DE69816467T2

DE69816467T2 - Robo: eine familie polypeptiden und nukleinesäuren wirksam in nervenzellleitung

Info

Publication number: DE69816467T2
Application number: DE69816467T
Authority: DE
Inventors: S. Corey GOODMAN; Thomas Kidd; J. Kevin MITCHELL; Guy Tear
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-10-20
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2018-10-21
Also published as: CA2304926A1; DE69816467D1; JP2003517262A; CA2304926C; US20100233819A1; EP1025231A1; AU1105799A; ATE245190T1; JP2006174839A; WO1999020764A1; EP1025231B1; US20050059040A1; AU729496B2; JP4636413B2

Description

Gebiet der Erfindung
Das Gebiet dieser Erfindung sind Proteine, welche bei der Leitung von Nervenzellen beteiligt sind.
Hintergrund
Bilateral symmetrische Nervensysteme, wie diejenigen, welche in Insekten und Wirbeltieren gefunden werden, besitzen spezielle Mittellinienstrukturen, welche eine Aufteilung zwischen den zwei spiegelbildlichen Hälften herbeiführen. Axons, welche die zwei Seiten des Nervensystems verknüpfen, verlaufen in Richtung zur und quer über die Mittellinie, wobei Axon-Kommissuren gebildet werden. Diesen Kommissur-Axons projizieren in Richtung auf die Mittellinie, indem sie, zumindestens teilweise, auf weitreichende Chemoattraktions-Substanzen antworten, welche von der Mittellinie ausgehen. Eine wichtige Klasse von Mittellinien-Chemoattraktionsstoffen sind die Netrine (Serafini et al., 1994; Kennedy et al., 1994), Leitungs-Signale, deren Struktur, Funktion und Mittellinien-Expression evolutionär von den Nematoden und Fruchtfliegen bis zu den Wirbeltieren hin konserviert ist (Hedgecock et al., 1990; Wadsworth et al., 1996; Mitchell et al., 1996; Harns et al., 1996). Die anziehenden bzw. attraktiven Wirkungen von Netrinen scheinen durch Wachstumskegel-Rezeptoren der DCC-Unterfamilie der Immunglobulin(Ig)-Superfamilie vermittelt zu werden (Keino-Masu et al., 1996; Chan et al., 1996; Kolodziej et al., 1996).
Die Mittellinie stellt ebenfalls bedeutsame Kurzweiten-Leitsignale bereit. Dies wird am besten durch Betrachtung der unterschiedlichen Klassen von Axon-Projektionen in das Rückenmark von Vertebraten oder das Nervenmark von Insekten veranschaulicht. Obwohl manche Wachstumskegel sich von der Mittellinie weg erstrecken, verlaufen die meisten während eines gewissen Segments ihrer Bahn in Richtung auf oder entlang der Mittellinie. Bestimmte Klassen von Wachstumskegeln erstrecken sich entweder in Richtung auf die Mittellinie oder longitudinal entlang derselben und kreuzen selbige dennoch niemals. Die meisten Wachstumskegel (~90% im ZNS von Drosophila) kreuzen allerdings die Mittellinie. Nach der Kreuzung biegt die Mehrzahl dieser Wachstumskegel ab, um longitudinal zu projizieren, wobei sie entlang oder nahe der Mittellinie wachsen. Interessanterweise kreuzen diese Axone die Mittellinie niemals wieder, obwohl sie in der Nachbarschaft anderer Axons navigieren, welche fortgesetzt kreuzen.
Welche Mittellinien-Signale und Wachstumskegelrezeptoren steuern, ob Wachstumskegel die Mittellinie kreuzen oder nicht kreuzen? Welcher Mechanismus hindert diese Wachstumskegel, nach einmaligem Kreuzen, an einem erneuten Kreuzen? Untersuchungen in den Embryonen von Huhn (Stoeckli und Landmesser, 1995; Stoeckli et al., 1997) und Heuschrecke (Myers und Bastiani, 1993) haben zum Vorschlag geführt, daß die Mittellinie einen Kontaktvermittelten Abstoßungsstoff enthält, und daß kommissurale Wachstumskegel diesen Abstoßungsstoff überwinden müssen, um die Mittellinie zu kreuzen. Zum Beispiel wird diese Vorstellung, daß die Mittellinie sogar für Wachstumskegel, welche selbige kreuzen, abstoßend sein kann, durch Zeitrafferabbildung des ersten Kommissur-Wachstumskegels im Heuschreckenembryo unterstützt. Nach Kontaktieren der Mittellinie zieht sich dieser Wachstumskegel häufig abrupt zurück, obwohl er letztendlich die Abstoßung überwindet und die Mittellinie kreuzt bzw. überquert.
Eine Vorgehensweise, um Gene zu finden, welche für die Komponenten eines derartigen Mittellinien-Leitsystems codieren, besteht darin, nach Mutationen zu screenen, in welchen entweder zu viele oder zu wenige Axons die Mittellinie kreuzen. Ein solches Mutanten-Screening in großem Maßstab wurde früher in Drosophila durchgeführt und führte zur Identifizierung von zwei Schlüsselmutationen: commissureless (comm) und roundabout (robo) (Seeger et al., 1993; Übersichtsartikel von Tear et al., 1993). In comm-Mutantenembryos orientieren sich Kommissur-Wachstumskegel anfänglich zur Mittellinie hin, versagen dann aber darin, selbige zu kreuzen, und laufen stattdessen zurück und wachsen auf ihrer eigenen Seite weiter. comm codiert ein neues Oberflächenprotein, welches auf Mittellinienzellen exprimiert wird. Wenn kommissurale Wachstumskegel die ZNS-Mittellinie kontaktieren und überqueren, wird scheinbar das Comm-Protein aus Mittellinienzellen auf kommissurale Axons übertragen (Tear et al., 1996). In robo-Mutantenembryos verlaufen viele Wachstumskegel, welche sich normalerweise nur auf ihrer eigenen Seite erstrecken, anstattdessen nun über die Mittellinie, und Axons, welche die Mittellinie normalerweise nur einmal überqueren, scheinen stattdessen mehrmals zu kreuzen und zurückzukreuzen (Seeger et al., 1993; Kidd et al., 1997). Doppelmutanten von comm und robo zeigen einen robo-ähnlichen Phänotyp auf.
Hier offenbaren wir die Charakterisierung von robo über Tierspezies hinweg. robo codiert für eine neue Klasse von Leitrezeptor mit 5 Ig-Domänen, 3 Fibronectin(FN)-Typ III-Domänen, einer Transmembrandomäne und einer langen cytoplasmatischen Domäne. Robo definiert eine neue Unterfamilie von Ig-Superfamilie-Proteinen, welche von Fruchtfliegen bis zu Säugetieren hoch konserviert ist. Die Ergebnisse von Proteinexpressions- und transgenischen "Res cue"-Experimenten zeigen, daß Robo als der Türsteher wirkt, welcher die eine Mittellinienübergeurung kontrolliert, und daß Robo auf einen unbekannten Mittellinien-Abstoßstoff antwortet.
Zusammenfassung der Beschreibung
Die Beschreibung hierin sieht Verfahren und Zusammensetzungen vor, welche Robol- und Robo2 (kollektiv Robo)-Polypeptide, verwandte Nukleinsäuren, Polypeptiddomänen davon mit Robo-spezifischer Struktur und Aktivität und Modulatoren der Robo-Funktion betreffen. Robo-Polypeptide können Funktion und Morphologie der Zelle, speziell der Nervenzelle, regulieren. Die Polypeptide können rekombinant aus transformierten Wirtszellen aus den vorliegenden, für Robo-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren hergestellt oder aus Säugerzellen gereinigt werden. Die Beschreibung sieht isolierte Robo-Hybridisierungssonden und -Primer, fähig zum spezifischen Hybridisieren mit natürlichen Robo-Genen, Robo-spezifische Bindungsmittel, wie spezifische Antikörper, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen in Diagnose (z. B. genetische Hybridisierungs-Screens auf Robo-Transkripte), Therapie (z. B. Robo-Inhibitoren zur Förderung des Nervenzellwachstums) und in der biopharmazeutischen Industrie (z. B. als Immunogene, Reagenzien zur Isolierung von Robo-Genen und -Polypeptiden, Reagenzien zum Screening von chemischen Bibliotheken für weiterführende bzw. wichtige pharmakologische Mittel etc.) vor.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Organisation des roundabout-Genom-Ortes

(A) Cosmid-Chromosomen-"Walk" durch die 58F/59A-Region des zweiten Chromosoms. Die Position der Defizienz-Bruchpunkte innerhalb der verwendeten Cosmide ist in den oberen zwei Reihen gezeigt. Identifizierte Transkripte aus dem Walk sind unterhalb der Cosmide gezeigt. Das Transkript 12-1 entspricht dem robo-Gen; die Richtung der Transkription verläuft von distal nach proximal. Die Lokalisierung des 16 kb großen genomischen XbaI-Rescue-Fragmentes ist darunter angezeigt.
(B) Position und Größe von Introns innerhalb des robo-Transkripts. Die codierende Sequenz wird durch den dickeren Teil der Linie angezeigt. Introns werden durch Lücken repräsentiert. Das Transkript ist 3'–5' gezeigt, um seine Orientierung in (A) wiederzuspiegeln.

