TWI628190B - 可結合及中和ｂ型流感病毒之人類結合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於結合B型流感病毒之血球凝集素且具有抗此等流感病毒之寬泛中和活性之結合分子，例如人類單株抗體。該等結合分子不結合A型流感病毒之血球凝集素。本發明進一步提供編碼該等結合分子之核酸分子及包含該等結合分子之組合物。該等結合分子可用於診斷、預防及/或治療B型流感病毒。

Description

可結合及中和B型流感病毒之人類結合分子及其用途
本發明係關於醫藥。本發明特定而言係關於能夠結合及中和B型流感病毒之人類結合分子，例如單株抗體或其抗原結合片段，特定而言結合及中和來自B/Yamagata譜系及/或B/Victoria譜系二者之B型流感病毒之中和性結合分子。另外，本發明係關於由B型流感病毒引起之感染、特定而言由來自B/Yamagata譜系及B/Victoria譜系二者之B型流感病毒引起之感染的診斷、預防及/或治療。
流感感染(亦稱作「influenza」或「flu」)係人類已知造成全世界每年3百萬與5百萬之間個嚴重患病病例及250,000與500,000之間個死亡的最常見疾病之一。流感在季節性流行中快速擴散，影響5-15%群體，且衛生保健費用負擔及生產力喪失較為廣泛(世界衛生組織(WHO))。造成人類及動物傳染性病狀之流感病毒有3種類型(A型、B型及C型)。當前，A型及B型病毒係造成在人類中觀察到之流感流行及大範圍流行之因素。
應對每年流感流行之現行方式包括每年接種疫苗，較佳產生異型交叉保護。然而，人類中之流傳流感病毒經受永久性抗原變化，此需要每年調適流感疫苗調配物以確保流感疫苗株與流傳流感株之間之 最近可能匹配。或者，諸如奧司他韋(oseltamivir，克流感®(Tamiflu®))等抗病毒藥可有效預防及治療流感感染。然而，顯示抗諸如奧司他韋等抗病毒藥抗性之流感病毒株數日益增加。
替代方式係研發基於抗體之預防或治療手段來中和各種季節性流感病毒。
最近已揭示識別系統發生組1之A型流感病毒(例如包含H1或H5亞型之HA之流感病毒)之HA保守主幹區中之表位的寬泛交叉中和性抗體(例如CR6261，參見WO2008/028946)，以及識別系統發生組2之A型流感病毒(例如包含H3及/或H7亞型之HA之流感病毒)之HA主幹區中之高度保守表位的交叉中和性抗體(例如CR8020、CR8043；參見WO 2010/130636)。最近，發現能夠結合及中和系統發生組1及系統發生組2二者之A型流感病毒以及B型流感病毒的抗體(例如CR9114，闡述於申請案第EP11173953.8號中)。
迄今為止，人們較少關注B型流感病毒。此可歸因於以下事實，主要侷限於人類作為宿主，B型流感病毒缺乏對於出現大範圍流行性A型流感株至關重要的大型動物儲體(reservoir)。然而，每年在大範圍流行之間期期間流行之累積影響超過大範圍流行且儘管可歸因於B型流感之發病率及死亡率低於(例如)H3N2病毒，但其高於H1N1病毒(Thompson(2003),Thompson(2004)。
B型流感病毒之演化特徵在於抗原及遺傳不同譜系共流傳延長時段。由原型病毒B/Victoria/2/87(Victoria譜系)及B/Yamagata/16/88(Yamagata譜系)代表之兩種譜系在當前較為著名(Kanegae(1990),Rota(1990))。直至出現B/Victoria譜系病毒之1980年代，B/Yamagata係主要流傳譜系。自當時開始，兩種B型流感譜系之漂變變體已在全球共流傳，其中兩種譜系於最近流感季節同時流傳。
考慮到B型流感病毒係每2-4年季節性流感流行之主要原因之事 實且鑒於由某些B型流感病毒引起之呼吸道疾病之嚴重程度，以及季節性流行之高度經濟影響，業內不斷需要用於預防及治療B型流感亞型之替代且有效之手段。因此需要能夠交叉中和B型流感病毒之結合分子，較佳為寬泛中和性人類結合分子。
本發明提供能夠特異性結合及中和來自B/Yamagata譜系及B/Victoria譜系二者之B型流感病毒株之結合分子，特定而言人類結合分子。該等結合分子不結合A型流感病毒亞型。
本發明亦係關於包含結合分子之免疫偶聯物及/或醫藥組合物，以及至少編碼人類結合分子之結合區之核酸分子。
本發明之結合分子、免疫偶聯物及/或核酸分子適於用作B型流感病毒之通用預防劑、診斷劑及/或治療劑，而不考慮成因性B型流感病毒之亞型。
圖1係基於競爭實驗之示意性表位定位圖。本發明中鑑別之抗B型流感抗體基於與B型流感HA之結合/競爭分成4組。
圖2顯示免疫螢光進入分析之結果，該分析經設計用於分析結合分子阻斷流感病毒結合受體及內在化之能力。A.藉由免疫螢光讀數測定對病毒進入之抑制；B.B/Florida/04/2006對MDCK細胞之感染。
圖3顯示本發明結合分子對病毒釋出之抑制。
圖4顯示B型流感感染細胞之掃描EM結果。
圖5顯示CR8033對小鼠之免受致命性B型流感感染(B/Florida/04/2006及B/Malaysia/2506/2004)影響之活體內保護。
下文給出本發明中所用術語之定義。
本文所用術語「包括(included或including)」視為後面為詞語 「不限於」。
本文所用術語「結合分子」係指完整免疫球蛋白，包括單株抗體，例如嵌合、人類化或人類單株抗體；或係指與完整免疫球蛋白競爭特異性結合免疫球蛋白之結合配偶體(例如HA)的包含抗原結合域及/或可變域之免疫球蛋白片段。不論結構如何，抗原結合片段皆與由完整免疫球蛋白識別之相同抗原結合。抗原結合片段可包含肽或多肽，該肽或多肽包含結合分子胺基酸序列之至少2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、175個、200個或250個鄰接胺基酸殘基的胺基酸序列。
本文所用術語「結合分子」包括業內已知所有免疫球蛋白類別及亞類。端視重鏈恆定域之胺基酸序列，可將結合分子劃分成五個主要類別之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將其中若干進一步劃分成亞類(同種型)，例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
抗原結合片段尤其包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、二鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、至少含有足以賦予(多)肽特異性抗原結合之免疫球蛋白片段之(多)肽等。上述片段可以合成方式或藉由酶促或化學裂解完整免疫球蛋白產生或其可藉由重組DNA技術進行遺傳改造。產生方法為業內所熟知且闡述於(例如)Antibodies：A Laboratory Manual，編輯：E.Harlow及D,Lane(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York中，其以引用方式併入本文中。結合分子或其抗原結合片段可具有一或多個結合位點。若存在一個以上結合位點，則結合位點可彼此相同或其可不同。
結合分子可為裸或未偶聯結合分子且亦可為免疫偶聯物之一部 分。裸或未偶聯結合分子意指不與效應部分或標籤(尤其例如毒性物質、放射性物質、脂質體、酶)偶聯、可操作地連接或以其他方式物理或功能締合的結合分子。應理解，裸或未偶聯結合分子並不排除除藉由附著效應部分或標籤以外經穩定、多聚體化、人類化或以任何其他方式操縱之結合分子。因此，一同包括所有經轉譯後修飾之裸及未偶聯結合分子，包括由產生重組結合分子之細胞在產生天然結合分子之細胞環境中進行且在製備初始結合分子後由人工引入修飾之情形。當然，術語裸或未偶聯結合分子並不排除結合分子在投與機體後與效應細胞及/或分子形成功能締合之能力，此乃因需要此等相互作用中之一些以施加生物學效應。因此，缺乏相關效應基團或標籤在定義上應用於活體外(非活體內)裸或未偶聯結合分子。
本發明所用術語「生物試樣」涵蓋多種試樣類型，包括生物來源之血液及其他液體試樣、固體組織試樣(例如生檢樣品)或組織培養物或源自其之細胞及其子代。該術語亦包括已在獲得後以任何方式操縱之試樣，該方式係例如藉由用試劑處理、溶解或富集某些組份(例如蛋白質或多核苷酸)。該術語涵蓋自任何物種獲得之各種臨床試樣，且亦包括培養中之細胞、細胞上清液及細胞溶解物。
本文所用術語「互補決定區」(CDR)意指結合分子(例如免疫球蛋白)之可變區內之序列，該等序列通常較大程度地促成在形狀及電荷分佈上與抗原上識別之表位互補之抗原結合位點。CDR區可對蛋白質或蛋白質片段之線性表位、不連續表位或構形表位具有特異性，該等表位以其天然構形存在於蛋白質上，或在一些情形下以藉由(例如)在SDS中溶解而變性之形式存在於蛋白質上。表位亦可由蛋白質之轉譯後修飾形式組成。
本文所用術語「缺失」表示與參考(通常為天然)分子相比分別不存在一或多個胺基酸或核苷酸殘基之胺基酸或核苷酸序列變化。
本文所用術語「調控表現之核酸序列」係指特定宿主有機體中可操作地連接之編碼序列之表現所必需及/或影響該表現之多核苷酸序列。調控表現之核酸序列，尤其例如適當的轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列、增強子序列；阻抑物序列或活化物序列；有效RNA處理信號，例如剪接及多核苷酸化信號；穩定細胞質mRNA之序列；增強轉譯效率之序列(例如，核糖體結合位點)；增強蛋白質穩定性之序列；及在期望時增強蛋白質分泌之序列，可為在所選宿主有機體中顯示活性之任何核酸序列且可源自與宿主有機體同源或異源之編碼蛋白質之基因。調控表現之序列之鑑別及使用為熟習此項技術者所熟知。
本文所用術語「功能變體」係指包含與參照核酸分子或結合分子之核苷酸及/或胺基酸序列相比改變一或多個核苷酸及/或胺基酸之核苷酸及/或胺基酸序列的核酸分子或結合分子。本發明結合分子之功能變體與參照結合分子相比能夠競爭與結合配偶體(即流感病毒)結合。換言之，參照結合分子之胺基酸及/或核苷酸序列之修飾並不顯著影響或改變由該核苷酸序列編碼或含有該胺基酸序列之結合分子之結合特性，即結合分子仍能夠識別及結合其靶標。功能變體可具有保守序列修飾，包括核苷酸及胺基酸取代、添加及缺失。該等修飾可藉由業內已知標準技術(例如定點誘變及隨機PCR介導之誘變)引入，且可包含天然以及非天然核苷酸及胺基酸。
保守胺基酸取代包括用具有類似結構或化學性質之胺基酸殘基替代胺基酸殘基者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺 酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸)、具有β具支鏈側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。熟習此項技術者應明瞭，亦可採用除上文所用者之外之其他胺基酸殘基家族分類。此外，變體可具有非保守胺基酸取代，例如，用具有不同結構或化學性質之胺基酸殘基替代胺基酸。類似微小變化形式亦可包括胺基酸缺失或插入或二者。可使用業內熟知之電腦程式發現確定可經取代、插入或缺失之胺基酸殘基而不消除免疫活性之指導。
核苷酸序列突變可為於一個基因座(點突變)作出之單一改變，例如轉換或顛換突變，或者，可於單一基因座插入、缺失或變化多個核苷酸。另外，可於核苷酸序列內任何數目之基因座作出一或多個改變。可藉由業內已知之任何適宜方法實施突變。
與A型流感病毒有關之術語「流感病毒亞型」係指特徵在於血球凝集素(H)與神經胺酸酶(N)病毒表面蛋白質之各種組合的A型流感病毒變體。A型流感病毒亞型可藉由其H編號來提及，例如「包含H1或H3亞型之HA之流感病毒」或「H1流感病毒」、「H3流感病毒」，或藉由H編號與N編號之組合來提及，例如「流感病毒亞型H3N2」或「H3N2」。術語流感病毒「亞型」具體包括各亞型內通常自突變引起且顯示不同致病特徵之所有個別流感病毒「株」。此等株亦可稱作病毒亞型之各種「分離物」。因此，本發明所用術語「株」與「分離物」可互換使用。
本文所用與本發明結合分子有關之術語「中和」係指不論達成中和之機制如何抑制流感病毒在活體外及/或在個體內複製之結合分子。因此，可藉由(例如)以下方式達成中和：抑制病毒附著或黏著至細胞表面，或在病毒附著至靶細胞後抑制病毒與細胞膜融合，或抑制病毒自感染細胞釋出，及諸如此類。
本文所用與本發明結合分子有關之術語「交叉中和(cross-neutralizing或cross-neutralization)」係指本發明結合分子中和來自B/Yamagata譜系與B/Victoria譜系二者之B型流感病毒及/或該等譜系內不同B型流感病毒株之能力。
本文所用術語「宿主」意欲指已引入諸如選殖載體或表現載體等載體之有機體或細胞。有機體或細胞可為原核或真核。較佳地，宿主係經分離宿主細胞，例如培養中之宿主細胞。術語「宿主細胞」僅表示，細胞經修飾用於(過)表現本發明結合分子且包括最初表現該等結合分子之B細胞且該等細胞已藉由永生化、擴增、增強表現等經修飾以過表現結合分子。應理解，術語宿主意欲不僅指特定標的有機體或細胞，且亦指此一有機體或細胞之子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與親代有機體或細胞不同但包括於本文所用術語「宿主」之範圍內。
術語「人類」在應用於本文所定義之結合分子時，係指直接源自人類或基於人類種系序列之分子。當結合分子源自或基於人類序列且隨後經修飾時，其仍應視為說明書中所用之人類。換言之，術語人類當應用於結合分子時，意欲包括具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區或基於出現於人類或人類淋巴球中且以某種形式修飾之可變區或恆定區的結合分子。因此，人類結合分子可包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基，包含取代及/或缺失(例如，藉由例如活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。「基於」本文所用係指以下情形：核酸序列可自模板準確拷貝，或例如藉由易錯PCR方法而具有微小突變，或以合成方式使其與模板準確匹配或具有微小修飾。
術語「插入」(亦稱為術語「添加」)表示與親代序列相比分別導致添加一或多個胺基酸或核苷酸殘基的胺基酸或核苷酸序列變化。
術語「經分離」當應用於本文所定義之結合分子時，係指實質上不含其他蛋白質或多肽、尤其不含具有不同抗原特異性之其他結合分子且亦實質上不含其他細胞材料及/或化學品的結合分子。例如，當結合分子係重組產生時，其較佳實質上不含培養基組份，且當結合分子係藉由化學合成產生時，其較佳實質上不含化學前體或其他化學物質，即，其係自參與蛋白質合成之化學前體或其他化學物質分離。術語「經分離」當應用於編碼本文所定義之結合分子之核酸分子時，意欲指以下核酸分子：編碼結合分子之核苷酸序列不含其他核苷酸序列、尤其編碼結合其他結合配偶體之結合分子之核苷酸序列。此外，術語「經分離」係指實質上自其他細胞組份分離之核酸分子，該等其他細胞組份天然伴隨天然宿主中之原有核酸分子，例如，與其天然關聯之核糖體、聚合酶或基因組序列。此外，「經分離」核酸分子(例如cDNA分子)當藉由重組技術產生時可實質上不含其他細胞材料或培養基，或當化學合成時實質上不含化學前體或其他化學物質。
本文所用術語「單株抗體」係指單特異性抗體分子製劑。單株抗體對於特定表位展示單結合特異性及親和力。因此，術語「人類單株抗體」係指展示單結合特異性之抗體，其具有源自或基於人類種系免疫球蛋白序列或源自完全合成序列之可變區及恆定區。製備單株抗體之方法與結合特異性無關。
本文所用術語「天然」在應用於物體時，係指物體或化合物可於自然界中發現之事實。例如，存在於有機體中可自自然界中之來源分離且未由人在實驗室中有意修飾之多肽或多核苷酸序列係天然的。
