DE69635738T2

DE69635738T2 - Neurturin und verwandte Wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE69635738T2
Application number: DE69635738T
Authority: DE
Inventors: Jr. Eugene M. St. Louis JOHNSON; Jeffrey D. St. Louis MILBRANDT; Paul T. St. Louis KOTZBAUER; Patricia A. St. Louis LAMPE
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1995-08-28
Filing date: 1996-08-27
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2016-08-28
Also published as: EP0787142A1; CA2194172C; ATE315578T1; US5739307A; CA2194172A1; DK0787142T3; AU7105496A; NZ332921A; US5817622A; US7015311B1; IL122774A0; JPH11512928A; EP0787142A4; MX9800277A; EP0787142B1; US6090778A; US5843914A; NZ332922A; NZ318939A; WO1997008196A1

Description

Verweis auf staatliche Unterstützung
Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den Förderungsnummern NS24679 und CA53524 gemacht. Die Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
(1) Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein trophische Faktoren oder Wachstumsfaktoren und insbesondere den neuen Wachstumsfaktor Neurturin.
(2) Beschreibung des verwandten Fachgebiets
Die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Geweben in komplexen Organismen macht eine präzise Kontrolle über die Prozesse der Zellproliferation, der Differenzierung, des Überlebens und der Funktion erforderlich. Ein wichtiger Mechanismus, wodurch diese Prozesse kontrolliert werden, ist durch die Wirkungen von Proteinen, welche als "Wachstumsfaktoren" bekannt sind. Diese strukturell verschiedenartigen Moleküle wirken über spezifische Zelloberflächenrezeptoren ein, um diese Wirkungen hervorzurufen.
In den letzten Jahren ist deutlich geworden, daß Wachstumsfaktoren basierend auf den Ähnlichkeiten hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenzen in Klassen, d.h. Familien oder Superfamilien, eingeteilt werden können. Beispiele solcher Familien, welche identifiziert worden sind, schließen die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Familie, die Neurotrophin-Familie und die Familie des transformierenden Wachstumsfaktors Beta (TGF-β) ein.
Von besonderer Wichtigkeit sind die als "neurotrophe Faktoren" bezeichneten Wachstumsfaktoren, welche die Differenzierung, das Wachstums und das Überleben von Neuronen fördern und im Nervensystem oder in innervierten Geweben vorkommen. Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) war der erste neurotrophe Faktor, welcher identifiziert und charakterisiert wurde (Levi-Montalcini et al., J. Exp. Zool. 116 (1951), 321). NGF liegt als ein nicht-kovalent gebundenes Homodimer vor. Dieser Faktor fördert das Überleben und das Wachstum von sympathischen Neuronen, aus der Neuralleiste stammenden sensorischen Neuronen und cholinergen Neuronen im basalen Vorderhirn. In sympathischen Neuronen induziert diese Substanz das Auswachsen von Neuriten in vitro und ein vermindertes axonales und dendritisches Wachstum in vivo. Frühe Hinweise auf die physiologischen Funktionen von NGF wurden aus in-vivo-Studien erhalten, welche die Verabreichung von neutralisierenden Antikörpern beinhalteten (Levi-Montalcini und Booker, Proc. Natl. Acad. Sci. 46 (1960), 384-391; Johnson et al., Science 210 (1980), 916-918), und diese Studien sind durch die Untersuchung von transgenen Mäusen, welche keinen NGF besitzen, mittels "Gen-Targeting" bestätigt worden (Crowley et al., Cell 76 (1994), 1001-1012). NGF hat Auswirkungen auf die Kognition und Neuronenplastizität und kann das Überleben von Neuronen, welche aufgrund einer Vielzahl von mechanischen, chemischen, viralen und immunologischen Verletzungen eine Schädigung erlitten haben, fördern (Snider und Johnson, Ann. Neurol. 26 (1989), 489-506; Hefti, J. Neurobiol. 25 (1994), 1418-1435). Es ist auch bekannt, daß NGF intensiv mit dem endokrinen System interagiert und an immunologischen und entzündlichen Prozessen beteiligt ist (zusammengefaßt bei Scully und Otten, Cell Biol. Int. 19 (1995), 459-469; Otten und Gadient, Int. J. Devl. Neurosci. 13 (1995), 147-151). Beispielsweise fördert NGF das Überleben von Mastzellen (Horigome et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 2695-2707).
Nach der Entdeckung und Clonierung des vom Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) (Liebrock et al., Nature 341 (1989), 149-152), welcher der zweite Vertreter dieser zu entdeckenden Familie war, wurde deutlich, daß NGF der Prototyp für eine Familie von neurotrophen Faktoren war. Die Verwandtschaft von BDNF mit NGF zeigt sich in der Konservierung von allen sechs Cysteinen, welche die drei internen Disulfidbrücken des NGF-Monomers bilden (Barde, Prog. Growth Factor Res. 2 (1990), 237-248). Durch Auswertung der durch BDNF bereitgestellten Information über die stark konservierten Bereiche der zwei Faktoren wurden durch mehrere Gruppen schnell weitere Vertreter (NT-3 und NT-4/5) dieser Neurotrophin-Familie gefunden (Klein, FASEB J. 8 (1994), 738-744). Informationen über ihre Verteilung und ihre Aktivitäten und die physiologischen Folgen ihres Mangels (mittels "Gen-Targeting") hat das Wissen über die neuronale Entwicklung stark erweitert (für eine Übersicht vgl. Jelsma et al., Curr. Opin. Neurobiol. 4 (1995), 717-725; Lindsay et al., Trends Neurosci. 17 (1994), 182-190; und Johnson et al., Curr. Biol. 4 (1994), 662-665). Zum Beispiel ist es nun offensichtlich, daß die verschiedenen Neurotrophine auf sich größtenteils nicht überlappende, neuronale Popula tionen (z.B. motorische Neurone, Subpopulationen von sensorischen Neuronen) einwirken und deren Überleben und deren Stoffwechsel in einer Art und Weise regulieren, welche derjenigen ähnlich ist, die ursprünglich für NGF beschrieben wurde. Ihre Identifizierung hat auch zu Verfeinerungen bei der neurotrophen Hypothese geführt, da sich die Hinweise verdichtet haben, daß Neurone ihre Neurotrophin-Überlebensanforderungen während der Reifung umstellen können (für eine Übersicht vgl. Davies, Curr. Biol. 4 (1994), 273-276).
Vor kurzem ist die Einsicht in die Mechanismen der Signalübertragung für neurotrophe Faktoren durch die Identifizierung von Rezeptoren für die NGF-Familie der neurotrophen Faktoren erweitert worden. Der Tyrosinkinase-Rezeptor trkA, welcher als der NGF-Rezeptor identifiziert wurde, und die nahe verwandten Rezeptoren trkB, welcher die Signalaussendung von BDNF und NT-4/5 vermittelt, und trkC, welcher die Wirkungen von NT-3 vermittelt, hat die genaue Analyse der Signalübertragungswege, welche durch diese Neurotrophine verwendet werden, ermöglicht (für eine Übersicht vgl. Tuszynski et al., Ann. Neurol. 35 (1994), S9-S12). An der Signalaussendung durch NGF sind Proteine, welche direkt mit dem phosphorylierten trkA-Rezeptor interagieren (z.B. Shc, PLCγ1, PI-3-Kinase), und andere trkA-Substrate wie SNT (Rabin et al., Mol. Cell Biol. 13 (1995), 2203-2213) sowie stromabwärts angeordnete Kinase-Effektoren (z.B. ras, raf1, MEK- und MAP-Kinase) beteiligt. In einigen Fällen sind einzelne Komponenten mit spezifischen Wirkungen von NGF, wie die Shc- und PLCγ1-Anforderung für das Auswachsen von Neuriten (Loeb et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 8901-8910; Stephens et al., Neuron 12 (1994), 691-705) und die PI-3-Kinase-Anforderung für das Überleben (Yao und Cooper, Science 267 (1995), 2003-2006), in Verbindung gebracht worden.
Zusätzlich zu der Entdeckung von Molekülen, welche mit NGF verwandt sind, sind vor kurzem auch strukturell nicht miteinander verwandte neurotrophe Faktoren identifiziert worden. Diese schließen Faktoren ein, welche ursprünglich basierend auf einer "neurotrophen Wirkung" isoliert wurden, wie der ziliare neurotrophe Faktor (CNTF) (Lin et al., Science 246 (1989), 1023-1025), sowie andere Faktoren, welche ursprünglich als Ergebnis einer nicht-neuronalen Aktivität isoliert wurden (z.B. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (Cheng und Mattson, Neuron 1 (1991), 1031-1041), IGF-I (Kanje et al., Brain Res. 486 (1989), 396-398) und der Leukämie-Inhibitionsfaktor (Kotzbauer et al., Neuron 12 (1994), 763-773).
Der von Gliazellen abstammende neurotrophe Faktor (GDNF) ist ein solcher neurotropher Faktor, welcher keine strukturelle Verwandtschaft mit NGF aufweist. GDNF war folglich ein einzigartiger Faktor, von dem bis heute nicht bekannt war, ob er ein Vertreter irgendeiner Subfamilie von Faktoren ist. Die Entdeckung, Reinigung und Clonierung von GDNF resultierte aus der Suche nach Faktoren, welche für das Überleben von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn, die bei der Parkinson-Krankheit degenerieren, entscheidend sind. GDNF wurde aus konditionierten Medien von Ratten-B49-Gliazellen gereinigt (Lin et al., Science 260 (1993), 1130-1132). Eine Sequenzanalyse ergab, daß es sich um einen entfernt verwandten Vertreter der Faktoren-Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors-β (TGF-β) mit einer Übereinstimmung von etwa 20%, basierend primär auf der charakteristischen Ausrichtung der 7 Cysteinreste, handelte (Lin et al., Science 260 (1993), 1130-1132). Somit könnte GDNF möglicherweise eine neue Subfamilie innerhalb der TGF-β-Superfamilie darstellen.
GDNF weist ähnlich wie andere Vertreter der TGF-β-Superfamilie ein Vorläufermolekül mit einer Signalsequenz und einer unterschiedlich großen Pro-Region auf welche im allgemeinen an einer RXXR-Stelle gespalten wird, um das 134 Aminosäuren aufweisende reife Protein, GDNF, freizusetzen. Folglich wird GDNF als ein Vorläuferprotein synthetisiert.
Die nachfolgende Prozessierung ergibt ein reifes glykosyliertes Homodimer von etwa 35-40 kD. Sechs der sieben Cysteine bilden Disulfidbrücken innerhalb der Kette aus und verknüpfen die über Wasserstoffbrücken miteinander verbundenen β-Faltblätter, um eine stabile Struktur zu bilden, welche als ein Cystinknoten bezeichnet wird (McDonald et al., Cell 73 (1993), 421-424), eine Struktur, welche interessanterweise auch für die Neurotrophine charakteristisch ist. Das verbleibende Cystein bildet eine Disulfidbrücke mit einem anderen Monomeren aus, um die biologisch aktiven Hetero- und Homodimere zu bilden. Diese Struktur kann für die hohe Resistenz von GDNF gegen Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Hitze und extreme pH-Werte verantwortlich sein.
Ein in Bakterien hergestellter, rekombinanter GDNF fördert insbesondere das Überleben und die morphologische Differenzierung von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn in Neuronenkulturen (Lin et al., Science 260 (1993), 1130-1132). Diese anfänglichen in-vitro-Experimente sind nun auf in-vivo-Modelle ausgedehnt worden, welche zeigen, daß GDNF wirksame protektive und regenerative Wirkungen auf durch MPTP oder eine Axotomie induzierte Läsionen in dopaminergen Neuronen im Gehirn von erwachsenen Nagetieren besitzt (Tomac et al., Nature 373 (1995), 335-339; und Beck et al., Nature 373 (1995), 339-341). GDNF fördert in vitro das Überleben von sensorischen und parasympathischen Neuronen des unteren Vagusganglions und kann sympathische Neurone des Huhns vor dem durch einen NGF-Entzug verursachten Zelltod retten, aber dies erfordert viel höhere Dosen, als für seine Wirkungen auf dopaminerge Neurone notwendig sind (Ebendal et al., J. Neurosci. Res. 40 (1995), 276-284). Bezeichnenderweise wird GDNF durch motorische Neurone retrograd transportiert und fördert bekannterweise das Überleben von motorischen Neuronen insofern als Tiere, welche mit GDNF behandelt wurden, einen viel geringeren Verlust an motorischen Neuronen als Antwort auf Läsionen erleiden als unbehandelte Tiere oder solche, welche mit anderen trophischen Faktoren wie CNTF, BDNF, NT-3 oder NT-4/5 behandelt wurden (Henderson et al., Science 266 (1994), 1062-1064; Yan et al., Nature 373 (1995), 341-344; und Oppenheim et al., Nature 373 (1995), 344-346). Allgemein war GDNF ein wirksamerer Faktor zur Förderung des Überlebens von motorischen Neuronen als die anderen Faktoren, und er war der einzige Faktor, welcher eine neuronale Atrophie als Antwort auf diese Läsionen verhinderte, was ihn zu einem vielversprechenden therapeutischen Agens für Erkrankungen von motorischen Neuronen macht.
Die Degeneration und das Absterben von Neuronen treten während der Entwicklung, während des Alterns und als eine Folge von pathologischen Ereignissen während des ganzen Lebens auf. Es wird nun allgemein angenommen, daß neurotrophe Faktoren viele Aspekte der neuronalen Funktion, einschließlich das Überleben und die Entwicklung im Fötus und die strukturelle Integrität und die Plastizität im Erwachsenenalter, regulieren. Da sowohl akute Verletzungen des Nervensystems als auch chronische neurodegenerative Erkrankungen durch eine strukturelle Schädigung und möglicherweise durch eine krankheitsbedingte Apoptose gekennzeichnet sind, ist es wahrscheinlich, daß neurotrophe Faktoren eine gewisse Rolle bei diesen Beschwerden spielen. In der Tat legt eine große Fülle von Hinweisen nahe, daß neurotrophe Faktoren nützliche therapeutische Agenzien für die Behandlung dieser neurodegenerativen Zustände sein können, welche in sozialer und ökonomischer Hinsicht vielleicht die destruktivsten Krankheiten sind, welche unsere Gesellschaft nun befallen. Da verschiedene neurotrophe Faktoren bevorzugt über unterschiedliche Rezeptoren und auf verschiedene neuronale Zelltypen einwirken können, besteht dennoch weiterhin ein Bedarf an der Identifizierung von neuen Vertretern der Familien der neurotrophen Faktoren zur Verwendung bei der Diagnose und der Behandlung einer Vielzahl von akuten und chronischen Erkrankungen des Nervensystems.
Zusammenfassung der Erfindung:
Kurz zusammengefaßt betrifft die vorliegende Erfindung daher die Identifizierung und die Isolierung von im wesentlichen gereinigten Faktoren, welche das Überleben und das Wachstum von Neuronen fördern. In Einklang hiermit ist den hierin genannten Erfindern die Entdeckung eines neuen Proteinwachstumsfaktors gelungen, welcher hierin als Neurturin bezeichnet wird. Es wird angenommen, daß dieser Wachstumsfaktor eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 85% mit homologen Sequenzen aus verschiedenen Säugerspezies zeigt, obgleich die Sequenzhomologie so gering wie 65% in Nicht-Säugerspezies wie Vogelspezies sein kann.
Im Einklang mit der Erfindung wird folglich ein Wachstumsfaktor bereitgestellt, welcher eine Aminosäuresequenz aufweist, umfassend eine Sequenz, die eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 85% mit SEQ ID NO: 31 aufweist, wobei die Sequenzübereinstimmung über mindestens 30 zusammenhängende Aminosäuren von SEQ ID NO: 31 berechnet wird.
Die Erfindung stellt auch einen isolierten und gereinigten Wachstumsfaktor bereit, welcher ein Vertreter der Neurturin-Familie ist, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche eine Sequenzübereinstimmung von 50% bis 85% mit SEQ ID NO: 31, wobei die Sequenzübereinstimmung über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 31 berechnet wird, und eine Sequenzübereinstimmung von 30% bis 85% mit dem menschlichen GDNF aufweist.
Die hierin identifizierten Neurturin-Proteine schließen die menschliche Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 angegeben (5; 7, Aminosäurereste 96 bis 197), und die Maussequenz, wie in SEQ ID NO: 2 angegeben (5; 8, Aminosäurereste 96 bis 195), ein.
Die Erfindung stellt weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, bereit.
Die Erfindung stellt auch isolierte und gereinigte Antikörper bereit, welche spezifisch an einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor binden.
Neurturin ist identifiziert und aus einem konditionierten Medium von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters, DG44CHO-pHSP-NGFI-B-Zellen, nachstehend bezeichnet als CHO-Zellen, erhalten worden, und der Faktor, so wie er aus diesen Zellen isolierte wurde, weist ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20-30 kD, wie durch eine Natrium dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestimmt wurde, und einen EC₅₀-Wert von weniger als etwa 10 ng/ml in einem Überlebenstest mit oberen Zervikalganglien auf. Es wird angenommen, daß das aus Ovarzellen des Chinesischen Hamsters isolierte Protein ein homodimeres Protein ist, dessen Monomere ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 10-15 kD aufweisen.
Neurturin kann auch auf der Grundlage von Fragmenten identifiziert werden, welche nach einer partiellen Spaltung des aus einem konditionierten Medium von CHO-Zellen isolierten Faktors erhalten werden, wobei zu diesem Zeitpunkt einige der Aminosäurereste nicht mit Sicherheit bekannt waren. Solche Fragmente schließen ein N-terminales Fragment, Ser-Gly-Ala-Arg-Pro-Xaa-Gly-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Val-Ser-Val-Ser, worin Xaa eine unbekannte Aminosäure war (SEQ ID NO: 3), und interne Aminosäurefragmente, Xaa₁-Cys-Ala-Gly-Ala-Xaa₂-Glu-Ala-Ala-Val, worin Xaa₁ eine unbekannte Aminosäure war und Xaa₂ die Bedeutung Ser oder Cys hatte (SEQ ID NO: 4), Xaa₁-Xaa₂-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa₃-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val, worin Xaa₁ und Xaa₂ unbekannt waren und Xaa₃ die Bedeutung Gln oder Glu hatte (SEQ ID NO: 5), und Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO: 6), ein.
Eine Präpro-Form von Neurturin wird zur Bildung des reifen Proteins gespalten, und die menschliche Präpro-Form, enthaltend die Präpro-Region und die reife Neurturin-Sequenz für den Menschen, entspricht der in SEQ ID NO: 7 angegebenen (7, Aminosäurereste 1 bis 197). Die Maus-Präpro-Form ist wie in SEQ ID NO: 8 angegeben (8, Aminosäurereste 1 bis 195).
Demgemäß stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Protein bereit, umfassend ein Präpro-Neurturin, wie in SEQ ID NO: 7 angegeben, eine Prä-Region von Neurturin, wie in SEQ ID NO: 15 angegeben, eine Pro-Region von Neurturin, wie in SEQ ID NO: 19 angegeben, oder eine Sequenz, welche eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 85% mit irgendeiner Sequenz hiervon aufweist, wobei die Sequenzübereinstimmung über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 19 berechnet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Nucleotidsequenzen bereit, welche eine erfindungsgemäße Neurturin-Sequenz codieren, zum Beispiel das menschliche Neurturin, wie in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 angegeben, und das Maus-Neurturin, wie in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 angegeben. Die menschliche Sequenz ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 9 (7, Nucleinsäure 286 bis Nucleinsäure 591) codiert wird, und die Maus-Sequenz ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 10 (8, Nucleinsäure 286 bis Nucleinsäure 585) codiert wird. Ebenfalls bereitgestellt werden die Nucleotidsequenzen, welche das menschliche Präpro-Neurturin, wie in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 angegeben, und das Maus-Präpro-Neurturin, wie in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 8 angegeben, codieren. Die menschliche Präpro-Neurturin-Sequenz ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 11 (7, Nucleinsäure 1 bis Nucleinsäure 591) codiert wird, und die Maus-Präpro-Neurturin-Sequenz ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 12 (8, Nucleinsäure 1 bis Nucleinsäure 585) codiert wird.
Expressionsvektoren und stabil transformierte Zellen werden ebenfalls bereitgestellt. Die Erfindung stellt folglich einen Vektor bereit, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend regulatorische Elemente für die Expression, welche mit einer erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz funktionell verbunden sind. Die Erfindung stellt auch eine Wirtszelle bereit, welche mit einem solchen Vektor transformiert ist.
Die transformierten Zellen können in einem Verfahren zur Herstellung von Neurturin verwendet werden. Demgemäß stellt die Erfindung ein DNA-Rekombinationsverfahren bereit, umfassend:

(a) das Subclonieren einer DNA-Sequenz, welche einen Wachstumsfaktor oder ein Protein der Erfindung codiert, in einen Expressionsvektor, der regulatorische Elemente umfaßt, welche erforderlich sind, um die DNA-Sequenz zu exprimieren;
(b) das Transformieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor;
(c) das Züchten der Wirtszelle in einer Wirtszellenkultur; und
(d) das Ernten des Wachstumsfaktors und/oder der DNA-Sequenz aus der Wirtszellenkultur.

In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung einer neuronalen Degeneration oder Insuffizienz bereit. Die Erfindung stellt auch die Verwendung von Zellen, welche einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor exprimieren, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung einer Zelldegeneration oder -insuffizienz in einem Individuum, umfassend das Implantieren der Zellen in das Individuum, bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors oder einer DNA-Sequenz, welche den Wachstumsfaktor codiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorzellen in einem Patienten bereit.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Neurturin-Antisense-Polynucleotid bereit, umfassend eine Sequenz, welche komplementär ist zu einer erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz und welche in der Lage ist, mit einer natürlich vorkommenden DNA- oder mRNA-Polynucleotidsequenz, welche ein Neurturin codiert, zu hybridisieren, um die Transkription und/oder Translation eines codierten Neurturin-Polypeptids zu verhindern. Eine solches Antisense-Polynucleotid kann bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettleibigkeit oder zur Modulation einer Neoplasie verwendet werden.
Weitere Ausführungsformen stellen Hybrid- und pan-Wachstumsfaktoren bereit. Die hybriden Polypeptide bestehen aus einer ersten Sequenz, welche mit einem Teil von Neurturin im wesentlichen identisch ist, und einer zweiten Sequenz, welche mit einem Teil eines Vertreters der TGF-β-Superfamilie, der von Neurturin verschieden ist, im wesentlichen identisch ist. Die pan-Wachstumsfaktoren bestehen aus einer aktiven Domäne eines erfindungsgemäßen Neurturin-Polypeptids und mindestens eines Wachstumsfaktors, der von einem Neurturin-Polypeptid verschieden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis von Neurturin bereit. Ein Verfahren basiert auf Neurturin-Antikörpern, und andere Verfahren basieren auf dem Nachweis einer Neurturin-mRNA mittels DNA-Rekombinationsverfahren.
Demgemäß stellt die Erfindung bereit:

– ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe von einem Patienten, umfassend das Umsetzen der erfindungsgemäßen gereinigten Antikörper mit einem in der Probe vorhandenen Wachstumsfaktor und das Nachweisen der Bindung der Antikörper an den Wachstumsfaktor;
– ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe von einem Patienten, umfassend das Nachweisen und/oder Quantifizieren der Anwesenheit einer mRNA, welche ein erfindungsgemäßes Neurturin codiert;
– ein Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in dem Neurturin-Gen, umfassend das Nachweisen des Vorhandenseins eines intakten Neurturin-Gens der Erfindung in einer Zelle, wobei das Fehlen des intakten Gens auf das Vorhandensein von Genveränderungen hinweist; und
– ein Verfahren zur Förderung des Wachstums und/oder der Differenzierung einer Zelle in einem Kulturmedium, umfassend das Verabreichen eines erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors an die Zelle.

Von den mehreren Vorteilen, welche durch die vorliegende Erfindung erzielt werden, können daher die Bereitstellung eines neuen Wachstumsfaktors, Neurturin, der die Atrophie, die Degeneration oder das Absterben von bestimmten Zellen, insbesondere Neuronen, aufhalten und verhindern kann; die Bereitstellung von anderen Vertretern der Neurturin-GDNF-Familie von Wachstumsfaktoren durch das Verfügbarmachen von neuen Verfahren, wodurch die anderen Familienmitglieder erhältlich sind; die Bereitstellung von Verfahren zum Erhalt von Neurturin durch Rekombinationsverfahren und durch die Isolierung aus Zellen; die Bereitstellung von Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung von Erkrankungen, welche ein zelluläre Degeneration und insbesondere eine neuronale Degeneration hervorrufen; die Bereitstellung von Verfahren, welche die Neurturin-Spiegel in einem Patienten nachweisen und überwachen können; und die Bereitstellung von Verfahren, welche Veränderungen in dem Neurturin-Gen nachweisen können, angeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht das Reinigungsschema für die Präparation von Neurturin aus CHO-Zellen;
2 veranschaulicht die Charakterisierung von Fraktionen, welche bei der Reinigung von Neurturin aus einer MonoS-Säule eluiert wurden, wobei (a) die Elektrophorese jeder Fraktion auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel und das Sichtbarmachen der Proteine durch eine Silberfärbung zeigt, und (b) die neurotrophe Aktivität, welche in jeder Fraktion vorhanden ist, in dem Überlebenstest mit oberen Zervikalganglien zeigt;
3 veranschaulicht die Fähigkeit von Neurturin, das Überleben von Zellen des oberen Zervikalganglions in Kultur aufrechtzuerhalten, wobei in (a) positive Kontrollzellen, welche mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) aufrechterhalten wurden, in (b) negative Kontrollzellen, welche mit anti-NGF-Antikörpern behandelt wurden und ein ver mindertes Überleben zeigen, und in (c) mit anti-NGF und Neurturin (etwa 3 ng/ml) behandelte Zellen, welche ein Überleben der Neurone zeigen, dargestellt sind;
4 veranschaulicht die Konzentration-Antwort-Wirkung von Neurturin in dem Überlebenstest mit oberen Zervikalganglien;
5 veranschaulicht die Homologie der Aminosäuresequenzen für die reifen Wachstumsfaktoren menschliches Neurturin (hNTN), Maus-Neurturin (mNTN), Ratten-GDNF (rGDNF), Maus-GDNF (mGDNF) und menschliches GDNF (hGDNF), wobei identische Aminosäurereste in Kästchen eingeschlossen sind;
6 veranschaulicht die Gewebeverteilung der Neurturin-mRNA und der mRNA für GDNF mittels RT/PCR-Analyse mit RNA-Proben, die von Rattenembryonen am Tag 21 (E21) und von erwachsenen Ratten erhalten wurden;
7 veranschaulicht die cDNA und die dadurch codierte Aminosäuresequenz des menschlichen Präpro-Neurturins (SEQ ID NO: 11), welche die Prä-Region von Nucleinsäure 1 bis 57 (SEQ ID NO: 17), die Pro-Region von Nucleinsäure 58 bis 285 (SEQ ID NO: 20), das menschliche Neurturin von Nucleinsäure 286 bis 591 (SEQ ID NO: 9) und die Spleißstelle zwischen den Nucleinsäuren 169 und 170, welche den codierenden Sequenzteil von zwei Exons von den Nucleinsäuren 1 bis 169 (SEQ ID NO: 27) und 170 bis 594 (SEQ ID NO: 28) definiert, zeigt;
8 veranschaulicht die cDNA und die dadurch codierte Aminosäuresequenz des Maus-Präpro-Neurturins (SEQ ID NO: 12), welche die Prä-Region von Nucleinsäure 1 bis 57 (SEQ ID NO: 18), die Pro-Region von Nucleinsäure 58 bis 285 (SEQ ID NO: 21), das Maus-Neurturin von Nucleinsäure 286 bis 585 (SEQ ID NO: 10) und die Spleißstelle zwischen den Nucleinsäuren 169 und 170, welche den codierenden Sequenzteil von zwei Exons von den Nucleinsäuren 1 bis 169 (SEQ ID NO: 29) und 170 bis 588 (SEQ ID NO: 30) definiert, zeigt;
9 veranschaulicht die Maus-cDNA-Sequenz, enthaltend eine 5'-nichtcodierende Region (SEQ ID NO: 13) und eine 3'-nichtcodierende Region (SEQ ID NO: 14), welche jeweils auf die codierende Region von Präpro-Neurturin folgen;
10 veranschaulicht das prozentuale neuronale Überleben von Neuronen aus dem unteren Vagusganglion einer E18-Ratte, welche 24 Stunden nach dem Ausplattieren mit NTN, GDNF, BDNF, NGF und AMO behandelt wurden;
11 veranschaulicht das prozentuale neuronale Überleben von Ganglienzellen aus der hinteren Spinalnervenwurzel einer E15-Ratte, welche 24 Stunden nach dem Ausplattieren mit NGF, NTN und GDNF behandelt wurden;
12 veranschaulicht die Aktivierung von ERK-1- und ERK-2-Isoformen der MAP-Kinasen durch Neurturin oder GDNF in sympathischen Neuronen unter Verwendung von: (a) einem Antikörper, welcher für eine phosphorylierte MAP-Kinase spezifisch ist, oder (b) einem Antikörper, welcher sowohl eine phosphorylierte als auch eine nicht-phosphorylierte MAP-Kinase erkennt;
13 zeigt mikrophotographische Aufnahmen von menschlichen Lan-5-Neuroblastomzellen: (A) ohne Behandlung, und (B) behandelt mit 50 ng/ml Neurturin für 3 Tage;
14 veranschaulicht die Aktivierung der MAP-Kinase-Aktivität durch Neurturin und GDNF in den Neuroblastomzelllinien: (a) SK-NSH-Neuroblastom (naiv), (B) NGP-Neuroblastom (RA-tx) und (c) SY5Y-Neuroblastom (RX-tx);
15 veranschaulicht den retrograden Transport von Neurturin in Neuronen von Ganglien der hinteren Spinalnervenwurzel unter Verwendung eines ¹²⁵I-markierten Neurturins oder GDNF in Abwesenheit oder Anwesenheit eines 100-fachen Überschusses an unmarkiertem Neurturin oder unmarkiertem GDNF;
16 veranschaulicht die Sequenzen von Vertretern der TGF-β-Superfamilie, ausgerichtet nach der Clustal-Methode, von dem ersten kanonischen Gerüstregion-Cystein bis zum Ende der Sequenz für den transformierenden Wachstumsfaktor-β1 (TGFβ1), den transformierenden Wachstumsfaktor-β2 (TGFβ2), den transformierenden Wachstumsfaktor-β3 (TGFβ3), Inhibin-βA (INHβA), Inhibin-βB (INHβB), das nodal-Gen (NODAL), die knochenmorphogenen Proteine 2 und 4 (BMP2 und BMP4), das Drosophila decapentaplegic-Gen (dpp), die knochenmorphogenen Proteine 5-8 (BMP5, BMP6, BMP7 und BMP8), die Drosophila-60A-Genfamilie (60A), das knochenmorphogene Protein 3 (BMP3), das Vgl-Gen, die Wachstumsdifferenzierungsfaktoren 1 und 3 (GDF1 und DGF3), Dorsalin (drsln), Inhibin-α (INHα), das MIS-Gen (MIS), den Wachstumsfaktor-9 (GDF-9), den von Gliazellen abstammenden neurotrophen Wachstumsfaktor (GDNF) und Neurturin (NTN);
17 veranschaulicht die Sequenzen von Vertretern der TGF-β-Superfamilie, ausgerichtet nach der Clustal-Methode, von dem ersten kanonischen Gerüstregion-Cystein bis zu, aber nicht einschließlich, des vierten kanonischen Gerüstregion-Cysteins für den transformierenden Wachstumsfaktor-β1 (TGFβ1), den transformierenden Wachstumsfaktor-β2 (TGFβ2), den transformierenden Wachstumsfaktor-β3 (TGFβ3), Inhibin-βA (INHβA), Inhibin-βB (INHβB), das nodal-Gen (NODAL), die knochenmorphogenen Proteine 2 und 4 (BMP2 und BMP4), das Drosophila decapentaplegic-Gen (dpp), die knochenmorphogenen Proteine 5-8 (BMP5, BMP6, BMP7 und BMP8), die Drosophila-60A-Genfamilie (60A), das knochenmorphogene Protein 3 (BMP3), das Vgl-Gen, die Wachstumsdifferenzierungsfaktoren 1 und 3 (GDF1 und DGF3), Dorsalin (drsln), Inhibin-α (INHα), das MIS-Gen (MIS), den Wachstumsfaktor-9 (GDF-9), den von Gliazellen abstammenden neurotrophen Wachstumsfaktor (GDNF) und Neurturin (NTN); und
18 veranschaulicht die Sequenzen von Vertretern der TGF-β-Superfamilie, ausgerichtet nach der Clustal-Methode, von dem vierten kanonischen Gerüstregion-Cystein bis zum Ende der Sequenz für den transformierenden Wachstumsfaktor-β1 (TGFβ1), den transformierenden Wachstumsfaktor-β2 (TGFβ2), den transformierenden Wachstumsfaktor-β3 (TGFβ3), Inhibin-βA (INHβA), Inhibin-βB (INHβB), das nodal-Gen (NODAL), die knochenmorphogenen Proteine 2 und 4 (BMP2 und BMP4), das Drosophila decapentaplegic-Gen (dpp), die knochenmorphogenen Proteine 5-8 (BMP5, BMP6, BMP7 und BMP8), die Drosophila-60A-Genfamilie (60A), das knochenmorphogene Protein 3 (BMP3), das Vgl-Gen, die Wachstumsdifferenzierungsfaktoren 1 und 3 (GDF1 und DGF3), Dorsalin (drsln), Inhibin-α (INHα), das MIS-Gen (MIS), den Wachstumsfaktor-9 (GDF-9), den von Gliazellen abstammenden neurotrophen Wachstumsfaktor (GDNF) und Neurturin (NTN).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung eines neuen Wachstumsfaktors, Neurturin. Überraschenderweise ist entdeckt worden, daß diese Substanz in der Lage ist, das Zellüberleben und insbesondere das Überleben von Neuronen zu fördern. Vor dieser Erfindung war Neurturin unbekannt und war weder als eine einzelne biologisch aktive Substanz identifiziert, noch in reiner Form isoliert worden.
