BRPI0806403A2

BRPI0806403A2 - anticorpo anti-robo4, usode um anticorpo e método de obtenção de imagem

Info

Publication number: BRPI0806403A2
Application number: BRPI0806403-2A
Authority: BR
Inventors: Franklin V Peale Jr; Ryan J Watts; Alexander W Roch; Yan Wu; Scott Stawicki; Richard Carano
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2008-02-08
Publication date: 2011-09-06
Also published as: US20110059013A1; ECSP099619A; US20080247951A1; WO2008100805A3; RU2009133784A; US20110059112A1; JP2010518115A; CR11017A; CL2008000420A1; IL200012A0; US7834154B2; CA2676766A1; PE20081760A1; EP2125896A2; CO6220835A2; KR20090114443A; MX2009008430A; AU2008216495A1; WO2008100805A2; EP2468776A2

Abstract

ANTICORPO ANTI-ROBO4, USO DE UM ANTICORPO E MéTODO DE OBTENçãO DE IMAGEM. A presente invenção trata de anticorpos anti-Robo4, composições compreendendo os anticorpos e métodos de utilização dos referidos anticorpos, incluindo métodos diagnósticos e terapêuticos.

Description

"ANTICORPO ANTI-R0B04, USO DE UM ANTICORPO E MÉTODO DE OBTENÇÃO DE IMAGEM"

Referência Cruzada ao Pedido de Patente Relacionado

O presente pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios de Patente US Nos. 60/889.214, depositado em 9 de Fevereiro de 2007 e 60/891.475, depositado em 23 de Fevereiro de 2007, as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção A presente invenção se refere, de modo geral, aos campos de angiogênese e proliferação e migração de células endoteliais. Mais especificamente, a presente invenção se refere a moduladores de Robo4 e usos de tais moduladores.

Antecedentes da Invenção A família Roundabout de receptores são moléculas de orientação molecular as quais regulam a orientação de axônio, migração neuronal e quimiotaxia de leucócito em resposta à interação com proteínas Slit (Suchting et ai, FASEB J. 19: 121-123 (2005)). Moléculas do receptor Roundabout contêm cinco domínios de imunoglobulina e três de fibronectina em sua região extracelular. Magic Roundabout (isto é, Robo4 ou molécula 4 célula endotelial- específica (ESCSM4)) é estruturalmente distinta de outros membros da família Roundabout. O Magic Roundabout humano (Robo4) compreende dois domínios do principal complexo de histocompatibilidade e dois de imunoglobulina (aminoácidos 46-116 e 151-209), dois domínios de fibronectina do tipo II (aminoácidos 252-335 e 347-432), uma região transmembrana (468- 490) e uma região rica em prolina (aminoácidos 715-772) (veja Huminiecki et ai, Genomics 79(4): 547-552 (2002) e Figura 1 no mesmo). Robo4 de camundongo e humano mostram 75% de identidade de seqüência de nucleotídeo (Huminiecki et al., supra (2002)). Análise de expressão de Robo4 indicou que expressão de Robo4 é altamente restrita, com expressão forte na placenta e tumores, incluindo metástase do cérebro, bexiga e colônica para o fígado, onde expressão do tumor está restrita à vasculatura do tumor (Huminiecki et al., supra (2002)).

Além disso, expressão de Robo4 está associada a locais de angiogênese ativa, mas não é detectada em tecido neuronal (Huminiecki, L. et al., supra (2002)).

Como um receptor associado à membrana com domínios extracelulares, o Robo4 é um alvo útil para distribuição de produtos terapêuticos citotóxicos para inibição de proliferação de célula endotelial vascular durante angiogênese. O Robo4 também é um alvo útil para distribuição de marcadores detectáveis à células endoteliais vasculares em proliferação. Conjugados de anticorpo objetivados ao Robo4 (também referido como ECSM4) também foram reportados como compostos terapêuticos potenciais onde o conjugado compreende uma citotoxina e como marcadores diagnósticos potenciais onde o conjugado compreende uma marcação detectável (veja, por exemplo, WO 2002/036771).

O uso de conjugados de anticorpo-fármaco para a distribuição local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, fármacos para matar ou inibir células tumorais no tratamento de câncer (Syrigos e Epenetos, Anticancer Res. 1 9: 605-614 (1999); Niculescu-Duvaz e Springer1 Adv. Drug Del. Rev. 26: 151- 172 (1997); Patente US 4.975.278) permite a distribuição objetivada da porção de fármaco a tumores e acúmulo intracelular dos fármacos.

Uma série de conjugados de anticorpo-fármaco que objetivam outras moléculas foi ou estão sendo desenvolvidos. Por exemplo, o ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugado de anticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal de IgGI kappa de murino dirigido contra o antígeno CD20 encontrado sobre a superfície de linfócitos B normais e malignos e radioisótopo 111In ou 90Y ligado através de um ligante-quelador de tioureia (Wiseman et ai, Eur. Jour. Nuel. Med. 27(7): 766-77 (2000); Wiseman et a!., Blood 99(12): 4336-42 (2002); Witzig et ai, J. Clin. Oncoi 20(10): 2453- 63 (2002); Witzig et ai, J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69 (2002)). Embora o ZEVALIN tenha atividade contra Iinfoma não-Hodgkin de células B (NHL), a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maioria dos pacientes. O MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), composto de um anticorpo huCD33 ligado à caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mieloide aguda através de injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; Patentes US Nos. 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.693.762; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001). O Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), composto de um anticorpo huCD242 ligado via o Iigante de dissulfeto SPP à porção de fármaco de maitansinoide, DM1, está sendo desenvolvido para o tratamento de cânceres que expressam o antígeno CanAg1 tal como cólon, pancreático, gástrico e outros. O MLN-2704 (Millennium Pharm, BZL Biologics, Immunogen Inc.), composto de um anticorpo monoclonal ao antígeno membrana-específico antipróstata (PSM antipróstata A) ligado à porção de fármaco de maitansinoide, DM1, está sendo desenvolvido para o tratamento potencial de tumores de próstata. A mesma porção de fármaco de maitansinoide, DM1, foi ligada através de um Iigante não clivável de não-dissulfeto, SMCC, a um anticorpo monoclonal de murino, TA.1 (Chari et al., CancerRes. 52: 127-131 (1992)). Foi reportado que esse conjugado é 200 vezes menos potente do que o conjugado com Iigante de dissulfeto correspondente.

Os peptídeos de auristatina, auristatina E (AE) e monometil auristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados a: (i) cBR96, um anticorpo monoclonal quimérico específico para Lewis Y em carcinomas; (ii) cAC10, o qual é específico para CD30 em malignidades t hematológicas (Klussman et ai, Bioeonjugate Chemistry 15(4): 765-773 (2004); Doronina et ai, Nature Biotech. 21(7): 778-784 (2003); Francisco et ai, Blood 102(4): 1458 -1465 (2003); Publicação de Patente US No. 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20, tal como Rituxan® (rituximab) (WO 04/032828) para o tratamento de cânceres expressando CD20 e distúrbios imunes; (iv) anticorpos anti-EphB2 2H9 e anti-IL-8 para o tratamento de câncer cólon-retal (Mao et ai, Câncer Res. 64(3): 781-788 (2004)); (v) anticorpo de E-selectina (Bhaskar et al., CancerRes. 63: 6387-6394 (2003)); e (vi) outros anticorpos anti-CD30 (WO 03/043583). Monometil auristatina (MMAE) também foi conjugada ao 2H9, um anticorpo contra EphB2R o qual é um receptor de quínase de tirosina TM do tipo 1 com homologia íntima entre camundongos e seres humanos e é superexpresso em células de câncer cólon-retal (Mao et ai, Câncer Res. 64: 781-788 (2004)).

A monometil lauristatina, MMAF, uma variante de auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina na terminação-C (Patentes US Nos. 5.767.237 e 6.124.431), foi reportada como sendo menos potente do que a MMAE, mas mais potente quando conjugada a anticorpos monoclonais (Senter et ai, Proceedings of the American Association for Câncer Research, Volume 45, Abstract Number 623, apresentado em 28 de Março de 2004). Fenileno diamina de auristatina F (AFP); uma variante de fenilalanina de MMAE foi ligada a um mAb anti-CD70, 1F6, através da terminação-C de 1F6 via um espaçador de fenileno diamina (Law et al., Proceedings of the American Association for Câncer Research, Volume 45, Abstract Number 625, apresentado em 28 de Março de 2004).

Há uma necessidade na técnica por fármacos adicionais para tratar doenças e distúrbios associados à angiogênese incluindo, por exemplo, angiogênese anormal associada a cânceres dependentes do crescimento e proliferação de vasculatura de origem endotelial. Há também uma necessidade na técnica por conjugados de anticorpo-fármaco anti-Robo4 objetivados à célula endotelial para a detecção e visualização de crescimento e proliferação de vasos sangüíneos, por exemplo, em cânceres ou distúrbios oculares suportados ou causados por proliferação excessiva de vasos sangüíneos, bem como em distúrbios ou outros estados fisiológicos nos quais monitoramento de crescimento de vasos sangüíneos é útil na compreensão ou tratamento do estado fisiológico. A presente invenção vai de encontro a essas e outras necessidades.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção proporciona anticorpos que se ligam especificamente ao Robo4 (incluindo, por exemplo, Robo4 de primata e/ou roedor, tal como Robo4 humano e/ou de camundongo) e métodos diagnósticos e terapêuticos usando tais anticorpos. Em algumas modalidades, os anticorpos são humanizados ou humanos. Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo consistindo de: um anticorpo intacto, uma variante de anticorpo e derivado de anticorpo, um Fab, um Fab2, um (Fab')2 e um Fv. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Robo4 tendo afinidade e especificidade pelo Robo4 humano e, opcionalmente, Robo4 de murino, o anticorpo compreendendo, consistindo de ou consistindo essencialmente de região hipervariável (HVR) de uma seqüência de domínio de cadeia leve e cadeia pesada, conforme representado nas Figuras 1A, 1B, 2A e 2B (SEQ ID NOS: 1-8, 17-71). Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Robo4 tendo afinidade e especificidade pelo Robo4 humano e, opcionalmente, Robo4 de murino, o anticorpo compreendendo, consistindo de ou consistindo essencialmente de regiões de framework (FRs) de uma seqüência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada, conforme representado nas Figuras 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A e 4B (SEQ ID NOS: 9-16, SEQ ID NO: 12, onde V é substituída por M e SEQ ID NOS: 99-139). Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Robo4 tendo afinidade e especificidade pelo Robo4 humano e, opcionalmente, Robo4 de murino, o anticorpo compreendendo, consistindo de ou consistindo essencialmente de seqüências de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada, conforme representado nas Figuras 1A e 1B (SEQ ID NOS: 72-97) e Figuras 2A e 2B (SEQ ID NOS: 140-165).

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Robo4 compreendendo:

pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis sequência(s) de região hipervariável (HVR) selecionada(s) do grupo consistindo de:

(i) HVR-L1 compreendendo a seqüência A1-A11, em que A1- A11 é RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 1)

(ii) HVR-L2 compreendendo a seqüência B1-B7, em que B1- B7 é SASFLYS (SEQ ID NO: 2)

(iii) HVR-L3 compreendendo a seqüência C1-C9, em que C1- C9 é QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 3)

(iv) HVR-H1 compreendendo a seqüência D1-D10, em que D1- D10 é GFTINGYYIH (SEQ ID NO: 17)

(v) HVR-H2 compreendendo a seqüência E1-E18, em que E1- E18 é GFIYPAGGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 18);

(vi) HVR-H3 compreendendo a seqüência F1-F17 em que F1- F17 é ARLIGNKFGWSSYGMDY (SEQ ID NO: 19); e

(vii) pelo menos uma HVR variante, em que a HVR variante compreende uma inserção, deleção ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido da seqüência representada em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 17, 18 ou 19.

Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Robo4 compreendendo:

pelo menos uma, duas, três,· quatro, cinco ou seis seqüências de região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo consistindo de:

(iv) HVR-H1 compreendendo a seqüência D1-D10, em que D1- D10 é GFTISGSWIH (SEQ ID NO: 4)

(v) HVR-H2 compreendendo a seqüência E1-E18, em que E1- E18 é AVITPAGGYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 5) e

(vi) HVR-H3 compreendendo a seqüência F1-F16, em que F1- F16 é SNRYSGQFVPAYAMDY (SEQ ID NO: 6).

Em uma modalidade, HVR-L1 de um anticorpo da presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, HVR-L2 de um anticorpo da presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, HVR-L3 de um anticorpo da presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, HVR-H1 de um anticorpo da presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, HVR-H2 de um anticorpo da presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, HVR-H3 de um anticorpo da presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, HVR-L1 compreende RASQSISSYLA (SEQ ID NO: 7) ou RASQDGARSLA (SEQ ID NO: 39) ou RASQDGAIYLA (SEQ ID NO: 40). Em uma modalidade, HVR-L2 compreende GASSRAS (SEQ ID NO: 8) ou SASFLAS (SEQ ID NO: 41) ou SASLES (SEQ ID NO: 42) ou SATLAS (SEQ ID NO: 43) ou SASFLAS (SEQ ID NO: 44) ou SASNLAS (SEQ ID NO:*45) ou SASTLAS (SEQ ID NO: 46). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreendendo essas seqüências (em combinação conforme descrito aqui) é humanizado ou humano.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco HVRs, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma seqüência selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 e em que SEQ ID NO: 1 ou 7 corresponde a uma HVR-L1, SEQ ID NO: 2 ou 8 corresponde a uma HVR- L2, SEQ ID NO: 3 corresponde a uma HVR-L3, SEQ ID NO: 4 corresponde a uma HVR-H1, SEQ ID NO: 5 corresponde a uma HVR-H2 e SEQ ID NO: 6 corresponde a uma HVR-H3. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 7, uma HVR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2, uma HVR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3, uma HVR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4, uma HVR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 8, uma HVR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3, uma HVR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4, uma HVR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2, uma HVR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 3, uma HVR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 4, uma HVR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 6.. Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2, uma HVR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 20, uma HVR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 17, uma HVR-H2 compreendendo SEQ ID: NO: 18 e uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 19. HVRs variantes em um anticorpo da presente invenção podem ter modificações de um ou mais resíduos dentro da HVR. Em uma modalidade, uma variante de HVR-L1 compreende SEQ ID NO: 1 em que A1-11 compreende 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: A5 (S), A6 (I ou G), A7 (A), A8 (S, R ou I), A9 (Y ou S) e A10 (L). Em uma modalidade, uma variante de HVR-L2 compreende SEQ ID NO: 2 em que B1-7 compreende 1-4 (1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: B, (G), B3 (T), B4 (S, L, N ou T), B5 (R, E ou A), B6 (A ou S) e B7 (Y). Em uma modalidade, uma variante de HVR-L3 compreende SEQ ID NO: 3 em que C1-9 compreende 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: C3 (Υ, P, T, F ou G), C4 (W, F, R ou N), C5 (S, N, A, D, F, H, V ou G), C6 (Y, S, A, D, N, L, I, M, Y ou G), Cl (L, H ou T) e C8 (L, F, A, M ou S). Em uma modalidade, uma variante de HVR-H1 compreende SEQ ID NO: 4 em que D1-10 compreende 1-9 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: D2 (Y), D3 (S), D4 (F ou L), D5 (N, T, Y, D ou K), D6 (N ou S), D7 (Y, N ou R), D8 (Y ou A), D9 (M, F1 L ou N) e D10 (S1 E ou Q). Em uma modalidade, uma variante de HVR-H2 compreende SEQ ID NO: 5 em que E1-18 compreende 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: E1 (G ou S), E2 (F, G, I, T ou R), E4 (Y ou S), E5 (G ou S), E6 (T, Y ou Μ), E7 (D ou L), E8 (S), E9 (D, S, T, H, Κ, A ou V), E10 (I) e E11 (D, N, A, E ou I). Em uma modalidade, uma variante de HVR-H3 compreende SEQ ID NO: 6 em que F1- 18 compreende 1-17 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: F2 (S), F3 (L, G, D, M ou W), F4 (I, G, V ou S), F5 (G, Y ou N), F6 (N, S ou V), F7 (K, Y, W ou M), F8 (F, S1 P ou uma deleção), F9 (G, A, S, Y ou uma deleção), F10;(W, R, P, E, G ou uma deleção), F11 (S, W, G, H ou uma deleção), F12 (S, W, H ou uma deleção), F13 (Y, D, G1 Vou uma deleção), F14 (G ou uma deleção), F15 (Vou uma deleção), F16 (L ou F), F17 (a) e F18 (V). A(s) letra(s) entre parênteses após cada posição indica uma substituição ilustrativa (isto é, reposição) de aminoácido ou, onde indicado, uma deleção de aminoácido. Em uma modalidade, uma HVR-L1 compreende a seqüência de SEQ ID NO: 1; uma HVR-L2 compreende SEQ ID NO: 2; uma variante de HVR-L3 compreende SEQ ID NO: 3 em que C4, C5, C6 e C6 são R, S, D e H1 respectivamente; uma HVR-H1 compreende SEQ ID NO: 17; uma HVR-H2 compreende SEQ ID NO: 18; e uma HVR-H3 compreende SEQ ID NO: 19 ou uma variante de HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade dos referidos anticorpos, os referidos anticorpos ainda compreendem uma seqüência de consenso de framework de cadeia leve κ humana. Em uma modalidade, a posição 104 na região de framework 4 da cadeia leve (LC-FR4) (numeração de Kabat) é V. Em uma modalidade, a posição 104 de LC-FR4 é M.

Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-H1 variante SEQ ID NO: 4 numerada D1-D10, em que de 1 a 6 substituições são selecionadas do seguinte: D2 (Y), D3 (S)1 D4 (F ou L), D5 (S, Τ, Y, D ou K), D6 (N ou S), D7 (S, N ou R), D8 (W ou A), D9 (M, F, L ou N) e D10 (S, E ou Q). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-H1 variante compreendendo SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27 ou 28. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-H2 variante SEQ ID NO: 5 numerada E1-E18, em que de 1 a 7 substituições são selecionadas do seguinte: E1 (A ou S), E2 (V, G, I, T ou R), E4 (T ou S), E5 (G ou S), E6 (Τ, Y ou Μ), E7 (D ou L), E8 (S), E9 (Y, S, Τ, Η, Κ, A ou V), E10 (I) e E11 (Υ, Ν, A, E ou I). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-H2 variante compreendendo SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32 ou 33. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-H3 variante compreendendo SEQ ID NO: 6 numerada F1-F16, em que de 1-15 substituições são selecionadas do seguinte: F1 (S, G, D, M ou W), F2 (N, G, V ou S), F3 (R, Y ou N), F4 (Y, S ou V), F5 (S, Y1 W ou M), F6 (G, S1 P ou uma deleção), F7 (Q, A, S1 Y ou uma deleção), F8 (F, R, Ρ, E, G ou uma deleção), F9 (V, W1 G, H ou uma deleção), F10 (P, W1 H ou uma deleção), F11 (A, D, G, V ou uma deleção), F12 (Y ou uma deleção), F13 (A ou V), F14 (L ou F) e F15 (V). De acordo com a presente invenção, uma substituição de aminoácido pode abranger uma deleção de aminoácido em uma determinada seqüência. Em uma modalidade da presente invenção, um anticorpo da presente invenção compreende uma HVR-H3 variante compreendendo SEQ ID NO: 34, 35, 36, 37 ou 38. Em uma modalidade dos referidos anticorpos, a seqüência de consenso de framework compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades dos referidos anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade dos referidos anticorpos, esses anticorpos ainda compreendem uma seqüência de consenso de framework de cadeia pesada do subgrupo Ill humana.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Robo4 compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais das seqüências de HVR representadas na Fig. 1, 2, 3 e (SEQ ID NOS: 1-8, 17-71).

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Robo4 humanizado. Um anticorpo anti-Robo4 da presente invenção pode compreender uma ou mais seqüências de região não- hipervariável de consenso (isto é, framework) humana em seu domínio variável de cadeia pesada e/ou leve. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações adicionais estão presentes dentro das seqüências de região não- hipervariável de consenso humana. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção compreende uma seqüência de framework de consenso humana, modalidade a qual é a seqüência de framework de consenso do subgrupo III. Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma seqüência de framework de consenso do subgrupo Ill variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Por exemplo, em uma modalidade, uma seqüência de framework de consenso do subgrupo Ill variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das posições 71, 73 e/ou 78. Em uma outra modalidade, a referida substituição é R71A, N73T e/ou N78A e/ou L/78A, em qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo da presente invenção compreende uma seqüência de framework de consenso humana, modalidade a qual é a seqüência de framework de consenso do subgrupo κΙ humana. Em uma modalidade, a seqüência de framework de consenso de cadeia leve é modificada em uma ou mais posições. Em uma modalidade, a seqüência de consenso de cadeia leve tem, na posição 104, o aminoácido V. Em uma modalidade, a seqüência de consenso de cadeia leve é modificada na posição 104 de acordo com o sistema de numeração de Kabat, em que a posição 104 é M.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo compreendendo 1 a 4 ou todas as seqüências de FR de cadeia leve LC-FR1 (SEQ ID NO: 9), LC-FR2 (SEQ ID NO: 10, LC-FR3 (SEQ ID NO: 11) e LC-FR4 (SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade, LC-FR4 (SEQ ID NO: 12) é uma variante, em que a posição 104 é M.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo compreendendo 1 a 4 ou todas as seqüências de FR de cadeia pesada HC- FR1 (SEQ ID NO: 13), HC-FR2 (SEQ ID NO: 14), HC-FR3 (SEQ ID NO: 15) e HC-FR4 (SEQ ID NO: 16).

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um agente terapêutico para uso em um«indivíduo hospedeiro que estimula pouca ou nenhuma resposta imunogênica contra o agente no referido indivíduo. Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo humanizado que estimula e/ou espera-se que estimule uma resposta de anticorpo anticamundongo humana (HAMA) em um nível substancialmente reduzido em um indivíduo hospedeiro comparado com um anticorpo de murino estimulado contra Robo4 humano. Em outro exemplo, a presente invenção proporciona um anticorpo humanizado que estimula e/ou espera-se que estimule resposta de anticorpo anticamundongo humana (HAMA) mínima ou nenhuma. Em um exemplo, um anticorpo da presente invenção estimula uma resposta de anticorpo anticamundongo que está em ou abaixo de um nível clinicamente aceitável.

A presente invenção também proporciona anticorpos compreendendo modificações em posições hipervariáveis híbridas conforme descrito abaixo. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma seqüência de framework de consenso do subgrupo III humana variante modificada em uma ou mais posições hipervariáveis híbridas. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de framework de consenso do subgrupo III humana variante modificada em uma ou mais das posições 26-35, 49-65, 95-102 e 94. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de framework de consenso do subgrupo I kappa humana variante modificada em uma ou mais das posições 24-34, 50-56 e 39-97.

Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos uma porção (ou toda) a seqüência de framework da cadeia leve κ humana. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos uma porção (ou toda) a seqüência de consenso de framework do subgrupo I κ humana. Em uma .modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende as seqüências de framework mostradas nas Figuras 3A e 3B.

Um anticorpo da presente invenção pode compreender quaisquer seqüências de framework de cadeia pesada de consenso humana adequadas, contanto que o anticorpo exiba as características biológicas desejadas (por exemplo, uma afinidade de ligação desejada). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos uma porção (ou toda) a seqüência de framework de cadeia pesada do subgrupo Ill humana. Em uma modalidade, um anticorpo a presente invenção compreende as seqüências de framework mostradas nas Figuras 4A e 4B.

Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve compreendendo a seqüência de framework representada em SEQ ID NOS: 72-137 (Figuras 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A e 4B).

Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo anti-Robo4 humanizado que se liga ao marcador de célula endotelial vascular Robo4 humano. Por exemplo, em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga ao Robo4 humano com um valor de IC50 que é menos do que 1000 nM, menos de 500 nM, menos de 200 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 30 nM, menos de 20 nM menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 3 nM, menos de 1 nM, menos de 0,1 nM ou menos de 0,01 nM. Comparação das capacidades de inibir a ligação de ligante a seu receptor pode ser realizada de acordo com vários métodos conhecidos na técnica, incluindo conforme descrito nos Exemplos abaixo.

Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo anti-Robo4 conjugado a uma porção citotóxica (um conjugado de anticorpo/fármaco anti-Robo4, também referido como um ADC anti-Robo4), em que o ADC anti-Robo4 inibe a proliferação celular Robo4-dependente em uma célula expressando Robo4. Células expressando Robo4 incluem, mas não estão limitadas a, células endoteliais, tais como células endoteliais vasculares. ADCs anti-Robo4 exemplificativos são divulgados aqui. Em uma modalidade, o anticorpo anti-Robo4 é humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo anti- Robo4 é um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo anti-Robo4 é derivado a partir de mutagênese por phage display e seleção.

Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo ADC anti-Robo4 que inibe a proliferação celular Robo4-dependente melhor do que um anticorpo anti-Robo4 de referência que não é conjugado a um agente citotóxico. Por exemplo, em uma modalidade, um anticorpo ADC anti-Robo4 da presente invenção inibe a proliferação celular com um valor de IC50 que é menos do que cerca de metade daquele do anticorpo anti-Robo4 de referência que não é conjugado a um agente citotóxico. Em uma modalidade, o valor de IC50 de um anticorpo ADC da presente invenção é cerca de 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3 ou 0,4 aquele do anticorpo de referência não-ADC. Comparação das capacidades de inibir a proliferação celular pode ser realizada de acordo com vários métodos conhecidos na técnica, incluindo conforme descrito nos Exemplos abaixo. Em uma modalidade, os valores de IC50 são determinados através de uma faixa de concentração de anticorpo de cerca de 0,01 nM a cerca de 100 nM.

Em uma modalidade, o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico são ambos monovalentes. Em uma modalidade, ambos o anticorpo humanizado e o anticorpo quimérico compreendem ambos uma única região Fab ligada a uma região Fe. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico de referência compreende seqüências de domínio variável representadas na Fig. 7 (SEQ ID NO: 9 e 10) ligadas a uma região Fc humana. Em uma modalidade, a região Fc humana é aquela de uma IgG (por exemplo, IgGI,, 2, 3 ou 4).

Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção compreende uma região Fe. Em uma modalidade, a região Fc é uma IgGI, 2, 3 ou 4. Em uma modalidade, a IgG é uma IgG nativa. Em uma modalidade, a região Fc exibe citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) intensificada com relação à atividade de ADCC do tipo silvestre da IgGI, 2, 3 ou 4 nativa. Em uma modalidade, a IgG é uma região Fc alterada com relação à IgG nativa, de modo que a região Fc alterada exibe atividade de ADCC intensificada com relação à região Fc nativa.

Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo anti-Robo4 conjugado a uma porção detectável, tal como um agente de formação de imagem. Em um aspecto, os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados com qualquer porção de rotulação a qual pode ser presa de forma covalente ao anticorpo através de uma porção reativa, uma porção ativada ou um grupo tiol de cisteína reativo (Singh et ai, Anal. Biochem. 304: 147-15 (2002); Harlow E. e Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2a ed. CRC Press, Boca Raton, FL). a marcação preso pode funcionar para: (i) proporcionar um sinal detectável; (ii) interagir com uma segunda marcação para modificar o sinal detectável fornecido pela primeira ou segunda marcação, por exemplo, para proporcionar FRET (transferência de energia por ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interações ou aumentar a afinidade de ligação com antígeno ou ligante; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética ou permeabilidade celular, através da carga, hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicos; ou (v) proporcionar uma porção de captura para modular a afinidade de ligante, ligação de anticorpo/antígeno ou formação de complexo iônico. Anticorpos marcados da presente invenção são ainda divulgados aqui.

Em uma modalidade, a marcação detectável é uma partícula insolúvel aquosa que é detectável in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, a partícula é uma partícula magnética ou metálica. Partículas metálicas são detectáveis através de métodos tais como as técnicas de formação de imagem por ressonância magnética (MRI), tráfego de uma única partícula ou única molécula, imunocitoquímica, freqüência de plasmônio com iluminação de campo escuro, contraste por interferência diferencial e vídeo intensificação, reflexão interna total e contraste por interferência fototérmica (PIC) (veja, por exemplo, PNAS USA 100(20): 11350-11355 (2003); Sheetz et ai, Nature 340: 284-288 (1989); Baschong et al., Histochemistry 83: 409-411 (1985); Slot e Geuze, Eur. J. Cell Bioi 38: 87-93 (1935); Frey e Frey1 J. Struct. Biol. 127: 94- 100 (1999); Hainfeld e Powell, J. Histochem. Cytochem. 48: 471-480 (2000); Schultz et al., PNAS USA 97: 996-1001 (2000); Gelles et ai, Nature 331: 450 - 453 (1988); Sonnichsen et ai, Appl. Phys. Lett. 77: 2949-2951 (2000); Boyer et ai, Science 297: 1160-1163 (2002)). Agentes em nanopartícula da presente invenção também podem incluir, mas não estão limitados a, microbolhas (veja Ellegala et al., Circulation 108: 336-341 (2003)), também referidas como liposferas acusticamente ativas (AALs) (veja Tartis et al., Ultrasound Med. Biol. 32(11): 1771-80 (2006)), agentes superparamagnéticos, lipossomos, emulsões de nanopartícula de perfluorocarboneto (WO 2005104051) e dendrímeros (veja Caruthers et al., Methods in Molecular Medicine, 124: 387 -400 (2006) e referências citadas nos mesmos, referências as quais são todas aqui incorporadas por referência em sua totalidade).

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de HVR-H1, HVR-H2 e/ou HVR-H3 representada nas Figuras 1B e 2B. Em uma modalidade, o domínio variável compreende a seqüência de HC- FR1, HC-FR2, HC-FR3 e/ou HC-FR4 representada nas Figuras 1B, 2B, 4A e 4B. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma seqüência de CH1 e/ou Fe. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de HVR-H1, HVR-H2 e/ou HVR-H3 e a seqüência de HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 e/ou HC- FR4 representada nas Figuras 1B, 2B, 4A e 4B. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de HVR1-HC, HVR2-HC e/ou HVR3-HC representada nas Figuras 1B, 2B, 4A e 4B e uma seqüência de CH1 e/ou Fc.

Em um aspecto, a presente invenção ρ roporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de HVR1-LC, HVR2-LC e/ou HVR3-LC representada nas Figuras 1A ou 2A. Em uma modalidade, o domínio variável compreende uma seqüência de FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC e/ou FR4-LC representada nas Figuras 3A e 3B.

Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende domínios variáveis de cadeias leve e pesada, conforme descrito nos dois parágrafos precedentes. Em uma modalidade, o anticorpo é monovalente e compreende uma região Fe. Em uma modalidade, a região Fc compreende pelo menos uma protuberância (nó) e pelo menos uma cavidade (buraco), em que a presença da protuberância e cavidade intensifica a formação de um complexo entre um polipeptídeo de Fc compreendendo a protuberância e um polipeptídeo de Fc compreendendo a cavidade, por exemplo, conforme descrito no WO 2005/063816. Em uma modalidade, a região Fc de um anticorpo da presente invenção compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo de Fe, em que os primeiro e segundo polipeptídeos compreendem, cada um, uma ou mais mutações com relação à Fc humana do tipo silvestre. Em uma modalidade, uma mutação na cavidade é T366S, L368A e/ou Y407V. Em uma modalidade, uma mutação na protuberância é T366W. Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo compreende a seqüência de Fc representada na Figura 13 e o segundo polipeptídeo compreende a seqüência de Fc representada na Figura 14. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos de modulação de um ou mais aspectos dos efeitos Robo4-associados (por exemplo, ativação de Robo4, sinalização molecular a jusante (por exemplo, fosforilação de quínase de proteína mitógeno-ativada (MAPK)), proliferação celular, migração celular, sobrevivência celular, morfogênese celular e angiogênese) através de administração de um anticorpo anti-Robo4 a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo mamífero, tal como um ser humano). Em algumas m modalidades, o anticorpo anti-Robo4 rompe a ligação de Iigante ao Robo4 (por exemplo, através de ligação a uma seqüência dentro do domínio extracelular do Robo4 e, desse modo, inibindo a interação do referido domínio de anticorpo com seu parceiro de ligação (tal como uma molécula ligante). Em outras modalidades, o anticorpo Robo4 se liga a uma seqüência que não está dentro do sítio de ligação de ligante de Robo4, em que a referida ligação resulta em ruptura da capacidade do Robo4 se interagir com seu parceiro de ligação.

Em uma modalidade da presente invenção, a ligação do anticorpo ao Robo4 inibe a proliferação de célula endotelial associada ao Robo4. Em outra modalidade de um anticorpo Robo4 da presente invenção, a ligação do anticorpo ao Robo4 em uma célula inibe a proliferação, sobrevivência, dispersão, morfogênese e/ou motilidade da célula. Em outra modalidade, a célula é uma célula endotelial tal como, sem limitação, uma célula endotelial vascular.

Em uma modalidade, um anticorpo Robo4 da presente invenção se liga especificamente a pelo menos uma porção do Robo4 mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO: 138) ou variante do mesmo. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente dentro da seqüência de aminoácidos do Robo4 de comprimento total carecendo da seqüência líder (isto é, carecendo da região indicada pelo sublinhado tracejado na Figura 5). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente dentro da seqüência de domínio extracelular mostrada na Figura 5 (indicada por um sublinhado sólido na Figura 5). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente a um epítopo conformacional formado por parte ou todo o domínio extracelular do Robo4. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente a uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade de seqüência ou similaridade com a seqüência mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO: 138). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente a uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade de seqüência ou similaridade com a seqüência da seqüência de aminoácidos de Robo4 de comprimento total carecendo da seqüência líder (isto é, carecendo da região indicada pelo sublinhado tracejado na Figura 5). Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente a uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade de seqüência ou similaridade com a seqüência do domínio extracelular do Robo4 (a região indicada pelo sublinhado sólido na Figura 5).

Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente ao Robo4 de uma primeira espécie animal e não se liga especificamente ao Robo4 de uma segunda espécie animal. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é um ser humano e/ou primata (por exemplo, macaco cynomolgus) e a segunda espécie animal é ratus (por exemplo, rato), murino (por exemplo, camundongo) e/ou canino. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é um ser humano. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é primata, por exemplo, macaco cynomolgus. Em uma modalidade, a segunda espécie animal é um murino, por exemplo, camundongo. Em uma modalidade, a segunda espécie animal é um canino. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção se liga especificamente ao Robo4 de pelo menos duas espécies. Em uma modalidade, a primeira espécie animal é um ser humano e/ou primata (por exemplo, macaco cynomolgus) e a segunda espécie animal é um murino (por exemplo, camundongo). Anticorpos da presente invenção que se ligam a mais de uma espécie encontram uso em estudos de modelamento animal para agentes terapêuticos ou diagnósticos.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de detecção de Robo4 no soro de um mamífero, onde uma concentração de Robo4 no soro que é maior do que os níveis normais de Robo4 indica a presença de angiogênese no mamífero. De acordo com o método da presente invenção, um anticorpo anti-Robo4 detectável ou detectavelmente marcado da presente invenção é contatado com uma amostra de soro de um mamífero de teste incluindo, mas não limitado a, um ser humano. O anticorpo anti-Robo4 é detectado diretamente via a marcação detectável ou indiretamente, por exemplo, através de contato com um anticorpo secundário detectável ou detectavelmente marcado. Uma concentração no soro (nível) de anti-Robo4 no mamífero de teste que é maior do que a concentração de anti-Robo4 no soro de um mamífero normal indica angiogênese no mamífero de teste. Um mamífero normal se refere a um mamífero conhecido por não estar experimentando angiogênese ou uma população de mamíferos não experimentando angiogênese. Em uma modalidade, o mamífero de teste e normal ou população de mamíferos é a mesma espécie incluindo, mas não limitado a, seres humanos. Os níveis no soro de proteína Robo4 foram detectados em pacientes humanos com câncer de pulmão de célula não- pequena avançado (Gorn et ai, Lung Câncer 49: 71 -76 (2005)). Os níveis de anti-Robo4 no soro são úteis para diagnóstico e prognóstico de angiogênese associada ao câncer. Em um aspecto, a presente invenção proporciona composições compreendendo um ou mais anticorpos da presente invenção e um veículo. Em uma modalidade, o veículo é farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona ácidos nucleicos que codificam um anticorpo Robo4 da presente invenção, vetores compreendendo os ácidos nucleicos e células hospedeiras (por exemplo, E. coli ou células de Ovário de Hâmster Chinês (CHO)) compreendendo os ácidos nucleicos e/ou vetores da presente invenção. Um vetor pode ser de qualquer tipo, por exemplo, um vetor recombinante, tal como um vetor de expressão. Qualquer uma de uma variedade de células hospedeiras pode ser usada. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula procariota, por exemplo, E. coli. Em uma modalidade, uma célula hospedeira é uma célula eucariota, por exemplo, uma célula de mamífero, tal como uma célula de Ovário de Hâmster Chinês (CHO).

Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos para fabricação de um anti-Robo4. Por exemplo, a presente invenção proporciona um método de fabricação de um anticorpo Robo4, o método compreendendo expressão, em uma célula hospedeira adequada, de um vetor recombinante da presente invenção que codifica o referido anticorpo (ou fragmento do mesmo) e recuperação do referido anticorpo.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um artigo de manufatura compreendendo um recipiente; e uma composição contida dentro do recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos anti- Robo4 da presente invenção. Em uma modalidade, a composição compreende um ácido nucleico da presente invenção. Em uma modalidade, uma composição compreendendo um anticorpo ainda compreende um veículo o qual, em algumas modalidades, é farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, um artigo de manufatura da presente invenção ainda compreende instruções para administração da composição (por exemplo, o anticorpo) a um indivíduo.

Em um aspecto, a presente invenção pro porciona um kit que compreende um primeiro container que compreende uma compasição que compreende uma ou mais anticorpos anti-Robo4 da presente invenção; um segundo container que compreende a buffer. Em uma realização, o buffer é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, o kit ainda compreende instruções para administrar a compasição (por exemplo, o anticorpo) a um indivíduo.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo Robo4 da presente invenção no preparo de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio imune (tal como autoimune) e/ou um distúrbio relacionado à angiogênese.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um ácido nucleico da presente invenção no preparo de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio imune (tal como autoimune) e/ou um distúrbio relacionado à angiogênese.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um vetor de expressão da presente invenção no preparo de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio imune (tal como autoimune) e/ou um distúrbio relacionado à angiogênese.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de uma célula hospedeira da presente invenção no preparo de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio imune (tal como autoimune) e/ou um distúrbio relacionado à angiogênese.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um artigo de manufatura da presente invenção no preparo de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio imune (tal como autoimune) e/ou um distúrbio relacionado à angiogênese.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um kit da presente invenção no preparo de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio imune (tal como autoimune) e/ou um distúrbio relacionado à angiogênese.

A presente invenção proporciona métodos e composições úteis para modulação de estados doentios associados à desregulação do eixo de sinalização de Robo4. A via de sinalização de Robo4 está envolvida em múltiplas funções biológicas e fisiológicas incluindo, por exemplo, proliferação celular e angiogênese. Assim, em um aspecto, a presente invenção proporciona um método compreendendo administração, a um indivíduo, de um anticorpo da presente invenção.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de inibição de proliferação celular ativada por Robo4, o referido método compreendendo contato de uma célula ou tecido com uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, pelo que a proliferação celular associada à ativação de Robo4 é inibida.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de uma condição patológica associada à desregulação de ativação de Robo4 em um indivíduo, o referido método compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, pelo que a referida condição é tratada. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de inibição do crescimento de uma célula que expressa Robo4, o referido método compreendendo contato da referida célula com um anticorpo da presente invenção ou um conjugado de anticorpo/fármaco da presente invenção, desse modo, causando uma inibição de crescimento da referida célula.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento terapêutico de um mamífero tendo um tumor cancerígeno compreendendo uma célula que expressa Robo4, o referido método compreendendo administração, ao referido mamífero, de uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção ou um conjugado de anticorpo/fármaco da presente invenção, desse modo, tratando eficazmente o referido mamífero.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular associado à expressão ou atividade aumentada de Robo4, o referido método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção ou um conjugado de anticorpo/fármaco da presente invenção, desse modo, tratando ou prevenindo eficazmente o referido distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, o referido distúrbio proliferativo é uma condição patológica associada à proliferação anormal ou indesejada de célula endotelial, tal como proliferação anormal ou indesejada de célula vascular em distúrbios incluindo, mas não limitado a, câncer, angiogênese e metástase, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal e outros tecidos transplantados, artrite reumatoide e psoríase. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento terapêutico de um tumor em um mamífero, em que o crescimento do referido tumor é, pelo menos em parte, dependente de um efeito de potencialização de crescimento de Robo4 expresso em células endoteliais incluindo, sem limitação, células endoteliais vasculares, o método compreendendo contato da referida célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção ou um conjugado de anticorpo/fármaco da presente invenção, desse modo, inibindo o crescimento de células endoteliais, por exemplo, em angiogênese associada ao tumor e, desse modo, tratando eficazmente o referido tumor.