本發明中所用術語「核酸分子」係指核苷酸之聚合形式且包括RNA、cDNA、基因組DNA之有義鏈及反義鏈二者以及上述之合成形式及混合聚合物。核苷酸係指核糖核苷酸、去氧核苷酸或任一類核苷酸之修飾形式。該術語亦包括單鏈及雙鏈DNA形式。另外，多核苷酸 可包括藉由天然及/或非天然核苷酸連接而連接在一起之天然及經修飾核苷酸中之任一者或二者。核酸分子可經化學或生物化學修飾或可含有非天然或衍生化核苷酸鹼基，如彼此熟悉此項技術者將容易瞭解。此等修飾包括(例如)標記、甲基化、用類似物對一或多個天然核苷酸之取代、核苷酸間修飾，例如不帶電連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)、帶電連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側接部分(例如，多肽)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂內酯(psoralen)等)、螯合劑、烷基化劑及經修飾連接(例如，α變旋異構核酸等)。上述術語亦意欲包括任何拓撲構形，包括單鏈構形、雙鏈構形、部分雙螺旋構形、三螺旋構形、髮卡構形、環形構形及掛鎖構形。亦包括在經由氫鍵及其他化學相互作用結合指定序列之能力方面模擬多核苷酸之合成分子。此等分子為業內已知且包括(例如)肽連接取代分子主鏈中之磷酸酯連接之分子。除非另有說明，否則提及核酸序列涵蓋其補體。因此應理解，提及具有特定序列之核酸分子涵蓋具有其互補序列的其互補鏈。互補鏈亦可用於(例如)反義療法、雜交探針及PCR引子。
術語「可操作地連接」係指兩個或更多個通常物理連接且彼此具有功能關係之核酸序列元件。例如，若啟動子能夠起始或調控編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子可操作地連接至編碼序列，在此情形下，編碼序列應理解為「在啟動子之控制下」。
「醫藥上可接受之賦形劑」意指與活性分子(例如藥物、藥劑或結合分子)組合用於製備適合或便利劑型之任何惰性物質。「醫藥上可接受之賦形劑」係在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與包含藥物、藥劑或結合分子之調配物之其他成份相容的賦形劑。醫藥上可接受之賦形劑被廣泛應用且為業內已知。
本文所用術語「特異性結合」在提及結合分子(例如抗體)與其結 合配偶體(例如抗原)之相互作用時，意指該相互作用取決於結合配偶體上特定結構(例如抗原決定簇或表位)之存在。換言之，即使在結合配偶體存在於其他分子或有機體之混合物中時，抗體仍會優先結合或識別結合配偶體。結合可藉由共價或非共價相互作用或二者之組合介導。換言之，術語「特異性結合」意指免疫特異性結合抗原決定簇或表位且不免疫特異性結合其他抗原決定簇或表位。免疫特異性結合抗原之結合分子可以較低親和力結合其他肽或多肽，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、BIACORE或業內已知之其他分析所測定。免疫特異性結合抗原之結合分子或其片段可與帶有相同表位之相關抗原交叉反應。較佳地，免疫特異性結合抗原之結合分子或其片段不與其他抗原交叉反應。
本文所用「取代」表示一或多個胺基酸或核苷酸分別由不同胺基酸或核苷酸替代。
術語「治療有效量」係指本文所定義結合分子有效預防、改善及/或治療自感染B型流感病毒所引起之病況之量。本文所用改善可指降低流感感染之可見或可感知之疾病症狀、病毒血症或任一其他可量測表現。
術語「治療」係指治癒或停止或至少延遲疾病進展之治療性治療以及預防性或防範性措施。彼等需要治療者包括彼等已患有自流感病毒感染引起之病況者以及彼等欲預防流感病毒感染者。自流感病毒感染部分或完全恢復之個體亦可能需要治療。預防涵蓋抑制或減少流感病毒之擴散，或抑制或減緩一或多種與流感病毒感染相關之症狀之發作、發展或進展。
術語「載體」表示可插入第二核酸分子以供引入將於其中複製且在一些情形下表現之宿主中的核酸分子。換言之，載體能夠轉運已與其連接之核酸分子。本文所用術語「載體」涵蓋選殖以及表現載 體。載體包括(但不限於)質粒、黏粒、細菌人工染色體(BAC)及酵母人工染色體(YAC)以及源自噬菌體或植物或動物(包括人類)病毒之載體。載體包含由所提出宿主識別之複製起點及(在表現載體之情形下)啟動子及由宿主識別之其他調控區。藉由轉化、轉染或藉由利用病毒進入機制將含有第二核酸分子之載體引入細胞中。某些載體(例如，具有細菌複製起始點之載體可在細胞中複製)能夠在引入其之宿主中自主複製。其他載體可在引入宿主中時整合至宿主基因組中，且藉此連同宿主基因組一起複製。
在第一態樣中，本發明提供能夠特異性結合B/Yamagata及B/Victoria譜系之B型流感病毒株之血球凝集素(HA)且能夠中和B/Yamagata及/或B/Victoria譜系之該等B型流感病毒株的結合分子。根據本發明，結合分子不結合A型流感病毒之HA。結合分子能夠在活體外與活體內中和B型流感病毒。
較佳地，結合分子係人類結合分子。在較佳實施例中，結合分子係人類抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，結合分子結合不同於CR9114(如共同待決申請案EP11173953.8中所述)之表位之表位，該等結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：116之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：117之輕鏈可變區。已顯示，CR9114能夠結合及在活體內中和系統發生組1及2二者之A型流感病毒以及B型流感病毒。
在某些實施例中，結合分子結合B型流感病毒之HA蛋白質之頭部區域、特定而言B型流感病毒之HA1之頭部區域。
在某些實施例中，結合分子阻斷B/Yamagata譜系及/或B/Victoria譜系之B型流感病毒之細胞受體結合。
在某些實施例中，結合分子不阻斷B/Yamagata譜系及/或B/Victoria譜系之流感病毒之細胞受體結合。
在某些實施例中，結合分子阻斷B型流感病毒、特定而言B/Victoria譜系與B/Yamagata譜系二者之流感病毒株自受感染細胞釋出。
在某些實施例中，經分離結合分子能夠特異性結合B型流感病毒之血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者之B型流感病毒株，其中結合分子不結合A型流感病毒亞型之HA蛋白質，且包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：71中所述之胺基酸序列或與該胺基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：73中所述之胺基酸序列或與該胺基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列。
在實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：71之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：73之輕鏈可變區。
本發明亦提供能夠特異性結合B型流感病毒之血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者之B型流感病毒株的結合分子，其中結合分子不結合A型流感病毒亞型之HA蛋白質，且其中結合分子包含含有SEQ ID NO：1中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：2中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR2及含有SEQ ID NO：3中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR3。根據本發明，CDR區係根據Kabat等人(1991)，如Sequences of Proteins of Immunological Interest中所述。
在某些實施例中，結合分子包含含有SEQ ID NO：4中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：5中所述胺基酸殘基序列之 輕鏈CDR2及含有SEQ ID NO：6中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：3之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：4之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：5之輕鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：6之輕鏈CDR3。
本發明進一步提供免疫特異性結合B型流感病毒HA蛋白質上與結合分子相同之表位的結合分子，其包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：71之重鏈可變序列及含有胺基酸序列SEQ ID NO：73之輕鏈可變區。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：14之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：15之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：16之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：17之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：18之輕鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：19之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：26之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：27之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：28之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：29之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：24之輕鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：3O之輕鏈CDR3。
本發明亦提供以下結合分子：當B型流感病毒、特定而言B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004之HA之168位上之胺基酸係脯胺酸(P)時能夠特異性結合血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria譜系之B型流感病毒株、特定而言B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004，且當B型流感病毒、特定而言B/Malaysia/2506/2004之HA之168位上之胺基酸係麩醯胺酸(Q)時不能夠中和B/Victoria譜系之B型流感病毒 株、特定而言B/Malaysia/2506/2004。
在某些實施例中，本發明提供以下結合分子：當B型流感病毒、特定而言B型流感病毒株B/Florida/04/200之HA之38位上之胺基酸係離胺酸(K)時能夠特異性結合血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Yamagata譜系之B型流感病毒株、特定而言B型流感病毒株B/Florida/04/2006，且當B型流感病毒、特定而言B/Florida/04/2006之HA之38位上之胺基酸係麩胺酸(E)時亦能夠中和B/Yamagata譜系、特定而言B/Florida/04/2006之B型流感病毒株。
本發明進一步提供以下結合分子：能夠特異性結合B型流感病毒之血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者之B型流感病毒株，且不結合A型流感病毒亞型之HA蛋白質，且包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：75中所述之胺基酸序列或與該胺基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：77中所述之胺基酸序列或與該胺基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：75之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：77之輕鏈可變區。
在某些實施例中，結合分子包含由胺基酸序列SEQ ID NO：78組成之重鏈可變區及由胺基酸序列SEQ ID NO：79組成之輕鏈可變區。
在某些實施例中，本發明提供能夠特異性結合B型流感病毒之血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者之B型流感病毒株的結合分子，其中結合 分子不結合A型流感病毒亞型之HA蛋白質，且其中結合分子包含含有SEQ ID NO：7中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：8中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR2及含有SEQ ID NO：9中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有SEQ ID NO：10中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：11中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR2及含有SEQ ID NO：12或13中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：7之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：8之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：9之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：10之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：11之輕鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：12之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：7之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：8之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：9之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：10之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：11之輕鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：13之輕鏈CDR3。