Den hierin genannten Erfinder gelang die Entdeckung und Isolierung von Neurturin aus einem konditionierten Medium von CHO-Zellen. Die erste das neuronale Überleben fördernde Aktivität wurde durch die Erfinder in einer teilweise gereinigten Zubereitung dieses CHO-konditionierten Mediums nachgewiesen. Die Herstellung eines konditionierten Mediums für eine bestimmte Zelllinie ist auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt (vgl. zum Beispiel Reid, in Methods in Enzymology, Bd. LVIII, Cell Culture, Jakoby und Pastan, Hrsg., Academic Press, San Diego, S. 161-164, 1979; Freshney, Culture of Animal Cells, in A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, Wiley-Liss, NY, S. 84, 1987). Folglich, obwohl in der vorliegenden Arbeit CHO-Zellen gezüchtet wurden und das konditionierte Medium für die Identifizierung und die Gewinnung von Neurturin in gereinigter Form verwendet wurde, ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, daß irgendeine Zelle, welche Neurturin exprimiert, als eine Quelle hierfür verwendet werden kann. Einige der Zellen, welche Neurturin exprimieren, werden nachstehend in Beispiel 11 identifiziert, und die hierin genannten Erfinder nehmen an, daß irgendeine der Zellen, für welche gezeigt wurde, daß sie Neurturin exprimieren, verwendet werden kann, um ein konditioniertes Medium zu erhalten, aus dem Neurturin isoliert werden kann.
Bei der Isolierung von Neurturin aus dem konditionerten Medium von CHO-Zellen kann ein erstes rohes konditioniertes Medium durch Zentrifugation und/oder Filtration, um Zelltrümmer zu entfernen, erhalten werden. Für den Fachmann ist ohne weiteres ersichtlich, daß für die weitere Reinigung irgendeines einer Reihe von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, angewendet werden kann, um Neurturin aus einer biologischen Probe zu isolieren und zu reinigen, wie eine Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, präparative Elektrophorese und dergleichen, wobei die Verfahren entweder einzeln oder in Kombination miteinander angewendet werden.
Die das Zellüberleben fördernde Wirkung von Neurturin kann in irgendeinem geeigneten System für die Beurteilung des Zellüberlebens beurteilt werden. Die hierin genannten Erfinder nehmen an, daß Neurturin, basierend auf dem Wissen über andere Wachstumsfaktoren und basierend auf der Beobachtung, daß Neurturin in einer Reihe von Geweben exprimiert wird, wobei angenommen wird, daß es darin eine das Zellüberleben fördernde Wirkung besitzt, das Überleben in einer Vielzahl von unterschiedlichen Geweben fördern kann. In der hierin vorgestellten Arbeit wurde die neuronale Aktivität unter Verwendung eines Überlebenstests mit sympathischen Neuronen (sympathischen Zervikalganglien, SCG), welche umfassend charakterisiert worden sind (Martin et al., J. Cell Biol. 106 (1989), 829-844; Deckwerth und Johnson, J. Cell Biol. 123 (1993), 1207-1222), beurteilt (vgl. 3). Die Erfinder zeigen die das Überleben fördernden Wirkungen von Neurturin auch für sensorische Neurone (vgl. 10).
Der SCG-Test beinhaltete kurz zusammengefaßt das Züchten von Zellen, welche aus dem oberen Zervikalganglion eines Rattenembryos erhalten wurden, während 5 Tagen bei 37°C in einem Medium, welches den Nervenwachstumsfaktor (NGF) enthält. Das Medium wurde anschließend durch ein Medium, welches keinen NGF, aber ein anti-NGF-Antiserum enthält, ausgetauscht. Der Entzug von NGF hat normalerweise das Absterben der Neurone innerhalb von 24-72 Stunden zur Folge. Das neuronale Überleben wurde an den Tagen 7-8 visuell unter einem Mikroskop beurteilt. Die Maximumkriterien für das neuronale Überleben beinhalteten das Fehlen einer Degeneration von sowohl den neuronalen Zellkörpern als auch den Neuriten. Eine Zellkörperdegeneration wurde angezeigt, wenn der neuronale Zellkörper verkleinert war, unregelmäßige Membranverdickungen zeigte, Vakuolen enthielt und seine Brechungskraft verloren hatte. Für einen Bereich von Neuriten wurden Anzeichen für einen Zerfall bestätigt, wenn Verdickungen und Bläschen entlang der Neuritenbündel auftraten. Das Überleben wurde durch den Vergleich mit Neuronen, welche in Anwesenheit von NGF (positive Kontrolle) oder in Abwesenheit von NGF mit NGF-Antiserum (negative Kontrolle) gezüchtet wurden, bestimmt.
Die Aktivität wurde durch Berechnung einer "Überlebenseinheit" quantifiziere. Die gesamten Überlebenseinheiten in einer Probe wurden als das minimale Volumen eines Aliquots der Probe, welches ein maximales Überleben hervorrief, dividiert durch das Gesamtvolumen dieser Probe, definiere. Zum Beispiel wurde ein Volumen von 600 ml aus der Heparin-Agarose-Säule eluiert, und von diesem Eluat entsprachen 12,5 μl dem minimalen Volumen, welches ein maximales Überleben förderte. Somit wurde für die Überlebenseinheiten in dem Eluat aus der Heparin-Agarose-Säule ein Wert von 48.000 erhalten. Die spezifische Aktivität wurde als die Überlebenseinheiten, dividiert durch die Proteingesamtmenge in mg, berechnet. Die tatsächliche Aktivität von Neurturin wird hierin in Konzentrationseinheiten von pg/ml oder pM, welche ein maximales oder halbmaximales Überleben fördern, angegeben. Wie in 5 gezeigt ist, gibt eine Konzentration-Antwort-Kurve für ein gereinigtes Neurturin-Protein an, daß die tatsächliche Aktivität von Neurturin, ausgedrückt als EC₅₀-Wert, etwa 1,5 ng/ml oder etwa 50 pM beträgt, und daß der EC₁₀₀-Wert etwa 3 ng/ml oder etwa 100 pM beträgt.
Die Überlebenseinheiten wurden in einem Test unter Verwendung von etwa 1200 Neuronen in einer 0,5 ml-Testkultur und einem Züchtungszeitraum von 48 Stunden nach Zugabe der Fraktion bestimmt. Das Überleben wurde nach dem Zeitraum von 48 Stunden visuell beurteilt. Die tatsächliche Aktivität, wie in 4 gezeigt, wurde in einem Test unter Verwendung von etwa 2700 Neuronen und einem Züchtungszeitraum von 72 Stunden bestimmt. Das Überleben wurde durch Fixieren der Neurone und Zählen der Anzahl der überlebenden Neuronen beurteilt. Da die Stabilität, wie durch die Halbwertszeit der Aktivität beurteilt wurde, für Neurturin abnimmt, wenn sich die Anzahl der Neurone erhöht, wäre zu erwarten, daß der Meßwert für die tatsächliche Aktivität niedriger als ist derjenige, welche für die Bestimmungen der spezifischen Aktivität vorhergesagt wurde. Es wäre auch zu erwarten, daß der Meßwert für die tatsächliche Aktivität niedriger ist als derjenige, welcher für die spezifische Aktivität vorhergesagt wurde, da das Überleben nach 72 Stunden anstatt 48 Stunden gemessen wurde.
Die Reinigung von Neurturin wird nachstehend in Beispiel 1 ausführlich beschrieben. Das als Ausgangsmaterial verwendete konditionierte Medium wurde von einem Abkömmling der DG44-Ovarzellen des Chinesischen Hamsters, DG44CHO-pHSP-NGFI-B (Day et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 15253-15260) erhalten. Die hierin genannten Erfinder haben auch Neurturin in einer teilweise gereinigten Form aus einem konditionierten Medium von anderen Abkömmlingen der DG44-Ovarzellen des Chinesischen Hamsters isoliert, und diese andere Zellen können in gleicher Weise wie die DG44CHO-pHSP-NGFI-B-Zellen verwendet werden, so wie auch die DG44-Ovarstammzellen des Chinesischen Hamsters, Ovarzellen von anderen Spezies und Zellen von anderen Geweben, wie solche, von denen bekannt ist, daß sie Neurturin exprimieren (vgl. Beispiel 10). Bei der Herstellung des konditionierten Mediums wurden die Zellen während 2 Tagen in ein serumfreies Medium eingebracht, nach diesem Zeitraum wurde das konditionierte Medium gesammelt und das Medium wurde ergänzt. Dieser Zyklus wurde wiederholt, bis 5 Ernten des konditionierten Mediums von jeder Charge der CHO-Zellen erhalten wurden. Die gesammelten Medien wurden zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen.
Der erste Schritt bei der Reinigung von Neurturin aus dem konditionierten Medium von CHO-Zellen beinhaltete das Aufgeben des konditionierten Mediums auf eine Heparin-Agarose-Säule und die Elution eines teilweise gereinigten Neurturins daraus. Dieser Schritt hatte eine 111-fache Erhöhung der spezifischen Aktivität und die Reinigung des Proteins zur Folge. Der für das Aufgeben des Mediums auf die Säule verwendete Puffer enthält 0,5 M NaCl. Bei dieser NaCl-Konzentration bindet das Neurturin an die Heparin-Agarose-Matrix. Die hierin genannten Erfinder nehmen an, daß LIF und CNTF basierend auf ihren isoelektrischen Punkten entweder nicht an die Heparin-Agarose-Matrix binden oder mit dem Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, aus der Matrix herausgewaschen werden. Somit wäre zu erwarten, daß durch diesen Schritt das Neurturin aus Wachstumsfaktoren wie LIF und CNTF isoliert wird. Nach dem Waschen der Säule wurde das Neurturin unter Verwendung von 1,0 M NaCl aus der Säule eluiert.
Zur weiteren Reinigung wurde das eluierte Material anschließend verdünnt und auf eine Säule, enthaltend ein SP-Sepharose^® High Performance-Ionenaustauschharz (Pharmacia, Piscataway, NJ), aufgegeben. Das aus dieser Säule eluierte Material wurde mittels einer schnellen Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) über eine chelatbildende Superose HR-10/2-Säule, geladen mit Cu⁺⁺ (Pharmacia, Piscataway, NJ), weiter gereinigt. Die eluierten Fraktionen aus der Cu⁺⁺-Superose-Säule wurden für eine weitere FPLC-Reinigung auf eine MonoS-HR-5/5-Kationenaustauschsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) aufgegeben. Die Zusammensetzung der Proteine in den MonoS-Fraktionen wurde mittels einer nichtreduzierenden SDS-PAGE und einer Silberfärbung analysiert.
Die bei jedem Schritt der Reinigung aus den Säulen gesammelten Fraktionen wurden mittels des neuronalen Überlebenstests auf eine biologische Aktivität und unter Anwendung der Farbstoffbindungsmethode nach Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), 248-254) mit einem Bio-Rad-Proteintest-Farbstoffreagens (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) auf den Proteingehalt untersucht. Die stufenweise Reinigung mittels der vorstehenden Schritte ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

a. Das Protein in mg wurde unter Anwendung der Farbstoffbindungsmethode nach Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), 248) bestimmt.
b. Die gesamten Aktivitätseinheiten oder Überlebenseinheiten in einer Probe wurden definiert als das minimale Volumen eines Aliquots der Probe, welches ein maximales Überleben hervorrief, dividiert durch das Gesamtvolumen der Probe.
c. Die Aktivität für das konditionierte Medium wurde abgeleitet aus der Annahme, daß 100% der Aktivität in der Heparin-Agarose-Fraktion gewonnen wurden, da die Aktivität des konditionierten Mediums für eine direkte Messung zu niedrig war.
d. Die spezifische Aktivität entsprach den Aktivitätseinheiten, dividiert durch die Gesamtmenge des Proteins in mg.

Die Ergebnisse dieser Analyse zusammen mit den Ergebnissen des neuronalen Überlebenstests der Fraktionen zeigten, daß ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 25 kD zusammen mit der Überlebensaktivität für die sympathischen Neurone aufgereinigt wurde.
Das gereinigte Material, welches aus dem konditionierten Medium von CHO-Zellen isoliert worden war, wurde verwendet, um partielle Aminosäuresequenzen des Proteins in dem konditionierten Medium von CHO-Zellen zu bestimmen, und wurde anschließend als Grundlage für die Bestimmung der Sequenzen in verschiedenen Spezies verwendet. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines automatischen Protein/Peptid-Sequenzanalysengeräts bestimmt, und für die ersten 16 Aminosäuren, wobei die Position 6 ungewiß war, wurde folgende Bedeutung angenommen: Ser-Gly-Ala- Arg-Pro-Xaa-Gly-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Val-Ser-Val-Ser, worin Xaa eine unbekannte Aminosäure war (SEQ ID NO: 3). Aus dem gereinigten Material wurden nach einem Verdau mit Proteaseenzmyen auch interne Aminosäurefragmente erhalten, und die Sequenzen wurden bestimmt. Die Sequenzen von drei internen Fragmenten, welche auf diese Weise erhalten wurden, waren wie folgt, wobei die Positionen 1, 2 und 6 ungewiß waren: (1) Xaa₁-Cys-Ala-Gly-Ala-Xaa₂-Glu-Ala-Ala-Val, worin Xaa₁ eine unbekannte Aminosäure war und Xaa₂ die Bedeutung Ser oder Cys hatte (SEQ ID NO: 4); (2) wobei die Positionen 1, 2, 4, 10, 17 und 22 ungewiß waren, Xaa₁-Xaa₂-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa₃-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val, worin Xaa₁ und Xaa₂ unbekannt waren und Xaa₃ Gln oder Glu bedeutete (SEQ ID NO: 5); und (3) Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO: 6). Basierend auf diesen partiellen Aminosäuresequenzen können DNA-Sonden und Primer hergestellt und zum Erhalt von cDNA-Clonen von verschiedenen Spezies basierend auf der hohen Sequenzkonservierung zwischen Säugerspezies verwendet werden. Die menschliche cDNA und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist in 7 dargestellt, und die Maus-cDNA und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist in 8 dargestellt.
Der cDNA-Clon von der Maus war 1,0 kb groß und wies ein offenes Leseraster von 585 Nucleotiden auf (SEQ ID NO: 12), welches das Maus-Präpro-Neurturin-Protein codiert (SEQ ID NO: 8, 8). Zusätzlich sind nichtcodierende Regionen an sowohl dem 5'- als auch dem 3'-Ende der codierenden Region identifiziert worden, wie in 9 gezeigt ist (SEQ ID NO: 13, 5'-nichtcodierende Region, Nucleinsäuren -348 bis -1; SEQ ID NO: 14, 3'-nichtcodierende Region, Nucleinsäuren 589 bis 675). Die Maus-Neurturin-Sequenz kann verwendet werden, um PCR-Primer zur Verwendung bei der Identifizierung von Homologen aus anderen Spezies zu erhalten. Ein menschliches Fragment von 192 Nucleotiden aus der menschlichen genomischen DNA wurde nach dieser Methode amplifiziert und weiterhin dazu verwendet, eine menschliche Genombank zu durchmustern, um Clone zu erhalten, welche den genomischen Locus des menschlichen Neurturin enthalten. Die menschliche cDNA-Sequenz wurde aus der Sequenzierung dieser Clone abgeleitet (7, cDNA-Sequenz des menschlichen Präpro-Neurturins).
Durch Bezugnahme auf Neurturin hierin sollen Wachstumsfaktoren beliebigen Ursprungs, die zu dem hierin charakterisierten und beschriebenen Neurturin im wesentlichen homolog und biologisch äquivalent sind, eingeschlossen sein. Solche im wesentlichen homologen Wachstumsfaktoren können natürlicherweise in irgendeinem Gewebe oder in irgendeiner Spezies vorkommen, und in ähnlicher Weise kann die biologische Aktivität in irgendeinem einer Reihe von biologischen Testsystemen charakterisiert werden. Durch Bezugnahme auf Präpro-Neurturin hierin sollen Wachstumsfaktoren eingeschlossen sein, welche eine Prä- oder Leader- oder Signalsequenz-Region, eine Pro-Sequenz-Region und Neurturin, wie hierin definiert, enthalten.
Der Begriff "biologisch äquivalent" soll bedeuten, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen fähig sind, einige oder alle derselben Wachstumseigenschaften in einer ähnlichen Weise, nicht notwendigerweise in dem gleichen Ausmaß wie das Neurturin, welches hierin aus dem konditionierten Medium von CHO-Zellen isoliert wurde, oder ein rekombinant erzeugtes menschliches oder Maus-Neurturin, zu zeigen.
Mit "im wesentlichen homolog" ist gemeint, daß der Homologiegrad zwischen dem menschlichen und dem Maus-Neurturin und einem Neurturin aus irgendeiner Spezies größer ist als zwischen Neurturin und irgendeinem der bereits beschriebenen Vertreter der TGF-β-Superfamilie oder GDNF (für eine Besprechung der Homologie von Vertretern der TGF-β-Superfamilie vgl. Kingsley, Genes and Dev. 8 (1994), 133-146, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen).
Sequenzübereinstimmung oder Übereinstimmung in Prozent soll auf den Prozentsatz der gleichen Reste zwischen zwei Sequenzen hinweisen, bezugnehmend auf menschliches Neurturin, wenn die Übereinstimmung in Prozent mit einem nichtmenschlichen Neurturin bestimmt wird; bezugnehmend auf Neurturin, wenn die Übereinstimmung in Prozent mit anderen Wachstumsfaktoren als Neurturin bestimmt wird; und bezugnehmend auf den menschlichen GDNF, wenn die Übereinstimmung in Prozent von anderen Wachstumsfaktoren als Neurturin mit GDNF bestimmt wird; wenn die zwei Sequenzen nach der Clustal-Methode (Higgins et al., Cabios 8 (1992), 189-191) der multiplen Sequenzausrichtung durch die Lasergene Biocomputing Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) ausgerichtet werden. Bei dieser Methode werden multiple Ausrichtungen in einer progressiven Weise durchgeführt, wobei immer größere Ausrichtungsgruppen unter Verwendung von Ähnlichkeitspunkten, welche aus einer Reihe von paarweisen Ausrichtungen berechnet wurden, zusammengestellt werden. Optimale Sequenzausrichtungen werden erhalten durch Ermittlung der maximalen Ausrichtungspunktzahl, welche dem Durchschnittswert aller Punktzahlen zwischen den einzelnen Resten in der Ausrichtung entspricht, der aus einer Restgewicht-Tabelle bestimmt wurde, welche die Wahrscheinlichkeit wiedergibt, mit der ein bestimmter Aminosäureaustausch in zwei verwandten Proteinen über ein bestimmtes evolutionäres Intervall auftritt. Punktabzüge für öffnende und verlängernde Lücken in der Ausrichtung tragen zu der Punktzahl bei. Die in diesem Programm verwendeten Standardparameter sind wie folgt: Punktabzug für eine Lücke für eine multiple Ausrichtung = 10; Punktabzug für die Lückenlänge für eine multiple Ausrichtung = 10; k-tuple-Wert bei einer paarweisen Ausrichtung = 1; Punktabzug für eine Lücke bei einer paarweisen Ausrichtung = 3; Fensterwert bei einer paarweisen Ausrichtung = 5; bei einer paarweisen Ausrichtung ausgesparte Diagonalen = 5. Die verwendete Restgewicht-Tabelle für das Ausrichtungsprogramm ist PAM250 (Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, Hrsg., NBRF, Washington, Bd. 5, Anhang 3, S. 345, 1978).
Die Konservierung in Prozent wird berechnet aus der obigen Ausrichtung durch das Addieren des Prozentsatzes der identischen Reste zu dem Prozentsatz der Positionen, an denen die zwei Reste eine konservative Substitution darstellen (definiert als ein log Odds-Wert von größer als oder gleich 0,3 in der PAM250-Restgewicht-Tabelle). Von einer Konservierung wird gesprochen, bezugnehmend auf menschliches Neurturin, wenn die Konservierung in Prozent mit einem nicht-menschlichen Neurturin bestimmt wird; bezugnehmend auf Neurturin, wenn die Konservierung in Prozent mit anderen Wachstumsfaktoren als Neurturin bestimmt wird; und bezugnehmend auf den menschlichen GDNF, wenn die Konservierung in Prozent mit anderen Wachstumsfaktoren als Neurturin mit GDNF bestimmt wird. Konservative Aminosäureaustäusche, welche diese Anforderung erfüllen, sind: R-K; E-D, Y-F, L-M; V-I, Q-H. Die Berechnungen der Identität (I) und der Konservierung (C) zwischen einem reifen menschlichen Neurturin und einem reifen Maus-Neurturin (hNTN bzw. mNTN) und zwischen jeder dieser Sequenzen und einem reifen Mensch-, Ratten- und Maus-GDNF (hGDNF, rGDNF bzw. mGDNF) sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Der Homologiegrad zwischen den reifen Maus- und Mensch-Neurturin-Proteinen beträgt etwa 90% Sequenzübereinstimmung, und es wird angenommen, daß alle Neurturin-Homologe von nicht-menschlichen Säugerspezies eine Ähnlichkeit von mindestens etwa 85% Sequenzübereinstimmung mit dem menschlichen Neurturin aufweisen. Für Nicht-Säugerspezies wie Vogelspezies wird angenommen, daß der Homologiegrad mit Neurturin mindestens einer Identität von etwa 65% entspricht. Zum Vergleich können die Variationen zwischen Familienmitgliedern der Neurturin-GDNF-Familie von Wachstumsfaktoren durch einen Vergleich von Neurturin und GDNF deutlich gemacht werden. Mensch- und Maus-Neurturin weisen etwa 40% Sequenzübereinstimmung und etwa 50% Sequenzkonservierung mit Mensch-, Maus- und Ratten-GDNF auf. Es wird angenommen, daß die anderen Familienmitglieder entsprechend eine Sequenzübereinstimmung von etwa 40% mit der Sequenz von Neurturin und etwa 40% mit der Sequenz von GDNF, sowie eine Identität innerhalb eines Bereiches von etwa 30% bis etwa 85% mit Neurturin, und eine Sequenzübereinstimmung innerhalb eines Bereiches von etwa 30% bis etwa 85% mit GDNF aufweisen. Folglich wäre zu erwarten, daß ein bestimmtes Nicht-Neurturin- und Nicht-GDNF-Familienmitglied von einer Spezies eine geringere Sequenzübereinstimmung mit Neurturin und mit GDNF aus der gleichen Spezies als die Sequenzübereinstimmung zwischen einem menschlichen Neurturin und einem Neurturin von einer nicht-menschlichen Säugerspezies aufweist, aber eine größere Sequenzübereinstimmung als diejenige zwischen einem menschlichem Neurturin und irgendeinem anderen bekannten Vertreter der TGF-β-Superfamilie, mit Ausnahme von GDNF (Kingsely, a.a.O.). Im Falle von Präpro-Neurturin können Homologe von Präpro-Neurturin in nicht-menschlichen Säugerspezies aufgrund des Neurturin-Anteils der Aminosäuresequenz, welcher eine Sequenz übereinstimmung von mindestens etwa 85% mit einem menschlichen Neurturin aufweist, identifiziert werden, und Homologe von Präpro-Neurturin in Nicht-Säugerspezies können aufgrund des Neurturin-Anteils der Aminosäuresequenz, welcher mindestens etwa 65% Übereinstimmung mit einem menschlichen Neurturin aufweist, identifiziere werden.
Neurturin kann auch hybride und modifizierte Formen von Neurturin, einschließlich Fusionsproteine und Neurturin-Fragmente, sowie hybride und modifizierte Formen, worin bestimmte Aminosäuren deletiert oder ersetzt worden sind, und Modifikationen, wie solche, worin eine oder mehrere Aminosäuren durch eine modifizierte Aminosäure oder eine ungewöhnliche Aminosäure ausgetauscht worden sind, und Modifikationen wie Glykosylierungen einschließen, solange die hybride oder modifizierte Form die biologische Aktivität von Neurturin beibehält. Mit Beibehaltung der biologischen Aktivität ist gemeint, daß das neuronale Überleben gefördert wird, obgleich nicht notwendigerweise in dem gleichen Ausmaß wie die Wirksamkeit des Neurturins, das aus einem konditionierten Medium von CHO-Zellen isoliert wurde, oder des rekombinant hergestellten Mensch- oder Maus-Neurturins.
In der Bedeutung des Ausdrucks "im wesentlichen homolog" ist auch irgendein Neurturin eingeschlossen, welches aufgrund einer Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen das hierin beschriebene Neurturin isoliert werden kann, oder dessen codierenden Nucleotidsequenzen, einschließlich genomische DNA, mRNA oder cDNA, durch Hybridisierung mit der komplementären Sequenz von genomischen oder subgenomischen Nucleotidsequenzen oder der cDNA für das Neurturin hierin oder Fragmenten hiervon isoliere werden kann. Dem Fachmann ist auch bekannt, daß degenerierte DNA-Sequenzen ein menschliches Neurturin codieren. können, und diese Sequenzen, sowie auch allelische Varianten von Neurturin, sollen ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
Im Falle von Präpro-Neurturin können alternativ gespleißte Proteinprodukte existieren, welche aus einem innerhalb der codierenden Sequenz der Pro-Region angeordneten Intron resultieren. Man nimmt an, daß das Intron in der genomischen Sequenz an einer Position vorliegt, welche derjenigen zwischen den Nucleinsäuren 169 und 170 der cDNA entspricht, welche wiederum einer Position innerhalb von Aminosäure 57 in sowohl der Maus- als auch der Mensch-Präpro-Neurturin-Sequenz entspricht (vgl. 7 und 8). Folglich könnte das alternative Spleißen an dieser Position eine Sequenz ergeben, die sich an der identifizierten Aminosäurestelle durch Addition und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren von derjenigen, welche hierin für das Mensch- und das Maus-Präpro-Neurturin identifiziert wurde (SEQ ID NO: 11 bzw. SEQ ID NO: 12), unterscheidet. In dem Begriff "Präpro-Neurturin", so wie hierin verwendet sollen beliebige bzw. alle alternativ gespleißten Präpro-Neurturin-Proteine eingeschlossen sein.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, nehmen die hierin genannten Erfinder an, daß die hierin identifizierten Mensch- und Maus-Proteine sowie Homologe aus anderen Geweben und Spezies in ihrer biologisch aktiven Form als Dimere in einer Art und Weise vorliegen können, welche mit den Erkenntnissen zu anderen Faktoren der TGF-β-Superfamilie vereinbar ist.
Zusätzlich zu Homodimeren können die monomeren Einheiten der Dimere von Neurturin zur Konstruktion von stabilen Wachstumsfaktor-Heterodimeren oder -Heteromultimeren, umfassend mindestens eine monomere Einheit, welche von Neurturin abgeleitet ist, verwendet werden. Dies kann durch das Dissoziieren eines Homodimeren von Neurturin in seine einzelnen monomeren Einheiten und das Reassoziieren in Gegenwart einer monomeren Einheit eines zweiten homodimeren Wachstumsfaktors erfolgen. Dieser zweite homodimere Wachstumsfaktor kann aus einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF oder einem Vertreter der NGF-Familie wie NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5 oder einem Vertreter der TGF-β-Superfamilie oder einem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor oder einem Vertreter der CNTF/LIF-Familie oder dergleichen, ausgewählt sein.
