KR20200016292A - 재조합 robo2 단백질, 조성물, 방법 및 그의 용도 - Google Patents

재조합 robo2 단백질, 조성물, 방법 및 그의 용도 Download PDF

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KR20200016292A
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gly
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스티븐 베라시
자넷 엘리자베스 불만
나단 히긴슨-스캇
마이클 샤마시킨
매튜 루소
스테파노 브이. 굴라
종 션 주오
스리쿠마 알. 코단가틸
웨이닝 루
슈에핑 판
데이빗 제이. 샐런트
Original Assignee
화이자 인코포레이티드
보스턴 메디칼 센터 코포레이션
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Abstract

본 발명은 SLIT 리간드에 결합하고 라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2) 세포 표면 수용체에 대한 그의 결합을 방지하도록 설계된 재조합 ROBO2 단백질을 제공한다. 또한, 이들 재조합 ROBO2 단백질의 사용 방법이 제공된다.

Description

재조합 ROBO2 단백질, 조성물, 방법 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 6월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 62/514,242; 및 2018년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 62/663,082를 우선권 주장하며, 이들 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
공동 연구 성명서 당사자
본원에 의해 청구된 발명은 아래에 열거된 공동 연구 협정 당사자에 의해 또는 그를 대신하여 이루어졌다. 공동 연구 협정은 청구된 발명이 이루어진 날짜 또는 그 이전에 발효되었으며 청구된 발명은 공동 연구 협정의 범주 내에서 수행된 활동의 결과로서 이루어졌다. 공동 연구 협정 당사자는 보스톤 메디칼 센터 코포레이션(BOSTON MEDICAL CENTER CORP.)과 화이자 인크.(PFIZER INC.)이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2018년 5월 3일에 생성된 상기 ASCII 카피는 PCFC-0043-WO1_SL.txt로 명명되고 그 크기가 54,754 바이트이다.
만성 신장 질환 (CKD)은 전 세계 공중 보건 문제이며, 종종 말기 신부전으로 이어진다. CKD는 미국 인구의 대략 13%, 또는 미국 내에서 ~2천7백만명에서 발생하고 전세계적으로는 5억명 초과에서 발생한다. CKD의 유병률은 일반 대중 내에서 당뇨병과 비만의 급속한 확산이 지속되기 때문에 계속 증가할 것으로 예상된다. 미국에서 약 50만명의 CKD 환자 (전 세계적으로는 ~7백만명)가 말기 신질환 (ESRD)으로 진행될 것이며, 생존을 위해 투석 또는 신장 이식이 필요할 것이다. ESRD의 이환율과 사망률은 높으며 매년 적어도 $400억 비용이 든다. 단백뇨 (즉, 소변에 과량의 혈청 단백질이 존재함 - 통상적으로 소변 알부민 수준 >30 mg/일로서 정의됨)는 당뇨병이 있는 환자 및 당뇨병이 없는 환자에서 초기 바이오마커, 위험 인자 및 CKD의 대리 결과이다. CKD의 초기 단계 동안 단백뇨 수준을 감소시키는 치료는 ESRD로의 진행을 늦출 수 있다. 그러나, 단백뇨가 있는 CKD 환자에게는 현재 이용가능한 신장 족세포 특이적 항-단백뇨 치료법이 없다.
족세포는 사구체 기저막의 외부 표면을 덮기 위해 1차 및 2차 돌기를 연장하는 특화된 상피 세포이다. 이웃하는 족세포로부터의 액틴-풍부한 서로 맞물리는 2차 돌기 (즉, 족양 돌기)는 단백질 투과에 대한 최종 장벽을 형성하는 반-다공성 슬릿-다이어프램에 의해 브릿지된 여과 슬릿을 창출한다. 단백뇨는 당뇨병성 및 비-당뇨병성 신장 질환에서 족세포 손상의 임상적 시그너처이다. 족세포의 분자 성분에 있어서의 유전적, 선천적 또는 후천적 이상이 단백뇨를 유발한다는 것을 제시하는 공개된 연구에 관한 확장 군이 있다. 족세포 슬릿-다이어프램 단백질, 예컨대 네프린 및 포도신의 유전적 돌연변이가 유전성 형태의 단백뇨 신장 질환과 연관이 있는 반면, 슬릿-다이어프램을 구성하고 이와 연관되는 단백질이 단순한 구조적 장벽 이상이라는 것이 점점 더 명백해지고 있다. 따라서, 실질적인 증거는 이들 단백질이 족세포 족양 돌기 구조에 영향을 미칠 수 있고 액틴 세포 골격과의 상호작용을 통해 기능할 수 있는 균형 잡힌 시그널링 네트워크를 형성한다는 것을 시사한다.
라운드어바웃 (ROBO) 수용체
라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2; 또한 라운드어바웃 가이던스 수용체 2 또는 라운드어바웃 상동체 2로서 지칭됨)는 슬릿 가이던스 리간드 (SLIT) 단백질 리간드에 대한 수용체이다. ROBO2는 신장에서 사구체 족세포의 기저 표면에서 발현되고 슬릿 가이던스 리간드 2 (SLIT2)는 신장 사구체에 존재한다. SLIT2 결합 시, ROBO2는 사구체 여과 장벽에서 네프린과 복합체를 형성하고 네프린-유도된 액틴 중합을 억제하는 음성 조절인자로서 작용한다. ROBO2의 손실은 족세포에서 액틴 중합을 증가시키고 네프린-널 마우스에서 발견된 비정상인 족세포 구조적 표현형을 완화시킨다. ROBO2의 손실은 또한, 마우스에서 사구체 기저막에 대한 족세포의 부착을 증가시킨다. 이들 데이터는, ROBO2 염색체 전좌를 가진 환자에게는 단백뇨가 없다는 관찰과 함께, SLIT2-ROBO2 시그널링 경로의 차단이 네프린-유도된 액틴 중합을 증가시켜 단백뇨를 감소시킬 수 있었다는 것을 시사한다. ROBO2 시그널링의 차단은 또한, 네프린 유도된 액틴 중합의 상향 조절에 의해 단백뇨 질환에서 사구체 여과 장벽을 복원시킬 수 있다.
SLIT1, SLIT2 및 SLIT3. SLIT는 세포외 매트릭스와 연관된 분비된 단백질이다. 모든 SLIT의 단백질 서열은 높은 보존도를 제시하고 동일한 구조를 갖는다: N-말단 시그널 펩티드; D1-D4로 명명된 4개의 탠덤 류신-풍부 반복 도메인 (LRR); 6개의 표피 성장 인자 (EGF)-유사 도메인; 라미닌 G-유사 도메인; 추가의 1개 (무척추동물) 또는 3개 (척추동물) EGF-유사 도메인 및 C 말단 시스테인 노트 도메인. SLIT 리간드는 절단되어 공지되지 않은 기능의 짧은 C-말단 단편 (SLIT-C 산물), 및 활성화되고 ROBO에 대한 결합을 매개하는 긴 N-말단 단편 (SLIT-N 산물)을 산출할 수 있다. SLIT 리간드 뿐만 아니라 본원에 기재된 절단 산물 (예를 들어, SLIT-N, SLIT2-D2)은 ROBO2 활성을 평가하는데 사용될 수 있다.
4개의 ROBO 수용체가 척추동물에서 특징규명되었다: ROBO1/Dutt1; ROBO2; ROBO3/Rig-1 및 ROBO4/매직 라운드어바웃. ROBO1, ROBO2 및 ROBO3은 세포 부착 분자를 연상시키는 공통의 세포외 도메인 (ECD) 구조를 공유한다. 이러한 영역은 5개의 이뮤노글로불린-유사 (Ig-유사) 도메인 (Ig1, Ig2, Ig3, Ig4 및 Ig5)에 이어 3개의 피브로넥틴 유형 3 (FN3) 반복부를 함유한다 (도 1a). 또한, ROBO2는 도 1a에 예시된 바와 같이 그의 세포내 도메인 내에 4개의 세포질 보존된 (CC) 서열을 갖는다.
전장 인간 ROBO2 전구체의 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 24로서 제시된다. 21개 아미노산 ROBO2 리더 서열 (서열식별번호: 17; 서열식별번호: 24에 제시된 넘버링에 따른 잔기 1-21)은 단백질 생산 동안 절단되어 성숙한 ROBO2를 생산한다 (도 1a). 서열식별번호: 24에 제시된 넘버링에 따른 잔기 22-859는 세포외 도메인을 형성하고, 서열식별번호: 24에 제시된 잔기 860-880은 막횡단 도메인을 형성하며, 서열식별번호: 24에 제시된 잔기 881-1378은 세포질 도메인을 형성한다 (도 1a).
ROBO2의 5개의 Ig-유사 도메인 (Ig1, Ig2, Ig3, Ig4 및 Ig5)의 예시적인 서열은 표 23에 제시되어 있다. ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8), Ig1-Ig2 도메인간 링커 (서열식별번호: 10) 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커 (서열식별번호: 12)가 또한 표 23에 개시되어 있다.
SLIT의 D2 LRR 도메인 및 ROBO의 Ig1 및 Ig2 도메인은 진화적으로 보존되며 결합에 관여한다. ROBO의 Ig1 및 Ig2 도메인은 함께, SLIT 결합 도메인으로서 지칭되기도 한다. 연구는 ROBO2의 이뮤노글로불린-유사 (Ig-유사) 도메인 1 및 2 (Ig1 및 Ig2) 둘 다가 SLIT와 상호작용하지만; 제1 Ig-유사 도메인 (Ig1)이 SLIT에 대한 1차 결합 부위인 것으로 제시한 바 있다. 또한, 이전의 연구는 3개의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복부를 제거하는 것이, 제3 및 제4 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig3 및 Ig4)의 제거보다 SLIT에의 ROBO 결합에 더 큰 부정적인 영향을 미친다는 것을 표시하였다 (예를 들어, 문헌 [Liu et al., 2004, Molecular Cellular Neuroanatomy 39:256-261] 참조).
ROBO-SLIT 결합 시, Rho GTPase 및 그의 조절인자 (GAP 및 GEF)는 하류 시그널링 경로에 관여한다. SLIT의 존재 하에, SLIT-ROBO Rho GTPase 활성화 단백질 1 (srGAP1)은 ROBO의 CC3 도메인에 결합하고 RhoA 및 Cdc42를 불활성화시킨다. 이들 이펙터 단백질은 다른 결과들 중에서, 반발, 세포 골격 역학의 제어 및 세포 극성을 매개할 수 있다. SLIT가 존재하는 경우, Vilse/CrossGAP는 또한, ROBO의 CC2 도메인에 결합하고 Rac1 및 Cdc42를 억제할 수 있다. Rac1은 또한, ROBO의 CC2-3 도메인에 결합하는 어댑터 단백질 드레드록 (Dock)를 통해 GEF 단백질 선 오브 세븐리스 (Sos)를 동원함으로써 활성화된다. 이는 ROBO CC2-3 도메인에 결합하기도 하는 Rac1 및 p21-활성화된 키나제 (Pak)의 하류 표적을 활성화시킨다. 이러한 ROBO의 하류 시그널링 파트너는 반발 및 세포 골격 역학을 제어한다. 티로신 키나제 아벨손(Abelson; Abl)은 또한, ROBO CC3 도메인에 결합할 수 있고 CC1 도메인의 인산화를 통해 ROBO 시그널링을 길항할 수 있으며 세포 부착을 매개할 수 있다. Abl의 기질인 인에이블드(Enabled; Ena)가 또한, ROBO CC1 및 CC2 도메인에 결합한다. 모든 이들 하류 ROBO-SLIT 분자는 ROBO2 활성을 평가할 뿐만 아니라 본원에 개시된 신규 재조합 ROBO2 단백질의 임의의 중화 효과를 평가하는데 사용될 수 있다.
신장에서 ROBO2는 어댑터 단백질 Nck를 통해 네프린과 복합체를 형성한다. 액틴 중합을 촉진하는 네프린의 역할과 대조적으로, SLIT-ROBO2 시그널링은 네프린-유도된 액틴 중합을 억제한다. 따라서, ROBO2 세포내 도메인 및 Nck의 결합은 ROBO2 활성을 평가하는데 사용될 수 있다.
많은 사구체 질환 (초점성 분절성 사구체 경화증 포함)을 앓고 있는 환자는 현재, 신장 기능을 보존하거나 또는 상기 질환을 달리 치료하기 위해 이용가능한 요법이 없다. 추가로, 단백뇨가 있는 CKD 환자에 대해서는 현재 이용가능한 치료제가 없다. 따라서, ROBO2-SLIT 시그널링을 조정함으로써, 족세포 기능을 보존 또는 조정하고 단백뇨를 감소시키거나 또는 ROBO2-SLIT 결합 및 시그널링과 연관되거나 또는 그에 의해 매개되는 신질환을 치료 또는 예방하는 치료제를 개발할 필요가 있다.
본 발명은 SLIT 리간드에 결합하는 재조합 ROBO2 단백질 뿐만 아니라 그의 용도 및 연관된 방법을 제공한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 또는 확실히 할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 실시양태 (E)에 의해 포괄되도록 의도된다.
E1. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203을 포함하고 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 추가로 포함하는 재조합 라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2) 단백질.
E2. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203, 및 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인으로 본질적으로 이루어진 재조합 라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2) 단백질.
E3. (i) SLIT-결합 모이어티; 및 (ii) 반감기 연장 모이어티를 포함하는 재조합 라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2) 단백질로서, 여기서 상기 SLIT-결합 모이어티는 ROBO2 세포외 도메인의 부분을 포함하는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
E4. 상기 ROBO2 세포외 도메인의 부분이 ROBO2의 제1의 2개 이뮤노글로불린-유사 (Ig1 및 Ig2) 도메인, 및 서열식별번호: 12의 서열로 이루어진 C-말단 서열을 포함하는 것인, E3의 재조합 ROBO2 단백질.
E5. 상기 ROBO2 세포외 도메인의 부분이 ROBO2 프리-이뮤노글로불린-유사 1 (Ig1) 서열 (SRLRQEDFP (서열식별번호: 8)), 제1 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig1), 제1 이뮤노글로불린-유사 도메인과 제2 이뮤노글로불린-유사 도메인 사이의 도메인간 링커 (Ig1-Ig2 도메인간 링커; VALLR (서열식별번호: 10)), 제2 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig2), 및 제2 이뮤노글로불린-유사 도메인과 제3 이뮤노글로불린-유사 도메인 사이의 도메인간 링커 (Ig2-Ig3 도메인간 링커; VFER (서열식별번호: 12))로 본질적으로 이루어지는 것인, E3의 재조합 ROBO2 단백질.
E6. 상기 ROBO2 세포외 도메인의 부분이 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203으로 본질적으로 이루어지는 것인, E3-E5 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E7. 상기 반감기 연장 모이어티가 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 것인, E3-E6 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E8. 상기 이뮤노글로불린 도메인이 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 도메인인, E1, E2 또는 E7 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E9. 상기 Fc 도메인이 인간 IgG1의 Fc 도메인인, E8의 재조합 ROBO2 단백질.
E10. 상기 Fc 도메인이 이펙터 기능을 제거하도록 변형되는 것인, E9의 재조합 ROBO2 단백질.
E11. 상기 Fc 도메인이 인간 IgG1의 Fc 도메인이고; 상기 인간 IgG1 Fc 도메인이, 모두 카바트(Kabat)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 234에서 류신에서 알라닌으로의 치환 (L234A), 아미노산 잔기 번호 235에서 류신에서 알라닌으로의 치환 (L235A), 및 아미노산 잔기 번호 237에서 글리신에서 알라닌으로의 치환 (G237A)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인, E10의 재조합 ROBO2 단백질.
E12. 상기 인간 IgG1 Fc 도메인이 카바트에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 잔기 번호 447에서 리신을 포함하지 않는 것인, E9-E11 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E13. 상기 Fc 도메인이 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 210 내지 440을 포함하는 것인, E11-E12 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E14. 상기 Fc 도메인이 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 210 내지 440으로 이루어지는 것인, E11-E12 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E15. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 상기 아미노산 잔기 1 내지 203이 상기 이뮤노글로불린 도메인과 인접해 있는 것인, E1, E2 또는 E7 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E16. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 상기 아미노산 잔기 1 내지 203이 링커를 통해 상기 이뮤노글로불린 도메인에 연결되는 것인, E1, E2 또는 E7 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E17. 상기 링커가 약 1 내지 30개 아미노산 잔기를 포함하는 펩티딜 링커인, E16의 재조합 ROBO2 단백질.
E18. 상기 펩티딜 링커가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, E17의 재조합 ROBO2 단백질:
a) 글리신 풍부 펩티드;
b) 글리신 및 세린을 포함하는 펩티드;
c) 서열 (Gly-Gly-Ser)n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)을 갖는 펩티드 (서열식별번호: 22); 및
d) 서열 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)을 갖는 펩티드 (서열식별번호: 23).
E19. 상기 펩티딜 링커가 (Gly-Gly-Ser)2 (서열식별번호: 15)인, E18의 재조합 ROBO2 단백질.
E20. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 ROBO2-Fc 단백질.
E21. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 ROBO2-Fc 단백질.
E22. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 ROBO2-Fc 단백질.
E23. ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고 ATCC 수탁 번호 PTA-124008을 갖는, E1-E22 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E24. 상기 ROBO2의 Ig1이 하기 돌연변이: S17T 및 R73Y 중 적어도 하나를 포함하며, 각각이 서열식별번호: 1에 따라 넘버링되는 것인, E4 또는 E5 중 어느 하나의 재조합 ROBO2-Fc 단백질.
E25. 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 ROBO2-Fc 단백질.
E26. 서열식별번호: 19의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 441에 위치한 C-말단 리신을 포함하지 않는, E25의 재조합 ROBO2-Fc 단백질.
E27. 상기 ROBO2가 인간 ROBO2인, E1-E26 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E28. 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 결합 친화도 (KD)로 SLIT2에 결합하는, E1-E27 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E29. SLIT2에의 ROBO1의 결합에 대한 KD 값보다 적어도 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 40배, 약 60배, 약 80배, 약 100배, 약 120배, 약 140배, 약 160배 더 낮은 KD로 SLIT2에 결합하는, E1-E27 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E30. SLIT2에의 ROBO1-Fc 단백질의 결합에 대한 KD 값보다 적어도 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 40배, 약 60배, 약 80배, 약 100배, 약 120배, 약 140배, 약 160배 더 낮은 KD 값으로 SLIT2에 결합하는, E1-E29 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E31. 상기 KD가 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정되는 것인, E28-E30 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E32. 상기 KD가 비아코어(Biacore) T200 기기를 사용하여 측정되는 것인, E31의 재조합 ROBO2 단백질.
E33. 상기 KD가 생물-층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정되는 것인, E28-E30 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E34. 상기 KD가 포르테바이오 옥테트(ForteBio Octet) 기기를 사용하여 측정되는 것인, E33의 재조합 ROBO2 단백질.
E35. SLIT 리간드와 ROBO2의 결합을 억제하는, E1-E34 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E36. ROBO2-의존성 SLITx-N 활성을 억제하는, E1-E34 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E37. SLIT 리간드와 ROBO2의 결합을 억제하고 ROBO2-의존성 SLIT-N 활성을 억제하는, E1-E36 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E38. 상기 ROBO2-의존성 SLITx-N 활성이 액틴 중합, 족세포 부착, 및 뉴런 세포 이동의 억제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, E1-E37 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E39. 약 15 nM, 약 13 nM, 약 11 nM, 약 9 nM, 약 7 nM, 약 6 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3 nM, 약 2 nM, 약 1 nM 이하의 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 갖는, E1-E38 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E40. 상기 IC50이 SLIT2에의 ROBO2의 결합의 억제에 대한 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정에 의해 측정되는 것인, E39의 재조합 ROBO2 단백질.
E41. 약 75 nM, 약 65 nM, 약 55 nM, 약 45 nM, 약 35 nM, 약 25 nM, 약 15 nM, 약 5 nM 이하의 반수 최대 IC50을 갖는, E1-E40 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E42. 상기 IC50이 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제를 측정함으로써 평가되는 것인, E41의 재조합 ROBO2 단백질.
E43. 상기 SLIT2가 인간 SLIT2인, E28-E42 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E44. 상기 재조합 ROBO2 단백질 중 2개가 회합되어 동종이량체를 형성하는 것인, E1-E43 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질.
E45. E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
E46. 서열식별번호: 21의 핵산 서열을 포함하는, E45의 단리된 핵산 분자.
E47. 서열식별번호: 21의 핵산 서열로 이루어진, E45의 단리된 핵산 분자.
E48. ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하고 ATCC 수탁 번호 PTA-124008을 갖는 단리된 핵산.
E49. 서열식별번호: 21의 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 ROBO2 단백질.
E50. 서열식별번호: 21의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 ROBO2 단백질.
E51. 고도로 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 21의 서열과 혼성화할 수 있는 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 ROBO2 단백질.
E52. E45-E48 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
E53. E45-E48 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
E54. E52의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
E55. 포유동물 세포인, E53 또는 E54의 숙주 세포.
E56. CHO 세포, HEK-293 세포, 또는 Sp2.0 세포인, E53 또는 E54의 숙주 세포.
E57. E53-E56 중 어느 하나의 숙주 세포를 재조합 ROBO2 단백질이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 상기 재조합 ROBO2 단백질을 제조하는 방법.
E58. 상기 재조합 ROBO2 단백질을 단리하는 것을 추가로 포함하는, E57의 방법.
E59. E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
E60. ROBO2의 생물학적 활성의 감소를 필요로 하는 대상체에게 E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, ROBO2의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
E61. 상기 ROBO2의 생물학적 활성이 적어도 하나의 SLIT 리간드에의 결합, 액틴 중합, 족세포 부착, 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N-매개된 억제를 억제하는 것, ROBO2와 srGAP1의 결합, 및 ROBO2와 Nck의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, E60의 방법.
E62. 신질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신질환을 치료하는 방법.
E63. 족세포를 E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 족세포 기능을 보존하는 방법.
E64. 족세포를 E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 족세포 기능을 조정하는 방법.
E65. 사구체 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 사구체 질환을 치료하는 방법.
E66. 초점성 분절성 사구체 경화증 (FSGS)의 치료를 필요로 하는 대상체에게 E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 초점성 분절성 사구체 경화증 (FSGS)을 치료하는 방법.
E67. 신병증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신병증을 치료하는 방법.
E68. 상기 신병증이 IgA 신병증인, E67의 방법.
E69. 상기 대상체가 인간인, E60-E68 중 어느 하나의 방법.
E70. 상기 재조합 ROBO2 단백질, 또는 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 것인, E60-E69 중 어느 하나의 방법.
E71. 상기 재조합 ROBO2 단백질, 또는 제약 조성물이 피하로 투여되는 것인, E60-E69 중 어느 하나의 방법.
E72. 재조합 ROBO2 단백질, 또는 제약 조성물이 약 1주에 2회, 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 1개월에 2회, 1개월에 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 4개월마다 1회 투여되는 것인, E60-E71 중 어느 하나의 방법.
E73. 의약으로서 사용하기 위한, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물.
E74. 세포에서 ROBO2의 활성을 감소시키는데 사용하기 위한, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물.
E75. 대상체에서 ROBO2의 활성을 감소시키는데 사용하기 위한, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물.
E76. 대상체에서 족세포 기능을 보존하는데 사용하기 위한, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물.
E77. 대상체에서 족세포 기능을 조정하는데 사용하기 위한, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물.
E78. 대상체에서 사구체 질환을 치료하는데 사용하기 위한, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물.
E79. 상기 사구체 질환이 FSGS인, E78의 재조합 ROBO2 단백질.
E80. 대상체에서 신병증을 치료하는데 사용하기 위한, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물.
E81. 상기 신병증이 IgA 신병증인, E80의 재조합 ROBO2 단백질.
E82. 세포에서 ROBO2의 활성을 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서의, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 용도.
E83. 대상체에서 ROBO2의 활성을 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서의, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 용도.
E84. 대상체에서 족세포 기능을 보존하기 위한 의약의 제조에 있어서의, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 용도.
E85. 대상체에서 족세포 기능을 조정하기 위한 의약의 제조에 있어서의, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 용도.
E86. 대상체에서 사구체 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 용도.
E87. 대상체에서 신병증을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물의 용도.
E88. 용기; E1-E44 중 어느 하나의 재조합 ROBO2 단백질 또는 E59의 제약 조성물을 포함하는, 상기 용기 내의 조성물; 및 치료를 필요로 하는 환자의 치료를 위하여 상기 재조합 ROBO2 단백질 또는 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것에 대한 지침서를 함유하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
도 1a는 인간 ROBO2의 도메인을 보여주는 그래픽 제시이다. 21개 아미노산 ROBO2 리더 서열 (서열식별번호: 17; 서열식별번호: 24에 제시된 넘버링에 따른 잔기 1-21)은 단백질 생산 동안 절단되어 성숙한 ROBO2를 생산한다. 서열식별번호: 24에 제시된 넘버링에 따른 잔기 22-859는 세포외 도메인을 형성하고, 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 잔기 860-880은 막횡단 도메인을 형성하며, 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 잔기 881-1378은 세포질 도메인을 형성한다. ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8), Ig1-Ig2 도메인간 링커 (서열식별번호: 10) 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커 (서열식별번호: 12)가 또한 제시된다.
