CN117396502A - 针对肺炎球菌抗原的人类单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了特异性结合肺炎球菌蛋白，特别是肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白(PhtD)和肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的单克隆抗体和抗原结合片段。还公开了编码抗体、抗原结合片段、抗体的VH或VL或包括VH和/或VL的多片段抗体的核酸分子、包括这些核酸分子的载体以及用这些载体转染的宿主细胞。还提供了抑制、治疗和检测肺炎链球菌感染的方法。

Description

针对肺炎球菌抗原的人类单克隆抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月9日提交的美国临时申请号63/147,393的权益，该申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
本申请涉及特异性结合肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的单克隆抗体和抗原结合片段，例如特异性结合肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白(PhtD)或肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的单克隆抗体和抗原结合片段，以及它们在抑制和检测肺炎链球菌感染中的用途。
政府支持的感谢
本发明得到了美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款1K01OD026569、R01AI123383和GM109435以及美国国家转化科学促进中心(NationalCenter for Advancing Translation Sciences，NCATS)授予的拨款UL1TR002378的政府支持；政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
尽管已广泛使用两种疫苗来预防疾病，但肺炎链球菌仍是传染病发病率和死亡率的主要原因(Levine et al.(2006)Lancet367：1880-1882)。据世界卫生组织估计，全世界每年有100多万人死于肺炎球菌感染(World Health Organization(2003)Wkly EpidemiolRec 78：110-119)。与其他呼吸道病原体类似，2岁以下和65岁以上的个体更容易感染侵入性肺炎球菌疾病(Practices AC on I.(2000)MMWR Recomm Rep 49：1-35)。此外，患有糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒等原有疾病的个体也会增加严重感染的频率和风险(van der Poll and Opal(2009)Lancet 374：1543-1556)。尽管疫苗接种已在发达国家普及，但肺炎球菌感染仍占成人肺炎的30％，死亡率高达11-40％(Bridy-Pappas et al.(2005)Pharmacotherapy 25：1193-212)。此外，在世界上儿童死亡率较高的地区，肺炎球菌肺炎是导致20-50％儿童死亡的原因(Williams et al.(2002)LancetInfect Dis 2：25-32)。
肺炎链球菌是上呼吸道的常住菌，肺炎链球菌携带发生在活动性感染之前(Sulikowska et al.(2004)J Clin Microbiol 42：3942-3949；Simell et al.(2012)Expert Rev Vaccines 11：841-855)。在幼儿中，肺炎球菌的携带率可高达40-60％(Cardozo et al.(2008)J Med Microbiol 57：185-189)。定植通常是无症状的；然而，肺炎链球菌通常会在流感等原发感染后迅速传播，导致肺炎和侵袭性疾病。肺炎链球菌的反复定植通常会导致免疫，多项研究已确定定植会诱导对荚膜多糖的血清抗体反应，以及对蛋白抗原的血清抗体和细胞免疫反应(Weinberger et al.(2008)J Infect Dis 197：1511-1518；Goldblatt et al.(2005)J Infect Dis 192：387-93；McCool et al.(2002)J ExpMed 195：359-365；Prevaes et al.(2012)Infect Immun 80：2221-2186-2193；Turner etal.(2013)Clin Microbiol Infect 19：E551-E558；Zhang et al.(2006)Eur J Immunol36：46-57；Mureithi et al.(2009)J Infect Dis 200：783-793；和Wright et al.(2013)PLoS Path e1003274)。血清中的这些抗体水平在人出生后的头几年会升高，但在老年人中会下降，这可能是儿童和老年人中观察到的患病风险较高的原因之一(Simell et al.(2008)Clin Vacc Immunol 15：1391-1397)。
虽然疫苗能有效降低肺炎球菌疾病的发病率，但非疫苗血清型的发病率也出现了上升，这被称为血清型替代(Wantuch et al.(2018)Hum Vaccines Immunother 14：2303-2309)。此外，尽管疫苗接种范围广泛，但血清型3和19A引起的侵袭性疾病的发病率仍持续存在(Linley et al.(2019)Vaccines 7：doi：10.3390/vaccines7010004)。在治疗方面，非疫苗血清型的抗生素耐药性有所上升，给肺炎球菌感染的治疗带来了挑战(Lo et al.(2019)Lancet Infect Dis 19：759-769)。鉴于目前疫苗和治疗的局限性，亟需另外的治疗选项。
发明内容
提供了与肺炎链球菌特异性结合的分离的单克隆抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括以下之一：
a)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其包括分别如SEQ ID NO：1和5所示的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
b)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO：9和13所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3；
c)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO：17和21所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO：25和29所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3；
e)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO：33和37所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，公开了多特异性抗体，其包括2种或2种以上这些抗体和/或抗原结合片段的组合。
还公开了编码抗体、抗原结合片段、抗体的VH或VL或包括VH和/或VL的多片段抗体的核酸分子、包括这些核酸分子的载体以及用这些载体转染的宿主细胞。
在更多的实施方案中，公开了抑制受试者肺炎链球菌感染的方法。
在进一步的实施方案中，公开了用于检测生物样品中肺炎链球菌的方法。
本发明的上述及其他特征和优点将从下面参照附图对一些实施方案的详细描述中变得更加明显。
附图说明
图1.重组PhtD和PspA蛋白的纯化。纯化的重组表达的PspA和PhtD的SDS-PAGE(左)和Western印迹(右)。两种蛋白都很纯，没有出现降解产物。
图2.受刺激B细胞的上清液与重组PhtD和PspA蛋白的ELISA结合反应。
图3A-3B.与PhtD和PspA结合的单克隆抗体(mAb)。图3A显示了抗PhtD mAb针对重组PhtD蛋白的ELISA结合曲线。PspA16用作阴性对照。＞表示在最高浓度下OD405超过1Abs时未观察到结合。图3B显示了PspA16与重组PspA的结合。对于图3A和图3B，报告了根据非线性回归曲线拟合(激动剂)计算的以ng/mL为单位的EC50值。数据点表示至少两个独立实验之一的四个重复的平均值。误差条表示95％的置信区间。
图4.纯化的麦芽糖结合蛋白(MBP)PhtD片段融合蛋白的SDS-PAGE。除游离MBP外，每个融合蛋白纯化后都是纯的。
图5.PhtD mAb与各MBP-PhtD片段的ELISA结合曲线。结合曲线的总结显示在结合曲线下方。数据点表示至少两个独立实验之一的四个重复的平均值。误差条表示95％的置信区间。
图6.PhtD特异性mAb的表位图。数据显示了与单独竞争抗体相比，竞争抗体在第一抗体存在下的结合百分比。黑色填充的单元格表示完全竞争，其中观察到≤33％的非竞争信号；灰色单元格表示中等竞争，其中信号在33％到66％之间；白色单元格表示非竞争，其中信号≥66％。
图7.重组MBP PspA片段融合蛋白的SDS-PAGE。片段1-2和4-5纯化良好，只有可见的MBP蛋白作为污染物。PspA片段3有多条共纯化带和/或降解产物。
图8.PspA16与各片段的ELISA结合曲线。PspA16与片段1和片段4结合，而与其他片段没有结合，表明表位在氨基酸1-247内。数据点表示至少两个独立实验之一的四个重复的平均值。误差条表示95％的置信区间。
图9.以PspA16和PhtD3为第一抗体对TIGR4和TCH8431菌株进行的Western印迹。在PspA16的Western印迹中，与MBP融合的PspA片段1-438用作阳性对照，MBP用作阴性对照。在PhtD3的Western印迹中，重组PhtD用作阳性对照，大肠杆菌裂解液用作阴性对照。
图10.分离的mAb针对涂有固定细菌的板的ELISA结合曲线。数据表示至少两个独立实验之一的四个数据点的平均值，误差条为标准差。
图11.热图和抗体与各肺炎球菌血清型结合的百分比。数据是3-4次实验的平均值，是APC阳性细菌的百分比。MPV314和MPV414是对人类变性肺病毒融合蛋白具有特异性的人类抗体，这些用作阴性对照。
图12A-12F.抗PhtD mAb的保护效力。图12A：mAb PhtD3和PhtD8、同种型切换mAb(PhtD3-IgG2a和PhtD8-IgG2a)以及IgG2a同种型对照的ELISA结合曲线。图12B：mAb PhtD3-IgG2a在C57BL/6小鼠肺炎球菌血清型3(菌株WU2)鼻内感染模型中的预防效力。经对数秩(log-rank)(Mantel-Cox)检验，**，P＝0.0012，ns＝无显著性。n＝10只小鼠/组。图12C：mAbPhtD8-IgG2a在C57BL/6小鼠肺炎球菌血清型3(菌株WU2)鼻内感染模型中的预防效力。经对数秩(Mantel-Cox)检验，***，P＝0.0009，ns＝无显著性。n＝10只小鼠/组。图12D：mAbPhtD3-IgG2a在CBA/N小鼠的肺炎球菌血清型4(菌株TIGR4)的鼻内感染模型中的预防效力。经对数秩(Mantel-Cox)检验，**，P＝0.0045。n＝15只小鼠/组。图12E：mAb PhtD3-IgG2a在C57BL/6小鼠肺炎球菌血清型4(菌株TIGR4)静脉内感染模型中的预防效力。经对数秩(Mantel-Cox)检验，**P＝0.0101。n＝13-15只小鼠/组。图12F：mAb PhtD3-IgG2a在C57BL/6小鼠肺炎球菌血清型3(菌株WU2)鼻内感染模型中的治疗效力。经对数秩(Mantel-Cox)检验，***P＝0.0002，ns＝无显著性。n＝20只小鼠/组。
图13A-13C.抗PhtD和抗PspA mAb的保护效力。图13A：小鼠在鼻内感染肺炎链球菌(5x106CFU的血清型3(WU2))前两小时，经腹膜内注射施用PhtD7(15mg/kg)或同种型对照IgG2a(15mg/kg)的存活曲线。随时间监测小鼠的存活率，并以百分比表示。使用对数秩(Mantel-Cox)检验对存活曲线进行统计比较，显示***p值为0.006。图13B：小鼠在经鼻内感染肺炎链球菌(5x106CFU的血清型3(WU2))前两小时，经腹膜内注射施用PspA16(15mg/kg)、同种型对照IgG2a(15mg/kg)或PBS的存活曲线。随时间监测小鼠的存活率，并以百分比表示。使用对数秩(Mantel-Cox)检验对存活曲线进行统计比较，显示**p值为0.0071。图13C：小鼠在经鼻内感染肺炎链球菌(5x106CFU的血清型3(WU2))后24小时，经腹膜内注射施用PhtD3-IgG2a和PhtD7(各7.5mg/kg)或同种型对照(15mg/kg)的组合的存活曲线。随时间监测小鼠的存活率，并以百分比表示。使用对数秩(Mantel-Cox)检验对存活曲线进行统计比较，显示****p值小于0.0001。
图14A-14B.PhtD特异性人类mAb的调理吞噬活性。图14A：使用分化的HL-60细胞在标准调理吞噬杀伤测定(OPKA)中测试mAb和血清。用抗体调理指定血清型(血清型4、血清型3或血清型19A)的细菌，随后加入HL-60细胞，再将其涂布在血琼脂板上。将板孵育过夜，对CFU进行计数。数据为一次实验中三个重复的平均值。误差条表示范围。细菌杀伤百分比计算为针对无Ab对照的平均值归一化的每个三重复的计数CFU值。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验来确定显著性。ns＝无显著性，****P＜0.0001。图14B：mAb和血清在基于流动的调理吞噬测定中进行检测。用抗体促进指定血清型(血清型4、血清型3或血清型19A)的pHRodoTM标记的细菌的调理作用，并与HL-60细胞一起孵育，然后通过流式细胞术进行分析。数据表示pHRodoTM+的CD38+CD11b+HL-60细胞的百分比。每个柱状图是三个实验重复的平均值，误差条是标准差。ns＝无显著性，***P＝0.0001-0.0006，****P＜0.0001，经单因素方差分析和Dunnett多重比较检验。MPV414是对人类变性肺病毒融合蛋白具有特异性的人类mAb。
图15.用PhtD3-IgG2a(标记为PhtD3)或同种型治疗的小鼠感染后三天的肺部和血液细菌滴度。数据以肺部匀浆或血液的CFU/mL的log10表示。使用非配对t检验对肺部和血液滴度进行统计学比较，显示p值分别为0.0002和0.009。
图16.用PhtD3-IgG2a(标记为PhtD3)治疗小鼠在流感和肺炎链球菌共同感染模型中的存活曲线。数据显示了初次感染流感(或对于“仅Spn”治疗，初次感染肺炎链球菌)后的存活率。第7天的虚线(标注为“Spn”)表示PhtD3、同种型和PBS治疗中鼻内合并感染肺炎链球菌的时间。使用对数秩(Mantel-Cox)检验对PhtD3与同种型对照组的存活曲线进行统计学比较，显示p值小于0.0001。
序列
如37 C.F.R.1.822所定义，核酸和氨基酸序列用标准字母缩写表示核苷酸碱基，用三字母代码表示氨基酸。每个核酸序列只显示一条链，但互补链可理解为通过所显示的链的任意参考而包括在内。序列表以名为“序列表.txt”的ASCII文本文件形式提交，该文件创建于2022年1月13日，28,672字节，通过引用并入本文。在所附序列表中：
SEQ ID NO：1是PhtD3 VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2、3和4分别是PhtD3 VH的HCDRl、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是PhtD3 VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6、7和8分别是PhtD3 VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是PhtD8 VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10、11和12分别是PhtD8 VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是PhtD8 VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14、15和16分别是PhtD8 VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是PhtD6 VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18、19和20分别是PhtD6 VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21是PhtD6 VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22、23和24分别是PhtD6 VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是PhtD7 VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26、27和28分别是PhtD7 VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29是PhtD7 VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30、31和32分别是PhtD7 VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33是PspA16 VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34、35和36分别是PspA16 VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37是PspA16 VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38、39和40分别是PspA16 VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41是编码PhtD3 VH的核酸序列。
SEQ ID NO：42是编码PhtD3 VL的核酸序列。
SEQ ID NO：43是编码PhtD8 VH的核酸序列。
SEQ ID NO：44是编码PhtD8 VL的核酸序列。
SEQ ID NO：45是编码PhtD6 VH的核酸序列。
SEQ ID NO：46是编码PhtD6 VL的核酸序列。
SEQ ID NO：47是编码PhtD7 VH的核酸序列。
SEQ ID NO：48是编码PhtD7 VL的核酸序列。
SEQ ID NO：49是编码PspA16 VH的核酸序列。
SEQ ID NO：50是编码PspA16 VL的核酸序列。
SEQ ID NO：51-64是引物的核酸序列。
具体实施方式
本文公开了特异性结合肺炎链球菌如组氨酸三聚体蛋白(PhtD)和肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的单克隆抗体。PhtD是肺炎链球菌高度保守的表面蛋白，在从儿童侵袭性疾病病例中分离出的菌株中为91％至98％不等(Yun et al.(2015)PLoS One 10：e0134055)。一项针对107株肺炎球菌菌株的研究显示，PhtD在100％的受测血清型中都有表达，而其他研究则发现PhtD广泛存在，但在分离的菌株的子集中却不存在(Rioux et al.(2011)Microbiology 157：335-348；Kawaguchiya et al.(2019)Pathog 8：162；Blumental etal.(2015)PLoS One 10：e0133885；和Rioux et al.(2011)Microbiology 157：336-348)。尽管有数据表明Pht蛋白家族参与了肺炎链球菌与呼吸道上皮细胞的附着，但其功能尚未完全阐明(Plumptre et al.(2013)Infect Immun 2013/07/22.81：3644-3651；和Kallioet al.(2014)InfectImmun 2014/02/03.82：1683-1691)。
PhtD具有免疫原性并能诱导保护性体液免疫，接种PhtD蛋白已被证明可减少定植、败血症和肺炎(Adamou et al.(2001)Infect Immun 69：949-958；Godfroid et al.(2011)Infect Immun 79：238LP-245；和Wizemann et al.(2001)InfectImmun 69：1593-1598)。在小鼠模型中，PhtD也被证明可预防全身性肺炎球菌疾病，用PhtD和脱毒的肺炎球菌溶血素一起免疫恒河猴，可保护动物免受肺炎球菌感染(Adamou et al.(2001)InfectImmun 69：949-958；和et al.(2011)Vaccine 29：5495-5501)。
所有Pht蛋白都具有免疫原性并能诱导保护性体液免疫，接种这些蛋白已被证明可减少定植、败血症和肺炎(Adamou et al.(2001)Infect Immun 69：949-958；Godfroidet al.(2011)Infect Immun 79：238 LP-245；和Wizemann et al.(2001)Infect Immun69：1593-1598)。在小鼠模型中，PhtD已被证明可预防全身性肺炎球菌疾病，用PhtD和脱毒的肺炎球菌溶血素一起免疫恒河猴，可保护动物免受肺炎球菌感染(Adamou et al.(2001)Infect Immun 69：949-958；和et al.(2011)Vaccine 29：5495-5501)。PhtD片段的保护效力也得到了评估，有些相互矛盾的报告显示，N末端和C末端都具有免疫原性和保护性(Plumptre et al.(2013)PLoS One 8：e78916；André et al.(2020)Vaccine 38：4146-4153)。PhtD最近在一项IIb期临床试验中被用作抗原，表明PhtD仍是肺炎球菌疫苗学中值得关注的抗原，不过PhtD是与PCV13一起施用的，因此无法对PhtD与PCV13进行直接比较。已证明PhtD的小鼠单克隆抗体可通过巨噬细胞和补体依赖机制保护小鼠，而PhtD的人多克隆抗体可减少肺炎球菌对肺上皮细胞的粘附，并减少鼠鼻咽部定植(Visan et al.(2018)HumVaccin Immunother 14：489-494)。添加明矾佐剂的PhtD疫苗接种后产生的人多克隆抗体也被证明能保护小鼠免受疾病侵袭(Brookes et al.(2015)Hum Vaccin Immunother 11：1836-1839)。
PspA是肺炎链球菌的另一个重要毒力因子，也是最丰富的表面蛋白之一(Rosenowet al.(1997)Mol Microbiol 25：819-829)。与PhtD一样，PspA也存在于大多数受检的临床分离株中(Hollingshead et al.(2006)J Med Microbiol 55：215-221)。与完整菌株相比，PspA突变菌株从小鼠血液中清除的速度更快，接种PspA蛋白可保护小鼠免受肺炎球菌感染(Briles et al.1988.Rev Infect Dis 10 Suppl.2：S372-4；Bosarge et al.(2001)Infect Immun 69：5456-5463)。PspA的小鼠mAb已被证明可延长小鼠的存活时间，并提高抗生素治疗的效力(et al.2001.Infect Immun 69：3372-3381)。此外，重组PspA蛋白免疫后从人体内分离出的抗体具有广泛的交叉反应性，可保护小鼠免受异源PspA肺炎球菌感染(Nabors et al.(2000)Vaccine 18：1743-1754；和Briles et al.(2000)J InfectDis 182：1694-1701)。抗PspA的小鼠mAb已被证明可延长小鼠的存活时间，并提高抗生素治疗的效力(/>et al.2001.Infect Immun 69：3372-3381)。此外，重组PspA免疫后从人体内分离出的抗体具有广泛的交叉反应性，并保护小鼠免受异源PspA肺炎球菌感染(Nabors et al.(2000)Vaccine 18：1743-1754；和Briles et al.(2000)J Infect Dis182：1694-1701)。产生PspA的重组伤寒沙门氏菌减毒疫苗载体的临床试验已经完成(NCT01033409)，目前正在进行包含PspA的基于蛋白质的Ia期临床试验(NCT04087460)。
由于PhtD和PspA在各种肺炎球菌血清型中高度保守，因此抗PhtD和PspA的mAb可以预防和/或治疗广谱肺炎球菌血清型引起的疾病。人类mAb有希望成为细菌病原体的治疗剂，因为贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)已获FDA批准用于预防艰难梭菌的复发性感染(Wilcox et al.(2017)N Engl J Med 376：305-317)。然而，尚未分离出针对任何肺炎球菌蛋白抗原的人类mAb。
本文公开了针对PhtD和PspA的人类单克隆抗体。所公开抗体的血清型广度、表位特异性和保护效力也在多种肺炎球菌感染小鼠模型中得到了证实。
I.术语概述
除非另有说明，否则技术术语均按常规用法使用。分子生物学中许多常用术语的定义可参见Krebs et al.(eds.)，Lewin’s genes XII，由Jones&Bartlett Learning出版，2017。如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”既指单数也指复数，除非上下文另有明确说明。例如，术语“抗原”(an antigen)包括单数或复数抗原，可视为等同于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包含”是指“包括”。还应理解的是，除非另有说明，否则核酸或多肽的任何及所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值均为近似值，且仅供描述之用。尽管可以使用许多与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但本文描述了特定的合适方法和材料。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实例只是说明性的，并不具有限制性。为便于查看各种实施方案，特提供以下术语解释：
约：除非上下文另有说明，否则“约”是指参考值的正负5％。例如，“约”100是指95至105。
施用：通过选择的途径将药剂(例如所公开的抗体)引入受试者中。施用可以是局部或全身的。例如，如果选择的途径是血管内，则通过将组合物引入受试者的血管来施用药剂(例如抗体)。示例性施用途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、经皮(例如局部施用)、鼻内、阴道和吸入途径。
氨基酸取代：用不同的氨基酸替换多肽中的一个氨基酸。
抗体和抗原结合片段：特异性结合和识别分析物(抗原)如PhtD或PspA的免疫球蛋白、抗原结合片段或其衍生物。本文使用的术语“抗体”以最广义的含义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗原结合片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。
抗体的非限制性实例包括例如完整的免疫球蛋白以及保持与抗原的结合亲和力的变体和片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过修饰全抗体产生的抗原结合片段或使用DNA重组方法从头合成的抗原结合片段(参见例如Kontermann and Dübel(Eds.)，Antibody Engineering，Vols.1-2，2nd ed.，Springer-Verlag，2010)。
抗体还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异种缀合抗体(heteroconjugate antibodies)(例如双特异性抗体)。