2 Struktur des Robo-Proteins Schematische Darstellung der Struktur des Drosophila-Robo-Proteins. Die Position der Immunglobulin(Ig)-, Fibronectin(FN)- und Transmembran(TM)-Domänen und der Aminosäuresubstitution in robo⁶ sind gezeigt. Die prozentuale Aminosäureidentität zwischen Drosophila Robo 1 und menschlichem Robo 1 ist für jede Domäne angegeben.
Ausführliche Beschreibung
Die Nukleotidsequenzen von beispielhaften natürlichen cDNAs, welche für Drosophila 1-, Drosophila 2-, C. elegans-, Mensch 1-, Mensch 2- und Maus 1-Robo-Polypeptide codieren, sind als die SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 9 bzw. 11 gezeigt, und die vollständigen konzeptualen Translate sind als SEQ ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 10 bzw. 12 gezeigt. Die hierin beschriebenen Robo-Polypeptide schließen unvollständige Translate der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 9 und 11 und Deletionsmutanten von SEQ ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 10 und 12 ein, wobei die Translate und Deletionsmutanten eine Robo-spezifische Aminosäurensequenz, Bindungsspezifität oder Funktion aufweisen. Bevorzugte Translate/Deletionsmutanten umfassen eine mindestens 6, vorzugsweise mindestens 8, weiter bevorzugt mindestens 32, am stärksten bevorzugt mindestens 64 Reste umfassende Domäne der Translate. Die Deletionsmutanten umfassen eine oder mehrere strukturelle/funktionelle Robo-Immunglobulin-, -Fibronectin- oder cytoplasmatische-Motiv-Domänen, welche hierin beschrieben werden. Beispielsweise stellen lösliche Formen der offenbarten Robo-Polypeptide, welche eine oder mehrere Robo-IG-Domänen, und speziell Fusionen von zwei oder mehreren Robo-IG-Domänen, insbesondere Fusionen von IG#1 und #2, umfassen, kompetitive Inhibitoren der Robo-vermittelten Signalweiterleitung bereit. Solche beispielhaften Deletionsmutanten und rekombinierten Deletionsmutantenfusionen schließen die humanen Robo 1 (SEQ ID NR.: 8)-Reste 1–67; 68–167; 168–259; 260–350; 351–451; 1– 167; 1–259; 1–350; 1–451; 68–259; 1–67, verknüpft an 168–259; und 1–67, verknüpft an 260– 451, ein.
Andere Deletionsmutanten stellen Robo-spezifische Antigene und/oder Immunogene, speziell bei Kopplung an Trägerproteine wie nachstehend beschrieben, bereit. Generische Robospezifische Peptide sind ohne weiteres als konservierte Regionen in den parallelübereinandergestellten Robo-Polypeptidsequenzen der Tabelle 1 offensichtlich.
Tabelle 1. Sequenz-Übereinanderstellung von Mitgliedern der Robo-Familie: Es wird die vollständige Aminosäure-Übereinanderstellung der vorhergesagten Robo-Proteine, codiert von drosophila robo 1 (D1, SEQ ID Nr.: 2) und humanem robo 1 (H1, SEQ ID Nr.: 8), gezeigt. Die extrazelluläre Domäne von C.elegans robo (CE, SEQ ID Nr.: 6; Sax-3; Zallen et al., 1997), die extrazelluläre Domäne von Drosophila robo 2 (D2, SEQ ID Nr.: 4) und die teilweise Sequenz von humanem robo 2 (H2, SEQ ID Nr.: 10) sind ebenfalls übereinandergestellt bzw. aligniert. Die D2-Sequenz wurde durch das Gen-Finder-Programm "Grail" vorhergesagt. Die Position der Immunglobulindomänen (Ig), Fibronectindomänen (FN), der Transmembrandomäne (TM) und der konservierten cytoplasmatischen Motive ist angegeben. Die extrazelluläre Domäne von Ratten-robo 1 ist nahezu identisch zu H1.
Derartige beispielhafte Robo-spezifischen immunogenen und/oder antigenen Peptide sind in der Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2. Immunogene Robo-Polypeptide, welche Robo-spezifischen polyklonalen Kaninchen-Antikörper hervorrufen:
Robo-Polypeptid-KLH-Konjugate, mit welchen durch das nachstehend beschriebene Protokoll immunisiert wurde.

Robo-Polypeptid, Sequenz	Immunogenität
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 68–77	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 79–94	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 95–103	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 122–129	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 165–176	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 181–191	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 193–204	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 244–251	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 274–290	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 322–331	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 339–347	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 407–417	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 441–451	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 453–474	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 502–516	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 541–553	+++
SEQ. ID. Nr.: 2, Reste 617–629	+++

Darüber hinaus sind speziesspezifische antigene und/oder immunogene Peptide ohne weiteres als abgewandelte extrazelluläre oder cytosolische Regionen in der Tabelle 1 offensichtlich. Solche beispielhaften humanen spezifischen Peptide sind in der Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3. Immunogene Robo-Polypeptide, welche für humanes Robo spezifischen, polyklonalen Kaninchen-Antikörper hervorrufen: Robo-Polypeptid-KLH-Konjugate, mit welchen durch das nachstehend beschriebene Protokoll immunisiert wurde (einige Antikörper zeigen Kreuzreaktivität mit entsprechenden Maus/Ratte-Robo-Polypeptiden).

Robo-Polypeptid, Sequenz	Immunogenität
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1–12	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 18–28	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 31–40	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 45–65	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 106–116	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 137–145	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 174–184	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 214–230	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 274–286	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 314–324	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 399–412	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 496–507	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 548–565	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 599–611	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 660–671	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 717–730	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 780–791	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 835–847	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 877–891	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 930–942	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 981–998	+++
SEQ. ID. Nr 8, Reste 1040–1051	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1080–1090	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1154–1168	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1215–1231	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1278–1302	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1378–1400	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1460–1469	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1497–1519	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1606–1626	+++
SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1639–1651	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 5–16	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 38–47	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 83–94	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 112–125	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 168–180	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 195–209	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 222–235	+++
SEQ. ID. Nr.: 10, Reste 241–254	+++