도 1b는 본원에 기재된 예시적인 재조합 ROBO2-Fc 융합 단백질을 제시하는 그래픽 제시이다: 본원에 기재된 ROBO2-Fc. 1.0 (단지 Ig1 도메인, 즉 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 31 내지 127 만을 함유함), ROBO2-Fc. 1.1 (Ig1 도메인 및 Ig1-Ig2 도메인간 링커, 즉 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 31 내지 132를 함유함), ROBO2-Fc. 2.0 (Ig1 도메인, Ig1-Ig2 도메인간 링커, 및 Ig2 도메인, 즉 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 31 내지 220을 함유함), ROBO2-Fc. 2.1 (Ig1 도메인, Ig1-Ig2 도메인간 링커, Ig2 도메인, 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커, 즉 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 31 내지 224를 함유함), ROBO2-Fc. 2.2 (프리-Ig1 서열, Ig1 도메인, Ig1-Ig2 도메인간 링커, Ig2 도메인, 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커, 즉 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 22 내지 224를 함유함), ROBO2-Fc. 3.0 (Ig1 도메인, Ig1-Ig2 도메인간 링커, Ig2 도메인, Ig2-Ig3 도메인간 링커, Ig3 도메인, 즉 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 31 내지 309를 함유함) 및 ROBO2-Fc. 4.0 (Ig1 도메인, Ig1-Ig2 도메인간 링커, Ig2 도메인, Ig2-Ig3 도메인간 링커, Ig3 도메인, Ig3-Ig4 도메인간 링커 및 Ig4, 즉 서열식별번호: 24의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 31 내지 409를 함유함).
도 2는 ROBO2-Fc 2.2 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)을 제시한다. 잔기는 N-말단부터 시작하여 순차적으로 넘버링된다. Ig1 및 Ig2 도메인은 모든 대문자로 제시되는 반면, Fc 도메인은 소문자로 제시된다. 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8) 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커 (서열식별번호: 12)는 볼드체 및 이탤릭체로 제시되는 반면, Ig1-Ig2 도메인간 링커 (서열식별번호: 10)는 이탤릭체로 제시된다. 예측된 쇄내 및 쇄간 디술피드 결합은 연결선으로 예시되어 있다. 단일 폴리펩티드 쇄는 Fc 힌지 영역에서 디술피드 결합을 갖는 것으로 나타나고, 이는 제2의 Fc 포함 폴리펩티드 쇄와 이량체를 형성할 수 있다. 정규 N-결합된 글리코실화 컨센서스 서열 부위에 원을 두르고 (즉, NXS/T; 여기서 글리칸은 아스파라긴 잔기에 부착되고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있으며, 제3 아미노산은 세린 또는 트레오닌임), A228, A229 및 A231에 위치한 Fc-이펙터 기능 널 점 돌연변이는 볼드체로 제시된다. 6개 아미노산 Gly-Ser 링커 서열은 박스 내에 있는 영역으로 제시된다.
도 3은 ROBO2-Fc 2.1 (서열식별번호: 2)이 SLIT2에 결합하지만, ROBO2-Fc 1.1 (서열식별번호: 4) 및 ROBO2-Fc 2.0 (서열식별번호: 3)은 그렇지 않다는 것을 입증한다. 옥테트 레드를 활용하여, ROBO2-Fc 단백질을 10 μg/ml 하의 항-인간 결정화 단편 (AHFc) 센서 상으로 부하하고 7분 동안 100 nM SLIT2와 함께 인큐베이션한 다음, 센서를 640초 동안 완충액 단독에 옮겼다. ROBO2-Fc 4.0 (서열식별번호: 7)이 결합에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. ROBO2-Fc 2.1 (서열식별번호: 2)을 창출하기 위해 ROBO2의 Ig2 도메인 다음에 서열 VFER (서열식별번호: 12)을 부가하는 것은, SLIT2에 결합하는 ROBO2-Fc 융합 단백질을 생산하는데 필수적이었다.
도 4a-4c는 ROBO2-Fc 2.2 (서열식별번호: 1)가 높은 친화도로 SLIT2에 결합한다는 것을 입증한다. KD 값은 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여 측정되었다. 인간/시노몰구스 원숭이 SLIT2-D2 (ROBO2 결합 도메인, 100% 동일함)에 대한 ROBO2-Fc 2.2의 KD는 0.293 nM이었다 (도 4a). 인간 SLIT2-N (N 말단 단편)에 대한 ROBO2-Fc 2.2의 KD는 0.279 nM이었고 (도 4b), 래트 SLIT2-N에 대한 ROBO2-Fc 2.2의 KD는 0.543 nM이었다 (도 4c).
도 5는 ROBO2-Fc 2.2 (서열식별번호: 1)가 9 nM의 EC50을 갖는 높은 친화도로 인간 배아 신장 (HEK293) 세포 상에서 과다발현되는 인간 SLIT2-N에 결합한다는 것을 입증한다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 (AF647)로 표지된 ROBO2-Fc 2.2의 12-포인트, 2배 희석 시리즈를 SLIT2-N 발현 HEK293 세포 또는 대조군 HEK293 세포와 함께 인큐베이션하였다. 데이터는 SLIT2-N HEK293 세포 상에서의 ROBO2-Fc 2.2 AF647의 기하 평균 형광 강도 (Geo MFI)에서 대조군 HEK293 세포 상에서의 ROBO2-Fc 2.2 AF647의 기하 평균 형광 강도를 뺀 것으로 제시된다.
도 6a-6b는 균질 시간 분해 형광 (HTRF)에 의해 평가 시 ROBO2-Fc 2.2 (서열식별번호: 1)에 의해 세포 표면 ROBO2에 대한 SLIT2-N 결합의 용량-의존성 억제를 입증한다. ROBO-Fc 2.2 (흑색 사각형) 또는 이소타입 대조군 항체 (흑색 원형)의 11-포인트, 4배 용량 적정을 인간 SLIT2-N (도 6a) 또는 래트 SLIT2-N (도 6b) 인간 ROBO2 HTRF 검정에 부가하였다. ROBO2-Fc 2.2는 인간 SLIT2-N:인간 ROBO2 (7 nM의 IC50) 결합과 래트 SLIT2-N:인간 ROBO2 (4 nM의 IC50) 결합 둘 다의 강력한 중화인자였다.
도 7은 ROBO2-Fc 2.2에 의한 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제의 용량-의존성 억제를 도시한다. 뇌실하 구역 (SVZ) 뉴런 조직 세포 외식편을 1 nM SLIT2-N 및 일정 용량 범위의 ROBO2-Fc 2.2의 존재 하에 밤새 배양하였다. ROBO2-Fc 2.2는 51 nM의 IC50으로 용량-의존성 방식으로 뉴런 세포 이동을 복원할 수 있었다.
도 8은 예시적인 예방적 투약 레지멘을 이용하여 래트 수동성 헤이만 신염 모델에서 ROBO2-Fc 2.2의 처리에 의한 단백뇨의 억제를 입증한다. 표시된 군 각각에서의 12마리의 동물을 표시된 용량의 ROBO2-Fc 2.2 또는 무관한 이소타입 대조군 모노클로날 항체 (대조군)로, 제0일에 상기 모델의 유도 전날부터 시작하여 3일마다 피하로 처리하였다. Y축은 족세포 손상을 나타내는, 소변 내로의 단백질 누출의 측정 기준으로서 소변 알부민 대 크레아티닌의 비율 (mg/mg)을 표시한다. 래트 신장 브러시 보더 (항-Fx1a, 기저막 및 족세포)에 대항하여 생성된 양 항-혈청을 루이스 래트에게 주사하였다. 상기 래트에게는 래트 족세포에 결합된 상기 양 혈청에 대한 면역 반응이 발생하였다. 족세포가 손상되고 소멸됨에 따라 단백뇨가 증가한다. 25 mg/kg 하의 최고 용량의 ROBO2-Fc 2.2로 처리하면, 대조군 항체 처리와 비교 시 반복 측정 ANOVA 통계 분석에 의해 p 값 0.001 미만으로 단백뇨가 최대 45% 감소되었다. 용량 효과는 또한, p 값 0.001 미만으로 통계상 유의하였다.
도 9는 예시적인 치료적 투약 레지멘을 이용하여 래트 수동성 헤이만 신염 모델에서 ROBO2-Fc 2.2의 처리에 의한 단백뇨의 억제를 입증한다. 표시된 군 각각에서의 12마리의 동물을 표시된 용량의 ROBO2-Fc 2.2 또는 무관한 대조군 모노클로날 항체 (대조군)로, 하기 투약 레지멘을 이용하여 3일마다 피하로 처리하였다: 대조군 항체는 제0일에 투여되었고 (원형), ROBO2-Fc 2.2는 제0일 (사각형), 제6일 (삼각형) 또는 제9일 (역 삼각형)에 투여되었다. Y축은 족세포 손상을 나타내는, 소변 내로의 단백질 누출의 측정 기준으로서 소변 알부민 대 크레아티닌의 비율 (mg/mg)을 표시한다. 래트 신장 브러시 보더 (항-Fx1a, 기저막 및 족세포)에 대항하여 생성된 양 항-혈청을 루이스 래트에게 주사하였다. 이러한 래트에게서 래트 족세포에 결합된 상기 양 혈청에 대한 면역 반응이 발생하였다. 족세포가 손상되고 소멸됨에 따라 단백뇨가 증가하였다. 제0일, 제6일 및 제9일에 투여된 ROBO2-Fc 2.2로 처리하면, 대조군 항체 처리와 비교 시 각각의 ROBO2-Fc 2.2 처리된 군에 대한 반복 측정 ANOVA 통계 분석에 의해 p 값 0.001 미만으로 단백뇨가 유사한 정도, 최대 40% 감소되었다.
도 10a-10b는 ROBO2-Fc 2.2로 처리하는 것이 수동성 헤이만 신염 모델에서 족세포 하부 구조에 대한 손상을 감소시킨다는 것을 입증한다. 표시된 군 각각에서의 12마리의 동물을 표시된 용량의 ROBO2-Fc 2.2 또는 무관한 대조군 모노클로날 항체로, 25 mg/kg 하에 3일마다 피하로 처리하여, 제0일에 모델의 유도 전날부터 시작하여 100% 표적 적용 범위를 달성하였다. 제16일에 동물을 희생시킨 후, 선택된 신장 샘플을 투과 전자 현미경을 사용하여 디지털 영상화하였다. 반복없이, 200x 배율에서 발견된 처음 3개의 사구체의 3개의 모세관 루프를 5000x 및 10,000x 배율로 영상화하였다. 이미지J(ImageJ) 소프트웨어 (버전 1.47v; 미국 국립 보건원 (미국 메릴랜드주 베데스다))를 사용하여, 사구체 기저막 (GBM)의 단위 길이당 슬릿 다이어프램의 밀도 뿐만 아니라 인접한 족양 돌기의 폭을 고 배율 투과 전자 현미경 영상에서 수동으로 추적하고 측정하였다. 3가지 별도의 실험에 대해 샘플을 분석하였다. ROBO2-Fc 2.2 처리된 동물의 족세포 족양 돌기는 대조군 항체 처리된 동물보다 상당히 더 짧았으며 (도 10a), 슬릿 다이어프램의 밀도는 ROBO2-Fc 2.2 처리된 동물에서 유의하게 더 높았는데 (도 10b; 양측 T 검정에 의한 p 값 0.01 미만), 이는 그들이 덜 소멸되었고 사구체 손상으로부터 보호되었다는 것을 표시한다.
도 11은 ROBO2-Fc S17T/R73Y가 2.5 nM의 EC50을 갖는 높은 친화도로 인간 배아 신장 (HEK293) 세포 상에 과다발현된 인간 SLIT2-N에 결합한다는 것을 입증한다. 알렉사 플루오르 647 (AF647)로 표지된 ROBO2-Fc S17T/R73Y의 12-포인트, 2배 희석 시리즈를 SLIT2-N 발현 HEK293 세포 또는 대조군 HEK293 세포와 함께 인큐베이션하였다. 데이터는 SLIT2-N HEK293 세포 상에서의 ROBO2-Fc S17T/R73Y AF647의 기하 평균 형광 강도 (Geo MFI)에서 대조군 HEK293 세포 상에서의 ROBO2-Fc S17T/R73Y AF647의 기하 평균 형광 강도를 뺀 것으로서 제시된다.
도 12는 균질 시간 분해 형광 (HTRF)에 의해 평가 시 ROBO2-Fc S17T/R73Y에 의해 세포 표면 ROBO2에 대한 SLIT2-N 결합의 용량-의존성 억제를 입증한다. ROBO2-Fc S17T/R73Y (흑색 사각형) 또는 이소타입 대조군 항체 (흑색 원형)의 11-포인트, 4배 용량 적정을 인간 SLIT2-N 인간 ROBO2 HTRF 검정에 부가하였다. ROBO2-Fc S17T/R73Y는 1.4 nM의 IC50으로 결합하는 인간 SLIT2-N:인간 ROBO2의 강력한 중화인자였다.
도 13은 ROBO2-Fc S17T/R73Y에 의한 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제의 용량-의존성 억제를 도시한다. 뇌실하 구역 (SVZ) 뉴런 조직 세포 외식편을 1 nM SLIT2-N 및 적정된 양의 ROBO2-Fc S17T/R73Y의 존재 하에 밤새 배양하였다. ROBO2-Fc S17T/R73Y는 11.5 nM의 IC50으로 용량-의존성 방식으로 뉴런 세포 이동을 복원할 수 있었다.
도 14는 ROBO2 프리-Ig1 서열 (SRLRQEDFP; 서열식별번호: 8); Ig1 도메인, Ig2 도메인; 및 C-말단에 6x 히스티딘 태그 (His6) (서열식별번호: 25)를 수반한 ROBO2 Ig2-3 도메인간 링커 (VFER; 서열식별번호: 12)로 이루어지는 ROBO2-His 구축물의 결정 구조를 도시하는 도면을 제시한다. ROBO2-His의 결정 구조는 Asp7, Phe8 및 Pro9가 ROBO2의 Ig1 도메인의 구조적 완전성에 필수적인 상호작용에 실질적으로 관여한다는 것을 밝혀내었다.
도 15는 ROBO2-His 구축물의 결정 구조를 도시하는 도면을 제시한다. ROBO2-His6의 결정 구조 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")는 ROBO2 Ig2-3 도메인간 링커, 발린200-페닐알라닌201-글루탐산202-아르기닌203 (서열식별번호: 12)이 ROBO2의 Ig2 도메인의 C-말단 영역에서의 구조적 폴드를 효과적으로 안정화시킨다는 것을 밝혀내었다.
도 16은 SLIT2와의 복합체에서 ROBO2 S17T/R73Y의 제1 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig1)의 결정 구조를 제시한다.
1. 개요
본 발명은 SLIT 리간드 (예를 들어, SLIT2 리간드)에 결합함으로써, SLIT와 ROBO2의 상호작용을 억제할 수 있고, 결과적으로 SLIT2-ROBO2 시그널링 경로를 억제할 수 있는 신규 재조합 ROBO2 단백질을 포괄한다. 이전 연구는 ROBO2의 이뮤노글로불린-유사 (Ig-유사) 도메인 1 및 2 (Ig1 및 Ig2) 둘 다가 SLIT 리간드와 상호작용하지만; 제1 Ig-유사 도메인 (Ig1)이 SLIT에 대한 1차 결합 부위인 것으로 제시한 바 있다. 또한, 이전의 연구는 3개의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복부를 제거하는 것이 제3 및 제4 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig3 및 Ig4)의 제거보다 SLIT 리간드에의 ROBO 결합에 더 큰 부정적인 영향을 미친다는 것을 표시하였다. 즉, FNIII 결실은 Ig3 및 Ig4의 결실보다 SLIT 리간드에의 ROBO 결합에 있어서 더 큰 감소를 야기한다.
놀랍게도, Ig2-3 도메인간 링커, VFER (서열식별번호: 12)과 함께 단지 제1의 2개 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig1 및 Ig2)만을 포함하고 3개의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복부가 없는 구축물인 ROBO2-Fc 2.1 (서열식별번호: 2; 도 1b)이 SLIT2에 결합되었다는 것이 (도 3) 본 발명에 의해 처음으로 밝혀졌다. 대조적으로, 3개의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복부는 결여되지만, 하기로 이루어진 재조합 ROBO2 단백질은 SLIT2에 결합하지 못하였다 (도 3):
(i) ROBO2의 Ig1 도메인 (ROBO2-Fc 1.1; 서열식별번호: 4; 도 1b),
(ii) ROBO2의 Ig1 및 Ig2 도메인 (ROBO2-Fc 2.0; 서열식별번호: 3; 도 1b), 또는
(iii) ROBO2의 Ig1, Ig2 및 Ig3 도메인 (ROBO2-Fc 3.0; 서열식별번호: 6; 도 1b).
따라서, Ig1-Ig2 도메인의 C-말단에 VFER (서열식별번호: 12)을 부가하는 것이, FNIII 반복부의 부재 하에 SLIT2에 대한 강력한 결합 프로파일을 갖는 ROBO2-Fc 구축물 (ROBO2-Fc 2.1; 서열식별번호: 2)을 창출하는데 필요하였다. 이러한 ROBO2-Fc 2.1 구축물에는 제3, 제4 및 제5 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig3, Ig4 및 Ig5)이 결여될 뿐만 아니라 3개의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복부가 없다. 놀랍게도, SLIT2에 결합하거나 또는 결합하지 않는 것에 있어서의 차이는 4개 아미노산 VFER 서열 (서열식별번호: 12)의 존재인 것으로 밝혀졌다.
상기 기재된 재조합 ROBO2 단백질 구축물 중 어느 것도 ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8)을 함유하지 않는다. 놀랍게도, 본원에 개시되고 예시된 이들 재조합 ROBO2 단백질의 생산은 ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8)을 포함함으로써 현저하게 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 서열의 부가는 SLIT2에 대한 높은 친화도 결합을 유지하면서도 상기 서열이 결여된 구축물과 비교 시 단백질 생산을 약 25배만큼 증가시켰다 (도 3-4a-c). 도 14에 제시된 바와 같이, 이러한 ROBO2 프리-Ig1 서열은 ROBO2의 Ig1 도메인의 2개의 β-시트를 함께 브릿지하고, N-말단 영역의 구조적 폴드를 안정화시키는 것으로 여겨진다. 임의의 특별한 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 프리-Ig1 서열은 신규 단백질의 증진된 발현에 기여하는 것으로 보인다.
2. 정의
일부 측면에서, 본원에는 SLIT에 결합할 수 있고 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 재조합 ROBO2 단백질이 제공된다.
용어 "재조합 단백질"은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 일반적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 적합한 발현 벡터 내로 삽입되고, 이는 결국, 재조합 단백질을 생산하기 위해 숙주 세포 내로 도입된다. 본원에 사용된 바와 같은, "단백질"은 아미노산을 포함하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 단백질로서 인식되는 임의의 조성물을 지칭한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에 상호교환가능하게 사용된다. 아미노산은 그의 완전한 명칭 (예를 들어, 알라닌) 또는 허용되는 1 문자 (예를 들어, A), 또는 3 문자 (예를 들어, Ala) 약어로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "이뮤노글로불린 도메인"은 이뮤노글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 도메인은 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄의 부분은 결정화가능한 단편 (Fc) 또는 그의 부분이다. 본원에 사용된 바와 같은, Fc 단편은 이뮤노글로불린의 중쇄 힌지 영역, 및 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 중쇄 (또는 그의 부분)는 공지된 중쇄 이소타입: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α) 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 또한, 중쇄 (또는 그의 부분)는 공지된 중쇄 이소타입 또는 하위 유형: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2) 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 도메인은 이뮤노글로불린의 비개재된 천연 (즉, 야생형) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인은 변이체 Fc 영역을 포함한다.
본 발명에서 논의된 모든 중쇄 불변 영역 아미노산 위치에 대해, 넘버링은 최초의 인간 IgG1 서열인 골수종 단백질 Eu의 아미노산 서열을 기재하는 문헌 [Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85]에 처음으로 보고된 Eu 지수에 따른다. 상기 문헌 [Edelman et al.]의 Eu 지수는 또한, 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda]에 제시된다. 따라서, "카바트에 제시된 바와 같은 EU 지수" 또는 "카바트의 EU 지수"는 카바트 (1991)에 제시된 바와 같이, 상기 문헌 [Edelman et al.]의 인간 IgG1 Eu 항체에 근거한 잔기 넘버링 시스템을 지칭한다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 비교 시 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역과 비교 시 약 1개 내지 약 10개 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는, 천연 서열 Fc 영역과의 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 가장 바람직하게는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 보유할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "링커"는 2개의 별도의 실체 (예를 들어, 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 도메인)가 서로 결합하고 이러한 2개의 실체 사이에 간격 및 유연성을 제공할 수 있는 분자 또는 분자 군이므로, 이들이, 예를 들어, 그들의 동족 리간드 (예를 들어, SLIT 리간드)에 특이적으로 결합하는 입체형태를 달성할 수 있게 된다. 단백질 링커가 특히 바람직하며, 이는 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 재조합 단백질의 성분으로서 발현될 수 있다.
용어 "IC50" 또는 "반수 최대 억제 농도"는 ROBO2-SLIT 시그널링 경로, 예를 들어 ROBO2-SLIT2 시그널링 경로의 50% 억제에 필요한 재조합 ROBO2 단백질의 농도를 지칭한다. IC50은 ROBO2-SLIT 생물학적 프로세스, 예컨대 ROBO2와 SLIT 리간드 사이의 결합, ROBO2의 세포내 도메인에 대한 세포내 시그널링 분자 (예컨대 srGAP1 또는 Nck)의 결합 및/또는 ROBO2-SLIT 시그널링의 하류 활성 (예컨대 액틴 중합, 족세포 부착, 및/또는 뉴런 세포 이동의 SLITx-N 매개된 억제)을 50%만큼 억제하는데 필요한 재조합 ROBO2 단백질의 양의 측정 기준이다. 더 적은 양의 재조합 ROBO2 단백질이 보다 강력한 억제 효과를 매개하기 때문에 IC50이 낮을수록 더 강력한 효과를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "SLITx"는 일반적으로 SLIT 리간드를 지칭한다. 유사하게, 용어 "SLITx-N" 및 "SLITx-C"는 일반적으로, SLIT 리간드의 N-말단 및 C-말단 단편을 각각 지칭한다. SLIT 리간드는 포유동물 SLIT 리간드, 바람직하게는 인간 SLIT 리간드일 수 있다. 일부 실시양태에서, SLIT 리간드는 SLIT1 리간드, SLIT2 리간드, 및 SLIT3 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. SLIT 리간드는 SLIT2 리간드, 바람직하게는 인간 SLIT2 리간드일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "대상체"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 비-인간 영장류, 가장 바람직하게는 인간이다. 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 모든 실시양태에서, 인간 핵산 및 인간 폴리펩티드가 바람직하다. 본원의 다른 곳에 기재된 인간, 래트 및 시노몰구스 원숭이 분자를 사용하여 수득된 결과는 다른 상동 서열을 사용하여 수득될 수 있는 결과를 예측하는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료"는 유익하거나 또는 원하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 또는 원하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하나, 그에 제한되지는 않는다: 단백뇨를 감소시키는 것 (즉, 약물 투여의 부재 하에서의 소변 중의 단백질 수준과 비교 시 소변 중의 단백질의 양을 감소시키는 것), 부종을 감소시키는 것 및/또는 혈액 알부민 수준을 복원시키는 것. 용어 "치료"는 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함한다. 특정 병태의 임상 증상이 나타나기 전에 투여되는 경우에는, 그 처치가 예방적인 것으로 간주된다. 치료적 처치는, 예를 들어, 질환의 중증도를 완화 또는 감소시키거나, 또는 질환의 기간을 단축시키는 것을 포함한다.
용어 "치료상 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 유효한 본 발명의 치료제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 치료상 유효량은 질환의 하나 이상의 증상을 경감시키는 양 또는 질환을 완화시키는데 필요한 양일 수 있다. 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS)의 경우, 치료상 유효량은 하기 효과 중 적어도 하나를 갖는 양을 지칭한다: 단백뇨를 감소시키는 것 (즉, 약물 투여의 부재 하에서의 소변 중의 단백질 수준과 비교 시 소변 중의 단백질의 양을 감소시키는 것), 부종을 감소시키는 것 및/또는 혈액 알부민 수준을 복원시키는 것.
