beitrag von Neuronen und Sternzellen zum im Gehirn synthetisierten NGF ist noch unbekannt.
Angesichts der vorherrschenden Expression sowohl von BDNF- als auch NGF-mRNAS in Neuronen des zentralen Nervensystems wurde untersucht, ob die Mengen dieser beiden mRNAS durch die neuronale Aktivität beeinflußt werden, und wenn dies der Fall ist, welche(r) Transmitter möglicherweise an der Regulation beteiligt sind. In einer ersten Reihe von Experimenten wurden neuronale Kulturen des Hippokampus von Rattenembryonen (E17) hergestellt. Wie in Fig. 16a dargestellt, bewirkte die Depolarisierung der Hippokampus-Neuronen mit einem hohen (50 mM) Kahumgehalt eine Erhöhung der BDNF-mRNA-Menge. Die maximalen Mengen wurden 3 bis 6 Stunden nach der Erhöhung der Kaliumkonzentration erreicht. Die Kalium vermittelte Erhöhung der BDNF-mRNA-Menge konnte durch Abwesenheit von Calciumionen im Medium gehemmt werden, und sie konnte ferner durch Inhibition des Calciumstroms durch den Calciumkanal-Blocker Nifedipin (Fig. 16b) reduziert werden.
Da die verwendeten Hippokampus-Kulturen aus einer gemischten Population von Neuronen bestanden, die unterschiedliche Muster der Transmitter- und Rezeptorexpression zeigten, wurde die Wirkung von verschiedenen physiologischen und synthetischen Rezeptoragonisten auf die BDNF- und NGF-mRNA-Expression untersucht. Die in Tabelle VI dargestellten Ergebnisse zeigen, daß von allen getesteten Substanzen Kainsäure, ein Glutamat-Rezeptor-Agonist (Monaghan et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29 (1989), 365), bei weitem die größte Erhöhung der BDNF- mRNA-Menge in Hippokampus-Neuronen produzierte. Im Gegensatz dazu erhöhten andere Moleküle wie Carbachol (ein Muskarin-Rezeptor-Agonist) und in geringerem Ausmaß Histamin und Bradykinin leicht, jedoch signifikant, die BDNF-mRNA-Menge (Tabelle VI). Da die NGF-mRNA-Mengen in den Hippokampus-Neuronen sehr gering waren, wurde ein quantitatives Polymerasekettenreaktions (PCR)-Verfahren, das zur Ermittlung von Veränderungen der NGF-mRNA geeignet ist, etabliert. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, daß wie die BDNF-mRNA-Mengen auch die NGF-mRNA-Mengen durch Kalium und Kainsäure in Hippokampus-Neuronen erhöht wurden (Figur 17).
Wie in Figur 18 dargestellt, wurde die maximale Erhöhung der BDNF- mRNA-Menge in Hippokampus-Neuronen mit etwa 25 µM Kainsäure erhalten. Eine weitere Erhöhung der Kainsäure-Konzentration bewirkte eine Abnahme der BDNF- mRNA-Mengen, was höchstwahrscheinlich die toxische Wirkung der hohen Konzentrationen von Kainsäure auf Hippokampus-Neuronen widerspiegelt (Figur 18). Eine Glutamat-Rezeptor-vermittelte Neurotoxizität wurde zuvor (Choi et al., J. Neurosci. 7 (1987), 357, Rothman, S. M. und Olney, J. W., Trends Neurosci. 10 (1987), 299, und Choi, D. W., Neuron 1 (1988), 623) für verschiedene zentrale Neuronen nach der Verwendung von Analogen der anregenden Aminosäure Glutamat beschrieben. Die Kainsäure-Konzentrationen, die zur Erhöhung der Expression von BDNF- und NGF-mRNA in Hippokampus-Neuronen erforderlich sind, konnten deutlich von den zur Neurotoxizität führenden Konzentrationen unterschieden werden.
Zur genaueren Untersuchung der Wirkungen von Kainsäure wurde getestet, ob die Erhöhung der BDNF-mRNA-Menge durch einen der bekannten Glutamat- Rezeptor-Antagonisten (Monaghan et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29 (1989), 365) blockiert werden konnte. Kynurensäure, ein Breitspektrum-Glutamat-Rezeptor- Antagonist, sowie CNQX, ein kompetitiver Inhibitor von Non-NMDA-Rezeptoren (Monaghan et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29 (1989), 365), blockierte die Kainsäure-vermittelte Erhöhung der BDNF-mRNA-Menge in Hippokampus-Neuronen vollständig (Tabelle VII). Andererseits war das NMDA-Rezeptoren spezifisch blockierende MK 801 bei der Blockierung der Erhöhung der BDNF-mRNA-Menge in diesen Neuronen ineffektiv. Ferner veränderte NMDA selber nicht die BDNF-mRNA-Mengen (Tabelle VI). Dies zeigt, daß Kainsäure direkt über seine Rezeptoren wirkt und daß die Wirkung nicht auf das Freisetzen von endogenem Glutamat (das auch auf NMDA- Rezeptoren wirkt) zurückgeht. Es kann daher der Schluß gezogen werden, daß Kainsäure in vitro die BDNF-mRNA-Mengen über Non-NMDA-Glutamat-Rezeptoren erhöht. Tabelle VI Wirkung von verschiedenen Rezeptoragonisten auf die BDNF-mRNA-Expression in gezüchteten Neuronen Tabelle VII Wirküng von Antagonisten für die verschiedenen Glutamat-Rezeptoren auf die Kainsäure-induzierte Expression von BDNF-mRNA Zugabe % Kontrolle
Zur Beurteilung der physiologischen Bedeutung der In vitro-Beobachtungen wurde untersucht, ob ähnliche Mechanismen auch in vivo funktionieren. Erwachsene Wistar-Ratten beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht von 180 bis 200 g wurden mit 12 mg/kg Kainsäure behandelt. Nach unterschiedlichen Zeiträumen wurden die Veränderungen in den BDNF- und NGF-mRNAS im Hippokampus und Cortex durch Northern-Blot-Analyse ermittelt. Fig. 19 zeigt, daß Kainsäure eine Erhöhung der BDNF- und NGF-mRNA-Mengen in beiden Hirnregionen erzeugt. Die Erhöhung der BDNF-mRNA-Menge war wesentlich größer als die der NGF-mRNAmRNA-Menge. Über 24 Stunden nach der Kainsäure-Verabreichung dauerte ferner die Erhöhung der mRNA- Mengen an. Der Zeitverlauf der Veränderungen der BDNF- und NGF-mRNA zeigte, daß die maximale Erhöhung im Hippokampus etwa 3 Stunden nach der Verabreichung von Kainsäure erreicht wurde (Fig. 19). Es ist interessant anzumerken, daß der Erhöhung der BDNF- und NGF-mRNAS im Hippokampus eine Erhöhung der c-fosmRNA vorausging; die beiden Phänomene können ursächlich verbunden sein, wie es kürzlich für den Ischiasnerv nach einer Läsion gezeigt wurde (Hengerer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3899). Es gibt ferner eine verzögerte Erhöhung sowohl von BDNF- als auch NGF-mRNAS im cerebralen Cortex im Vergleich zur Erhöhung im Hippokampus, was anzeigt, daß die zu einer erhöhten Expression von BDNF und NGF führenden Signale sich vom Hippokampus zu anderen Hirnregionen ausbreiteten. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Berichten überein (Morgan et al., Science 237 (1987), 192), die zeigen, daß die Erhöhung von c-fos, die durch das Krampfgift Metrazol erzeugt wurde, zuerst im Hippokampus und anschließend im Cortex auftrat.
Nachdem frühere Untersuchungen den Beweis geliefert hatten, daß NMDA- Rezeptoren an der Regulation von Hippokampus-mRNAS wie NGFI-A beteiligt sind (Cole et al., Nature 340 (1989), 474), wurde anschließend untersucht, ob die NMDA- Rezeptor-Antagonisten MK 801 und Ketamin die Erhöhung der BDNF- und NGFmRNA-Mengen in vivo blockieren konnten oder nicht. Jedoch, und das bestätigt die hier erhaltenen In vitro-Ergebnisse, hemmte MK 801 die Kainsäure-vermittelte Erhöhung der Hippokampus-BDNF-mRNA nicht, obwohl es die durch die NMDA- Rezeptor-Aktivierung bewirkten Anfälle effektiv unterdrückte (Fig. 20). Diese NMDA- Rezeptoraktivierung wird wahrscheinlich von durch Kainsäure freigesetztem endogenem Glutamat bewirkt (Biziere, K. und Coyle, T., Neurosci. Lett. 8 (1978), 303, und McGeer et al., Brain Res. 139 (1978), 381). In ähnlicher Weise wurde die Erhöhung der NGF-mRNA-Menge im Hippokampus nach der Kainsäure-Behandlung weder von MK 801 noch von Ketamin verhindert. In einer früheren Untersuchung (Gall, C. M. und Isackson, P. J., Science 245 (1989), 758) wurde gezeigt, daß limbische Anfälle verursachende elektrolytische Läsionen NGF-mRNA-Mengen im Ratten-Hippokampus erhöhen. Die mit MK 801 und Kainsäure erhaltenen bisherigen Ergebnisse zeigten jedoch eine klare Unterscheidung zwischen der Induktion der Anfälle und Erhöhungen der BDNF- und NGF-Expression. Die Diazepam (Valium)-Behandlung von Ratten vor den Injektionen von Kainsäure blockierte vollständig die Erhöhung der BDNF- und NGF- mRNA-Mengen im Ratten-Hippokampus (Figur 20). Die blockierende Wirkung von Diazepam auf die Erhöhung der BDNF- und NGF-mRNA-Mengen wurde höchstwahrscheinlich durch die Unterdrückung der neuronalen Aktivität über das inhibitorische Gabaerge-System bewirkt. 90 Minuten nach der Verabreichung von Kainsäure (d. h., etwa 30 Minuten nach dem Beginn des Krampfes) konnte jedoch die Erhöhung der BDNF- und NGF-mRNA-Mengen durch Diazepam nicht länger blockiert werden, was anzeigt, daß ein relativ kurzer Zeitraum mit vermehrter Aktivität ausreichen kann, um eine Kaskade von Ereignissen zu initiieren, die zu einer erhöhten Expression der mR- NAs der beiden neurotrophen Faktoren führt.
Die vorliegende Untersuchung zeigte, daß Non-NMDA-Rezeptoren an der Regulation von BDNF- und NGF-mRNA im Hippokampus beteiligt sein können, wodurch sich dieser regulatorische Mechanismus von dem zuvor von Cole et al. beschriebenen (Cole et al., Nature 340 (1989), 474) unterscheidet, was den Schluß zuläßt, daß frühe Gene codierende Hippokampus-mRNAS anscheinend über den NMDA-Subtyp der Glutamat-Rezeptoren reguliert werden. Es wurde berichtet, daß einige der Wirkungen von Kainsäure auf Neuronen auch durch den Quisqualat-Typ der Glutamat-Rezeptoren vermittelt werden können (Monaghan et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29 (1989), 365).
Die vorliegende Untersuchung zeigte also, daß die neuronale Aktivität die Mengen von die neurotrophen Faktoren BDNF und NGF im Hippokampus und Cortex von Ratte codierenden mRNAS reguliert. Von allen getesteten Substanzen erhöhte Kainsäure, die über die Non-NMDA-Glutamat-Rezeptoren wirkt, die BDNF- und NGF- mRNA-Mengen sowohl in vivo als auch in neuronalen Hippokampus-Kulturen. Im Gegensatz dazu gibt es in der Peripherie keinen Hinweis, daß die NGF-Synthese in Non-Neuronen-Zellen durch übliche Transmittersubstanzen oder Neuropeptide, die durch innervierende (auf NGF antwortende) Neuronen freigesetzt werden, reguliert wird (Barth et al., J. Cell Biol. 99 (1984), 839, und Hellweg et al., Exp. Cell Res. 179 (1988), 18). BDNF wird überwiegend im ZNS exprimiert, und es gibt mindestens ein partielles Überlappen zwischen den zentralen Wegen, die Glutamat als Neurotransmitter verwenden, und Bereichen, von denen gezeigt wurde, daß sie relativ reich an BDNFund NGF-mRNA sind (Hofer et al., EMBO J., im Druck; Monaghan et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29 (1989), 365). Insbesondere gibt es eine auffallende Übereinstimmung zwischen der Verteilung von NGF-mRNA, wie es durch In situ- Hybridisierung gezeigt wurde (Hofer et al., EMBO J., im Druck), und den Kainsäure- Rezeptoren, die durch Autoradiographie im Hippokampus, cerebralen Cortex und Cerebellum sichtbar gemacht wurden (Monaghan et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29 (1989), 365). Die Beobachtungen passen zur Interpretation, daß Glutamat den physiologischen Transmitter, der die BDNF- und NGF-mRNA-Mengen im ZNS reguliert, darstellt.