抗体可以有一个或多个结合位点。如果有一个以上的结合位点，则这些结合位点可以彼此相同，或者可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体有两个不同的结合位点。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重链(H)和轻链(L)。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变结构域基因。有两种类型的轻链，即lambda(λ)和kappa(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链都包含恒定区(或恒定结构域)和可变区(或可变结构域)。组合时，重链和轻链可变区特异性结合抗原。
提及“VH”或“VH”是指抗体重链的可变区，包括抗原结合片段，例如Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”是指抗体轻链的可变结构域，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变结构域。
VH和VL含有“框架”区，中间有三个超变区，也称为“互补决定区”或“CDR”(Kabat etal.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thed.，NIH PublicationNo.91-3242，Public Health Service，National Institutes of Health，U.S.Departmentof Health and Human Services，1991)。不同轻链或重链的框架区序列在物种内相对保守。抗体的框架区，即组成性轻链和重链的组合的框架区，用于在三维空间中定位和排列CDR。
CDR主要负责与抗原的表位结合。给定CDR的氨基酸序列边界可通过一系列众所周知的方案中的任何一种容易地确定，所述方案包括Kabat等人(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5thed.，NIH Publication No.91-3242，Public HealthService，National Institutes of Health，U.S.Department of Health and HumanServices，1991；“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等人(“Standard conformations forthe canonical structures of immunoglobulins，”J.Mol.Bio.，273(4)：927-948，1997；“Chothia”编号方案)和Lefranc等人(“IMGT unique numbering for immunoglobulin andT cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains，”Dev.Comp.Immunol.，27(1)：55-77，2003；“IMGT”编号方案)描述的那些。每条链上的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3(从N末端到C末端)，并且通常以特定CDR所在的链来标识。因此，VH CDR3是来自发现该CDR的抗体的VH的CDR3，而VL CDR1是来自发现该CDR的抗体的VL的CDR1。轻链CDR有时被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR有时称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，所公开的抗体包括异源恒定结构域。例如，抗体包括不同于天然恒定结构域的恒定结构域，如包括一个或多个修饰以增加半衰期的恒定结构域。
“单克隆抗体”是从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，也就是说，组成该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，可能的变异抗体除外，例如，含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制剂过程中产生，这种变体一般以较少的量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体只针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”表明抗体是从基本上同质的抗体群体中获得的，而不能理解为要求用任何特定方法生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术制造，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和其他制造单克隆抗体的示例性方法在本文中均有描述。在一些实例中，单克隆抗体是从受试者中分离出来的。单克隆抗体可以具有保守的氨基酸取代，这些取代对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本没有影响。(参见，例如，Greenfield(Ed.)，Antibodies：A Laboratory Manual，2nded.New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，2014。)
“人源化”抗体或抗原结合片段包括人类框架区和一个或多个来自非人类(例如小鼠、大鼠或合成)抗体或抗原结合片段的CDR。提供CDR的非人类抗体或抗原结合片段称为“供体”，提供框架的人类抗体或抗原结合片段称为“受体”。在一个实施方案中，所有CDR都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但如果存在，它们可以与人类免疫球蛋白恒定区基本相同，例如至少约85-90％，如约95％或更多的同一性。因此，除可能的CDR外，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分都与天然人类抗体序列的相应部分基本相同。
“嵌合抗体”是一种抗体，它包括源自两种不同抗体的序列，这两种抗体通常属于不同的物种。在一些实例中，嵌合抗体包括来自一种人类抗体的一个或多个CDR和/或框架区，以及来自另一种人类抗体的CDR和/或框架区。
“全人抗体”或“人类抗体”是指包括来自(或衍生自)人类基因组的序列而不包括来自其他物种的序列的抗体。在一些实施方案中，人类抗体包括来自(或衍生自)人类基因组的CDR、框架区和(如果存在)Fc区。人类抗体可例如通过噬菌体展示或使用转基因动物，使用基于源自人类基因组的序列产生抗体的技术进行鉴定和分离(参见，例如，Barbas etal.Phage display：A Laboratory Manuel.1stEd.New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2004.Print.；Lonberg，Nat.Biotech.，23：1117-1125，2005；Lonenberg，Curr.Opin.Immunol.，20：450-459，2008)。
生物样品：从受试者中获得的样品。生物样品包括用于检测受试者疾病或感染的所有临床样品，包括但不限于细胞、组织和体液，如血液、血液的衍生物和级分(例如血清)、脑脊液；以及活检或手术切除的组织，例如未固定、冷冻或用福尔马林或石蜡固定的组织。在特定的实例中，生物样品从患有、疑似患有或有风险患有肺炎链球菌感染的受试者或患有或疑似患有病毒性呼吸道感染的受试者获得。
双特异性抗体：由两个不同的抗原结合结构域组成的重组分子，其因此可与两个不同的抗原表位结合。双特异性抗体包括两个抗原结合结构域的化学或基因连接的分子。抗原结合结构域可以使用接头连接。抗原结合结构域可以是单克隆抗体、抗原结合片段(例如Fab、scFv)或其组合。双特异性抗体可包括一个或多个恒定结构域，但不一定包括恒定结构域。
足以形成免疫复合物的条件：使抗体或抗原结合片段与其同源表位结合的程度明显高于基本所有其他表位和/或基本上排除与基本所有其他表位结合的条件。足以形成免疫复合物的条件取决于结合反应的形式，通常是免疫测定方案中使用的条件或在体内遇到的条件。参见Greenfield(Ed.)，Antibodies：A Laboratory Manual，2nd ed.New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，2014中有关免疫测定形式和条件的描述。方法中采用的条件是“生理条件”，其包括参考活的哺乳动物或哺乳动物细胞内的典型条件(例如温度、渗透压、pH)。虽然认识到某些器官会受到极端条件的影响，但生物体内和细胞内的环境通常在pH 7左右(例如pH 6.0至pH 8.0，更典型地pH 6.5至7.5)，以水为主要溶剂，温度高于0℃且低于50℃。渗透压在有利于细胞活力和增殖的范围内。
免疫复合物的形成可通过常规方法检测，例如免疫组织化学(IHC)、免疫沉淀(IP)、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(例如Western印迹)、磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、放射摄影和亲和层析。
缀合物：两个分子连接在一起的复合物，例如通过共价键连接在一起。在一个实施方案中，抗体与效应分子连接；例如，与肺炎链球菌特异性结合的抗体与效应分子(例如可检测标签)共价连接。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗体部分和效应分子之间的反应在两个分子之间产生了共价键，以形成一个分子。抗体和效应分子之间可以任选地包括肽接头(短肽序列)。由于缀合物可由两个具有不同功能的分子(例如抗体和效应分子)制备而成，因此它们有时也被称为“嵌合分子”。
保守变体：“保守”氨基酸取代是不会明显影响或降低蛋白质的功能(例如蛋白质与靶蛋白质相互作用的能力)的取代。例如，与参考抗体序列相比，肺炎链球菌特异性抗体可包括多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个保守取代，并保留对PhtD或PspA的特异性结合活性。术语保守变异还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸。
在编码序列中改变、增加或缺失单个氨基酸或较小百分比的氨基酸(例如少于5％，在一些实施方案中少于1％)的单个取代、缺失或添加是保守变异，其中的改变导致氨基酸被化学性质相似的氨基酸取代。
以下六组氨基酸是被认为是相互保守取代的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
非保守取代是降低抗体活性或功能的取代，例如降低与PhtD或PspA特异性结合的能力。例如，如果一个氨基酸残基对蛋白质的功能至关重要，那么即使是保守取代也可能会破坏其活性。因此，保守取代不会改变目的蛋白质的基本功能。
接触：直接物理结合的放置；包括固态和液态形式，可在体内或体外进行。接触包括一种分子与另一种分子之间的接触，例如一种多肽(例如抗原)表面的氨基酸与另一种多肽(例如抗体)的接触。接触还可以包括与细胞接触，例如通过将抗体与细胞直接物理结合。
对照：参考标准。在一些实施方案中，对照为阴性对照，例如从未感染肺炎链球菌的健康患者中获得的样品。在其他实施方案中，对照是阳性对照，例如从诊断感染肺炎链球菌的患者中获得的组织样品。在另一些实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值的范围(例如先前检测过的对照样品，如一组已知预后或结果的患者，或一组代表基线或正常值的样品)。
检测样品与对照之间的差异可以是增加，或相反是减少。差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学上的显著差异。在一些实例中，差异是相对于对照至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％或至少约500％的增加或减少。
简并变体：在本公开的上下文中，“简并变体”是指编码多肽(例如抗体重链或轻链)的多核苷酸，它包括因遗传密码而简并的序列。有20种天然氨基酸，其中大多数由一个以上的密码子指定。因此，只要核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列不变，那么编码肽的所有简并核苷酸序列都包括在内。
可检测标志物：可检测分子(也称标签)，其直接或间接与第二分子(例如抗体)缀合，以便于检测第二分子。例如，可检测标志物可通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(例如CT扫描、MRI、超声波、光导纤维镜检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标志物的具体非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，Green和Sambrook(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4thed.，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2012)以及Ausubel等人(编辑)(Current Protocols in MolecularBiology，New York：John Wiley and Sons，包括补充材料，2017)讨论了使用可检测标志物的方法以及关于选择适合各种目的的可检测标志物的指导。
检测：鉴定某物的存在性、存在或事实。
有效量：特定物质的数量，足以使施用该物质的受试者达到预期效果。例如，这可以是抑制肺炎链球菌感染(例如肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A感染)、可测量地改变此类感染的外在症状或降低继发感染风险所需的量。
在一个实例中，所需的反应是抑制、减少或预防肺炎链球菌感染。肺炎链球菌感染不一定要完全消除、减少或预防才说明方法有效。
在一些实施方案中，施用有效量的公开抗体或抗原结合片段可减少或抑制希望量的肺炎链球菌感染(例如，以滴度、感染肺炎链球菌的受试者数量或百分比或受感染受试者存活时间的增加或与感染相关的症状的减轻来衡量)，例如与合适的对照相比减少或抑制至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、甚至至少100％(消除或预防可检测到的感染)。
向受试者施用特异性结合PhtD或PspA的抗体或抗原结合片段以抑制感染的有效量会因与受试者相关的一些因素而变化，例如受试者的总体健康状况和/或体重。有效量可通过改变剂量和测量所产生的反应来确定，例如病原体负荷的减少。有效量也可通过各种体外、体内或原位免疫测定法确定。
有效量包括与之前或之后的施用相结合以达到有效反应的部分剂量。例如，在持续数天或数周的疗程中，有效量的药剂可以以单剂量或多个剂量施用，例如每天。然而，有效量可取决于接受治疗的受试者、被治疗的病况的严重程度和类型以及施用方式。药剂的单位剂型可以按有效量或有效量的倍数包装，例如，包装在具有无菌组分的小瓶(例如，具有可穿刺的盖子)或注射器中。
效应分子：旨在具有或产生预期效果的分子；例如，对效应分子靶向的细胞产生预期效果，或可检测标志物。效应分子可包括例如多肽和小分子。一些效应分子可能具有或产生不止一种预期效果。
表位：抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，使得它们可引起特定的免疫反应，例如，表位是B和/或T细胞对其产生应答的抗原区域。抗体可与特定的抗原表位结合，例如肺炎链球菌表面蛋白上的表位，如PhtD或PspA的表位。
表达：核酸序列的转录或翻译。例如，当编码核酸序列(例如基因)的DNA被转录为RNA或RNA片段(其在一些实例中加工成为mRNA)时，该编码核酸序列(例如基因)就可以表达。编码核酸序列(例如基因)也可在其mRNA翻译成氨基酸序列(例如蛋白质或蛋白质片段)时表达。在特定的实例中，异源基因在转录成RNA时表达。在另一个实例中，异源基因在其RNA翻译成氨基酸序列时表达。表达调控可包括对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(例如mRNA)降解的控制，或通过特定蛋白质分子产生后的活化、失活、区室化或降解。
表达控制序列：用于调节与其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和翻译(视情况而定)时，表达控制序列与该核酸序列可操作地连接。因此，表达控制序列可包括适当的启动子、增强子、转录终止子、编码蛋白质的基因前的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译以及终止密码子。术语“控制序列”旨在至少包括其存在可影响表达的组分，也可包括其存在是有利的其他组分，例如引导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。
表达载体：包含重组多核苷酸的载体，其包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；其他用于表达的元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体的非限制性实例包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸质粒或包含在脂质体中的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
多核苷酸可插入表达载体，所述表达载体含有启动子序列，可促进宿主有效转录插入的基因序列。表达载体通常包含复制源、启动子以及可对转化细胞进行表型选择的特定核酸序列。
Fc区：抗体的恒定区，不包括第一重链恒定结构域。Fc区一般指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定结构域，以及IgE和IgM的最后三个重链恒定结构域。Fc区还可包括这些结构域N末端的部分或全部柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc区可以包括或不包括尾部，并且可以被或不被J链结合。对于IgG，Fc区通常被理解为包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及任选地Cγ1和Cγ2之间的铰链的下半部分。尽管Fc区的边界可能有所不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为包括C226或P230至Fc羧基末端的残基，其中编号是根据Kabat进行的。对于IgA，Fc区包括免疫球蛋白结构域Cα2和Cα3以及Cα1和Cα2之间的铰链的下半部分。
异源的：来源于不同的遗传源。与细胞异源的核酸分子来源于表达该核酸分子的细胞以外的遗传源。在一个具体的非限制性实例中，编码蛋白质(例如scFv)的异源核酸分子在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达。在细胞或生物体中引入异源核酸分子的方法是本领域众所周知的，例如用核酸转化，包括电穿孔、脂质转染、粒子枪加速和同源重组。
宿主细胞：可在其中繁殖载体并表达其DNA的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，由于在复制过程中可能会发生突变，因此所有后代可能与亲代细胞并不相同。不过，在使用术语“宿主细胞”时，此类后代也包括在内。
IgG：属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别或同种型的多肽。在人类中，该类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
免疫复合物：抗体或抗原结合片段(例如scFv)与可溶性抗原结合形成免疫复合物。免疫复合物的形成可通过常规方法检测，如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(例如Western印迹)、磁共振成像、CT扫描、放射摄影和亲和层析。
抑制或治疗疾病：抑制疾病或病况的全面发展，例如，在有肺炎链球菌感染等疾病风险的受试者中。“治疗”是指在疾病或病理状态开始发展后，改善其体征或症状的治疗干预。术语“改善”，就疾病或病理状况而言，是指治疗的任何可观察到的有益效果。抑制疾病可包括预防或降低疾病的风险，例如预防或降低细菌感染的风险，如预防或降低肺炎链球菌感染的风险。例如，有益效果可以通过易感受试者疾病的临床症状的延迟出现、疾病的部分或全部临床症状的严重程度的降低、疾病进展的减缓、细菌负荷的减少、受试者整体健康状况或健康的改善或特定疾病特有的其他参数来证明。“预防性”治疗是指对没有表现出疾病症状或仅表现出早期症状的受试者进行的治疗，目的是降低发生病变的风险。
术语“减轻”是一个相对术语，如果在施用药剂后疾病或病况在数量上减轻，或如果与参照药剂相比，在施用药剂后疾病或病况减轻，则该药剂可减轻疾病或病况。同样，术语“预防”并不一定意味着药剂能完全消除疾病或病况，只要疾病或病况的至少一种特征被消除即可。因此，减轻或预防感染的组合物可以但不一定完全消除这种感染，只要感染明显减少，例如与在没有药剂的情况下或与参考药剂相比，减少至少约50％，例如减少至少约70％，或约80％，或甚至减少约90％的感染。
分离的：在生物组分天然存在的生物体细胞中与其他生物组分(即其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本分离、分开生产或纯化的生物组分(例如核酸、肽、蛋白质或蛋白质复合物，如抗体)。因此，分离的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。分离的核酸、肽或蛋白质(例如抗体)的纯度可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
接头：可用于将两个分子连接成一个连续的分子的双功能分子，例如，将可检测标志物与抗体连接起来。肽接头的非限制性实例包括甘氨酸-丝氨酸接头。
术语“缀合”、“相连”、“结合”或“连接”可指将两个分子连接成一个连续的分子；例如，将两个多肽连接成一个连续的多肽，或将效应分子或可检测标志物放射性核素或其他分子共价连接到多肽如scFv上。连接可以通过化学或重组方式。“化学方式”是指抗体部分和效应分子之间发生反应，使两个分子之间形成共价键，以形成一个分子。
核酸(分子或序列)：脱氧核苷酸或核糖核苷酸聚合物或其组合，包括但不限于cDNA、mRNA、基因组DNA和合成(例如化学合成)DNA或RNA。核酸可以是双链(ds)或单链(ss)的。如果是单链的，则核酸可以是有义链或反义链。核酸可以包括天然核苷酸(例如A、T/U、C和G)，并且可以包括天然核苷酸的类似物，例如标记的核苷酸。
“cDNA”是指与mRNA互补或相同的DNA，可以是单链或双链形式。
“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，在生物过程中作为合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译能在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，那么该基因编码蛋白质。基因或cDNA的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常以序列表的形式提供)和非编码链(用作转录模板)均可称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有相互为简并形式且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子(例如CMV启动子)影响编码序列的转录或表达，则该启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，如果需要在同一阅读框内连接两个蛋白质编码区。
药学上可接受的载体：使用的药学上可接受的载体(carriers(是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy，22nded.，London，UK：Pharmaceutical Press，2013描述了适用于所公开药剂的药物递送的组合物和制剂。
一般来说，载体的性质取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，其包括药学上和生理学上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为运载体(vehicle)。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、添加的防腐剂(例如非天然防腐剂)、pH缓冲剂等，如乙酸钠或山梨醇单月桂酸酯。在特定的实例中，药学上可接受的载体是无菌的，适合例如通过注射方式向受试者肠胃外施用。在一些实施方案中，活性剂和药学上可接受的载体以单位剂型提供，如丸剂或以小瓶中的选定数量提供。单位剂型可包括一个剂量或多个剂量(例如，以小瓶的形式，可选择性地从小瓶中分装药剂的计量剂量)。
肺炎球菌疾病：由肺炎链球菌感染引起的疾病。侵袭性肺炎球菌疾病是一种严重的病况，通常需要住院治疗，并可能致命。严重的疾病表现包括肺炎球菌肺炎、败血症和/或脑膜炎。肺炎球菌肺炎的常见症状包括发烧、咳嗽、气短和胸痛。肺炎球菌脑膜炎的症状包括颈部僵硬、发烧、意识模糊、定向障碍和昏迷。肺炎球菌败血症的症状与肺炎和脑膜炎的症状相似，但包括发冷、血压下降和严重的器官功能障碍。某些慢性病况会导致患者患侵袭性肺炎球菌疾病，如糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒。其他风险因素还包括病毒性呼吸道感染、年龄和既往病毒性呼吸道感染。2岁以下的儿童和65岁以上的成人更容易患肺炎球菌疾病。
尽管疫苗接种已在发达国家普及，但肺炎球菌感染仍占成人肺炎的30％，死亡率高达11-40％。(Bridy-Pappas et al.(2005)Pharmacotherapy 25：1193-212)。此外，在世界上儿童死亡率较高的地区，肺炎球菌肺炎是导致20-50％儿童死亡的原因(Williams etal.(2002)Lancet Infect Dis 2：25-32)。
肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)：PhtD是肺炎链球菌保守表面蛋白群中的成员，该蛋白群还包括PhtA、PhtB和PhtC，所有这些蛋白都具有组氨酸三聚体基序(Adamou etal.(2001)Infect Immun 69：949-958)。这些蛋白彼此的序列同源性很高，PhtB和PhtD具有87％的序列同源性(Rioux et al.(2011)Microbiology 157：335-348)。PhtD高度保守，在从儿童侵袭性疾病病例中分离出的菌株中，PhtD在91-98％不等(Yun et al.(2015)PLoSOne 10：e0134055)。一项对107株肺炎球菌菌株的研究显示，PhtD在100％的测试血清型中都有表达，而其他研究则发现PhtD广泛存在，但在分离出的菌株亚组中却不存在(Rioux etal.(2011)Microbiology 157：335-348；Kawaguchiya et al.(2019)Pathog 8：162；Blumental et al.(2015)PLoS One 10：e0133885；和Rioux et al.(2011)Microbiology157：336-348)。尽管有数据表明Pht蛋白家族与肺炎链球菌附着于呼吸道上皮细胞有关，但其功能尚未完全阐明(Plumptre et al.(2013)Infect Immun 2013/07/22.81：3644-3651；Kallio et al.(2014)Infect Immun 2014/02/03.82：1683-1691)。此外，PhtD的第一个组氨酸三聚体基序已被证明对锌的获得和细菌的稳态很重要(Eijkelkamp et al.(2016)Infect Immun 84：407 LP-415)。已确定了与Zn2+结合的第三个组氨酸三聚体基序的晶体结构，以及PhtD的N末端片段的溶液NMR结构(Luo et al.(2018)FEBS Lett 592：2341-2350)。PhtD的示例性氨基酸和核酸序列可参见2016年7月14日的登录号AF318955.1，其通过引用的方式并入本文。