측정가능한 수치 변수와 연계해서 사용될 때 "약" 또는 "대략"은 변수의 표시된 값, 및 표시된 값의 실험 오차 내에 있는 변수의 모든 값 (예를 들어, 평균에 대한 95% 신뢰 구간 이내) 또는 표시된 값의 ±10% 중 큰 값을 지칭한다. 수치 범위는 그러한 범위를 규정하는 숫자를 포함한다.
결합 친화도
"결합 친화도"는 일반적으로, 하나의 결합 파트너 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 ROBO2 단백질)의 접촉 잔기와 그의 결합 파트너 (예를 들어, SLIT 리간드)의 접촉 잔기 사이의 비-공유적 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화도"는 결합 쌍 또는 결합 파트너의 구성원들 (예를 들어, 재조합 ROBO2 단백질과 SLIT2 리간드) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 결합 친화도를 지칭한다.
가장 상세한 수준에서, ROBO2와 SLIT 리간드 사이의 상호작용에 대한 결합 친화도는 ROBO2/SLIT 상호작용에 존재하는 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표 뿐만 아니라 결합 열역학에 대한 그들의 상대적 기여에 관한 정보에 의해 정의될 수 있다. 하나의 수준에서, 접촉 잔기는 ROBO2와 SLIT 사이의 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표로 특징지을 수 있다. 한 측면에서, 접촉 잔기는 특이적 기준, 예를 들어, ROBO2 단백질 아미노산 잔기 내의 원자와 SLIT 단백질 아미노산 잔기 내의 원자 사이의 거리 (예를 들어, ROBO2 아미노산 잔기의 중원자 및 SLIT의 아미노산 잔기의 중원자로부터의 약 4 Å 이하, 예컨대 본원 실시예에 사용된 3.8 Å의 거리)에 의해 정의될 수 있다. 또 다른 측면에서, 접촉 잔기는 동족 결합 파트너와의 수소 결합 상호작용, 또는 결합 파트너와 수소 결합되기도 하는 물 분자 (즉, 물-매개된 수소 결합)와의 수소 결합 상호작용에 참여하는 것으로서 특징지을 수 있다. 또 다른 측면에서, 접촉 잔기는 결합 파트너의 잔기와 염 브릿지를 형성하는 것으로서 특징지을 수 있다. 또 다른 측면에서, 접촉 잔기는 결합 파트너의 접촉 잔기와의 상호작용으로 인해 매립 표면적 (BSA)에서 0이 아닌 변화를 갖는 잔기로서 특징지을 수 있다. 덜 상세한 수준에서, 결합 친화도는, 예를 들어, 다른 단백질과의 경쟁 결합에 의한 기능을 통해 특징지을 수 있다.
낮은 친화도의 재조합 단백질은 일반적으로, 그들의 리간드와 느리게 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은 친화도의 재조합 단백질은 일반적으로, 그들의 리간드와 더 신속하게 결합하고 더 길게 결합을 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 실례 및 예시적인 실시양태는 하기에 기재된다.
결합 친화도는 KD 값으로서 표현될 수 있으며, 이는 특별한 재조합 ROBO2 단백질-SLIT 리간드 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. KD는 "오프-레이트 (koff)"로 불리우기도 하는 해리 속도 대 회합 속도, 또는 "온-레이트 (kon)"의 비이다. 따라서, KD는 koff/kon이고, 이는 몰 농도 (M)로서 표현되며, KD가 더 작을수록, 결합 친화도는 더 강력해진다. KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. KD를 측정하는 한 가지 예시적인 방법은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법인 표면 플라스몬 공명 (SPR)이다 (예를 들어, 문헌 [Nguyen et al. Sensors (Basel). 2015 May 5;15(5):10481-510]). KD 값은 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(BIACORE)® 시스템을 사용하여 SPR에 의해 측정될 수 있다. 비아코어 역학적 분석은 그의 표면 상에서, 고정화된 분자 (예를 들어, 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자)와 칩으로부터의 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 단백질의 KD를 결정하기 위한 관련 기술분야에 널리 공지된 또 다른 방법은 생물-층 간섭측정법을 이용하는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Shah et al. J Vis Exp. 2014; (84): 51383]). KD 값은 OCTET® 기술 (옥테트 QKe 시스템, 포르테바이오)을 사용하여 측정될 수 있다. 또 다른 한편으로는 또는 또한, 사피딘 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments; 아이다호주 보이시)로부터 입수가능한 KinExA® (역학적 배제 검정) 검정이 또한 사용될 수 있다. 2개의 결합 파트너 사이의 결합 친화도를 평가하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 본원에 포괄된다.
3. 재조합 ROBO2 단백질
일부 측면에서, 본 개시내용은 재조합 ROBO2 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 재조합 ROBO2 단백질은 SLIT 리간드 (특히, SLIT2 리간드)에 결합함으로써, 세포성 ROBO2 수용체에 대한 SLIT의 결합을 방지하므로, SLIT 중화 리간드 트랩으로서 지칭된다. 놀랍게도, 본 실시예에 제시된 바와 같이, 제1의 2개 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig1 및 Ig2), lg1-lg2 도메인간 링커를 Ig2-3 도메인간 링커, VFER (서열식별번호: 12)과 함께 포함하고, 3개의 피브로넥틴 유형 III (FNIII) 반복부가 없는 구축물인 ROBO2-Fc 2.1 (서열식별번호: 2; 도 1b)이 SLIT2에 결합하였다 (도 3). 결정 구조 연구는 또한, ROBO2 Ig2-Ig3 도메인간 링커, VFER (V200-F201-E202-R203; 서열식별번호: 12)의 봉입이 ROBO2의 제2 Ig 도메인의 C-말단 영역에서 구조적 폴드를 효과적으로 안정화시키고 (도 15), 특히 재조합 ROBO2 단백질의 발현 수준을 증가시킨다는 것을 제시한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 SLIT-결합 모이어티 및 반감기 연장 모이어티를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. "SLIT-결합 모이어티"는 재조합 ROBO2 단백질에 SLIT-결합 능력을 부여한다. 일부 실시양태에서, SLIT-결합 모이어티는 ROBO2 세포외 도메인의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, ROBO2 세포외 도메인의 부분은 적어도 2개의 이뮤노글로불린-유사 (Ig-유사) 도메인, 및 VFER (서열식별번호: 12)로 이루어진 C-말단 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 Ig-유사 도메인은 Ig1, Ig2, Ig3, Ig4 및 Ig5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 Ig-유사 도메인은 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, ROBO2 세포외 도메인의 부분은 ROBO2의 제1의 2개 Ig-유사 도메인 (Ig1 및 Ig2)을 포함한다. 일부 실시양태에서, ROBO2 세포외 도메인의 부분은 서열식별번호: 9 및/또는 서열식별번호: 11을 포함한다.
단백질 생산 연구는 또한, 본원에 개시되고 예시된 재조합 ROBO2 단백질의 생산이 ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8)을 포함함으로써 극적으로 증가될 수 있었다고 결정하였다. 이러한 서열의 부가는 SLIT에 대한 높은 친화도 결합을 유지하면서 일시적으로 및/또는 안정적으로 형질감염된 포유동물 세포에서 단백질 생산을 약 25배만큼 증가시킨다 (도 3-5).
따라서, 일부 실시양태에서, ROBO2 세포외 도메인의 부분은 ROBO2 프리-Ig1 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ROBO2 프리-Ig1 서열은 서열식별번호: 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROBO2 세포외 도메인의 부분은 ROBO2 프리-Ig1 서열, Ig1, Ig1-Ig2 도메인간 링커, Ig2, 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커를 포함한다. ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8), Ig1 (서열식별번호: 9), Ig1-Ig2 도메인간 링커 (서열식별번호: 10), Ig2 (서열식별번호: 11), 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커 (서열식별번호: 12)의 예시적인 서열이 표 23에 제시되고, 또한 도 2에 예시된다. 본 발명은 본원에 개시된 서열에 제한되지는 않는다. 다른 ROBO2 상동체, 이소형, 변이체 또는 단편으로부터의 상응하는 잔기는 관련 기술분야에 공지되어 있는 서열 정렬 또는 구조적 정렬에 따라 확인될 수 있다. 예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하는 널리 공지된 서열 정렬 프로그램, 예컨대 클러스탈W2 또는 "BLAST 2 서열"을 사용하거나 또는 수동으로 정렬을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, ROBO2 세포외 도메인의 부분은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203과의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 공유하는 ROBO2 세포외 도메인의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203으로 이루어진 세포외 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, ROBO2는 인간 ROBO2이다. 일부 측면에서, ROBO2는 래트 ROBO2이다. 일부 측면에서, ROBO2는 마우스 ROBO2이다. 일부 측면에서, ROBO2는 영장류 ROBO2이다. 일부 측면에서, ROBO2는 유인원 ROBO2이다. 일부 측면에서, ROBO2는 원숭이 ROBO2이다. 일부 측면에서, ROBO2는 시노몰구스 원숭이 ROBO2이다.
SLIT-결합 모이어티 외에도, 신규 재조합 ROBO2 단백질은 반감기 연장 모이어티를 포함한다. "반감기 연장 모이어티"는 반감기 연장 모이어티가 없는 동일한 ROBO2 단백질과 비교 시 재조합 ROBO2 단백질의 생체내 혈청 반감기를 연장시킨다. 반감기 연장 모이어티의 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 이뮤노글로불린 도메인, 말토스 결합 단백질 (MBP), 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 이뮤노글로불린 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 도메인은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 공지된 중쇄 이소타입: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α) 중 어느 하나로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 공지된 중쇄 이소타입 또는 하위 유형: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2) 중 어느 하나로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 비개재된 천연 서열 (즉, 야생형 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인은 변이체 Fc 도메인을 포함하여, 변경된 생물학적 활성을 초래한다. 예를 들어, 적어도 하나의 점 돌연변이 또는 결실이 Fc 도메인 내로 도입되어, 이펙터 활성을 감소 또는 제거하고/하거나 (예를 들어, WO 2005/063815) 재조합 단백질의 생산 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이고, 하기 이펙터-널 치환 중 하나 이상을 포함한다: L234A, L235A, 및 G237A (Eu 넘버링) 또는 서열식별번호: 1의 넘버링을 기준으로 한 L228A, L229A 및 G231A. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 C-말단 위치에 위치한 리신 (즉, Eu 넘버링에 의한 K447)을 포함하지 않는다. 리신의 부재는 재조합 단백질의 생산 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 C-말단 위치에 위치한 리신 (K447, Eu 넘버링)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 폴리펩티드는 ROBO2 세포외 도메인 내에 또는 Fc 도메인 내에 위치할 수 있는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 쇄내 디술피드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 폴리펩티드는 4개의 쇄내 디술피드 결합을 포함하며, 그 중 2개는 ROBO2 세포외 도메인 내에 위치하고, 2개는 Fc 도메인 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, ROBO2 세포외 도메인 내에 위치한 쇄내 디술피드 결합은 Cys31과 Cys89 사이, 및 Cys133과 Cys182 사이에 있으며, 모두 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인 내에 위치한 쇄내 디술피드 결합은 Cys255와 Cys315 사이, 및 Cys361과 Cys419 사이에 있으며, 모두 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른다.
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 폴리펩티드 중 2개는 공유적으로, 예를 들어, 디술피드 결합, 폴리펩티드 결합 또는 가교제에 의해, 또는 비-공유적으로 회합하여 동종이량체성 단백질을 생산한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재조합 ROBO2 폴리펩티드는 바람직하게는 각각의 폴리펩티드의 이뮤노글로불린 Fc 영역 내에 위치한 시스테인 잔기를 통해 적어도 하나, 보다 바람직하게는 2개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 공유적으로 회합되어 동종이량체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 2개의 쇄간 디술피드 결합은 Cys220과 Cys223 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 폴리펩티드의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 8% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 2% 미만, 1% 미만이 회합되어 동종이량체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 폴리펩티드는 공유적으로, 예를 들어, 디술피드 결합, 폴리펩티드 결합 또는 가교제에 의해, 또는 비-공유적으로 또 다른 폴리펩티드와 회합하여 이종이량체성 단백질을 생산한다. 일부 실시양태에서, 이종이량체성 단백질은 이중특이적 또는 다중특이적이다. 일부 실시양태에서 다른 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 바람직하게는 각각의 폴리펩티드의 이뮤노글로불린 Fc 영역 내에 위치한 시스테인 잔기를 통해 적어도 하나, 보다 바람직하게는 2개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 공유적으로 회합되어 이종이량체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 2개의 쇄간 디술피드 결합은 재조합 ROBO2 폴리펩티드의 Cys220과 Cys223 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 이종이량체성 단백질은 2개의 상이한 재조합 ROBO2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질의 Fc 도메인은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 210 내지 440을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 210 내지 440과의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 210 내지 440으로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질의 세포외 도메인은 이뮤노글로불린 도메인과 인접해 있다. 즉, ROBO2 단백질의 세포외 도메인의 마지막 C-말단 아미노산 잔기는 이뮤노글로불린 도메인의 첫 번째 N-말단 아미노산 잔기와 펩티딜 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질의 세포외 도메인은 링커를 통해 이뮤노글로불린 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티딜 링커이다. 일부 실시양태에서, 펩티딜 링커는 약 1 내지 30개 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티딜 링커는 글리신 풍부 펩티드; 글리신 및 세린을 포함하는 펩티드; 서열 [Gly-Gly-Ser]n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)을 갖는 펩티드 (서열식별번호: 22); 및 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)을 갖는 펩티드 (서열식별번호: 23)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펩티딜 링커는 Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser (서열식별번호: 15)이다. 글리신 풍부 펩티드 링커는 펩티드 링커를 포함하며, 여기서 잔기의 적어도 25%가 글리신이다. 글리신 풍부 펩티드 링커는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Chichili et al. Protein Sci. 2013 Feb; 22(2): 153-167])
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열과의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열과의 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열과의 적어도 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열과의 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열과의 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 1의 서열과의 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 치환이 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 이루어진다. 일부 실시양태에서, 5개 이하의 치환이 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 이루어진다. 일부 실시양태에서, 4개 이하의 치환이 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 이루어진다. 일부 실시양태에서, 3개 이하의 치환이 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 이루어진다. 일부 실시양태에서, 2개 이하의 치환이 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 이루어진다. 일부 실시양태에서, 1개 이하의 치환이 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 치환(들)은 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 단백질의 KD와 비교 시 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과만큼 KD를 변화시키지 않는다. 특정 실시양태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다.
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 표 4-15에 열거된 ROBO2 아미노산 잔기 중 하나 이상은 치환되지 않는다 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 기준으로 하여 각각 넘버링된 E6, D7, F8, P9, V200, F201, E202, R203). 일부 실시양태에서, 표 4-15에 열거된 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열식별번호: 1을 기준으로 하여 넘버링된 E6, D7, F8, P9, V200, F201, E202, R203) 중 어느 것도 치환되지 않는다. 표 4-15에 개시된 ROBO2 아미노산 잔기는 결정 구조 연구에 따라 SLIT-결합 도메인의 구조적 완전성을 뒷받침하는데 중요할 것으로 여겨지는 아미노산 잔기이다 (실시예 5 참조). 이들 위치에서의 아미노산 치환은 SLIT 결합에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있었다. 따라서, 이들 위치에서 치환이 일어나지 않는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 1에 제시된 서열의 아미노산 잔기 1 내지 203과의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 공유하는 ROBO2 세포외 도메인의 부분을 포함하고, 하나 이상의 잔기 E6, D7, F8, P9, V200, F201, E202, 및 R203 (서열식별번호: 1의 서열에 따른 넘버링)을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 한 하나 이상의 점 돌연변이가 도입되어, SLIT 리간드, 예를 들어, SLIT2에 대한 재조합 ROBO2 단백질의 친화도를 증가시킬 수 있다. 본 실시예에 제시된 바와 같이, SLIT2에 대한 결합 친화도는 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 점 돌연변이 S17T 및 R73Y를 도입함으로서 약 10배만큼 증가될 수 있다 (도 11-13). 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 서열을 기준으로 하여 하기 돌연변이: S17T 및 R73Y 중 하나 이상을 갖는 재조합 ROBO2 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 19에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 19에 제시된 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 서열식별번호: 19의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 441에 위치한 C-말단 리신을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 약 1x10-6 M 이하, 예컨대 약 1x10-7 M 이하, 약 9x10-8 M 이하, 약 8x10-8 M 이하, 약 7x10-8 M 이하, 약 6x10-8 M 이하, 약 5x10-8 M 이하, 약 4x10-8 M 이하, 약 3x10-8 M 이하, 약 2x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 9x10-9 M 이하, 약 8x10-9 M 이하, 약 7x10-9 M 이하, 약 6x10-9 M 이하, 약 5x10-9 M 이하, 약 4x10-9 M 이하, 약 3x10-9 M 이하, 약 2x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 9x10-10 M 이하, 약 8x10-10 M 이하, 약 7x10-10 M 이하, 약 6x10-10 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 4x10-10 M 이하, 약 3x10-10 M 이하, 약 2x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 9x10-11 M 이하, 약 8x10-11 M 이하, 약 7x10-11 M 이하, 약 6x10-11 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 4x10-11 M 이하, 약 3x10-11 M 이하, 약 2x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 9x10-12 M 이하, 약 8x10-12 M 이하, 약 7x10-12 M 이하, 약 6x10-12 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 약 4x10-12 M 이하, 약 3x10-12 M 이하, 약 2x10-12 M 이하, 약 1x10-12 M 이하, 약 9x10-13 M 이하, 약 8x10-13 M 이하, 약 7x10-13 M 이하, 약 6x10-13 M 이하, 약 5x10-13 M 이하, 약 4x10-13 M 이하, 약 3x10-13 M 이하, 약 2x10-13 M 이하, 약 1x10-13 M 이하의 KD를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 약 1 x 10-7 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 9 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 8 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 7 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 6 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 5 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 4 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 3 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 2 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 1 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 9 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 8 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 7 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 6 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 5 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 4 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 3 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 2 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-14 M, 약 1 x 10-7 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 9 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 8 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 7 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 6 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 5 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 4 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 3 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 2 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 1 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 9 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 8 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 7 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 6 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 5 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 4 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 3 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 2 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 또는 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M의 범위의 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD로 SLIT2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 약 600 pM의 KD로 SLIT2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 약 500 pM의 KD로 SLIT2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 약 400 pM의 KD로 SLIT2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 약 300 pM의 KD로 SLIT2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 약 250 pM의 KD로 SLIT2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2 단백질은 약 200 pM의 KD로 SLIT2에 결합한다.
일반적으로, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 ROBO2의 활성을 효과적으로 차단하기 위해 높은 친화도로 SLIT 리간드 (예를 들어, SLIT2)에 결합해야 한다. 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 낮은 나노몰 및 피코몰 범위에서, 예컨대 약 1x10-8 M 이하의 결합 친화도 (KD)를 갖는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 재조합 ROBO-Fc 단백질은 SLIT2에의 ROBO1의 결합에 대한 KD 값보다 적어도 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 40배, 약 60배, 약 80배, 약 100배, 약 120배, 약 140배, 약 160배 더 낮은 KD로 SLIT2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 SLIT2에의 ROBO1-Fc 단백질의 결합에 대한 KD 값보다 적어도 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 40배, 약 60배, 약 80배, 약 100배, 약 120배, 약 140배, 약 160배 더 낮은 KD로 SLIT2에 결합한다.
생물학적 활성 검정
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 ROBO2-SLIT 시그널링의 적어도 하나의 생물학적 활성을 감소시킨다. 이러한 활성은 관련 기술분야에 공지된 다른 ROBO2-SLIT 활성 중에서, ROBO2와 SLIT 리간드 사이의 결합, ROBO2의 세포내 도메인에 대한 세포내 시그널링 분자 (예컨대 srGAP1 또는 Nck)의 결합 및/또는 ROBO2-SLIT 시그널링의 하류 활성, 예컨대 액틴 중합, 족세포 부착, 및/또는 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 재조합 ROBO2-Fc 단백질이 ROBO2의 활성을 감소시키는지의 여부는 관련 기술분야에 널리 공지된 다수의 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 검정을 사용하여, 재조합 ROBO2-Fc 단백질이 (a) SLIT와 ROBO2의 결합을 억제하는지의 여부; (b) srGAP1과 ROBO2의 결합을 감소시키는지의 여부; (c) Nck와 ROBO2의 결합을 감소시키는지의 여부; (d) ROBO2-의존성 SLIT2-N 활성을 억제하는지의 여부; (e) 액틴 중합을 억제하는지의 여부; (f) 족세포 부착을 억제하는지의 여부; 및/또는 (g) 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제를 억제하는지의 여부를 결정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 SLIT 리간드와 ROBO2의 결합을 억제한다 (예를 들어, SLIT2에 대한 재조합 ROBO2-Fc 단백질 및 ROBO2 사이의 경쟁적 결합을 평가함으로써 평가될 수 있음). 예를 들어, 검정은 (i) 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 존재 하에서의 ROBO2와 SLIT의 결합을 (ii) 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 부재 하에서의 ROBO2와 SLIT의 결합과 비교할 수 있다. ROBO2와 SLIT의 결합에 있어서의 감소는 시험 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 부재 하에서의 ROBO2와 SLIT의 결합과 비교 시 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 존재 하에 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%일 수 있다. 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 부재 하에서 SLIT와 ROBO2의 예상된 결합도는 100%로서 설정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 SLIT와 ROBO2의 결합을, 약 1x10-7 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 1x10-12 M 이하, 약 1x10-13 M 이하, 약 1x10-14 M 이하, 약 1x10-15 M 이하, 약 1x10-7 M 내지 약 5x10-14 M, 약 1x10-7 M 내지 약 1x10-14 M, 약 1x10-7 M 내지 약 5x10-13 M, 약 1x10-7 M 내지 약 1x10-13 M, 약 1x10-7 M 내지 약 5x10-12 M, 또는 약 1x10-7 M 내지 약 1x10-12 M의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 억제한다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 ROBO2와 SLIT2의 결합의 억제에 대하여 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정에 의해 측정 시에 15 nM 이하, 약 13 nM, 약 11 nM, 약 9 nM, 약 7 nM, 약 6 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3 nM, 약 2 nM, 약 1 nM의 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 갖는다. IC50은 SLIT 또는 ROBO2의 단편, 예컨대 SLIT-N, 및 ROBO2의 Ig 도메인 1, 또는 ROBO2의 Ig 도메인 1 & 2를 사용하여 평가될 수 있다.
재조합 ROBO2-Fc 단백질의 억제 활성은 또한, ROBO2-의존성 SLIT-N 활성, 예컨대 액틴 중합, 족세포 부착, 및/또는 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 검정은 (i) ROBO2, SLIT, 및 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 존재 하에서의 뉴런 세포 이동을 (ii) ROBO2, SLIT의 존재 하에, 그러나 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 부재 하에서의 뉴런 세포 이동과 비교할 수 있다. 뉴런 세포 이동에 있어서의 증가는 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 부재 하에서의 뉴런 세포 이동과 비교 시 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 존재 하에서, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%일 수 있다. 재조합 ROBO2-Fc 단백질의 부재 하에서의 기준선 뉴런 세포 이동이 0%로서 설정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 ROBO2-의존성 SLIT-N 활성, 예컨대 액틴 중합, 족세포 부착, 및/또는 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제를 약 1x10-7 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 1x10-12 M 이하, 약 1x10-13 M 이하, 약 1x10-14 M 이하, 약 1x10-15 M 이하, 약 1x10-7 M 내지 약 5x10-14 M, 약 1x10-7 M 내지 약 1x10-14 M, 약 1x10-7 M 내지 약 5x10-13 M, 약 1x10-7 M 내지 약 1x10-13 M, 약 1x10-7 M 내지 약 5x10-12 M, 또는 약 1x10-7 M 내지 약 1x10-12 M의 반수 최대 억제 농도 (IC50)로 억제한다. 특정 실시양태에서, 약 1x10-10 M 내지 약 1x10-13 M의 IC50이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 약 5x10-11 M 내지 약 5x10-12 M의 IC50이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO-Fc 단백질은 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제를 측정함으로써 평가 시 약 75 nM 이하, 약 65 nM, 약 55 nM, 약 45 nM, 약 35 nM, 약 25 nM, 약 15 nM, 약 5 nM의 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 ROBO-Fc 단백질의 특징은, 예를 들어 그의 치료제로서의 효능, 약리학적 활성 및 잠재적 효능을 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 검정을 사용하여 추가로 평가된다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 재조합 단백질에 대한 의도된 용도에 의존한다. 그 예는, 예를 들어, 독성 검정, 면역원성 검정, 안정성 검정, 항-약물 항체 검정 및/또는 PK/PD 프로파일링을 포함한다.