Die exprimierten Sequenz-Tags bzw. -Markierungsstellen EST;yu23d11, Zugangs-Nr. H77734, und EST;yg76e12, Zugangs-Nr. H52936, sowie davon konzeptuell codierte Peptide, liegen nicht innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung (Tabellen 4 und 5). Die vorliegenden Robo-Polypeptide sind nicht die entsprechenden Regionen des offenbarten natürlichen humanen Robo I-Polypeptids, d. h. SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 168–217, und SEQ. ID. Nr.: 8, Reste 1316–1485.
Tabelle 4. EST:yu23d11-Sequenzen, im Vergleich zu H-Robol. yu23d11 bezieht sich auf das DNA-Fragment, welche sequenziert wurde. Das Fragment wurde von beiden Enden her sequenziert, wobei die folgenden zwei Sequenzen erzeugt wurden: H77734 und H77733. yu23d11 ist eine ungespleißte cDNA. Nur die Basen 59–215 entsprechen der codierenden Sequenz von H-Robo 1 (502–651). Die verbleibenden Basen sind intronisch. Keine Basen von H77733 entsprechen der codierenden Sequenz von H-Robol.
Es gibt einen Fehler in der Sequenz, eine Änderung von T nach G, welche dazu führt, daß die Aminosäure N durch K ersetzt wird. Die Sequenz wird nachstehend gezeigt und ist zur Deutlichkeit umgekehrt worden:
Tabelle 5 EST:yg76e12-Sequenzen im Vergleich zu H-Robol. yg76e12 bezieht sich auf das DNA-Fragment, welche sequenziert wurde. Das Fragment wurde von beiden Enden her sequenziert, wobei die folgenden zwei Sequenzen erzeugt wurden: H52936 und H52937 (letztere ist zur Deutlichkeit umgekehrt worden). Es läßt sich ersehen, daß die Sequenzen in der Mitte überlappen. Eine Lücke gibt einen Leserahmenverschiebungs-Fehler an. Man bemerke, daß Fehler nur in einer Sequenz an einer beliebigen Position auftreten.
Die vorliegenden Domänen liefern eine Robo-domänenspezifische Aktivität oder Funktion, wie Robo-spezifische Zell-, speziell Neuronen-modulierende oder inhibitorisch-modulierende Aktivität, Robo-Ligandenbindungs- oder bindungsinhibierende Aktivität. Die Robo spezifische Aktivität oder Funktion kann durch zweckmäßige in vitro, Zell-basierende oder in vivo-Assays bestimmt werden: z. B. in vitro-Bindungsassays, Zellkultur-Assays, in Tieren (z. B. Gentherapie, transgene Tiere etc.) usw. Bindungs-Assays schließen jedweden Assay ein, in welchem die molekulare Wechselwirkung eines Robo-Polypeptids mit einem Bindungsziel ausgewertet wird. Das Bindungsziel kann ein natürliches intrazelluläres Bindungsziel, ein Robo-regulierendes Protein oder ein anderer Regulator, welcher Robo-Aktivität oder seine Lokalisierung direkt moduliert; oder ein nicht-natürliches Bindungsziel, wie ein spezifisches Immunprotein, wie ein Antikörper, oder ein Robo-spezifisches Mittel, wie diejenigen, identifiziert in Screening-Assays, wie nachstehend beschrieben, sein. Die Robo-Bindungsspezifität kann durch Bindungsgleichgewichtskonstanten (üblicherweise mindestens etwa 10⁷M^–1, vorzugsweise mindestens etwa 10⁸M^–1, weiter bevorzugt mindestens etwa 10⁹M^–1), durch die Fähigkeit des vorliegenden Polypeptids, als Negativmutanten in Robo-exprimierenden Zellen zu wirken, Robo-spezifischen Antikörper in einem heterologen Wirt (z. B. einem Nagetier oder Kaninchen) hervorzurufen, etc. getestet werden.
Die beanspruchten Robo-Polypeptide sind isoliert oder rein: Ein "isoliertes" Polypeptid ist zumindestens von einigem Material nicht-begleitet, mit welchem es in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, wobei es vorzugsweise mindestens etwa 0,5 Gew.-%, und stärker bevorzugt mindestens etwa 5 Gew.-% des Gesamtpolypeptids in einer gegebenen Probe ausmacht, und ein reines Polypeptid macht mindestens etwa 90 Gew.-% und vorzugsweise mindestens etwa 99 Gew.-% des Gesamtpolypeptids in einer gegebenen Probe aus. Ein Polypeptid, wie hierin verwendet, ist ein Polymer aus Aminosäuren, im allgemeinen von mindestens 6 Resten, vorzugsweise mindestens etwa 10 Resten, weiter bevorzugt mindestens etwa 25 Resten, am stärksten bevorzugt mindestens etwa 50 Resten Länge. Die Robo-Polypeptide und Polypeptiddomänen können synthetisiert, durch rekombinante Technologie hergestellt oder aus Säuger-, vorzugsweise Menschen-Zellen gereinigt werden. Eine große Vielzahl von molekularen und biochemischen Verfahren steht für die biochemische Synthese, molekulare Expression und Reinigung der vorliegenden Zusammensetzungen zur Verfügung, siehe z. B. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Sambrook, et al. Cold Spring Harbor Laboratory), "Current Protocols in Molecular Biology" (Hrsg.: Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), oder diejenigen, welche anderweitig im Fachgebiet bekannt sind.
Die Beschreibung liefert Bindungsmittel, welche spezifisch für die beanspruchten Robo-Polypeptide sind, einschließlich natürlicher intrazellulärer Bindungsziele, etc., Verfahren zur Identifizierung und Herstellung derartiger Mittel und deren Verwendung in Diagnose, Therapie und pharmazeutischer Entwicklung. Beispielsweise sind spezifische Bindungsmittel in einer Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen nützlich, insbesondere wo Pathologie, Wundheilungs-Unvermögen oder Prognose mit unrichtigem oder unerwünschten Axon-Auswachsen, -Orientieren oder einer Inhibition davon assoziiert sind. Neue Robospezifische Bindungsmittel schließen Robo-spezifische Rezeptoren, wie somatisch rekombinierte Polypeptidrezeptoren, wie spezifische Antikörper oder T-Zell-Antigenrezeptoren (siehe z. B. Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory), natürliche intrazelluläre Bindungsmittel, identifiziert mit Assays, wie Ein-, Zwei- und Drei-Hybrid-Screenings, nicht-natürliche intrazelluläre Bindungsmittel, identifiziert in Screenings bzw. Durchsuchungen von chemischen Bibliotheken, wie nachstehend beschrieben, etc. ein. Mittel von besonderem Interesse modulieren die Robo-Funktion.
In einer besonderen Ausführungsform werden die vorliegenden Polypeptide verwendet, um für Robo oder humanes Robo spezifische Antikörper zu erzeugen. Beispielsweise werden die für Robo und humanes Robo spezifischen, obenstehend beschriebenen, Peptide kovalent an "keyhole limpet"-Antigen (KLH, Schlüssellochnapfschnecken-Antigen) gekoppelt, und das Konjugat wird in vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert. Laboratoriums-Kaninchen werden gemäß eines herkömmlichen Protokolls immunisiert, und ihnen wird Blut abgenommen. Das Vorliegen von Robo-spezifischen Antikörpern wird durch Festphasen-Immunosorbent-Assays unter Verwendung immobilisierter Robo-Polypeptide von SEQ. ID. Nr.: 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 getestet. Für humanes Robo spezifische Antikörper werden als nichtkreuzreagierend mit nicht-humanen Robo-Polypeptiden gekennzeichnet (SEQ. ID. Nr.: 2, 4, 6 und 12).
Folglich sieht die Beschreibung Verfahren zur Modulierung der Zellfunktion vor, umfassend den Schritt des Modulierens der Robo-Aktivität z. B. durch Kontaktieren der Zelle mit einem Robo-Inhibitor, z. B. inhibitorischen Robo-Deletionsmutanten, Robo-spezifischen Antikörpern etc. (siehe oben). Die Zielzelle kann in Kultur oder in situ, d. h. innerhalb des natürlichen Wirtes, vorliegen. Der Inhibitor kann auf jedwede zweckmäßige Weise bereitgestellt werden, einschließlich durch (i) intrazelluläre Expression von einer rekombinanten Nukleinsäure aus, oder (ii) von außen erfolgendem Inkontaktbringen mit der Zelle. Für viele in situ-Anwendungen werden die Zusammensetzungen zu einem zurückbehaltenen physiologischen Fluid, wie Blut oder Synovialflüssigkeit, zugesetzt. Für eine ZNS-Verabreichung ist eine Vielzahl von Techniken zur Beschleunigung des Transfers des Therapeutikums über die Bluthirnschranke verfügbar, einschließlich Disruption durch chirurgischen Eingriff oder Injektion, Arzneimitteln, welche vorübergehend den Adhäsionskontakt zwischen ZNS-Gefäßsystem-Endothelzellen öffnen, und Verbindungen, welche eine Translokation durch derartige Zellen erleichtern. Robo-Polypeptid-Inhibitoren können ebenfalls für direkte Injektion oder Infusion, topische, intratracheale/nasale Verabreichung, z. B. durch Aerosol, intraokular oder innerhalb/auf Implantaten, z. B. Fasern, z. B. Kollagen, osmotische Pumpen, Transplantate, umfas send geeignet transformierte Zellen, etc. geeignet sein. Ein besonderes Verfahren zur Verabreichung beinhaltet das Beschichten, Einbetten oder Derivatisieren von Fasern, wie Kollagenfasern, Proteinpolymeren etc., mit therapeutischen Proteinen. Andere nützliche Vorgehensweisen werden beschrieben in Otto et al. (1989) J Neuroscience Research 22, 83–91, und Otto und Unsicker (1990) J Neuroscience 10, 1912–1921. Im allgemeinen wird die verabreichte Menge empirisch bestimmt, typischerweise im Bereich von etwa 10 bis 1000 μg/kg des Empfängers, und die Konzentration wird im allgemeinen im Bereich von etwa 50 bis 500 μg/ml in der verabreichten Dosis liegen. Andere Zusatzstoffe, wie Stabilisatoren, Bakterizide, etc. können eingeschlossen werden und werden in herkömmlichen Mengen vorliegen. Für diagnostische Anwendungen werden die Inhibitoren oder andere Robo-Bindungsmittel häufig markiert, wie mit fluoreszenten, radioaktiven, chemolumineszenten oder anderen einfach nachweisbaren Molekülen, entweder direkt konjugiert an das Bindungsmittel oder konjugiert an eine Sonde, welche für das Bindungsmittel spezifisch ist.
Die Aminosäuresequenzen der offenbarten Robo-Polypeptide werden verwendet, um Robo-Polypeptid-codierende Nukleinsäuren rückzutranslatieren, welche für ausgewählte Expressionssysteme optimiert sind (Holler et al. (1993) Gene 136, 323–328; Martin et al. (1995) Gene 154, 150–166), oder werden verwendet, um degenerierte Oligonukleotidprimer und -Sonden zur Verwendung in der Isolierung von natürlichen, Robo-codierenden Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen ("GCG"-software, Gentics Computer Group, Inc, Madison WI). Für Robo codierende Nukleinsäuren, welche in Robo-Expressionsvektoren verwendet werden, werden in rekombinante Wirtszellen, z. B. zur Expression und zum Screening, transgene Tiere, z. B. für funktionelle Untersuchungen, wie der Wirksamkeit von Kandidaten-Arzneistoffen für eine Krankheit, welche mit einer Robo-modulierten Zellfunktion assoziiert ist, etc. eingebracht.
Die Beschreibung sieht auch Nukleinsäure-Hybridisierungssonden (Tabellen 6, 7) und Replikations/Amplifikations-Primer (Tabellen 7, 8) vor, welche eine Robo-cDNA-spezifische Sequenz aufweisen, umfassend SEQ. ID. Nr.: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11, und zur Bewirkung einer spezifischen Hybridisierung daran (d. h. spezifische Hybridisierung mit SEQ. ID. Nr.: 1, 3, 5, 7, 9 bzw. 11) in Gegenwart von CDO-cDNA hinreichend sind.
Tabelle 5. Hybridisierungssonden für Humanes Roundabout 1
Tabelle 6. Hybridisierungssonden für Humanes Roundabout 2
Tabelle 7. Primerpaare für PCR von Humanen-Roundabout 1-Domänen
Tabelle 8. Humanes Roundabout 2 – Primerpaare
Derartige Primer oder Sonden sind mindestens 12, vorzugsweise mindestens 24, weiter bevorzugt mindestens 36 und am stärksten bevorzugt mindestens 96 Basen lang. Das Aufzeigen einer spezifischen Hybridisierung erfordert im allgemeinen stringente Bedingungen, beispielsweise eine Hybridisierung in einem Puffer, umfassend 30% Formamid in 5 × SSPE (0,18 M NaCl, 0,01 M NaPO₄, pH 7,7, 0,001 M EDTA) -Puffer bei einer Temperatur von 42°C und Gebundenbleiben bei Unterziehen unter Waschen bei 42°C mit 0,2 × SSPE; vorzugsweise Hybridisieren in einem Puffer, umfassend 50 % Formamid in 5 × SSPE-Puffer bei einer Temperatur von 42°C und Gebundenbleiben bei Unterziehen unter Waschen bei 42°C mit 0,2 × SSPE-Puffer bei 42°C. Robo-Nukleinsäuren können auch unter Verwendung von Alignierungs-Algorithmen, wie BLASTX (Altschul et al. (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol. 215. 403–410) unterschieden werden.
Die vorliegenden Nukleinsäuren sind von synthetischen/nicht-natürlichen Sequenzen und/oder sind isoliert, d. h. nicht von zumindest einigem des Materials, mit welchem sie in ihrem natürlichen Zustand assoziiert sind, begleitet, wobei sie vorzugsweise mindestens etwa 0,5 Gew.%, vorzugsweise mindestens etwa 5 Gew.-% der Gesamtnukleinsäure, welche in einer gegebenen Fraktion vorhanden ist, ausmachen, und sind üblicherweise rekombinant, was bedeutet, daß sie eine nicht-natürliche Sequenz oder eine natürliche Sequenz umfassen, welche an Nukleotid(e) verknüpft ist, verschieden von denjenigen, mit denen sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist. Die vorliegenden rekombinanten Nukleinsäuren, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ. ID. Nr.: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11, oder Fragmente hiervon, enthalten eine) derartige(s) Sequenz oder Fragment an einem Terminus, unmittelbar flankiert von (d. h. benachbart mit) einer Sequenz, welche verschieden ist von derjenigen, mit welcher es auf ei nem natürlichen Chromosom verknüpft ist, oder flankiert von einer nativen flankierenden Region, kleiner als 10 kb, vorzugsweise kleiner als 2 kb, weiter bevorzugt kleiner als 500 bp, welche an einem Terminus vorliegt oder unmittelbar von einer Sequenz flankiert wird, verschieden von derjenigen, an welche sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist. Während die Nukleinsäuren üblicherweise RNA oder DNA sind, ist es häufig vorteilhaft, Nukleinsäuren zu verwenden, welche andere Basen oder Nukleotidanaloga umfassen, um eine modifizierte Stabilität etc. vorzusehen.
Die exprimierten Sequenz-Tags EST;yu23d11, Zugangs-Nr. H77734, und EST;yg76e12, Zugangs-Nr. H52936, und Deletionsmutanten hiervon, liegen nicht innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die vorliegenden Robo-Nukleinsäuren sind nicht die entsprechenden Regionen der offenbarten natürlichen humanen Robo I-Nukleinsäuren, d. h. SEQ. ID. Nr.: 7, Nukleotide 500–651, und SEQ. ID. Nr.: 7, Nukleotide 3945–4455.
Tabelle 10. Beispielhafte Unterschiede zwischen H52936 und entsprechenden humanen Robo I-Sequenzen.