16. Beispiel: Der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor erhöht in Kultur die Überlebensrate von septalen cholinergen Neuronen von Ratten und bewirkt eine Zunahme von differenzierten Funktionen

16.1. Materialien und Verfahren

16.1.1. Herstellung von abgetrennten Zellen und Zellkulturbedingungen

Die septale Region von Ratten (Sprague-Dawley) wurde nach 17 Tagen der Gestation durch Sezieren vom umliegenden Gewebe freigelegt. Die Gewebefragmente wurden vereinigt, dreimal mit Hams-F-10 gewaschen und anschließend auf eine 35 mm- Gewebekulturschale transferiert und zerkleinert. Eine Suspension aus einzelnen Zellen wurde durch Inkubation des Gewebes mit 0,25% Trypsin 20 Minuten bei 37ºC hergestellt. Nach der Inaktivierung des Trypsins durch eine fünfminütige Ihkubation bei Raumtemperatur in einem Wachstumsmedium (nachstehend), das 50 µg/ml Desoxyribonuclease Typ 1 (Sigma) enthielt, wurden die Zellen durch wiederholtes Hindurchleiten der Fragmente durch die verengte Spitze einer Pasteur-Pipette getrennt. Die getrennten Zellen wurden anschließend bei 500 x g 45 Sekunden zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und erneut zentrifugiert. Die getrennte Zellen enthaltenden Pellets wurden resuspendiert und in Wachstumsmedium vereinigt, und die Zellausbeute wurde unter Verwendung eines Hämocytometers ermittelt. Schließlich wurden die Zellen in mit Polyomithin (10 µg/ml) und Laminin (10 µg/ml) beschichtete 6 mm- Vertiefungen plattiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach 24 Stunden in Kultur durch die Fähigkeit der Zellen zum Ausschluß von Trypan-Blau getestet.
Das normale Wachstumsmedium 5HS/N3 für Kulturen, die aus Neuronen und Gliazellen bestehen, enthielt: 5% (Vol./Vol.) Pferdeserum (Gibco), 1 % N3-Zusätze (Vol./Vol.) (Romijn et al., Dev. Brain Res. 2 (1982), 583-589), 0,5% (Vol./Vol.) Glutamin (200 mM, Gibco) und 0,25% (Vol./Vol.) Penicillin-Streptomycin (10 000 Einheiten/ml bzw. 10 000 mcg/ml, Gibco) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Mit neuronalen Zellen angereicherte Kulturen wurden fünf bis sechs Stunden nach dem Plattieren durch Austausch des Wachstumsmediums gegen 1 % N3-Zusätze, 0,5% Glutamin und 0,25 % Penicillin und Streptomycin enthaltendes DMEM hergestellt. Unter beiden Bedingungen wurde die Behandlung mit Cytosinarabinosid (1 µM für 24 Stunden) zur Begrenzung der Proliferation der Gliazellen verwendet.

16.1.2. Test der Cholin-Acetyltransferase-Aktivität

Das Wachstumsmedium wurde von den Kulturen durch zweimaliges Abspülen der Zellen mit 100 µl PBS entfernt. Die Zellen wurden über einen Gefrier-Auftau- Cyclus und eine 15-minütige Inkubation bei 37ºC in 50 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH 6,7, das 200 mM NaCl und 0,25% (Vol./Vol.) Triton X-100 enthielt, lysiert. Zwei Microliter des Zellysats wurden entnommen und auf die CAT-Aktivität gemäß dem Micro-Fonnum- Verfahren (Fonnum, F., J. Neurochem. 24 (1975), 407-409) getestet. Die Endzusammensetzung des Substrats bestand aus 0,2 mM [¹&sup4;C]-Acetyl-CoA (NEN, 54,4, mCi/mmol), 300 mM NaCl, 8 mM Cholinbromid, 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure und 0,1 mM Neostigmin in 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer (pH 7,4). Bei diesen Enzym- und Substratkonzentrationen war die enzymatische Reaktion 90 bis 120 Minuten linear. Die Spezifität der Induktion für die Cholin-Acetyltransferase wurde durch Zugabe eines spezifischen Inhibitors der CAT-Aktivität, N-Hydroxyethyl-4-(1-naphthylvinyl)pyridium (HNP), während des Tests (White, H. L. und Cavallito, C. J., J. Neurochem. 17 (1970), 1579-1589) untersucht.

16.1.3. Test der Acetylcholinesterase (AChE)-Aktivität

Die in den Lysaten vorhandene Menge AChE wurde durch die Verfahren von Potter (Potter, L. T., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics 156 (1967), 500- 506) und Johnson und Russell (Johnson, C. D. und Russell, R. L., Anal. Biochem. 64 (1975), 229-238) mit mehreren Modifikationen gemessen. Lysate, die in 50 mM KH&sub2;PO&sub4;-Puffer, pH 6,7, der 200 mM NaCl und 0,25% (Vol./Vol.) Triton X-100 enthielt, hergestellt wurden, wurden mit [³H]-Acetylcholiniodid (NEN, NET-113, 73,3 mCi/mmol) und Ethopropazin (0,1 mM) in 50 mM KH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0, vermischt. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stoppufferlösung, die 1 M Chioressigsäure, 0,5 M NaOH und 2,0 M NaCl enthielt, beendet. Die spezifische AChE-Aktivität wurde in Gegenwart von 1,0 (10-6) M Neostigmin ermittelt.

16.1.4. Messung der Cholin-Aufnahme mit hoher Affinität

Die Cholin-Aufnahme über einen Na&spplus;-abhängigen Mechanismus mit hoher Affinität wurde im wesentlichen durch das Verfahren von Vaca und Pilar (Vaca, K. und Pilar, G., J. Gen. Physiol. 73 (1979), 605-628) getestet. Die Zellen wurden einmal mit 100 µl Hams-F-10 gewaschen und anschließend mit 100 µl Tyrodes-Lösung gespült. Nach einer 10-minütigen Depolarisation, die durch eine 25 mM Kalium-enthaltende Tyrodes-Lösung induziert wurde, wurden die Zellen 20 Minuten bei Raumtemperatur mit [³H]-Cholin (NEN, NET-109, 0,11 µM, 86,7 Ci/mmol) in normaler Na&spplus;- oder Li&spplus;-enthaltender Tyrodes-Lösung inkubiert. Die Aufnahme-Reaktion wurde durch zweimaliges Abspülen der Zellen mit PBS beendet. Das angesammelte Cholin wurde durch Inkubation der Kulturen über mindestens 20 Minuten mit 100 µl kaltem Aceton, das 1 N Ameisensäure enthielt, extrahiert. Die lösliche Fraktion wurde anschließend entfernt und gezählt. Die spezifische Cholinaufnahme ist der Unterschied zwischen der Menge der gesamten und der Na&spplus;-unabhängigen Cholinaufnahme.

16.1.5. Histochemische Anfärbung für die Acetylcholinesterase

Cholinerge Zellen wurden durch histochemische Anfärbung der Acetylcholinesterase durch eine Modifikation des Färbeverfahrens von Geneser-Jensen und Blackstadt (Z. Zellforsch. 114 (1971), 460-481) identifiziert. Nach der Fixierung der Kulturen in 4% Paraformaldehyd wurden die Zellen 5 bis 6 Tage bei 4ºC in Gegenwart der AChE-Substratlösung, die aus 4 mM Acetylthiocholiniodit, 2 mM Kupfersulfat, 10 mM Glycin und 10 µg/ml Gelatine in 50 mM Acetatpuffer, pH 5,0, bestand, inkubiert. Die sichtbare Darstellung des Reaktionsproduktes wurde, wie zuvor beschrieben, erreicht (Hartikka, J. und Hefti, F., J. Neurosci. 8 (1988), 2967-2985).

16.1.6. Immunhistochemische Färbung des NGF-Rezeptors

Die Kulturen wurden zweimal mit DMEM gewaschen und anschließend mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen wurden anschließend 3 bis 4 Stunden mit einem 5% Rinderserumalbumin, 0,02% Triton X-100 und 5% Saccharose enthaltenden Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, behandelt (Hartikka, J. und Hefti, F., J. Neurosci. 8 (1988), 2967-2985). Das NGF-R wurde unter Verwendung des monodonalen Antikörpers 192-IGG (Taniuchi, M. und Johnson, E., 3. Cell Biol. 101(1985), 1100- 1106, und Chandler et al., 3. Biol. Chem. 259 (1984), 6882-6889) in einer 1:1 000 Verdünnung in 5% Pferdeserum enthaltendem Puffer nachgewiesen. Die Kulturen wurden mit dem verdünnten Antikörper 15 bis 18 Stunden bei 4ºC inkubiert. Das gebundene Maus-Immunglobulin wurde unter Verwendung eines biotinylierten Pferde-anti- Maus-IGG (1:200 Vektor) nachgewiesen. Die immunreaktiven Zellen wurden unter Verwendung von 3',3'-Diaminobenzidin als Substrat für das gebundene Peroxidaseenzym identifiziert.

16.1.7. Reinigung von BDNF und NGF

Die Reinigung von BDNF aus Schweinehirn und NGF aus der submaxillären Drüse der männlichen Maus wurde gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen (Barde et al., EMBO J. 1 (1982), 549-553, und Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319-328) durchgeführt. Das für einen Teil dieser Untersuchungen verwendete rekombinante BDNF wurde bereits charakterisiert (Maisonpierre et al., Science 247 (1990), 1446-141).