핵산 및 재조합 ROBO2 단백질을 생산하는 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 제조하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조되고 발현될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 ROBO2 세포외 도메인 (ECD)의 부분을 포함하고 이뮤노글로불린 도메인을 추가로 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 세포외 도메인은 적어도 2개의 이뮤노글로불린-유사 (Ig-유사) 도메인; 및 서열식별번호: 12의 서열로 이루어진 C-말단 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1에 제시된 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203을 포함하고 이뮤노글로불린 도메인을 추가로 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 재조합 ROBO2 단백질: ROBO2-Fc 2.2 (서열식별번호: 1), ROBO2-Fc 2.1 (서열식별번호: 2), ROBO2-Fc 2.0 (서열식별번호: 3), ROBO2-Fc 1.1 (서열식별번호: 4), ROBO2-Fc 1.0 (서열식별번호: 5), ROBO2-Fc 3.0 (서열식별번호: 6), ROBO2-Fc 4.0 (서열식별번호: 7), 및 ROBO2-Fc S17T R73Y (서열식별번호: 19) 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 ROBO2-Fc 2.2 (서열식별번호: 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 ROBO2-Fc 2.1 (서열식별번호: 2)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 ROBO2-Fc 2.0 (서열식별번호: 3)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 그를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 ATCC 수탁 번호 PTA-124008을 갖는, ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입물의 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 ROBO2-Fc 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체를 제공하며, 여기서 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 19의 핵산 및 ATCC 수탁 번호 PTA-124008을 갖는, ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 핵산이지만 이에 제한되지는 않는 본원에 개시된 임의의 핵산과의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 19의 핵산을 포함하는 핵산이지만 이에 제한되지는 않는 본원에 개시된 임의의 핵산과의 적어도 95% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 19의 핵산을 포함하는 핵산이지만 이에 제한되지는 않는 본원에 개시된 임의의 핵산과의 적어도 96% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 19의 핵산을 포함하는 핵산이지만 이에 제한되지는 않는 본원에 개시된 임의의 핵산과의 적어도 97% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 19의 핵산을 포함하는 핵산이지만 이에 제한되지는 않는 본원에 개시된 임의의 핵산과의 적어도 98% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 19의 핵산을 포함하는 핵산이지만 이에 제한되지는 않는 본원에 개시된 임의의 핵산과의 적어도 99% 서열 동일성을 공유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 21에 제시된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 21에 제시된 핵산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 21에 제시된 핵산 서열에 대해 N-말단이다.
한 실시양태에서, ROBO2의 세포외 도메인 및 이뮤노글로불린 Fc 도메인은 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 또 다른 한편으로는, ROBO2의 세포외 도메인과 이뮤노글로불린 Fc 도메인 둘 다는 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
임의의 상기 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한, 본 개시내용에 의해 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA (재조합, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일 대 일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 hnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 부가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 야생형 서열)을 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열의 비-천연 (즉, 변이체)을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 SLIT 결합 능력이 천연 분자를 기준으로 하여 감소되지 않도록 하는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 SLIT 결합 활성에 대한 효과는 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 ROBO2의 천연 (야생형) 서열 및 Fc 도메인을 포함하는 재조합 ROBO2-Fc 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과의 적어도 약 70% 동일성, 일부 실시양태에서, 적어도 약 80% 동일성, 일부 실시양태에서, 적어도 약 90% 동일성, 및 일부 실시양태에서, 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 1에 제시된 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203 중 적어도 20개, 적어도 19개, 적어도 18개, 적어도 17개, 적어도 16개, 적어도 15개, 적어도 14개, 적어도 13개, 적어도 12개, 적어도 11개, 적어도 10개, 적어도 9개, 적어도 8개, 적어도 7개, 적어도 6개, 적어도 5개, 적어도 4개, 적어도 3개, 적어도 2개, 또는 적어도 1개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 1에 제시된 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203 중 적어도 5개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 1에 제시된 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203 중 적어도 4개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 1에 제시된 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203 중 적어도 3개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 1에 제시된 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203 중 적어도 2개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 1에 제시된 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203 중 적어도 1개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 ROBO2 단백질을 코딩한다. 이들 양은 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 나열된 백분율 사이의 증분이 본 개시내용의 일부로서 구체적으로 구상된다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 이들 두 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기에 기재되는 바와 같이 최대 상응도를 위해 정렬된 경우에 동일하다면, "동일한" 것으로 여겨진다. 두 서열 사이의 비교는 전형적으로, 이들 서열을 비교 윈도우 전반에 걸쳐 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인 및 비교함으로써 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접 위치의 세그먼트, 통상적으로 50 내지 약 450개, 또는 100 내지 약 300개의 인접 위치의 세그먼트를 지칭하며, 여기서 서열은 동일한 수의 연속되는 위치의 참조 서열과 최적으로 정렬시킨 후, 이러한 서열을 상기 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위해 서열을 최적으로 정렬시키는 것은 디폴트 파라미터를 이용하여, 생물 정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene®) 스위트 중의 메갈라인(MegAlign®) 프로그램 (DNASTAR®, 인크.(DNASTAR®, Inc.); 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 시행될 수 있다. 이러한 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 몇 가지 정렬 도식을 구체화한다 (Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730).
일부 실시양태에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우 전반에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우 중의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교 시 20 퍼센트 이하, 통상적으로 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 이러한 백분율은 매칭된 위치의 수를 산출하기 위해 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하고, 이와 같이 매칭된 위치의 수를 참조 서열 내의 총 위치 수 (즉, 윈도우 크기)로 나눈 다음, 그 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한, 또는 또 다른 한편으로는, 천연 유전자, 또는 그의 부분 또는 보체와 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 중간 정도로 엄격한 조건 하에, ROBO2의 천연 (야생형) 서열 및 Fc 도메인 (또는 상보성 서열)을 포함하는 재조합 ROBO2-Fc 단백질을 코딩하는 자연적으로 발생하는 DNA 서열과 혼성화될 수 있다.
적합한 "중간 정도로 엄격한 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액 중에서 미리 세척하고; 50℃-65℃ 하에, 5X SSC를 밤새 혼성화한 다음; 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 65℃ 하에 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 이용하는 조건; (2) 혼성화 동안 42℃ 하에 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨를 수반한 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)을 수반한 50% (v/v) 포름아미드를 이용하는 조건; 또는 (3) 42℃ 하에 50% 포름아미드, 5X SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5X 덴하르트 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 μg/mL), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 이용하고, 42℃ 하에 0.2X SSC (염화나트륨/시트르산 나트륨)에서 세척하고 55℃ 하에 50% 포름아미드로 세척한 다음, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1X SSC로 이루어진 고 엄격성 세척을 수행하는 조건이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 요인을 수용하는데 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식하고 있을 것이다.
유전 암호의 축중성에 따른 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 ROBO2-Fc 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 최소한의 상동성을 보유하고 있다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용 빈도 상의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오티드가 본 개시내용에 의해 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립 유전자는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 대립 유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경되는 내인성 유전자이다. 이로써 생성되는 mRNA와 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 대립 유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 핵산 서열이 특별한 세포에서의 발현을 최대화하도록 최적화된 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개, 또는 그 초과의 코돈)을, 천연 아미노산 서열은 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 사용되거나 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현을 증진시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 지칭한다. 다양한 종은 특별한 아미노산의 특정 코돈에 대해 특별한 편향을 나타낸다. 코돈 편향 (유기체 사이의 코돈 사용 빈도 상의 차이)은 종종, 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관이 있으며, 이는 결국 특히, 번역되는 코돈의 특성 및 특별한 전이 RNA (tRNA) 분자의 유용성에 의존성인 것으로 여겨진다. 세포 내의 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로, 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 근거하여 주어진 유기체에서의 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다. 코돈 사용 빈도 표를 용이하게 이용할 수 있으며, 이러한 표는 수많은 방식으로 적응시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]). 특별한 숙주 세포에서의 발현을 위해 특별한 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 진 포지(Gene Forge) (압타젠(Aptagen; 펜실베니아주 야코부스))가 또한 이용가능하다. 일부 실시양태에서, 재조합 ROBO2-Fc 단백질을 코딩하는 서열 내의 하나 이상의 코돈 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 또는 그 초과, 또는 모든 코돈)은 특별한 아미노산에 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
따라서, 한 측면에서, 변형된 핵산 서열은, 예를 들어, 달리 동일한 세포에서 ROBO2-Fc 2.2를 코딩하는 핵산 (서열식별번호: 21)의 야생형 핵산 서열로부터의 재조합 ROBO2 단백질의 발현과 비교 시 상기 세포에서의 재조합 ROBO2 단백질의 검출가능하게 더 높은 수준의 발현을 제공한다. 이는 "발현 최적화된" 또는 "증진된 발현" 핵산, 또는 간단히 "변형된 핵산"으로서 지칭될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 지칭된 바와 같은 "최적화된" 또는 "코돈-최적화된"은, 예를 들어, 희귀 코돈의 사용 빈도를 최소화하거나, CpG 디뉴클레오티드의 수를 감소시키거나, 잠재적 스플라이스 공여체 또는 수용체 부위를 제거하거나, 코작(Kozak) 서열을 제거하거나, 리보솜 진입 부위를 제거함으로써, 코딩 서열의 발현을 증가시키기 위해 야생형 코딩 서열 (예를 들어, 인간 ROBO2 및/또는 인간 Fc 도메인에 대한 코딩 서열)에 비해 최적화된 코딩 서열을 지칭한다.
변형의 예는 하나 이상의 시스-작용성 모티프의 제거 및 하나 이상의 코작 서열의 도입을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 시스-작용성 모티프가 제거되고 하나 이상의 코작 서열이 도입된다.
제거될 수 있는 시스 작용성 모티프의 예는 내부 TATA-박스; 카이 부위; 리보솜 진입 부위; ARE, INS 및/또는 CRS 서열 요소; 반복 서열 및/또는 RNA 2차 구조; (잠재적) 스플라이스 공여체 및/또는 수용체 부위, 분기점; 및 SalI를 포함한다.
한 실시양태에서, GC 함량 (예를 들어, 핵산 서열에 존재하는 G 및 C 뉴클레오티드의 수)은 본 발명의 신규 ROBO2 단백질의 야생형 ROBO2 및/또는 인간 IgG1 Fc 도메인 유전자 서열에 비해 증진된다. GC 함량은 야생형 유전자 (예를 들어, 서열식별번호: 21)보다, 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는, 적어도 6%, 또한 보다 바람직하게는, 적어도 7%, 보다 더 바람직하게는, 적어도 8%, 보다 바람직하게는, 적어도 9%, 보다 더 바람직하게는, 적어도 10%, 또한 보다 바람직하게는, 적어도 12%, 보다 더 바람직하게는, 적어도 14%, 또한 보다 바람직하게는, 적어도 15%, 보다 바람직하게는, 적어도 17%, 보다 더 바람직하게는, 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는, 적어도 30%, 또한 보다 바람직하게는, 적어도 40%, 보다 바람직하게는, 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는, 적어도 60%, 가장 바람직하게는, 적어도 70% 더 많다.
또 다른 실시양태에서, GC 함량은 서열 내의 G (구아닌) 및 C (시토신) 뉴클레오티드의 백분율로서 표현된다. 즉, ROBO2-Fc 2.2를 코딩하는 야생형 핵산 (서열식별번호: 21)의 GC 함량은 ROBO2-Fc 2.2를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열의 GC 함량보다 적다.
한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 핵산의 GC 함량은 서열식별번호: 21의 핵산 서열을 포함하는 ROBO2-Fc 2.2를 코딩하는 야생형 핵산의 GC 함량보다 더 많다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 핵산 코드의 축중성을 알고 있고, 단백질을 코딩하는 핵산의 서열에 관계없이, 그로부터 발현된 ROBO2-Fc 2.2의 아미노산 서열이 바람직하게는, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열이라는 것을 인지할 것이다.
CpG 디뉴클레오티드의 메틸화가 진핵 생물에서의 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 구체적으로, 진핵 생물에서의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화는 본질적으로, 전사 기구를 방해함으로써 유전자 발현을 침묵시키는 역할을 한다. 따라서, CpG 모티프의 메틸화에 의해 유발된 유전자 침묵으로 인해, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 핵산 및 벡터는 높고 오래 지속되는 트랜스진 발현 수준을 제공할 것이다.
잠재적 CpG 아일랜드는, 예를 들어, http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html에서 찾은 공개적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 확인될 수 있다. CpG 아일랜드 소프트웨어는 잠재적 CpG 아일랜드를 확인하기 위한 관련 기술분야에 널리 공지된 많은 다른 방법들 중에서, 문헌 [Gardiner-Garden and Frommer, 1987, J. Mol. Biol. 196(2):261-282]에 기재된 방법을 사용하여 잠재적 CpG 아일랜드 영역을 보고할 수 있다. 계산은 1 bp 간격으로 서열 전체에 걸쳐 이동하는 200 염기쌍 (bp) 윈도우를 사용하여 수행될 수 있다. CpG 아일랜드는 Obs/Exp 값이 0.6보다 크고 GC 함량이 50% 초과인 서열 범위로서 정의된다. 윈도우 내의 예상된 CpG 이량체 수는 윈도우 내의 'C'의 수에 윈도우 내의 'G'의 수를 곱하고, 이를 윈도우 길이로 나눈 값으로서 계산될 수 있다. 따라서, 핵산 서열에 존재하는 잠재적인 CpG 아일랜드는 논쟁 중인 서열을, 소프트웨어에 의해 제공되는 윈도우에 입력함으로써 용이하게 결정될 수 있다 ("원시 서열 또는 하나 이상의 FASTA 서열을 아래 텍스트 영역에 붙여 넣는다. 입력 제한은 100000 글자이다."라는 명령어에 의해 표시됨). CpG 아일랜드는 척추동물 유전자의 5' 영역에서 종종 발견되므로, 이러한 프로그램을 사용하여 게놈 서열 내의 잠재적 유전자를 강조할 수 있다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법, 또는 PCR을 이용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세히 기재될 필요는 없다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공된 서열을 이용할 수 있고 원하는 DNA 서열을 생산하기 위한 상업적 DNA 합성기를 이용할 수 있다.
재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에는, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이러한 벡터를 결국, 본원에 추가로 논의되는 바와 같이 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 세포는 직접적인 흡수, 세포내 이입, 형질감염, F-짝짓기 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환시킨다. 일단 도입되면, 이러한 외인성 폴리뉴클레오티드를 비-통합된 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 세포 내에 유지시킬 수 있거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합시킬 수 있다. 이로써 증폭된 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야 내에서 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989] 참조.
또 다른 한편으로는, PCR은 DNA 서열을 재생산할 수 있다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 중의 단리된 DNA를 이용하고, 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득될 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 이때 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터를 표준 기술에 따라 구축할 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택할 수 있다. 선택된 클로닝 벡터가 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 다양할 수 있긴 하지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로, 자기 복제할 수 있는 능력을 가질 것이고, 특별한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 상기 벡터를 함유하는 클론을 선별하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 운반할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터가 상업적 판매인, 예컨대 바이오라드(BioRad), 스트라타진(Strategene), 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수가능하다.
발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로, 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이는 발현 벡터가 에피솜으로서 또는 염색체성 DNA의 절대 필요한 요소로서 숙주 세포에서 복제가능해야만 한다는 것을 암시한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로, 하기 중 하나 이상을 포함하나, 그에 제한되지는 않을 수 있다: 시그널 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해, 하나 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 통상적으로 요구된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 21에 제시된 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열식별번호: 21에 제시된 핵산 분자 및 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 21에 제시된 핵산 서열에 대해 N-말단이다.
관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 그 자체를 함유하는 벡터는 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 이용하는 형질감염; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염체, 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 포함한, 적절한 수많은 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입되는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종, 숙주 세포의 특색에 좌우될 것이다.
예시적인 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 많은 세포 중에서, CHO 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포 또는 Sp2.0 세포를 포함한다.
숙주 세포는 코딩된 재조합 ROBO2 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩된 재조합 ROBO2-Fc 단백질은 서열식별번호: 17에 제시된 ROBO2 리더 서열 또는 서열식별번호: 18에 제시된 Ig 리더 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ROBO2 리더 서열 (서열식별번호: 17)은 단백질 생산 동안 절단되어 성숙한 ROBO2-Fc를 생산한다. 일부 실시양태에서, Ig 리더 서열 (서열식별번호: 18)은 단백질 생산 동안 절단되어 성숙한 ROBO2-Fc, 예를 들어, ROBO2-Fc 2.2를 생산한다.
4. 제형 및 용도
본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 제약 조성물로서 제형화될 수 있다. 제약 조성물은 동결 건조된 제형 또는 수용액 중에, 제약상 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 안정화제 (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약적 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합될 때 이러한 성분이 생물학적 활성을 유지할 수 있게 해주고 대상체의 면역 체계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 그의 예는 표준 제약 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 정상 (0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing, 2000] 참조).
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트란 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제가 본원에 추가로 기재되어 있다.
진단 용도
본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 다양한 치료 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 친화도 정제 작용제로서 (예를 들어, SLIT 리간드, 예컨대 SLIT2의 시험관내 정제를 위함), 진단제로서 (예를 들어, SLIT 리간드 (예를 들어, 특이적 세포, 조직 또는 혈청에서의 SLIT2)의 발현을 검출하기 위함) 사용될 수 있다. SLIT 리간드, 예컨대 SLIT2에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어, 환자로부터 수득된 샘플을 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질과 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 재조합 ROBO2 단백질은 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다.
본 발명은 샘플, 세포, 조직 또는 환자에서 SLIT 리간드, 예컨대 SLIT2의 시각화를 위한 진단 영상화 방법으로서 본원에 개시된 재조합 ROBO2 단백질의 용도를 포괄한다. 예를 들어, 재조합 ROBO2 단백질은 영상화 작용제와 접합되어, 재조합 ROBO2 단백질의 존재가 검출될 수 있도록 함으로써 SLIT 리간드, 예컨대 SLIT2의 존재를 검출할 수 있게 한다.
치료적 용도
본 발명의 재조합 ROBO2 단백질의 예시적인 치료적 용도는 신질환, 예컨대 사구체 질환, 초점성 분절성 사구체 질환 (FSGS)을 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 또한, 예방적 처치에 사용될 수 있다 (예를 들어, 질환 증상을 나타내지 않았지만 신질환, 예컨대 사구체 질환, FSGS에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여함).
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 질환, 장애 또는 병태의 부재 하에서의 소변 중의 단백질의 수준과 비교 시 소변 중의 단백질의 증가된 수준에 의해 매개되거나 또는 이와 연관된 상기 장애, 질환 또는 병태의 치료를 포함한다. 이러한 질환, 장애 또는 병태는 루푸스 신염, IgA 신병증, 막성 신병증 (MN), 미세 변화형 질환 (MCD), 섬유증 (예컨대, 간 섬유증), 비-알콜성 지방 간염 (NASH), 단백뇨, 알부민뇨, 사구체신염, 당뇨병성 신병증, 신증후군, 국소 사구체경화증, 급성 신부전, 급성 세뇨관간질 신염, 신우신염, 신장 이식 거부 및 역류성 신병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치료적 적용을 위해, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 통상적인 기술, 예컨대 정맥내로 (볼루스로서 또는 일정 기간에 걸쳐 연속적 주입에 의함), 근육내로, 복강내로, 뇌척수내로, 피하로, 관절내로, 활막내로, 척추강내로, 경구로, 국소로 또는 흡입에 의해 포유동물, 특히 인간에게 투여될 수 있다. 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 또한, 종양내, 종양주위, 병변내 또는 병변주위 경로에 의해 적절하게 투여될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 ROBO2의 활성의 감소를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 치료상 유효량의 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질을 투여하는 것을 포함하는, ROBO2의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 족세포 기능의 보존 또는 조정을 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 치료상 유효량의 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 족세포 기능을 보존 또는 조정하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 대상체는 신질환을 앓고 있거나 또는 신질환에 걸리기 쉽다. 특정 실시양태에서, 신질환은 사구체 질환이다. 특정 실시양태에서, 신질환은 FSGS이다.
특정 실시양태에서, 대상체는 신병증을 앓고 있거나 또는 신병증에 걸리기 쉽다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 세포에서 ROBO2의 활성을 감소시키고, 대상체에서 ROBO2의 활성을 감소시키며, 대상체에서 족세포 기능을 보존하고, 대상체에서 족세포 기능을 조정하며, 대상체에서 사구체 질환을 치료하고, 대상체에서 신병증을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포에서 ROBO2의 활성을 감소시키고, 대상체에서 ROBO2의 활성을 감소시키며, 대상체에서 족세포 기능을 보존하고, 대상체에서 족세포 기능을 조정하며, 대상체에서 사구체 질환을 치료하고, 대상체에서 신병증을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질의 용도를 제공한다.
투약 및 투여
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 정맥내로 투여된다.
제약 조성물은 신질환의 중증도에 따라 변할 수 있는 빈도로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 예방적 요법의 경우, 빈도는 대상체의 신질환에 대한 감수성 또는 소인에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 단일 용량으로서 피하로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다수의 용량으로서 피하로 또는 정맥내로 투여된다.
상기 조성물은 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 재조합 ROBO2 단백질의 볼루스 투여는 0.0025 내지 200 mg/체중 kg, 0.025 내지 0.25 mg/kg, 0.010 내지 0.10 mg/kg 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우, 재조합 ROBO2 단백질은 1-24시간, 1-12시간, 2-12시간, 6-12시간, 2-8시간, 또는 1-2시간 동안 0.001 내지 200 mg/체중 kg/min, 0.0125 내지 1.25 mg/kg/min, 0.010 내지 0.75 mg/kg/min, 0.010 내지 1.0 mg/kg/min, 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg/min으로 투여될 수 있다.
재조합 ROBO2 단백질을 투여하는 경우, 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 이상, 약 2 mg/kg 이상, 약 3 mg/kg 이상, 약 4 mg/kg 이상, 약 5 mg/kg 이상, 약 6 mg/kg 이상, 약 7 mg/kg 이상, 약 8 mg/kg 이상, 약 9 mg/kg 이상, 약 10 mg/kg 이상, 약 11 mg/kg 이상, 약 12 mg/kg 이상, 약 13 mg/kg 이상, 약 14 mg/kg 이상, 약 15 mg/kg 이상, 약 16 mg/kg 이상, 약 17 mg/kg 이상, 약 19 mg/kg 이상, 또는 약 20 mg/kg 이상일 수 있다. 투여 빈도는 병태의 중증도에 좌우될 것이다. 빈도는 1주에 3회 내지 2주 또는 3주마다 1회의 범위일 수 있다.
부가적으로, 조성물은 피하 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 1 내지 200 mg의 재조합 ROBO2 단백질의 용량은 1주에 2회, 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 1개월에 2회, 1개월에 1회, 2개월마다 1회, 또는 3개월마다 1회로 투여되는 피하 또는 정맥내 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 인간에서의 재조합 ROBO2 단백질의 반감기는 약 24시간, 약 2일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일, 약 29일, 약 30일, 약 5일 내지 약 40일, 약 5일 내지 약 35일, 약 5일 내지 약 30일, 약 5일 내지 약 25일, 약 10일 내지 약 40일, 약 10일 내지 약 35일, 약 10일 내지 약 30일, 약 10일 내지 약 25일, 약 15일 내지 약 40일, 약 15일 내지 약 35일, 약 15일 내지 약 30일, 또는 약 15일 내지 약 25일이다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3.0 mg/kg, 약 3.5 mg/kg, 약 4.0 mg/kg, 약 4.5 mg/kg, 약 5.0 mg/kg, 약 5.5 mg/kg, 약 6.0 mg/kg, 약 6.5 mg/kg, 약 7.0 mg/kg, 약 7.5 mg/kg, 약 8.0 mg/kg, 약 8.5 mg/kg, 약 9.0 mg/kg, 약 9.5 mg/kg, 또는 약 10.0 mg/kg의 용량으로, 2 내지 6주마다 피하로 또는 정맥내로 투여된다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 3.0 mg/kg의 용량으로, 2 내지 6주마다 피하로 또는 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 2.0 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg의 용량으로, 2 내지 6주마다 피하로 또는 정맥내로 투여된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 또는 300 mg의 용량으로, 매주 또는 2주마다 피하로 또는 정맥내로 투여된다.
하나의 예시적인 실시양태에서, 제약 조성물은 매주 또는 2주마다 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 2 mg/kg의 용량으로 매주 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 150 mg의 용량으로 매주 피하로 투여된다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 10.0 mg/kg의 용량으로, 2 내지 6주마다 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1.0 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg의 용량으로, 2 내지 6주마다 피하로 또는 정맥내로 투여된다.
하나의 예시적인 실시양태에서, 제약 조성물은 매월 정맥내로 투여된다.
본 발명의 재조합 ROBO2 단백질은 단일 요법으로서, 또는 예를 들어, 신질환을 치료하기 위한 다른 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 신장 질환을 치료하기 위한 다른 요법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 본원에 열거되지 않는다.
5. 키트
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 ROBO2 단백질, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트 또는 제조 물품을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 용기; 재조합 ROBO2 단백질을 포함하는 상기 용기 내의 조성물; 및 치료를 필요로 하는 환자의 치료를 위하여 치료상 유효량의 재조합 ROBO2 단백질을 투여하는 것에 대한 지침서를 함유하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트 또는 제조 물품을 제공한다.
