JP4628679B2 - Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞 - Google Patents

Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞 Download PDF

Info

Publication number
JP4628679B2
JP4628679B2 JP2003582281A JP2003582281A JP4628679B2 JP 4628679 B2 JP4628679 B2 JP 4628679B2 JP 2003582281 A JP2003582281 A JP 2003582281A JP 2003582281 A JP2003582281 A JP 2003582281A JP 4628679 B2 JP4628679 B2 JP 4628679B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
dna
gdp
fucose
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2003582281A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2003085102A1 (ja
Inventor
豊 神田
光男 佐藤
勝弘 森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=28786450&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP4628679(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Publication of JPWO2003085102A1 publication Critical patent/JPWO2003085102A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4628679B2 publication Critical patent/JP4628679B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失するように、ゲノムが改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫、該動物あるいは植物から抗体組成物を製造する方法、および該抗体組成物を含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体ＩｇＧ分子のＦｃ領域には、２個所のＮ−グリコシド型の糖鎖結合部位が存在しており、血清中のＩｇＧでは、通常、この部位に、シアル酸やバイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンの付加の程度が少ない複数本の枝を持つコンプレックス型糖鎖が結合している。このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクトースの付加および還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性があることが知られている［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６，１３０，１９９７］。
このような糖鎖の構造は、糖鎖を合成する糖転移酵素と糖鎖を分解する糖分解酵素によって規定されていると考えられている。
【０００３】
以下に、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成に関して述べる。
糖蛋白質は、小胞体（以下、ＥＲと表記する）内腔で糖鎖の修飾を受ける。Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成過程では、比較的大きな糖鎖が、ＥＲ内腔で伸長しつつあるポリペプチド鎖に転移される。この際、糖鎖はまず、ドリコールリン酸（以下、Ｐ−Ｄｏｌとも表記する）と呼ばれるα−イソプレン単位を２０個程度含む長鎖の脂質担体のリン酸基に順次付加される。すなわち、ドリコールリン酸にＮ−アセチル−グルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃとも表記する）が転移されＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなり、続いてもう１個ＧｌｃＮＡｃが転移されＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌとなる。次いで、マンノース（以下、Ｍａｎとも表記する）が５個転移され（Ｍａｎ）５−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌに、さらに、Ｍａｎが４個、グルコース（以下、Ｇｌｃとも表記する）が３個転移される。このようにして、コアオリゴ糖と呼ばれる糖鎖の前駆体（Ｇｌｃ）３−（Ｍａｎ）９−（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌができる。この１４個の糖からなる糖鎖の前駆体はアスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン配列（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）を持ったポリペプチドへＥＲ内腔でひとかたまりのまま転移される。この際、コアオリゴ糖に結合していたドリコールピロリン酸（Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌ）は遊離するが、ピロホスファターゼの分解を受けて再びドリコールリン酸となり再利用される。糖鎖のトリミングは、糖鎖がポリペプチドに結合すると直ちに開始される。すなわち、３個のＧｌｃと１ないし２個のＭａｎがＥＲ上で除去され、この除去にはα１，２−グルコシダーゼＩ、α１，３−グルコシダーゼＩＩおよびα１，２−マンノシダーゼが関与することが知られている。ＥＲ上でトリミングを受けた糖蛋白質はゴルジ体へ輸送され様々な修飾を受ける。ゴルジ体シス部には、マンノースリン酸を付加するＮ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン１−ホスホジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびα−マンノシダーゼＩが存在し、Ｍａｎ残基を５個にまで減少させる。ゴルジ体メディア部には、コンプレックス型のＮ−グリコシド結合糖鎖の最初の外側のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）、２個のＭａｎを除去するα−マンノシダーゼＩＩ、外側から２個目のＧｌｃＮＡｃを付加するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（ＧｎＴＩＩ）、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するα１，６−フコシルトランスフェラーゼが存在する。ゴルジ体トランス部にはガラクトースを付加するガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルノイラミン酸などのシアル酸を付加するシアル酸転移酵素が存在する。このような各種酵素の作用を受けてＮ−グリコシド結合糖鎖が作られることが知られている。
【０００４】
抗体の糖鎖に関しては、ボイド（Ｂｏｙｄ）らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）或いはマウスミエローマ細胞由来のＮＳＯ細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）を各種糖分解酵素で処理し、糖鎖の抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性とも表記する）、補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性とも表記する）に対する影響を検討した結果、非還元末端のシアル酸の除去は、両活性に影響を与えないが、更にガラクトース残基を除去することでＣＤＣ活性のみが影響を受け、約５０％程度活性が低下すること、糖鎖の完全な除去は、両活性を消失させることを報告している［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３２，１３１１（１９９５）］。また、ライフリー（Ｌｉｆｅｌｙ）らは、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞或いはラットミエローマＹ０細胞で生産したヒト型ＣＤＲ移植抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒトＩｇＧ１サブクラス）の糖鎖の分析およびＡＤＣＣ活性を測定した結果、Ｙ０細胞由来のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈが最も高いＡＤＣＣ活性を示し、その活性にはバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃとも表記する）が重要であることを示唆している［グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）、ＷＯ９９／５４３４２］。
【０００５】
さらに、抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加修飾によって、抗体のＡＤＣＣ活性が大きく変化することが報告されている（ＷＯ００／６１７３９）。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしていることを示している。
【０００６】
一般的に、医薬への応用が考えられているヒト化抗体の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞などを宿主細胞として用い製造されているが、上述したように、抗体のエフェクター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、宿主細胞によって発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違いが観察されることから、より高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望まれている。
【０００７】
宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節し、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変する一つの方法として、糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤を応用することが試みられている。
糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の前駆体であるコアオリゴ糖形成の最初のステップであるＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｐ−Ｄｏｌの形成を選択的に阻害するツニカマイシン、グリコシダーゼＩの阻害剤であるカスタノスペルミンやＮ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、グルコシダーゼＩＩの阻害剤であるブロモコンヅリトール、マンノシダーゼＩの阻害剤である１−デオキシノジリマイシンや１，４−ジオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール、マンノシダーゼＩＩの阻害剤であるスワンソニンなどが知られている。糖転移酵素の特異的な阻害剤としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）などに対する基質のデオキシ誘導体が開発されつつある［グライコバイオロジーシリーズ２−糖鎖の細胞における運命（講談社サンエンティフィック）永井克孝・箱守仙一朗・木幡陽編（１９９３）］。また、１−デオキシノジリマイシンはコンプレックス型糖鎖の合成を抑え、ハイマンノース型やハイブリッド型糖鎖の割合を増加させることが知られている。実際に、カスタノスペルミン、Ｎ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、スワンソニンあるいはツニカマイシンなどの阻害剤を培地に添加することでハイブリドーマが産生するＩｇＧの糖鎖構造が変化し、抗原結合性やＡＤＣＣ活性などが変化することが報告されている［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ），２６，１１１３（１９８９）］。しかしながら、これら阻害剤の特異性は弱く、また標的とする酵素を十分に阻害することも難しいため、生産抗体の糖鎖構造を確実に制御することは難しい。
【０００８】
また、糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられており、その具体的な例としては、１）ラットのβ−ガラクトシドα
２，６−シアリルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が可能であること［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８，１９８９］、２）ヒトのβ−ガラクトシド２−αフコシルトランスフェラーゼをマウスＬ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−）の発現が可能であること［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８，１９９１］、３）β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を生産することでＮ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること［グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）、ＷＯ９９／５４３４２］が報告されている。ＧｎＴＩＩＩを導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性を示した。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩあるいはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すと報告されているため、抗体医薬の生産には適切ではない。
【０００９】
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されており、その具体的な例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）の活性が欠損しているＣＨＯ細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する抗体を生産した報告が挙げることができる［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。また、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターやＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、ガラクトースの付加のない抗体の発現例が報告されているが、医薬への応用に適したエフェクター作用が向上した抗体の発現には成功していない［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。これら変異株は、変異剤処理によりランダムに変異が導入された結果の株として取得されており、医薬品製造に用いる株として適切ではない。
【００１０】
このように、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、実際には糖鎖の修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。特に、抗体のエフェクター機能は糖鎖構造により大きな影響を受ける事が明らかになりつつあるが、最適な糖鎖構造で修飾された抗体分子を産生しうる宿主細胞の取得には至っていない。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、以下に関する。
１．以下の（１）〜（３）から選ばれる遺伝子工学的な手法により、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの活性が、該遺伝子工学的な手法を施す前の細胞よりも低下または欠失した、抗体分子をコードする遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞。
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端３０アミノ酸が欠失したＮ末端欠失体を導入する手法；
（２）配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの転写または翻訳を抑制する手法；
（３）ＧＤＰ−フコーストランスポーターの遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法。
２．前記遺伝子工学的な手法が前記（３）の遺伝子破壊の手法であり、前記ＧＤＰ−フコーストランスポーターが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である前項１に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
３．抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、前項１または２に記載の細胞。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
４．抗体分子のクラスがＩｇＧである、前項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
５．抗体分子が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子である、前項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
６．抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子が、該抗体分子中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子よりも高いことを特徴とする、前項５に記載の細胞。
７．糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である前項６に記載の細胞。
８．フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、前項６または７に記載の細胞。
９．前項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を用いること特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
１０．前項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
１１．抗体組成物が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、前項９または１０に記載の方法。
１２．抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、前項１１に記載の方法。
１３．糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である前項１２に記載の方法。
１４．フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、前項１２または１３に記載の方法。
１５．前項９〜１４のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
１６．前項１５に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
１７．医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬または治療薬である、前項１６に記載の医薬。
１８．前項１６または１７に記載の医薬を製造するための、前項１５に記載の抗体組成物の使用。
【００２３】
本発明の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が親細胞よりも低下または欠失した細胞（以下、「本発明の宿主細胞」と略記する）としては、親株細胞よりも細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質（以下、「ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質」と略記する）の活性を低下または欠失させた細胞であればいかなる細胞も包含される。
【００２４】
親株細胞とは、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法を施す前の細胞をいう。
ＮＳＯ細胞の親株細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳＯ細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳＯ細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００２５】
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
【００２６】
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株なども具体的な例としてあげられる。
【００２７】
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞をあげることができる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００２８】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法としては、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を低下または欠失させるための方法であればいずれの手法でも用いることができるが、遺伝子工学的な手法が望ましい。その具体的な方法としては、
（ａ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法などがあげられる。
【００２９】
また、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選別する方法を用いることにより、本発明のＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞を取得することができる。
【００３０】
レクチンに耐性な細胞とは、培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を行ったときにも、生育が阻害されない細胞をいう。
本発明において、生育が阻害されないレクチン有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌである。親株細胞に変異が導入された場合のレクチンの有効濃度とは、親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上である。
【００３１】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
【００３２】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性に影響を与えたり、発現に影響を与える蛋白質もＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に包含される。
【００３３】
本発明のＧＤＰ−フコーストランスポーターとしては、
以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質があげられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００３４】
さらに、本発明のＧＤＰ−フコーストランスポーターとしては、以下の（ｉ）〜（ｔ）からなる群から選ばれる蛋白質があげられる。
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｌ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｍ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｏ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｐ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｑ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｒ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｓ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質；
（ｔ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
【００３５】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１、３、２９または３０で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡなどがあげられる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、３、２９または３０で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００３６】
本発明において、配列番号２、４、３１または３２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号２、４、３１または３２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質などがあげられる。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００３７】
また、本発明において、配列番号２、４、３１または３２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質してとは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号２、４、３１または３２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質などがあげられる。
【００３８】
本発明の宿主細胞としては、抗体分子を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、好ましくは、動物細胞があげられる。動物細胞の好ましい具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。
本発明の宿主細胞に抗体分子をコードする遺伝子を導入することにより、あるいは、宿主細胞が抗体分子を生産する能力を有する場合は、そのまま当該宿主細胞を用いることにより抗体組成物を製造することができる。
【００３９】
本発明は、また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下するようにゲノムが改変された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を用いることを特徴とする抗体組成物を製造する方法に関する。
【００４０】
本発明において、抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子を含有する組成物をいう。
抗体は、重鎖および軽鎖（以下、それぞれ「Ｈ鎖」および「Ｌ鎖」と表記する）の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。Ｈ鎖のＮ末端側の約４分の１とＬ鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域（以下、「Ｖ領域」と表記する）と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。Ｖ領域以外の部分の大半は定常領域（以下、「Ｃ領域」と表記する）と呼ばれる。抗体分子はＣ領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスはＣ領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
【００４１】
Ｈ鎖はＮ末端側よりＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｅ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の構造式（Ｉ）に示す基本となる共通のコア構造を有する［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］。
【００４２】
【化１】
Figure 0004628679
【００４３】
上記構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式（Ｉ）のコア構造を有するものであればいかなるものでもよいが、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
【００４４】
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明において、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が欠失または低下した細胞を用いて製造した本発明の抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。そのような本発明の抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を欠失または低下させるような処置が施されていない親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い抗体組成物があげられる。
【００４５】
また、本発明において、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下するようにゲノムが改変された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を用いて製造した本発明の抗体組成物も、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。そのような本発明の抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫（以下、親個体と称す）が生産する抗体組成物よりも高い抗体組成物があげられる。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
【００４６】
ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞または親個体が生産する抗体組成物の該割合よりも高いものがあげられる。具体的には、該割合が親株細胞または親個体よりも２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上高い抗体組成物があげられ、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の全てが糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物が最も好ましい。
【００４７】
本発明の抗体組成物において、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞または親個体が生産する抗体組成物よりも高い場合、本発明の抗体組成物は、親株または親個体が生産する抗体分子からなる抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
【００４８】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって分析することによっても決定することができる。
【００４９】
抗体分子とは、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
抗体としてはハイブリドーマ細胞が分泌するモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
【００５０】
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体をいう。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００５２】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体酸産生トランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００５３】
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギ等があげられる。
本発明の宿主細胞は、親株細胞が生産する抗体組成物より、ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物を生産することができる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
【００５４】
抗体の断片は、上記抗体の少なくともＦｃ領域の一部を含んだ断片をいう。Ｆｃ領域とは、抗体のＨ鎖のＣ末端側の領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともＦｃ領域の一部とは、好ましくはＣＨ２領域を含む断片、より好ましくはＣＨ２領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）らのＥＵ Ｉｎｄｅｘ［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］のナンバリングで２２６番目のＣｙｓからＣ末端、あるいは２３０番目のＰｒｏからＣ末端までを意味する。抗体の断片としては、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域の一部を有する融合蛋白質とは、抗体のＦｃ領域の一部を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質（以下、Ｆｃ融合蛋白質と称す）を意味する。
【００５５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
【００５６】
（１）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする蛋白質の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
【００５７】
（ａ）アンチセンス法またはリボザイム法による本発明の細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、細胞工学，１２，２３９（１９９３）、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１７，１０９７（１９９９）、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），５，１０８３（１９９５）、細胞工学，１３，２５５（１９９４）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），９６，１８８６（１９９９）等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
【００５８】
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするゲノムＤＮＡの例としては、配列番号３４または３５で表される塩基配列からなるＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードするゲノムＤＮＡがあげられる。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡ部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
【００５９】
本発明の宿主細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得する。
【００６０】
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
【００６１】
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法などがあげられる。
【００６２】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
【００６３】
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
【００６４】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得することができる。
【００６５】
取得した遺伝子断片がＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のＤＮＡを取得することができる。
【００６６】
また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１、３、２９または３０に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを取得することもできる。
【００６７】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）などを用いることにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。形質転換体を選択する方法
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座 ３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製），谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、ＧＤＰ−フコースを基質として用いゴルジ体への輸送活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
【００６８】
また、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などがあげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の５．に記載の方法があげられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、好ましくはレンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等があげられる。
具体的には、１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地に１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、本発明の宿主細胞を選択することができる。
【００６９】
また、発現ベクターを用いず、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの塩基配列のうち、連続した５〜１５０塩基、好ましくは５〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
【００７０】
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
【００７１】
（ｂ）相同組換え法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
【００７２】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する。
該ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
【００７３】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【００７４】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００７５】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
【００７６】
（ｃ）ＲＤＯ方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ（ＲＮＡ−ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【００７７】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした蛋白質、すなわちＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００７８】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００７９】
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした蛋白質、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記１の（１）の（ａ）に記載の、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述の５．に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
【００８０】
（ｄ）ＲＮＡｉ方法による本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【００８１】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を得ることができる。
【００８２】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼＩＩＩにより転写が行われるタイプの発現ベクター、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００８３】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【００８４】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載された「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
【００８５】
また、発現ベクターを用いず、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したＲＮＡｉ遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を得ることもできる。
ＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１５５０２（１９９８）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３９５，８５４（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，５０４９（１９９９）；セル（Ｃｅｌｌ），９５，１０１７（１９９８）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，１４５１（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９５，１３９５９（１９９８）；ネイチャー・セル・バイオオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），２，７０，（２０００）］等の記載に従って設計することができる。
【００８６】
本発明のＲＮＡｉ法に用いられるＲＮＡとしては、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質などをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。好ましくはＧＤＰ−フコース輸送蛋白質が、上記記載のＧＤＰ−フコーストランスポーターであるＤＮＡに対応するＲＮＡがあげられる。
本発明のＲＮＡｉ法で使用されるＲＮＡとしては、ＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成され、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター等のＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のｍＲＮＡ量を減少させることが可能な２本鎖ＲＮＡであればいかなるものでもよいが、ＲＮＡの長さとしては、好ましくは１〜３０、より好ましくは５〜２９、さらに好ましくは１０〜２９、最も好ましくは１５〜２９の連続したＲＮＡがあげられる。具体的には、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号２９で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号３０で表される塩基配列中連続した１０〜３０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ、さらに好ましくは、
（ａ）配列番号３３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号３３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列からなり、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に対して配列番号３３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡがあげられる。
上述の「配列番号３３と実質的に同一のＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ」としては、配列番号３３で表されるＲＮＡと、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質に対する同様のＲＮＡｉ活性を有するものであればいかなるものでもよく、ＲＮＡの長さなどの量的要素は異なっていてもよい。
【００８７】
１または数個の塩基が欠失または付加された塩基配列とは、配列番号３３の両端の塩基が１または数個欠失および／または付加された塩基配列をいう。塩基配列としては、好ましくは１〜３０塩基、より好ましくは５〜２９塩基、さらに好ましくは１０〜２９塩基、最も好ましくは１５〜２９塩基の連続したＲＮＡがあげられる。
また、これらＲＮＡに対応するＤＮＡおよびその相補ＤＮＡも本発明に包含され、ＲＮＡに対応するＤＮＡとして、具体的には配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡがあげられる。さらに、該ＤＮＡおよびその相補ＤＮＡをベクターに含む組換え体ＤＮＡおよび該組換え体ＤＮＡを細胞に導入して得られる形質転換体も、本発明に包含され、該２本鎖ＲＮＡを発現させるために用いることができる。
【００８８】
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の宿主細胞の作製
本発明の宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
【００８９】
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００９０】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【００９１】
（２）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質を標的とし、該蛋白質のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
【００９２】
細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターは、小胞体およびゴルジ体の膜上においてダイマーを形成して機能していることが知られている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８（２０００）］。また、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を細胞内で強制発現させることにより、野生型トランスポーターとヘテロダイマーを形成し、形成したヘテロダイマーは野生型ホモダイマーに対して阻害活性を示すことが報告されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７５，１７７１８（２０００）］。従って、細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を作製し細胞内に導入することで、ドミナントネガティブ体として機能させることが可能である。このような変異体の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
【００９３】
上記方法で得られる、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体としては、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質のＮ末端欠失体、好ましくは、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質のＮ末端３０アミノ酸が欠失したＮ末端欠失体があげられる。具体的には、実施例１に記載のＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体があげられる。
【００９４】
本発明の宿主細胞は、上述のように作製した標的蛋白質のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
【００９５】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。
【００９６】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
【００９７】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の３．に記載の発現ベクターがあげられる。
【００９８】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００９９】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。また、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【０１００】
（３）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質についての突然変異を導入する手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子について突然変異を導入し、該蛋白質に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
【０１０１】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子としては、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどがあげられる。
具体的には、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
【０１０２】
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
【０１０３】
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性を測定する方法、あるいは、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、前記１の（１）の（ａ）に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述の５．に記載の方法があげられる。
【０１０４】
（４）ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法
本発明の宿主細胞は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
【０１０５】
２．本発明の、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が制御されるようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的として、１．に記載の手法を用いて作製した本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物細胞より、公知の方法を用い作製することができる。
具体的な方法について、以下に記す。
【０１０６】
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
【０１０７】
具体例としては、染色体上のＧＤＰ−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンなどがあげられる。作製した胚性幹細胞（例えば、該変異クローン）を用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞でＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【０１０８】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
【０１０９】
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ，Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
【０１１０】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。具体的には、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をＧ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない）ことにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
【０１１１】
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
【０１１２】
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−Ｄｉｌ−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、（Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ、ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨ ｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ等があげられる。
【０１１３】
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した本発明の受精卵細胞を作製することができる。
【０１１４】
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。
【０１１５】
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルスまたは細胞に、１．に記載の手法を施すことで、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した本発明の植物細胞からなるカルスを作製することができる。
【０１１６】
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェニック植物を作製することができる。
【０１１７】
３．抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
【０１１８】
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調製した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
【０１１９】
宿主細胞として、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができるが、好ましくは動物細胞があげられる。
【０１２０】
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
【０１２１】
本発明の抗体組成物の製造方法に用いられる宿主細胞としては、上記１．で作製した、ＧＤＰ−フコース輸送蛋白質の活性が親株細胞より欠失または低下した細胞をあげることができる。
【０１２２】
発現ベクターとしては、上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【０１２３】
ｃＤＮＡは、上記１．の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」に従い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
【０１２４】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
【０１２５】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
【０１２６】
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
【０１２７】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
【０１２８】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
【０１２９】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１３０】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
【０１３１】
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
【０１３２】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【０１３３】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
【０１３４】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
【０１３５】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
【０１３６】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
【０１３７】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
【０１３８】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
【０１３９】
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【０１４０】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
【０１４１】
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
【０１４２】
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
【０１４３】
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
【０１４４】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１４５】
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１４６】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
【０１４７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【０１４８】
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【０１４９】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【０１５０】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１５２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養、ホロファイバー培養などの培養法を用いて１日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５３】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５４】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５５】
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
【０１５６】
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【０１５７】
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１５８】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１５９】
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素・遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【０１６０】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
【０１６１】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
【０１６２】
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
【０１６３】
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【０１６４】
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
【０１６５】
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１６６】
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１６７】
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１６８】
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質などを挙げることができる。
【０１６９】
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物およびＦｃ融合蛋白質の製造方法について記すが、他の抗体組成物を上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
【０１７０】
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１７１】
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
【０１７２】
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
【０１７３】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【０１７４】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
【０１７５】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａｅｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖およびＶＬの全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１（以下、シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレストと略記する）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０１７６】
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）と比較することによって見出すことができる。
【０１７７】
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１７８】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されて
いるヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト）を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０１７９】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製において、該抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定することが、最も重要な点である。抗体と抗原との結合活性に関わるＦＲのアミノ酸を同定する方法としては、Ｘ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等の抗体の立体構造の構築及び解析方法があげられる。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらした。しかしながら、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されていない。したがって、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項３の（５）に記載のＰＣＲ法により行うことができる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０１８０】
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１８１】
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、１．に記載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンチボディズ、モノクローナルアンチボディズ）等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（レキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ β ｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【０１８２】
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
前記の（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有している場合には、前記１．に記載の方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を採取することにより、本発明の抗体組成物を製造することができる。
【０１８３】
４．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
【０１８４】
５．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
【０１８５】
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的には、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【０１８６】
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【０１８７】
６．本発明により得られる抗体組成物の利用
本発明により得られる抗体組成物は高いＡＤＣＣ活性を有する。高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
【０１８８】
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、本発明の抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
【０１８９】
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
【０１９０】
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
【０１９１】
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
【０１９２】
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
【０１９３】
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３，３３１−３３６，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０−２６６，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４，１５１１−１５１６，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３−４９７，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７−３９５，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９−２９１１，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１−９９１５，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５−１６４６３，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７−６５９，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６−２４０１，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７，４５９３−４５９９，１９９７）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８−２１４６，２０００）などがあげられる。
【０１９４】
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１−３８１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５−２４，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２−５６７，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１−５０，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３−１９０，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７−２４５，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６−７８０，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９−２５７，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３−１３８１，１９９７）などがあげられる。