Ainda outra modalidade da presente invenção proporciona métodos de modulação de angiogênese através de contato de uma célula ou tecido com uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-Robo4 descrito aqui. Em algumas modalidades, o anticorpo ainda compreende um agente citotóxico. Em algumas modalidades, a angiogênese é inibida. Em algumas modalidades, a angiogênese é intensificada. Em algumas modalidades, a angiogênese está associada a um distúrbio selecionado de: câncer, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado, artrite reumatoide, psoríase e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a angiogênese está associada ao câncer. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo consistindo de: sarcomas, incluindo sarcomas osteogênicos e angiosarcomas, câncer de células escamosas, câncer de pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal ou de rim, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pênis, melanoma, mieloma múltiplo e Iinfoma de células B, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço e metástases associadas e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a célula ou tecido está em um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem contato da célula com um agente selecionado de: um agente antineoplásico, um agente quimioterapêutico, um agente inibitório de crescimento, um agente citotóxico, um agente antiangiogênico e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti-VEGF. Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem contato da célula com um segundo, terceiro ou quarto agente selecionado de: um agente antineoplásico, um agente quimioterapêutico, um agente inibitório de crescimento, um agente citotóxico, um agente antiangiogênico e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o segundo, terceiro ou quarto agente é um anticorpo anti-VEGF.

Métodos da presente invenção podem ser usados para afetar qualquer estado patológico adequado, por exemplo, células e/ou tecidos associados à super-regulação da expressão de Robo4. Em uma modalidade, uma célula que é objetivada em um método da presente invenção é uma célula endotelial ou célula endotelial que prolifera dentro de um tumor (incluindo, por exemplo, um câncer de mama, um câncer cólon-retal, um câncer de pulmão, um carcinoma papilar (por exemplo, da glândula tiroide), um câncer de cólon, um câncer pancreático, um câncer ovariano, um câncer cervical, um câncer do sistema nervoso central, um sarcoma:osteogênico, um carcinoma renal, um carcinoma hepatocelular, um câncer de bexiga, um carcinoma gástrico, um carcinoma escamoso de cabeça e pescoço, um melanoma e uma leucemia ou um sarcoma (por exemplo, um sarcoma osteogênico ou um angiosarcoma) ou qualquer câncer, o crescimento do qual é suportado por proliferação de célula endotelial em angiogênese). Em uma modalidade, as condições patológicas estão associadas à proliferação anormal ou indesejada de célula endotelial. Em algumas modalidades, o alvo do anticorpo anti-Robo4 ou conjugado de anticorpo/fármaco da presente invenção inclui proliferação anormal ou indesejada de célula vascular em distúrbios incluindo, mas não limitado a, câncer (incluindo, por exemplo, tumores sólidos e metástases), arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal e outros tecidos transplantados, artrite reumatoide, psoríase e distúrbios associados à angiogênese (incluindo, por exemplo, distúrbios aumentados por proliferação de célula endotelial dentro do tecido que experimenta o distúrbio).

Os métodos da presente invenção podem ainda compreender etapas adicionais de tratamento. Por exemplo, em uma modalidade, um método ainda compreende uma etapa em que uma célula e/ou tecido alvo (por exemplo, uma célula cancerígena) é exposto a tratamento de radiação ou um agente quimioterapêutico.

Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, uma célula que é objetivada (por exemplo, uma célula endotelial de um tecido tumoral ou a retina) é uma na qual expressão de Robo4 está aumentada quando comparado com uma célula endotelial em tecido normal da mesma origem tecidual. Em uma modalidade, um método da presente invenção causa a morte de uma célula objetivada. Por exemplo, contato com um anticorpo anti- Robo4 da presente invenção, incluindo contato com um anticorpo anti-Robo4 da presente invenção conjugado a um composto citotóxico, pode resultar em internalização do composto citotóxico, o qual resulta em morte celular. Em outra modalidade alternativa, contato com um anticorpo anti-Robo4 da presente invenção conjugado a uma porção detectável faz com que as células endoteliais, por exemplo, da vasculatura de um tecido (por exemplo, um tecido tumoral ou retina) sejam detectadas, tal como através de métodos de formação de imagem bem conhecidos na técnica relevante.

Outra modalidade da presente invenção proporciona métodos de formação de imagem in vivo através de administração de um anticorpo anti- Robo4 descrito aqui a um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, se suspeita que o mamífero tem uma doença ou distúrbio selecionado de: câncer, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado, artrite reumatoide, psoríase e combinações dos mesmos.

Outra modalidade da presente invenção proporciona métodos de detecção de uma célula expressando Robo4 através de contato da célula com um anticorpo anti-Robo4 descrito aqui. Em algumas modalidades, a célula é uma célula endotelial vascular. Em algumas modalidades, a célula está em um mamífero. Em algumas modalidades, se suspeita que o mamífero tem uma doença ou distúrbio selecionado de: câncer, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado, artrite reumatoide, psoríase e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, se suspeita que o mamífero tem um câncer selecionado de: câncer de células escamosas, câncer de pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal ou de rim, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pênis, melanoma, mieloma múltiplo e Iinfoma de células B, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço e metástases associadas e combinações dos mesmos.

Breve Descrição dos Desenhos As Figuras 1A e 1B representam um alinhamento das seqüências de aminoácido das regiões variáveis das cadeias leve e pesada para vários clones anti-Robo4 da presente invenção (Figuras 1A e 1B, respectivamente). As regiões hipervariáveis (HVRs) das cadeias leve e pesada são indicadas sob as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) em caixas. Na Figura 1A, as HVRs L1, L2 e L3 de cadeia leve são as posições 24-34, 50-56 e 89-102 de Kabat, respectivamente. Na Figura 1B, as HVRs H1, H2 e H3 de cadeia pesada são as posições 26-35, 49-65 e 93-102 de Kabat, respectivamente. Os clones foram preparados através de phage display, conforme divulgado nos Exemplos e sequenciados.

As Figuras 2A e 2B representam seqüências de aminoácido das regiões variáveis das cadeias leve e pesada (Figuras 2A e 2B, respectivamente) de anticorpos maturados por afinidade selecionados de bibliotecas com HVR individualmente randomizadas. As HVRs nas Figuras 2A e 2B estão nas mesmas posições conforme representado nas Figuras 1A e 1B.

As Figuras 3A, 3B, 4A e 4B representam seqüências de fràmework de consenso humanas receptoras exemplificativas para uso na prática da presente presente invenção, com identificadores de seqüência como segue:

REGIOES DE FRAMEWORK DE CONSENSO DE CADEIA LEVE VARIAVEL(VL) MENOS HVRs DE KABAT (FIGURAS 3A E 3B)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo I de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 9, 10, 99, 100)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo I' de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 9, 101, 99, 100)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo II de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 102, 103, 104, 100)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo III de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 105, 106, 107, 100)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo IV de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 108, 109, 110, 100)

Os locais das HVRs L1, L2 e L3 de Kabat dentro das seqüências de framework são representados como caixas sombreadas. Regiões de framework de consenso de cadeia pesada variável (VH) menos

HVRs de Kabat (FIGs. 4A ε Β) frameworks 1-4 de consenso do subgrupo I de VH humana menos HVRs de Kabat (Subgrupo IA, SEQ ID NOS: 111, 112, 113, 16) e (subgrupo IB, SEQ ID NOS: 114, 115, 113, 16)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo I de VH humana menos HVRs estendidas, (subgrupo IC1 SEQ ID NOS: 114, 115, 116, 16) e (subgrupo ID, SEQ ID NOS: 114, 115, 117, 16)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo II de VH humana menos HVRs de Kabat (subgrupo IIAj SEQ ID NOS: 118, 119, 120, 16), (subgrupo IfB, SEQ ID NOS: 121,(122, 120, 16)

frameworks 1-4 de , consenso do subgrupo II de VH humana menos HVRs estendidas (subgrupo IIC1 SEQ ID NOS: 121, 122, 123, 16), (subgrupo IID1 SEQ ID NOS: 121, 122, 124, 16)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo III de VH humana menos HVRs de Kabat (subgrupo IIIA, SEQ ID NO:125, 126, 127, 16), (subgrupo IIIB, SEQ ID NOS: 128, 129, 127, 16)

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo Ill de VH humana menos HVRs estendidas (subgrupo IIIO1 SEQ ID NOS: 128, 129, 130, 16), (subgrupo IIID, SEQ ID NOS: 128, 129, 131, 16)

frameworks 1-4 receptoras 1 de VH humana menos HVRs de Kabat (Subgrupo aceitador 1A, SEQ ID NOS: 132, 126, 133, 16) e (Subgrupo aceitador 1B, SEQ ID NOS: 128, 129, 133, 16)

frameworks 1-4 receptoras 1 de VH humana menos HVRs estendidas (Subgrupo aceitador 1C, SEQ ID NOS: 128, 129, 134, 16)

frameworks 1-4 receptoras 2 de VH humana menos HVRs de Kabat (Subgrupo aceitador 2A, SEQ ID NOS: 132, 126, 135, 16) e (Subgrupo aceitador 2B, SEQ ID NOS: 128, 129, 135, 16)

frameworks 1-4 receptoras 2 de VH humana menos HVRs estendidas (Subgrupo aceitador 2C, SEQ ID NOS: 128, 129, 136, 16) e (Subgrupo aceitador 2D, SEQ ID NOS: 128, 129, 137, 16).

A Figura 5A representa a seqüência de aminoácidos de comprimento total do polipeptídeo de Robo4. Uma seqüência sinalizadora potencial é indicada pelo sublinhado tracejado. Uma porção do domínio extracelular é indicada por um sublinhado sólido. A Figura 5B representa a seqüência do fragmento de domínio extracelular de Robo4 solúvel His-marcado (SEQ ID NO: 171) usado, por exemplo, em experimentos de phage display de Fab anti-Robo4 divulgados aqui. O domínio extracelular de Robo4 foi ligado a uma marcação de histidina para facilidade de recuperação ou detecção.

A Figura 6A representa a seqüência de comprimento total da cadeia pesada do anticorpo anti-Robo4 YW71.22 (SEQ ID NO: 169). A alanina mostrada no texto em negrito e sublinhada é a posição na qual uma cisteína foi substituída para gerar o tioMAb. A Figura 6B representa a seqüência de comprimento total da cadeia leve do anticorpo anti-Robo4 YW71.22 (SEQ ID NO: 170).

A Figura 7 representa a seqüência de aminoácidos do domínio extracelular de Robo4 de murino compreendendo uma seqüência sinalizadora potencial e tendo a marcação de histidina RRA(H)5 presa na posição H232 (SEQ ID NO: 172). Um sublinhado tracejado indica a seqüência sinalizadora potencial a qual é clivada durante expressão em células de mamífero.

A Figura 8 é um gráfico de barra dos resultados de um ensaio de migração de HUVEC usando construtos de Robo4.

A Figura 9 mostra os resultados de um ensaio BiaCore indicando que o Robo4 não se liga a Slit2.

A Figura 10 mostra os resultados de um ensaio BiaCore indicando que o Robo4 interage com UNC5B.

A Figura 11 é uma fotografia de um ensaio ISH mostrando que o Robo4 é expresso em endotélio de camundongo fetal.

As Figuras 12A e 12B mostram a expressão de Robo4 no modelo de tumor de xenoenxerto em camundongo de câncer de cólon humano HM-7. As Figuras 12C e 12D mostram a expressão de Robo4 no modelo de xenoenxerto em camundongo de tumor de câncer de mama humano MDA-MB- 175.

As Figuras 13A-D mostram a expressão de Robo4 em melanoma maligno humano.

As Figuras 14A-D mostram a expressão de Robo4 em câncer de pulmão de células pequenas. As Figuras 14E-H mostram a expressão de Robo4 em câncer de cólon. As Figuras 15A-15C representam a internalização de anticorpo anti-Robo4 71.22 por células MS1 de camundongo (Figuras 15A e 15B) e a internalização de anticorpo anti-Robo4 71.22.S1.16 maturado por afinidade por células MS1 de camundongo (Figura 15C).

A Figura 16 é um gráfico de barra mostrando os resultados do ensaio de migração de célula endotelial. Anticorpo anti-Robo4 não bloqueia a migração de EC induzida por VEGF.

A Figura 17 é um gráfico de alterações no volume médio de tumor como uma função do tempo em modelos de xenoenxerto em camundongos dosados com anticorpos de controle, anti-VEGF, anti-Robo4 (YW71.22) e anti- Robo4 mais anti-VEGF. Anticorpo Robo4 nu não inibiu o crescimento de tumor nesses experimentos.

As Figuras 18A e 18B mostram os resultados de plotagens por FACS indicando que os clones 71.22.S1.16 e 71.22.S1.21 anti-Robo4 maturados por afinidade se ligam ao Robo4 endogenamente expresso sobre células HUVEC. As Figuras 18C e 18D mostram os resultados de plotagens por FACS indicando que os mesmos clones de anticorpo anti-Robo4 maturados por afinidade se ligam ao Robo4 de murino sobre células MS1 de murino endogenamente expressas. Essas plotagens também mostram que o anticorpo precursor, 71.22, também reage cruzadamente com o Robo4 humano e de murino.

As Figuras 19A e 19B mostram que o anticorpo anti-Robo4 71.22 se associa com a vasculatura após injeção em camundongos, conforme descrito no Exemplo 12.

As Figuras 20A e 20B representam os resultados de um ensaio de crescimento de glóbulo indicando que o anticorpo anti-Robo4 71.22 inibe o alongamento de tubo em HUVEC. A Figura 20A mostra que o número total e comprimento dos tubos são reduzidos quando de tratamento e HUVECs com 71.22 comparado com um anticorpo de controle irrelevante (antilosna branca, E25). Anti-VEGF foi usado como anticorpo de controle positivo. A Figura 20B mostra exemplos representativos com círculos concêntricos desenhados a 100, 200 e 300 μΐη.

Descrição Detalhada da Invenção

I. Introdução

A presente invenção proporciona composições que se ligam ao Robo4 ou uma porção do mesmo, kits e artigos de manufatura compreendendo tais composições e métodos de uso de tais composições incluindo, por exemplo, métodos para modulação de ligação de Iigante ao receptor Robo4 e para modulação de atividades biológicas/fisiológicas associadas à ligação de Iigante ao receptor Robo4. A presente invenção é baseada, em parte, sobre a identificação de uma variedade de anticorpos anti-Robo4 que se ligam ao receptor Robo4, um receptor útil como um alvo diagnóstico e terapêutico (por exemplo, formação de imagem in vivo, in vitro ou ex vivo). Os anticorpos anti- Robo4 da presente invenção podem, convenientemente, ser usados como agentes terapêuticos e diagnósticos para uso na objetivação de condições patológicas associadas à proliferação anormal ou indesejada de células endoteliais, tal como associadas à proliferação de célula endotelial (por exemplo, aumentada) dentro do tecido que experimenta o distúrbio, tumores sólidos e metástases, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal e outros tecidos transplantados, artrite reumatoide e psoríase. Os anticorpos anti-Robo4 da presente invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com: agentes adicionais (incluindo composições antineoplásicas, agentes quimioterapêuticos, agentes citotóxicos, agentes inibitórios de crescimento). Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona métodos para a identificação e/ou uso de anticorpos objetivados ao Robo4 para bloquear a função de Robo4, distribuir agentes citotóxicos à células que expressam Robo4 (por exemplo, sobre a superfície celular) e/ou distribuir agentes de formação de imagem à células expressando Robo4 sobre a superfície celular. Por exemplo, em algumas modalidades, anticorpos anti- Robo4 detectavelmente marcados podem, convenientemente, ser usados como um agente de formação de imagem para estados doentios nos quais vascularização aumentada é prejudicial (por exemplo, câncer e degeneração macular) ou para condições fisiológicas nas quais proliferação de célula endotelial, proliferação de célula vascular e/ou angiogênese é uma condição desejável (tal como, por exemplo, em cicatrização de ferimentos).

II. Definições

Conforme usado aqui, os termos a seguir são dotados dos significados atribuídos aos mesmos abaixo, a menos que de outro modo especificado.

O termo "Robo4" ou "Magic Roundabout", "Molécula 4 Células Endotelial-Específica" ou "ECSM4", conforme usado aqui, se refere a qualquer polipeptídeo de Robo4 nativo ou variante (quer nativa ou sintética) compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 5, uma variante ou uma sub-sequência da mesma ao qual o anticorpo da presente invenção se liga especificamente incluindo, por exemplo, o domínio extracelular de Robo4 ou qualquer sub-sequência do mesmo. O termo "Robo4 do tipo silvestre" se refere, em geral, a um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de uma proteína Robo4 que ocorre naturalmente. O termo "seqüência de Robo4 do tipo silvestre" se refere, em geral, a uma seqüência de aminoácidos encontrada em um Robo4 que ocorre naturalmente. O polipeptídeo de Robo4 da presente invenção é um polipeptídeo de Robo4 de mamífero tal como, sem limitação, Robo4 de ser humano, eqüino, bovino, suíno, canino, felino, de roedor. "Robo4" ou "Magic Roundabout", "Molécula 4 Células Endotelial-Específica" ou "ECSM4" também se refere a ácidos nucleicos e variantes polimórficas polipeptídicas, alelos, mutantes e homólogos inter-espécie que: (1) têm uma seqüência de aminoácidos que tem mais de cerca de 60% de identidade de seqüência de aminoácidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, de preferência 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de seqüência de aminoácidos, de preferência sobre uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais aminoácidos, a uma seqüência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico de Robo4 (para uma seqüência de polipeptídeo de Robo4 humana veja, por exemplo, Figuras 5 e 7 e SEQ ID NOs: 138 e 171; para uma seqüência de polipeptídeo de Robo4 de murino veja, por exemplo, SEQ ID NO: 172); (2) se ligam a anticorpos, por exemplo, anticorpos policlonais e/ou anticorpos monoclonais, estimulados contra um imunogênio compreendendo uma seqüência de aminoácidos de uma proteína Robo4 e variantes conservativamente modificadas dos mesmos; (3) se hibridizam especificamente, sob condições de hibridização estringente, a uma fita antissenso correspondendo a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de Robo4 e variantes conservativamente modificadas dos mesmos, (4) têm uma seqüência de ácido nucleico que tem mais de cerca de 95%, de preferência mais de cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência de nucleotídeo, de preferência sobre uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleotídeos a um ácido nucleico de Robo4 (por exemplo, um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo apresentado nas Figuras 5 e 7 e SEQ ID NOs: 138, 171 ou 172). De preferência, o ácido nucleico de Robo4 tem mais de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade à seqüência de ácido nucleico que codifica SEQ ID NOs: 138, 171 ou 172, de preferência sobre uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 ou mais nucleotídeos.

O termo "anticorpo anti-Robo4" ou "um anticorpo que se liga ao Robo4" se refere a um anticorpo que é capaz de ligação ao Robo4 com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo é útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico na objetivação de Robo4. De preferência, a extensão de ligação de um anticorpo anti-Robo4 a uma proteína de não-Robo4 não relacionada é menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo ao Robo4 conforme medido, por exemplo, através de um radioimunoensaio (RIA). Em determinadas modalidades, um anticorpo que se liga ao Robo4 tem uma constante de dissociação (Kd) de > 1 μΜ, > 100 nM, > 10 nM ou > 0,1 nM. Em determinadas modalidades, um anticorpo anti-Robo4 se liga a um epítopo de Robo4 que é conservado entre o Robo4 de diferentes espécies. Em outras modalidades, um anticorpo anti-Robo4 se liga a um epítopo de Robo4 que não é conservado entre o Robo4 de diferentes espécies.

O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos bi-específicos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo, na medida em que eles exibam a atividade biológica desejada.

Um anticorpo "isolado" é um o qual tenha sido identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais os quais interferirão com usos em pesquisa, diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos e não proteináceos. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado (1) para mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado, por exemplo, através do método de Lowry e, em algumas modalidades, para mais de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos N-terminal ou interna usando, por exemplo, um sequenciador com copo giratório ou (3) até homogeneidade através de SDS- PAGE sob condições de redução ou não-redução usando, por exemplo, coloração com prata ou azul Coomassie. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Comumente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

"Anticorpos nativos" são usualmente glicoproteína heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto que o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem, regularmente espaçadas, ligações em ponte de dissulfeto intercadeia. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (VH), seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácido em particular formem uma interface entre os domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve.

A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo se refere aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Esses domínios são, geralmente, as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação de antígeno.

O termo "variável" se refere ao fato de que determinadas porções do domínio variável diferem extensivamente quanto à seqüência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo em particular por seu antígeno em particular. Contudo, a variabilidade não está uniformemente distribuída por todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada nos três segmentos denominados regiões hipervariáveis (HVRs) nos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas as regiões de framework (FR). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas compreende, cada um, quatro regiões FR, adotando grandemente uma configuração de beta-folha, conectada por três HVRs, as quais formam Ioops de conexão e, em alguns casos, formam parte da estrutura de beta-folha. As HVRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas regiões de FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno dos anticorpos (veja Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetuadoras, tal como participação do anticorpo em toxicidade celular anticorpo-dependente.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e Iambda (λ), baseado nas seqüências de aminoácido de seus domínios constantes.

Dependendo das seqüências de aminoácido dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA1 IgD1 IgE1 IgG e IgM e vários desses podem ser ainda divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi1 IgG2, lgG3, IgG4l IgAi e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas de modo geral, por exemplo, em Abbas et dl., Cellulsr snd Mol. Immunology, 4a ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Um anticorpo pode ser parte de uma molécula de fusão maior, formada através de associação covalente ou não covalente do anticorpo com uma ou mais de outras proteínas ou peptídeos.

Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados aqui permutavelmente para se referir a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, não fragmentos de anticorpo conforme definido abaixo. Os termos se referem, particularmente, a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm uma região Fc.

Um "anticorpo nu", para as finalidades aqui, é um anticorpo que não é conjugado a uma porção tóxica ou radio-ma reação.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência compreendendo a região de ligação a antígeno do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares, moléculas de anticorpo com uma única cadeia; e anticorpos multi-específicos formados de fragmentos de anticorpo.

Digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação de antígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. Tratamento com pepsina rende um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação de antígeno e ainda é capaz de ligação cruzada com o antígeno.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo o qual contém um sítio de ligação de antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie Fv com duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação não covalente hermética. Em uma espécie Fv com uma única cadeia (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem ser ligados de forma covalente através de um Iigante peptídico flexível, de modo que as cadeias leve e pesada podem se associar em uma estrutura "dimérica" análoga àquela em uma espécie Fv com duas cadeias. É nessa configuração que as três HVRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis HVRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar a antígeno, embora com uma afinidade menor do que o sítio de ligação todo.

O fragmento Fab contém os domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos na terminação carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab-SH é a designação aqui para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes trazem um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' os quais têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos.

Fragmentos de anticorpo "Fv com uma única cadeia" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo de scFv ainda compreende um Iigante polipeptídico entre os domínios VH e VL1 o que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno.

Para uma revisão de scFv veja, por exemplo, Pluckthün em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-'Verlag1 New York, 1994), páginas 269-315.

O termo "diacorpos" se refere a fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, fragmentos os quais compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Usando um Iigante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos podem ser bivalentes ou bi-específicos. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, no EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et ai, Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto quanto à possíveis mutações, por exemplo, mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em quantidades mínimas. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos. Em determinadas modalidades, tal anticorpo monoclonal inclui, tipicamente, um anticorpo compreendendo umg seqüência polipeptídica que se liga a um alvo, em que a seqüência polipeptídica de ligação ao alvo foi obtida através de um processo que inclui a seleção de uma única seqüência polipeptídica de ligação ao alvo de uma pluralidade de seqüências polipeptídicas. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone de uma pluralidade de clones, tal como um reservatório de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve ser entendido que uma seqüência de ligação ao alvo selecionada pode ser ainda alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade pelo alvo, para humanizar a seqüência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção em cultura de célula, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multi-específico, etc. e que um anticorpo compreendendo a seqüência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal da presente invenção. Em contraste a preparados de anticorpo policlonal os quais, tipicamente, incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de um preparado de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre um antígeno. Além de sua especificidade, preparados de anticorpo monoclonal são vantajosos pelo fato de que eles não são, tipicamente, contaminados por outras imunoglobulinas.

O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser construído como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos através de uma variedade de técnicas incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohier e Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et a/., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et ai, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al. em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente US No. 4.816.567), tecnologias de phage display (veja, por exemplo, Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et ai, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et ai, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et ai, J. Immunoi Methods 284(1-2): 119 - 132 (2004) e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhantes aos humanos em animais que têm partes ou todos os Ioci de imunoglobulina humana ou genes que codificam seqüências de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et ai, PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et ai, Year in Immunol. 7: 33 (1993); Patentes US Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et ai, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et ai, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et ai, Na ture Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Os anticorpos monoclonais aqui incluem, especificamente, anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga à seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico a ou homólogo à seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, na medida em que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente US No. 4.816.567; e Morrison et ai, PNAS USA 81: 6851 -6855 (1984)). Anticorpos quiméricos incluem anticorpos PRIMATIZED®, em que a região de ligação de antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, através de imunização de macacos com o antígeno de interesse.

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm a seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Em sua maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de framework (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não- humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variaveis, nos quais todos ou substancialmente todos os Ioops hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes veja Jones et ai, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct Bioi 2: 593-596 (1992). Veja também os seguintes artigos de revisão e referências citadas nos mesmos: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunoi 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soe. Transaotions 23: 1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994). Um "anticorpo humano" é um o qual possui uma seqüência de aminoácidos a qual corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou tenha sido feita usando qualquer uma das técnicas para fazer anticorpos humanos, conforme divulgado aqui. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação a antígeno não-humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando vários métodos conhecidos na técnica, incluindo bibliotecas de phage display. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Também disponíveis para o preparo de anticorpos monoclonais humanos são métodos descritos em Cole et al, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Veja também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Anticorpos humanos podem ser preparados através de administração do antígeno a um animal transgênico que tenha sido modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um estímulo antigênico, mas cujos Ioci endógenos tenham sido inativados, por exemplo, xeno-camundongos imunizados (veja, por exemplo, Patentes US Nos. 6.075.181 e 6.150.584 referente à tecnologia XENOMOUSETM). Veja também, por exemplo, Li et al., PNAS USA, 103: 3557-3562 (2006) com relação a anticorpos humanos gerados via uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.

Um "antígeno" é um antígeno predeterminado (por exemplo, uma seqüência de Robo4) ao qual um anticorpo pode se ligar seletivamente. O antígeno alvo pode ser um polipeptídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídio, hapteno ou outro composto sintético ou que ocorre naturalmente. De preferência, o antígeno alvo é um polipeptídeo.

Uma "framework humana receptora", para as finalidades aqui, é uma framework compreendendo a seqüência de aminoácidos dç uma framework de VL ou VH derivada de uma framework de imunoglobulina humana ou de uma framework de consenso humana. Uma framework humana receptora "derivada de" uma framework de imunoglobulina humana ou framework de consenso humana pode compreender a mesma seqüência de aminoácidos dessa ou pode conter alterações de seqüência de aminoácidos pré-existentes. Em algumas modalidades, o número de alterações de aminoácido pré-existentes são 10 ou menos 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Onde alterações de aminoácido pré-existentes estão presentes em uma VH, de preferência, essas alterações ocorrem em apenas três, duas ou mais das posições 71 Η, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoácido nessas posições podem ser 71 A, 73T e/ou 78A. Em uma modalidade, a framework humana receptora de VL é idêntica, quanto à seqüência, à seqüência de framework de imunoglobulina humana de VL ou seqüência de framework de consenso humana. Onde alterações de aminoácido pré-existentes estão presentes em uma VH, de preferência, essas alterações são apenas em três, duas ou mais das posições 71 Η, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoácido nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Em uma modalidade, a framework humana receptora de VL é idêntica, quanto à seqüência, à seqüência de framework de imunoglobulina humana de VL ou seqüência de framework de consenso humana.

Uma "framework de consenso humana" é uma framework a qual representa o resíduo de aminoácido que ocorre mais comumente em uma seleção de seqüências de framework de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de seqüências de VH ou VL de imunoglobulina humana é de um subgrupo de seqüências com domínio variável. Geralmente, o subgrupo de seqüências é um subgrupo conforme em Kabat et ai. Em uma modalidade, para a VL, o subgrupo é;o subgrupo kappa I, conforme em Kabat et ai. Em uma modalidade, para a VH1 o subgrupo é o subgrupo Ill conforme em Kabat et ai.

Uma "framework de consenso do subgrupo III de VH" compreende a seqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácido no subgrupo III de cadeia pesada variável de Kabat et al.. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácidos da framework de consenso do subgrupo Ill de VH compreende pelo menos uma porção ou todas de cada uma das seguintes seqüências: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 128)-H1- WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 129)-H2- RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 131)-H3- WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). Em outra modalidade, a seqüência de aminoácidos da framework de consenso do subgrupo Ill de VH compreende pelo menos uma porção ou todas de cada uma das seguintes seqüências: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 128)-H1- WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 129)-H2- RFTISADTSKNTAYLQMNSLRLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 137)-H3- WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16).

Uma "framework de consenso do subgrupo I de VL" compreende a seqüência de consenso obtida das seqüências de aminoácido no subgrupo I de cadeia leve kappa variável de Kabat et al.. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácidos de framework de consenso do subgrupo I de VH compreende pelo menos uma porção ou todas as seguintes seqüências: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 9)-L1 -WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 10)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 99)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 100).

Uma "framework humana não modificada" é uma framework humana a qual tem a mesma seqüência de aminoácidos que a framework humana receptora, por exemplo, carecendo de substituição(ões) de aminoácido humano para não-humano na framework humana receptora.

O termo "região hipervariável", ΉVR" ou "HV", quando usado aqui, se refere às regiões de um domínio variável de anticorpo as quais são hipervariáveis quanto à seqüência e/ou formam loops estruturalmente definidos. Geralmente, anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Uma série de delineamentos de região hipervariável está em uso e são abrangidos aqui. As Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) de Kabat são HVRs que são baseadas em variabilidade de seqüência e são as mais comumente usadas (Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda1 MD. (1991)). Chothia se refere, antes, à localização dos loops estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. BioL 196: 901-917 (1987)). As regiões hipervariáveis AbM representam um compromisso entre as CDRs de Kabat e os loops estruturais de Chothia e são usadas pelo software de modelamento de anticorpo Oxford Molecular's AbM. As regiões hipervariáveis de "contato" são baseadas em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas regiões hipervariáveis são mencionados abaixo.

Loop Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração de Kabat) H1 H31-H65 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 A posição/limite de aminoácido que delineia uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica (conforme descrito abaixo). Algumas posições dentro de um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas pelo fato de que essas posições podem ser consideradas como estando dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios, o mesmo tempo em que são consideradas como estando fora de uma região hipervariável sob um conjunto diferente de critérios. Uma ou mais dessas posições podem também ser encontradas em regiões hipervariáveis estendidas. Em uma modalidade, essas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais das posições 26-30, 26-35 33-35B, 47-49, 49-65, 57-65, 95-102, 93, 94 e 102 em um domínio variável de cadeia pesada. Em uma modalidade, essas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais das posições 24-29, 24-34, 35-36, 46-49, 50-56, 89-97, 56 e 97 em um domínio variável de cadeia leve.

Conforme usado aqui, as HVRs da cadeia leve são referidas permutavelmente como HVR-L1, -L2 ou -L3 ou HVR1-LC, HVR2-LC ou HVR3- LC ou outra designação similar que indica que uma HVR de cadeia leve é mencionada. Conforme usado aqui, as HVRs da cadeia pesada são referidas permutavelmente como HVR-H1, -H2 ou -H3 ou HVR1-HC, HVR2-HC ou HVR3-HC ou outra designação similar que indica que uma HVR de cadeia pesada é mencionada.

Regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) na VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos de domínio variável são numerados de acordo com Kabat et ai, supra, para cada uma dessas definições. ?·

Uma "região hipervariável alterada", para as finalidades aqui, é uma região hipervariável compreendendo uma ou mais (por exemplo, uma a cerca de 16) substituições de aminoácido na mesma.

Uma "região hipervariável não-modificada", para as finalidades aqui, é uma região hipervariável tendo a mesma seqüência de aminoácidos conforme um anticorpo não-humano do qual ela foi derivada, isto é, uma a qual carece de uma ou mais substituições de aminoácido na mesma.

Resíduos de "framework" ou "FR" são aqueles outros resíduos de domínio variável que não os resíduos da região hipervariável, conforme aqui definido. Conforme usado aqui, LC-FR1-4 ou FR1-4-LC ou designação similar é usada permutavelmente e se refere às regiões de framework da cadeia leve. Conforme usado aqui, HC-FR1-4 ou FR1-4-HC ou designação similar é usada permutavelmente e se refere à região de framework da cadeia pesada.

Um anticorpo "maturado por afinidade" é um com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs do mesmo as quais resultam em um aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo pelo antígeno, comparado com um anticorpo precursor o qual não possui essa(s) alteração(ões). Anticorpos maturados por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares pelo antígeno alvo. Anticorpos maturados por afinidade são produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade através de embaralhamento dos domínios VH e VL. Mutagênese aleatória de resíduos de CDR e/ou framework é descrita por: Barbas et al., PNAS USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Moi Biol. 226: 889-896 (1992).

Um "anticorpo de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um o qual inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno o qual se liga. Por exemplo, anticorpos de bloqueio ou anticorpos anti-Robo4 antagonistas inibem, substancial ou completamente, a angiogênese através de ligação ao Robo4.

O termo "numeração de resíduo de domínio variável conforme em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido conforme em Kabat" e variações dos mesmos se refere ao sistema de numeração usado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest1 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando esse sistema de numeração, a seqüência de aminoácidos linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais correspondendo a uma redução de ou inserção em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc., de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo através de alinhamento em regiões de homologia da seqüência do anticorpo com uma seqüência numerada de Kabat "padrão".

A frase "substancialmente similar" ou "substancialmente o mesmo", conforme usado aqui, denota um grau suficientemente alto de similaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da presente invenção e o outro associado com um anticorpo de referência/comparativo), de modo que aqueles habilitados na técnica considerarão a diferença entre os dois valores como tendo pouca ou nenhuma significância biológica dentro do contexto da característica biológica medida pelos referidos valores (por exemplo, valores de Kd). A diferença entre os referidos dois valores é, de preferência, de menos do que cerca de 50%, de preferência menos do que cerca de 40%, de preferência menos do que cerca í de 30%, de preferência menos do que cerca de 20%, de preferência menos do que cerca de 10% como uma função do valor para o anticorpo de referência/comparativo.

"Afinidade de ligação" se refere, em geral, à resistência da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que de outro modo indicado, conforme usado aqui, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca a qual reflete uma interação a 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode, em geral, ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos aqui. Anticorpos com baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a dissociar prontamente, enquanto que anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados mais tempo. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para fins da presente invenção. Modalidades ilustrativas específicas são descritas a seguir.

Em uma modalidade, a "Kd," "KD," ou "valor de Kd" é medido através de um ensaio de ligação a antígeno rádio-marcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno, conforme descrito pelo ensaio a seguir, que mede a afinidade de ligação em solução de Fabs para antígeno através de equilíbrio do Fab com uma concentração mínima de antígeno ( l)-marcado na presença de uma série de titulações de antígeno não marcado, então, captura do antígeno ligado com uma lâmina revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et ai, (1999) J. Mol Biol 293: 865-881). Para estabelecer condições para o ensaio, lâminas de microtitulação (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio a 50 mM (pH de 9,6) e subseqüentemente bloqueadas com albumina de soro bovino a 2% (peso/v) em PBS durante duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma lâmina não adsorvente (Nunc #269620), [125l]-antígeno 100 pM ou 26 pM é misturado com diluições seriais de um Fab de interesse (por exemplo, Fab-12, conforme descrito em Presta et a/., Câncer Res. 57: 4593- 4599 (1997)). O Fab de interesse é, então, incubado durante a noite; contudo, a incubação pode continuar durante um período mais longo (por exemplo, 65 horas) para assegurar que equilíbrio é atingido. Após o que, as misturas são transferidas para a lâmina de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, durante uma hora). A solução é, então, removida e a lâmina lavada oito vezes com Tween® 20 a 0,1% em PBS. Quando as lâminas secaram, 150 ul/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard) são adicionados e as lâminas são contadas sobre um contador gama Topcount (Packard) durante 10 minutos. As concentrações de cada Fab que proporcionam menos do que ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva. De acordo com outra modalidade, a Kd ou valor de Kd é medido usando ensaios de ressonância de plasmônio em superfície usando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com lascas CM% com antígeno imobilizado a ~10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas biosensoras de dextrana carbóximetilada (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com hidrocloreto de A/-etil-/V- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e /V-hidróxi-succinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com acetato de sódio a 10 mM, pH de 4,8 em 5 ug/ml (~0,2 uM) antes de injeção em uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, etanolamina a 1 M é injetada para bloquear os grupos não reagidos. Para medições de cinética, diluições seriais de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com Tween® 20 a 0,05% (PBST) a 25°C em uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 pL/minuto. Os coeficientes de associação (kon) e coeficientes de dissociação (k0ff) são calculados usando um modelo de ligação de Langmuir simples de um-a-um (BIAcore Evaluation Software, versão 3.2) adaptando simultaneamente o sensorgrama de associação e dissociação. A constante de dissociação em equilíbrio (Kd) é calculada como a proporção k0ff/k0n Veja, por exemplo, Chen et ai, J. Mol Biol 293: 865-881 (1999). Se o coeficiente-on excede a 106 M-1 S-1 através do ensaio de ressonância de plasmônio em superfície acima, então, o coeficiente-on pode ser determinado usando uma técnica de anelamento fluorescente que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passe de banda de 16 nm) a 25°C de um anticorpo antiantígeno a 20 nM (forma Fab) em PBS, pH de 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno, conforme medido em um espectrômetro, tal como um espectrômetro equipado com interrupção de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco™ série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho agitado.

A frase "substancialmente reduzida" ou "substancialmente diferente", conforme usado aqui, denota um grau suficientemente alto de diferença entre dois valores numéricos (geralmente, um associado a um anticorpo da presente invenção e o outro associado a um anticorpo de referência/comparativo), de modo que aqueles habilitados na técnica considerarão a diferença entre os dois valores como sendo de significância estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelos referidos valores (por exemplo, valores de Kd, resposta HAMA). A diferença entre os referidos dois valores é, de preferência, maior do que cerca de 10%, de preferência maior do que cerca de 20%, de preferência maior do que cerca de 30%, de preferência maior do que cerca de 40%, de preferência maior do que cerca de 50% como uma função do valor para o anticorpo de referência/comparativo.

"Identidade percentual (%) de seqüência de aminoácidos", com relação a uma seqüência peptídica ou polipeptídica, é definida como o percentual de resíduos de aminoácido em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na seqüência peptídica ou polipeptídica especifica, após alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para obter a identidade percentual máxima de seqüência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüência. Alinhamento, para fins de determinação da identidade percentual de seqüência de aminoácidos, pode ser obtido de várias formas que estão dentro da capacidade na técnica, por exemplo, usando um software de computador publicamente disponível, tal como o software BU\ST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR™). Aqueles habilitados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter alinhamento máximo sobre o comprimento total das seqüências que estão sendo comparadas. Para as finalidades aqui, contudo, os valores de identidade % de seqüência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2 foi autorizado pela Genentech, Inc. E o código fonte mostrado foi depositado com a documentação do usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde ele está registrado sob o Registro de Copyright U.S. No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, de preferência UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de seqüência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para comparações da seqüência de aminoácidos, a identidade % de seqüência de aminoácidos de uma determinada seqüência de aminoácidos A com ou contra uma determinada seqüência de aminoácidos B (a qual pode, alternativamente, ser escrito como uma determinada seqüência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada identidade % de seqüência de aminoácidos com ou contra uma determinada seqüência de aminoácidos B) é calculada como segue:

10O vezes a fração X/Y

onde X é o número de resíduos de aminoácido classificado como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de seqüência ALIGN-2 nesse alinhamento do programa de A e B e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será apreciado que, onde o comprimento da seqüência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da seqüência de aminoácidos B, a identidade % de seqüência de aminoácidos de A para B não será igual à identidade % de seqüência de aminoácidos de B para A.

A menos que estabelecido especificamente de outro modo, todos os valores de identidade % de seqüência de aminoácidos são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente precedente usando o programa de computador ALIGN-2.

O termo "vetor", conforme usado aqui, se destina a se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela tenha sido ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", o qual se refere a um Ioop de DNA fita dupla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor de fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores não-epissomais de mamífero) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando de introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores recombinantes"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão, freqüentemente, na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados permutavelmente, uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor.

"Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", conforme usado permutavelmente aqui, se referem a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser deóxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas e/ou seus análogos ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero através de DNA ou RNA polimerase ou através de uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos não modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, modificação na estrutura do nucleotídeo pode ser conferida antes ou após montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeo pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após síntese, tal como através de conjugação com uma marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo porções pendentes tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinalizadores, poli-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquelas com queladores (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Ainda, qualquer um dos grupos hidroxila comumente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfato, grupos fosfonato, protegido por grupos de proteção padrões ou ativado para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais ou pode ser conjugado a suportes sólidos ou semi-sólidos. A OH 5' e 3' terminal pode ser fosforilada ou substituída por aminas ou porções de capping orgânicas de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas também podem ser derivatizadas em grupos de proteção padrões. Polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou deóxiribose que são geralmente conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-, 2-0- alil, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares a- anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásico, tal como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídos por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, modalidades em que o fosfato é substituído por P(0)S("tioato'!), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), nos quais cada R ou R' é, independentemente, H ou alquila não substituída (1-20 C.) opcionalmente contendo uma ligação de éter (-0-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente se aplica a todos os polinucleotídeos mencionados aqui, incluindo RNA e DNA.

"Oligonucleotídeo", conforme usado aqui, se refere, em geral, a polinucleotídeos curtos, geralmente fita simples, geralmente sintéticos que têm, em geral, mas não necessariamente, menos de cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é igual e totalmente aplicável a oligonucleotídeos.