특정 실시양태에서, 이러한 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기와 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 다를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 및 다중 챔버의 미리 채워된 주사기 (예를 들어, 액체 주사기 및 리오시린지)를 함유하는 키트가 포함된다.
본 발명의 재조합 ROBO2 단백질의 사용에 관한 지침서는 일반적으로, 의도한 치료에 대한 투여량, 투약 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 상기 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다수-용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로, 표지 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 작성된 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 수반된 지침서)가 또한 제공된다.
본 발명의 키트는 적합하게 패키징되어 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징 [예를 들어, 밀폐 마일라(Mylar) 또는 비닐 봉지] 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 디바이스, 예컨대 흡입기, 비내 투여용 디바이스 (예를 들어, 분무기) 또는 주입 디바이스, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 용기는 제2의 제약상 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로, 부가 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 정상적으로, 키트는 특정 용기와, 이러한 용기 상에 있거나 이와 회합된 표지 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
6. 생물학적 기탁
본 발명의 대표적인 물질은 2017년 2월 23일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버서티 불러바드 10801)에 기탁하였다. ATCC 수탁 번호 PTA-124008을 갖는 벡터 ROBO2-Fc 2.2는 서열식별번호: 1을 코딩하는 DNA 삽입물을 포함한다. 상기 기탁은 특허 절차 및 그에 따른 규칙상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정하에 이루어졌다 (부다페스트 조약). 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양의 유지를 보장한다. 상기 기탁은 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC에 의해 입수가능하고, 어느 것이든 먼저 도래하는 관련 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 외래 특허 출원의 공표 시 대중에게 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 제한 없는 입수가능성을 보증하고, 35 U.S.C. 섹션 122에 따라 그에 대한 권리가 있는 미국 특허 상표 감독관 및 그에 따르는 감독관의 규칙 (886 OG 638을 특별히 참조한 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 의해 결정된 것에 대한 자손의 입수가능성을 보증하는, 화이자 인크.와 ATCC 사이의 합의에 따른 것이다.
본 출원의 출원인인 화이자 인크.는 기탁 시의 상기 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양된 경우에 사멸하거나 분실되거나 또는 파괴되어야 한다면, 이러한 물질을 동일한 또 다른 것으로 즉시 대체하고 고지할 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수가능성은 특허법에 따라 임의의 정부의 권한에 따라 부여된 권리에 위반하여 본 발명을 실시할 수 있는 라이센스로서 해석되는 것은 아니다.
실시예
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1. ROBO2-Fc 2.2의 생성
다중 ROBO2-Fc 융합 단백질의 설계를 통한 ROBO2-Fc 2.2의 선택
최적의 ROBO2-Fc 리간드 트랩을 선택하기 위해, 글리신-세린 (GS) 링커를 통해 IgG1 Fc 도메인에 융합된 다양한 길이의 ROBO2 세포외 도메인으로 이루어진 다수의 단백질이 생성되었다. 연구는 ROBO1 및 ROBO2 수용체의 경우에 그의 Ig1 도메인은 SLIT 리간드의 D2 류신 풍부 반복 (LRR) 도메인에 결합하기에 충분한 것으로 제시한 바 있다. ROBO2는 5개의 Ig 도메인 (Ig 1-5)을 함유한다. 선택 기준은 먼저, SLIT2에 결합할 수 있는 최소 ROBO2 서열을 갖는 ROBO2-Fc 융합 단백질을 생성하는데 초점을 맞춘 다음, HEK 293 세포에서 재조합 단백질 발현을 위해 그 분자를 최적화하는데 초점을 맞추었다. 초기에, GS 링커를 통해 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된, Ig1 도메인 (ROBO2-Fc 1.0; 서열식별번호: 5), Ig1 및 Ig2 도메인 (ROBO2-Fc 2.0; 서열식별번호: 3), Ig1, Ig2, 및 Ig3 도메인 (ROBO2-Fc 3.0; 서열식별번호: 6), 및 Ig1, Ig2, Ig3, 및 Ig4 도메인 (ROBO2-Fc 4.0; 서열식별번호: 7)으로 이루어진 폴리펩티드 서열의 발현을 위해 4개의 DNA 구축물을 생성하였다 (표 23). 구축물의 발현은 Ig 리더 (서열식별번호: 18)에 의해 구동되었다. ROBO2-Fc 1.0, 2.0 및 3.0 단백질은 SLIT2에 결합하지 않았다. ROBO2-Fc 4.0은 결합하였다. Fc 융합체의 ROBO2 부분을 최소화하기 위해, C-말단에 Ig1-Ig2 도메인간 링커 (서열식별번호: 10)를 포함하는 Ig1 도메인을 갖는 버전을 포함한 더 많은 단백질을 생성하였다 (ROBO2-Fc 1.1; 서열식별번호: 4). Ig1 및 Ig2 도메인 및 Ig2-Ig3 도메인간 링커 (VFER (서열식별번호: 12))를 포함한 또 다른 구축물이 관여하였다 (ROBO2-Fc 2.1; 서열식별번호: 2). ROBO2-Fc 2.1 단백질을 창출하기 위해 Ig1-Ig2 도메인의 C-말단에 VFER (서열식별번호: 12)을 부가하는 것이 SLIT2에 대한 강력한 결합을 가능하게 하였다 (도 3). ROBO2-Fc 1.1은 SLIT2에 결합하지 않았다. 옥테트 레드를 활용하여, ROBO2-Fc 단백질을 10 ug/ml 하의 항 인간-Fc (AHC) 센서 상으로 부하하고, 7분 동안 100 nM SLIT2와 함께 인큐베이션한 다음, 센서를 640초 동안 완충액 단독에 이동시켰다. 결합에 대한 양성 대조군으로서 ROBO2-Fc 4.0이 포함되었다.
HEK 293 세포에서의 ROBO2-Fc 2.1의 재조합 단백질 발현은 매우 열악하였다 (3 μg/ml). 발현을 증가시키기 위해, ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8)을 부가하였고 ROBO2 리더 서열 (서열식별번호: 17)을 ROBO2-Fc 2.1 발현 구축물에 또한 포함시켜 ROBO2-Fc 2.2 발현 구축물을 창출시켰다. ROBO2 리더 서열 (서열식별번호: 17)을 단백질 생산 동안 절단시켜 성숙한 ROBO2-Fc 2.2를 생산하였다. ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8)의 부가는 달리 동일한 숙주 세포에서 프리-Ig1 서열 SRLRQEDFP (서열식별번호: 8)를 코딩하지 않는 달리 동일한 발현 구축물의 발현과 비교 시 25배 이상 단백질 발현을 증가시켰다. 이와 같이 증가된 발현은 SLIT2와 여전히 높은 친화도로 결합된 ROBO2-Fc 2.2의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 3-4a-c).
실시예 2. ROBO2-Fc 2.2 결합 및 중화 활성의 특징규명
ROBO2-Fc 2.2는 SLIT2-N 결합, SLIT2-N 결합의 중화 및 SLITx-N 기능적 활성의 억제에 대한 수많은 검정에서 스크리닝되었다. SLIT2에의 ROBO2-Fc 2.2 결합은 2가지 방식으로 평가되었다; 첫 번째는 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 평가되었고, 두 번째는 세포 발현된 인간 SLIT2-N에의 ROBO2-Fc 2.2 결합을 검출하기 위한 세포 기반 유동 세포측정법 검정을 사용하여 평가되었다.
SPR 분석
인간 SLIT2는 시노몰구스 원숭이 SLIT2와 높은 수준의 상동성을 공유하며; 전체 상동성은 99%이고, ROBO2 결합 부위를 함유하는 SLIT2의 류신-풍부 반복 도메인 2 (D2)에서의 상동성은 100%이다. 시노몰구스 원숭이와 유사하게, 인간 및 래트 SLIT2는 전체 서열 동일성을 수반한 고도의 상동성을 공유하며 D2 결합 도메인 내에서는 97%이다. D2 영역을 함유하는 인간 및 래트 SLIT2의 N 말단 단편 (SLIT2-N), 및 인간 및 시노몰구스 원숭이 (100% 동일함)의 특이적 SLIT2 D2 도메인에의 ROBO2-FC 2.2의 결합을 SPR에 의해 평가하였다. 역학적 적정 실험의 각각의 주기에 대해 (도 4a-4c), ROBO2-Fc 2.2 분자는 C1 칩에 부착된 항-인간 Fc (AHFc)에 의해 비-공유적으로 포획되며, 이는 ROBO2-Fc 2.2의 인간 IgG1 Fc 영역에 결합되었다. 이어서, 이와 같이 포획된 ROBO2-Fc 2.2를 다양한 농도의 SLIT2 리간드에 노출시켜 회합 및 해리 역학을 모니터링하였다. ROBO2-Fc 2.2를 2 nM이 되도록 희석하였다. 희석제로서 HBS-EP를 사용하였다. 인간/시노몰구스 원숭이 SLIT2-D2, 인간 SLIT2-N 및 래트 SLIT2-N을 HBS-EPB에서 그의 스톡 농도로부터 2 nM이 되도록 희석시켰다. 희석제로서 HBS-EPB를 사용하여 2 nM 내지 15.6 pM 범위의 SLIT2 리간드에 대해 8 포인트 2배 희석 시리즈를 수행하였다. ROBO2-Fc 2.2를 10-15 RU 당량의 판독값까지 포획한 다음, 적정된 양의 특이적 SLIT2 분석물 (즉, 인간/시노몰구스 원숭이 SLIT2-D2, 인간 SLIT2-N 또는 래트 SLIT2-N)에 노출시켰다. 표시된 SLIT2 리간드의 회합을 120초 동안 추적하고 해리를 180초 동안 모니터링하였다. 겉보기 결합 친화도는 운동 속도 상수의 간단한 1:1 상호작용 모델을 사용하여 결정되었다. 인간/시노몰구스 원숭이 SLIT2-D2 (ROBO2 결합 도메인, 100% 동일함)에 대한 ROBO2-Fc 2.2 결합의 KD는 0.293 nM인 것으로 결정되었다 (도 4a). 인간 SLIT2-N (N 말단 단편)에 대한 ROBO2-Fc 2.2 결합의 KD는 0.279 nM인 것으로 결정되었고 (도 4b), 최종적으로, 래트 SLIT2-N에 대한 ROBO2-Fc 2.2 결합의 KD는 0.543 nM인 것으로 결정되었다 (도 4c).
유동 세포측정법 검정
ROBO2-Fc 2.2를 제조업체의 지시에 따라 알렉사 플루오르 (AF) 647과 접합시켰다. 인간 SLIT2-N을 과다발현하는 인간 배아 신장 (HEK293)을, 염색 준비를 위해 5% 태아 소 혈청을 함유하는 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 ROBO2-Fc 2.2-AF647로 염색하기 위해, 2x 스톡을 준비하고, 11 내지 12 포인트 2배 희석 시리즈를 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 완충액에서 제조하였다. 세포 및 ROBO2-Fc 2.2-AF647의 관련 희석물을 96-웰 u자형 바닥 플레이트에서 합하고, 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 웰당 150 μL의 FACS 완충액을 부가하여 세포를 세척하였다. 세척 후, 세포를 포르테사(Fortessa) 유동 세포측정기에서 데이터 수집을 위해 완충액에 재현탁시켰다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였고, 이는 SLIT2-N 발현 HEK293 세포의 기하 평균 형광 강도 (Geo MFI)에서 대조군 HEK293 세포의 Geo MFI를 뺀 값으로서 나타낸다. ROBO2-Fc 2.2는 9 nM의 EC50을 갖는 높은 친화도로 용량-의존성 방식으로, HEK293 세포 상에 과다발현된 인간 SLIT2-N에 결합한다 (도 5).
균질 시간 용해 형광 (HTRF) 검정
ROBO2-Fc는 아마도 리간드 트랩으로서 작용함으로써 SLIT 리간드, 예컨대 SLIT2가 세포성 ROBO2 수용체에 결합하는 것을 억제한다. 인간 ROBO2에 대한 SLIT 리간드 결합을 중화시킬 수 있는 ROBO2-Fc 2.2의 능력을 평가하기 위해 ROBO2-SLITx-N HTRF 염료 표지화 검정을 사용하였다. 이러한 검정에서, 테르븀 (Tb)으로 표지된 (공여자), SNAP-태그부착된 (SNAP-태그® 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs); 또한, 문헌 [Keppler et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21:86] 참조) 인간 ROBO2 발현 HEK293 세포를 적정된 양의 ROBO2-Fc 2.2의 존재 하에 1시간 동안, 다양한 종으로부터의 5 nM d2-표지된 (수용자) SLITx-N (제조업체의 지시에 따라 Cisbio d2 염료 표지화 키트를 사용하여 제조됨)과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 665 nm 및 620 nm에서의 형광을 엔비전(Envision) 다중 표지 플레이트 판독기 상에서 측정하였다. HTRF 비를 하기과 같이 계산하였다: 665 nm에서의 형광/620 nm에서의 형광 x 10,000. 최대 시그널은 ROBO2-Fc 2.2의 부재 하에 d2-표지된 SLIT2-N을 갖는 Tb-표지된 ROBO2 세포의 HTRF 비로서 정의되었고, 최소 시그널은 Tb-표지된 ROBO2 발현 HEK293 세포 단독의 HTRF 비로서 정의되었다. 인간, 시노몰구스 원숭이, 토끼, 래트 및 마우스를 포함한 몇 가지 종으로부터의 3개의 상이한 SLIT 리간드 (SLIT1-N, SLIT2-N 및 SLIT3-N)의 중화를 본 검정에 사용하였다. 각각의 SLITx-N에 대한 IC50은 4000 nM의 최고 농도를 갖는 11-포인트, 4배 희석 시리즈를 사용하여 결정되었다. 3가지 독립적인 실험 전체에 걸친 IC50의 기하 평균을 계산하였고, 평가된 모든 리간드에 대해 요약된다 (표 2).
Figure pct00002
HTRF에 의해 평가 시 ROBO2-Fc 2.2에 의한 인간 ROBO2에 대한 다양한 종으로부터의 SLIT 리간드 결합의 용량-의존성 억제. IC50은 인간, 시노몰구스 원숭이, 토끼, 래트 또는 마우스 SLIT 리간드의 패널에 대항한 HTRF 검정에서 ROBO-Fc 2.2의 11-포인트, 4배 용량 적정을 사용하여 결정되었다. ROBO2-Fc 2.2는 낮은 5.9 nM (인간) 내지 높은 9.8 nM (토끼)의 범위의 IC50으로 인간 ROBO2에 결합하는 인간, 시노몰구스 원숭이, 토끼 및 래트 SLIT1-N의 강력한 중화인자이며; ROBO2-Fc 2.2는 또한, 3.9 nM (인간) 내지 5.7 nM (토끼)의 범위의 IC50으로 인간 ROBO2에 결합하는 SLIT2-N의 용량 의존성 억제를 입증하였다. ROBO2-Fc 2.2는 3.6 nM (시노몰구스 원숭이) 내지 10.2 nM (토끼)의 범위의 IC50으로 인간 ROBO2에 결합하는 SLIT3-N의 강력한 중화인자였다. 최종적으로, ROBO2-Fc 2.2는 각각 7 nM 또는 4 nM의 IC50으로 결합하는 인간 SLIT2-N:인간 ROBO2 (도 6a)와 래트 SLIT2-N:인간 ROBO2 (도 6b) 둘 다의 강력한 중화인자였다.
뉴런 세포 이동 검정
최종 선택 스크린은 ROBO2-의존성 SLIT2-N 활성의 기능적 중화였다. SLIT2-ROBO2 상호작용은 발생 동안 축삭 이동의 주요 조절인자이다. SLIT2는 뇌실하 구역 뉴런에 대해 화학-반발성이라는 것과, 이러한 활성은 ROBO2 의존성이라는 것이 공지되어 있다. 래트의 뇌실하 구역 (SVZ)으로부터의 뉴런 조직 외식편을 단리하고 콜라겐 매트릭스에 포매시켰다. SLIT2-N의 존재 하에서, 뉴런 세포 이동이 억제되고 (SVZ 검정); 적정된 양의 ROBO2-Fc 2.2를 수반하거나 또는 수반하지 않으면서 1 nM SLIT2-N의 존재 하에 조직 외식편을 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 훽스트(Hoechst) 33342로 염색하였다. 10X 높은 NA 대물렌즈로 오페레타 하이 컨텐트 이미저(Operetta High Content Imager; 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 광 시야 형광 영상을 획득하였다. 웰의 전체 중심 영역을 포착하기 위해 5% 오버랩을 갖는 웰당 9개의 필드를 취하였다. 조직 외식편의 전체 깊이를 포착하기 위해 각각의 평면 사이에 1 μm 거리의 6개의 평면으로 이루어진 각각의 필드에 대한 Z-스택을 획득하였다. 볼로시티(Volocity) 소프트웨어 (퍼킨 엘머)에서 분석을 수행하였다. 각각의 웰 내의 모든 필드는 함께 스티칭되었다. 중앙에서 조직 외식편의 면적 및 조직 외식편 외부의 각각의 핵은 훽스트 33342 염색에 의해 검출되었다. 개별 핵을 계수하고, 조직 외식편의 가장 가까운 가장자리까지의 각각의 핵의 중심 거리를 μm로 측정하였다. 웰에서 핵의 평균 이동 거리에 핵 계수를 곱하여 각각의 웰에 대한 총 이동 거리를 수득하였다. ROBO2-Fc 2.2는 51 nM의 IC50으로 용량-의존성 방식으로 뉴런 세포 이동을 복원시킬 수 있었다 (도 7). 이러한 결과는 ROBO2-Fc 2.2가 ROBO2에 대한 SLIT2의 결합을 억제할 뿐만 아니라 SVZ 뉴런에 대한 ROBO2-의존성 SLIT2 화학-반발 활성에 대한 강력한 용량-의존성 중화 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 3. 신규 ROBO2 단백질의 생체내 효과
수동성 헤이만 신염은 단백뇨 상의 증가를 유발시키는, 사구체 족세포에 침범하는 신독성 손상의 래트 모델이다. 이러한 모델은 단백뇨를 감소시키는 ROBO2-Fc 2.2의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 래트를 ROBO2-Fc 2.2로 처리하면, 단백뇨가 감소될 뿐만 아니라 족세포 족양 돌기 구조가 보호되었다. 도 8 및 도 9에 제시된 바와 같이, 래트를 ROBO2-Fc 2.2의 예방적 또는 치료적 투약 레지멘으로 처리하면, 단백뇨의 양이 감소되었다. 래트 신장 브러시 보더 (항-Fx1a (프로베텍스 인크. (Probetex Inc.)), 기저막 및 족세포)에 대항하여 생성된 양 항-혈청을 루이스 래트에게 주사하였다. 이러한 래트에게서 상기 양 혈청에 대한 면역 반응이 발생하였다. 보체 활성화시키면, 족세포가 소멸되고 제3일 내지 제12일에 단백뇨가 증가한 다음, 정체 상태를 유지한다. 이러한 메카니즘은 (사례의 70%에서) 족세포 단백질 PLA2R에 대항한 자가 항체가 보체 개입 후 족세포 소멸 및 신성 범위 단백뇨를 유발시키는 막성 신병증에서 발견되는 것과 매우 유사하다. 래트를, 대략 50, 90 및 99% (1, 5 및 25 mg/kg)의 사구체 ROBO2를 커버하는 용량 범위로 양 항혈청 투여 24시간 전에 미리 처리하였고, 이후 72시간마다 처리하였다 (예방적 투약 레지멘). ROBO2-Fc 2.2를 제6일 또는 제9일 (양 항혈청의 투여 후 5일 또는 8일)에 투여하는 치료적 투약 레지멘의 경우에는, 양 항혈청을 투여하기 24시간 전에 제공된 용량도 본 연구에 포함되었다. 치료가 예방적으로 시작될 때 단백뇨에 있어서의 최대 감소는 45%였고 (도 8), 반복 측정 ANOVA 통계 분석은 p 값 .001 미만인 용량 반응을 확증하였다. 제0일, 제6일 및 제9일에 투여된 ROBO2-Fc 2.2로의 처리는 대조군 항체 처리와 비교 시 각각의 ROBO2-Fc 2.2 처리군에 대한 반복 측정 ANOVA 통계 분석에 의해 p 값 .001 미만으로 및 유사한 정도 (도 9), 최대 40%로 단백뇨를 감소시켰다. 보체 IHC 스코어링에 의해 결정된 바와 같이 신장에서 면역 복합체 침착에 있어서의 감소는 없었으며, 이는 반응이 족세포 보호 효과에 기인하였다는 것을 표시한다.
족세포 기능 및 구조의 조정에 있어서의 신뢰를 추가로 제공하기 위해, 족세포 하부 구조의 전자 현미경 사진의 정량 분석을 하기 기재된 바와 같이 수행하였다.
수집, 샘플링 및 절편화
침지 (4% 포름알데히드/1% 글루타르알데히드)에 의해 고정된 전면 샘플 신장 (동물 1마리당 하나의 신장)을 받고, 피질만 포함하도록 손질하며, 각각의 신장의 5개 샘플을 에폭시 수지에 포매시켰다. 각각의 신장의 첫 번째 포매된 샘플을 절편화하였다. 3개의 사구체를 함유한 경우에는, 샘플을 얇게 절편화하고 영상화하였다. 이러한 첫 번째 샘플이 사구체를 함유하지 않은 경우에는, 그 신장으로부터 다른 포매된 샘플을 순차적으로 절편화하고 유사하게 평가하여 3개의 사구체가 있는 샘플을 찾아냈다.
보기 및 영상화
선택된 신장 샘플을 투과 전자 현미경 (히타치(Hitachi) H-7100) 및 디지털 CCD 카메라 시스템 (어드밴스드 마이크로스코피 테크닉스(Advanced Microscopy Techniques; 매사추세츠주 댄버))을 사용하여 디지털 영상화하였다. 반복없이, 200x 배율에서 발견된 첫 번째 3개의 사구체의 3개의 모세관 루프를 5,000x 및 10,000x 배율로 영상화하였다. 이로써, 신장당 18개의 디지털 영상이 생성되었다 (즉, 신장 샘플당 3개 사구체 x 사구체당 3개 영역 x 2배율). 맹검 방식으로 평가할 수 있도록, 각각의 영상은 단지 연구 번호, 동물 번호, 샘플 번호 및 배율로만 확인되었다.
족세포 족양 돌기 폭 및 슬릿-다이어프램 밀도 측정
이미지J 소프트웨어 (버전 1.47v; 미국 국립 보건원 (미국 메릴랜드주 베데스다))를 사용하여, 사구체 기저막 (GBM)의 단위 길이당 인접한 족양 돌기의 폭을 고 배율 투과 전자 현미경 영상에서 수동으로 추적하고 측정하였다. 간략하게, 군당 6마리의 래트 및 각각의 래트로부터의 9개의 5000x TEM 영상에서 측정을 수행하였다. 족세포 족양 돌기 폭은 GBM에 평행한 선을 그려 슬릿 다이어프램의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 측정하였다. 이는 영상의 모든 족양 돌기에 대해 반복되었다. 그런 다음, 이러한 결과를 스케일 바에 맞게 조정하고 각각의 영상에 대한 조화 평균을 계산하였다.
슬릿 다이어프램 밀도: 슬릿 다이어프램 밀도는 슬릿 다이어프램의 수를 계수하고 이들 슬릿 다이어프램의 영역 전체에 걸쳐 있는 총 GBM 길이로 나눔으로써 계산되었다. 간략하게, 군당 6마리의 래트 및 각각의 래트로부터의 9개의 5000x TEM 영상에서 측정을 수행하였다. 슬릿 다이어프램의 수를 GBM 길이로 나누어 밀도를 계산하였다. 족양 돌기의 비-가시성으로 인해 2개 이상의 GBM 구역이 가시적이거나 또는 GBM이 분리된 경우에는, 상기 절차를 반복하고 이들 측정의 평균을 사용하여 슬릿 다이어프램 밀도를 계산하였다. 서로 맞물린 족양 돌기의 슬릿 다이어프램 사이의 거리는 다중 모세관 루프 전체에 걸쳐 계산되어, 평균 족양 돌기 폭을 결정하였다. 소멸된 족세포의 족양 돌기 폭은 정상의 소멸되지 않은 족세포의 것보다 더 클 것이다.
도 10a에 제시된 바와 같이, 25 mg/kg 용량 하에 ROBO2-Fc 2.2 처리된 동물의 족양 돌기 폭은 대조군 항체 처리된 동물보다 상당히 더 짧았다. 이러한 데이터는 단백뇨의 감소가 족세포 하부 구조에 있어서의 변경에 기인하였다는 것을 입증한다. 부가적으로, 도 10b에 제시된 바와 같이, ROBO2-Fc 2.2로 처리하면 슬릿 다이어프램의 밀도가 증가되었으며 (양측 T 검정에 의한 p 값 0.01 미만), 이는 사구체 손상으로부터 덜 소멸되고 보호되었다는 것을 표시한다.