【０１９５】
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８−２９７６，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００−１７４０４，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８−１１６４，２０００）などがあげられる。
【０１９６】
自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１−６８，２０００）などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５−３９５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５−２０７６，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体または抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６−３９９，１９９９）などがあげられる。
【０１９７】
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
【０１９８】
本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１９９】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０２００】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０２０１】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
【０２０２】
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０２０３】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０２０４】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
【０２０５】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
【０２０６】
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０２０７】
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【０２０８】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２０９】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【０２１０】
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
【０２１１】
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
【実施例】
【０２１２】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１３】
実施例１．ＧＤＰ−フコーストランスポータードミナントネガティブ体発現細胞の作製と産生抗体の評価
【０２１４】
（１）ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーター遺伝子の単離
ネイチャー・ジェネティクス［Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，７３（２００１）］に記載のヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターｍＲＮＡ配列を用いて、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと表記）の全長を増幅する為のプライマーセット［ＧＤＰｆＴ−Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５）とＧＤＰｆＴ−Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号６）］を設計し、ＤＮＡを合成した。
【０２１５】
５００μｌ容のマイクロ遠心管（エッペンドルフ社製）中に、２．５μｌのヒト胎児脳由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ−ｃＤＮＡ（クロンテック社製）、５μｌの２０ｍＭデオキシリボヌクレオチド混合液（東洋紡績社製）、
５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（クロンテック社製）、４μｌのＧＤＰｆＴ−Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、４μｌのＧＤＰｆＴ−Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社製）、２８．５μｌの滅菌蒸留水（インビトロジェン社製）を添加し、ＰＣＲ液を調製した。反応液を十分に混合後、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｌ重層し、サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）にて、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６４℃で３分間からなる反応を１サイクルとして、３０回反復させ、最後に７２℃にて３分間反応させた。反応液から５μｌを分取してアガロースゲル電気泳動を行い、全長約１．１ｋｂｐの用いたプライマー特異的なＤＮＡの増幅を確認した。
【０２１６】
次に、５００μｌ容のマイクロ遠心管（エッペンドルフ社製）中に、４μｌのＰＣＲ液、１μｌのＴｏｐｏＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社製）、１μＬのＳａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）を混合し、室温にて１５分間放置した。反応後の液から１μｌを分取して、５０μｌの大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅコンピテントセル（Ｓｔｉａｔａｇｅｎｅ社製）と混合し、氷上にて１５分間放置後、４２℃の温浴にて４５秒間加熱して熱ショックによる大腸菌の形質転換を行った。形質転換後の大腸菌は、ＬＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製）に懸濁後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加したＬＢ寒天培地プレート上に播種した。プレートを３７℃にて一晩培養し、寒天培地上に形質転換株のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で剥ぎ取り、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加した５０ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃、１５０ｒｐｍ（往復振とう）の条件で一晩培養した。得られた培養液を遠心管（ベクトンディッキンソン社製）に分取し、４℃にて８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離を行い、上清を除去し、大腸菌の菌体を取得した。得られた菌体に対し、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡはアガロースゲル電気泳動にて純度を確認後、分光光度計（島津製作所社製）を用いて波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、濃度を算出した。ＤＮＡシーケンサー３７７Ａ（島津製作所社製）を用いて、１．１ｋｂｐの組換えＤＮＡ配列を解読し、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの全長ＯＲＦであることを確認した。配列決定したヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、該塩基配列に基づくヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのアミノ酸配列を配列番号４に示した。得られたプラスミドＤＮＡは、ｐＣＲ／ｈＧＤＰｆＴと名付けた。
【０２１７】
（２）ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターＮ末端欠失変異体とその発現ベクターの作製
ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端側から３０残基のアミノ酸を削除したｃＤＮＡ配列を増幅する為のプライマーセット［ＧＤＰｆＴΔ３０−Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号７）とＧＤＰｆＴΔ３０−Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号８）］を設計し、ＤＮＡを合成した。なお、ＧＤＰｆＴΔ３０−Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒには、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターの３１番目のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列の５’末端側上流に、動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込む為の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト、翻訳効率化配列であるＫｏｚａｋ配列（ＣＣＧＣＣ）および翻訳開始コドンＡＴＧを接続した形で設計した。
【０２１８】
また、ＧＤＰｆＴΔ３０−Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒには、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターの翻訳終止コドンをコードするＤＮＡ配列の５’末端外側に、動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込む為の制限酵素ＸｂａＩサイトを接続した形で設計した。
【０２１９】
５００μｌ容のマイクロ遠心管（エッペンドルフ社製）中に、本項（１）で作製した１０ｎｇのｐＣＲ／ｈＧＤＰｆＴ、５μｌの２０ｍＭデオキシリボヌクレオチド混合液（東洋紡社製）、５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（クロンテック社製）、４μｌのＧＤＰｆＴΔ３０−Ｆｗ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、４μｌのＧＤＰｆＴΔ３０−Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏｌ相当量）、１μｌのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）、２８．５μｌの滅菌蒸留水（インビトロジェン社製）を添加し、ＰＣＲ液を調製した。反応液を十分に混合後、ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ社製）を３０μｌ重層し、サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）にて、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、６４℃で３分間からなる反応を１サイクルとして、３０回反復させ、最後に７２℃にて３分間反応させた。反応液から５μｌを分取してアガロースゲル電気泳動を行い、全長約１ｋｂｐの用いたプライマー特異的なＤＮＡの増幅を確認した。
【０２２０】
次に、ＰＣＲ液をマイクロ遠心管に回収し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを精製し、ＤＮＡ溶液の１／１０容のＭバッファー（宝酒造社製）を添加後、各１０ｕｎｉｔｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ（共に宝酒造社製）を添加して３７℃にて８時間処理した。なお、この制限酵素処理の際、１０μｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）も同様に処理した。
【０２２１】
制限酵素処理したサンプルよりＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを精製し、Ｎ末欠失体のｃＤＮＡ溶液５μＬとｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）溶液１μＬを混合後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を６μＬ添加し、１６℃にて３０分間ライゲーション反応を行った。反応液を２μＬ分取し、５０μｌの大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）と混合し、氷上にて１５分間放置後、４２℃の温浴にて４５秒間加熱して熱ショックによる大腸菌の形質転換を行った。形質転換後の大腸菌は、ＬＢ培地（ＤＩＦＣＯ社製）に懸濁後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加したＬＢ寒天培地プレート上に播種した。プレートを３７℃にて一晩培養し、寒天培地上に形質転換株のシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で剥ぎ取り、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製）を添加した５０ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃、１５０ｒｐｍ（往復振とう）の条件で一晩培養した。
【０２２２】
得られた培養液を遠心管（ベクトンディッキンソン社製）に分取し、４℃にて８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離を行い、上清を除去し、大腸菌の菌体を取得した。得られた菌体に対し、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡはアガロースゲル電気泳動にて純度を確認後、分光光度計（島津製作所社製）を用いて波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、濃度を算出した。ＤＮＡシーケンサー３７７Ａ（島津製作所社製）を用いて、１ｋｂｐの組換えＤＮＡ配列を解読し、ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体であることを確認した。得られたプラスミドＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ／ｈＧＤＰｆＴΔ３０と名付けた。
【０２２３】
（３）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へのプラスミドの導入と形質転換体の取得
１０μｇのｐｃＤＮＡ／ｈＧＤＰｆＴΔ３０と１０μｇのＣＣＲ４キメラ抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０（ＷＯ０１／６４７５４に記載）を、１．６×１０６個のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）］へ、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により共導入した。また、対照として、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）と１０μｇのｐＫＡＮＴＥＸ２１６０をＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に同様に共導入した。
【０２２４】
それぞれの細胞懸濁液を１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−Ｈｙｇ（５００）［透析牛胎児血清を１０％、ハイグロマイシン（和光純薬社製）を５００μｇ／ｍｌで含むＩＭＤＭ培地］に懸濁し、Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）へ播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２週間培養し、ハイグロマイシン耐性形質転換株を得た。次に培地をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−Ｈｙｇ（５００）に５０ｎＭ ＭＴＸを添加した培地に交換し、２週間培養して５０ｎＭ ＭＴＸ耐性株を取得した。更に、引続き、培地をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−Ｈｙｇ（５００）に２００ｎＭ ＭＴＸを添加した培地に交換し、２週間培養して２００ｎＭ ＭＴＸ耐性株を取得した。これらの２００ｎＭ ＭＴＸ耐性株は、本実施例（６）に記載のＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法により抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現を確認した。
【０２２５】
ヒトＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体を導入した形質転換株をＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ（＋）を導入した形質転換株をＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株とそれぞれ称す。なお、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株はＮｅｇａ−１３／ＧＤＰｆＴΔ３０の細胞名で、平成１４年３月１４日付けで独立法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７９６５として寄託されている。
【０２２６】
（４）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製
作製したＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が産生する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製は、以下のように行った。
【０２２７】
ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株をそれぞれＴ１８２フラスコ（グライナー社製）に播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にてコンフルエントになるまで増殖させた。細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍｌのＰＢＳバッファー（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、３５ｍｌのＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を添加した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて一週間培養後、培養上清を回収し、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア社製）による精製を添付の説明書に従い行った。精製抗体の蛋白質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）で定量した。得られた精製抗体は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株の生産抗体をＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体と、ＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株の生産抗体をＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体とそれぞれ名付けた。
【０２２８】
（５）精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体の解析
本実施例の（４）で得られた、２種類の精製抗ＣＣＲ４キメラ抗体の各４μｇを公知の方法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、分子量および精製度を解析した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４、モノクローナル・アンティボディズ）と一致し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【０２２９】
（６）ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性の評価
本実施例の（４）で得られた２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性は、ＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法に従って以下の方法で測定した。
【０２３０】
抗体ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号１５）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ｍＬに、１００ｍｌの２５ｍｇ／ｍＬ ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液を撹拌しながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬ ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬ
【０２３１】
ＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）を撹拌しながら添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
【０２３２】
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、２０分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０２３３】
その結果、第１図に示したように、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体とＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体は、ほぼ同等のＣＣＲ４ペプチドに対する抗原結合活性を示した。
【０２３４】
（７）ヒトＣＣＲ４高発現細胞株に対するＡＤＣＣ活性の評価
本実施例の（４）で得られた２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の、ヒトＣＣＲ４高発現細胞であるＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞（ＷＯ０１／６４７５４）に対するＡＤＣＣ活性は、以下に記載の方法に従って測定した。
【０２３５】
（ａ）標的細胞溶液の調製
ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトＣＣＲ４を発現しているＣＣＲ４／ＥＬ−４細胞の１．５×１０６細胞を調製し、放射性物質であるＮａ２ ５１ＣｒＯ４を５．５５ＭＢｑ当量加えて３７℃で１時間３０分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、培地を用いた懸濁および遠心分離操作により３回洗浄し、培地に再懸濁し、４℃で３０分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を１５ｍＬ加え、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
【０２３６】
（ｂ）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血６０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を０．６ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。培地で３回遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分間）して洗浄後、培地を用いて５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ヒトエフェクター細胞溶液とした。
【０２３７】
（ｃ）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（ａ）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（ｂ）で調製したヒトエフェクター細胞溶液を１００μＬ（５×１０５細胞／ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は５０：１となる）添加した。さらに、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を各最終濃度０．０００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の５１Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離５１Ｃｒ量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。全解離５１Ｃｒ量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の５１Ｃｒ量を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性（％）は下式（１）により求めた。
【０２３８】
【式１】
Figure 0004628679
【０２３９】
その結果、第２図に示したように、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体のＡＤＣＣ活性は、ＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体と比較して有意に高いことが明らかとなった。
【０２４０】
（８）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の糖鎖構造の解析
本実施例の（４）で得られた２種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体について、糖鎖構造の解析を行った。精製したそれぞれの抗体を、ウリトラフリー０．５−１０Ｋ（ミリポア社製）を用いて１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４に溶液を置換した。置換倍率は８０倍以上になるように行なった。置換した抗体は、ＵＶ−１６００（島津製作所製）を用いて濃度を測定した。抗体のアミノ酸配列から下記式（２）［アドバンスズ・イン・プロテインケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１２，３０３（１９６２）］を用いてモル吸光定数を算出し、２８０ｎｍの吸光度１．０を１．３８ｍｇ／ｍｌとして濃度を決定した。
【０２４１】
【式２】
Figure 0004628679
【０２４２】
１００μｇの抗体をヒドラクラブＳ−２０４用試験管に入れ、遠心濃縮機にて乾固した。サンプルを乾固させた該試験管をホーネン社製ヒドラクラブを用いてヒドラジン分解を行なった。ヒドラジン分解はホーネン社製ヒドラジン分解試薬を用い、１１０℃、１時間反応させることにより行った［メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），８３，２６３（１９８２）］。反応後ヒドラジンを減圧留去させて、反応容器を３０分間放置して室温に戻した。試験管にホーネン社製アセチル化試薬のａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ入れてよく攪拌させ、室温で３０分間反応させた。さらにａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを２５０μｌ、無水酢酸を２５μｌ加えてよく攪拌させ、室温で１時間反応させた。試料を−８０℃のフリーザーで凍結させ、約１７時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料から、ＴａＫａＲａ社製セルロースカートリッジ グリカンプレパレーションキットを用いて糖鎖を回収した。
【０２４３】
試料糖鎖溶液を遠心濃縮機にて乾固後、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］。２−アミノピリジン溶液は２−アミノピリジン１ｇに対しＨＣｌ７６０μｌを加え（１×ＰＡ溶液）、その溶液を逆浸透精製水で１０倍に希釈したものを用いた（１０倍希釈ＰＡ溶液）。シアン化水素化ホウ素ナトリウム溶液は、シアン化水素化ホウ素ナトリウム１０ｍｇに対し１×ＰＡ溶液２０μｌ、逆浸透精製水４３０μｌを加えて調製した。試料に１０倍希釈ＰＡ溶液を６７μｌ入れて１００℃、１５分間反応させ、放冷後にシアン化水素化ホウ素ナトリウム溶液を２μｌ入れて９０℃、１２時間反応させて試料糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識した糖鎖群（ＰＡ化糖鎖群）を、Ｓｕｒｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて過剰な試薬と分離した。溶離液は１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、流速は０．５ｍｌ／分、カラム温度は室温、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行なった。試料添加後２０分から３０分の溶出液を回収し、遠心濃縮機にて乾固させ、精製ＰＡ化糖鎖群とした。次に、ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製φ６．０ｎｍ×１５０ｎｍ）を用いて、精製ＰＡ化糖鎖群の逆相ＨＰＬＣ分析を行った。カラム温度は５５℃、流速は１ｍｌ／ｍｌ、蛍光検出器は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで行なった。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）でカラムを平衡化し、０．５％１−ブタノールの直線濃度勾配にて８０分間溶出した。各ＰＡ化糖鎖の同定は、分取した各ＰＡ化糖鎖のピークのマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）におけるポストソース分解（Ｐｏｓｔ Ｓｏｕｒｃｅ Ｄｅｃａｙ）分析、ＴａＫａＲａ社製ＰＡ化糖鎖スタンダードとの溶出位置の比較、並びに各種酵素を用いて各ＰＡ化糖鎖を消化後、逆相ＨＰＬＣ分析により行なった。糖鎖含量は、逆相ＨＰＬＣ分析における各ＰＡ化糖鎖のピーク面積より算出した。還元末端がＮ−アセチルグルコサミンでないＰＡ化糖鎖は、不純物由来であるか、ＰＡ化糖鎖調製中の副反応物であるため、ピーク面積の算出から除外した。ＨＰＬＣの分析チャートを第３図に示す。緩衝液Ａとしてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、緩衝液Ｂとして０．５％１−ブタノールを含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）を用い、以下のグラジエントで分析した。
【０２４４】
【表１】
Figure 0004628679
【０２４５】
なお、第３図で示した（１）〜（８）（図中では丸付き数字で表記）のピークは、以下の構造（１）〜（８）にそれぞれ対応する。
【０２４６】
【化２】
Figure 0004628679
【０２４７】
【化３】
Figure 0004628679
【０２４８】
ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコース、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。第３図において、α１，６−フコースを持たない糖鎖群の割合は、（１）〜（８）のうち（１）〜（４）のピークが占める面積、α１，６−フコースが結合した糖鎖群の割合は、（１）〜（８）のうち（５）〜（８）のピークが占める面積から算出した。その結果を第１表に示す。
【０２４９】
【表２】
Figure 0004628679
【０２５０】
ピーク面積から計算すると、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体のα１，６−フコースのない糖鎖含量は３５％、α１，６−フコースが結合した複合型糖鎖の割合は６５％であった。ＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体のα１，６−フコースのない糖鎖含量は１０％、α１，６−フコースが結合した複合型糖鎖の割合は９０％であった。
【０２５１】
以上の結果から、導入したＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端欠失体はＧＤＰ−フコーストランスポーターのドミナントネガティブ体として働き、産生抗体のα１，６−フコースが結合した複合型糖鎖の割合を低下させることが可能であることが分かった。
【０２５２】
実施例２．チャイニーズハムスター細胞からのＧＤＰ−フコーストランスポーター遺伝子の単離
【０２５３】
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全ＲＮＡの抽出
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）］を、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１倍濃度のＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、２×１０５個／ｍｌの密度で接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１５ｍｌ播種した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、培養２日目に１×１０７個を回収後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により添付の説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
【０２４３】
（２）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来全一本鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製した全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、５０μｌの滅菌水に溶解した。
【０２５４】
得られた各々の全ＲＮＡ３μｌに対しＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲクローニングには該反応液の５０倍希釈水溶液を使用した。使用するまで−８０℃で保管した。
【０２５５】
（３）ヒト／チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）キメラＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡの取得
上記（２）で作製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡに対し、実施例１の（１）に記載したヒトＧＤＰ−フコーストランスポーター配列に基づいて設計したプライマーセットＧＤＰｆＴ−Ｆｗ ＰｒｉｍｅｒとＧＤＰｆＴ−Ｒｖ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５および配列番号６）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ないプライマー部分がヒトＧＦＴ配列、増幅部分がＣＨＯ配列となるキメラＧＤＰ−フコーストランスポーターを増幅した。ＰＣＲはＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２５μｌの反応液［ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ上記遺伝子特異的プライマーセット］を調製し、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの後、さらに７２℃で５分間加熱する条件で行った。ＰＣＲ終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約１１００ｂｐをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製（以下、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いた）し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片９μｌをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いた２０μｌの反応系でＴ７ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ５０ｎｇとの連結反応を行ない、該反応液２μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αをコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた）により形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーから、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｅｈ），７，１５１３（１９７９）］（以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いた）に従って、プラスミドＤＮＡを単離した。インサートの有無は、アガロースゲル電気泳動によるサイズ比較により確認し、塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒａｅｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して添付のマニュアルに従い決定した。決定した４つのクローンの塩基配列を比較し、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを除いた後、本法より決定した挿入ＤＮＡがヒト／ＣＨＯキメラＧＤＰ−フコーストランスポーターをコードしていることを確認した。
【０２５６】
（４）ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの合成
上記（１）で抽出したＣＨＯ／ＤＧ４４全ＲＮＡからの５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡの作製を、ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、添付の説明書に従って行った。ただしＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を逆転写酵素として用いた。調製後の一本鎖ｃＤＮＡは各々、キット添付のＴｒｉｃｉｎ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈したものをＰＣＲの鋳型として用いた。
【０２５７】
（５）ＲＡＣＥ法によるチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターの非翻訳領域塩基配列の決定
上記（３）で決定したヒト／ＣＨＯキメラＧＤＰ−フコーストランスポーター塩基配列をもとにチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターに特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ５’−１（配列番号９）およびＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ５’−２（配列番号１０）、チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーター特異的な３’ＲＡＣＥ用プライマーＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ３’−１（配列番号１１）およびＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＧＳＰ３’−２（配列番号１２）を設計した。
【０２５８】
次にＡｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、本実施例（４）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む５０μｌの反応液［Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／ｌチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーター特異的ＲＡＣＥ用プライマー、１倍濃度の共通プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは９４℃で５秒間、６４℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして２０サイクル繰り返す条件で行った。反応終了後、反応液より１μｌをテンプレートとして使用し、再度反応液を調製し、同条件でＰＣＲを行った。１回目および２回目のＰＣＲで用いたテンプレート、プライマーの組み合わせおよび増幅されるＤＮＡ断片長を第２表に示した。２回目のＰＣＲ終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片を精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。
【０２５９】
上記、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥにより取得したＰＣＲ産物の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒａｅｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用してダイレクトシークエンス法により決定した。方法は添付のマニュアルに従った。チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターのＯＲＦに隣接する５’および３’の非翻訳領域の塩基配列について第４図に示す。
【０２６０】
【表３】
Figure 0004628679
【０２６１】
（６）チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターの全長ｃＤＮＡのクローニング
まず、本実施例（５）で決定したＧＤＰ−フコーストランスポーターの非翻訳領域の塩基配列に基づいて、チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーター特異的増幅用プライマーセット、ＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＦＷ（配列番号１３）および、ＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＲＶ（配列番号１４）を設計した。次にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いて、本実施例（２）で調製したＣＨＯ／ＤＧ４４由来一本鎖ｃＤＮＡを１μｌを含む２０μｌの反応液［ＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μＭ上記遺伝子特異的プライマー（ＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＦＷおよびＣＨＯ＃ＧＦＴ＃ＲＶ）］を調製し、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で５秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクル繰り返す条件でＰＣＲを行った。独立した系で４回のＰＣＲを実施後、それぞれの反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約１２５０ｂｐをＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製し、滅菌水２０μｌで溶出した。上記増幅断片４μｌをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いた２０μｌの系でｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ ｖｅｃｔｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５ｎｇとの連結反応を行ない、該反応液２μｌを用いてＤＨ５αを形質転換した。得られた複数のカナマイシン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、約１００ｎｇをＥｃｏＲＩ消化後、アガロースゲル電気泳動に供しインサートの存在を確認した。クローニングしたＰＣＲ増幅断片の塩基配列はＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒａｅｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して決定した。本法より配列決定したチャイニーズハムスターのＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡについて配列番号１に示した。さらに、決定した全長ｃＤＮＡ配列中に存在するＯＲＦ（塩基番号１１７番〜１２１４番）より推定されるチャイニーズハムスターのＧＤＰ−フコーストランスポーターアミノ酸配列（３６５アミノ酸）を配列番号２に示した。
【０２６２】
実施例３．ＧＤＰ−フコーストランスポーターを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入細胞の作製と該細胞を用いた抗体組成物の生産
【０２６３】
１．ＧＤＰ−フコーストランスポーターを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築
【０２６４】
（１）ＲＮＡｉの標的とするＣＨＯ由来遺伝子塩基配列の選別
配列番号１６に示した１９塩基をＲＮＡｉの標的配列とした。該配列は実施例２で取得したチャイニーズハムスター由来ＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡ（配列番号１）に示された塩基配列の８０３番目から８２１番目に相当する。該配列を標的としたショートインターフェアリングＲＮＡ（以下、ｓｉＲＮＡと記載する）をｓｉＲＮＡ＿ＧＦＴ＿Ｈと称す。以下にｓｉＲＮＡ＿ＧＦＴ＿Ｈを動物細胞内で発現するプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築方法を記載する。なお、該発現プラスミドの基本構造はＭｉｙａｇｉｓｈｉらの方法［ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），２０，５（２００２）］に準じて設計した。
【０２６５】
（２）プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅを構築した（第５図）。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＵ６ ｓｎＲＮＰ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ０７４２５およびＭ１４４８６）より設計したプライマー（配列番号１７および配列番号１８）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、ヒトＵ６ ｓｎＲＮＰ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。ＰＣＲはＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（クロンテック社製）を２００ｎｇ含む５０μＬの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ
Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号１７および配列番号１８）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
【０２６６】
このＰＣＲ液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法によりＰＣＲ増幅断片を回収した。この増幅断片をＸｂａＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＸｂａＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）をコーエンらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），６９，２１１０（１９７２）］（以下、大腸菌の形質転換はこの方法を用いた）により形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれるＵ６プロモーター塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンよりＰＣＲに伴う塩基の変異が生じていないプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅと命名した。
【０２５７】
（３）プラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩの構築
以下の手順でプラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩを構築した（第６図）。配列番号１９および配列番号２０に示す合成オリゴＤＮＡ（５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＳａｃＩ（宝酒造社製）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。各クローンの中からＢａｌＩＩ（宝酒造社製）で切断されるプラスミドを選択し、ｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩと命名した。
【０２６７】
（４）プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅを構築した（第７図）。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＵ６ ｓｎＲＮＰ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０７４２５、Ｍ１４４８６）より設計したプライマー（配列番号２１および配列番号２２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、ヒトＵ６ ｓｎＲＮＰ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。ＰＣＲはＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（クロンテック社製）を２００ｎｇ含む５０μＬの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号２１および配列番号２２）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。
【０２６８】
このＰＣＲ液をフェノール／クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿法によりＰＣＲ増幅断片を回収した。この増幅断片をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＢａｍＨＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれるＵ６プロモーター塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンよりＰＣＲに伴う塩基の変異が生じていないプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅと命名した。
【０２６９】
（５）プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈを構築した（第８図）。配列番号２３および配列番号２４に示す合成オリゴＤＮＡ（５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号２３および配列番号２４の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈと命名した。
【０２７０】
（６）プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈを構築した（第９図）。配列番号２５および配列番号２６に示す合成オリゴＤＮＡ（５’末端をリン酸化している）を各１０ｐｍｏｌずつ蒸留水に溶解し、９０℃で１０分間熱したのち室温に戻るまで放置しアニーリングさせた。該反応液よりアニーリングした合成オリゴ０．２ｐｍｏｌを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｍａＣＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる合成オリゴ由来の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより配列番号２５および配列番号２６の塩基が正しく導入されているプラスミドを選択し、Ｕ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈと命名した。
【０２７１】
（７）プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈを構築した（第１０図）。プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿ＨをＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断後、フェノール／クロロホルム抽出を行ないエタノール沈殿法によりＤＮＡ断片を回収し、次にＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で切断した。該反応溶液をアガロースゲル電気泳動後、約３７０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＳａｌＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈに連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＧＦＴ＿Ｈと命名した。
【０２７２】
（８）プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築
以下の手順でプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏを構築した（第１１図）。プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿ＨをＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断後、該反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１１５０ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。回収したＤＮＡ断片はＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、あらかじめＰｖｕＩＩ（宝酒造社製）で切断したプラスミドｐＰＵＲ（クロンテック社製）に連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドに含まれる塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（パーキンエルマー社製）を用い、常法に従って決定した。決定したクローンより目的の塩基配列を有するプラスミドを選択し、Ｕ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏと命名した。
【０２７３】
（９）直鎖化したプラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの作製
プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏを制限酵素ＦｓｐＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で切断することにより直鎖化した。切断後は反応液をアガロース電気泳動に供し、該プラスミドが正確に直鎖化されていることを確認した。
【０２７４】
２．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｓｉＲＮＡ発現プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏを導入した抗体生産株の取得
【０２７５】
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主とした、抗ＣＣＲ４キメラ抗体生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０（ＷＯ０１／６４７５４に記載）の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍｌのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［透析牛胎児血清（以下、ｄＦＢＳと表記する；インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）を］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（旭テクノグラス社製）に１００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の濃度を実施例１．の（６）に記載のＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０２７６】
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（旭テクノグラス社製）に０．５ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭに上昇させた。最終的にＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株を、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）に５００ｎＭ ＭＴＸを添加した培地に０．５細胞／ウェルの密度で懸濁し、９６穴プレート（旭テクノグラス社製）に播種することにより、限界希釈法による単細胞分離を実施した。３７℃で２週間培養後、各プレートを顕微鏡で観察し、シングルコロニーの増殖を確認したウェルを拡大培養し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現するクローンである、３２−０５−０９株を得た。
【０２７７】
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体生産細胞へのｓｉＲＮＡ発現ベクターＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの導入
本実施例第１項で構築したｓｉＲＮＡ発現ベクターを、本実施例第２項の（１）で作製した３２−０５−０９株へ導入した。
【０２７８】
ｓｉＲＮＡ発現ベクターの３２−０５−０９株への導入は、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、ＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で培養中の３２−０５−０９株をダルベッコＰＢＳ（Ｋ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０６個／ｍｌとし、細胞懸濁液２００μｌ（１．８×１０６個）を本実施例第１項で調製した線状化プラスミド１０μｇと混和した。細胞−ＤＮＡ混和液をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移した後、細胞融合装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧０．３５ＫＶ、電気容量２５０μＦの条件で導入を行った。
【０２７９】
この細胞懸濁液を３０ｍｌの基本培地（１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））に混和し、３枚の組織培養用９６穴プレート（旭テクノグラス社製）に、１００μＬ／ウエルで分注した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後に培地を吸引除去し、１２μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を１００μＬ／ウエルで分注した。引続き６日間培養後に培地を吸引除去し、０．４ｍｇ／ｍｌ ＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｒｉｎａｌｉｓ Ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ）（Ｖｅｃｔｏｒ社製）と１２μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を１００μＬ／ウエルで分注した。引続き１０日間培養することにより生き残った株を取得した。なお、これら生き残った株については、実施例１．の（６）に記載のＣＣＲ４ペプチド固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法により、培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現を確認した。
【０２８０】
取得した株をトリプシン処理して培養器より剥離させ、組織培養用２４穴プレート（旭テクノグラス社製）へ移植し、１２ｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて５日間培養した。培養後、上記プレート各ウエル中の各株に対し、１２μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した基本培地を用いて、組織培養用フラスコ（旭テクノグラス社製）へ拡大培養を行いった。このようにして取得した、ｓｉＲＮＡ発現ベクターＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏ導入株の一株を３２−０５−０９−Ｈ１２株と名付けた。なお、３２−０５−０９−Ｈ１２株は、３２−０５−０９−Ｈ１２株の細胞名で、平成１５年３月２７日付けで独立法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−８３４５として寄託されている。
【０２８１】
３．ＧＤＰ−フコーストランスポーターを標的としたｓｉＲＮＡ＿ＧＦＴ＿Ｈ導入株におけるＧＤＰフコーストランスポーターｍＲＮＡ量の測定
本実施例第２項で得た３２−０５−０９−Ｈ１２株を１２μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した基本培地に３×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に播種して３日間培養した。トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、懸濁液に対し１２００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を除去した。ダルベッコＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、再度１２００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行った後、−８０℃で凍結した。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入していない親株３２−０５−０９株についても同様の操作を行い、凍結細胞を調製した。
【０２８２】
調製した凍結細胞を室温で融解後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し全ＲＮＡを抽出した。方法は添付の説明書に従った。全ＲＮＡを４５μｌの滅菌水に溶解し、ＲＱ１ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、付属の１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ＲＮａｓｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）０．５μｌをそれぞれに添加して、３７℃で３０分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを再精製し、４０μｌの滅菌水に溶解した。
【０２８３】
得られた各々の全ＲＮＡ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとした２０μｌの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０２８４】
次に、配列番号１に示したチャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡの塩基番号７９９番から１１０８番の領域を増幅するよう設計したプライマーセットｈ＿ＧＦＴ＿ｆｗ４（配列番号２７）およびｈ＿ＧＦＴ＿ｒｖ２（配列番号２８）を用い、１００倍に希釈したｃＤＮＡ溶液を鋳型としてＰＣＲを行なった。すなわち、２０μＬの反応液［１×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、２．５単位のＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅホットスタートバージョン（宝酒造社製）、０．５μＭの上記プライマー（配列番号２７および配列番号２８）］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて２分間のサイクルを３２サイクル行なった。ＰＣＲ溶液のうち、７ｕｌを１．７５％アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを１倍濃度のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）に３０分間浸漬し染色し、フルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）でＰＣＲで増幅させたＤＮＡ量を測定することで、ＧＤＰ−フコーストランスポーターのｍＲＮＡ発現量を比較した。また、ＧＤＰ−フコーストランスポーターのｍＲＮＡ量を測定した際に鋳型として用いた一本鎖ｃＤＮＡと同量の一本鎖ｃＤＮＡを用い、ＷＯ００／６１７３９記載の競合的ＰＣＲによる転写量の定量方法に従い、β−アクチンｍＲＮＡ発現量についても測定し比較した。
【０２８５】
上記の方法により、３２−０５−０９株および３２−０５−０９−Ｈ１２株で発現するＧＤＰ−フコーストランスポーターとβ−アクチンのｍＲＮＡを比較した結果について第１２図に示した。独立した３回のＰＣＲにおいて、比較した２株の間でβ−アクチンのｍＲＮＡ量に変化はなかったが、３２−０５−０９−Ｈ１２株においてＧＤＰ−フコーストランスポーターｍＲＮＡの発現量が有意に減少していることが示された。
【０２８６】
４．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入株が生産する抗体組成物の取得
取得した３２−０５−０９−Ｈ１２株および３２−０５−０９株が生産する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の取得を以下の手順で行った。
【０２８７】
３２−０５−０９−Ｈ１２株を、１２μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを添加した基本培地へ３×１０５個／ｍｌの密度で懸濁後、３０ｍｌを接着細胞培養用Ｔ１８２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種し、１００％コンフルエントになるまで培養した３２−０５−０９株も、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ未添加基本培地を使用した以外は上記と同様に培養した。各株の培地全量を除去して、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を同量入れてから再度除去することで洗浄し、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３０ｍｌへ交換した。さらに７日間培養後、各細胞懸濁液を回収した。懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２μｍ孔径ＰＥＳ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて濾過した。
【０２８８】
０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．５ｍｌを充填し、精製水３．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌを順次通筒した。さらに、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記濾過処理した培養上清３０ｍｌをカラムに通筒した後、０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１．２５ｍｌを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。始めに溶出する０．２５ｍｌの画分を廃棄し、次に得られる溶出画分１ｍｌを回収して２ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）０．２ｍｌと混合して中和した。このようにして取得した抗体組成物を含む溶出液に対し、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。
【０２８９】
５．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入株が生産する抗体組成物の単糖組成分析
本実施例第４項で精製した抗ＣＣＲ４キメラ化抗体に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），６，１５７７（１９８３）］に従って単糖組成分析を行った。第３表に各抗体の単糖組成比より計算される、全複合型糖鎖に占める、フコースを持たない複合型糖鎖の割合を示した。ｓｉＲＮＡ導入に供した親株３２−０５−０９株の生産する抗体のフコースを持たない糖鎖の割合が８％であったのに対し、ｓｉＲＮＡ導入株３２−０５−０９−Ｈ１２株の生産する抗体のフコースを持たない糖鎖は５６％となり、フコースを有さない糖鎖の割合が有為に上昇していることが示された。
【０２９０】
以上の結果より、ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡの導入により、宿主細胞の生産する抗体における複合型糖鎖のフコース修飾を制御できることが示された。
【０２９１】
【表４】
Figure 0004628679