肺炎球菌表面蛋白A(PspA)：PspA是另一种疫苗抗原，是肺炎链球菌的重要毒力因子，并且是最丰富的表面蛋白之一(Rosenow et al.(1997)Mol Microbiol 25：819-829)。与PhtD一样，PspA也发现于大多数受检的临床分离株中(Hollingshead et al.(2006)JMed Microbiol 55：215-221)。与完整的菌株相比，PspA突变菌株从小鼠血液中清除的速度更快，接种PspA可保护小鼠免受肺炎球菌感染(Briles et al.1988.Rev Infect Dis 10Suppl.2：S372-4；Bosarge et al.(2001)Infect Immun 69：5456-5463)。与PhtD相比，PspA的保守性较低，PspA可分为三个同一性大于55％的家族和六个同一性大于75％的进化枝(Hollingshead et al.(2000)Infect Immun 68：5889-5900)。PspA有四个不同的结构域，包括α-螺旋区、富脯氨酸区、胆碱结合重复结构域和胞质尾区，其中富脯氨酸区在不同进化枝间高度保守，而N末端的α-螺旋区变化较大(Khan and Jan(2017)Front Microbiol 8：742；Ren et al.(2004)Infect Immun 72：114-122；Mukerji et al.2012.J Immunol 189：5327-5335；和Tu et al.(1999)Infect Immun 67：4720 LP-4724)。已证明PspA可抑制补体沉积，并显示出与人类乳铁蛋白结合的特异性，但这种结合的重要性尚不清楚。已经确定了PspA的乳铁蛋白结合结构域与人乳铁蛋白N末端区域复合的X射线晶体结构(Senkovich etal.(2007)J Mol Biol 370：701-713)。PspA的示例性氨基酸和核酸序列可参见2016年7月24日的登录号AF490268.1，其通过引用的方式并入本文。
多肽：一种聚合物，其单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体，优选L-异构体。本文使用的术语“多肽”或“蛋白质”意在涵盖任何氨基酸序列，并包括修饰的序列，例如糖蛋白。多肽既包括天然存在的蛋白质，也包括重组或合成产生的蛋白质。多肽具有氨基末端(N末端)和羧基末端。在一些实施方案中，多肽是所公开的抗体或其片段。
纯化：术语“纯化”并不要求绝对纯度；相反，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽制剂是其中的肽或蛋白质(例如抗体)比细胞内天然环境中的肽或蛋白质更富集的制剂。在一个实施方案中，纯化制剂，使得蛋白质或肽占制剂中肽或蛋白质总含量的至少50％。
重组的：重组核酸是具有非天然存在的序列或具有由两个原本分离的序列片段人工组合而成的序列的核酸。这种人工组合可以通过化学合成实现，或更常见的是通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术实现。重组蛋白是具有非天然存在的序列或具有由两个原本分离的序列片段人工组合而成的序列的蛋白质。在一些实施方案中，重组蛋白由异源(例如重组)核酸编码，该核酸已被引入宿主细胞，例如细菌或真核细胞。例如，核酸可以引入表达载体，该载体具有能够表达由引入的核酸编码的蛋白质的信号，或者核酸可以整合到宿主细胞染色体中。
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2：SARS-CoV-2又称2019新型冠状病毒，是p冠状病毒属的正义单链RNA病毒，已成为严重急性呼吸道感染的高致命性病因。SARS-CoV-2感染的症状包括发烧和呼吸道疾病，例如干咳和呼吸急促。严重感染病例可发展为重症肺炎、多器官衰竭和死亡。从暴露到出现症状大约需要2到14天。
检测病毒感染的标准方法可用于检测SARS-CoV-2感染，包括但不限于评估患者的症状和背景以及基因检测，例如逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)。检测可在患者样品如呼吸道样品或血液样品上进行。
序列同一性：两个或多个核酸序列或两个或多个氨基酸序列之间的同一性用序列之间的同一性百分比表示。序列同一性可以用同一性百分比来衡量；百分比越高，序列同一性越高。特异性结合靶抗原的抗体的VL或VH的同源物和变体的典型特征是具有至少约75％的序列同一性，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，该同一性是与目的氨基酸序列进行全长比对来计算的。
任何合适的方法都可用于序列比对，以进行比较。以下描述了程序和比对算法的非限制性实例：Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2(4)：482-489，1981；；Needlemanand Wunsch，J.Mol.Biol.48(3)：443-453，1970；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(8)：2444-2448，1988；Higgins and Sharp，Gene，73(1)：237-244，1988；Higgins and Sharp，Bioinformatics，5(2)：151-3，1989；Corpet，NucleicAcids Res.16(22)：10881-10890，1988；Huang et al.Bioinformatics，8(2)：155-165，1992；和Pearson，Methods Mol.Biol.24：307-331，1994.，Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990，展示了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990)可从多个来源获得，包括美国国家生物信息中心(National Cemer for BiologicalInformation)和互联网，可与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx配合使用。Blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。更多信息请访问NCBI网站。
一般来说，一旦对两个序列进行了比对，就可以通过计算两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定匹配数。两个序列之间的序列同一性百分比是通过将匹配数除以鉴定序列中所示序列的长度，或除以一个衔接长度(例如来自鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将所得值乘以100来确定的。
特异性结合：在指抗体或抗原结合片段时，是指一种结合反应，它能确定在异质蛋白质和其他生物品群体存在下是否存在靶蛋白质。因此，在指定条件下，抗体优先与特定的靶蛋白、肽或多糖(例如病原体表面上存在的抗原，如PhtD或PspA)结合，而不会与样品或受试者中存在的其他蛋白大量结合。特异性结合可通过标准方法确定。参见Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Publications，NewYork(2013)有关可用于确定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述。
关于抗体-抗原复合物，抗原和抗体的特异性结合的KD小于约10-7摩尔，例如小于约10-8摩尔、10-9或甚至小于约10-10摩尔。KD是指给定相互作用(例如多肽配体相互作用或抗体抗原相互作用)的解离常数。例如，对于抗体或抗原结合片段与抗原的双分子相互作用来说，KD是双分子相互作用中各组分的浓度除以复合物的浓度。
与PhtD或PspA上的表位特异性结合的抗体是与附着有蛋白质的PhtD或PspA基底或生物样品中的蛋白质有实质性结合的抗体。当然，认识到抗体与非靶标之间可能会发生一定程度的非特异性相互作用。与缺乏表位的蛋白质或细胞或组织相比，与包括该表位的蛋白质或表达靶表位的细胞或组织的特异性结合通常会导致结合的抗体的量(单位时间内)增加2倍以上，例如5倍以上、10倍以上或100倍以上。在这种条件下与蛋白质特异性结合需要选择对特定蛋白质具有特异性的抗体。有多种免疫测定形式适合用于选择对特定蛋白质具有特异性免疫反应的抗体或其他配体。例如，固相ELISA免疫测定法通常用于选择对蛋白质具有特异性免疫反应的单克隆抗体。
肺炎链球菌：一种常见于上呼吸道的革兰氏阳性兼性厌氧菌。肺炎球菌携带在活动性感染之前。在幼儿中，肺炎链球菌的携带率可高达40-60％。定植通常是无症状的；但是，肺炎链球菌通常会在流感等原发性病毒感染后迅速传播，引起肺炎和侵袭性肺炎球菌疾病。目前，有至少100种已知的血清型，其中大多数可导致肺炎球菌疾病，包括血清型3、血清型4或血清型19A。
肺炎是由肺炎链球菌引起的最常见疾病。症状包括发烧和发冷、咳嗽、呼吸急促、呼吸困难和胸痛。老年人还会出现意识模糊和警觉性低。肺炎链球菌还可引起肺炎球菌脑膜炎，它是覆盖大脑和脊髓的组织受到感染。症状包括颈部僵硬、发烧、头痛、意识模糊和畏光。败血症也可由肺炎链球菌引起；败血症可导致组织损伤、器官衰竭和死亡。症状包括意识模糊、呼吸急促、心率加快、疼痛或不适、多汗、发烧、颤抖或感觉寒冷。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，一种包括人类和非人类哺乳动物的类别，如非人类灵长类动物、猪、骆驼、蝙蝠、绵羊、牛、狗、猫、啮齿动物等。在一个实例中，受试者是人类。在特定的实例中，受试者是人类。在另外的实例中，选择需要抑制肺炎链球菌感染的受试者。例如，受试者要么未感染肺炎链球菌并面临感染风险，要么已感染并需要治疗。
转化的：转化的细胞是通过分子生物学技术引入核酸分子的细胞。如本文所用，术语转化的等(例如转化、转染、转导等)包括将核酸分子引入细胞的所有技术，包括用病毒载体转导、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速引入DNA。
载体：包含核酸分子(例如DNA或RNA分子)的实体，带有启动子，所述启动子与目的蛋白质的编码序列可操作地连接，并能表达编码序列。非限制性实例包括裸露的或包装的(脂质和/或蛋白质)DNA、裸露的或包装的RNA、可能无复制能力的病毒或细菌或其他微生物的亚组分或可能有复制能力的病毒或细菌或其他微生物的亚组分。载体有时称为构建体。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包括一个或多个可选择标志物基因和其他遗传元件。病毒载体是重组核酸载体，其具有来源于一个或多个病毒的至少一些核酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包括编码与肺炎链球菌特异性结合的所公开的抗体或抗原结合片段的核酸分子。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体。
在足以......的条件下：用于描述允许预期活性的任何环境的短语。
II.一些实施方案的描述
提供了特异性结合肺炎链球菌的分离的单克隆抗体和抗原结合片段。抗体和抗原结合片段可以是全人源的。在一些实施方案中，所公开的抗体可抑制肺炎链球菌的体内感染，并可在肺炎链球菌(例如但不限于肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A)感染之前或之后施用。还提供了包括这些抗体的可变结构域的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。此外，本文公开了包含抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段和药学上可接受的载体的组合物。还提供了编码抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段、可变结构域的核酸，以及包含这些核酸的表达载体(例如腺相关病毒(AAV)病毒载体)。所述抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段、核酸分子、宿主细胞和组合物可用于研究、诊断、治疗和预防目的。例如，所公开的抗体和抗原结合片段可用于诊断患有肺炎链球菌感染的受试者，或可施用以抑制受试者的肺炎链球菌感染。
A.特异性结合PhtD.或PspA的单克隆抗体及其抗原结合片段
下面讨论的单克隆抗体是指包括重链和/或轻链可变结构域的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，这些结构域包括CDR1、CDR2和/或CDR3，参照IMGT编号方案(除非上下文另有说明)。各种CDR编号方案(例如Kabat、Chothia或IMGT编号方案)可用于确定CDR位置。在序列表中提供了所公开的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列和CDR(根据IMGT编号方案)，但这些只是示例性的。
在一些实施方案中，提供了一种单克隆抗体，它包含本文所述任何一种抗体的重链和轻链CDR。在一些实施方案中，提供了一种单克隆抗体，它包含本文所述任何一种抗体的重链和轻链可变区。
表1.抗体的IMGT CDR和SEQ ID NO
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a.单克隆抗体PhtD3
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD3抗体为基础或来源于PhtD3抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。
单克隆抗体PhtD3靶向PhtD的N末端部分，PhtD是肺炎链球菌的保守表面蛋白。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD3 mAb可延长感染肺炎球菌血清型3的小鼠的存活时间，并在鼻内和静脉感染模型中对血清型4提供预防性保护。此外，在肺炎球菌感染24小时后施用的血清型3治疗模型中，mAb PhtD3具有保护作用。
在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含PhtD3抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别独立地包含与如SEQ ID NO：1和5所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在进一步的实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：2、3和4所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，和/或包含分别如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：2、3和4所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，包含分别如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中VH包括与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中VL包括与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：5具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。在该实施方案中，因序列识别而产生的变异位于CDR之外。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含如SEQ ID NO：1和5所示的氨基酸序列。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。
b.单克隆抗体PhtD8
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD8抗体为基础或来源于PhtD8抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。
单克隆抗体PhtD8靶向PhtD的C末端部分，PhtD是肺炎链球菌的保守表面蛋白。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD8在多种不相关的肺炎球菌血清型中具有广泛的反应性，并且PhtD8 mAb延长了感染肺炎球菌血清型3的小鼠的存活时间。
在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含PhtD8抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别独立地包含与如SEQ ID NO：9和13所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在进一步的实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，和/或包含分别如SEQ ID NO：14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，包含分别如SEQ ID NO：14、15和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中VH包括与SEQ ID NO：9具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：9具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中VL包括与SEQ ID NO：13具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：13具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。在该实施方案中，因序列识别而产生的变异位于CDR之外。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含如SEQ ID NO：9和13所示的氨基酸序列。在一些实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。
c.单克隆抗体PhtD6
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD6抗体为基础或来源于PhtD6抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。
单克隆抗体PhtD6靶向PhtD的N末端部分，PhtD是肺炎链球菌的保守表面蛋白。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD6在多种不相关的肺炎球菌血清型中具有广泛的反应性，并且对固定细菌的亲和力高于PhtD8。PhtD6也表现出与PhtD3的中等结合竞争。与PhtD8相比，mAb PhtD3和PhtD6的N末端特异性与对全细胞细菌的更高的结合相关，这是一个惊人的观察结果，因为预测该蛋白质的N末端区域附着在细菌表面，使C末端一半更多暴露于表面。
在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含PhtD6抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别独立地包含与如SEQ ID NO：17和21所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在进一步的实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：18、19和20所示的HCDRl、HCDR2和HCDR3的VH，和/或包含分别如SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：18、19和20所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，包含分别如SEQ ID NO：22、23和24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中VH包括与SEQ ID NO：17具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：17具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中VL包括与SEQ ID NO：21具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：21具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。在该实施方案中，因序列识别而产生的变异位于CDR之外。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，分别包含如SEQ ID NO：17和21所示的氨基酸序列，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。
d.单克隆抗体PhtD7
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD7抗体为基础或来源于PhtD7抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。
单克隆抗体PhtD7似乎靶向依赖于氨基酸341-838的独特构象表位，但这种mAb不结合PhtD的341-647或645-838片段。正如实施例中进一步讨论的那样，PhtD7在多种不相关的肺炎球菌血清型中具有广泛的反应性，并且对固定化细菌的亲和力高于对PhtD8的亲和力。此外，在肺炎链球菌感染的小鼠模型中，PhtD7 mAb具有保护作用并能提高存活率。
在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含PhtD7抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别独立地包含与如SEQ ID NO：25和29所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在进一步的实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：26、27和28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，和/或包含分别如SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：26、27和28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，包含分别如SEQ ID NO：30、31和32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中VH包括与SEQ ID NO：25具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：25具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中VL包括与SEQ ID NO：29具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：29具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。在该实施方案中，因序列识别而产生的变异位于CDR之外。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含如SEQ ID NO：25和29所示的氨基酸序列。在一些实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PhtD。
在一些实施方案中，所公开的抗体抑制肺炎链球菌感染。
e.单克隆抗体PspA16
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段以PhtD8抗体为基础或来源于PhtD8抗体，并与肺炎链球菌特异性结合。
单克隆抗体PspA16靶向PspA的N末端区段，PspA是肺炎链球菌最丰富的表面蛋白之一。正如实施例中进一步讨论的那样，PspA16对重组PspA有很高的亲和力，并根据与氨基酸片段1-438和1-512的阳性结合以及与247-512、436-725和247-725片段的阴性结合，与N末端片段1-247结合。发现PspA16结合肺炎链球菌血清型19A和血清型菌株3WU。由于PspA16与PspA的最可变区域结合，因此与不同血清型的结合减少是意料之中的。此外，如实施例所示，在肺炎链球菌感染的小鼠模型中，PspA16 mAb具有保护作用并能提高存活率。
在一些实例中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，分别包含PspA16抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3(例如，根据IMGT、Kabat或Chothia)，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PspA。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含与如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别独立地包含与如SEQ ID NO：33和37所示的氨基酸序列具有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的氨基酸序列。在一些实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PspA。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：34、35和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，和/或包含分别如SEQ ID NO：38、39和40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PspA。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含分别如SEQ ID NO：34、35和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的Vn，包含分别如SEQ ID NO：38、39和40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中VH包括与SEQ ID NO：33具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：33具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其中VL包括与SEQ ID NO：37具有至少90％同一性，例如与SEQ ID NO：37具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌特异性结合。在一些实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PspA。在该实施方案中，因序列识别而产生的变异位于CDR之外。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的VH，并与肺炎链球菌特异性结合。在更多的实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的VL，并与肺炎链球菌特异性结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL并与肺炎链球菌特异性结合，所述VH和VL分别包含如SEQ ID NO：33和37所示的氨基酸序列。在一些实例中，所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎链球菌表面蛋白PspA。