16.2. Ergebnisse

Die Kulturen von septalen Zellen produzierten einen kompliziertes Neunten- Auswuchs auf Polyomithin-Laminin-beschichteten Vertiefungen, wobei viele Zellen ein charakteristisches neuronales phasenhelles Soma nach 24 Stunden zeigten (Figur 21A und B). Der fortgesetzte Neuritenauswuchs bewirkte eine fortschreitende Erhöhung des Zell-Zell-Kontakts an den Tagen 2 und 4 in vitro (vergleiche Figur 21 C, D mit E, F). Es gab sehr wenige nicht-neuronale Zellen in den Kulturen selbst nach 4 Tagen, wie es durch die Abwesenheit von abgeflachten phasendunklen Zellen festgestellt wurde. Zur Beurteilung der Wirkung von BDNF auf das Überleben von septalen cholinergen Neuronen in Kultur wurde eine histochemische Anfärbung für AChE und eine immunhistochemische Färbung für den NGF-Rezeptor verwendet. Die typische Morphologie von AChE-positiven Neuronen ist in Figur 21G, H dargestellt. Mehrere NGF-Rezeptor-positive Neuronen sind in Figur 211 dargestellt.
BDNF bewirkte eine 2,4fache Erhöhung der Zahl der ACIIE-positiven Zellen in Kulturen mit geringer Dichte (definiert als Zelldichten zwischen 66 700 - 133 300 Zellen/cm²) von septalen Zellen von Rattenembryonen, wie in Figur 22A dargestellt. Bei den gleichen Zelldichten war die Wirkung von NGF etwas geringer (1,9fach). Aufgrund der Erkenntnis, daß BDNF sowie NGF eine Erhöhung der Zahl von AChE- positiven Neuronen in septalen Kulturen produzieren können, wurde untersucht, ob diese beiden Faktoren auf ähnliche oder unterschiedliche neuronale Populationen einwirken. Wie in der dritten Tafel von Figur 22A dargestellt, führte eine gleicnzeitige Zugabe von sättigenden Mengen BDNF und NGF zu keiner größeren Erhöhung der Zahl von AChE-positiven Neuronen als bei Zugabe von jedem Faktor allein beobachtet wurde. In bezug auf die neuronale Überlebensrate lassen diese Ergebnisse den Schluß zu, daß die cholinergen Neuronen in septalen Kulturen von Ratte, die auf BDNF oder NGF antworten, eng überlappende Populationen sein müssen.
Die Wirkung von BDNF auf die Überlebensrate von AChE-positiven Neuronen war von der Wachstumsdichte der Zellen abhängig (Figur 22A). Bei hohen Plattierungsdichten (200 000 - 266 000 Zellen/cm²) produzierte weder BDNF allein noch in Kombination mit NGF eine Erhöhung der Zahl von AChE-exprimierenden Neuronen. Dies wird durch die erhöhten endogenen Mengen von neurotropher Aktivität oder alternativ durch die überlebensfördernde Wirlcung des bei höheren Zeildichten auftretenden erhöhten Zell-Zell-Kontaktes bewirkt.
Bei geringen Zelldichten erhöhte sich die Zahl von AChE-positiven Zellen als eine Funktion der BDNF-Konzentration, wobei eine maximale Antwort bei einer Dosis von 10 ng/ml beobachtet wurde, die die Zahl von AChE-positiven Zellen/Vertiefung von den Kontrollwerten von 169,2 1 12,9 auf 388 0 ± 26,2 (eine 2,Sfache Erhöhung) in behandelten Kulturen erhöhte. Im Vergleich dazu wurde eine maximale Antwort auf NGF bei 50 ng/ml beobachtet und produzierte eine Erhöhung der AChE-positiven Zellen/Vertiefung von 121,0 ± 7 6 auf 231,7 ± 12 9 (eine 1,9fache Erhöhung). Die Plateau-Phase in der Antwortkurve war anscheinend sowohl für BDNF als auch NGF stabil, was sich darin zeigte, daß es keine Reduktion der Zahl von AChE-positiven Neuronen bei Dosen von 100 ng/ml gab.
Es ist offensichtlich, daß in Kulturen von geringer Dichte sowohl BDNF als auch NGF die Zahl von durch AChE-Histochemie nachgewiesenen Zellen erhöhen konnten. Es ist möglich, daß diese Erhöhung durch eine Rettung der cholinergen Zellen, die in Kultur in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren absterben, die Verwendung von Vorläuferzellen oder die Induktion des cholinergen Markers, AChE, bewirkt wird. Für den Versuch der Unterscheidung zwischen diesen Möglichkeiten wurden Experimente mit verzögertem Zusatz in einer Reihe von insgesamt 12 Tage gezüchteten Kulturen durchgeführt (Figur 23). Ein Satz von Kulturen, der fünf bis sechs Stunden nach der Plattierung behandelt wurde, wurde in Gegenwart von BDNF oder NGF über die gesamten 12 Tage aufrechterhalten. Ein zweiter Satz von Kulturen wurde ohne Wachstumsfaktoren 5 Tage aufrechterhalten und anschließend mit BDNF oder NGF für die letzten sieben Tage (-5/ +7) behandelt. Bei einem Vergleich dieser beiden Sätze von Kulturen war die Antwort auf nach 5 Tagen zugesetztes NGF oder BDNF in etwa die gleiche Antwort, die beobachtet wurde, wenn die Zellen kontinuierlich in Gegenwart der Faktoren gezuchtet wurden (vergleiche einfarbiges und schraffierte Balken in Figur 23). Die Ergebnisse zeigten jedoch in einem dritten Satz von Kulturen, in denen BDNF oder NGF nur in den letzten 5 Tagen vorhanden war (-7/ + 5-Kulturen), auffallende Unterschiede. Unter diesen Bedingungen konnte weder NGF noch BDNF die Zahl von AChE-positiven Zellen erhöhen. In anderen Experimenten wurde festgestellt, daß eine Exposition von septalen Neuronen gegen NGF oder BDNF für nur 3 bis 4 Tage ausreicht, um eine starke Erhöhung der AChE-Enzymaktivität zu produzieren und so den Nachweis von Zellen durch eine AChE-Färbung zu führen. Daher war der fehlende Nachweis für die Erhöhung der Zahl von AChE-positiven Neuronen in den "-7/+5"- Kulturen nicht auf die Möglichkeit zurückzuführen, daß die Dauer der Exposition gegen einen Wachstumsfaktor für eine Induktion von AChE-positiven Zellen unzureichend war.
Es wurde in vivo (Montero, C. und Hefti, F., J. Neurosci. 8 (1988), 2986- 2999, und Higgins et al., Neuron. 3 (1989), 247-256) sowie in vitro gezeigt, daß NGF die Mengen seines eigenen Rezeptors regulieren kann, wie sowohl auf der mRNA- als auch der Proteinebene gemessen wurde. Da festgestellt wurde, daß BDNF ähnliche Wirkungen wie NGF auf die Induktion von Zellen des cholinergen Phänotyps und die Überlebensrate der Zellen in septalen Kulturen zeigte, wurde das Potential von BDNF zur Regulation der Menge des NGF-Rezeptors untersucht, wie durch Messung der Zahl von IgG-192-immunpositiven Zellen quantitativ bestimmt wurde. Bei 10 ng/ml produzierte BDNF eine 3fache Erhöhung der Zahl von NGF-Rezeptor-immunpositiven Zellen, wie in Figur 24 dargestellt ist. Interessanterweise war bei höheren Konzentrationen (25 bis 100 ng/ml) die Wirkung von BDNF fortschreitend weniger deutlich. Daher unterschied sich die Dosis-Wirkung in diesem Fall bemerkenswert von der für die Wirkung von BDNF auf andere Parameter in diesen Kulturen beobachtete, z. B. die Zahl von AChE-positiven Zellen. Als positive Kontrolle wurden die Zellen mit NGF in einer Konzentration von 50 ng/ml behandelt, was auch zu einer 3fachen Erhöhung der Zahl von positiven Zellen führte. Daher hat BDNF gemäß der IgG-192- Anfärbung eine etwa gleiche Wirkung wie NGF auf die Hochregulierung der Expression des NGF-Rezeptors.
Zusätzlich zur Wirkung auf die Überlebensrate der Zellen wurde die Möglichkeit der Fähigkeit von BDNF zur Förderung von cholinergen Phänotypischen Merkmalen untersucht. Eine linear erhöhte CAT-Aktivität wurde in septalen Kulturen gefunden, die in Gegenwart von steigenden Mengen BDNF bis zu 50 ng/ml gezüchtet wurden, wobei die Antwort bei dem 1 ,8fachen Kontrollwert einen Sättigungswert erreichte, wie in Figur 25 dargestellt wurde. Die Induktion der CAT-Aktivität in mit NGF behandelten parallelen Kulturen erreichte ein Plateau bei 25 ng/ml, was eine 3,4fache Erhöhung über die Kontrollwerte darstellte. Die Antwort auf BDNF oder NGF zeigte keine signifikante Abnahme bei dem dreifachen Wert derjenigen Konzentration, die zur Produktion einer sättigenden Antwort ausreicht. Die Induktion der CAT-Aktivität entweder mit BDNF oder NGF beeinflußte nicht die Menge der Angesichts der Erkenntnis, daß BDNF sowie NGF eine erhöhte CAT- Aktivität in septalen Kulturen bewirkten, wurde die Antwort auf eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Faktoren untersucht (Tabelle VIII). Für diese Experimente wurden zwei Konzentrationen von BDNF, 5 und 25 ng/ml, die die CAT-Aktivität 1,4 bzw. 2,6fach erhöhten, verwendet. Bei einer Kombination von NGF (50 ng/ml), das allein die Enzym-Aktivität um das 2,8fache erhöhte, mit BDNF ließ das CAT-Aktivitätsniveau mindestens eine additive Wirkung erkennen (Tabelle VIII). Bei den verwendeten Konzentrationen von BDNF hätte eine rein additive Wirkung zu der von NGF zu einer Erhöhung um das 4,2 bzw. 5,4fache der Kontrollwerte geführt. Die beobachteten Werte waren tatsächlich etwas mehr als additiv. Tabelle VIII Wirkung der gleichzeitigen Zugabe von BDNF und NGF auf die CAT-Aktivität
Septale Zellen wurden über einen Zeitraum von 12 Tagen in 5HS/N3 in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von trophischen Faktoren gezüchtet. Die CAT-Aktivität wurde, wie beschrieben, ermittelt. Die Werte geben Durchschnittswerte ± SEM von 4 bis 5 Messungen wider.
Die Möglichkeit wurde untersucht, ob die bei der BDNF-Behandlung beobachtete biologische Antwort auf eine BDNF-abhängige Freisetzung von endogenem NGF zurückzuführen war. Zur Untersuchung dieser Frage wurde ein monodonaler Antikörper gegen NGF (Antikörper 27/21, Korsching und Thoenen, 1983) zur Blockierung jeder mit NGF in Zusammenhang stehenden Antwort verwendet. Wie in Tabelle IX dargestellt, wurde die Wirkung von NGF auf die CAT-Aktivität durch den anti-NGF-Antikörper stark reduziert, während die BDNF-induzierte Antwort im wesentlichen nicht beeinflußt wurde. Es sollte beachtet werden, daß das Grundniveau der CAT-Aktivität in Kulturen, die mit anti-NGF-Antikörper allein behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen um etwa 20% reduziert war. Trotzdem wird die beobachtete Erhöhung der CAT-Aktivität in septalen Kulturen anscheinend von BDNF direkt bewirkt und nicht durch eine Erhöhung des endogenen NGF vermittelt. Tabelle IX Wirkung von anti-NGF auf die Fähigkeit von NGF und BDNF zur Induktion der CAT- Enzym-Aktivität
Nach einer Züchtungsdauer von 12 Tagen in 5HS/N3 in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen des trophischen Faktors wurden die septalen Zellen (Plattierungsdichte von 2,3 x 10&sup5; Zellen/cm²) geerntet. Die CAT-Aktivität wurde, wie im Abschnitt über experimentelle Verfahren beschrieben, ermittelt. Die Werte geben Durchschnittswerte ± SEM von 6 Messungen wider.
Ferner wurde die Möglichkeit getestet, ob die AChE-Aktivität zusammen mit der CAT-Aktivität durch BDNF oder NGF koordiniert reguliert wurde (Figur 26). Im Gegensatz zur CAT-Aktivität war die Dosis-Wirkung von AChE auf BDNF oder NGF anscheinend ziemlich ähniich, was sich dadurch zeigte, daß sich die Enzymaktivität bis zu einer Konzentration von 50 ng/ml linear erhöhte. Bei dieser Konzentration erhöhten NGF und BDNF die AChE-Aktivität auf 274% bzw. 234% im Vergleich zu den nichtbehandelten Kontrollwerten.
Der Zeitverlauf der BDNF- oder NGF-induzierten Erhöhung der CAT- Aktivität wurde untersucht (Figur 27). Die CAT-Aktivität in mit 50 ng/ml BDNF-behandelten Kulturen erhöhte sich auf 170% der Kontrollwerte nach 3 Tagen. Diese Erhöhung setzte sich fort bis zum Tag 6, an dem ein Plateau bei dem 2,Sfachen Wert der Kontrollwerte über den Rest des Testzeitraums erreicht wurde. Im Gegensatz dazu war die CAT-Antwort auf die NGF (50 ng/ml)-Verabreichung schneller, wobei die induzierte Menge das 2,Sfache der Kontrolle am Tag 3 erreichte. Die Erhöhung der CAT- Aktivität war fortlaufend linear, wobei ein Wert des 3 ,2fachen der Kontrolle nach 12 Tagen erreicht wurde.
Es wurde gezeigt, daß eine Zeitlang gezüchtete Sternzellen eine Reihe von neurotrophen Aktivitäten außer NGF synthetisieren (Lindsay, R. M., Nature 282 (1979), 80-82, Lindsay et al., Brain Res. 243 (1982), 329-343, und Alderson et al., Dev. Brain Res. 48 (1989), 229-241). Obwohl die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, daß die vorliegenden Beobachtungen im Hinblick auf BDNF durch eine Erhöhung der Mengen an NGF vermittelt sind, ist es denkbar, daß BDNF indirekt durch Modulierung der Expression von anderen neurotrophen Faktoren, besonders in Gliazellen, einwirken könnte. Zur Einschätzung der Möglichkeit, daß nicht-neuronale Zellen die Wirkung von BDNF auf die CAT-Aktivität in septalen Kulturen beeinflussen könnten, wurde die Antwort von cholinergen Neuronen auf BDNF in einem Glia-Neuronen-Kulturgemisch und in mit Neuronen angereicherten Kulturen verglichen (Figur 28). In mit Neuronen angereicherten Kulturen zeigte die Antwort der CAT-Aktivität auf BDNF eine glockenförmige Kurve; eine maximale Erhöhung wurde bei einer Dosis von 5 ng/ml BDNF erreicht, und bei einer Konzentration von 25 ng/ml gab es eine signifikante Abnahme der Enzymaktivität (p > 0,001, Vergleich von 15 mit 25 ng/ml BDNF). Ähnlich dem in Figur 25 dargestellten Ergebnis war die CAT-Antwort auf BDNF in Gegenwart einer konfluenten Gliaschicht linear, in diesem Fall bis zu 25 ng/ml BDNF, der getesteten Höchstdosis. In Gegenwart von neuronalen Zellen waren größere BDNF-Mengen erforderlich, um eine äquivalente Erhöhung der CAT-Aktivität wie in ähnlich behandelten mit Neuronen angereicherten Kulturen zu produzieren. Ungeachtet dessen war die Fähigkeit von BDNF zur maximalen Stimulierung der CAT-Aktivität in septalen chohnergen Neuronen in Gegenwart oder Abwesenheit von Gliazellen im wesentlichen die gleiche.
Auf der Basis der CAT- und AChE-Aktivität ist es offensichtlich, daß BDNF ähnlich wie NGF eine Erhöhung der cholinergen pHänotypischen Marker bewirken kann. Um dies weiter zu untersuchen, wurde die Wirkung von BDNF auf das Niveau der Na&spplus;-abhängigen Cholin-Aufnahme mit hoher Affinität mit der von NGF verglichen (Figur 29). Die 12 Tage in Gegenwart von 50 ng/ml BDNF gezüchteten Zellen akkumulierten Cholin bis zu einem Niveau, das 3,8fach über dem der nicht-behandelten Kontrollen war. In parallelen Kulturen induzierte NGF (25 ng/ml) eine 2,3fache Erhöhung der Cholin-Akkümulation.