이들 결과는 ROBO2-Fc 2.2가 사구체 질환의 2가지 특징인 단백뇨 및 확산성 족세포 소멸을 억제하는데 효과적이라는 것을 입증한다. 따라서, 이들 결과는 예컨대 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS)이지만 이에 제한되지는 않는 사구체 질환을 치료하기 위한 잠재적 치료제로서의 ROBO2-Fc 2.2의 용도를 뒷받침해준다.
ROBO2-Fc 2.2에 대한 주요 약리학적 특성이 표 3에 요약되어 있다.
Figure pct00003
시험관내 약리학 연구는 ROBO2-Fc 2.2가 인간 SLIT2-N 및 동일한 인간 및 시노몰구스 원숭이 SLIT2-D2 도메인과 동일한 높은 친화도로 결합하였다는 것을 입증하였다. ROBO2-Fc 2.2는 또한 높은 친화도로 래트 SLIT2-N에 결합하였다. ROBO2-Fc 2.2는 인간 SLIT2-N을 발현하는 세포와 용량-의존성 방식으로 결합하였다. 부가적으로, ROBO2-Fc 2.2는 세포 기반 결합 HTRF 검정에서 인간 ROBO2에 대한 래트 및 인간 SLIT2-N의 결합을 강력하게 억제하였다. 생체내 기계적, 약리학 및 효능 연구는 또한, 단백뇨 사구체 질환의 래트 모델을 사용하여 시행되었다. 예방적 또는 치료적 투약 레지멘으로 ROBO2-Fc 2.2를 투여하면, PHN 모델에서 단백뇨가 통계적으로 유의하게 감소되었다. 이들 결과는 사구체 질환, 예컨대 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS)을 치료하기 위한 ROBO2-Fc 2.2의 용도를 뒷받침해준다.
실시예 4. ROBO2-Fc S17T/R73Y 결합 및 중화 활성의 특징규명
유동 세포측정법 검정
ROBO2-Fc S17T/R73Y를 제조업체의 지시에 따라 알렉사 플루오르 (AF) 647과 접합시켰다. 인간 SLIT2-N을 과다발현하는 세포를, 염색 준비를 위해 5% 태아 소 혈청을 함유하는 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 ROBO2-Fc S17T/R73Y-AF647로 염색하기 위해, 2x 스톡을 준비하고, 11 내지 12 포인트 2배 희석 시리즈를 FACS 완충액에서 제조하였다. 세포 및 ROBO2-Fc S17T/R73Y-AF647의 관련 희석물을 96-웰 u자형 바닥 플레이트에서 합하고, 4℃에서 45분 동안 놓아두었다. 인큐베이션 후, 웰당 150 μL의 FACS 완충액을 부가하여 세포를 세척하였다. 세척 후, 세포를 포르테사 유동 세포측정기에서 데이터 수집을 위해 완충액에 재현탁시켰다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였고, 이는 SLIT2-N 발현 HEK293 세포의 기하 평균 형광 강도 (Geo MFI)에서 대조군 HEK293 세포의 Geo MFI를 뺀 값으로서 나타낸다. ROBO2-Fc S17T/R73Y는 2.5 nM의 EC50을 갖는 높은 친화도로 인간 배아 신장 (HEK293) 세포 상에 과다발현된 인간 SLIT2-N에 결합하였다 (도 11).
균질 시간 용해 형광 (HTRF) 검정
ROBO2-SLIT2-N 균질 시간 용해 형광 (HTRF) 검정을 사용하여, SLIT2-N과 세포 발현된 ROBO2의 상호작용을 차단시킬 수 있는 ROBO2-Fc S17T/R73Y의 능력을 평가하였다. 이러한 검정에서, 테르븀 (Tb)으로 표지된 (공여자), SNAP-태그부착된 ROBO2 발현 HEK293 세포를 제조업체의 지시에 따라 (Cisbio HTRF d2 표지화 키트 62D2DPEA 및 테르븀 크립테이트 표지화 키트 62TBSPEA) 적정된 양의 ROBO2-Fc S17T/R73Y의 존재 하에 1시간 동안, 5 nM d2-표지된 (수용자) 인간 SLIT2-N과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 665 nm 및 620 nm에서의 형광을 엔비전 다중 표지 플레이트 판독기 상에서 측정하였다. HTRF 비는 하기과 같이 계산되었다: 665 nm에서의 형광/620 nm에서의 형광 x 10,000. 최대 시그널은 ROBO2-Fc S17T R73Y의 부재 하에 d2-표지된 SLIT2-N을 갖는 Tb-표지된 ROBO2 세포의 HTRF 비로서 정의되었고, 최소 시그널은 Tb-표지된 ROBO2 발현 HEK293 세포 단독의 HTRF 비로서 정의되었다. ROBO2-Fc S17T R73Y은 1.4 nM의 IC50으로 결합하는 인간 SLIT2-N:인간 ROBO2의 강력한 중화인자였다 (도 12).
뉴런 세포 이동 검정
ROBO2-Fc 2.2에 대해 수행된 바와 같이, ROBO2-Fc S17T/R73Y는 용량-의존성 방식으로 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제를 역전시킬 수 있는 능력에 관하여 평가되었다. 래트의 뇌실하 구역 (SVZ)으로부터의 뉴런 조직 외식편을 단리하고 콜라겐 매트릭스에 포매시켰다. SLIT2-N의 존재 하에서, 뉴런 세포 이동이 억제되며 (SVZ 검정); 적정된 양의 ROBO2-Fc S17T R73Y를 수반하거나 또는 수반하지 않으면서 1 nM SLIT2-N의 존재 하에 조직 외식편을 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 훽스트 33342로 염색하였다. 10X 높은 NA 대물렌즈로 오페레타 하이 컨텐트 영상화기 (퍼킨 엘머) 상에서 광 시야 형광 영상을 획득하였다. 웰의 전체 중심 영역을 포착하기 위해 5% 오버랩을 갖는 웰당 9개의 필드를 취하였다. 조직 외식편의 전체 깊이를 포착하기 위해 각각의 평면 사이에 1 μm 거리의 6개의 평면으로 이루어진 각각의 필드에 대한 Z-스택을 획득하였다. 볼로시티 소프트웨어 (퍼킨 엘머)를 사용하여 분석을 수행하였다. 각각의 웰 내의 모든 필드는 함께 스티칭되었다. 중앙에서 조직 외식편의 면적 및 조직 외식편 외부의 각각의 핵은 훽스트 33342 염색에 의해 검출되었다. 개별 핵을 계수하고 조직 외식편의 가장 가까운 가장자리까지의 각각의 핵의 중심 거리를 μm로 측정하였다. 웰에서 핵의 평균 이동 거리에 핵 계수를 곱하여 각각의 웰에 대한 총 이동 거리를 수득하였다. ROBO2-Fc S17T/R73Y는 11.5 nM의 IC50으로 용량-의존성 방식으로 뉴런 세포 이동을 복원시킬 수 있었다 (도 13).
이들 결과는 ROBO2-Fc 2.2와 마찬가지로, ROBO2-Fc S17T/R73Y는 ROBO2에 대한 SLIT2의 결합을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 SVZ 뉴런에 대한 ROBO2-의존성 SLIT2 화학-반발 활성에 대한 강력한 용량-의존성 중화 기능적 효과를 갖는다는 것을 입증한다. 따라서, 이들 데이터는 ROBO2-Fc 2.2와 마찬가지로, ROBO2-Fc S17T/R73Y는 ROBO2-SLIT 상호작용을 수반하는 사구체 질환, 예컨대 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS)을 치료하는데 유용할 수 있는 잠재적 치료제일 수 있음을 시사한다.
실시예 5. ROBO2-Fc 2.2의 구조적 분석
재료 준비, 결정화, 데이터 수집 및 구조 결정:
ROBO2-His 구축물의 발현 및 정제
ROBO2 프리-Ig1 서열 (서열식별번호: 8), Ig1 도메인, Ig2 도메인; 및 C-말단에 6x 히스티딘 태그 (서열식별번호: 25)를 수반한 ROBO2 Ig2-3 도메인간 링커 (서열식별번호: 12) (ROBO2-His6 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6"))로 이루어진 ROBO2 구축물이 HEK293 세포에서 발현되었다. 이러한 구축물을 이미다졸 구배 용리와 함께 Ni 엑셀 컬럼을 통해 정제하였다. 구축물을 하이로드(HiLoad) 26/200 슈퍼덱스 200 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 통해 균질하게 추가로 정제하였다.
결정화
ROBO2-His의 결정을 하기 조건: 100 mM 시트르산 나트륨 pH 4.5, 12% PEG8000 하에 수득하였으며, 이로써 2.19 Å로 회절된 결정이 산출되었다.
데이터 수집
결정은 일시적으로 동결 방지되었고, 싱크로트론 데이터 수집은 어드밴스드 포톤 소스(Advanced Photon Source; APS)에서 원격으로 수행되었다. 이미지 프레임은 소프트웨어 AutoPROC (글로벌 페이징 리미티드(Global Phasing Ltd))를 사용하여 프로세싱되었다. 데이터는 하기와 같이 유닛 셀이 있는 공간 군 P21에 속한다: a = 79.307 Å, b = 50.887 Å, c = 93.854 Å, α = γ = 90°, β = 114.92, 비대칭 단위당 인간 ROBO2 (Ig1+Ig2)의 2개의 카피를 수반한다.
구조 결정 및 정련
ROBO1의 상동성 모델 (Ig1+Ig2, PDB 코드: 2V9Q)을 사용하는 분자 대체 검색은 각각의 구성요소에 대한 확실한 솔루션을 산출하였다. 소프트웨어 autoBUSTER (글로벌 페이징 리미티드)를 사용하여 개선을 수행하였고, 2.19 Å에서의 최종 R/R프리 인자는 각각 0.2119 및 0.2425이며, 결합의 RMSD는 0.010 Å이고, 각도의 RMSD는 1.19°이다.
구조적 결과 및 분석:
ROBO2 프리-Ig1 서열을 통한 발현의 증진
실시예 1에서, 야생형 ROBO2 프리-Ig1 서열 SRLRQEDFP (서열식별번호: 8)의 봉입이 ROBO2-Fc 2.2에 대한 발현 수준을 극적으로 개선시키는 것으로 입증되었다. Asp7 (D7), Phe8 (F8) 및 Pro9 (P9)가 ROBO2의 제1 Ig 도메인의 구조적 완전성에 필수적인 상호작용에 실질적으로 관여한다는 것이 ROBO2-His6 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")의 결정 구조로부터 명백하다 (도 14). Asp7은 Tyr94와 수소 결합을 형성하는 반면, Phe8은 Arg36 및 Asn93과 이중 결합을 형성한다 (표 4-5; 이웃하는 잔기들 사이의 거리는 3.8 Å 이하의 거리 이내임). 또한, Asp7 (D7), Phe8 (F8) 및 Pro9 (P9)는 또한, 이웃하는 잔기와 광범위한 반 데르 발스의 접촉을 수반하여, 그의 표면적의 50% 초과가 매립되게 한다 (표 6-9). 임의의 특별한 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 이들 데이터는 ROBO2 프리-Ig1 서열이 ROBO2의 제1 Ig 도메인의 2개의 β-시트를 함께 브릿지함으로써, N-말단 영역의 구조적 폴드를 상당히 안정화시킨다는 것을 입증한다. 놀랍게도, 이들 데이터는 구조적 폴드의 안정화가 프리-Ig1 서열이 결여된 ROBO2-Fc 구축물의 발현과 비교 시 적절하게 폴딩된 ROBO2-Fc 2.2의 증가된 발현을 매개한다는 것을 시사한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
ROBO2 Ig2-3 도메인간 링커를 통한 발현의 증진:
ROBO2 Ig2-3 도메인간 링커 V200-F201-E202-R203 (VFER; 서열식별번호: 12)의 봉입은 ROBO2-Fc 2.2의 발현 수준을 현저하게 증가시켰다. Val200은 ROBO2의 Ig2 도메인에서 마지막 β-가닥의 일부이다. V200은 광범위한 반 데르 발스 접촉을 통해 이웃하는 잔기에 의해 깊게 둘러싸여 있으며 (표 10-11); 결과적으로 그의 표면적의 85%가 매립되었다 (표 12-13). Val200 외에, Phe201-Glu202-Arg203이 또한 상기 영역 내에서 수소 결합 및 반 데르 발스의 상호작용에 실질적으로 관여한다 (표 10-11, 14-15). 종합적으로, 이들 데이터는 이들 4개 아미노산 잔기가 ROBO2의 Ig2 도메인의 C-말단 영역에서 구조적 폴드를 효과적으로 안정화시킨다는 것을 시사한다 (도 15). 임의의 특별한 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 이들 데이터는 구조적 폴드의 안정화가 Ig2-3 도메인간 링커가 결여된 ROBO2-Fc 구축물의 감소된 발현과 비교 시 적절하게 폴딩된 ROBO2-Fc 2.2의 발현을 증가시킨다는 것을 시사한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 6. ROBO2-Fc S17T/R73Y의 구조적 분석
재료 준비, 결정화, 데이터 수집 및 구조 결정:
발현
인간 ROBO2 S17T/R73Y-His6 구축물 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")은 2개의 점 돌연변이 (S17T 및 R73Y)를 갖는 인간 ROBO2 Ig1 도메인에 이어 C-말단 His x 6 태그 (서열식별번호: 25)로 이루어진다. 인간 SLIT2 구축물은 SLIT2의 D2 도메인 (271-479)에 이어 C-말단 His6 태그 (서열식별번호: 25)로 이루어진다. 이들 구축물은 HEK293 세포에서 별도로 발현되었고, 조건부 배지는 형질감염 후 120시간에 수거하였다.
인간 ROBO2 S17T/R73Y-His6 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6") 및 SLIT2 D2 도메인의 정제
인간 ROBO2 S17T/R73Y-His6 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")을 니켈 세파로스 HP (지이 헬스케어) 및 이미다졸 구배를 사용하여 조건부 배지로부터 정제하였다. 피크 분획을 합하고 20 mM NaCl로 희석하며, pH 6.0이 되도록 조정하고, 하이트랩(HiTrap) 강한 술포프로필 (SP) 고성능 (HP) 컬럼과 나란히 배치된 하이트랩, Q 세파로스 패스트 플로우 (Q FF) 컬럼 상에 부하하였다. 광범위한 세척 후, Q FF 컬럼을 꺼내고 NaCl의 구배를 SP HP 컬럼에 적용하였다. 글리코실화의 정도에 근거하여 분획을 풀링하고 TBS에 대항하여 투석하였다.
인간 SLIT2 D2 도메인을 니켈 세파로스 HP (지이 헬스케어)를 사용하여 조건부 배지로부터 포획하고, 이미다졸의 구배로 정제하였다. 피크 분획을 풀링하고, 50 mM 트리스 HCl pH 7.5, 1000 mM NaCl을 함유하는 완충액 하에 슈퍼덱스 200 크기 배제 크로마토그래피를 통해 추가로 정제하였다. SLIT2 D2를 함유하는 분획을 풀링하고 500 mM NaCl로 조정하였다.
인간 ROBO2 S17T/R73Y-His와 SLIT2 D2 도메인의 복합체 형성
SLIT2와 겔 여과 컬럼의 수지 사이의 예상치 못한 상호작용으로 인해, ROBO2 S17T/R73Y-His6 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")과 SLIT2의 복합체는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 수득할 수 없었다. 대신, 정제된 ROBO2 S17T/R73Y-His6 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")을 1:1 몰 비로 SLIT2 D2 도메인과 혼합하고 결정화 시도를 위해 농축시켰다.
결정화
SLIT2 D2 도메인과의 복합체 중의 ROBO2 S17T/R73Y-His6 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")의 결정은 하기 조건에서 수득하였다: 100 mM 시트르산 나트륨 pH 5.5, 15% PEG6000. 1.78 Å로 회절된 결정이 산출되었다.
데이터 수집
결정은 일시적으로 동결 방지되었고, 싱크로트론 데이터 수집은 어드밴스드 포톤 소스 (APS)에서 원격으로 수행되었다. 이미지 프레임은 소프트웨어 AutoPROC (글로벌 페이징 리미티드)를 사용하여 프로세싱되었다. 데이터는 하기와 같이 유닛 셀이 있는 공간 군 P212121에 속한다: a = 163.251 Å, b = 41.896 Å, c = 50.938 Å, α = β = γ = 90°, 비대칭 단위당 상기 복합체의 1개 카피를 수반한다.
구조 결정 및 정련
ROBO1 Ig1 도메인 및 SLIT2 D2 도메인의 상동성 모델 (PDB 코드: 2V9T)을 사용하는 분자 대체 검색은 각각의 구성요소에 대한 확실한 솔루션을 산출하였다. 소프트웨어 autoBUSTER (글로벌 페이징 리미티드)를 사용하여 개선을 수행하였고, 1.78 Å에서의 최종 R/R프리 인자는 각각 0.1848 및 0.2354이며, 결합의 RMSD는 0.010 Å이고, 각도의 RMSD는 1.10°이다.
구조적 결과 및 분석
ROBO2 S17T/R73Y-His6-SLIT2 (서열식별번호: 25로서 개시된 "His6")의 결정 구조는 ROBO1-SLIT2의 결정 구조와 광범위하게 정렬되며, ROBO-SLIT 인터페이스는 ROBO2와 ROBO1 사이에 고도로 보존된다. 따라서, 공개적으로 이용가능한 ROBO1-SLIT2 구조는 S17T 및 R73Y의 영향을 조사하기 위한 구조적 비교를 위해 ROBO2-SLIT2에 대한 대체물로서 사용될 수 있다.
ROBO2의 Ser17 (S17)은 수소 결합을 통해 SLIT2의 Arg287과 상호작용한다 (도 16). 아르기닌과의 수소 결합은 돌연변이에 관계없이 보존되지만; Thr17은 부가의 반 데르 발스의 Arg287과의 접촉을 제공하므로, 야생형 Ser17에 비해 약간 활동적인 이점을 이끌어 낸다.
ROBO2의 R73Y는 SLIT2의 Tyr404와 상호작용한다 (도 16). 두 티로신 잔기의 pi-pi 스태킹에 의해 유발된 반 데르 발스의 상호작용은 티로신과 가요성 아르기닌 측쇄 사이의 것보다 명확하게 더 탁월하다. 이는 매립 표면적의 백분율 (Tyr73의 경우에 42% 대 Arg73의 경우에 22%; 표 16-19)을 통해 명백하다. ROBO2 S17T/R73Y에서 Arg에서 Tyr로의 돌연변이가 S17 및 R73을 포함하는 야생형 ROBO2와 비교 시 친화도 상의 증가에 대한 주요 원인 제공자일 것으로 예상된다.
또한, S17T 및 R73Y는 ROBO2-SLIT2 인터페이스의 반대쪽 끝에 위치한다 (도 16). 임의의 특별한 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 이들 위치에서 상호작용을 안정화시키는 것이, ROBO2가 SLIT2와 더 잘 '고착'하는데 도움이 되고, 따라서 두 단백질의 전체 결합 친화도를 증가시키는 것으로 예상된다.
Figure pct00008
실시예 7: ROBO2-Fc 2.2의 번역 후 변형
LC/MS - 펩티드 맵핑
ROBO2-Fc 2.2의 번역 후 변형의 분석은 펩티드 맵핑에 의해 달성되었다. 간략하게, ROBO2-Fc 2.2를 리신 특이적 프로테아제인 리실 엔도펩티다제 (Lys-C)로 환원, 알킬화 및 소화시켰다. Lys-C 단백질 분해 펩티드를 214 nm에서의 UV 검출을 수반하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 분석하였다.
ROBO2-Fc 2.2에 대한 펩티드 맵 내의 모든 주요 및 부차 피크는 온라인 전기 분무 이온화 질량 분석법 (RP-HPLC/ESI MS 또는 LC/MS)에 의해 확인되었다. 각각의 피크에 대한 관찰된 질량은 ROBO2-Fc 2.2로부터 예측된 Lys-C 단백질 분해 펩티드와 일치하였다. 이들 LC/MS-펩티드 맵핑 결과는 ROBO2-Fc 2.2가 cDNA 서열로부터 예측된 바와 같이, 정확한 아미노산 서열을 함유한다는 것을 입증한다. LC/MS 분석은 N-연결된 글리코실화를 위한 N102 AS 컨센서스 서열을 함유하는 펩티드 K6 (K4K5K6으로서 검출됨)에서의 N-연결된 올리고사카라이드의 존재를 나타냈다. K4K5K6 글리코펩티드에서 확인된 주요 올리고사카라이드 구조는 1개의 말단 N-아세틸뉴라민산 잔기를 갖는 2개의 갈락토스 잔기 (G2F+1NeuAc) 또는 2개의 말단 N-아세틸뉴라민산 잔기를 갖는 2개의 갈락토스 잔기 (G2F+2NeuAc)를 함유하는 이중안테나 복합체-유형 구조를 포함한다. 2개의 말단 갈락토스 잔기 (G2F)를 함유하는 부차 수준의 K4K5K6 글리코펩티드가 관찰되었다. 최대 4개의 말단 N-아세틸뉴라민산 잔기를 함유하는 코어-치환된 푸코스를 갖는 삼중안테나 및 사중안테나 복합체 유형 구조를 나타내는 다른 부차 수준의 종이 관찰되었다.
LC/MS 분석은 또한, N-연결된 글리코실화를 위한 N291ST 컨센서스 서열을 함유하는 펩티드 K19 (K18K19로서 관찰됨)에서의 N-연결된 올리고사카라이드의 존재를 나타냈다. K18K19에서 확인된 주요 올리고사카라이드 구조는 제로 (G0F) 또는 1개의 (G1F) 말단 갈락토스 잔기를 함유하는 아시알로-이중안테나 복합체 유형 구조를 포함한다. 2개의 갈락토스 잔기 (G2F)를 함유하는 아시알로-이중안테나 복합체 유형 구조를 갖는 부차 수준의 K18K19가 관찰되었다. 말단절단된 N-글리칸 및 최대 2개의 말단 N-아세틸뉴라민산 잔기를 함유하는 복합 N-글리칸을 함유하는 부차 및 미량 수준의 글리코펩티드 K18K19가 검출되었다.
Figure pct00009
실시예 8: 안전 약리학 연구
ROBO2-Fc 2.2는 심혈관 (CV) 종말점을 평가하기 위해 원격측정된 수컷 원숭이에게 50 mg/kg/투약의 용량으로 6주 동안 정맥내 (IV) 주사에 의해 매주 1회 (총 6회 용량) 투여되었다. 심박수 (HR)와 활성의 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. 그러나, 이러한 차이는 그 규모가 작고, 산발적이며 시간이 지나도 지속되지 않았으므로; ROBO2-Fc 2.2와 관련된 것으로 고려되지 않았다. 50 mg/kg/투약으로 ROBO2-Fc 2.2를 6주 동안 매주 1회 IV 투여하면, 연구 내내 언제든지 ROBO2-Fc 2.2와 관련하여 혈압 (BP), HR 또는 활성에 있어서의 변화가 발생하지 않았다. Cmax 값은 제1일, 제22일 및 제36일에 각각 1060, 1030 및 1070 μg/mL였다.
원격측정된 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에서 반복-투약 탐색적 독성 연구 (ETS)에서, 심전도 (ECG) 및 혈압 (BP) 파라미터 및 활성에 대한, 29일 동안 50 mg/kg/투약으로 ROBO2-Fc 2.2를 매주 1회 IV 투여한 효과 (총 5회 용량)를 평가하였다. 제9일에 수집된 CV 측정에 대한 ROBO2-Fc 2.2-관련 효과는 없었다. 제29일에, 조합 성별 Cmax는 497 μg/mL였다.
ECG 및 HR 측정은 20, 100, 또는 300 mg/kg/투약 IV, 또는 300 mg/kg/투약 피하 (SC)의 용량으로 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에서 우수 실험실 관리 기준 (GLP) 준수 3-개월 반복-투약 독성 연구에 통합되었다. 이러한 연구에서 최대 9210 μg/mL의 평균 조합 성별 Cmax에서 ECG 또는 HR에 대한 ROBO2-Fc 2.2-관련 효과는 없었다. 또한, 임의의 호흡기 또는 중추 신경계 효과를 암시하는 ROBO2-Fc 2.2-관련 임상 관찰 내용은 없었다.
또한, 래트에서의 3-개월 독성 연구에서 신경 기능 종말점을 평가하였다. 최대 425 mg/kg/투약 IV 또는 425 mg/kg/투약 SC의 용량에서 운동 활동 또는 기능성 관찰 배터리에 대한 ROBO2-Fc 2.2-관련 효과는 없었다 (최대 7610 μg/mL의 평균 조합 성별 Cmax).