在一些实施方案中，所公开的抗体可抑制肺炎链球菌感染。
f.其他抗体
在一些实例中，与目的表位结合的抗体可以根据它们在结合测定中与本文提供的抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性地抑制其结合)的能力来鉴定。在其他实例中，与目的表位结合的抗体可以根据它们在结合测定中与本文提供的一种或多种抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性地抑制其结合)的能力来鉴定。
与所公开抗体结合的PhtD或PspA的相同表位结合的人类抗体可以用任何合适的方法产生。例如，可以通过向转基因动物施用免疫原来制备这种抗体，转基因动物经过改造，可以在抗原挑战下产生完整的人类抗体或带有人类可变区的完整抗体。这种动物通常含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座，这些基因座取代了内源性免疫球蛋白基因座，或以染色体外方式存在，或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。有关从转基因动物中获取人类抗体的方法，请参阅Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。另见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述了技术；美国专利号7,041,870，其描述了K-M/>技术，和美国专利申请公开号US 2007/0061900，其描述技术)。由这些动物产生的完整抗体中的人类可变区可以进一步修饰，例如，通过与不同的人类恒定区结合。
还可以通过基于杂交瘤的方法制造与相同表位结合的其他人类抗体。已经描述了用于生产人类单克隆抗体的人类骨髓瘤细胞系和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boemer et al.，J.Immunol.，147：86(1991)。)Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)还描述了通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体。其他方法包括那些描述于例如美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人类IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的方法。Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)和Vollmers and Brandlein，Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)还描述了人类杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)。人类抗体也可以通过从人类衍生的噬菌体展示文库中分离出Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可将这些可变结构域序列与所需的人类恒定结构域相结合。
还可以通过筛选具有所需结合特性的抗体组合文库，分离出与相同表位特异性结合的抗体和抗原结合片段。例如，通过生成噬菌体展示文库并筛选出具有所需结合特性的抗体的此类文库。此类方法在例如Hoogenboom et al.，Methods in Molecular Biology178：1-37(O'Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2001)中进行了综述，并在例如McCafferty et al.，Nature 348：552-554；Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks and Bradbury，inMethods in Molecular Biology 248：161-175(Lo，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2003)；Sidhuetal.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中进一步描述。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)描述进行抗原结合噬菌体的筛选。噬菌体通常会显示抗体片段，既可以是单链Fv(scFv)片段，也可以是Fab片段。来自免疫源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。备选地，如Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)中描述的那样，可以克隆天然库(例如从人类中)，以提供针对各种非自身抗原和自身抗原的单一抗体源，而无需任何免疫。最后，如HoogenboomandWinter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)中描述的那样，还可以通过从干细胞中克隆未重排的V-基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域，并在体外完成重排，从而合成天然文库。描述人类抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373，以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。竞争性结合测定，类似于下文实施例部分所公开的那些，可用于选择具有所需结合特性的抗体。
2.抗体和抗原结合片段的其他说明
本文公开的抗体或抗体的抗原结合片段可以是人类抗体或其片段。还提供了嵌合抗体。抗体或抗原结合片段可包括任何合适的框架区，例如(但不限于)来自另一来源的人类框架区或优化的框架区。备选地，抗体的重链或轻链中也可包括异源框架区，例如(但不限于)小鼠或猴子框架区。
抗体可以是任何同种型。例如，抗体可以是IgA、IgM或IgG抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。与肺炎链球菌特异性结合的抗体类别可以彼此转换。在一个方面，分离出编码VL或VH的核酸分子，使其不包括分别编码轻链或重链恒定区的任何核酸序列。然后将编码VL或VH的核酸分子可操作性地连接至编码来自不同类别的免疫球蛋白分子的CL或CH的核酸序列。例如，可以使用包含CL或CH链的载体或核酸分子来实现这一点。例如，原本是IgG的特异性结合肺炎链球菌的抗体可以类别转换为IgA。类别转换可用于将一种IgG亚类转换为另一种，例如从IgG1转换为IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实例中，所公开的抗体是抗体的寡聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等。
抗体或抗原结合片段可以衍生或连接到另一种分子(例如另一种肽或蛋白质)。一般来说，对抗体或抗原结合片段进行衍生化使得其与肺炎链球菌(例如PhtD或PspA)的结合不会受到衍生化或标记的不利影响。例如，抗体或抗原结合片段可(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)与一个或多个其他分子实体进行功能连接，所述分子实体如另一种抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、可检测标志物、效应分子或可介导抗体或抗体部分与另一种分子结合的蛋白质或肽(例如链霉亲和素核心区或聚组氨酸标签)。
(a)结合亲和力
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌特异性结合，例如与PhtD或PspA特异性结合，其亲和力(例如以KD测定)不超过1.0x10-8M、不超过5.0x10-8M、不超过1.0x10-9M、不超过5.0x10-9M、不超过1.0x10-10M、不超过5.0x10-10M或不超过1.0x10-11M。KD可例如通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量，用目的抗体的Fab版本与其抗原来进行。在一种测定中，Fab与抗原的溶液结合亲和力是通过使Fab与最小浓度的(125I)标记抗原在未标记抗原的滴定系列存在下达到平衡，然后用抗Fab抗体包被板捕获结合的抗原来测量的(参见，例如，Chen et al.，J.Mol.Biol.293(4)：865-881，1999)。为建立测定条件，多孔板(Thermo Scientific)在50mM碳酸钠(pH 9.6)中涂布5μg/ml的捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)过夜，然后在室温(约23℃)下用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭2至5小时。在非吸附板(NUNC目录#269620)中，将100μM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta et al.，Cancer Res.57(20)：4593-4599，1997中对抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab孵育过夜；不过，孵育可持续更长时间(例如约65小时)，以确保达到平衡。然后，将混合物转移到捕获板上，在室温下孵育(例如一小时)。然后移去溶液，用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20/>洗涤板八次。待板干燥后，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINTTM-20；PerkinElmer)，在TOPCOUNTTM伽玛计数器(PerkinElmer)上对板计数十分钟。选择小于或等于最大结合量的20％的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定。
在另一种测定中，可使用生物层干涉测量法(Biolayer interferometry，BLI)使用表面等离振子共振测定来测量KD，请参阅实施例部分。在其他实施方案中，可使用或/>(BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.)在25℃下，用约10个反应单位(RU)的固定抗原CM5芯片测量KD。简而言之，羧甲基葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)按照供应商的说明用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活。在以5l/min的流速注射前，用pH为4.8的10mM乙酸钠将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，以获得约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃下将两倍系列稀释的Fab(0.78nM至500nM)注射到含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中，流速为约25l/min。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(/>评估软件3.2版)计算出结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)按koff/kon的比值计算。参见，例如，Chen et al.，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过上述表面等离振子共振测定的结合速率(on rate)超过106M-1s-1，则可使用荧光淬灭技术测定结合速率，该技术测定在PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在增加的抗原浓度存在下，25℃下荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如在分光光度计，如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中所测量的。亲和力也可以通过高通量SPR使用Carterra LSA来测量。
(b)多特异性抗体
在一些实施方案中，提供了一种多特异性抗体，如双特异性抗体，它包括特异性结合肺炎链球菌的抗体或抗原结合片段，如本文提供的与PhtD或PspA结合的抗体或抗原结合片段。任何合适的方法都可用于设计和生产多特异性抗体，如交联两种或多种抗体(例如交联特异性结合PhtD的抗体和特异性结合PspA的抗体)、相同类型或不同类型的抗原结合片段(例如scFv)。制造多特异性抗体的示例性方法包括PCT公开号WO2013/163427中所述的方法，该专利通过引用的方式整体并入本文。合适的交联剂的非限制性实例包括异双官能的交联剂，其具有被适当的间隔区(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯)隔开的两个明显的反应性基团，或同双官能的交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。
在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段以及PhtD7、PhtD6、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD7抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在一些实例中，多特异性抗体包括PhtD3抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD6、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在一些实例中，多特异性抗体包括PhtD7抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD7、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，多特异性抗体包括PhtD6抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，多特异性抗体包括PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PhtD8抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD7、PhtD6和PspA16抗体或抗原结合片段中的一种或多种。在一个实例中，多特异性抗体包括PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，多特异性抗体包括PspA16抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，多特异性抗体包括PspA16抗体或抗原结合片段以及PhtD3、PhtD7、PhtD6和PhtD8抗体或抗原结合片段中的一种或多种。
多特异性抗体可以具有任何合适的形式，允许本文提供的抗体或抗原结合片段与肺炎链球菌结合，如与PhtD或PspA结合。双特异性单链抗体可由单个核酸分子编码。双特异性单链抗体的非限制性实例以及构建这种抗体的方法在美国专利号8,076,459、8,017,748、8,007,796、7,919,089、7,820,166、7,635,472、7,575,923、7,435,549、7,332,168、7,323,440、7,235,641、7,229,760、7,112,324、6,723,538中提供。双特异性单链抗体的其他实例可参见PCT申请号WO 99/54440；Mack et al.，J.Immunol.，158(8)：3965-3970，1997；Mack et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92(15)：7021-7025，1995；Kufer et al.，Cancer Immunol.Immunother.，45(3-4)：193-197，1997；et al.，Blood，95(6)：2098-2103，2000；和Brühl et al.，J.Immunol.，166(4)：2420-2426，2001。双特异性Fab-scFv(“bibody”)分子的生产描述于例如Schoonjans et al.(J.Immunol.，165(12)：7050-7057，2000)和Willems et al.(J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed Life Sci.786(1-2)：161-176，2003)中。对于双抗体(bibody)，scFv分子可与VL-CL(L)链或VH-CH1链之一融合，例如，将一个scFv与Fab链的C末端融合以产生双抗体。/>
最外层或N末端可变结构域称为VD1，最内层可变结构域称为VD2；VD2位于C末端CH1或CL的近端。正如Jakob等人在上文所公开的，DVD-免疫球蛋白分子可以大量制造和纯化至均一，具有与传统IgG1相似的药理学特性，并显示出体内效力。任何所公开的单克隆抗体都可以包含在DVD-免疫球蛋白形式中。
(c)抗原结合片段
本公开包括抗原结合片段，如Fab、F(ab’)2和Fv，它们包括重链和VL并特异性结合肺炎链球菌，如PhtD或PspA。这些抗体片段保留了与抗原选择性结合的能力，属于“抗原结合”片段。这类片段的非限制性实例包括：
(1)Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生完整的轻链和一条重链的一部分；
(2)Fab’，抗体分子的片段，可用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，得到完整的轻链和部分重链；
(3)(Fab')2，用胃蛋白酶处理整个抗体得到的抗体片段，无需随后还原；F(ab’)2是两个Fab'片段通过两个二硫键结合在一起的二聚体；
(4)Fv，基因工程片段，包含以两条链表达的VL和VL；和
(5)单链抗体(例如scFv)，定义为含有VH和VL的基因工程分子，所述VH和VL由合适的多肽接头连接成基因融合的单链分子(参见，例如，Ahmad et al.，Clin.Dev.Immunol.，2012，doi：10.1155/2012/980250；Marbry and Snavely，IDrugs，13(8)：543-549，2010)。scFv中VH结构域和VL结构域的分子内取向对所提供的抗体(例如对所提供的多特异性抗体)并不是决定性的。因此，可以使用具有两种可能排列(VH结构域-接头结构域-VL结构域；VL结构域-接头结构域-VH结构域)的scFv。
(6)单链抗体的二聚体(scFV2)，定义为scFV的二聚体。这也被称为“微型抗体”。
可以使用任何合适的方法来生产上述抗原结合片段。非限制性实例在Harlow andLane，Antibodies：A Laboratory Manual，2nd，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，2013中提供。
抗原结合片段可通过对抗体进行蛋白水解或在宿主细胞(例如大肠杆菌细胞)中表达编码所述片段的DNA来制备。抗原结合片段也可以通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体而获得。例如，抗原结合片段可以通过胃蛋白酶酶促裂解抗体来产生，从而得到5S片段，即F(ab')2。使用硫醇还原剂和任选地由二硫键裂解产生的巯基封端基团可进一步裂解该片段，生成3.5S Fab'单价片段。
也可使用其他裂解抗体的方法，如分离重链以形成单价轻重链片段，进一步裂解片段，或使用其他酶促、化学或基因技术，只要片段能与完整抗体识别的抗原结合即可。
(d)变体
在一些实施方案中，提供了本文提供的抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)的氨基酸序列变体。例如，改善抗体或多特异性抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性可能是理想的。抗体的氨基酸序列变体可通过在编码抗体VH结构域和/或VL结构域的核苷酸序列中引入适当的修饰，或通过肽合成来制备。例如，这种修饰包括抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。只要最终构建体具有所需的特性，例如抗原结合，就可以进行缺失、插入和取代的任意组合来获得最终的构建体。
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的变体。取代诱变的目的位点包括CDR和框架区。可将氨基酸取代引入到目的抗体中，并对产物进行所需活性的筛选，如保留/改善抗原结合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC。
变体通常保留正确折叠和稳定VH与VL区域所需的氨基酸残基，并保留残基的电荷特性，以保持分子的低pI和低毒性。可以在VH和VL区域进行氨基酸取代，以提高产量。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VH包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：5中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VL包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在更多的实施方案中，与SEQ ID NO：9中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VH包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：13中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VL包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在进一步的实施方案中，与SEQ ID NO：17中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VH包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：21中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VL包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在另一些实施方案中，与SEQ ID NO：25中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VH包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：29中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VL包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在更多的实施方案中，与SEQ ID NO：33中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VH包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：37中的一个所示的氨基酸序列相比，抗体的VL包含多达10个(例如多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个或多达9个)氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。
在一些实施方案中，可以在一个或多个CDR内发生取代、插入或缺失，只要这种改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中进行不显著降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。在上文提供的变体VH和VL序列的一些实施方案中，每个CDR要么没有改变，要么包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。在上文提供的变体VH和VL序列的一些实施方案中，只有框架残基被修饰，因此CDR没有变化。
为了提高抗体的结合亲和力，可以随机突变VL和VH区段，例如在HCDR3区域或LCDR3区域内，其过程类似于天然免疫反应过程中负责抗体亲和力成熟的体内体细胞突变过程。因此，体外亲和力成熟可以通过使用分别与HCDR3或LCDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区域来实现。在这一过程中，引物在某些位置“掺加”(spiked)了四种核苷酸碱基的随机混合物，这样得到的PCR产物编码VH和VL区段，而这些区段中的VH和/或VL CDR3区域被引入了随机突变。可以对这些随机突变的VH和VL区段进行检测，以确定其与肺炎链球菌的结合亲和力，如确定与PhtD或PspA的结合亲和力。在特定的实例中，VH氨基酸序列是SEQ ID NO：1、9、17、25或33中的一个。在其他实例中，VL氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5、13、21、29或37中的一个。
在一些实施方案中，改变抗体或抗原结合片段以增加或减少抗体或抗原结合片段糖基化的程度。糖基化位点的增加或缺失可通过改变氨基酸序列使一个或多个糖基化位点产生或缺失来实现。
当抗体包含Fc区时，可改变附着其上的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链双触角(biantennary)寡糖，该寡糖一般通过N-连接连接到Fc区CH2结构域的Asn297上。参见，例如，Wright et al.Trends Biotechnol.15(1)：26-32，1997。寡糖可包括各种碳水化合物，如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接到双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一个实施方案中，所提供的变体具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。岩藻糖的量是通过计算相对于连接到Asn 297的所有糖结构(例如复合物结构、杂合体结构和高甘露糖结构)的总和，糖链中Asn297处岩藻糖的平均量来确定的，如通过MALDI-TOF质谱(例如如WO 2008/077546中所述)所测量的。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Ash297也可能位于297位上游或下游约±3个氨基酸，即294位和300位之间。这种岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd)。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki et al.，J.Mol.Biol.，336(5)：1239-1249，2004；Yamane-Ohnuki et al.，Biotechnol.Bioeng.87(5)：614-622，2004。能产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec 13 CHO细胞(Ripka et al.，Arch.Biochem.Biophys.249(2)：533-545，1986；美国专利申请号US 2003/0157108和WO2004/056312，特别是在实施例11中)，以及基因敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki et al.，Biotechnol.Bioeng.，87(5)：614-622，2004；Kanda et al.，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688，2006；和WO2003/085107)。