16.3. Diskussion

Im Vergleich zu seiner etablierten Wirkungen auf periphere Neuronen (Barde et al., EMBO J. 1 (1982), 549-553, Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319-328, Davies et al., J. Neurosci. 6 (1986), 1897-1904, und Hofer, M. und Barde, Y., Nature 331 (1988), 262-262) ist die neuronale Spezifität von BDNF innerhalb des zentralen Nervensystems weniger gut charakterisiert. Bisher sind die einzigen bekannten antwortenden ZNS-Neuronen eine kleine Subpopulation von Thy-1-positiven retinalen Ganglionzellen, die zuerst in Kulturen von E17-Ratten-Retina identifiziert wurden (Johnson et al., J. Neurosci. 6 (1986), 3031-3038). Weitere Untersuchungen zeigten ferner Wirkungen von BDNF auf erwachsene retinale Ganglionzellen in Explantatkulturen (Thanos et al., Eur. J. Neuro 1 (1989), 19-26). In dieser Untersuchung wurde gezeigt, daß BDNF das Überleben von gezüchteten cholinergen Neuronen vom Septum von Rattenembryonen erhöht, wie durch eine histochemische AChE-Anfärbung gezeigt wurde, und die Expression von verschiedenen cholinergen Phänotypischen Markern erhöht, d. h., die enzymatische Aktivität von AChE und CAT und die Cholinaufnahme mit hoher Affinität Ferner wurde festgestellt, daß BDNF die Expression des NGF-Rezeptors in septalen Kulturen erhöht.
In anfänglichen Experimenten wurde festgestellt, daß BDNF die Zahl von AChE-postiven Neuronen in septalen E17-Kulturen um etwa das zweifache erhöhte. Wie bei NGF (Hartikka, J. und Hefti, F., J. Neurosci. 8 (1988), 2967-2985) war diese Wirkung. bei geringen Zeildichten am deutlichsten. Interessanterweise konnte NGF und BDNF nach einer gemeinsamen Zugabe die Zahl von AChE-positiven Zellen nicht über die Zahl, die in Gegenwart jedes Wachstumsfaktors allein beobachtet wurde, erhöhen. Diese Beobachtung läßt besonders darauf schließen, daß BDNF und NGF weitestgehend auf die gleiche Population von septalen cholinergen Neuronen einwirken.
Wie anfänglich für NGF berichtet wurde (Hefti et al., Neuroscience 1 (1985), 55-68), erhöhte BDNF nicht das Überleben von cholinergen Neuronen in Kulturen mit relativ hohen Zelldichten. Bei einem Teil der plattierten Zellen wurde festgestellt, daß das Überleben von cholinergen Neuronen bei einer hohen Zelldichte höher als bei einer geringen Zelldichte ist, selbst in Abwesenheit von jeglichen neurotrophen Faktoren. Es gibt mehrere mögliche Erklärungen, die dies erklären können, einschließlich der von einem erhöhten Zell-Zell-Kontakt, günstigen Wirkungen der erhöhten Zahl von nicht-neuronalen Zellen oder einer mehr als proportionalen Erhöhung der endogenen neurotrophen Aktivität. In bezug auf die letzte Möglichkeit wurde kein Anzeichen von wesentlich erhöhten Mengen von endogenem NGF festgestellt, da die Zugabe eines Überschusses von anti-NGF-Antikörper zu unbehandelten Kulturen mit hoher Dichte die CAT-Grundaktivität nur um 20% reduzierte. In solchen Kulturen konnte exogenes NGF eine 3,4fache Erhöhung der CAT-Aktivität produzieren.
Wie sowohl auf der Ebene des Proteins als auch der der mRNA beobachtet wurde, gibt es bereits viele Berichte, die anzeigen, daß NGF die Expression seines eigenen Rezeptors sowohl bei gezüchteten Neuronen als auch in vivo hochregulieren kann. In dieser Untersuchung wurde der monodonale Antikörper IgG-192 zum Nachweis des NGF-Rezeptors verwendet. Dieser monodonale Antikörper wurde sowohl bei sensorischen Neuronen von Ratten als auch im Gehirn von Ratten charakterisiert (Taniuchi, M. und Johnson, E., J. Cell Biol. 101 (1985), 1100-1106). Obwohl die Befunde von Hartikka und Hefti bestätigt wurden, daß NGF die Menge seiner Rezeptoren in septalen Kulturen hochregulieren kann, wie durch eine Erhöhung der Zahl von IgG-192-immunpositiven Neuronen bemerkt wurde, wurde zusätzlich festgestellt, daß BDNF die Zahl an IgG-192-immunpositiven Zellen um das bis zu 3fache erhöht. Die Antwort auf BDNF war zweiphasig, was sich darin äußerte, daß bei hohen Konzentrationen im Bereich von 25 bis 100 ng/ml keine so stark erhöhte Zahl von positiven Zellen wie bei 10 ng/ml erhalten wurde. Interessanterweise unterschied sich diese Form der Dosis- Wirkung ziemlich von der bei der BDNF-induzierten Erhöhung der Zahl von AChE-positiven Neuronen beobachteten. Bei letzterem wurde bei hohen Konzentrationen keine Reduktion der maximalen Wirkung von BDNF beobachtet. Es muß darauf hingewiesen werden, daß kürzlich gezeigt wurde, daß der NGF-Rezeptor mit niedriger Affinität auch BDNF mit einer ähnlichen Affinität bindet, was darauf schließen läßt, daß die NGFund BDNF-Rezeptoren mit geringer Affinität identisch sein könnten (Rodriguez-Tebar et al., Binding of Brain-Derived Neurotrophic Factor to Nerve Growth Factor Receptor Neuron. 4 (1990), 487-492).
Mögliche Ähnlichkeiten des Wirkungsmechanismus von BDNF und NGF wurden durch die Befunde nahegelegt, daß BDNF und NGF bei der Induktion der AChE-Aktivität gleich wirksam waren. Obwohl festgestellt wurde, daß BDNF die Überlebensrate von cholinergen Neuronen zu einem ähnlichen Ausmaß wie NGF fördert, war die Wirkung von BDNF auf die enzymatische CAT-Aktivität nicht so groß wie bei NGF. Über mehrere Experimente war die maximale CAT-Induktion mit BDNF im Bereich von 1,8 bis 2,6fach, während Werte von mehr als 3fach bei NGF routinemäßig beobachtet wurden. Obwohl es einige Ähnlichkeiten im Wirkungsmechanismus von BDNF und NGF gibt, ist es daher ziemlich wahrscheinlich, daß es einige subtile Unterschiede in der Expression und Regulation ihrer jeweiligen Rezeptoren und der Kupplung dieser Rezeptoren an den (die) zweiten Messenger- Weg(e), der (die) zur Induktion der CAT-Aktivität erforderlich ist (sind), gibt.
Die Annahme, daß Unterschiede im durch BDNF oder NGF bewirkten Induktionsniveau der CAT-Aktivität unterschiedliche regulatorische Stoffwechselwege wiedergeben, wurde weiter durch die Ergebnisse von Untersuchungen des Zeitverlaufs gestützt. Gezüchtete septale Neuronen antworteten auf BDNF mit einer Erhöhung der CAT-Aktivität bis zum Tag 6, an dem die Antwort anscheinend ein Plateau erreichte. Im Gegensatz dazu zeigte die Induktion der CAT-Aktivität als Antwort auf NGF eine verlängerte lineare Erhöhung von 3 bis 12 Tagen. Das Ende einer Erhöhung der Induktion der CAT-Aktivität nach 6 Tagen bei BDNF-behandelten Kulturen kann eine entwicklungsmäßige Veränderung der Expression entweder des BDNF-Rezeptors oder eines erforderlichen Bestandteils des Antwortwegs anzeigen. Angesichts der Tatsache, daß die Zahl von in Kulturen mit hoher Dichte nach 12 Tagen gefundenen cholinergen Neuronen (AChE-positive Neuronen) anscheinend von exogenem BDNF oder NGF unabhängig ist, scheint es unwahrscheinlich, daß der differentielle neuronale Zelltod für die bei der Induktion der CAT-Aktivität durch diese beiden Wachstumsfaktoren gefundenen Unterschiede im Zeitverlauf verantwortlich ist.
In den anfänglichen Experimenten, die eine BDNF-Behandlung der cholinergen Zellen des basalen Prosencephalons einschließen, wurde keine Annahme über den primären Zelltyp, neuronal oder glial, der auf diesen neurotrophen Faktor antwortet, gemacht. Obwohl an hoch angereicherten Kulturen von peripheren Neuronen durchgeführte Untersuchungen klar darauf schließen lassen, daß BDNF direkt auf Neuronen einwirkt (Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319-328, und Lindsay, J. Neurosci. 7 (1988), 2394-2405), ist es denkbar, daß die in der vorliegenden Untersuchung beobachteten neuronalen Wirkungen von BDNF durch eine primäre Wirkung von BDNF auf Sternzellen oder andere nicht-neuronale Zellen vermittelt wurden. Es wurde jedoch festgestellt, daß BDNF die CAT-Aktivität in Gegenwart einer überwiegend aus Sternzellen bestehenden konfluenten einzelligen Schicht oder in Kulturen, aus denen die Gliazellen durch Behandlung mit dem mitotischen Inhibitor Cytosinarabinosid fast vollständig entfernt wurden, gleich wirksam induzierte Eine faszinierende Beobachtung bei diesen Experimenten war, daß sich die Form der Dosis-Antwort-Kurven auf BDNF in den beiden Fällen deutlich unterschied. In Gegenwart einer einzelligen Schicht aus Gliazellen erhöhte sich die Antwort auf BDNF linear mit der Konzentration von BDNF. In mit Neuronen angereicherten Kulturen war die Dosis-Wirkung auf BDNF nach links verschoben. Eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse ist, daß die Gliazellen selber den BDNF-Rezeptor exprimieren können, wodurch die wirksame Konzentration des Liganden, der für den auf Neuronen liegenden Rezeptor verfügbar ist, verringert wird. Alternativ könnte die unterdrückende Wirkung von Sternzellen indirekt sein, ohne Zusammenhang mit einer Wirkung auf die Ligandenkonzentration oder Rezeptorexpression und durch Vermittlung beispielsweise durch einen stark erhöhten Abbau von BDNF. Ahnliche Beobachtungen wurden von Hartikka und Hefti (Hartikka, J. und Hefti, F., J. Neurosci. 8 (1988), 2967-2985) und Honegger und Lenoir (Honegger, P. und Lenoir, D., Dev. Brain Res. 3 (1982), 229-238) beschrieben. Es wurde gezeigt, daß Gliazellen von verschiedenen Hirnregionen die Morphologie von Neuronen, die mit ihnen assoziiert sind, stark beeinflussen k-nnen (Prochiantz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5387-5391, und Prochiantz et al., Nature 293 (1981), 570-572). Daher können septalen Gliazellen innewohnende Eigenschaften entweder eine membrangebundene oder sekretorische Natur aufweisen, die die Unterdrückung der Expression des cholinergen pHänotyps bewirken können. Die regulatorischen Eigenschaften von Sternzellen, die vom Hippokampus abstammen, werden nun unter ähnlichen Testbedingungen untersucht.
Auf der Basis der präsentierten Daten ist es offensichtlich, daß sowohl BDNF als auch NGF eine Zunahme der Funktionen von septalen cholinergen Neuronen bewirken kann. Es ist interessant, über die mögliche physiologische Beziehung von zwei hoch homologen neurotrophen Faktoren, die anscheinend auf eine einzige neuronale Population einwirken, nachzudenken. Es wurde angenommen, daß sich die Wirkungen von BDNF und NGF während der frühen Entwicklung von peripheren Neuronen, besonders auf Subpopulationen von Spinalganglionneuronen oder ihren Vorläufern, anfänglich überlappen können und sich dann später aufspalten, um unabhängig auf verschiedene Populationen zu wirken (Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319-328, Ersberger, U. und Rohrer, H., Dev. Biol. 126 (1988), 420-432, und Barde, Y. A., Neuron. 2 (1989), 1525-1534). Dies wurde jedoch nicht unter Verwendung von geeigneten Markem zur Definition von Subpopulationen von sensorischen Neuronen definitiv bestätigt. Da sich die vorliegende Untersuchung auf in Kultur etablierte embryonale septale Neuronen zu einem einzigen Entwicklungszeitpunkt, E17, konzentrierte, ist es möglich, daß eine ähnliche Art von sich aufspaltenden pHänomenen im Septum in späteren Entwicklungsphasen auftritt. Daher kann es sich herausstellen, daß es interessante zeitliche und räumliche Unterschiede in der Fähigkeit von septalen cholinergen Neuronen zur Antwort auf BDNF oder NGF gibt.
Es ist nun interessant, die Wirkungen von BDNF auf cholinerge Neuronen des basalen Prosencephalons in vivo zu untersuchen, wo es nun Beweise gibt, daß vom Hippokampus stammendes NGF an der normalen Entwicklung und dem Erhalt von cholinergen Neuronen des basalen Prosencephalons in vivo beteiligt ist. Es wird interessant sein, zu untersuchen, ob BDNF in vivo eine ähnliche Rolle spielt oder nicht. Der kürzliche Befund, daß BDNF-mRNA im Hippokampus besonders häufig ist, unterstützt eine solche Rolle.