【０２９２】
６．ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入株が生産する抗体組成物の生物活性
本実施例第４項で精製した抗ＣＣＲ４キメラ化抗体の生物活性を、実施例１．の（７）に記載のＡＤＣＣ活性の測定方法および実施例１．の（６）に記載の抗原結合活性の測定方法に従って測定した。その結果を第３表に示す。親株３２−０５−０９株の生産する抗体とｓｉＲＮＡ導入株３２−０５−０９−Ｈ１２株が産生する抗体で抗原結合活性に違いは観察されなかったが、ＡＤＣＣ活性はｓｉＲＮＡ導入株３２−０５−０９−Ｈ１２株が産生する抗体の方が大幅に上昇していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２９３】
本発明によれば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または欠失した細胞、該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失するように、ゲノムが改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫、該動物あるいは植物から抗体組成物を製造する方法、および該抗体組成物を含有する医薬を提供することができる。
【０２９４】
配列表フリーテキスト
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
<120> Cells in which activity of the protein involved in transportation
of GDP-fucose is reduced or lost
<130> P044079
<150> JP 2002-106952
<151> 2002-04-09
<160> 35
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1245
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 1
gaacttcacc caagccatgt gacaattgaa ggctgtaccc ccagacccta acatcttgga 60
gccctgtaga ccagggagtg cttctggccg tggggtgacc tagctcttct accaccatga 120
acagggcccc tctgaagcgg tccaggatcc tgcgcatggc gctgactgga ggctccactg 180
cctctgagga ggcagatgaa gacagcagga acaagccgtt tctgctgcgg gcgctgcaga 240
tcgcgctggt cgtctctctc tactgggtca cctccatctc catggtattc ctcaacaagt 300
acctgctgga cagcccctcc ctgcagctgg atacccctat cttcgtcact ttctaccaat 360
gcctggtgac ctctctgctg tgcaagggcc tcagcactct ggccacctgc tgccctggca 420
ccgttgactt ccccaccctg aacctggacc ttaaggtggc ccgcagcgtg ctgccactgt 480
cggtagtctt cattggcatg ataagtttca ataacctctg cctcaagtac gtaggggtgg 540
ccttctacaa cgtggggcgc tcgctcacca ccgtgttcaa tgtgcttctg tcctacctgc 600
tgctcaaaca gaccacttcc ttctatgccc tgctcacatg tggcatcatc attggtggtt 660
tctggctggg tatagaccaa gagggagctg agggcaccct gtccctcata ggcaccatct 720
tcggggtgct ggccagcctc tgcgtctccc tcaatgccat ctataccaag aaggtgctcc 780
cagcagtgga caacagcatc tggcgcctaa ccttctataa caatgtcaat gcctgtgtgc 840
tcttcttgcc cctgatggtt ctgctgggtg agctccgtgc cctccttgac tttgctcatc 900
tgtacagtgc ccacttctgg ctcatgatga cgctgggtgg cctcttcggc tttgccattg 960
gctatgtgac aggactgcag atcaaattca ccagtcccct gacccacaat gtatcaggca 1020
cagccaaggc ctgtgcgcag acagtgctgg ccgtgctcta ctatgaagag actaagagct 1080
tcctgtggtg gacaagcaac ctgatggtgc tgggtggctc ctcagcctat acctgggtca 1140
ggggctggga gatgcagaag acccaagagg accccagctc caaagagggt gagaagagtg 1200
ctattggggt gtgagcttct tcagggacct gggactgaac ccaag 1245
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<400> 2
Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu Arg Met Ala Leu
1 5 10 15
Thr Gly Gly Ser Thr Ala Ser Glu Glu Ala Asp Glu Asp Ser Arg Asn
20 25 30
Lys Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser Leu
35 40 45
Tyr Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Leu
50 55 60
Asp Ser Pro Ser Leu Gln Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Gln Cys Leu Val Thr Ser Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Thr Leu Ala
85 90 95
Thr Cys Cys Pro Gly Thr Val Asp Phe Pro Thr Leu Asn Leu Asp Leu
100 105 110
Lys Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met
115 120 125
Ile Ser Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr
130 135 140
Asn Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr
145 150 155 160
Leu Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly
165 170 175
Ile Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ala Glu
180 185 190
Gly Thr Leu Ser Leu Ile Gly Thr Ile Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu
195 200 205
Cys Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Lys Lys Val Leu Pro Ala Val
210 215 220
Asp Asn Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys
225 230 235 240
Val Leu Phe Leu Pro Leu Met Val Leu Leu Gly Glu Leu Arg Ala Leu
245 250 255
Leu Asp Phe Ala His Leu Tyr Ser Ala His Phe Trp Leu Met Met Thr
260 265 270
Leu Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln
275 280 285
Ile Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys
290 295 300
Ala Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys
305 310 315 320
Ser Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Ser Ser
325 330 335
Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Gln Lys Thr Gln Glu Asp
340 345 350
Pro Ser Ser Lys Glu Gly Glu Lys Ser Ala Ile Gly Val
355 360 365
<210> 3
<211> 1095
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgaataggg cccctctgaa gcggtccagg atcctgcaca tggcgctgac cggggcctca 60
gacccctctg cagaggcaga ggccaacggg gagaagccct ttctgctgcg ggcattgcag 120
atcgcgctgg tggtctccct ctactgggtc acctccatct ccatggtgtt ccttaataag 180
tacctgctgg acagcccctc cctgcggctg gacaccccca tcttcgtcac cttctaccag 240
tgcctggtga ccacgctgct gtgcaaaggc ctcagcgctc tggccgcctg ctgccctggt 300
gccgtggact tccccagctt gcgcctggac ctcagggtgg cccgcagcgt cctgcccctg 360
tcggtggtct tcatcggcat gatcaccttc aataacctct gcctcaagta cgtcggtgtg 420
gccttctaca atgtgggccg ctcactcacc accgtcttca acgtgctgct ctcctacctg 480
ctgctcaagc agaccacctc cttctatgcc ctgctcacct gcggtatcat catcgggggc 540
ttctggcttg gtgtggacca ggagggggca gaaggcaccc tgtcgtggct gggcaccgtc 600
ttcggcgtgc tggctagcct ctgtgtctcg ctcaacgcca tctacaccac gaaggtgctc 660
ccggcggtgg acggcagcat ctggcgcctg actttctaca acaacgtcaa cgcctgcatc 720
ctcttcctgc ccctgctcct gctgctcggg gagcttcagg ccctgcgtga ctttgcccag 780
ctgggcagtg cccacttctg ggggatgatg acgctgggcg gcctgtttgg ctttgccatc 840
ggctacgtga caggactgca gatcaagttc accagtccgc tgacccacaa tgtgtcgggc 900
acggccaagg cctgtgccca gacagtgctg gccgtgctct actacgagga gaccaagagc 960
ttcctctggt ggacgagcaa catgatggtg ctgggcggct cctccgccta cacctgggtc 1020
aggggctggg agatgaagaa gactccggag gagcccagcc ccaaagacag cgagaagagc 1080
gccatggggg tgtga 1095
<210> 4
<211> 364
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu His Met Ala Leu
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ser Asp Pro Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asn Gly Glu Lys
20 25 30
Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Tyr
35 40 45
Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Leu Asp
50 55 60
Ser Pro Ser Leu Arg Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr Gln
65 70 75 80
Cys Leu Val Thr Thr Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Ala Leu Ala Ala
85 90 95
Cys Cys Pro Gly Ala Val Asp Phe Pro Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg
100 105 110
Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met Ile
115 120 125
Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr Asn
130 135 140
Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr Leu
145 150 155 160
Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Ile
165 170 175
Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Val Asp Gln Glu Gly Ala Glu Gly
180 185 190
Thr Leu Ser Trp Leu Gly Thr Val Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu Cys
195 200 205
Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Thr Lys Val Leu Pro Ala Val Asp
210 215 220
Gly Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys Ile
225 230 235 240
Leu Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg
245 250 255
Asp Phe Ala Gln Leu Gly Ser Ala His Phe Trp Gly Met Met Thr Leu
260 265 270
Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln Ile
275 280 285
Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys Ala
290 295 300
Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys Ser
305 310 315 320
Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Met Met Val Leu Gly Gly Ser Ser Ala
325 330 335
Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Lys Lys Thr Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Ser Ala Met Gly Val
355 360 364
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400>5
gcaagcttcc gccatgaata gggcccctct gaagcgg 37
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 6
gctctagatc acacccccat ggcgctcttc tcgc 34
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 7
gcaagcttcc gccatggaga agccctttct gctgcgggca ttgcagatcg cgc 53
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 8
gctctagatc acacccccat ggcgctcttc tcgc 34
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 9
gagatggagg tgacccagta gaga 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 10
gagagagacg accagcgcga tctg 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 11
gccattggct atgtgacagg actg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 12
gcagatcaaa ttcaccagt cccc 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 13
gaacttcacc caagccatgt gac 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 14
cttgggttca gtcccaggtc 20
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys
1 5 10 15
Pro Cys
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<220>
<400> 16
gcgcctaacc ttctataac 19
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 17
gctctagaga attcaaggtc gggcaggaag agggcctatt tc 42
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 18
cgggatcctt cacgtgtttc gtcctttcca caagatatat aaagcc 46
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 19
cagatctgcg gccgcgagct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 20
cgcggccgca gatctgagct 20
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 21
cgggatccaa ggtcgggcag gaagagggcc tatttcc 37
<210> 22
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 22
cggaattctt cacgtgtttc gtcctttcca caagatatat aaagcc 46
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 23
cgcgcctaac cttctataac tttttg 26
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 24
gatccaaaaa gttatagaag gttaggcgcg 30
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 25
cgttatagaa ggttaggcgc tttttt 26
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 26
aattaaaaaa gcgcctaacc ttctataacg 30
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 27
tctggcgcct gactttctac aacaa 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 28
accatcatgt tgctcgtcca ccaga 25
<210> 29
<211> 2609
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 29
gagccgaggg tggtgctgca ggtgcacccg agggcaccgc cgagggtgag caccaggtcc 60
ctgcatcagc caggacacca gagcccagtc gggtggacgg acgggcgcct ctgaagcggt 120
ccaggatcct gcgcatggcg ctgactggag tctctgctgt ctccgaggag tcagagagcg 180
ggaacaagcc atttctgctc cgggctctgc agatcgcgct ggtggtctct ctctactggg 240
tcacctccat ttccatggta ttcctcaaca agtacctgct ggacagcccc tccctgcagc 300
tggatacccc catttttgtc accttctacc aatgcctggt gacctcactg ctgtgcaagg 360
gcctcagcac tctggccacc tgctgccccg gcatggtaga cttccccacc ctaaacctgg 420
acctcaaggt ggcccgaagt gtgctgccgc tgtcagtggt ctttatcggc atgataacct 480
tcaataacct ctgcctcaag tacgtagggg tgcccttcta caacgtggga cgctcgctca 540
ccaccgtgtt caacgttctt ctctcctacc tgctgctcaa acagaccact tccttctatg 600
ccctgctcac ctgcggcgtc atcattggtg gtttctggct gggtatagac caagaaggag 660
ctgagggaac cttgtccctg acgggcacca tcttcggggt gctggccagc ctctgcgtct 720
ccctcaatgc catctatacc aagaaggtgc tccctgcagt agaccacagt atctggcgcc 780
taaccttcta taacaatgtc aatgcctgcg tgctcttctt gcccctgatg atagtgctgg 840
gcgagctccg tgccctcctg gccttcactc atctgagcag tgcccacttc tggctcatga 900
tgacgctggg tggcctgttt ggctttgcca tcggctatgt gacaggactg cagatcaaat 960
tcaccagtcc cctgacccat aacgtgtcag gcacggccaa ggcctgtgca cagacagtgc 1020
tggccgtgct ctactacgaa gagattaaga gcttcctgtg gtggacaagc aacctgatgg 1080
tgctgggtgg ctcctccgcc tacacctggg tcaggggctg ggagatgcag aagacccagg 1140
aggaccccag ctccaaagat ggtgagaaga gtgctatcag ggtgtgagct ccttcaggga 1200
gccagggctg agctcgggtg gggcctgccc agcacggaag gcttcccata gagcctactg 1260
ggtatggccc tgagcaataa tgtttacatc cttctcagaa gaccatctaa gaagagccag 1320
gttctttcct gataatgtca gaaagctgcc aaatctcctg cctgccccat cttctagtct 1380
tgggaaagcc ctaccaggag tggcaccctt cctgcctcct cctggggcct gtctacctcc 1440
atatggtctc tggggttggg gccagctgca ctctttgggc actggactga tgaagtgatg 1500
tcttactttc tacacaaggg agatgggttg tgaccctact atagctagtt gaagggagct 1560
gtgtaacccc acatctctgg ggccctgggc aggtagcata atagctaggt gctattaaca 1620
tcaataacac ttcagactac ctttggaggc agttgggagc tgagccgaga gagagagatg 1680
gccattctgc cctcttctgt gtggatgggt atgacagacc aactgtccat ggggtgactg 1740
acacctccac acttcatatt ttcaacttta gaaaaggggg agccacacgt tttacagatt 1800
aagtggagtg atgaatgcct ctacagcccc taaccccact ttccctgcct ggcttctctt 1860
ggcccagaag ggccaccatc ctgttctcca acacctgacc cagctatctg gctatactct 1920
ctttctgtac tcccttcccc ttcccccccc cattagcctc ctccccaaca cctccatctt 1980
caggcaggaa gtggggtcca ctcagcctct gttcccatct gcttggaccc ctgagcctct 2040
catgaaggta ggcttatgtt ctctgaggct ggggccggag gagcgcactg attctcggag 2100
ttatcccatc aggctcctgt cacaaaatag cctaggccgt gtgtctaaga acagtggagg 2160
ttggcttata actgttctgg gggcagcgaa gcccacatca aggtactcat agacccagta 2220
tttctgagga aacccctgtc cacatcctca cttggtaaag gcacagataa tctccctcag 2280
gcctcttgta taggagcact agccctggga gggctccgcc ccatgacctg atcaccccaa 2340
agccttcaac agaaggattc caacatgaat ttggggacag aagcactcag accacgatgc 2400
ccagcaccac accctcctat cctcagggta gctgtcactg tcctagtccc ttctgtttgg 2460
ccttttgtac cctcatttcc ttggcgtcat gtttgatgtc tttgtctctt tcgtgagaag 2520
atggggaaac catgtcagcc tctgcttccg acttcccatg ggttctaatg aagttggtgg 2580
ggcctgatgc cctgagttgt atgtgattt 2609
<210> 30
<211> 1053
<212> DNA
<213> Rattus norvegiucus
<400> 30
atggcgctga ctggagcctc tgctgtctct gaggaggcag acagcgagaa caagccattt 60
ctgctacggg ctctgcagat cgcgctggtg gtttctctct actgggtcac ctccatctcc 120
atggtattcc tcaacaagta cctgctggac agcccctccc tgcagctgga tacccccatc 180
ttcgtcacct tctaccaatg cctggtgacc tcactgctgt gcaagggcct cagcactctg 240
gccacctgct gccctggcat ggtagacttc cccaccctaa acctggacct caaggtggcc 300
cgaagtgtgc tgccgctgtc cgtggtcttt atcggcatga taaccttcaa taacctctgc 360
ctcaagtacg tgggggtggc cttctacaac gtgggacgct cgctcactac cgtgttcaat 420
gtgcttctct cctacctgct gcttaaacag accacttcct tttatgccct gctcacctgt 480
gccatcatca ttggtggttt ctggctggga atagatcaag agggagctga gggcaccctg 540
tccctgacgg gcaccatctt cggggtgctg gccagcctct gtgtctcact caatgccatc 600
tacaccaaga aggtgctccc tgccgtagac cacagtatct ggcgcctaac cttctataac 660
aacgtcaacg cctgtgtgct cttcttgccc ctgatggtag tgctgggcga gctccatgct 720
ctcctggcct tcgctcatct gaacagcgcc cacttctggg tcatgatgac gctgggtgga 780
ctcttcggct ttgccattgg ctatgtgaca ggactgcaga tcaaattcac cagtcccctg 840
acccataatg tgtcgggcac agccaaggcc tgtgcacaga cagtgctggc tgtgctctac 900
tatgaagaga ttaagagctt cctgtggtgg acaagcaact tgatggtgct gggtggctcc 960
tctgcctaca cctgggtcag gggctgggag atgcagaaga cccaggagga ccccagctcc 1020
aaagagggtg agaagagtgc tatcggggtg tga 1053
<210> 31
<211> 360
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 31
Met Ala Leu Thr Gly Val Ser Ala Val Ser Glu Glu Ser Glu Ser Gly
1 5 10 15
Asn Lys Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser
20 25 30
Leu Tyr Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Pro Ser Leu Gln Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe
50 55 60
Tyr Gln Cys Leu Val Thr Ser Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ala Thr Cys Cys Pro Gly Met Val Asp Phe Pro Thr Leu Asn Leu Asp
85 90 95
Leu Lys Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly
100 105 110
Met Ile Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Pro Phe
115 120 125
Tyr Asn Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser
130 135 140
Tyr Leu Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys
145 150 155 160
Gly Val Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ala
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Ser Leu Thr Gly Thr Ile Phe Gly Val Leu Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Lys Lys Val Leu Pro Ala
195 200 205
Val Asp His Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala
210 215 220
Cys Val Leu Phe Leu Pro Leu Met Ile Val Leu Gly Glu Leu Arg Ala
225 230 235 240
Leu Leu Ala Phe Thr His Leu Ser Ser Ala His Phe Trp Leu Met Met
245 250 255
Thr Leu Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu
260 265 270
Gln Ile Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala
275 280 285
Lys Ala Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Ile
290 295 300
Lys Ser Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Ser
305 310 315 320
Ser Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Gln Lys Thr Gln Glu
325 330 335
Asp Pro Ser Ser Lys Asp Gly Glu Lys Ser Ala Ile Arg Val
340 345 350
<210> 32
<211> 350
<212> PRT
<213> Rattus norvegiucus
<400> 32
Met Ala Leu Thr Gly Ala Ser Ala Val Ser Glu Glu Ala Asp Ser Glu
1 5 10 15
Asn Lys Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser
20 25 30
Leu Tyr Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Pro Ser Leu Gln Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe
50 55 60
Tyr Gln Cys Leu Val Thr Ser Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ala Thr Cys Cys Pro Gly Met Val Asp Phe Pro Thr Leu Asn Leu Asp
85 90 95
Leu Lys Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly
100 105 110
Met Ile Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe
115 120 125