本發明進一步提供免疫特異性結合B型流感病毒HA蛋白質上與結合分子相同之表位的結合分子，其包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：75之重鏈可變序列及含有胺基酸序列SEQ ID NO：77之輕鏈可變區。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：20之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：21之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：22之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：23之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：24之輕鏈CDR2及 含有胺基酸序列SEQ ID NO：25之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：31之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：32之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：33之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：4之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：5之輕鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：34之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，本發明提供以下結合分子：當B型流感病毒、特定而言B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004之HA之168位上之胺基酸係脯胺酸(P)時能夠特異性結合血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria譜系之B型流感病毒株、特定而言B型流感病毒株B/Malaysia/2506/2004，且當B型流感病毒、特定而言B/Malaysia/2506/2004之HA之168位上之胺基酸係麩醯胺酸(Q)時亦能夠中和B/Victoria譜系之B型流感病毒株、特定而言B/Malaysia/2506/2004。
在某些實施例中，本發明提供以下結合分子：當B型流感病毒、特定而言B型流感病毒株B/Florida/04/200之HA之38位上之胺基酸係離胺酸(K)時能夠特異性結合血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Yamagata譜系之B型流感病毒株、特定而言B型流感病毒株B/Florida/04/2006，且當B型流感病毒、特定而言B/Florida/04/2006之HA之38位上之胺基酸係麩胺酸(E)時不能夠中和B/Yamagata譜系、特定而言B/Florida/04/2006之B型流感病毒株。
本發明進一步提供以下結合分子：能夠特異性結合B型流感病毒之血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者之B型流感病毒株，其中結合分子不結合A型流感病毒亞型之HA蛋白質，且其中結合分子包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：113中所述之胺基酸序列或與該胺基酸序 列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合分子包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：115中所述之胺基酸序列或與該胺基酸序列具有至少或至少約80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列。
在實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：113之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO：115之輕鏈可變區。
在某些實施例中，本發明提供能夠特異性結合B型流感病毒之血球凝集素蛋白質(HA)且能夠中和B/Victoria/2/87譜系與B/Yamagata/16/88譜系二者之B型流感病毒株的結合分子，其中結合分子不結合A型流感病毒亞型之HA蛋白質，且其中結合分子包含含有SEQ ID NO：54中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：55中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR2及含有SEQ ID NO：56中所述胺基酸殘基序列之重鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有SEQ ID NO：57中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：5中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR2及含有SEQ ID NO：58中所述胺基酸殘基序列之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：54之重鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：55之重鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：56之重鏈CDR3，以及含有胺基酸序列SEQ ID NO：57之輕鏈CDR1、含有胺基酸序列SEQ ID NO：5之輕鏈CDR2及含有胺基酸序列SEQ ID NO：58之輕鏈CDR3。
本發明進一步提供免疫特異性結合B型流感病毒HA蛋白質上與結合分子相同之表位的結合分子，其包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：113之重鏈可變序列及含有胺基酸序列SEQ ID NO：115之輕鏈可變區。
與A型流感病毒一樣，B型流感病毒藉由結合靶細胞之細胞表面上之唾液酸殘基且在轉移至核內體後藉由將其膜與核內體膜融合並將基因組-轉錄酶複合物釋放細胞中來感染細胞。受體結合與膜融合過程二者皆係由HA糖蛋白介導。A型流感與B病毒二者之HA皆包含兩種在結構上不同之區，即球形頭部區域，其含有負責病毒附著至靶細胞且參與HA之血球凝集活性的受體結合位點；及主幹區，其含有對於病毒外膜與細胞之核內體膜之間之膜融合所需的融合肽。HA蛋白質係三聚物，其中各單體由兩個二硫化物連接之糖多肽組成，即HA1及HA2，其係在感染期間藉由前體(HA0)之蛋白水解裂解產生。裂解為病毒感染性所必需，此乃因需要預處理HA用於膜融合，以允許構形變化。經預處理分子之活化在核內體中發生於介於pH5與pH6之間之低pH下。且需要HA結構之深入變化。
在某些實施例中，結合分子能夠特異性結合HA蛋白質之HA1亞單位、特定而言HA1亞單位之頭部區域。結合分子可能能夠特異性結合HA蛋白質之HA1亞單位上之線性或結構及/或構形表位。HA分子可自病毒純化或重組產生且視情況在使用前分離。或者，HA可在細胞表面上表現。
本發明結合分子可能能夠特異性結合有活力、活的及/或有感染性或呈不活化/衰減形式之B型流感病毒。使病毒(例如流感病毒)不活化/衰減之方法為業內熟知且包括(但不限於)用福馬林(formalin)、β-丙內酯(BPL)、硫柳汞(merthiolate)及/或紫外光處理。
本發明結合分子亦可能夠特異性結合B型流感病毒之一或多個片段，尤其例如源自B型流感病毒亞型之一或多種蛋白質及/或(多)肽之製劑或B型流感病毒之一或多種重組產生之蛋白質及/或多肽。各種B 型流感株之核苷酸及/或蛋白質胺基酸序列可在GenBank-數據庫、NCBI流感病毒序列數據庫、流感序列數據庫(ISD)、EMBL-數據庫及/或其他數據庫中找到。在各別數據庫中找到此等序列為熟習此項技術者所熟知。
在另一實施例中，本發明結合分子能夠特異性結合上述蛋白質及/或多肽之片段，其中該片段至少包含由本發明結合分子識別之表位。本文所用「表位」係能夠以足夠高親和力結合本發明結合分子以形成可檢測抗原結合分子複合物之部分。
本發明結合分子可為完整免疫球蛋白分子，例如單株抗體，或結合分子可為其抗原結合片段，包括(但不限於)重鏈及輕鏈可變區、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、二鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體及至少含有足以賦予流感病毒株或其片段特異性抗原結合之免疫球蛋白片段的(多)肽。在較佳實施例中，本發明結合分子係人類單株抗體及/或其抗原結合片段。結合分子亦可為奈米抗體(nanobody)、α抗體(alphabody)、親和體(affibody)、FN3-域架構及基於(人類)重複蛋白質中之域之其他架構(如阿德耐汀(Adnectin)、昂替卡林(Anticalin)、達平(Darpin)等)或包含表位結合序列之其他架構。
在某些實施例中，結合分子係包含完全重鏈及輕鏈可變區以及完全重鏈及輕鏈恆定區之完整抗體。
在某些實施例中，結合分子具有補體依賴性細胞毒性活性(CDC)及/或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。
本發明結合分子可以未經分離或分離形式使用。此外，本發明結合分子可單獨或以混合物形式使用，該混合物包含至少一種本發明結合分子(或其變體或片段)及一或多種結合流感且具有流感病毒抑制效應之其他結合分子。換言之，結合分子可組合使用，例如，作為包 含兩種或更多種結合分子、其變體或片段之醫藥組合物。例如，具有不同但互補活性之結合分子可在單一療法中組合以達成期望預防、治療或診斷效應，但或者，具有相同活性之結合分子亦可在單一療法中組合以達成期望預防、治療或診斷效應。視情況，混合物亦可包含至少一種本發明結合分子及至少一種其他治療劑。較佳地，諸如M2抑制劑(例如，金剛烷胺、金剛乙胺)及/或神經胺酸酶抑制劑(例如，紮那米韋(zanamivir)、奧司他韋)等治療劑可用於預防及/或治療流感病毒感染。
通常，本發明結合分子可以低於0.2×10-4 M、1.0×10-5 M、1.0×10-6 M、1.0×10-7 M、較佳低於1.0×10-8 M、更佳低於1.0×10-9 M、更佳低於1.0×10-10 M、甚至更佳低於1.0×10-11 M且特定而言低於1.0×10-12 M之親和力常數(Kd值)結合其結合配偶體，即B/Yamagata及/或B/Victoria譜系之B型流感病毒及/或其片段。親和力常數對於抗體同種型可有所不同。例如，IgM同種型之親和力結合係指至少約1.0×10-7 M之結合親和力。親和力常數可(例如)使用表面電漿共振量測，例如使用BIACORE系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)量測。
本發明結合分子展現中和活性。可(例如)如本文所述量測中和活性。用於量測中和活性之替代分析闡述於(例如)WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,Geneva：World Health Organisation,2005，第2002.5版中。
通常，本發明結合分子具有50 μg/ml或更小、較佳20 μg/ml或更小之中和活性，更佳10 μg/ml或更小、甚至更佳5 μg/ml或更小之中和活性，如在如實例6中所述活體外病毒中和分析(VNA)中所測定。本發明結合分子可結合呈可溶形式之流感病毒或其片段(例如在試樣中或在懸浮液中)或可結合與載體或基板(例如，微量滴定板、膜及珠粒 等)結合或附著之流感病毒或其片段。載體或基板可由玻璃、塑膠(例如，聚苯乙烯)、多糖、耐綸(nylon)、硝酸纖維素或特夫綸(Teflon)等製得。此等載體之表面可為實心或有孔及任何便利形狀。此外，結合分子可結合呈純化/分離或未經純化/未經分離形式之流感病毒。
如上文所論述，本發明在某些實施例中提供能夠識別及結合B型流感病毒之流感血凝素蛋白(HA)中之表位的經分離人類結合分子，其中該等結合分子在活體外與活體內皆具有抗B/Yamagata及/或B/Victoria譜系二者之B型流感病毒的中和活性。根據本發明，已顯示，本發明結合分子交叉中和屬於兩種系統發生譜系之流感病毒亞型。熟習此項技術者基於本文所揭示之內容可確定抗體是否真正地與來自不同亞型之HA蛋白質交叉反應且亦可確定其是否能夠活體外及/或活體內中和不同亞型之流感病毒。
本發明之另一態樣包括上文所定義結合分子之功能變體。若變體結合分子能夠與「親代」或「參照」結合分子競爭免疫特異性結合流感病毒或其片段，則認為分子為本發明結合分子之功能變體。換言之，當功能變體仍能夠結合流感病毒或其片段之相同或重疊表位時，則認為分子係本發明結合分子之功能變體。對於本申請案而言，「親代」及「參照」將用作同義詞，意指參照或親代分子或物理分子本身之資訊構成變化形式之基礎。功能變體包括(但不限於)一級結構序列實質上類似之衍生物，包括彼等在Fc受體或參與效應功能之其他區中具有修飾及/或含有(例如)未在親代結合分子發現之活體外或活體內化學及/或生物化學修飾者。此等修飾尤其包括乙醯化、醯化、核苷酸或核苷酸衍生物之共價附著、脂質或脂質衍生物之共價附著、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化及諸如此類。或者，功能變體可為如本發明中所定義之結合分子，其包含與親代結合分子之胺基酸序列相比含有一或多個 胺基酸之取代、插入、缺失或其組合的胺基酸序列。此外，功能變體可在胺基或羧基端之一端或兩端包含胺基酸序列之截短形式。本發明功能變體與親代結合分子相比可具有相同或不同(更高或更低)結合親和力，但仍能夠結合流感病毒或其片段。例如，本發明功能變體與親代結合分子相比對流感病毒或其片段之結合親和力有所增加或降低。在某些實施例中，可變區(包括(但不限於)框架區、超變區、特定而言CDR3區)之胺基酸序列經修飾。通常，輕鏈及重鏈可變區包含三個超變區(包含三個CDR)及更為保守區(所謂的框架區(FR))。超變區包含來自CDR之胺基酸殘基及來自超變環之胺基酸殘基。意欲屬於本發明範圍內之功能變體與本文所定義親代結合分子具有至少約80%至約99%、較佳至少約70%至約99%、更佳至少約80%至約99%、甚至更佳至少約90%至約99%、最佳至少約95%至約99%、特定而言至少約97%至約99%胺基酸序列一致性及/或同源性。可使用熟習此項技術者已知之電腦演算法(尤其例如Gap或Bestfit)對欲比較之胺基酸序列進行比對及界定類似或相同胺基酸殘基。功能變體可藉由業內已知之一般分子生物學方法改變親代結合分子或其部分獲得，一般分子生物學方法包括(但不限於)易錯PCR、寡核苷酸定向誘變、定點誘變以及重鏈及/或輕鏈改組。
在某些實施例中，本發明功能變體具有抗B型流感病毒之中和活性。與親代結合分子相比，中和活性可相同或更高或更低。如本申請案中所用，當使用術語(人類)結合分子時，此亦涵蓋(人類)結合分子之功能變體。驗證變體結合分子是否具有中和活性之分析為業內熟知(參見WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,Geneva：World Health Organisation,2005第2002.5版)。
在某些實施例中，功能變體係包含以下之結合分子：與SEQ ID NO：71相比包含一或多個胺基酸突變(例如1個、2個、3個、4個、5 個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸突變)之重鏈可變序列及/或與SEQ ID NO：73相比包含一或多個胺基酸突變(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸突變)之輕鏈可變區。