17. Beispiel: Enzymatische Umwandlung von PräproBDNF in aktives reifes BDNF

17.1. Materialien und Verfahren

Die im Handel erhältliche Endoproteinase Arg-C (von submaxillären Drüsen der Maus gereinigt) wurde zur enzymatischen Umwandlung des großen Vorläufers von hBDNF (PräproBDNF) in das biologisch aktive reife Protein verwendet. Die enzymatische Spaltung wurde in einer In vitro-Reaktion erreicht. Das Substrat der enzymatischen Reaktion war in CHO-DG44-Zellen synthetisiertes PräprohBDNF, das in Zellkulturmedien sezerniert und geerntet wurde. Die Kulturmedien bestanden aus Harns- F12-Medien (Nucleosid-frei) mit 1 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % sowohl Penicillin als auch Streptomycin. Die Reaktion wurde 5 Minuten bei 37ºC unter Verwendung von 5 Einheiten Enzym und 50 µl CHO-DG44-Zellüberstand, der PräprohBDNF enthielt, durchgeführt. Die Spaltung von PräprohBDNF zu reifem hBDNF war bei diesen Bedingungen vollständig.

17.2. Ergebnisse und Diskussion

Die Präpro-Form von rekombinantem hBDNF (etwa 31 000 Dalton) wurde in vitro vollständig zur reifen bioaktiven Form von hBDNF (etwa 12 000 Dalton) unter Verwendung der Endoproteinase Arg-C prozessiert. Der rekombinante, von menschlichem Gehirn stammende neurotrophe Faktor wurde erfolgreich in Säugerzellen (CHO- DG44-Zellen) produziert. Das hBDNF-Gen wurde stabil in das CHO-Zellgenom integriert und das hBDNF-Gen unter Verwendung einer Methotrexat-Amplifikationsstrategie amplifiziert. Das rekombinante hBDNF wurde in das Medium sezemiert und erwies sich als biologisch aktiv. Die metabolische Markierung mit einer anschließenden SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (15 % Gel) zeigt, daß der größte Teil des in das Kulturmedium sezemierten, synthetisierten, [³&sup5;S]-markierten hBDNF-Produkts in der Präpro-Form mit einem relativen Molekulargewicht von 31 000 wanderte (Figur 30, Bahn 2). [³&sup5;S]-markierte Proteine, die von Wildtyp-CHO-DG44-Zellen sezerniert wurden, sind in Figur 30, Bahn 1, dargestellt. Zur Erzeugung von überwiegend der reifen Form von hBDNF (relatives Molekulargewicht von 12 000) wurde eine in vitro- Strategie zur enzymatischen Spaltung der Präpro-Form von hBDNF entwickelt.
Die Trypsin-Spaltungsprodukte sind in Figur 30 in den Bahnen 3 bis 6 dargestellt. Rinder-Pankreas-Trypsin (von Worthington erworben; Chymotrypsin-frei) wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst und zu 50 µl Aliquoten von [³&sup5;S]-markiertem, von CHO-Zellen exprimiertem hBDNF zugesetzt. Die verwendeten Trypsinkonzentrationen waren 25, 50, 75 und 100 µg/ml. Die [³&sup5;S]-markierten Reaktionsprodukte sind entsprechend in den Bahnen 3 bis 6 dargestellt. Die enzymatische Spaltungsreaktion wurde 5 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Eine graduelle Abnahme der Markierungsintensität von PräprohBDNF mit einem Molekulargewicht von 31 000 wurde bei einer entsprechenden Zunahme eines Produktes mit einem Molekulargewicht von 18 500 beobachtet. Die reife Form von hBDNF (Molekulargewicht von 12 000) wurde bei diesen Bedingungen nicht erzeugt. In Figur 30 zeigt die Bahn 7 die [³&sup5;SJ-markierten Reaktionsprodukte nach einer enzymatischen Spaltung von von CHO-Zellen exprimiertem hBDNF mit der Endoproteinase Arg-C, die aus der submaxillären Drüse der Maus von Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc., isoliert wurde. 100 Einheiten dieses Enzyms wurden von einem gefriergetrockneten Präparat in 100 µl Milli-Q-Wasser gelöst und bei -20ºC aufbewahrt. Zur enzymatischen Spaltung von CHO-Zell-hBDNF wurden 5 Einheiten (5 µl) Enzym und 50 µl ³&sup5;5-markiertes Protein von CHO-Zell-Überständen, die PräprohBDNF enthielten, verwendet (Figur 30, Bahn 2). Wie in Figur 30 in der Bahn 7 dargestellt, konnten 5 Einheiten Endoproteinase Arg-C die Präpro-Form von hBDNF (Molekulargewicht von 31 000) in die reife Form von hBDNF (Molekulargewicht von 12 000) in 5 Minuten bei 37ºC umwandeln.
Die enzymatische Behandlung mit Endoproteinase Arg-C der Überstände von hBDNF-exprimierenden CHO-Zellen erhöhte die Menge der biologischen Aktivität von BDNF relativ zu unbehandelten Überständen. Die Überstände von hBDNF-exprimierenden CHO-DG44-Zellen wurden 5 Minuten bei 37ºC mit Endoproteinase Arg-C behandelt. 200 µl Überstand wurden mit 20 Einheiten Enzym behandelt und sowohl das behandelte als auch das nicht-behandelte hBDNF auf eine biologische Aktivität unter Verwendung von Explantaten von Spinalganglien von E8-Hühnern getestet. 24 Stunden nach der Zugabe von hBDNF wurde der Neuriten-Auswuchs qualitativ erfaßt. Es wurde durchgehend beobachtet, daß die Endoproteinase-behandelten BDNF-Proben bioaktiver als die Kontroll (unbehande lt en)-hBDNF-Proben waren. Eine Zeichnung der Konzentrationskurve dieser Daten ist in Figur 31 dargestellt.
Abschließend gesagt kann gereinigte Endoproteinase Arg-C in einer enzymatischen Reaktion in vitro verwendet werden, um die reife bioaktive Form des rekombinanten, von menschlichem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor aus unvollständig prozessierten Vorläufermolekülen (d. h., Pro BDNF) zu erzeugen. Dieses neue Verfahren ermöglicht eine effiziente Produktion in großem Maßstab von bioaktivem menschlichem BDNF von Säugerzell-Kultursystemen. Es kann beispielsweise möglich sein, die Endoproteinase Arg-C auf einer festen Matrix zu immobilisieren und einen effizienten Säulenchromatographieschritt durchzuführen.

18. Beispiel: Aus dem Gehirn stammender neurotropher Faktor fördert die Überlebensrate und Reifung von dopaminergen Neuronen des ventralen Mittelhims der Ratte

18.1. Materialien und Verfahren

18.1.1. Zellkulturen

Abgetrennte Kulturen wurden durch enzymatische und mechanische Trennung von aus E14-E15-Rattenembryonen seziertem Gewebe des ventralen Mittelhims hergestellt. Typischerweise wurde das vereinigte Gewebe von zwei oder drei Würfen von Rattenembryonen von zeitgenau-gepaarten Sprague-Dawley-Ratten mit Trypsin (0,125%; Worthington) in F12-Medium (Gibco) 20 Minuten bei 37ºC behandelt. Nach dem Waschen in Wachstumsmedium (MEM, das die folgenden Zusätze enthielt: 2 mM Glutamin, 6 mg/ml Glucose, 0,5 E/ml Penicillin G, 5 j£g/ml Streptomycin und 7,5% fötales Kälberserum) wurde das Gewebe kurz bei geringer Geschwindigkeit 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet durch Zerkleinern dispergiert. Man ließ die nicht-dispergierten Zeliklumpen 1 bis 2 Minuten absitzen und die Suspension aus einzelnen Zellen wurde auf Wachstumsmedium-enthaltende 35 mm-Schalen (zuvor mit Polyomithin und Laminin beschichtet; Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319) beimpft, um eine Dichte von 5 x 10&sup4; Zellen pro cm² zu erhalten. Nach einer Inkubation über Nacht in Wachstumsmedium, um das Anheften der Zellen zu ermöglichen, wurden die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von BDNF in einem serumfreien definierten Medium gezüchtet, wie von Bottenstein und Sato (Bottenstein und Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 514) beschrieben, ausgenommen daß Insulin mit 20 ng/ml enthalten war. Zur Sichtbarmachung von dopaminergen Zellen wurden die Kulturen mit 4% Paraformaldehyd fixiert, ausgiebig gewaschen, mit 0,02% Saponin in Sorensens-Puffer mit 1,5 % Pferdeserum permeabilisiert und mit einem monodonalen Maus-Antikörper gegen Ratten-TH (Boehringer-Mannheim) angefärbt. Die Bindung des primären Antikörpers wurde unter Verwendung eines Vectastain ABC-Kits (Vector Labs) sichtbargemacht.