进一步提供具有二等分(bisected)寡糖的抗体变体，例如，其中连接到抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美国专利号6,602,684(Umana et al.)；和US 2005/0123546(Umana et al.)。还提供了在连接到Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
在一些实施方案中，抗体或多特异性抗体的恒定区包含一个或多个氨基酸取代，以优化抗体的体内半衰期。IgG Abs的血清半衰期受新生儿Fc受体(FcRn)调节。因此，在一些实施方案中，抗体包含增加与FcRn的结合的氨基酸取代。此类取代的非限制性实例包括IgG恒定区T250Q和M428L(参见，例如，Hinton et al.，J Immunol.，176(1)：346-356，2006)；M428L和N434S(“LS”突变，参见，例如，Zalevsky，et al.，Nature Biotechnol.，28(2)：157-159，2010)；N434A(参见，例如，Petkova et al.，Int.Immunol.，18(12)：1759-1769，2006)；T307A、E380A和N434A(参见，例如，Petkova et al.，Int.Immunol.，18(12)：1759-1769，2006)；以及M252Y、S254T和T256E(参见，例如，Dall'Acqua et al.，J.Biol.Chem.，281(33)：23514-23524，2006)处的取代。所公开的抗体和抗原结合片段可以与包含上述任一取代的Fc多肽连接或包括包含上述任一取代的Fc多肽，例如，Fc多肽可以包括M428L和N434S取代。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或多特异性抗体可进一步被修饰以包含另外的非蛋白部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性，在生产中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链的或非支链的。附着在抗体上的聚合物的数量可以不同，如果附着有一种以上的聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可根据如下考虑因素来确定，包括但不限于待改进抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在规定条件下用于应用等。
B.缀合物
与肺炎链球菌如本文公开的PhtD或PspA特异性结合的抗体、抗原结合片段和多特异性抗体(例如双特异性抗体)可与效应分子或可检测标志物等物质缀合。共价和非共价连接方式均可使用。可使用各种效应分子和可检测标志物，包括(但不限于)毒素和放射活性剂，如125I、32P、14C、3H和35S及其他标签、靶部分、酶和配体等。特定效应分子或可检测标志物的选择取决于特定的靶分子或细胞以及所需的生物学效应。
将可检测标志物连接到抗体、抗原结合片段或多特异性抗体上的步骤因效应物的化学结构而异。多肽通常含有多种官能团，如羧基(-COOH)、游离胺基(-NH2)或巯基(-SH)基团，这些官能团可与多肽上的适当官能团反应，从而导致效应分子或可检测标志物的结合。备选地，对抗体、抗原结合片段或多特异性抗体进行衍生化，以暴露或连接另外的活性官能团。衍生化可包括连接任何合适的接头分子。接头既能与抗体或抗原结合片段形成共价键，也能与效应分子或可检测标志物形成共价键。合适的接头包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体、抗原结合片段或多特异性抗体和效应分子或可检测标志物为多肽时，接头可通过其侧链(例如通过与半胱氨酸的二硫键)或α碳，或通过末端氨基酸的氨基和/或羧基与组成氨基酸连接。
鉴于已经报道了大量将各种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标签(例如酶或荧光分子)、毒素和其他物质附着到抗体上的方法，因此可以确定一种合适的方法，用于将给定的物质附着到抗体或抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)上。
抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)可与可检测标志物缀合；例如，可通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微镜或诊断成像技术(例如CT、计算机轴向断层扫描(CAT)、MRI、磁共振断层扫描(MTR)、超声波、光纤检查和腹腔镜检查)检测的可检测标志物。可检测标志物的具体非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶促连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标志物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系荧光粉等。也可以使用生物发光标志物，如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体还可以与用于检测的酶缀合，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶缀合时，可通过添加另外的试剂来检测，所述试剂被酶用来产生可被识别的反应产物。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺会产生彩色反应产物，其可通过视觉检测。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体也可以与生物素缀合，并通过间接测量亲和素或链霉亲和素的结合来检测。值得注意的是，亲和素本身可以与酶或荧光标签缀合。
抗体、抗原结合片段或多特异性抗体可与顺磁剂(例如钆)缀合。顺磁剂如超顺磁性氧化铁也可用作标签。抗体还可以与镧系元素(例如铕和镝)和锰缀合。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体也可以用二级报告物识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)进行标记。
抗体、抗原结合片段或多特异性抗体也可以与放射性标记氨基酸缀合，例如用于诊断目的。例如，放射性标记可用于通过放射摄影、发射光谱或其他诊断技术检测肺炎链球菌。多肽的标签的实例包括但不限于以下放射性同位素：3H、14C、35S、90Y、99mTc、111In、125I、131I。例如，可使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记，可使用光电探测器检测荧光标记物，以检测发射的照度。酶标签通常是通过向酶提供底物并检测酶作用于底物所产生的反应产物来检测的，而比色标签是通过简单地观察有色标签来检测的。
例如，缀合物中每个抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的可检测标志物部分的平均数量范围为从每个抗体或抗原结合片段中有1个到20个部分不等。在一些实施方案中，缀合物中每个抗体或抗原结合片段的效应分子或可检测标志物部分的平均数量范围为约1个至约2个、约1个至约3个、约1个至约8个、约2个至约6个、约3个至约5个、或约3个至约4个。缀合物的负载量(例如，效应分子与抗体的比率)可以通过不同的方式进行控制，例如通过以下方式：(i)限制效应分子-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程化，从而改变半胱氨酸残基的数量和位置，以控制接头-效应分子连接的数量或位置。
C多核苷酸和表达
提供了编码与肺炎链球菌如本文公开的PhtD或PspA特异性结合的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和缀合物的氨基酸序列的核酸分子(例如cDNA或RNA分子，如mRNA)。利用本文提供的氨基酸序列(例如CDR序列以及VH和VL序列)、本领域现有的序列(例如框架区或恒定区序列)以及遗传密码，可以容易地产生编码这些分子的核酸。在一些实施方案中，核酸分子可以编码所公开的抗体或抗原结合片段的VH、VL或VH和VL两者(例如在双顺反子表达载体中)。在一些实施方案中，核酸分子编码scFv。在一些实施方案中，核酸分子可在宿主细胞(例如哺乳动物细胞)中表达，以产生所公开的抗体或抗原结合片段。提供了编码scFv的核酸分子。
遗传密码可用于构建各种功能上等效的核酸序列，如序列不同但编码相同抗体序列的核酸，或编码包括VL和/或VH核酸序列的缀合物或融合蛋白的核酸。
在一个非限制性实例中，分离的核酸分子编码PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体的VH。本文提供了示例性核酸序列。在另一个非限制性实例中，核酸分子编码PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体的VL。在进一步的非限制性实例中，核酸分子可以编码双特异性抗体，如以DVD免疫球蛋白形式。核酸还可以编码scFv。核酸分子还可以编码缀合物。
下文公开了示例性核苷酸序列：
PhtD3 VH(SEQ ID NO：41)
PhtD3 VL(SEQ IDNO：42)
PhtD8 VH(SEQ ID NO：43)
PhtD8 VL(SEQ ID NO：44)
PhtD6 VH(SEQ ID NO：45)
PhtD6VL(SEQ ID NO：46)
PhtD7 VH(SEQ ID NO：47)
PhtD7VL (SEQ ID NO：48)
PspA16 VH(SEQ ID NO：49)
PspA16 VL(SEQ ID NO：50)
还提供了这些核酸序列的简并变体。
编码与肺炎链球菌如PhtD或PspA特异性结合的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和缀合物的核酸分子可以通过任何合适的方法制备，包括例如克隆适当的序列或通过标准方法直接进行化学合成。化学合成可产生单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交或通过使用DNA聚合酶以单链为模板进行聚合，可将其转化为双链DNA。
示例性核酸可通过克隆技术制备。适当的克隆和测序技术的实例可参见例如Green and Sambrook(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，2012)和Ausubel et al.(Eds.)(Current Protocolsin Molecular Biology，New York：John Wiley and Sons，包括增刊)。
核酸也可通过扩增方法制备。扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)和自我维持序列复制系统(3SR)。
核酸分子可在重组工程细胞，如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中表达。抗体、抗原结合片段和缀合物可以表达为包括VH和/或VL的单个蛋白质(根据需要与效应分子或可检测标志物连接)，或者可以表达为融合蛋白。可使用任何合适的方法表达并纯化抗体和抗原结合片段；Al-Rubeai(Ed.)，Antibody Expression and Production，Dordrecht；New York：Springer，2011)中提供了非限制性实例。也可以表达免疫粘附素。因此，在一些实例中，提供了编码VH和VL以及免疫粘附素的核酸。核酸序列可任选地编码前导序列。
为产生scFv，可将编码VH和VL的DNA片段与另一个编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的片段可操作地连接，这样VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，VL和VH结构域由柔性接头连接(参见，例如，Bird et al.，Science，242(4877)：423-426，1988；Huston et al.，Proc.Natl.Acad，.Sci.U.S.A.，85(16)：5879-5883，1988；McCafferty etal.，Nature，348：552-554，1990；Kontermann and Dübel(Eds.)，Antibody Engineering，Vols.1-2，2nd ed.，Springer-Verlag，2010；Greenfield(Ed.)，Antibodies：A LaboratoryManual，2nd ed.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2014)。任选地，在接头中加入裂解位点，例如弗林蛋白酶裂解位点。
如果只使用单个VH和VL，单链抗体可以是一价的；如果使用两个VH和VL，单链抗体可以是二价的；如果使用两个以上的VH和VL，单链抗体可以是多价的。可产生与肺炎链球菌如PhtD和/或PspA以及另一种抗原特异性结合的多特异性或多价抗体。编码的VH和VL可以任选地包括VH和VL结构域之间的弗林蛋白酶裂解位点。还可以编码接头，例如当核酸分子编码DVD-IgTM格式的双特异性抗体时。
编码抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)或缀合物的一个或多个DNA序列可通过DNA转移到合适的宿主细胞进行体外表达。细胞可以是原核细胞或真核细胞。许多可用于表达蛋白质的表达系统，包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞，如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系，都可用来表达所公开的抗体和抗原结合片段。可以使用稳定转移的方法，即外来DNA在宿主中持续保持。表达目的抗体的杂交瘤也包含在本公开中。
编码本文所述抗体、抗原结合片段和多特异性抗体的核酸的表达可通过将DNA或cDNA与启动子(组成型或诱导型)可操作地连接，然后将其纳入表达盒来实现。启动子可以是任何目的启动子，包括巨细胞病毒启动子。任选地，在构建体中包括增强子，如巨细胞病毒增强子。表达盒可以适合在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达盒含有用于调节编码蛋白质的DNA表达的特定序列。例如，表达盒可包括适当的启动子、增强子、转录和翻译终止子、启动序列、蛋白质编码基因前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA适当翻译的序列以及终止密码子。载体可编码可选择标志物，如编码抗药性(例如氨苄西林或四环素抗药性)的标志物。
为了获得克隆基因的高水平表达，需要构建表达盒，例如，表达盒包含强启动子以指导转录，核糖体结合位点以启动翻译(例如内部核糖体结合序列)，以及转录/翻译终止子。对于大肠杆菌，这可以包括启动子，如T7、trp、lac或λ启动子，核糖体结合位点，以及优选地转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可以包括启动子和/或增强子，例如来自免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒的启动子和/或增强子，以及多聚腺苷酸化序列，并且可以进一步包括剪接供体和/或受体序列(例如CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。可通过任何合适的方法将盒转移到所选的宿主细胞中，例如对于大肠杆菌使用转化或电穿孔以及对于哺乳动物细胞使用磷酸钙处理、电穿孔或脂转染。用盒转化的细胞可通过盒中包含的基因(例如amp、gpt、neo和hyg基因)赋予的抗生素抗性进行选择。
可以对编码本文所述多肽的核酸进行修饰而不降低其生物活性。可以进行一些修饰，以便于靶向分子的克隆、表达或将靶向分子并入融合蛋白中。这些修饰包括例如终止密码子、建立方便定位的限制位点的序列和在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点的序列或帮助纯化步骤的另外的氨基酸(例如多聚His)。
一旦表达，抗体、抗原结合片段、多特异性抗体和缀合物可根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析等(一般参见Simpson et al.(Eds.)，Basicmethods in Protein Purification and Analysis：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2009)。抗体、抗原结合片段和缀合物的纯度不必达到100％。一旦根据需要纯化、部分纯化或纯化至均一，如果是预防性使用，多肽应基本上不含内毒素。
从哺乳动物细胞和细菌(例如大肠杆菌)中表达抗体、抗原结合片段、多特异性抗体和缀合物和/或再折叠成适当的活性形式的方法已经被描述，并适用于本文公开的抗体。参见，例如，Greenfield(Ed.)，Antibodies：A Laboratory Manual，2nd ed.New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，2014；Simpson et al.(Eds.)，Basic methods inProtein Purification and Analysis：A Laboratory Manual，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2009；和Ward et al.，Nature 341(6242)：544-546，1989。
D.方法和组合物
1.抑制肺炎链球菌感染和/或肺炎球菌疾病
本文公开了抑制受试者肺炎链球菌感染的方法。肺炎链球菌感染可以是任何血清型，例如肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A感染。在一些实例中，肺炎链球菌是血清型3。这些方法包括向有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的受试者施用有效量(即有效抑制受试者感染的量)的所公开的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码这种抗体或抗原结合片段的核酸。这些方法可用于暴露前或暴露后。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以以多特异性抗体(例如双特异性抗体)的形式使用。抗原结合片段可以是scFv。
在一些实施方案中，选择受试者进行治疗。例如，有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的受试者。受试者可能患有肺炎球菌疾病或有患肺炎球菌疾病的风险，包括但不限于肺炎球菌肺炎、败血症或脑膜炎。患有某些慢性病况(例如糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒)的受试者患肺炎链球菌感染或肺炎球菌疾病的风险会增加。在一些实例中，被选中的受试者患有糖尿病、慢性阻塞性肺病、心血管疾病和人类免疫缺陷病毒。受试者可能合并感染另一种病毒，例如但不限于流感病毒。
此外，急性病况如原发性病毒性呼吸道感染也会增加肺炎链球菌感染的风险。在一些实例中，被选中进行治疗的受试者患有肺炎链球菌感染以外的感染。例如，可以选择患有原发性病毒感染的受试者，如呼吸道病毒感染。在一些实施方案中，被选中的受试者患有流感、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、人类变性肺病毒、副流感病毒感染。在具体的非限制性实例中，感染是流感或严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2感染。在另一个非限制性实例中，感染是甲型流感感染。
年龄是另一个风险因素，2岁以下或65岁以上的受试者更容易感染肺炎链球菌。在一些实例中，被选中进行治疗的受试者年龄在约2岁以下或约65岁以上。受试者的年龄可以小于一岁，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月大。受试者可以是老年人，例如年龄大于65、70、75、80、85或90岁。
该方法不需要完全消除或抑制感染才有效。例如，与未治疗时的肺炎链球菌感染相比，该方法可按所需量减少感染，例如减少至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，甚至至少100％(消除或预防可检测到的肺炎链球菌感染)。在一些实施方案中，还可以用有效量的另外的药剂(例如抗菌剂)治疗受试者。在一些实施方案中，对受试者施用青霉素或其衍生物，如阿莫西林、大环内酯类、克林霉素、头孢菌素、利福平、万古霉素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和/或头孢曲松。
在一些实施方案中，施用有效量的所公开抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码所公开抗体的核酸分子可抑制受试者感染的建立和/或随后的疾病进展，例如侵袭性肺炎球菌疾病的发展，这可包括受试者肺炎链球菌感染的活动(例如生长或侵袭)或症状的任何统计学意义上的显著降低。
本文公开了用于抑制受试者中肺炎链球菌复制的方法。这些方法包括向有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的受试者施用有效量(即有效抑制受试者中复制的量)的所公开抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)或编码此类抗体、抗原结合片段的核酸。这些方法可用于暴露前或暴露后。
公开了用于治疗受试者肺炎链球菌感染的方法。还公开了用于预防受试者肺炎链球菌感染的方法。这些方法包括施用如本文公开的一种或多种所公开的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体、或编码此类抗体的核酸分子、或包括此类抗体的组合物。核酸分子可以是DNA或RNA。
可以使用任何施用途径。在一些实施方案中，抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗原结合片段、核酸分子、载体或药物组合物向受试者鼻内、静脉内、皮下、腹腔内或肌肉内施用。
在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量可为约0.5mg/kg至50mg/kg。在一些实例中，剂量为约1mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约30mg/kg至约50mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约0.5mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.5mg/kg至约20mg/kg、约0.5mg/kg至约15mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约25mg/kg、约1mg/kg至约25mg/kg、约5mg/kg至约25mg/kg、约10mg/kg至约25mg/kg、约15mg/kg至约25mg/kg、约20mg/kg至约25mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约15mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg至约15mg/kg、约10mg/kg至约15mg/kg或约10mg/kg至约20mg/kg。在一些实例中，剂量为约7.5mg/kg至约15mg/kg。
抗体、其抗原结合片段和多特异性抗体可通过静脉内输注施用。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量会改变，但一般在约0.5mg/kg至约50mg/kg的范围内，例如剂量为约1mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg或约50mg/kg。在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量可以为约0.5mg/kg至约5mg/kg，例如剂量为约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg或约5mg/kg。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体按照医生确定的给药计划施用。在一些实例中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体每周、每两周、每三周或每四周施用一次。
抗体、其抗原结合片段和多特异性抗体(例如双特异性抗体)可鼻内施用。抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量会改变，但一般在约0.5mg/kg至约50mg/kg的范围内，例如剂量为约1mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg或约50mg/kg。在一些实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的剂量可以为约0.5mg/kg至约5mg/kg，例如剂量为约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg或约5mg/kg。
抗体、抗原结合片段或多特异性抗体按照医生确定的给药计划施用。在一些实例中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体每周、每两周、每三周或每四周施用一次。
在一些实施方案中，抑制受试者感染的方法进一步包括向受试者施用一种或多种另外的药剂。另外的目的药剂包括但不限于抗生素，例如青霉素或其衍生物，如阿莫西林、大环内酯类、克林霉素、头孢菌素、利福平、万古霉素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和/或头孢曲松。
在一些实施方案中，该方法包括施用有效量的特异性结合肺炎链球菌的一种以上所公开的抗体或抗原结合片段的组合，或编码这种抗体或抗原结合片段的核酸分子，例如，2、3、4、5或更多种所公开的抗体或抗原结合片段的组合，或编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。在一些非限制性实例中，该方法包括施用第一抗体或抗原结合片段，例如PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或抗原结合片段，和第二抗体或抗原结合片段，例如PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或抗原结合片段中的另一种。在进一步的实例中，该方法包括施用第三抗体或抗原结合片段，例如，PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或抗原结合片段中的另一种。
在一些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段结合PhtD或PspA的一个表位，而另外的抗体或抗原结合片段(例如，第二、第三、第四、第五抗体或抗原结合片段)结合PhtD或PspA的不同表位。在一些实例中，组合中的每个抗体都能结合PhtD或PspA的不同表位。在一些实施方案中，一种或多种特异性结合PhtD(例如PhtD3、PhtD6、PhtD7和/或PhtD8)的抗体或抗原结合片段与特异性结合PspA(例如PspA16)的抗体或抗原结合片段联合施用。在进一步的实例中，施用至少一种靶向PspA的抗体或抗原结合片段和至少两种靶向PhtD的抗体或抗原结合片段，例如PhtD3、PhtD7和PspA16。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码上述抗体或抗原结合片段的核酸分子，如本文所公开的。