(1) An der Position 86 befindet sich ein T anstelle eines A. Das neue Codon lautet deshalb TGA (Stop) anstelle von AGA (R).
(2) Es fehlt ein G an der Position 286-7, was eine Leserahmenverschiebung verursacht.
(3) Es gibt ein extra G an der Position 334, was eine Leserahmenverschiebung verursacht.
(4) Es gibt ein extra T an der Position 344, was eine Leserahmenverschiebung verursacht.
(5) Es gibt ein extra N an der Position 357, was eine Leserahmenverschiebung verursacht.
(6) Es gibt ein T anstelle eines C bei 362. Das neue Codon lautet TTT (F) anstelle von TCT (S).
(7) Es gibt ein extra T an der Position 364, was eine Leserahmenverschiebung verursacht.
(8) Es gibt ein extra N an der Position 370, was eine Leserahmenverschiebung und eine veränderte Aminosäure verursacht (das Codon TTN ist zweideutig)
(9) Es gibt zwei Ts an Position 394 und 395 anstelle eines C, was eine Leserahmenverschiebung und Aminosäureaustausche verursacht.

Tabelle 11. Beispielhafte Unterschiede zwischen H52937 (umgekehrte Sequenz) und entsprechenden humanen Robo I-Sequenzen.

(1) Es gibt mehrere Fehler in den ersten 30 Basen.
(2) An der Position 63 ersetzt ein G ein A. Das neue Codon CGG codiert für R anstelle von CAG für Q.
(3) Der EST endet durch Verknüpfen an einen Teil des humanen Glycophorin B-Gens (353– 442).

Die vorliegenden Nukleinsäuren finden eine große Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Verwendung als translatierbare Transkripte, Hybridisierungssonden, PCR-Primer, diagnostische Nukleinsäuren etc.; Verwendung beim Nachweis des Vorhandenseins von Robo-Genen und -Gentranskripten und beim Nachweis oder Amplifizieren von Nukleinsäuren, codierend für zusätzliche Robo-Homologe und -Strukturanaloge. In der Diagnose finden Robo-Hybridisierungssonden Anwendung bei der Identifizierung von Wildtyp- und Mutanten-Robo-Allelen in klinischen und Laboratoriums-Proben. Mutante Allele werden verwendet, um Allel-spezifische Oligonukleotid(ASO)-Sonden für klinische Diagnosen mit hohem Durchsatz zu erzeugen. In einer Therapie werden therapeutische Robo-Nukleinsäuren verwendet, um die zelluläre Expression oder intrazelluläre Konzentration oder Verfügbarkeit von aktivem Robo zu modulieren.
Die Beschreibung sieht effiziente Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, Verbindungen oder Leit-Verbindungen für Mittel, welche auf einem Spiegel einer Robo-modulierbaren zellulären Funktion aktiv sind, vor. Im allgemeinen beinhalten diese Screeningverfahren einen Assay auf Verbindungen, welche die Robo-Wechselwirkung mit einem natürlichen Robo-Bindungsziel modulieren. Es wird eine große Vielzahl von Assays für Bindungsmittel vorgesehen, einschließlich Bindungsassays von markierten Protein-Protein-in-vitro-Bindungsassays, Immunassays, zellbasierten Assays etc. Die Verfahren sind geeignet für automatisiertes, kosteneffizientes Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken nach Leitverbindungen. Identifizierte Reagenzien finden Anwendung in der pharmazeutischen Industrie für Versuche an Tier und Mensch; zum Beispiel können die Reagenzien derivatisiert und in in vitro- und in vivo-Assays erneut gescreent werden, um die Aktivität zu optimieren und die Toxizität für eine pharmazeutische Entwicklung zu minimieren.
Zell- und Tier-basierte neurale Lenkungs/Abstoßungs-Assays werden ausführlich im nachstehenden experimentellen Abschnitt beschrieben. in vitro-Bindungsassays wenden eine Mischung von Komponenten an, einschließlich eines Robo-Polypeptids, welches Teil eines Fusionsproduktes mit einem anderen Peptid oder Polypeptid, z. B. einem Tag bzw. Markierungsstoff für Nachweis oder Verankerung, etc. sein kann. Die Assaymischungen umfassen ein natürliches intrazelluläres Robo-Bindungsziel. Obgleich native Volllängen-Bindungsziele verwendet werden können, wird es häufig bevorzugt, Abschnitte (z. B. Peptide) davon zu verwenden, solange der Abschnitt Bindungsaffinität und -Anziehungskraft zu dem vorliegenden Robo-Polypeptid vorsieht, welche bequem in dem Assay meßbar ist. Die Assaymischung umfaßt auch ein pharmakologisches Kandidaten-Mittel. Kandidatenmittel überspannen zahlreiche chemische Klassen, obwohl sie typischerweise organische Verbindungen, vorzugsweise kleine organische Verbindungen, sind und aus einer großen Vielzahl von Quellen, einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen, erhalten wer den. Eine Vielzahl von anderen Reagenzien kann ebenfalls in der Mischung eingeschlossen werden. Diese schließen Reagenzien ein, wie Salze, Puffer, neutrale Proteine, wobei man z. B. Albumin, Detergentien, Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel etc. verwenden kann.
Die resultierende Mischung wird unter Bedingungen inkubiert, unter denen, außer bei Vorliegen des pharmakologischen Kandidaten-Mittels, das Robo-Polypeptid spezifisch das zelluläre Bindungsziel, einen Bereich oder Analog davon mit einer Referenz-Bindungsaffinität, bindet. Die Mischungskomponenten können in einer beliebigen Reihenfolge zugesetzt werden, welche gestattet, daß die erforderlichen Bindungen und Inkubationen bei jedweder Temperatur durchgeführt werden können, welche eine optimale Bindung erleichtert. Die Inkubationsdauern werden gleichermaßen für eine optimale Bindung ausgewählt, aber ebenfalls minimiert, um ein rasches Hochdurchsatz-Screening zu erleichtern.
Nach Inkubation wird die von dem Mittel beeinflußte Bindung zwischen dem Robo-Polypeptid und einem oder mehreren Bindungszielen auf einem beliebigen zweckmäßigen Weg nachgewiesen. Falls mindestens eines von dem Robo- oder dem Bindungsziel-Polypeptid eine Markierung umfaßt, kann die Markierung einen direkten Nachweis wie Radioaktivität, Lumineszenz, optische oder Elektronendichte etc., oder einen indirekten Nachweis, wie einen Epitop-Anker etc., vorsehen. Eine Vielzahl von Verfahren kann angewandt werden, um die Markierung in Abhängigkeit von der Natur der Markierung und anderen Assaykomponenten, z. B. durch optische oder Elektronendichte, Strahlungsemissionen, Nichtstrahlungs-Energietransfers etc. nachzuweisen, oder sie kann indirekt mit Antikörperkonjugaten etc. nachgewiesen werden.
Ein Unterschied der Bindungsaffinität des Robo-Polypeptids zum Ziel in Abwesenheit des Mittels im Vergleich zur Bindungsaffinität in Gegenwart des Mittels zeigt, daß das Mittel die Bindung des Robo-Polypeptids an das Robo-Bindungsziel moduliert. Zum Beispiel zeigt, in dem auch nachstehend beschriebenen, zellbasierenden Assay, ein Unterschied in der Roboabhängigen Modulierung des Axon-Auswachsens oder -Orientierens in Gegenwart und Abwesenheit eines Mittels, daß das Mittel die Robo-Funktion moduliert. Ein Unterschied, wie hierin verwendet, ist statistisch signifikant und repräsentiert vorzugsweise einen Unterschied von mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 90%.
Der nachfolgende experimentelle Abschnitt und die Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht auf dem Wege der Einschränkung angegeben.
Experimente
Klonierung des roundabout-Gens.
Das robo¹ -Allel wurde durch Rekombinationskartierung auf das plexus-brown-Interval auf dem rechten Arm des zweiten Chromosoms kartiert; die Zahlen an Rekombinanten wiesen auf eine Kartierungsposition sehr nahe zu plexus bei 58F/59A hin. Eine Defizient [Df(2R)P, welche 58E3/F1 bis 60D14/E2 deletiert] versagt darin, robo-Mutationen zu komplementieren, zwei andere Defizienzen [Df(2R)59AB und Df(2R)59AD, welche 59A1/3 bis 59B1/2 bzw. 59A1/3 bis 59D1/4 deletieren] komplementieren robo, und eine Duplikation [Dp(2; Y)bw⁺Y, welche 58F1/59A2 bis 60E3/F1 dupliziert] rettet robo-Mutationen. Diese Kartierung lokalisiert robo in der 58F/59A-Region.
Wir initiierten chromosomale Walks von P1-Klonen, kartiert auf die Region, beginnend von der distalen Seite unter Verwendung des Klons DS02204 und von der proximalen Seite unter Verwendung des Klons DS05609. Wir verwendeten Cosmidklone (Tamkun et al., 1992), um einen Walk von 150 kb zu bewerkstelligen. Wir suchten dann nach RFLPs in den Rekombinanten zwischen dem mit mehreren Markern versehenen Chromosom und dem robo-Mutantenchromosom. Ein 6,8 kb großes EcoRI-Fragment aus dem Cosmid 106-5 identifizierte einen HindII-RFLP auf dem Kartierungschromosom, der auf einer einzelnen robo-Mutanten-Rekombinantenlinie vorhanden war. Dieses Fragment identifizierte eine proximate Grenze für die Lokalisierung von robo. Weitere Defizienten in dieser Region wurden dann getestet (Kerrebrock et al., 1995). Von diesen Defizienten entfernen Df(2R)X58-5 und Df(2R)X58-12 robo, während Df(2R)X58-1, dies nicht tut. Df(2R)X58-12 versagt darin, Df(2R)59AB zu komplementieren, komplementiert jedoch Df(2R)59AD, was anzeigt, daß Df(2R)59AB weiter nach proximal reicht; dieser proximale Endpunkt sieht eine distale Grenze für die Lokalisierung von robo vor. Sonden aus dem Walk wurden verwendet, um die Bruchpunkte dieser Defizienten zu identifizieren (1A). Df(2R)X58-1 bricht in einem 9,6 kb großen EcoRI/BamHI-Fragment innerhalb des Cosmides GJ12, wohingegen Df(2R)59AB in einem 8 kb großen BamHI/EcoRI-Fragment innerhalb des Cosmides 106–1435 bricht. Dies reduziert die Lokalisierung von robo auf eine 75-kb-Region, welche von diesen Restriktionsfragmenten begrenzt wird. Eine Hybridisierung von 0–16 h embryonischen poly-A⁺-Northern-Blots mit den Cosmiden GJ12, 106–12 und 106–1435 enthüllte mindestens fünf Transkripte. Eine reverse Northern-Kartierung identifizierte die Regionen, welche diese Transkripte enthielten (1A). Diese Regionen wurden als Sonden zur Isolierung von cDNAs verwendet. Sieben verschiedene cDNAs wurden isoliert und durch in situ Hybridisierung analysiert. Das Expressionsmuster von fünf dieser Transkripte gestattete uns, sie versuchsweise als für robo codierend zu rechnen, da sie nicht im embryonischen ZNS im passenden Stadium exprimiert wurden. Von den zwei verbleibenden cDNAs erschien 12-1 durch seine Größe und Expression als der wahrscheinlichste Kandidat für robo. Ein 16 kb großes XbaI-Fragment, einschließlich des 12-1-Transkriptes und einer Region 5' von dem Transkript, ist in der Lage, die robo-Mutante zu retten.
roundabout codiert für ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie. Wir gewannen und sequenzierten überlappende cDNA-Klone, entsprechend der 12-1-Transkriptionseinheit. Ein einzelner, langer offener Leserahmen (ORF), welcher 1395 Aminosäuren codiert, wurde identifiziert (D1 in der Tabelle 1). Die konzeptuelle Translation des ORF enthüllt, daß das Robo-Protein ein Mitglied der Ig-Superfamilie ist; die Ectodomäne von Robo enthält fünf Immunglobulin(Ig)-ähnliche Wiederholungen, gefolgt von drei Fibronectin(Fn)-Typ-III-Wiederholungen. Der vorhergesagte ORF enthält ebenfalls eine Transmembrandomäne und eine große 457 Aminosäuren (a. a.) lange cytoplasmatische Domäne. Eine Hydropathie-Analyse der Robo-Sequenz zeigt eine einzelne Membran-überspannende Domäne von 25 a. a. (Kyte und Doolittle, 1982) plus einer Signalsequenz mit einer vorhergesagten Spaltungsstelle zwischen G51 und Q52 (Nielsen et al. 1997).
Wir identifizieren das 12-1-Transkript auf der Basis mehrerer Kriterien als für robo codierend. Zum Ersten kann der embryonische robo-Phänotyp durch das 16 kb große genomische XbaI-Fragment, welches diese cDNA enthält, gerettet werden; es sind keine anderen Transkripte in diesem 16 kb großen XbaI-Fragment enthalten. Zum Zweiten identifizierten wir einen CfoI-RFLP, der mit dem Allel robo6 assoziiert ist. Dieser Polymorphismus beruht auf einem Austausch des Nukleotides 332 des ORF von G zu A, was zu einem Austausch des Gly₁₁₁ zu Asp führt. Gly₁₁₁ liegt in der ersten Ig-Domäne (2) und ist in allen identifizierten Robo-Homologen konserviert. Der Austausch ist für das Allel robo6 spezifisch und wird nicht in dem parentalen Chromosom oder in irgendeinem der anderen sieben Allele beobachtet, welche alle aus demselben parentalen Genotyp erzeugt wurden. Zum Dritten enthüllt die Erzeugung von Antikörpern (nachstehend), welche das Robo-Protein erkennen, daß die Allele robo¹, robo², robo³, robo⁴ und robo⁵ kein Robo-Protein herstellen (Tabelle 12).
Tabelle 12. robo-Mutantenallele
Alle Allele wurden durch EMS-Mutagenese von FasIII-null-Chromosomen erzeugt. Jedes dieser Allele scheint einen vollständigen, oder nahezu vollständigen Funktionsverlust- Phänotyp für robo zu repräsentieren, da der mutante Phänotyp, der beobachtet wird, wenn diese Allele über ein Chromosom gestellt werden, welches für den robo-Locus defizient ist [Df(2R)X58-5], nicht von dem homozygoten Allel unterscheidbar ist.
Schließlich rettet die transgene neurale Expression von robo den Mittellinien-kreuzenden Phänotyp von robo-Mutanten (siehe nachstehend).
Eine Entwicklungs-Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von sowohl cDNA- als auch genomischen Sonden legt nahe, daß robo von einem einzelnen Transkript von ~7500 by codiert wird. Wie sequenzierten genomische DNA und identifizierten 17 Introns innerhalb der Sequenz, von denen 14 lediglich 50–75 by lang sind, plus drei Introns von 843 bp, 236 by und 110 by (1B). Der genaue Startpunkt des Transkriptes muß noch bestimmt werden.
Eine Familie von evolutionär konservierten Robo-ähnlichen Proteinen.
Das Vorhandensein von fünf Ig- und drei Fn-Domänen, einer Transmembrandomäne und einer langen (452 a. a.) cytoplasmatischen Region zeigt an, daß Robo ein Rezeptor und Signalübertragungsmolekül sein kann. Der Netrin-Rezeptor DCC/Frazzled/UNC-40 besitzt eine verwandte Domänenstruktur mit 6 Ig- und 4 Fn-Domänen und einer ähnlich langen cytoplasmatischen Region (Keino-Masu et al., 1996; Chan et al., 1996; Kolodziej et al., 1996). Das einzige derzeitig bekannte Protein mit einer "5 + 3"-Organisation ist CDO (Kang et al.,1997). Allerdings ist CDO nur entfernt mit Robo verwandt (15–33% a. a.-Identität zwischen entsprechenden Ig- und FN-Domänen).