Um "distúrbio" ou "doença" é qualquer condição que se beneficiaria de tratamento com uma substância/molécula ou método da presente invenção. Isso inclui distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas as quais predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não Iimitativos de distúrbios a serem tratados aqui incluem tumores malignos e benignos; malignidades Iinfoides e não- leucêmicas; distúrbios neuronais, gliais, astrocíticos, hipotalâmicos e outros glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, imunológicos e outros relacionados à angiogênese.

Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio proliferativo" se referem a distúrbios que estão associados a algum grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é câncer. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é angiogênese.

"Tumor", conforme usado aqui, se refere a todo crescimento e proliferação de célula neoplásica, quer maligna ou benigna, e todos os tecidos e células pré-cancerígenas e cancerígenas. Os termos "câncer", "cancerígeno", "distúrbio proliferativo celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos, conforme referido aqui.:

Os termos "câncer" e "cancerígeno" se refere a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é, tipicamente, caracterizada por proliferação celular desregulada. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastrintestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer renal ou de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não-Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de pequenas células não-clivadas de alto grau; NHL de grau denso; linfoma de mastócitos; linfoma relacionados à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio Iinfoproliferativo pós- transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada à facomatoses, edema (tal como aquele associado a tumores cerebrais) e síndrome de Meigs.

O termo "composição antineoplásica" ou "composição anticâncer" ou "agente anticâncer" se refere a uma composição útil no tratamento de câncer compreendendo pelo menos um agente terapêutico ativo, por exemplo, "agente anticâncer". Exemplos de agentes terapêuticos (agentes anticâncer) incluem, mas não estão limitados a, agentes quimioterapêuticos, agentes. inibitórios de crescimento, agentes citotóxicos, agentes usados em terapia de radiação, agentes antiangiogênese, agentes apoptóticos, agentes antitubulina e outros agentes para tratar câncer, tais como anticorpos anti-HER-2, anticorpos anti-CD20, um antagonista do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, um inibidor de quínase de tirosina), inibidor de HER1/EGFR (por exemplo, erlotinib (Tarceva™), inibidores de fator de crescimento derivado de plaqueta (por exemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesilato)), um inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxib), interferons, citocinas, antagonistas (por exemplo, anticorpos de neutralização) que se ligam a um ou mais dos seguintes alvos ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BIyS, APRIL, BCMA VEGF ou receptor(es) de VEGF1 TRAIL/Apo2 e outros agentes químicos bioativos e orgânicos, etc. Combinações dos mesmos também são incluídas na presente invenção.

Um "fator ou agente angiogênico" é um fator de crescimento o qual estimula o desenvolvimento de vasos sangüíneos, por exemplo, promove a angiogênese, crescimento de célula endotelial, estabilidade dos vasos sangüíneos e/ou vasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos incluem, mas não estão limitados a, VEGF e membros da família do VEGF, PIGF1 família PDGF, família do fator de crescimento de fibroblasto (FGFs), ligantes TIE (Angiopoietinas), efrinas, Del-1, fatores de crescimento de fibroblasto: ácidos (aFGF) e básicos (bFGF), Folistatina1 fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de crescimento (HGF) /fator de dispersão (SF) de hepatócito, lnterleucina-8 (IL-8), Leptina1 Midcina, fator de crescimento placental, fator de crescimento de célula endotelial derivada de plaqueta (PD-ECGF)1 fator de crescimento derivado de plaqueta, especialmente PDGF-BB ou PDGFR-beta, Pleiotrofina (PTN), Progranulina1 Proliferina1 fator-alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa), fator-beta de crescimento de transformação (TGF-beta), fator-alfa de necrose de tumor (TNF-alfa), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)/fator de permeabilidade vascular (VPF)1 etc. Ele também incluirá fatores que aceleram a cicatrização de ferimentos, tais como hormônio do crescimento, fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-I), VIGF1 fator de crescimento epidérmico (EGF)1 CTGF e membros de sua família e TGF-alfa e TGF-beta.

Veja, por exemplo, Klagsbrun e D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et ai, Oncogene, 22: 6549 - 6556 (2003) (por exemplo, a Tabela 1, que lista fatores angiogênicos conhecidos); e Sato Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003).

O ter mo "VEGF", conforme usado aqui, se refere ao fator de crescimento de célula endotelial vascular humano de 165 aminoácidos e fatores de crescimento de célula endotelial vascular humana de 121, 189 e 206 aminoácidos relacionados, conforme descrito por Leung et al., Science, 246: 1306 (1989) e Houck et ai, Moi Endocrin., 5: 1806 (1991), junto com as formas processadas e alélicas que ocorrem naturalmente dos mesmos. O termo "VEGF" também se refere a VEGFs de espécies não-humanas, tais como camundongo, rato ou primata. Algumas vezes, o VEGF de uma espécie específica é indicado por termos tais como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF de murino, etc. O termo "VEGF" é também usado para se referir à formar truncadas do polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento de célula endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. Referência a qualquer uma de tais formas de VEGF pode ser identificada no presente, por exemplo, por "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" ou "VEGF16Sn. As posições de aminoácido para um VEGF nativo "truncado" são numeradas conforme indicado na seqüência do VEGF nativo. Por exemplo, a posição de aminoácido 17 (metionina) no VEGF nativo truncado é também a posição 17 (metionina) no VEGF nativo. O VEGF nativo truncado tem afinidade de ligação pelos receptores KDR e Flt-1 comparável ao VEGF nativo. De acordo com uma modalidade preferida, o VEGF é um VEGF humano.

Um "antagonista de VEGF" se refere a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, eliminar, reduzir ou interferir com as atividades do VEGF, incluindo sua ligação ao VEGF ou um ou mais receptores de VEGF ou o ácido nucleico que codifica os mesmos. De preferência, o antagonista de VEGF se liga ao VEGF ou um receptor de VEGF. Antagonistas de VEGF incluem anticorpos anti-VEGF e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, polipeptídeos que se ligam ao VEGF e receptores de VEGF e bloqueiam a interação ligante-receptor (por exemplo, imunoadesinas, pepticorpos), anticorpos antirreceptor de VEGF e antagonistas do receptor de VEGF, tais como inibidores de pequena molécula das quínases de tirosina de VEGF, aptâmeros que se ligam ao VEGF e ácidos nucleicos que hibridizam, sob condições estringentes, à seqüências de ácido nucleico que codificam o VEGF ou receptor de VEGF (por exemplo, RNAi). De acordo com uma modalidade preferida, o antagonista de VEGF se liga ao VEGF e inibe a proliferação de células endoteliais VEGF-induzida in vitro. De acordo com uma modalidade preferida, o antagonista de VEGF se liga ao VEGF ou um receptor de VEGF com maior afinidade do que um não-VEGF ou não-receptor de VEGF. De acordo com uma modalidade preferida, o antagonista de VEGF se liga ao VEGF ou um receptor de VEGF com uma Kd de entre 1 uM e 1 pM. De acordo com outra modalidade preferida, o antagonista de VEGF se liga ao VEGF ou um receptor de VEGF entre 500 nM e 1 pM.

De acordo com uma modalidade preferida, o antagonista de VEGF é selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo tal como um anticorpo, um pepticorpo, uma imunoadesina, uma pequena molécula ou um aptâmero. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo anti- VEGF, tal como o anticorpo AVASTIN® ou um anticorpo antirreceptor de VEGF, tal como um anticorpo anti-VEGFR2 ou um anti-VEGFR3. Outros exemplos de antagonistas de VEGF incluem: VEGF-Trap1 Mucagen1 PTK787, SU11248, AG- 013736, Bay 439006 (sorafenib), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 e KRN-633.

Um "anticorpo anti-VEGF" é um anticorpo que se liga ao VEGF com afinidade e especificidade suficientes. De preferência, o anticorpo anti- VEGF da presente invenção pode ser usado como um agente terapêutico na objetivação e interferência com doenças ou condições em que a atividade do VEGF está envolvida. Um anticorpo anti-VEGF usualmente não se ligará a outros homólogos de VEGF, tais como VEGF-B ou VEGF-C, nem outros fatores de crescimento, tais como PIGF, PDGF ou bFGF. Um anticorpo anti- VEGF preferido é um anticorpo monoclonal o qual se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et al. (1997) Câncer Res. 57: 4593-4599 incluindo, mas não limitado a, o anticorpo conhecido como bevacizumab (BV; Avastin®). De acordo com outra modalidade, anticorpos anti-VEGF que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, os anticorpos divulgados no WO 2005/012359. De acordo com uma modalidade, o anticorpo anti-VEGF compreende a região variável de cadeia pesada e leve de qualquer um dos anticorpos divulgados nas Figuras 24, 25, 26, 27 e 29 do WO 2005/012359 (por exemplo, G6, G6-23, G6-31, G6- 23.1, G6-23.2, B20, B20-4 e B20.4.1). Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-VEGF conhecido como ranibizumab é o antagonista de VEGF administrado para doença ocular, tal como neuropatia diabética e AMD.

O anticorpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", também conhecido como "rhuMAb VEGF" ou "Avastin®", é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta et al. (1997) Câncer Res. 57: 4593- 4599. Ele compreende as regiões de framework de IgGI humana com mutação e regiões de determinação de complementaridade de ligação a antígeno do anticorpo monoclonal anti-hVEGF A.4.6.1 de murino que bloqueia a ligação de VEGF humano a seus receptores. Aproximadamente 93% da seqüência de aminoácidos do Bevacizumab1 incluindo a maioria das regiões de framework, são derivados de IgGI humana e cerca de 7% da seqüência são derivados do anticorpo A4.6.1 de murino. O Bevacizumab tem uma massa molecular de cerca de 149.000 daltons e é glicosilado. Outros anticorpos anti-VEGF incluem os anticorpos descritos na Patente dos Estados Unidos No. 6884879 e WO 2005/044853.

O anticorpo anti-VEGF Ranibizumab ou LUCENTIS® ou rhuFab V2 é um fragmento Fab anti-VEGF humanizado, maturado por afinidade. O Ranibizumab é produzido através de métodos de tecnologia recombinante padrões em um vetor de expressão de Escherichia coli e fermentação bacteriana. O Ranibizumab não é glicosilado e tem uma massa molecular de ~48.000 daltons. Veja W098/45331 e US20030190317.

Desregulação de angiogênese pode levar à angiogênese anormal, isto é, quando crescimento excessivo ou inapropriado de novos vasos sangüíneos (por exemplo, a localização, momento ou inicio da angiogênese sendo indesejados de um ponto de vista médico) em um estado doentio ou de modo que ela causa um estado doentio. Angiogênese excessiva, inapropriada ou descontrolada ocorre quando há o crescimento de um novo vaso sangüíneo que contribui para a piora do estado doentio ou causa um estado doentio. Os novos vasos sangüíneos podem alimentar os tecidos doentes, destruir tecidos normais e, no caso de câncer, os novos vasos sangüíneos podem permitir que as células tumorais escapem para a circulação e se desenvolvam em outros órgãos (metástases de tumor). Estados doentios envolvendo angiogênese anormal incluem condições não-neoplásicas e neoplásicas incluindo, por exemplo, câncer, especialmente tumores sólidos vascularizados e tumores metastáticos (incluindo câncer de cólon, câncer de mama, câncer de pulmão (especialmente câncer de pulmão de células pequenas) ou câncer de próstata), hipertrofia anormal ou indesejada, artrite, artrite reumatoide (RA)1 doença inflamatória do intestino ou IBD (doença de Crohn e colite ulcerativa), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, arterioesclerose, placas ateroscleróticas, retinopatias diabéticas e outras proliferativas, incluindo retinopatia de prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração macular relacionada à idade, edema macular diabético, neovascularização corneal, neovascularização de enxerto corneal, rejeição a enxerto corneal, neovascularização retinal/coroidal, neovascularização da superfície anterior da íris (rubeose), doença neovascular ocular, restenose vascular, má formações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tiroide (incluindo doença de Grave), inflamação crônica, inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda/ARDS, sepsia, hipertensão pulmonar primaria, efusões pulmonares malignas, edema cerebral (por exemplo, associado a derrame agudo/lesão na cabeça/trauma), inflamação sinovial, miosite ossificante, formação óssea hipertrófica, osteoartrite (OA), ascite resistente, doença de ovário policístico, endometriose, 3o espaçamento de doenças de fluido (pancreatite, síndrome de compartimento, queimaduras, doença do intestino), fibrose uterina, parto prematuro, inflamação crônica tal como IBD, rejeição a aloenxerto renal, doença inflamatória do intestino, síndrome nefrótica, crescimento de massa tecidual indesejada ou anormal (não-cancerígena), articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição do crescimento de pêlos, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogênico, fibroplasias retrolentais, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovite, dermatite, pré-eclampsia, ascite, efusão pericárdica (tal como aquela associada à pericardite) e efusão pleural.

Conforme usado aqui, "tratamento" se refere à intervenção clínica . em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula que está sendo tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejáveis de tratamento incluem prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, alívio ou melhora do estado doentio e remissão ou prognóstico aperfeiçoado. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio.

Uma "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, nas dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico ou profilático desejado.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substância/molécula da presente invenção, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista, de estimular uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância/molécula, agonista ou antagonista são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um anticorpo, polipeptídeo ou antagonista da presente invenção eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um mamífero (ou paciente). No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho ou peso do tumor; inibir (isto é, diminuir até algum grau e, de preferência, cessar) a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir até algum grau e, de preferência, cessar) a metástase de tumor; inibir, até algum grau, o crescimento do tumor; e/ou aliviar, até algum grau, um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Até o ponto em que o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou morte de células cancerígenas existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade inibitória de crescimento. Em outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que prolonga a sobrevivência de um paciente. Em outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que melhora a sobrevivência sem progressão de um paciente.

Uma "quantidade profilaticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes de ou em um estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz é menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

O termo "agente citotóxico", conforme usado aqui, se refere a uma substância que inibe ou impede a função e células e/ou causa destruição de células. O termo se destina a incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, 131 ,125, Y90) Re186 Re188 Srr,153 Bj212 p32 e jsótopos radÍ0atiV0S de Lu), agentes quimioterapêuticos, por exemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcalóides (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorubicina, melphalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes de intercalação, enzimas e fragmentos das mesmas, tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas, tais como toxinas de pequena molécula ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, planta ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos e os vários agentes antitumor ou anticâncer divulgados abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição de células tumorais. ; Um "agente quimioterapêutico" é um composto útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes de alquilação, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofillotoxina; ácido podofilínico; teniposídeo; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiína; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, cholofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto de oxido de mecloretamina, melphalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enodiína (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamai I e caliqueamicina ômegaM (veja, por exemplo, Agnew1 Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de cromoproteína enodiína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deóxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C1 ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideóxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico, tais como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidróxiureia; lentinana; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristòl-Myers Squibb Oncology1 Princeton, N.J.), ABRAXANE™ Cremophor- free, "formulação de nanopartícula albumina-manipulada de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners1 Schaumberg1 Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer1 Antony1 França); clorambucila; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina;

etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tal como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima, tal como CHOP1 uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona e FOLFOX1 uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado com 5-FU e leucovovina. Agentes quimioterapêuticos adicionais incluem os agentes citotóxicos úteis como conjugados de anticorpo/fármaco, tais como maitansinoides (DM1, por exemplo) e as auristatinas MMAE e MMAF1 por exemplo.

"Agentes quimioterapêuticos" também incluem "agentes anti- hormonais" que atuam para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento de câncer e, freqüentemente, estão na forma de um tratamento sistêmico ou para o corpo todo. Eles podem ser hormônios em si. Exemplos incluem antiestrogênios e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs) incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidróxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; antiprogesteronas; sub-reguladores do receptor de estrogênio (ERDs); agentes que funcionam para suprimir ou paralisar os ovários, por exemplo, agonistas do: hormônio de liberação de hormônio de luteinização (LHRH), tais como acetato de leuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros antiandrogênios, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais tais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestania, fadrozola, vorozola RIVISOR®, letrozola FEMARA® e anastrozola ARIMIDEX®. Além disso, tal definição de agentes quimioterapêuticos inclui bisfosfonatos, tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrônico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bem como troxacitabina (um análogo de citosina de nucleosídeo de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos antissenso, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas em proliferação celular anormal tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas, tal como a vacina THERATOPE®e vacinas de terapia gênica, por exemplo, a vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor de topoisomerase I LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; Iapatinib ditosilato (um inibidor duplo de pequena molécula de quínase de ErbB-2 e EGFR, também conhecido como GW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.

Um "agente inibitório de crescimento", quando usado aqui, se refere a um composto ou composição a qual inibe o crescimento e/ou proliferação de uma célula (por exemplo, uma célula expressando Robo4), seja in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibitório de crescimento pode ser um o qual reduz significativamente o percentual de células expressando Robo4na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um outro lugar que não a fase S), tais como agentes que induzem à interrupção de G1 e interrupção da fase M. Bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores de topoísomerase II, tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposídeo e bleomicina. Aqueles agentes que interrompem G1 também atuam sobre a interrupção da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA1 tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e ara-C. Informação adicional pode ser encontrada em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs" por Murakami et aí. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente página 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticâncer derivados da árvore yew. O docetaxel (TAXOTERE®, Rhone- Poulenc Rorer), derivado da yem europeia, é um análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). O paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos impedindo a despolarização, a qual resulta na inibição de mitose em células.

"Doxorubicina" é um antibiótico de antraciclina. O nome químico completo da doxorubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideóxi-p-L-lixo- hexapiranosil)óxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11 -trihidróxi-8-(hidróxiacetil)-1 -metóxi- 5,12-naftacenodiona.

III. Anticorpos anti-Robo4

Em um aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos que se ligam ao Robo4. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Robo4 é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Robo4 é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fab1 Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2. Em uma modalidade, *um anticorpo anti-Robo4 é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em uma modalidade, um anticorpo anti- Robo4 é purificado.

Em outro aspecto da presente invenção, polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Robo4 são proporcionados. Em determinadas modalidades, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Robo4 são proporcionados. Em determinadas modalidades, células hospedeiras compreendendo tais vetores são proporcionadas. Em outro aspecto da presente invenção, composições compreendendo anticorpos anti- Robo4 ou polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Robo4 são proporcionados. Em determinadas modalidades, uma composição é uma formulação farmacêutica para o tratamento de doenças e distúrbios incluindo, por exemplo, câncer, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal e outros tecidos transplantados, artrite reumatoide, psoríase e combinações dos mesmos.

Anticorpos monoclonais exemplificativos derivados de uma biblioteca de fago são fornecidos aqui e descritos nos Exemplos abaixo. Esses anticorpos são designados YW71.6, YW71.1, YW71.22, YW71.89, YW79.1, YW79.8 e YW79.11. Esses anticorpos foram maturados para afinidade para gerar YW71.22.S1.2, YW71.22S1.8, YW71.22S1.16, YW71.22S1.23, YW71.22S1.24, YW71.22S1.27, YW71.22S1.31, YW71.22S1.38, YW71.22S1.77 YW71.22.S2.21, YW71.22.S2.79, YW71.22.H1.2, YW71.22.H1.9, YW71.22.H1.46, YW71.22.H1.77, YW71.22.H1.91 e YW71.22.H2.31. As seqüências dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve dos anticorpos são apresentadas nas Figuras 1 e 2.

Um anticorpo da presente invenção pode compreender quaisquer seqüências de framework de cadeia leve humana adequadas, contanto que o anticorpo exiba as características biológicas desejadas (por exemplo, afinidade de ligação desejada).

Em uma modalidade, as frameworks de consenso humanas aqui são de ou derivadas de seqüências de framework de consenso do subgrupo Ill de VH (veja Figuras 4A e 4B) e/ou subgrupo I de VL kappa (veja Figuras 3A e 3B).

Assim, a framework humana receptora de VH pode compreender uma, duas, três ou todas as quatro das seguintes seqüências de framework:

FR1 compreendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 13),

FR2 compreendo VWRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 14), FR3 compreendo RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 15),

FR4 compreendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16). Em outras modalidades, as frameworks de consenso de VH

incluem:

frameworks 1-4 de consenso de VH humana do subgrupo I menos CDRs de Kabat (SEQ ID NOS: 111, 112, 113, 16);

frameworks 1-4 de consenso de VH humana do subgrupo I menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOS: 114, 115, 113, 16 ou SEQ ID NOS: 114, 115, 116, 16 ou SEQ ID NOS: 114, 115, 117, 16);

frameworks 1-4 de consenso de VH humana do subgrupo Il menos CDRs de Kabat (SEQ ID NOS: 118, 119, 120, 16);

frameworks 1-4 de consenso de VH humana do subgrupo Il menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOS: 121, 122, 120, 16 ou SEQ ID NOS: 121, 122, 123, 16 ou SEQ ID NOS: 121, 122, 124, 16);

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo Ill de VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO:125, 126, 127, 16);

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo III de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOS: 128, 129, 127, 16 ou SEQ ID NOS: 128, 129, 130, 16 ou SEQ ID NOS: 128, 129, 131, 16);

frameworks 1-4 receptoras 1 de VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NOS: 132, 126, 133, 16);

frameworks 1-4 receptoras 1 de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOS: 128, 129, 133, 16 ou SEQ ID NOS: 128, 129, 134, 16);

frameworks 1-4 receptoras 2 de VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID NO:132, 126, 135, 16); ou

frameworks 1-4 receptoras 2 de VH humana menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID NOS: 128, 126, 135, 16 ou SEQ ID NOS: 128, 126, 136, 16 ou SEQ ID NOS: 128, 126, 137, 16).

Em uma modalidade, a região 4 de framework humana receptora de VH (H-FR4) compreende WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 45).

A framework humana receptora de VL pode compreende uma, duas, três ou quatro das seguintes seqüências de framework:

FR1 compreendendo DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 9),

FR2 compreendendo WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 10), FR3 compreendendo

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 11), FR4 compreendendo FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 173) ou

FGQGTKMEIKR (SEQ ID NO: 139).

Em outra modalidade, as frameworks de consenso de VL incluem:

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo I de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 9, 10, 99, 100); frameworks 1-4 de consenso do subgrupo I de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 9, 101, 99, 100);

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo Il de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 102, 103, 104, 100);

frameworks 1-4 de consenso do subgrupo Ill de VL kappa humana (SEQ ID NOS: 105, 106, 107, 100); ou

Embora o aceitador possa ser idêntico, quanto à seqüência, à seqüência de framework humana selecionada, se essa será de uma imunoglobulina humana ou uma framework de consenso humana, a presente invenção considera que a seqüência receptora pode compreender substituições de aminoácido pré-existentes com relação à seqüência de imunoglobulina humana ou seqüência de framework de consenso humana.

Essas substituições pré-existentes são, de preferência, mínimas; usualmente, quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácido apenas com relação à seqüência de imunoglobulina humana ou seqüência de framework de consenso.

Resíduos de região hipervariável do anticorpo não-humano são incorporados nas frameworks humanas receptoras de VL e/ou VH. Por exemplo, se pode incorporar resíduos correspondendo aos resíduos de CDR de Kabat, os resíduos do Ioop hipervariável de Chothia1 os resíduos Abm e/ou resíduos de contato. Opcionalmente, os resíduos da região hipervariável estendida como segue são incorporados: 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) and 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3).

Embora "incorporação" de resíduos de região hipervariável seja discutida aqui, será apreciado que isso pode ser obtido de várias formas, por exemplo, o ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácidos desejada pode ser gerado através de mutação do ácido nucleico que codifica a seqüência de domínio variável de camundongo, de modo que os resíduos de framework do mesmo sejam trocados por resíduos de framework humana aceitadores ou através de mutação do ácido nucleico que codifica a seqüência de domínio variável humana, de modo que os resíduos de domínio hipervariável sejam trocados para resíduos não-humanos ou através de síntese de ácido nucleico que codifica a seqüência desejada, etc.

Nos exemplos aqui, variantes com região hipervariável enxertada foram geradas através de mutagênese de Kunkel do ácido nucleico que codifica as seqüências receptoras humanas, usando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987). Alterações apropriadas podem ser introduzidas dentro da região de framework e/ou hipervariável usando técnicas de rotina para corrigir e re-estabelecer interações de região hipervariável-antígeno apropriadas.

A. Fragmentos de anticorpo

A presente invenção abrange fragmentos de anticorpo. Fragmentos de anticorpo podem ser gerados através de meios tradicionais, tais como digestão enzimática ou técnicas recombinantes. Em determinadas circunstâncias, há vantagens no uso de fragmentos de anticorpo, ao invés de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida clearance e pode levar a acesso aperfeiçoado a tumores sólidos. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpo veja Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9: 129-134.

Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Contudo, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab1 Fv e ScFv podem todos ser expressos em e secretados de E. coli, assim, permitindo a produção fácil de grandes quantidades desses fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab1-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et ai, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de culturas de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com meia-vida aumentada in vivo compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento são descritos na Pat. U.S. No. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para aqueles habilitados. Em determinadas modalidades, um anticorpo é um fragmento Fv com uma única cadeia (scFv). Veja WO 93/16185; Pats. U.S. Nos. 5.571.894; e 5.587.458. Fv e scFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; assim, elas podem ser adequadas para ligação não específica reduzida durante uso in vivo. Proteínas de fusão de scFv podem ser construídas para proporcionar fusão de uma proteína efetuadora, seja na terminação amino ou carbóxi de um scFv. Veja Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Pat. U.S. No. 5.641.870, por exemplo. Tais anticorpos lineares podem ser mono- específicos ou bi-específicos.

B. Anticorpos Humanizados A presente invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos para humanização de anticorpos não-humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de uma fonte a qual é não- humana. Esses resíduos de aminoácido não-humano são, freqüentemente, referidos como resíduos "importados" os quais são, tipicamente, tomados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser realizada essencialmente seguindo o método de Winter et al. (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536), substituindo seqüências de região hipervariável pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüência, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US No. 4.8 16.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são, tipicamente, anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos pelos resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.

A escolha dos domínios variáveis humanos, leve e pesado, a ser usado na fabricação dos anticorpos humanizados pode ser importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim denominado método de "melhor-adaptação", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada contra a biblioteca toda de seqüências de domínio variável humana. A seqüência humana a qual está mais próxima daquela do roedor é, então, aceita como a framework humana para o anticorpo humanizado. Veja, por exemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901. Outro método usa uma framework particular derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma framework pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes. Veja, por exemplo, Carter et ai (1992) PNAS USA, 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151: 2623.

Ainda, em geral, é desejável que anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esse objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das seqüências precursoras e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das seqüências precursora e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles habilitados na técnica. Programas de computador estão disponíveis os quais ilustram e visualizam prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. Inspeção dessas visualizações permite análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar a seu antígeno. Dessa forma, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir de seqüências recipientes e importadas, de modo que a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada pelo(s) antígeno(s) alvo, é obtida. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão direta e mais substancialmente envolvidos ao influenciar a ligação de antígeno.

Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona anticorpos que são humanizados, de modo que a resposta HAMA é reduzida ou eliminada. Redução ou eliminação de uma resposta HAMA é um aspecto significativo do desenvolvimento clinico de agentes terapêuticos adequados. Veja, por exemplo, Khaxzaeli et ai, J. Nati Câncer Inst. (1988), 80: 937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41: 572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135: 1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3: 138; Miller et al., Blood (1983), 62: 988; Hakimi et ai, J. Immunol. (1991), 147: 1352; Reichmann et ai, Nature (1988), 332: 323; Junghans et a/., Câncer Res. (1990), 50: 1495. Variantes dos referidos anticorpos podem ainda ser obtidas usando métodos de rotina conhecidos na técnica, alguns dos quais são ainda descritos abaixo.

Por exemplo, uma seqüência de aminoácidos de um anticorpo conforme descrito aqui pode servir como uma seqüência inicial (precursora) para diversificação da(s) sequência(s) de framework e/ou hipervariável. Uma seqüência de framework selecionada à qual uma seqüência hipervariável inicial está ligada é referida aqui como uma framework humana receptora. Embora as frameworks humanas receptoras possam ser de ou derivadas de uma imunoglobulina humana (as regiões de VL e/ou VH da mesma), de preferência, as frameworks humanas receptoras são de ou derivadas de uma seqüência de framework de consenso humana, tais como frameworks que demonstraram ter imunogenicidade mínima ou nenhuma em pacientes humanos.

Onde o aceitador é derivado de uma imunoglobulina humana, pode-se opcionalmente selecionar uma seqüência de framework humana que é selecionada baseado em sua homologia com a seqüência de framework doadora através de alinhamento da seqüência de framework doadora com várias seqüências de framework humanas em uma coleção de seqüências de framework humana e selecionar a seqüência de framework mais homóloga ao aceitador.

C. Anticorpos humanos

Anticorpos humanos da presente invenção podem ser construídos combinando sequência(s) de domínio variável do clone de Fv selecionada(s) de bibliotecas de phage display derivadas de ser humano com sequência(s) de domínio constante humana(s), conforme descrito acima. Alternativamente, anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser feitos através do método de hibridoma. Linhagens de célula de mieloma humano e heteromieloma humano-camundongo para a produção de anticorpos monoclonais foram descritas, por exemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Agora, é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, quando de imunização, de produzir um repertório total de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada (JH) do anticorpo em camundongos quiméricos e mutantes para a linhagem germinativa resulta em inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da série de gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana para tais camundongos mutantes para a linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos quando de estimulação com antígeno. Veja, por exemplo, Jakobovits et al., PNAS USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Yearin Immunol., 7: 33 (1993).

Embaralhamento gênico também pode ser usado para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos não-humanos, por exemplo, de roedor, o anticorpo humano tendo afinidades e especificidades diferentes pelo anticorpo não-humano inicial. De acordo com esse método, o qual é também denominado "impressão de epítopo", a região variável de cadeia pesada ou leve de um fragmento de anticorpo não-humano obtida através de técnicas de phage display, conforme descrito aqui, é substituída por um repertório de genes de domínio V humano, criando uma população de quimeras de scFv ou Fab de cadeia humana/cadeia não-humana. Seleção com antígeno resulta em isolamento de um scFv ou Fab quimérico com cadeia humana/cadeia não- humana, em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação de antígeno destruído quando de remoção da cadeia não-humana correspondente no clone de phage display primário, isto é, o epítopo governa (imprime) a escolha do parceiro da cadeia humana. Quando o processo é repetido de forma a substituir a cadeia não-humana restante, um anticorpo humano é obtido (veja PCT WO 93/06213 publicado em 1 de Abril de 1993). Diferente da humanização tradicional de anticorpos não-humanos através de enxertagem de CDR1 essa técnica proporciona anticorpos completamente humanos, os quais não têm resíduos de FR ou CDR de origem não-humana.

D. Variantes de anticorpo Em algumas modalidades, modificação(ões) da seqüência de aminoácidos dos anticorpos descritos aqui é(são) considerada(s). Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de seqüência de aminoácidos do anticorpo podem ser preparadas através de introdução de alterações apropriadas na seqüência de nucleotídeo que codifica o anticorpo ou através de síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, contanto que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácido podem ser introduzidas na seqüência de aminoácidos do anticorpo em questão no momento em que a seqüência é feita.

Um método útil para a identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagênese é denominado "mutagênese por exploração de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para realizar a interação dos aminoácidos com antígeno. Aqueles locais de aminoácido demonstrando sensibilidade funcional às substituições são, então, refinados através de introdução de outras variantes adicionais em ou para os locais de substituição.

Assim, embora o sítio para introdução de uma variação na seqüência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser determinada.

Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um determinado local, mutagênese de exploração por ala ou aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as imunoglobulinas expostas são selecionadas com relação à atividade desejada.

Inserções na seqüência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxila-terminais oscilando, quanto ao comprimento, de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra- sequência de um único ou múltiplos resíduos de aminoácido. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N- terminal. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão à terminação N- ou C- do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo o qual aumenta a meia-vida no soro do anticorpo.

Em determinadas modalidades, um anticorpo da presente invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão até a qual o anticorpo é glicosilado. Glicosilação de polipeptídeos é, tipicamente, N-Iigada ou O-ligada. N-Iigada se refere à fixação de uma porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências tripeptídicas asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para fixação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença dessas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. Glicosilação O-Iigada se refere à fixação de um dos açúcares N-- acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidróxi aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidróxiprolina ou 5-hidróxilisina também possa ser usada.

A adição ou deleção de sítios de glicosilação ao anticorpo é, convenientemente, realizada alterando a seqüência de aminoácidos, de modo que uma ou mais das seqüências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados) são criadas ou removidas. A alteração também pode ser feita através da adição, deleção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de ligação O- ligados).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato preso ao mesmo pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamífero compreendem, tipicamente, um oligossacarídeo biantenário ramificado que é geralmente preso através de uma N-ligação à Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Veja, por exemplo, Wright et al. (1997) TIBTECH 15: 26-32. O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GIcNAc), galactose e ácido siálico, bem como fucose presa a uma GIcNAc no "tronco" da estrutura de oligossacarídeo biantenária. Em algumas modalidades, modificações do oligossacarídeo no anticorpo da presente invenção podem ser feitas de forma a criar variantes de anticorpo com propriedades aperfeiçoadas.

Por exemplo, variantes de anticorpo são proporcionadas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose presa (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tais variantes podem ter função de ADCC aperfeiçoada. Veja, por exemplo, Publicações de Patente US Nos. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltda). Exemplos de publicações relacionadas à variantes de anticorpo "defucosiladas" ou "deficientes de fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; W02002/031140; Okazaki et ai, J. Moi Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et ai, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens de células capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células CHO Lecl3 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et ai, Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Ped. de Pat. US No US 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et ai, especialmente no Exemplo 11) e linhagens de células com knockout, tais como células CHO com knockout do gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8 (veja, por exemplo, Yamane- Ohnuki et ai, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et ai., Biotechnoi Bioeng., 94(4): 680-688 (2006); e W02003/085107).

Variantes de anticorpo são ainda proporcionadas com oligossacarídeos bisseccionados, por exemplo, nos quais um oligossacarídeo biantenário preso à região Fc do anticorpo é bissecionado por GIcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC aperfeiçoada. Exemplos de tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, no WO 2003/011878 (Jean-Mairet et ai)] Patente US No. 6.602.684 (Umana et al.y, e US 2005/0123546 (Umana et ai). Variantes de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo preso à região Fc também são proporcionados. Tais variantes de anticorpo podem ter função de CDC aperfeiçoada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, no WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).

Em determinadas modalidades, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácido as quais melhorar adicionalmente a ADCC, por exemplo, substituições = nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração Norte Americana de resíduos). Tais substituições podem ocorrer em combinação com qualquer uma das variações descritas acima.

Em determinadas modalidades, a presente invenção considera uma variante de anticorpo que possui algumas, mas não todas as funções efetuadoras, o que a torna um candidato desejável para muitas aplicações nas quais a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, ainda que determinadas funções efetuadoras (tais como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou prejudiciais.

Em determinadas modalidades, as atividade de Fc do anticorpo são medidas para assegurar que apenas as propriedades desejadas são mantidas. Ensaios de citotoxicidade in vivo e/ou in vitro podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação ao receptor Fe (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo carece de ligação ao FcyR (consequentemente, carecendo provavelmente de atividade de ADCC), mas retém a capacidade de ligação ao FcRn.

As células primárias para mediar a ADCC, células NK, expressam FeyRII apenas, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Exemplos não Iimitativos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente US No. 5.500.362 (veja, por exemplo, Hellstrom, I. et ai, PNAS USA 83: 7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I. et al., PNAS USA 82: 1499-1502 (1985); 5.821.337 (veja Bruggemann, M. et ai, J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)).

Alternativamente, métodos de ensaio não-radioativo podem ser empregados (veja, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não-radioativo ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View1 CA; e o ensaio de citotoxicidade não-radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Células efetuadoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Assassinas Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al., PNAS USA 95: 652-656 (1998). Ensaios de ligação a C1q também podem ser realizados para confirmar se o anticorpo é incapaz de se ligar ao C1q e, consequentemente, carece de atividade de CDC. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (veja, por exemplo, Gazzano-Santoro et ai, J. Immunoi Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). A ligação ao FcRn e determinações de c/earance/meia-vida in vivo podem também ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Petkova, S.B. et ai, lnt'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Outras variantes de anticorpo tendo uma ou mais substituições de aminoácido são proporcionadas. Locais de interesse para mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações na FR também são consideradas.

Substituições conservativas são mostradas na Tabela I sob o cabeçalho de "substituições preferidas". Alterações mais substanciais, denominadas "alterações exemplificativas", são fornecidas na Tabela I ou conforme ainda descrito abaixo em referência à classes de aminoácido. Substituições de aminoácido podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados, por exemplo, com relação a uma atividade desejada, tal como ligação de antígeno aperfeiçoada, ADCC ou CDC aperfeiçoada, etc. Tabela 1

<table>table see original document page 93</column></row><table> Modificações nas propriedades biológicas de um anticorpo podem ser realizadas ao selecionar substituições que afetam (a) a estrutura do suporte de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no campo alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers1 New York (1975)):

(1) não-polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W),Met(M)

(2) polar não carregado: Gli (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) acídico: Asp (D), Glu (E)

(4) básico: Lys (K), Arg (R), His(H)

Alternativamente, resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base em propriedades comuns de cadeia lateral:

(1) hidrófobo: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie;

(2) hidrófila neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) acídico: Asp, Glu;

(4) básico: His, Lys, Arg;

(5) resíduos que influenciam orientação de cadeia: Gli, Pro;

(6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Substituições não-conservadoras acarretarão a troca de um membro de uma das referidas classes por outra classe. Os referidos resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos campos de substituição conservadores ou, nos campos restantes (não-conservados).

Um tipo de variante de substituição envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parente (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada para desenvolvimento adicional será dotada de propriedades biológicas (por exemplo, aprimoradas) com relação ao anticorpo parente a partir do qual as mesmas são geradas. Uma variante de substituição exemplificativa é um anticorpo maturado por afinidade, que pode ser convenientemente gerado utilizando técnicas de maturação de afinidade com base em phage display. Em suma, diversos campos de região hipervariável (por exemplo, 6-7 campos) são modificados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada campo. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas de fago filamentosas como fusões a pelo menos parte de uma proteína de revestimento de fago (por exemplo, o produto gene Ill de M13) acondicionado dentro de cada partícula. As variantes de fago exibidas são então cl assificadas quanto às suas a tividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação). De modo a identificar campos candidatos de região hipervariável para modificação, mutagênese de varredura (por exemplo, varredura de alanina) pode ser realizada para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente para ligação de antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico se analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Os referidos resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com técnicas conhecidas na técnica, incluindo aquelas aqui elaboradas. Uma vez que as referidas variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a varredura utilizando técnicas conhecidas na técnica, incluindo aquelas descritas aqui, e variantes com propriedades superiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionadas para desenvolvimento adicional.

Moléculas de ácido nucleico codificando variantes de seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Os referidos métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de seqüência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada a oligonucleotídeo (ou direcionada a campo), mutagênese de PCR1 e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma vernão são-variante do anticorpo.

Pode ser desejável se introduzir uma ou mais modificações de aminoácido em uma região FC de anticorpos da presente invenção, deste modo gerando uma região variante FC. A região variante FC pode compreender uma seqüência de região FC humana {por exemplo, uma região IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 Fc humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) emuma ou mais posições de aminoácido incluindo aquela de uma cisteína de articulação.

De acordo com a presente descrição e os ensinamentos da técnica, é contemplado que em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma ou mais alterações em comparação com o anticorpo de contraparte do tipo selvagem, por exemplo, na região FC. Os referidos anticorpos iriam, no entanto, reter substancialmente as mesmas características necessárias para utilidade terapêutica em comparação com suas contrapartes do tipo selvagem. Por exemplo, é pensado que determinadas alterações podem ser produzidas na região FC que resultará em ligação de C1q alterada (isto é, sej a aprimorada ou diminuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, como descrito em W099/51642. Ver também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente US No. 5.648.260; Patente US No. 5.624.821; e W094/29351 referente a outros exemplos da região variante FCes. W000/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpo com ligação aprimorada ou diminuída a FcRs. O conteúdo das referidas publicações de patentes são especificamente incorporados aqui por referência. Ver, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com maior meias vidas e ligação aprimorada a o rec eptor FC neonatal ( FcRn), que é responsável pela transferência de maternal IgGs ao feto (Guyer et al., J.

Immunoi 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Os referidos anticorpos compreendem uma região FC com uma ou mais substituições na mesma que aprimora a ligação da região FC a FcRn. Variantes de polipeptídeo com seqüência de aminoácidos de região Fc alterada e maior ou menor capacidade de ligação a C1q são descritas na Patente US No. 6.194.551 B1, W099/51642. Os conteúdos das referidas publicações de patentes estão especificamente aqui incorporados por referência. Ver, também, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos compreendendo modificações na interface de polipeptídeos FC compreendendo a região Fc, em que as modificações facilitam e/ou promovem heterodimerização. As referidas modificações compreendem a introdução de uma protuberância em um primeiro polipeptídeo FC e uma cavidade dentro do segundo polipeptídeo FC, em que a protuberância é posicionável na cavidade de modo a promover a complexação dos primeiro e segundo polipeptídeos FC. Métodos de gerar anticorpos com as referidas modificações são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na Patente US No. 5.731.168.