在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD7、PhtD6、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD7抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在一些实例中，该方法包括施用PhtD3抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。
在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD6、PhtD8和PspAl6抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD6抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实例中，该方法包括施用PhtD7抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。
在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD7、PhtD8和PspA16抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段和PhtD8抗体或抗原结合片段。在另一个实例中，该方法包括施用PhtD6抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。
在一些实施方案中，该方法包括施用PhtD8抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PhtD8抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD7、PhtD6和PspA16抗体或抗原结合片段。在一个实例中，该方法包括施用PhtD8抗体或抗原结合片段和PspA16抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，该方法包括施用PspA16抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该方法包括施用PspA16抗体或抗原结合片段和以下一种或多种：PhtD3、PhtD7、PhtD6和PhtD8抗体或抗原结合片段。在所公开的方法中，也可以向受试者施用编码抗体或抗原结合片段的核酸分子。
在一些实施方案中，向受试者施用编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的DNA或RNA，以提供体内抗体生产，例如使用受试者的细胞机制。在一些实例中，向受试者施用有效量的编码scFV的mRNA或编码抗体VH和VL链的mRNA。在一些实施方案中，如上所述，抗体的Fc结构域被修饰以增加半衰期。施用外源mRNA用于体内蛋白表达的方法已在例如Schlake et al.(2019)Molecular Therapy 27(4)：773-784中公开，该文献通过引用的方式并入本文。
可以使用任何合适的核酸施用方法；美国专利号5,643,578、美国专利号5,593,972和美国专利号5,817,637提供了非限制性实例。美国专利号5,880,103描述了几种向生物体递送编码蛋白质的核酸的方法。施用核酸的一种方法是直接施用质粒DNA，如哺乳动物表达质粒。可将编码所公开抗体、其抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)的核苷酸序列置于启动子的控制下以增加表达。这些方法包括核酸的脂质体递送。这些方法可用于生产抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，使用pVRC8400载体(描述于Barouch et al.，J.Virol.，79(14)，8828-8834，2005，该文献通过引用的方式并入本文)在受试者中表达所公开的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，可以向受试者(例如有感染肺炎链球菌风险或已感染肺炎链球菌的人类受试者)施用有效量的AAV病毒载体，该AAV病毒载体包含一个或多个编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)的核酸分子。AAV病毒载体设计用于表达编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的核酸分子，向受试者施用有效量的AAV病毒载体可导致受试者中表达有效量的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体。可用于在受试者中表达所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的AAV病毒载体的非限制性实例包括Johnson et al.，Nat.Med.，15(8)：901-906，2009和Gardner et al.，Nature，519(7541)：87-91，2015提供的AAV病毒载体，其中每篇文献的全部内容通过引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，将编码所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的核酸直接引入组织。例如，可以用标准方法将核酸装载到金微球上，然后用Bio-Rad的HELIOSTMGene Gun等装置将核酸引入皮肤。核酸可以是“裸露的”，由强启动子控制下的质粒组成。
通常，DNA被注射到肌肉中，尽管也可直接注射到其他部位。注射剂量通常为约0.5μg/kg至约50mg/kg，通常为约0.005mg/kg至约5mg/kg(参见，例如，美国专利号5,589,466)。
包括所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)、缀合物或编码此类分子的核酸分子在内的组合物的单次或多次施用可根据患者需要和耐受的剂量和频率进行。剂量可以一次施用，也可以定期施加，直到达到预期效果或出现副作用需要停止治疗为止。一般来说，该剂量足以抑制肺炎链球菌感染，而不会对患者产生不可接受的毒性。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定人体使用的剂量范围。剂量通常在包括ED50在内的循环浓度范围内，毒性很小或极小。剂量可在此范围内变化，取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。有效剂量可通过细胞培养测定和动物研究确定。
肺炎链球菌特异性抗体、抗原结合片段或多特异性抗体或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物可以通过各种方式向受试者施用，包括局部和全身施用，如通过皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮内注射或鞘内注射。在一个实施方案中，抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物每天一次通过单次皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮内注射或鞘内注射施用。抗体、抗原结合片段、多特异性抗体、缀合物或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物也可以通过在疾病部位或附近直接注射施用。进一步的施用方法是通过渗透泵(例如Alzet泵)或微型泵(例如Alzet迷你渗透泵)，在预先确定的时间段内可控制、持续和/或缓释递送抗体、抗原结合片段、缀合物或编码此类分子的核酸分子或包括此类分子的组合物。渗透泵或微型泵可皮下或靶部位附近植入。
2.组合物
所提供的组合物包括在药学上可接受的载体中的本文公开的一种或多种肺炎链球菌特异性抗体、抗原结合片段、缀合物或编码此类分子的核酸分子。在一些实施方案中，组合物包含本文公开的PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，组合物包含两种、三种、四种或更多种特异性结合肺炎链球菌(例如PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8或PspA16)的抗体或抗原结合片段。在一个实例中，组合物包含PhtD3和PhtD7抗体或抗原结合片段。在其他实例中，组合物包括以下抗体或抗原结合片段：PhtD3和PhtD6、PhtD3和PhtD8、PhtD3和PspA16、PhtD7和PhtD6、PhtD7和PhtD8、PhtD7和PspA16、PhtD6和PhtD8、PhtD6和PspA16、或PhtD8和PspA16。在一些实施方案中，组合物中包含至少一种特异性结合PhtD(例如PhtD3、PhtD6、PhtD7或PhtD8)的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体。在其他实施方案中，组合物中包含至少一种特异性结合PspA(例如PspA16)的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体。例如，组合物可用于抑制或检测肺炎链球菌感染，如肺炎链球菌血清型3、血清型4或血清型19A感染。
组合物可以制备成单位剂型，如试剂盒，用于向受试者施用。施用量和施用时序由施用医生决定，以达到预期目的。抗体、抗原结合片段、多特异性(例如双特异性)抗体、缀合物或编码此类分子的核酸分子可配制成全身或局部用药。在一个实例中，抗原结合片段、多特异性抗体、缀合物或编码此类分子的核酸分子配制成肠胃外施用，如静脉内施用或鼻内施用。
在一些实施方案中，组合物中抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或其缀合物的纯度为至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)。在一些实施方案中，组合物含有小于10％(例如小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％或甚至更少)的大分子污染物，例如其他哺乳动物(例如人类)蛋白质。
用于施用的组合物可包括溶解在药学上可接受的载体(例如水性载体)中抗体、抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、缀合物或编码此类分子的核酸分子的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，一般不含不想要的物质。这些组合物可以通过任何合适的技术进行灭菌。为接近生理条件，组合物可含有药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。抗体在这些制剂中的浓度可以变化很大，主要根据液体体积、粘度、体重等按照所选的特定施用方式和受试者的需要来选择。
典型的用于静脉内施用的组合物包括每名受试者每天约0.01至约30mg/kg的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或缀合物(或相应剂量的包含抗体或抗原结合片段的缀合物)。任何合适的方法都可用于制备可施用的组合物；非限制性实例在诸如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，22nd ed.，London，UK：Pharmaceutical Press，2013之类的出版物中提供。在一些实施方案中，组合物可以是液体制剂，包括一种或多种抗体、抗原结合片段或多特异性抗体，浓度范围为约0.1mg/ml至约20mg/ml，或约0.5mg/ml至约20mg/ml，或约1mg/ml至约20mg/ml，或约0.1mg/ml至约10mg/ml，或约0.5mg/ml至约10mg/ml，或约1mg/ml至约10mg/ml。
典型的用于鼻内施用的组合物包括每名受试者每天约0.01至约50mg/kg的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或缀合物(或相应剂量的包含抗体或抗原结合片段的缀合物)。任何合适的方法都可用于制备可施用的组合物；非限制性实例在诸如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，22nd ed.，London，UK：Pharmaceutical Press，2013之类的出版物中提供。在一些实施方案中，组合物可以是液体制剂或雾化的，包括一种或多种抗体、抗原结合片段或多特异性抗体，浓度范围为约0.1mg/ml至约20mg/ml，或约0.5mg/ml至约20mg/ml，或约1mg/ml至约20mg/ml，或约0.1mg/ml至约10mg/ml，或约0.5mg/ml至约10mg/ml，或约1mg/ml至约10mg/ml。在一些实施方案中，使用雾化器。
提供了一种气雾剂组合物，用于递送抗体、其抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。单克隆抗体雾化的示例性方法已在欧洲公开号EPl8819934中公开。呼吸道包括上呼吸道，其包括口咽部和喉部，随后是下呼吸道，其包括气管，气管随后分支成支气管和细支气管。上气道和下气道被称为传导气道。末端细支气管再分为呼吸性细支气管，呼吸性细支气管然后通向最终呼吸区--肺泡或深肺。
肺部递送可通过吸入实现，本文的通过吸入施用可以是口服和/或鼻腔施用。用于肺部递送的药物装置的实例包括计量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和雾化器。例如，美国专利号5,756,353；5,858,784；和PCT公开号WO98/31346；WO98/10796；WO00/27359；WO01/54664；WO02/060412中描述了通过吸入的示例性递送系统，其可适于递送治疗剂(例如抗体、其抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体))。美国专利号6,294,153；美国专利号6,344,194；美国专利号6,071,497和PCT公开号WO02/066078；PCT公开号WO02/053190；PCT公开号WO01/60420；和PCT公开号WO00/66206中还公开了用于递送抗体的气雾剂制剂。
可以使用加压计量吸入器(pMDI)。在这些装置中，当阀门打开(通常通过按压推进剂罐)，使液体推进剂从罐中喷出时，就会产生气雾剂。通常情况下，治疗剂包含在悬浮在液体推进剂中的小颗粒(直径通常为几微米)中，但在一些制剂中，治疗剂可以溶解在推进剂中。当气雾剂离开装置时，推进剂会迅速蒸发，从而产生被吸入的小颗粒。此类pMDI通常使用的推进剂包括但不限于氢氟烃(HFA)。表面活性剂也可用于pMDI，例如用于配制治疗剂。pMDI还可使用其他溶剂或赋形剂，如乙醇、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、甘油、氯丁醇和氯化十六烷基吡啶。此类pMDI可以进一步包括附加装置，例如间隔器、容纳室和其他改装装置。
雾化器可产生供吸入的雾状含药液滴，可分为两种类型：超声波雾化器和喷射雾化器。此外，还开发了单次呼吸雾化器(例如)，其可在单次吸入中递送治疗剂，如抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。喷射雾化器使用加压空气源喷射气流通过含有治疗剂的储水器，在复杂的过程中产生液滴，该过程涉及粘度引起的表面不稳定性，导致非线性现象，其中表面张力和液滴在挡板上破裂发挥作用。超声波雾化器通过板或网的机械振动产生液滴。无论是哪种类型的雾化器，治疗剂都可能包含在雾化器中液体的溶液中，因此产生的液滴包含溶液中的治疗剂。不过，治疗剂也可以包含在悬浮在水中的小颗粒中，然后以悬浮颗粒的形式包含在所产生的液滴中。适用于雾化的制剂中通常包含某些赋形剂，例如氯化钠(例如，以保持等渗性)、矿物酸和矿物碱(例如，保持或调节pH)、氮气顶空喷射、苯扎氯铵、氯化钙、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠和聚山梨醇酯80。
另一种类型的吸入器是干粉吸入器(DPI)。在DPI中，气雾剂可以是粉末，在吸入前一直保存在装置中。治疗剂以粉末形式制成，粉末颗粒很小(直径通常为几百万分之一米，或微米)。在许多DPI中，治疗剂与大得多的糖颗粒(例如乳糖一水合物)混合，糖颗粒的直径通常为50-100微米。乳糖/治疗剂团聚体上增加的空气动力可改善吸入时颗粒的夹带。吸入时，粉末会借助湍流和/或机械装置(例如筛网或颗粒团聚体撞击的旋转表面)碎裂成其组成颗粒，将小的单个治疗剂/粉末颗粒释放到空气中，以被吸入肺部。糖颗粒可能会留在装置中和/或口腔-咽部中。
抗体、其抗原结合片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)或编码此类分子的核酸可以以冻干形式提供，并在施用前用无菌水再水化，尽管它们也可以以已知浓度的无菌溶液提供。然后，可将包括抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或编码此类分子的核酸的溶液加入含有0.9％氯化钠(USP)的输注袋中，通常按0.5至15mg/kg体重的剂量施用。自1997年利妥昔单抗获批以来，抗体药物已在美国上市，在抗体药物的施用领域已有相当丰富的经验。抗体、抗原结合片段、缀合物或编码此类分子的核酸可以通过缓慢输注施用，而不是静脉内推注或快速注射。在一个实例中，施用较高的负荷剂量，随后施用较低水平的维持剂量。例如，初始负荷剂量为4mg/kg，输注时间为约90分钟，如果前一剂量的耐受性良好，则随后每周维持剂量为2mg/kg，输注时间为30分钟，持续4-8周。
控释肠胃外制剂可制成植入剂、油性注射剂或微粒系统。有关蛋白质递送系统的广泛概述请参阅Banga，Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems，Lancaster，PA：Technomic Publishing Company，Inc.，1995。微粒系统包括微球、微颗粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有活性蛋白剂(例如细胞毒素或药物)作为中心核。在微球中，活性蛋白剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊一般分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径约为5μm，因此只能静脉内施用纳米颗粒。微粒的直径通常为约100μm，可皮下施用或肌肉内施用。参见，例如，Kreuter，Colloidal Drug Delivery Systems，J.Kreuter(Ed.)，New York，NY：Marcel Dekker，Inc.，pp.219-342，1994；和Tice and Tabibi，Treatise on ControlledDrug Delivery：Fundamentals，Optimization，Applications，A.Kydonieus(Ed.)，NewYork，NY.Marcel Dekker，Inc.，pp.315-339，1992。
聚合物可用于本文公开的组合物的离子控制释放。可使用任何合适的聚合物，例如设计用于控制药物递送的可降解或不可降解聚合物基质。备选地，羟基磷灰石被用作控制蛋白质释放的微载体。另一方面，脂质体可用于脂质封装药物的控释和药物靶向。
2.检测和诊断方法
还提供了在体外或体内检测肺炎链球菌的存在的方法。在一个实例中，肺炎链球菌的存在在受试者的生物样品中检测，并可用于鉴定受试者是否感染。样品可以是任何样品，包括但不限于来自活检的组织、尸体解剖和病理标本。生物样品还包括组织切片，例如用于组织学目的的冷冻切片。生物样品进一步包括体液，例如血液、血清、血浆、痰液、脊髓液或尿液。检测方法可包括在足以形成免疫复合物的条件下，使细胞或样品与特异性结合肺炎链球菌的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体(例如双特异性抗体)或其缀合物(例如包括可检测标志物的缀合物)接触，并检测所述免疫复合物(例如通过检测与抗体或抗原结合片段缀合的可检测标志物)。
在一个实施方案中，抗体、抗原结合片段或多特异性抗体直接用可检测标志物标记。在另一个实施方案中，结合肺炎链球菌的抗体(或抗原结合片段或多特异性抗体)(第一抗体)是未标记的，使用第二抗体或其他可以结合第一抗体的分子进行检测。选择的第二抗体应能特异性结合第一抗体的特定种类和类别。例如，如果第一抗体是人类IgG，那么第二抗体可以是抗人类IgG。可以与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，这两种蛋白都可以商购获得。抗体、抗原结合片段、多特异性抗体或第二抗体的合适标签是已知的，并如上所述，包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。
在一些实施方案中，所公开的抗体、其抗原结合片段或多特异性抗体可用于检测疫苗。例如，检测包括PhtD或PspA或其片段的疫苗组合物是否产生包括所公开抗体的表位的构象。因此，本文提供了一种检测疫苗的方法，其中该方法包括在足以形成免疫复合物的条件下，使含有疫苗(例如PhtD或PspA免疫原)的样品与所公开的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体接触，并检测免疫复合物，以检测样品中包括目的表位的疫苗。在一个实例中，检测样品中的免疫复合物表明疫苗组分(例如免疫原)具有能够结合抗体或抗原结合片段的构象。
实施例
分离特异性结合肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白(PhtD)或肺炎球菌表面蛋白A(PspA)这两种保守的保护性抗原的人类mAb(PhtD3、PhtD6、PhtD7、PhtD8和PspA16)。抗PhtD的mAb靶向跨越整个PhtD蛋白的不同表位，而抗PspA16的mAb靶向PspA的N末端区段。发现PhtD特异性mAb可与多种血清型结合，而PspA16的血清型范围有限。还检验了两种PhtD mAb(PhtD3和PhtD8)对预防肺炎球菌疾病的预防效力，这两种mAb分别靶向PhtD的N末端和C末端区域。虽然这两种mAb都能延长感染肺炎球菌血清型3的小鼠的存活时间，但PhtD3能提供更强大的保护。为了检验mAb PhtD3所诱导的保护作用的广度，在一项针对血清型4的预防性治疗研究中对mAb进行了测试，PhtD3延长了鼻内和静脉内感染模型中小鼠的存活时间。此外，在血清型3治疗模型中，在肺炎球菌感染24小时后施用时，PhtD3mAb具有保护作用。所有PhtD和PspA mAb都表现出了调理吞噬活性。这些结果为疾病预防和治疗提供了新的人类mAb，并确定了人类B细胞识别的PhtD和PspA上的表位，以用于治疗和疫苗开发。
实施例1
材料和方法
抽血和PBMC分离
通过静脉穿刺将90mL血液抽入9个肝素涂覆的管中，然后将10mL血液收集到血清分离管中。使用Ficoll-Histopaque密度梯度离心法从人类供体血液样品中分离出外周血单核细胞(PBMC)，并将PBMC冷冻在液氮蒸汽相中，直至进一步使用。
肺炎球菌蛋白克隆和表达
用下表2所列的引物从肺炎链球菌菌株TCH8431(血清型19A)的基因组中克隆PspA和PhtD全长蛋白和片段。全长PspA和PhtD被连接到pET28a载体中，而片段被连接到pMAL-c5x载体中。所有构建质粒的序列均通过测序确认，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达。挑取转化的大肠杆菌的单菌落，在5mL补充有抗生素(pET28a为50μg/ml卡那霉素，pMAL-c5x为100μg/ml氨苄青霉素)的LB培养基中培养，在37℃下在震荡培养箱中过夜。然后将过夜培养物以1∶100的比例在含抗生素的2x YT培养基中扩大，并在37℃下培养。当OD600达到0.5至0.7时，用50μM异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷在室温下诱导培养物12-16小时。在6,000xg下离心10分钟收集细菌沉淀物，并在-80℃下冷冻。解冻后的大肠杆菌沉淀物在10mL含有20mM Tris pH 7.5和500mM NaCl的缓冲液中重悬，然后超声裂解。细胞裂解液在12,000x g下离心30分钟，上清液随后通过HisTrapTM柱(His标记的全长蛋白，GE)或Amylose树脂(MBP标记的片段，New England Biolabs)按照生产商的方案进行蛋白纯化。/>
与肺炎球菌蛋白结合的酶联免疫吸附测定
在重组蛋白捕获ELISA测定中，用PBS中的2μg/ml抗原处理384孔板1小时(37℃)或过夜(4℃)。之后，用水洗涤板一次，然后用PBS-T中的2％脱脂奶/2％山羊血清(封闭缓冲液)封闭1小时。用水洗涤板三次，然后施加PBS中的系列稀释的一级mAb 1小时。之后，用水洗涤板三次，然后施加25μL在封闭溶液中以1∶4,000稀释的二级抗体(山羊抗人IgG Fc；Meridian Life)。孵育1小时后，用PBS-T洗涤板5次，每个孔加入25μl PNPP(对硝基苯磷酸酯)溶液(1M Tris碱中的1mg/ml PNPP)。在室温下孵育板1小时，然后在/>读板器上在405nm读取光密度。在GraphPad Prism中使用非线性回归曲线拟合和log(激动剂)-对-反应函数分析结合测定数据，以计算结合EC50值。
产生肺炎球菌特异性杂交瘤
为了产生杂交瘤，将从人类供体血液中纯化的1000万个外周血单核细胞与先前冷冻和γ射线照射的800万个经修饰以表达人CD40L、人白细胞介素-21(IL-21)和人BAFF(69)的NIH 3T3细胞在80mL StemCellTM培养基A(StemCell TechnologiesTM)中混合，所述StemCellTM培养基A含有6.3μg/mL的CpG(的硫代磷酸酯修饰的寡聚脱氧核苷酸；见PCT公开号WO 2017/011394A1，以及Bar-Peled et al.，J Virol(2019)doi：10.1128/jvi.00342-19，两者均通过引用的方式并入本文)和1μg/mL的环孢霉素A将细胞混合物在4个96孔板中以每孔200μ1在StemCellTM培养基A中涂布。6天后，用ELISA筛选培养上清液与重组肺炎球菌蛋白的结合，并将阳性孔中的细胞电融合以产生杂交瘤，并按照之前的描述进行生物克隆(Bar-Peled et al.(2019)J Virol 93：e00342-19)。
人类mAb表达与纯化
对于杂交瘤衍生的mAb，杂交瘤细胞系在StemCellTM培养基A中扩大到75-cm2烧瓶中的汇合为80％。用细胞刮板从一个75-cm2的细胞培养烧瓶中收集细胞，在无血清培养基(Hybridoma-SFM；Thermo Fisher)中扩大到225-cm2细胞培养瓶中。转染的重组培养物在5-7天后停止，杂交瘤培养物在30天后停止。对于重组PhtD3-IgG2a，合成了编码PhtD3-IgG2a重链和轻链序列cDNA的质粒/>并克隆到pCDNA3.1+。将质粒转染Expi293FTM细胞，获得mAb。对于每毫升转染，在66.67μl/>细胞培养基/>中，1μg质粒DNA与4μg 25,000分子量的聚乙烯亚胺(PEI；PolySciences，/>)混合。30分钟后，将DNA-PEI混合物加入Expi293FTM细胞中，将细胞培养5-6天进行蛋白质表达。两种方法的培养上清液均用0.45μm过滤器过滤以去除细胞碎片。mAb直接用HiTrap蛋白G柱(GEHealthcare Life/>)按照生产商的方案从培养上清液中纯化。
人类mAb的同种型测定