在某些實施例中，功能變體係包含以下之結合分子：與SEQ ID NO：75相比包含一或多個胺基酸突變(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸突變)之重鏈可變序列及/或與SEQ ID NO：77相比包含一或多個胺基酸突變(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸突變)之輕鏈可變區。
在某些實施例中，功能變體係包含以下之結合分子：與SEQ ID NO：113相比包含一或多個胺基酸突變(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸突變)之重鏈可變序列及/或與SEQ ID NO：115相比包含一或多個胺基酸突變(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個胺基酸突變)之輕鏈可變區。
在某些實施例中，本發明結合分子係選自由包含以下之結合分子組成之群：(a)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：17之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：18之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：60之輕鏈CDR3；(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：62之輕鏈CDR1、包含胺基 酸序列SEQ ID NO：18之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：63之輕鏈CDR3；(c)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：64之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：65之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之輕鏈CDR3；及(d)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：67之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：68之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：69之輕鏈CDR3；(e)包含胺基酸序列SEQ ID NO：35之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：36之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：37之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：4之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：38之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之輕鏈CDR3；(f)包含胺基酸序列SEQ ID NO：40之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：41之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：42之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：43之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：5之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：44之輕鏈CDR3；(g)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：46之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：48之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：38之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO： 49之輕鏈CDR3；及(h)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：50之重鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：47之重鏈CDR3，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：51之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：52之輕鏈CDR2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：53之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，結合分子係選自由以下組成之群：a)包含重鏈可變區SEQ ID NO：119及輕鏈可變區SEQ ID NO：121之結合分子；b)包含重鏈可變區SEQ ID NO：123及輕鏈可變區SEQ ID NO：125之結合分子；c)包含重鏈可變區SEQ ID NO：127及輕鏈可變區SEQ ID NO：129之結合分子；d)包含重鏈可變區SEQ ID NO：131及輕鏈可變區SEQ ID NO：133之結合分子；e)包含重鏈可變區SEQ ID NO：77及輕鏈可變區SEQ ID NO：79之結合分子；f)包含重鏈可變區SEQ ID NO：101及輕鏈可變區SEQ ID NO：103之結合分子；g)包含重鏈可變區SEQ ID NO：105及輕鏈可變區SEQ ID NO：107之結合分子；及h)包含重鏈可變區SEQ ID NO：109及輕鏈可變區SEQ ID NO：111之結合分子。
在某些實施例中，本發明結合分子用作藥劑，且較佳用於治療性及/或預防性治療由B型流感病毒引起之流感感染。引起流感感染且可使用本發明結合分子治療之流感病毒可為B/Yamagata及/或 B/Vicforia譜系之B型流感病毒。
本發明亦係關於包含至少一種本發明結合分子及至少一種醫藥上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
在再一實施例中，本發明係關於本發明結合分子在製備用於預防及/或治療流感病毒感染之藥劑中之用途。
可使用本發明結合分子預防及/或治療之流感病毒感染可發生於小群體中，但亦可在季節性流行中或更糟糕地在全球大範圍流行(其中數百萬個體具有風險)中在全世界擴散。本發明提供可中和引起此等季節性流行以及潛在大範圍流行之流感株感染的結合分子。
在再一態樣中，本發明提供免疫偶聯物，即包含至少一種如本文所定義之結合分子且進一步包含至少一種標籤(尤其例如可檢測部分/試劑)之分子。本發明中亦涵蓋本發明免疫偶聯物之混合物或至少一種本發明免疫偶聯物與另一分子(例如治療劑或另一結合分子或免疫偶聯物)之混合物。在其他實施例中，本發明免疫偶聯物可包含超過一種標籤。該等標籤可彼此相同或不同且可非共價地接合/偶聯至結合分子。標籤亦可經由共價鍵結直接接合/偶聯至人類結合分子。或者，標籤可藉助一或多種連接化合物接合/偶聯至結合分子。將標籤偶聯至結合分子之技術為熟習此項技術者所熟知。
本發明免疫偶聯物之標籤可為治療劑，但其亦可為可檢測部分/試劑。適於療法及/或預防之標籤可為毒素或其功能部分、抗生素、酶、增強吞噬作用或免疫刺激之其他結合分子。包含可檢測試劑之免疫偶聯物可作為臨床測試程序之一部分在診斷上用於(例如)評價個體是否已感染流感病毒或監測流感病毒感染之發展或進展，以(例如)確定給定治療方案之功效。然而，其亦可用於其他檢測及/或分析及/或診斷目的。可檢測部分/試劑包括(但不限於)酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性材料、正電子發射金屬及非放射性順 磁性金屬離子。用於標記結合分子以供檢測及/或分析及/或診斷目的之標籤取決於所用具體檢測/分析/診斷技術及/或方法，尤其例如(組織)試樣之免疫組織化學染色、流式細胞術檢測、掃描雷射細胞術檢測、螢光免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、生物分析(例如，吞噬作用分析)、西方墨點法(Western blotting)應用等。用於業內已知檢測/分析/診斷技術及/或方法之適宜標記為熟習此項技術者所熟知。
此外，本發明之人類結合分子或免疫偶聯物亦可附著至固體載體，該等載體尤其可用於活體外免疫分析或純化流感病毒或其片段。此等固體載體可為有孔或無孔、平面或非平面。本發明結合分子可融合至標記物序列(例如肽)以促進純化。實例包括(但不限於)六組胺酸標籤、血球凝集素(HA)標籤、myc標籤或flag標籤。或者，抗體可偶聯至第二抗體以形成抗體異源偶聯物。在另一態樣中，本發明結合分子可偶聯/附著至一或多種抗原。較佳地，該等抗原係由投與結合分子-抗原偶聯物之個體之免疫系統識別的抗原。抗原可相同，但亦可彼此不同。附著抗原與結合分子之偶聯方法為業內熟知且包括(但不限於)使用交聯劑。本發明結合分子將結合流感病毒HA且附著至結合分子之抗原將起始T細胞對偶聯物的有力攻擊，此最終將破壞流感病毒。
除藉由直接或經由(例如)連接體間接偶聯以化學方式產生免疫偶聯物之外，亦可以包含本發明結合分子及適宜標籤之融合蛋白質之形式產生免疫偶聯物。融合蛋白質可藉由業內已知方法產生，例如，藉由構築包含編碼結合分子之核苷酸序列與框架內編碼適宜標籤之核苷酸序列的核酸分子且隨後表現核酸分子以重組方式產生。
本發明之另一態樣係提供編碼至少一種本發明結合分子、功能變體或免疫偶聯物之核酸分子。此等核酸分子可(例如)在如上文所述 親和力成熟過程中作為中間體用於選殖目的。在較佳實施例中，核酸分子係分離或純化的。
熟習此項技術者應瞭解，該等核酸分子之功能變體亦意欲成為本發明之一部分。功能變體係可使用標準遺傳密碼直接轉譯以提供與自親代核酸分子轉譯者相同之胺基酸序列之核酸序列。
較佳地，核酸分子編碼包含如上文所述CDR區之結合分子。在又一實施例中，核酸分子編碼包含本發明結合分子之2個、3個、4個、5個或甚至所有6個CDR區的結合分子。
在另一實施例中，核酸分子編碼包含重鏈之結合分子，該重鏈包含如上文所述可變重鏈序列。在另一實施例中，核酸分子編碼包含輕鏈之結合分子，該輕鏈包含如上文所述可變輕鏈序列。下文給出本發明結合分子之核苷酸序列以及重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。
本發明另一態樣係提供包含一或多種本發明核酸分子之載體，即核酸構築體。載體可源自質粒，尤其例如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；黏粒；噬菌體，例如λ、λ形、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T-偶數、T-奇數、T2、T4、T7等；植物病毒。載體可用於選殖及/或用於表現本發明結合分子且甚至可用於基因治療目的。本發明亦涵蓋包含一或多種本發明核酸分子可操作地連接至一或多種調控表現之核酸分子之載體。載體之選擇取決於所遵循重組程序及所用宿主。在宿主細胞中引入載體尤其可藉由磷酸鈣轉染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導之轉染、lipofectamin轉染或電穿孔實現。載體可自主複製或可與已整合其之染色體一起複製。較佳地，載體含有一或多種選擇標記物。標記物之選擇可取決於所選宿主細胞，但此對於本發明並不重要，如熟習此項技術者所熟知。其包括(但不限於)康黴素(kanamycin)、新黴素(neomycin)、嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素(hygromycin)、zeocin、皰疹單純性病毒之胸苷激酶基因(HSV-TK)、 小鼠之二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。本發明亦涵蓋包含一或多種編碼如上文所述人類結合分子之核酸分子可操作地連接至一或多種編碼可用於分離人類結合分子之蛋白質或肽之核酸分子的載體。該等蛋白質或肽包括(但不限於)麩胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白質、結合金屬之多組胺酸、綠色螢光蛋白質、螢光素酶及β-半乳糖苷酶。
含有上述載體之一或多個拷貝之宿主係本發明之又一態樣。較佳地，宿主係宿主細胞。宿主細胞包括(但不限於)哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或細菌來源之細胞。細菌細胞包括(但不限於)來自革蘭氏(Gram)陽性細菌或革蘭氏陰性細菌(例如艾氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌(E.coli))及假單孢菌屬(Pseuaomonas)之若干物種)之細胞。在真菌細胞群中，較佳使用酵母細胞。在酵母中之表現可藉由使用酵母株(尤其例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha))來達成。此外，可使用昆蟲細胞(例如來自果蠅及Sf9之細胞)作為宿主細胞。此外，宿主細胞可為植物細胞，尤其例如來自作物植物(例如林業植物)之細胞、或來自提供食物及原材料之植物(例如穀類植物或藥用植物)之細胞、或來自觀賞植物之細胞或來自花球作物之細胞。經轉化(轉基因)植物或植物細胞係藉由已知方法產生，例如，農桿菌屬(Agrobacterium)介導之基因轉移、葉圓片(leaf disc)之轉化、藉由聚乙二醇介導之DNA轉移實施之原生質體轉化、電穿孔、音波處理、微注射或基因槍(bolistic)基因轉移。另外，適宜表現系統可為桿狀病毒系統。在本發明中較佳為使用哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞或博斯黑色素瘤細胞)之表現系統。哺乳動物細胞提供轉譯後修飾最類似於哺乳動物來源之天然分子的經表現蛋白質。由於本發明涉及可能必須投與人類之分子，因此尤佳將為完全人類表現系統。因此，甚至更佳地，宿主細胞係人類細 胞。人類細胞之實例尤其為HeLa、911、AT1080、A549、293及HEK293T細胞。在較佳實施例中，人類產生細胞包含以可表現形式編碼腺病毒E1區之核酸序列之至少一功能部分。在甚至更佳實施例中，該等宿主細胞源自人類視網膜且經包含腺病毒E1序列之核酸永生化，例如911細胞或於1996年2月29日以編號96022940寄存於歐洲細胞培養物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC，CAMR，Salisbury,Wiltshire SP4 OJG,Great Britain)且以商標PER.C6®(PER.C6係Crucell Holland B.V.之注冊商標)出售之細胞系。出於本申請案之目的，「PER.C6細胞」係指以編號96022940寄存之細胞或祖細胞、上游或下游傳代細胞以及來自寄存細胞之祖細胞之後代以及上述之衍生物。在宿主細胞中產生重組蛋白質可根據業內熟知方法實施。使用以商標PER.C6®出售之細胞作為所關注蛋白質之產生平臺已闡述於WO 00/63403中，其揭示內容之全文以引用方式併入本文中。