Tyr Asn Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser
130 135 140
Tyr Leu Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys
145 150 155 160
Ala Ile Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ala
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Ser Leu Thr Gly Thr Ile Phe Gly Val Leu Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Lys Lys Val Leu Pro Ala
195 200 205
Val Asp His Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala
210 215 220
Cys Val Leu Phe Leu Pro Leu Met Val Val Leu Gly Glu Leu His Ala
225 230 235 240
Leu Leu Ala Phe Ala His Leu Asn Ser Ala His Phe Trp Val Met Met
245 250 255
Thr Leu Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu
260 265 270
Gln Ile Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala
275 280 285
Lys Ala Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Ile
290 295 300
Lys Ser Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Leu Met Val Leu Gly Gly Ser
305 310 315 320
Ser Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Gln Lys Thr Gln Glu
325 330 335
Asp Pro Ser Ser Lys Glu Gly Glu Lys Ser Ala Ile Gly Val
340 345 350
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 33
gcgccuaacc uucuauaac 19
<210> 34
<211> 7752
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 34
agcgttgcaa gttcagccga gggtggtgct gcaggtgcac ccgagggcac cgccgagggt 60
gagcaccagg tccctgcatc agccaggaca ccagagccca gtcgggtgga cggacggtac 120
gttctggaag ggaaagggcc ccgggaaggg gatacagcat tgagaagctc agaggctttg 180
gtctgggcat ccagaatgga ctttatctgg aggaggtgac atggcttctc gcctctggaa 240
gtgctgcttg gatctccggg acttcatgtc ctgactaggt ctggaagcgg tgaaaatagg 300
ggtaggaaaa aaggagagga ctgcaacaag gtcttcccga gtggcctgag ctcgagggac 360
gagggaggtg caacggtggg gagccgggcg caagggctgg gcggagggag ggggggggtc 420
tccctaagca gaaaggtggt attccatttt ctgggtagat ggtgaagatg cacctgaccg 480
agtctggtcg atctgaagat atcaggggaa aagatagtgc gggtggaggg gagaatgaca 540
gaaccttcca gaaaatggga gaggctatag cacttgcaaa cccttccctg atctccgggg 600
actcccggaa gaagagggca ggtctgtggg cataggtgca gacttgccgg ggagctcttg 660
acggccgcgg gaagtggcaa cggcctgcga gctggccctt taaggcggct cgtaggcgtg 720
tcaggaaatg cgcgcagggc ccgccctgct cggtaagtgg cccgggaccc gcgtcgctga 780
gccggaactt gaattcggct cgtggcaacc gcagggcctt gctccggtca ggcccctgtc 840
cgtgtccctc gagacgcctt cctgagcctc ggtgatctcc ctgcagcacg ccctcctttc 900
ggctctgcgg gtgcttccgg gggttcccgc agcccatgct tcccacgcgg tccgcgtcca 960
gttatttcct cctccgctcc gtccttcctt cgctctctcg cttcctttct ccctgcgact 1020
cacgtgtccc ctgtcctcaa actggccatg gctgtcaaag cccacatcct tagttaggcc 1080
ccttctccct tccctgggtc ttgtttcgtg acaccacctc cctcccccgc cccgggagcg 1140
agcaagatga ggagcggtgc acctcggcaa atccggaagc agaacttcat ccaagaagga 1200
ggggaccgat aggtcatccc atgtgacagt tgaaggctgc agccacagac cctagctgct 1260
tgaagccctg tagtccaggg actgcttctg gccgtaaggt gacccagctc ttctgccacc 1320
atgaacaggg cgcctctgaa gcggtccagg atcctgcgca tggcgctgac tggagtctct 1380
gctgtctccg aggagtcaga gagcgggaac aagccatttc tgctccgggc tctgcagatc 1440
gcgctggtgg tctctctcta ctgggtcacc tccatttcca tggtattcct caacaagtac 1500
ctgctggaca gcccctccct gcagctggat acccccattt ttgtcacctt ctaccaatgc 1560
ctggtgacct cactgctgtg caagggcctc agcactctgg ccacctgctg ccccggcatg 1620
gtagacttcc ccaccctaaa cctggacctc aaggtggccc gaagtgtgct gccgctgtca 1680
gtggtcttta tcggcatgat aaccttcaat aacctctgcc tcaagtacgt aggggtgccc 1740
ttctacaacg tgggacgctc gctcaccacc gtgttcaacg ttcttctctc ctacctgctg 1800
ctcaaacaga ccacttcctt ctatgccctg ctcacctgcg gcgtcatcat tggtgagtgg 1860
gactgggggc gtggggagca ggaatcgtaa agatcaatac cacattactc attatctgtc 1920
ccaggtcttt tgcaccacca gtcataggga gagacctgta gagaacaaat aacttcctta 1980
ctgtgactca gtaagttagg gatccagcca aggtgaacat aataatgtta ggcagacact 2040
acagcaaagc cagccagaca ctcagatcta gctaagcatt tgagccatgt taatgtaacg 2100
gatccccatt acaaggtata atatagctgc gttttatgga gagaaaccca aggcacagag 2160
aagctaagta gctgggatca cacaggtaat cactgacgta gcagaaattt gcacataagc 2220
agttacctcc ataggttaca ctcttgacca acacaccact gttctcaaga ggtcaagggt 2280
gaactcaggt catcacaatt ggcacaagta cctctaccca ctgagccatt tcagtggtcc 2340
agtcaatatg tgtgtgcttt aagaggcttt aactaccttc tcagatgtga ccataagtaa 2400
ttaattaccg ataggagcgt tgtgctgatc attacacttg tagcatcctc tttattgtac 2460
ccataagctc tctgagtggc ggcatctctg tgaaactgca gctcggagag gctgcgctcc 2520
ttgccacagc cccacaacta agaagcagat agtctgggac gcagtcccca gttggtcata 2580
ctccctggcc tgtgtttcaa gccagtctgc tttgctcctg acccttggga gttagcgcaa 2640
tgaaaaccaa cactatcact acagtctaaa tgtgctttta aatgaaagcc caggaacttt 2700
gaagcatccg gccccttaac ggcagccact atgtcctgat tccgccaaca tcttttcagt 2760
gcccggcagt cacatggagc aagggcctct tggcttggac agcatgtgtt agggaacatg 2820
tttgccactt tgaatgaatt tagtggctgc tgggttacag agaccagggc atctttcccc 2880
tcagagtcct gaatgaacga aaagcaacct tcatttgtac ctgctctgga ttttagttcg 2940
tcttgtttgg cctatttaga tgtccctggt gtctctgagg cccaggctgg gtgctctaga 3000
tgtagggacc aggccaacct gtactgtctt ccctagaaac attgccctgg ttgggcagct 3060
cctggatcca gggttaaggg gtctgggcgg agagaggtca gatagtggca ggatgcctcc 3120
cactgccccc acatacatac cctaagagat ctggtactcc tccttccagc ctacaagcta 3180
ccgtggggtc ccacttcagt ccaccagccc tgccaacgtt agaggggatg ggcctcctag 3240
taggagaact tacatgcagg aaggtacagt ctctggagaa cctgagcccg ggtccccaaa 3300
gggacaagta gctgatagtg aggcagctga gccccatggc ggcctgccca agtggcacgg 3360
gaaagtggag ctctctgctg cccccactac tggccccatc tcttggctct cccctccctt 3420
cctcctgtgg agaaggccca tctctggaaa ggcctcctag acatgcggca ctttgcaaag 3480
cctgtcgggc tcacagcccc tctagggtct aggaccttga gaatgaagaa tggagtcact 3540
tctagactct agtggtaacc accaggaggt acagggtgct ctgactgtgc agggaaaccc 3600
accgtgggct ctgctgagcc aagtgcctgt gaggctggag agtctggtgc ccttgttctg 3660
agatagcatc ttgctatgtt gccctcaagt cccaggcaac tggggctgca ggagcaccac 3720
cttgcctctc tccagcttct tgaagacttg tacctttctc ctagcagtct ctatctgctc 3780
tcactccatc cattgagcag ctattagctt gtggccaagt attttccagg ccctgtactg 3840
agttttaggg tacaagtttg agaaaggaag ggtggggtcc ttgctcctgg tccgtgaatg 3900
atgttgatgg cagaaacgat agttacacta gatgctaagg gctgtgggta tctagaggga 3960
gcagggagca tgtgggataa cctgagcagg cctagctgaa aagtcattgc tggcatgaga 4020
ctgctccagt agtacaggct gggaacacac atttgaatgt ttcctgaaga cagttgggag 4080
ccacaggaaa tatccactgt agaaagatta tttagttgta agacagagta gtagattggt 4140
taacatagta gcaaaaacgt ggccccagtt tttacagatg aagggaattg gaactcagag 4200
aggttaagta acttctccca agcagctcag ctacaaaaat cacagaacag gcaggggcct 4260
gatggctctg atgcctgtgc tggtcccact attccatgtt gctaattcct gcagcagcag 4320
taaacctctg ccttgtggaa atgaggagtc taaataaaga gaccatagca ttgccacaag 4380
caggtttcta ccaactgggg gtggcaagga atgctgtgtt agcagcagga agctgggaag 4440
aggctgagta ctggggggat gaggaaggga tccccaggag aggctgactt tggccttgaa 4500
gaatggtgga gtccctggaa agatgcagat acacagagct ctgtggatat acagagaagt 4560
ggggagctaa gtaggtggct tggggccatc atgtgacaga ggaagtcggg ctagatgcag 4620
gaagcccggt gctgtggcct agggagccat gtaggttctt tgagcagggg gcgggggggg 4680
gggggggtga cccaggagtg actgtaaaca acatcaggcc atgagcagct ctgacctaat 4740
gttctcacca agggagccag aaccaaggct tagagccctg tcccttttta gtgtccaagg 4800
tcactttact ggccctcttc ctttacagct gttggccccc acaggccatc aggcacctat 4860
gctattttat tttatagcct tcattacaat gactacaatt gtaattagag agttgacagg 4920
gtcacatctg tccttatata ttccccctct gctaagttct gcctgggaga atgtggaggg 4980
tattggtgaa atttggggaa gttataaccc ccccacccct gcccccaccc cctgctttgc 5040
tccctttatc tgcagggcat ttctgtgccc actttagccc atatagctcc caaataaatg 5100
acacagaaac ctggtatttt cattaacaaa ctgctggcac tctgctgggc aggttctgag 5160
ctgttctaac cctctaagct gctaatgccc agatagatgc cccaatgctt gccatccgag 5220
tctttctctg gcttgctctg ctccatgtgt gacctcatgg tgaatcctcc tgatttcccc 5280
acatggcctc tccacacttt tccttctccc ctctctctac cagggaccct ctcactggga 5340
cccgatgtcc catctgtact gtcctctccc acccagtcat aggctgattg agtctttatt 5400
aaccaatcag agatgatgga aaaacagttt ttacatagca ctgaggatgg agatgcttga 5460
cccttgagat gcttgcccgt aacctgtact gtatccagat gtctgggccc ccaaatcagc 5520
aggtgaatac acagtacaca ggactgaccc ccaacagagg gggaacacag gttctcactc 5580
tgggctccac gccctcggcc ctttcttagt gcaggggtta gactttgtat gtgttgatga 5640
tgaggtaagg gccatggaac agtcagaacg gtggtgtcag aatcctgtcc ctctccctcc 5700
tgtcctcatc cctccttacc gtgtcactct tctgtctgtt gcaggtggtt tctggctggg 5760
tatagaccaa gaaggagctg agggaacctt gtccctgacg ggcaccatct tcggggtgct 5820
ggccagcctc tgcgtctccc tcaatgccat ctataccaag aaggtgctcc ctgcagtaga 5880
ccacagtatc tggcgcctaa ccttctataa caatgtcaat gcctgcgtgc tcttcttgcc 5940
cctgatgata gtgctgggcg agctccgtgc cctcctggcc ttcactcatc tgagcagtgc 6000
ccacttctgg ctcatgatga cgctgggtgg cctgtttggc tttgccatcg gctatgtgac 6060
aggactgcag atcaaattca ccagtcccct gacccataac gtgtcaggca cggccaaggc 6120
ctgtgcacag acagtgctgg ccgtgctcta ctacgaagag attaagagct tcctgtggtg 6180
gacaagcaac ctgatggtgc tgggtggctc ctccgcctac acctgggtca ggggctggga 6240
gatgcagaag acccaggagg accccagctc caaagatggt gagaagagtg ctatcagggt 6300
gtgagctcct tcagggagcc agggctgagc tcgggtgggg cctgcccagc acggaaggct 6360
tcccatagag cctactgggt atggccctga gcaataatgt ttacatcctt ctcagaagac 6420
catctaagaa gagccaggtt ctttcctgat aatgtcagaa agctgccaaa tctcctgcct 6480
gccccatctt ctagtcttgg gaaagcccta ccaggagtgg cacccttcct gcctcctcct 6540
ggggcctgtc tacctccata tggtctctgg ggttggggcc agctgcactc tttgggcact 6600
ggactgatga agtgatgtct tactttctac acaagggaga tgggttgtga ccctactata 6660
gctagttgaa gggagctgtg taaccccaca tctctggggc cctgggcagg tagcataata 6720
gctaggtgct attaacatca ataacacttc agactacctt tggaggcagt tgggagctga 6780
gccgagagag agagatggcc attctgccct cttctgtgtg gatgggtatg acagaccaac 6840
tgtccatggg gtgactgaca cctccacact tcatattttc aactttagaa aagggggagc 6900
cacacgtttt acagattaag tggagtgatg aatgcctcta cagcccctaa ccccactttc 6960
cctgcctggc ttctcttggc ccagaagggc caccatcctg ttctccaaca cctgacccag 7020
ctatctggct atactctctt tctgtactcc cttccccttc ccccccccat tagcctcctc 7080
cccaacacct ccatcttcag gcaggaagtg gggtccactc agcctctgtt cccatctgct 7140
tggacccctg agcctctcat gaaggtaggc ttatgttctc tgaggctggg gccggaggag 7200
cgcactgatt ctcggagtta tcccatcagg ctcctgtcac aaaatagcct aggccgtgtg 7260
tctaagaaca gtggaggttg gcttataact gttctggggg cagcgaagcc cacatcaagg 7320
tactcataga cccagtattt ctgaggaaac ccctgtccac atcctcactt ggtaaaggca 7380
cagataatct ccctcaggcc tcttgtatag gagcactagc cctgggaggg ctccgcccca 7440
tgacctgatc accccaaagc cttcaacaga aggattccaa catgaatttg gggacagaag 7500
cactcagacc acgatgccca gcaccacacc ctcctatcct cagggtagct gtcactgtcc 7560
tagtcccttc tgtttggcct tttgtaccct catttccttg gcgtcatgtt tgatgtcttt 7620
gtctctttcg tgagaagatg gggaaaccat gtcagcctct gcttccgact tcccatgggt 7680
tctaatgaag ttggtggggc ctgatgccct gagttgtatg tgatttaata aaaaaaaaat 7740
ttttttaaaa ac 7752
<210> 35
<211> 4039
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 35
gaacttcacc caagccatgt gacaattgaa ggctgtaccc ccagacccta acatcttgga 60
gccctgtaga ccagggagtg cttctggccg tggggtgacc tagctcttct accaccatga 120
acagggcccc tctgaagcgg tccaggatcc tgcgcatggc gctgactgga ggctccactg 180
cctctgagga ggcagatgaa gacagcagga acaagccgtt tctgctgcgg gcgctgcaga 240
tcgcgctggt cgtctctctc tactgggtca cctccatctc catggtattc ctcaacaagt 300
acctgctgga cagcccctcc ctgcagctgg atacccctat cttcgtcact ttctaccaat 360
gcctggtgac ctctctgctg tgcaagggcc tcagcactct ggccacctgc tgccctggca 420
ccgttgactt ccccaccctg aacctggacc ttaaggtggc ccgcagcgtg ctgccactgt 480
cggtagtctt cattggcatg ataagtttca ataacctctg cctcaagtac gtaggggtgg 540
ccttctacaa cgtggggcgc tcgctcacca ccgtgttcaa tgtgcttctg tcctacctgc 600
tgctcaaaca gaccacttcc ttctatgccc tgctcacatg tggcatcatc attggtgagt 660
ggggcccggg ggctgtggga gcaggatggg catcgaactg aagccctaaa ggtcaacact 720
gtaggtacct ttacttactg tcccaggtcc cttgcatcag cagttacagg aagagccctg 780
tagaaaacaa ataacttcct tatggtcatt caacaagtta gggacccagc cagggtgaaa 840
ataatgttag cagcaactac agcaaagatg gctctcgcca cttgcatgat taaaatgtgc 900
caggtactca gatcyaagca ttggatccac attaactcaa ctaatcccta ttacaaggta 960
aaatatatcc gaattttaca gagggaaaac caaggcacag agaggctaag tagcttgacc 1020
aggatcacac agctaataat cactgacata gctgggattt aaacataagc agttacctcc 1080
atagatcaca ctatgaccac catgccactg ttccttctca agagttccag gatcctgtct 1140
gtccagttct ctttaaagag gacaacacat ctgacattgc taccttgagg taacatttga 1200
aatagtgggt agacatatgt tttaagtttt attcttrctt tttatgygtg tgtgtttggg 1260
gggccaccac agtgtatggg tggagataag gggacaactt aagaattggt cctttctccc 1320
accacatggg tgctgaggtc tgaactcagg tcatcaggat tggcacaaat ccctttaccc 1380
actgagccat ttcactggtc caatatatgt gtgcttttaa gaggctttaa ctattttccc 1440
agatgtgaat gtcctgctga tcattatccc cttttacccg gaagccctct gggaggtgcc 1500
atccctgtgg tcgtctgcat acaaatgggg aaactgcaac tcagagaaac aaggctactt 1560
gccagggccc cacaagtaag ataggctggg atgccatccc agactggcca cactccctgg 1620
cctgtgcttc aagccagttt actttgttcc tgcccattgg aagttagcat gttgcagtca 1680
aacacaataa ctacaggcca aaagtgcttt taaattaaag tcagatgaac ttttaaacat 1740
ccagagctcc tcaactgcag gagttacaac ctgattctgc aaccatcttt gcagtgcccg 1800
gtagtcatat gtagctagag gctcttggct aggacagcat gtgttaggaa acatctggcc 1860
ctgagatcat tgaattgagt gactgctggg tgacaaagac caaggcatcc gttccctgag 1920
agtcctgggc aagcagcaat gtgaccttca tttgtaccta ctcaggttct ttatctgtcc 1980
tgtttgacct acttagtctc ctctggtgtc tcagaggccc aggctgggta ctctggatgt 2040
caggatcagg ccaatgcgca catctgccct agaaatgtcc ccctggttga gcagctcctg 2100
aatccatcgg taaagggtct ggaccaggga ggagtcagat aaaaagctga cagcactggg 2160
ggactccatg gggaactccc acctgccccc acacatccat cctaagagaa ctggtattcc 2220
ttgtttcctc tttgtcctac aaggcaccct gggatcccac ttcagtctcc cagccttgcc 2280
agggttagag ggcatgagcc tccttgtggg gaatttagat gcaagaaggt acagtcacta 2340
gagaacctga gctcagatcc ccaaagtaac cagtacctga tagtgaggca gctgagaacc 2400
gcagcagcct gcctgagtgg ctgaactctg cggcctccgg aactggcccc aactgttggg 2460
tctcctcttc cttcctcctg tgagggaggg cccatctctg ataagtgctg tggggactct 2520
agagtaggga ggaggaggag caatctaagc aggccttact gagaagtcct tgctggcatg 2580
tggctgcctg aggagtacag actgggaaca cccatttgaa tgagtaaggt ttttcctgaa 2640
ggccatgggg agccacggag gaaaatcatt ttagttacaa gacaaagagt agattggtta 2700
acatgggagc arggacatgg ccccaatttt cattgatgaa ggaaattgga actcrgagag 2760
gttaagtaac ttctcccaaa tagctcagct tcataatcac agaacagtca gagtctagat 2820
ctctctgatg cctgtgatgg tcctgccatt ccatgttgct gatccctgtg gcatcagtaa 2880
gcctctacct tgtgggaatg caggatctaa atgaagagag raagtgctgg ccccatgctg 2940
tggtctggaa agctatgcag gctctttgag cagagagtga cccacaagtg aatagagtcc 3000
tatgagactc aaagcaacat ccacccttaa gcagctctaa ccaaatgctc acactgaggg 3060
agccaaagcc aagttagagt cctgtgcttg cccaaggtca ctttgcctgg ccctcctcct 3120
atagcacccg tgttatctta tagccctcat tacagtgatt acaattataa ttagagaggt 3180
aacagggcca cactgtcctt acacattccc ctgctagatt gtagctggga gagggggaga 3240
tgtaggtggc tgggggagtg ggagggaaga tgcagatttt cattctgggc tctactccct 3300
cagccatttt ttggtgtggg agttagactt tggatatgtt gatgatgagg taagggccac 3360
agaacagtct gaactgtggt atcagaatcc tgtccctctc cctctctcct catccctctt 3420
caccttgtca ctcctctgtc tgctacaggt ggtttctggc tgggtataga ccaagaggga 3480
gctgagggca ccctgtccct cataggcacc atcttcgggg tgctggccag cctctgcgtc 3540
tccctcaatg ccatctatac caagaaggtg ctcccagcag tggacaacag catctggcgc 3600
ctaaccttct ataacaatgt caatgcctgt gtgctcttct tgcccctgat ggttctgctg 3660
ggtgagctcc gtgccctcct tgactttgct catctgtaca gtgcccactt ctggctcatg 3720
atgacgctgg gtggcctctt cggctttgcc attggctatg tgacaggact gcagatcaaa 3780
ttcaccagtc ccctgaccca caatgtatca ggcacagcca aggcctgtgc gcagacagtg 3840
ctggccgtgc tctactatga agagactaag agcttcctgt ggtggacaag caacctgatg 3900
gtgctgggtg gctcctcagc ctatacctgg gtcaggggct gggagatgca gaagacccaa 3960
gaggacccca gctccaaaga gggtgagaag agtgctattg gggtgtgagc ttcttcaggg 4020
acctgggact gaacccaag 4039
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体とＣＣＲ４部分ペプチドとの結合活性を抗体濃度を変化させて測定した結果を示したものである。グラフの縦軸は、ＣＣＲ４部分ペプチドとの結合活性を波長４９０ｎｍにおける吸光度で示している。横軸は抗ＣＣＲ４キメラ抗体の反応液中の濃度を示している。▲はＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体、■はＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体の抗原結合活性を示す。
第２図は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を抗体濃度を変化させて測定した結果を示したものである。グラフの縦軸に細胞障害活性、横軸に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の反応液中の濃度をそれぞれ示す。▲はＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４抗体、■はＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４抗体の活性をそれぞれ示す。
第３図は、ＣＨＯ／ＧＤＰｆｔΔ３０−ＣＣＲ４株、およびＣＨＯ／ｐｃＤＮＡ−ＣＣＲ４株が生産した抗ＣＣＲ４キメラ抗体から調製したＰＡ化糖鎖を、それぞれ逆相ＨＰＬＣで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第４図は、チャイニーズハムスターＧＤＰ−フコーストランスポーターの非翻訳部分および隣接する翻訳領域の塩基配列を示した図である。全長ｃＤＮＡ取得のために設計したプライマー部分を下線で示す。翻訳領域の塩基配列下部に塩基配列より推定されるアミノ酸配列を示す。
第５図は、プラスミドＵ６＿ｐｒｅ＿ｓｅｎｓｅの構築工程を示す図である。
第６図は、プラスミドｐＢＳ＿ＢｇｌＩＩの構築工程を示す図である。
第７図は、プラスミドＵ６＿＿ｐｒｅ＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅの構築工程を示す図である。
第８図は、プラスミドＵ６＿ｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築工程を示す図である。
第９図は、プラスミドＵ６＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＿Ｈの構築工程を示す図である。
第１０図は、プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈの構築工程を示す図である。
第１１図は、プラスミドＵ６＿ＧＦＴ＿Ｈ＿ｐｕｒｏの構築工程を示す図である。
第１２図は、ｓｉＲＮＡ発現によるβ−アクチンとＧＤＰ−フコーストランスポーターの発現量の変化を示す写真である。