为了测定mAb的同种型，在96孔4HBX板(Thermo Fisher/>)上涂覆2μg/mL的PBS中的每种mAb(每种样品设置一重复)。在4℃下将板孵育过夜，然后用水洗涤一次。用封闭缓冲液封闭板，然后在室温下孵育1小时。孵育后，用水洗涤板三次。获自Southern/>(山羊抗人κ-碱性磷酸酶[AP][产品目录编号100244-340]、山羊抗人λ-AP[产品目录编号100244-376]、小鼠抗人IgG1[Fc]-AP[产品目录编号100245714]、小鼠抗人IgG2[Fc]-AP[产品目录编号100245-734]、小鼠抗人IgG3[铰链]-AP[产品目录编号100245-824]和小鼠抗人IgG4[Fc]-AP[产品目录编号100245-812])的同种型特异性抗体在封闭缓冲液中稀释1∶1,000，然后将50μl的每种溶液加入相应的孔中。将板在室温下孵育1小时，然后用PBS-T洗涤5次。在底物缓冲液(1M Tris碱，0.5mM MgCl2，pH 9.8)中制备1mg/mL的PNPP底物，将100μl的该溶液加入各孔中。将板在室温下孵育1小时，然后在/>读板器上在405nm读数。
RT-PCR检测杂交瘤mAb可变γ链和可变轻链
根据生产商的方案，使用总RNA试剂盒(Omega/>)从扩增的杂交瘤细胞中分离RNA。使用SuperScriptTMIV逆转录酶试剂盒获得cDNA。之后，使用重链、κ和λ轻链的既定引物分两步进行PCR(Guthmiller et al.(2019)An Efficient Method toGenerate Monoclonal Antibodies from Human B Cells BT-Human MonoclonalAntibodies：Methods and Protocols，p.109-145.In Steinitz，M(ed.)Springer NewYork，NewYork，NY)。样品经琼脂糖凝胶电泳分析，按照生产商的方案，纯化的PCR产物(Cycle-Pure试剂盒；Omega/>)用Original TA/>试剂盒(ThermoFisher/>)克隆到pCR2.1载体中。使用/>质粒DNA mini试剂盒(Omega)从阳性DH5α菌落中纯化质粒，并提交给/>进行测序。使用IMGT/V-Quest对序列进行分析(Brochet et al.(2008)Nucleic Acids Res 36：503-508)。/>
生物层干涉测量的实验设置
对于所有生物传感器，在运行缓冲液(PBS、0.5％牛血清白蛋白[BSA]、0.05％吐温20、0.04％硫柳汞)中获得初始基线。为绘制表位，将100μg/mL的His标记的PhtD蛋白固定在抗五组氨酸生物传感器吸头上120秒。为进行结合竞争，在将生物传感器吸头浸入含有100μg/mL第一抗体的孔中300秒之前，再次测量基线信号60秒。之后，将生物传感器浸入含有100μg/mL的第二mAb的孔中300秒。通过比较加入第一mAb后第二mAb的最大信号与单独第二mAb的最大信号，确定第一mAb存在时第二mAb的结合百分比。如果第二mAb的最大结合≥其非竞争结合的66％，则该mAb被视为非竞争。其非竞争结合的33％至66％的水平被视为中等竞争，而≤33％被视为竞争。
细菌菌株和生长条件
肺炎球菌菌株在37℃、5％CO2下在补充有0.5％酵母提取物的Todd-Hewitt肉汤(Franklin Lakes NJ)中生长12小时。在培养基中加入10％的甘油，并制成500μL的等分试样。培养物在使用前保存在-80℃，在用于实验前用PBS洗涤两次。菌落在含5％绵羊血的/>TrypticaseTM Soy Agar II(/>Franklin Lakes NJ)上生长。等分试样冷冻后，将单份快速解冻的稀释的等分试样置于绵羊血琼脂板上，测定每毫升这些储存液中的CFU数量。计算出的CFU数量随后用于为后来解冻的等分试样的实验制备稀释液。在每次实验中，实际施用的CFU数量是在测定时通过在血琼脂上涂布来确定的。表3列出了本研究中使用的菌株。
Western印迹
将肺炎球菌菌株与非还原性上样缓冲液(Laemmli SDS样品缓冲液，非还原性6X)混合，并在4-12％Bis-Tris凝胶上上样。然后通过/>系统/>将样品转移到PVDF膜上，再用5％封闭缓冲液(PBS-T中的5％脱脂奶)在室温下封闭1小时或在4℃下封闭过夜。在轨道摇床上用0.05％PBS-T以五分钟为间隔洗涤膜三次。然后，加入第一抗体，其在PBS中的稀释度1μg/mL，室温下放置一小时。然后在轨道摇床上用PBS-T以5分钟的间隔洗涤膜三次，并用1∶8,000稀释度的在封闭缓冲液中的第二抗体浸泡一小时。然后，在轨道摇床上用PBS-T以五分钟的间隔洗涤膜五次，加入底物(PierceTM ECL WesternBlotting Substrate，Thermo/>)，并立即用ChemiDocTM成像系统/>拍摄图像。
固定的肺炎球菌的酶联免疫吸附测定
在384孔板的每个孔中加入15μL(约107CFU)PBS中的全细胞肺炎球菌。用显微镜检查细胞密度，以确保涂布了汇合层的肺炎球菌。然后在每个孔中加入15μl 4％多聚甲醛固定细菌，并将其放在板振动器上10分钟以混合。将384孔板在4℃下孵育24-48小时，使细菌固定在板底部。之后，在每个孔中加入75μl PBS-T，洗涤板一次。然后用2％的封闭缓冲液在室温下封闭板1小时，再用PBS-T洗涤三次。然后，将25μl系列稀释的第一抗体施加在孔中，室温下放置1小时，再用PBS-T洗涤板三次。之后，将25μl经封闭缓冲液1∶4,000稀释的第二抗体(山羊抗人IgG Fc；Meridian Life)施加在每个孔中，室温下放置1小时。用PBS-T洗涤板5次后，在每个孔中加入25μl PNPP(对硝基苯磷酸酯)溶液(在1M Tris碱中的1mg/ml PNPP)，室温下放置1小时。1小时后，在/>读板器上在405nm读取光密度。用GraphPad Prism分析结合测定数据。
通过流式细胞术检测抗体与细菌的结合
通过流式细胞术测定mAb与暴露在肺炎链球菌表面的抗原结合的能力。细菌用10μM CFSE在37℃下染色1小时。然后用含1％牛血清白蛋白(BSA)的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)洗涤细菌，以去除多余的染色剂。之后，1x106个细菌与10μg/ml抗体在37℃下孵育30分钟。然后用HBSS+1％BSA洗涤细菌两次。使用1∶100稀释度的APC抗人IgG Fc(BiolegendTM)与细菌孵育1小时，检测抗体结合。在NovoCyte QuanteonTM流式细胞仪上进行分析之前，用HBSS+1％BSA洗涤细胞并用PBS中的2％多聚甲醛(PFA)固定细胞。
确定PhtD3的效力
致死性肺炎挑战研究使用5-7周龄的CBA/CaHN-Btkxid/J(CBA/N)小鼠(TheJacksonBar Harbor，ME)。小鼠在感染肺炎球菌前两小时腹腔内接种抗体治疗剂。为了感染，小鼠通过吸入5％的异氟醚进行麻醉，鼻内施用30μL含有105个菌落形成单位(CFU)的TIGR4的PBS。向小鼠递送的实际剂量通过递送后滴定细菌来确定。每天对小鼠进行称重和评估，当小鼠体重下降超过20％或对人工刺激无反应时，则认为小鼠已经垂死。小鼠经CO2窒息后颈椎脱位安乐死。败血症模型使用5-7周龄的C57BL/6小鼠(Charles River)。小鼠在感染肺炎球菌前两小时腹膜内接种抗体治疗。小鼠经尾静脉通过静脉内感染106CFU的TIGR4。按上述方法对小鼠进行监测和安乐死。
调理吞噬杀伤测定
如前所述，进行了调理吞噬杀伤测定，该测定改编自早先的方案并进行了修改(Burton and Nahm(2012)Clin Vaccine Immunol 2012/04/18.19：835-841)。将TIGR4储存液与指定抗体(每孔10μg抗体，每孔最终体积100μL)在调理缓冲液B(OBB：含Ca2+/Mg2+、0.1％明胶和5％热灭活FetalCloneTM HyCloneTM的无菌1×PBS)中在96孔圆底板中于37℃孵育1小时，一式三份，热失活的FetalCloneTM处理的仅TGR4细胞用作对照。人类早幼粒细胞白血病细胞系HL-60(ATCC)的细胞在含有10％热失活的FetalCloneTM和1％1-谷氨酰胺的RPMI中培养。在进行OPA测定前，用0.6％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)将HL-60细胞分化3天，收获细胞并重悬于OBB中。将幼兔补体/>以1∶5的最终体积加入HL-60细胞中。按5×105个细胞/孔将HL-60补体混合物加入细菌中。最终反应混合物在37℃下振荡孵育1小时。将样品在冰上孵育约20分钟，停止反应。然后将10μL的每种反应混合物(一式三份)稀释至50μL的最终体积，并将其涂布在血琼脂板上。板在30℃下孵育过夜，第二天进行计数。细菌杀伤百分比的计算方法是：每个样品重复与对照样品的平均值进行归一化，再从100中减去(无Ab对照样品代表0％存活)。
基于流动的调理吞噬测定
按照生产商的方案，用PHrodoTM琥珀酰亚胺酯对肺炎球菌细胞进行染色。室温下用PBS中的1％多聚甲醛溶液固定约108CFU的细菌30分钟。用PBS洗涤固定的细菌两次，然后用0.5mL新鲜制备的100mM NaHCO3(pH 8.5)重悬。在使用前，将小瓶中的内容物0.1mg pHrodoTMiFL胺活性染料溶解于10μL的DMSO中，制成10mM的储存溶液。pHrodoTM在细菌悬浮液中稀释，最终浓度为0.1mM，细菌在室温下染色1小时。染色后的细菌用含Ca2+和Mg2+的Hank's平衡盐溶液(HBSS，/>)洗涤两次，用0.5mL HBSS重悬，并于4℃在黑暗中保存。调理吞噬测定在96孔U型底板中进行，每孔总体积为120μL。首先，将20μL pHrodoTM标记的细菌(约107CFU/孔)与40μL无菌过滤的mAb(50μg/孔)混合，并在37℃摇床上孵育30分钟。细菌与HBSS混合作为阴性对照，纯化的人血清IgG用作阳性对照。分化的HL-60细胞用HBSS洗涤两次，并与幼兔补体(Pel-Freez/>)混合，每孔的最终浓度为10％。之后，向细菌和抗体的混合物中加入60μL(1×106个存活细胞)分化的HL60细胞和补体，并在37℃摇床上孵育60分钟。然后在4℃下以1300rpm离心平板5分钟以去除上清液，并用200μLHBSS洗涤沉淀物两次。第二次洗涤后，将沉淀物重悬于50μL含有1％BSA的PBS中的PE-抗人CD11b(Southem/>10μL/百万细胞)、Alexa Fluor/>-抗人CD35(BD/>5μL/百万细胞)和DAPI(/>50ng/百万细胞)的混合物中。于4℃在黑暗中孵育30分钟后，用200μL PBS洗涤板两次，并将细胞重悬在100μL PBS中。用NovoCyte QuanteonTM流式细胞仪分析细胞。单荧光团染色的分化HL60细胞和pHrodoTM染色的细菌用于计算补偿矩阵。每个样品孔共收集了10,000个非门控事件，并通过/>分析数据。
实施例2
肺炎球菌蛋白特异性入类mAb的分离与表征
为了鉴定PhtD和PspA特异性人类mAb，在大肠杆菌中重组表达来自菌株TCH8431(血清型19A)的His标记的PhtD和PspA(图1)，并利用这些蛋白筛选来自人类供体外周血单核细胞(PBMC)的受刺激B细胞，如前所述(Bar-Peled et al.(2019)J Virol 93：e00342-19)。将健康人类受试者的PBMC涂布在表达人CD40L、人IL-21和人BAFF的饲养层上六天，以刺激B细胞生长和抗体分泌。通过酶联免疫吸附测定针对重组PhtD和PspA来筛选受刺激B细胞的细胞上清液。如图2中的实例所示，受试者之间对重组蛋白的反应各不相同。从五个受试者的PBMC中融合出几个反应孔，用于产生人杂交瘤和随后的人类mAb分离。成功产生了四个分别来自独特供体的杂交瘤系，通过单细胞分选对PhtD进行生物克隆，并从独立的受试者产生一个PspA的mAb。通过ELISA测定，针对每种PhtD的mAb都有相似的结合EC50值(图3A)，mAb与PhtD和PspA以高亲和力结合，EC50值在26-45ng/mL的范围(图3A和3B)。为了确定每种mAb利用的V、D和J基因，通过RT-PCR对杂交瘤进行测序，然后进行TA克隆，结果见表4。
mAb PhtD3和PhtD6使用κ轻链，而mAb PhtD7和PhtD8使用λ轻链。根据通过ELISA测定的分型数据，所有mAb均为IgG1同种型。除mAb PhtD7和PhtD8外，所有mAb都使用独特的重链和轻链V基因。mAb PhtD7和PhtD8共享VH和JH基因使用，尽管在DH基因的使用上有所不同，这导致了CDR3长度的明显差异，mAbPhtD7和PhtD8的HCDR3长度分别为20个氨基酸和8个氨基酸长度。mAb PhtD7和PhtD8还共享预测的VL和JL基因使用，尽管LCDR3序列几乎没有序列同一性。
为了确定人类mAb靶向的PhtD的特定区域，根据二级结构预测器生成了PhtD的截短片段。这些片段与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合以确保溶解性，并在大肠杆菌中表达并使用直链淀粉树脂纯化。除MBP融合蛋白中的游离MBP蛋白外，大多数片段的纯度都大于90％(图4)。为了确定分离出的mAb靶向的PhtD的特定区域，我们测量了mAb与PhtD片段的ELISA结合。由于以前没有针对这些蛋白生成过具有确定表位的mAb，因此生成的片段可提供mAb表位的粗略估计。四种mAb中的每一种都与PhtD蛋白上的独特区域结合(图5)。mAb PhtD3和PhtD6结合蛋白质的N末端部分，而mAb PhtD8结合C末端部分。mAb PhtD7似乎靶向依赖于氨基酸341-838的独特构象表位，但这种mAb并不结合341-647或645-838片段。通过竞争性生物层干涉测量法评估了mAb的表位，以比较mAb之间的结合表位(图6)。用His标记的PhtD蛋白装载抗五组氨酸生物传感器，并且mAb依次竞争结合(图6)。mAb结合不同的区域，竞争有限，类似于片段ELISA数据的结果。mAb PhtD3和PhtD6显示出中等竞争，这些mAb的表位在我们的片段ELISA数据中也有重叠。为了绘制mAb PspAl6的结合区，根据先前确定的结构域将PspA片段化为几个截短片段(图7)(Khan N，Jan AT.(2017)Front Microbiol 8：742)。mAbPspA16对重组PspA具有高亲和力，根据与氨基酸片段1-438和1-512的阳性结合以及与247-512、436-725和247-725片段的阴性结合，与N末端片段1-247结合(图8)。
肺炎球菌表面蛋白PhtD和PspA在不同血清型中是保守的，而且在大多数血清型中广泛存在。因此，针对这些抗原的人类mAb具有治疗多种血清型的肺炎球菌感染的潜力。为了确定分离出的mAb的血清型广度，评估了mAb与两种不同肺炎球菌血清型的结合，一种是菌株TCH8431(血清型19A)，从其克隆并表达了重组PhtD和PspA蛋白的基因；另一种是常用的实验室菌株TIGR4(血清型4)。PspA在TCH8431和TIGR4之间有88％的氨基酸序列同一性，尽管N末端结构域存在显著差异，氨基酸1-247的同一性为70％。相比之下，PhtD在这两个菌株之间有98％的氨基酸序列同一性。通过用mAb PhtD3和PspA16对来自TIGR4和TCH8431的细菌裂解物进行探针探查来进行Western印迹。mAb PspA16只标记菌株TCH8431(血清型19A)的PspA蛋白(图9)，而mAb PhtD3能标记两种肺炎球菌菌株的PhtD蛋白。然而，由于细菌裂解可能会导致蛋白质变性，因此mAb PspA16的表位可能会在变性过程中发生改变。接下来测定的是针对每种重组蛋白分离的mAb是否与整个细菌结合。通过用固定细菌包被板并通过ELISA测量mAb结合来进行ELISA测定。mAb PhtD 3、PhtD6、PhtD7和PhtD8对多种无关的肺炎球菌血清型具有广泛的反应性，并且与PhtD8相比，mAb PhtD3、PhtD6和PhtD7对固定细菌具有更高的亲和力(图10)。相比之下，PspA16只与菌株TCH8431结合，与Western印迹实验的结果相似。由于PspA16与PspA最易变的区域结合，因此与不同血清型的结合减少是意料之中的。在第三项实验中，通过流式细胞术评估了mAb与一组肺炎球菌血清型的结合。使用来自21天前接种过的供体血清，作为阳性对照。PhtD mAb与大多数测试的血清型结合，其中mAb PhtD3和PhtD8的结合范围最广(图11)。相比之下，PspA16只与TCH8431和血清型3菌株WU2结合。
实施例3
mAB治疗可保护小鼠免受肺炎球菌感染
进一步分析了mAb PhtD3、PhtD8、PspA16和PhtD7在肺炎球菌感染小鼠模型中的保护效力。
由于mAb PhtD3和PhtD8在通过流式细胞术进行的血清型结合分析中表现出最高的整体广度，因此进一步分析了这些mAb在小鼠模型中的保护效力。此外，选择这些mAb以确定mAb对PhtD的表位特异性是否会影响保护效力，因为它们靶向不重叠的表位。在肺炎球菌感染的小鼠模型中，针对PhtD的小鼠mAb和来自健康人类受试者和接种有PhtD疫苗的人的多克隆人类抗体已被证明对定植或疾病有保护作用。然而，还没有对人类mAb的保护效力进行过研究。
为了确定PhtD特异性mAb是否对感染有保护作用，在使用血清型3菌株(WU2)的肺炎球菌肺炎小鼠模型中检测了mAb PhtD3和PhtD8的效力，因为血清型3是侵袭性肺炎球菌疾病的主要病因。由于mAb是从人类杂交瘤中分离出来的，因此具有真实的人类Fc区，Fc区被同种型转换为最接近的小鼠同源物(人类IgG1变成小鼠IgG2a)。在HEK293F细胞中重组表达了具有小鼠IgG2aFc区的mAb PhtD3和PhtD8嵌合体(PhtD3-IgG2a和PhtD8-IgG2a)，以便在小鼠模型中进行测试。作为研究对照，购买了小鼠IgG2a同种型对照抗体。首先检查mAb的结合，以确保重组PhtD3-IgG2a和PhtD8-IgG2amAb仍能观察到结合，而同种型对照mAb则观察不到结合。如所预期的，PhtD3-IgG2a和PhtD8-IgG2a与重组PhtD的结合亲和力与杂交瘤衍生的PhtD相似，而同种型对照没有结合(图12A)。
PhtD3-IgG2a和PhtD8-IgG2a的预防效力首先在肺炎球菌血清型3的肺炎模型中进行了测试。与同种型对照相比，两种mAb都延长了小鼠的存活时间，尽管接受mAb PhtD3治疗的小鼠存活率更高(80％对30％)(图12B和12C)。由于mAb PhtD3-IgG2a保护的小鼠百分比较大，因此选择该mAb进行进一步分析。然后测试了mAb PhtD3-IgG2a对肺炎球菌血清型4(TIGR4)的保护效力，以确定广泛的结合是否与广泛的保护相关。对于该血清型，由于TIGR4在C57BL/6小鼠中的鼻内感染致死率不够高，因此采用CBA/N小鼠作为鼻内感染模型。CBA/N小鼠先前已被证明对血清型4易感(Sandgren et al.(2005)JInfect Dis 192：791-800)。PhtD3-IgG2a延长了小鼠的存活时间，提供了93％的保护，而同种型对照为47％(图12D)。由于无法在C57BL/6小鼠TIGR4鼻内感染模型中测试PhtD3-IgG2a，因此在C57BL/6小鼠中进行了一项实验，其中用TIGR4静脉内感染小鼠，以模拟脓毒性肺炎球菌感染。在这项研究中，PhtD3-IgG2a延长了小鼠的存活时间，效力为69％，而同种型对照的存活率为27％(图12E)。与mAb治疗肺炎球菌感染在临床上最相关的场景是在肺炎球菌感染后施用。为了模拟这种场景，小鼠感染了肺炎球菌血清型3，并在感染后24小时施用mAb PhtD3-IgG2a。在该模型中，65％的PhtD3-IgG2a治疗小鼠在感染后存活，而同种型对照组为10％(图12F)。
由于上述数据表明针对肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)的mAb具有保护作用，因此对针对PhtD不同区域的mAb PhtD7进行了评估，以确定它是否也具有保护作用。两组小鼠(n＝10/组)经鼻内感染5x106CFU的血清型3(WU2)肺炎链球菌。感染前两小时，小鼠经腹膜内注射施用PhtD7(全人源；15mg/kg)或同种型对照IgG2a(15mg/kg)。监测小鼠的存活率随时间的变化，并以百分比表示(图13A)。发现PhtD7具有显著的保护作用，与对照相比，存活率提高了80％。
此外，针对肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的mAb PspA16也被确定在鼠血清型3鼻内感染模型中具有显著的保护作用。三组C57BL/6小鼠(n＝10/组)经鼻内感染5x106CFU的血清型3(WU2)肺炎链球菌。感染前两小时，经腹腔注射向小鼠施用PspA16(全人源；15mg/kg)、同种型对照IgG2a(15mg/kg)或PBS。监测小鼠的存活率随时间的变化，并以百分比表示(图13B)。与同种型和PBS对照相比，发现PspA16治疗具有显著的保护作用，存活率提高了50％。
实施例4
感染后用mAB PhtD3和PhtD7联合治疗可提高存活率
由于上述数据表明mAB PhtD3和PhtD7都有保护作用，因此要确定这两种mAB的组合在感染后施用与感染前施用相比是否有保护作用。两组小鼠(n＝20/组)经鼻内感染5x106CFU的血清型3(WU2)肺炎链球菌。感染后24小时，小鼠经腹膜内注射施用PhtD3-IgG2a(标记为PhtD3)和PhtD7(各7.5mg/kg)的组合或同种型对照IgG2a(15mg/kg)。监测小鼠的存活率随时间的变化，并以百分比表示(图13C)。
鼻内感染后24小时腹膜内递送这两种mAb的组合具有显著作用，与同种型对照相比，存活率提高了75％(图13C)。
实施例5
PhtD特异性人类mAb具有调理吞噬活性
目前肺炎球菌疫苗的相关保护作用是基于激发抗荚膜抗体，这种抗体能调理细菌，导致宿主免疫细胞对它们的吞噬细菌并随后的细菌杀死(Romero-Steiner et al.(2006)Clin Vaccine Immunol 13：165-169；Paschall et al.(2019)JoVE e59400)。通过接种PhtD分离出的小鼠mAb先前已被证明能诱导细菌调理吞噬，而这种调理吞噬依赖于补体和巨噬细胞(Visan et al.(2018)Hum Vaccin Immunother 14：489-494)。为了确定PhtD3和其他PhtD mAb的潜在保护机制，利用使用HL-60细胞系建立的调理吞噬杀伤测定(OPKA)。针对血清型4(菌株TIGR4)、血清型3(菌株WU2)和血清型19A(菌株TCH8431)检测mAb，从其克隆PhtD和PspA构建体。这些mAb还与从采血前21天接种有的人类受试者获得的纯化IgG进行了比较，因为OPKA测定是衡量疫苗吸收的标准(Pilishvili(2015)Vaccine 33：D60-D65)。与无抗体和与人类变性肺病毒无关的mAb相比，所有PhtD mAb对所有三种血清型的菌落形成单位的诱导都有所下降(图14A)。PspA16也降低了针对所有三种血清型的菌落形成单位，尽管对血清型4的效力较低，如根据血清型结合数据所预期的。为了证实这些发现，采用了基于流动的测定，这种测定以前曾用于B群链球菌(Fabbrini etal.(2012)J Immunol Methods 378：11-19)。用pHRodoTM标记的经调理的细菌孵育HL-60细胞，所述标记导致经标记细菌被吞噬后，HL-60细胞发出荧光。与我们的OPA测定结果相似，与无抗体和同种型对照抗体相比，所有PhtD mAb都能诱导pHRodoTM+HL-60细胞的增加(图14B)。来自未接种供体的纯化IgG显示了最高数量的pHRodoTM+细胞，因为人类IgG含有针对多种肺炎球菌表面蛋白的抗体。有趣的是，在该测定中，PspA16也诱导增加了对所有三种血清型的摄取，尽管在血清型19A中观察到的活性最高，PspA基因就是从该血清型中克隆出来的。
实施例6
mAb PhtD3治疗降低了肺部和血液细菌滴度
下面描述了mAb PhtD3-IgG2a治疗对感染后3天肺部和血液细菌滴度的影响。
两组小鼠(n＝10/组)经鼻内感染5x106CFU的血清型3(WU2)肺炎链球菌。感染前两小时，小鼠经腹膜内注射施用PhtD3-IgG2a(标记的PhtD3；15mg/kg)或同种型对照IgG2a(15mg/kg)。感染后三天，对小鼠实施安乐死，收集肺部和血液。将肺部匀浆，对肺部匀浆和血液进行系列稀释并滴定在绵羊血琼脂板上。数据以肺部匀浆或血液中CFU/mL的loglo表示(图15)。使用非配对t检验对肺部和血液滴度进行统计学比较，显示与同种型对照组相比，p值分别为0.0002和0.009。
与同种型对照相比，肺部滴度降低了约4个对数值，有些经治疗的动物的滴度低于检测限。血液滴度显示了类似的结果，与同种型对照相比降低了约2.4个对数值，经PhtD3治疗的动物血液中均未出现可检测到的细菌水平(见图15)。
实施例7
mAb PhtD3在流感合并感染模型中具有保护作用
下面描述了mAb PhtD3-IgG2a治疗在流感合并感染模型中的保护作用。
三组小鼠(n＝20/组)经鼻内感染100FFU的甲型流感病毒CA04/09(IAV)。流感感染后七天，小鼠经鼻内感染1x104CFU的血清型3(WU2)肺炎链球菌。在肺炎链球菌感染前两小时，小鼠经腹膜内注射施用PhtD3-IgG2a(标记的PhtD3；15mg/kg)、同种型对照IgG2a(15mg/kg)或PBS。两组小鼠(n＝5/组)单独感染IAV或肺炎链球菌，以确保单独感染不会致死。
监测小鼠的存活率随时间的变化，并以百分比表示(图16)。使用对数秩(Mantel-Cox)检验对PhtD3与同种型对照组的存活曲线进行统计学比较，显示p值小于0.0001。与对照相比，接受PhtD3治疗的小鼠存活率提高了20％，并且与对照相比，到达死亡的时间明显延长。
鉴于所公开的本发明的原理可以应用于许多可能的实施方案，应该认识到，所阐述的的实施方案只是本发明的优选实施例，不应被视为对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们将这些权利要求的范围和精神内的内容视为我们的发明。
序列表
<110> 佐治亚大学研究基金会有限公司
<120> 针对肺炎球菌抗原的人类单克隆抗体
<130> 8618-105628-02
<150> US 63/147,393
<151> 2021-02-09
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<170> PatentIn version 3.5
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Ile Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Ser Pro Asn Thr Gly Ala Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Thr Arg Leu Ala Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Arg Gly Ser Tyr Asp Phe Arg Gly Asn Tyr Pro His
100 105 110
Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 HCDR1
<400> 26
Gly Asp Ile Phe Ser Asp Ser Tyr
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 HCDR2
<400> 27
Val Ser Pro Asn Thr Gly Ala Thr
1 5
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 HCDR3
<400> 28
Ala Arg Val Leu Arg Gly Ser Tyr Asp Phe Arg Gly Asn Tyr Pro His
1 5 10 15
Asp Phe Asp Tyr
20
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 VL
<400> 29
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Arg Gly His Asn Asn Tyr Pro
20 25 30
Ile Ala Trp Leu Gln Lys Gln Thr Asp Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met
35 40 45
Arg Leu Asn Ser Asp Gly Ser His His Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp
85 90 95
Thr Gly Leu Gln Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Phe Val Leu
100 105 110
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 LCDR1
<400> 30
Arg Gly His Asn Asn Tyr Pro