실시예 9: 동물에서의 약동학 및 산물 대사
분석 방법
I. 래트 및 원숭이 혈청에서의 ROBO2-Fc 2.2의 정량
전기 화학 발광 (ECL) 검정은 메소 스케일 디스커버리 (MSD®) 검정 플랫폼 (15-1611, 15-1609) 상에서 위스타 한 래트 및 시노몰구스 원숭이 혈청에서 ROBO2-Fc 2.2의 정량에 관하여 검증하였다. 이들 검정에서, ROBO2-Fc 2.2를 함유하는 샘플을, 비오티닐화된 항-ROBO2-Fc 항체 포획 시약으로 코팅된 스트렙타비딘-코팅된 MSD 플레이트 상으로 인큐베이션하였다. 결합된 ROBO2-Fc 2.2를 루테닐화 마우스 항-인간 IgG Fc 항체로 검출하였다. MSD 플레이트 판독기를 사용하여 판독된 ECL 시그널을 생성하기 위해 MSD 판독 버퍼를 부가함으로써 최종 검출을 달성하였다. 이로써 생성된 ECL 시그널은 ROBO2-Fc 2.2의 농도에 정비례하였다. 가중 계수가 1/y인 4PL 로지스틱 (자동 추정) 모델을 사용하여 피팅된 표준 곡선으로부터 보간에 의해 샘플 농도를 결정하였다. 100% 혈청에서의 정량 범위는 20x의 최소 요구 희석 계수 (MRD)로 50 내지 1280 ng/mL였다.
II. 래트 및 원숭이 혈청에서의 항 ROBO2-Fc 2.2 항체의 검출
MSD® 검정 플랫폼을 사용하여 위스타 한 래트 및 시노몰구스 원숭이 혈청에서 항-약물 항체 (ADA)의 존재를 검출하기 위해 ECL 검정을 검증하였다. 이들 검정에서, 비오틴 및 루테늄-표지된 ROBO2-Fc 2.2를 연구 샘플, 양성 대조군 (위스타 한 또는 시노몰구스 원숭이 혈청에서의 항-ROBO2-Fc 2.2 항체) 또는 음성 대조군 (풀링된 정상 위스타 한 또는 시노몰구스 원숭이 혈청)과 공동 인큐베이션하였다. 샘플에 존재하는 ROBO2-Fc 2.2에 대한 항체는 이들 검정에서 검출될 ROBO2-Fc 2.2의 비오틴- 및 루테늄-표지된 버전 둘 다에 결합해야만 한다. 결합된 ADA를 스트렙타비딘-코팅된 MSD 플레이트를 사용하여 포획하였다. MSD 플레이트 판독기를 사용하여 측정하고 상대 광 단위 (RLU)로 보고된 ECL 시그널을 생성하기 위해 트리프로필아민을 사용하여 최종 검출을 달성하였다.
계층 전략을 사용하여 연구 샘플을 ADA에 관하여 시험하였다. 샘플을 초기에, 1:50의 최소 요구 희석으로 스크리닝 검정에서 시험하였다. 검정 컷오프 지점 아래에서 RLU를 생성한 샘플은 음성으로서 보고되었다 (<1.70, 최소 요구 희석 계수 50의 log10). 검정 컷오프 지점에서 또는 그 이상에서 RLU를 생성한 샘플을 완전 희석 시리즈로 재분석하여 양성 결과를 확인하고 항체 역가를 결정하였다. 항체 역가는 검정 컷오프 지점 RLU와 동등한 RLU를 생성할 것인 샘플의 상호 희석으로서 정의되었고, 그 역가의 log (기수 10)가 보고되었다.
ADA의 유도에 관한 결론은 제1일에 투약하기 전에 수집된 샘플과 투약 후 샘플 결과의 비교에 근거하여 이루어졌다. 투약 전 샘플이 ADA에 대해 음성으로 시험되고 상응하는 투약 후 샘플이 양성으로 시험된 경우, 동물은 ROBO2-Fc 2.2에 대한 ADA 반응의 유도에 대해 양성인 것으로 간주되었다. 투약 후 샘플과 투약 후 샘플 둘 다가 ADA에 대해 양성으로 시험된 경우, 단지 투약 후 샘플 역가가 부가적으로 적어도 0.48 (log 3, 연속 희석 계수)이거나 또는 투약 전 샘플의 역가보다 더 높은 경우에만 동물이 ADA 반응의 유도에 대해 양성인 것으로 간주되었다.
결과
I. 약동학
A. 단일-투약 약동학
ROBO2-Fc 2.2의 혈청 PK는 10 mg/kg에서의 단일 IV 투약 후 루이스 래트 (n = 3) 및 시노몰구스 원숭이 (n = 2)에서 결정되었다. ROBO2-Fc 2.2는 래트에서 1.5 mL/h/kg의 클리어런스 (CL), 원숭이에서 0.89 mL/h/kg, 및 래트에서 0.19 L/kg, 원숭이에서 0.09 L/kg의 항정 상태 분포 용적 (Vss)을 나타내므로, 래트 및 원숭이에서 각각 대략 5일 및 8일의 말단 반감기 (t½)를 초래하였다. ROBO2-Fc 2.2를 래트에게 10 mg/kg SC 투여한 후, 추정된 생체 이용률은 56%였다.
B. 반복-투약 약동학 (독성동태학; TK)
래트 독성동태학
TK 및 ADA 평가는 25, 125 또는 425 mg/kg/투약을 IV 투여한 후 및 425 mg/kg/투약을 SC 투여한 후에 시행되었으며, 이는 6-주 회복기를 동반한 3-개월 GLP 중추적 독성 연구의 파트로서 수컷 및 암컷 위스타 한 래트 (n=6/성별/투약군)에게 3일마다 1회 제공되었다.
제1일에 투약하기 전에 수집 및 분석된 샘플, 또는 비히클 대조군으로부터 수집 및 분석된 샘플에서는 정량화가능한 농도의 ROBO2-Fc 2.2가 없었다. ROBO2-Fc 2.2의 정량화가능한 농도는 ROBO2-Fc 2.2-투약군에서 제88일 (마지막 샘플이 수집됨)까지 및 회복기의 마지막 날 (제135일)까지 관찰되었다.
임의의 투약군에서 전신 노출에 있어서의 성별 관련된 명백한 차이는 없었다 (최대 농도 [Cmax] 및 0 내지 72 시간에 농도 곡선하 면적 (AUC) [AUC72]에 의해 평가된 바와 같음). 평균 전신 노출은 제1일부터 제88일까지 대략 용량-비례 방식으로 용량을 증가시킴에 따라 증가하였다. ROBO2-Fc 2.2 전신 생체 이용률은 제1일 및 제88일에 SC 투약한 후 각각 24.4% 및 25.4%였다. IV 및 SC 군에 대한 누적 비율 (AUC, 제88일/제1일)은 <2.0이었다 (표 21))
25, 125 및 425 mg/kg IV 군에서 ROBO2-Fc 2.2에 대한 ADA 유도의 발생률은 각각 0.0% (12마리 동물 중 0마리), 0.0% (12마리 동물 중 0마리) 및 0.0% (12마리 동물 중 0마리)였고, 425 mg/kg SC 군에서는 41.7% (12마리 동물 중 5마리)였다. 혈청 ROBO2-Fc 2.2 농도는 ADA-음성 동물과 비교 시 ADA-양성 동물에서 유사하였다. 그러나, 샘플에 존재하는 ROBO2-Fc 2.2의 순환 수준은 ADA의 검출을 방해했을 수 있다는 것에 유의해야 한다.
시노몰구스 원숭이 독성동태학
TK 및 ADA 평가는 20, 100 또는 300 mg/kg/투약을 IV 투여한 후 및 300 mg/kg/투약을 SC 투여한 후에 시행되었으며, 이는 6-주 회복기를 동반한 3-개월 GLP 중추적 독성 연구의 파트로서 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이 (n=3 또는 5/성별/투약군)에게 매주 1회 제공되었다.
제1일에 투약하기 전에 수집 및 분석된 샘플, 또는 비히클 대조군으로부터 수집 및 분석된 샘플에서는 정량화가능한 농도의 ROBO2-Fc 2.2가 없었다. ROBO2-Fc 2.2의 정량화가능한 농도는 ROBO2-Fc 2.2-투약군에서 제78일 (마지막 샘플이 수집됨)까지 및 회복기의 마지막 날 (제127일 또는 제128일)까지 관찰되었다.
임의의 투약군에서 전신 노출에 있어서의 성별 관련된 명백한 차이는 없었다 (Cmax 및 AUC168에 의해 평가된 바와 같음). 평균 전신 노출은 제1일부터 제78일까지 대략 용량-비례 방식으로 용량을 증가시킴에 따라 증가하였다. ROBO2-Fc 2.2 전신 생체 이용률은 (300 mg/kg IV 및 SC 용량) 제1일 및 제78일에 SC 투약한 후 각각 53.7% 및 77.0%였다. IV 군에 대한 누적 비율 (AUC, 제78일/제1일)은 <2.0이었고, SC 군에 대한 비율은 2.1이었다 (표 21).
20, 100 및 300 mg/kg IV 군에서 ROBO2-Fc 2.2에 대한 ADA 유도의 발생률은 각각 0% (6마리 동물 중 0마리), 0% (6마리 동물 중 0마리) 및 20% (10마리 동물 중 2마리)였고, 300 mg/kg SC 군에서는 33% (6마리 동물 중 2마리)였다. 혈청 ROBO2-Fc 2.2 농도는 ADA-음성 동물과 비교 시 ADA-양성 동물에서 유사하였다. 그러나, 샘플에 존재하는 ROBO2-Fc 2.2의 순환 수준은 ADA의 검출을 방해했을 수 있다는 것에 유의해야 한다.
II. 분포
래트 (0.19 L/kg) 및 원숭이 (0.09 L/kg)에서의 ROBO2-Fc 2.2의 Vss는 단일 IV 투약 후에 낮았으며, 이는 Fc 함유 단백질에 대한 세포외 유체 내로의 제한된 분포와 일치한다.
III. 약동학-약력학 및 인간 PK 예측
PK/PD 모델링 (예측된 인간 PK, 측정된 ROBO2 및 SLIT2 혈청 및 신장 농도 데이터 포함)에 근거하여 추정되는 매주 인간 SC 용량 2 mg/kg (150 mg)은 신장에서 Cmin 표적 적용 범위 >90%를 유지하는 것으로 예측된다. 약 11 μg/ml 혈청의 예측된 인간 유효 농도 (Ceff)는 신장에서 표적 적용 범위 >90%를 제공한다. 매주 인간 SC 용량 2 mg/kg (150 mg)과 연관된 예측된 인간 항정 상태 Cmax 및 AUCtau는 각각 18.2 μg/mL 및 2610 μg·h/mL이다.
ROBO2-Fc 2.2에 대한 인간 PK의 예측은 알로메트릭 지수에 근거하여 시노몰구스 원숭이 정맥내 PK 데이터를 스케일링함으로써 이루어졌다. 인간에서, ROBO2-Fc 2.2는 대략 14일의 말단 반감기를 제공하는 0.5 mL/h/kg의 클리어런스 및 90 mL/kg의 항정 상태 분포 용적을 나타내는 것으로 예측된다. 인간 SC 생체 이용률은 60%일 것으로 예측된다.
초기 임상 연구에서, 노출 한계는 각각 예상되는 인간 유효 용량 (매주 1회 150 mg SC)에서, 예상 인간 유효 노출의 161x 및 29x의 노출 안전역과 연관된 것으로서 결정된 2930 μg/mL의 Cmax 및 74500 μg·h/mL의 AUC로 설정될 것이다. 이러한 노출 한계는 래트에서 3-개월 GLP 독성 연구로부터 확인된, 유해 효과 수준이 관찰되지 않는 것 (NOAEL)에 근거한다.
혈청 시토카인 수준에 대한 ROBO2-Fc 2.2-관련 효과는 10 mg/kg/투약 SC 또는 50 또는 200 mg/kg/투약 IV로 각각 ROBO2-Fc 2.2를 매주 1회 투여한 후 래트 또는 시노몰구스 원숭이 ETS에서 3-개월 GLP 독성 연구에서 언급되지 않았지만, 시험관 내에서 인간 공여자 8명 중 1명 및 12마리 원숭이 중 1마리에서 TNF-α 및/또는 IL-6의 증가가 관찰되었다. 시험관내 발견의 번역가능성은 널리 이해되지 않지만, 측정 기준, 예컨대 투약의 일시정지/종료를 허용하는 본 연구의 단일 상승 용량 단계에서 IV 주입을 통한 ROBO2-Fc 2.2의 느린 투여 (제2 시간에 따른 나머지 용량을 투여하기 전에 제1 시간에 주어진 총 용량의 작은 비율을 수반함), 활력 징후의 면밀한 모니터링, 임상 증상 및 시토카인 수준의 평가가 구현될 것이다.
Figure pct00010
실시예 10: 독성학
ROBO2-Fc 2.2를 지속기간 3개월 (13주)까지의 탐색적 (비-우수 실험실 관리 기준 [GLP]-준수) 및 중추적 (GLP-준수) 독성 연구에서 IV 및 SC 주사에 의해 래트 및 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 투약 3개월 후, 유해 효과 수준이 관찰되지 않는 것 (NOAEL)은 하기와 같다:
(i) 래트에서 125 mg/kg/투약 IV (2930 μg/mL의 Cmax 및 74,500 μg·h/mL의 AUC72) 및 425 mg/kg/투약 SC (842 μg/mL의 Cmax 및 50,500 μg·h/mL의 AUC72), 및
(ii) 원숭이에서 300 mg/kg/투약 IV (9210 μg/mL의 Cmax 및 427,000 μg·h/mL의 AUC168) 및 SC (2340 μg/mL의 Cmax 및 328,000 μg·h/mL의 AUC168).
I. 반복-투약 독성
래트 및 시노몰구스 원숭이에서 ROBO2-Fc 2.2를 이용하여 탐색적 및 중추적 반복-투약 독성 연구를 시행하였다.
A. 래트 연구
(i) 탐색적 독성 연구 (ETS)
수컷 래트의 탐색적 독성 연구 (ETS)에서는, ROBO2-Fc 2.2를 200 mg/kg/투약 IV 또는 10, 50 또는 200 mg/kg/투약 SC 하에 14일 동안 3일마다 1회 (총 5회 용량) 투여하였고, 모든 용량에서 내약성이었다. ROBO2-Fc 2.2-관련 임상 징후는 없었으며 체중 또는 음식 소비 파라미터에 있어서도 변화가 없었다.
ROBO2-Fc 2.2-관련 효과는 ≥10 mg/kg/투약 SC에서 SC 주사 부위의 최소 내지 중간 정도의 SC 혈관주위 염증; 현미경적 상관 관계와 연관이 없는 ≥10 mg/kg/투약 SC 및 IV에서 더 높은 절대 흉선 중량 (1.21x-1.44x 대조군) 및 상대 흉선 중량 (기관 대 체중의 경우에는 1.17x-1.39x 대조군이고, 기관 대 뇌 중량의 경우에는 1.22x-1.46x 대조군임); 200 mg/kg/투약 SC 및 IV에서 더 높은 소변 크레아티닌 (1.70x 및 1.83x 대조군) 및 더 낮은 소변 용적 (각각 0.52x 및 0.55x 대조군); 200 SC 및 200 IV mg/kg/투약에서 더 높은 평균 소변 비중 (1.011x-1.012x 대조군); 및 200 mg/kg/투약 IV에서 더 높은 평균 혈청 콜레스테롤 (1.38x 대조군)을 포함하였다. 임상 화학 및 기관 중량 소견은 임의의 현미경적 소견과 연관되지 않았다.
(ii) 반복-투약 독성 연구
중추적, 반복-투약 래트 독성 연구에서, ROBO2-Fc 2.2를 25, 125, 또는 425 mg/kg/투약 IV 또는 425 mg/kg/투약 SC로 3개월 동안 3일마다 1회 (총 31회 용량) 래트에게 투여한 다음, 6-주 회복기를 거쳤다 (대조군 및 425 mg/kg/투약 IV). ROBO2-Fc 2.2의 신경 기능 효과를 또한 평가하였다. ROBO2-Fc 2.2-관련 임상 징후는 투약 단계 동안 425 mg/kg/투약 SC 하에 4마리/10마리 수컷 래트에서 언급된 피부 병변 (등, 흉부, 두개골 또는 주사 부위)을 포함하였다. 이들 변화는 대조군 (2마리/15마리 수컷)과 비교 시 발병률이 단지 약간 더 높았기 때문에 유해한 것으로 간주되지 않았으며, 투약 단계에서 단지 산발적으로만 변화가 나타났으며, 최대 425 mg/kg/투약의 IV 용량으로 ROBO2-Fc 2.2가 투여된 동물에서는 변화가 존재하지 않았다. ROBO2-Fc 2.2와 관련된 체중, 음식 소비, 안과, 신경 기능 또는 거시적 소견은 없었다.
수컷에서, 신장 소견은 ≥125 mg/kg/투약 IV에서 최소 사구체병증으로 이루어졌다. 암컷에서, 최소 사구체병증이 또한, 단지 425 mg/kg/투약 IV에서만 관찰되었으며, 최소 내지 경증의 관상 호염기구증가증 및 유리질 관상 원주 뿐만 아니라 더 높은 소변 단백질 (100 mg/dL)이 동반되었다. 암컷에서 사구체병증, 관상 호염기구증가증 및 유리질 관상 원주의 형태학적 소견은 유해한 것이었는데, 이는 유해하지 않은 더 높은 소변 단백질과 함께 조합되면 신장 기능 장애가 나타났기 때문이다. 수컷에서는, 사구체병증이 유해하지 않았는데, 이는 그러한 소견이 분포에 있어서 훨씬 덜 광범위하고, 관상 호염기구증가증 및 유리질 원주의 부재 하에서 발생하였으며, 더 높은 소변 단백질과도 연관되지 않았기 때문이다. 사구체병증은 광 현미경에 의해 관찰된 신장 피질에서의 사구체에서의 과립상 호산구 물질의 응집 및 투과 전자 현미경에 의해 관찰된 사구체 모세관 루프를 둘러싼 족세포 족양 돌기 융합으로 특징지을 수 있었다. 회복기 말기에, 사구체병증은 수컷에서 완전히 회복되었고, 암컷에서는 부분적으로 회복되었으며 유해하지 않았다. 또한 암컷에서는 관상 호염기구증가증, 유리질 관상 원주, 및 소변 단백질의 완전한 회복이 있었다. 더 높은 혈청 총 단백질 (1.09x-1.18x) 및 혈청 알부민 (1.10x-1.20x)이 수컷 군에서 425 mg/kg/투약 IV 하에 관찰되었고, 암컷 군에서는 ≥25 mg/kg/투약 IV 및 425 mg/kg/투약 SC 하에 관찰되었다. 이는 더 높은 소변 단백질에도 불구하고 425 mg/kg/투약 IV 하에 암컷 군에서 관찰되었다.
부가의 ROBO2-Fc 2.2-관련 현미경적 소견은 425 mg/kg/투약 SC를 투여한 동물에서 발생했으며, 대조군 (최소 내지 경증)과 비교 시 주사 부위의 출혈 및 염증의 발생률 및/또는 중증도 증가 (중간 정도), 및 유출 림프절에서 최소 림프 증식증의 발생률 증가로 이루어졌다. SC 주사 부위에서의 증가된 출혈 및 염증은 유해하지 않았는데, 이는 공동으로 작용하는 대조군보다 단지 약간만 더 심각하고 주사 절차의 결과로서 예상되는 것 이상으로 상당한 조직 손상과 연관이 없었기 때문이다. 유출 림프절에서 최소 림프 증식증의 발생률 증가는 유해하지 않았는데, 이는 대조군과 형태학적으로 유사하고 ROBO2-Fc 2.2 및/또는 투약 절차에 대해 약간의 면역 반응을 나타낸 것으로 예상되었기 때문이다. 일단 주사제가 더 이상 투여되지 않으면 이러한 소견들은 회복될 것으로 예상된다.
투약 단계의 결론에서 언급된 ROBO2-Fc 2.2-관련 더 높은 간 중량은 유해하지 않았으며, ≥125 mg/kg/투약 IV 및 425 mg/kg/투약 SC 하의 암컷 군에서 더 높은 평균 절대 및 상대 체중 및 뇌 중량 (대조군과 비교 시 1.11x 내지 1.17x)으로 이루어졌다. 이러한 더 높은 간 중량은 거시적 및 현미경적 소견과의 상관 관계가 없고 조직 손상을 표시하는 간 효소에서의 변경이 없기 때문에 유해하지 않았다. 더 높은 간 중량의 완전한 회복이 있었다.
부가의 임상 병리학 응고 및 임상 화학 파라미터 변화는 유해하지 않았으며, ≥125 mg/kg/투약 IV 하의 수컷 및 암컷 군에서 더 높은 피브리노겐 (1.21x-1.48x), ≥125 mg/kg/투약 IV 하의 수컷 군에서, 및 ≥25 mg/kg/투약 IV 및 425 mg/kg/투약 SC 하의 암컷 군에서 더 높은 콜레스테롤 (1.37x-2.52x) 및 트리글리세리드 (1.58x-3.11x), 및 425 mg/kg/투약 IV 하의 암컷 군에서 더 높은 글로불린 (1.16x) 및 더 높은 칼슘 (1.09x)으로 이루어졌다. 수컷 및 암컷 군에서 피브리노겐, 콜레스테롤, 트리글리세리드, 총 단백질, 혈청 알부민 및 글로불린의 완전한 회복이 있었지만, 425 mg/kg/투약 IV 하의 암컷 군에서는 칼슘의 단지 부분적 회복 (회복에 있어서 1.04x 대조군)만 있었다. 이러한 임상 병리학 변화는 ROBO2-Fc 2.2 투여군과 대조군 사이의 작은 규모의 차이, 및 거시적 및 현미경적 소견의 상관 관계의 부재에 근거하여 유해하지 않았다.
ROBO2-Fc 2.2 투여 3개월 후 래트에서의 독성동태학에 관한 요약은 표 22에서 찾을 수 있다. 3개월 동안 3일마다 1회 (총 31회 용량) ROBO2-Fc 2.2를 래트에게 25, 125, 또는 425 mg/kg/투약으로 IV 투여하거나, 또는 425 mg/kg/투약으로 SC 투여한 후, 125 mg/kg/투약 IV 및 425 mg/kg/투약 SC가 NOAEL로서 확인되었다.
B. 원숭이 연구
(i) 탐색적 독성 연구 (ETS)
수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이의 ETS에서, ROBO2-Fc 2.2를 50 또는 200 mg/kg/투약 IV 또는 10 mg/kg/투약 SC 하에 29일 동안 매주 1회 (총 5회 용량) 투여하였다. 심혈관 효과는 50 mg/kg/투약 IV 군에서 원격측정-이식된 동물에서 평가되었다. 선택된 동물을 마지막 투약 다음 날인 제30일에 괴사시켰다. 50 mg/kg/투약 IV 군으로부터의 2마리의 원숭이를 내약성 및 독성동태학의 평가를 위해 제71일까지 유지시켰다. ROBO2-Fc 2.2의 투여는 모든 용량에서 내약성이었다. 생존, 임상 징후, 체중, 음식 소비, 심혈관 측정, 생체내 시토카인 평가, 혈액학 및 응고 파라미터, 및 거시적 및 현미경적 소견에 대한 ROBO2-Fc 2.2-관련 효과는 없었다. ROBO2-Fc 2.2-관련 효과는 50 mg/kg/투약 IV 하의 암컷 (1.26x-1.51x 기준선)에서 및 200 mg/kg/투약 IV 수컷 및 암컷 동물 (각각 1.59x 및 1.55x 기준선) 둘 다에서 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제에 있어서의 약간의 증가, 및 50 mg/kg/투약 IV (1.29x-2.05x 기준선) 및 200 mg/kg/투약 IV (1.29x 기준선) 하의 동일한 암컷에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제에 있어서의 약간의 증가를 포함하였다. 이러한 효소 증가는 이들 동물의 사이에서 ROBO2-Fc 2.2-관련 현미경적 변화와 연관이 없었다.
(ii) 반복-투약 독성 연구
중추적 반복-투약 시노몰구스 원숭이 독성 연구에서, ROBO2-Fc 2.2를 20, 100, 또는 300 mg/kg/투약 IV 또는 300 mg/kg/투약 SC로 3개월 동안 매주 1회 (총 13회 용량) 투여하였으며, 이어서 6-주 회복기를 거쳤다 (대조군 및 300 mg/kg/투약 IV). 이러한 연구에서 평가된 임의의 종말점에서 유해한 ROBO2-Fc 2.2-관련 소견은 없었다. ROBO2-Fc 2.2-관련 임상 징후, 체중, 음식 소비, 심전도/심박수, 혈액학, 응고, 소변 검사, 안과, 기관 중량 또는 거시적 소견은 없었다. ROBO2-Fc 2.2-관련 임상 화학 변경은 300 mg/kg/투약 IV 또는 SC 하에서 증가된 콜레스테롤 (1.25x-1.61x 기준선), ≥20 mg/kg/투약 IV 또는 300 mg/kg/투약 SC 하에서 증가된 트리글리세리드 (1.58x-4.59x 기준선), 및 ≥100 mg/kg/투약 IV 또는 300 mg/kg/투약 SC 하에서 감소된 글로불린 (0.83x-0.87x 기준선)을 포함하였다. 모든 임상 화학 변경은 작은 규모의 변화 및 연관된 조직 변화의 부재로 인해 유해하지 않았다. 회복기 후 300 mg/kg/투약 IV 수컷에서 지속되는 증가된 트리글리세리드 (2.78x-6.79x 기준선)를 제외하고는 임상 화학 변경이 완전히 회복되었고; 회복기의 제128일/제127일까지는 정량화가능한 농도의 ROBO2-Fc 2.2가 존재하였다.