Claims (14)

  1. 以下の（１）〜（３）から選ばれる遺伝子工学的な手法により、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの活性が、該遺伝子工学的な手法を施す前の細胞よりも低下または欠失した、抗体分子をコードする遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞。
    （１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＧＤＰ−フコーストランスポーターのＮ末端３０アミノ酸が欠失したＮ末端欠失体を導入する手法；
    （２）配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させて、ＧＤＰ−フコーストランスポーターの転写または翻訳を抑制する手法；
    （３）ＧＤＰ−フコーストランスポーターの遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法。
  2. 前記遺伝子工学的な手法が前記（３）の遺伝子破壊の手法であり、前記ＧＤＰ−フコーストランスポーターが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である請求項１に記載の細胞。
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｄ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｆ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｇ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
    （ｈ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
  3. 抗体分子が、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求項１または２に記載の細胞。
    （ａ）ヒト抗体；
    （ｂ）ヒト化抗体；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
    （ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
  4. 抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
  5. 抗体分子が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
  6. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体分子が、該抗体分子中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体分子よりも高いことを特徴とする、請求項５に記載の細胞。
  7. 糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求項６に記載の細胞。
  8. フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項６または７に記載の細胞。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を用いること特徴とする、抗体組成物を製造する方法。
  10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、抗体組成物を製造する方法。
  11. 抗体組成物が遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、遺伝子工学的な手法を施す前の細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の２０％以上である請求項１２に記載の方法。
  14. フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖である、請求項１２または１３に記載の方法。
JP2003582281A 2002-04-09 2003-04-09 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞 Expired - Lifetime JP4628679B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002106952 2002-04-09
JP2002106952 2002-04-09
PCT/JP2003/004506 WO2003085102A1 (fr) 2002-04-09 2003-04-09 Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2003085102A1 JPWO2003085102A1 (ja) 2005-08-11
JP4628679B2 true JP4628679B2 (ja) 2011-02-09