18.1.2. Messung der Dopamin-Aufnahme

Die Kulturen wurden, wie vorstehend in 18.1.1. beschrieben, hergestellt und über die angegebene Zahl von Tagen entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 ng/ml Schweine-BDNF gezüchtet. Die Dopaminaufnahme wurde in dreifachen Kulturen zu den angegebenen Zeitpunkten ermittelt. Die Zellen wurden in Aufnahmepuffer der folgenden Zusammensetzung vorgewaschen: 136,8 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na&sub2;HPO&sub4; x 7H&sub2;O, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 5 mM Glucose, 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM Ascorbat und 0,1 mM Pargylin, pH 7,4. Diese Proben, bei denen die nichtneuronale H-Dopamin-Aufnahme gemessen wurde, enthielten Benztropin (BZT) im Aufnahmepuffer in einer Konzentration von 5 µM. Nach dem Waschen wurden die Zellen fünf Minuten auf 37 ºC in frischem Aufnahmepuffer vorgewärmt, wonach ³H- Dopamin (NEN, 40 Ci/mmol) zu einer Endkonzentration von 50 nM zugesetzt wurde. Die Kulturen wurden 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, die Aufnahmelösung entfernt und die Zellen auf Eis gegeben und viermal mit eiskaltem Aufnahmepuffer gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 0,5 N NaOH zu den Kulturschalen geerntet und der NaOH-Extrakt in einem Beckman-Scintillationszähler mit 15 ml Ultima Gold- Scintillationsflüssigkeit (Packard Instruments) gezählt. Die spezifische neuronale Dopamin-Aufnahme wird definiert als die Aufnahme (cpm), die in Abwesenheit von BZT beobachtet wurde, minus der in Gegenwart von BZT beobachteten. Üblicherweise waren 70 bis 90% der Gesamtaufnahme durch BZT inhibierbar. In Replikakulturen wurde zu jedem Zeitpunkt die Zahl von TH+-Neuronen durch immuncytochemische Anfärbung ermittelt und die dargestellten Ergebnisse zeigen die Aufnahme, die auf der Basis pro TH+-Neuron normalisiert wurden.

18.1.3. Übergangsexpression von BDNF

COS M5-Zellen wurden mit dem Vektor CDMB, der die menschlichen BDNF codierende Sequenz enthielt, transfiziert. 72 Stunden nach der Transfektion wurden 50 ml Kulturüberstand gesammelt und gegen 6 M Harnstoff dialysiert. Der dialysierte Überstand wurde anschließend mit Ampholin (pH 3,5 bis 10, Biorad) 4 1/2 Stunden vereinigt. Die Fraktionen wurden gesammelt, gegen 25 mM NaPO&sub4;-Puffer, pH 7,6, unter Verwendung eines Dialyseschlauchs, der zur Verhinderung einer nicht-spezifischen Absorption zuvor in BSA (0,5 mg/ml) gewaschen wurde, dialysiert. Die Fraktionen wurden auf eine den Neuritenauswuchs fördernde Aktivität in Kulturen von Expiantaten des Spinalganglions von E8-Hühnern getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt. Die Analyse des aktiven Pools durch SDS-PAGE und die anschließende Silberanfärbung (Wray et al., Anal. Biochem. 118 (1981), 197) auf einem 8 bis 18% Gel zeigten eine dem BSA entsprechende schwache Bande bei 68 kd und eine einzelne Bande bei etwa 12 kd, die der zuvor für Schweine-BDNF beobachteten entsprach (Barde et al., EMBO J. 1 (1982), 549) (Daten nicht dargestellt). In vergleichenden Biotests, die mit Spinal-, unteren Vagus- und sympathischen Ganglionexplantaten von Hühnern durchgeführt wurden, war die spezifische Aktivität und die neuronale Spezifität von gereinigtem rekombinantem menschlichem BDNF der von gereinigtem Schweine-BDNF ähnlich.

18.1.4. Produktion von hBDNF von transfizierten CHO-Zellen

Die CHO-DG44-Zellen waren ein freundliches Geschenk von Dr. L. Chasin (Columbia University, NY). Diese Zellen sind Dihydrofolatreductase-defizient (dhfr-) (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216-4220). Die CHO- DG44-Zellen wurden in Hams-F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin gehalten. Das Medium der Zellen wurden zweimal pro Woche gewechselt und üblicherweise auf eine Mycoplasma- Kontamination überprüft. Die gesamte Plasmid-DNA wurde durch zweifache Cäsiumchlorid-Bandierung vor der Transfektion gereinigt. Das Gen des aus menschlichem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors wurde in den Säuger-Expressionsvektor pCDMB subcloniert, um pcBhb zu erzeugen, wie vorstehend beschrieben (Maisonpierre et al., Science 247 (1990), 1446-1451). Ein geschwächtes Dihydrofolatreductasegen p410 wurde freundlicherweise von Dr. L. Chasin zur Verfügung gestellt. Diese beiden Genkonstrukte wurden durch Elektroporation (Zusammenfassung von Shigekawa und Dower, Biotechniques 6 (1988), 742-751) in CHO-DG44-Zellen cotransfiziert. Etwa 1 x 10&sup6; Zellen wurden mit 20 µg pC8hB und 0,2 µg p410 transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die CHO-DG44-Zellen in den Selektionsmedien verteilt, die aus Nucleosid-freiem Hams-F12-Medium (ohne Thymidin und Hypoxanthin; -HT) sowie 10% dialysiertem fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin und Streptomycin bestanden. Individuelle Kolonien wurden etwa 10 Tage nach der Zugabe der Zellen zu Nucleosid-freiem Selektionsmedium isoliert. Einzeln selektierte Kolonien, die in Nucleosid-freiem Hams-F12 (-HT)-Medium wachstumsresistent waren, wurden entweder mit 0,02, 0,05 oder mit 0,1 µM Methotrexat (MTX) behandelt, um die Genamplifikation zu induzieren (Alt et al., J. Biol. Chem. 253 (1978), 1357-1370). MTX-resistente Kolonien wurden als Pools gezüchtet und entweder mit 1,5, 2,0 oder 2,5 µM MTX weiter amplifiziert. Eine einzelne Kolonie, die gegen 2,5 µM MTX resistent war, wurde isoliert und für eine Kultur in großem Maßstab und Produktion von hBDNF selektiert. Die Southern-Blot-Analyse dieses Clons (DGZ1000-B-3-2.5) zeigte eine etwa Sofache Amplifikation des BDNF-Gens relativ zu Wildtyp-CHO-DG44-Zellen an. Biotests mit Expiantaten von Spinalganglien (DRG) von Hühnerembryonen (E8) wurden verwendet, wobei geschätzt wurde, daß dieser Clon etwa 9,5 µg hBDNF/ml produzierte (nicht dargestellt). Rekombinanter hBDNF wurde in großem Maßstab durch Züchtung von DGZ1000-B-3-2.5-Zellen in 480 cm²-Rundflaschen (roller bottles) produziert. Die Medien wurden etwa vier Tage nach Erreichen der Zellkonfluenz geerntet. Die Reinigung von hBDNF aus dem Kulturüberstand wurde, wie vorstehend für den COS-Überstand beschrieben, durchgeführt.