300 mg/kg/투약 SC로 투여된 동물의 유출 (왼쪽 겨드랑이) 및 겨드랑이 (오른쪽 겨드랑이) 림프절에서 림프 여포의 증가된 세포성이 관찰되었다. 이러한 소견은 현저한 배아 중심 형성을 갖는 림프 여포의 크기 및 수를 최소 내지 약한 정도로 증가시키는 것을 특징으로 하며, 항원 자극에 대항한 반응과 일치하였다. 이러한 소견은 그의 최소 내지 약한 중증도로 인해 유해하지 않았다. 일단 주사제가 더 이상 투여되지 않으면, 이러한 소견은 회복될 것으로 예상된다. 대조적으로, ROBO2-Fc 2.2를 최대 300 mg/kg/투약의 용량으로 IV 투여한 동물에서는 ROBO2-Fc 2.2-관련 현미경적 소견이 없었다.
ROBO2-Fc 2.2의 투여 3개월 후 시노몰구스 원숭이에서의 독성동태학에 관한 요약은 표 22에서 찾을 수 있다. ROBO2-Fc 2.2를 20, 100, 또는 300 mg/kg/투약 IV, 또는 300 mg/kg/투약 SC로 3개월 동안 매주 1회 (총 13회 용량) 원숭이에게 투여한 후, 300 mg/kg/투약 IV 및 300 mg/kg/투약 SC가 NOAEL로서 확인되었다.
II. 국부 내약성
IV 및 SC 주사 부위는 탐색적 및 중추적 래트 및 시노몰구스 원숭이 반복-투약 독성 연구에서 현미경으로 평가되었다. 래트의 IV 주사 부위에서 ROBO2-Fc 2.2-관련 소견은 없었다. ROBO2-Fc 2.2-관련 소견은 단지 래트의 SC 주사 부위에서만 주목되었다. 래트 ETS에서, ≥10 mg/kg/투약 SC 하에서 최소 내지 중간 정도의 피하 혈관주위 염증은 주사의 물리적 외상에 기인하였고, 유해하지 않은 것으로 간주되었다. 중추적 래트 연구에서, 증가된 중증도 (중간 수준)의 출혈은 유해하지 않은 것으로 간주되었는데, 이는 공동으로 작용하는 대조군보다 단지 약간만 더 심각하고 주사 절차의 결과로서 예상되는 것 이상으로 상당한 조직 손상과 연관이 없었기 때문이다. 또한 중추적 래트 연구에서, 투약 단계 동안 425 mg/kg/투약 SC 하에서는 ROBO2-Fc 2.2-관련 피부 병변 (등, 흉부, 두개골 또는 주사 부위)이 수컷에서 관찰되었다. 이러한 변화는 유해한 것으로 간주되지 않았는데, 이는 대조군과 비교 시 발생률이 단지 약간만 더 높았고, 투약 단계에서 산발적으로 언급되었기 때문이다.
시노몰구스 원숭이의 IV 주사 부위에서 ROBO2-Fc 2.2-관련 소견은 없었다. 대조군을 포함한 대부분의 동물에서 IV 주사 부위에 존재하는 다양한 중증도의 출혈 및/또는 호중구 염증은 최대 200 mg/kg/투약의 IV 용량 하의 ETS에서 ROBO2-Fc 2.2와 관련된 것으로 간주되지 않았으며, 최대 300 mg/kg/투약의 IV 용량 하의 중추적 시노몰구스 원숭이 연구에서 ROBO2-Fc 2.2-관련 IV 주사 부위 소견은 없었다. 원숭이의 SC 주사 부위에서는 ROBO2-Fc 2.2-관련 소견이 없었다.
III. 시토카인 방출 검정
인간 전혈 샘플을 사용하는 시험관내 시토카인 방출 검정 (CRA)에서, ROBO2-Fc 2.2는 시험된 8명의 인간 공여자 중 1명으로부터의 전혈 샘플에서 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 및 인터루킨-6 (IL-6) 생산을 유도하였다. ROBO2-Fc 2.2와 함께 인큐베이션된 인간 전혈 샘플에서는 ROBO2-Fc 2.2-관련 인터페론-감마 (IFN-γ) 방출이 관찰되지 않았다.
투약 개시 전에 수집된 시노몰구스 원숭이 전혈 샘플을 사용하는 시험관내 CRA에서, ROBO2-Fc 2.2는 시험된 12마리의 시노몰구스 원숭이 중 1마리로부터의 전혈 샘플에서 IL-6 생산을 유도하였으며, ROBO2-Fc 2.2-관련 TNF-α 또는 IFN-γ 방출은 관찰되지 않았다.
부가적으로, 시토카인 농도에 있어서의 변화를 규명하기 위해, ROBO2-Fc 2.2를 10 mg/kg/투약 SC 또는 50 또는 200 mg/kg/투약 IV로 매주 1회 투여한 후 ETS에서 시노몰구스 원숭이로부터 혈액 샘플을 수집하였다. TNF-α, IL-6 또는 IFN-γ의 혈청 농도에 있어서 ROBO2-Fc 2.2-관련 변화는 없었다.
IV. C1q 및 FcγR 결합 검정
ROBO2-Fc 2.2는 시험관 내에서, 보체-의존성 세포 독성 (CDC)을 이끌어낼 수 있는 그의 잠재력을 시험하기 위해 보체 단백질 1q (C1q) 결합 ELISA에서, 및 항체-의존성 세포 매개된 세포 독성 (ADCC) 활성에 대한 그의 잠재력을 시험하기 위한 단편 결정화가능한 감마 수용체 (FcγR) 결합 검정에서 평가되었다. ROBO2-Fc 2.2는 시험된 농도 이하에서 C1q에 결합하지 않았으므로, CDC를 유도할 가능성이 낮은 것으로 간주된다. 시험된 모든 FcγR에의 ROBO2-Fc 2.2 결합은 검정 대조군 항체를 이용한 경우에 관찰되는 결합과 비교 시 유사하거나 더 낮았고, 양성 대조군 항체로부터의 데이터와 비교 시 더 낮았다. 이러한 데이터는 ROBO2-Fc 2.2가 ADCC 활성을 이끌어낼 가능성이 낮다는 것을 암시한다.
V. 약동학에 대한 소견의 관계
ROBO2-Fc 2.2 노출 (Cmax 및 AUC에 의해 평가된 바와 같음)은 시험된 용량 범위에 걸쳐 래트 및 시노몰구스 원숭이에게 반복 IV 및 SC 투약한 후 대략적인 용량-비례 방식으로 용량을 증가시킴에 따라 증가되었다. 관찰된 노출에 있어서 명백한 성별 관련 차이는 없었다. 주요 반응 및 이러한 주요 반응에 대항하여 계산된 노출 안전역과 연관된 ROBO2-Fc 2.2의 한계치 농도는 표 22에서 찾을 수 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
요약하면, 이들 데이터는 ROBO2-Fc 2.2가 다양한 질환, 장애 및 병태에 대한 잠재적인 인간 치료제라는 것을 시사한다.
따라서, 본 발명은 전술한 대표적인 실시양태를 참조하여 광범위하게 개시되고 예시되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고서도 본 발명에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 모든 간행물, 특허 출원 및 허여된 특허는 각각의 개별 간행물, 특허 출원 또는 허여된 특허가 그의 전문이 참조로 포함되었다는 것을 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 텍스트에 함유된 정의는 본 개시내용의 정의와 모순되는 정도까지 배제된다.
명확하게 하기 위해, 별도의 실시양태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 특정의 특색은 또한, 단일 실시양태에서 조합하여 제공될 수 있는 것으로 인지된다. 반대로, 간결하게 하기 위해, 단일 실시양태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 다양한 특색은 별도로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태와 관련하여 논의된 임의의 제한이 본 발명의 임의의 다른 실시양태에 적용될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 더욱이, 본 발명의 임의의 조성물이 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 방법이 본 발명의 임의의 조성물을 생산 또는 활용하는데 사용될 수 있다. 특히, 청구범위에 기재된 본 발명의 임의의 측면은 단독으로 또는 하나 이상의 부가의 청구범위 및/또는 설명의 측면과 조합하여, 청구범위 및/또는 설명 및/또는 서열 목록 및/또는 도면의 다른 곳에 제시된 본 발명의 다른 측면과 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 발견된 구체적 예가 본 발명의 범주 내에 속하지 않는 한, 상기 구체적 예는 명시적으로 거부될 수 있다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 단지 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 표시되지 않거나 또는 대안이 상호 배타적일 수 없다면, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 본 개시내용은 단지 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하고 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는 한 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 연계해서 사용될 때, 본원의 청구범위(들)에 사용된 바와 같은 단수 형태는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 연계해서 사용된 과학 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형는 복수를 포함하고 복수형은 단수를 포함해야 한다. 본 발명과 관련하여 본원에 사용될 때 단어 "포함한다/포함하는" 및 "갖는/포함한"은 언급된 특색, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 명시하기 위해 사용되지만, 하나 이상의 다른 특색, 정수, 단계, 구성요소 또는 그의 군의 존재 또는 부가를 배제하지는 않는다.
개시된 교시가 다양한 적용, 방법 및 조성물을 참조로 하여 기재되긴 하였지만, 다양한 변화 및 변형이 본원의 교시 및 하기 청구된 발명으로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 본 실시예는 개시된 교시를 보다 잘 예시하기 위해 제공된 것이고, 본원에 제시된 교시의 범주를 제한하는 것은 아니다. 본 교시가 이들 예시적인 실시양태의 관점에서 기재되긴 하였지만, 이들 예시적인 실시양태의 수많은 변동 및 변형이 과도한 실험없이도 가능하다. 이러한 모든 변동 및 변형은 현 교시의 범주 내에 있다.
본 발명의 측면 또는 실시양태를 대체물의 마쿠쉬 군 또는 다른 집단과 관련해서 기재하는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 군 뿐만 아니라 이러한 군의 각각의 구성원 개별적으로 및 주요 군의 가능한 모든 하위 군 (또한, 상기 군 구성원 중 하나 이상이 존재하지 않는 주요 군)을 포괄한다. 본 발명은 또한, 청구된 본 발명의 군 구성원 중 임의의 것의 하나 이상을 명시적으로 배제하는 것을 구상한다.
특허, 특허 출원, 서류, 텍스트 북 등을 포함한, 본원에 인용된 모든 참고문헌, 및 이미 그렇지 않은 정도까지 그에 인용된 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 포함된 문헌 및 유사한 물질 중 하나 이상 (정의된 용어, 용어 활용, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음)이 본 출원과 상이하거나 상반되는 경우에는, 본 출원이 우선한다.
전술된 설명 및 실시예는 본 발명의 특정의 구체적 실시양태를 상세히 열거한 것이고, 본 발명자들에 의해 고려된 최상의 방식을 기재한 것이다. 그러나, 전술된 내용을 아무리 텍스트에 상세히 나타낼 수 있다 하더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것을 인지해야 것이다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. BOSTON MEDICAL CENTER CORPORATION <120> RECOMBINANT ROBO2 PROTEINS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES THEREOF <130> PCFC-0043-WO1 <140> <141> <150> 62/663,082 <151> 2018-04-26 <150> 62/514,242 <151> 2017-06-02 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ser Arg Leu Arg Gln Glu Asp Phe Pro Pro Arg Ile Val Glu His Pro 1 5 10 15 Ser Asp Val Ile Val Ser Lys Gly Glu Pro Thr Thr Leu Asn Cys Lys 20 25 30 Ala Glu Gly Arg Pro Thr Pro Thr Ile Glu Trp Tyr Lys Asp Gly Glu 35 40 45 Arg Val Glu Thr Asp Lys Asp Asp Pro Arg Ser His Arg Met Leu Leu 50 55 60 Pro Ser Gly Ser Leu Phe Phe Leu Arg Ile Val His Gly Arg Arg Ser 65 70 75 80 Lys Pro Asp Glu Gly Ser Tyr Val Cys Val Ala Arg Asn Tyr Leu Gly 85 90 95 Glu Ala Val Ser Arg Asn Ala Ser Leu Glu Val Ala Leu Leu Arg Asp 100 105 110 Asp Phe Arg Gln Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Ala Gly Glu Pro 115 120 125 Ala Ile 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Ser Ile Arg Gly Gly Lys Leu Met Ile Ser Asn Thr Arg Lys Ser Asp 165 170 175 Ala Gly Met Tyr Thr Cys Val Gly Thr Asn Met Val Gly Glu Arg Asp 180 185 190 Ser Asp Pro Ala Glu Leu Thr Val Phe Glu Arg Gly Gly Ser Gly Gly 195 200 205 Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 305 310 315 320 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 325 330 335 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 340 345 350 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 20 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Pro Arg Ile Val Glu His Pro Thr Asp Val Ile Val Ser Lys Gly Glu 1 5 10 15 Pro Thr Thr Leu Asn Cys Lys Ala Glu Gly Arg Pro Thr Pro Thr Ile 20 25 30 Glu Trp Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Val Glu Thr Asp Lys Asp Asp Pro 35 40 45 Arg Ser His Arg Met Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu Phe Phe Leu Tyr 50 55 60 Ile Val His Gly Arg Arg Ser Lys Pro Asp Glu Gly Ser Tyr Val Cys 65 70 75 80 Val Ala Arg Asn Tyr Leu Gly Glu Ala Val Ser Arg Asn Ala Ser Leu 85 90 95 Glu <210> 21 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 21 tcgcgtcttc gccaggagga ctttcccccg cggattgtgg agcatccttc cgatgtcatc 60 gtctctaagg gcgagcccac gactctgaac tgcaaggcgg agggccggcc aacgcccacc 120 attgagtggt acaaagatgg ggagcgagtg gagactgaca aggacgatcc ccggtcccac 180 aggatgcttc tgcccagcgg atccttattc ttcttgcgca tcgtgcacgg gcgcaggagt 240 aaacctgatg aaggaagcta cgtttgtgtt gcgaggaact atcttggtga agcagtgagt 300 cgaaatgcgt ctctggaagt ggcattgtta cgagatgact tccgacaaaa ccccacagat 360 gttgtagtgg cagctggaga gcctgcaatc ctggagtgcc agcctccccg gggacaccca 420 gaacccacca tctactggaa aaaagacaaa gttcgaattg atgacaagga agaaagaata 480 agtatccgtg gtggaaaact gatgatctcc aataccagga aaagtgatgc agggatgtat 540 acttgtgttg gtaccaatat ggtgggagaa agggacagtg acccagcaga gctgactgtc 600 tttgaacgag gcggcagcgg cggcagcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtcccccgga 1320 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> /note="This sequence may encompass 1-6 'Gly Gly Ser' repeating units" <400> 22 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 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320 Arg Asp Gln Ile Val Ala Gln Gly Arg Thr Val Thr Phe Pro Cys Glu 325 330 335 Thr Lys Gly Asn Pro Gln Pro Ala Val Phe Trp Gln Lys Glu Gly Ser 340 345 350 Gln Asn Leu Leu Phe Pro Asn Gln Pro Gln Gln Pro Asn Ser Arg Cys 355 360 365 Ser Val Ser Pro Thr Gly Asp Leu Thr Ile Thr Asn Ile Gln Arg Ser 370 375 380 Asp Ala Gly Tyr Tyr Ile Cys Gln Ala Leu Thr Val Ala Gly Ser Ile 385 390 395 400 Leu Ala Lys Ala Gln Leu Glu Val Thr Asp Val Leu Thr Asp Arg Pro 405 410 415 Pro Pro Ile Ile Leu Gln Gly Pro Ala Asn Gln Thr Leu Ala Val Asp 420 425 430 Gly Thr Ala Leu Leu Lys Cys Lys Ala Thr Gly Asp Pro Leu Pro Val 435 440 445 Ile Ser Trp Leu Lys Glu Gly Phe Thr Phe Pro Gly Arg Asp Pro Arg 450 455 460 Ala Thr Ile Gln Glu Gln Gly Thr Leu Gln Ile Lys Asn Leu Arg Ile 465 470 475 480 Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Val Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu 485 490 495 Thr Ser Trp Ser Ala Val Leu Asp Val Thr Glu Ser Gly Ala Thr Ile 500 505 510 Ser Lys Asn Tyr Asp Leu Ser Asp Leu Pro Gly Pro Pro Ser Lys Pro 515 520 525 Gln Val Thr Asp Val Thr Lys Asn Ser Val Thr Leu Ser Trp Gln Pro 530 535 540 Gly Thr Pro Gly Thr Leu Pro Ala Ser Ala Tyr Ile Ile Glu Ala Phe 545 550 555 560 Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser Trp Gln Thr Val Ala Asn His Val Lys 565 570 575 Thr Thr Leu Tyr Thr Val Arg Gly Leu Arg Pro Asn Thr Ile Tyr Leu 580 585 590 Phe Met Val Arg Ala Ile Asn Pro Gln Gly Leu Ser Asp Pro Ser Pro 595 600 605 Met Ser Asp Pro Val Arg Thr Gln Asp Ile Ser Pro Pro Ala Gln Gly 610 615 620 Val Asp His Arg Gln Val Gln Lys Glu Leu Gly Asp Val Leu Val Arg 625 630 635 640 Leu His Asn Pro Val Val Leu Thr Pro Thr Thr Val Gln Val Thr Trp 645 650 655 Thr Val Asp Arg Gln Pro Gln Phe Ile Gln Gly Tyr Arg Val Met Tyr 660 665 670 Arg Gln Thr Ser Gly Leu Gln Ala Thr Ser Ser Trp Gln Asn Leu Asp 675 680 685 Ala Lys Val Pro Thr Glu Arg Ser Ala Val Leu Val Asn Leu Lys Lys 690 695 700 Gly Val Thr Tyr Glu Ile Lys Val Arg Pro Tyr Phe Asn Glu Phe Gln 705 710 715 720 Gly Met Asp Ser Glu Ser Lys Thr Val Arg Thr Thr Glu Glu Ala Pro 725 730 735 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Ser Thr Ala Thr Leu Thr Pro Ser Pro Arg 1145 1150 1155 Glu Glu Met Gln Pro Met Leu Gln Ala His Leu Asp Glu Leu Thr 1160 1165 1170 Arg Ala Tyr Gln Phe Asp Ile Ala Lys Gln Thr Trp His Ile Gln 1175 1180 1185 Ser Asn Asn Gln Pro Pro Gln Pro Pro Val Pro Pro Leu Gly Tyr 1190 1195 1200 Val Ser Gly Ala Leu Ile Ser Asp Leu Glu Thr Asp Val Ala Asp 1205 1210 1215 Asp Asp Ala Asp Asp Glu Glu Glu Ala Leu Glu Ile Pro Arg Pro 1220 1225 1230 Leu Arg Ala Leu Asp Gln Thr Pro Gly Ser Ser Met Asp Asn Leu 1235 1240 1245 Asp Ser Ser Val Thr Gly Lys Ala Phe Thr Ser Ser Gln Arg Pro 1250 1255 1260 Arg Pro Thr Ser Pro Phe Ser Thr Asp Ser Asn Thr Ser Ala Ala 1265 1270 1275 Leu Ser Gln Ser Gln Arg Pro Arg Pro Thr Lys Lys His Lys Gly 1280 1285 1290 Gly Arg Met Asp Gln Gln Pro Ala Leu Pro His Arg Arg Glu Gly 1295 1300 1305 Met Thr Asp Glu Glu Ala Leu Val Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Phe 1310 1315 1320 Pro Ser Pro Gly Gly His Ser Ser Ser Gly Thr Ala Ser Ser Lys 1325 1330 1335 Gly Ser Thr Gly Pro Arg Lys Thr Glu Val Leu 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Claims (33)

  1. (i) ROBO2 세포외 도메인의 부분, 및 (ii) 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 재조합 라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2) 단백질로서, 여기서 상기 ROBO2 세포외 도메인의 부분은 ROBO2 프리-이뮤노글로불린-유사 1 (Ig1) 서열, 제1 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig1), 제1 이뮤노글로불린-유사 도메인과 제2 이뮤노글로불린-유사 도메인 사이의 도메인간 링커 (Ig1-Ig2 도메인간 링커), 제2 이뮤노글로불린-유사 도메인 (Ig2), 및 제2 이뮤노글로불린-유사 도메인과 제3 이뮤노글로불린-유사 도메인 사이의 도메인간 링커 (Ig2-Ig3 도메인간 링커)로 본질적으로 이루어지는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ROBO2 세포외 도메인의 부분이 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 1 내지 203으로 본질적으로 이루어지는 것인 재조합 ROBO2.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 도메인이 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 도메인인 재조합 ROBO2 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 인간 IgG1의 Fc 도메인인 재조합 ROBO2 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인간 IgG1 Fc 도메인이 L234A, L235A, 및 G237A 치환 (Eu 넘버링)을 포함하고, K447 (Eu 넘버링)은 포함하지 않는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 210 내지 440을 포함하는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 상기 아미노산 잔기 1 내지 203이 상기 이뮤노글로불린 도메인과 인접해 있는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 상기 아미노산 잔기 1 내지 203이 링커를 통해 상기 이뮤노글로불린 도메인에 연결되는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커가 약 1 내지 30개 아미노산 잔기를 포함하는 펩티딜 링커인 재조합 ROBO2 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 펩티딜 링커가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 ROBO2 단백질:
    a) 글리신 풍부 펩티드;
    b) 글리신 및 세린을 포함하는 펩티드;
    c) 서열 [Gly-Gly-Ser]n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)을 갖는 펩티드 (서열식별번호: 22); 및
    d) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)을 갖는 펩티드 (서열식별번호: 23).
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩티딜 링커가 [Gly-Gly-Ser]2 (서열식별번호: 15)인 재조합 ROBO2 단백질.
  12. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2)-Fc 단백질.
  13. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 라운드어바웃 수용체 2 (ROBO2)-Fc 단백질.
  14. 제12항에 있어서, ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하고 ATCC 수탁 번호 PTA-124008을 갖는 재조합 ROBO2-Fc 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD로 SLIT2에 결합하는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 SLIT2에의 ROBO1의 결합에 대한 KD 값보다 적어도 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 40배, 약 60배, 약 80배, 약 100배, 약 120배, 약 140배, 약 160배 더 낮은 KD로 SLIT2에 결합하는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 SLIT2에의 ROBO1-Fc 단백질의 결합에 대한 KD 값보다 적어도 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 40배, 약 60배, 약 80배, 약 100배, 약 120배, 약 140배, 약 160배 더 낮은 KD로 SLIT2에 결합하는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KD가, 임의로 비아코어(Biacore) T200 기기를 사용하여, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정되는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KD가, 임의로 포르테바이오 옥테트(ForteBio Octet) 기기를 사용하여, 생물-층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정되는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 SLIT와 ROBO2의 결합을 억제하고/하거나 ROBO2-의존성 SLIT-N 활성을 억제하는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이, SLIT2에의 ROBO2의 결합의 억제에 대한 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정에 의해 측정 시에, 약 15 nM, 약 13 nM, 약 11 nM, 약 9 nM, 약 7 nM, 약 6 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3 nM, 약 2 nM, 약 1 nM 이하의 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 갖는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이, 뉴런 세포 이동의 SLIT2-N 매개된 억제를 측정함으로써 평가 시에, 약 75 nM, 약 65 nM, 약 55 nM, 약 45 nM, 약 35 nM, 약 25 nM, 약 15 nM, 약 5 nM 이하의 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 갖는 것인 재조합 ROBO2 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 ROBO2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 분자가 서열식별번호: 21의 핵산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  25. 제23항 또는 제24항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  26. 제23항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 ROBO2 단백질, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  28. 신질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 ROBO2 단백질의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신질환을 치료하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 신질환이 사구체 질환, 초점성 분절성 사구체 경화증 (FSGS), 또는 신병증인 방법.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 신질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 재조합 ROBO2 단백질.
  31. 제30항에 있어서, 상기 신질환이 사구체 질환, 초점성 분절성 사구체 경화증 (FSGS), 또는 신병증인 재조합 ROBO2 단백질.
  32. 신질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 ROBO2 단백질의 용도.
  33. 제32항에 있어서, 상기 신질환이 사구체 질환, 초점성 분절성 사구체 경화증 (FSGS), 또는 신병증인 용도.
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