Family

ID=28786450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003582281A Expired - Lifetime JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2003-04-09 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7749753B2 (ja)
EP (1) EP1500698B1 (ja)
JP (1) JP4628679B2 (ja)
AT (1) ATE503829T1 (ja)
AU (1) AU2003236020B2 (ja)
CA (1) CA2481656A1 (ja)
DE (1) DE60336548D1 (ja)
ES (1) ES2362419T3 (ja)
WO (1) WO2003085102A1 (ja)

Families Citing this family (644)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ATE503829T1 (de) * 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
JPWO2005017155A1 (ja) * 2003-06-18 2006-10-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーター
WO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP3130349A1 (en) 2004-06-04 2017-02-15 Genentech, Inc. Method for treating multiple sclerosis
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
US20090061485A1 (en) * 2004-12-22 2009-03-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of Producing an Antibody Using a Cell in Which the Function of Fucose Transporter Is Inhibited
PL1871805T3 (pl) 2005-02-07 2020-03-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen, które wiążą egfr, wektory kodujące te cząsteczki oraz ich zastosowania
RU2007139283A (ru) * 2005-03-25 2009-04-27 Гликарт Биотехнологи Аг (Ch) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ К MCSP И ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
CA2605781A1 (en) * 2005-05-09 2007-04-12 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
KR20080032065A (ko) * 2005-06-03 2008-04-14 제넨테크, 인크. 푸코실화 수준이 조절된 항체의 생성 방법
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
CA2631961A1 (en) 2005-12-02 2007-11-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling relating to antibodies that bind to il-22
ES2526204T3 (es) 2006-01-05 2015-01-08 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-EphB4 y métodos para usar los mismos
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
TWI523864B (zh) 2006-05-30 2016-03-01 建南德克公司 抗體及免疫接合物及其用途
JP2009539384A (ja) * 2006-06-06 2009-11-19 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ｄｌｌ４抗体および抗ｄｌｌ４抗体使用の方法
EP2029159A2 (en) * 2006-06-06 2009-03-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
CA2657934C (en) 2006-07-19 2017-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Wsx-1/p28 as a target for anti-inflammatory responses
AR062223A1 (es) * 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
KR20090078349A (ko) * 2006-10-12 2009-07-17 제넨테크, 인크. 림포톡신-알파에 대한 항체
PT2061814E (pt) 2006-10-27 2012-09-10 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados e suas utilizações
WO2008091222A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Bioinvent International Ab Dll4 signaling inhibitors and uses thereof
RU2009133784A (ru) 2007-02-09 2011-03-20 Дженентек, Инк. (Us) АНТИ-Robo4-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US20080279851A1 (en) 2007-05-07 2008-11-13 Medlmmune, Llc Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
ES2558689T3 (es) 2007-05-14 2016-02-08 Medimmune, Llc Métodos para reducir los niveles de eosinófilos
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
KR20160129099A (ko) 2007-11-07 2016-11-08 제넨테크, 인크. 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
TWI580694B (zh) 2007-11-30 2017-05-01 建南德克公司 抗-ｖｅｇｆ抗體
KR20100131003A (ko) * 2008-03-31 2010-12-14 제넨테크, 인크. 천식을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 방법
PL2282773T3 (pl) 2008-05-02 2014-08-29 Seattle Genetics Inc Sposoby i kompozycje do wytwarzania przeciwciał i pochodnych przeciwciał o obniżonej fukozylacji rdzeniowej
KR101054362B1 (ko) * 2008-07-03 2011-08-05 재단법인 목암생명공학연구소 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법
WO2010018847A1 (ja) 2008-08-13 2010-02-18 協和発酵キリン株式会社 遺伝子組換えプロテインs組成物
TW201014605A (en) 2008-09-16 2010-04-16 Genentech Inc Methods for treating progressive multiple sclerosis
SG195558A1 (en) 2008-10-14 2013-12-30 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
CN102264759B (zh) 2008-12-23 2016-05-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 与蛋白a的结合改变的免疫球蛋白变体
MY152068A (en) 2009-03-20 2014-08-15 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
PE20120770A1 (es) 2009-03-25 2012-07-10 Genentech Inc ANTICUERPOS ANTI alfa5ß1 CON ACTIVIDAD SOBRE GLIOBLASTOMAS
BRPI1006448B1 (pt) 2009-03-25 2021-08-17 Genentech, Inc Anticorpo antagonista anti-fgfr3, anticorpo monoclonal, polinucleotídeo, vetor, micro­organismo transgênico, método para produção de um anticorpo anti-fgfr3, formulação farmacêutica e usos do anticorpo antagonista anti-fgfr3
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
WO2010138184A2 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
AR077595A1 (es) 2009-07-27 2011-09-07 Genentech Inc Tratamientos de combinacion
ES2513292T3 (es) 2009-07-31 2014-10-24 Genentech, Inc. Inhibición de metástasis tumoral usando anticuerpos anti-G-CSF
PE20121552A1 (es) 2009-08-31 2012-11-26 Roche Glycart Ag Anticuerpos monoclonales anti cea humanizados de afinidad madura
DK2473522T3 (en) 2009-09-02 2016-11-28 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
EP2491059B1 (en) 2009-10-22 2015-02-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods using same
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056494A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
WO2011056997A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
US8361744B2 (en) 2009-11-05 2013-01-29 Genentech, Inc. Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
TWI505836B (zh) 2009-12-11 2015-11-01 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ－ｃ抗體及其使用方法
AR079704A1 (es) 2009-12-23 2012-02-15 Genentech Inc Anticuerpos anti-bv8 y sus usos
CN102933231B (zh) 2010-02-10 2015-07-29 伊缪诺金公司 Cd20抗体及其用途
CN102892779B (zh) 2010-02-18 2016-12-21 基因泰克公司 神经调节蛋白拮抗剂及其在治疗癌症中的用途
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
JP5820800B2 (ja) 2010-03-02 2015-11-24 協和発酵キリン株式会社 改変抗体組成物
KR101899835B1 (ko) 2010-03-24 2018-09-19 제넨테크, 인크. 항-ｌｒｐ６ 항체
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
NZ602840A (en) 2010-06-03 2014-11-28 Genentech Inc Immuno-pet imaging of antibodies and immunoconjugates and uses therefor
CA2794731C (en) 2010-06-18 2019-03-19 Genentech, Inc. Anti-axl antibodies and methods of use
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
WO2012006503A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Genentech, Inc. Anti-neuropilin antibodies and methods of use
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
RU2013106216A (ru) 2010-08-03 2014-09-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биомаркеры хронической лимфоцитарной лейкемии
JP2013541937A (ja) 2010-08-05 2013-11-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｍｈｃ抗体−抗ウイルス性サイトカイン融合タンパク質
RU2584597C2 (ru) 2010-08-13 2016-05-20 Рош Гликарт Аг Антитела против а2 тенасцина с и способы их применения
LT2603530T (lt) 2010-08-13 2018-01-25 Roche Glycart Ag Anti-fap antikūnai ir jų naudojimo metodai
AR082518A1 (es) 2010-08-25 2012-12-12 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra il-18r1 y usos de los mismos
DK2612151T3 (en) 2010-08-31 2017-10-02 Genentech Inc BIOMARKETS AND METHODS OF TREATMENT
US8481680B2 (en) 2010-10-05 2013-07-09 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
ES2607086T3 (es) 2010-11-10 2017-03-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Métodos y composiciones para la inmunoterapia de enfermedades neuronales
CN112168962A (zh) 2010-12-16 2021-01-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 与th2抑制相关的诊断和治疗
KR20140014116A (ko) 2010-12-20 2014-02-05 제넨테크, 인크. 항-메소텔린 항체 및 면역접합체
AU2011348232A1 (en) 2010-12-22 2013-07-18 Genentech, Inc. Anti-PCSK9 antibodies and methods of use
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
US20120258073A1 (en) 2011-02-10 2012-10-11 Christian Gerdes Immunotherapy
MX342034B (es) 2011-02-28 2016-09-12 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
EP2681239B8 (en) 2011-02-28 2015-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding proteins
CA2827722C (en) 2011-03-02 2020-05-12 Roche Glycart Ag Anti-cea antibodies
KR20140021589A (ko) 2011-04-07 2014-02-20 제넨테크, 인크. 항-fgfr4 항체 및 사용 방법
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2012155019A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides
EA030462B1 (ru) 2011-05-16 2018-08-31 Дженентек, Инк. Агонисты fgfr1 и способы их применения
CA2837914A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-human epo receptor antibodies and methods of use
EP2722343A4 (en) 2011-06-20 2014-12-17 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ANTI-ERBB3 ANTIBODIES
FR2976811A1 (fr) 2011-06-22 2012-12-28 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom
ES2667864T3 (es) 2011-06-22 2018-05-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Eliminación de células diana mediante linfocitos T citotóxicos específicos de virus en circulación usando complejos que comprenden MHC de clase I
TW201306866A (zh) 2011-06-30 2013-02-16 Genentech Inc 抗－ｃ－ｍｅｔ抗體調配物
MX2014001736A (es) 2011-08-17 2014-03-31 Genentech Inc Inhibicion de angiogenesis en tumores refractarios.
CN103890007A (zh) 2011-08-17 2014-06-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 神经调节蛋白抗体及其用途
BR112014003598B1 (pt) 2011-08-23 2022-05-31 Roche Glycart Ag Molécula de ligação de antígeno biespecífica, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação de antígeno biespecífica
RU2014109038A (ru) 2011-08-23 2015-09-27 Рош Гликарт Аг Антитела к хондроитинсульфат протеогликану меланомы
CN103930781A (zh) 2011-09-15 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 促进分化的方法
US20130078252A1 (en) 2011-09-19 2013-03-28 Genentech, Inc. Combination treatments comprising c-met antagonists and b-raf antagonists
US9663573B2 (en) 2011-10-05 2017-05-30 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using Notch2 antagonists
CN108373506A (zh) 2011-10-14 2018-08-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗HtrA1抗体及使用方法
EP2766000A2 (en) 2011-10-15 2014-08-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Scd1 antagonists for treating cancer
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
AU2012328980A1 (en) 2011-10-28 2014-04-24 Genentech, Inc. Therapeutic combinations and methods of treating melanoma
BR112014012005A2 (pt) 2011-11-21 2017-12-19 Genentech Inc composições, métodos, formulação farmacêutica e artigo
WO2013083497A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
SG10201805622QA (en) 2011-12-22 2018-08-30 Hoffmann La Roche Expression Vector Organization, Novel Production Cell Generation Methods And Their Use For The Recombinant Production Of Polypeptides
MX355624B (es) 2011-12-22 2018-04-25 Hoffmann La Roche Combinaciones de elementos de vector de expresion, metodos novedosos de generacion de celulas de produccion y su uso para la produccion recombinante de polipeptidos.
MX2014007262A (es) 2011-12-22 2014-08-01 Hoffmann La Roche Sistema de exhibicion de anticuerpos de longitud completa para celulas eucarioticas y su uso.
AR089434A1 (es) 2011-12-23 2014-08-20 Genentech Inc Procedimiento para preparar formulaciones con alta concentracion de proteinas
WO2013101771A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Genentech, Inc. Compositions and method for treating autoimmune diseases
CN104520321A (zh) 2012-01-09 2015-04-15 斯克利普斯研究所 超长互补决定区及其用途
EP2802601B1 (en) 2012-01-09 2019-11-13 The Scripps Research Institute Humanized antibodies with ultralong cdr3s
KR20140119114A (ko) 2012-01-18 2014-10-08 제넨테크, 인크. Fgf19 조절제의 사용 방법
SG11201404198TA (en) 2012-01-18 2014-08-28 Genentech Inc Anti-lrp5 antibodies and methods of use
SG11201404486QA (en) 2012-01-31 2014-11-27 Genentech Inc Anti-ig-e m1' antibodies and methods using same
US20130209473A1 (en) 2012-02-11 2013-08-15 Genentech, Inc. R-spondin translocations and methods using the same
CA2860600C (en) 2012-02-15 2022-07-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
JP2015514710A (ja) 2012-03-27 2015-05-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｈｅｒ３阻害剤に関する診断及び治療
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
EP2844300B1 (en) 2012-05-01 2018-10-17 Genentech, Inc. Anti-pmel17 antibodies and immunoconjugates
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
RU2625771C2 (ru) 2012-05-23 2017-07-18 Дженентек, Инк. Способ отбора терапевтических средств
US9266961B2 (en) 2012-06-15 2016-02-23 Genentech, Inc. Anti-PCSK9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
SI2869848T1 (sl) 2012-07-04 2017-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Kovalentno vezani konjugati antigen-protitelo
BR112014030843A2 (pt) 2012-07-04 2019-10-15 Hoffmann La Roche anticorpo anti-teofilina, formulação farmacêutica e uso do anticorpo
EP2870180B1 (en) 2012-07-04 2024-08-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
CN110042114B (zh) 2012-07-05 2024-09-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达和分泌系统
TW201406785A (zh) 2012-07-09 2014-02-16 Genentech Inc 抗ｃｄ２２抗體及免疫結合物
BR112015000437A2 (pt) 2012-07-09 2017-06-27 Genentech Inc imunoconjugados, formulação farmacêutica, métodos de tratamento e de inbir a proliferação de uma célula
WO2014011520A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
TR201802376T4 (tr) 2012-07-09 2018-03-21 Genentech Inc Anti-CD79b antikorları içeren immünokonjugatlar.
ES2848732T3 (es) 2012-08-07 2021-08-11 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
EP2905290B1 (en) 2012-10-05 2019-12-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Heterodimeric protein composition
WO2014071358A2 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
EP2917243B1 (en) 2012-11-08 2018-03-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
SG11201503734UA (en) 2012-11-13 2015-06-29 Genentech Inc Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use
CA2894225A1 (fr) 2012-12-17 2014-06-26 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
MX361076B (es) 2012-12-21 2018-11-27 Hoffmann La Roche Proteínas multifunción que comprenden complejo mayor de histocompatibilidad (cmh) de clase i multivalente unido mediante disulfuro.
EP3939614A1 (en) 2013-01-18 2022-01-19 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
KR20150118159A (ko) 2013-02-22 2015-10-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법
JP2016512489A (ja) 2013-02-26 2016-04-28 ロシュ グリクアート アーゲー 抗ｍｃｓｐ抗体
KR20150123250A (ko) 2013-03-06 2015-11-03 제넨테크, 인크. 암 약물 내성의 치료 및 예방 방법
BR112015022019A2 (pt) 2013-03-14 2017-08-29 Genentech Inc Anticorpos isolados, ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de anticorpos, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos de tratamento de indivíduos, de inibição da proliferação de células, de detecção de b7-h4 humano e de detecção de câncer
WO2014153030A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
US20140271634A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 The Regents Of The University Of California Combinations of a mek inhibitor compound with an her3/egfr inhibitor compound and methods of use
CA2902910A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
SG10201701380TA (en) 2013-03-15 2017-04-27 Genentech Inc Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
BR112015021521A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Genentech Inc anticorpos anti-crth2 e métodos para seu uso
ES2676023T3 (es) 2013-03-15 2018-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Polipéptidos de IL-22 y proteínas de fusión de IL-22 Fc y métodos de uso
CN105339001A (zh) 2013-03-15 2016-02-17 基因泰克公司 治疗癌症和预防癌症耐药性的方法
SG11201507427QA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Genentech Inc Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP2992010B1 (en) 2013-04-29 2021-03-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
EP2992011B1 (en) 2013-04-29 2017-12-13 F. Hoffmann-La Roche AG Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
PL3594240T3 (pl) 2013-05-20 2024-04-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała przeciwko receptorowi transferyny i sposoby ich zastosowania
DK3004162T3 (da) 2013-05-31 2020-05-18 Genentech Inc Anti-væg-teichoin-antistoffer og konjugater
CN105358574B (zh) 2013-05-31 2020-10-16 基因泰克公司 抗壁磷壁酸抗体和缀合物
EP3022224A2 (en) 2013-07-18 2016-05-25 Fabrus, Inc. Antibodies with ultralong complementarity determining regions
AU2014290361B2 (en) 2013-07-18 2019-04-18 Taurus Biosciences, Llc Humanized antibodies with ultralong complementarity determining regions
DK3708583T3 (da) 2013-08-01 2022-05-16 Five Prime Therapeutics Inc Ikke-fucosylerede anti-fgfr2iiib-antistoffer
MX2016001854A (es) 2013-08-12 2016-09-06 Genentech Inc Composiciones y metodo para tratar condiciones asociadas con el complemento.
AR097685A1 (es) 2013-09-17 2016-04-06 Genentech Inc Métodos de uso de anticuerpos anti-lgr5
EP3620470B1 (en) 2013-10-11 2023-07-26 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Tem8 antibodies and their use
EP3055329B1 (en) 2013-10-11 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
CA2926084A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Genentech, Inc. Nsp4 inhibitors and methods of use
CN105744954B (zh) 2013-10-18 2021-03-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途
KR20160068802A (ko) 2013-10-23 2016-06-15 제넨테크, 인크. 호산구성 장애를 진단 및 치료하는 방법
LT3071597T (lt) 2013-11-21 2020-10-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Antikūnai prieš alfa-sunukleiną ir jų naudojimo būdai
NZ720769A (en) 2013-12-09 2022-10-28 Allakos Inc Anti-siglec-8 antibodies and methods of use thereof
CN110590950A (zh) 2013-12-13 2019-12-20 基因泰克公司 抗cd33抗体和免疫缀合物
RU2016128726A (ru) 2013-12-17 2018-01-23 Дженентек, Инк. Способы лечения злокачественных опухолей с использованием антагонистов связывания по оси pd-1 и антитела против cd20
WO2015095392A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
EP3083687A2 (en) 2013-12-17 2016-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
EP3083686B2 (en) 2013-12-17 2023-03-22 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
RU2682754C2 (ru) 2014-01-03 2019-03-21 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты полипептидного токсина и антитела, соединенных ковалентной связью
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
CN105873615B (zh) 2014-01-03 2020-12-25 豪夫迈·罗氏有限公司 共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途
PL3089996T3 (pl) 2014-01-03 2021-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste przeciwciała przeciw haptenowi/przeciw receptorowi występującemu w barierze krew-mózg, ich kompleksy i ich zastosowanie jako przenośniki wahadłowe występujące w barierze krew-mózg
PL3092251T3 (pl) 2014-01-06 2021-08-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Jednowartościowe moduły transportera wahadłowego przez barierę krew-mózg
WO2015107026A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
FR3016633B1 (fr) 2014-01-17 2018-04-13 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Immunoglobuline anti-toxine du charbon
JP2017505305A (ja) 2014-01-24 2017-02-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｓｔｅａｐ１抗体及びイムノコンジュゲートを使用する方法
ES2694857T3 (es) 2014-02-04 2018-12-27 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de uso de la misma
AU2015214058B2 (en) 2014-02-08 2020-07-09 Genentech, Inc. Methods of treating Alzheimer's Disease
CA2938731A1 (en) 2014-02-08 2015-08-13 Genentech, Inc. Methods of treating alzheimer's disease
MX2016010433A (es) 2014-02-12 2016-09-22 Genentech Inc Anticuerpos anti-jagged1 y metodos de uso.
UA117608C2 (uk) 2014-02-21 2018-08-27 Дженентек, Інк. Спосіб лікування еозинофільного захворювання у пацієнта шляхом застосування біспецифічного анти-il-13/il-17 антитіла
AU2015222757B2 (en) 2014-02-28 2020-10-08 Allakos Inc. Methods and compositions for treating Siglec-8 associated diseases
EP3116999B1 (en) 2014-03-14 2021-09-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US20170107294A1 (en) 2014-03-21 2017-04-20 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
WO2015148531A1 (en) 2014-03-24 2015-10-01 Genentech, Inc. Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
AU2015241038A1 (en) 2014-03-31 2016-10-13 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and OX40 binding agonists
PL3126394T3 (pl) 2014-03-31 2020-05-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała anty-OX40 i sposoby stosowania
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
JP2017522861A (ja) 2014-05-22 2017-08-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｇｐｃ３抗体及びイムノコンジュゲート
WO2015179835A2 (en) 2014-05-23 2015-11-26 Genentech, Inc. Mit biomarkers and methods using the same
WO2015191715A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Genentech, Inc. Anti-lgr5 antibodies and uses thereof
WO2015191986A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
JP6654581B2 (ja) 2014-06-26 2020-02-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 抗ｂｒｄｕ抗体および使用方法
SG11201700207WA (en) 2014-07-11 2017-02-27 Genentech Inc Anti-pd-l1 antibodies and diagnostic uses thereof
KR20170029490A (ko) 2014-07-11 2017-03-15 제넨테크, 인크. 노치 경로 억제
ES2913865T3 (es) 2014-08-28 2022-06-06 Bioatla Inc Receptores de antígeno quimérico condicionalmente activos para células T modificadas
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
MX2017003022A (es) 2014-09-12 2017-05-12 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados.
EP3191518B1 (en) 2014-09-12 2020-01-15 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
CN114106185A (zh) 2014-09-12 2022-03-01 基因泰克公司 抗her2抗体和免疫缀合物
WO2016044396A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-her2 antibodies and pyrrolobenzodiazepines
WO2016049214A1 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Genentech, Inc. METHOD OF USING ANTI-CD79b IMMUNOCONJUGATES
WO2016061389A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Genentech, Inc. Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
EP3223865A4 (en) 2014-10-31 2018-10-03 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind b7-h4
EP3215850B1 (en) 2014-11-03 2019-07-03 F. Hoffmann-La Roche AG Assays for detecting t cell immune subsets and methods of use thereof
SG11201703521UA (en) 2014-11-03 2017-05-30 Genentech Inc Methods and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
RU2017119185A (ru) 2014-11-05 2018-12-05 Дженентек, Инк. Антитела против fgfr2/3 и способы их применения
EP3842453A1 (en) 2014-11-06 2021-06-30 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
DK3215528T3 (da) 2014-11-06 2019-10-07 Hoffmann La Roche Fc-regionvarianter med modificeret FcRn-binding og anvendelsesfremgangsmåder
US20160152720A1 (en) 2014-11-06 2016-06-02 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
CA2960297A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
EP3217787B1 (en) 2014-11-10 2019-04-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Animal model for nephropathy and agents for treating the same
US10160795B2 (en) 2014-11-14 2018-12-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to Ebola virus glycoprotein and their use
SG11201703605QA (en) 2014-11-17 2017-06-29 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
WO2016081643A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
JP6993228B2 (ja) 2014-11-19 2022-03-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トランスフェリン受容体／抗ｂａｃｅ１多重特異性抗体および使用方法
EP3221364B1 (en) 2014-11-19 2020-12-16 Genentech, Inc. Antibodies against bace1 and use thereof for neural disease immunotherapy
LT3789402T (lt) 2014-11-20 2022-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Kompleksinė terapija, naudojant t ląsteles aktyvinančias bispecifines antigeną surišančias molekules ir pd-1 ašį surišančius antagonistus
CA2965540A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Anti-staphylococcus aureus antibody rifamycin conjugates and uses thereof
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
BR112017011478A2 (pt) 2014-12-03 2018-02-27 Genentech, Inc. composto de conjugado anticorpo-antibiótico, conjugado anticorpo-antibiótico, composição farmacêutica, métodos de tratamento de uma infecção bacteriana e para exterminar staph aureus, processo para a preparação do composto, kit e intermediário antibiótico-ligante
MA40938A (fr) 2014-12-05 2017-10-11 Hoffmann La Roche Anticorps anti-cd79b et méthodes d'utilisation desdits anticorps
MX2017007491A (es) 2014-12-10 2018-05-04 Genentech Inc Anticuerpos del receptor de la barrera hematoencefálica y métodos para su uso.
KR102650420B1 (ko) 2014-12-19 2024-03-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
EA201791366A1 (ru) 2014-12-19 2018-02-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к c5 и способы их применения
US20160200815A1 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
EP3245231B1 (en) 2015-01-16 2020-08-12 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
WO2016117346A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
JP2018512597A (ja) 2015-02-04 2018-05-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体スムースンド及びその使用方法
US9969800B2 (en) 2015-02-05 2018-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IL-8 antibodies
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
CN107430117A (zh) 2015-03-16 2017-12-01 豪夫迈·罗氏有限公司 检测和定量IL‑13的方法和在诊断和治疗Th2相关疾病中的用途
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
EP3683233A1 (en) 2015-03-20 2020-07-22 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to gp120 and their use
CN114907481A (zh) 2015-03-23 2022-08-16 震动疗法股份有限公司 Icos的抗体
EP3590961A1 (en) 2015-03-25 2020-01-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific multivalent fusion proteins
SG10201913158PA (en) 2015-04-03 2020-02-27 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
IL254887B2 (en) 2015-04-07 2023-11-01 Alector Llc Anti-sortilin antibodies and methods of using them
SI3286315T1 (sl) 2015-04-24 2021-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek identifikacije bakterij, ki obsegajo vezavne polipeptide
CN107709363A (zh) 2015-05-01 2018-02-16 基因泰克公司 掩蔽抗cd3抗体和使用方法
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
WO2016183104A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
IL295002A (en) 2015-05-12 2022-09-01 Genentech Inc Therapeutic and diagnostic methods for cancer containing a pd–l1 binding antagonist
AR105618A1 (es) 2015-05-29 2017-10-25 Genentech Inc Metilación del promotor del ligando al receptor de muerte programada (pd-l1) en cáncer
CN107771182A (zh) 2015-05-29 2018-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法
PL3303632T5 (pl) 2015-05-29 2023-07-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Terapeutyczne i diagnostyczne sposoby stosowane w nowotworze
WO2016196679A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for using anti-il-34 antibodies to treat neurological diseases
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
TWI790642B (zh) 2015-06-05 2023-01-21 美商建南德克公司 抗-tau抗體及使用方法
CN107750164A (zh) 2015-06-08 2018-03-02 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗ox40抗体和pd‑1轴结合拮抗剂治疗癌症的方法
CN107810011A (zh) 2015-06-08 2018-03-16 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗ox40抗体治疗癌症的方法
CN108064246A (zh) 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
EP3310811B1 (en) 2015-06-16 2021-06-16 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
TW201718647A (zh) 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
AU2016280102B2 (en) 2015-06-16 2022-06-16 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
JP6896650B2 (ja) 2015-06-17 2021-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及びタキサンを使用した局所進行性または転移性乳癌の治療方法
EP3310385A4 (en) 2015-06-17 2018-12-19 Allakos Inc. Methods and compositions for treating fibrotic diseases
CA2986592A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-her2 antibodies and methods of use
CA2985718A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
CA2989936A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Genentech, Inc. Type ii anti-cd20 antibody for use in organ transplantation
EP3313878B1 (en) 2015-06-29 2021-09-15 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
FR3038517B1 (fr) 2015-07-06 2020-02-28 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN108026180B (zh) 2015-08-28 2022-06-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗羟腐胺赖氨酸抗体及其用途
CN105399830B (zh) * 2015-09-08 2019-11-19 北京天广实生物技术股份有限公司 抗egfr人源化单克隆抗体、其制备方法及用途
EP3353206A1 (en) 2015-09-22 2018-08-01 Spring Bioscience Corporation Anti-ox40 antibodies and diagnostic uses thereof
MY191756A (en) 2015-09-23 2022-07-14 Genentech Inc Optimized variants of anti-vegf antibodies
MX2018003533A (es) 2015-09-24 2019-04-25 Abvitro Llc Composiciones de anticuerpo de virus de inmunodeficiencia humana (vih) y metodos de uso.
CN113956358A (zh) 2015-09-25 2022-01-21 豪夫迈·罗氏有限公司 抗tigit抗体和使用方法
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
PE20231655A1 (es) 2015-10-02 2023-10-17 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos contra el cd20 humano y el receptor de transferrina humano y metodos de uso
KR20180075537A (ko) 2015-10-06 2018-07-04 제넨테크, 인크. 다발성 경화증을 치료하기 위한 방법
WO2017062748A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
KR20180066236A (ko) 2015-10-22 2018-06-18 조운스 테라퓨틱스, 인크. Icos 발현을 계측하기 위한 유전자 특질
US10604577B2 (en) 2015-10-22 2020-03-31 Allakos Inc. Methods and compositions for treating systemic mastocytosis
EP4015533A1 (en) 2015-10-29 2022-06-22 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-variant fc-region antibodies and methods of use
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
WO2017075212A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
WO2017075173A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-factor d antibodies and conjugates
WO2017079479A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
JP6998869B2 (ja) 2015-11-08 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体のスクリーニング方法
CN108368174B (zh) 2015-11-23 2023-04-14 戊瑞治疗有限公司 用于癌症治疗的单独fgfr2抑制剂或与免疫刺激剂的组合
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
EP4026848A1 (en) 2015-12-09 2022-07-13 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing the cytokine release syndrome
PE20240365A1 (es) 2015-12-18 2024-03-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y metodos de uso
PL3400246T3 (pl) 2016-01-08 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworów z dodatnim markerem cea z wykorzystaniem antagonistów wiążących oś pd-1 oraz przeciwciał dwuswoistych anty-cea/anty-cd3