Em ainda outro aspecto, pode ser desejável se criar anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia, por exemplo, "tioMAbs," e "tioFabs" nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos com resíduos de cisteína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em campos acessíveis do anticorpo. Ao substituir os referidos resíduos com cisteína, grupos reativos tiol são deste modo posicionados em campos acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras frações, tais como frações de fármaco ou frações de fármaco de ligação, como descrito adicionalmente aqui. Em determinadas modalidades, qualquer um ou mais dos resíduos a seguir pode ser substituído com cisteína: V205 (Numeração Kabat) de cadeia leve; A118 (Numeração EU) de cadeia pesada; e S400 (Numeração EU) de cadeia pesada de região Fe. Em uma modalidade preferida, A118 (Numeração EU) de cadeia pesada é substituída por cisteína. TioMabs e tioFabs de cisteína trabalhos por engenharia são descritos e m detalhes adicionais aqui abaixo,

E. Derivados de anticorpo

Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente modificados para conterem frações não protéicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. Preferivelmente, as frações adequadas para derivação do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não Iimitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (seja homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de oxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ser dotado de vantagens de fabricação em virtude de sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados ao anticorpo pode variar, e se mais do que um polímero for fixado, os mesmos podem ser as mesmas ou diferentes moléculas. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivação pode ser determinado com base em considerações incluindo, mas não limitadas, às propriedades particulares ou funções do anticorpo a serem aprimoradas, se o derivado de anticorpo for usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

Em outra modalidade, conjugados de um anticorpo e fração não protéica que podem ser seletivamente aquecidas por exposição à radiação são proporcionados. Em uma modalidade, a fração não protéica é um nanotubo de carbono (Kam et a/., PNAS USA 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não é limitado a, comprimentos de onda que não prejudicam as células comuns, mas que aquecem a fração não protéica a uma temperatura na qual as células proximais à fração não protéica do anticorpo são exterminadas.

IV. Métodos de Produção de Anticorpos A. Geração de Anticorpos Derivados de Fago

Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados por técnicas de phage display (mid) como descrito em Lee et a/., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93). Phage display (mid) permite a geração de grandes bibliotecas de variantes de proteína as quais podem ser rapidamente classificadas para aquelas seqüências que se eligam a uma molécula alvo com alta afinidade. Ácidos nucleicos codificando polipeptídeos variantes são em geral fundidos a uma seqüência de ácido nucleico codificando uma cápsula protéica viral, tal como a proteína do gene Ill ou a proteína do gene VIII. Sistemas de phage displaymid monovalentes onde a seqüência de ácido nucleico codificando a proteína ou polipeptídeo é fundida a uma seqüência de ácido nucleico codificando uma porção da proteína do gene Ill foram desenvolvidos. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman e Cavidades, Métodos: A Companion to Métodos in Enzymology, 3:205 (1991)). Em um sistema de phage displaymú monovalente, a fusão de gene é expressa em níveis baixos e proteínas de gene Ill do tipo selvagem são também expressas de modo que a infectividade das partículas é mantida. Métodos de gerar bibliotecas de peptídeos e a leitura das referidas bibliotecas foram descritos em diversas patentes (por exemplo, Patente US No. 5.723.286, Patente US No. 5.432. 018, Patente US No. 5.580.717, Patente US No. 5.427.908 e Patente US No. 5.498.530).

Bibliotecas de anticorpos ou polipeptídeos de ligação de antígeno foram preparadas em uma série de maneiras incluindo ao se alterar um único gene ao inserir seqüências de DNA aleatórias ou ao clonar uma família de genes relacionados. Métodos para exibir anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno utilizando phage display (mid) foram descritos nas Patentes US Nos. 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717, e 5.658.727. A biblioteca é então varrida com relação à expressão de anticorpos ou proteínas de ligação de antígeno com as características desejadas.

Métodos de substituir um aminoácido de escolha em um modelo de ácido nucleico são bem estabelecidos na técnica, alguns dos quais são descritos aqui. Por exemplo, resíduos de região hipervariável podem ser substituídos utilizando o método de Kunkel. Ver, por exemplo, Kunkel et ai, Métodos Enzymol. 154:367-382 (1987).

A seqüência de oligonucleotídeos inclui um ou mais dos conjuntos de códons designados para os resíduos de região hipervariável para serem alterados. Um conjunto de códons é um conjunto de diferentes seqüências triplet de nucleotídeos usadas para codificar a variante de aminoácidos desejada. Conjuntos de códons podem ser representados utilizando símbolos para designar nucleotídeos particulares ou misturas equimolares de nucleotídeos como mostrado abaixo de acordo com the IUB code. Códigos IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A ou G) Y(C ou Τ) M (Α ou C) K (G ou Τ) S (C ou G) W (Α ou Τ) H (Α ou C ou Τ) B (CouGouT) V (Α ou C ou G) D (Α ou G ou Τ) H N (Α ou C ou G ou Τ)

Por exemplo, no conjunto de códon DVK1 D pode ser nucleotídeos A ou G ou Τ; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou Τ. O referido conjunto de códons pode apresentar 18 diferentes códons e pode codificar aminoácidos Ala, Trp1 Tyr1 Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg1 Asp, Glu, Gli, e Cys.

Conjuntos de oligonucleotídeo ou de primer podem ser sintetizados utilizando métodos padrão. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizados, por exemplo, por síntese de fase sólida, contendo seqüências que representam todas as combinações possíveis de nucleotídeos triplets proporcionadas pelo conjunto de códons e que irá codificar o grupo desejado de aminoácidos. A síntese de oligonucleotídeos com "degeneração" selecionada de nucleotídeo em determinadas posições é bem conhecida na técnica. Os referidos conjuntos de nucleotídeos dotados de determinados conjuntos de códons podem ser sintetizados utilizando sintetizadores comerciais de ácido nucleico (oferecidos a partir de, por exemplo, Applied Biosistemas, Foster City, CA), ou podem ser comercialmente obtidos (por exemplo, a partir da Life Technologies, Rockville, MD). Portanto, um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados dotado de um conjunto particular de códons irá tipicamente incluir uma pluralidade de oligonucleotídeos com diferentes seqüências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códons dentro da seqüência geral. Oligonucleotídeos, como usados de acordo com a presente invenção, são dotados de seqüências que permitem a hibridização a um domínio variável de modelo de ácido nucleico e também podem incluir campos de enzima de restrição com objetivo de clonagem.

Em um método, seqüências de ácido nucleico codificando variantes de aminoácidos podem ser criadas por mutagênese mediada a oligonucleotídeo. A referida técnica é bem conhecida na técnica como descrito por Zoller et ai, Nuclei Acids Res. 10:6487-6504(1987). Em suma, seqüências de ácido nucleico codificando variantes de aminoácidos são criadas ao hibridizar um conjunto de oligonucleotídeos codificando os conjuntos desejados de códons a um modelo de DNA, onde o modelo é a forma de fita única do plasmídeo contendo uma região variável de modelo de seqüência de ácido nucleico. Após a hibridização, polimerase de DNA é usada para sintetizar toda uma segunda fita complementar do modelo que irá assim incorporar o primer de oligonucleotídeo, e irá conter os conjuntos de códons como proporcionado pelo conjunto de oligonucleotídeos.

Em geral, oligonucleotídeos de pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento são usados. Um oligonucleotídeo ideal será dotado de 12 a 15 nucleotídeos que são completamente complementares ao modelo em cada lado da codificação de nucleotídeo(s) para a mutação(s). Isto garante que o oligonucleotídeo irá hibridizar adequadamente ao modelo de fita única de molécula de DNA. Os oligonucleotídeos são prontamente sintetizados utilizando técnicas conhecidas na técnica tais como as descritos por Crea et ai, PNAS USA, 75:5765 (1978). O modelo de DNA é geradao por aqueles vetores que são ou derivados a partir de vetores bacteriofagos M13 (os vetores comercialmente oferecidos M13mp18 e M13mp19 são adequados), ou aqueles vetores que contêm uma origem de replicação de fago de fita única como descrito por Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Assim, o DNA que tem que ser modificado pode ser inserido em um dos referidos vetores de modo a gerar modelo de fita única. A produção do modelo de fita única é descrita nas seções 4.21-4.41 de Sambrook et al., acima.

Para alterar a seqüência de DNA nativa, o oligonucleotídeo é hibridizado em um modelo de fita única sob condições de hibridização adequadas. Uma enzima de polimerização de DNA1 em geral polimerase de DNA T7 ou o Fragmento de polimerase Klenow de DNA I, é então adicionado para sintetizar a fita complementar do modelo utilizando o oligonucleotídeo como um primer para síntese. Uma molécula heteroduplex é assim formada de modo que uma fita de DNA codifica a forma de gene modificada 1, e a outra fita (o modelo original) codifica a seqüência de gene nativa inalterada 1. A referida molécula heteroduplex é então transformada em uma célula hospedeira adequada, em geral um procariota tal como E. coli JM101. Após o crescimento das células, as mesmas são laminadas em placas de agarose e varridas utilizando o primer de oligonucleotídeo radiomarcado com um fosfato-32 para identificar as colônias bacterianas que contêm os DNA modificados.

O método descrito imediatamente acima pode ser modificado de modo que a molécula homoduplex é criada em que ambos os filamentos do plasmídeo contêm a(s) mutação(s). As modificações são como a seguir: O oligonucleotídeo de fita única é anelado ao modelo de fita única como descrito acima. Uma mistura de três deoxiribonucleotídeos, deoxiriboadenosina (dATP), deoxiriboguanosina (dGTP), e deoxiribotimidina (dTT), é combinada com uma tiodeoxiribocitosina modificada chamada dCTP-(aS) (a qual pode ser obtida a partir da Amersham). A referida mistura é adicionada ao complexo de modelo de oligonucleotídeo. Com a adição de polimerase de DNA à referida mistura, uma fita de DNA idêntico ao modelo exceto pelas bases modificadas é gerado. Adicionalmente, a referida nova fita de DNA irá conter dCTP-(aS) em vez de dCTP, que serve para proteger o mesmo de digestão por endonuclease de restrição. Após o modelo de fita heteroduplex de fita dupla ser entalhado com uma enzima de restrição apropriada, o modelo de fita pode ser digerido com nuclease Exolll ou outra nuclease apropriada adiante da região que contém o(s) campo(s) a sofrerem mutação. A reação é então interrompida para deixar a molécula que é apenas parcialmente de fita única. Um homoduplex de DNA de fita dupla completo é então for mado utilizando polimerase de DNA na presença de todos os quatro deoxiribonucleotídeo trifosfatos, ATP, e DNA ligase. A referida molécula homoduplex pode então ser transformada em uma célula hospedeira adequada.

Como indicado anteriormente a seqüência do conjunto de oligonucleotídeos é de comprimento suficiente para hibridizar ao modelo de ácido nucleico e pode também, mas não necessariamente, contêm campos de restrição. O modelo de DNA pode ser gerado por aqueles vetores que são ou derivados a partir de vetores bacteriofagos M13 ou vetores que contêm a origem de replicação de fago de fita única como descrito por Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Assim, o DNA que tem que ser modificado deve ser inserido em uma dos referidos vetores de modo a gerar o modelo de fita única. A produção do modelo de fita única é descrita nas seções 4.21-4.41 de Sambrook et al., supra.

De acordo com outro método, uma biblioteca pode ser gerada ao proporcionar conjuntos de oligonucleotídeos a montante e a jusante, cada conjunto dotado de uma pluralidade de oligonucleotídeos com diferentes seqüências, as diferentes seqüências estabelecidas pelos conjuntos de códons proporcionados dentro da seqüência dos oligonucleotídeos. Os conjuntos de oligonucleotídeos a montante e a jusante, junto com uma seqüência de ácido nucleico de modelo de domínio variável, podem ser usados em uma reação de cadeia de polimerase para gerar uma "biblioteca" de produtos PCR. Os produtos PCR podem ser referidos como "cassetes de ácido nucleico", na medida em que os mesmos podem ser fundidos com outras seqüências relacionadas ou não relacionadas de ácido nucleico, por exemplo, cápsulas protéicas virais e domínios de dimerização, utilizando técnicas de biologia molecular estabelecidas.

A seqüência de primers de PCR inclui um ou mais dos conjuntos de códons designados para o solvente acessível e posições altamente diversas em uma região hipervariável. Como descrito acima, um conjunto de códons é um conjunto de diferentes seqüências triplet de nucleotídeos usados para codificar variantes desejadas de aminoácidos.

Seletores de anticorpo que vão de encontro aos critérios desejados, como selecionados através de etapas apropriadas de varredura/seleção podem ser isolados e clonados utilizando técnicas recombinantes padrão.

Em um aspecto, as seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 são variadas ao se manter os aminoácidos em posições constantes particulares e variando os aminoácidos em outras posições.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três dos a seguir:

(i) uma seqüência HVR-L1 compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 1;

(ii) uma seqüência HVR-L2 compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 2; (iii) uma seqüência HVR-L3 compreendendo a

seqüência de SEQ ID NO: 3.

A seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1, 2, e 3 são numeradas com relação a HVR individual (isto é, L1, L2, ou L3) como indicado pelas Figures 1A (posições 24-34, 50-56, e 89-97, respectivamente) e 2A (posições 24-34, 50-56, e 89-97, respectivamente), a numeração sendo consistente com o Sistema de numeração de Kabat como descrito abaixo.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três das a seguir:

(i) uma seqüência HVR-H1 compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 4;

(ii) uma seqüência HVR-H2 compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 5;

(iii) uma seqüência HVR-H3 compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 6.

A seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 5, e 6 são numeradas com relação a HVR individual (isto é, H1, H2 ou H3) como indicado pelas Figuras 1B (posições 26-35, 49-65, e 93-102, respectivamente) e 2B (posições 26-35, 49-65, e 93-102, respectivamente), a numeração sendo consistente com o Sistema de numeração de Kabat como descrito abaixo.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos compreendendo seqüências HVR de cadeia leve como ilustrado nas Figuras 1A e 2A.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos compreendendo seqüências HVR de cadeia pesada como ilustrado nas Figuras 1B e 2B.

Algumas modalidades de anticorpos da presente invenção compreendem um domínio variável de cadeia leve de anticorpo 4D5 humanizado (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN® anticorpo anti-HER2, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (também referido na Patente US No. 6.407.213 e Lee et ai., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93) como ilustrado em SEQ ID NO: 98 abaixo.

1 Asp lle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gli Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gli Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr Ser Gli Val Pro Ser Arg Phe Ser Gli Ser Arg Ser Gli Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gli Gln Gli Thr Lys Val Glu lle Lys 107 (SEQ ID NO: 98) (resíduos HVR são sublinhados)

Em uma modalidade, a seqüência de domínio variável de cadeia leve huMAb4D5-8 é modificada em uma ou mais de posições 30, 66 e 91 (Asn, Arg e His como indicado em negrito/itálico acima, respectivamente). Em uma modalidade, a seqüência huMAb4D5-8 modificada compreende Ser na posição 30, Gli na posição 66 e/ou Ser na posição 91. Assim, em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo a seqüência ilustrada em SEQ ID NO: 167 abaixo: 1 Asp lle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gli Asp Arg Val Thr lle Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val SerThr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gli Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr Ser Gli Val Pro Ser Arg Phe Ser Gli Ser Gli Ser Gli Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln SerTvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gli Gln Gli Thr Lys Val Glu lle Lys 107 (SEQ ID NO: 167) (resíduos HVR são sublinhados)

Resíduos substituídos com relação a huMAb4D5-8 são indicados em negrito/itálico acima. Os anticorpos da presente invenção podem compreender qualquer seqüência de domínio variável de framework adequada, desde que a atividade de ligação a Robo4 seja substancialmente mantida, tal como pelo menos 1%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou maior atividade de ligação com relação a um anticorpo da presente invenção descrito aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção compreendem uma seqüência de consenso de framework de cadeia pesada do subgrupo III humana. Em uma modalidade dos referidos anticorpos, a seqüência de consenso de framework compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas modalidades dos referidos anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma modalidade, os referidos anticorpos compreendem seqüências de framework de domínio variável de cadeia pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (também referido nas Patentes US Nos. 6.407.213 e 5.821.337, e Lee et a!., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-93 (2004)). Em uma modalidade, os referidos anticorpos adicionalmente compreendem uma seqüência de consenso de framework de cadeia leve κΙ humana. Em uma modalidade, os referidos anticorpos compreendem seqüências HVR de cadeia leve de huMAb4D5-8 como descrito nas Patentes US Nos. 6.407.213 e 5.821.337.) Em uma modalidade, os referidos anticorpos compreendem seqüências de domínio variável de cadeia leve de huMAb4D5-8 (SEQ ID NOS: 98 ou 167) (HERCEPTIN® anticorpo anti- HER2, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (também referido nas Patentes US Nos. 6.407.213 & 5.821.337, e Lee et ai., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-93 (2004)).

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção podem compreender seqüências de região de framework de huMAb4D5-8 de cadeias leve e pesada como proporcionado abaixo (SEQ ID NOS: 9, 10, 168, 12 (cadeia leve) e SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16 (cadeia pesada)). Números em sobrescrito/negrito indicam posições de aminoácido de acordo com Kabat.

Seqüências de Framework de huMAb4D5-8 de cadeia leve

LC-FR1 1Asp lle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

Ser Ala Ser Val Gli Asp Arg Val Thr lle Thr Cys23 (SEQ ID NO: 9)

LC-FR2 35Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gli Lys Ala Pro Lys

Leu Leu lle Tyr49 (SEQ ID NO: 10)

LC-FR3 57GIi Val Pro Ser Arg Phe Ser Gli Ser Arg Ser

Gli Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

Tyr Cys88 (SEQ ID NO: 168)

LC-FR4 98Phe Gli Gln Gli Thr Lys Val Glu lle Lys107

(SEQ ID NO: 12)

Seqüências de Framework de huMAb4D5-8 de cadeia Pesada

HC-FR1 1GIu Val Gln Leu Val Glu Ser Gli Gli Gli Leu

Val Gln Pro Gli Gli Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser25 (SEQ ID NO: 13)

HC-FR2 36Trp Val Arg Gln Ala Pro Gli Lys Gli Leu Glu

TrpVaI48 (SEQ ID NO: 14)

HC-FR3 66Arg Phe Thr lle Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn82a Ser82b Leu82c Arg83 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

TyrCys92 (SEQ ID NO: 15)

HC-FR4 103Trp Gli Gln Gli Thr Leu Val Thr Val Ser

Ser113 (SEQ ID NO: 16)

Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção podem compreender seqüências de região de framework modificada/variantes de huMAb4D5-8 de cadeias leve e pesada como proporcionado abaixo (SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12 (cadeia leve) e SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16 (cadeia pesada)). Números em sobrescrito/negrito indicam posições de aminoácido de acordo com Kabat. ? SEQUENCIAS DE FRAMEWORK DE HUMAB4D5-8 DE CADEIA LEVE MODIFICADO NA pOSICAO 66 (SUBLINHADOS)

LC-FR1 1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

Ser Ala Ser Val Gli Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys23 (SEQ ID NO: 9)

LC-FR2 35Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gli Lys Ala Pro Lys

Leu Leu Ile Tyr49 (SEQ ID NO: 10)

LC-FR3 57GIi Val Pro Ser Arg Phe Ser Gli Ser Gli Ser

Gli Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

TyrCys88 (SEQ ID NO: 11)

LC-FR4 98Phe Gli Gln Gli Thr Lys Val Glu Ile Lys107

(SEQ ID NO: 12)

Seqüências de Framework huMAb4D5-8 de Cadeia Pesada Modificado nas

Posições 71.73 ε 78 (sublinhados)

HC-FR1 1GIu Val Gln Leu Val Glu Ser Gli Gli Gli Leu

Val Gln Pro Gli Gli Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser25 (SEQ ID NO: 13)

HC-FR2 36Trp Val Arg Gln Ala Pro Gli Lys Gli Leu Glu

TrpVaI48 (SEQ ID NO: 14)

HC-FR3 66Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn82a Ser82b Leu82c Arg83 Ala Glu Asp Thr Ala Val

Tyr Tyr Cys92 (SEQ ID NO: 15)

HC-FR4 103Trp Gli Gln Gli Thr Leu Val Thr Val Ser

Ser113 (SEQ ID NO: 16)

Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é maturado por afinidade para se obter a afinidade de ligação alvo desejada. Em um exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende substituição nas posições de aminoácido de cadeia leve como a seguir. Em uma modalidade, a variante HVR-L1 A1-A11 (Kabnas posições 24-34) é RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 1) dotada de 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições em qualquer combinação das posições a seguir: A6 (G)1 A7 (A), A8 (R ou I), A9 (S ou Y), e A10 (L). Em uma modalidade, a variante HVR-L2 B1-B7 (Kabnas posições 50-56) é SASFLYS (SEQ ID NO: 2) dotada de 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições em qualquer combinação das posições a seguir: B3 (Τ), B4 (L, N ou Τ), B5 (E ou A), B6 (A ou S), e B7 (Y ou uma deleção). Em uma modalidade, a variante HVR-L3 C1-C9 (Kabnas posições 89-97) é QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 3) dotada de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições em qualquer combinação das posições a seguir: C3 (P, T1 F, ou G), C4 (F, R, ou N), C5 (A, S, D, F1 Η, Ν, V, ou G), C6 (A, D, N, L1 I, Μ, Y, ou G), C7 (L, H, ou T), e C8 (A, M1 F, ou S).

Em uma modalidade, um anticorpo do anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende substituição nas posições de aminoácido de cadeia pesada como a seguir. Em uma modalidade, a variante HVR-H1 D1-D10 (Kabnas posições 26-35) é GFTINGYYIH (SEQ ID NO: 17) dotada de 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições em qualquer combinação das posições a seguir: D3 (S)1 D4 (L)1 D5 (Y, D, ou K), D9 (F, L ou N), e D10 (E ou Q). Em uma modalidade, a variante HVR-H2 E1-E18 (Kabnas posições 49-65) é GFIYPAGGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 18) dotada de 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições em qualquer combinação das posições a seguir: E2 (R), E5 (S), E7 (L)1 E9 (Η, K, A, ou V), e E11 (A, E ou I). Em uma modalidade, HVR-H3 F1- F18 (Kabnas posições 93-102) é ARLIGNKFGWSSYG*MDY (SEQ ID NO: 19), em que "*" em uma seqüência de aminoácidos indica uma deleção na posição F15, Kabna posição 100).

Em uma modalidade, o anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende uma, duas ou três HVRs (L1, L2, e/ou L3) ilustradas na Figura 2A. Em uma modalidade, o anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende uma, duas, ou três HVRs (H1, H2, e/ouH3) ilustradas na Figura 2B. Em uma modalidade, o anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende uma, duas, três, quatro, cinco, ou todas as seis HVRs selecionadas a partir de HVRs ilustrada nas Figuras 2A e 2B.

Em uma modalidade, o anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende seqüência de região variável de cadeia leve de qualquer uma das seqüências como ilustrado na Figura 2A. Em uma modalidade, o anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende seqüência variável de região de cadeia pesada de qualquer uma das seqüências como ilustrado na Figura 2B.

Em uma modalidade, o anticorpo maturado por afinidade da presente invenção compreende a seqüência de região variável de cadeia leve (compreendendo seqüências de framework e seqüências HVR) mostradas na Figura 2A e seqüências de região variável de cadeia pesada (compreendendo seqüências de framework e seqüências HVR) do anticorpo correspondente mostrado na Figura 2B.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo que competes com qualquer um dos anticorpos acima mencionados para a ligação a Robo4. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em Robo4 que qualquer dos anticorpos acima mencionados.

B. Métodos Baseados em Hybridoma Anticorpos monoclonais da presente invenção podem também ser produzidas utilizando o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et ai, Nature, 256:495 (1975), e adicionalmente descrito, por exemplo, em Hongo et al., Hybridoma1 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Anticorpos: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal antibodies e T-Célula Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) relativos a hibridoma humano-humano. Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente US No. 7.189.826 relativo à produção de anticorpos IgM naturais humanos monoclonais a pratir de linhagens celulares de hibridoma. Tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) é descrita em Vollmers e Brandlein1 Histology e Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein1 Methods and Findings in Experimental and Clinicai Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005). Outras técnicas de hibridoma, ver, por exemplo, US 2006/258841; US 2006/183887 (anticorpos humanos totais), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; e Patentes US Nos. 7.078.492 e 7.153.507.

C. Vetores, Células hospedeiras, ε Métodos recombinantes

Anticorpos podem também ser produzidos utilizando métodos recombinantes. Para a produção recombinante de um anticorpo anti-Robo4, ácido nucleico codificando o anticorpo é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA codificando o anticorpo pode ser prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, ao utilizar sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligação especificamente aos genes codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes de vetor em geral incluem, mas não são limitados a, um ou mais dos a seguir: uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento de intensificação, um promotor, e uma seqüência de terminação de transcrição.

1. Componente de Seqüência de Sinal

Um anticorpo da presente invenção pode ser produzido recombinantemente não só diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferivelmente uma seqüência de sinal ou outro polipeptídeo dotado de um campo de clivagem específico na terminação-N da proteína madura ou polipeptídeo. A seqüência de sinal heterólogo selecionada preferivelmente é uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira, para célula hospedeira procariótica que não reconhecem e processam seqüência de sinal de anticorpo nativo, a seqüência de sinal é substituída por uma seqüência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp1 ou endotoxina Il líderes estáveis a calor. Para secreção de levedura a seqüência de sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder invertase de levedura, fator α líder (incluindo fatores α líderes de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder de fosfatase ácida, o líder glicoamilase de C. albicans, ou o sinal descrito em WO 90/13646. Em expressão de célula de mamífero, seqüências de sinal de mamífero assim como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal gD da herpes simplex, estão disponíveis.

2. Origem de replicação

Ambos os vetores de expressão e clonagem contêm a seqüência de ácido nucleico que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Em geral, em vetores de clonagem a referida seqüência é uma que permite que o vetor replique independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro, e incluem origens de replicação ou seqüências de replicação autônoma. As referidas seqüências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras, e vírus. A origem da replicação a partir do plasmídeo pBR322 é adequada para a maior parte das bactérias Gram negativas, a origem de plasmídeo 2μ é adequada para levedura, e diversas origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamífero. Em geral, uma origem de componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usada apenas pelo fato de que a mesma contém o promotor precoce). 3. Componente de Gene de Seleção Vetores de expressão e de clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes fundamentais não oferecidos a partir do meio complexo, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. As referidas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e assim sobrevive ao regime de seleção. Exemplos da referida seleção domiante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores eelecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para captar o anticorpo-codificando ácido nucleico, tal como DHFR, glutamina sintetase (GS), timidina quinase, metalotioneina-l e -II, preferivelmente genes metalotioneina de primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene DHFR são identificadas ao se cultivar os transformantes em um meio de cultura contendo metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Sob as referidas condições, o gene DHFR é amplificado junto com qualquer outro ácido nucleico co-transformado. Uma linhagem celular (CHO) de ovário de hamster Chinês deficiente em atividade DHFR endógena (por exemplo, ATCC CRL-9096) pode ser usada.

Alternativamente, células transformadas com o /gene GS são identificadas ao cultivar os transformantes em um meio de cultura contendo L- metionina sulfoximina (Msx), um inibidor de GS. Sob as referidas condições, o gene GS é amplificado junto com qualquer outro ácido nucleico co- transformado. O sistema de seleção/amplificação de GS pode ser usado em combinação com o sistema de seleção/amplificação de DHFR descrito acima.

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA codificando um anticorpo de interesse, gene DFHR do tip oselvagem, e outro marcador selecionável tal como aminoglicoside 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por proliferação celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Ver Patente US No. 4.965.199.

Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trp*\ presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et ai, Nature, 282:39 (1979)). O gene trpl proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura desprovida da capacidade de se desenvolver em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). A presença da lesão írpl no genoma da célula hospedeira de levedura então proporciona um ambiente eficaz para detectar transformação por crescimento na ausência de triptofano. De modo similar, cepas de levedura com deficiencia de Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) são complementadas por plasmídeos conhecidos portando o gene Leu2.

Adicionalmente, vetores derivados a partir do plasmídeo 1.6 pm circular pKD1 podem ser usados para atransformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi reportado parar K. Iactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Vetores de expressão de múltiplas cópias estáveis para a secreção de albumina de soro humano recombinante madura por cepas industriais de Kluyveromyces foram também descritos. Fleer etal., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

4. Componente Promotor

Vetores de expressão e de clonagem em geral contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ligado ao ácido nucleico codificando um anticorpo. Promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, β-lactamase e sistemas promotores de lactose, promotor de fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp), e promotores híbridos tais como o promotor tac. Entretanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também irão conter uma seqüência de Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA codificando um anticorpo.

Seqüências promotoras são conhecidas para eucariotas. Na prática, todos os genes eucarióticos são dotados de uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante a partir do campo onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada de 70 a 80 bases a montante a partir do início da transcrição de muitos genes é a região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na terminação 3' da maioria dos genes eucarióticos é uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para a adição do prolongamento poli A à terminação 3' da seqüência de codificação. Todas as referidas seqüências são adequadamente inseridas nos vetores de expressão eucarióticos.

Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, < fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, os quais são promotores induzíveis dotados da vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradantes associadas com o metabolismo do nitrogênio, metalotioneina, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão de levedura são adicionalmente descritos em EP 73.657. Intensificadores de levedura também são vantajosamente usados com promotores de levedura.

Transcrição de anticorpo a partir de vetores em células de mamífero hospedeiras pode ser controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomes de vírus tais como vírus polioma, vírus fowlpox, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus de sarcoma de ave, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B, vírus Simian 40 (SV40), ou a partir de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, a partir de promotores de choque de calor, desde que os referidos promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.

Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição de Hindlll E. Um sistema para expressar DNA em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus do papiloma bovino como um vetor é descrito na Patente US No. 4.419.446. A modificação do referido sistema é descrita na Patente US No. 4.601.978. Ver também Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) na expressão de cDNA de β-interferon humano em células de rato sob o controle de um promotor timidina quinase a partir do vírus da herpex simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa do vírus de sarcoma Rous pode ser usada como o promotor.

5. Component de Elemento Intensificaador

A transcrição de um DNA codificando um anticorpo da presente invenção por eucariotas superiores é com freqüência aumentada ao inserir uma seqüência intensificadora no vetor. Muitas seqüências intensificadoras são agora conhecidas a partir dos genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, e insulina). Tipicamente, entretanto, poderá ser usado um intensificador a partir de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o intensificador SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o intensificador promotor precoce do citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificadores de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) em elementos de intensificação para ativação de promotores eucarióticos. O intensificador pode ser associado ao vetor na posição 5' ou 3' à seqüência codificando o anticorpo, mas é preferivelmente localizada em um campo 5' a partir do promotor.

6. Componente de Terminação de Transcrição

Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungo, inseto, vegetal, animal, humano, ou células nucleadas a partir de outros organismos multicelulares) conterão também seqüências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilizar o mRNA. As referidas seqüências são comumente oferecidas a partir das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. As referidas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados não porção não traduzida do mRNA codificando anticorpo. Um componente útil de terminação de transcrição é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Ver W094/11026 e o vetor de expressão descrito na mesma.

7. Seleção ε transformação de células hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressar o DNA em the vetores aqui são the prokaryote, levedura, ou higher eukaryote células descritos acima. Procariotas adequadas para este fim incluem eubacteria, tais como organismos Gram-negativo ou Gram-positivo, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim como Bacilli tal como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41P descritos em DD 266,710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem preferido de E. coli é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras cepas tais como E. coli Β, E. coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27,325) são adequadas. Os referidos exemplos são ilustrativos em vez de limitantes.

Anticorpo de comprimento total, anticorpo de proteínas de fusão, e fragmentos de anticorpo podem ser produzidos em bactéria, em particular quando glicosilação e Função efetora Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado ao agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) que por si só mostra eficácia na destruição de célula tumoral. Anticorpos de comprimento total são dotados de maior meia vida na circulação. A produção em E. coli é mais rápida e de custo mais eficaz. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactéria, ver, por exemplo, U.S. 5.648.237 (Carter et. al.), U.S. 5.789.199 (Joly et a/.), U.S. 5.840,523 (Simmons et al.), os quais descrevem a região de início de translação (TIR) e as seqüências de sinal para otimizar expressão e secreção. Ver também Charlton, Methods in Molecular Biology, Voi 248 (B.K.C. Lo1 ed., Humana Press, Totowa, NJ1 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli. Após expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purificado através de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. A purificação final pode ser realizada de modo similar ao processo para purificar o anticorpo expresso, por exemplo, em células CHO.

Além dos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou levedura são adequados hospedeiros de clonagem ou de expressão para vetores que codificam anticorpos. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura comum de padaria, é o mais comumente usado dentre os microorganismos hospedeiros eurcarióticos inferiores. Entretanto, uma série de outros gêneros, espécies, e cepas são comumente disponíveis e úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces tais como, por exemplo, K. laetis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaríeus (ATCC 16,045), K. wiekeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K . thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Piehia pastoris (EP 183,070); Candida; Triehoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, hospedeiros Neurospora, Penicilium, Tolypocladium, e Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger. Para uma revisão discutindo o uso de leveduras e fungos filamentosos para a produção de proteínas terapêuticas, ver, por exemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409 -1414 (2004).

Determinados fungos e cepas de levedura podem ser selecionados nos quais os trajetos de glicosilação foram "humanizados," resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou completamente humano. Ver, por exemplo, Li et ai, Nat. Biotech. 24:210 -215 (2006) (descrevendo a humanização do trajeto de glicosilação em Pichia pastoris); e Gerngross et ai, supra.

Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são também derivadas a partir de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Diversas cepas baculovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes a partir de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção são publicamente disponíveis, por exemplo, as variantes L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e os referidos vírus podem ser usados como o vírus aqui de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda.

Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, lentilha d'água (Lemnaceae), alfalfa (M. truncatula), e tabaco podem também ser utilizadas como hospedeiros. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 5.959.177, 6.040.498, 6.420,548, 7.125.978, e 6.417.429 (descrevendo tecnologia PLANTICORPOS™ para a produção de anticorpos em plantas transgênicas).

Células de vertebrados podem ser usadas como hospedeiros, e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento de rotona. Exemplos úteis de linhagens de células hospedeiras de mamífero são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim de embrião humano (293 ou células 293 subclonadas para desenvolvimento em cultura de suspensão, Graham et ai, J. Gen Virol. 36:59 (1977)) ; células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células sertoli de rato (TM4, Mather, Bioi Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim de canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de rato (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster Chinês (CHO)1 incluindo células CHO DHFR (Urlaub et ai, PNAS USA 77:4216 (1980)); e linhagens de células de mieloma tais como NSO e Sp2/0. Para uma revisão de determinadas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpo, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268.

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem acima desertos para a produção de anticorpo e cultivadas em meio nutriente convencional modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes codificando as seqüências desejadas.

8. Cultivo das Células Hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo da presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente oferecidos tais como Harn1s F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de EagIe1s modificado a Dulbecco ((DMEM)1 Sigma) são adequados par o cultivo das células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer dos meios descritos em Ham et al, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes US Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560,655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente US Re. 30.985 pode ser usado como o meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer dos referidos meios pode ser suplementado como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como fármaco GENTAMICIN™), elementos de traços (definidos como compostos inorgânicos em geral presentes em concentrações finais na faixa de micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidos daqueles versados na técnica. As condições de cultura, tal como temperatura, pH, e semelhante, são aquelas anteriormente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será aparente para aqueles versados na técnica.

9. Purificação de anticorpos

Quando utilizando técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, qualquer uma das células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et ai, Bio/Technology 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretados para o espaço periplasmático de E. coli. Em suma, a pasta de células é degelada na presença de acetato de sódio (pH 3.5), EDTA, e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) por cerca de 30 minutos. Resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. Onde o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes a partir dos referidos sistemas de expressão são em geral primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteína comercialmente oferecido, por exemplo, uma unidade de uItrafiItração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer das etapas anteriores para inibir proteólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar o desenvolvimento de contaminantes casuais.

A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxil apatita, cromatografia de interação hidrófoba, gel de eletroforese, diálise, e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade estando entre as etapas de purificação tipicamente preferidas. A adequadabilidade da proteína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio de imunoglobulina Fc que está presente no anticorpo. Proteína A pode ser usada para purificar os anticorpos que são com base em cadeias pesadas de γ1, γ2, ou γ4 humano (Lindmark et ai, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Proteína G é recomendada para todos os isotipos de rato e para γ3 humano (Guss et ai, EMBO J. 5:15671575 (1986)).

A matriz à qual o Iigante de afinidade é fixado é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tal como poro de vidro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem coeficientes de fluxo mais rápidos e tempos de processamento mais curtos do que pode ser alcançado com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3 domain, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tal como fracionamento em uma coluna de troca de íon, precipitação de etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™ cromatografia em uma resina de troca de anion ou cation (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofoco, SDS-PAGE, e precipitação de sulfato de amônia são também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado. Em seguida de qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes podem ser submetidos a cromatografia de interação hidrófoba de baixo pH utilizando um tampão de elução a um pH entre cerca de 2,5 - 4,5, preferivelmente realizada em baixas concentrações de sal {por exemplo, a partir de cerca de 0 - 0,25 M de sal).

Em geral, diversas metodologias para preparar anticorpos para uso em pesquisa, teste, e clínica são bem estabelecidas na técnica, consistente com as metodologias acima descritas e/ou como considerado apropriado por aqueles versados na técnica para um anticorpo de interesse particular.

V. Imunoconjugados

A presente invenção também proporciona imunoconjugados (intercambiavelmente referidos como "conjugados anticorpo-fármaco," ou "ADCs") compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-Robo4 da presente invenção conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como um agente quimioterapêutico, um fármaco, um agente inibidor de crescimento, uma toxina {por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal, ou animal, ou fragmentos dos mesmos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de pequenas moléculas, tais como a caliqueamicina, maitansinoides, um tricoteceno, e CC1065, e os derivados das referidas toxinas que são dotados de atividade de toxina, são também contemplados aqui.

Em determinadas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo anti-Robo4 e um agente quimioterapêutico ou outra toxina. Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de imunoconjugados são descritos aqui {por exemplo, acima). Toxinas enzimaticamente ativas ,e fragmentos das mesmas podem também ser usadas e são descritas aqui.

Em determinadas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo anti-Robo4 e uma ou mais toxinas de pequenas moléculas, incluindo, mas não limitadas a, fármacos de pequenas moléculas tais como uma caliqueamicina, maitansinoide, dolastatina, auristatina, tricoteceno, e CC1065, e os derivados dos referidos fármacos que são dotados de atividade citotóxica. Exemplos dos referidos imunoconjugados são discutidos em detalhes adicionais abaixo.

A. Imunoconjugados Exemplificativos

Um imunoconjugado (ou "conjugado anticorpo-fármaco" ("ADC")) da presente invenção pode ser de Fórmula I, abaixo, em que um anticorpo anti- Robo4 é conjugado (isto é, fixado de forma covalente) a uma ou mais frações de fármaco (D) através de um Iigante opcional (L).

Ab-(L-D)p Fórmula I

Assim, o anticorpo anti-Robo4 pode ser conjugado ao fármaco seja diretamente ou por meio de um ligante. Na fórmula I, ρ é o número médio de frações de fármaco por anticorpo, que pode variar, por exemplo, a partir de cerca de 1 a cerca de 20 frações de fármaco por anticorpo, e em determinadas modalidades, a partir de 1 a cerca de 8 frações de fármaco por anticorpo.

B. Ligantes Exemplificativos

Ligantes exemplificativos e frações de fármaco são descritos aqui e nas Publicações de Patentes US Nos. 20050238649 A1; 20050276812 A1; e 20070092940 A1. Um ligante pode compreender um ou mais Iigantes componentes. Ligantes componentes exemplificativos incluem 6- maleimidocaproila ("MC"), maleimidopropanoila ("MP"), valina-citrulina ("vai-cit" ou "vc"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonil (a "PAB"), N- Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-succinimidil 4-(N- maleimidometil) cicloexano-1 carboxilato ;("SMCC"), e N-Succinimidil (4-iodo- acetil) aminobenzoato ("SIAB"), N-succinimidil 3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (ver, por exemplo , Carlsson et ai, Biochem. J., 173, 723-737 (1978)), N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) (ver, por exemplo , Patente US 4.563.304), N- succinimidil 4-metil-4-[2-(5-nitro-piridil)-ditio] pentanoato (SMNP), e o derivado de polietileno glicol, metóxi-polióxido de etileno (mPEO). Diversos ligantes componentes são conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo.

Um ligante pode ser um "ligante clivável", facilitando a liberação de um fármaco na célula. Por exemplo, um Iigante ácido lábil (por exemplo, hidrazona), ligante sensível a protease (por exemplo, sensível a peptidase), ligante foto lábil, ligante de dimetila ou Iigante contendo disulfeto (Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992); Patente US No. 5.208.020) pode ser usado.

Em algumas modalidades, um componente ligante pode compreender uma "unidade de estiramento" que liga um anticorpo a outro componente Iigante ou a uma fração de fármaco. Unidades de estiramento exemplificativas são mostradas abaixo (em que a linha ondulada indica campos de fixação covalente a um anticorpo, outro componente ligante ou uma fração de fármaco):

<formula>formula see original document page 128</formula> <formula>formula see original document page 129</formula>

Em algumas modalidades, um componente Iigante pode compreender uma unidade de aminoácido. Na referida modalidade, a unidade de aminoácido permite a clivagem do Iigante por uma protease, deste modo facilitando a liberação do fármaco a partir do imunoconjugado com exposição às proteases intracelulares, tais como enzimas lisossomais. Ver1 por exemplo, Doronina et ai (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784. Unidades de aminoácido exemplificativas incluem, mas não são limitadas a, um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo, e um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplificativos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe); fenilalanina-lisina (fk ou phe-lys); ou N- metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Tripeptídeos exemplificativos incluem: glicina- valina-citrulina (gli-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gli-gli-gli). Uma unidade de aminoácido pode compreender resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente, assim como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, tal como citrulina. Unidades de aminoácido podem ser projetadas e otimizadas em suas seletividades para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada um tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmídeo.