Wir identifizierten andere "5 + 3"-Proteine in Wirbeltieren, deren Aminosäureidentität diejenige von CDO übertrifft, und welche Robo-Homologe repräsentieren. Ein humaner, exprimierter Sequenz-Tag (EST;yu23d11, Zugangs-Nr. H77734) zeigt starke Homologie zur zweiten Ig-Domäne von robo und wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek aus humanem fötalen Gehirn (Stratagene) zu sondieren. Die gewonnenen Klone entsprechen einem humanen Gen mit fünf Ig- und drei Fn-Domänen (2). Beispielhafte funktionelle Robo-Domänen sind in den Tabellen 13–17 aufgezählt (die entsprechenden codierenden Nukleinsäuren sind leicht aus den entsprechenden Nukleinsäuresequenzen der Sequenzauflistung erkennbar). Tabelle 13. Beispielhafte Domänen von humanem Robo 1, nach Aminosäure-Sequenzpositionen

Signalsequenz:	6–21
Erste Immunglobulin-Domäne:	68–167
Zweite Immunglobulin-Domäne:	168–258
Dritte Immunglobulin-Domäne:	259–350
Vierte Immunglobulin-Domäne:	351–450
Fünfte Immunglobulin-Domäne:	451–546
Erste Fibronectin-Domäne:	547–644
Zweite Fibronectin-Domäne:	645–761
Dritte Fibronectin-Domäne:	762–862
Transmembran-Domäne:	896–917
Cytoplasmatisches Motiv #1:	1070–1079
Cytoplasmatisches Motiv #2:	1181–1195
Cytoplasmatisches Motiv #3:	1481–1488

Tabelle 14. Beispielhafte Domänen von humanem Robo II, nach Aminosäure-Sequenzpositionen

Vierte Immunglobulin-Domäne:	1–91
Fünfte Immunglobulin-Domäne:	92–185
Erste Fibronectin-Domäne:	186–282

Tabelle 15. Beispielhafte Domänen von Drosophila-Robo 1, nach Aminosäure-Sequenzpositionen

Signalsequenz:	30–46
Erste Immunglobulin-Domäne:	56–152
Zweite Immunglobulin-Domäne:	153–251
Dritte Immunglobulin-Domäne:	252–344
Vierte Immunglobulin-Domäne:	345–440
Fünfte Immunglobulin-Domäne:	441–535
Erste Fibronectin-Domäne:	536–635
Zweite Fibronectin-Domäne:	636–753
Dritte Fibronectin-Domäne:	754–854
Transmembran-Domäne:	915–938
Cytoplasmatisches Motiv #1:	1037–1046
Cytoplasmatisches Motiv #2:	1098–1119
Cytoplasmatisches Motiv #3:	1262–1269

Tabelle 16. Beispielhafte Domänen von Drosophila-Robo II, nach Aminosäure-Sequenzpositionen