產生本發明結合分子之方法係本發明之又一態樣。該方法包含以下步驟：a)在有益於表現結合分子之條件下培養本發明宿主，及b)視情況回收所表現結合分子。所表現結合分子可自無細胞提取物回收，但較佳地其係自培養基回收。上述產生方法亦可用於製備本發明結合分子及/或免疫偶聯物之功能變體。自無細胞提取物或培養基回收諸如結合分子等蛋白質之方法為熟習此項技術者所熟知。可藉由上述方法獲得之結合分子、功能變體及/或免疫偶聯物亦為本發明之一部分。
或者，除諸如宿主細胞等宿主中表現之外，本發明之結合分子及免疫偶聯物亦可藉由習用肽合成器以合成方式或在無細胞轉譯系統中使用源自本發明DNA分子之RNA核酸產生。如可藉由上述合成產生方法或無細胞轉譯系統獲得之結合分子及免疫偶聯物亦為本發明之一部分。
在再一實施例中，本發明結合分子亦可在轉基因非人類哺乳動物(尤其例如兔、山羊或奶牛)中產生並分泌至(例如)其乳中。
在再一替代實施例中，本發明結合分子可藉由在轉基因非人類哺乳動物(例如表現人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠或兔)中產生。較佳地，轉基因非人類哺乳動物具有編碼如上文所述人類結合分子之全部或一部分之包含人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因的基因組。可用流感病毒或其片段之純化或富集製劑對轉基因非人類哺乳動物實施免疫。對非人類哺乳動物實施免疫之方案已在業內充分確立。參見Using Antibodies：A Laboratory Manual，編輯：E.Harlow,D.Lane(1998),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York及Current Protocols in Immunology，編輯：J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober(2001),John Wiley & Sons公司，New York，其提示內容以引用方式併入本文中。免疫方案通常包括利用或不利用佐劑(例如弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及弗氏不完全佐劑)之多次免疫，但亦可包括裸DNA免疫。在另一實施例中，人類結合分子係由源自轉基因動物之B-細胞、血漿細胞及/或記憶細胞產生。在再一實施例中，人類結合分子係由藉由將自上述轉基因非人類哺乳動物獲得之B-細胞融合至永生化細胞製備的雜交瘤產生。可自上述轉基因非人類哺乳動物獲得之B-細胞、血漿細胞及雜交瘤以及可自上述轉基因非人類哺乳動物、B-細胞、血漿細胞及/或記憶細胞以及雜交瘤獲得之人類結合分子亦為本發明之一部分。
在再一態樣中，本發明提供包含至少本發明結合分子(較佳為人類單株抗體)、至少其功能變體、至少本發明免疫偶聯物及/或其組合之組合物。此外，該等組合物尤其可包含穩定分子(例如白蛋白或聚乙二醇)或鹽。較佳地，所用鹽係保持結合分子之期望生物學活性且 不賦予任何不期望之毒理學效應的鹽。若需要，則本發明人類結合分子可塗覆於材料中或上以保護其免受酸或可使結合分子不活化之其他天然或非天然條件之作用。
在再一態樣中，本發明提供至少包含如本發明中所定義之核酸分子的組合物。組合物可包含水溶液，例如含有鹽(例如，NaCl或上述鹽)、清潔劑(例如，SDS)及/或其他適宜組份之水溶液。
此外，本發明係關於包含至少本發明結合分子(例如人類單株抗體)(或其片段或變體)、至少本發明免疫偶聯物、至少本發明組合物或其組合之醫藥組合物。本發明醫藥組合物進一步包含至少一種醫藥上可接受之賦形劑。醫藥上可接受之賦形劑為熟習此項技術者熟知。本發明醫藥組合物可進一步包含至少一種其他治療劑。適宜試劑亦為熟習此項技術者所熟知。
在某些實施例中，本發明醫藥組合物包含至少一種其他結合分子，即醫藥組合物可為結合分子之混合劑或混合物。醫藥組合物可包含至少兩種本發明結合分子、或至少一種本發明結合分子及至少一種其他流感病毒結合及/或中和分子(例如針對HA蛋白質或針對存在於流感病毒(例如M2)上之其他抗原結構之另一抗體)及/或中和一或多種其他病原之結合分子。在另一實施例中，其他結合分子可經調配用於同時單獨或依序投與。
在某些實施例中，結合分子在組合使用時展現協同中和活性。本發明所用術語「協同」意指結合分子在組合使用時之組合效應大於其在個別使用時之加和效應。協同作用結合分子可結合流感病毒之相同或不同片段上之不同結構。一種計算協同作用之方式係藉助組合指數。組合指數(CI)之概念已由Chou及Talalay(1984)闡述。組合物可(例如)包含一種具有中和活性之結合分子及一種非中和結合分子。非中和及中和結合分子亦可協同作用以中和流感病毒。
在某些實施例中，醫藥組合物可包含至少一種本發明結合分子及至少一種其他結合分子，較佳其他流感病毒中和性結合分子。醫藥組合物中之結合分子較佳能夠與不同亞型之流感病毒反應。結合分子可具有高親和力且具有寬特異性。較佳地，兩種結合分子係交叉中和分子，此乃因其各自中和不同亞型之流感病毒。另外，較佳地，其儘可能多地中和不同流感病毒亞型中每一者之株。
在某些實施例中，醫藥組合物包含至少一種其他預防劑及/或治療劑。較佳地，該等其他治療劑及/或預防劑係能夠預防及/或治療流感病毒感染及/或自此一感染引起之病況的藥劑。治療劑及/或預防劑包括(但不限於)抗病毒劑。此等藥劑可為結合分子、小分子、有機或無機化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。目前用於治療感染流感病毒之患者的其他藥劑係M2抑制劑(例如，金剛烷胺、金剛乙胺)及/或神經胺酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、奧司他韋)。該等藥劑可與本發明結合分子組合使用。本文中之「組合」意指同時、作為單獨調配物或作為一種單一組合調配物、或根據依序投與方案作為單獨調配物以任何順序。能夠預防及/或治療流感病毒感染及/或自此一感染引起之病況之處於實驗階段的藥劑亦可用作可用於本發明中之其他治療劑及/或預防劑。
本發明之結合分子或醫藥組合物在用於人類之前可在適宜動物模型系統中進行測試。此等動物模型系統包括(但不限於)小鼠、雪貂及猴。
通常，醫藥組合物必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。本發明之結合分子、免疫偶聯物或組合物可呈粉末形式以供在遞送前或遞送時在適當醫藥上可接受之賦形劑重構。在使用無菌粉末來製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其可產生由活性成份與任何其他所期望成份構成之粉末(來自其先前 經無菌過濾之溶液)。
或者，本發明之結合分子、免疫偶聯物或組合物可呈溶液形式且可在遞送前或遞送時添加及/或混合適當醫藥上可接受之賦形劑以提供單位劑量可注射形式。較佳地，用於本發明中之醫藥上可接受之賦形劑適於高藥物濃度，可維持適當流動性且若需要，可延遲吸收。
醫藥組合物之最佳投與途徑之選擇將受到若干因素影響，包括組合物內活性分子之物理化學性質、臨床狀況之緊急程度及活性分子之血漿濃度與期望治療效應之關係。例如，若需要，則本發明結合分子可利用將保護其免於快速釋放之載劑製備，例如受控釋放調配物，包括埋植劑、透皮貼劑及微囊封遞送系統。尤其可使用生物可降解之生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。此外，可能需要用防止人類結合分子不活化之材料或化合物塗覆結合分子或共投與結合分子與該材料或化合物。例如，結合分子可以適當載劑(例如，脂質體或稀釋劑)投與個體。
投與途徑可分成兩個主要類別，經口及非經腸投與。較佳投與途徑係靜脈內或藉由吸入。
經口劑型尤其可調配呈錠劑、喉錠、菱形錠劑、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬質膠囊、軟質明膠膠囊、糖漿或酏劑、丸劑、糖衣錠、液體、凝膠或漿液。該等調配物可含有醫藥賦形劑，包括(但不限於)惰性稀釋劑、造粒劑及崩解劑、結合劑、潤滑劑、防腐劑、著色劑、矯味劑或甜味劑、植物油或礦物油、潤濕劑及增稠劑。
本發明醫藥組合物亦可經調配用於非經腸投與。用於非經腸投與之調配物尤其可呈水性或非水性等滲無菌無毒注射或輸注溶液或懸浮液形式。溶液或懸浮液可包含在所用劑量及濃度下對接受者無毒之試劑，例如1,3-丁二醇、灑林格氏溶液(Ringer’s solution)、漢克氏溶 液(Hank’s solution)、等滲氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局部麻醉劑、防腐劑、緩衝劑、增黏劑或增溶劑、水溶性抗氧化劑、油溶性抗氧化劑及金屬螯合劑。
在又一態樣中，本發明之結合分子(諸如人類單株抗體)(其功能片段及變體)、免疫偶聯物、組合物或醫藥組合物可用作藥劑或診斷劑。因此，本發明之另一態樣係使用本發明之結合分子、免疫偶聯物、組合物或醫藥組合物診斷、治療及/或預防流感病毒感染之方法。上述分子尤其可用於由B型流感病毒引起之流感病毒感染之診斷、預防、治療或其組合。其適於治療尚未經治療之罹患流感病毒感染之患者及已經或正在治療流感病毒感染之患者。
上述分子或組合物可結合可用於診斷、預防及/或治療之其他分子使用。其可在活體外、離體或活體內使用。例如，本發明之結合分子(例如人類單株抗體)(或其功能變體)、免疫偶聯物、組合物或醫藥組合物可與抗流感病毒(若有)之疫苗共投與。或者，疫苗亦可在投與本發明分子之前或之後投與。代替疫苗，抗病毒劑亦可結合本發明結合分子使用。適宜抗病毒劑如上文所述。
通常將該等分子以治療或診斷有效量調配於本發明之組合物及醫藥組合物中。或者，其可經單獨調配並投與。例如，可全身性施加諸如抗病毒劑等其他分子，同時可經注射內施加本發明結合分子。
治療可針對易感染流感之患者群。此等患者群包括(但不限於例如)老年人(例如50歲、60歲且較佳65歲)、幼兒(例如5歲、1歲)、住院患者及已用抗病毒化合物治療但顯示不充足抗病毒反應之已感染患者。
可調整劑量方案以提供最佳期望反應(例如，治療反應)。適宜劑量範圍可為(例如)0.01-100 mg/kg體重、較佳0.1-50 mg/kg體重、較佳0.01-15 mg/kg體重。此外，例如，可投與單次濃注劑，可經一段時間 投與若干分次劑量或可根據治療狀況緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。本發明之分子及組合物較佳無菌。使該等分子及組合物無菌之方法為業內熟知。可用於診斷、預防及/或治療之其他分子可以與針對本發明結合分子所提出類似之劑量方案投與。若單獨投與其他分子，則可在投與一或多種本發明人類結合分子或醫藥組合物之前(例如，之前2 min、5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、2 hr、4 hr、6 hr、8 hr、10 hr、12 hr、14 hr、16 hr、18 hr、20 hr、22 hr、24 hr、2天、3天、4天、5天、7天、2週、4週或6週)、與其同時或在其之後(例如，之後2 min、5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、2 hr、4 hr、6 hr、8 hr、10 hr、12 hr、14 hr、16 hr、18 hr、20 hr、22 hr、24 hr、2天、3天、4天、5天、7天、2週、4週或6週)將其投與患者。通常在人類患者中進行臨床試驗期間分選出確切劑量方案。
人類結合分子及包含人類結合分子之醫藥組合物尤其有用，且通常在作為活體內治療劑投與人類時較佳，此乃因接受者對所投與抗體之免疫反應通常將實質上小於由投與單株鼠類、嵌合或人類化結合分子偶然引起者。
在另一態樣中，本發明係關於本發明之結合分子(中和人類單株抗體)(其功能片段及變體)、免疫偶聯物、核酸分子、組合物或醫藥組合物之用途，其用於製備用於診斷、預防、治療或其組合流感病毒感染、特定而言由B型流感病毒引起之流感病毒感染之藥劑。
此外，包含至少本發明之結合分子(例如中和人類單株抗體)(其功能片段及變體)、至少免疫偶聯物、至少核酸分子、至少組合物、至少醫藥組合物、至少載體、至少宿主或其組合之套組亦為本發明之態樣。視情況，將本發明套組之上述組份包裝於適宜容器中並標記用於所指示病況之診斷、預防及/或治療。上述組份可作為水(較佳無菌) 溶液或作為重構用凍乾(較佳無菌)調配物儲存於單元或多劑量容器中。容器可自諸如玻璃或塑膠等多種材料形成且可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。套組可進一步包含較多容器，該等容器包含醫藥上可接受之緩衝劑。其可進一步包括自商業及使用者角度合意之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、填充劑、針、注射器、用於一或多種適宜宿主之培養基及可能甚至至少一種其他治療劑、預防劑或診斷劑。通常在治療、預防或診斷產品之商業包裝中可包括與套組相關之說明書，其含有關於(例如)此等治療、預防或診斷產品之適應症、用法、劑量、製造、投與、禁忌及/或有關其使用之警告之資訊。
本發明結合分子亦可有利地在活體外方法中用作診斷劑用於檢測流感病毒。因此本發明進一步係關於檢測試樣中之B型流感亞型流感病毒之方法，其中該方法包含以下步驟：(a)使用本發明結合分子及/或本發明免疫偶聯物分析生物試樣中B型流感病毒抗原之含量；及(b)比較B型流感病毒抗原之經分析含量與對照含量，其中B型流感病毒抗原之經分析含量與B型流感病毒抗原之對照含量相比增加指示B型流感病毒感染。
生物試樣可為包括(但不限於)來自(潛在)受感染個體之血液、血清、糞便、痰、鼻咽吸出物、枝氣管灌洗物、尿液、組織或其他生物材料之生物試樣或諸如水、飲料等非生物試樣。(潛在)受感染個體可為人類個體，且亦可使用本發明之人類結合分子或免疫偶聯物測試疑為流感病毒載體之動物中病毒之存在。首先可操縱試樣以使其更適於檢測方法。操縱尤其意指以病毒將崩解成諸如蛋白質、(多)肽或其他抗原片段等抗原組份之方式處理懷疑含有及/或含有病毒之試樣。較佳地，使本發明之人類結合分子或免疫偶聯物在一定條件下與試樣接 觸，該等條件允許在人類結合分子與可能存在於試樣中之病毒或其抗原組份之間形成免疫複合物。隨後藉由適宜手段檢測並量測指示試樣中存在病毒之免疫複合物(若有)之形成。此等方法尤其包括均質性及異質性結合免疫分析，例如放射免疫分析(RIA)、ELISA、免疫螢光、免疫組織化學、FACS、BIACORE及西方墨點分析。
尤其用於對患者血清及血液及血液源產物進行大規模臨床篩選之較佳分析技術係ELISA及西方墨點技術。尤佳為ELISA測試。在用作該等分析中之試劑時，將本發明之結合分子或免疫偶聯物便利地結合至微量滴定孔之內表面。本發明之結合分子或免疫偶聯物可直接結合至微量滴定孔。然而，本發明之結合分子或免疫偶聯物與孔之最大結合可在添加本發明之結合分子或免疫偶聯物之前藉由用多離胺酸預處理孔來達成。此外，本發明之結合分子或免疫偶聯物可藉由已知手段共價附著至孔。通常，使用濃度介於0.01 μg/ml至100 μg/ml之間之結合分子或免疫偶聯物用於塗覆，但亦可使用更高以及更低量。然後將試樣添加至經本發明結合分子或免疫偶聯物塗覆之孔。
本發明進一步提供治療或預防個體之B型流感病毒感染之方法，包含向個體投與治療或預防有效量之本發明之結合分子、免疫偶聯物及/或醫藥組合物。在某些實施例中，個體係哺乳動物，較佳為人類。
此外，本發明結合分子可用於鑑別流感病毒之具體結合結構。結合結構可為蛋白質及/或多肽上之表位。其可為線性，且亦可為結構及/或構形型。在一個實施例中，可藉助PEPSCAN分析來分析結合結構(尤其參見WO 84/03564、WO 93/09872、Slootstra等，1996)。或者，可針對能夠結合本發明結合分子之肽篩選包含來自流感病毒之蛋白質之肽的隨機肽文庫。
本發明進一步闡釋於以下實例及圖式中。該等實例不欲以任何 方式限制本發明之範圍。
實例 實例1 使用自記憶B細胞提取之RNA構築scFv噬菌體展示文庫.