Es wird angenommen, daß Wachstumsfaktoren auf spezifische Rezeptoren einwirken. Zum Beispiel sind die Rezeptoren für TGF-β und Aktivine identifiziert worden welche eine Familie von Ser/Thr-Kinase-Transmembranproteinen bilden (Kingsley, Genes and Dev. 8 (1994), 133-146; Bexk et al., Nature 373 (1995), 339-341). In der NGF-Familie bindet NGF an den TrkA-Rezeptor in peripheren sensorischen und sympathischen Neuronen und in Neuronen im basalen Vorderhirn; BDNF und NT-4/5 binden an trkB-Rezeptoren; und NT-3 bindet vorwiegend an trkC-Rezeptoren, welche eine andere Verteilung innerhalb des ZNS aufweisen (Tuszynski et al., Ann. Neurol. 35 (1994), S9-S12). Die hierin genannten Erfinder nehmen an, daß GDNF, Neurturin und bisher noch unbekannte Vertreter dieser Familie von Wachstumsfaktoren über spezifische Rezeptoren wirksam sind, welche unterschiedliche Verteilungen aufweisen, so wie es für andere Wachstumsfaktor-Familien gezeigt worden ist. Folglich wäre zu erwarten, daß der Wachstumsfaktor, welcher durch die Bildung von Heterodimeren oder Heteromultimeren aus Neur turin und einem oder mehreren anderen Wachstumsfaktoren erhalten wird, in der Lage ist, an mindestens zwei verschiedene Rezeptortypen, welche vorzugsweise eine unterschiedliche Gewebeverteilung aufweisen, zu binden. Es wäre zu erwarten, daß die erhaltenen Heterodimere oder Heteromultimere ein erweitertes Spektrum an Zellen haben, auf welche sie einwirken können, oder eine größere Wirksamkeit vorsehen. Es ist ebenfalls möglich, daß das Heterodimer oder Heteromultimer synergistische Effekte vorsehen könnte, welche bei Homodimeren oder Homomultimeren nicht beobachtet werden. Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß die Kombination von Faktoren aus verschiedenen Klassen das Langzeitüberleben von Oligodendrocyten fördert, während einzelne Faktoren oder Kombinationen von Faktoren innerhalb derselben Klasse das Kurzzeitüberleben förderten (Barres et al., Development 118 (1993), 283-295).
Heterodimere können durch eine Reihe von Verfahren gebildet werden. Zum Beispiel können Homodimere gemischt und Bedingungen, unter denen eine Dissoziation/Entfaltung erfolgt, wie in Gegenwart eines Dissoziations/Entfaltungsmittels, unterworfen werden, gefolgt von dem Aussetzen von Bedingungen, welche eine Monomer-Reassoziation und die Bildung von Heterodimeren ermöglichen. Dissoziations/Entfaltungsmittel schließen irgendein Mittel ein, welches bekanntermaßen die Dissoziation von Proteinen begünstigt. Solche Mittel schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Guanidinhydrochlorid, Harnstoff, Kaliumthiocyanat, pH-senkende Mittel wie gepufferte HCl-Lösungen und polare wassermischbare organische Lösungsmittel wie Acetonitril oder Alkohole wie Propanol oder Isopropanol ein. Zusätzlich können für Homodimere, welche über Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden sind, wie im Falle von Vertretern der TGF-β-Familie, Reduktionsmittel wie Dithiotreit und β-Mercaptoethanol für die Dissoziation/Entfaltung und für die Reassoziation/Umfaltung verwendet werden.
Heterodimere können auch durch Transfektion einer Zelle mit zwei oder mehreren Faktoren, so daß die transformierte Zelle Heterodimere produziert, hergestellt werden, welches Verfahren bei Neurotrophin durchgeführt worden ist (Heymach und Schooter, J. Biol. Chem. 270 (1995), 12297-12304).
Ein anderes Verfahren zur Bildung von Heterodimeren ist durch das Kombinieren von Neurturin-Homodimeren und einem Homodimer von einem zweiten Wachstumsfaktor und das Inkubieren der Mischung bei 37°C.
Wenn Heterodimere aus Homodimeren hergestellt werden, können die Heterodimere anschließend von den Homodimeren mittels Verfahren, welche für Fachleute zugänglich sind, wie zum Beispiel durch Elution aus präparativen, nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen, getrennt werden. Alternativ können Heterodimere mittels Hochdruck-Kationenaustauschchromatographie, wie mit einer MonoS-Kationenaustauschsäule, oder durch aufeinanderfolgende Immunoaffinitätssäulen, gereinigt werden.
Auf dem Fachgebiet ist hinreichend bekannt, daß viele Proteine innerhalb einer Zelle mit einer Signalsequenz am N-Terminus der reifen Proteinsequenz synthetisiert werden, und das Protein, welches eine solcher Leadersequenz trägt, wird als ein Prä-Protein bezeichnet. Prä-Anteil des Proteins wird während der zellulären Prozessierung des Proteins abgespaltet. Zusätzlich zu einer Prä-Leadersequenz enthalten viele Proteine eine davon verschiedene Pro-Sequenz, welche eine Region auf einem Protein bezeichnet, die ein stabiler Vorläufer des reifen Proteins ist. Proteine, welche mit sowohl einer Prä- als auch einer Pro-Region synthetisiert werden, werden als Präpro-Poteine bezeichnet. Im Hinblick auf die Prozessierungsereignisse, welche bekanntermaßen bei anderen Vertretern der TGF-β-Familie auftreten, sowie auf die hierin bestimmten Sequenzen, nehmen die Erfinder an, daß die Form eines Neurturin-Proteins, so wie es innerhalb einer Zelle synthetisiert wird, das Präpro-Neurturin ist. Es wird angenommen, daß das Präpro-Neurturin eine N-terminale Signalsequenz von 19 Aminosäuren enthält (menschliche Prä-Signalsequenz, SEQ ID NO: 15, 7, Aminosäuren 1 bis 19, codiert durch SEQ ID NO: 17, 7, Nucleinsäuren 1 bis 57; Maus-Prä-Signalsequenz, SEQ ID NO: 16, 8, Aminosäuren 1 bis 19, codiere durch SEQ ID NO: 18, 8, Nucleinsäuren 1 bis 57). Es ist bekannt, daß die vollständige Länge einer Leadersequenz nicht notwendigerweise erforderlich ist, damit die Sequenz als eine Signalsequenz wirksam ist, und daher sind innerhalb der Definition der Prä-Region von Neurturin auch Fragmente hiervon, üblicherweise N-terminale Fragmente, welche die Eigenschaft beibehalten, als eine Signalsequenz wirksam zu sein, das heißt, um die cotranslationale Insertion in die Membranen einer oder mehrerer Zellorganellen, wie das endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, den Golgi-Apparat, die Plasmamembran und dergleichen, zu erleichtern, eingeschlossen.
Auf die Signalsequenz folgt eine Pro-Domäne, welche eine proteolytische RXXR-Prozessierungsstelle unmittelbar vor der N-terminalen Aminosäuresequenz für das reife Neurturin enthält (menschliche Pro-Region-Sequenz, SEQ ID NO: 19, 7, Aminosäuren 20 bis 95, codiert durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 20, 7, Nucleinsäuren 58 bis 285; Maus-Pro-Region-Sequenz, SEQ ID NO: 22, 8, Amino säuren 19 bis 95, codiert durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 21, 8, Nucleinsäuren 58 bis 285).
Die Prä- und Pro-Regionen umfassen zusammengenommen eine Präpro-Sequenz, welche als die menschliche Präpro-Sequenz (SEQ ID NO: 23, 7, Aminosäuren 1 bis 95, codiert durch SEQ ID NO: 25, Nucleinsäuren 1 bis 285) bzw. die Maus-Präpro-Sequenz (SEQ ID NO: 24, 8, Aminosäuren 1 bis 95, codiert durch SEQ ID NO: 26, Nucleinsäuren 1 bis 285) identifiziert wurde. Die Prä-Region-Sequenzen und die Pro-Region-Sequenzen sowie die Präpro-Region-Sequenzen können identifiziert und für nicht-menschliche Säugerspezies und für Nicht-Säugerspezies aufgrund der Sequenzen, welche in dem Präpro-Neurturin, wie hierin definiert, enthalten sind, erhalten werden.
Anhand der obigen Merkmale wird für das reife, sezernierte Neurturin-Molekül eine Größe von etwa 11,5 kD vorhergesagt, wobei wahrscheinlich ist, daß es analog zu anderen Vertretern der TGF-β-Familie ein über Disulfidbrücken verbundenes Homodimer von etwa 23 kD bildet. Das vorhergesagte Protein mit einer Größe von etwa 23 kD ist vereinbar mit dem 25 kD-Protein, welches aus konditionierten Medien von CHO-Zellen gereinigt wurde und welches ein Homodimer ist. Die hierin genannten Erfinder haben mit Hilfe einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen ein etwa 11,5 kD großes Protein in einem konditionierten Medium von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters, welche mit dem Neurturin-Expressionsvektor (pCMV-NTN-3-1) transfiziert wurden, entdeckt, und es wird angenommen, daß dieses Protein das Monomer ist.
Die Nucleotidsequenzen der Prä- und/oder Pro-Regionen können auch verwendet werden, um chimäre Gene mit den codierenden Sequenzen von anderen Wachstumsfaktoren oder Proteinen zu konstruieren, und in ähnlicher Weise können chimäre Gene aus der codierenden Sequenz von Neurturin, gekoppelt an Sequenzen, welche Prä- und/oder Pro-Regionen aus Genen für andere Wachstumsfaktoren oder Proteine codieren, konstruiert werden (Booth et al., Gene 146 (1994), 303-308; Ibanez, Gene 146 (1994), 303-308; Storici et al., FEBS Letters 337 (1994), 303-307; Sha et al., J. Cell Biol. 114 (1991), 827-839). Solche chimären Proteine können eine veränderte Produktion oder Expression der aktiven Proteinspezies zeigen.
Ein bevorzugtes Neurturin der vorliegenden Erfindung ist identifiziert und in einer gereinigten Form aus einem durch CHO-Zellen konditionierten Medium isoliert worden. Ebenfalls bevorzugt wird ein durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestelltes Neurturin. Mit "reiner Form" oder "gereinigter Form" oder "im wesentlichen gereinigter Form" ist gemeint, daß eine Neurturin-Zusammensetzung im wesentlichen frei an anderen Proteinen als Neurturin ist.
Ein rekombinantes menschliches Neurturin kann durch Expression der DNA-Sequenzen, welche das Neurturin codieren, in einer geeignet transformierten Wirtszelle hergestellt werden. Unter Anwendung der auf dem Fachgebiet hinreichend bekannten Verfahren kann die das Neurturin codierende DNA mit einem Expressionsvektor verknüpft, in eine Wirtszelle transformiert und etablierten Bedingungen, welche für die Expression von Neurturin durch die transformierte Zelle geeignet sind, unterworfen werden.
Jeder geeignete Expressionsvektor kann verwendet werden, um ein rekombinantes menschliches Neurturin herzustellen, wie zum Beispiel der Säugerexpressionsvektor pCB6 (Brewer, Meth. Cell Biol. 43 (1994), 233-245) oder die E. coli pET- Expressionsvektoren, insbesondere pET-30a (Studier et al., Methods Enzymol. 185 (1990), 60-89), welche beide hierin verwendet wurden. Andere geeignete Expressionsvektoren für eine Expression in Säuger- und Bakterienzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie auch Expressionsvektoren zur Verwendung in Hefe oder in Insektenzellen. Baculovirus-Expressionssysteme können ebenfalls verwendet werden.
Neurturin kann in Form der monomeren Einheiten exprimiert werden, wobei eine solche monomere Form aber auch durch eine Präparation unter reduzierenden Bedingungen erzeugt werden kann. In solchen Fällen kann die Umfaltung und Renaturierung unter Verwendung eines der vorstehend erwähnten Mittel, welches bekanntermaßen die Dissoziation/Assoziation von Proteinen begünstigt, ausgeführt werden. Zum Beispiel kann die monomere Form mit Dithiothreit inkubiert werden, gefolgt von einer Inkubation mit einem oxidierten Glutathiondinatriumsalz, und gefolgt von einer Inkubation mit einem Puffer, enthaltend ein Umfaltungsmittel wie Harnstoff.
Analog zu der N-terminalen Sequenz und den internen Fragmenten des aus einem konditionierten Medium von CHO-Zellen gereinigten Neurturins wurde die reife Maus-Sequenz abgeleitet, und aus dieser Sequenz wurde die reife menschliche Form unter Verwendung der Sequenz für das menschliche Gen vorhergesagt. Die Aminosäuresequenz der reifen menschlichen Form ist wie in 5 gezeigt (hNTN, SEQ ID NO: 1). Das aus einem konditionierten Medium von CHO-Zellen gereinigte Material wird als das reife Neurturin angesehen und kann als ein Dimer oder ein anderes Multimer vorliegen und kann glykosyliert oder auf andere Weise chemisch modifiziert sein. Wie vorstehend erwähnt, deuten die Maus- und die Mensch-Nucleinsäuresequenzen darauf hin, daß Neurturin zuerst als ein Präpro-Polypeptid translatiert wird und daß die proteolytische Prozessierung der Signalsequenz und des "Pro"-Anteils dieses Moleküls zum Erhalt der reifen Sequenz führt, welche hierin als "reifes Neurturin" bezeichnet wird, so wie es aus dem konditionierten Medium von CHO-Zellen erhalten und in menschlichen und in nichtmenschlichen Spezies in homologer Form vorliegt. Die vorliegende Erfindung schließt daher beliebige bzw. alle "reifen Neurturin"-Sequenzen von menschlichen und nichtmenschlichen Spezies sowie beliebige bzw. alle Präpro-Neurturin-Polypeptide, welche von dem Neurturin-Gen translatiert werden können, ein.
Es wird angenommen, daß die codierende Sequenz für das Präpro-Neurturin-Polypeptid bei dem ersten ATG-Codon, codierend ein Methionin, am 5'-Ende des Clons beginnt (Position 1 in 9), welches in demselben Leseraster vorliegt wie die Sequenz, welche die von dem gereinigten Neurturin abgeleiteten Aminosäuresequenzen codiere. Stromabwärts von dem ersten Codon befindet sich das längste offene Leseraster, welches die codierende Sequenz für die Prä- und die Pro-Regionen, gefolgt von der codierenden Sequenz für das reife Maus-Neurturin, enthält.
Durch die Sequenzanalyse von genomischen Clonen des Maus-Neurturins wurde ein 0,5 kb großes Intron identifiziere, welches zwischen Nucleotid 169 und 170 des Präpro-Neurturins aus den cDNA-Clonen vorliegt. Dieses Intron liegt in der codierenden Sequenz der Pro-Region des Präpro-Neurturin-Proteins. Daher wird angenommen, daß das Maus-Neurturin-Gen mindestens zwei Exons enthält, wobei eines hiervon die codierenden Sequenzen stromabwärts von der Spleißstelle enthält, und das andere die codierende Sequenz stromaufwärts enthält (8, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30). Es ist bekannt, daß das Gen für GDNF ein Intron enthält, welches an einer analogen Position vorliegt, und durch RT-PCR-Experimente ist eine alterativ gespleißte Form von GDNF nachgewiesen worden (Suter-Crazzolara und Unsicker, Neuroreport 5 (1994), 2486-2488, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen). Diese andere Form resultiere aus der Verwendung einer Spleißstelle in dem zweiten codierenden Exon, welches 78 bp 3' zu der ursprünglich beschriebenen Spleißstelle vorliegt. Die alternativ gespleißte Form codiere ein GDNF-Protein mit einer Deletion von 26 Aminosäuren relativ zu der ursprünglich beschriebenen Form. Die zwei Formen werden in unterschiedlichen Verhältnissen in verschiedenen Geweben exprimiert. Die Erfinder haben in RT-PCR- und RACE-Experimenten unter Verwendung von Maus-P1-Hirn- und -P1-Leber-cDNAs keine alternativ gespleißte Formen von Neurturin nachgewiesen. Jedoch besteht die Möglichkeit, daß andere Spleißstellen in dem Neurturin-Gen in verschiedenen Geweben verwendet werden können.
Die codierende Sequenz der menschlichen Neurturin-cDNA ist aus der Sequenz der genomischen Clone des menschlichen Neurturins abgeleitet worden. Die codierende Sequenz der menschlichen cDNA ist ähnlich wie die Sequenz der Maus-cDNA durch ein Intron zwischen den Nucleotiden 169 und 170 der codierenden Sequenz unterbrochen. Folglich wird angenommen, daß das menschliche Neurturin-Gen mindestens zwei Exons enthält, wobei eines hiervon die codierende Sequenz stromaufwärts von der Spleißstelle enthält, und das andere die codierende Sequenz stromabwärts enthält (7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28). Die Spleißstellen an den Intron-Exon-Verbindungsstellen der menschlichen Gene und der Maus-Gene sind konserviert worden.
Aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz des menschlichen Neurturins kann geschlossen werden, daß die bereits vorhergesagte N-terminale Sequenz zwischen den Positionen 286 und 339 vorliegt und daß die vorhergesagten internen Sequenzen zwischen den Positionen 385 und 417, den Positionen 474 und 533 und den Positionen 547 und 576 vorliegen. Das TGA-Stoppcodon an den Positionen 592-593 beendet das offene Leseraster.
Die vorhergesagte Länge für das gereinigte Präpro-Neurturin beträgt 197 Aminosäurereste für das menschliche Präpro-Neurturin (SEQ ID NO: 7) und 195 Aminosäurereste für das Maus-Präpro-Neurturin (SEQ ID NO: 8). Das vorhergesagte Molekulargewicht dieses Polypeptids beträgt 22,2 kD für die Maus und 22,4 kD für den Menschen. Die vorhergesagte Länge für das gereinigte Neurturin beträgt 100 Aminosäurereste, und das vorhergesagte Monomer-Molekulargewicht hiervon beträgt 11,5 kD. Es gibt keine N-gebundenen Glykosylierungsstellen, jedoch liegen mögliche O-gebundene Glykosylierungsstellen an den Aminosäureresten in den Positionen 18, 26, 80, 86 und 95 in dem menschlichen Neurturin vor. Die Glykosylierung an irgendeiner Stelle oder einer Kombination dieser Stellen würde das Molekulargewicht des Moleküls erhöhen.
Verschiedene mögliche Spaltstellen können in der Präpro-Neurturin-Sequenz vorliegen. Die Aminosäuresequenz des reifen Maus-Neurturins (5, SEQ ID NO: 2) wird aus der Ausrichtung mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Neurturins des Chinesischen Hamsters vorhergesagt. Eine aus vier Resten bestehende RRAR-Spaltstelle (Aminosäuren 92-95) ist unmittelbar vor der vorhergesagten N-terminalen Aminosäure des reifen Maus-Neurturins angeordnet. Diese RRAR-Sequenz stimmt mit der RXXR-Konsensussequenz überein, an welcher üblicherweise Vertreter der TGF-β- Superfamilie gespalten werden. Diese mutmaßliche RRAR-Spaltsequenz ist in dem menschlichen Neurturin konserviert. Jedoch wird für das reife menschliche Neurturin vorhergesagt, daß es eine aus zwei Aminosäuren bestehende N-terminale Extension relativ zu dem reifen Maus-Neurturin aufweist, wenn es an dieser Sequenz gespalten wird. Da Neurturin andere Sequenzen enthält, welche mit dem RXXR-Konsensus übereinstimmen (zum Beispiel die Sequenz RRRR bei den Aminosäuren 90-93), und die Spezifitäten der Proteasen, welche an dieser Spaltung beteiligt sind, nicht vollständig verstanden sind, besteht die Möglichkeit, daß das Neurturin in einigen Situationen an anderen Stellen als der vorstehenden RRAR-Sequenz gespalten wird, und das reife Neurturin-Protein eine unterschiedliche Anzahl an Aminosäuren, welche dem Cysteinrest an Position 101 in der Maus-Sequenz (Präpro-Protein) und an Position 103 in der menschlichen Sequenz vorhergehen, aufweisen kann. Solche anderen Spaltstellen könnten in verschiedenen Organismen und in verschiedenen Geweben desselben Organismus unterschiedlich genutzt werden. Die N-terminalen Aminosäuren, welche dem ersten der sieben konservierten Cysteine in den reifen Formen von Vertretern der TGF-β-Familie vorhergehen, variieren bezüglich sowohl der Länge als auch der Sequenz außerordentlich. Außerdem hat die Insertion einer aus zehn Aminosäuren bestehenden Sequenz zwei Reste stromaufwärts des ersten konservierten Cysteins keinen Einfluß auf die bekannten biologischen Aktivitäten des Familienmitglieds Dorsalin (Basler K., Edlund T., Jessell T.M. und Yamada T., Cell 73 (1993), 687-702). Somit ist wahrscheinlich, daß Neurturin-Proteine, welche unterschiedlich lange Sequenzen enthalten, die dem Cystein 101 in der Maus und dem Cystein 103 im Menschen vorhergehen, ihre biologische Aktivität beibehalten.
Die hierin genannten Erfinder nehmen an, daß die Sequenz eines Neurturins, welches eine biologische Aktivität zeigt, zumindest die Sequenz beginnend bei Cystein 103 und endend bei Cystein 196 für das menschliche Neurturin (7, SEQ ID NO: 31) und beginnend bei Cystein 101 und endend bei Cystein 194 für das Maus-Neurturin (7, SEQ ID NO: 32) enthält. Folglich sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung Aminosäuresequenzen, enthaltend SEQ ID NO: 31, und Aminosäuresequenzen, enthaltend SEQ ID NO: 32, sowie Nucleinsäuresequenzen, codierend diese Aminosäuresequenzen, eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung schließt Nucleinsäuresequenzen ein, einschließlich Sequenzen, welche ein Mensch- und ein Maus-Neurturin codieren (5). Im Schutzumfang dieser Erfindung ebenfalls eingeschlossen sind Sequenzen, welche im wesent lichen den Nucleinsäuresequenzen entsprechen, welche Neurturin codieren. Solche sich im wesentlichen entsprechenden Sequenzen können zum Beispiel durch Codons substituiert sein, welche in einer bestimmten Wirtszelle wie E. coli in Einklang mit hinreichend bekannten und herkömmlichen Verfahren leichter exprimiert werden. Solche modifizierten Nucleinsäuresequenzen wären im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen.
Spezifische Nucleinsäuresequenzen können durch Fachleute modifiziert werden, und folglich können alle Nucleinsäuresequenzen, welche die Aminosäuresequenzen von Präpro-Neurturin oder die Prä-Region oder die Pro-Region oder Neurturin codieren, in gleicher Weise modifiziert werden. Die vorliegende Erfindung schließt folglich auch Nucleinsäuresequenzen ein, welche mit allen derartigen Nucleinsäuresequenzen – oder Komplementärsträngen der Nucleinsäuresequenzen, falls geeignet, – hybridisieren und ein Polypeptid mit einer das Zellüberleben fördernden Aktivität codieren. Die vorliegende Erfindung schließt auch Nucleinsäuresequenzen ein, welche Polypeptide codieren, die eine das neuronale Überleben fördernde Aktivität besitzen und die durch Antikörper, welche an Neurturin binden, erkannt werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Vektoren, umfassend regulatorische Elemente für die Expression, welche mit irgendeiner der Nucleinsäuresequenzen, die im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen sind, funktionell verbunden sind. Diese Erfindung schließt auch Wirtszellen – jeglicher Art – ein, welche mit Vektoren, umfassend regulatorische Elemente für die Expression, welche mit irgendeiner der Nucleinsäuresequenzen, die im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen sind, funktionell verbunden sind, transformiert worden sind.
Hierin werden auch Verfahren zur Herstellung von Neurturin bereitgestellt. Die Herstellung kann durch Isolierung aus einem konditionierten Medium einer Vielzahl von Zelltypen, solange der Zelltyp Neurturin produziert, erfolgen. Ein zweites und bevorzugtes Verfahren beinhaltet die Anwendung von Rekombinationsverfahren durch das Isolieren einer Nucleinsäuresequenz, welche das Neurturin codiert, das Clonieren der Sequenz zusammen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen in geeignete Vektoren und Zelltypen und das Exprimieren der Sequenz zur Herstellung von Neurturin.
Eine Säuger-Genfamilie, bestehend aus vier neurotrophen Faktoren, ist identifiziert worden, welche den Nervenwachstumsfaktor (NGF), der vom Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDGF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) einschließt. Diese Faktoren weisen eine Nucleinsäurensequenzhomologie von etwa 60% auf (Tuszynski und Gage, Ann. Neurol. 35 (1994), S9-S12). Das Neurturin-Protein zeigt keine signifikante Homologie zu der NGF-Familie von neurotrophen Faktoren. Neurturin weist weniger als etwa 20% Homologie zu der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren auf. Jedoch zeigt Neurturin eine etwa 40%ige Sequenzübereinstimmung mit GDNF. Insbesondere sind die Positionen der sieben Cysteinreste, welche in sowohl Neurturin als auch GDNF vorhanden sind, genau konserviert. Die hierin genannten Erfinder nehmen an, daß andere nicht identifizierte Gene existieren können, welche Proteine codieren, die eine wesentliche Aminosäurensequenzhomologie zu Neurturin und GDNF zeigen und die als Wachstumsfaktoren wirksam sind, welche für dieselben oder andere Gewebe selektiv sind und dieselben oder unterschiedliche biologische Aktivitäten besitzen. Ein unterschiedliches Aktivitätsspektrum im Hinblick auf betroffene Gewebe und/oder die hervorgerufene Antwort könnte aus einer bevorzugten Aktivierung von verschiedenen Rezeptoren durch verschiedene Familienmitglieder resultieren, was bekanntermaßen auf Vertreter der NGF-Familie von neurotrophen Faktoren zutrifft (Tuszynski und Gage, 1994, a.a.O.).
Als Folge davon, zeigen die Vertreter einer bestimmten Genfamilie eine wesentliche Konservierung der Aminosäuresequenz unter den Proteinprodukten der Familienmitglieder, wobei eine sehr starke Konservierung der Sequenzen auf der DNA-Ebene zu beobachten ist. Dies bildet die Grundlage für einen neuen Ansatz zur Identifizierung von anderen Vertretern der Genfamilie, welcher GDNF und Neurturin angehören. Das für eine solche Identifizierung angewendete Verfahren ist die Kreuzhybridisierung unter Verwendung von Nucleinsäuresonden, welche von einem Familienmitglied abgeleitet werden, um ein stabiles hybrides Duplexmolekül mit einer Nucleinsäuresquenz von anderen Vertretern der Genfamilie zu bilden oder um Nucleinsäuresquenzen von anderen Familienmitgliedern zu amplifizieren (vgl. zum Beispiel Kaisho et al., FEBS Letters 266 (1990), 187-191). Die Sequenz des anderen Familienmitglieds muß nicht mit der Sonde identisch sein, aber ist dennoch mit der Sondensequenz hinreichend verwandt, um mit der Sonde zu hybridisieren. Alternativ kann eine PCR unter Verwendung von Primern eines Familienmitglieds verwendet werden, um weitere Familienmitglieder zu identifizieren.
Die vorstehenden Ansätze sind bisher bei der Identifizierung von anderen Vertretern der Genfamilie nicht erfolgreich gewesen, da nur ein Familienmitglied, GDNF, bekannt war. Mit der Identifizierung von Neurturin hierin können jedoch einzigartige neue Sonden und Primer hergestellt werden, welche Sequenzen aus den konservierten Regionen dieser Genfamilie enthalten. Insbesondere sind hierin drei konservierte Regionen identifi ziert worden, welche als Grundlage für die Konstruktion von neuen Sonden und Primern verwendet werden können. Die neuen Sonden und Primer, welche durch die vorliegende Arbeit zugänglich gemacht werden, ermöglichen diesen überzeugenden neuen Ansatz, durch welchen nun andere Vertreter der Genfamilie erfolgreich identifiziert werden können. Dieser neue Ansatz ermöglicht eine Durchmusterung auf Gene, welche mit GDNF und Neurturin bezüglich einer Sequenzhomologie verwandt sind, indem DNA- oder RNA-Sonden basierend auf den konservierten Regionen in den GDNF- und Neurturin-Molekülen hergestellt werden. Daher umfaßt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Sonden und Primer, welche für eine Nucleotidsequenz, die solche konservierten Regionen codiert, einmalig sind oder davon abgeleitet sind, sowie ein Verfahren zur Identifizierung von weiteren Vertretern der GDNF-Neurturin-Genfamilie. Konservierte Regionen in den Aminosäuresequenzen schließen ein: Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa₁ Ser oder Thr ist und Xaa₂ Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 33); Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₄-Gly-Xaa₅-Cys-Xaa₆-Xaa₇-Ala, worin Xaa₁ Thr oder Glu ist, Xaa₂ Val oder Leu ist, Xaa₃ Leu oder Ile ist, Xaa₄ Ala oder Ser ist, Xaa₅ Ala oder Ser ist, Xaa₆ Glu oder Asp ist und Xaa₇ Ala oder Ser ist (SEQ ID NO: 34); und Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa₁-Ala-Xaa₂-Xaa₃-Asp-Xaa₄-Xaa₅-Ser-Phe-Leu-Asp, worin Xaa₁ Thr oder Val oder Ile ist, Xaa₂ Tyr oder Phe ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist, Xaa₄ Glu oder Asp ist und Xaa₅ Val oder Leu ist (SEQ ID NO: 35). Nucleotidsequenzen, welche eine codierende Sequenz für die vorstehenden konservierten Sequenzen enthalten, oder Fragmente der obigen konservierten Sequenzen können als Sonden verwendet werden. Beispielhafte Sonden- und Primersequenzen schließen die Aminosäuresequenzen codierenden Nucleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41, und insbesondere die Nucleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 und SEQ ID NO: 48 ein.
Eine Hybridisierung unter Verwendung der neuen Sonden aus den konservierten Regionen der Nucleinsäuresequenzen würde unter Bedingungen einer verringerten Stringenz durchgeführt werden. Die Faktoren, welche an der Festlegung der Stringenzbedingungen beteiligt sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, 1989, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen). Die Quellen der Nucleinsäure für eine Durchmusterung würden genomische DNA-Banken von Säugerspezies oder cDNA-Banken, welche unter Verwendung von RNA, die aus Säuger zellen erhalten und in einen geeigneten Vektor cloniert wird, konstruiert werden, einschließen.
Die PCR-Primer würden unter PCR-Bedingungen einer verringerten Anlagerungstemperatur verwendet, was die Amplifikation von Sequenzen anderer Vertreter der Genfamilie als GDNF und Neurturin ermöglichen würde. Die Quellen der Nucleinsäure für eine Durchmusterung würden genomische DNA-Banken von Säugerspezies, cloniert in einen geeigneten Vektor; cDNA, transkribiert von RNA, welche aus Säugerzellen erhalten wird; und genomische DNA von Säugerspezies einschließen.
Die basierend auf einer Hybridisierung oder durch PCR-Assays identifizierten DNA-Sequenzen würden sequenziert und mit GDNF und Neurturin verglichen werden. Die DNA-Sequenzen, welche die gesamte Sequenz des neuen Faktors codieren, würden dann in gleicher Weise, wie hierin beschrieben, erhalten werden. Genomische DNA oder Banken von genomischen Clonen können ebenfalls als Matrizen verwendet werden, da die Intron/Exon-Strukturen von GDNF und Neurturin konserviert sind und die codierenden Sequenzen für die reifen Proteine nicht durch Introns unterbrochen sind.