Immunglobulin-Domäne # 1:	4–99
Immunglobulin-Domäne #2:	100–192
Immunglobulin-Domäne #3:	193–296
Immunglobulin-Domäne #4:	297–396
Immunglobulin-Domäne #5:	397–494
Fibronectin-Domäne #1:	495–595
Fibronectin-Domäne #2:	596–770
Fibronectin-Domäne #3:	771–877
Transmembran-Domäne:	906–929
Konserviertes cytoplasmatisches Motiv #1:	1075–1084

Tabelle 17. Beispielhafte Domänen von C. elegans-Robo 1, nach Aminosäure-Sequenzpositionen

Erste Immunglobulin-Domäne:	30–129
Zweite Immunglobulin-Domäne:	130–223
Dritte Immunglobulin-Domäne:	224–315
Vierte Immunglobulin-Domäne:	316–453
Fünfte Immunglobulin-Domäne:	454–543
Erste Fibronectin-Domäne:	544–643
Zweite Fibronectin-Domäne:	644–766
Dritte Fibronectin-Domäne:	767–865
Transmembran-Domäne:	900–922
Cytoplasmatisches Motiv #1:	1036–1045
Cytoplasmatisches Motiv #2:	1153–1163
Cytoplasmatisches Motiv #3:	1065–1074