Em algumas modalidades, um componente ligante pode compreender uma unidade "espaçadora" que liga o anticorpo a uma fração de fármaco, seja diretamente ou por meio de uma unidade de estiramento e/ou uma unidade de aminoácido. A unidade espaçadora pode ser "auto-imolativa" ou "não- auto-imolativa." Uma unidade "não-auto-imolativa" espaçadora é uma na qual parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à fração de fármaco com clivagem enzimática (por exemplo, proteolítica) da ADC. Exemplos de unidades espaçadoras não-auto-imolativas incluem, mas não são limitados a, uma unidade espaçadora de glicina e uma unidade espaçadora de glicina-glicina. Outras combinações de espaçadores peptídicos susceptíveis a clivagem enzimática específica de seqüência são também contempladas. Por exemplo, clivagem enzimática de um ADC contendo uma unidade espaçadora de glicina-glicina por uma protease associada um tumor celular resultará na liberação de uma fração de fármaco de glicina-glicina a partir do restante da ADC. Na referida modalidade, a fração de fármaco de glicina-glicina é então submetida a uma etapa de hidrólise separada na célula tumoral, assim clivando a unidade espaçadora de glicina-glicina a partir da fração de fármaco.

A unidade espaçadora "auto-imolativa" permite a liberação da fração de fármaco sem a etapa de hidrólise separada. Em determinadas modalidades, a unidade espaçadora de um Iigante compreende uma unidade p-aminobenzila. Na referida modalidade, um álcool p-aminobenzílico é fixado a uma unidade de aminoácido por meio de uma ligação amida, e um carbamato, metilcarbamato, ou carbonato é produzido entre o álcool benzílico e um agente citotóxico. Ver, por exemplo, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patentes (2005) 15:1087-1103. Em uma modalidade, a unidade espaçadora é p-aminobenzilóxicarbonila (PAB). Em determinadas modalidades, a porção fenileno de uma unidade p-amino benzila é substituída com Qm, em que Q é -Alquila C1-C8, -0-(alquila C1-C6), -halogênio,- nitro ou -ciano; e m é um número inteiro que varia a partir de 0-4. Exemplos de unidades espaçadoras auto-imolativas incluem adicionalmente, mas não são limitados a, compostos aromáticos que são eletronicamente similares a álcool p-aminobenzílico (ven, por exemplo, US 2005/0256030 A1), tal como derivados de 2-aminoimidazol-5- metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto-,ou para- aminobenzilacetais. Espaçadores podem ser usados os quais sofrem ciclização com hidrólise de ligação amida, tal como amidas de ácido 4-aminobutírico substituídos e não substituídos (Rodrigues et ai, Chemistry Biology, 1995, 2, 223); sistemas de anel apropriadamente substituídos biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] (Storm, et ai, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815); e amidas de ácido 2- aminofenilpropiônico (Amsberry, et ai., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867). Eliminação de fármacos contendo amina que são substituídos na posição a de glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) são também exemplos de espaçadores auto-imolativos úteis em ADCs.

Em uma modalidade, a unidade espaçadora é uma unidade ramificada bis(hidroximetil)estireno (BHMS) como ilustrado abaixo, que pode ser usada para incorporar e liberar múltiplos fármacos.

<formula>formula see original document page 131</formula>

em que Q é -alquila C1-C8, -0-(alquila C1-C6), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia a partir de 0-4; η é 0 ou 1; e ρ varia a partir de 1 a cerca de 20.

Um ligante pode compreender qualquer um ou mais dos ligantes componentes acima. Em determinadas modalidades, um Iigante é como mostrado entre parênteses na fórmula II ADC a seguir

Ab-([Aa-Ww-Yy]-D)p Fórmula II

em que A é a unidade de estiramento, e a é um número inteiro a partir de 0 a 1; W é uma unidade dé aminoácido, e w é um número inteiro a partir de O a 12; Y é a unidade espaçadora, e y é 0, 1, ou 2; e Ab, D, e ρ são definidos como acima para Fórmula I. Modalidades exemplificativas dos referidos Iigantes são descritas em US 20050238649 A1, a qual está aqui expressamente incorporada por referência.

Ligantes componentes exemplificativos e combinações dos mesmos são mostradas abaixo no contexto de ADCs de Fórmula II:

<formula>formula see original document page 132</formula>

Ligantes componentes, incluindo unidades de estiramento, espaçadora, e de aminoácido, podem ser sintetizados por métodos conhecidos na técnica, tal como aqueles descritos em US 2005-0238649 A1. C. Frações de fármaco Exemplificativas

1. Maitansina E maitansinoides

Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo da presente invenção conjugado a uma ou mais moléculas maitansinoides. Maitansinoides são inibidores mitóticos que atuam ao inibir a polimerização da tubulina. M aitansina foi ρ rimeiro i solada a partir do arbusto a África oriental Maytenus serrata (Patente US No. 3896111).

Subseqüentemente, foi descoberto q ue determinados micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres C-3 maitansinol (Patente US No. 4.151,042). Maitansinol sintético e derivados e análogos do mesmo são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260,608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533, as descrições das quais são aqui expressamente incorporadas por referência.

Compostos maitansina inibem a proliferação celular ao inibir a formação de microtúbulos durante mitose através de inibição da polimerização da proteína microtubulina, tubulina (Remillard et al (1975) Science 189:1002 -1005; US 5208020). Maitansina e maitansinoides são altamente citotóxicos, mas o uso clínico dos mesmos em terapia do câncer tem sido grandemente limitado por seus graves efeitos colaterais sistêmicos ρ rincipalmente atribuídos à pobre seletividade para tumores. Testes clínicos com maitansina foram descontinuados em virtude dos sérios efeitos adversos no sistema nervoso central e sistema gastrointestinal (Issel et al, (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207).

Frações de fármaco de maitansinoides são frações de fármaco atraentes em conjugados anticorpo-fármaco pelo fato de que as mesmas são: (i) relativamente acessíveis para preparar por fermentação ou modificação química ou derivação de produtos de fermentação, (ii) receptivos a derivação com grupos funcionais adequados para conjugação através de Iigantes não-disulfeto a anticorpos, (iii) estáveis em plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais.

Compostos maitansina adequados para uso como frações de fármaco de maitansinoides são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados a partir de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou produzidos utilizando técnicas de engenharia genética (ver Yu et al.(2002) PNAS 99:7968-7973). Maitansinol e análogos de maitansinol podem também ser preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos. Modalidades exemplificativas de frações de fármaco maitansinoide incluem: DM1; DM3; e DM4, como descrito aqui abaixo.

Da mesma forma que com outras frações de fármaco, todos os estereoisômeros da fração de droga maitansinoide são contemplados para os compostos da presente invenção, isto é qualquer combinação de configuração ReS nos carbonos quirais de D. Em uma modalidade, a fração de droga maitansinoide (D) será dotada da estequiometria a seguir:

<formula>formula see original document page 134</formula>

Modalidades exemplificativas de frações de fármaco maitansinoide incluem: DM1, (CR2)m = CH2CH2; DM3, (CR2)m = CH2CH2CH(CH3); e DM4, (CR2)m = CH2CH2C(CH3)2, dotado das^estruturas: <formula>formula see original document page 135</formula>

Em uma tentative de aprimorae o índice terapêutico de anticorpos alvo, maitansina e maitansinoides foram conjugados a anticorpos que se ligam especificamente a antígenos de células tumorais. Imunoconjugados contendo maitansinoides e o uso terapêutico dos mesmos é descrito, por exemplo, nas Patentes US Nos. 5.208.020, 5.416.064 e Patente Européia EP 0 425 235 B1, as descrições das quais são aqui expressamente incorporadas por referência. Liu et al, PNAS USA 93:8618-8623 (1996) descreve imunoconjugados compreendendo um maitansinoide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 direcionado contra câncer colorretal humano. O conjugado foi observado ser altamente citotóxico contra células cultivadas de câncer de cólon, e apresentaram atividade antitumor em um teste in vivo de crescimento. Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992) descreve imunoconjugados nos quais um maitansinoide foi conjugado por meio de um Iigante disulfeto ao anticorpo A7 de murino se ligando a um antígeno em linhagens de células de câncer de cólon humano, ou a outro anticorpo monoclonal de murino TA.1 que liga o oncogene HER-Hneu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansonoide foi testada in vitro na linhagem celular de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 χ 105 HER-2 antígenos de superfície por célula. O conjugado de fármaco alcançou um grau de citotoxicidade similar ao do fármaco maitansinoide livre, a qual pode ser aumentada ao se aumentar o número de moléculas maitansinoides por molécula de anticorpo. O conjugado A7- maitansinoide apresentou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.

Conjugados anticorpo-maitansinoide são preparados ao se quimicamente ligar um anticorpo a uma molécula maitansinoide sem significativamente diminuir a atividade biológica seja do anticorpo ou da molécula maitansinoide. Uma média de 3-4 conjugados de moléculas maitansinoides por molécula de anticorpo mostrou eficácia em aumentar a citotoxicidade de células alvo sem afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora seja esperado que mesmo uma molécula de toxina/anticorpo aumente a citotoxicidade com relação ao uso de anticorpo nu. Maitansinoides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Maitansinoides adequados são descritos, por exemplo, na Patente US No. 5.208.020 e em outras patentes e publicações não patentes referidas aqui acima. Maitansinoides preferidos são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tal como diversos ésteres maitansinol.

Há muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para a produção de conjugados anticorpo-maitansinoide, incluindo, por exemplo, aqueles descritos na Patente US No. 5.208.020 ou Patente EP 0 425 235 B1, e Chari et ai, Câncer Research 52:127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos disulfeto, grupos tioéter, grupos ácido lábeis, grupos fotolábeis, grupos peptidase lábeis, ou grupos esterase lábeis, como descrito nas patentes acima identificadas, os grupos disulfeto e tioéter sendo os preferidos.

Conjugados de anticorpo e maitansinoide podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCI de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazôniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolueno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditio) (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N- succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar uma ligação disulfeto.

O ligante pode ser fixado à molécula maitansinoide em diversas posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada por reação com um grupo hidroxila utilizando técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 dotada de um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidróximetila, a posição Ο- 15 modificada com um grupo hidroxila, e a posição C-20 dotada de um grupo hidroxila. Em uma modalidade preferida, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou um análogo de maitansinol.

2. Auristatinas, dolastatinas

Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo da presente invenção conjugado a dolastatina ou um análogo ou derivado peptídico de dolastatina, por exemplo, uma auristatina (US Pat. Nos. 5635483; 5780588).

Dolastatinas e auristatinas foram observadas por interferir com a dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP, e divisão nuclear e cellular (Woyke et ai(2001) Antimicrob. Agents e Chemother. 45(12):3580-3584) e apresentam atividade anticâncer (US Pat. No.5663149) e antifúngica (Pettit et aí.(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração dolastatina ou auristatina de fármaco pode ser fixada ao anticorpo através da terminação N (amino) ou da terminação C (carboxila) da fração peptídica do fármaco (WO 02/088172).

Modalidades exemplificativas de auristatina incluem as frações monometilauristatina ligadas na terminação-N de fármaco DE e DF, descritas em Senter et al, Proceedings de the American Associação for Câncer Research, Volume 45, Abstract Number 623, apresentada em 28 de Março de 2004, a descrição do qual se encontra expressamente aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Uma fração peptídica de fármaco pode ser selecionada a partir das Fórmulas De e Df abaixo: <formula>formula see original document page 139</formula>

em que a linha ondulada de De e Df indica o campo de fixação covalente a um anticorpo ou ligante componente de anticorpo, e independentemente em cada local:

R2 é selecionada a partir de H e alquila C1-C8;

R3 é selecionada a partir de H1 alquila C1-C8, carbociclo C3-C8, arila, alquila C1-C8-arila, alquila C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 e alquila C1-C8-(heterociclo C3-C8);

R4 é selecionada a partir de H, alquila C1-C8, carbociclo C3-C8, arila, alquila C1-C8-arila, alquila C1-C8 -(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 e alquila C1-C8-(heterociclo C3-C8);

R5 é selecionada a partir de H e metila;

ou R4 e R5 juntos formam um anel carbocíclico e são dotados de fórmula -(CRaRb)n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de H1 alquila C1-C8 e carbociclo C3-C8 e η é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6;

R6 é selecionada a partir de H e alquila C1-C8;

R7 é selecionada a partir de H, alquila C1-C8, carbociclo C3-C8, arila, alquila C1-C8-arila, alquila C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 e alquila C1-C8-(heterociclo C3-C8);

cada R8 é independentemente selecionado a partir de H, OH1 alquila C1-C8, carbociclo C3-C8 e 0-(alquila C1-C8); R9 é selecionada a partir de H e alquila C1-C8;

R10 é selecionada a partir de arila ou heterociclo C3-C8;

Z é O, S, NH1 ou NR121 em que R12 é alquila C1-C8;

R11 é selecionado a partir de H1 alquila C1-C2O, arila, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14l ou -(R13O)m-CH(R15)2;

m é um número inteiro que varia a partir de 1-1000;

R13 é alquila C2-C8;

R14 é H ou alquila C1-C8;

cada ocorrência de R15 é independentemente H1 COOH1 -(CH2)n- N(R16)2, -(CH2)n-SO3H1 ou -(CH2)n-S03-alquila C1-C8;

cada ocorrência de R16 é independentemente H1 alquila C1-C8, ou -(CH2)n-COOH;

R18 é selecionado a partir de -C(R8)2-C(R8)2-arila, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), e -C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); e

η é um número inteiro que varia a partir de O a 6.

Em uma modalidade, R31 R4 e R7 são independentemente isopropil ou sec-butila e R5 é -H ou metila. Em uma modalidade exemplificativa, R3 e R4 são cada um isopropila, R5é -H1 e R7 é sec-butila.

Em ainda outra modalidade, R2 e R6 são cada um metila, e R9 é -H.

Em ainda outra modalidade, cada ocorrência de R8 é -OCH3.

Em uma modalidade exemplificativa, R3 e R 4 s ão c ada um isopropila, R2 e R6 são cada um metila, R5 é -H, R7 é sec-butila, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.

Em uma modalidade, Z é -O- ou -NH-.

Em uma modalidade, R10 é arila.

Em uma modalidade exemplificativa, R10 é -fenila.

Em uma modalidade exemplificativa, quando Z é -O-, R11 é -H, metila ou t-butila. Em uma modalidade, quando Z é -NH1 R11 é -CH(R15)2, em que R15 é -(CH2)n-N(R16)2, e R16 é -alquila C1-C8 ou -(CH2)n-COOH.

Em outra modalidade, quando Z é -NH1 R11 é -CH(R15)2, em que R15 é-(CH2)n-SO3H.

Uma modalidade de auristatina exemplificativa de fórmula De é MMAE, em que a linha ondulada indica a fixação covalente a um Iigante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:

<formula>formula see original document page 141</formula>

MMAE

Uma modalidade de auristatina exemplificativa de fórmula Df é MMAF, em que a linha ondulada indica a fixação covalente a um Iigante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco (ver US 2005/0238649 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124):

<formula>formula see original document page 141</formula>

Outras frações de fármaco incluem os derivados MMAF a seguir, em que a linha ondulada indica a fixação covalente a um Iigante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:

<formula>formula see original document page 141</formula> <formula>formula see original document page 142</formula> <formula>formula see original document page 143</formula>

Em um aspecto, grupos hidrófilos incluindo mas não limitadas a, ésteres de trietileno glicol (TEG), como mostrado acima, podem ser fixados à fração de fármaco em R11. Sem estar ligado a qualquer teoria particular, os grupos hidrófilos ajudam na internalização e não-aglomeração da fração de fármaco.

Modalidades exemplificativas de ADCs de Fórmula I compreendendo an auristatina/dolastatina ou derivado das mesmas são descritas em US 2005-0238649 A1 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124, a qual está aqui expressamente incorporada por referência. Modalidades exemplificativas de ADCs de Fórmula I compreendendo MMAE ou MMAF e diversos Iigantes componentes apresentam as estruturas e abreviações a seguir (em que "Ab" é um anticorpo; ρ é 1 a cerca de 8, "Val-Cit" é um dipeptídeo valina-citrulina; e "S" é um átomo de enxofre:

<formula>formula see original document page 143</formula> <formula>formula see original document page 144</formula>

Modalidades exemplificativas de ADCs de Fórmula I compreendendo MMAF e diversos Iigantes componentes incluem adicionalmente Ab-MC-PAB-MMAF e Ab-PAB-MMAF. É interesante que, imunoconjugados compreendendo MMAF fixados a um anticorpo por um ligante que não é proteoliticamente clivável foram mostrados dotados de atividade comparável aos imunoconjugados compreendendo MMAF fixados a um anticorpo por um ligante proteoliticamente clivável. Ver, Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Nos referidos casos, acredita-se que a liberação do fármaco seja efetuada por degradação de anticorpo na célula. Id.

Tipicamente, frações de fármaco com base em peptídeo podem ser preparadas ao formar uma ligação peptídeo entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. As referidas ligações peptídeo podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (ver E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeo. Frações de fármaco de auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: US 2005-0238649 A1; US Pat. No. 5635483; US Pat. No. 5780588; Pettit et al.{1989) J. Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anticâncer Fármaco Design 13:243-277; Pettitj G.R., etal Synthesis1 1996, 719-725; Pettit et a/.(1996) J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863; e Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.

Em particular, frações de fármaco de auristatina/dolastatina de fórmula Df, tal como MMAF e derivados das mesmas, podem ser preparadas utilizando os métodos descritos em US 2005-0238649 A1 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Frações de fármaco de auristatina/dolastatina de fórmula De, tal como MMAE e derivados das mesmas, podem ser preparadas utilizando os métodos descritos em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784. Frações de Iigante de fármaco MC- MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, e MC-vc-PAB-MMAE podem ser convenientemente sintetizadas por métodos de rotina, por exemplo, como descrito em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, e Publicacao de Patente US No. 20050238649 A1, e então conjugadas a um anticorpo de interesse.

3. Caliqueamicina

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir rupturas de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família da caliqueamicina, ver Patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas para a American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, γ1', α2', α3', N-acetil-γ1', PSAG e θ'ι (Hinman et al., Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as Patentes US acima mencionadas para a American Cyanamid). Outro fármaco antitumor que ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato. Tanto a caliqueamicina como a QFA são dotados de campo de ação intracelulares e não cruzam prontamente a membrana plasmática. Portanto, a captação cellular dos referidos agentes através de internalização mediada um anticorpo aumenta grandemente os efeitos citotóxicos dos mesmos.

4. Outros agentes citotóxicos

Outro agentes antitumor que podem ser conjugados aos anticorpos da presente invenção incluem BCNU, streptozoicina, vincristina e 5- fluorouracila, a família dos agentes complexos conhecidos coletivamente LL- E33288 descritos nas Patentes US 5.053.394, 5.770.710, assim como esperamicinas (Patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser usadas incluem cadeia de difteria A1 fragmentos ativos de não ligação de toxina de diftheria, cadeia de exotoxina A (da Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII1 e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de Outubro de 1993.

A presente invenção adicionalmente contempla um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma endonuclease de DNA tal como uma deoxiribonuclease; DNase).

Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu.

As radio- ou outras marcações podem ser- incorporadas no conjugado em formas conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biosintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácido adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em lugar de hidrogênio. Marcações tais como Tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser fixadas por meio de um resíduo de cisteína no peptídeo. Itrio-90 pode ser fixado por meio de um resíduo de. O método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser usado para incorporar iodo-123. "Monoclonal antibodies in lmunocintigrafia" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.

Anticorpos anti-Robo4 da presente invenção podem ser conjugados um agentes nanoparticulados que podem por sua vez ser conjugados a frações citotóxicas. Agentes nanoparticulados adequados incluem, mas não são limitados a, microbolhas (ver Ellegala et ai, Circulation 108:336-341 (2003)), também referidos como Iipoesferas acusticamente ativas (AALs) (ver Tartis et al., Ultra-som Med. Biol. 32(11): 1771-80 (2006)), agentes superparamagnéticos, lipossomos, emulsões de nanopartículas de perfluorocarbono (W02005014051), e dendrímeros (ver Caruthers et al, Methods in Molecular Medicine, 124:387-400 (2006) e referências citadas na mesma, todas as referências se encontram aqui incorporadas por referência em sua totalidade)).

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetil adipimidate HCI), ésteres ativos (tal como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tal como bis-(p-diazôniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina rica pode ser preparada como descrito em Vitetta et ai, Science 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapenta acético marcado com carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplificativo para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver W094/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" facilitando a liberação de fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ácido lábil, sensível a ligante peptidase, ligante foto lábil, ligante de dimetila ou ligante contendo disulfeto (Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992); Patente US No. 5.208.020) pode ser usado.

Os compostos da presente invenção contemplam expressamente, mas não são limitados a, ADC preparadas com agentes reticulados-ligantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP1 SIA, SIAB, SMCC1 SMPB1 SMPH1 sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) os quais são comercialmente oferecidos (por exemplo, pela Pierce Biotechnology1 Inc., Rockford, IL., U.S.A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 Aplicações Handbook e Catalog.

5. Carregamento do Fármaco

Carregamento do fármaco é representado por ρ e é o número médio de frações de fármaco por anticorpo em uma molécula de Fórmula I, Ia, Ia' ou II. Carregamento do fármaco pode variar a partir de 1 a 20 frações de fármaco (D) por anticorpo. ADCs de Fórmula I incluem coleções de anticorpos conjugados com uma faixa de frações de fármaco, a partir de 1 a 20. O número médio de frações de fármaco por anticorpo em preparações de ADC a partir das reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espectroscopia de massa, teste ELISA, e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de ρ pode também ser determinada. Em alguns casos, a separação, purificação, e caracterização de ADC homogêneo onde ρ é um valor determinado de ADC com outro carregamento de fármacos pode ser alcançada por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese.

Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, ρ pode ser limitado pelo número de campos de fixação no anticorpo. Por exemplo, onde a fixação é uma cisteína tiol, como nas modalidades exemplificativas acima, um anticorpo pode ser dotado apenas de um ou diversos grupos cisteína tiol, ou pode ser dotado apenas de um ou diversos grupos tiol suficientemente reativos através do qual um Iigante pode ser fixado. Em determinadas modalidades, carregamento de fármaco mais elevado, por exemplo, ρ > 5, pode ocasionar agregação, insolubilidade, toxicidade, ou perda de permeabilidade celular de determinados conjugados anticorpo-fármaco. Em determinadas modalidades, o carregamento do fármaco para um ADC da presente invenção varia a partir de 1 a cerca de 8; a partir de cerca de 2 a cerca de 6; a partir de cerca de 3 a cerca de 5; a partir de cerca de 3 a cerca de 4; a partir de cerca de 3,1 a cerca de 3,9; a partir de cerca de 3,2 a cerca de 3,8; a partir de cerca de 3,2 a cerca de 3,7; a partir de cerca de 3,2 a cerca de 3,6; a partir de cerca de 3,3 a cerca de 3,8; ou a partir de cerca de 3,3 a cerca de 3,7. De fato, tem sido mostrado que para determinadas ADCs, a proporção ideal de frações de fármaco por anticorpo pode ser menor do que 8, e pode ser cerca de 2 a cerca de 5. Ver US 2005-0238649 A1 (aqui incorporada por referência em sua totalidade).

Em determinadas modalidades, menos do que a máxima teórica das frações de fármaco é conjugada a um anticorpo durante a reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o indenominadoiato ligante de fármaco ou reagente ligante, como discutido abaixo. Em geral, anticorpos não contêm muitos grupos cisteína tiol livres e reativos que podem ser ligados a uma fração de fármaco; de fato a maior parte dos resíduos cisteína tiol e m anticorp os exist em como po ntes disulfeto. Em determinadas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor tal como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições de redução parciais ou totais, para gerar grupos cisteína tiol reativos. Em determinadas modalidades, um anticorpo é submetido a condições de desnaturação para revelar grupos nucleofílicos reativos tais como lisina ou cisteína.

O carregamento (proporção fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlado de diferentes formas, por exemplo, por: (i) limitar o excesso molar de indenominadoiato Iigante de fármaco ou reagente Iigante com relação ao anticorpo, (ii) limitar a reação de tempo de conjugação ou temperatura, (iii) condições de redução parciais ou Iimitantes para modificação de cisteína tiol, (iv) engenharia por técnicas recombinantes a seqüência de aminoácidos do anticorpo de modo que o número e a posição dos resíduos de cisteína sejam modificados para o controle do número e/ou posição de fixações de Iigante- fármaco (tal como tioMab ou tioFab preparadas como descrito aqui e em W02006/034488 (aqui incorporadas por referência em sua totalidade)). Em uma modalidade da presente invenção, um resíduo de aminoácido do anticorpo da presente invenção é su bstituído c om u m resíduo de cisteína. E m u ma modalidade, o aminoácido na posição 118 de região Fc de cadeia pesada do anticorpo é um cisteína ou é substituído com um resíduo de cisteína (onde 118 se refere à posição de aminoácido na região FC do anticorpo numerada de acordo com Numeração EU1 ver Kabat, E. A. et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Dept de Health e Hum. Serv., Bethesda (1991)).

Em uma modalidade, o resíduo de cisteína na posição 118 de região Fc de cadeia pesada (Numeração EU) é fixado de forma covalente a uma fração de fármaco ou uma marcação detectável, tal como as frações de fármaco ou marcações detectáveis descritas aqui. Na Figura 6A, a alanina de região Fc de cadeia pesada mostrada em texto em negrito e sublinhado é a posição na qual a cisteína foi substituída para gerar a tioMAb.

Deve ser entendido que onde mais de um grupo nucleofílico reage com um indenominadoiato Iigante de fármaco ou reagente Iigante seguido por reagente de fração de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos ADC com uma distribuição de uma ou mais frações de fármaco fixadas a um anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por um teste de anticorpo ELISA duplo, que é específico para anticorpo e específico para o fármaco. Moléculas individuais de ADC podem ser identificadas em uma mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidrófoba (ver, por exemplo, Hamblett1 K.J., et ai "Effect of carga de fármacoing on the pharmacology, farmacocinéticas, and toxicity of an anti-CD30 antibody-fármaco conjugate" Abstract No. 624, American Associação for Câncer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, Março de 2004; Alley, S.C., et al. "Controlando the Iocation of fármaco attachment in antibody-fármaco conjugates", Abstract No. 627, American Associação for Câncer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings de the AACR, Volume 45, Março de 2004). Em determinadas modalidades, um ADC homogêneo com um único valor de carga pode ser isolado a partir da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia.

D. Metabólitos de os conjugados anticorpo-fármaco

Também incluídos no âmbito da presente invenção estão os produtos metabólicos in vivo dos compostos ADC descritos aqui, no sentido de que os referidos produtos são novos e não óbvios em relação à técnica anterior. Os referidos produtos podem resultar, por exemplo, a partir da oxidação, redução, hidrólise, amidação, esterificação, clivagem enzimática, e semelhante, do composto administrado. Assim, a presente invenção inclui compostos novos e não óbvios produzidos por um processo compreendendo colocar em contato um composto da presente invenção com um mamífero por um período de tempo suficiente para produzir um produto metabólico do s mesmos.

Produtos metabólitos tipicamente são identificados ao preparar um ADC radiomarcado (por exemplo, 14C ou 3H), administrar o mesmo por via parenteral em uma dose detectável (por exemplo, maior do que cerca de 0,5 mg/kg) a um animal tal como rato, camundongo, porco da guiné, macaco, ou ao homem, permitindo tempo suficiente para que ocorra o metabolismo (tipicamente cerca de 30 segundos a 30 horas) e isolar seus produtos de conversão a partir da urina, sangue ou outras amostras biológicas. Os referidos produtos são facilm ente isolados um a vez que os mesmos são marcados (outros são isolados pelo uso de anticorpos capazes de se ligar aos epítopos que sobrevivem no metabólito). As estruturas de metabólito são determinadas de modo convencional, por exemplo, por análise MS, LC/MS ou NMR. Em geral, a análise de metabólitos é realizada da mesma maneira que os estudos de metabolismo de fármaco convencionais bem conhecidos daqueles versados na técnica. Os produtos de conversão, enquanto os mesmos não são de outro modo encontrado in vivo, são úteis e m t estes diagnósticos pa ra dosagem dosagem terapêutica dos compostos ADC da presente invenção.

VI. Métodos de Preparar Immnão conjugados

Nos conjugados de anticorpo fármaco (ADC) da presente invenção, um anticorpo (Ab) é conjugado a uma ou mais frações de fármaco (D), por exemplo, cerca de 1 a cerca de 20 frações de fármaco por anticorpo, através de um Iigante (L). Um ADC de Fórmula I, Ia, Ia', ou II pode ser preparado por diversas vias empregando reações de química orgânica, condições, e reagentes conhecidos daqueles versados na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um Iigante reagente bivalente para formar Ab-L por meio de uma ligação covalente, seguido por reação com uma fração de fármaco D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração de fármaco com um Iigante reagente bivalente, para formar D-L, por meio de uma ligação covalente, seguido por reação com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos exemplificativos para preparar um ADC de Fórmula I por meio da última via são descritos na Publicação de Patente US No. 20050238649 A1, a qual se encontra aqui expressamente incorporada por referência.

Grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, mas não são limitados a: (i) Grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral, por exemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína, e (iv) grupos açúcar hidroxila ou amino onde o anticorpo é glicosilado. Grupos amina, tiol, e hidroxila são nucleófilos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrófilos em frações Iigantes e reagentes Iigantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos, e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) grupos aldeídos, cetonas, carboxila, e maleimida.

Determinados anticorpos são dotados de disulfetos de intercadeia redutíveis, isto é pontes de cisteína. Anticorpos podem ser produzidos reativos para conjugação com reagentes Iigantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), de modo que o anticorpo é totalmente ou parcialmente reduzido. Cada ponte de cisteína irá assim formar, teoricamente, dois nucleófilos tiol reativo. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através da modificação de resíduos de lisina, por exemplo, ao reagir resíduos de lisina com 2-iminotiolano (reagente de Traut), resultando em conversão de uma amina em um tiol.

Grupos reativos tiol podem ser introduzidos em um anticorpo ao introduzir um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, ao preparar anticorpos variantes compreendendo um ou mais resíduos de cisteína não nativos de aminoácido).

Conjugados anticorpo-fármaco da presente invenção podem também ser produzidos por reação entre um grupo eletrofílico on um anticorpo, tal como um grupo aldeído ou carbonil cetona, com um grupo nucleofílico on um reagente Iigante ou fármaco. Grupos nucleofílicos úteis em um reagente ligante incluem, mas não são limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazone, carboxilato de hidrazina, e arilhidrazida. Em uma modalidade, um anticorpo é modificado para introduzir frações eletrofílícas que são capazes de reagir com subsituentes nucleófilos no reagente ligante ou fármaco. Em outra modalidade, os açúcares de anticorpo glicosilado podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes de oxidação periodato, para formar grupos aldeído ou cetona os quais podem reagir com o grupo amina de reagentes ligantes ou frações de fármaco. Os grupos de base Schiff imina resultantes podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidoa, por exemplo, por reagentes boroidreto para formar ligações amina estáveis. Em uma modalidade, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado seja com galactose oxidase ou meta-periodato de sódio pode produzir gripos carbonil (aldeído e ketone) no anticorpo que pode reagir com grupos apropriados no fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra modalidade, anticorpos contendo serina N-terminal ou resíduos de treonina podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído em lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). O referido aldeído pode ser reagido com uma fração de fármaco ou nucleófilo ligante.

Grupos nucleofílicos on uma fração de fármaco incluem, mas não são limitados a: grupos amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e arilhidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrófilos em frações ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tal como ésteres NHS1 ésteres HOBt1 haloformatos, e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) grupos aldeídos, cetonas, carboxila, e maleimida.

Os compostos da presente invenção contemplam expressamente, mas não são limitados a, ADC preparados com os agentes reticulados-ligantes a seguir: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS1 LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH1 sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo- MBS, suIfo-SIAB1 sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) os quais são comercialmente oferecidos (por exemplo, pela Pierce Biotechnology1 Inc., Rockford1 IL., U.S.A; ver páginas 467-498, 2003-2004 Aplicações Handbook e Catalog.

Imunoconjugados compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico podem também ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como HCI de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tal como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tal como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6- diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina rica pode ser preparada como descrito em Vitetta et ai, Science 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil- 3-metildietileno triaminapenta acético marcado com carbono-14 (MX-DTPA) é um agente; quelante exemplificativo para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver W094/11026. Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico pode ser produzida, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. Uma molécula de DNA recombinante pode compreender regiões codificando o anticorpo e porções citotóxicas do conjugado sejam adjacentes uma à outra ou separadas por uma região codificando um peptídeo Iigante which não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

Os compostos da presente invenção incluem anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo parente são substituídos com um aminoácido de cisteína livre. Um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia compreende um ou mais aminoácidos de cisteína livre dotados de um valor de reatividade de tiol na faixa de 0,6 a 1,0. Um aminoácido de cisteína livre é um resíduo de cisteína que foi trabalhado por engenharia em um anticorpo parente e não é parte de uma ponte disulfeto.

Em um aspecto, o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia é preparado por um processo compreendendo:

(a) substituir um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo parente por cisteína; e

(b) determinar a reatividade de tiol do anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia ao reagir o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia com um reagente reativo a tiol.

O anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia pode ser mais reativo do que o anticorpo parente com o reagente reativo a tiol.

Os resíduos de cisteína livres de aminoácido podem ser localizados nas cadeias pesadas ou leves, ou nos domínios constante o u variável. Fragmentos de anticorpo, por ,exemplo, Fab, podem também ser trabalhados por engenharia com um ou mais aminoácidos de cisteína substituindo os aminoácidos do fragmento de anticorpo, para formar fragmentos de anticorpo de cisteína trabalhados por engenharia.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de preparar (produzir) um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia, compreendendo:

(a) introduzir um ou mais aminoácidos de cisteína into um anticorpo parente de modo a gerar o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia; e

(b) determinar a reatividade de tiol do anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia com um reagente reativo a tiol;

em que o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia é mais reativo do que o anticorpo parente com o reagente reativo a tiol.

Etapa (a) do método de preparar um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia pode compreender:

(i) mutacionar a seqüência de ácido nucleico codificando o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia;

(ii) expressar o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia; e

(iii) isolar e purificar o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia.

Etapa (b) do método de preparar um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia pode compreender expressar o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia em uma partícula viral selecionada a partir de um fago ou uma partícula fagomid.

Etapa (b) do método de preparar um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia pode também compreender:

(i) reagir o anticorpo de cisteína trabalhado, por engenharia com um reagente de afinidade reativo a tiol para gerar um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia marcado por afinidade; e

(ii) medir a ligação do anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia marcado por afinidade a um meio de captura.

Outro aspecto da presente invenção é um método de varredura de anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia com aminoácidos de cisteína não pareados altamente reativos para reatividade a tiol compreendendo:

(a) introduzir um ou mais aminoácidos de cisteína em um anticorpo parente de modo a gerar um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia;

(b) reagir o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia com um reagente de afinidade reativo a tiol para gerar um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia marcado por afinidade; e

(c) medir a ligação do anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia marcado por afinidade em um meio de captura; e

(d) determinar a reatividade de tiol do anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia com o reagente reativo a tiol.

Etapa (a) do método de varredura de anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia pode compreender:

(ii) expressar o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia; e

(iii) isolar e purificar o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia.

Etapa (b) do método de varredura de anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia pode compreender expressar o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia em uma partícula viral selecionada a partir de um fago ou uma partícula fagomid.

Etapa (b) do método de varredura de anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia pode também compreender:

(i) reagir o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia com um reagente de afinidade reativo a tiol para gerar an anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia marcado por afinidade; e

Anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia podem ser úteis no tratamento de câncer e incluem anticorpos específicos para superfície celular e receptores de transmembrana, e antígenos associados um tumor (TAA). Os referidos anticorpos podem ser usados como anticorpos nus (não conjugado a um fármaco ou fração marcada) ou como conjugados anticorpo- fármaco (ADC) de Fórmula I, Ia1 Ia ou II.

Modalidades dos métodos para preparar e varrer um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia incluem onde o anticorpo parente é um fragmento de anticorpo, tal como hu4D5Fabv8. O anticorpo parente pode também ser uma proteína de fusão compreendendo uma seqüência de peptídeo de ligação a albumina (ABP).

Anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia da presente invenção podem ser acoplados específica e eficientemente a campo com um reagente reativo a tiol. O reagente reativo a tiol pode ser um reagente Iigante multifuncional, um reagente de marcação de captura, um reagente fluoróforo, ou um indenominadoiato Iigante de fármaco.

O anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia pode ser marcado com uma marcação detectável, imobilizado em um suporte de fase sólida e/ou conjugado com uma fração de fármaco.

Outro aspecto da presente invenção é um composto conjugado de anticorpo-fármaco co mpreendendo u m anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia (Ab)1 e uma fração de fármaco (D) em que o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia é fixado através de um ou mais aminoácidos de cisteína livre por uma fração Iigante (L) to D; o composto dotado de Fórmula Ia:

Ab(LD)p Ia

onde ρ é 1, 2, 3, ou 4; e em que o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia é preparado por um processo compreendendo substituir um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo parente por um ou mais aminoácidos de cisteína livre. Frações de fármaco incluem, mas não são limitados a uma maitansinoide, uma auristatina, uma dolastatina, um tricoteceno, CC1065, uma caliqueamicina e outros antibióticos enediina, um taxano, uma antraciclina, e estereoisômeros, isosteres, análogos ou derivados dos mesmos. Frações de fármaco exempIificativas incluem DM1, MMAE, e MMAF. Conjugados anticorpo-fármaco exemplificativos são determinados na Publicação de Patente US No. 20070092940 A1.

O conjugado anticorpo-fármaco de Fórmula Ia pode adicionalmente compreender uma seqüência de peptídeo de ligação a albumína (ABP); a composição dotada de Fórmula Ia':

ABPAb(LD)p Ia'

Anticorpos da presente invenção compreendendo proteínas de fusão com seqüências ABP são ensinadas por: (i) Dennis et a/.(2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 nas Tabelas Ill e IV, página 35038; (ii) US 20040001827 na [0076] SEQ ID NOS: 9-22; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12-13, SEQ ID NOS: z1-z14, e todas as quais estão incorporadas aqui por referência.

VII. Anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia (TioMAbs ε TIOFABS)

Os compostos da presente invenção incluem anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo parente ou do tipo selvagem são substituídos com um aminoácido de cisteína. Qualquer forma de anticorpo pode ser trabalhada por engenharia, isto é modificada. Por exemplo, um fragmento de anticorpo Fab parente pode ser trabalhado por engenharia para formar a cisteína trabalhada por engenharia Fab1 referida aqui como "TioFab." De modo similar, um anticorpo monoclonal parente pode ser trabalhado por engenharia para formar um "TioMab." Deve ser observado que um único campo de mutação produz um único resíduo de cisteína trabalhado por engenharia em um TioFab, embora um único campo de mutação produz dois resíduos de cisteína trabalhado por engenharia em um TioMab, em virtude da natureza dimérica do anticorpo IgG. Mutantes com resíduos de cisteína (Cys) substituídos ("trabalhado por engenharia") são avaliados para a reatividade dos novos grupos cisteína tiol recentemente introduzizdos, trabalhados por engenharia. O valor de reatividade de tiol é um termo numérico relativo na faixa de 0 a 1,0 e pode ser medido para qualquer anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia. Valores de reatividade de tiol de anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia da presente invenção estão na faixa de 0,6 a 1,0; 0,7 a 1,0; ou 0,8 a 1,0.

Os métodos de configuração, seleção, e preparação da presente invenção capacitam os anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia que são reativos com funcionalidade eletrófila. Os referidos métodos adicionalmente permitem que os compostos conjugados de anticorpo tais como os compostos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) com moléculas de fármaco em campos designados, projetados, seletivos. Resíduos de cisteína reativos em uma superfície de anticorpo permitem especificamente a conjugação de uma fração de fármaco através de um grupo reativo tiol tal como maleimida ou haloacetila. A reatividade niocleofílica da funcionalidade tiol de uma um resíduo Cys de um grupo maleimida é cerca de 1000 vezes maior em comparação a qualquer outra fucionalidade de aminoácido em uma proteína, tal como grupo amino de resíduos de Iisina ou o grupo amino N-terminal. Funcionalidade específica de tiol em reagentes iodoacetila e maleimida pode reagir com grupos amina, mas pH mais elevados (> 9,0) e temposd e reação mais longos são necessários (Garman, 1997, Non-Radioactive Marcação: A Practical Approach, Academic Press, London).

Anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia da presente invenção preferivelmente retêm a capacidade de ligação de antígeno de suas contrapartes parentes de anticorpo do tipo selvagem. Assim, anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia são capazes de ligação, preferivelmente especificamente, a antígenos. Os referidos antígenos incluem, por exemplo, antígenos associados um tumor (TAA), proteínas receptoras de superfície celular e outras moléculas de superfície celular, proteínas de transmembrana, proteínas de sinalização, fatores regulatórios de sobrevivência celular, fatores regulatórios de proliferação celular, moléculas associadas com (por exemplo, conhecidas ou com suspeita de contribuir funcionalmente a) desenvolvimento de tecido ou diferenciação, linfoquinas, citoquinas, moléculas envolvidas em regulação do ciclo celular, moléculas envolvidas em vasculogênese e moléculas associadas com (por exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente a) angiogênese. O antígeno associado um tumor pode ser um fator de diferenciação de grupo (isto é, uma proteína CD). Um antígeno ao qual um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia é capaz de ligação pode ser um membro de um subconjunto de uma das categorias acima mencionadas, em que o(s) outro(s) subconjunto(s) da referida categoria compreendem outras moléculas/antígenos que são dotadas de uma característica distinta (com relação ao antígeno de interesse).