Obwohl Neurturin basierend auf seiner Fähigkeit, das Überleben eines bestimmten Neuronentyps zu fördern, aufgereinigt worden ist, ist dieser Faktor auch bei anderen neuronalen Zelltypen wirksam. Zum Beispiel wird hierin gezeigt, daß Neurturin das Überleben von sensorischen Neuronen des unteren Vagusganglions fördert (vgl. Beispiel 3). Neurturin fördert auch wahrscheinlich das Überleben von nicht-neuronalen Zellen. Tatsächlich ist für alle der bis heute isolierten Wachstumsfaktoren gezeigt worden, daß sie auf viele verschiedene Zelltypen einwirken (vgl. zum Beispiel Scully und Otten, Cell Biol. Int. 19, 459-469, 1995; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25 (1994), 1418-1435). Es ist bekannt, daß NGF auf sympathische Neurone, mehrere Typen von sensorischen Neuronen und bestimmte Populationen von ZNS-Neuronen einwirkt. Für den GDNF, welcher mit Neurturin näher verwandt ist, ist gezeigt worden, daß er auf dopaminerge, sympathische, motorische und mehrere sensorische Neurone einwirkt (Henderson et al., 1994, a.a.O.; Miles et al., J. Cell Biol. 130 (1995), 137-148; Yan et al., Nature 373 (1995), 341-344; Lin et al., Science 260 (1993), 1130-1132; Trupp et al., J. Cell Biol. 130 (1995), 137-148; Martin et al., Brain Res. 683 (1995), 172-178; Bowenkamp et al., J. Comp. Neurol. 355 (1995), 479-489). Somit ist es wahrscheinlich, daß Neurturin zusätzlich zu peripheren sympathischen und sensorischen Neuronen auch auf eine große Vielzahl von zentralen und peripheren neuronalen Zelltypen einwirken kann.
Es ist auch wahrscheinlich, daß Neurturin auf nicht-neuronale Zellen einwirkt, um deren Überleben, Wachstum oder Funktion zu fördern. Diese Erwartung beruht auf der Aktivität von bekannten Wachstumsfaktoren. Obgleich NGF der Prototyp eines neurotrophen Faktors ist, wirkt dieser Wachstumsfaktor auch auf Mastzellen ein, um die Anzahl an Mastzellen zu erhöhen, wenn es neugeboren Ratten injiziert wird (Aloe, J. Neuroimmunol. 18 (1988), 1-12). Außerdem exprimieren Mastzellen den trk-Rezeptor und antworten auf NGF, so daß NGF ein Mastzellen-Sekretagogum und ein das Überleben fördernder Faktor ist (Horigome et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 2695-2707). Ferner wirken Vertreter der TGF-β-Superfamilie auf viele Zelltypen unterschiedlicher Funktion und unterschiedlicher embryologischer Herkunft ein.
Die hierin genannten Erfinder haben mehrere nicht-neuronale Gewebe identifiziert, in denen Neurturin exprimiert wird, einschließlich Blut, Knochenmark, die neonatale Leber und Mastzellen. Dies deutet auf eine Rolle von Neurturin bei der Hämotopoese, einer Entzündung und einer Allergie hin.
Es wird angenommen, daß neurotrophe Faktoren der NGF-Familie durch faktorspezifische Rezeptoren mit hoher Affinität wirksam sind (Tuszynski und Gage, 1994, a.a.O.). Nur bestimmte Teile des Proteins, welche auf die Rezeptorstelle einwirken, sind für die Bindung an den Rezeptor erforderlich. Diese bestimmten Teile oder diskreten Fragmente können als Agonisten fungieren, wenn die Substanzen den Rezeptor aktivieren, um die fördernde Wirkung auf das Zellüberleben und das Wachstum hervorzurufen, und als Antagonisten gegen Neurturin wirksam sein, wenn sie an den Rezeptor binden, aber ihn nicht aktivieren, oder das Überleben und das Wachstum fördern. Solche Teile oder Fragmente, welche als Agonisten fungieren, und solche, welche als Antagonisten dienen, sind ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Synthetische pan-Wachstumsfaktoren können ebenfalls konstruiert werden, indem die aktiven Domänen von Neurturin mit den aktiven Domänen von einem oder mehreren anderen Wachstumsfaktoren kombiniert werden (vgl. zum Beispiel Ilag et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995), 607-611). Es wäre zu erwarten, daß diese pan-Wachstumsfaktoren die kombinierten Aktivitäten von Neurturin und dem einen oder den mehreren anderen Wachstumsfaktoren besitzen. Daher wird angenommen, daß sie wirksame und multispezifische Wachstumsfaktoren sind, die bei der Behandlung eines breiten Spektrums von degenerativen Erkrankungen und Zuständen, einschließlich Zuständen, die durch irgendwelche bzw. alle der Stammfaktoren, aus welchen die aktiven Domänen abgeleitet wurden, behandelt werden können, nützlich sind. Solche pan-Wachstumsfaktoren könnten auch synergistische Effekte vorsehen, welche über die Aktivitäten der Stammfaktoren hinausgehen (Barres et al., a.a.O.).
Pan-Wachstumsfaktoren innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung können auch chimäre oder hybride Polypeptide einschließen, welche aus Teilen von Fragmenten von mindestens zwei Wachstumsfaktoren konstruiert werden. Wachstumsfaktoren der TGF-β-Superfamilie sind strukturell verwandt und besitzen stark konservierte Sequenzmerkmale, wodurch Familienmitglieder identifiziert werden. Insbesondere sind sieben kanonische Gerüstbereich-Cysteinreste bei den Vertretern der Superfamilie nahezu invariant (Kingsley, Genes & Dev. 8 (1994), 133-146) (vgl. 17). Chimäre Polypeptidmoleküle können daher aus einer Sequenz, welche mit einem Teil des Neurturin-Moleküls bis zu einem Überkreuzungspunkt im wesentlichen identisch ist, und einer Sequenz, welche mit einem Teil eines anderen Vertreters der TGF-β-Superfamilie, welcher sich über die andere Seite des entsprechenden Überkreuzungspunkts in dem anderen Vertreter der TGF-β-Superfamilie erstreckt, im wesentlichen identisch ist, konstruiert werden.
Solche Teile von Neurturin umfassen vorzugsweise etwa 10 bis etwa 90, mehr bevorzugt etwa 20 bis etwa 80 und am meisten bevorzugt etwa 30 bis etwa 70 zusammenhängende Aminosäuren, und die Teile eines anderen Vertreters der TGF-β-Superfamilie, welcher nicht Neurturin ist, umfassen vorzugsweise etwa 10 bis etwa 90, mehr bevorzugt etwa 20 bis etwa 80 und am meisten bevorzugt etwa 30 bis etwa 70 zusammenhängende Aminosäuren. Zum Beispiel könnte ein bestimmter Überkreuzungspunkt zwischen dem dritten und dem vierten kanonischen Gerüstregion-Cysteinrest liegen. Ein solches beispielhaftes Konstrukt würde am 5'-Ende eine Sequenz enthalten, die aus der menschlichen Neurturin-Sequenz von Rest 1 bis zu dem dritten kanonischen Gerüstregion-Cysteinrest 39 und bis zu dem Rest 68 besteht, aber nicht den vierten kanonischen Gerüstregion-Cysteinrest 69 einschließt. Das 3'-Ende des hybriden Konstrukts würde aus einer Sequenz bestehen, welche von einem anderen Vertreter der TGF-β-Superfamilie abgeleitet ist, wie zum Beispiel von GDNF, der ein anderer Vertreter der TGF-β-Superfamilie ist, welcher mit Neurturin eng verwandt ist. Unter Verwendung von GDNF als den anderen Vertreter der TGF-β-Familie würde das hybride Konstrukt ausgehend von dem Überkreuzungspunkt aus einer Sequenz beginnend an dem vierten kanonischen Gerüstregion-Cysteinrest 101 des menschlichen GDNF und weiterhin bis zu Rest 134 am 3'-Ende des menschlichen GDNF bestehen. Ein zweites beispielhaftes hybrides Konstrukt würde aus den Resten 1 bis 100 des menschlichen GDNF beginnend am 5'-Ende des Konstrukts, aufeinanderfolgend verknüpft mit den Resten 69 bis 102 des menschlichen Neurturins, bestehen. Die vorstehenden Konstrukte mit Neurturin und GDNF sind nur als Beispiele gedacht, wobei der besondere Vertreter der TGF-β-Familie ausgewählt ist aus den Familienmitgliedern einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, dem transformierenden Wachstumsfaktor-β1 (TGFβl), dem transformierenden Wachstumsfaktor-β2 (TGFβ2), dem transformierenden Wachstumsfaktor-β3 (TGFβ3), Inhibin-βA (INHβA), Inhibin-βB (INHβB), dem nodal-Gen (NODAL), den knochenmorphogenen Proteinen 2 und 4 (BMP2 und BMP4), dem Drosophila decapentaplegic-Gen (dpp), den knochenmorphogenen Proteine 5-8 (BMP5, BMP6, BMP7 und BMP8), der Drosophila-60A-Genfamilie (60A), dem knochenmorphogenen Protein 3 (BMP3), dem Vgl-Gen, den Wachstumsdifferenzierungsfaktoren 1 und 3 (GDF1 und DGF3), Dorsalin (drsln), Inhibin-α (INHα), dem MIS-Gen (MIS), dem Wachstumsfaktor-9 (GDF-9), dem von Gliazellen abstammenden neurotrophen Wachstumsfaktor (GDNF) und Neurturin (NTN) (vgl. 18). Zusätzlich kann der Überkreuzungspunkt irgendein Rest zwischen dem ersten und dem siebten kanonischen Gerüstregion-Cysteinmolekül von Neurturin und dem bestimmten anderen Familienmitglied sein.
Bei der Konstruktion eines bestimmten chimären Moleküls werden die Teile von Neurturin und die Teile des anderen Wachstumsfaktors, welcher nicht Neurturin ist, mittels PCR amplifiziert, gemischt und als Matrize für eine PCR-Reaktion unter Verwendung des Vorwärtsprimers von einem Teil und des Rückwärtsprimers von dem anderen Teil der zwei Komponententeile des chimären Moleküls verwendet. So werden zum Beispiel die Vorwärts- und Rückwärtsprimer derart gewählt, daß der Teil von Neurturin vom Beginn des gewählten Überkreuzungspunkts zwischen dem dritten und dem vierten kanonischen Cysteinrest unter Verwendung eines Neurturin-Plasmids als Matrize amplifiziert wird. Anschließend werden ein Vorwärtsprimer mit einem kurzen überlappenden Teil der Neurturin-Sequenz und ein Rückwärtsprimer verwendet, um den Teil des anderen Vertreters der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren, welcher nicht Neurturin ist, von dem entsprechenden Überkreuzungspunkt bis zum 3'-Ende unter Verwendung einer Plasmid-Matrize, enthaltend die codierende Sequenz für den Vertreter der TGF-β-Familie, welcher nicht Neurturin ist, zu amplifizieren. Die Produkte aus den zwei PCR-Reaktionen werden auf einem Gel gereinigt und zusammengemischt, und anschließend wird eine PCR- Reaktion durchgeführt. Unter Verwendung eines Aliquots dieser Reaktion als Matrize wird eine PCR-Reaktion unter Verwendung des Neurturin-Vorwärtsprimers und des Rückwärtsprimers für den Wachstumsfaktor, welcher nicht Neurturin ist, durchgeführt. Das Produkt wird dann zur Herstellung des chimären Moleküls in einen Expressionsvektor cloniert.
Es wäre zu erwarten, daß chimäre Wachstumsfaktoren in der Förderung des Wachstums und der Entwicklung von Zellen wirksam sind und zur Verwendung bei der Verhinderung einer Atrophie, Degeneration oder des Absterbens von Zellen, insbesondere bei Neuronen, geeignet sind. Die chimären Polypeptide können auch als Rezeptor-Antagonisten von einem oder beiden der Wachstumsfaktoren vollständiger Länge, aus denen das chimäre Polypeptid konstruiert wurde, oder als ein Antagonist von irgendeinem anderen Wachstumsfaktor, welcher auf denselben Rezeptor oder dieselben Rezeptoren einwirkt, wirksam sein. Solche Polypeptide können auch als Nahrungs/Futtermittel, verbrennbare Energiequellen und die Viskosität erhöhende Lösungsprodukte verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend Neurturin in einer wirksamen Menge, zur Behandlung von Patienten mit einer Zelldegeneration und ein Verfahren, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von Neurturin, ein. Diese Zusammensetzungen und Verfahren sind zur Behandlung einer Reihe von degenerativen Erkrankungen nützlich. Wenn die zelluläre Degeneration eine neuronale Degeneration beinhaltet, schließen die Erkrankungen, aber sind nicht begrenzt auf, periphere Neuropathie, amyotrophe laterale Sklerose, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, ischämischer Infarkt, akute Hirnverletzung, akute Rückenmarksverletzung, Tumore des Nervensystems, Multiple Sklerose, peripheres) Nerventrauma oder -verletzung, Exposition gegen Neurotoxine, Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes oder Nierenfehlfunktionen und eine durch infektöse Agenzien verursachte Schädigung ein. Wenn die zelluläre Degeneration eine Degeneration der Knochenmarkszellen beinhaltet, schließen die Erkrankungen, aber sind nicht begrenzt auf, Störungen durch insuffiziente Blutzellen wie zum Beispiel Leukopenien wie Eosinopenie und/oder Basopenie, Lymphopenie, Monocytopenie, Neutropenie, Anämien, Thrombocytopenie sowie eine Insuffizienz von Stammzellen für irgendwelche der vorstehenden Zellen ein. Die vorstehenden Zellen und Gewebe können auch wegen einer geschwächten Funktion behandelt werden.
Die Zusammensetzungen und Verfahren hierin können auch nützlich sein, um eine Degeneration zu verhindern und/oder um auch das Überleben in anderen nicht-neuro nalen Geweben zu fördern. Der Fachmann kann mit Hilfe einer Vielzahl von Tests, welche auf dem Fachgebiet für einen Nachweis bekannt sind, ohne weiteres feststellen, ob Neurturin bei der Förderung des Überlebens nützlich sein würde oder in einem bestimmten Zelltyp wirksam ist.
Unter bestimmten Umständen kann es wünschenswert sein, die Menge des exprimierten Neurturins zu modulieren oder zu verringern. Zum Beispiel haben die hierin genannten Erfinder festgestellt, daß eine Überexpression von Neurturin in transgenen Mäusen eine Fettleibigkeit zur Folge hat, wobei sich subkutan und in der Leber große Mengen an Fett anreichern. Es wird angenommen, daß eine solche Überproduktion von Neurturin in Menschen den Stoffwechsel derart verändern kann, daß zusätzliches Fettgewebe gebildet wird. Bei einem solchen Krankheitszustand wäre es wünschenswert, die Menge des vorhandenen Neurturins zu modulieren oder zu verringern, und die Behandlungen zur Modulation oder Verringerung von Neurturin können die Verabreichung von Neurturin-Antikörpern, entweder polyclonal oder monoclonal, die Verwendung von Antisense-Polynucleotiden, um die Neurturin-Expression zu modulieren, oder hybriden oder chimären Polynucleotiden mit antagonistischen Eigenschaften beinhalten.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem anderen Aspekt die Herstellung von isolierten und gereinigten Neurturin-Antisense-Oligonucleotiden und ein Verfahren zur Verminderung der Expressionsrate von Neurturin durch eine Zelle, umfassend die Verabreichung von einem oder mehreren Neurturin-Antisense-Oligonucleotiden. Mit "Neurturin-Antisense-Oligonucleotiden" wird auf Oligonucleotide verwiesen, welche eine Nucleotidsequenz aufweisen, die durch Basenpaarung mit einer spezifischen komplementären Nucleinsäuresequenz interagiere, welche an der Expression von Neurturin beteiligt ist, so daß die Expression von Neurturin verringert wird. Vorzugsweise ist die an der Expression von Neurturin beteiligte spezifische Nucleinsäuresequenz ein genomisches DNA-Molekül oder ein mRNA-Molekül, welches Neurturin codiere. Dieses genomische DNA-Molekül kann regulatorische Regionen des Neurturin-Gens, die Prä- oder Pro-Teile des Neurturin-Gens oder die codierende Sequenz für das reife Neurturin-Protein umfassen. Der Begriff "komplementär zu einer Nucleotidsequenz" in Zusammenhang mit Neurturin-Antisense-Oligonucleotiden und Verfahren hierfür bedeutet ausreichend komplementär zu einer solchen Sequenz, um eine Hybridisierung mit der Sequenz in einer Zelle, d.h. unter physiologischen Bedingungen, zu ermöglichen. Die Neurturin-Antisense-Oligonucleotide umfassen vorzugsweise eine Sequenz, enthaltend etwa 8 bis etwa 100 Nucleotide, und mehr bevorzugt umfassen die Neurturin-Antisense-Oligonucleotide etwa 15 bis etwa 30 Nucleotide. Die Neurturin-Antisense-Oligonucleotide können auch Derivate einschließen, welche eine Vielzahl von Modifikationen enthalten, die eine Resistenz gegen einen nucleolytischen Abbau verleihen, wie zum Beispiel modifizierte Internucleotidbindungen, modifizierte Nucleinsäurebasen und/oder Zucker und dergleichen (Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990), 543-584; Schneider und Banner, Tetrahedron Lett. 31 (1990), 335; Milligan et al., J. Med. Chem. 36 (1993), 1923-1937; Tseng et al., Cancer Gene Therap. 1 (1994), 65-71; Miller et al., Parasitology 10 (1994), 92-97). Solche Derivate schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Grundgerüstmodifikationen wie Phosphotriester, Phosphorothioat, Methylphosphonat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat und Formacetal sowie Morpholino, Peptidnucleinsäure-Analoga und wiederkehrende Dithioat-Einheiten ein. Die Neurturin-Antisense-Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können bei der Behandlung einer Überexpression von Neurturin oder einer unzureichenden Expression von Neurturin, wie bei der Behandlung von Fettleibigkeit oder bei der Modulation einer Neoplasie, verwendet werden. Ein solche Behandlung kann auch die ex-vivo-Behandlung von Zellen einschließen.
Die therapeutischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können über irgendeinen geeigneten Weg, welcher auf dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich zum Beispiel intravenös, subkutan, intramuskulär, transdermal, intrathekal oder intracerebral, oder durch Verabreichung in die Zellen bei ex-vivo-Behandlungsprotokollen verabreicht werden. Die Verabreichung kann entweder schnell, wie durch eine Injektion, oder über einen Zeitraum, wie durch langsame Infusion oder durch Verabreichung einer Formulierung mit langsamer Freisetzung, erfolgen. Zur Behandlung von Geweben im Zentralnervensystem kann die Verabreichung durch Injektion oder Infusion in die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) erfolgen. Wenn beabsichtigt ist, daß Neurturin an Zellen im Zentralnervensystem verabreicht werden soll, kann die Verabreichung zusammen mit einem oder mehreren Agenzien erfolgen, welche befähigt sind, die Penetration von Neurturin durch die Blut-Hirn-Schranke zu begünstigen.
Neurturin kann auch an Agenzien, welche wünschenswerte pharmazeutische oder pharmakodynamische Eigenschaften vorsehen, gebunden oder konjugiert werden. Zum Beispiel kann Neurturin an irgendeine Substanz, von welcher auf dem Fachgebiet bekannt ist, daß sie die Penetration oder den Transport durch die Blut-Hirn-Schranke begünstigt, wie ein Antikörper gegen den Transferrin-Rezeptor, gekoppelt und durch intra venöse Injektion verabreicht werden (vgl. zum Beispiel Friden et al., Science 259 (1993), 373-377). Außerdem kann Neurturin an ein Polymer wie Polyethylenglykol stabil gebunden werden, um wünschenswerte Eigenschaften im Hinblick auf Löslichkeit, Stabilität, Halbwertszeit und andere pharmazeutisch vorteilhafte Eigenschaften zu erhalten (vgl. zum Beispiel Davis et al., Enzyme Eng. 4 (1978), 169-173; Burnham, Am. J. Hosp. Pharm. 51 (1994), 210-218).
Die Zusammensetzungen werden üblicherweise in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verwendet. Solche Zubereitungen werden in einer auf dem Fachgebiet der Pharmazie hinreichend bekannten Art und Weise hergestellt. Eine bevorzugte Zubereitung verwendet ein Vehikel aus physiologischer Salzlösung, aber es wird erwartet, daß andere pharmazeutisch annehmbare Träger, wie physiologische Konzentrationen von anderen nicht-toxischen Salzen, 5%ige wäßrige Glucoselösung, steriles Wasser oder dergleichen, ebenfalls verwendet werden können. Es kann auch wünschenswert sein, daß ein geeigneter Puffer in der Zusammensetzung vorhanden ist. Solche Lösungen können gegebenenfalls gefriergetrocknet und in einer sterilen Ampulle fertig zur Rekonstitution durch die Zugabe von sterilem Wasser für eine gebrauchsfertige Injektion gelagert werden. Das primäre Lösungsmittel kann wäßrig oder alternativ nicht-wäßrig sein. Neurturin kann auch in eine feste oder halbfeste, biologisch verträgliche Matrix eingearbeitet werden, welche in Gewebe, die eine Behandlung benötigen, implantiert werden kann.
Der Träger kann auch andere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten zur Modifizierung oder Aufrechterhaltung des pH-Werts, der Osmolarität, Viskosität, Klarheit, Farbe, Sterilität, Stabilität, Auflösungsrate oder des Geruchs der Formulierung enthalten. In ähnlicher Weise kann der Träger auch andere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten zur Modifizierung oder Aufrechterhaltung der Freisetzung oder Absorption oder Penetration durch die Blut-Hirn-Schranke enthalten. Solche Exzipienten sind Substanzen, welche üblicherweise und gebräuchlicherweise bei der Formulierung von Dosierungen für die parenterale Verabreichung in entweder Einheitsdosis- oder Multidosisform oder zur direkten Infusion in die Cerebrospinalflüssigkeit durch kontinuierliche oder periodische Infusion verwendet werden.
Die Dosisverabreichung kann abhängig von den pharmakokinetischen Parametern der verwendeten Dosierungsformulierung und dem verwendeten Verabreichungsweg wiederholt werden.
Es wird auch erwartet, daß bestimmte Formulierungen, enthaltend Neurturin, oral verabreicht werden können. Solche Formulierungen werden vorzugsweise eingekapselt und zusammen mit geeigneten Träger in festen Dosierungsformen zubereitet. Einige Beispiele für geeignete Träger, Exzipienten und Verdünnungsmittel schließen Lactose, Dextrose, Sucrose, Sorbit, Mannit, Stärken, Gummi arabicum, Calciumphosphat, Alginate, Calciumsilicat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Gelatine, Sirup, Methylcellulose, Methyl- und Propylhydroxybenzoate, Talkum, Magnesiumstearat, Wasser, Mineralöl und dergleichen ein. Die Formulierungen können zusätzlich Gleitmittel, Benetzungsmittel, Emulgier- und Suspendiermittel, Konservierungsmittel, Süßungsmittel oder Geschmacksstoffe einschließen. Die Zusammensetzungen können derart formuliert sein, daß sie eine schnelle, langanhaltende oder verzögerte Freisetzung der Wirkstoffbestandteile nach der Verabreichung an den Patienten unter Anwendung von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, vorsehen. Die Formulierungen können auch Substanzen enthalten, welche den proteolytischen Abbau vermindern und die Absorption fördern, wie zum Beispiel oberflächenaktive Mittel.
Die spezifische Dosis wird entsprechend dem ungefähren Körpergewicht oder der Körperoberfläche des Patienten oder dem Volumen des auszufüllenden Körperraums berechnet. Die Dosis wird auch abhängig von dem besonderen gewählten Verabreichungsweg berechnet. Durch die Fachleute wird routinemäßig eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, welche zur Bestimmung der geeigneten Dosierung für eine Behandlung notwendig sind, vorgenommen. Solche Berechnungen können durch den Fachmann ohne unnötiges Experimentieren im Hinblick auf die hierin offenbarte Aktivität in Testzubereitungen von Zielzellen durchgeführt werden. Die genauen Dosierungen werden in Verbindung mit Dosis-Antwort-Standardstudien ermittelt. Es ist selbstverständlich, daß die Menge der tatsächlich verabreichten Zusammensetzung durch einen praktischen Arzt im Hinblick auf die relevanten Umstände, einschließlich des Zustands oder der Zustände, welche behandelt werden sollen, der Auswahl der zu verabreichenden Zusammensetzung, dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des einzelnen Patienten, der Schwere der Symptome des Patienten und dem gewählten Verabreichungsweg ermittelt wird.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann Neurturin durch Implantation in Vektoren oder Zellen der Patienten, welche befähigt sind, eine biologisch aktive Form von Neurturin oder einen Vorläufer von Neurturin, d.h. ein Molekül, das ohne weiteres durch den Körper in eine biologisch aktive Form von Neurturin umgewandelt werden kann, therapeutisch verabreicht werden. Bei einem Ansatz können Zellen, die Neurturin sezernieren, in semipermeable Membranen zur Implantation in einen Patienten eingekapselt werden. Die Zellen können Zellen sein, welche normalerweise Neurturin oder einen Vorläufer hiervon exprimieren, oder die Zellen können transformiert werden, um Neurturin oder einen Vorläufer hiervon zu exprimieren. Es wird bevorzugt, daß die Zelle menschlichen Ursprungs ist und daß das Neurturin ein menschliches Neurturin ist, wenn es sich bei dem Patienten um einen Menschen handelt. Jedoch können die Formulierungen und Verfahren hierin sowohl für veterinäre als auch humane Anwendungen verwendet werden, und der Begriff "Patient", so wie hierin verwendet, soll menschliche und veterinäre Patienten einschließen.
Zellen können ex vivo gezüchtet werden, zum Beispiel für die Verwendung bei einer Transplantation oder Ansiedelung in Patienten (Muench et al., Leuk. & Lymph. 16 (1994), 1-11). Neurturin kann an solche Zellen verabreicht werden, um deren Wachstum und Differenzierung zu induzieren. So wird Neurturin in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet, um die ex-vivo-Vermehrung von Zellen für die Transplantation oder Ansiedelung zu fördern. Gegenwärtige Methoden haben Bioreaktor-Kultursysteme, enthaltend Faktoren wie Erythropoietin, Kolonie-stimulierende Faktoren, Stammzellenfaktoren und Interleukine, verwendet, um hämatopoietische Vorläuferzellen für Erythrocyten, Monocyten, Neutrophile und Lymphocyten zu vermehren (Verfaillie, Stem Cells 12 (1994), 466-476). Diese Stammzellen können aus dem Knochenmark von menschlichen Spendern, aus menschlichem peripherem Blut oder aus Nabelschnur-Blutzellen isoliere werden. Die vermehrten Blutzellen werden verwendet, um Patienten zu behandeln, welche einen Mangel an diesen Zellen aufgrund von spezifischen Krankheitszuständen oder als Folge einer Hochdosis-Chemotherapie zur Behandlung einer Malignität aufweisen (George, Stem Cells 12 (Anhang 1) (1994), 249-255). Im Falle einer Zellverpflanzung nach einer Chemotherapie können autologe Transplantate durch Entnahme von Knochenmarkszellen vor der Chemotherapie, Vermehrung der Zellen ex vivo unter Anwendung von Verfahren, welche auch in der Entfernung von malignen Zellen wirksam sind, und Transplantation der vermehrten Zellen wieder zurück in den Patienten nach der Chemotherapie gewonnen werden (für eine Übersicht vgl. Rummel und Van Zant, J. Hematotherapy 3 (1994), 213-218). Da Neurturin in dem sich entwickelnden Tier im Blut, im Knochenmark und in der Leber exprimiert wird, d.h. Geweben, worin die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen erfolgt, wird angenommen, daß Neurturin in der Regulierung der Proliferation von hämatopoietischen Stammzellen und in der Differenzierung von reifen hämatopoietischen Zellen wirksam sein kann. Folglich könnte die Zugabe von Neurturin zu Kultursystemen, welche für die ex-vivo-Vermehrung von Zellen verwendet werden, die Rate erhöhen, in der sich bestimmte Populationen von Zellen vermehren oder differenzieren, und die Effektivität dieser Vermehrungssysteme bei der Erzeugung von Zellen, welche für ein Transplantat erforderlich sind, verbessern.
Es wird ebenfalls angenommen, daß Neurturin für die ex-vivo-Vermehrung von Vorläuferzellen im Nervensystem verwendet werden kann. Die Transplantation oder Ansiedelung von Zellen wird gegenwärtig als eine Therapie für Erkrankungen, bei denen bestimmte Populationen von Neuronen aufgrund einer Degeneration verloren gehen, wie zum Beispiel bei der Parkinson-Krankheit, erforscht (Bjorklund, Curr. Opin. Neurobiol. 2 (1992), 683-689). Neuronale Vorläuferzellen können von tierischen oder menschlichen Spendern oder aus menschlichem fötalem Gewebe erhalten und dann unter Verwendung von Neurturin oder von anderen Wachstumsfaktoren in Kultur vermehrt werden. Diese Zellen können dann in Patienten verpflanzt werden, in denen sie wirksam sind, um einige der Zelle zu ersetzen, welche aufgrund einer Degeneration verloren gegangen sind. Da gezeigt worden ist, daß Neurotrophine fähig sind, das Überleben und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen zu stimulieren, wie zum Beispiel die NT-3-Stimulierung von sympathischen Neuroblastenzellen (Birren et al., Develop. 119 (1993), 597-610), könnte Neurturin auch in ähnlicher Weise während der Entwicklung des Nervensystems wirksam und bei der ex-vivo-Vermehrung von neuronalen Zellen nützlich sein.
Unter einer Reihe von Umständen wäre es wünschenswert, die Neurturin-Spiegel in einem Patienten zu bestimmen. Die Identifizierung von Neurturin zusammen mit dem vorliegenden Bericht, welcher zeigt, daß Neurturin durch eine Reihe von Geweben exprimiert wird, liefert die Grundlage für die Schlußfolgerung, daß die Anwesenheit von Neurturin einer normalen physiologischen Funktion in Verbindung mit dem Zellwachstum und -überleben dient. Tatsächlich ist bekannt, daß andere neurotrophe Faktoren bei der Funktion von neuronalen und nicht-neuronalen Geweben eine Rolle spielen (für eine Übersicht vgl. Scully und Otten, Cell Biol. Int. 19 (1995), 459-469; Otten und Gadient, Int. J. Devl. Neurosciences 13 (1995), 147-151). Endogen gebildetes Neurturin kann auch eine Rolle bei bestimmten Krankheitszuständen spielen, insbesondere, wenn eine zelluläre Degeneration vorliegt, wie bei neurodegenerativen Zuständen oder Erkrankungen. Es ist bekannt, daß sich andere neurotrophe Faktoren während Krankheitszuständen verändern.
Zum Beispiel sind bei Multipler Sklerose die Spiegel des NGF-Proteins in der Cerebrospinalflüssigkeit während den akuten Phasen der Krankheit erhöht (Bracci-Laudiero et al., Neuroscience Lett. 147 (1992), 9-12), und beim systemischen Lupus erythematodes besteht eine Korrelation zwischen entzündlichen Schüben und den NGF-Spiegeln im Serum (Bracci-Laudiero et al., NeuroReport 4 (1993), 563-565).