藉由靜脈穿刺將周邊血液自正常健康供體採集於EDTA抗凝試樣管中。如WO 2008/028946中所述獲得單鏈Fv(scFv)噬菌體展示文庫，該案件以引用方式併入本文中。利用菌落PCR使用側接經插入VH-VL區之引子組檢查最終文庫之插入頻率(100-150個單菌落)。通常，超過95%的菌落顯示正確長度插入(參見表1)。使用菌落PCR產物進行隨後DNA序列分析以檢查序列變異並評價顯示完全ORF之菌落之百分比。此通常高於70%(參見表1)。亦分析V基因突變之頻率。約95%序列不呈指示成熟過程之種系組態且與用作文庫之RNA源之B細胞之記憶表型一致。
應用兩輪PCR擴增方式，使用顯示於WO 2008/028946中之引子組，以自各別供體譜分離免疫球蛋白VH及VL區。
對各別cDNA之第一輪擴增分別產生VH、Vκ及Vλ區之約650個鹼基對之7種、6種及9種產物。對於IgM記憶B細胞VH區擴增而言，組合使用OCM恆定引子(IgM恆定重鏈特異性)與OH1至OH7。第一輪擴增之熱循環程式為：96℃持續2 min(變性步驟)，96℃持續30 sec/60℃持續30 sec/72℃持續50 sec維持35次循環，72℃持續10 min進行最終延長及6℃冷凍。將產物加載於1%瓊脂糖凝膠上且使用凝膠提取管柱(Macherey-Nagel,MN)自該凝膠分離該等產物並在50 μl 5 mM Tris-HCl(pH 8.0)中溶析。使10%第一輪產物(5 μl)經受第二輪擴增。利用限制位點延伸該等引子，從而使得能夠將各別VL及VH區定向選殖至噬菌體展示載體PDV-C06中。第二輪擴增之PCR程式如下：96℃持續2 min(變性步驟)，96℃持續30 sec/60℃持續30 sec/72℃持續50 sec維持30次循環，72℃持續10 min進行最終延長及6℃冷凍。首先將第二輪產物(約350個鹼基對)加載於凝膠上且自瓊脂糖提取該等產物，如上文所述。然後根據免疫球蛋白基因產物中所發現J區段之天然出現彙集片段，從而分別產生VH、Vκ及Vλ可變區之7種、6種及9種彙集物，如表1及2中所示。
為獲得免疫文庫中之免疫球蛋白序列之正規化分佈，根據表1中所提及之百分比混合6種Vκ與9種Vλ輕鏈彙集物。用SalI及NotI限制酶消化此單一最終VL彙集物(5 μg)，將其加載於1.5%瓊脂糖凝膠(約350個鹼基對)上且使用MN-提取管柱自該凝膠分離該彙集物且如下將其連接於經SalI-NotI切割之PDV-C06載體(約5000個鹼基對)中：500 ng PDV-C06載體、70 ng VL插入物、5 μl 10×連接緩衝液(NEB)、2.5 T4 DNA連接酶(400 U/μl)(NEB)，且添加超純水直至總體積為50 μl(載體對插入物之比率係1：2)。在16℃水浴中過夜實施連接。接下來，用水使體積加倍，用等體積酚-氯仿-異戊醇(75：24：1)(Invitrogen)萃取，之後進行氯仿(Merck)萃取，且在-20℃下用1 μl Pellet Paint(Novogen)、10 μl乙酸鈉(3 M pH 5.0)及100 μl異丙醇沈澱2 hr。隨後在4℃下將所得試樣以20.000×g離心30 min。用70%乙醇洗滌所得沈澱且在室溫下以20.000×g離心10 min。去除乙醇且將沈澱風乾幾分鐘且隨後溶解於含有10 mM Tris-HCl(pH 8.0)之50 μl緩衝液中。使用2 μl連接混合物使用設定在1.7 kV、200 Ohm、25 μF(時間常數為約4.5 msec)之Genepulser II裝置(Biorad)在經冷凍0.1 cm電穿孔光析管(Biorad)中轉化40 μl TG-1電穿孔勝任(electro-competent)細胞(Agilent)。脈衝後，立即在37℃下用含有5%(w/v)葡萄糖(Sigma)之750 μl SOC培養基(Invitrogen)自光析管沖洗細菌且將其轉移至15 ml圓底培養管中。使用另一750 μl SOC/葡萄糖自光析管沖洗殘餘細菌且將其添加至培養管中。藉由在37℃下在振盪培育器中以220 rpm準確地 培養1 hr來回收細菌。將經轉化細菌平鋪於240 mm正方形大培養皿(NUNC)上，該等培養皿含有補充有50 μg/ml胺苄青黴素(ampicillin)及5%(w/v)葡萄糖(Sigma)之200 ml 2TY瓊脂(16 g/l細菌用胰蛋白腖、10 g/l細菌用酵母提取物、5 g/l NaCl、15 g/l瓊脂(pH 7.0))。出於計數目的將1對1000及1對10.000稀釋物平鋪於含有相同培養基之15 cm培養皿上。將此轉化程序依序重複20次且將完全文庫平鋪於總共10個正方形大培養皿上並在37℃培養爐中生長過夜。通常，使用上述方案獲得約1×107 cfu。藉由將細菌輕輕地刮至12 ml 2TY培養基/板中自板收穫中間VL輕鏈文庫。藉由OD600量測測定細胞質量且使用2×細菌之500 OD使用兩個maxiprep管柱(MN)根據製造商說明書進行大量質粒DNA製備。
類似於VL可變區，首先將第二輪VH-JH產物混合在一起以獲得正規J區段使用分佈(參見表2)，從而產生稱為PH1至PH7之7種VH子彙集物。使用表2中描述之百分比混合彙集物以獲得正規化序列分佈，從而獲得一個VH部分，用SfiI及XhoI限制酶將其消化且連接於如上文所述獲得之SfiI-XhoI切割之PDV-VL中間文庫中。除所用240 mm板之數目以外，TG1之連接裝配、純化方法、後續轉化及細菌之收穫準確地如針對VL中間文庫(參見上文)所述。對於最終文庫而言，使用20個板，從而產生約2×107 cfu。利用菌落PCR使用側接經插入VH-VL區之引子組檢查最終文庫之插入頻率(100-150個單菌落)。通常，超過95%的菌落顯示正確長度插入(參見表3)。使用菌落PCR產物進行隨後DNA序列分析以檢查序列變異並評價顯示完全ORF之菌落之百分比。此通常高於70%(參見表3)。亦分析V基因突變之頻率。約95%序列不呈指示成熟過程之種系組態且與用作文庫之RNA源之B細胞之記憶表型一致。最終，使文庫復蘇並藉由使用CT輔助噬菌體(參見WO 02/103012)擴增且將其用於藉由淘選方法進行噬菌體抗體選擇，如下 文所述。
實例2 帶有抗B型流感之單鏈Fv片段之噬菌體之選擇.
使用抗B型流感(B/Ohio/01/2005、B/Florida/04/2006及B/Brisbane/60/2008)之重組血球凝集素(HA)之抗體噬菌體展示文庫實施選擇。在PBS(5.0 μg/ml)中稀釋HA抗原，以每管2 ml將其添加至MaxiSorpTM Nunc-免疫管(Nunc)中，且在4℃下在旋轉輪上培育過夜。排空免疫管且用阻斷緩衝液(存於PBS中之2%脫脂乳粉(ELK))洗滌三次。隨後，用阻斷緩衝液完全填充免疫管且在室溫下培育1-2 hr。在室溫下將噬菌體展示文庫之等分試樣(350-500 μl，使用CT輔助噬菌體(參見WO 02/103012)擴增)在阻斷緩衝液(視情況：補充有10%未加熱不活化胎牛血清及2%小鼠血清)中阻斷1-2 hr。將阻斷噬菌體文庫添加至免疫管中，在室溫下培育2 hr，且用洗滌緩衝液(存於PBS中之0.05%(v/v)Tween-20)洗滌，以去除未結合噬菌體。藉由在室溫下與1 ml 100 mM三乙胺(TEA)一起培育10 min自各別抗原溶析經結合噬菌體。隨後，混合經溶析噬菌體與0.5 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5以中和pH。使用此混合物感染已在37℃下生長至約0.3之OD 600 nm之5 ml XL1-Blue大腸桿菌培養物。在37℃下使噬菌體感染XL1-Blue細菌30 min。然後，在室溫下將混合物以3000×g離心10 min且將細菌沈澱再懸浮於0.5 ml 2-胰蛋白腖酵母提取物(2TY)培養基中。將所得細菌懸浮液劃分於兩個補充有四環素(tetracycline)、胺苄青黴素及葡萄糖之2TY瓊脂板上。在使板在37℃下培育過夜後，自板刮出菌落且使用其來製備富集噬菌體文庫，基本上如De Kruif等人(1995a)及WO 02/103012中所述。簡言之，使用刮出細菌來接種含有胺苄青黴素、四環素及葡萄糖之2TY培養基且使其在37℃之溫度下生長至約0.3之OD 600 nm。添加CT輔助噬菌體且使其感染細菌，此後將培養基更換 成含有胺苄青黴素、四環素及康黴素之2TY。在30℃下持續培育過夜。第二天，藉由離心自2TY培養基去除細菌，此後使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl使培養基中之噬菌體沈澱。最終，將噬菌體溶解於具有1%牛血清白蛋白(BSA)之2 ml PBS中，過濾滅菌且用於下一輪選擇。對相同HA亞型或對不同亞型之HA實施第二輪選擇。
實施連續兩輪選擇，然後分離個別單鏈噬菌體抗體。在第二輪選擇後，使用個別大腸桿菌菌落來製備單株噬菌體抗體。基本上使個別菌落以96孔板形式生長至對數期且用VCS-M13輔助噬菌體感染，此後過夜產生噬菌體抗體。含有噬菌體抗體之上清液直接用於ELISA中用於結合HA抗原。或者，使噬菌體抗體經PEG/NaCl沈澱且過濾滅菌以用於ELISA與流式細胞術分析(通常用在ELISA中呈陽性之純系進行)。
實例3 HA特異性單鏈噬菌體抗體之確認
在ELISA中確認在上述篩選中獲得之含有單鏈噬菌體抗體之所選上清液之特異性，即結合不同HA抗原。出於此目的，將表現桿狀病毒之重組B型流感HA(B/Ohio/01/2005、B/Malaysia/2506/2004、B/Jilin/20/2003、B/Brisbane/60/2008及B/Florida/04/2006)(Protein Sciences,CT,USA)塗覆(0.5 μg/ml)至MaxisorpTM ELISA板上。在塗覆後，用含有0.1% v/v Tween-20之PBS將板洗滌三次且在室溫下在含有2% ELK之PBS中阻斷1 hr。將所選單鏈噬菌體抗體在含有4% ELK之等體積PBS中培育1 hr，以獲得經阻斷噬菌體抗體。將板排空，用PBS/0.1% Tween-20洗滌三次且將經阻斷單鏈噬菌體抗體添加至孔中。培育一小時；用PBS/0.1% Tween-20將板洗滌五次。使用偶聯至過氧化物酶之抗M13抗體檢測(使用OD 492nm量測)經結合噬菌體抗體。作為對照，同時不利用單鏈噬菌體抗體及利用無關陰性對照單鏈 噬菌體抗體實施程序。
自用免疫文庫對不同HA抗原進行選擇，獲得14種對Yamagata樣與Victoria樣B型流感HA二者具有特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(sc08-031、sc08-032、sc08-033、sc08-034、sc08-035、sc08-059、sc10-023、sc10-032、sc10-049、sc10-051、sc11-035、sc11-036、sc11-038及sc11-039)。參見表4。
使用該14種噬菌體抗體來構築完全人類免疫球蛋白以供進一步表徵(參見實例4)。
實例4 自所選單鏈Fv構築完全人類免疫球蛋白分子(人類單株抗體)
自所選特異性單鏈噬菌體抗體(scFv)純系，獲得質粒DNA且使用標準定序技術測定核苷酸序列。使用IMGT/V-QUEST搜索頁(Brochet，等人(2008))確定scFv之VH及VL基因一致性(參見表5)。
藉由限制性消化(SfiI/XhoI)選殖scFv之重鏈可變區(VH)以供在用相同酶消化之IgG表現載體pIg-C911-HCγ1中表現。亦使用用於插入片段之SalI/NotI及用於靶載體之XhoI/NotI將輕可變區(VL)選殖至其IgG指定表現載體pIG-C909-Cκ或pIg-C910-Cλk中，如先前於WO 2008/028946中所述。
為去除一種抗體(CR8059)中之潛在去醯胺位點，藉由裝配PCR產生單一胺基酸突變抗體(CR8071)。產生兩個各自含有期望突變之重疊PCR片段。將該等片段以等莫耳比率混合且在第二輪PCR中用作模板以獲得全長LC序列。使用標準定序技術確認所有構築體之核苷酸序列。將編碼人類IgG1重鏈及輕鏈之所得表現構築體一起在HEK293T細胞中瞬時表現。一週後，獲得含有人類IgG1抗體之上清液且使用標準純化程序處理。針對B型流感HA抗原在介於10 μg/ml至0.003 μg/ml之間之濃度範圍中滴定人類IgG1抗體(數據未顯示)。包括無關抗體作 為對照抗體。
所選免疫球蛋白分子之重鏈及輕鏈二者之CDR的胺基酸序列於表5中給出。重鏈及輕鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列於下文給出。
實例5 抗B型流感IgG之交叉結合反應性
使用所選抗B型流感抗體藉由FACS分析來測試結合寬度。出於此目的，使用lipofectamin(Invitrogen)以1對5之比率將編碼HA之全長重組B型流感表現載體(B/Mississippi/04/2008、B/Houston/B60/1997、B/Nashville/45/1991、B/Florida/01/2009、B/Mississippi/07/2008及B/Ohio/01/2005)轉染至PER.C6®細胞中。轉染後48小時，藉由FACS(CantoII,BD bioscience)分析在表面上表現B型流感HA之PER.C6®細胞。對此，將細胞與IgG抗體一起培育1小時，之後用含有0.1%BSA之PBS實施三個依序洗滌步驟。使用亦培育1小時之PE-偶聯二級抗人類抗體檢測結合抗體。作為陰性對照，使用未經轉染PER.C6®細胞且將其與二級抗體一起培育。FACS結果顯示，B型流感結合抗體CR8033、CR8059、CR8071、CR10032及CR10051顯示結合所有6種所測試B型流感HA(表6)。