18.2. Ergebnisse und Diskussion

Die Charakterisierung von molekularen Signalen, die das neuronale Überleben und die Spezifität der Zielinnervierung kontrollieren, ist von fundamentalem Interesse, nicht nur weil sie bei der Aufklärung des Aufbaus des Nervensystems hilfreich ist, sondern auch weil sie wahrscheinlich zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führt, die an der Erhaltung und Reparatur von reifen Neuronen in geeigneten synaptischen Konfigurationen beteiligt sind. Während es weithin anerkannt ist, daß das Überleben und die Erhaltung von Neuronen von spezifischen, von Zielzellen stammenden neurotrophen Faktoren abhängt (Levi-Montalcini und Angeletti, Physiol. Rev. 48 (1968), 534, Thoenen und Barde, Physiol. Rev. 60 (1980), 1284, Purves, D., in Body and Brain, Harvard University Press, Cambridge, MA, Barde, Y. A., Neuron 2 (1989), 1525, und Lindsay, R. M., The Making of the Nervous System, Oxford University Press, Oxford, (1988), 5. 148), wurden nur sehr wenige solcher Moleküle vollständig charakterisiert. Bisher wurde gezeigt, daß nur zwei neurotrophe Faktoren, der Nervenwachstumsfaktor (NGF) und der vom Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF), das Überleben von verschiedenen neuronalen Populationen in vivo selektiv unterstützen (Levi-Montalcini und Angeletti, Physiol. Rev. 48 (1968), 534, Barde, Y. A., Neuron 2 (1989), 1525, und Leibrock et al., Nature 341 (1989), 149).
Kulturen von neuronalen Zellen wurden zur Etablierung von Biotests zur Identifizierung der neurotrophen Aktivität in Zell- und Gewebeextrakten (Levi- Montalcini und Angeletti, Physiol. Rev. 48 (1968), 534, Thoenen und Barde, Physiol. Rev. 60 (1980), 1284, Lindsay, R. M., The Making of the Nervous System, Oxford University Press, Oxford, (1988), S.148, und Varon und Adler, Adv. Cell. Neurobiol. 2 (1981), 118) und zur Ermittlung der neuronalen Spezifität(en) von gereinigten neurotrophen Faktoren (Ebendal, T., Nerve Growth Factors, John Wiley, London, (1989), 81, Barbin et al., 3. Neurochem. 43 (1984), 1468, Barde et al., EMBO J. 1 (1982), 549, Davies et al., 3. Neurosci. 6 (1986), 1897, und Lindsay et al., Dev. Biol. 112 (1985), 319) weithin verwendet. Bisher konzentrierten sich die meisten Untersuchungen auf die neurotrophen Erfordernisse von verschiedenen Klassen von Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS). Seine Verfügbarkeit machte NGF zum bei weitem am besten charakterisierten neurotrophen Faktor: Es wurde gezeigt, daß NGF für das Überleben und den Erhalt von neuronalen Subpopulationen sowohl im PNS als auch ZNS sowohl in vitro als auch in vivo essentiell ist (Levi-Montalcini und Angeletti, Physiol. Rev. 48 (1968), 534, Thoenen und Barde, Physiol. Rev. 60 (1980), 1284, Whittemore und Seiger, Brain Res. Rev. 12 (1987), 439, Snider und Johnson, Ann. Neurol. 26 (1989), 489, Hefti et al., Neurobiology of Aging 10 (1989), 515, Martinez et al., Brain Res. 412 (1987), 295, Takei et al., 3. Neurochem. 51 (1988), 1118, und Hartikka und Hefti, 3. Neurosci. 8 (1988), 2967). Ein Hindernis für die Identifikation von neurotrophen Wachstumsfaktoren für spezifische ZNS-Neuronen war die begrenzte Verfügbarkeit von gereinigten Präparationen von anderen neurotrophen Faktoren als NGF und die Schwierigkeit der Herstellung von homogenen Präparationen von spezifischen neuronalen Populationen. Aufgrund von zwei kürzlichen Beobachtungen wurde die Wirkung von BDNF auf das Überleben von dopaminergen Substantia nigra-ZNS- Neuronen untersucht. Zunächst ist nun klar, daß das BDNF-Gen im ZNS und in vergleichbaren oder höheren Mengen als das NGF-Gen (Leibrock et al., Nature 341 (1989), 149) exprimiert wird. Zweitens wurde berichtet, daß ein Protein, das von Rinder-Striatum (ein Ziel von dopaminergen Substantia nigra-Neuronen) partiell gereinigt worden war, mit Charakteristika, die anscheinend denen von BDNF ähnlich sind, das Überleben von aus dem Mittelhirn hergestellten dopaminergen Neuronen in vitro erhöhen kann (Dal Toso et al., 3. Neurosci. 8 (1988), 733).
Figur 32A erläutert das typische Aussehen von dissozuerten ventralen Mittelhirnzellen nach neun Tagen in Kultur. Fast alle Zellen hatten ein phasenhelles Perikaryon und lange Fortsätze. Wenige Zellen mit Fibroblasten-Morphologie waren sichtbar und keine Sternzellen wurden nachgewiesen, wenn die Kulturen mit Antikörpern gegen den Sternzellen-Marker, einem fibrillären sauren Protein der Gliazellen, angefärbt wurden (GFAP; Bignami et al., Brain Res. 43 (1972), 429). Zur Sichtbarmachung von dopaminergen Neuronen in dieser Kultur wurde eine immuncytochemische Anfärbung mit monodonalen Antikörpern gegen TH durchgeführt. Wie erwartet, war die Zahl von TH+-Neuronen klein (Pfeile, Fig. 328, 32C) und schwankte je nach der Kulturzeit zwischen 0,1 und 0,5% der plattierten Zellen. Verschiedene neuronale Morphologien wurden bei den TH +-Zellen festgestellt, wie in Figur 33 dargestellt.
In allen Kulturen gab es ständig eine graduelle Abnahme der Zahl von TH+- Zellen (Figs. 34A, 35) nach den ersten 3 bis 4 Tagen in vitro. Nach 8 Tagen Züchtung war beispielsweise die Zahl von TH+-Zellen in Kontrollkülturen nur 25 % von der, die in ähnlichen Kulturen am Tag 2 gefunden wurde (Fig. 35). In mit BDNF behandelten Kulturen war jedoch der Verlust von TH+-Zellen im Vergleich zu den Kontrollen stark reduziert. Zu allen Zeiten, die nach 8 Tagen in vitro untersucht wurden, war die Zahl der TH+-Zellen in BDNF-behandelten Kulturen größer als in den unbehandelten Kontrollen, z. B. 1,8fach höher nach einer einzigen Zugabe von BDNF (Fig. 34A) und Sfach höher nach mehreren Zugaben (Fig. 35). Selbst bei einer einmaligen Zugabe zu 8 Tage erhaltenen Kulturen wurde festgestellt, daß die Wirkung von BDNF dosisabhängig war (Fig. 348). In Übereinstimmung mit früheren Berichten (Dal Toso et al., J. Neurosci. 8 (1988), 733, und Knusel et al., J. Neurosci. 10 (1990), 558) hatte NGF (50 ng/ml) keine Wirkung auf die Zahl von TH+-Zellen (Fig. 34C).
Als weiterer Weg zur Untersuchung der Wirkung von BDNF auf dopaminerge Neuronen in diesen Kulturen wurde die Kapazität der TH+-Zellen zur Aufnahme von H-Dopamin untersucht. Wie in Tabelle X dargestellt, erhöhte sich die Dopamin-Aufnahmekapazität (pro TH+-Neuron normalisiert) deutlich während der ersten 8 Tage der Züchtung, fiel jedoch danach wieder. Es wurde jedoch festgestellt, daß BDNF die Aufnahmekapazität von TH+-Zellen für Dopamin nicht veränderte, da der gleiche Zeitverlauf und ähnliche Werte in Gegenwart oder Abwesenheit von BDNF erhalten wurden (Tabelle X). Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde die Hypothese aufgestellt, daß BDNF wahrscheinlich direkt das Überleben von dopaminergen Neuronen in Mittelhirnkulturen im Gegensatz zur Induktion der Expression eines dopaminergen pHänotyps in nicht notwendigerweise BDNF für ihr Überleben benötigenden Neuronen fördert. Zur weiteren Untersuchung wurden Experimente durchgeführt, in denen die Zahl von TH+-Neuronen in Kultur, zu der BDNF mit einer anfänglichen Verzögerung von mehreren Tagen zugesetzt wurde, ermittelt wurde. Es wurde festgestellt, daß bei einer Verzögerung der BDNF-Zugabe bis zum Tag 5 und der anschließenden Ermittlung der Zahl von TH+-Zellen nach 6, 8 oder 10 Tagen weniger dopaminerge Zellen in diesen Kulturen im Vergleich zu parallelen Kulturen, in denen BDNF vom Tag 2 an vorhanden war, beobachtet wurden (Fig. 36). Obwohl eine verzögerte Zugabe von BDNF die Zahl von TH+-Neuronen im Vergleich zu den Kontrollen deutlich erhöhte, wurde selbst bei einer Untersuchung zu gleichen Zeitpunkten niemals festgestellt, daß die Wirkung der verzögerten Zugabe so viele TH+-Neuronen rettete wie die Zugabe von BDNF am Tag 2.
Zusammengefaßt sprechen diese Ergebnisse gegen die Möglichkeit, daß BDNF nur die Erhöhung der TH-Genexpression in einer bestimmten Zahl von Zellen bewirkt, und lassen den Schluß zu, daß die Wirkung von BDNF auf Erhöhung der Überlebensrate von dopaminergen Neuronen beruht, die sonst verloren gehen, wenn dieser neurotrophe Faktor den Kulturen in einem frühen Stadium nicht zugesetzt wird.
Mehrere Berichte dokumentierten die In vitro-Stimulierung der Reifung und Erhöhung des Überlebens von dopaminergen Neuronen des Mittelhims entweder durch vom Ziel stammende Extrakte oder verschiedene Wachstumsfaktoren (Dal Toso et al., 3. Neurosci. 8 (1988), 733, Knusel et al., J. Neurosci. 10 (1990), 558, Prochiantz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5387, Diporzio et al., Nature 288 (1980), 370, Prochiantz et al., Nature 293 (1981), 570, und Denis-Donini et al., J. Neurosci. 3 (1983), 2292). Bisher wurde jedoch noch kein vollständig gereinigtes Molekül beschrieben, das direkt und selektiv das Überleben von TH+-Neuronen bei vollständiger Abwesenheit von Gliazellen oder einer erhöhten Zellteilung unterstützt (wie beispielsweise bei IGF-1 oder FGF beobachtet wurde, Dal Toso et al., 3. Neurosci. 8 (1988), 733). In Übereinstimmung mit früheren Berichten wurde unter Verwendung von Gewebe von frühen Mausembryonen (Dal Toso et al., J. Neurosci. 8 (1988), 733) festgestellt, daß Gewebe von ventralen Mittelhirnzellen von E14-Ratten, die in serumfreiem definierten Medium gezüchtet wurden, im wesentlichen frei von Sternzellen oder Fibroblasten waren. Die in dieser Untersuchung verwendete relativ geringe Zellplattierungsdichte von 50 000 Zellen/cm² verringerte die Wirkungen jeder möglichen endogenen neurotrophen Aktivität und ermöglichte eine genauere Zellzählung. Angesichts der hier dargestellten Ergebnisse scheint es, daß der neurotrophe Faktor, der von Rinder-Striatum von Del Toso et al. partiell gereinigt wurde (Dal Toso et al., 3. Neurosci. 8 (1988), 733), wahrscheinlich BDNF ist. Dies läßt den Schluß zu, daß BDNF im Striatum produziert und von den Enden der dopaminergen Neuronen, die von der Substantia nigra ausgehen, aufgenommen wird. Bisher wurde jedoch durch Northem-Blot-Analysen festgestellt, daß die mRNA für BDNF (oder auch mRNA für andere Mitglieder der Neurotrophin-Famihe) im striatalen Gewebe nicht in großen Mengen vorhanden ist.
Es ist klar, daß die Zugabe von BDNF, selbst bei mehrfacher Zugabe, nicht zu einem vollständigen Überleben von nigralen dopaminergen Substantia nigra- Neuronen während der analysierten Züchtungszeiträume fülrrte. Dieses Phänomen wurde bereits unter zu den hier beschriebenen experimentellen Bedingungen sehr ähnlichen Bedingungen von Dal Toso et al. (Dal Toso et al., J. Neurosci. 8 (1988), 733) beobachtet, die zeigen konnten, daß dieser Verlust mit der verwendeten Zelldichte zusammenhängt; bei höheren Zelldichten (die vierfache der hier verwendeten) konnte eine größere Zahl von Brenzkatechinamin-fluoreszierenden Zellen beobachtet werden, und das spontane Verschwinden dieser Zellen verringerte sich. Möglicherweise ist der Zell-Zell-Kontakt für ein Langzeit-Überleben dieser Zellen erforderlich.
Weitere Untersuchungen, besonders solche, die auf die Untersuchung der Wirkungen von BDNF auf die Entwicklung und den Erhalt von dopaminergen Neuronen des ventralen Mittelhirns in vivo gerichtet sind, werden erforderlich sein, um die physiologische Relevanz der Wirkung des hier beschriebenen BDNF zu ermitteln. Angesichts des spezifischen Verlustes von dopaminergen Substantia nigra-Neuronen bei der Parkinson-Krankheit ist es besonders wünschenswert, einen neurotrophen Faktor zu finden, der diese Zellen selektiv beeinflußt. Der vorliegende Befund, daß BDNF das Überleben dieser Neuronenzellen unterstützt, die auf NGF nicht antworten, liefert daher das Grundprinzip für Tierexperimente, die entscheiden werden, ob BDNF dopaminerge Neuronen vor den neurotoxischen Wirkungen entweder von 6-Hydroxydopamin oder MPTP (1-Methyl-4-phenyl- 1,2,3,6-tetrahydropyridin) schützen kann. Diese Untersuchungen können zu einem neuen therapeutischen Verfahren für die Parkinson- Krankheit führen. Tabelle X Die Dopaminaufnahme in Kulturen des ventralen Mittelhirns wird durch BDNF nicht direkt erhöht

19. Beispiel: BDNF bewirkt eine dosisabhängige Inhibition der Aufnahme von Gamma- Aminobuttersäure

19.1. Materialien und Verfahren

19.1.1. Hippokampus-Zellkülturen

Hippokampi wurden aus E18-19-Rattenembryonen von Sprague-Dawley- Ratten seziert und in F10-Medium gesammelt. Die Gewebe wurden zerkleinert, zweimal mit F10-Medium (Gibco) gespült und mit 0,25% Trypsin (Gibco) 20 Minuten bei 37ºC behandelt. Das Trypsin wurde durch Zugabe eines Serum-enthaltenden Mediums inaktiviert, das aus einem "minimal essential" Medium (MEM) bestand, dem fötales Kälberserum (10% FCS), Glutamin (2 mM), Penicillin (25 E/ml) und Streptomycin (25 µg/ml) zugesetzt wurden. Die getrennten Zellen, die durch vorsichtiges Zerkleinern erhalten wurden, wurden gesammelt und bei geringer Geschwindigkeit (500 Upm) 30 Sekunden zentrifugiert. Die Zentrifugation wurde zweimal wiederholt, und die Zellpellets wurden anschließend in Serum-enthaltendem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend in 6 mm-Vertiefungen oder auf 35mm-Schalen, die mit Polyomithin (10 µg/ml) und Laminin (10 µg/ml) beschichtet waren, plattiert. In den meisten Experimenten wurden die Zellen mit geringer Dichte von etwa 71 000 Zellen/cm² plattiert. Fünf bis sechs Stunden nach der Plattierung der Zellen wurde das Medium gegen ein serumfreies Medium, das 1 % N3 und Penicillin- Streptomycin (25 Einheiten/ml bzw. 25 µg/ml) enthielt, ausgetauscht, wobei auch BDNF zugesetzt wurde. Das Medium wurde alle drei bis vier Tage ausgetauscht, wobei der Faktor erneut zugesetzt wurde.