In Anbetracht der Tatsache, daß Neurturin in Blutzellen, im Knochenmark und in Mastzellen exprimiert wird, ist es wahrscheinlich, daß sich der Neurturin-Spiegel bei einer Vielzahl von Zuständen verändert werden kann und daß die Quantifizierung der Neurturin-Spiegel klinisch nützliche Informationen liefern würde. Außerdem können bei der Behandlung von degenerativen Zuständen Neurturin enthaltende Zusammensetzungen verabreicht werden, und es wäre wahrscheinlich wünschenswert, bestimmte Zielspiegel an Neurturin im Serum, in der Cerebrospinalflüssigkeit oder in irgendeinem anderen gewünschten Gewebekompartiment zu erreichen. Es wäre daher vorteilhaft, die Neurturin-Spiegel in einem Patienten überwachen zu können. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Neurturin in einer Probe von einem Patienten bereit.
Der Begriff "Nachweis", so wie hierin in Zusammenhang mit dem Nachweis der Anwesenheit von Neurturin in einem Patienten verwendet, soll die Bestimmung der Menge an Neurturin oder der Fähigkeit zur Expression einer Menge an Neurturin in einem Patienten, die Unterscheidung zwischen Neurturin und anderen Wachstumsfaktoren, die Einschätzung der Prognose im Hinblick auf den wahrscheinlichen Folgezustand einer degenerativen Erkrankung und der Aussicht für eine Genesung, die Überwachung der Neurturin-Spiegel über einen Zeitraum als eine Maßeinheit für den Status des Zustandes und die Überwachung der Neurturin-Spiegel zur Ermittlung eines bevorzugten Therapieschemas für den Patienten einschließen.
Für den Nachweis der Anwesenheit von Neurturin in einem Patienten wird eine Probe von dem Patienten erhalten. Die Probe kann eine Gewebe-Biopsieprobe oder eine Blut-, Plasma- Serum- oder CSF-Probe oder dergleichen sein. Neurturin wird in einer großen Vielzahl von Geweben exprimiert, wie in Beispiel 10 gezeigt wird. Die Proben für den Nachweis von Neurturin können aus irgendeinem dieser Gewebe entnommen werden. Bei der Beurteilung der peripheren Neurturin-Spiegel wird bevorzugt, daß die Probe eine Blut-, Plasma- oder Serumprobe ist. Bei der Beurteilung der Neurturin-Spiegel im Zentral nervensystem ist eine bevorzugte Probe eine von der Cerebrospinalflüssigkeit erhaltene Probe.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, festzustellen, ob das Neurturin-Gen in dem Patienten oder in einem Gewebe oder in einer Zelllinie in dem Patienten intakt ist. Mit einem intakten Neurturin-Gen ist gemeint, daß in den Gen keine Veränderungen wie Punktmutationen, Deletionen, Insertionen, Chromosomenbrüche, Chromosomenumlagerungen und dergleichen vorliegen, wobei eine solche Veränderung die Produktion von Neurturin oder dessen biologische Aktivität, Stabilität und dergleichen verändern könnte, wodurch Krankheitsprozesse oder eine Anfälligkeit für zelluläre degenerative Zustände hervorgerufen werden. So wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von irgendwelchen Veränderungen in dem Neurturin-Gen bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Bereitstellung eines Oligonucleotids, welches die Neurturin-cDNA, eine genomische DNA oder ein Fragment hiervon oder ein Derivat hiervon enthält. Mit einem Derivat eines Oligonucleotids ist gemeint, daß das abgeleitete Oligonucleotid im wesentlichen dieselbe Sequenz aufweist wie die Sequenz, von der sie abgeleitet ist, insofern als die abgeleitete Sequenz eine ausreichende Sequenzkomplementarität zu der Sequenz, von der sie abgeleitet ist, aufweist, um mit dem Neurturin-Gen zu hybridisieren. Die abgeleitete Nucleotidsequenz muß nicht notwendigerweise physikalisch von der Nucleotidsequenz abgeleitet werden, sondern kann auf irgendeine Weise, einschließlich zum Beispiel durch chemische Synthese oder DNA-Replikation oder reverse Transkription oder Transkription, erzeugt werden.
Typischerweise wird die genomische DNA des Patienten aus einer Zellprobe von dem Patienten isoliert und mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen, wie zum Beispiel TagI und AluI, gespalten. Durch einen Test unter Verwendung des Southern-Blot-Protokolls, welches auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt ist, wird festgestellt, ob ein Patient oder ein bestimmtes Gewebe in einem Patienten ein intaktes Neurturin-Gen oder eine Neurturin-Genabnormalität aufweist.
Eine Hybridisierung mit dem Neurturin-Gen würde die Denaturierung der chromosomalen DNA zum Erhalt einer einzelsträngigen DNA; das Inkontaktbringen der einzelsträngigen DNA mit einer Gensonde, welche mit der Neurturin-Gensequenz assoziiert ist; und die Identifizierung der hybridisierten DNA-Sonde zum Nachweis der chromosomalen DNA, welche mindestens einen Teil des menschlichen Neurturin-Gens enthält, beinhalten.
Der Begriff "Sonde", so wie hierin verwendet, verweist auf eine Struktur, bestehend aus einem Polynucleotid, welches eine hybride Struktur mit einer Zielsequenz aufgrund der Komplementarität der Sondensequenz mit einer Sequenz in der Zielregion ausbildet. Oligomere, welche zur Verwendung als Sonden geeignet sind, können mindestens etwa 8-12 und bevorzugt mindestens etwa 20 zusammenhängende Nucleotide, welche zu der Zielsequenz komplementär sind, enthalten.
Die Neurturin-Gensonden der vorliegenden Erfindung können DNA- oder RNA-Oligonucleotide sein und können durch ein beliebiges Verfahren, welches auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie zum Beispiel durch Exzision, Transkription oder chemische Synthese, hergestellt werden. Die Sonden können mit irgendeinem nachweisbaren Marker, welcher auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie zum Beispiel radioaktive oder fluoreszierende Marker oder enzymatische Marker, markiert sein. Die Markierung der Sonde kann durch ein beliebiges Verfahren, welches auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie durch PCR, Zufallsprimer, Endmarkierung, Nicktranslation oder dergleichen, erfolgen. Dem Fachmann ist auch bekannt, daß andere Verfahren, worin keine markierte Sonde verwendet wird, zum Nachweis der Hybridisierung angewendet werden können. Beispiele für Verfahren, welche zum Nachweis der Hybridisierung angewendet werden können, schließen das Southern-Blot-Verfahren, die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse mittels PCR-Amplifikation ein.
Die Hybridisierung wird typischerweise bei 25-45°C, mehr bevorzugt bei 32-40°C und stärker bevorzugt bei 37-38°C ausgeführt. Der zur Hybridisierung erforderliche Zeitraum beträgt etwa 0,25 bis etwa 96 Stunden, mehr bevorzugt etwa eine Stunde bis etwa 72 Stunden und am meisten bevorzugt etwa 4 bis etwa 24 Stunden.
Neurturin-Genabnormalitäten können auch mit Hilfe des PCR-Verfahrens und unter Verwendung von Primern, welche das Neurturin-Gen umgeben oder innerhalb davon liegen, nachgewiesen werden. Das PCR-Verfahren ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Kurz zusammengefaßt, wird dieses Verfahren unter Verwendung von zwei Oligonucleotidprimern durchgeführt, welche in der Lage sind, mit den Nucleinsäuresequenzen, welche eine Zielsequenz umgeben, die innerhalb eines Neurturin-Gens liegt, zu hybridisieren und die Zielsequenz zu amplifizieren. Der Begriff "Oligonucleotidprimer", so wie hierin verwendet, verweist auf einen kurzen DNA- oder RNA-Strang mit einer Länge im Bereich von etwa 8 bis etwa 30 Basen. Die Stromaufwärts- und die Stromabwärtsprimer haben typischerweise eine Länge von etwa 20 bis etwa 30 Basenpaaren und hybridisieren mit dem umgebenden Regionen unter Replikation der Nucleotidsequenz. Die Polymerisierung wird durch eine DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten oder Nucleotidanaloga unter Bildung von doppelsträngigen DNA-Molekülen katalysiert. Die Doppelstränge werden dann durch ein beliebiges Denaturierungsverfahren, einschließlich physikalisch, chemisch oder enzymatisch, voneinander getrennt. Im allgemeinen wird das Verfahren der physikalischen Denaturierung angewendet, welches typischerweise das Erhitzen der Nucleinsäure auf Temperaturen von etwa 80°C bis 105°C während Zeiträumen im Bereich von etwa 1 Minute bis etwa 10 Minuten beinhaltet. Der Vorgang wird während der gewünschten Anzahl der Zyklen wiederholt.
Die Primer werden derart ausgewählt, daß sie zu dem DNA-Strang, der amplifiziert werden soll, im wesentlichen komplementär sind. Daher ist es nicht erforderlich, daß die Primer die genaue Sequenz der Matrize wiedergeben, aber sie müssen ausreichend komplementär sein, um mit dem zu amplifizierenden Strang selektiv zu hybridisieren.
Nach der PCR-Amplifikation wird die DNA-Sequenz, umfassend Neurturin oder Präpro-Neurturin oder ein Fragment hiervon, dann direkt sequenziert und durch den Vergleich der Sequenz mit den hierin offenbarten Sequenzen analysiert, um Veränderungen zu identifizieren, welche die Aktivität oder die Expressionsraten oder dergleichen verändern könnten.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis von Neurturin basierend auf der Analyse eines Gewebes, welches das Neurturin-Gen exprimiert, bereitgestellt. Es ist festgestellt worden, daß bestimmte Gewebe, wie die nachstehend in Beispiel 10 identifizierten, das Neurturin-Gen exprimieren. Das Verfahren umfaßt die Hybridisierung eines Polynucleotids mit der mRNA aus einer Probe von Geweben, welche normalerweise das Neurturin-Gen exprimieren. Die Probe wird von einem Patienten erhalten, welcher im Verdacht steht, eine Abnormalität in dem Neurturin-Gen oder in dem Neurturin-Gen von bestimmten Zellen aufzuweisen. Das Polynucleotid umfaßt SEQ ID NO: 11 oder ein Derivat hiervon oder ein Fragment hiervon.
Für den Nachweis der Anwesenheit einer mRNA, welche das Neurturin-Protein codiert, wird eine Probe von einem Patienten erhalten. Die Probe kann Blut oder eine Gewebe-Biopsieprobe sein. Die Probe kann behandelt werden, um die darin enthaltenen Nucleinsäuren zu extrahieren. Die erhaltene Nucleinsäure aus der Probe wird einer Gelelektrophorese oder einer anderen nach Größe auftrennenden Technik unterworfen.
Die mRNA der Probe wird mit einer DNA-Sequenz, welche als eine Sonde dient, in Kontakt gebracht, um Hybrid-Duplexe zu bilden. Die Verwendung einer markierten Sonde, wie vorstehend besprochen, ermöglicht den Nachweis des resultierenden Duplexes.
Falls die cDNA, welche das Neurturin-Protein codiert, oder ein Derivat der cDNA als eine Sonde verwendet wird, können hoch stringente Bedingungen verwendet werden, um falsch positive Ergebnisse, daß heißt, die Hybridisierung und den scheinbaren Nachweis von Neurturin-Nucleotidsequenzen, zu verhindern, wenn eigentlich kein intaktes oder funktionsfähiges Neurturin-Gen vorhanden ist. Bei der Verwendung von Sequenzen, welche von der Neurturin cDNA abgeleitet sind, können weniger stringente Bedingungen verwendet werden, dies wäre jedoch ein weniger bevorzugter Ansatz, da eine Wahrscheinlichkeit für falsch positive Ergebnisse besteht. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Reihe von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschprozesses, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Zeitdauer und Konzentration an Formamid, bestimmt. Diese Faktoren werden zum Beispiel bei Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989, a.a.O.) besprochen.
Um die Empfindlichkeit des Nachweises einer mRNA, welche das Neurturin-Protein codiert, in einer Probe zu erhöhen, kann die Technik der reversen Transkription/Polymerasekettenreaktion (RT/PCR) angewendet werden, um die cDNA zu amplifizieren, welche von der mRNA, welche das Neurturin-Protein codiert, transkribiert wurde. Das RT/PCR-Verfahren ist auf dem Fachgebiet gut bekannt (vgl. nachstehend Beispiel 10 und 6).
Das RT/PCR-Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden. Die gesamte zelluläre RNA wird zum Beispiel durch das herkömmliche Guanidiumisothiocyanat-Verfahren isoliert, und die gesamte RNA wird reverse transkribiert. Das reverse Transkriptionsverfahren beinhaltet die Synthese einer DNA an einer RNA-Matrize unter Verwendung eines reversen Transkriptaseenzyms und einem 3'-Ende-Primer. Typischerweise enthält der Primer eine Oligo(dT)-Sequenz. Die so hergestellte cDNA wird dann mittels des PCR-Verfahrens und unter Verwendung von Neurturin-spezifischen Primern amplifiziert (Belyavsky et al., Nucl. Acid Res. 17 (1989), 2919-2932; Krug und Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, NY, Bd. 152, S. 316-325, 1987).
Die Polymerasekettenreaktion wird, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von zwei Oligonucleotidprimern, welche im wesentlichen komplementär zu den zwei umgebenden Regionen des zu amplifizierenden DNA-Segments sind, durchgeführt.
Nach der Amplifikation wird das PCR-Produkt dann einer Elektrophorese unterworfen und durch eine Ethidiumbromidfärbung oder ein Phosho-Imaging-Verfahren nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit des Neurturin-Proteins in einer Probe, welche von einem Patienten erhalten wurde, bereit. Jedes Verfahren, welches auf dem Fachgebiet zum Nachweis von Proteinen bekannt ist, kann angewendet werden. Solche Verfahren schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Immundiffusion, Immunelektrophorese, immunchemische Verfahren, Bindemolekül-Liganden-Tests, immunhistochemische Techniken, Agglutination und Komplementtests ein (vgl. zum Beispiel Basic and Clinical Immunology, Sites und Terr, Hrsg., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., S. 217-262, 1991). Bevorzugt werden Bindemolekül-Liganden-Immunoassay-Verfahren, welche die Umsetzung von Antikörpern mit einem Epitop oder mehreren Epitopen des Neurturin-Proteins und die kompetitive Verdrängung eines markierten Neurturin-Proteins oder eines Derivats hiervon einschließen.
So wie hierin verwendet, soll ein Derivat des Neurturin-Proteins ein Polypeptid einschließen, worin bestimmte Aminosäuren deletiert oder ersetzt oder durch modifizierte oder ungewöhnliche Aminosäuren ausgetauscht worden sind, wobei das Neurturin-Derivat biologisch äquivalent zu Neurturin ist, und wobei das Polypeptid-Derivat mit Antikörpern, welche gegen das Neurturin-Protein hervorgerufen wurden, kreuzreaktiv ist. Mit Kreuzreaktion ist gemeint, daß ein Antikörper mit einem Antigen reagiert, das sich von demjenigen unterscheidet, welches dessen Bildung induziert hat.
Zahlreiche kompetitive und nicht-kompetitive Proteinbindungs-Immunoassays sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Die in solchen Tests verwendeten Antikörper können unmarkiert sein, so wie zum Beispiel in Agglutinationstests verwendet, oder zur Verwendung in einer großen Vielzahl von Testverfahren markiert werden. Verwendbare Marker schließen Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszierende Stoffe, Enzymsubstrate oder Cofaktoren, Enzyminhibitoren, Partikel, Farbstoffe und dergleichen zur Verwendung in Radioimmunoassays (RIA), Enzym-Immunoassays, z.B. einem enzymgebundenen Immunadsorptionstest (ELISA), Fluoreszenz-Immunoassays und dergleichen ein.
Polyclonale oder monoclonale Antikörper gegen das Neurturin-Protein oder ein Epitop hiervon können für die Verwendung in Immunoassays durch irgendeines einer Reihe von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Mit Epitop wird eine antigene Determinante eines Polypeptids bezeichnet. Ein Epitop könnte drei Aminosäuren in einer räumlichen Konformation, welche für das Epitop einmalig ist, umfassen. Im allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens fünf solcher Aminosäuren. Verfahren zur Bestimmung der räumlichen Konformation von Aminosäuren sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen zum Beispiel die Röntgenkristallographie und die zweidimensionale Kernmagnetresonanz ein.
Ein Ansatz für die Herstellung von Antikörpern gegen ein Protein ist die Aus wahl und die Herstellung einer Aminosäuresequenz aus dem gesamten oder einem Teil des Proteins, die chemische Synthese der Sequenz und die Injektion hiervon in ein geeignetes Tier, üblicherweise ein Kaninchen oder eine Maus (vgl. Beispiel 11).
Oligopeptide können als Kandidaten für die Herstellung eines Antikörpers gegen das Neurturin-Protein basierend auf den Oligopeptiden, welche in den hydrophilen Regionen vorliegen und welche somit wahrscheinlich in dem reifen Protein exponiert werden, ausgewählt werden.
Antikörper gegen Neurturin können auch gegen Oligopeptide hervorgerufen werden, welche eine oder mehrere der hierin identifizierten konservierten Regionen einschließen, so daß der Antikörper mit anderen Familienmitgliedern kreuzreaktiv sein kann. Solche Antikörper können verwendet werden, um die anderen Familienmitglieder zu identifizieren und zu isolieren.
Verfahren zur Herstellung des Neurturin-Proteins oder eines Epitops hiervon schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die chemische Synthese; DNA-Rekombinationstechniken oder die Isolierung aus biologischen Proben ein. Die chemische Synthese eines Peptids kann zum Beispiel durch die klassische Merrifield-Methode der Festphasenpeptidsynthese (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149) oder die FMOC-Strategie mit einem Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis-System (DuPont Company, Wilmington, DE) (Caprino und Han, J. Org. Chem. 37 (1972), 3404) durchgeführt werden.
Polyclonale Antikörper können durch die Immunisierung von Kaninchen oder anderen Tieren durch Injizieren des Antigens, gefolgt von nachfolgenden Nachimpfungen in geeigneten Intervallen, hergestellt werden. Den Tieren wird Blut entnommen, und die Seren werden üblicherweise durch einen ELISA oder durch einen Bioassay, basierend auf der Fähigkeit, die Wirkung von Neurturin auf Neurone oder andere Zellen zu blockieren, auf ein gereinigtes Neurturin-Protein untersucht. Bei der Verwendung von Vogelspezies, z.B. einem Huhn, Truthahn und dergleichen, kann der Antikörper aus dem Eigelb des Eies isoliert werden. Monoclonale Antikörper können nach der Methode von Milstein und Kohler durch die Fusion von Splenocyten von immunisierten Mäusen mit kontinuierlich replizierenden Tumorzellen wie Myelom- oder Lymphomzellen hergestellt werden (Milstein und Kohler, Nature 256 (1975), 495-497; Gulfre und Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73 (1981), 1-46, Langone und Banatis, Hrsg., Academic Press). Die auf diese Weise gebildeten Hybridomzellen werden dann durch Grenzverdünnungsverfahren cloniert, und die Überstände werden durch einen ELISA, RIA oder Bioassay auf eine Antikörperproduktion untersucht.
Die einzigartige Fähigkeit von Antikörpern, Zielproteine zu erkennen und spezifisch daran zu binden, stellt einen Ansatz für die Behandlung einer Überexpression des Proteins bereit. So wird gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung von Erkrankungen in Verbindung mit einer Überexpression des Neurturin-Proteins durch die Behandlung eines Patienten mit spezifischen Antikörpern gegen das Neurturin-Protein bereitgestellt.
Spezifische Antikörper, entweder polyclonal oder monoclonal, gegen das Neurturin-Protein können durch irgendein geeignetes Verfahren, welches auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie vorstehend besprochen, hergestellt werden. Beispielsweise können murine oder menschliche monoclonale Antikörper durch die Hybridomtechnik hergestellt werden, oder alternativ kann das Neurturin-Protein oder ein immunologisch aktives Fragment hiervon oder ein anti-Idiotyp-Antikörper oder ein Fragment hiervon an ein Tier verabreicht werden, um die Herstellung von Antikörpern zu induzieren, welche in der Lage sind, das Neurturin-Protein zu erkennen und daran zu binden. Solche Antikörper können einer beliebigen Klasse von Antikörpern, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, oder im Falle von Vogelspezies auch IgY, und irgendeiner Unterklasse von Antikörpern angehören.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
Beispiel 1
Dieses Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Reinigung von Neurturin aus ei nem konditionierten CHO-Zellen-Medium.
Herstellung des konditionierten CHO-Zellenmediums:
Ein Derivat von DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, DG44CHO-pHSP-NGFI-B (CHO)-Zellen, wurde verwendet (Day et al., J. Biol. Chem. 265: 15253-15260, 1990). Wie oben angegeben haben die Erfinder ebenso Neurturin in teilweise gereinigter Form aus anderen Derivaten der DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters erhalten. Die CHO-Zellen wurden in 20 ml Medium gehalten, welches minimales essentielles Medium (MEM)-alpha (Gibco-BRL Nr. 12561, Gaithersburg, MD) enthielt, das 10% fötales Kalbserum (Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin, 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 25 nM Methotrexat unter Verwendung von 150 cm²-Flaschen (Corning Inc., Corning NY) aufwies. Für den Durchlass und die Vermehrung wurde Medium aus einer konfluenten Flasche eingezogen; die Zellen wurden mit 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend in g/l 0,144 KH₂PO₄, 0,795 Na₂HPO₄ und 9,00 NaCl, gewaschen; und die Flasche wurde anschließend zwei bis drei Minuten mit 2 ml 0,25% Trypsin in PBS inkubiert. Die Zellen wurden anschließend von der Flaschenoberfläche entnommen, 8 ml des Mediums wurden zugesetzt, und die Zellen wurden mehrere Male mit einer Pipette trituriert. Die Zellen wurden 1:5 oder 1:10 aufgeteilt, bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft inkubiert und 3 bis 4 Tage lang bis zum Zusammentreffen (Konfluenz) wachsen gelassen.
Anschließend ließ man die Zellkultur in 850 cm²-Rollflaschen (Becton Dickinson, Bedford, MA) sich vermehren. Eine konfluente 150 cm²-Flasche wurde trypsinisiert und in eine Rollflasche, enthaltend 240 ml des obengenannten modifizierten MEM-Mediums ohne Methotrexat, gesetzt. Der pH wurde entweder durch Überlagern des Mediums mit 5% CO₂ in Luft oder durch Herstellen des Mediums mit 25 mM HEPES pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO) gehalten. Die Rollflaschen wurden bei 0,8 bis 1,0 Umdrehungen pro Minute routieren gelassen. Die Zellen erreichten eine Konfluenz in 4 Tagen.
Zum Sammeln des konditionierten Mediums wurde serumfreies CHO-Zellen- Medium (SF-CHO) verwendet. SF-CHO wurde unter Verwendung von 1:1 DME/F12-Basis-Medium hergestellt, welches durch Mischen von 1:1 (v/v) DMEM (Gibco-BRL Produkt Nr. 11965, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) mit Ham's F12 (Gibco-BRL Produkt Nr. 11765) hergestellt wurde. Das fertige SF-CHO-Medium enthielt 15 mM HEPES pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO), 0,5 mg/ml bovines Serum-Albumin (BSA, Sigma, St. Louis, MO), 25 μg/ml Heparin, (Sigma, St. Louis, MO), ein 1X Insulin-Transferrin-Selenit-Supplement (bovines Insulin, 5 μg/ml; humanes Transferrin, 5 μg/ml; Natriumselenit, 5 ng/ml; Sigma, St. Louis, MO), 2 mM 1-Glutamin, 100 U/ml Penezillin und 100 μg/ml Streptomycin. Das Medium aus den konfluenten Rollflaschen wurde entfernt, und die Zellen wurden einmal mit 30 ml SF-CHO-Medium zur Entfernung der Serumproteine gewaschen. Die Zellen wurden anschließend bei 37°C 16 bis 24 Stunden lang in 80 ml SF-CHO-Medium zur weiteren Entfernung von Serumproteinen inkubiert. 80 ml Medium wurden entfernt und verworfen. Es wurde ein Volumen von 120 ml SF-CHO-Medium zu der Flasche zugesetzt, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert. Weitere 48 Stunden später wurden 120 ml entnommen und durch dasselbe Volumen SF-CHO-Medium ersetzt. Die gesammelten Medien wurden gepoolt und bei 4°C in konischen Polypropylenrohren zur Entfernung von zellulärer Debris zentrifugiert, und der Überstand wurde bei –70°C gelagert. Die Medien wurden fünfmal innerhalb von 10 Tagen gesammelt, um insgesamt ungefähr 600 ml konditioniertes Medium pro Rollflasche zu erhalten.
Die gesammelten Fraktionen aus den Säulen wurden bei jeder Reinigungsstufe hinsichtlich der biologischen Aktivität unter Verwendung des neuronalen Überlebensassays und hinsichtlich des Proteingehalts durch den Farbstoffbindungsassay von Bradford (Anal. Biochem. 72: 248 et seq., 1976, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) untersucht. Die Gesamt-mg an Protein in dem Ausgangsvolumen, typischerweise 50 1, des konditionierten Mediums wurden bestimmt.
Höheres Cervical_Ganglion_Überlebens_Assay (Superior Cervical Ganglion Survival Assay):
Die neurotrophe Aktivität von konditioniertem CHO-Medium-Ausgangsmaterial wurde bei verschiedenen Aufreinigungsstufen unter Verwendung des höheren Cervial-Ganglion-Überlebens-Assay-Systems, von dem bereits früher berichtet wurde (Martin et al., J. of Cell Biology 106: 829-844; Deckwerth und Johnson, J. Cell. Bio. 123: 1207-1222, 1993), untersucht. Es wurden primäre Kulturen sympathischer Neuronen aus dem höheren/oberen Cervical-Ganglion (SCG) durch Entnahme von Gewebe aus dem Rattenembryo am Tag 20-21 (E20-E21) hergestellt. Die SCG's wurden in Leibovitz's L15-Medium mit 1-Glutamin (Cat #11415-023 Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) gegeben, 30 Minuten lang mit 1 mg/ml Kollagenase (Cat #4188 Worthington Biochemical, Freehold, NJ) in Leibovitz's L15-Medium bei 37°C digeriert, gefolgt von einer 30-minütigen Digerierung in lyophilisiertem und bestrahltem Trypsin (Typ TRLVMF Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ), welches in modifizierter Hanks' Balanced Salt Solution (Cat #H-8389 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) resuspendiert wurde. Die Digerierung wurde unter Verwendung von AM50 gestoppt, welches minimales essentielles Medium (Minium Essential Medium) mit Earle's Salzen und ohne 1-Glutamin (Cat #11090-016 Gibco-BRL), 10% fötales Kalbsserum (Cat #1115 Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin (Cat #G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM FuDr (F-0503 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM Uridine (Cat #3003 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 50 ng/ml 2,5 S NGF enthält. Die Zellen wurden in eine Suspension einzelner Zellen unter Verwendung einer silanierten und flammpolierten Pasteur-Pipette aufgetrennt. Nach der Filtration der Suspension durch einen Nitex-Filter (Größe 3-20/14, Tetko Inc., Elmsford, NY) wurden die Zellen in ein AM50-Medium wie oben angegeben überführt und auf eine 100 mm Falcon- oder Primaria-Kulturplatte (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) gegeben, um die Anzahl von nichtneuronalen Zellen zu vermindern. Nach 2 Stunden wurde das Medium, welches die ungebundenen neuronalen Zellen enthielt, von diesen Platten entfernt und wiederum durch eine silanierte und flammpolierte Pasteur-Pipette trituriert. Die Einzelzellsuspension wurde auf 24-Well-Gewebekulturplatten (Costar, Wilmington, MA) gegeben, welche vorher mit einer Doppelschicht aus Kollagen überzogen wurden, wobei eine Kollagenschicht ammonisiert wurde und eine zweite Kollagenschicht luftgetrocknet wurde. Man ließ sie 30 Minuten bis 2 Stunden lang anhaften. Eine spezifische Zahl viabler bzw. lebensfähiger Zellen, gewöhnlich ungefähr 1.200 bis ungefähr 3.000 Gesamtzellen pro Well, oder ein spezifischer Prozentanteil des Ganglions, gewöhnlich 25% der pro Ganglion erhaltenen Zellen, wurden in jedes Well gegeben. Sofern das Auszählen der Zellen durchgeführt werden musste, wurden sie in 24-Well-Platten, wie oben angegeben, oder alternativ in 2-Well-Kammer-Slides (Nunc, Naperville, IL) überführt. Die Kulturen wunden anschließend 5 bis 6 Tage bei 37°C in AM50-Medium in einer 5% CO₂/95% Luftatmosphäre inkubiert. Der Tod der kultivierten Neuronen wurde durch Austausch des Mediums mit Medium ohne NGF und mit 0,05% Ziegen-Anti-NGF (finaler Titer in den Wells ist 1:10) induziert. Dieser NGF-Verlust resultiert in dem Tod der Neuronen innerhalb einer Zeitdauer von 24 bis 72 Stunden. Aliquots von teilweise aufgereinigtem oder gereinigtem Faktor oder geeignete Kontrollen wurden zu den Kulturen zur Zeit der NGF-Entfernung zugesetzt, um die Fähigkeit des Vorbeugens bzw. Verhinderns des neuronalen Tods zu bestimmen.
Die Evaluierung der Fähigkeit der Säulenfraktion, der Gel-Eluate oder des gereinigten Faktors zur Vorbeugung des neuronalen Tods wurde durch visuelle Inspektion der Kulturen unter dem Phasen-Kontrast-Mikroskop vorgenommen. Die viablen Neuronen verblieben in der hellen Phase mit intakten Neuriten, wohingegen die toten Neuronen zusammengeschrumpft in der dunklen Phase waren, unregelmäßige Membranen aufwiesen und fragmentierte Neuriten zeigten (3). Wenn eine genaue Quantifizierung des neuronalen Überlebens erforderlich war, wurden die Kulturen in 4% Paraformaldehyd oder 10% Formalin in PBS fixiert und mit Crystal Violet-Lösung angefärbt (Huntoon Formula Harleco E. M. Diagnostics Systems, Gibbstown, NJ). Wenn 24-Well-Platten verwendet wurden, wurde 1 μl Crystal Violet-Lösung zu jedem Well, enthaltend 10% Formalin, zugesetzt, und die Zellen wurden unter Verwendung eines Phasen-Kontrast-Mikroskops gezählt. Wenn die 2-Well-Kammer-Slides verwendet wurden, wurden die Kulturen fixiert, mit Crystal Violet angefärbt, mit Wasser gewaschen, in steigenden Ethanolkonzentrationen gegenüber Toluol entwässert und in einer Toluol-basierten Mounting-Lösung befestigt. Die Neuronen wurden als lebensfähig gezählt, wenn sie einen klaren Nucleolus aufwiesen, und die Kerne mit Crystal Violet deutlich gefärbt waren.
Der neuronale Tod nach 72 Stunden ist in 3B gezeigt. Ebenso gezeigt sind (A) die positiven Kontrollzellen, welche mit Nervenwachstumsfaktor versehen wurden, und (C) die Zellen, welche mit Anti-NGF und Neurturin (ungefähr 3 ng/ml) behandelt wurden und das Überleben von Neuronen zeigen.