實例6 競爭結合交叉反應性抗B型流感IgG之HA
確認上述抗B型流感IgG抗體競爭B型流感HA上之表位。對此，使用EZ-連接磺基-NHS-LC-LC-生物素套組(Pierce)用生物素標記B/Brisbane/60/2008、B/Florida/04/2006及B/Jillin/20/2003。將1 μl 10 mM生物素溶液(其係6倍莫耳過量之生物素)添加至110 μg重組HA中，且在室溫下培育30至40分鐘。使用Amicon超離心過濾器(0.5 ml,10K Ultracel-10K膜；Millipore，目錄編號：UFC501096)去除游離未納入 生物素。對此，將試樣(300 μl)加載於管柱上且在埃彭道夫臺式離心機(Eppendorf tabletop centrifuge)(20800 rcf)中以14000 RPM旋轉10分鐘。丟棄流動槽且將0.4 ml DPBS緩衝液加載於管柱上並再次旋轉。將此步驟重複兩次。藉由倒置管柱將經標記試樣回收至新收集管中；然後加載200 μl DPBS並在臺式離心機中以1000 rpm旋轉1分鐘。使用Nanodrop ND-1000裝置(Thermo Scientific)量測HA濃度。
使用在室溫下在動態緩衝液中預先潤濕30分鐘之經抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)塗覆之生物感測器(ForteBio，目錄編號為18-5019)根據表7中之設定在Octet-QK生物層干涉儀(ForteBio)上進行實際競爭實驗。當第二抗體在第一抗體存在下能夠結合B型流感HA時，認為此無競爭性(參見表8)。作為對照，使用主幹結合抗體CR9114(如共同待決申請案EP11173953.8中所述)及不結合抗體CR8057(如WO2010/130636中所述)。
抗體CR10023及CR10049與CR8033競爭結合。抗體CR10032及CR10051與CR8059競爭結合。抗體CR10049與CR10032競爭結合。所測試抗體皆不與主幹結合抗體CR9114競爭。該等結果指示，B型流感HA上存在至少3至4個不同表位(圖1)。
實例7 IgG之交叉中和活性
為確定所選IgG是否能夠阻斷多種B型流感株，實施活體外病毒中和分析(VNA)。對在MDCK細胞培養基(補充有20 mM Hepes及0.15%(w/v)碳酸氫鈉之MEM培養基(完全MEM培養基)，補充有10%(v/v)胎牛血清)中培養之MDCK細胞(ATCC CCL-34)實施VNA。將用於分析中之B型流感Yamagata樣(B/Harbin/7/1994及B/Florida/04/2006)及Victoria樣(B/Malaysia/2506/2004及B/Brisbane/60/2008)株全部稀釋至5.7×103 TCID50/ml(50%組織培養感染劑量/ml)之滴定度，其中根據 Spearman及Karber之方法計算滴定度。將IgG製劑(100 μg/ml)於一式四份孔中連續2倍稀釋(1：2-1：512)於完全MEM培養基中。將50 μl各別IgG稀釋物與50 μl病毒懸浮液(100 TCID50/35 μl)混合且在37℃下培育1 hr。然後將懸浮液以一式四份轉移至含有存於100 μl完全MEM培養基中之鋪滿MDCK培養物之96孔板中。在使用前，將MDCK細胞以2×104個細胞/孔播種於MDCK細胞培養基中，使其生長直至細胞已達到鋪滿，用300-350 μl PBS(pH 7.4)洗滌且最終將100 μl完全MEM培養基添加至各孔中。在37℃下將所接種細胞培養3-4天且每天觀察致細胞病變效應(CPE)之發展。比較CPE與陽性對照。
CR8032、CR8033、CR8034、CR8035、CR8059、CR8071、CR10023、CR10032、CR10049、CR10051、CR11035、CR11036、CR11038及CR11039全部顯示對Yamagata及Victoria樣B型流感病毒株二者之代表株之交叉中和活性。參見表9。
實例8 IgG之受體結合阻斷活性
為確定所選IgG是否能夠阻斷受體介導之B型流感株與宿主細胞之結合，實施血球凝集抑制(HI)分析。將B型流感Yamagata樣(B/Harbin/7/1994及B/Florida/04/2006)及Victoria樣(B/Malaysia/2506/2004及B/Brisbane/60/2008)病毒株稀釋至8個HA單位(如在HAU分析中所測定)，且與等體積連續稀釋之IgG組合並在室溫下培育1 hr。將等體積之0.5%火雞紅血球(TRBC)添加至孔中，並持續培育30 min。對扣狀物形成(Button formation)評分作為血球凝集之證據。
CR8059、CR8071、CR10032、CR10051及CR11036不顯示對任何所測試B型流感病毒株之HI活性(CR11036>10 μg/ml，其他抗體>50 μg/ml)，從而指示，其不阻斷受體結合。抗體CR8033及CR10023顯示 對僅Yamagata-而非Victoria樣B型流感病毒株之代表株之HI活性。抗體CR11035顯示對僅Victoria-而非Yamagata樣B型流感病毒株之代表株之HI活性。抗體CR10049、CR11038及CR11039顯示對Yamagata與Victoria樣B型流感病毒株二者之代表株之HI活性。參見表10。
或者，設計免疫螢光進入分析來分析給定抗體阻斷病毒之受體結合及內在化之能力。因此，預培育病毒與連續兩倍稀釋步驟中之抗體，然後將其於感染培養基(DMEM+200 mM麩醯胺酸)中添加至平鋪於96孔盤中之鋪滿單層MDCK細胞並保持2至3小時。隨後去除接種物並用所示濃度之抗體替代並在37℃、5% CO2下保持16-18 hr。此後，去除上清液並將板在80%丙酮中固定以供隨後藉由使用小鼠單株抗NP一級抗體(Santa Cruz,sc-52027)及Alexa488-偶合抗小鼠二級抗體(Invitrogen A11017)標記感染細胞、之後用DAPI標記細胞核實施免疫螢光檢測(參見圖2a)。如利用HI分析所發現，抗體CR8033特異性阻斷Yamagata樣病毒B/Florida/04/2006而非Victoria樣病毒B/Malaysia/2506/2004之病毒進入。抗體CR8059不阻斷所測試B型流感病毒之進入。隨後使用BD Pathway 855生物成像器分析一些板。為評價進入抑制程度，使用BD Pathway成像分析工具分析每給定孔高於界定背景之螢光強度及感染細胞(使用DAPI染色來界定細胞)之量。經抗體之所示稀釋物處理之感染細胞與經不結合對照抗體處理之感染細胞相比之百分比展示於圖2b中。
實例9 抗HA IgG之釋出抑制
為研究抗體之作用機制，設計釋出分析來分析在抗體處理條件下感染後18 hr病毒粒子釋放至上清液中之量。在此等上清液凝膠電泳、之後西方墨點後檢測到(或不存在)抗HA信號視為存在(或不存在)所釋放病毒粒子之指示。
在實驗前4小時，將40,000個MDCK細胞/孔於DMEM/麩醯胺酸中播種至96孔板中。在單獨實驗中滴定達成90-100%感染所需病毒量。將所需量病毒添加至細胞且在37℃、5% CO2下培育。3小時後，去除上清液並用PBS將細胞洗滌三次以去除未內在化病毒粒子。用含有mAb(以20 μg/ml開始之連續稀釋物)之感染培養基補充細胞。在37℃、5% CO2下16-18 hr後，收穫上清液並溶解剩餘細胞(Tris HCl pH 7.5,150 mM NaCl,5 mM EDTA,1%(v/v)Triton-X)。使試樣經受SDS-PAGE/西方墨點以分析釋放至上清液中之病毒粒子之量，如藉由使用兔多株抗HA染色(Protein Sciences)、之後HRP-偶合抗兔F(ab’)2-片段(Jackson Immuno Research Laboratories,111-036-047)使WB顯影所量測。如圖3中所示，抗體CR8033與CR8059二者皆以濃度依賴性方式抑制病毒粒子之釋放。其他實驗已顯示，至少CR8071及CR10051亦抑制病毒粒子之釋放。
藉由用80%丙酮固定以相同方式處理之孔來檢查對細胞之適當感染。使用免疫螢光標記利用小鼠單株抗NP一級抗體(Santa Cruz,sc-52027)及Alexa488-偶合抗小鼠二級抗體(Invitrogen A11017)來評價感染量。隨後使用BD Pathway 855生物成像器分析板(結果未顯示)。
實例10 B型流感感染細胞之掃描電子顯微術
在實驗前一天將MDCK細胞播種於玻璃蓋玻片上。第二天，用不同量之病毒感染細胞以確定在感染後18 hr產生90-100%感染細胞之量。初始感染後三小時，去除上清液；用PBS將細胞洗滌三次，然後添加含有所示濃度抗體之培養基。再經過15-18 hr後，去除細胞培養基且將細胞在2.5%戊二醛緩衝液中固定並儲存在4℃下直至進一步分析。使用戊二醛(GA)及/或四氧化鋨(OsO4)將試樣進一步化學固定。在SEM成像前，使樣品經受丙酮去水及臨界點乾燥。最終，將細 胞封固於氧化鋁平臺(alumina stub)上並用碳薄層塗覆且在Zeiss Ultra 55 SEM顯微鏡中檢查。
與未受感染對照(圖4a)相比，B型流感感染之MDCK細胞之表面覆蓋有電子緻密球形粒子(圖4b)。與抗體CR8059一起培育不會阻止該等球形粒子之形成(圖4c)，而與抗體CR8033一起培育顯著減少粒子之形成(圖4d)。與CR8059培育之細胞相比，在CR8033培育之細胞上不能容易地檢測到出芽病毒粒子(圖4e及f)。
實例11 人類IgG單株抗體活體內抗致命性B型流感攻擊之預防活性
實施研究以測試單株抗體CR8033及CR8071活體內抗兩種B型流感病毒之致命性攻擊之預防效應。在小鼠致命性攻擊模型中利用適應小鼠之B型流感/Florida/04/2006病毒測試mAb CR8033及CR8071之預防功效。使B/Florida/04/2006病毒在5次肺至肺傳代後適應小鼠。使適應小鼠之B型流感第5次傳代病毒在含胚雞蛋中繁殖。使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8週齡，n=8隻/組)適應並維持至少4天時間，然後開始實驗。於攻擊前第-1天將mAb CR8033及CR8071以0.06 mg/kg、0.2 mg/kg、0.6 mg/kg、1.7 mg/kg及5 mg/kg經靜脈內給予至尾靜脈(尾骨肌靜脈)中，假定每只小鼠平均重量為18 g且固定劑量體積為0.2 ml。同時向對照組給予媒劑對照。然後於第0天藉由鼻內接種用25 LD50適應小鼠之B/Florida/04/2006 B型流感病毒攻擊小鼠。圖5顯示在投與mAb後小鼠之存活率。向小鼠給予劑量低至0.2 mg/kg之CR8033及0.6 mg/kg之CR8071顯示顯著高於媒劑治療對照動物之存活率。
或者，在小鼠致命性攻擊模型中利用適應小鼠之B型流感/Malaysia/2506/2004病毒測試mAb CR8033及CR8071之預防功效。使B/Malaysia/2506/2004病毒在4次肺至肺傳代後適應小鼠。使適應小鼠之B型流感第4次傳代病毒在含胚雞蛋中繁殖。使所有小鼠(Balb/c， 雌性，6-8週齡，n=8隻/組)適應並維持至少4天時間，然後開始實驗。於攻擊前第-1天將MAb CR8033及CR8071以0.06 mg/kg、0.2 mg/kg、0.6 mg/kg、1.7 mg/kg及5 mg/kg經靜脈內給予尾靜脈(尾骨肌靜脈)中，假定每只小鼠平均重量為18 g且固定劑量體積為0.2 ml。同時向對照組給予媒劑對照。然後於第0天藉由鼻內接種用25 LD50適應小鼠之B/Malaysia/2506/2004 B型流感病毒攻擊小鼠。圖5顯示在投與mAb後小鼠之存活率。向小鼠給予劑量低至0.2 mg/kg之CR8033及0.6 mg/kg之CR8071顯示顯著高於媒劑治療對照動物之存活率。
該等結果顯示，如本文所鑑別及研發之人類抗流感抗體CR8033及CR8071當於感染前一天分別以等於或高於0.2 mg/kg或0.6 mg/kg劑量投與時，能夠提供針對B/Yamagata與B/Victoria譜系二者之B型流感病毒之致命性劑量的活體內保護。
- 無結合nt 未測試到
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參考文獻
Brochet等人，Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008).
De Kruif J等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3938 (1995).
Kanegae等人，J. Virol. 64: 2860-2865 (1990).
Kubota-Koketsu等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 387: 180-185 (2009).
Rota等人，J. Gen. Virol. 73: 2737-2742 (1992).
Thompson等人，JAMA 289(2): 179-186 (2003).
Thompson等人，JAMA 292(11): 1333-1340 (2004).
Wrammert等人，Nature 453: 667-672 (2008).