Die Homologie ist besonders hoch in den ersten zwei Ig-Domänen (58% bzw. 48% a. a.-Identität, verglichen zu 26% und 30% für dieselben zwei Ig-Domänen zwischen D-Robo 1 und CDO), und hat uns, zusammen mit der Gesamtidentität über die gesamte extrazelluläre Region hinweg und dem Vorhandensein von drei konservierten cytoplasmatischen Motiven, dazu veranlaßt, dies als das humane roundabout 1-Gen (H-robol) zu bezeichnen. Eine Durchsuchung von Datenbanken enthüllt eine Nukleotidsequenz, welche H-robol entspricht, in der Datenbank, DUTTI, welche sich in der Signalsequenz, was ein alternatives Splicing nahelegt, einer 9-bp-Insertion und sieben Einzelbasenpaaraustauschen unterscheidet. Fünf ESTs (siehe experimentelle Vorgehensweisen) zeigen hohe Sequenzähnlichkeit zur cytoplasmatischen Domäne von H-robol. Eine Sequenzierung von cDNAs, isoliert unter Verwendung von einem dieser ESTs als Sonde, bestätigte ein zweites humanes roundabout-Gen (H-robo2).
Degenerierte PCR-Primer, basierend auf zwischen H-robol und D-robol konservierten Sequenzen, wurden verwendet, um ein PCR-Fragment aus einer Rattenembryo-El3-GehirncDNA-Bibliothek zu isolieren. Das Fragment wurde verwendet, um eine E13-RückenmarkcDNA-Bibliothek zu sondieren, was zur Isolierung eines Volllängen-Ratten-robo-Gens (R robol ) führte. Das vorhergesagte Protein zeigte hohe Sequenzidentität (> 95 %) mit H-robol über die gesamte Länge. Die 5'-Sequenzen verschiedener R-robol-cDNA-Klone zeigen, daß dieses Gen auf eine ähnliche Weise zu H-robo 1/DUTTI alternativ gespleißt wird. Wir wendeten eine ähnliche Vorgehensweise an, um cDNA-Klone für R-robo2 zu isolieren, welches in hohem Maße homolog zu H-robo2 ist.
Der Maus-EST vi92e02 ist hoch homolog zu dem cytoplasmatischen Abschnitt von H-robol. Das C. elegans-Sax-3-Gen ist ebenfalls ein robo-Homolog (Tabelle 1; Zallen et al., 1997). Ein zweites Drosophila-robo-Gen (D-robo2) wird ebenfalls aus der Analyse der genomischen Sequenz in der öffentlichen Datenbank vorhergesagt. Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß Robo das Gründungsmitglied einer neuen Unterfamilie von Ig-Superfamilien-Proteinen ist, mit mindestens einem Mitglied in Nematoden, zwei in Drosophila, zwei in der Ratte und zwei beim Menschen.
Die Übereinanderstellung der Proteine der Robo-Familie enthüllt, daß es sich bei der ersten und zweiten Ig-Domäne um den am stärksten konservierten Abschnitt der extrazellulären Domäne handelt. Die cytoplasmatischen Domänen sind stark divergent, mit Ausnahme des Vorhandenseins von drei hochkonservierten Motiven (Tabelle 18).
Tabelle 18. Konservierte Cytoplasmatische Motive: Aminosäure-Übereinanderstellungen der drei konservierten cytoplasmatischen Motive werden unterhalb der Struktur gezeigt; in C. elegans-robo sind die Motive #2 und #3 vertauscht bzw. verschoben worden, um eine bessere Übereinanderstellung vorzusehen.
Konserviertes Cytoplasmatisches Motiv # 1
Konserviertes Cytoplasmatisches Motiv #2
Konserviertes Cytoplasmatisches Motiv #3
Der Konsensus für das erste Motiv ist PtPYATTxhh, worin x jedwede Aminosäure und h I, L oder V ist. Das Vorhandensein eines Tyrosins in der Mitte des Motivs zeigt eine Stelle für eine Phosphorylierung an. Die anderen zwei Motive bestehen aus Strecken von Prolinen, getrennt durch eine oder zwei Aminosäuren, und erinnern an Bindungsstellen für SH3-Domänen. Insbesondere stellt die LPPP-Sequenz im Motiv #2 eine gute Bindungsstelle für das Drosophila-Enabled-Protein oder dessen Säuger-Homolog Mena (Hiebuhr et al., 1997) bereit. Alle drei von diesen konservierten Stellen können als Bindungsstellen für Domänen (z. B. SH3-Domänen) von Linker/Adapter-Proteinen wirken, welche in der Robo-vermittelten Signalweiterleitung eine Rolle spielen.
Robo wird auf longitudinalen Axonen im Drosophila-Embryo regional exprimiert. Um die Rolle, welche robo bei der Steuerung des Axon-Kreuzungsverhaltens spielen könnte, zu bestimmen, untersuchten wir das robo-Expressionsmuster im embryonischen ZNS. Das in situ-Hybridisierungsmuster von robo-mRNA in Drosophila zeigt, daß es eine erhöhte und weit verbreitete Expression im ZNS besitzt. Wir gewannen einen monoklonalen Antikörper (MAb 13C9) gegen einen Teil des extrazellulären Bereichs (Aminosäuren 404–725) des Proteins, um die Robo-Expression sichtbar zu machen. Robo wird zuerst im Embryo in schwacher Expression in lateralen Streifen während der Keimband-Extension beobachtet. Zu Beginn der Keimband-Retraktion wird eine Robo-Expression im Neuroektoderm beobachtet. Am Ende des Stadiums 12, wenn sich die Wachstumskegel zum ersten Mal ausbreiten, wird Robo auf Wachstumskegeln beobachtet, welche ipsilateral projizieren, einschließlich pCC, aCC, MP1, dMP2 und vMP2. Überraschenderweise wird geringe oder gar keine Robo-Expression auf kommissuralen Wachstumskegeln beobachtet, wenn sie sich in Richtung auf und quer über die Mittellinie wandern. Wenn diese Wachstumskegel jedoch abbiegen, um longitudinal weiter zu projizieren, erhöht sich ihr Spiegel der Robo-Expression drastisch. Robo wird auf allen longitudinal-projizierenden Wachstumskegeln und Axonen bei hohen Spiegeln exprimiert. Im Gegensatz dazu wird Robo bei nahezu nicht nachweisbaren Spiegeln auf kommissuralen Axons exprimiert. Die ist bemerkenswert, da ~90% der Axons in den Longitudinal-Trakten auch Axonsegmente aufweisen, welche in einer der Kommissaren kreuzen. Somit ist die Robo-Expression regional eingegrenzt. Eine Robo-Expression wird auch bei einem niedrigen Spiegel über die gesamte Epidermis hinweg und bei einem höheren Spiegel an Muskelan knüpfungsstellen beobachtet. In Embryos des Stadiums 16–17, kann eine blasse Robo-Färbung in den Kommissaren gesehen werden, jedoch bei viel niedrigeren Spiegeln, als in den Longitudinal-Trakten beobachtet.
Immunoelektronenmikroskopie von Robo. Wir setzten Immun-Elektronenmikroskopie ein, um die Robo-Lokalisierung bei einer höheren Auflösung zu untersuchen. In Embryos des Stadiums 13 wird Robo bei höheren Spiegeln auf Wachstumskegeln und Filopodien in den Longitudinal-Trakten als auf den Longitudinal-Axons selbst exprimiert. Diese Lokalisierung ist konsistent mit dem Modell, das Robo als ein Lenk-Rezeptor fungiert. Die erhöhte Empfindlichkeit der Immunelektronenmikroskopie enthüllt das Vorhandensein von sehr niedrigen Spiegeln an Robo-Protein auf der Oberfläche von kommissuralen Axons. Darüber hinaus können Robo-positive Vesikel innerhalb der kommissuralen Axons gesehen werden, was möglicherweise den Transport von Robo zum Wachstumskegel repräsentiert. Durch Rekonstruieren des Weges eines Einzelaxons durch Anwendung von Reihenschnitten bestätigen wir schließlich, daß die Robo-Expression in großem Maße hochreguliert wird, nachdem einzelne Axons von der Kommissar in einen Longitudinal-Trakt abbiegen. Die Expression von Robo auf nicht-kreuzenden und nach-Kreuzungs-Axons und sein höherer Expressionsspiegel auf Wachstumskegeln und deren Filopodien stellen ein Modell bereit, worin Robo als ein Axon-Lenkungsrezeptor für eine von der Mittellinie abstoßende Richtungsanweisung fungiert.
Transgene Expression von Robo.
Wir hatten die Hypothese, daß wenn Robo tatsächlich ein Wachstumskegel-Rezeptor für einen Mittellinien-Abstoßungsstoff ist, die pan-neurale Expression des Robo-Proteins während der frühen Stufen des Axon-Auswachsens dann zu einem robo-Funktionsgewinn-Phänotyp führen könnte, der dem comm-Funktionsverlust ähnlich und zum robo-Funktionsverlust entgegengesetzt ist. Um diese Hypothese zu testen, klonierten wird eine robo-cDNA, enthaltend den vollständigen ORF, jedoch ohne die meisten seiner untranslatierten Regionen (UTRs), stromabwärts des UAS-Promotors in den pUAST-Vektor, und erzeugten transgene Fliegen zur Verwendung im GAL4-System (Brand und Perrimon, 1993). Die Expression von robo in allen Neuronen wurde durch Kreuzen der UAS-robo-Fliegen mit entweder den elav-GAL4- oder scabrous-GAL4-Linien erzielt.
Überraschenderweise erzeugte die pan-neurale Expression von robo-mRNA keinen starken Axongerüst-Phänotyp, wie mit dem MAb BP 102 geassayed wurde. Die Färbung mit Anti-Fas II (MAb 1D4) enthüllte schwache Faszikulierungs-Defizite, aber insgesamt sah das Axongerüst ziemlich normal aus. Ein Einblick, warum wir darin versagten, einen stärkeren ektopischen robo-Expressionsphänotyp zu beobachten, wurde durch Färbung dieser Embryos mit dem Anti-Robo-MAb gewonnen. Interessanterweise bleibt das Robo-Protein, obwohl bei höheren Spiegeln als im Wildtyp exprimiert, begrenzt wie im Wildtyp, d. h. hohe Spiegel der Expression auf den longitudinalen Abschnitten von Axonen und sehr geringe Spiegel auf den Kommissaren. Dieses Ergebnis zeigt, daß es eine starke Regulierung der Robo-Expression, wahrscheinlich post-translational, geben maß, welche seine Lokalisierung auf longitudinale Axonsegmente sicherstellt. Ein derartiger Mechanismus könnte durch die Regulierung von Protein-Translation, -Transport, -Insertion, -Internalisierung und/oder -Stabilität funktionieren.
Wir verwendeten diese transgenen Fliegen, um robo-Mutanten zu retten. Die Expression von robo durch die elav-GAL4-Linie sowohl in robo3- als auch robos-Homozygoten rettete die Mittellinien-Kreuzung bzw. -Überquerung von Fas II-positiven Axons, einschließlich pCC und anderen identifizierten Neuronen.
Robo scheint auf zell-autonome Weise zu funktionieren.
Um zu testen, ob Robo in einer zellautonomen Weise funktionieren kann, verwendeten wir das UAS-robo-Transgen mit der ftzng-GAL4-Linie (Lin et al., 1994). Die ftzng-GAL4-Linie exprimiert in einer Untergruppe von ZNS-Neuronen, einschließlich vielen der frühesten Neuronen, welche später noch von der robo-Mutation betroffen werden, wie pCC, vMP2, dMP2 und MP1. Die Expression von robo durch die ftzng-GAL4-Linie ist ausreichend, um diese identifizierten Neuronen in der robo-Mutante zu retten: pCC, welches in robo-Mutanten auf die Mittellinie zu wandert und sie überquert, projiziert in diesen geretteten Embryonen nun ipsilateral und kreuzt die Mittellinie nicht. Als die gleichen Embryonen mit dem Anti-robo-MAb 13C9 gefärbt wurden, beobachteten wir, daß alle Robo-positiven Axone die Mittellinie nicht überquerten. Die ftzng-GAL4-Linie lenkt die Expression in vielen der Axone in der pCC-Bahn (Lin et al., 1994), einem medialen longitudinalen Bündel. In robo-Mutanten kreuzt dieses Axonbündel willkürlich über die Mittellinie und umkreist selbige, wobei eine Anknüpfung an seine kontralaterale Bahn erfolgt. Bei Rettung durch die ftzng-GAL4-Linie, welche UAS-robo steuert, bleibt dieser Weg nun weitgehend auf seiner eigenen Seite der Mittellinie, selbst obwohl gelegentlich einige wenige Axons die Mittellinie kreuzen. Diese Experimente unterstützen die Vorstellung, daß Robo in einer zellautonomen Weise funktionieren kann.
Expression von Säuger-robol im Ratten-Rückenmark.
Die Isolation mehrerer Wirbeltier-Robo-Homologe legt nahe, daß Robo eine ähnliche Rolle bei der Abstimmung der Mittellinien-Überquerung im Wirbeltier-Nervensystem spielen kann, wie es dies in Drosophila tut. Im Wirbeltier-Rückenmark besteht die ventrale Mittellinie aus einer einzigartigen Gruppe von Zellen, welche die Bodenplatte genannt wird (zur Übersicht, Colamarino und Tessier-Lavingne, 1995). Wie im Drosophila-Nervensystem enthält das Wirbeltier-Rückenmark wohl kreuzende als auch nicht-kreuzende Axons. Spinale kommissurale Neuronen werden in der dorsalen Hälfte des Rückenmarks geboren; kommissurale Axons projizieren zur und kreuzen die Bodenplatte, bevor sie longitudinal in einer rostralen Richtung abbiegen. Im Gegensatz dazu kreuzen die Axons von zwei anderen Klassen von Neuronen, die dorsalen Assoziationsneuronen und die ventralen Motoneuronen, die Bodenplatte nicht (Altman und Bayer, 1984).
Um die Möglichkeit zu prüfen, daß Robo eine Rolle bei der Organisation der Projektionen dieser spinalen Neuronen spielt, untersuchten wir die Expression von Ratten-robol durch RNA-in-situ-Hybridisierung. Eine Ratten-robol-Ribosonde, überspannend die ersten drei Ig-Domänen, wurde an Querschnitte von E13-Rattenrückenmark hybridisiert. Bei E13, wenn sich viele kommissurale Axons bereits quer durch die Bodenplatte erstreckt haben werden (Altman und Bayer, 1984), wird Ratten-robol bei hohen Spiegeln im dorsalen Rückenmark in einem Muster, entsprechend den Zellkörpern von Kommissuralneuronen, exprimiert. Rattenrobol wird auch bei niedrigeren Spiegeln in einer Subpopulation ventraler Zellen in der Region der sich entwickelnden motorischen Säule exprimiert. Interessanterweise ist dieses Expressionsmuster ähnlich zu und überlappend teilweise mit der mRNA, welche DCC codiert, ein anderes Mitglied der Ig-Superfamilie, welches ebenfalls auf Kommissural- und Motoneuronen exprimiert wird und für einen Rezeptor für Netrin-1 codiert (Keino-Masu et al., 1996). Rattenrobol wird jedoch weder in der Bodenplatte oder der Dachplatte des Rückenmarks noch in den dorsalen Wurzelganglien exprimiert. Dies steht im Gegensatz zu Ratten-cdo, welches in der Dachplatte stark exprimiert wird, (KB, MT-L und R. Kraus). In der Peripherie wird ebenfalls festgestellt, daß Ratten-robol im Myotom und den sich entwickelnden Gliedmaßen in einem Muster exprimiert wird, das an c-met (Ebens et al., 1996) erinnert, was darauf hinweist, daß Ratten-robol auch von wandernden Muskelvorläuferzellen exprimiert werden kann. Deshalb wird, wie bei seinem Drosophila-Homolog, Ratten-roboI-RNA sowohl von kreuzenden als auch nicht-kreuzenden Populationen von Axonen exprimiert, was anzeigt, daß es für das funktionelle Äquivalent von D-Robo 1 codiert.
Genetische Ausgangsmaterialien.
Alle acht unabhängigen robo-Allele wurden auf, für Fasciclin III defizienten Chromosomen, wie beschrieben in Seeger et al., 1993, isoliert. Die anschließende Verwendung einer Duplikation, welche FasIII einschließt, und Rekombination der robo-Chromosomen zeigt, daß der robo-Phänotyp unabhängig von der Abwesenheit von FasIII ist. Defizienzen wurden aus dem Drosophila-"Stock Center" in Bloomington, Indiana, erhalten.
Klovierung und molekulare Analyse der robo-Gene.
Startpunkte für einen molekularen Walk zu robo wurden aus den "Berkeley"- und "Grete"-Drosophila-Genomprojekten erhalten. Das Chromosomen-Walking wurde unter Anwendung von Standardtechniken zur Isolierung von Cosmiden aus der Tamkun-Bibliothek (Tamkun et al., 1992) durchgeführt. cDNAs wurden aus der Zinn-9-12-Stunden-Drosophila-Embryo-gtl 1-Bibliothek (Zinn et al., 1988) und aus einer humanen fötalen Gehirn-Bibliothek (Stratagene) isoliert. Ein Northern-Blot von Poly-A⁺-RNA und reverse Northern-Blots wurden unter Anwendung von empfindlichen Church-Bedingungen hybridisiert.
Die Sequenzierung der cDNAs und genomischen Subklone erfolgte durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung von Sequenaee (USB) unter Befolgung des Protokolls des Herstellers und mit dem "AutoRead"-Kit oder "AutoCycle"-Kit (Pharmacia) oder durch 33P-Zyklus-Sequenzierung. Die Reaktionen wurden auf automatischen Pharmacia-LKB- bzw. ABI-Lasenfluoreszenz-DNA-Sequenziervorrichtungen analysiert. Die cDNAs wurden auf beiden Strängen vollständig sequenziert. Sequenz-"Contigs" wurden unter Anwendung der Software Lasergene, Intelligenetics, und AssemblyLIGN (Kodak Eastman) kompiliert bzw. zusammengestellt. Datenbank-Suchen wurden Anwendung von BLAST (Altschuel et al., 1990) durchgeführt.
Eine Volllängen-D-robol-cDNA wurde durch Ligieren zwei partieller cDNAs an einer internen HpaI-Stelle und Subklonieren in die EcoRI-Stelle von pBluescript.SK+ erzeugt. Eine Volllängen-H-robol-cDNA wurde durch Ligieren eines XbaI-SaII-Fragments aus einer cDNA und eines PCR-Produktes, codierend für die carboxyterminalen 222 Aminosäuren, an einer SaII-Stelle synthetisiert. Bei dem PCR-Produkt wurde eine EcoRI-Stelle am Stop-Codon eingefügt. Das Ligationsprodukt wurde in mit XbaI und EcoRI verdauten pBluescript.SK+ kloniert.
Um die Ratten-robol-cDNA zu klonieren, wurden degenerierte Oligonukleotid-Primer, entworfen gegen Sequenzen, welche zwischen den 5'-Enden von D-Robo1 und H-Robol konserviert sind, verwendet, um ein 500-bp-Fragment aus einer E13-Rattengehirn-cDNA mittels PCR zu amplifizieren. Dieses Fragment wurde verwendet, um eine E13-Rückenmark-Bibliothek bei hoher Stringent zu screenen, was zur Isolierung eines 4,2-kb-cDNA-Klons führte, welcher alle außer den letzten 700 Nukleotiden umfaßte. Anschließende Screenings der Bibliothek mit nicht-überlappenden Sonden aus dieser cDNA führten zur Isolierung von 4 teilweisen und 7 Volllängen-Klonen. Um die Ratten-robo2-cDNA zu klonieren, screenten wir die gleiche Bibliothek mit einem Fragment der H-robo2-cDNA.
Exprimierte Sequenz-Tag- und Genomische Sequenzen.
Die ESTs yu23d11 (#H77734), zr54g12 (#AA236414) und yg76e12 (#H52936, #H52937) codieren für Abschnitte von H-RoboI. Der EST yg7e12 wird abweichend an einen Teil des humanen Glycophorin-B-Gens angespleißt. Fünf ESTs yn50a07, yg02b06, yg17b06, yn13a04 und ym17g11 codieren für einen Teil von H-robo2. Der Drosophila-Pl-K1on DS00329 codiert für die genomische Sequenz von D-robo2. Die Sequenzen 1825710 und 1825711 (beide: #U88183; Locus ZK377) codieren für die vorhergesagte Sequenz von C. elegans-robo. Der EST vi62e02 (#AA499193) codiert für Maus-robol.
Identifizierung molekularer Defekte in robo-Allelen.
Southern-Blots von robo-Allelen und ihren parentalen Chromosomen wurden mit Fragmenten aus dem genomischen Cosmid-Klon 106–1435 oder partiellen cDNA-Klonen hybridisiert, um Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen zu identifizieren, welche die robo-Transkriptionseinheit betreffen. DNA wurde aus homozygoten Mutantenembryonen erhalten. Anschließend wurden 35 Zyklen PCR an der aus einem halben Embryo erhaltenen DNA durchgeführt. Die für die Region, welche den CfoI-Polymorphismus flankiert, spezifischen Primer, welche verwendet wurden, waren: ROBO6 (5'-GCATTGGGTCATCTGTAGAG-3') und ROBO23 (5'-AGCTATCTGGAGGGAGGCAT-3'). Die PCR-Produkte wurden auf einer Pharmacia-H300-Zentrifugiersäule gereinigt und direkt sequenziert.
Transformation von Drosophila, robo-Rescue und Überexpression.
Das 16 kb große XbaI-Fragment aus dem Cosmid 106-1435 wurde in dem Drosophila-Transformationsvektor pCaSpeR3 kloniert. Transformantenlinien wurden erzeugt und durch Standardvorgehen kartiert. Vier unabhängige Linien retteten gezeigtermaßen robo^1,3,5-Allele, wie beurteilt durch MAb 1D4-Färbung.
Die PCR-Amplifikation des D-robo-ORF unter Verwendung der Primer (5'-GAGTGGTGAATTCAACAGCACCAAAACCACAAAATGCATCCC-3') und (5'-CGGGGAGTCTAGAACACTTCATCCTTAGGTG-3') erzeugte ein PCR-Produkt mit einer veränderten Ribosomenbindungsstelle, welches dem Drosophila-Consensus (Cavener, 1987), stärker entspricht und lediglich 21 by 5'-UTR- und keine 3'-UTR-Sequenzen aufweist. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und XbaI verdaut und in pBluescript (Stratagene) und anschließend pUAST (Brand und Perrimon, 1993) kloniert. Die Transformantenlinien wurden gekreuzt mit elav-GAL4- und sca-GAL4-Linien, welche GAL4 in allen Neuronen exprimieren, oder ftzng-GAL4, welches Expression in einer Untergruppe von ZNS-Neuronen aufweist (Lin et al., 1994). Embryonen wurden durch Färben mit den MAbs BP102, 1D4 und 13C9 getestet. Für eine ektopische Expression im robo-Mutantenhintergrund, wurden die Ausgangsformen robo³ und robo⁵ (beide ohne Protein) verwendet. Kreuzungen verwendeten die Ausgangsformen w; robo/CyO; UAS-robo und w; robo/CyO; elav-GAL4. Aufgrund der Schwierigkeit, eine balancierte Ausgangsform aufrecht zu erhalten, wurden robo/+; ftz-ngGAL4/+-Männchen nach Bedarf erzeugt.
Erzeugung von Fusionsproteinen und Antikörpern.
Ein mit sechs Histidin markiertes Fusionsprotein wurde durch Klonieren der Aminosäuren 404–725 des D-robo-Proteins in die PstI-Stelle des Vektors pQE31 (Quiagen) konstruiert. Fusionsproteine wurden unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und anschließend gegen PBS dialysiert. Die Immunisierung von Mäusen und die MAb-Herstellung folgten Standardprotokollen (Patel, 1994).
RNA-Lokalisierung und Protein-Immuncytochemie.
Mit Digoxigenin markierte Antisinn-robo-Transkripte wurden aus einem Subklon einer robocDNA in Bluescript erzeugt. Eine in-situ-Gewebe-Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Tear et al., 1996. Immuncytochemie wurde durchgeführt, wie beschrieben von Patel, 1994. MAb 1D4 wurde bei einer Verdünnung von 1 : 5 und BP 102 bei 1 : 10 verwendet. Für eine Anti-robo-Färbung wurde der MAb 13C9 1 : 10 in PBS mit 0,1% Tween-20 verdünnt, und die Embryonen wurden fixiert und aufgebrochen, um die Exposition an Methanol zu minimieren. Das Vorhandensein von Triton und die Aufbewahrung von Embryonen in Methanol zerstörten nachgewiesenermaßen beide die Aktivität von MAb 13C9.
Die in-situ-Hybridisierung von Ratten-Rückenmark wurde im wesentlichen ausgeführt, wie beschrieben in Fan und Tessier-Lavigne, 1994. E13-Embryonen wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, verarbeitet, in OCT eingebettet und zu 10 m zerschnitten. Eine 1,0 kb große 355-Antisinn-rRobo-Ribosonde, welche die ersten drei Immunglobulindomänen überspannte, wurde für die Hybridisierung verwendet. Eine zusätzliche nicht-überlappende Sonde wurde ebenfalls mit identischen Resultaten verwendet. DCC-Transkripte wurden nachgewiesen, wie beschrieben in Keino-Masu et al., 1996. Die Immunhistochemie gegen TAG-1 wurde an 10 m-Querschnitten des Rückenmarks unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 4D7 (Dodd et al., 1988) ausgeführt.
Elektronenmikroskopie.
Canton S-Embryonen wurden von Hand devitellinisiert, dorsal geöffnet, um den Darm zu entnehmen, und für eine Immun-Elektronenmikroskopie gemäß den früher beschriebenen Vorgehensweisen (Lin et al., 1994) mit den folgenden Modifikationen vorbereitet. Die fixierten Embryonen wurden aufeinanderfolgend mit MAb 13C9 (1 : 1) während 1–2 Stunden, biotinyliertem Ziege-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1 : 250) während 1,5 Stunden und dann Streptavidin-konjugierter HRP (1 : 200) während 1,5 Stunden inkubiert. Wasserstoffperoxid (0,01 %) wurde anstelle von Glucoseoxidase für die HRP-DAB-Reaktion verwendet.
Literaturbezugsstellen