Die Aktivität wurde durch Berechnung einer "Überlebenseinheit" quantifiziert. Die Gesamtüberlebenseinheiten in einer Probe wurden als das minimale Volumen eines Aliquots der Probe definiert, welches ein maximales Überleben, geteilt durch/in das Gesamtvolumen der Probe, hervorruft. Die spezifische Aktivität wurde als die Überlebenseinheiten, geteilt durch die mg-Gesamtprotein, berechnet.
Überlebenseinheiten wurden in einem Assay unter Verwendung von ungefähr 1.200 lebensfähigen Neuronen in einem 0,5 ml-Kulturassay und einer Kulturierungsdauer von 48 Stunden, die der Zugabe der Fraktion folgt, bestimmt. Das Überleben wurde visuell nach den 48 Stunden bestimmt. Die intrinsische Aktivität, wie sie in 4 gezeigt ist, wurde in einen Assay unter Verwendung von ungefähr 2.700 Neuronen und einer Kulturierungsdauer von 72 Stunden bestimmt. Das Überleben wurde durch Fixieren der Neuronen und Zählen der Anzahl der überlebenden Neuronen beurteilt. Weil die Stabilität, wie mittels des Halbwertslebens der Aktivität beurteilt, für Neurturin mit steigender Anzahl der Neuronen abnimmt, wurde angenommen, dass die Messung der intrinsischen Aktivität geringer ist als die durch die Specific Activity-Bestimmungen vorausgesagten. Man würde ebenso erwarten, dass die Messung der intrinsischen Aktivität geringer ist als die durch die spezifische Aktivität vorausgesagte, da das Überleben nach 72 Stunden anstelle von 48 Stunden gemessen wurde.
Um die Wiederholbarkeit dieser Aktivitätseinheitsassays sicher zu stellen, war es notwendig, die primären Neuronal-Kulturen bei reproduzierbaren Zelldichten zu plattieren, da die Stabilität der Aktivität deutlich mit einem Anstieg der neuronalen Dichte abnimmt. Der Bereich der Zelldichten reichte von ungefähr 1.200 bis 2.700 Zellen pro Well. Die Anwesenheit von löslichem Heparin in dem Assay-Medium hatte keinen Effekt auf die Kurzzeit- (ungefähr 3 Tage) Stabilität der Überlebensaktivität.
Reinigung von Neurturin:
Gepooltes konditioniertes Medium wurde durch 0,2 μl-Poren-Flaschenaufsatz-Filter (Celluloseacetatmembran, Corning Inc., Corning, NY) filtriert. Typischerweise wurden 50 l des konditionierten Mediums verwendet und in 25-1-Ansätzen verarbeitet. Jeder 25-1-Ansatz wurde in einer Rate von 20 ml/Min auf eine 5 × 5 cm Säule geleitet, welche 100 ml Heparin-Agarose (Sigma, St. Louis, MO) enthielt, äquilibriert _mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer mit 150 nM NaCl. Die Säule wurde anschließend mit ungefähr 1.000 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, bei 20 ml/Min gewaschen, und die Aktivität wurde anschließend mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl eluiert. Nach dem Umschalten auf den 1,0 M NaCl-Elutions-Puffer wurden die ersten 50 ml Puffer verworfen, und anschließend wurde eine 300 ml-Fraktion gesammelt.
Gepooltes Material, eluiert aus der Heparin-Agarose-Säule, wurde anschließend 1:1 (v/v) mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,04% TWEEN 20, auf eine NaCl-Konzentration von 0, 5 M verdünnt und in eine 1, 5 cm × 9 cm-Säule, enthaltend 16 ml SP SEPHAROSE^® High Performance-Ionenaustauschharz (Pharmacia, Piscataway, NJ), äquilibriert in 25 mM HEPES 7,4, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,02% TWEEN 20, geleitet. Die Säule wurde anschließend mit 160 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,02% TWEEN 20, gewaschen, und die Aktivität wurde mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl und 0,02% TWEEN 20 bei einer Fließrate von 2 ml/Min eluiert. Eine 50 ml-Fraktion wurde nach den ersten 7 ml Eluat von der Säule entnommen.
Das von der SP SEPHAROSE^®-Säule eluierte Material wurde unter Verwendung von schneller Protein-Flüssigchromatographie (fast protein liquid chromatography; FPLC) auf einer Chelating Superose HR 10/2-Säule, welche mit Cu⁺⁺ beladen war (Pharmacia, Piscataway, NJ), fraktioniert. Die Säule wurde durch Waschen mit 10 ml Wasser, beladen mit 3 ml 2,5 mg/ml CuSO₄·5H₂O, Waschen mit 10 ml Wasser und Äquilibrieren mit 10 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl und 0,02% TWEEN 20, hergestellt. Das Eluat wurde in die Säule in 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl in einer Rate von 1,0 ml/Min eingeleitet. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Gradienten steigender Glycin-Konzentration (0-300 mM) in 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl, in einer Rate von 1,0 ml/Min. eluiert. Der Gradient wurde durch ein Pharmacia-FPLC-System unter Verwendung eines LCC-500-Controllers und P-500-Pumpen gebildet, sodass ein 0-300 mM-Glycin-Gradient in 40 ml bei 1,0 ml/Min. bereitgestellt wurde. So stieg der Gradient um 7,5 mM Glycin pro Minute. Es wurden 1 ml-Fraktion gesammelt und hinsichtlich der SCG-Überlebenspromotion untersucht. Die. Peak-Aktivität wurde in den Fraktionen 17-20 beobachtet, d. h. 17 bis 20 Minuten oder ml von dem Startpunkt des Gradienten.
Die Absorbanz-Messungen bei 280 mM durch einen Inline-UV-Monitor zeigte an, dass die meisten Proteine vor der Überlebensaktivität in den Fraktionen 17-20 eluiert wurden. Somit wurde eine deutliche Aufreinigung bei diesem Schritt erreicht. Ein 25 kD-Band wurde mit der Überlebensaktivität co-gereinigt.
Die kombinierten eluierten Fraktionen der Cu++-Superose-Säule wurden auf 0,45 M NaCl unter Verwendung von 25 mM HEPES pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,02% TWEEN 20, verdünnt und in eine Mono-S-HR 5/5-Kationenaustauschsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) für die weitere FPLC-Reinigung geleitet. Die Säule wurde mit 25 mM HEPES pH 7,4-Puffer, enthaltend 0,45 M NaCl, enthaltend 0,02% TWEEN 20, äquilibriert. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Gradienten ansteigender NaCl-Konzentration (0,45-1,0 M) eluiert. Der Gradient wurde wie oben beschrieben aus 0,45 M-1,0 M NaCl in 35 ml bei 1,0 ml/Min gebildet, wodurch die Konzentration um 0,0157 M pro ml oder Minute stieg. Dreizehn 1,0 ml-Fraktionen (Fraktionen 1-13) wurden gesammelt, gefolgt von 44 0,5 ml-Fraktionen (Fraktionen 14-53). Die Peak-Aktivität in dem SCG-Assay lag in den Fraktionen 26-29. Eine jede Fraktion wurde in dem SCG-Überlebens-Assay innerhalb eines Bereichs von Volumina von 0,1 bis 1,0 μl pro 0,5 ml Kulturmedium untersucht.
Ein Prozent (5 μl) einer jeden Fraktion wurde auf ein nichtreduzierendes, 14%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel gegeben und für 750 V-Stunde bei 25°C einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden mittels Silberfärbung visualisiert. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die in Reihe M auf dem Gel gezeigten Marker repräsentieren 20 ng bovines Serumalbumin, Kohlensäureanhydrase, B-Lactoglobulin und Lysozym in der Reihenfolge des abnehmenden Molekulargewichts.
Ein 25 kD-Band erschien bei den Fraktionen 25-30, ein 28 kD-Protein wurde früher in dem Gradienten eluiert, und ein 18 kD wurde später in dem Gradienten eluiert. Die 2 zeigt die Überlebensaktivität in jeder der Fraktionen. Es wurde verzeichnet, dass die Überlebensaktivität der Anwesenheit und der sichtbaren Intensität des 25 kD-Proteins in den Fraktionen 25-30 entsprach.
Um zu zeigen, dass das 25 kD-Band für die überlebensfördernde Aktivität verantwortlich ist, wurde das 25 kD-Protein von dem Polyacrylamid-Gel nach der Elektrophorese eluiert und hinsichtlich der Überlebensaktivität in dem SCG-Assay untersucht. Nach der Elektrophorese von 150 μl der SP SEPHAROSE^® 1,0 M NaCl-Fraktion in einer Reihe eines oben beschriebenen nichtreduzierenden 14%-igen SDS-Polyacrylamid-Gels wurde die Reihe in 12 Streifen geschnitten, und jeder Streifen wurde zerstoßen und durch Diffusion unter Schwenken in Puffer, enthaltend 25 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20, innerhalb von 18 Stunden bei 25°C eluiert. BSA wurde zugesetzt, um eine finale Konzentration von 200 μg/ml zu eluieren, und das Eluat wurde durch einen 0,45 μm-Filter filtriert, μm Acrylamidgel-Fragmen te zu entfernen. Das Filtrat wurde anschließend einer SP SEPHAROSE^®-Säule zugesetzt, um die Probe aufzukonzentrieren und zu reinigen. Vor der Elution der Probe wurde die Säule einmal in 400 μl 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, und einmal in 400 μl 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, gewaschen. Die Säule wurde anschließend wiederum in 400 μl 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, gewaschen. Die Probe wurde mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl, 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, eluiert. Die Proben wurden anschließend hinsichtlich ihrer Überlebensaktivität analysiert. Nur der Streifen, welcher dem 25 kD-Band entsprach, zeigte den Beweis für eine Überlebensaktivität. Das 25 kD-Protein, gereinigt aus den konditionierten CHO-Zellenmedien, wird als ein Homodimer angenommen.
Die Ausbeute aus der oben beschriebenen Aufreinigung betrag typischerweise 1-1,5 μg für 50 1 konditioniertes CHO-Zellenmedium. Die Gesamtgewinnung wird auf 10 bis 30% geschätzt, was in einer Aufreinigung von ungefähr 390.000-fach resultiert.
Beispiel 2
Diese Probe verdeutlicht die Charakterisierung von Neurturin und verschiedenen Mitgliedern der TGF-β-Familie von Wachstumsfaktoren in dem SCG-Assay sowie die Abwesenheit der Kreuzreaktivität von Anti-GNDF-Antikörpern mit Neurturin.
Der SCG-Assay des aufgereinigten Proteins zeigte, dass der Faktor bei einer Konzentration von ungefähr 3 ng/ml oder ungefähr 100 pM maximal wirksam bzw. aktiv ist, und dass der EC₅₀ ungefähr 1, 5 ng/ml oder ungefähr 50 pM in dem erwarteten Bereich für einen diffusionsfähigen Peptid-Wachstumsfaktor lag (4).
Mehrere Mitglieder der TGF-β-Familie beeinflussen die Neuropeptid-Gen-Expression in sympathischen Neuronen, während andere das Überleben unterschiedlicher neuronaler Populationen fördern. Neurturin, welches ein entferntes Mitglied dieser Proteinfamilie darstellt, ist zur Förderung des annähernd vollständigen Überlebens von sympathischen Neuronen innerhalb von drei Tagen in der Lage. Zusätzlich zeigte ein weiteres Kultivieren der SCG-Zellen, dass Neurturin den Erhalt dieser Neuronen innerhalb von mindestens 10 Tagen nach der Entfernung von NGF fortsetzen konnte.
Wir haben verschiedene andere Mitgleider der TGF-β-Familie hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Unterstützung des Überlebens in dem SCG-Assay untersucht, einschließlich von TGF-β1, Aktivin, BMP-2, BMP-4, BMP-6 und GDNF. Unter diesen Faktoren zeigte nur GDNF eine überlebensfördernde Aktivität. Jedoch war die Aktivität von GDNF viel weniger potent als die von Neurturin hinsichtlich dieser Aktivität, welches einen EC₅₀ von 2-4 nM in dem 3-Tages-Überlebensassay zeigt. Das in die sem Assay untersuchte GDNF war rhGDNF, welches von E. Coli, erhalten von Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N. J., gebildet wurde. Die Dauer der Wirkung von GDNF war ebenso geringer als die von Neurturin, dahingehend, dass die Fähigkeit von GDNF (50 ng/ml)., ein Überleben von länger als 3 Tagen zu bewerkstelligen, wesentlich nachließ. Diese Experimente legen die Möglichkeit nahe, dass GDNF ein Agonist für den Neurturin-Rezeptor ist. Darüber hinaus legt die Unfähigkeit von Aktivin und BMP-2, das Überleben im Gegensatz zu ihrer starken Induktion der Transmitter-bezogenen Gen-Expression in diesen Neuronen zu fördern (Fann und Paterson, Int. J. Dev. Neurosci. 13: 317-330, 1995; Fann und Patterson, J. Neurochem. 61: 1349–1255, 1993), nahe, dass sie über andere Rezeptoren oder Signalübertragungswege signalisieren.
Um die Kreuzreaktivität von Anti-GDNF-Antikörpern mit teilweise aufgereinigtem Neurturin zu bestimmen, wurden SCG-Neuronen, welche wie in Beispiel 1 beschrieben entnommen und plattiert wurden, am Tag 6 mit 1 ng/ml, 3 ng/ml, 10 ng/ml oder 30 ng/ml GDNF (Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N. J.) in Gegenwart von Anti-NGF allein oder in Gegenwart von Anti-NGF und Anti-GDNF (Ziegen-IgG-Antikörper gegenüber E. coli-abgeleitetem rhGDNF, R & D Systems, Minneapolis, Minn) behandelt. Eine teilweise gereinigte 1,0 M SP Sepharose-Fraktion von Neurturin wurde in dem Assay in geeigneten Konzentrationen von 375 pg/ml, 750 pg/ml, 1,5 ng/ml und 3 ng/ml verwendet. Diese Fraktion wurde in Gegenwart von Anti-NGF alleine und in Anwesenheit von Anti-NGF und Anti-GDNF untersucht. Der Anti-GDNF-Antikörper blockierte die überlebensfördernde Aktivität von GDNF bei einer Konzentration bis zu 30 ng/ml, blockierte allerdings nicht die überlebensfördernde Aktivität von Neurturin.
Beispiel 3
Dieses Beispiel verdeutlicht die Wirkung von Neurturin auf Sensorneuronen in einem Knoten-Ganglion-Überlebensassay.
Konditionierte CHO-Zellen-Medien, welche teilweise auf der SP Sepharose-Säule gereinigt wurden, wurden hinsichtlich der neurotrophen Aktivität gegenüber Sensorneuronen unter Verwendung von Knoten-Ganglien untersucht. Der Überlebensassay stellt eine Modifikation des vorstehend Beschriebenen hinsichtlich der höheren Cervical-Ganglien dar. Primär dissoziierte Kulturen von Knoten-Ganglien wurden durch Entnahme von Gewebe von E18-Sprague-Dawley-Ratten-Jungen hergestellt. Die Knoten-Ganglien (Nodose-Ganglien) wurden in Leibovitz's L15 mit 2 mM 1-Glutamin (Cat #11415-023, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) gegeben und die Gewebe wurden entnommen, 30 Minuten mit 1 mg/ml Collagenase (Cat #4188, Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey) in Leibovitz's L15-Medium bei 37°C digeriert, gefolgt von 30 minütiger Digerierung in Trypsin (lyophilisiert und bestrahlt, Typ TRLVMF, Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ), und auf eine finale Konzentration von 0,25% in modifizierter Hank's Balanced Salt Solution (Cat #H8389, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) resuspendiert. Die Digerierung wurde unter Verwendung von AMO-BDNF100, einem Medium, welches Minimum Essential Medium mit Earle's Salzen und ohne 1-Glutamin (#11090-016 GIBCO-BRL), 10% fötales Kalbsserum (Cat #1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin (Cat #G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM FuDr (F-0503, Sigma Chemical Co.), 20 μM Uridine (Cat #3003, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 100 ng hirnabgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF, Amgen, Thousand Oaks, CA) enthält, gestoppt. Die Zellen wurden in eine Suspension von Einzelzellen unter Verwendung einer silanierten und flammpolierten Pasteur-Pipette in das AMO-BDNF100-Medium dissoziiert und auf einer 100 mm-Falcon- oder Primaria-Kulturplatte (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) zur Entfernung von nichtneuronalen Zellen präplattiert. Nach 2 Stunden wurde das Medium, welches die nichtbefestigten neuronalen Zellen enthielt, von diesen Platten entfernt und erneut durch eine silanierte und flammpolierte Pasteur-Pipette trituriert. Die Einzelzellensuspension wurde auf 24-Well-Gewebe-Kultur-Platten (Costar, Wilmington, MA) gegeben, welche vorher mit einer Kollagendoppelschicht überzogen wurden, wobei eine Schicht ammonisiert wurde und die zweite Schicht luftgetrocknet wurde. Die Ganglien von 10 E18-Rattenembryos wurden in 2,5 ml Medium dissoziiert, und 100 μl dieser Suspension wurde zu jedem Well zugesetzt. Die Zellen ließ man 30 Minuten in einem 37°C-Inkubator mit 5% CO2/95% Luft anhaften. Die Wells wurden mit AMO-BDNF100-Medium über Nacht versehen.
Am nächsten Tag wurden die Zellen dreimal 20 Minuten lang jeweils mit AMO-Medium, welches kein BDNF enthielt, gewaschen. Diese Wells wurden mit 0,5 ml dieses Mediums alleine oder dieses Mediums, welches entweder 50 ng/ml NGF, 100 ng/ml BDNF (Amgen, Thousand Oaks, CA), 100 ng/ml GDNF (Prepro Tech, Inc., Ro cky Hill, N. J.) oder 3 ng/ml Neurturin enthielt, versehen. Die Zellen wurden bei 37°C in einem 5% CO₂/95% Luft-Inkubator drei Tage lang inkubiert, mit 10% Formalin fixiert, mit Crystal Violet gefärbt (1 μl/ml 10% Formalin) und gezählt. Das Überleben wurde wie vorstehend angegeben festgestellt.
Der neuronale Tod nach 72 Stunden ist in 10 gezeigt. Das neuronale Überleben von Knoten-Neuronen, kultiviert in BDNF, wurde kürzlich vorgestellt (Thaler et al., Deuelop. Biol. 161: 338-344, 1994, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist). Dieses wurde als Standard für das Überleben dieser Neuronen verwendet, und ihm wurde der Wert von 100% Überleben bzw. Fortbestand verliehen. Knoten-Ganglien, welche keinen trophischen Träger (AMO) aufwiesen, zeigten 20% bis 30% Überleben, genau so wie Neuronen, welche in Gegenwart von 50 ng/ml NGF kultiviert wurden. Die in Gegenwart von 3 ng/ml Neurturin und in Abwesenheit von BDNF kultivierten Neuronen zeigten ein Überleben, welches dem von in Gegenwart von BDNF (100 ng/ml) kultivierten Neuronen ähnlich ist. GDNF bei einer Konzentration von 100 ng/ml förderte das Überleben von Knoten-Neuronen in höherem Maße als BDNF (100 mg/ml). Ähnliche Ergebnisse mit GDNF wurden kürzlich für Sensorneuronen vom Huhn vorgestellt (Ebendal, T. et al., J. Neurosci. Res. 40: 276-284, 1995).
Beispiel 4
Dieses Beispiel verdeutlicht die Wirkung von Neurturin auf Sensorneuronen in einem Spinalganglion-Überlebensassay.
Die Spinalganglion-Zellen (dorsal root ganglion-Zellen; DRG) wurden gemäß den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt, außer dass das Spinalganglion von E15-Rattenembryos verwendet wurde. Der neuronale Tod nach 72 Stunden ist in 11 gezeigt. Das neuronale Überleben von DRG wurde auf ein Überleben in Gegenwart von Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor; NGF) bei einer Konzentration von 50 ng/ml standardisiert, welcher als der Wert für 100% Überleben angesetzt wurde. Die in Gegenwart von Anti-NGF-Antikörper kultivierten Neuronen zeigten ungefähr 14% Überleben. Die in Gegenwart von GDNF (50 ng/ml) oder Neurturin (6 ng/ml), jeweils zusammen mit Anti-NGF, kultivierten Neuronen zeigten ungefähr 34% Überleben. Folglich zeigten GDNF und Neurturin vergleichbare Effektivitäten im Erhalt des DGR-Zellenüberlebens.
Beispiel 5
Dieses Beispiel verdeutlicht die Bestimmung von Teilaminosäuresequenzen von Neurturin, isoliert aus konditioniertem CHO-Zellenmedium.
Um eine N-terminale Aminosäuresequenz aus einer aufgereinigten Zubereitung von ungefähr 1 μg Neurturin zu erhalten, wurden die Mono-S-Fraktionen 26 bis 29, welche den Peak der Aktivität enthielten, auf 25 μl durch Zentrifugalultrafiltration in einem Microcon-3-Konzentrator (Amicon, Inc., Beverly, MA) aufkonzentriert und auf ein nichtreduzierendes 14%-iges SDS-Polyacrylamidgel beladen. Nach elektrophoretischer Trennung wurden die Proteine gegen eine PVDF-Membran elektrogeblotted (Bio-Rad, Hercules, CA) und mit 0,1%-igem Coomassie Blue gefärbt. Das 25 kD-Band wurde ausgeschnitten und in die Reaktionskartusche eines automatischen Sequenzierers (Model 476, Applied Biosystems, Foster City, CA) eingesetzt. Eine Phenylthiohydantoin-Aminosäure-Gewinnung (PTH-aa) in den ersten 2-3 Zyklen eines automatischen Sequenzierens durch Edman-Abbau zeigte eine, Sequenzierungsausbeute von 4 pMol, was ungefähr 10% der abgeschätzten Menge des auf das SDS-Gel beladenen Proteins entspricht.
Zwei N-terminale Sequenzierungsdurchläufe wurden aus zwei 50 1-Aufreinigungszubereitungen durchgeführt. In dem ersten Durchlauf wurden 1 μg Protein in drei gepoolten Fraktionen mit 1,5 ml Gesamtvolumen auf 25 μl aufkonzentriert und bei 100 V zwei Stunden lang bei 25°C unter Verwendung eines Elektroblot-Puffers aus 10 mM CAPS pH 11,0 Puffer (Sigma, St. Louis, MO), enthaltend 5% Methanol, elektrogeblotted. Die Aminosäuresequenz wurde aus 13 Zyklen Edman-Abbau erhalten, und die Sequenzierungsausbeute betrug 4 pMol, wie oben.
In dem zweiten Durchlauf wurden 1,5 μg Protein in vier gepoolten Fraktionen mit 2,0 ml Gesamtvolumen auf 25 μl aufkonzentriert und bei 36 V 12 Stunden lang bei 4°C unter Verwendung eines Elektroblot-Puffers aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,04% SDS und 17% MeOH elektrogeblotted. Die Sequenzierungsausbeute betrug 15 pMol, und die Sequenz nach 16 Zyklen war SGARPXGLRELEVSVS (SEQ ID NO: 3). Die nach 16 Zyklen erhaltene Sequenz entspricht der kürzeren Sequenz, welche in dem ersten Durchlauf erhalten wurde. Definitive Zuordnungen konnten bei drei der Aminosäurereste in der Sequenz nicht vorgenommen werden (Reste 1, 6 und 11 vom N-terminalen Ende). Eine Recherche in Protein-Datenbanken detektierte keine deutlich homologen Sequenzen, was nahelegt, dass der aufgereinigte Faktor ein neues Protein war.
Diese ersten N-terminalen Aminosäuresequenzdaten ermöglichten nicht die Isolierung von cDNA-Klonen unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotiden als PCR-Primer oder Sonden zum Screenen von Bibliotheken. Um diese Ansätze zu erleichtern, wurde zusätzliches Protein aufgereinigt, um eine interne Aminosäuresequenz aus proteolytischen Fragmenten zu erhalten. Um die interne Aminosäuresequenz aus Neurturin zu erhalten, wurden zusätzliche 50 1 des konditionierten CHO-Zellenmediums unter Verwendung nur der ersten drei Chromatographieschritte, wie sie oben angegeben sind, aufgereinigt, außer dass der zum Eluieren der Cu⁺⁺-Chelating-Superose-Säule verwendete Gradient wie folgt lautete: 0-60 mM Glycin (4 ml), 60 mM Glycin (10 ml), 60-300 mM Glycin (32 ml). Die Fraktionen Nr. 20-23, welche Neurturin enthielten, wurden auf 25 μl durch Ultrafiltration (Amicon Microcon 3, Amicon, Beverly, MA) aufkonzentriert und auf ein nichtreduzierendes SDS-Polyacrylamid-Gel geladen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Blue angefärbt, und das 25 kD-Neurturinband wurde ausgeschnitten. Neurturin wurde in dem Gelstreifen mit Endoproteinase-Lys-C digeriert bzw. aufgeschlossen, und die eluierten proteolytischen Fragmente wurden durch reverse Phasen-HPLC aufgereinigt. Nur ein Peak wurde durch HPLC-Auftrennung der eluierten Peptide beobachtet, welcher eine Aminosäuresequenzinformation aus 23 Zyklen bei dem 1 pMol-Signallevel unter Verwendung des automatischen Sequenzierers ergab (internes Fragment P2, SEQ ID NO: 5).
Die Aminosäureanalyse, welche bei 10% der oben angegebenen Probe vor deren Unterziehen einer Digerierung durchgeführt wurde, zeigte, dass 150 pMol Protein in dem Gelstreifen vorlagen, bestehend aus 7,6% Lysin und 19,5% Arginin. Der einzige Peak niedrigen Niveaus aus der Lys-C-Digerierung deutete an, dass die Digerierung und Eluierung der Peptide ineffizient war. Derselbe Gelstreifen wurde erneut mit Trypsin digeriert, und die eluierten Peptide wurden durch HPLC aufgetrennt. Zwei Peaks wurden in der HPLC beobachtet, was in der Sichtbarmachung von zwei zusätzlichen Aminosäuresequenzen mit 10 Resten resultierte (4-5 pMol Signalanteil, internes Fragment P1, SEQ ID NO: 4, und internes Fragment P3, SEQ ID NO: 6), welche sich von den N-terminalen und vorstehenden internen Aminosäuresequenzen unterschieden. Die in situ-Digerierung, Elution und Aufreinigung von Peptiden und das Peptidsequenzieren wurde durch die W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory an der Yale University gemäß Standardprotokollen für diesen Service durchgeführt.
Beispiel 6
Das folgende Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Sequenzanalyse von Maus- und Human-Neurturin-cDNA-Klonen.
Es wurden entartete bzw. degenerierte Oligonucleotide, welche verschiedene Strecken zuverlässiger Aminosäuresequenzdaten entsprachen, synthetisiert und als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung von cDNA-Sequenzen von revers-transkribierter mRNA verwendet. Ein Vorwärts-Primer (M1676; 5'-CCNACNGCNTAYGARGA, SEQ ID NO: 50), entsprechend der Peptidsequenz P2 Xaa₁-Xaa₂-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa₃-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val, worin Xaa₁ und Xaa₂ unbekannt waren, Xaa₃ Gln oder Glu war (SEQ ID NO: 5), in Kombination mit einem Rückwärts-Primer (M1677; 5'-ARYTCYTGNARNGTRTGRTA (SEQ ID NO: 52), entsprechend der Peptidsequenz P3 (Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg) (SEQ ID NO: 6), wurden zur Amplifizierung eines 69- Nucleotid-Produkts von aus E21-Ratten- und erwachsenem Mäusehirn abgeleiteten cDNA-Templaten verwendet. Die PCR-Parameter waren: 94°C für 30 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden; 72°C für 1 Minute für 35 Zyklen. Das Produkt wurde in den Bluescript KS-Plasmid subkloniert und sequenziert. Sämtliche Nucleotidsequenzierungen wurden unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffterminator-Technologie gemäß den Herstellerangaben auf einem automatischen Applied Biosystems-Sequenzierer vom Modell Nr. 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Die Plasmid-DNA zum Sequenzieren wurde unter Verwendung des Wizard Miniprep-Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Herstellerangaben hergestellt. Die Sequenz des amplifizierten Produkts sagte die Aminosäuresequenzdaten innerhalb der PCR-Primer korrekt voraus.
Die Primer, welche der amplifizierten Sequenz entsprechen, wurden in Kombination mit den entarteten Primern in der schnellen Verstärkung der cDNA-Enden (RACE)-Technik (Frohman, M. A. Methods in Enzymology 218: 340-356, 1993) unter Verwendung des Marathon-RACE-Kits (CLONTECH, Palo Alto, CA) gemäß den Herstellerangaben verwendet, außer dass die Synthese des ersten cDNA-Strangs bei 50°C unter Verwendung von Superscript-II-Reverse-Transkriptase (Gibco-BRL) durchgeführt wurde. Kurz gesagt wurde ein Doppelstrang-Adaptor-Oligonucleotid an die Enden einer Doppelstrang-cDNA ligiert, synthetisiert aus Rattenhirn-mRNA am postnatalen Tag 1. Unter Verwendung von verschachteltem Vorwärts-Neurturin-PCR-Primer (M1676: 5'-CCNACNGCNTAYGARGA, SEQ ID NO: 50 und 1678: 5'-GACGAGGGTCCTTCCTGGACGTACACA, SEQ ID NO. 53) in Kombination mit Primern des in dem Kit bereitgestellten gebundenen Adapters (AP1, AP2) wurde das 3'-Ende der Neurturin-cDNA durch zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen amplifiziert (Erstens: M1676 und AP1 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten für 35 Zyklen; Zweitens: M1678 und AP2 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen). Ein 5'-Abschnitt der Ratten-Neurturin-cDNA wurde durch zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen unter Verwendung der gelinkerten cDNA als Templat erhalten. Die erste Reaktion verwendete Primer M 1677 (SEQ ID NO: 52) und AP1; unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden; und 72°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete M 1679 5'-TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (SEQ ID NO: 54) und AP2 bei 94°C für 30 Sekunden und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Diese Reaktionen resultierten in einer trunkierten Form des 5'-Endes der Neurturin-cDNA, dem Anschein nach das Ergebnis von vorzeitigem Abbruch der cDNA während der reversen Transkription. Die 5'- und 3'-RACE-Produkte wurden in das Plasmid Bluescript KS subkloniert und sequenziert. Die Sequenz dieser 3'- und 5'-RACE-Produkte resultierte in einer teilweisen Ratten-Neurturin-cDNA-Sequenz mit 220 nt. Die Primer (#467921 5'-CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG, SEQ ID NO: 55; und M1679, SEQ ID NO: 54), entsprechend der teilweisen Ratten-cDNA-Sequenz, wurden verwendet (PCR-Parameter 94°C für 30 Sekunden und 68°C für 1 Minute für 35 Zyklen) zur Amplifizierung eines 101-Nucleotid-PCR-Produkts aus Maus-Genom-DNA, welches zu der Ratten-Neurturin-cDNA-Sequenz homolog war.