O anticorpo parente pode também ser um anticorpo anti-Robo4 humano ou humanizado ou Fab dotado de qualquer uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das seqüências HVR descritas aqui. Anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia da presente invenção podem ser específica e eficientemente acoplados a campo com um reagente reativo a tiol. O reagente reativo a tiol pode ser um reagente Iigante multifuncional, um reagente de marcação de captura, isto é afinidade (por exemplo, um Iigante reagente de biotina), uma marcação de detecção (por exemplo, um reagente fluoróforo), um reagente de imobilização de fase sólida (por exemplo, SEPHAROSE™, poliestireno, ou vidro), ou um indenominadoiato Iigante de fármaco. Um exemplo de um reagente reativo a tiol é N-etil maleimida (NEM). Em uma modalidade exemplificativa, a reação de um TioFab com um Iigante reagente de biotina proporciona um TioFab biotinilado pelo qual a presença e a reatividade do resíduo de cisteína trabalhado por engenharia pode ser detectado e medido. Reação de um TioFab com um reagente Iigante multifuncional proporciona um TioFab com um Iigante funcionalizado que pode ser adicionalmente reagido com um reagente de fração de fármaco ou outra marcação. Reação de um TioFab com um indenominadoiato Iigante de fármaco proporciona um conjugado de farmaco TioFab.

A referida abordagem pode ser aplicada para a conjugação de outros agentes reativos de tiol em que o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um dissulfeto de piridila, ou outro parceiro de conjugação reatico a tiol (Haugland, 2003, Molecular Sondas Handbook de Fluorescent Sondas and Research Chemicals, Molecular Sondas, Inc.; Brinkley1 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Marcação: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). O parceiro pode ser um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina tal como doxorubicina ou toxina 4 pertussis), um fluoróforo tal como um corante fluorescente como fluoresceínaa ou rodamina, um agente quelante para um metal de imagem ou radioterapêutico, uma marcação peptidila ou não-peptidila ou tag de detecção, ou um agente de modificação de depuração tal como diversos isômeros de polietileno glicol, um peptídeo que se liga a um terceiro componente, ou outro carboidrato ou agente lipófilo.

Os campos identificadas no fragmento de anticorpo exemplificativo estão pricipalmente no domínio constante de um anticorpo que é bem conservados por todas as espécies de anticorpos. Os referidos campos dxevem ser amplamente aplicáveis a outros anticorpos, sem necessidade adicional de configuração estrutural ou conhecimento de estrutura de anticorpos específicas, e sem interferência nas propriedades de ligação de antígeno inerentes aos domínios variáveis do anticorpo.

O teste PHESELECTOR (Fago ELISA para a Seleção de tióis Reativos, descrito em W02006/034488 (aqui incorporada por referência em sua totalidade)) permite a detecção de grupos de cisteína reativos em anticorpos em um formato de fago ELISA. O processo de revestimento de uma proteína {por exemplo, anticorpo) de interesse em superfícies de cavidade, seguido de incubação com partículas de fago e então anticorpo secundário marcado com HRP com detecção de absorção é detalhado em W02006/034488. Proteínas mutantes exibidas em fago podem ser varridas em uma maneira rápida, robusta, e de alta produtividade. Bibliotecas de anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia podem ser produzidas e submetidas a seleção de ligação utilizando a mesma abordagem para identificar campos apropriadamente reativos de incorporação de Cys livre a partir de bibliotecas de anticorpos aleatórios proteína-fago ou outras proteínas. A referida técnica inclui reagir proteínas mutantes de cisteína exibidas em fago com um reagente de afinidade ou grupo reportador que é também tiol-reativo.

Anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia que podem ser úteis no tratamento de câncer incluem, mas não são limitados a, anticorpos contra receptores de superfície celular e antígenos associados um tumor (TAA). Os referidos anticorpos podem ser usados como anticorpo nus (não conjugados a um fármaco ou fração marcada) ou como conjugados anticorpo- fármaco de Fórmula I1 Ia, Ia', ou Il (ADC). Antígenos associados um tumor são conhecidos na técnica, e podem ser preparados para uso na geração de anticorpos utilizando métodos e informação que são bem conhecidos na técnica. Em tentativas de descobrir alvos celulares eficazes para diagnóstico e terapia de câncer, pesquisadores procura ram identificar transmembrana ou então polipeptídeos associados um tumor que são especificamente expressos na superfície de um ou mais tipo(s) particular de célula de câncer em comparação com on uma ou mais célula(s) normal não-cancerosa ou expressa na superfície de células angiogênicas (tais como células endoteliais vasculares) em comparação com células não endoteliais não associadas com câncer. Com freqüência, os referidos polipeptídeos associados um tumor são mais abundantemente expressos na superfície de a células de câncer ou células angiogênicas em comparação com a superfície das células não cancerosas ou células não angiogênicas. A identificação dos referidos polipeptídeos de antígeno celular de superfície associado um tumor suscitaram a capacidade de especificamente se direcionar a células de câncer ou células angiogênicas para destruição por meio de terapia com base em anticorpo.

Em ainda outra modalidade, um anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (tal como streptavidina) para utilização em pré-direcionamento um tumor em que o conjugado receptor de anticorpo é administrado ao paciente, seguido por remoção do conjugado não ligado a partir da circulação utilizando um agente de depuração e então administrar um "ligante" (por exemplo, avidina) which é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo). VIII. Métodos de Tratamento Utilizando Anticorpos anti-Robo4

É contemplado que os anticorpos anti-Robo4 (incluindo, por exemplo, anticorpos nus anti-Robo4 e ADC) da presente invenção podem ser usados para tratar diversas doenças ou desordens, por exemplo, caracterizadas pela superexpressão de um tumor ou angiogênese associada antígeno tal como Robo4. Condições exmeplificativas de desordens hiperproliferativas incluem condições patológicas associadas com proliferação anormal ou indesejada de célula endotelial, tal como proliferação celular vascular anormal ou indesejada em desordens incluindo, mas não limitadas a, câncer, angiogênese e desordens associadas com (por exemplo, aumento por proliferação de célula endotelial dentro do tecido que está experimentando a disfunção) tumores sólidos e metástase, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado e outros tecidos, artrite reumatoide, e psoríase.

Os anticorpos anti-Robo4 e compostos ADC que são identificados em modelos animais e testes com base em células podem ser adicionalmente testados em testes clínicos em humanos e em priomatas superiores portadores de tumor. Testes clínicos em humanos podem ser projetados para testar a eficácia do anticorpo anti-Robo4 monoclonal ou imunoconjugado da presente invenção em pacientes experimentando uma disfunção de célula proliferativa incluindo sem limitação condições patológicas associadas com proliferação de célula endotelial anormal ou indesejada, tal como proliferação celular vascular anormal ou indesejada em desordens incluindo, mas não limitadas a, câncer, angiogênese e desordens associadas com (por exemplo, aumento por proliferação de célula endotelial dentro do tecido que está experimentando a disfunção) tumores sólidos e metástase, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares tal como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado e outros tecidos, artrite reumatoide, e psoríase. O teste clínico pode ser projetado para avaliar a eficácia de um anticorpo anti-Robo4 em combinações com regimes terapêuticos conhecidos, tais como radiação e/ou quimioterapia envolvendo conhecidos quimioterapêuticos e/ou agente citotóxicos.

O câncer pode compreender células que expressam Robo4, de modo que um anticorpo anti-Robo4 da presente invenção é capaz de se ligar às células endoteliais que expressam Robo4 dentro do tecido canceroso. Para determinar a expressão Robo4 no câncer, diversos testes diagnósticos/prognósticos são disponíveis. Em uma modalidade, a superexpressão de Robo4 pode ser analisada por IHC. Seções de tecido embebidas em parafina a partir de uma biópsia de tumor podem ser submetidas à teste IHC e concedido um critério de intensidade de coloração de proteína Robo4 com relação ao grau de coloração e em que proporção de células tumorais examinadas. Em uma modalidade, a superexpressão de Robo4 pode ser analisada por detecção in vivo ou in vitro de anticorpo anti- Robo4 marcado com um marcador detectável posto em contato com células que expressam Robo4 in vivo. Marcadores detectáveis incluem sem limitação radioisótopos, compostos fluorescentes, nanopartículas metálicas e/ou magnéticas, microbolhas, Iigantes quelantes, e outros marcadores detectáveis como descrito aqui.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo anti-Robo4 dependerá do, tipo de doença a ser tratada, como definido acima, a gravidade e o curso da doença, se a molécula é administrada com fim preventivo ou terapêutico, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e da ponderação do médico que está atendendo. A molécula é adequadamente administrada ao paciente de uma vez ou em uma serei de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μ9/Ι<9 a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de molécula é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica deve variar a partir de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplificativa de ADC a ser administrada a um paciente é na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg do peso do paciente.

Para administrações repetidas por diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que a supressão desejada dos sintomas da doença ocorra. Um regime de dosagem exemplificativo compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg de um anticorpo anti-Robo4. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. Em ainda outra modalidade, a faixa de dosagem é 275-375 mg/m2. O progresso da referida terapia é facilmente monitorado por técnicas e testes convencionais.

A. Administração de Anticorpos anti-Robo4 Os anticorpos anti-Robo4 (e agente terapêutico adjunto) da presente invenção podem ser administrados por qualquer via apropriada para a condição a ser tratada, incluindo parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Os anticorpos anti-Robo4 serão tipicamente administrados por via parenteral, isto é infusão, subcutânea, intramuscular, intravenosas, intradermal, intratecal, epidural, intraarterial, e intraperitoneal. Adicionalmente, o anticorpo é adequadamente administrado por infusão de pulso, particularmente com doses decrescentes do anticorpo. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tal como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte em se a administração é breve ou crônica.

Para tratar cânceres ou qualquer doença na qual ocorra angiogênese, o anticorpo anti-Robo4 ou conjugado anticorpo-fármaco é administrado por meio de infusão intravenosa. A dosagem administrada por meio de infusão é na faixa de cerca de 1 pg/m2 a cerca de 10,000 pg/m2 por dose, em geral uma dose por semana por um total de uma, duas, três ou quatro doses. Alternativamente, a faixa de dosagem é cerca de 1 pg/m2 a cerca de 1000 pg/m2, cerca de 1 pg/m2 a cerca de 800 pg/m2, cerca de 1 pg/m2 a cerca de 600 pg/m2, cerca de 1 pg/m2 a cerca de 400 pg/m2, cerca de 10 pg/m2 a cerca de 500 pg/m2, cerca de 10 pg/m2 a cerca de 300 pg/m2, cerca de 10 pg/m2 a cerca de 200 pg/m2, ou cerca de 1 pg/m2 a cerca de 200 pg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, múltiplas vezes por semana, mas menos do que uma vez por dia, múltiplos vezes por mês mas menos do que uma vez por dia, múltiplas vezes por mês mas menos do que uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para suavizar ou aliviar os sintomas da doença. A administração pode continuar em qualquer dos itnervalos descritos até que os sintomas da doença ou disfunção sendo tratada sejam reduzidos, aliviados, ou eliminados (por exemplo, como indicado por retração de um tumor, redução de eliminação de sintomas de linfoma, leucemia, inibição de disseminação metastática sem retração do tumor primário (isto é, sobrevivência livre de progressão), inibição de neovascularização ocular). A administração pode continuar após a remissão ou alívio dos sintomas ser alcançado onde as referidas remissão ou alívio é prolongado pela referida administração continuada.

A presente invenção também proporciona um método de tratar um câncer, e/ou uma metástase de um câncer e/ou uma disfunção ocular caracterizada por proliferação de células endoteliais vasculares, compreendendo administrar a um paciente sofrendo a partir da referida disfunção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti- Robo4 de qualquer uma das modalidades precedentes, cujo anticorpo não é conjugado a uma molécula citotóxica ou uma molécula detectável. O anticorpo será tipicamente administrado em uma faixa de dosagem de cerca de 1 ug/m2 a cerca de 1000 mg/m2. Alternativamente, a faixa de dosagem é de cerca de 1 ug/m2 a cerca de 800 ug/m2, cerca de 1 ug/m2 a cerca de 600 ug/m2, cerca de 1 ug/m2 a cerca de 400 ug/m2, cerca de 10 ug/m2 a cerca de 500 ug/m2, cerca de 10 ug/m2 a cerca de 300 ug/m2, cerca de 10 ug/m2 a cerca de 200 ug/m2, ou cerca de 1 ug/m2 a cerca de 200 ug/m2.

A presente invenção também proporciona um método de tratar um câncer, e/ou uma metástase de um câncer e/ou uma disfunção ocular caracterizada por proliferação de células endoteliais vasculares, compreendendo administrar a um paciente sofrendo a partir da referida disfunção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti- Robo4 de qualquer uma das modalidades precedentes, cujo anticorpo é conjugado a uma molécula citotóxica ou uma molécula detectável. O anticorpo será tipicamente administrado em uma faixa de dosagem de cerca de 1 ug/m2 a cerca de 1000 mg/m2. Alternativamente, a faixa de dosagem é de cerca de 1 ug/m2 a cerca de 800 ug/m2, cerca de 1 ug/m2 a cerca de 600 ug/m2, cerca de 1 ug/m2 a cerca de 400 ug/m2, cerca de 10 ug/m2 a cerca de 500 ug/m2, cerca de 10 ug/m2 a cerca de 300 ug/m2, cerca de 10 ug/m2 a cerca de 200 ug/m2, ou cerca de 1 ug/m2 a cerca de 200 ug/m2.

B. Formulações farmacêuticas

Em um aspecto, a presente invenção adicionalmente proporciona formulações farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo anti- Robo4 da presente invenção e/ou pelo menos um imunoconjugado dos mesmos e/ou pelo menos um conjugado de anticorpo anti-Robo4-fármaco da presente invenção. Em algumas modalidades, uma formulação farmacêutica compreende 1) um anticorpo anti-Robo4 e/ou um conjugado anticorpo anti- Robo4-fármaco e/ou um imunoconjugado dos mesmos, e 2) um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma formulação farmacêutica compreende 1) um anticorpo anti-Robo4 e/ou um imunoconjugado dos mesmos, e opcionalmente, 2) pelo menos um agente terapêutico adicional.

Formulações farmacêuticas compreendendo um anticorpo ou imunoconjugado da presente invenção ou o conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção são preparadas para armazenamento ao misturar o anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco dotado do grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) na forma de soluções aquosas ou Iiofilizadas ou outras formulações secas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos receptores em dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônia; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio); fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menor do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, mannose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares, tal como sucrose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não- iônicos tal como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). Formulações farmacêuticas a serem usadas para administração in vivo são em geral estéreis. Isto é prontamente realizado por filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

Ingredientes ativos podem também ser acondicionados em microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de envio de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. As referidas técnicas são descritas em Remington1S Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol1 A. Ed. (1980).

As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo ou imunoconjugado da presente invenção, cujas matrizes são na forma de artigos formados, por exemplo, filmes, ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactidas (Patente US No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de vinil etileno não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico ácido glicólico tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuproleto), e ácido poli- D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como acetato de vinil etileno e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por cerca de 100 dias, determinados hidrogéis liberam proteína por períodos de tempo mais curto. Quando anticorpos encapsulados ou imunoconjugados permanecem no corpo por um longo tempo, os mesmos podem desnaturar ou agregar em resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças em i munogenicidade. Estratégias racionais podem ser previstas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação é a formação de uma ligação S-S intermolecular através do intercâmbio de tio- disulfeto, a estabilização pode ser alcançada ao modificar resíduos sulfidrila, liofilização a partir de soluções acídicas, controlando o teor de umidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições de matriz de polímero específicas.

A formulação aqui pode também conter mais do que um composto ativo como necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. As referidas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o objetivo pretendido.

C. Terapia de Combinação Um anticorpo anti-Robo4s da presente invenção pode ser combinado em uma formulação de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação, com pelo menos um composto adicional dotado de propriedades anticâncer. O pelo menos um composto adicional da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem preferivelmente é dotado de atividades complementares para a composição de anticorpo anti-Robo4 de modo que os mesmos não afetem adversamente um ao outro. O pelo menos um composto adicional pode ser um agente quimioterapêutico, um agente citotóxico, uma citoquina, um agente inibidor de crescimento, um agente anti-hormonal, e combinações dos mesmos. As referidas moléculas são adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o objetivo pretendido. Uma composição farmacêutica contendo um anticorpo anti-Robo4 da presente invenção pode também compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterapêutico tal como um inibidor de formação de tubulina, um inibidor de topoisomerase, ou um agente de ligação de DNA.

Em um aspecto, o primeiro composto é um ADC anti-Robo4 da presente invenção e o pelo menos um composto adicional é um anticorpo terapêutico diferente de um anti-Robo4 (anticorpo nu ou um ADC). Em uma modalidade, o pelo menos um composto adicional é um anticorpo que se liga a um marcador de supefície celular de câncer. Em uma modalidade o pelo menos um composto adicional é um anticorpo anti-HER2, trastuzumab (por exemplo, Herceptin®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Em uma modalidade o pelo menos um composto adicional é um anticorpo anti-HER2, pertuzumab (Omnitarg™, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, ver US6949245). Em uma modalidade, o pelo menos um composto adicional é um anticorpo anti-VEGF (por exemplo, AVASTIN®, Genentech, Inc.). Em uma modalidade, o pelo menos um composto adicional é um anticorpo (seja um anticorpo nu ou um ADC), e o anticorpo adicional é um segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto anticorpo ou mais, de modo que a combinação dos referidos segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, ou mais anticorpos (seja nu ou como um ADC) é eficaz em tratar a doença de célula proliferativa em um tecido que expressa Robo4.

Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com: a administração de um agente anticâncer identificado de acordo com a presente invenção, incluindo sem limitação terapia de radiação e/ou medula óssea e transplantes de sangue periférico, e/ou um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, ou um agente inibidor de crescimento. Em uma das referidas modalidades, um agente quimioterapêutico é um agente ou uma combinação de agentes, tal como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorubincin, vincristina (ONCOVIN™), prednisolona, CHOP, CVP1 ou COP, ou immunoterapêuticos tais como anti- PSCA, anti-HER2 (por exemplo, HERCEPTIN®, OMNITARG™) ou anti-VEGF (por exemplo, AVASTIN®). A terapia de combinação pode ser administrada como um regime simultâneo ou seqüencial. Quando administrada seqüencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações. A administração combinada inclui coadministração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e a administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferivelmente há um período de tempo enquanto ambos os (ou todos) agentes ativos simultaneamente exercem suas atividades biológicas.

Em uma modalidade, o tratamento com um anticorpo anti-Robo4 envolve a administração combinada de um agente anticâncer aqui identificado, e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores de crescimento, incluindo coadministração de cocktails de diferentes Agentes quimioterapêuticos. Agentes quimioterapêuticos incluem taxanos (tais como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos antraciclina. Programas de preparação e de dosagem para os referidos agentes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente por aqueles versados na técnica. Pogramas de preparação e de dosagem para a referida quimioterapia são também descritos em "Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. Dosagens adequadas para qualquer um dos agentes coadministrados acima são aqueles atualmente usados e podem ser reduzidos em virtude da ação combinada (sinergia) dos agentes recém identificados e outros agentes quimioterapêuticos ou tratamentos.

A terapia de combinação pode proporcionar "sinergia" e prove "sinergística", isto é o efeito alcançado quando os ingredientes ativos usados juntos é maior do que a soma dos efeitos que resultam a partir da utilização dos compostos separadamente. O efeito sinergístico pode ser alcançado quando os ingredientes ativos são: (1) co-formulados e administrados ou enviados simultaneamente em uma formulação combinada de unidade de dosagem; (2) enviados por alternância ou em paralelo às formulações separadas; ou (3) por algum outro regime. Quando enviados em terapia de alternância, um efeito sinergístico pode ser alcançado quando os compostos são administrados ou enviados seqüencialmente, por exemplo, por diferentes injeções em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternância, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada seqüencialmente, isto é em série, enquanto que em terapia de combinação, dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas juntas.

Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da presente invenção (quando usado isoladamente ou em combinação com outros agentes tais como agentes quimioterapêuticos) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo administrado tiver objetivo preventivo ou terapêutico, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e do critério do médico que atende. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em um momento ou em uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 Mg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica deve variar a partir de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas por diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que a desejada supressão de sintomas da doença ocorra. Uma dosagem exemplificativa do anticorpo estaria na faixa a partir de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação dos mesmos) pode ser administrada ao paciente. As referidas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba a partir de cerca de duas a cerca de vinte, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose de alta carga inicial, seguida por uma ou mais doses mais baixas pode ser administrada. Um regime de dosagem exemplificativo compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso da referida terapia é facilmente monitorado por técnicas e testes convencionais.

IX. Anticorpos Marcados ε Usos Dos mesmos A presente invenção também proporciona anticorpos marcados anti-Robo4. Anticorpos marcados podem ser úteis em testes diagnósticos, por exemplo, em testes in vitro, ex vivo, ou in vivo para detectar expressão de Robo4 em células específicas ou tecidos (por exemplo, para imagear angiogênese, neovascularização, e/ou vasculatura do tumor). Em algumas modalidades, os anticorpos marcados são usados em testes de imagem in vivo. Os anticorpos anti-Robo4 da prçsente invenção, podem ser conjugados com qualquer fração marcada que pode ser fixada de forma covalente ao anticorpo. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Robo4 da presente invenção (incluindo, por exemplo, o anticorpo de cisteína trabalhado por engenharias anti-Robo4) são fixados de forma covalente ao anticorpo através de um grupo reativo no anticorpo, tal como uma Iisina reativa ou resíduo de cisteína. Fixação covalente através de um grupo tiol reativo a cisteína é descrita em Singh et ai, Anal. Biochem. 304:147-15 (2002); Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Proteína Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton1 FL.

A marcacao fixada pode funcionar para: (i) proporcionar um sinal detectável; (ii) interagir com uma segunda marcação para modificar o sinal detectável proporcionado pela primeira ou segunda marcação, por exemplo, para proporcionar FRET (transferência de energia fluorescente ressonante); (iii) estabilizar as interações ou aumentar a afinidade de ligação, com antígeno ou ligante; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética ou permeabilidade celular, por carga, hidrofobicidade, formato, ou outros parâmetros físicos, ou (v) proporcionar uma fração de captura, para modular a afinidade do ligante, anticorpo/ligação de antígeno, ou complexação iônica.

Para aplicações diagnosticas, o anticorpo será tipicamente marcado com uma fração detectável. Numerosas marcações são disponíveis as quais podem ser em geral agrupadas nas categorias a seguir:

(a) Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Robo4 são marcados com radioisótopos (radionuclídeos), tais como 3H, 11C, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111ln, 1231, 1241, 1251, 1311, 133Xe, 177Lu, 211At, ou 213ΒΪ. Anticorpos anti-Robo4 marcados com radioisótopos são úteis em imagem direcionada a receptor de células que expressam Robo4, (por exemplo, para uso em diagnóstico da 4 presente invenção tal como imagem in vivo de tumor de células endoteliais, vasculatura do tumor, angiogênese, e neovascularização).

(b) Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Robo4 são marcados com Iigante reagentes que ligam, promovem quelação ou de outro modo formam complexo com um metal radioisótopo onde o reagente é reativo com a cisteína tiol trabalhada por engenharia do anticorpo, utilizando as técnicas como descrito em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al, Ed. Wiley-lnterscience, New York, NY1 Pubs. (1991). Ligantes quelantes que podem complexar um íon de metal incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Reagentes de ligação quelantes tal como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados por uma reação de aminobenzil-DOTA com ácido 4- maleimidobutírico (FIuka) ativado com isopropilcloroformato (Aldrich), seguindo o procedimento de Axworthy et al.(2000) PNAS USA 97(4): 1802-1807). Reagentes DOTA-maleimida reagem com os aminno ácidos de cisteína livre dos anticorpos de cisteína trabalhados por engenharia e proporcionam um Iigante de complexação de metal no anticorpo (Lewis et al., Bioconj. Chem. 9:72-86 (1998)). Reagentes de marcação Iigantes quelantes tal como DOTA- NHS mono (éster N-hidróxisuccinimida) de ácido (1,4,7,10- tetraazaciclododecane-1,4,7,10-tetracético são comercialmente oferecidos (Macrocyclics, Dallas, TX). Radionuclídeos podem ser direcionados por meio de complexação com os conjugados anticorpo-fármaco da presente invenção (Wu et al. Nature Biotech. 23(9):1137-1146 (2005)). Imageamento direcionado a receptor com anticorpos marcados com radionuclídeo podem proporcionar um marcador de de maior expressão direcionada por detecção e quantificação de acúmulo progressivo de anticorpos em tecido tumoral (Albert et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210 (1998)). Os os radio-metais conjugados podem premanecer intracelular em seguida de degradação lisossomal. Complexos de metal-quelato adequados como marcações de anticorpo para experimentos de imageamento são descritos: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et ai, Anal. Biochem. 142:68-78 (1984); Mirzadeh et ai, Bioconjugate Chem. 1:59-65 (1990); Meares et al., J. Câncer, Suppl. 10:21-26 (1990); Izard et ai., Bioconjugate Chem. 3:346-350 (1992); Nikula et al., Nucl. Med. Biol. 22:387-90 (1995); Camera et ai., Nuci Med. Biol. 20:955-62 (1993); Kukis et ai, J. Nuci Med. 39:2105-2110 (1998); Verei et ai, J. Nucl. Med. 44:1663-1670 (2003); Camera et ai, J. Nucl. Med. 21:640-646 (1994); Ruegg et al., CancerRes. 50:4221 -4 226 (1990); Verei et ai, J. Nucl. Med. 44:1663-1670 (2003); Lee et ai, CancerRes. 61:4474-4482 (2001); Mitchell1 et ai, J. Nucl. Med. 44:1105-1112 (2003); Kobayashi et ai, Bioconjugate Chem. 10:103-111 (1999); Miederer et ai, J. Nucl. Med. 45:129 - 137 (2004); DeNardo et al., Clinicai CancerResearch 4:2483-90 (1998); Blend et ai, Câncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363 (2003); Nikula et ai, J. Nucl. Med. 40:166-76 (1999); Kobayashi et ai, J. Nucl. Med. 39:829 -36 (1998); Mardirossian et ai, Nucl. Med. Biol. 20:65-74 (1993); Roselli et ai, Câncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20 (1999).

(c) Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Robo4 são marcados com marcações fluorescentes tais como quelatos de terras raras (quelatos de európio), tipos fluoresceína incluindo FITC1 5-carboxifluoresceína, 6-carboxi flúor esceína; tipos rodamina incl uindo TAMRA; dansil; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; Vermelho Texas; e análogos dos mesmos. As marcações fluorescentes podem ser conjugadas a anticorpos utilizando as técnicas como descrito em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. Corantes fluorescentes e reagentes de marcação ^fluorescente -incluem aqueles que são comercialmente oferecidos a1 partir de Invitrogen/Molecular Sondas (Eugene, OU) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).

(d) Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Robo4 são marcados com diversas marcações enzima-substrato que são disponíveis ou descritas (Patente US No. 4.275.149). A enzima em geral catalisa uma alteração química de um substrato cromogênico que pode ser medido utilizando diversas técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, o que pode ser medido espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma mudança em fluorescência são descritas acima. O substrato quimioluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doar energia a um receptor fluorescente. Exemplos de marcações enzimáticas incluem Iuciferases (por exemplo, Iuciferase do vagalume e Iuciferase bacteriana; Patente US No. 4.737.456), luciferina, 2,3- diidroftalazinedionas, desidrogenase de malato, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina (AP), -galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases sacarídeos {por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tal como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhante. Técnicas para conjugação de enzimas a anticorpos são descritas em O1SuIIivan et a/.( 1981) "Methods for the Preparation of Enzima-Conjugates of antibody for use in Enzima Immunoassay", em Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166.

Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo:

(i) Peroxidase de rábano silvestre (HRP) com hidrogênio peroxidase como um substrato, em que a hidrogênio peroxidase oxida um precursor corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou hidrocloreto de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB));

(ii) fosfatase alcalina (AP) com para-nitrofenil fosfato como substrato cromogênico; e

(iii) -D-galactosidase (-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil--D-galactosidase.

Numerosas outras combinações de enzima-substrato são disponíveis para aqueles versados na técnica. Para uma revisão geral, ver US 4275149 e US 4318980.

Uma marcação pode ser indiretamente conjugada com um anticorpo anti-Robo4 (incluindo, por exemplo, um anticorpo anti-Robo4 de cisteína trabalhado por engenharia). Por exemplo, o anticorpo anti-Robo4 pode ser conjugado com biotina e qualquer das três amplas categorias de marcações mencionadas acima pode ser conjugada com avidina ou streptavidina, ou vice versa. Biotina se liga seletivamente à streptavidina e assim, a marcação pode ser conjugada com o anticorpo anti-Robo4 deste modo indireto. Alternativamente, para alcançar conjugação indireta de uma marcação com o anticorpo anti-Robo4, o anticorpo anti-Robo4 é conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcações mencionados acima é conjugado com variantes de polipeptídeo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Assim, a conjugação indireta da marcação com o anticorpo anti-Robo4 pode ser alcançada (Hermanson, G. (1996) em Bioconjugate Techniquess Academic Press, San Diego).

O anticorpo anti-Robo4 da presente invenção pode ser empregado em qualquer método de teste conhecido, tal como ELISA, testes de ligação competitiva, testes de sanduíche direto e indireto, e testes de imunoprecipitação (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.).

Os anticorpos marcados anti-Robo4 da presente invenção podem detectar receptores de superfície celular e são úteis para localizar, visualizar, e quantificar células endoteliais (por exemplo, tumor de células endoteliais), campos de angiogênese, campos de neovascularização, e/ou vasculatura do tumor. Outro uso para os anticorpos detectavelmente marcados é um método de imunocaptura com base em conta compreendendo conjugação de uma conta com um anticorpo marcado fluorescente e detectar um sinal de fluorescência com a ligação de um ligante. Metodologias de detecção de ligação similares utilizam o efeito de ressonância de plásmon de superfície (SPR) para medir e detectar interações anticorpo-antígeno. O anticorpo anti- Robo4 detectavelmente marcado da presente invenção pode ser empregado em qualquer método de teste conhecido, tal como ELISA, testes de ligação competitiva, testes de sanduíche direto e indireto, e testes de imunoprecipitação (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).

Marcações de detecção tal como corantes fluorescentes e corantes quimioluminescentes (Briggs et al, J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058 (1997)) proporcionam um sinal detectável e são em geral aplicáveis para a marcação de anticorpos, preferivelmente com as propriedades a seguir: (i) o anticorpo marcado deve produzir um sinal bastante alto com baixo fundo de modo que pequenas quantidades de anticorpos podem ser sensivelmente detectadas tanto em testes com base em células como em livres de células; e (ii) o anticorpo marcado deve ser fotoestável de modo que o sinal fluorescente pode ser observado, monitorado e registrado sem significante foto alvejamento. Para aplicações envolvendo ligação de superfície celular de anticorpo marcado a membranas ou superfície celulares, em especial células vivas, as marcações preferivelmente (iii) são dotadas de boa solubilidade em água para alcançar concentração eficaz de conjugado e sensibilidade de detecção e (iv) não são-tóxicas às células vivas de modo a não romper os processos metabólicos normais das células ou ocasionar morte celular prematura.

A quantificação direta de intensidade de fluorescência celular e enumeração de eventos fluorescentemente marcados, por exemplo, ligação de superfície celular de conjugados peptídeo-corante pode ser conduzida em um sistema (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems1 Foster City, Calif.) que automatiza mistura-e-leitura, testes testes não radioativos com células vivas ou contas (Miraglia, "Homogeneous cell- and conta-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). Usos de anticorpos marcados também incluem testes de ligação a receptor de superfície celular, testes de imunocaptura, testes de imunoabsorção ligada a fluorescência (FLISA), caspase-clivagem (Zheng, "Caspase-3 controis both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) PNAS USA 95:618-23; Patente US No. 6.372.907), apoptose (Vermes, J. Immunol. Methods 184:39-51 (1995)) e testes de citotoxicidade. Tecnologia de teste de microvolume fluorométrico pode ser usada para identificar a regulação a maior e a menor por uma molécula que é direcionada à superfície celular (Swartzman, Anal. Biochem. 271:143-51(1999)).

Anticorpos marcados de cisteína trabalhados por engenharia da presente invenção são úteis como biomarcadores de imageamento e sondas pelos diversos métodos e técnicas de imageamento biomédico e molecular tal como: (i) MRI (imagem de ressonância magnética); (ii) tomografia computadorizada de raio-X); (iii) SPECT (tomografia computadorizada de emissão de um único fóton); (iv) PET (tomografia de emissão de pósitron) Chen et al.(2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) bioluminescência; (vi) fluorescência; e (vii) ultra-som. Imunocintigrafia é um procedimento de imagem no qual anticorpos marcados com substâncias radioativas são administrados a um animal ou paciente humano e uma foto é obtida de campos no corpo (por exemplo, tumores incluindo vasculatura do tumor, ou metástases dos mesmos) onde o anticorpo localiza (US 6528624). Biomarcadores de imageamento podem ser objetivamente medidos e avaliados como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Biomarcadores podem ser de diversos tipos: Tipo 0 são marcadores de história natural de uma doença e se correlaciona longitudinalmente com índices clínicos conhecidos, por exemplo, avaliação de MRI de inflamação sinovial em artrite reumatoide; marcadores do Tipo I capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo-de- ação, embora o mecanismo possa não estar associado com resultado clínico; marcadores do Tipo Il funcionam como pontos finais hospedeiros onde a mudança em, ou sinal a partir de, o biomarcador prevê um benefício clínico para "validar" a resposta direcionada, tal como erosão óssea medida em artrite reumatoide por X-ray plano, MRI ou CT. Biomarcadores de imageamento assim podem proporcionar informação terapêutica farmacodinâmica (PD) sobre a: (i) expressão de uma proteína alvo, (ii) ligação de um terapêutico à proteína alvo, isto é seletividade, e (iii) dados de depuração e meia-vida farmacocinética. Vantagens de biomarcadores de imageamento in vivo com relação a biomarcadores com base em Iab incluem: tratamento não invasivo, quantificável, avaliação de corpo total, dosagem repetitiva e avaliação, isto é múltiplos pontos de tempo, e efeitos potencialmente transferíveis a partir de resultados pré-clínicos (pequenos animais) a clínicos (humano). Para algumas aplicações, bioimageamento substitui ou minimiza o número de experimentos animais em estudos pré-clínicos.

Métodos de marcação de peptídeo são bem conhecidos. Ver Haugland1 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley1 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et ai (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes1 C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and Il1 CRC Press1 New York; Pfleiderer1 G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche1 Ed., Walter DeGryter1 Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross- linking, CRC Press, Boca Raton1 Fla.); De Leon-Rodriguez et al.(2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et a/.(2001) Bioconjugate Chem. 12:320- 324; Li et al.(2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al.(2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.

Peptídeos e proteínas marcadas com duas frações, um reportador fluorescente e resfriador em proximidade suficiente sofre transferência de energia fluorescente ressonante (FRET). Grupos reportadores são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados pela luz em determinados comprimentos de onda e trans ferem en ergia a um recept or, ou resfriad or, grupo, com o apropriado desvio de Stokes para emissão com máximo brilho. Corantes fluorescentes incluem moléculas com estendida aromaticidade, tal como fluoresceína e rodamina, e seus derivados. O reportador fluorescente pode ser parcialmente ou significativamente resfriado pela fração resfriadora em um pepetideo intacto. Com a clivagem do peptídep por uma peptidase ou protease, um aumento detectável em fluorescência pode ser medido (Knight1 C. (1995) "Fluorimetric Tests of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology1 Academic Press, 248:18-34).

Os anticorpos anti-Robo4 marcados da presente invenção podem também ser usados como um agente de purificação de afinidade. No referido processo, o anticorpo marcado é imobilizado em uma fase sólida tal como uma resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é posto em contato com uma amostra contendo o antígeno a ser purificado, e após o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra exceto o antígeno a ser purificado, que é ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que irá liberar o antígeno a partir do anticorpo.

Reagentes de marcação tipicamente contêm funcionalidade reativa que pode reagir (i) diretamente com a cisteína tiol de um anticorpo de cisteína trabalhado por engenharia para formar o anticorpo marcado, (ii) com um reagente Iigante para formar um indenominadoiate marcado a ligante, ou (iii) com um ligante anticorpo para formar o anticorpo marcado. A funcionalidade reativa dos reagentes de marcação inclui: maleimida, haloacetila, éster succinimidil iodoacetamida (por exemplo, NHS, N- hidroxisuccinimida), isotiocianato, cloreto de sulfonila, 2,6-diclorotriazinila, éster pentafluorofenila, e fo sforamidita, embora outro s grupos funcionais possam também ser usados.

Um grupo reativo funcional exemplificativo é éster N- hidroxisuccinimidila (NHS) de um grupo carboxila substituinte de uma marcação detectável, por exemplo, biotina ou um corante fluorescente. O éster NHS de uma marcação pode ser pré-formado, isolado, purificado, e/ou caracterizado, ou o mesmo pode ser formado no local e reagido com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Tipicamente, a forma carboxila de uma marcação é ativada ao reagir com alguma combinação de um reagente carbodiimida, por exemplo, dicicloexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, ou um reagente urônio, por exemplo, TSTU tetrafluoroborato de (O-(N-SuccinimidiI)-N1N1N11N'- tetrametilurônio, HBTU hexafluorofosfato de (0-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio), ou HATU hexafluorofosfato (0-(7-azabenzotriazol-1-il)- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametilurônio), um ativador, tal como 1-hidroxibenzotriazola (HOBt), e N-hidroxisuccinimida para proporcionar o éster NHS da marcação. Em alguns casos, a marcação e o anticorpo podem ser acoplados por ativação in situ da marcação e reação com o anticorpo para formar o conjugado marcação-anticorpo em uma etapa. Outros reagentes de ativação e acoplamento incluem TBTU hexafluorofosfato de (2-(1H-benzotriazo-1-il)-1- 1,3,3-tetrametilurônio), TFFH (N,N',N",N"'-tetrametilurônio 2-fluoro- hexafluorofosfato), PyBOP hexafluorofosfato de (benzotriazola-1-il-oxi-tris- pirrolidino-fosfônio, EEDQ (2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-diidro-quinoline), DCC (dicicloexilcarbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), MSNT (1- (mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazola, e haletos de aril sulfonila, por exemplo, cloreto de triisopropilbenzen sulfonila.

Um anticorpo marcado de modo detectável da presente invenção pode ser detectável ao ser ligado a (incluindo conjugado a de forma covalente) uma partícula magnética ou nanopartícula ou partícula metálica ou nanopartícula. Partículas metálicas são detectáveis pelos referidos métodos como imagem de ressonância magnética (MRI), rastreio de molécula simples ou de partícula simples, imunocitoquímica, freqüência de plásmon com microscopia de campo escuro, contraste de intereferência diferencial e intensificação de vídeo, reflexo interno total, e técnica de contraste de interferência fototermal (PIC) (ver, por exemplo PNAS USA 100(20): 11350- 11355 (2003); Sheetz et al. Nature 340:284-288 (1989); Baschong et ai, Histochemistry 83:409-411 (1985); Slot e Geuze, Eur. J. Célula Biol. 38:87-93 (1935); Frey e Frey J. Struct. Biol. 127:94-100 (1999); Hainfeld e Powell1 J. Histochem. Cytochem. 48:471-480 (2000); Schultz et al. PNAS USA 97:996- 1001 (2000); Gelles et al., Nature 331:450-453 (1988); Sonnichsen et ai, Appi Phys. Lett. 77:2949-2951 (2000); Boyer, D. et ai, Science 297:1160-1163 (2002)). Anticorpos anti-Robo4 da presente invenção podem compreender agentes nanoparticulados incluindo, mas não limitadas a, microbolhas (ver Ellegala et al., Circulação 108:336-341 (2003)) ), também referidos como Iipoesferas acusticamente ativas (AALs) (ver Tartis et al., Ultra-som Med. Biol. 32(11): 1771-80 (2006)), agentes superparamagnéticos, lipossomos, emulsões de nanopartículas de perfluorocarbono (W02005014051), e dendrímeros (ver Caruthers et al., Methods in Molecular Medicine, 124:387-400 (2006) e referências citadas na mesma, todas as referências se encontram aqui incorporadas por referência em sua totalidade).

Quando os anticorpos marcados anti-Robo4 são usados para detecção (por exemplo, em estudos cintigráficos), as marcações podem compreender um átomo radioativo (por exemplo, At211, I1311 I1251 Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321 Pb212 e isótopos radioativos de Lu) ou uma marcação de spin para imagem de ressonância nuclear magnética (também conhecida como imagem de ressonância magnética, mri), tal como Tc99m, 1231, 1111n, 1311, 19F, 1H, 14N, 15N, 170, 23Na, 31P, ou 13C, gadolínio, manganês, ferro, ou óxidos de ferro (por exemplo, partículas de óxido de ferro super- paramagnéticas (SPIL) ou partículas de óxido de ferro paramagnéticas ultra- pequenas (USPIL)), ou outros observáveis por NMR.