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Obwohl die vorstehende Erfindung in einiger Ausführlichkeit auf dem Wege von Veranschaulichung und Beispielen aus Zwecken der Deutlichkeit des Verständnisses beschrieben wurde, wird es dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet angesichts der Lehren dieser Erfindung offensichtlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein isoliertes Polypeptid, welches die SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 umfasst.
Ein isoliertes Polypeptid, welches die SEQ ID NR: 8 umfasst, oder ein Fragment von diesem, welches die Reste 1–12, die Reste 18–28, die Reste 31–40 oder die Reste 45–65 der SEQ ID NR: 8 umfasst.
Ein isoliertes Polypeptid, welches die SEQ ID NR: 10 umfasst, oder ein Fragment von diesem, welches die Reste 5–16, die Reste 38–47, die Reste 83–94, die Reste 112–125, die Reste 168–180, die Reste 195–209, die Reste 222–235 oder die Reste 241–254 der SEQ ID NR: 10 umfasst.
Eine isolierte rekombinante Nukleinsäure, die mit einem Nukleotid (Nukleotiden) verknüpft ist, das (die) von dem verschieden ist (sind), mit dem sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist, welche einen codierenden Strang umfasst, der ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 codiert.
Eine Zelle, welche eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 umfasst.
Ein Verfahren zur Erzeugung eines Robo-Polypeptids, welches die folgenden Schritte umfasst: Inkubieren einer Wirtszelle oder eines Zellextrakts, welcher eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 enthält, unter Bedingungen, durch welche das Polypeptid, das durch die Nukleinsäure codiert wird, exprimiert wird, und Gewinnen des exprimierten Polypeptids.
Ein Verfahren zum Modulieren der Funktion oder Morphologie einer Zielzelle in vitro, wobei das Verfahren das Bereitstellen der Zielzelle in Kultur mit einem Polypeptid, das die SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8, 10 umfasst, oder einem Antikörper, der für das Polypeptid spezifisch ist, umfasst.
Eine rekombinante Nukleinsäure, welche einen Strang der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 umfasst, wobei der Strang durch weniger als 500 by der nativen flankierenden Seqenz flankiert ist.
Ein Antikörper, der für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 spezifisch ist.