Diese Primer wurden anschließend verwendet, um murine Neurturin-Genom-Klone durch Amplifizieren von Genfragmenten in einer Maus-129/Sv-Bibliothek in einem P1-Bakteriophagen-Vektor zu erhalten (library screening service von Genome Systems, Inc., St. Louis, MO). Ein 1,6 kb Nco I-Fragment aus diesem P1-Klon, enthaltend das Neurturin-Gen, wurde mittels Hybridisierung mit dem Primer (#465782; 5'-TAYGARGACGAGGTGTCCTTCCTGGACGTACACAGCCGCTAYCAYAC, SEQ ID NO: 56) identifiziert. Dieses Nco I-Fragment wurde sequenziert, und es wurde gefunden, dass es einen Abschnitt der Kodierungssequenz enthielt, welche den N-terminalen und internen Aminosäuresequenzen, welche durch das Sequenzieren des aktiven Proteins, isoliert aus konditionierten CHO-Zellenmedien, erhalten wurde, entsprach. Beginnend mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins kodiert diese Nucleotid-Sequenz ein 100-Aminosäure-Protein mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 11,5 kD. Eine Recherche in Protein- und Nucleinsäure-Datenbanken identifizierte Neuturin als ein neues Protein, welches ungefähr 40% identisch zu Glial-abgeleitetem neurotrophen Faktor (GDNF) ist. GDNF wurde aufgereinigt und als ein Faktor kloniert, welcher das Überleben von dopaminergen Mittelhirn-Neuronen förderte und welcher ein entfernt verwandtes Mitglied der TGF-β-Superfamilie darstellt, welche nun mehr als 25 unterschiedliche Gene enthält, die eine breite Vielfalt von vielfältigen und unterschiedlichen Wirkungen zeigen. Obwohl GDNF weniger als 20% identisch ist zu jeglichen anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie, enthält es die sieben Cystein-Reste, welche innerhalb der gesamten Familie erhalten sind und von denen man annimmt, dass sie die Basis für eine erhaltene Cystein-Knoten-Struktur darstellt, welche in der Kristallstrukturbestimmung von TGF-β 2 beobachtet wurde. Neurturin enthält ebenso diese sieben Cystein-Reste, allerdings ist es wie GDNF weniger als 20% homolog zu irgendeinem anderen Mitglied der TGF-β-Familie. Folglich scheinen Neurturin und GDNF eine Subfamilie von Wachstumsfaktoren zu repräsentieren, welche sich von dem Rest der TGF-β-Superfamilie deutlich unterscheidet.
Um die Sequenz der vollen Länge der Maus-Neurturin-cDNA zu bestimmen, wurde eine 5'- und 3'-RACE-PCR durchgeführt, wie sie oben für die Ratte angegeben ist, wobei verschachtelte Primer, die von der Maus-Genom-Sequenz vorausgesagt wurden, und cDNA aus neonatalem Mäusehirn verwendet wurden. Die erste Reaktion für das 3'-Ende verwendete Primer: M 1777 5'-GCGGCCATCCGCATCTACGACCGGG (SEQ ID NO: 57) und AP1 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete Primer #467921 (SEQ ID NO: 55) und AP2 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 20 Zyklen. Das 5'-Ende wurde erhalten unter Verwendung des Primers M1759 für die erste Reaktion, 5'-CRTAGGCCGTCGGGCGRCARCACGGT (SEQ ID NO: 58) und AP1 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete Primer M1785, 5'-GCGCCGAAGGCCCAGGTCGTAGATGCG (SEQ ID NO: 59) und AP2 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 20 Zyklen. Beide Sätze an PCR-Reaktionen verwendeten 5% DMSO. Die 5'- und 3'-Maus-RACE-Produkte wurden in das Plasmid Bluescript KS subkloniert und sequenziert. Unter Verwendung der Sequenz von RACE-Produkten konnte eine 1,0 kb-Maus-Neurturin-cDNA-Sequenz zusammengestellt werden. Diese cDNA-Sequenz enthält einen offenen Leserahmen von 585 Nucleotiden, welcher ein Protein mit einem Molekulargewicht von 24 kD kodiert. Diese Maus-cDNA-Sequenz ist in voller Länge in 7 gezeigt (SEQ ID NO: 12). In Übereinstimmung mit den Prozessabläufen, welche bekanntermaßen bei den TGF-β-Familienmitgliedern auftreten, enthält das 24 kD-Neurturin-Protein eine Amino-terminale 19-Aminosäure-Signalsequenz, gefolgt von einer Pro-Domäne, die eine proteolytische RXXR-Prozessstelle unmittelbar vor der N-terminalen Aminosäuresequenz, die beim Sequenzieren des aus konditioniertem CHO-Zellenmedien gereinigten Proteinen erhalten wird, enthält. Unter Verwendung dieser Charakteristika wird vorausgesagt, dass das reife 11,5 kD-Neurturin-Molekül 11,5 kD aufweist, und es wird durch Analogie zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie vorausgesagt, dass es ein Disulfid-gebundenes Homodimer mit 23 kD bildet, was mit der 25 kD Masse des aus konditioniertem CHO-Zellenmedien gereinigtem Protein konsistent ist, wie es durch SDS-PAGE-Analyse abgeschätzt wurde.
Zur Isolierung von Human-Genom-Klonen wurden Primer (#467524; 5'-CGCTACTGCGCAGGCGCGTGCGARGCGC, SEQ ID NO: 60 und #1005, 5'-CGCCGACAGCTCTTGCAGCGTRTGGTA, SEQ ID NO: 61), vorausgesagt von der Sequenz von Maus-Neurturin, zur Amplifizierung (PCR-Parameter: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 1 Minute 30 Sekunden, gefolgt von 94°C für 30 Sekunden; 60°C für 15 Sekunden; und 68°C für 60 Sekunden für 35 Zyklen) eines 192-Nucleotid-Fragments aus Human-Genom-DNA verwendet. Die Sequenz des PCR-Produkts zeigte, dass es das menschliche Homologe von 1-Neurturin war. Die Primer wurden anschließend verwendet, um eine Humangenom-Bibliothek zu screenen, aufgebaut in dem P1-Vektor (library screening service, Genome Systems, Inc.), und es wurden zwei Klone erhalten, welche den Human-Neurturin-Genom-Lokus enthielten.
Dieselbe Strategie wurde verwendet zur Bestimmung der menschlichen Sequenz, wie sie oben für die Maus-Sequenz diskutiert wurde. Ein Oligo (#30152, GACCTGGGCCTGGGCTACGCGTCCGRCGAG, SEQ ID NO: 62) wurde als eine Sonde in einer Southern-Blot-Analyse zur Identifizierung der Restriktions-Fragmente der P1-Klone verwendet, welche die Human-Neurturin-Kodierungssequenz enthielten. Diese Restriktionsfragmente (Eag I, Pvu II, Hind III, Kpn I) wurden in das Bluescript KS-Plasmid subkloniert und sequenziert.
Die Ergebnisse des Subklonierens und Sequenzierens von Human-Genom-Fragmenten war wie folgt. Es wurde gefunden, dass das Eag I-Fragment eine Größe von ungefähr 6 kb aufwies mit der 3'-Eag I-Stelle 60 bp unterhalb des Stopkodons ange ordnet. Das Pvu II-Fragment war ungefähr 3,5 kb groß mit der 3'-Pvu II-Stelle 250 bp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Hind III-Fragment war ungefähr 4, 8 kb groß mit der 3'-Hind III-Stelle 3 kp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Kpn I-Fragment war ungefähr 4,2 kb groß mit der 3'-Kpn I-Stelle 3,1 kb unterhalb des Stopkodons angeordnet.
Das zweite Kodierungsexon wurde unter Verwendung dieser subklonierten Fragmente sequenziert. Zusätzlich wurde eine Sequenz von 250 bp, die die 3'-Seite des zweiten Exons flankiert, erhalten. Die Sequenz wurde ebenso von 1.000 bp erhalten, welche die 5'-Seite des Kodierungsexons flankieren. Von diesen Flankierungs-Sequenzen wurden der Vorwärts-Primer 30341 (5'-CTGGCGTCCCAMCAAGGGTCTTCG-3', SEQ ID NO: 71) und der Rückwärts-Primer 30331 (5'-GCCAGTGGTGCCGTCGAGGCGGG-3', SEQ ID NO: 72) derartig entworfen, dass die Gesamt-Kodierungssequenz des zweiten Exons durch PCR amplifiziert werden konnte.
Das erste Kodierungsexon wurde nicht relativ zu den Restriktionsstellen oben gemapped, sondern war in dem Eag I-Fragment enthalten. Die Sequenz dieses Exons wurde aus dem subklonierten Eag I-Fragment unter Verwendung des Maus-Primers 466215 (5'-GGCCCAGGATGAGGCGCTGGAAGG-3', SEQ ID NO: 73), erhalten, welcher das ATG-Initialisierungskodon enthält. Die weitere Sequenz des ersten Kodierungsexons wurde erhalten mit dem reversen Primer 20215 (5'-CCACTCCACTGCCTGAWATTCWACCCC-3', SEQ ID NO: 74), entworfen aus der mit dem Primer 466215 erhaltenen Sequenz. Der Vorwärts-Primer 20205 (5'-CCATGTCATTATCGACCATTCGGC-3', SEQ ID NO: 75) wurde aus der mit dem Primer 20215 erhaltenen Sequenz entworfen. Die Primer 20205 und 20215 flankieren die Kodierungssequenz des ersten Kodierungsexons und können zur Amplifizierung dieser Kodierungssequenz unter Verwendung von PCR verwendet werden.
Beispiel 7
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Expressionsvektoren, welche Neurturin-cDNA enthalten.
Zur Expression von rekombinantem Neurturin in Säugerzellen wurde der Neurturin-Vektor pCMV-NTN-3-1 hergestellt. Der offene 585-Nucleotid-Leserahmen der Neurturin-cDNA wurde durch PCR unter Verwendung eines Primers, welcher die ersten 27 Nucleotide der Neurturin-Kodierungssequenz (5'-GCGACGCGTACCATGAGGCGCTGGAAGGCAGCGGCCCTG, SEQ ID No. 63) enthält, und eines Primers, welcher die letzten 5 Kodons und das Stopkodon (5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC) (SEQ ID NO: 64) enthält, amplifiziert, wobei revers-transkribierte Maushirn-mRNA am postnatalen Tag 1 als Templat verwendet wurde, wobei PCR-Parameter eingesetzt wurden: 94°C für 30 Sekunden; 60°C, für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen, einschließlich 5% DMSO in der Reaktion. Das PCR-Produkt wurde in die Eco RV-Stelle von BSKS subkloniert und sequenziert, um zu verifizieren, dass es keine PCR-generierten Mutationen enthielt. Die Neurturin-Kodierungssequenz wurde anschließend aus diesem Vektor ausgeschnitten, wobei Mlu I (5'-Ende) und Bam HI (3'-Ende) verwendet wurden, und unterhalb des CMV IE-Promoters/Enhancers in den Säugerexpressionsvektor pCB6 eingesetzt (Brewer, C. B. Methods in Ceil Biology 43: 233-245, 1994), um den pCMV-NTN-3-1-Vektor unter Verwendung dieser Stellen zu bilden.
Zur Expression von rekombinantem Protein in E. Coli wurde der reife Kodierungsabschnitt von Maus-Neurturin durch PCR amplifiziert, wobei ein Primer, der die ersten sieben Kodons von der reifen Kodierungssequenz (5'-GACCATATGCCGGGGGCTCGGCCTTGTGG) (SEQ ID NO. 65) enthielt, und ein Primer, welcher die letzten fünf Kodons und das Stopkodon 5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC (SEQ ID NO: 66) enthielt, unter Verwendung eines Fragments, enthaltend das Murin-Neurturin-Gen als Templat, verwendet wurde, wobei PCR-Parameter verwendet wurden: 94°C für 30 Sekunden; 60°C für 15 Sekunden und 68°C für 90 Sekunden für 25 Zyklen mit 5% DMSO, welches zu der Reaktion zugesetzt wurde. Das amplifizierte Produkt wurde in die Eco RV-Stelle von BSKS subkloniert, die Nucleotid-Sequenz wurde verifiziert, und dieses Fragment wurde anschließend in dem Expressionsvektor pET-30a (Novagen, Madison, WI) unter Verwendung einer Nde 1-Stelle (5'-Ende) und einer Eco R1-Stelle (3'-Ende) transferiert. Der pET-Neurturin-Vektor (pET-NTN) kodiert für ein Initiator-Methionin vor der ersten Aminosäure des reifen Maus-Neurturin-Proteins, vorausgesagt auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz von Neuturin, welche aus dem konditionierten CHO-Zellenmedium gereinigt wurde.
Beispiel 8
Dieses Beispiel verdeutlicht die vorübergehende Transfizierung von NIH3T3-Zellen mit dem Neurturin-Expressions-Vektor pCMV-NTN-3-1, und dass das Produkt der Genom-Sequenz in Beispiel 7 biologisch aktiv ist.
Um zu zeigen, dass geklonte Neurturin-cDNA ausreichte, um die Synthese von biologisch wirksamem Neurturin hervorzurufen, wurde das pCMV-NTN-3-1-Plasmid in NIH3T3-Zellen vorübergehend eingefügt, wobei das Lipofectamin-Verfahren der Transfizierung verwendet wurde. Die NIH3T3-Zellen wurden bei einer Dichte von 400.000 Zellen pro Well (34,6 mm -Durchmesser) auf 6 Well-Platten (Corning, Corning, NY) 24 Stunden vor der Transfizierung gegeben. DNA-Liposom-Komplexe wurden hergestellt und zu den Zellen gemäß dem Herstellerprotokoll zugesetzt, wobei 1,5 μg CMV-Neurturin-Plasmid-DNA (isoliert und gereinigt unter Verwendung einer Qiagen- (Chatsworth, CA) Tip-500-Säule gemäß dem Herstellerprotokoll) und 10 μl Lipofectamin-Reagenz (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) in 1:1 DME/F12-Medium, enthaltend 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin und 5 ng/ml Natriumselenit (Sigma, St. Louis, MO), verwendet wurde. Fünf Stunden nach der Zugabe von DNA-Liposom-Komplexen in 1 ml Medium pro Well wurden 1 ml DME-Medium, enthaltend 20% Kalbsserum, zu jedem Well zugesetzt. 24 Stunden nach der Zugabe der DNA-Liposom-Komplexe wurden die obigen 2 ml Medium durch 1 ml DME-Medium, enthaltend 10% Kalbsserum, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penizillin, 100 μ/ml Streptomycin und 25 μg/ml Heparin, ersetzt. Die Zellen wurden zusätzliche 24 Stunden inkubiert, bevor das konditionierte Medium geerntet, zur Entfernung von zellulärer Debris zentrifugiert und eingefroren wurde.
Als Kontrolle wurden NIH3T3-Zellen wie oben transfiziert, wobei 1,5 μg CMV-Neo-Expressions-Plasmid (enthaltend keinen cDNA-Einsatz) anstelle von 1,5 μg CMV-Neurturin-Plasmid verwendet wurden. Das konditionierte Medium aus NIH3T3-Zellen, welches mit entweder Kontrollplasmid oder CMV-Neurturin-Plasmid transfiziert worden ist, wurde durch direkte Zugabe zu dem SCG-Kulturmedium zu der Zeit der NGF-Deprivation untersucht. Die Zugabe von 0,25 ml konditioniertem Medium aus CMV-Neurturin-transfektierten Zellen förderten 70% Überleben der sympathischen Neuronen, und ein Überleben von > 90% konnte mit 0,45 ml dieses konditionierten Mediums erhalten werden. Es konnte keine signifikante überlebensfördernde Wirkung in dem konditionierten Medium der transfizierten Kontroll-NIH3T3-Zellen detektiert werden.
Beispiel 9
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, welche stabil mit Neurturin-cDNA transformiert wurden.
DG44-Zellen, ein Eierstockzellen-Derivat des chinesischen Hamsters, dem es an Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) mangelt (Urlaub et al. Cell. 3: 405-412, 1983, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist), wurden mit Expressionsplasmid (pCMV-NTN-3-1) und einem DHFR-Expressionsplasmid (HLD) (McArthur, und Stanners J. Biol. Chem. 266: 6000-6005, 1991) stabil co-transfiziert.
Am Tag 1 würden DG44-Zellen in 1 × 10⁶ Zellen pro 1.0 cm Platte in Ham's F12-Medium mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS) platziert. Diese Dichte darf nicht überschritten werden, oder die Zellen würden überwuchern, bevor das Selektionsmedium am Tag 5 zugesetzt wird.
Am Tag 2 wurden die Zellen mit einem 9:1-Verhältnis von pCMV-NTN zu DHFR-Expressionsplasmid unter Verwendung der Calciumphosphatmethode (10 μg DNA/10 cm Platte) (Chen und Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987) transfiziert.
Am Tag 3 wurden die transfizierten Zellen mit Ham's F12-Medium und mit 10% FCS gefütterten Ham's F12 gewaschen.
Am Tag 5 wurden die Zellen mit MEM-alpha-Medium gewaschen und mit Selektionsmedium, welches MEM-alpha mit 10% FCS und 400 μg/ml G418 darstellt, gefüttert. Die Zellen wurden in dem Selektionsmedium gehalten und alle 4 Tage gefüttert. Die Kolonien begannen ungefähr 14 Tage nach der Transfizierung sichtbar zu werden. Die in dem Selektionsmedium wachsenden Kolonien wurden anschließend in eine 24-Well-Platte überführt und am nächsten Tag trypsinisiert, um die Zellen zu dispergieren. Man ließ die Zellen in entweder 24-Well- oder 6-Well-Platten zur Konfluenz zusammenwachsen, um die Zellen hinsichtlich der Expression von rekombinantem Protein zu screenen. Die Expression von Neurturin wurde in 10 Klonreihen bestimmt, und zwei hochexprimierende Reihen wurden unter Verwendung des SCG-Überlebensassays detektiert. Diese Klonreihen wurden vermehrt, und die Expression in diesen ausgewählten Zellreihen wurde durch Selektion in 50 mM Methotrexat (MTX) amplifiziert. Für die Selektion in MTX ließ man Zellen bis auf 50% Konfluenz in einer 150 cm²-Flasche in dem Selektionsmedium wachsen. Das Medium wurde nach MEM-alpha, enthaltend 50 nM MTX-Konzentration geändert (es war nicht notwendig, G418 während der MTX-Amplifikation zu verwenden). Nach Platzieren in 50 mM MTX starb die Mehrzahl der Zellen ab, und Kolonien der resistenten Zellen traten in 1 bis 2 Wochen erneut auf. Dann wurden die Zellen trypsinisiert, um die Kolonien zu dispergieren, und aufgeteilt, wenn die Zellen die Konfluenz erreichten. Die Zellen erreichten letztendlich dieselbe Wachstumsrate wie vorher. Die ausgewählten Zellen wurden hinsichtlich der Expression von rekombinantem Protein gescreent. Ein 2-3-facher Anstieg in der Expression wurde nach der Selektion in 50 mM MTX beobachtet. Gefrorene Stocks wurden gehalten für Zelllinien, die von der ursprünglichen Selektion und der 50 mM MTX-Selektion erhalten wurden. Eine weitere Selektion konnte in zunehmendem MTX fortgesetzt werden, bis erwünschte Expressionsniveaus erhalten wurden.
Unter Verwendung des obengenannten Verfahrens konnten als DG44CHO5- 3(G418) (pCMV-NTN-3-1) und DG44CHO5-3 (50nMMTX) (pCMV-NTN-3-1) identifizierte Zellen isoliert werden. Die Zellen des DG44CHsO5-3 (50nMMTX) (pCMV-NTN-3-1)-Stammes exprimierten Mengen von ungefähr 100 μg biologisch aktives Protein pro Liter konditioniertem Medium, wie es durch direkte Untersuchung des konditionierten Mediums in dem SCG-Assay gemäß dem Verfahren im Beispiel 1 bestimmt wurde.
Beispiel 10
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung des pJDM1926-Expressionsvektors und die Herstellung von mit diesem Vektor stabil transformierte E. Coli.
Das Neurturin-cDNA-Fragment, welches für das reife Murin-Neurturin-Protein kodiert (d.h. 5 Aminosäuren oberhalb (PGARP) des, ersten Gerüst-Cys-Restes), wur de in den pET-Expressionsvektor pET-30a an den Nde I- und Bam H1-Stellen kloniert. Um die Expressionsanteile zu verbessern, wurde die Nucleotidsequenz derartig geändert, dass von Bakterien bevorzugte Codons gegen die natürlich auftretenden Murin-Codons ausgetauscht wurden. Das von E. Coli bevorzugte Codon Neurturin war wie in SEQ ID NO: 79 dargestellt (5'-ATGCCGGGTGCTCGTCCGTGCGGCCTGCGTGAACTGGAACTGGAAGTTCGTGTTTCTGAACTGGGTCTGGGTTACACTTCTGACGAAACTGTTCTGTTCCGTTACTGCGCTGGTGCTTGAAGCTGCTATCCGTATCTACGACCTGGGTCTGCGTCGTCTGCGTCAGCGTCAGCGTCGTCGTGTTCGTCGTGAACGTGCTCGTGCTCACCCGTGCTGCCGTCCGACTGCTTACGAAGCGAAGTTTCTTTCCTGGACGTTCACTCTCGTTACCACACTCTGCAGGAACTGTCTGCTCGTGAATGCGCTTGCGTTTAA). Keine Veränderung in der Aminosäuresequenz resultierte aus diesen Veränderungen. Um dieses künstliche Neurturin-Gen herzustellen, synthetisierten wir eine Reihe von 4 überlappenden Oligonucleotiden:

M2021: (5'-CATATGCCGGGTGCTCGTCCGTGCGGCCTGCGGCCTGCGTGAACTGGAAGTTCGTGTTTCTGAACTGGGTCTGGGTTACACTTCTGACGAAACTGT, SEQ ID NO: 80);
M2025: (5'-CTGACGCAGACGACGCAGACCCAGGTCGTAGATACGGATAGCAGCTTCGCATGCACCAGCGCAGTAACGGAACAGAACAGTTTCGT, SEQ ID NO: 81);
M2032: (5'-CTGCGTCAGCGTCGTCGTGTTCGTCGTGAACGTGCTCGTGCTCACCCGTGCTGCCGTCCGACTGCTTACGAAGACGAACTTTCTTTC, SEQ ID NO: 82);
M2033: (5'-CGGATCCTTAAACGCAAGCGCATTCACGAGCAGACAGTTCCTTGCAGAGTGTGGTAACGAGAGTGAACGTCCAGGAAAGAAACTTCG, SEQ ID NO: 83).

Die Oligonucleotide entsprachen der Sequenz des reifen Neurturins. Diese Primer wurden aneinander gebunden unter Bildung einer linearen Sequenz, mit Klenow-Fragment verlängert, kinasiert und in das pBS-KS-Plasmid gebunden. Diese Bindungsreaktion wurde als Templat in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von M2021 und M2033 unter Verwendung der folgenden Parameter eingesetzt (94°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden × 30 Zyklen). Das PCR-Produkt (entsprechend der SEQ ID NO: 79) wurde in die EcoRV-Stelle des BSKS-Plasmids subkloniert und sequenziert, um sicherzustellen, dass es keine Mutationen enthielt. Die Neurturin-Sequenz wurde anschließend aus diesem Vektor unter Verwendung von NdeI und Bam H1 ausgeschnitten und in die Nde I (5') und Bam H1 (3') Stellen des bakteriellen Expressionsvektors pET30a (Novagen, Madison, WI) kloniert. Ein Histidin-Tag, bestehend aus 6 His-Resten, gefolgt von einer Enterokinase-Stelle, wurde oberhalb des Initiators Methionin durch Klonierung der Oligonucleotide M3199 (5'- TAGCCTTGTCGTCGTCGTCATGATGATGATGATGGTGCA, SEQ ID NO: 84) und M3197 (5'-TATGCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACGACAAGGC, SEQ ID NO: 85) in die Nde I-Stelle platziert. Dieses resultierte in der Herstellung eines Neurturin-Proteins, welches einen Amino-terminalen Tag, bestehend aus 6 Histidin-Resten, gefolgt direkt von einer Enterokinase-Stelle, aufwies.
Das resultierende Plasmid (pJDM1926) wurde in den E. Coli-Stamm BL21 (DE3) eingesetzt. Um Neurturin zu bilden wurden diese plasmidaufweisene Bakterien 16 Stunden lang wachsen gelassen, geerntet und unter Verwendung von 6M Guanidin-HCl, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 8,0 lysiert, und rekombinantes Neurturin-Protein wurde aus diesen Lysaten durch Chromatographie über einen Ni-NTA-Harz (Qiagen) aufgereinigt. Das Protein wurde unter Verwendung von 3 Säulenvoluminapuffer E (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 4,5) eluiert. Das Neurturin wurde anschließend durch Dialyse in Renatuierungspuffer (0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 8,3, 0,15 M NaCl, 3 mM Cystein, 0,02% Tween-20, 10% Glycerin), enthaltend abnehmende Konzentrationen an Harnstoff (beginnend mit 4 M für 16 Stunden, gefolgt von 2 M für 16 Stunden, 1 M für 72 Stunden und 0,5 M für 16 Stunden), renaturiert. Die Neurturin-Konzentration wurde anschließend unter Verwendung der Bradford-Methode (BioRad) bestimmt und bei 4°C gelagert.
Beispiel 11
Dieses Beispiel verdeutlicht die Expression von Neurturin in verschiedenen Geweben.
Es wurde eine Studie der Neurturin- und GDNF-Expression in Rattenembryo-Geweben (E10, Tag 10 nach der Empfängnis), neonatalen Geweben (P1, postnataler Tag 1) und erwachsenen Geweben (> 3 Mos) unter Verwendung von semiquantitativer RT/PCR durchgeführt (Estus et al., J. Cell. Biol. 127: 1717-1727, 1994). Die RNA-Proben wurden aus verschiedenen Geweben erhalten, und PCR-Produkte wurden entweder durch Autoradiographie nach der Inkorporierung von α-³²P-dCTP in der PCR und Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel (6) oder durch Ethidiumbromid-Färbung der DNA nach der Elektrophorese auf Agarosegelen (Tabellen 3 und 4) detektiert. Das Neurturin-Fragment mit 101 Basenpaaren wurde unter Verwendung des Vorwärts-Primers CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG (SEQ ID NO: 67) und des Rückwärts-Primers TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (SEQ ID NO: 68) erhalten, und das GDNF-Fragment mit 194 Basenpaaren wurde unter Verwendung des Vorwärts-Primers AAAAATCGGGGGTGYGTCTTA (SEQ ID NO. 69) und des Rückwärts-Primers CATGCCTGGCCTRCYTTGTCA (SEQ ID NO: 70) erzielt.
Es wurde keine Neurturin- oder GDNF-mRNA im frühesten embryonalen Alter (embryonaler Tag 10, E10), welches erfasst wurde, detektiert.
Bei Neugeborenen (postnataler Tag 1, P1) wurden beide Transkripte/Kopien in vielen Geweben exprimiert, obwohl Neurturin dazu neigte, eine größere Expression in den meisten Geweben zu zeigen, als es bei GDNF der Fall war (siehe Tabelle 3). Tabelle 3
Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, wurden Unterschiede in den Gewebeverteilungen von Neurturin und GDNF verzeichnet. Insbesondere wurde kein GDNF in Leber und Thymus detektiert, worin eine Neurturin-Expression detektiert wurde, und kein Neurturin wurde in dem Ischiasnerv detektiert, wo GDNF detektiert wurde.
Neurturin- und GDNF-mRNA wurden in vielen Geweben in dem erwachsenen Tier detektiert, allerdings war das gewebespezifische Muster der Expression für diese zwei Gene äußerst unterschiedlich (Tabelle 4, 5). Tabelle 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, wurde gefunden, dass Neurturin im Gehirn und Rückenmark sowie im Blut und Knochenmark exprimiert wurde, wo kein GDNF detektiert wurde. Das Expressionsniveau von Neurturin im Gehirn und Blut war jedoch geringer als das, welches in neonatalem Gewebe detektiert wurde.
Neurturin wurde ebenso in frisch isolierten Rattenbauchfell-Mastzellen hoch exprimiert, wohingegen GDNF nur eine geringe oder keine Expression zeigte.
Beispiel 12
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Antiseren gegenüber Neurturin durch Immunisieren von Kaninchen mit einem Neurturinpeptid.
Die Peptidsequenz, welche den Aminosäuren 73-87 des reifen Murin-Neurturin-Proteins entsprach, wurde synthetisiert und an Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH) gekoppelt, wie bereits früher beschrieben wurde (Harlow und Lane, Antibodies: a laboratory manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY., Seiten 72-81). Das KLH-gekoppelte Peptid wurde an die Caltag, Inc. geschickt, und ein jeder von zwei Hasen wurden immunisiert. Die Immunisierung wurde durch subkutane Injektion an 7-10 Stellen durchgeführt. Die erste Injektion erfolgte mit 150 μm KLH-gekoppeltem Peptid, welches in 0,5 ml Salzlösung resuspendiert wurde und mit 0,5 ml Freundschem kompletten Adjuvants emulgiert wurde. Es wurden Boost-Injektionen 4 Wochen nach der ersten Injektion begonnen und einmal in 7 Tagen wie oben für insgesamt 5 Injektionen durchgeführt, außer dass 100 μg KLH-gekoppeltes Peptid und Freundsches inkomplettes Adjuvants verwendet wurde. Serumproben wurden 1 Woche nach dem fünften Boost gesammelt.
Ein gepooltes Volumen von 20 ml Serum, welche von beiden Kaninchen eine Woche nach der fünften Injektion gesammelt wurde, wurde aufgereinigt. Für die Aufreinigung wurde eine Peptidaffinitätssäule durch Kupplung des obengenannten Peptids and Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B gemäß dem Herstellerprotokoll (Pharmacia Biotech) präpariert. Das Serum wurde 10-fach in 10 mM Tris pH 7,5 Puffer verdünnt und durch behutsames Schwenken 16 Stunden lang. bei 4°C mit 0,5 ml Peptid-Agarose-Matrix, enthaltend 5 mg gekoppeltes Peptid, gemischt. Die Matrix wurde auf eine Säule gegeben, mit 5 ml 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl gewaschen, mit 5 ml 10 mM Tris pH 7,5-Puffer, enthaltend 0,4 M NaCl, gewaschen und mit 5,5 ml 100 mM Glycin pH 2,5-Puffer eluiert. Ein zehntel Volumen von 1,0 M Tris pH 8,0 Puffer wurde zu dem Eluat direkt nach der Elution zugesetzt, um den pH zu neutralisieren. Das Glycin-Eluat wurde über Nacht gegenüber 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl dialysiert.