X. Artigos de Fabricação Em outro aspecto da presente invenção, um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das desordens descritas acima é proporcionado. O artigo de fabricação compreende um recipiente e uma marcação ou dispositivo de inserção de embalagem em ou associado com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a poartir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só ou quando combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição e pode ser dotada de uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco dotado de uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da presente invenção. A marcação ou dispositivo de inserção de embalagem indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha, tal como câncer. Ademais, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da presente invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida na mesma, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional. O artigo de fabricação na referida modaldiade da presente invenção pode adicionalmente compreender um dispositivo de inserção de embalagem indicando que as primeira e segunda composições de anticorpo podem ser usadas para tratar uma condição particular, por exemplo, câncer. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode adicionalmente compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), salina tamponada a fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. O mesmo pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis sob o ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas.

O a seguir são exemplos de métodos e composições da presente invenção. É entendido que diversas outras modalidades podem ser praticadas, given the general descrição proporcionados acima.

Exemplos

Resíduos de aminoácido dentro das seqüências de aminoácidos de anticorpo são numerados de acordo com Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Abreviações de uma letra de aminoácidos são usadas. As degenerações de DNA são representadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).

Exemplo 1: Anticorpos derivados a partir de fago codificando região hipervariável de um anticorpo de partida

As seqüências de ácido nucleico dos domínios VL e VH do anticorpo HERCEPTIN® anti-HER2 rhuMAB 4D5-8 (Genentech, Inc.) foram usadas como as seqüências de partida para mutagênese de HVRs e seleção de fago para ligação a antígeno His-marcado Robo4 humano mostrado na Figura 5B ou proteína de fusão Rob4-Fc humano. Anticorpo 4D5 é um anticorpo humanizado específico para um antígeno associado a câncer conhecido como Her-2 (erbB2). O anticorpo inclui domínios variáveis dotados de regiões de framework de consenso; umas poucas posições foram revertidas para seqüência de camundongo durante o processo de aumentar a affinity do anticorpo humanizado. A seqüência e a estrutura de cristal do anticorpo humanizado 4D5 foram descritos na Patente US No. 6.054.297, Carter et al, PNAS USA 89:4285 (1992), a estrutura de cristal é mostrada em J. MoL Biol. 229:969 (1993) e online em www/ncbi/nih/gov/structure/ mmdb(MMDB#s-990- 992). Os domínios HERCEPTIN® VL e VH compreendem o o domínio kappa I VL humano de consenso e as variantes do domínio VH de consenso de subgrupo Ill humano, respectivamente. O domínio variante VH é dotado de 3; mudanças a partir do consenso humano: R71 A, N73T e L78A. O fagomid usado para este trabalho é um vetor de exibição Fab- g3 monovalente (pV0350-2B) dotado de 2 estruturas de leitura aberta sob o controle do promotor phoA, essencialmente como descrito em Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93. A primeira estrutura de leitura aberta consiste da seqüência stll de sinal fundido para a cadeia leve de receptor de domínios VL e CH1 e a segunda consiste da seqüência stll de sinal fundido para a cadeia pesada de receptor de domínios VL e CH1 seguido por u ma proteína de revestimento de fago P3 menor truncada. Ver Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93.

Exemplo 2: Anticorpos gerados por mutagênese de cadeia pesada HVRs

Clones Fab YW71.6, YW71.1, YW71.22, e YW71.89 foram gerados por mutagênese de HVR-H1, H2, e H3 de huMAb 4D5-8 (HERCEPTIN® anticorpo anti-HER2, Genentech, Inc.) de cadeia pesada e seleção contra proteína de fusão de antígeno rotulada com Robo4-His humano. Em HVR-H1, as posições Kabat 26 (G)1 27 (F), 28 (T)1 29 (I), 34 (I), e 35 (H) foram mantidas constantes, e os aminos ácidos nas posições 30-33 foram variados. Em HVR-H2, posições Kabat 51 (I), 52a (P)1 55 (G), 57 (T), 59 (Y), 60 (A), 61 (D), 62 (S), 63 (V), 64 (K), e 65 (G) foram mantidas constantes, e posições 49, 50, 52, 53, 54, 56, e 58 foram variadas. Em HVR-H3, posições Kabat 93 (A) e 102 (Y) foram mantidas constantes, e posições 94-100, 100a-h, e 101 foram variadas. A cadeia leve de YW71.22 foi a seqüência huMAb 4D5-8 modificada (modificada nas posições 30, 66 e 91 resultando em SEQ ID NO: 168, compreendendo SEQ ID NOS: 1, 2, e 3 como HVR-L1, L2, e L3, respectivamente), as HVRs das quais não foram variadas durante seleção de fago. A diversidade da seqüência foi introduzida em cada região hipervariável por mutagênese de posições selecionadas de aminoácido utilizando técnicas de mutagênese padrão.

Generation de bibliotecas, de fago- Reservatórios de oligonucleotídeos aleatorizados projetados paracada região hipervariável foram fosforilados separadamente em seis reações de 20 μΙ_ contendo 660 ng de oligonucleotídeo, 50 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de MgCI2, 1 mM de ATP, 20 mM de DTT1 e 5 U de polinucleotídeo quinase por 1 hora a 37°C. Os seis reservatórios de oligonnucleotídeos fosforilados foram então combinados com 20 pg de modelo Kunkel em 50 mM de Tris pH 7.5, 10 mM de MgCI2 em um volume final de 500 pL resultando em uma proporção de oligonucleotídeo para modelo de 3. A mistura foi anelada a 90 0C por 4 minutos, 50 0C por 5 minutos e então resfriada em gelo. O excesso de oligonucleotídeo não anelado foi removido com um kit de purificação QIAQUICK™ PCR (Qiagen kit 28106) utilizando um protocolo modificado para evitar desnaturação excessiva do DNA anelado. À 500 pL da mistura anelada, 150 pL de PB foi adicionado, e a mistura foi separada entre 2 colunas de sílica. Em seguida de lavagem de cada coluna com 750 pL de PE e um giro extra para secar as colunas, cada coluna foi elúida com 110 pL de 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA1 pH 8. O modelo anelado e limpo (220 pL) foi então carregado ao se adicionar 1 pL 100 mM de ATP, 10 pL 25 mM de d NTPs (25 mM cada de d ATP, dCTP, dGTP e dTTP), 15 pL 100 mM de DTT, 25 pL 10X tampão TM (0,5 M de Tris pH 7.5, 0,1 M de MgCI2), 2400 U de Iigase T4, e 30 U de polimerase T7 por 3 horas a temperatura ambiente.

O produto carregado foi analisado em géis de Tris-Acetato-EDTA/ agarose (Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)). Três faixas foram em geral visíveis: a faixa de fundo é um produto corretamente carregado e ligado, a faixa do meio é um produto carregado mas não ligado, e a faixa de cima é um produto de fita deslocada. A faixa de cima é produzida por uma atividade lateral intrínseca de polimerase T7 e é difícil de evitar (Lechner et ai, J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983)); entretanto, a referuda faixa transformá 30-vezes menos eficientemente do que a a faixa de fundo e em geral contribui pouco a uma biblioteca. A faixa do meio é em função da ausência de um 5' fosfato para a reação de ligação final; a referida faixa se transforma eficientemente e proporciona diversas seqüências principalmente do tipo selvagem.

O produto carregado foi então purificado e eletroporado em células SS320 e propagado na presença de fago auxiliador M13/K07 como descrito por Sidhu et ai, Methods in En zymology 328:33 3-363 (2000). Os tamanhos das bibliotecas variaram a partir de 1 - 2 χ 109 clones independentes. Clones aleatórios a partir das bibliotecas iniciais foram sequenciados para avaliar a qualidade da biblioteca.

Seleção de fago - As proteínas Robo4-Fc e Robo4-His-rotuladas humanas foram usadas como os antígenos de seleção. Robo4-Fc e Robo4-His humano foi revestido em placas de microtitulação MaxiSorp (Nunc) a 10 pg/mL em PBS e incubadas durante a noite a 4 graus. Para a primeira rodada de seleção 12 cavidades de alvo foram usadas. As cavidades foram bloqueadas por 1 hora a temperatura ambiente utilizando Tampão de Bloqueio de Fago (1% BSA, .05 % de Tween® 20, PBS). Bibliotecas de fago foram PEG precipitadas a partir dos estoques de glicerol congelados, resuspensas em Tampão de Bloqueio de Fago e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. Bibliotecas de fago foram então adicionadas às placas de antígeno bloqueado incubadas durante a noite a temperatura ambiente. Após ligação durante a noite, fagos não ligados ou não especificamente ligados foram removidos a partir das placas de antígeno por lavagem com Tampão de Lavagem (PBS, 05 % de Tween®20). Os fagos ligados foram elúidos por incubação das cavidades com 50 mM de HCI, 0,5 M de KCI por 30 minutos. Fagos foram amplificados utilizando células XL-1 Blue e fago auxiliador M13/K07 e desenvolvidos por 36 horas a 30 0C em 2YT, 50 pg/mL de carbanecilinaa, 50 ug/mL de canamicina, 10 pg/mL de tetraciclina. Os fagos amplificados foram então recuperados utilizando um protocolo de precipitação PEG modificado (Clackson & Lowman 2004). As titulações de fago elúido a partir de uma cavidade alvo revestida foram comparadas às titulações de fagos recuperados a partir uma cavidade alvo não revestida para avaliar o enriquecimento. Quatro rodadas de seleção de fago foram completadas com o número de cavidades alvo reduzindo para 4 (rodada 2) e 2 (rodadas 3 e 4). Tampão de Bloqueio de Caseína (Pierce) foi usado como o reagente de bloqueio para placas de antígeno e fago para as rodadas 2 e 4. As rodadas de seleção 2-4 usaram um período de 3-4 horas de ligação de fago-antígeno e aumentaram o rigor da lavagem. Quatro clones de fago foram selecionados: YW71.6, YW7.1, YW71.22, e YW71.89. As seqüências de domínios de cadeia leve e pesada foram determinadas e são mostradas nas Figuras 1A e 1B. As características de ligação de Robo4 foram determinadas como descrito aqui abaixo.

Exemplo 3: Anticorpos gerados por variação de HVRs H1. H2. H3 ε L3.

Clones YW79.1, YW79.8, e YW79.11 foram gerados por mutagênese de HVR-H1, H2, H3 e L3 de huMAb 4D5-8 (HERCEPTIN® anticorpo anti-HER2, Genentech1 Inc.) domínio variável de cadeia pesada e huMAb 4D5-8 domínio variável de cadeia leve modificado, SEQ ID NO: 168. Em HVR-H1, posições Kabat 26 (G)1 28 (T)1 29 (F)1 30 (S), 31 (S), e 35 (S) foram mantidas constantes, e os aminoácidos nas posições 27, 32-34 foram variados. Em HVR-H2, posições Kaba 49 (S)1 51 (I), 55 (G)1 57 (T)1 59 (Y)1 60 (A), 61 (D), 62 (S)1 63 (V), 64 (K)1 e 65 (G) foram mantidas constantes, e posições 50, 52, 52a, 53, 54, 56, e 58 foram variadas. Em HVR-H3, posições Kabat 93 (A), 94 (R), 100f-g (deleção) foram mantidas constantes, e posições 95-100, 10Oa-e, 100h, e 102 foram variadas. Em HVR-L3, posições Kabat 89 (Q), 90 (Q), 95 (P) e 97 (T) foram mantidas constantes, e posições 91 -9 4 e 96 foram variadas. A seqüência de HVR-L1 foi mantida constante como RASQSISSYLA (SEQ ID NO: 7) e a seqüência de HVR-L2 foi mantida constante como GASSRAS (SEQ ID NO: 8). A diversidade de seqüência foi introduzida em cada região hipervariável por mutagênese de posições selecionadas de aminoácido utilizando técnicas de mutagênese padrão. Clones de anticorpo anti-Robo4 YW79.1, YW79.8, e YW79.11 foram selecionados e sequenciados. As regiões variáveis de seqüências de cadeia leve e cadeia pesada são mostradas nas Figuras 1A e 1B.

Exemplo 4: Purificação de Robo4 solúvel ε anticorpos anti-Robo4

Este exemplo descreve métodos úteis na purificação de antígeno Robo4 e os anticorpos anti-Robo4 da presente invenção. Antígeno Robo4 foi purificado co mo um domínio extracelular de Robo4 solúvel fundido a uma marcação de histidina como mostrado na Figura 5B.

Purificação de antígeno Robo4 Construtores Robo4 humanos (aminoácido M1 a aminoácido L461 e aminoácido M1 a aminoácido Y231) foram clonados no vetor de expressão eucariótico pRK5 seja como fusões à porção Fc de IgGI humano ou a uma marcação de histidina C-terminal. Robo4 de murino (M1 a H232) foi clonados em pRK5 como fusão a um marcação de histidina C-terminal apenas. Todas as proteínas foram produzidas por transfecção transitória de células CHO. Proteínas foram purificadas a > 90% de pureza por cromatografia de afinidade utilizando seja proteína-A Sepharose™ (GE Healthcare) para proteínas de fusão Fc ou NiNTA Superflow™ (Qiagen) para Fusões de marcação de histidina. Se necessário uma etapa de cromatografia de troca de íon (Q- ou SP- Sepharose™, GE Healthcare) foi adicionada e/ou uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex™ 75, GE Healthcare). As identidades das proteínas foram confirmadas por sequenciamento N-terminal utilizando o método de degradação de Edman, as concentrações foram determinadas pelo teste BCA e pormedições de absorção de OD 280, e pureza foi avaliada por cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE. Purificação de Anticorpo

Anticorpos Robo4 de comprimento total foram tra nsitoriamente expressos em células CHO e purificados a > 95% de pureza por cromatografia de afinidade utilizando proteína-A Sepharose™ (GE Healthcare), seguido por cromatografia de troca de íon utilizando SP-Sepharose™ (GE Healthcare). Se necessário, uma etapa adicional de cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex™ 200, GE Healthcare) foi adicionada. As concentrações de anticorpo foram determinadas pelo teste BCA de acordo com instruções do fabricante (Pierce Chemical Co.) e por medições de absorção de OD 280, e a pureza foi avaliada por cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE. Para todas as purificações de anticorpo, os níveis de agregados como determinado por dispersão de luz a laser foram abaixo de 5%, os níveis de proteína A como determinado por ELISA de proteína A foram abaixo de 50 ppm, e os níveis de endotoxina como determinado pelo teste de endotoxina cromogênica LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) foram abaixo de 0,5 EU/mg.

Exemplo 5: maturação de Afinidade de YW71.22 Para aprimorar a afinidade do anticorpo anti-Robo4 YW71.22, três bibliotecas de phage display foram geradas no fundo de YW71.22, cada HVRs de múltiplos alvos para mutagênese de aleatorização suave como descrito em Lee et ai, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-93 (2004). Para evitar a re-seleção de YW71.22 a partir de um fundo altamente potencial de modelo, códons de parada foram introduzidos no HVR a ser modificado antes de gerar cada biblioteca. Um método de classificação de solução foi usado para aumentar a eficácia do processo de seleção de fago com base em afinidade. Ao manipular a concentração alvo biotinilada, a redução do tempo de captura de fago a fundos mais baixos e a adição de alvo não biotinilado para eliminar clones com coeficientes mais rápidos, clones de alta afinidade podem ser proficientemente selecionados. Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93. A* partir da primeira rodada de seleção, enriquecimento (captura dependente de fago) foi observado sugerindo que um grande número de clones esteve presente em cada biblioteca com afinidade razoavelmente alta para Robo4 humano. O rigor da seleção foi aumentado em rodadas subsequentes. Após 5 rodadas de seleção, clones a partir de cada biblioteca foram analisados. Novas seqüências foram observadas em bibliotecas objetivando cada um dos seis HVRs (Figures 2A e 2B).

Os clones selecionados foram varridaos por ELISA de fago e então expressos como proteína IgG e a afinidade dos mesmos caracterizada utilizando análise de ligação Biacore™.

Bibliotecas de fago de clones maturados por afinidade foram classificadas utilizando um método de classificação sólido/solução. Robo4-His humano foi biotinilado ao misturar 500 pL de 3,6 mg/mL de Robo4-His humano em PBS1 e 10 pL de 1 M de fosfato de potássio, pH 8 com 20 pL 4 mM de Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce). Para a primeira rodada de seleção, Robo4-His biotinilado foi revestido em placas de microtitulação MaxiSorp (Nunc) a 10 pg/mL em PBS e incubadas durante a noite a 4 °C. Para a primeira rodada de seleção 16 cavidades de alvo foram usadas. As cavidades foram bloqueadas por 1 hora a temperatura ambiente utilizando SuperBIock (Pierce). Bibliotecas de fago de maturação foram diluídas em tampão SuperBIock e incubadas 1 hora a temperatura ambiente. Bibliotecas de fago foram então adicionadas às placas de antígeno bloqueadas incubadas 2 horas a temperatura ambiente. Após a ligação, fagos não ligados e não especificamente ligados foram removidos das placas de antígeno por lavagem com Tampão de Lavagem (PBS, 05% de Tween®20). Os fagos ligados foram elúidos por incubação das cavidades com 50 mM de HCI, 0,5 M de KCI por 30 minutos. Fagos foram amplificados utilizando células ;XL-1 Blue e fago auxiliador M13/K07 e desenvolvidos por 36 horas a 30 °C em 2YT1 50 pg/mL de carbanecilina, 50 ug/mL de canamicina, 10 ug/mL de tetraciclina. Fagos amplificados foram então recuperados utilizando um protocolo de precipitação PEG modificado (Clackson & Lowman 2004). As titulações de fago elúido a partir da cavidade alvo revestida foram comparadas às titulações de fago recuperado a partir da cavidade alvo não revestida para avaliar o enriquecimento. Para as rodadas de seleção 2-5 um um protocolo de classificação de solução foi implementado. Cavidades de microtitulação foram revestidas com 10 ug/mL de neutravidina em P BS durante a noite a 4°C e e ntão b loqueadas por 1 hor a utilizand o SuperBIock (Pierce). Bibliotecas recuperadas de fago foram suspensas em SuperBIock e foram misturadas com 50 nM Robo4-His biotinilado por 1 hora. Fago ligado a Robo4-His biotinilado foi capturado em cavidades revestidas com neutravidina por 30 minutos e fago não ligado foi retirado por lavagem com Tampão de Lavagem. Fago foi elúido utilizando 50 mM de HCI1 500 mM de KCI por 30 minutos, neutralizado, e propagado em células XL1 blue (Stratagene) na presença de fago auxiliador K07 (New England Biolabs). Rodadas de classificação subsequentes foram realizadas de modo similar com as exceções a seguir: na rodada 2 a concentração final de Robo4-His biotinilado foi 50 nM, na rodada 3 a concentração final de Robo4-His biotinilado foi 25 nM, na rodada 4 a concentração final de Robo4-His biotinilado foi 5 nM e na rodada 5 a concentração final de Robo4-His biotinilado foi 0,5 nM com 50 nM Robo4-His não biotinilado adicionado a um mistura por 1 hora antes da captura em neutravidina.

Diversos clones maturados por afinidade foram selecionados para ligação s Robo4-His humano e sequenciados.

As seqüências de região variável dos clones de anticorpo derivados por maturação de afinidade do clone YW71.22 são mostradas na Figura 2A (regiões variáveis de cadeia leve) e Figura 2B (região variável de cadeia pesada). Exemplo 6: Caracterização de clones selecionados de anticorpo anti- Robo4

Fago ELISA - Testes de ligação de competição de fago foram realizados para determinar a afinidade de ligação aproximada (determinada como fago IC50) de Fabs de fago-exibido para Robo4. Os testes foram realizados como a seguir.

Em suma, sobrenadantes de fago purificado a partir de cada clone foram produzidos utilizando um protocolo de precipitação PEG modificado como descrito acima. Sobrenadantes de fago purificado foram diluídos em série em Tampão de Bloqueio de Fago1 então incubados em placas revestidas com Robo4-His (1pg /mL) por 15 minutos. As placas foram lavadas com Tampão de Lavagem e foram incubadas por 30 minutos com conjugado de peroxidase de rábano silvestre/anticorpo anti-M13 (diluídas 1:5000 em tampão de PBS) (Amersham Pharmacia Biotech). As placas foram lavadas, desenvolvidas com substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories) e resfriadas com 0,1 N de H2SO4. A absorção foi medida espectrofotometricamente a 450 nm para determinar a concentração de fago proporcionando cerca de 50% do sinal em saturação. Uma concentração de fago fixa de sub-saturação foi diluída em Tampão de Bloqueio de Fago contendo duas diluições em série de proteína Robo4-His a partir de 350 nM de Robo4 a 5nM de Robo4.

As misturas foram incubadas por uma hora com agitação suave a temperatura ambiente, transferidas para as placas revestidas com Robo4-His (1pg /mL) e as placas fora m incubadas ρ or 20 minutos. As placas foram lavadas e tratadas como acima. As afinidades de ligação foram estimadas como valores IC50 (definidos como a concentração de antígeno que bloqueou 50% da ligação de fago ao antígeno imobilizado). Os resultados de IC50 para os sete clones são mostrados na Tabela 2. TABELA 2

Sumário da competição de Fago Anti-Robo4

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Produção de Fab A e determinação de afinidade — Para expressar proteína Fab para medições de afinidade, um códon de parada foi introduzido entre a cadeia pesada e g3 no vetor de phage display. Clones foram transformados em células E. coli 34B8 e desenvolvidos em meio AP5 a 30 C (Presta et aí. Câncer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Células foram coletadas por centrifugação, suspensas em 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA pH 8 e rompidas utilizando um microfluidificador. Fab foi purificada com Cromatografia de afinidade de proteína G.

As determinações de afinidade foram realizadas por ressonância de plásmon de superfície utilizando um sistema BlAcore™ 2000 (BIAcore, Piscataway1 NJ). Robo4-His foi imobilizado (~1000 unidades de resposta (RU)) em um chip CM5 e concentrações variadas de Fab (4 a 500 nM) em PBST foram injetadas. Após cada injeção o chip foi regerado utilizando 100 mM de HCI.

A afinidade de ligação de três anticorpos anti-Robo4 fago-derivados para domínio extracelular solúvel de Robo4 (ECD) foi determinada por medição de ressonância de plásmon de superfície u tilizando u m s istema B IACORE® 3 000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ). Os anticorpos testados incluíram YW71.6, YW71.22, e YW79.8. Em suma, lascas de dextrana biosenson carbóximetilados (CM5, Biacore Inc.) foram ativados com hidrocloreto de N-etil-N'- (3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida ( NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. As referidas lascas ativadas foram revestidas com anti-Robo Fab por diluição a 5 pg/mL com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, antes da injeção a um coeficiente de fluxo de 5 pL/minuto para alcançar aproximadamente 500 unidades de resposta (RU) de anticorpos acoplados. Em seguida, 1M de etanolamina foi injetado para bloquear grupos não reagidos.

Para medições de cinética, duas diluições em série de a ntígeno solúvel de ECD-His marcado de humano ou camundongo (aproximadamente 500 nM a aproximadamente 7,8 nM) foram injetados em PBS com 0,05% de Tween® 20 a 25°C a um coeficiente de fluxo de 25 μl/minuto. Resposta de ligação foi corrigida ao substrair a RU a partir de uma célula de fluxo vazio. Coeficientes de associação (kon) e coeficientes de dissociação (koff) foram calculados utilizando um modelo de ligação simples uma-a-uma Langmuir (BIAevaIuation Software version 3.2). A constante de dissociação de equilíbrio (K0) foi calculada como a proporção kdissociação/kassociação- Os resultados deste experimento são mostrados na Tabela 3 abaixo. A nticorpo YW71.22 reage transversalmente com Robo4 de humano e camundongo.

Tabela 3

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Um clone de anticorpo anti-Robo4 clone maturado por afinidade derivado a partir de YW71.22 foi testado para ligação ao Robo4 humano expresso endogenamente em células HUVEC e a Robo4 de murino expresso endogenamente em células MS1. A análise FACS revelou que clones YW71.22.S1.16 e Y W71.22.S1.21 se ligam a am bos Robo4 de humano e murino e que a ligação foi comparável ao anticorpo YW71.22 (Figura 18).

Exemplo 7: Análise de Ligação dos anticorpos Robo4 maturados por afinidade

YW71.22.S1.16 maturado por afinidade foi usado para gerar um IgGI de comprimento total e um fragmento Fab ambos com uma substituição Cys na posição 118 de região Fc de cadeia pesada de acordo com Numeração EU. O Cys é usado para conjugação do anticorpo específica a campo a uma marcação ou fármaco de interesse.

Afindiades de ligação a Robo4 de humano e camundongo foram determinadas por medições de ligação in vitro e por ligação de célula radiomarcada para o YW71.22.S1.16 de comprimento total (Mab)1 YW71.22.S1.16 de comprimento total com Cys trabalhado por engenharia (tioMab), e um fragmento Fab de YW71.22.S1.16 com Cys trabalhado por engenharia (TioFab).

Os experimentos de ligação in vitro foram realizados por medições SPR em um instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) at 25°C. Anticorpos Robo4 maturados por afinidade (Mab1 TioMab e TioFab) foram imobilizados em densidades de superfície de 500-1000 RUs em um chip sensor ProteOn GLC ativado (Bio-Rad Laboratories, Inc.) utilizando procedimentos padrão de acoplamento de amina como descrito pelo fabricante. Em suma, anticorpos foram injetados a uma concentração de 10 μg/mL em 20 mM de acetato de sódio, pH 4,5 e a um coeficiente de fluxo de 30 μΙ/minuto por 5 minutos. Grupos não reagidos foram bloqueados ao se injetar 1 M de etanolamina. Para realizar os testes de ligação, amostras foram injetadas a um coeficiente de fluxo de 30 μΙ/minuto. Para medições de cinética diluições em série de Robo4-His purificado seja de humano ou camundongo (aproximadamente 25 nM a 0,8 nM) foram injetados em PBS com 0,01% de Tween-20 e sensorgramas para as fases de associação e dissociação foram registrados. Superfícies em branco foram usadas para as correções de fundo. Não houve necessidade de se regenerar as superfícies uma vez que o sistema de estrutura de interação ProteOn permite que se rode cerca de seis experimentos de ligação em uma superfície idêntica em paralelo. Coeficientes de associação (ka) e coeficientes de dissociação (kd) foram calculados utilizando um modelo de ligação simples uma-a-uma Longmuir (ProteOn Manager Software V2,0, Bio-Rad Laboratories, Inc.) e a constante de dissociação de equilíbrio (K0) foi calculada como a proporçãon kd/ka. Os resultados são resumidos na Tabela 4 abaixo.

TABELA 4

Resumo de Afinidades de Anticorpo anti-Robo4 (Kn)

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HUVECs e células MS1, as quais endogenamente express am proteína Robo4 foram usadas em experimentos de ligação de célula radioligante.

Para os experimentos de ligação de célula anticorpos anti-Robo4 tioMab e tioFab foram iodados utilizando o método lodogen. Cada anticorpo radiomarcado foi purificado a partir de 125I-Na livre por filtragem de gel utilizando uma coluna de NAP-5; o anticorpo tioMab purificado foi dotado de uma atividade específica de 6,96 μΟΐ/μ9 e o anticorpo tioFab purificado foi dotado de uma atividade específica de 16,05 μΟΐ^. 50μΙ_ misturas de competição contendo uma concentração fixa de anticorpo iodado e concentrações reduzidas do anticorpo não marcado foram dispostas em placas de 96 cavidades. Células MS1 e HUVEC foram cultivadas em meio de desenvolvimento a 37°C em 5% de CO2 e então foram destacadas a partir das placas de cultura de tecido utilizando uma solução de dissociação de célula não-enzimática (Sigma #C5914) para estudos de ligação subsequentes. Células foram lavadas com tampão de ligação (50:50 meio DMEM/F12 contendo 2% de FBS1 2 mM de azeda de sódio e 50 mM de HEPES, pH 7.2) e foram dispostas nas placas de 96 cavidades contendo as misturas de competição em aproximadamente 200,000 células em 0,2 ml_ de tampão de ligação. A concentração final do anticorpo Mab iodado em cada incubação com células foi -150 pM (-70,000 cpms por 0,25 ml_) e a concentração final do anticorpo não marcado nas incubações com células iniciou a 400 nM e foi diluída em série por 2 vezes por 10 concentrações. A concentração final do anticorpo Fab iodado em cada incubação com células foi -400 pM (-150,000 cpms por 0,25 mL) e a concentração final do anticorpo não marcado nas incubações com células iniciou a 1,0 μΜ e foi diluída em série por 2 vezes por 10 concentrações. As reações de competição foram testadas em triplicata. As reações de competição foram incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. Então as mesmas foram transferidas a uma placa de filtro Millipore Multiscreen e lavadas três vezes com tampão de ligação para separar o anticorpo livre do ligado a iodo. Os filtros foram contados em um contador Wallac Wizard 1470 gamma (PerkinEImer Life and Analytical Sciences Inc. Wellesley, MA). Os dados de ligação foram avaliados utilizando NewLigand software (Genentech), o qual usou o algoritmo de adaptação de Munson e ,Robard1 Anal. Biochem. 107: 220-39 (1980), para determinar a afinidade de ligação do anticorpo e a concentração de sítios de ligação por cavidade. O número de sítios de ligação por célula foi determinado ao se dividir o total dos sítios de ligação pelo número de células por cavidade.

Exemplo 8: Anticorpo anti-Robo4 inibe alongamento de tubo HUVEC

Anticorpo anti-Robo4 (YW71.22) significativamente inibe HUVEC alongamento do tubo em um teste de desenvolvimento de conta. Não só o número total mas também o comprimento dos tubos são reduzidos em comparação com o anticorpo E25 de controle (Figura 20). Por exemplo, o número de tubos com um comprimento de 300 μηι ou mais é reduzido em 60%.

Para o teste de desenvolvimento de conta, contas microveículo Cytodex 3 revestidas com dextrana (Amersham) foram incubadas com HUVECs (400 células por conta) em EGM-2, durante a noite a 37°C e 5% de CO2.

Para induzir a coagulação, 0,5 mL contas revestidas de célula em PBS com 2,5 pg/mL de fibrinogênio (200 contas/mL) foi adicionado em uma cavidade de uma placa de cultura de tecido com 24 cavidades contendo 0,625 unidades de trombina e incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente e então por 20 minutos a 37°C. O coágulo foi equilibrado em EGM-2 por 30 minutos a 37°C. O meio foi então substituído comcélulas de fibroblasto de pele contendo EGM-2 (Detroit 551, 20.000 células/mL). Anticorpos (50 μg/mL) foram adicionados a cada cavidade, e o teste foi monitorado por 8 dias com mudança do meio a cada dia alternado. Imagens das contas foram capturadas por um microscópio invertido, e círculos concêntricos espaçados a 100, 200, e 300 um foram desenhados em torno da conta em cada image.

O número de recipientes que cruzam cada círculo foi contado 10- 12 contas foram usados por condição para quantificação (Nakatsu et al., Microvascular Pesquisa 66: 102-112 (2003)). Exemplo 9: Anticorpo anti-Robo4 ε conjugados de fármaco anticorpo Anti-Robo4 como terapêuticos

ADCs anti-Robo4 foram produzidos ao conjugar anticorpos anti- Robo4 às fracoces de fármaco-ligantes MCC-DM1, SPDB-DM4, e mPEO-DM1. Antes da conjugação, os anticorpos foram parcialmente reduzidos com TCEP utilizando m étodos padrão de acordo com a metodologia des crita e m WO 2004/010957. Os anticorpos parcialmente reduzidos foram conjugados às frações de fármaco-ligantes acima utilizando os métodos padrão de acordo com a metodologia descrita em Doronina et ai, Nat. Biotechnol. 21:778-784 (2003) e Pedido de patente US No. 2005/0238649. Em suma, os anticorpos parcialmente reduzidos foram combinados com as frações de fármaco Iigantes para permitir a conjugação das frações em resíduos de cisteína (incluindo sem limitação, resíduos de cisteína trabalhada por engenharia tioMAbs como descrito aqui). As reações de conjugação foram resfriadas, e os ADCs foram purificados. A carga de fármaco (número médio de frações de fármaco por anticorpo) para cada ADC foi determinado por HPLC. ADCs anti-Robo4 adicionais são produzidos utilizando, por exemplo, frações de Iigante fármaco incluindo spp-DM1, smcc-DM1, MC-vc-PAB-MMAE; MC-vc-PAB-MMAF; MC- MMAE e MC-MMAF (ver, por exemplo, WO 2004/010957, e W02006/034488 (cada uma das quais é aqui incorporadapor referência em sua totalidade).

Exemplo 10: in vivo Tumor Volume Redução Assay

Anticorpo anti-Robo4 nu: Crescimento de tumor não foi inibido pelo anticorpo anti-Robo4 nu YW71.22 (anticorpo não conjugado a um agente citotóxico ou outro agente) em modelos de xenoenxerto de camundongo de carcinoma de pulmão de célula não pequena humano SK-MES-1. Para este estudo, cada camundongo nu fêmea HRLN recebeu um implante s.c. de fragmento de tumor de 1 mm3 no flanco. O crescimento de tumor foi monitorado duas vezes por semana por medições de calibre. Quando tumores alcancaram um tamanho médio de 80-120 mm3, os camundongos foram classificados para proporcionar tamanhos médios de tumor quase idênticos, e o tratamento foi iniciado (Dia 1). Animais foram dosados duas vezes por semana i.p. com 10 mg/kg de anti-Robo4 e/ou 5 mg/kg de anti-VEGF ou anticorpo de controle por 5 semanas. Todos os tratamentos foram ajustados ao peso corporal a 0,2 mg/20 g. Os resultados são mostrados na Figura 17. Adicionalmente, não foi observada redução de crescimento de tumor em modelo de camundongo Fo5 com xenoenxerto de câncer de mama MDA-MB- 231.

Um anticorpo anti-Robo4 compreendendo uma região FC dotada de maior atividade ADCC pode ser usado para inibir crescimento de tumor. O anticorpo anti-Robo4 com ADCC aumentada pode ser um anticorpo nu ou um conjugado de anticorpo fármaco como descrito aqui. Aumento de ADCC é alcançado, por exemplo, ao se aumentar as interações de IgGI-FcgammaRIII, que são dependentes das frações de carboidrato ligadas à região Fc do anticorpo. Métodos não Iimitantes exemplificativos para aumento de ADCC incluem a redução de fucosilação de anticorpo ao expressar anti-Robo4 em uma célula hospedeira que superexpressa GnTIII, que codifica N- acetilglicosaminiltransferase (Narishimhan, J. Biol. Chem. 257:10235-10242 (1982) e Umana et al., Nature Biotech. 17:176-180 (1999)); uma célula hospedeira subexpressa ou é desprovida de expressão de FUT8, que codifica alfa-1,6-fucosiltransferase (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473 (2003)); ou a célula hospedeira que é desprovida de ou que subexpressa UDP- N-acetilglicosamina 2-epinerase (tal como células CHO Lec3) (Hong e Stanley, J. Biol. Chem. 278:53045-53054 (2003)). Adicionalmente, ADCC é aumentada por mudanças de aminoácido na região FC (ver, por exemplo, W02000042072 e W02004029207). Assim, anticorpos anti-Robo4 da presente invenção que são úteis como agentes citotóxicos incluem anticorpos anti-Robo4 que exibem função aumentada de ADCC com relação a um anticorpo anti-Robo4 que exibe atividade Fc ADCC do tipo selvagem.

Conjugado de anticorpo anti-Robo4 fármaco (ADC anti-Robo4): Para testar a eficácia de ADCs anti-Robo4 toxina-conjugado para a capacidade de reduzir o volume de tumor in vivo, os protocolos a seguir são empregados.

Camundongos SCID são cada um dos quais inoculados subcutaneamente no flanco com células de uma linhagem celular de câncer humano. As linhagens celulares de câncer humano incluem, como exemplos não limitantes, células de câncer de pulmão não-pequenas SK-MES-1 humano e células de câncer de mama MDA-MB-231. Quando os tumores alcançam um volume médiod e tumor entre aproximadamente 80-200 mm3, os camundongos são divididos em grupos, e tratados por injeção intravenosa com anticorpo toxina-conjugado ou anticorpo não conjugado.

Uso DE UM CONJUGADO ANTI-R0B04 MAITANSINA FÁRMACO PARA REDUZIR VOLUME

DE TUMOR SÓLIDO

Camundongos SCID são injetados com células tumorais humanas subcutaneamente em um volume de 0,2 mL/20 g de peso corporal do camundongo no flanco. Células são suspensas em HBSS. Quando o tamanho médio do tumor alcança aproximadamente 80 - 200 mm3, os camundongos são aleatoriamente agrupados em grupos e administrados com tratamentos únicos ou múltiplos I.V. (por meio da veia do rabo) seja um conjugado ADC anti-Robo4 a maitansina ou um anticorpo de controle.

Volume médio de tumor é monitorado em cada grupo de tratamento por aproximadamente 30 dias pós injeção de anticorpo. Tumor pode ser detectado, por exemplo, por detecção de fluorescência de Iuciferase restante onde as células tumorais são trabalhadas por engenharia para expressar luciferase. Eficácia de the anticorpos anti-CD22 toxina-conjugado é determinada por comparação ao controle e anticorpos não conjugados. O mesmo expermento é realizado utilizando ADC anti-Robo4 em que o fármaco conjugado ao anticorpo é uma auristatina.

O mesmo expermento é repetido utilizando um ADC anti-Robo4 compreendendo uma região FC dotada de maior atividade ADCC.

Exemplo 11: Conjugado de Anticorpo anti-Robo4 a marcadores detectáveis

Anticorpos anti-Robo4 sDOTA-marcados são preparados como a seguir. O éster DOTA-NHS foi dissolvido em dimetilacetamida (DMA, Fluka Chemika, Switzerland) e preparado em concentrações de 60 - 100 mg/mL. Procedimentos típicos envolveram troca de tampão de MAb em PBS com 2 mM de EDTA a pH 7,2. As reações foram realizadas a uma proporção de 1 molécula de MAb a 4 DOTA moléculas (1:4) e realizada a 25°C enquanto em agitação suave em uma placa Thermomixer (Eppendorf, Westbury, NY). O anticorpo anti-Robo4DOTA-marcado é útil como um marcador detectável in vitro ou in vivo quando associado com, como exemplos não limitantes, ítrio 90Y, 111Inl 177Lu e semelhante. Os conjugados mAb são marcados com, por exemplo, 111In por incubação do conjugado com 111InCb em 0,25 M de acetato de amônia por 45 minutos a 43°C. EDTA é adicionado a uma concentração final de 1 mM, e a mistura é incubada a 37°C por 15 minutos. A marcação com 90Y1 por exemplo, é realizada utilizando incubação de uma hora a 43°C, após o que DTPA é adicionado a uma concentração final de 1 mM, e a mistura é incubada por 15 minutos adicionais a 37°C. Os conjugados mAb radiometal- marcados são purificados por HPLC de exclusão de tamanho, utilizando uma coluna TosoHaas TSKgeI G2000 SW e uma fase móvel de salina normal. Exemplo 12: Caracterização Adicional de Robo4 ε anticorpos anti-Robo4 Robo4 não bloqueia a migração de célula endotelial (EC). Robo4- Fc e Robo4-His foram postos em contato com ECs vascular utilizando um teste de migração de HUVEC e na presença ou ausência de VEGF. Figura 8 mostra; os resultados do teste. Robo4-Fc ou Robo4-His isoladamente não induziram a migração EC e a migração EC VEGF-induzida não foi aumetnada por Robo4.

Robo4 não se liga a Slit2. Robo4-Fc posto em contato com Slit2 não mostrou ligação por análise Biocore™, enquanto que Robol e Slit 2 mostram ligação no mesmo teste (Figura 9). Slit2-His (Slit2 de comprimento total histidina-marcado) foi imobilizado em um chip CM5 Biacore™ em alta densidade. Uma alíquota de 5 μΙ_ de cada analito (proteínas de fusão Robo4-Fc ou Robol-Fc) foi injetada e permitida interagir com o Iigante imobilizado em tampão (HEPES/EDTA/NaCI, pH7.5).

Robo4 interage iri vitro com UNC5B, um receptor de superfície celular envolvido em direcionamento vascular. Tem sido mostrado que ligação de netrina a membros da família de receptores não coordenados-5 (UNC5) (UNC5A, B1 C1 e D) resulta em repressão de axônio neural (Klagsbrun, M. e Eichmann1 A., Cytoquine & Growth Factor Reviews 16(4-5):535-548 (2005)). A interação de Netrina-U NC5B tem estado implicada em angiogênese (Klagsbrun, M. e Eichmann, A., supra (2005) e Lu, X. et ai, Nature 432:179-186 (2004)). A interação de Robo4 com UNC5B in vitro foi determinada por medições de ligação de SPR nas quais a proteína de fusão UNC5B-Fc (domínio extracelular de UNC5B fundido a uma região FC) foi imobilizada em um chip e Robo4-Fc solúvel ou Robo4-His foi permitido interagir com a mesma em diferentes concentrações. Medições SPR foram realizadas como descrito no Exemplo 7 e os resultados de interação são mostrados na Figura 10.

Robo4 é expressa em endotélio fetal de camundongo como mostrado por um teste ISH utilizando sondas de RNA específicas a Robo4 (Figura 11). Robo4 é também expressa em modelos de tumor de camundongo de tumor de cólon (xenoenxerto de tumor de cólon humano HM-7, Figura 12A e 12B) e em tumor mamário (xenoenxerto de tumor de câncer de mama humano MDA-MB-175, Figura 12C e 12D). Robo4 mostra expressão aumentada em tecido tumoral humano com relação ao tecido humano normal como evidenciado nas Figuras 13A e 13C (expressão aumentada em melanoma maligno) com relação a tecido normal (Figuras 13B e 13D). A expressão de Robo4 é também observada em câncer de pulmão de pequena célula humano (Figures 14A-D), câncer de cólon humano (Figures 14G-H), tumor de próstata humano, e angiosarcoma de camundongo. Robo4 é expressa em tumor de células endoteliais em cólon, câncer de pulmão de célula não pequena, carcinoma de célula renal (RCC)1 carcinoma de célula transicional (TCC, uma forma comum de câncer de bexiga), câncer de mama, glioma, e sarcoma.