CN108602883A (zh) 2016-01-20 2018-09-28 基因泰克公司 用于阿尔茨海默氏病的高剂量治疗
CA3019952A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
JP6821693B2 (ja) 2016-02-29 2021-01-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんのための治療方法及び診断方法
AU2017235097B2 (en) 2016-03-15 2023-08-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-GPC3 antibodies
CN108700598A (zh) 2016-03-25 2018-10-23 豪夫迈·罗氏有限公司 多路总抗体和抗体缀合的药物量化测定法
WO2017180864A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
CA3019921A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
MX2018012493A (es) 2016-04-15 2019-06-06 Genentech Inc Métodos para controlar y tratar el cáncer.
EP3889175A1 (en) 2016-05-02 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG The contorsbody - a single chain target binder
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
CN109071640B (zh) 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
HRP20221298T1 (hr) 2016-05-13 2022-12-23 Bioatla, Inc. Anti-ror2 protutijela, fragmenti protutijela, njihovi imunokonjugati i njihove uporabe
CN109152843A (zh) 2016-05-20 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
WO2017223405A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
CN117986372A (zh) 2016-07-29 2024-05-07 中外制药株式会社 显示增加的备选fviii辅因子功能活性的双特异性抗体
MX2019001184A (es) 2016-07-29 2019-09-26 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos anti-idiotípicos y métodos relacionados.
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
WO2018029124A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
CN109844134B (zh) * 2016-08-16 2023-05-05 塔驰莱特Ip有限公司 闭合线性dna的生产
CA3035081A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating b cell disorders
US11168148B2 (en) 2016-09-07 2021-11-09 The Regents Of The University Of California Antibodies to oxidation-specific epitopes
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
EP3515932B1 (en) 2016-09-19 2023-11-22 F. Hoffmann-La Roche AG Complement factor based affinity chromatography
RU2752785C2 (ru) 2016-09-23 2021-08-04 Дженентек, Инк. Применение антагонистов il-13 для лечения атопического дерматита
CA3037086A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
KR20190072528A (ko) 2016-10-06 2019-06-25 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
CN110267678A (zh) 2016-10-29 2019-09-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗mic抗体和使用方法
ES2898025T3 (es) 2016-11-02 2022-03-03 Jounce Therapeutics Inc Anticuerpos contra PD-1 y sus usos
US11466094B2 (en) 2016-11-15 2022-10-11 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
JOP20190100A1 (ar) 2016-11-19 2019-05-01 Potenza Therapeutics Inc بروتينات ربط مولد ضد مضاد لـ gitr وطرق استخدامها
EP3468991A1 (en) 2016-11-21 2019-04-17 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
CA3045294A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
TW202328181A (zh) 2016-12-07 2023-07-16 美商建南德克公司 抗-tau抗體及使用方法
BR112019011199A2 (pt) 2016-12-12 2019-10-08 Genentech Inc método para tratar um indivíduo que tem um câncer de próstata e kits
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
TW201825515A (zh) 2017-01-04 2018-07-16 美商伊繆諾金公司 Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途
EP3568468A4 (en) 2017-01-12 2020-12-30 Eureka Therapeutics, Inc. RECOMBINATION PRODUCTS TARGETING PEPTIDE HISTONE H3 / MHC COMPLEXES AND THEIR USES
US10738131B2 (en) 2017-02-10 2020-08-11 Genentech, Inc. Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof
WO2018148660A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2018160841A1 (en) 2017-03-01 2018-09-07 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
CN108570106B (zh) * 2017-03-10 2021-07-16 北京天广实生物技术股份有限公司 抗埃博拉病毒单克隆抗体、其制备方法及用途
AR111249A1 (es) 2017-03-22 2019-06-19 Genentech Inc Composiciones de anticuerpo optimizadas para el tratamiento de trastornos oculares
MA48996A (fr) 2017-03-28 2020-02-05 Genentech Inc Méthodes de traitement de maladies neurodégénératives
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
SG11201909218RA (en) 2017-04-03 2019-11-28 Hoffmann La Roche Antibodies binding to steap-1
DK3606954T3 (en) 2017-04-05 2022-09-26 Hoffmann La Roche Anti-LAG3-antistoffer
AU2018251993A1 (en) 2017-04-14 2019-10-24 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
MA49131A (fr) 2017-04-21 2020-03-25 Hoffmann La Roche Utilisation d'antagonistes de klk5 pour le traitement d'une maladie
SG11201909728XA (en) 2017-04-26 2019-11-28 Eureka Therapeutics Inc Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
TWI791519B (zh) 2017-04-27 2023-02-11 美商提薩羅有限公司 針對淋巴細胞活化基因-3（lag-3）之抗體藥劑及其用途
KR20200016232A (ko) 2017-05-05 2020-02-14 알라코스 인크. 알레르기성 안구 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
WO2018209125A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Epstein barr virus antibodies, vaccines, and uses of the same
CN118416216A (zh) 2017-05-16 2024-08-02 戊瑞治疗有限公司 癌症治疗中抗fgfr2抗体与化学治疗剂的组合
JP2020527351A (ja) 2017-07-21 2020-09-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの治療法及び診断法
PL3658589T3 (pl) 2017-07-26 2024-03-18 Forty Seven, Inc. Przeciwciała anty-sirp-alfa i powiązane sposoby
EP3684413A1 (en) 2017-09-20 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dosage regimen for combination therapy using pd-1 axis binding antagonists and gpc3 targeting agent
CA3080546A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
AU2018347521A1 (en) 2017-10-12 2020-05-07 Immunowake Inc. VEGFR-antibody light chain fusion protein
SG11202003501XA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
MX2020004567A (es) 2017-11-06 2020-08-13 Genentech Inc Metodos diagnosticos y terapeuticos para el cancer.
WO2019108639A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Pfizer Inc. Anti-cxcr5 antibodies and compositions and uses thereof
US12006356B2 (en) 2017-12-15 2024-06-11 Juno Therapeutics, Inc. Anti-CCT5 binding molecules and chimeric antigen receptors comprising the same
KR102575787B1 (ko) 2017-12-21 2023-09-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Hla-a2/wt1에 결합하는 항체
EP3728321A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 F. Hoffmann-La Roche AG Use of pilra binding agents for treatment of a disease
MX2020006668A (es) 2017-12-22 2020-10-07 Jounce Therapeutics Inc Anticuerpos para lilrb2.
TW201930358A (zh) 2017-12-28 2019-08-01 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對ｔｉｇｉｔ之單域抗體及其變異體
US20220135687A1 (en) 2017-12-28 2022-05-05 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibodies and variants thereof against pd-l1
CN111886246A (zh) 2017-12-29 2020-11-03 艾莱克特有限责任公司 抗tmem106b抗体及其使用方法
EP3731865A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche AG Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody
EP3724223A1 (en) 2018-01-02 2020-10-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
US11466077B2 (en) 2018-01-05 2022-10-11 Ac Immune Sa Misfolded TDP-43 binding molecules
KR20200120641A (ko) 2018-01-15 2020-10-21 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Pd-1에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 변이체
CA3088649A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
KR20200115546A (ko) 2018-01-26 2020-10-07 제넨테크, 인크. IL-22 Fc 융합 단백질 및 사용 방법
LT3743088T (lt) 2018-01-26 2022-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Il-22 fc kompozicijos ir jų naudojimo būdai
WO2019152715A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Alector Llc Anti-ms4a4a antibodies and methods of use thereof
TWI732176B (zh) 2018-02-01 2021-07-01 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 全人源的抗ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）單鏈抗體及其應用
KR20200118065A (ko) 2018-02-08 2020-10-14 제넨테크, 인크. 이중특이적 항원-결합 분자 및 이의 사용 방법
KR20220098056A (ko) 2018-02-09 2022-07-08 제넨테크, 인크. 비만 세포 매개 염증성 질환에 대한 치료 및 진단 방법
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
JP7350756B2 (ja) 2018-02-14 2023-09-26 アバ セラピューティクス アーゲー 抗ヒトｐｄ－ｌ２抗体
WO2019165122A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
AU2019226085A1 (en) 2018-02-21 2020-09-17 Genentech, Inc. Dosing for treatment with IL-22 Fc fusion proteins
WO2019165434A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
US11485782B2 (en) 2018-03-14 2022-11-01 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. Anti-claudin 18.2 antibodies
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
SG11202009542PA (en) 2018-03-29 2020-10-29 Genentech Inc Modulating lactogenic activity in mammalian cells
TW202003567A (zh) 2018-03-30 2020-01-16 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對lag-3之單一結構域抗體及其用途
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
TWI840351B (zh) 2018-04-05 2024-05-01 美商奇諾治療有限公司 T細胞受體及表現其之工程化細胞
EP3794022A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
SG11202011349PA (en) 2018-05-14 2020-12-30 Werewolf Therapeutics Inc Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
JP7337099B2 (ja) 2018-05-25 2023-09-01 アレクトル エルエルシー 抗ｓｉｒｐａ抗体およびその使用法
KR20210056288A (ko) 2018-06-01 2021-05-18 타유 후아시아 바이오테크 메디컬 그룹 컴퍼니 리미티드 질환 또는 병태를 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도
CA3102398A1 (en) 2018-06-03 2019-12-12 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
EP3805400A4 (en) 2018-06-04 2022-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule showing changed half-life in cytoplasm
SG11202012342WA (en) 2018-06-18 2021-01-28 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (psma) and uses thereof
US20200030443A1 (en) 2018-06-23 2020-01-30 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
CN112384532A (zh) 2018-06-29 2021-02-19 艾利妥 抗SIRP-β1抗体及其使用方法
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
US11396546B2 (en) 2018-07-13 2022-07-26 Alector Llc Anti-Sortilin antibodies and methods of use thereof
CN112839644A (zh) 2018-07-18 2021-05-25 豪夫迈·罗氏有限公司 用pd-1轴结合拮抗剂、抗代谢物和铂剂治疗肺癌的方法
MX2021000745A (es) 2018-07-20 2021-03-26 Surface Oncology Inc Composiciones anti-cd112r y metodos.
JP7504027B2 (ja) 2018-08-03 2024-06-21 中外製薬株式会社 互いに連結された２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子
CA3051549A1 (en) 2018-08-09 2020-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
WO2020032230A1 (ja) 2018-08-10 2020-02-13 中外製薬株式会社 抗ｃｄ１３７抗原結合分子およびその使用
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP3849565A4 (en) 2018-09-12 2022-12-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center REDUCING CD33 EXPRESSION FOR SELECTIVE PROTECTION OF THERAPEUTIC CELLS
AU2019342099A1 (en) 2018-09-19 2021-04-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
EP4249917A3 (en) 2018-09-21 2023-11-08 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
SG11202102777PA (en) 2018-09-27 2021-04-29 Xilio Development Inc Masked cytokine polypeptides
US20210380684A1 (en) 2018-09-28 2021-12-09 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition
CN112804989A (zh) 2018-10-05 2021-05-14 戊瑞治疗有限公司 抗fgfr2抗体制剂
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CA3116324A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
AU2019380320A1 (en) 2018-11-16 2021-06-03 Eureka Therapeutics, Inc. Antibodies to Mucin-16 and methods of use thereof
AU2019394940A1 (en) 2018-12-05 2021-06-24 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for cancer immunotherapy
BR112021010908A2 (pt) 2018-12-06 2021-08-31 Genentech, Inc. Método para tratamento de linfoma difuso de grandes células b, kit e imunoconjugado
JP2022513198A (ja) 2018-12-10 2022-02-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｃ含有タンパク質への部位特異的コンジュゲーションのための光架橋性ペプチド
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
US20220089694A1 (en) 2018-12-20 2022-03-24 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
TW202035442A (zh) 2018-12-20 2020-10-01 美商建南德克公司 經修飾之抗體Fc及其使用方法
SG11202106100VA (en) 2018-12-21 2021-07-29 23Andme Inc Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
CA3123503A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf and il-1beta and methods of use
SG11202102859TA (en) 2018-12-21 2021-04-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
US20220064301A1 (en) 2018-12-26 2022-03-03 Xilio Development, Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of use thereof
CN113272327A (zh) 2018-12-30 2021-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗兔cd19抗体及其使用方法
MX2021008434A (es) 2019-01-14 2021-09-23 Genentech Inc Metodos para tratar el cancer con un antagonista de union al eje de pd-1 y una vacuna de arn.
JPWO2020153467A1 (ja) 2019-01-24 2021-12-02 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
US20220096651A1 (en) 2019-01-29 2022-03-31 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
AU2020228383A1 (en) 2019-02-27 2021-09-23 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-CD20 or anti-CD38 antibodies
JP7402247B2 (ja) 2019-03-08 2023-12-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞外小胞の膜結合タンパク質を検出及び定量化するための方法
AU2020236015A1 (en) 2019-03-14 2021-09-09 Genentech, Inc. Treatment of cancer with HER2XCD3 bispecific antibodies in combination with anti-HER2 MAB
AU2020258480A1 (en) 2019-04-19 2021-10-21 Genentech, Inc. Anti-mertk antibodies and their methods of use
US20220143094A1 (en) 2019-04-19 2022-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chimeric receptor that recognizes engineered site in antibody
US20220227853A1 (en) 2019-05-03 2022-07-21 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
TW202108616A (zh) 2019-05-03 2021-03-01 美商建南德克公司 用抗pd-l1抗體治療癌症之方法
SG11202112541RA (en) 2019-05-14 2021-12-30 Werewolf Therapeutics Inc Separation moieties and methods and use thereof
MX2021013825A (es) 2019-05-14 2022-01-18 Genentech Inc Procedimientos de uso de inmunoconjugados anti-cd79b para tratar el linfoma folicular.
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
SG11202112453TA (en) 2019-05-23 2021-12-30 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
JP7512310B2 (ja) 2019-06-11 2024-07-08 アレクトル エルエルシー 治療に使用するための抗ソルチリン抗体
AU2020299382A1 (en) 2019-07-02 2022-01-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind EGFRvIII and their use
JPWO2021010326A1 (ja) 2019-07-12 2021-01-21
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP4004045A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
CN114341181A (zh) 2019-07-31 2022-04-12 艾莱克特有限责任公司 抗ms4a4a抗体及其使用方法
KR20220028035A (ko) 2019-07-31 2022-03-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Gprc5d에 결합하는 항체
JP7181438B2 (ja) 2019-08-06 2022-11-30 アプリノイア セラピューティクス リミテッド 病理学的タウ種に結合する抗体及びその使用
CA3146616A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Matthew Dominic CASCINO Compositions and methods of treating lupus nephritis
CA3150999A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 James Thomas Koerber Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
CN114423454A (zh) 2019-09-20 2022-04-29 豪夫迈·罗氏有限公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
PE20221110A1 (es) 2019-09-27 2022-07-11 Genentech Inc Administracion de dosis para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1
CA3153880A1 (en) 2019-10-18 2020-06-09 Juana Elva HERNANDEZ MONTALVO Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
WO2021092171A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for treatment of hematologic cancers
EP4058471A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
WO2021113780A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
WO2021113776A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to bcma-targeted binding domains and related compositions and methods
KR20220113790A (ko) 2019-12-13 2022-08-16 제넨테크, 인크. 항-ly6g6d 항체 및 사용 방법
KR20220127252A (ko) 2019-12-13 2022-09-19 알렉터 엘엘씨 항-mertk 항체 및 이의 사용 방법
WO2021122875A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a2/mage-a4
KR102645629B1 (ko) 2019-12-27 2024-03-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ctla-4 항체 및 그의 사용
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
AU2021212197A1 (en) 2020-01-31 2022-08-04 BioNTech SE Methods of inducing neoepitope-specific T cells with a PD-1 axis binding antagonist and an RNA vaccine
CA3165319A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Vincent K. Tuohy Anti-mullerian hormone receptor 2 antibodies and methods of use
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
CN115087488A (zh) 2020-02-14 2022-09-20 震动疗法股份有限公司 与ccr8结合的抗体和融合蛋白及其用途
WO2021168292A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
CA3169939A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Jie Xue Anti-cd137 construct and use thereof
EP4110826A4 (en) 2020-02-28 2024-08-14 Shanghai Henlius Biotech Inc ANTI-CD137 CONSTRUCTS, MULTISPECIFIC ANTIBODIES AND THEIR USES
CR20220461A (es) 2020-03-13 2022-10-21 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y usos de estos
EP4121163A1 (en) 2020-03-19 2023-01-25 Genentech, Inc. Isoform-selective anti-tgf-beta antibodies and methods of use
WO2021194913A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Tie2-binding agents and methods of use
KR20220159426A (ko) 2020-03-26 2022-12-02 제넨테크, 인크. 감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포
CN116075525A (zh) 2020-03-31 2023-05-05 艾莱克特有限责任公司 抗mertk抗体及其使用方法
JPWO2021201236A1 (ja) 2020-04-01 2021-10-07
WO2021202959A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
WO2021217051A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
US20230167198A1 (en) 2020-04-27 2023-06-01 The Regents Of The University Of California Isoform-independent antibodies to lipoprotein(a)
WO2021222167A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Genentech, Inc. Methods and compositions for non-small cell lung cancer immunotherapy
CN116963782A (zh) 2020-05-03 2023-10-27 联宁（苏州）生物制药有限公司 包含抗trop-2抗体的抗体药物偶联物
WO2021238886A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
BR112022024339A2 (pt) 2020-05-29 2022-12-27 23Andme Inc Anticorpos anti cd200r1 e métodos de uso dos mesmos
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
WO2021247769A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-cd93 constructs and uses thereof
CN115697489A (zh) 2020-06-08 2023-02-03 豪夫迈·罗氏有限公司 抗hbv抗体及其使用方法
JP2023529206A (ja) 2020-06-12 2023-07-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド がん免疫療法のための方法及び組成物
KR20230025691A (ko) 2020-06-16 2023-02-22 제넨테크, 인크. 삼중 음성 유방암을 치료하기 위한 방법과 조성물
KR20230024368A (ko) 2020-06-18 2023-02-20 제넨테크, 인크. 항-tigit 항체 및 pd-1 축 결합 길항제를 사용한 치료
EP4168447A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3 and cd19
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
CR20220639A (es) 2020-06-19 2023-02-17 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y folr1
WO2021255142A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
WO2021259880A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Almirall, S.A. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
KR20230026491A (ko) 2020-06-24 2023-02-24 제넨테크, 인크. 아폽토시스 내성 세포주
EP4178985A1 (en) 2020-07-10 2023-05-17 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
MX2023000617A (es) 2020-07-17 2023-02-13 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso.
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
CN116783215A (zh) 2020-07-29 2023-09-19 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
EP4189121A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for lymphoma
WO2022029660A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
AR123158A1 (es) 2020-08-07 2022-11-02 Genentech Inc Proteínas de fusión del ligando para flt3 y métodos de uso
TW202221026A (zh) 2020-08-14 2022-06-01 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途
EP4204448A2 (en) 2020-08-27 2023-07-05 cureab GmbH Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
WO2022047222A2 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Genentech, Inc. Crispr/cas9 multiplex knockout of host cell proteins
WO2022049165A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody that binds to vegf-a and ang2 and methods of use
WO2022053715A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to il1rap and uses thereof
MX2023003685A (es) 2020-09-30 2023-06-02 Dren Bio Inc Anticuerpos anti-cd94 y metodos de uso de los mismos.
KR20230082632A (ko) 2020-10-05 2023-06-08 제넨테크, 인크. 항-fcrh5/항-cd3 이중특이성 항체를 사용한 치료를 위한 투약
US12037399B2 (en) 2020-10-07 2024-07-16 Dren Bio, Inc. Anti-Dectin-1 antibodies and methods of use thereof
WO2022084210A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1 axis binding antagonists and lrrk2 inhitibors
EP4232475A1 (en) 2020-10-20 2023-08-30 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
KR20230100732A (ko) 2020-11-04 2023-07-05 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 피하 투여
JP7402381B2 (ja) 2020-11-04 2023-12-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
WO2022098648A2 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
CA3202986A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Alector Llc Methods of use of anti-sortilin antibodies
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
AU2022207615A1 (en) 2021-01-12 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
JP2024503654A (ja) 2021-01-13 2024-01-26 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 併用療法
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
EP4284422A1 (en) 2021-01-28 2023-12-06 Vaccinvent GmbH Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
WO2022169872A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
CN117396502A (zh) 2021-02-09 2024-01-12 佐治亚大学研究基金会有限公司 针对肺炎球菌抗原的人类单克隆抗体
WO2022173670A1 (en) 2021-02-09 2022-08-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies targeting the spike protein of coronaviruses
CA3208365A1 (en) 2021-02-15 2022-08-18 Chantal KUHN Cell therapy compositions and methods for modulating tgf-b signaling
WO2022187272A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Xilio Development, Inc. Combination of masked ctla4 and pd1/pdl1 antibodies for treating cancer
TW202317612A (zh) 2021-03-01 2023-05-01 美商艾希利歐發展股份有限公司 用於治療癌症的ｃｔｌａ４及ｐｄ１／ｐｄｌ１抗體之組合
JP2024509169A (ja) 2021-03-03 2024-02-29 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート
CN117715933A (zh) 2021-03-05 2024-03-15 当康生物技术有限责任公司 抗vista的构建体及其用途
EP4294927A2 (en) 2021-03-10 2023-12-27 Immunowake Inc. Immunomodulatory molecules and uses thereof
JP2024512377A (ja) 2021-03-12 2024-03-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体、及び使用方法
BR112023018621A2 (pt) 2021-03-15 2023-10-24 Hoffmann La Roche Métodos para tratar nefrite lúpica, esgotar células b periféricas, kits para tratar nefrite lúpica e anticorpos anti-cd20 tipo ii
WO2022197947A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 Alector Llc Anti-tmem106b antibodies and methods of use thereof
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
EP4314063A1 (en) 2021-03-23 2024-02-07 Alector LLC Anti-tmem106b antibodies for treating and preventing coronavirus infections
JP2024511424A (ja) 2021-03-25 2024-03-13 ダイナミキュア バイオテクノロジー エルエルシー 抗ｉｇｆｂｐ７構築物およびその使用
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
KR20230173164A (ko) 2021-04-19 2023-12-26 제넨테크, 인크. 변형된 포유류 세포
JP2024514281A (ja) 2021-04-23 2024-04-01 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｎｋ細胞係合剤関連の有害作用の防止または軽減
CN117321078A (zh) 2021-04-30 2023-12-29 豪夫迈·罗氏有限公司 针对用抗cd20/抗cd3双特异性抗体和抗cd79b抗体药物缀合物进行组合治疗的给药
MX2023013264A (es) 2021-05-12 2023-11-30 Genentech Inc Metodos para usar inmunoconjugados anti-cd79b para tratar linfoma difuso de linfocitos b grandes.
CN117396510A (zh) 2021-05-14 2024-01-12 基因泰克公司 Trem2的激动剂
JP2024521107A (ja) 2021-05-21 2024-05-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 目的の組換え産物を産生するための修飾細胞
TW202306994A (zh) 2021-06-04 2023-02-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ddr2抗體及其用途
AU2022289684A1 (en) 2021-06-09 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
CN117642426A (zh) 2021-06-16 2024-03-01 艾莱克特有限责任公司 双特异性抗MerTK和抗PDL1抗体及其使用方法
EP4355783A1 (en) 2021-06-16 2024-04-24 Alector LLC Monovalent anti-mertk antibodies and methods of use thereof
US20240279334A1 (en) 2021-06-17 2024-08-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
CN117616123A (zh) 2021-06-25 2024-02-27 中外制药株式会社 抗ctla-4抗体
BR112023023480A2 (pt) 2021-06-25 2024-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Uso de anticorpo anti-ctla-4
TW202317633A (zh) 2021-07-08 2023-05-01 美商舒泰神（加州）生物科技有限公司 特異性識別ｔｎｆｒ２的抗體及其用途
JP2024525769A (ja) 2021-07-14 2024-07-12 舒泰神（北京）生物製薬股フン有限公司 Ｃｄ４０を特異的に認識する抗体およびその使用
EP4370553A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Genentech, Inc. Anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies and methods of use
EP4373576A1 (en) 2021-07-22 2024-05-29 Genentech, Inc. Brain targeting compositions and methods of use thereof
AU2022315528A1 (en) 2021-07-22 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
EP4380980A1 (en) 2021-08-03 2024-06-12 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies and methods of use
KR20240046524A (ko) 2021-08-07 2024-04-09 제넨테크, 인크. 미만성 거대 b-세포 림프종을 치료하기 위해 항-cd79b 면역접합체를 사용하는 방법
EP4384553A1 (en) 2021-08-13 2024-06-19 Genentech, Inc. Dosing for anti-tryptase antibodies
CN117858905A (zh) 2021-08-19 2024-04-09 豪夫迈·罗氏有限公司 多价抗变体fc区抗体及使用方法
KR20240049296A (ko) 2021-08-27 2024-04-16 제넨테크, 인크. 타우 병증을 치료하는 방법
TW202325727A (zh) 2021-08-30 2023-07-01 美商建南德克公司 抗聚泛素多特異性抗體
CA3232223A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Ying Fu Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
WO2023058705A1 (ja) 2021-10-08 2023-04-13 中外製薬株式会社 抗ｈｌａ－ｄｑ２．５抗体の製剤
EP4419558A1 (en) 2021-10-19 2024-08-28 Alector LLC Anti-cd300lb antibodies and methods of use thereof
WO2023081818A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
EP4430072A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
MX2024005876A (es) 2021-11-16 2024-05-29 Ac Immune Sa Moleculas novedosas para terapias y diagnostico.
CA3236006A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating systemic lupus erythematosus (sle) with mosunetuzumab
WO2023094569A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies and tyrp1-specific antibodies
WO2023103788A1 (zh) 2021-12-06 2023-06-15 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 特异性结合肺炎克雷伯菌o2抗原和o1抗原的双特异性抗体以及组合物
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023109900A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
CN118574849A (zh) 2021-12-17 2024-08-30 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗ox40抗体和使用方法
AR128222A1 (es) 2022-01-07 2024-04-10 Johnson & Johnson Entpr Innovation Inc MATERIALES Y MÉTODOS DE PROTEÍNAS DE UNIÓN A IL-1b
WO2023141445A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and conjugates and methods of use
WO2023154824A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
AU2023221539A1 (en) 2022-02-16 2024-08-22 Ac Immune Sa Humanized anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
TW202342520A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 美商樂天醫藥生技股份有限公司 抗計畫性死亡配體１（ｐｄ—ｌ１）抗體分子、編碼多核苷酸及使用方法
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
TW202346365A (zh) 2022-03-23 2023-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及化學療法之組合治療
WO2023179740A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Shanghai Henlius Biotech , Inc. Anti-msln antibodies and methods of use
WO2023192827A1 (en) 2022-03-26 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
TW202404637A (zh) 2022-04-13 2024-02-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體之醫藥組成物及使用方法
US20230406930A1 (en) 2022-04-13 2023-12-21 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
WO2023203177A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
WO2023215737A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Genentech, Inc. Anti-ly6e antibodies, immunoconjugates, and uses thereof
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
AR129268A1 (es) 2022-05-11 2024-08-07 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a e il6 y métodos de uso
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
WO2024015897A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020407A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing b- and t-lymphocyte attenuator (btla) and uses thereof
TW202413433A (zh) 2022-07-19 2024-04-01 美商建南德克公司 用抗ｆｃｒｈ５／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
TW202417504A (zh) 2022-07-22 2024-05-01 美商建南德克公司 抗ｓｔｅａｐ１抗原結合分子及其用途
WO2024026447A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Alector Llc Anti-gpnmb antibodies and methods of use thereof
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
TW202417034A (zh) 2022-08-19 2024-05-01 大陸商億一生物醫藥開發（上海）有限公司 包含ｇ—ｃｓｆ之調配物及其用途
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024054929A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
TW202421664A (zh) 2022-10-07 2024-06-01 美商建南德克公司 用抗ｃ—ｃ模體趨化因子受體８（ｃｃｒ８）抗體治療癌症之方法
WO2024086796A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Alector Llc Anti-ms4a4a antibodies with amyloid-beta therapies
WO2024091991A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for multiple myeloma
WO2024097741A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Anticancer therapies using anti-ccr8 antibody, chemo and immunotherapy combinations
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024100170A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to hla-a*02/foxp3
US20240226313A1 (en) 2022-11-17 2024-07-11 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024137381A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies for treating sars-cov-2 infection
WO2024148232A2 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Alector Llc Anti-il18 binding protein antibodies and methods of use thereof
WO2024155807A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 Genentech, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
WO2024156672A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to csf1r and cd3
WO2024184494A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061739A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5324663A (en) * 1990-02-14 1994-06-28 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
WO2000064262A1 (en) * 1999-04-26 2000-11-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Antisense human fucosyltransferase sequences and methods of use thereof
FR2807767B1 (fr) * 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
EP1331266B1 (en) * 2000-10-06 2017-01-04 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) * 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2003236015A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061739A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule

Also Published As

Publication number Publication date
ES2362419T3 (es) 2011-07-05
US20040110282A1 (en) 2004-06-10
DE60336548D1 (de) 2011-05-12
US8361751B2 (en) 2013-01-29
JPWO2003085102A1 (ja) 2005-08-11
CA2481656A1 (en) 2003-10-16
ATE503829T1 (de) 2011-04-15
AU2003236020A1 (en) 2003-10-20
WO2003085102A1 (fr) 2003-10-16
EP1500698A1 (en) 2005-01-26
EP1500698A4 (en) 2006-02-15
US20100291628A1 (en) 2010-11-18
US7749753B2 (en) 2010-07-06
EP1500698B1 (en) 2011-03-30
AU2003236020B2 (en) 2009-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4628679B2 (ja) Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
JP6523404B2 (ja) 抗体組成物を生産する細胞
US20040132140A1 (en) Production process for antibody composition
JPWO2003085107A1 (ja) ゲノムが改変された細胞
JPWO2003085119A1 (ja) 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
JPWO2003055993A1 (ja) Ｃｄ２０に特異的に結合する抗体組成物
JPWO2003084569A1 (ja) 抗体組成物含有医薬
JPWO2006013964A1 (ja) 糖蛋白質組成物の製造法
JPWO2005035778A1 (ja) α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
WO2007099988A1 (ja) α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ変異体とその用途
JPWO2005035741A1 (ja) ゲノムが改変された細胞
JPWO2005035740A1 (ja) 無血清馴化したゲノム改変細胞
JPWO2005035583A1 (ja) Ｉｌ−５受容体に特異的に結合する抗体組成物

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060406

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20060425

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060616

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20071130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090609

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090807

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100608

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100805

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100831

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100928

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20100928

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101026

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101110

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131119

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4628679

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141119

Year of fee payment: 4

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

EXPY Cancellation because of completion of term