Die Affinitäts-gereinigten Antikörper wurden in einem Western Blot verwendet, um die spezifische Erkennung des rekombinanten Neurturin-Proteins zu zeigen. 10 ml konditioniertes Medium, gesammelt aus DG44CHO5-3 (G418) (pCMV-NTN-3-1)- Zellen, wurden über SP-Sepharose, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, und die Proteine wurden auf einem reduzierenden SDS-PAGE-Gel in dem Tricine-Puffer-System (Schagger und von Jagow Analytical Biochemistry 166: 368-479, 1987) elektrophoresiert. Die Proteine wurden an eine Nitrocellulose-Membran in 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,04% SDS, 17% Methanol bei 4°C 16 Stunden lang elektrogeblotted. Die Membran wurde mit den Affinitäts-gereinigten Anti-Neurturin-Peptid-Antikörpern und anschließend mit Meerettich-Peroxidase-gekoppelten Schaf-Anti-Kaninchen-IgG inkubiert (Harlow und Lane, supra, Seiten 498-510). Die gebundenen Antikörper wurden mit verstärkter Chemilumineszenz detektiert (ECL Kit, Amersham, Buckinghamshire, England). Die Anti-Neurturin-Antikörper erkannten ein einzelnes ungefähr 11,5 kD-Protein-Band in dem konditionierten Medium der DG44CHO5-3 (G418) (pCMV-NTN-3-1)-Zellen. Unter Verwendung dieser Anti-Neurturin-Antikörper konnte Neurturin-Protein in 10 ml konditioniertem Medium aus DG44CHO5-3 (G418) (pCMV-NTN-3-1)-Zellen detektiert werden, konnte allerdings nicht in 10 ml Medium, konditioniert mit DG44-Zellen detektiert werden, welche nicht mit dem Neurturin-Expressionsvektor transformiert worden waren.
Beispiel 13
Das folgende Beispiel verdeutlicht die Identifizierung von zusätzlichen Mitgliedern der GDNF/Neurturin-Gen-Subfamilie.
Die TGF-β-Superfamilie enthält derzeit über 25 unterschiedliche Genmitglieder (als Überblick siehe Kingsley, Genes and Deuelopment 8: 133-146, 1994). Die einzelnen Familienmitglieder zeigen unterschiedliche Homologiegrade miteinander auf, und nähere Subgruppen können innerhalb der Superfamilie durch phylogenetische Analyse unter Verwendung des Clustal V-Programms (Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191, 1992) und durch Bootstrap-Analyse von phylogenetischen Bäumen (Felsenstein, Evolution 39: 783-791, 1985) definiert werden. Neurturin ist ungefähr 40% identisch zu GDNF, allerdings weniger als 20% identisch zu jedem anderen Mitglied der TGF-β-Superfamilie. Mehrere Sequenzbereiche in. Neurturin können identifiziert werden (5), welche innerhalb der GDNF/Neurturin-Subfamilie, allerdings nicht innerhalb der TGF-β-Superfamilie hoch konserviert bzw. hoch erhalten sind. Diese erhaltenen Bereiche können wahrscheinlich eine Subfamilie kennzeichnen, die bisher unisolierte Gene enthält, welche nun unter Verwendung der erhaltenen Sequenzbereiche isoliert werden können, die durch die Entdeckung und Sequenzierung des Neurturin-Gens identifiziert wurden. Die Bereiche hoher Sequenz-Konservierung bzw. hohem Sequenzerhalt zwischen Neurturin und GDNF erlauben den Entwurf von entarteten bzw. degenerierten Oligonucleotiden, welche entweder als Sonden oder Primer verwendet werden können. Aminosäuresequenzen konservierter Bereiche wurden hierin identifiziert und umfassen Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu- Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa₁ Ser oder Thr ist, und Xaa₂ Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 33); Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₄-Gly-Xaa₅-Cys-Xaa₆-Xaa₇-Ala, worin Xaa₁ Thr oder Glu darstellt, Xaa₂ Val oder Leu ist, Xaa₃ Leu oder Ile darstellt, Xaa₄ Ala oder Ser ist, Xaa₅ Ala oder Ser darstellt, Xaa₆ Glu oder Asp ist und Xaa₇ Ala oder Ser darstellt (SEQ ID NO: 34); und Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa₁-Ala-Xaa₂-Xaa₃-Asp-Xaa₄-Xaa₅-Ser-Phe-Leu-Asp, worin Xaa₁ Thr oder Val oder Ile ist, Xaa₂ Tyr oder Phe darstellt, Xaa₃ Glu oder Asp ist, Xaa₄ Glu oder Asp ist und Xaa₅ Val oder Leu ist (SEQ ID NO: 35). Nucleotidsequenzen, welche eine Kodierungssequenz für die obengenannten konservierten Sequenzen oder Fragmente der obengenannten konservierten Sequenzen enthalten, können als Sonden verwendet werden. Beispielhafte Sonden- und Primer-Sequenzen, welche aus diesen Bereichen bzw. Abschnitten erstellt werden können, sind Primer 1, GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA (SEQ ID NO: 42), welcher für die Aminosäuresequenz Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr kodiert, worin Xaa₁ Ser oder Thr ist und Xaa₂ Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 33); Primer 2, TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGYGANKCNGC (SEQ ID NO: 43), welcher für die Aminosäuresequenz Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Ala kodiert, worin Xaa₁ Ala oder Ser darstellt, Xaa₂ Ala oder Ser ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 36); Primer 3, reverse GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTANCKRAA (SEQ ID NO: 44), welcher für die Aminosäuresequenz Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Ala kodiert, worin Xaa₁ Ala oder Ser darstellt, Xaa₂ Ala oder Ser ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 37); Primer 4, reverse TCRTCNTCRWANGCNRYNGGNCKCARCA (SEQ ID NO: 45), welcher für die Aminosäuresequenz Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa₁-Ala-Xaa₂-Xaa₃-Asp-Xaa₄ kodiert, worin Xaa₁ Ile oder Thr oder Val darstellt, Xaa₂ Try oder Phe ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 38); Primer 5, reverse TCNARRAANSWNAVNTCRTCNTCRWANGC (SEQ ID NO: 46, welcher für die Aminosäuresequenz Ala-Xaa₁-Xaa₂-Asp-Xaa₃-Xaa₄-Ser-Phe-Leu-ASp kodiert, worin Xaa₁ Tyr oder Phe darstellt, Xaa₂ Glu oder Asp ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Val oder Leu ist (SEQ ID NO: 39); Primer 6, GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTG (SEQ ID NO: 47), welcher für die Aminosäuresequenz Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys kodiert, worin Xaa₁ Glu oder Thr darstellt, Xaa₂ Leu oder Val ist und Xaa₃ Ile oder Leu ist (SEQ ID NO: 40); Primer 7, GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGHGA (SEQ ID NO: 48), welcher für die Aminosäuresequenz Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₄-Gly-Xaa₅-Cys-Xaa₆ kodiert, worin Xaa₁ Glu oder Thr darstellt, Xaa₂ Leu oder Val ist, Xaa₃ Ile oder Leu ist, Xaa₄ Ser oder Ala ist, Xaa₅ Ser oder Ala ist und Xaa₆ Glu oder Asp ist. (SEQ ID NO: 41).
Die obigen Sequenzen können als Sonden zum Screenen von Bibliotheken für Genomklone oder Primer zur Amplifizierung von Genfragmenten aus Genom-DNA oder Bibliotheken von Genomklonen oder von revers-transkribierter cDNA unter Ver wendung RNA-Templaten aus einer Vielzahl von Geweben verwendet werden. Genom-DNA oder Bibliotheken von Genom-Klonen können als Template verwendet werden, weil die Intron/Exon-Strukturen von Neurturin und GDNF erhalten sind und die kodierenden Sequenzen für die reifen Proteine nicht durch Introns unterbrochen sind.
Ein entartetes Oligonucleotid kann als eine Mischung von Oligonucleotiden synthetisiert werden, welche sämtliche der möglichen Nucleotidsequenzen enthält, die für die konservierte Aminosäuresequenz kodieren. Um die Anzahl unterschiedlicher Oligonucleotide in einer entarteten Mischung zu vermindern, kann eine Inosin-Base in die Synthese an Positionen eingefügt werden, wo sämtliche vier Nucleotide möglich sind. Die Inosin-Base bildet Basenpaare mit jedem der vier normalen DNA-Basen, welche weniger stabilisierend sind als AT- und GC-Basenpaare, welche allerdings ebenso weniger destabilisierend sind als Fehlordnungen zwischen den normalen Basen (d. h. AG, AC, TG, TC).
Um Familienmitglieder zu isolieren, kann ein obiger Primer mit ³²P unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase endgelabelt werden und an Bibliotheken humaner Genomklone gemäß Standardverfahren hybridisiert werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung von Familienmitglieds-Genen wäre die Verwendung verschiedener Kombinationen der obigen entarteten Primer als Primer in der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Genom-DNA als ein Templat. Als ein Beispiel kann Primer 2 (SEQ ID NO: 43) mit Primer 4 (SEQ ID NO: 45) in der PCR mit 1 μg Humangenom-DNA und zyklierenden Parametern von 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden verwendet werden. Die PCR-Bedingungen sind nur beispielhaft, und der Fachmann wird leicht erkennen, dass ein Bereich geeigneter Bedingungen verwendet oder optimiert werden kann, wie unterschiedliche Temperaturen und variierende Salzkonzentrationen in dem Puffermedium und ähnliches. Es ist bevorzugt, dass DMSO zu der PCR-Reaktion in einer finalen Konzentration von 5% zugesetzt wird, da gefunden wurde, dass dieses für die Amplifizierung dieses Abschnitts des Neurturin-Gens notwendig ist. Die PCR-Reaktion, wenn sie auf einem Agarose-Gel laufen gelassen wird, sollte Produkte in dem Größenbereich von 125-150 Basenpaaren enthalten, da eine Ein-Aminosäure-Spalte in die Neurturin-Sequenz eingefügt wird, wenn sie mit GDNF ausgerichtet/abgeglichen wird, und folglich können die Familienmitgliedsgene ebenso einen leicht variablen Abstand zwischen den konservierten Sequenzen der Primer 2 und 4 enthalten. Die PCR-Produkte in dem Bereich von 125 bis 150 Basenpaaren sollten mehrfach amplifizierte Genprodukte enthalten, einschließlich GDNF und Neurturin sowie bisher unisolierte Familienmitglieder. Um die Sequenzen dieser Produkte zu identifizieren, können sie gelgereinigt und in das Bluescript-Plasmid (Stratagene) ligiert werden und anschließend in den XL1-Blue E. Coli-Wirtsstamm (Stratagene) transformiert werden. Die Bakterienkolonien, welche einzelne Subklone enthalten, können für die Isolierung herausgegriffen und auf Nitrocellulose-Filter in zwei Repliken platiert werden. Jeder der Replikfilter kann mit einer Oligonucleotidsonde nach entweder einzelner GDNF- oder einzelner Neurturin- oder einzelner Persephin-Sequenz in dem amplifizierten Abschnitt gescreent werden. Subklone, welche weder an GDNF noch an Neurturin oder Persephin hybridisieren, können sequenziert werden und, sofern sie als die bisher unisolierten Familienmitglieder kodierend gefunden werden, kann die Sequenz zur Isolierung der cDNA-Klone voller Länge und der Genomklone verwendet werden, wie es für Neurturin vorgenommen wurde (Beispiel 7). Ein ähnliches Verfahren wurde zur Isolierung neuer Genmitglieder (GDF-3 und GDF-9) der TGF-β-Superfamilie auf der Basis der Homologie zwischen den bisher identifizierten Generi verwendet (McPherron, J. Biol. Chem. 268: 3444-3449, 1993).
Die vorliegenden Erfinder glauben, dass der am meisten bevorzugte Weg zur Isolierung der Familienmitgliedergene die Anwendung des obengenannten PCR-Verfahrens als Screening-Verfahren zur Isolierung der einzelnen Familienmitglieder-Genomklone aus einer Bibliothek sein kann. Dieses liegt daran, weil nur ein Exon für den Kodierungsabschnitt sowohl von reifem Neurturin als auch von GDNF existiert. Wenn beispielsweise die obengenannte PCR-Reaktion mit den Primern 2 und 4 Produkte geeigneter Größe unter Verwendung von Humangenom-DNA als Templat bildet, kann dieselbe Reaktion durchgeführt werden, wobei als Templat Pools von Genomklonen in dem P1-Vektor gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren verwendet werden, beispielsweise jenes, das für die Isolierung von Neurturin-Humangenomklonen verwendet wurde (Beispiel 7). Pools bzw. Datensammlungen, welche das Neurturin-Gen in dieser Bibliothek enthalten, wurden früher identifiziert, und GDNF-enthaltende Pools können leicht durch Screening mit GDNF-spezifischen Primern identifiziert werden. Folglich werden Nicht-Neurturin-, Nicht-GDNF-Pools, welche ein Produkt der richtigen Größe bilden unter Verwendung der entarteten Primer, leicht als die bisher unisolierten Familienmitglieder erkannt werden. Die PCR-Produkte, welche aus diesen Pools gebildet werden, können direkt unter Verwendung automatischer Sequenzierer sequenziert werden, und Genomklone können durch weitere Unterteilung und Screenen der gepoolten Klone als ein von Genom Systems, Inc. angebotener Standardservice isoliert werden.
Beispiel 14
Dieses Beispiel verdeutlicht die Präparation einer transgenen Maus, welche Neurturin überexprimiert.
Um die potentielle Rolle von Neurturin in einem sich ändernden Metabolismus und die Fettgewebeakkumulation zu bestimmen, wurden die Konsequenzen von einer Neurturin-Überexprimierung bei einer Vielzahl von Geweben durch Generierung von transgenen Mäusen, in welchen Neurturin in Muskeln über den Myogenin-Promoter exprimiert wurde, evaluiert. Ein Konstrukt wurde generiert, in welchem die Murin-Neurturin-cDNA in die Bam H1-Stelle kloniert wurde, welche zwischen dem Murin-Myogenin-Promoter (nt –1565 bis +18) (Edmondson et al., Mol. Cell. Biol. 12: 3665-3677, 1992) und der 3'-Verbindung des menschlichen Wachstumshormons und den Polyadenylierungs-Signalen (nt 500 bis 2650) liegt. Ein Nucleotidsequenzieren dieses Konstrukts wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass es korrekt generiert wurde. Das Plasmidrückgrat wurde von dem Myogenin/Neurturin/GH-Fragment unter Verwendung von Xba I und Kpn I ausgeschnitten, und das Fragment wurde gelgereinigt. Das gelgereinigte Fragment wurde in Oozyten der B157-Maus mittels Standardverfahren injiziert (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Hogan, B., Beddington, R., Constantini, F. and Lacy, E., Herausgeber; Cold Spring Harbor Press, 1994). Stammmäuse (founder mice), welche das Myogenin/Neurturin-Transgen (MyoNTN) enthielten, wurden mittels PCR identifiziert und verknüpft, um die transgene Linie zu erweitern. Zehn Stammmäuse wurden erhalten, und transgene Linien wurden von 3 von diesen erstellt.
Um festzustellen, ob Neurturin exprimiert wurde, wurden einige der MyoNTN F1-Mäuse getötet, und ein Bioassay wurde durchgeführt. Die Muskeln der hinteren neonatalen Mausgliedmaße von transgenen Tieren wurden entnommen, und es wurde gezeigt, dass in dem SCG-Assay ein Überleben gefördert wurde, wohingegen es bei den nicht-transgenen Wurfgeschwistern nicht der Fall war. Eine histologische Analyse zeigte viel höhere Mengen an subkutanem Fett (12) und Fettakkumulation in der Leber (13), was nahe legt, dass eine Neurturin-Überexprimierung den Metabolismus der Tiere derartig beeinflusst, dass zusätzliches Fettgewebe gebildet wird.
Beispiel 15
Dieses Beispiel zeigt die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAP-Kinase) durch die Neurturin- oder die GDNF-Behandlung von sympathischen Neuronen.
Die Aktivierung des MAP-Kinase-Pathways wurde mit den tropischen Effekten von NGF in Verbindung gebracht (Cowley et al., Cell. 77: 841-852, 1994). Daher testeten wir die Fähigkeit von Neurturin und GDNF zur Aktivierung der extrazellulären signalregulierten Kinase-Isoformen, ERK-1 und ERK-2, von MAP-Kinase (MAPK) in sympathischen Neuronen unter Verwendung eines für phosphorylierte MAP-Kinase spezifischen Antikörpers und eines zur Erkennung von sowohl phosphorylierten als auch von nicht-phosphorylierten Isoformen fähigen Antikörpers, wobei die nicht-phosphorylierte Isoform als Kontrolle für die Gesamtmenge von ERK-1 und ERK-2, welche auf das Gel geladen wurde, diente.
Die zuerst abgetrennten Kulturen von Neuronen aus den höheren Cervicalganglien wurden wie oben in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Sechs Tage alten Kulturen wurde NGF 12 Stunden lang entnommen/vorenthalten und anschließend mit Neurturin, GDNF oder NGF behandelt. Fünf Minuten nach der Behandlung wurden die Kulturen direkt in Laemmli-Probenpuffer lysiert, 5 Minuten gekocht und SDS-PAGE unterzogen, sowie in die in Beispiel 5 verwendeten PVDF-Membranen überführt. Die MAPK-Aktivierung wurde durch mit einem phospho-spezifischen MAPK-Antikörper (14a) durchgeführten Westernblots, gefolgt von Strippen und erneutem Durchführen mit einem Kontroll-MAPK-Antikörper, welcher sowohl phosphorylierte als auch nicht-phosphorylierte ERK-1 und ERK-2 erkennt (14b), unter Verwendung des PhosphoPlus MAPK Antikörperkits (New England BioLabs) gemäß den Herstellerangaben bestimmt.
Linie 1 zeigt 2 ng phosphoryliertes ERK-2-Protein (P-ERK-2); Linie 2 zeigt 2 ng nicht-phosphoryliertes ERK-2-Protein; und Linien 3-6 zeigen ein Lysat von sympathischen Neuronen, behandelt mit 50 ng/ml NGF, kein Faktor (Kontrolle), 50 ng/ml Neurturin oder 50 ng/ml GDNF.
Der für phosphorylierte MAP-Kinase spezifische Antikörper detektierte phosphoryliertes ERK-1 und ERK-2, wobei die Behandlung mit Neurturin, GDNF oder NGF (14a) folgte. Dieses zeigte, dass sowohl Neurturin als auch GDNF, wie NGF, die ERK-1- und ERK-2-Isoformen der MAP-Kinase in sympathischen Neuronen aktivierte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die neue Subfamilie von Faktoren bei denselben spezifischen Signalübertragungs-Pathways, welche von NGF und anderen Neurotrophinen verwendet werden, durch Wechselwirken mit einer spezifischen Klasse von Rezeptorproteinen wirkt.
Beispiel 16
Dieses Beispiel zeigt die Differentiation von Neuroblastom-Zellen durch Behandlung mit Neurturin und die Aktivierung von MAP-Kinaseaktivität durch Neurturin und GDNF.
Neuroblastom-Zelllinien wurden in Kultur bei subkonfluenten Dichten in RPMI-Gewebekulturmedien gehalten, versehen mit 10% fötalem Kalbserum, und zweimal pro Woche plattiert. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten am Tag 1 bei einer Dichte von 5 × 10³/cm² plattiert. Am Tag 2 und danach innerhalb von 3 Tagen wurden die Zellen mit 50 mg/ml Neurturin behandelt und anschließend am Tag 3 mikroskopisch untersucht. Während unbehandelte Zellen abgerundet und in ihrer Erscheinung blastartig waren, entwickelten behandelte Zellen eine neuronal-ähnliche Morphologie mit ausgeprägten Neuriten, was eine Zellreifung und -differentiation anzeigt (15A und 15B).
Bei der Evaluierung der Wirkung von Neurturin auf MAP-Kinaseaktivität in Neuroblastom-Zellen wurden Zellen (NSH-Neuroblastom-, NGP-Neuroblastom- oder SY5Y-Neuroblastom-Zellen) auf 6-Well-Platten plattiert, und man ließ sie für verschiedene Experimente eine Konfluenz erreichen, was ungefähr 2 bis 3 Tage für die naiven Zellen erforderte. Nicht-naive Zellen wurden bei subkonfluenten Dichten mit Retinolsäure (10 μM) 3 Tage lang behandelt. Vor der Stimulierung mit Faktoren wurden die Zellen 2 Stunden in Niedrigserum-Medien (0,5%) inkubiert. Die Zellen wurden 5 Minuten nach der Zugabe der angegebenen Faktoren in SDS-Laemmli-Puffer für die SDS-PAGE entnommen und anschließend wie in Beispiel 15 für die Phospho-MAPK's immunogeplottet.
Wie in den 16a, 16b und 16c gezeigt ist, aktivierte Neurturin (NTN) und GDNF zusammen NGF die ERK-1- und ERK-2-Isoformen der MAP-Kinase in SKNSH-Neuroblastomzellen (naiv), NGP-Neuroblastom-Zellen (Ga tx) und SY5Y-Neuroblastom-Zellen (RX tx). Zum Vergleich zeigten alle drei Zelltypen eine Phosphorylierung der MAP-Kinase-Isoformen bei Behandlung mit dem Kinaseaktivator PMA.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Neurturin und GDNF in der Förderung der Differentiation in Tumorzellen wirksam sind und dadurch eine neue Behandlung von Neoplasmen und insbesondere eine neue Behandlung für Neuroblastome zur Verfügung stellen.
Beispiel 17
Dieses Beispiel zeigt den retrograden Transport von Neurturin in Neuronen des Spi nalganglions (dorsal root ganglia; DRG). Neurturin und GDNF wurden mit Na¹²⁵I und Lactoperoxidase unter Verwendung der Verfahren von Marchalonis (Biochem. Journal 113: 299-305, 1969) auf ähnliche spezifische Aktivitäten (0.6 × 10⁵ cpm/ng) iodiert. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung der folgenden Mengen durchgeführt: 1 oder 5 μg Protein in 36 λ von 0,2 M NaPO₄-Puffer bei pH 6,0, 5-10 λ von Na¹²⁵I (Amersham, 1mCi/10 λ) und 1 λ von einer 1:103-Verdünnung von H₂O₂ (30%) in einen 0,1 M NaPO₄-Puffer bei pH 6,0. Die Reaktion wurde nach 15 Minuten durch Zugabe von 150 λ eines 0,1 M NaPO₄-Puffers, enthaltend 0,42 M NaCl und 0,1 M NaI bei pH 7,5, beendet.
Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (250-300 g) wurden anästhesiert. Der Ischiasnerv wurde exponiert, und ein kräftiger Druck wurde an den Nerv 30 Sekunden lang angelegt, um einen teilweisen Bruch hervorzurufen. Ein bis fünf λ (1 – 5 × 10⁶ cpm) des radiogelabelten Proteins wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100-fachem Überschuss an ungelabeltem Protein direkt in den Nerv injiziert. Vierzehn Stunden später wurden die Tiere transkardial mit gepufferter Salzlösung durchschwämmt, gefolgt von 10% Formalin (fix), die ipsilateralen und contralateralen L5-L3-DRG's wurden entfernt, unter Verwendung eines Beckman-gamma-Counters gezählt und tauchfixiert. Die DRG's wurden in Alkohol dehydriert, in Methylsalicylat aufgeklärt und in Paraffin eingebettet. Es wurden 10 μm Serienabschnitte erstellt, deparaffinisiert und mit Kodak NTB-2-Emulsion beschichtet und 4 bis 5 Wochen bei 4°C vor der Entwicklung ausgesetzt. Die mikroskopische Untersuchung der Autoradiographie-Aufnahmen zeigte die erwartete Akkumulierung der Radioaktivität in den Sensorneuronen.
Die Verabreichung von ¹²⁵I-Neurturin an den Ischiasnerv von erwachsenen Ratten resultierte in der spezifischen Akkumulierung von gelabeltem Protein 14 Stunden nach der Injektion (17). Diese Akkumulierung konnte durch einen 100-fachen Überschuss an ungelabeltem GDNF oder ungelabeltem Neurturin blockiert werden, was stark vermuten lässt, dass Neurturin und GDNF um denselben Rezeptor konkurrieren.
Hinterlegung des Stamms.
Der folgende Stamm wurde unter dem Budapester Abkommen bei der American Type Culture Collection, 1230 l Parklawn Drive, Rockville, MD hinterlegt. Das angegebene Aktenzeichen wurde nach erfolgreichem Lebensfähigkeitstest zugeordnet, und die erforderlichen Gebühren wurden bezahlt. Ein Zugang zu den Kulturen ist möglich während der Anhängigkeit der Patentanmeldung bei einer durch den beauftragten Commissioner gemäß 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 bestimmten Person. Alle Restriktionen hinsichtlich der Verfügbarkeit der Kulturen für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich zurückgenommen nach Erteilung des Patents auf der Basis der Anmeldung. Darüber hinaus werden die angegebenen Hinterlegungen für eine Dauer von dreizig (30) Jahren von dem Tag der Hinterlegung oder für fünf (5) Jahre nach dem letzten Antrag für die Hinterlegung oder für die durchsetzbare Lebenslauer des US-Patents aufrechterhalten, je nachdem, welche am längsten ist. Sollte eine Kultur nicht überlebensfähig werden oder unwiderruflich zerstört werden oder, im Fall von Plasmid-enthaltenden Stämmen, bei Verlust des Plasmids, wird sie durch eine lebensfähige Kultur ersetzt werden. Die hierin erwähnten hinterlegten Materialien sollen lediglich der Annehmlichkeit dienen und sollen keinesfalls für ein Durchführen der vorliegenden Erfindung vor dem Hintergrund der Beschreibung hierin erforderlich sein.
Im Hinblick darauf ist ersichtlich, dass die verschiedenen Vorteile der Erfindung erzielt werden und dass andere vorteilhafte Ergebnisse erhalten werden.
Da verschiedene Änderungen in den obengenannten Verfahren und Zusammensetzungen vorgenommen werden können, ohne von dem Umfang der Erfindung abzuweichen, soll sämtliche in der obengenannten Beschreibung und in den angehängten Zeichnungen enthaltene Information zur Verdeutlichung und keinesfalls in einer begrenzenden Weise interpretiert werden.

Claims

Wachstumsfaktor, umfassend eine Aminosäuresequenz, die eine Sequenz umfaßt, welche eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 85% mit SEQ ID NO: 31 aufweist, wobei die Sequenzübereinstimmung über mindestens 30 zusammenhängende Aminosäuren von SEQ ID NO: 31 berechnet wird.
Wachstumsfaktor nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz ein reifes menschliches Neurturin umfaßt, das eine Sequenz besitzt, welche eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 85% mit SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei die Sequenzübereinstimmung über mindestens 30 zusammenhängende Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 berechnet wird.
Wachstumsfaktor nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche ein Fragment der in SEQ ID NO: 7 angegebenen Aminosäuresequenz ist, die durch Spaltung an einer Konsensus-RXXR-Spaltstelle, worin R ein Argininrest ist und X irgendeinen Aminosäurerest bedeutet, erhältlich ist, wobei das Fragment eine Sequenz einschließt, welche eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 85% mit SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei die Sequenzübereinstimmung über mindestens 30 zusammenhängende Aminosäuren von SEQ ID NO: 7 berechnet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Wachstumsfaktor nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Isoliertes und gereinigtes Protein, umfassend ein Präpro-Neurturin wie in SEQ ID NO: 7 angegeben, eine Prä-Region von Neurturin wie in SEQ ID NO: 15 angegeben, eine Pro-Region von Neurturin wie in SEQ ID NO: 19 angegeben, oder eine Sequenz, welche eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 85% mit irgendeiner Sequenz hiervon aufweist, wobei die Sequenzübereinstimmung über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 19 berechnet wird.
Isolierter und gereinigter Wachstumsfaktor, welcher ein Vertreter der Neurturin-Familie ist, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche eine Sequenzübereinstimmung von 50% bis 85% mit SEQ ID NO: 31 aufweist, wobei die Sequenzübereinstimmung über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 31 berechnet wird, sowie eine Sequenzübereinstimmung von 30% bis 85% mit dem menschlichen GDNF aufweist.
Pan-Wachstumsfaktor, umfassend eine aktive Domäne aus einem Neurturin-Poly peptid, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, und eine aktive Domäne aus mindestens einem Wachstumsfaktor, welcher von einem Neurturin-Polypeptid, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiere, verschieden ist.
Isolierte und gereinigte Nucleinsäure, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche einen Wachstumsfaktor codiert, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 definiert ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 8, umfassend eine menschliche Neurturin-Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 9 angegeben ist.
Isolierte und gereinigte Nucleinsäuresequenz, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche ein Protein nach Anspruch 5 codiert.
Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 10, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 20 angegeben ist.
Vektor, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül, das regulatorische Elemente für die Expression umfaßt, welche mit einer Nucleinsäuresequenz, wie in irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11 definiert, funktionell verbunden sind.
Wirtszelle, welche mit dem Vektor aus Anspruch 12 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle ein Baculovirus-Expressionssystem ist.
DNA-Rekombinationsverfahren, umfassend: (a) das Subclonieren einer DNA-Sequenz, welche einen Wachstumsfaktor oder ein Protein codiert, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 7 definiert ist, in einen Expressionsvektor, der regulatorische Elemente umfaßt, welche erforderlich sind, um die DNA-Sequenz zu exprimieren; (b) das Transformieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor; (c) das Züchten der Wirtszelle in einer Wirtszellenkultur; und (d) das Ernten des Wachstumsfaktors und/oder der DNA-Sequenz aus der Wirtszellenkultur.
Isolierte und gereinigte Antikörper, welche an einen Wachstumsfaktor, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, oder ein Epitop hiervon spezifisch binden.
Verwendung eines Wachstumsfaktors, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 definiert, oder eines DNA-Moleküls, welches den Faktor codiert, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung einer Zelldegeneration oder -insuffizienz.
Verwendung von Zellen, welche einen Wachstumsfaktor exprimieren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 definiert ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung einer Zelldegeneration oder -insuffizienz in einem Individuum, umfassend das Implantieren der Zellen in ein solches Individuum.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe aus einem Patienten, umfassend das Umsetzen von gereinigten Antikörpern nach Anspruch 18 mit einem in der Probe anwesenden Wachstumsfaktor und das Nachweisen der Bindung der Antikörper an den Wachstumsfaktor.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe aus einem Patienten, umfassend das Nachweisen und/oder Quantifizieren der Anwesenheit einer mRNA, welche ein Neurturin nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.
Verfahren zum Nachweis von Veränderungen im Neurturin-Gen, umfassend das Nachweisen des Vorhandenseins eines intakten Neurturin-Gens, wie in irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11 definiert, in einer Zelle, wobei das Fehlen des intakten Gens auf das Vorhandensein von Genveränderungen hinweist.
Verfahren zur Förderung des Wachstums und/oder der Differenzierung einer Zelle in einem Kulturmedium, umfassend das Verabreichen eines Wachstumsfaktors, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, an die Zelle.
Verwendung eines Wachstumsfaktors, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, oder einer DNA-Sequenz, welche den Wachstumsfaktor codiert, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorzellen in einem Patienten.
Isoliertes und gereinigtes Neurturin-Antisense-Polynucleotid, umfassend eine Sequenz, welche komplementär ist zu einer Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11, und welche in der Lage ist, mit einer natürlich vorkommenden DNA- oder mRNA-Polynucleotidsequenz, welche ein Neurturin codiert, zu hybridisieren, um die Transkription und/oder Translation eines codierten Neurturin-Polypeptids, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zu verhindern.
Verwendung eines Antisense-Polynucleotids nach Anspruch 26 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Fettleibigkeit oder zur Modulation einer Neoplasie.