Anticorpo anti-Robo4 YW71.22 foi internalizado porcélulas endoteliais microvasculares de camundongo que expressa Robo4 MS1 por um período de 2 horas. O anticorpo YW71.22 foi permitido se ligar a Robo4 em ccelulas endoteliais de microvasculatura de camundongo MS1 a O0C por 30 minutos, incubadas a 37°C por 0-2 horas. Em intervalos, as células foram fixadas e permeabilizadas ou não permeabilizadas. Anticorpos anti-Robo4 na superfície celular ou internalizados pela célula foram interagidos com um anticorpo secundário IgG anti-humano fluorescentemente marcados (Alexa- marcados). Os resultados são mostrados nas Figuras 15A e 15B. O anticorpo anti-Robo4 YW71.22.S1.16 foi internalizado pelo mesmo protocolo exceto em que anti-Robo4 foi incubado on células MS1 a 37°C foi por 0-4 horas. As células foram permeabilizadas e coradas como acima. Os resultados são mostrados na Figura 15C.

A migração de célula endotelial não foi bloqueada pelo anticorpo anti-Robo4 em um teste in vitro utilizando um teste de migração celular de células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC). HUVECs endogenamente expressam Robo4 humano. O teste foi realizado como a seguir. HUVECs foram pre-incubadas por 2 horas com VEGF. A migração celular foi permitida continuar por 16 horas na presença de anticorpo anti- Robo4 YW71.22, anticorpo anti-VEGF, ou Robo4-Fc ou Robo4-His. Nem o anti- Robo4 nem o domínio extracelular solúvel de proteína Robo4s de fusão (Robo4-Fc e Robo4-His) bloqueou a migração EC sob as referidas condições (Figura 16).

Anticorpo anti-Robo4 se associa com a vasculatura in vivo. Cinqüenta microgramas de anticorpo anti-Robo4 71.22 (Figura 19A) ou anticorpo de controle (anti-HER2, Figura 19B) foram injetados por meio da veia do rabo e permitidos circular por 10 minutos. Cem microgramas de FITC- Lycopersicum esculentum foram injetadas e permitidas circular por 5 minutos. Camundongos foram perfundidos com 1% de PFA em PBS1 tecidos foram coletados em 30% de sucrose e congelados em OCT. Os anticorpos foram detectados com IgG anti-humano de cabra Cy3. Figura 19A mostra que o local de colroacao de FITC-Lycopersicum esculentum na vasculatura se sobrepõe ao local de colroacao para anti-Robo4 Cy3, diferente do anticorpo de controle que migrou no tecido circundante.

Embora a presente invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes apenas como ilustração e exemplo com objetivo de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser construídas como limitantes do âmbito da presente invenção. As descrições de todas as patentes, pedidos de patente, referências científicas, e Nos. de acesso ao Genbank citados aqui são expressamente incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins como se cada patente, pedido de patente, referência científica e Nos. de acesso ao Genbank foram especificamente e individualmente incorporados por referência. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Genentech, Inc. Peale Jr., Franklin V. Watts, Ryan J. Koch, Alexander W. Wu, Yan Stawicki, Scott Carano, Riehard

<120> ANTICORPOS ANTI-R0B04 E SEUS USOS <13O> P2275R1 WO

<150> US 60/889,214 <151> 09-02-2007

<150> US 60/891,475 <151> 23-02-2007

<160> 187

<210> 1 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 1

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 5 10

<210> 2 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 2

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 5 <210> 3 <211> 9 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 3

Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 5

<210> 4 <211> 10 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 4

Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser Trp Ile His 5 10

<210> 5 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 5

Ala Val Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 6 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 6

Ala Arg Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Gln Phe Val Pro Ala Tyr Ala 1 5 10 15

Met Asp Tyr

<210> 7 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 7

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 5 10

<210> 8 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 8

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser 5

<210> 9 <211> 23 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 10 <211> 15 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 10

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 11 <211> 32 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 11

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Thr 20 25 30

Tyr Cys

<210 > 12 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 12

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10

<210> 13 <211> 25 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 14 <211> 13 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 14

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10

<210> 15 <211> 30 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400 > 15

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 16 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de estrutura de cadeia pesada do anticorpo

<400> 16

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser <210> 17 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 17

Gly Phe Thr Ile Asn Gly Tyr Tyr Ile His 5 10

<210> 18 <211> 18 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 18

Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 19 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 19

Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly Trp Ser Ser Tyr Gly Met 15 10 15

Asp Tyr

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 20

Gln Gln Ser Arg Ser Asp His Pro Thr 5

<210> 21 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 21

Gln Gln Ser Trp Ser Tyr Pro Leu Thr

5

<210> 22 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 22

Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 5

<210> 23 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 23

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 5

<210> 24 <211> 10 <212> PRT

<213 > Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 24

Gly Phe Thr Ile Thr Asn Tyr Trp Ile His 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<22 0 >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 25

Gly Phe Thr Ile Asn Asn Asn Tyr Ile His 5 10

<210> 26 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 26

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Ser 5 10

<210> 27 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

220>

223> região hipervariável do anticorpo 400> 27

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Arg Tyr Met Ser 5 10

210> 28 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 28

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 5 10

<210> 29 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 29

Gly Gly Ile Tyr Pro Ala Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 30 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 30

Ala Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 31 <211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220> <223> região hipervariável do anticorpo <400> 31

Ser Thr Ile Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 32 <211> 18 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 32

Ser Gly Ile Tyr Pro Met Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 33 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 33

Ser Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 34

<211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 34

Ala Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Ala Tyr 5 10

<210> 35 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 35

Ala Arg Asp Val Asn Val Tyr Ser Ala Arg Trp Trp Asp Tyr Val 15 10 15

Met Asp Tyr

<210> 36 <211> 16 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 36

Ala Arg Met Ser Tyr Asn Trp Ser Ser Pro Gly His Gly Met Asp 15 10 15

Val

<210> 37 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 37

Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Ser Glu Phe Asp Tyr 5 10

<210> 38 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 38

Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Met Pro Tyr Gly His Pro Val Met Asp 1 5 10 15

Val

<210> 39 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 39

Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala Arg Ser Leu Ala 5 10

<210> 40 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 40

Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala Ile Tyr Leu Ala 5 10

<210> 41 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 41 Ser Ala Ser Phe Leu Ala Ser 5

<210> 42 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 42 Ser Ala Ser Leu Glu Ser 5

<210> 43 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 43 Ser Ala Thr Leu Ala Ser 5

<210> 44 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 44 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Tyr 5

210> 45 211> 7 212> PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região hipervariável do anticorpo <400> 45 Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser 5

<210> 46 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 46 Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser 5

<210> 47 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 47

Gln Gln Ser Phe Ala Thr Pro Ala Thr 5

<210> 48 <211> 9 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 48

Gln Gln Ser Arg Ala Ala Leu Pro Thr 5

210> 49 211> 9 212> PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região hipervariável do anticorpo <400> 49

Gln Gln Ser Arg Ala Asn Thr Pro Thr 5

<210> 50 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 50

Gln Gln Ser Arg Thr Thr Pro Pro Thr 5

<210> 51 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 51

Gln Gln Pro Phe Asp Leu Pro Met Thr 5

<210 > 52 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 52

Gln Gln Pro Asn Ser Thr Pro Phe Thr 5

210> 53 211> 9 212> PRT

213> Seqüência artificial

220> <223> região hipervariável do anticorpo <400> 53

Gln Gln Ser Arg Phe Asp His Pro Thr 5

<210> 54 <211> 9 <212 > PRT

<213 > Seqüência artificial <22 O >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 54

Gln Gln Ser Tyr His Thr His Ser Thr 5

<210> 55 <211> 9 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <4OO> 55

Gln Gln Ser Arg Asp Ile Pro Pro Thr 5

<210> 56 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo 400> 56

Gln Gln Ser Arg Asn Met Pro Ala Thr 5

210> 57 211> 9 212> PRT

213> Seqüência artificial <22 O >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 57

Gln Gln Thr Arg Val Met Pro Ala Thr 5

<210> 58 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 O >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 58

Gln Gln Thr Tyr Thr Ile Pro Pro Thr 5

<210> 59 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 59

Gln Gln Ser Tyr Ala Tyr Pro Phe Thr 5

<210> 60 <211> 9 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo 400> 60

Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Phe Thr 5

210> 61 211> 9 212> PRT

213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 61

Gln Gln Ser Tyr Gly Gly Pro Phe Thr 5

<210 > 62 <211> 9 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 62

Gln Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr 5

<210> 63 <211> 9 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 63

Gln Gln Phe Tyr Ser Asp Pro Phe Thr 5

<210 > 64 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo 400> 64

Gln Gln Gly Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr 5

210> 65 211> 10 212> PRT <213> Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 65

Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Phe Glu 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 66

Gly Phe Thr Leu Asp Gly Tyr Tyr Leu Gln 5 10

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 67

Gly Phe Ser Ile Asn Gly Tyr Tyr Asn Gln 5 10

<210> 68

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<400> 68

Gly Arg Ile Tyr Ser Ala Gly Gly His Thr Ala Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly <210> 69 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 69

Gly Phe Xle Tyr Pro Ala Gly Gly Lys Thr Glu Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 70 <211> 18 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 70

Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Ala Thr Ile Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 71 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> região hipervariável do anticorpo <400> 71

Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Leu Ser Val Ile Glu Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 72 <211> 108 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 72

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Xle Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 73 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 74 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105 Ile Lys Arg

<210> 75 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo

<400> 75

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 76 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo

<400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 XO 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Trp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 77 <211> 108 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 77

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 80

Ser Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 95

Ile Lys Arg

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

100 105

<210> 78 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg

210> 79 211> 108 212> PRT

213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 79

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Phe Ala Thr Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 80 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

223> cadeia leve do anticorpo 400> 80

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Ser Arg Ala Ala Leu Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 81 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Arg Ser Asp His Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg <210> 82 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 82

Asp Xle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Arg Ala Asn Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 83 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 83

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Arg Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 84 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Pro Phe Asp Leu Pro Met Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95

Ile Lys Arg

100

105

<210> 85 <211> 108 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 85

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Pro Asn Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 86

<211> 108

212> PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> cadeia leve do anticorpo

400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Arg Phe Asp His Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 87

<211> 108

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220 >

<223> cadeia leve do anticorpo

<400> 87

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Tyr Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Tyr His Thr His Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 88

<211> 108

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> cadeia leve do anticorpo

<400> 88

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Arg Asp Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 89

<211> 108

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223 > cadeia leve do anticorpo <400> 89

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Arg Asn Met Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210=· 90 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 90

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Thr Arg Val Met Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 91

<211> 108

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> cadeia leve do anticorpo

<400> 91

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Tyr Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Thr Tyr Thr Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg <210> 92 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp 35

Leu Leu Ile Tyr Ser 50

Tyr Gln Gln Lys Pro 40

Ala Ser Phe Leu Ala 55

Gly Lys Ala Pro Lys 45

Ser Gly Val Pro Ser 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Ser Tyr Ala Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 93 <211> 107 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

223> cadeia leve do anticorpo 400> 93

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp 35

Leu Leu Ile Tyr Ser 50

Tyr Gln Gln Lys Pro 40

Ala Ser Leu Glu Ser 55

Gly Lys Ala Pro Lys 45

Gly Val Pro Ser Arg 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

80 85 90

Tyr Asp Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

95 100 105

Lys Arg

<210> 94 <211> 107 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 94

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 80 85 90 Tyr Gly Gly Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105

Lys Arg

<210> 95 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 95

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 96 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 96

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala

20 25 30

Arg Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Phe Tyr Ser Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 97 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 97

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Gly Ala 20 25 30

Ile Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Gly Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 98 <211> 107 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 98

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn

20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys

210> 99 211> 32 212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 99

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30

Tyr Cys

<210> 100 <211> 10 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 100

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10

<210> 101 <211> 14 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 101

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 5 10

<210 > 102 <211> 23 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 102

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 15 10 15

Gly Glu Pro Ala Ser Xle Ser Cys 20

<210> 103 <211> 15 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 103

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 104 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 104

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 20 25 30

Tyr Cys

<210 > 105 <211> 23 <212> PRT 213> Seqüência artificial

220>

223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo 400> 105

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20

<210> 106 <211> 15 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 106

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15

<210> 107 <211> 32 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400 > 107

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 20 25 30

Tyr Cys

<210> 108 <211> 23 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo

<400> 108

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20

<210 > 109 <211> 15 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 109

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 110 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 110

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 20 25 30

Tyr Cys

210> 111 211> 30 212 > PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo 400> 111

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 112 <211> 14 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 112

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 5 10

<210> 113 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 113

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 1 5 10 15

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ala Arg

<210> 114 <211> 25 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo 400> 114

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

<210> 115 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 115

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 5 10

<210> 116 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 116

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 15 10 15

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ala

<210> 117 <211> 30 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 117

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 15 10 15

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

210> 118 211> 30 212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 118

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15

Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30

<210> 119 <211> 14 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 119

Trp Xle Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 5 10

<210> 120 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 120

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 15 10 15

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ala Arg

<210 > 121 <211> 25 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400 > 121

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15

Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25

<210> 122 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <4 00 > 122

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10

<210> 123 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400 > 123

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 15 10 15

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ala

<210> 124 <211> 30

<212 > PRT

213> Seqüência artificial

220>

223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 124

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 15 10 15

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 125 <211> 30 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <4 00 > 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

<210> 126 <211> 14 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 126

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10

<210> 127 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial 220>

223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo

400> 127

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 15 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ala Arg

<210> 128 <211> 25 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 128

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 129 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 129

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10

<210 > 130 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo 400> 130

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 15 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala

<210> 131 <211> 30 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 131

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 132 <211> 30 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 132

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30

<210> 133 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 133

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20

Ser Arg

25

30

<210> 134 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 134

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ser

<210> 135 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 135

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ala Arg

<210> 136 <211> 31 <212> PRT <213> Seqüência

<220>

artificial <223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 136

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ala

<210> 137 <211> 30 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia pesada do anticorpo <400> 137

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 138 <211> 1007 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 138

Met Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu Leu Gly Gly Arg Gly Ser Leu

1 5 10 15

Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ile Met Gly Gly Met Ala Gln Asp Ser

20 25 30

Pro Pro Gln Ile Leu Val His Pro Gln Asp Gln Leu Phe Gln Gly

35 40 45

Pro Gly Pro Ala Arg Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Gln Pro Pro

50 55 60

Pro Thr Ile Arg Trp Leu Leu Asn Gly Gln Pro Leu Ser Met Val 65 70 75 Pro Pro Asp Pro His His Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu Leu Leu 80 85 90

Leu Gln Pro Pro Ala Arg Gly His Ala His Asp Gly Gln Ala Leu 95 100 105

Ser Thr Asp Leu Gly Val Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg Leu 110 115 120

Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly Ala Arg Leu Ser Val Ala Val Leu 125 130 135

Arg Glu Asp Phe Gln Ile Gln Pro Arg Asp Met Val Ala Val Val 140 145 150

Gly Glu Gln Phe Thr Leu Glu Cys Gly Pro Pro Trp Gly His Pro 155 160 165

Glu Pro Thr Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Ala Leu 170 175 180

Gln Pro Gly Arg His Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Leu Met Ala 185 190 195

Arg Ala Glu Lys Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Met Cys Val Ala Thr 200 205 210

Asn Ser Ala Gly His Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Val Ser Ile 215 220 225

Gln Glu Pro Gln Asp Tyr Thr Glu Pro Val Glu Leu Leu Ala Val 230 235 240

Arg Ile Gln Leu Glu Asn Val Thr Leu Leu Asn Pro Asp Pro Ala 245 250 255

Glu Gly Pro Lys Pro Arg Pro Ala Val Trp Leu Ser Trp Lys Val 260 265 270

Ser Gly Pro Ala Ala Pro Ala Gln Ser Tyr Thr Ala Leu Phe Arg 275 280 285

Thr Gln Thr Ala Pro Gly Gly Gln Gly Ala Pro Trp Ala Glu Glu 290 295 300

Leu Leu Ala Gly Trp Gln Ser Ala Glu Leu Gly Gly Leu His Trp 305 310 315

Gly Gln Asp Tyr Glu Phe Lys Val Arg Pro Ser Ser Gly Arg Ala 320 325 330

Arg Gly Pro Asp Ser Asn Val Leu Leu Leu Arg Leu Pro Glu Lys 335 340 345

Val Pro Ser Ala Pro Pro Gln Glu Val Thr Leu Lys Pro Gly Asn 350 355 360

Gly Thr Val Phe Val Ser Trp Val Pro Pro Pro Ala Glu Asn His 365 370 375

Asn Gly Ile Ile Arg Gly Tyr Gln Val Trp Ser Leu Gly Asn Thr 380 385 390

Ser Leu Pro Pro Ala Asn Trp Thr Val Val Gly Glu Gln Thr Gln 395 400 405

Leu Glu Ile Ala Thr His Met Pro Gly Ser Tyr Cys Val Gln Val 410 415 420

Ala Ala Val Thr Gly Ala Gly Ala Gly Glu Pro Ser Arg Pro Val 425 430 435

Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ala Met Glu Arg Ala Thr Gln Glu Pro 440 445 450

Ser Glu His Gly Pro Trp Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ala Thr Leu 455 460 465

Lys Arg Pro Glu Val Ile Ala Thr Cys Gly Val Ala Leu Trp Leu 470 475 480

Leu Leu Leu Gly Thr Ala Val Cys Ile His Arg Arg Arg Arg Ala 485 490 495

Arg Val His Leu Gly Pro Gly Leu Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Asp 500 505 510

Ala Ile Leu Lys His Arg Met Asp His Ser Asp Ser Gln Trp Leu 515 520 525

Ala Asp Thr Trp Arg Ser Thr Ser Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser 530 535 540 Ser Ser Ser Leu Ser Ser Arg Leu Gly Ala Asp Ala Arg Asp Pro 545 550 555

Leu Asp Cys Arg Arg Ser Leu Leu Ser Trp Asp Ser Arg Ser Pro 560 565 570

Gly Val Pro Leu Leu Pro Asp Thr Ser Thr Phe Tyr Gly Ser Leu 575 580 585

Ile Ala Glu Leu Pro Ser Ser Thr Pro Ala Arg Pro Ser Pro Gln 590 595 600

Val Pro Ala Val Arg Arg Leu Pro Pro Gln Leu Ala Gln Leu Ser 605 610 615

Ser Pro Cys Ser Ser Ser Asp Ser Leu Cys Ser Arg Arg Gly Leu 620 625 630

Ser Ser Pro Arg Leu Ser Leu Ala Pro Ala Glu Ala Trp Lys Ala 635 640 645

Lys Lys Lys Gln Glu Leu Gln His Ala Asn Ser Ser Pro Leu Leu 650 655 660

Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu Leu Gly Asn 665 670 675

Arg Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gln Ser Pro Gly Ala Val Pro Gln 680 685 690

Ala Leu Val Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser Ser 695 700 705

Ser Asn Glu Leu Val Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe 710 715 720

Pro His Glu Thr Pro Pro Thr Gln Ser Gln Gln Thr Gln Pro Pro 725 730 735

Val Ala Pro Gln Ala Pro Ser Ser Ile Leu Leu Pro Ala Ala Pro 740 745 750

Ile Pro Ile Leu Ser Pro Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gln Ala Ser 755 760 765

Ser Leu Ser Gly Pro Ser Pro Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser 770 775 780 Ser Leu Ser Ser Leu Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Leu Thr Pro 785 790 795

Glu Glu Val Ala Leu Cys Leu Glu Leu Ser Glu Gly Glu Glu Thr 800 805 810

Pro Arg Asn Ser Val Ser Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro 815 820 825

Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser Val Pro Thr Ala Ser Glu Phe Thr 830 835 840

Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly Val Gly Pro Lys Gly Gly Val 845 850 855

Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu Thr Pro Thr Pro Ser Glu 860 865 870

Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala Ser Glu Asp Asn Ala 875 880 885

Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser Ser Ser Asp Gly Ser Phe 890 895 900

Leu Ala Asp Ala His Phe Ala Arg Ala Leu Ala Val Ala Val Asp 905 910 915

Ser Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys Val Phe 920 925 930

Ile Asp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro Arg Asp Glu Ile Phe Leu 935 940 945

Thr Pro Asn Leu Ser Leu Pro Leu Trp Glu Trp Arg Pro Asp Trp 950 955 960

Leu Glu Asp Met Glu Val Ser His Thr Gln Arg Leu Gly Arg Gly 965 970 975

Met Pro Pro Trp Pro Pro Asp Ser Gln Ile Ser Ser Gln Arg Ser 980 985 990

Gln Leu His Cys Arg Met Pro Lys Ala Gly Ala Ser Pro Val Asp 995 1000 1005

Tyr Ser <210> 139

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo

<400> 139

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys Arg 5 10

<210> 140

<211> 125

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> cadeia leve do anticorpo

<400> 140

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser 20 25 30

Gly Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Val Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Gln 95 100 105

Phe Val Pro Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 120 Val Thr Val Ser Ser 125

<210> 141

<211> 117

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400> 141

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr 20 25 30

Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Pro Ala Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Ala 95 100 105

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 142

<211> 124

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400> 142

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn

20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210 > 143 <211> 125 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400> 143

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Asn Asn Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Val Asn Val Tyr Ser Ala 95 100 105

Arg Trp Trp Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 110 115 120

Val Thr Val Ser Ser 125

<210> 144 <211> 123 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 144

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ser Thr Ile Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Ser Tyr Asn Trp Ser Ser 95 100 105

Pro Gly His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser

<210> 145 <211> 120 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <4 00 > 145

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Arg Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ser Gly Ile Tyr Pro Met Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Ser 95 100 105

Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

210> 146 211> 123 212 > PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região variável da cadeia pesada do anticorpo 400> 146

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Met Pro Tyr 95 100 105

Gly His Pro Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120

Val Ser Ser

<210> 147 <211> 124 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 147

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Tyr 20 25 30

Ser Tyr Tyr Phe Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Ser Ala Gly Gly His Thr Ala Tyr f 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 148 <211> 124 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 148

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn

20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120 Thr Val Ser Ser

<210> 149

<211> 124

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400 > 149

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

210> 150 211> 124 212> PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 150

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn

20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 151 <211> 124 212 > PRT

213> Seqüência artificial 22 0 >

223> região variável da cadeia pesada do anticorpo 400> 151

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 152 <211> 124 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 152

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp

20 25 30

Gly Tyr Tyr Leu Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Lys Thr Glu Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105 Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 153

<211> 124

<212 > PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400> 153

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Asn Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Ala Thr Ile Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

210 > 154 211> 124 212> PRT

213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<4 00 > 154

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 155 211> 124 212> PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região variável da cadeia pesada do anticorpo 400> 155

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Leu Ser Val Ile Glu Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210 > 156 <211> 124 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <4 00 > 156

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210 > 157 <211> 124 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 157

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 158 <211> 124 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400> 158

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 159 211> 124 212> PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região variável da cadeia pesada do anticorpo 400> 159

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 160 <211> 124 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 160

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys 65

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 161 <211> 124 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 161

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser <210> 162

<211> 124

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400 > 162

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210 > 163

<211> 124

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo

<400> 163

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser

:210> 164 211> 124 212 > PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região variável da cadeia pesada do anticorpo 400> 164

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly

95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

110 115 120

Thr Val Ser Ser

<210> 165 <211> 124 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223> região variável da cadeia pesada do anticorpo <400> 165

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

<210> 166 <211> 10 <212 > PRT

<213 > Seqüência artificial <220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400> 166

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys 5 10

<210 > 167 <211> 107 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do anticorpo <400> 167

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys <210> 168 <211> 32 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo <400 > 168

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30

Tyr Cys

<210> 169 <211> 454 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

<223> cadeia pesada do anticorpo <400> 169

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn 20 25 30

Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Phe Ile Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ile Gly Asn Lys Phe Gly 95 100 105

Trp Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 110 115 120

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 125 130 135

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140 145 150

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 155 160 165

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 170 175 180

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 185 190 195

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 200 205 210

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 215 220 225

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 320 325 330 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

335 340 345

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

350 355 360

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

365 370 375

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

380 385 390

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

395 400 405

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

410 415 420

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

425 430 435

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

440 445 450

Ser Pro Gly Lys

:210> 170 211> 214 212 > PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> cadeia pesada do anticorpo 400> 170

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Thr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90

Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210

Arg Gly Glu Cys

210> 171 211> 214 212> PRT

213> Seqüência artificial 22 0 >

223 > Robo4 marcado na His 400> 171

Gln Asp Ser Pro Pro Gln Ile Leu Val His Pro Gln Asp Gln Leu 15 10 15 Phe Gln Gly Pro Gly Pro Ala Arg Met Ser Cys Gln Ala Ser Gly 20 25 30

Gln Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Leu Leu Asn Gly Gln Pro Leu 35 40 45

Ser Met Val Pro Pro Asp Pro His His Leu Leu Pro Asp Gly Thr 50 55 60

Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Ala Arg Gly His Ala His Asp Gly 65 70 75

Gln Ala Leu Ser Thr Asp Leu Gly Val Tyr Thr Cys Glu Ala Ser 80 85 90

Asn Arg Leu Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly Ala Arg Leu Ser Val 95 100 105

Ala Val Leu Arg Glu Asp Phe Gln Ile Gln Pro Arg Asp Met Val 110 115 120

Ala Val Val Gly Glu Gln Phe Thr Leu Glu Cys Gly Pro Pro Trp 125 130 135

Gly His Pro Glu Pro Thr Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Pro 140 145 150

Leu Ala Leu Gln Pro Gly Arg His Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu 155 160 165

Leu Met Ala Arg Ala Glu Lys Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Met Cys 170 175 180

Val Ala Thr Asn Ser Ala Gly His Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg 185 190 195

Val Ser Ile Gln Glu Pro Gln Asp Tyr Arg Ala His His His His 200 205 210

His His His His

<210> 172

<211> 243 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Robo4 marcado na His

<400> 172

Met Gly Ser Gly Gly Thr Gly Leu Leu Gly Thr Glu Trp Pro Leu 1 5 10 15

Pro Leu Leu Leu Leu Phe Ile Met Gly Gly Glu Ala Leu Asp Ser 20 25 30

Pro Pro Gln Ile Leu Val His Pro Gln Asp Gln Leu Leu Gln Gly 35 40 45

Ser Gly Pro Ala Lys Met Arg Cys Arg Ser Ser Gly Gln Pro Pro 50 55 60

Pro Thr Ile Arg Trp Leu Leu Asn Gly Gln Pro Leu Ser Met Ala 65 70 75

Thr Pro Asp Leu His Tyr Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu Leu Leu 80 85 90

His Arg Pro Ser Val Gln Gly Arg Pro Gln Asp Asp Gln Asn Ile 95 100 105

Leu Ser Ala Ile Leu Gly Val Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg 110 115 120

Leu Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly Ala Arg Leu Ser Val Ala Val 125 130 135

Leu Gln Glu Asp Phe Gln Ile Gln Pro Arg Asp Thr Val Ala Val 140 145 150

Val Gly Glu Ser Leu Val Leu Glu Cys Gly Pro Pro Trp Gly Tyr 155 160 165

Pro Lys Pro Ser Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Val 170 175 180

Leu Gln Pro Gly Arg Arg Thr Val Ser Gly Asp Ser Leu Met Val 185 190 195

Ser Arg Ala Glu Lys Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Met Cys Met Ala 200 205 210

Thr Asn Asn Ala Gly Gln Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Val Ser 215 220 225

Ile Gln Glu Ser Gln Asp His Arg Arg Ala His His His His His

230 235 240

His His His

<210> 173

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região de suporte da cadeia leve do anticorpo

<400> 173

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 5 10

<210> 174

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220>

<221> Xaa

<222> 5

<223> Xl é D ou S

<220>

<221> Xaa

<222> 6

<223> X2 é V( I ou G

<220>

<221> Xaa

<222> 7

<223> X3 é S ou A

<220>

<221> Xaa

<222> 8

<223> X4 é T, S, R, ou I <220>

<221> Xaa

<222> 9

<223 > Χ5 é Α, Y OU S

<220>

<221> Xaa

< 2 22 > 10

<223> Χ6 é V ou L

<4 00 > 174

Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 5 10

<210> 175

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <22 0 >

<223 > região hipervariável do anticorpo

<22 0 > <221> Xaa <222> 1

<223> Xl é S ou G

<220> <221> Xaa <222> 3

<223> X2 é T ou S

<220> <221> Xaa <222> 4

<223> X3 é F, S, L, N, ou T

<220> <221> Xaa <222> 5

<223> X4 é L, R, E, ou A

<220> <221> Xaa <222> 6

<223> X5 é Y, A, ou S <220> <221> Xaa <222> 7

<223> Χ6 é S ou Y

<400> 175 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5

<210> 176 <211> 9 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222 > 3

<223> Xl é S, Υ, Ρ, T, F ou G

<220> <221> Xaa <222> 4

<223> X2 é Y, W, F, R ou N

<220> <221> Xaa <222> 5

<223> X3 é T, S, N, A, D, F, Η, V ou G 22 O >

221> Xaa 222> 6

223> X4 é Τ, Y, S, A, D, N, L, I, Μ, Y ou 220>

221> Xaa 222> 7

223> X5 é P, L, H, ou T 220>

221> Xaa 222> 8

223> X6 é P. L. F, A, M ou S <400> 176

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 5

<210 > 177 <211> 10 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220 >

<223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222> 2

<223> Xl é F ou Y

<220>

<221> Xaa

<222> 3

<223> X2 é T ou S

<220>

<221> Xaa

<222> 4

<223> X3 é I, F, ou L

<220> <221> Xaa <222> 5

<223> X4 é S, Ν, Τ, Y, D, ou K

<220> <221> Xaa <222> 6

<223> X5 é G, N, ou S

<220> <221> Xaa <222> 7

<223> X6 é S, Υ, N ou R <220>

<221> Xaa <222> 8

<223> X7 é W, Y ou A <220> <221> Xaa <222> 9

<223> Χ8 é I, Μ, F, L ou N

<220> <221> Xaa <222 > 10

<223 > Χ9 é Η, S, E ou Q <400> 177

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10

<210> 178 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222 > 1

<223> Xl é A, G ou S

<220> <221> Xaa <222> 2

<223 > X2 é V, F, G, I, T ou R

<220> <221> Xaa <222 > 4

<223 > X3 é Τ, Y OU S

<220> <221> Xaa 222> 5

223> X4 é P, G ou S 220>

221> Xaa 222> 6

223> X5 é A, Τ, Y, ou M <220> <221> Xaa <222 > 7

<223> Χ6 é G, D, ou L

<220> <221> Xaa <222> 8

<223> XT é G ou S

<220> <221> Xaa <222> 9

<223> Χ8 é Υ, D, S, Τ, Η, Κ, A ou V

<220> <221> Xaa <222 > 10

<223> Χ9 é T ou I

<220> <221> Xaa <222> 11

<223> XlO é Υ, D, Ν, Α, Ε, ou I <4 00 > 178

Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 179 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222> 2

<223> Xl é R ou S

<220> <221> Xaa <222> 3

<223 > Χ2 é S, L, G, D, M ou W

<220> <221> Xaa <222 > 4

<223 > X3 é Ν, I, G, V, ou S

<22 0 > <221> Xaa <222> 5

<223 > X4 é R, G, Y ou N

<220> <221> Xaa <222> 6

<223 > X5 é Υ, N, S, ou V

<22 0 > <221> Xaa <222> 7

<223 > X6 é S, Κ, Y, W, ou M

:220> :221> Xaa :222 > 8

:223 > X7 é G, F, S, P ou uma deleção

:220> :221 > Xaa 222> 9

223 > X8 é Q, G, A, S, Y ou uma deleção 220>

221> Xaa 222 > 10

223> X9 é F, W, R, Ρ, E, G ou uma deleção 220>

221> Xaa 222 > 11

223> XlO é V, S, W, G, H, ou uma deleção 220>

221> Xaa 222 > 12 <223> X11 é Ρ, S, W, Η, ou uma deleção

<220> <221> Xaa <222 > 13

<223> X12 é A, Y, D, G, V, ou uma deleção

<220>

<221> Xaa

<222> 14

<223> X13 é Y, G ou uma deleção

<220> <221> Xaa <222 > 15

<223> X14 é A, V ou uma deleção

<220> <221> Xaa <222> 16

<223> X15 é M, L, ou F

<220> <221> Xaa <222> 17

<223> X16 é D ou A

<220> <221> Xaa <222 > 18

<223 > X17 é Y ou V <400> 179

Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa

<210> 180 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo <220> <221> Xaa <222> 2

<223 > Xl é F ou Y

<22 0 > <221> Xaa <222> 3

<223> Χ2 é T ou S

<220> <221> Xaa

<222> 4

<223> Χ3 é I, F, ou L

<220> <221> Xaa <222 > 5

<223 > X4 é S1 Τ, Υ, D, ou K

<220> <221> Xaa <222> 6

<223> Χ5 é G, Ν, ou S

<22 O > <221> Xaa <222> 7

<223> Χ6 é S, N ou R

<22 O > <221> Xaa <222> 8

<223 > Χ7 é W ou A

<220> <221> Xaa <222> 9

<223> Χ8 é I, Μ, F, L ou N

<22 O > <221> Xaa <222 > 10

<223> Χ9 é Η, S1 E ou Q <400> 180

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 181 <211> 18 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220>

<221> Xaa

<222> 1

<223> Xl é A ou S

<220 > <221> Xaa <222> 2

<223> X2 é V, G, I, T1 ou R

<220> <221> Xaa <222> 4

<223> X3 é T ou S

<220> <221> Xaa <222> 5

<223> X4 é P, G, ou S

<220> <221> Xaa <222> 6

<223> X5 é A, Τ, Y, ou M

<220> <221> Xaa <222> 7

<223> X6 é G, D, ou L

<220>

<221> Xaa <222> 8

<223> X7 é G ou S

<220>

<221> Xaa <222> 9

<223> Χ8 é Υ, S, Τ, Η, Κ, A ou V

<220> <221> Xaa <222> 10

<223> Χ9 é T ou I

<220> <221> Xaa <222> 11

<223> X10 é Y, N, A, Ε, ou I <400> 181

Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 182 <211> 16 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222> 1

<223> Xl é S, G, D, M ou W

<220> <221> Xaa <222> 2

<223> X2 é N, G, V, ou S

<220> <221> Xaa <222> 3

<223> X3 é R, Y, ou N

<220> <221> Xaa <222> 4

<223> X4 é Y, S, ou V <220> <221> Xaa <222 > 5

<223> Χ5 é S, Υ, W, ou M

<22 0 > <221> Xaa <222> 6

<223> Χ6 é G, S, Ρ, ou uma deleção

<220> <221> Xaa <222> 7

<223> X7 é Q, A, S, Y, ou uma deleção

<220>

<221> Xaa

<222> 8

<223 > X8 é F, R, Ρ, E, G, ou uma deleção

<220> <221> Xaa <222> 9

<223> X9 é V, W, G, H, ou uma deleção

<220> <221> Xaa <222> 10

<223> XlO é P, W, G, H, ou uma deleção

<220> <221> Xaa <222 > 11

<223> Xll é A, D, G, V, ou uma deleção

<220> <221> Xaa

<222 > 12

223> X12 é Y ou uma deleção

220>

221> Xaa 222 > 13

223> X13 é A ou V

220> <221> Xaa <222 > 14

<223> Χ14 é Μ, L, ou F

<220> <221> Xaa <222 > 16

<223> X15 é Y ou V <4 OO > 182

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp 15 10 15

Xaa

<210> 183 <211> 11 <212 > PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222> 6

<223> Xl é V ou G

<220> <221> Xaa <222> 7

<223> X2 é S ou A

<220> <221> Xaa <222> 8

<223> X3 é T, R, ou I

<220> <221> Xaa <222> 9

<223> X4 é A, S, ou Y

<220> <221> Xaa <222> 10 <223> Χ5 é V ou L

<400> 183

Arg Ala Ser Gln Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Al 5 10

<210> 184

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220>

<221> Xaa

<222> 3

<223> Xl é S ou T

<220>

<221> Xaa

<222> 4

<223> X2 é F, L, N OU T

<220>

<221> Xaa

<222> 5

<223> X3 é L, E, ou A

<220>

<221> Xaa

<222> 6

<223> X4 é Y, A, ou S

<220>

<221> Xaa

<222> 7

<223> X5 é S, Y ou uma deleção

<400> 184

Ser Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5

<210> 185

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222> 3

<223 > Xl é S, Ρ, T, F, ou G

<220> <221> Xaa <222> 4

<223> X2 é Y, F, R, ou N

<220> <221> Xaa <222> 5

<223> X3 é T, A, S, D, F, Η, Ν, V, ou G

<220>

<221> Xaa

<222> 6

<223> X4 é T, A, D, N, L, I, Μ, Y, ou G

<220> <221> Xaa <222> 7

<223> X5 é P, L, H, ou T

<220> <221> Xaa <222> 8

<223> X6 é Ρ, A, M, F, ou S <400> 185

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 5

<210 > 186 211> 10 212> PRT

213> Seqüência artificial 220>

223> região hipervariável cio anticorpo

220> <221> Xaa <222> 3 <223> Xl é T ou S

<220> <221> Xaa <222> 4 <223> Χ2 é I ou L

<220> <221> Xaa <222> 5 <223> Χ3 é Ν, Υ, D, ou K

<220> <221> Xaa <222> 9 <223 > X4 é I, F, L ou N

<220> <221> Xaa <222> 10 <223> Χ5 é Η, Ε, ou Q

<400> 186 Gly Phe Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Xaa Xaa 5 10

<210> 187 <211> 18 <212> PRT <213> Seqüência artificial

<220> <223> região hipervariável do anticorpo

<220> <221> Xaa <222> 2 <223> X1 é F ou R

<220> <221> Xaa <222> 5 <223> X2 é P ou S

<220 > <221> Xaa <222> 7

<223> Χ3 é G ou L

<220> <221> Xaa <222> 9

<223> Χ4 é D, H, Κ, Α, ou V <220>

<221> Xaa <222> 11

<223> Χ5 é D, Α, E ou I <400> 187

Gly Xaa Ile Tyr Xaa Ala Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

Claims

1. ANTICORPO ANTI-R0B04, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis sequência(s) de região hipervariável (HVR) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: (i) HVR-L1 compreendendo seqüência A1-A11, em que A1- A11 é RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 1); (ii) HVR-L2 compreendendo seqüência B1-B7, em que B1-B7 é SASFLYS (SEQ ID NO: 2); (iii) HVR-L3 compreendendo seqüência C1-C9, em que C1-C9 é QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 3); (iv) HVR-H1 compreendendo seqüência D1-D10, em que D1- D10 é GFTINGYYIH (SEQ ID NO: 17); (v) HVR-H2 compreendendo seqüência E1-E18, em que E1- E18 é GFIYPAGGDTDYADSVKG (SEQ ID NO: 18); (vi) HVR-H3 compreendendo seqüência F1-F17, em que F1- F17 é ARLIGNKFGWSSYGMDY (SEQ ID NO: 19); e (vii) pelo menos uma variante HVR, em que a variante HVR compreende uma inserção, deleção ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido de uma seqüência ilustrada em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 17, 18 ou 19.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 72-97.

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 140-165.

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo: uma HVR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; uma HVR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2; e uma HVR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 20.

5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo: uma HVR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 17; uma HVR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 18; e uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 19.

6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: uma HVR-L1 compreendendo SEQ ID NO: 1; uma HVR-L2 compreendendo SEQ ID NO: 2; e uma HVR-L3 compreendendo QQSRSDHPT (SEQ ID NO: 20); e (ii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo: uma HVR-H1 compreendendo SEQ ID NO: 17; uma HVR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 18; e uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO: 19.

7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado.

8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fab, um Fab' e um (Fab')2.

9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um agente citotóxico.

10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que que o agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste em: N2'-deacetil-N-2'(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1), monometil auristatina E (MMAE)1 monometil auristatina F (MMAF) e combinações dos mesmos.

11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicio nalmente uma marcação detectável.

12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a marcação detectável é selecionada a partir do grupo que consiste em: biotina, um corante fluorescente, um radionuclídeo, agente quelante ácido 1, 4, 7, 10-tetrazaciclododecano-N, N', N", N'"-tetracético (DOTA), uma microbolha, uma emulsão de nanopartícula de perfluorocarbono, uma partícula metálica e combinações dos mesmos.

13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a marcação detectável é ligada de forma covalente ao anticorpo em um resíduo de cisteína.

14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o resíduo de cisteína está na posição 118 de região Fc de cadeia pesada de acordo com a Numeração EU.

15. USO DE UM ANTICORPO, conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para a modulação de angiogênese.

16. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende adicionalmente um agente citotóxico.

17. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a angiogênese é inibida.

18. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a angiogênese está associada com uma disfunção selecionada a partir do grupo que consiste em: câncer, arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, retinopatias proliferativas, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado e outros tecidos, artrite reumatoide, psoríase e combinações dos mesmos.

19. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a angiogênese está associada com câncer.

20. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer de células escamosas, câncer de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estomago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colonretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, carcinoma de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, mielomas múltiplos e linfoma de célula B, câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, sarcoma osteogênico e angiosarcoma, e metástases associadas e combinações dos mesmos.

21. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE IMAGEM in vivo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar um anticorpo, conforme descrito na reivindicação 11, a um mamífero.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o mamífero é suspeito de portar uma doença ou disfunção selecionada a partir do grupo que consiste em: câncer, ateroesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, retinopatias proliferativas, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado, artrite reumatoide, psoríase e combinações dos mesmos.