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 LCDR2
<400> 31
Leu Asn Ser Asp Gly Ser His
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 LCDR3
<400> 32
Gln Thr Trp Asp Thr Gly Leu Gln Gly Val
1 5 10
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 VH
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ala Leu Gly Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Trp Ala Pro Gly Ala Glu Tyr Leu His His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 HCDR1
<400> 34
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 HCDR2
<400> 35
Val Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr
1 5
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 HCDR3
<400> 36
Ala Arg Ala Trp Ala Pro Gly Ala Glu Tyr Leu His His
1 5 10
<210> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 VL
<400> 37
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp His Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Leu Lys
100 105
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 LCDR1
<400> 38
Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr
1 5
<210> 39
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 LCDR2
<400> 39
Gly Ala Ser
1
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 LCDR3
<400> 40
Gln Gln His Asp His Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 41
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD3 VH
<400> 41
caggtgcagc tagtgcagtc tgggcctgac gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggagc cgccttcgag agttttgcct tcgcctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggtttgagtg gatgggaagg atcattccaa tcttggaaac aagggactac 180
gcagagaagt tccagggcag aatgacgatg accacagacg agtcgacggc gacagcctac 240
atggaactga acagcctaag atttgaagac acggccgttt atttctgtgc gcgagatggg 300
cacattatga ggacaactct ctcggatgct gcacttgatg tctggggcca agggacaacg 360
gtcattgtct cctcag 376
<210> 42
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD3 VL
<400> 42
gacatcgtga tgacccagtc tccagtcacc ctgtctttgt ctccagggga gagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtcttact gacaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctac gccgcatcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggatca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagagtggag 240
cctgaagatt ttgcaatgtt ttactgtcaa cagtatcaga actcaccgtt caccttcggc 300
ggggggacca cggtggagat caaac 325
<210> 43
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD8 VH
<400> 43
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttctggata caccttcacc gactacttta tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacacg gtcttgaatg gatggggtgg atcaacccta accgcggtgt cacaaactat 180
acacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accaaggaca cgtccgtcac ctcagtctac 240
atggagctga gcaggctgac atctgacgac acggccctat attattgtgc gagaggtggt 300
acgcttgacc actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctctg 346
<210> 44
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD8 VL
<400> 44
cagcttgtgc tgactcaatc gccctctgcc tctgcctccc tgggagcctc ggtcaccctc 60
acctgcactc tgagcagtgg gcacagcacc tacgacatcg catggcatca gcagcagcca 120
ggaaagggcc ctcgacactt gatgagactt aacggtgatg gcagtcacac caacggggac 180
gggatccctg atcgcttctc aggctccagc tctggggctg agcgctacct caccatctcc 240
agcctccagt ctgaagatga ggctgactat tactgtcaca cctgggtcac taacattcat 300
ttggtgttcg gcggagggac caaactgacc gtcctag 337
<210> 45
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD6 VH
<400> 45
caggtgcagt tggtgcagtc tgggactgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
gcctgcaagg cttctggata caccttcact agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacgcga acagtggcaa cacaggctat 180
gcacaaaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccattac cacagcctac 240
atggacctga ttgatctgac atctgaggac acggccatat attactgtgc gagagggccg 300
tactgggtgg agaattggtt cgacacctgg ggccagggaa ccctggtcag cgtctcctca 360
g 361
<210> 46
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD6 VL
<400> 46
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtcggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtcg gagcattcgc agctttttaa attggtatca acaaaaacca 120
gggaaacccc ctaacctcct gatctataaa gcatccactt tgcacagtgg ggtcccgtct 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcaacaa tctacaaccc 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta atcagaagac cttcggccaa 300
gggaccaagg tggacatcaa ac 322
<210> 47
<211> 382
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 VH
<400> 47
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggaga catcttcagc gactcctata ttcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcctgagtg gatgggatgg gtcagcccta acactggtgc cacacattat 180
gcacagaagt tgcagggcag agtcaccatg accagcgaca cgtccatcag tacagcctat 240
ttggagctga ccaggctggc atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagtctta 300
aggggaagtt atgatttccg gggtaattat ccacatgatt ttgactactg gggccaggga 360
accctggtca ccgtctcctc ag 382
<210> 48
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD7 VL
<400> 48
cagcttgtgc tgactcaacc gccctctgcc tctgcctccc tgggagcctc ggtcaccctc 60
acctgcactc tgagcagagg acacaacaac taccccatcg cttggctcca aaagcagaca 120
gataagggcc ctcgttatgt gatgagactt aatagtgatg gcagccacca caagggggac 180
ggaatccctg atcgcttctc aggctccagt tctggggctg agcgctacct cagcatttcc 240
agtctccagc ctgaagatga ggctgaatac tactgtcaga cgtgggacac tggccttcag 300
ggggtgttcg gcggagggac caaactgttc gtcctag 337
<210> 49
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 VH
<400> 49
caggtgcagc tggtgcagtc tgggcctgac gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgtaaga cttctggata caccttcact ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg gtcaacccta acaccggtgg cacaagttat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccgtg accagggaca cgtccatcag cacagtctac 240
atggaactga gcgctctagg atctgacgac acggccatat atttctgtgc gagggcgtgg 300
gctccgggcg ctgagtacct ccaccactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 50
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA16 VL
<400> 50
gagattgtga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aacagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatcttt ggtgcgtcca acagggccac tggcatccca 180
gtcaggttca gtgccagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt tcgcagtgta ttactgtcag cagcatgatc actcaccatt cactttcggc 300
cctgggacca aagtggatct caaac 325
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA1-F引物
<400> 51
cgccatatga tggctaataa gaaaaaaatg atttt 35
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA247-F引物
<400> 52
cgccatatgg agctaaacgc taaacaa 27
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA436-F引物
<400> 53
cgccatatgg atgaagaaga aactccagcg 30
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA438-R引物
<400> 54
tagcggccgt taatggtgat ggtgatggtg ttcttcatct ccatcagggc 50
<210> 55
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA512-R引物
<400> 55
tagcggccgt taatggtgat ggtgatggtg ttttggagtg gctggttttt c 51
<210> 56
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PspA725-R引物
<400> 56
tagcggccgt taatggtgat ggtgatggtg aacccattca ccattggcat 50
<210> 57
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD1-F引物
<400> 57
catgccatgg ccatgaaaat caataaaaaa tatctagcag g 41
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD168-F引物
<400> 58
catgccatgg ccgcagataa tgctgttgct g 31
<210> 59
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD341-F引物
<400> 59
catgccatgg cctatcgttc aaaccattgg gt 32
<210> 60
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD645-F引物
<400> 60
catgccatgg ccgaccatta ccataacatc aaatttg 37
<210> 61
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD170-R
<400> 61
cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg attatctgct cttgagttat gattatg 57
<210> 62
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD343-R引物
<400> 62
cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg tgaacgataa cgaaggggaa t 51
<210> 63
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD647-R引物
<400> 63
cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg gtaatggtca taatgaggta tgattaaa 58
<210> 64
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PhtD838-R引物
<400> 64
cccaagcttt taatggtgat ggtgatggtg ctgtatagga gccggttga 49

Claims (33)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括：
a)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其包括分别如SEQ ID NO:1和5所示的VH和VL的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；
b)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO:25和29所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3；
c)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO:9和13所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3；
d)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO:17和21所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
e)VH和VL，其包括分别如SEQ ID NO:33和37所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，
其中所述单克隆抗体特异性结合肺炎链球菌。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中
a)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID NO:2、3、4、6、7和8所示的氨基酸序列；
b)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID NO:26、27、28、30、31和32所示的氨基酸序列；
c)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID NO:10、11、12、14、15和16所示的氨基酸序列；
d)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID NO:18、19、20、22、23和24所示的氨基酸序列；或
e)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID NO:34、35、36、38、39和40所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中
a)VH和VL分别包括与如SEQ ID NO:1和5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
b)VH和VL分别包括与如SEQ ID NO:25和29所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；或
c)VH和VL分别包括与如SEQ ID NO:9和13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
d)VH和VL分别包括与如SEQ ID NO:17和21所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；或
e)VH和VL分别包括与如SEQ ID NO:33和37所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其包括人类框架区。
5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中：
a)VH和VL分别包括如SEQ ID NO:1和5所示的氨基酸序列；
b)VH和VL分别包括如SEQ ID NO:25和29所示的氨基酸序列；
c)VH和VL分别包括如SEQ ID NO:9和13所示的氨基酸序列；
d)VH和VL分别包括如SEQ ID NO:17和21所示的氨基酸序列；或
e)VH和VL分别包括如SEQ ID NO:33和37所示的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包括人类恒定结构域。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体为人类抗体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其包括包含增加抗体半衰期的修饰的重组恒定结构域。
9.根据权利要求8所述的分离的抗体，其中所述修饰增加了与新生儿Fc受体的结合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或抗原结合片段包括如下所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)分别如SEQ ID NO:1和5所示，
b)分别如SEQ ID NO:25和29所示，
c)分别如SEQ ID NO:9和13所示，或
d)分别如SEQ ID NO:17和21所示；和
其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎球菌组氨酸三聚体蛋白(PhtD)。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:33和37所示的VH和VL的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；并且其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合肺炎球菌表面蛋白A(PspA)。
12.根据权利要求1-5或10-11中任一项所述的分离的抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的分离的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fv、Fab、F(ab’)2、scFV或scFV2片段。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其与可检测标志物缀合。
15.一种多特异性抗体，其包含权利要求1-14中任一项的抗体或抗原结合片段。
16.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-14中任一项的抗体或抗原结合片段、所述抗体或抗原结合片段的VH或VL或权利要求15的多特异性抗体。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子是编码VH或VL的cDNA序列。
18.根据权利要求16或17所述的核酸分子，其与启动子可操作地连接。
19.一种载体，其包含权利要求16-18中任一项的核酸分子。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求16-19中任一项的核酸分子或载体。
21.一种用于抑制肺炎链球菌感染的药物组合物，其包含有效量的前述权利要求中任一项的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体、核酸分子或载体；和
药学上可接受的载体。
22.一种生产与PhtD或PspA特异性结合的抗体、多特异性抗体或抗原结合片段的方法，其包括：
在宿主细胞中表达一种或多种编码权利要求1-15中任一项的抗体、抗原结合片段或多特异性抗体的核酸分子；和
纯化抗体、多特异性抗体或抗原结合片段。
23.一种检测受试者生物样品中肺炎链球菌的存在的方法，其包括：
在足以形成免疫复合物的条件下，使生物样品与有效量的权利要求1-15中任一项的抗体、多特异性抗体或抗原结合片段接触；和
检测生物样品中免疫复合物的存在，其中生物样品中免疫复合物的存在表明样品中肺炎链球菌的存在。
24.根据权利要求23所述的方法，其中检测生物样品中免疫复合物的存在表明受试者患有肺炎链球菌感染。
25.一种抑制受试者肺炎链球菌感染的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项的抗体、多特异性抗体、抗原结合片段、核酸分子、载体或药物组合物，其中受试者患有肺炎链球菌感染或有肺炎链球菌感染的风险。
26.根据权利要求25所述的方法，进一步包括向受试者施用抗生素。
27.根据权利要求25或26所述的方法，进一步包括选择有原发感染的受试者，其中原发感染增加了肺炎链球菌感染的风险。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述原发感染是流感、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、人类变性肺病毒或副流感病毒感染。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述原发感染是流感或严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)-2感染。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述肺炎链球菌是肺炎链球菌血清型3、血清型4和/或血清型19A。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述抗体、多特异性抗体、抗原结合片段、核酸分子、载体或药物组合物向受试者鼻内、静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内施用。
32.一种药物组合物，其包含权利要求1-19或21中任一项的抗体、抗原结合片段、多特异性抗体、核酸分子、载体或药物组合物，用于抑制受试者肺炎链球菌感染或检测生物样品中肺炎链球菌的存在。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述肺炎链球菌是肺炎链球菌血清型3、血清型4和/或血清型19A。
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