19.1.2. Messung der Hochaffinitätsaufnahme von Gamma-Aminobuttersäure (GABA)

Die Hochaffinitätsaufnahme von GABA wurde unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens von Tomozawa und Appel gemessen (Brain Res. 399 (1986), 111- 124). Die Zellen wurden in GABA-Aufnahmepuffer, der 140 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1 mM KH&sub2;PO&sub4;, 1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 6 mg/ml Glucose, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM CaCl&sub2; und 0,1 % BSA enthielt, gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in GABA- Aufnahmepuffer 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. ³H-GABA (NEN, NET-191X, 111,4 Ci/mmol) wurde anschließend zu einer Endkonzentration von 12 nM zugesetzt und die Inkubation 10 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Die Zellen wurden anschließend auf Eis gehalten und dreimal mit dem Aufnahmepuffer gewaschen. Die Zellen wurden mit 0,14 N NaOH 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und ³H-GABA wurde im Extrakt gezählt. Es wurde festgestellt, daß die ³H-GABA-Aufnahme für mindestens bis zu 30 Minuten linear war. Die Aufnahme von GABA in nicht-neuronale Zellen wurde durch Zugabe von 2 mM β-Alanin gehemmt, während die für Neuronen spezifische Aufnahme durch Inhibition mit Nipecotinsäure bei 1 mM überprüft wurde.

19.2. Ergebnisse und Diskussion

Kürzlich wurden große Mengen der mRNA-message für BDNF in mit Neuronen angereicherten Hippokampus-Kulturen, jedoch nicht in Hippokampus- Sternzellen nachgewiesen. Diese Daten lassen stark darauf schließen, daß BDNF in Hippokampus-Neuronen lokalisiert ist. Zur Untersuchung dieser Wirkung von BDNF auf Hippokampus-Neuronen in Kultur wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von BDNF (von COS-Überständen Rotophor-gereinigt) behandelt. Am Ende des 8-tägigen Behandlungszeitraums wurde die Hochaffinitäts-GABA-Aufnahme in Neuronen gemessen. Wie in Figur 37 dargestellt, produzierte BDNF eine dosisabhängige Inhibition der GABA-Aufnahme. BDNF kann daher das Überleben und/oder die phänotypische Expression von Gabaergen Neuronen beeinflußt. BDNF hatte weder eine Wirkung auf Glutamat-enthaltende Neuronen (wie durch Messung der Glutamat- Aufnahme ermittelt wurde) noch auf die Menge von neurofilamentösem Protein. Daher scheint die Wirkung von BDNF auf Hippokampus-Kulturen für Gabaerge Neuronen spezifisch zu sein.

20. Beispiel: BDNF überträgt eine Schutzwirkung gegen die toxische Wirkung von MPP+

20.1. Materialien und Verfahren

20.1.1. Messung der Wirkungen von neurotrophen Faktoren auf MPP+-behandelte SH- SY5Y-Zellen

SH-SY5Y-Zellen wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 1 x 10&sup5; Zellen pro Vertiefung beimpft. 24 Stunden nach der Beimpfung wurden die Zellen mit neurotrophen Faktoren behändelt. 24 Stunden nach der Behandlung mit neurotrophen Faktoren wurden die Zellen mit MPP+ (10 µM) behandelt. 48 Stunden nach der MPP+-Zugabe wurden die lebensfähigen Zellen durch den Trypan-Blau- Ausschlußtest quantitativ bestimmt. Die verwendeten neurotrophen Faktoren waren mNGF-COS (1:5-Verdünnung), hBDNF-COS (1:5-Verdünnung), gereinigtes rCNTF von E. coli (25 ng/ml), gereinigtes Rinderhim-BFGF (25 ng/ml), rNT3-COS (1:5- Verdünnung) und gereinigtes hEGF (25 ng/ml).

20.1.2. Messung der Wirkungen von neurotrophen Faktoren auf MPP+-behandelte Kulturen des ventralen Mittelhirns

Kulturen von abgetrennten Neuronen des ventralen Mittelhims wurden von E14-Rattenembryonen gemäß den bekannten Protokollen etabliert (Vgl. vorstehenden Abschnitt 18). 48 Stunden nach ihrer Etablierung wurden diese Kulturen mit den geeigneten neurotrophen Wirkstoffen, wie angegeben, behandelt. Neurotrophe Faktoren schlossen hBDNF (von CHO-Zellen Rotophor-gereinigt, ≤ 50 ng/ml), gereinigtes MNGF (50 ng/ml), rNT-3 (COS-Überstände mit einer 1:50-Verdünnung), gereinigtes Rinderhirn BFGF (10 ng/ml) und gereinigtes rCNTF (25 ng/ml) von E. coli ein. 24 Stunden nach der Zugabe des neurotrophen Faktors wurden diese Kulturen mit MPP+ (1 µM) behandelt. 48 Stunden nach der Behandlung mit MPP+ wurden die TH-positiven Neuronen durch immunhistochemische Verfahren identifiziert und quantitativ bestimmt. Die Daten stellen Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten dar, die mit dreifachen Proben pro Experiment durchgeführt wurden. Die Zahl von TH-positiven Neuronen nach einer MPP+-Behandlung wird durch gekreuzt-schraffierte Balken dargestellt. Leere Balken geben die Zahl von TH-positiven Neuronen ohne eine MPP+- Behandlung wider.

20.2. Ergebnisse und Diskussion

Wenn BDNF, NGF, CNTF, NT-3, BFGF und EGF getrennt auf ihre Schutzwirkung von SH-SY5Y-Zellen vor der Toxizität von 1-Methyl-4-phenylpyrridinium (MPP+), wie durch einen Trypan-Blau-Ausschlußtest gemessen wurde, getestet wurden, schien nur BDNF und NGF eine signifikant schützende Aktivität gegen die Toxizität von MPP+ zu zeigen (Tabellen XI und XII). Tabelle XI BDNF- und NGF-Schutz von SH-SY5Y-Zellen vor der MPP+-Toxizität Tabelle XII BDNF- und NGF-Konzentrationskurve für MPP+-Toxizitätsexperimente
In Kulturen des ventralen Mittelhims zeigen die Daten, daß BDNF eine signifikante Schutzwirkung gegen die MPP+-Toxizität zeigte, während sie bei BFGF geringer war (Figur 38). Es wurde festgestellt, daß die MPP+-Behandlung die Zahl von Tyrosin-Hydroxylase-positiven Neuronen um 85 % in Kontrollkulturen, jedoch nur um 40% in Kulturen, die mit BDNF vor der MPP+-Exposition vorbehandelt wurden, reduzierte. MPP + ist der angenommene aktive Metabolit für das Toxin MPTP, von dem beobachtet wurde, daß er ein der Parkinson-Krankheit ähnliches Syndrom in vivo induzierte, was ein akzeptiertes Modellsystem für die Parkinson-Krankheit ist. Daher zeigt die Schutzwirkung von BDNF und NT-3, daß diese Verbindungen sich zur Behandlung der Parkinson-Krankheit oder zur Prävention des neurologischen Schadens im Anschluß an eine toxische Exposition als nützlich erweisen können.

21. Hinterlegung von Mikroorganismen

Der nachstehende rekombinante Bakteriophage und die nachstehende Plasmid- DNA wurden am 30. August 1989 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt:

Claims

1. Ein im wesentlichen gereinigtes DNA-Molekül, umfassend eine Sequenz, die ein reifes, aus dem menschlichen Gehirn stammendes neurotropher Faktor (BDNF)-Protein codiert, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt:

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das in Figur 5 dargestellt ist oder eine Teilsequenz davon, das ein Polypeptid mit BDNF-Aktivität codiert.

3. Im wesentlichen gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das homolog oder komplementär zu dem DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 oder einer Teilsequenz davon ist und ein Polypeptid mit BDNF-Aktivität codiert.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, das ein DNA-Molekül ist, das die in Figur 5 für menschliches BDNF gezeigte Sequenz von Nucleotid 974 bis Nucleotid 1330 besitzt.

5. DNA-Molekül nach Anspruch 2, das in PhBDNF-C-1 (hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40648) oder in XhBDNF-G-1 (hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40649) enthalten ist.

6. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3 oder 4 oder DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 11 2 oder 5, das in der Lage ist BDNF oder ein Peptidfragment davon in einer Wirtszelle zu exprimieren, wobei die Nucleinsäure oder das DNA-Molekül unter der Kontrolle einer regulatorischen DNA-Sequenz ist.

7. Vektor, umfassend ein Nualeinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 6 oder ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1, 2, 5 oder 6.

8. Vektor nach Anspruch 7, ausgewählt aus phBDNF-C-1 (hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40648) und λhBDNF-G-1 (hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40649).

9. Zelle, die ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1, 2, 5 oder 6, ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 6 oder einen Vektor nach Anspruch 7 oder 8 enthält.

10. Zelle nach Anspruch 9, die ein rekombinanter Mikroorganismus ist.

11. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 10, der ein Bakterium oder Hefe ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines BDNF-Proteins, umfassend das Züchten einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Nucleinsäure oder das DNA-Molekül in der Wirtszelle exprimiert wird; und die Isolierung des exprimierten BDNF-Proteins.

113. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zelle eine eukaryontische oder prokaryontische Zelle ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die prokaryontische Zelle ein Bakterium ist.

15. Im wesentlichen gereinigtes, isoliertes und nicht-denaturiertes Protein, das neurotrophische Aktivität und die folgende Aminosäuresequenz besitzt:

16. Im wesentlichen gereinigtes, isoliertes und nicht-denaturiertes Protein nach Anspruch 15, das in Ovar-Zellen eines Chinesischen Hamsters hergestellt und daraus gereinigt wird.

17. Im wesentlichen gereinigtes, isoliertes und nicht-denaturiertes BDNF-Protein oder Polypeptid mit BDNF-Aktivität, das von einer bakteriellen Zelle nach Anspruch 11 hergestellt und daraus gereinigt wird.

18. Arzneimittel, umfassend ein im wesentlichen gereinigtes, isoliertes und nicht-denaturiertes Protein nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

119. Arzneimittel nach Anspruch 18, wobei der Träger ein langsam freigebender Träger ist.

20. Arzneimittel nach Anspruch 18 oder 19, das einen Zweiten Wirkstoff umfaßt.

21. Arzneimittel nach Anspruch 20, wobei der zweite Wirkstoff ein Nervenwachstumfaktor oder ein anderes Mitglied der BDNF/NGF (aus dem Gehirn stammender neurotropher Faktor/Nervenwachstumfaktor)-Familie ist.

22. Antikörper, Antikörperfragment oder ein Derivat davon, das spezifisch ein BDNF-Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14 erkennt.

23. Antikörper, Antikörperfragment oder ein Derivat nach Anspruch 22, die eine nachweisbare Markierung besitzen; zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems.

24. BDNF-Protein nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers gegen eine Krankheit oder Störung des Nervensystems.

25. BDNF nach Anspruch 24, wobei die Krankheit oder Störung eine Krankheit oder Störung sensorischer Neuronen ist.

26. BDNF nach Anspruch 25, wobei die Krankheit oder Störung der sensorischen Neuronen diabetische Neuropathie ist.

27. BDNF nach Anspruch 24, wobei die Krankheit oder Störung des Nervensystems eine Krankheit oder Störung cholinergischer Neuronen ist.

28. BDNF nach Anspruch 27, wobei die cholinergischen Neuro nen basale Vorderhirn-cholinergische Neuronen oder Septum-cholinergische Neuronen sind.

29. BDNF nach Anspruch 24, wobei die Krankheit oder Störung die Alzheimer-Krankheit, Huntington chorea, Netzhaut- Krankheit, Parkinson-Krankheit, Parkinson-Plus-Syndrom oder diabetische Neuropathie ist.

30. BDNF nach Anspruch 24, wobei die Krankheit oder Störung des Nervensystems eine Krankheit oder Störung dopaminergischer Neuronen ist.

31. BDNF nach Anspruch 30, wobei die Krankheit oder Störung die Parkinson-Krankheit ist.

32. BDNF nach Anspruch 24, wobei die Krankheit oder Störung des Nervensystems Schädigungen des Nervensystems umfaßt.

33. BDNF näch Anspruch 32, wobei die Schädigung durch Verletzung, Operation, Infarkt, Infektion, Malignität, Ausgesetztsein einem toxischen Stoff, Ernährungsmangel, oder diabetische Neuropathie verursacht wird.