<110> 荷蘭商庫賽爾荷蘭公司
<120> 可結合及中和B型流感病毒之人類結合分子及其用途
<130> 0194EP00P00PR1
<140> TW 102108417
<141> 2013-03-08
<150> EP12158525.1
<151> 2012-03-08
<160> 133
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造
<220>
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<220>
<223> HC CDR1
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<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> HC CDR2
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<212> PRT
<213> 人造
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<213> 人造
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<220>
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<213> 人造
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> LC CDR3
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<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-033 VH DNA
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-033 VH蛋白質
<400> 71
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<212> DNA
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<220>
<223> SC08-033 VL DNA
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
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<212> DNA
<213> 人造
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
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<212> DNA
<213> 人造
<220>
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-059 VL蛋白質
<400> 77
<210> 78
<211> 125
<212> PRT
<213> 人造
<220>
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<400> 78
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CR08071 VL蛋白質
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<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-051 VH DNA
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC10-051 VH蛋白質
<400> 81
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<211> 328
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-051 VL DNA
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<210> 83
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC10-051 VL蛋白質
<400> 83
<210> 84
<211> 368
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-049 VH DNA
<400> 84
<210> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC10-049 VH蛋白質
<400> 85
<210> 86
<211> 337
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-049 VL DNA
<400> 86
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC10-049 VH蛋白質
<400> 87
<210> 88
<211> 382
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-023 VH DNA
<400> 88
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
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<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-023 VL DNA
<400> 90
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC10-023 VL蛋白質
<400> 91
<210> 92
<211> 378
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-032 VH DNA
<400> 92
<210> 93
<211> 126
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC10-032 VH蛋白質
<400> 93
<210> 94
<211> 334
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC10-032 VL DNA
<400> 94
<210> 95
<211> 111
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC10-032 VL蛋白質
<400> 95
<210> 96
<211> 364
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-024 VH DNA
<400> 96
<210> 97
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-24 VH蛋白質
<400> 97
<210> 98
<211> 325
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-024 VL DNA
<400> 98
<210> 99
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-024 VL蛋白質
<400> 99
<210> 100
<211> 364
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-035 VH DNA
<400> 100
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-035 VH蛋白質
<400> 101
<210> 102
<211> 322
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-035 VL DNA
<400> 102
<210> 103
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-035 VL蛋白質
<400> 103
<210> 104
<211> 375
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-036 VH DNA
<400> 104
<210> 105
<211> 125
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-036 VH蛋白質
<400> 105
<210> 106
<211> 325
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-036 VL DNA
<400> 106
<210> 107
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-036 VL蛋白質
<400> 107
<210> 108
<211> 375
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-038 VH DNA
<400> 108
<210> 109
<211> 125
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-038 VH蛋白質
<400> 109
<210> 110
<211> 331
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-038 VL DNA
<400> 110
<210> 111
<211> 110
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-038 VL蛋白質
<400> 111
<210> 112
<211> 364
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-039 VH DNA
<400> 112
<210> 113
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-039 VH蛋白質
<400> 113
<210> 114
<211> 321
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC11-039 VL DNA
<400> 114
<210> 115
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC11-039 VL蛋白質
<400> 115
<210> 116
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC09-114 VH蛋白質
<400> 116
<210> 117
<211> 110
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC09-114 VL蛋白質
<400> 117
<210> 118
<211> 372
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-031 VH DNA
<400> 118
<210> 119
<211> 124
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-031 VH蛋白質
<400> 119
<210> 120
<211> 331
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-031 VL DNA
<400> 120
<210> 121
<211> 110
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-031 VL蛋白質
<400> 121
<210> 122
<211> 381
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-032 VH DNA
<400> 122
<210> 123
<211> 127
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-032 VH蛋白質
<400> 123
<210> 124
<211> 331
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-032 VL DNA
<400> 124
<210> 125
<211> 110
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-032 VL蛋白質
<400> 125
<210> 126
<211> 381
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-034 VH DNA
<400> 126
<210> 127
<211> 127
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-034 VH蛋白質
<400> 127
<210> 128
<211> 322
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-034 VL DNA
<400> 128
<210> 129
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-034 VL蛋白質
<400> 129
<210> 130
<211> 381
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-035 VH DNA
<400> 130
<210> 131
<211> 127
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-035 VH蛋白質
<400> 131
<210> 132
<211> 325
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> SC08-035 VL DNA
<400> 132
<210> 133
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> SC08-035 VL蛋白質
<400> 133

Claims (14)

  1. 一種結合分子，其能夠特異性結合B/Yamagata及B/Victoria譜系之B型流感病毒株之血球凝集素(HA)且能夠中和該B/Yamagata及/或B/Victoria譜系之該等B型流感病毒株，其中該結合分子不結合A型流感病毒之HA，且其中該結合分子包含含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之重鏈CDR2及含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈CDR3，以及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：11之胺基酸序列之輕鏈CDR2及含有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之胺基酸序列之輕鏈CDR3。
  2. 如請求項1之結合分子，其中該結合分子結合B型流感病毒之該HA蛋白質之頭部區域。
  3. 如請求項1之結合分子，其中該結合分子包含含有SEQ ID NO：75之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：77之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  4. 如請求項1之結合分子，其中該結合分子包含由SEQ ID NO：78之胺基酸序列組成之重鏈可變區及由SEQ ID NO：79之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
  5. 一種結合分子，其與如請求項1至4中任一項之結合分子免疫特異性競爭結合B型流感病毒HA蛋白質上之抗原表位(epitope)，其中該結合分子包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：21之胺基酸序列之重鏈CDR2及含有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之重鏈CDR3，以及含有SEQ ID NO：23之胺基酸序列之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：24之胺基酸序列之輕鏈CDR2及含有SEQ ID NO：25之胺基酸序列輕鏈CDR3；或包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：32之胺基酸序列之重鏈CDR2及含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈CDR3，以及含有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之輕鏈CDR2及含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列輕鏈CDR3。
  6. 如請求項1至5中任一項之結合分子，其中該結合分子抑制B型流感病毒自受感染細胞之釋出。
  7. 如請求項1至5中任一項之結合分子，其中該結合分子係人類單株抗體或其抗原結合片段。
  8. 一種如請求項1至5中任一項之結合分子於製備藥劑之用途，該藥劑用於診斷、預防及/或治療由B型流感病毒引起之流感感染。
  9. 一種免疫偶聯物，其包含至少一種如請求項1至7中任一項之結合分子且進一步包含至少一種標籤。
  10. 一種如請求項9之免疫偶聯物於製備藥劑之用途，該藥劑用於診斷、預防及/或治療由B型流感病毒引起之流感感染。
  11. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至7中任一項之結合分子。
  12. 一種如請求項11之核酸分子於製備藥劑之用途，該藥劑用於診斷、預防及/或治療由B型流感病毒引起之流感感染。
  13. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之結合分子及/或如請求項9之免疫偶聯物以及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
  14. 一種檢測B型流感病毒感染之方法，其包含：(a)使用如請求項1至7之結合分子及/或如請求項9之免疫偶聯物分析生物試樣中B型流感病毒抗原之含量；及(b)比較B型流感病毒抗原之該經分析含量與對照含量，其中B型流感病毒抗原之該經分析含量與該B型流感病毒抗原之該對照含量相比增加指示B型流感病毒感染。
TW102108417A 2012-03-08 2013-03-08 可結合及中和ｂ型流感病毒之人類結合分子及其用途 TWI628190B (zh)

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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX357009B (es) 2011-11-28 2018-06-22 Crucell Holland Bv Vacunas contra el virus de la influenza y sus usos.
WO2013086052A2 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Trellis Bioscience, Llc Antibodies useful in passive influenza immunization
MX360056B (es) 2012-03-08 2018-10-19 Janssen Vaccines & Prevention Bv Moléculas de unión humanas que pueden unirse a los virus de la influenza b y neutralizarlos, y sus usos.
US9969794B2 (en) 2012-05-10 2018-05-15 Visterra, Inc. HA binding agents
WO2014152946A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Polypeptides for treating and/or limiting influenza infection
AU2014236508A1 (en) 2013-03-14 2015-09-17 Contrafect Corporation Composition and methods based on neutralizing antibodies delivered intranasally for enhanced therapeutic efficacy
AU2014329609B2 (en) 2013-10-02 2019-09-12 Humabs Biomed Sa Neutralizing anti-influenza A antibodies and uses thereof
EP3076993A1 (en) * 2013-12-05 2016-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Process for preparing influenza vaccines
WO2015120097A2 (en) * 2014-02-04 2015-08-13 Contrafect Corporation Antibodies useful in passive influenza immunization, and compositions, combinations and methods for use thereof
US10639370B2 (en) 2014-02-04 2020-05-05 Contrafect Corporation Antibodies useful in passive influenza immunization, and compositions, combinations and methods for use thereof
EP3122771A1 (en) 2014-03-27 2017-02-01 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-influenza b virus hemagglutinin antibodies and methods of use
AU2015289805B2 (en) * 2014-07-15 2020-06-25 Humabs Biomed Sa Neutralizing anti-influenza B antibodies and uses thereof
TWI702229B (zh) 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
CA2975655C (en) 2015-02-05 2023-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules directed against influenza hemagglutinin and uses thereof
AU2016261299B2 (en) * 2015-05-11 2019-12-05 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Influenza virus neutralizing peptidomimetic compounds
MA48852A (fr) 2015-05-13 2020-04-01 Univ Pennsylvania Expression médiée par aav d'anticorps anti-grippaux et leurs procédés d'utilisation
DK3303384T3 (da) * 2015-06-01 2021-10-18 Medimmune Llc Neutraliserende anti-influenza-bindingsmolekyler og anvendelser deraf
JP6423550B2 (ja) * 2015-06-03 2018-11-14 シャアメン ユニバーシティ 広域スペクトルモノクローナル抗ＦｌｕＢ抗体およびその使用
JP2017062300A (ja) * 2015-09-24 2017-03-30 セイコーエプソン株式会社 半導体装置、システム、電子機器、及び、音声認識方法
WO2017083627A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Visterra, Inc. Compositions and methods for treating and preventing influenza
SG11201805001UA (en) 2016-01-13 2018-07-30 Medimmune Llc Method of treating influenza a
EP3423484B1 (en) 2016-03-01 2021-01-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Human neutralizing antibodies binding to influenza b neuraminidase
AU2017306709A1 (en) 2016-08-05 2019-03-14 Humabs, BioMed SA Anti-o2 antibodies and uses thereof
JP7160484B2 (ja) 2016-10-19 2022-10-25 メディミューン，エルエルシー 抗ｏ１抗体およびその使用
SG10201913833PA (en) 2017-02-28 2020-03-30 Univ Pennsylvania Influenza vaccines based on aav vectors
SG11201907714UA (en) 2017-02-28 2019-09-27 Univ Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) clade f vector and uses therefor
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
CA3058567A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Cadila Healthcare Limited Novel peptide based pcsk9 vaccine
US11780907B2 (en) 2018-01-26 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to influenza hemagglutinin
EP3820998A4 (en) * 2018-07-11 2022-04-27 Momenta Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO ENGINEERED FC ANTIGEN-BINDING ANTI-PD-L1 DOMAIN CONSTRUCTS
AU2020248404A1 (en) 2019-03-25 2021-09-30 Visterra, Inc. Compositions and methods for treating and preventing influenza
WO2021195326A1 (en) * 2020-03-26 2021-09-30 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2)
WO2021201677A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Kiadis Pharma Intellectual Property B.V. Compositions and methods targeting influenza
BR112022021789A2 (pt) 2020-04-27 2023-03-07 Twist Bioscience Corp Bibliotecas de ácido nucléico variantes para coronavírus

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101821290A (zh) * 2007-10-08 2010-09-01 赛诺菲巴斯德有限公司 流感病毒血细胞凝集素特异性单克隆抗体

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
NL9101953A (nl) 1991-11-21 1993-06-16 Seed Capital Investments Testinrichting omvattende een plaat met een veelvoud van putjes met een bijbehorende doseerinrichting, alsmede een kit die deze inrichtingen omvat en toepassing van de inrichtingen.
US6248780B1 (en) 1998-10-01 2001-06-19 Duquesne University Of The Holy Ghost Compounds for the treatment of estrogen-dependent illnesses and methods for making and using the same
SI1533380T1 (sl) 1999-04-15 2010-03-31 Crucell Holland Bv Proizvajanje rekombinantnega proteina v človeški celici ki obsega vsaj en protein E adenovirusa
DK1402025T3 (da) 2001-06-15 2006-06-06 Crucell Holland Bv Kimære fager
US7135174B2 (en) * 2002-01-07 2006-11-14 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to PDGFD and uses thereof
EP2441471B1 (en) * 2005-03-08 2014-10-08 MedImmune, LLC Reassortant influenza viruses
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
TW200815474A (en) 2006-08-03 2008-04-01 Astrazeneca Ab Antibodies alphaVbeta6 and uses thereof
WO2008028946A2 (en) 2006-09-07 2008-03-13 Crucell Holland B.V. Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h5n1 and uses thereof
US8846867B2 (en) * 2007-06-26 2014-09-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Isolation of anti-desmoglein 1 antibodies by phage display of pemphigus foliaceus autoantibodies
JP2011528902A (ja) * 2008-07-25 2011-12-01 インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン 抗ａ型インフルエンザウイルス中和抗体およびその使用
EP2179811B1 (en) 2008-10-21 2018-10-03 Agie Charmilles SA Method and apparatus for controlling an electric discharge machining process
PT2842573T (pt) 2008-11-07 2017-12-04 Galaxy Biotech Llc Anticorpos monoclonais para o recetor 2 do factor de crescimento de fibroblastos
US8975378B2 (en) * 2008-12-25 2015-03-10 Osaka University Human anti-human influenza virus antibody
US8470327B2 (en) 2009-05-11 2013-06-25 Crucell Holland B.V. Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus H3N2 and uses thereof
AU2010254136B2 (en) * 2009-05-26 2016-09-29 Mount Sinai School Of Medicine Monoclonal antibodies against influenza virus generated by cyclical administration and uses thereof
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
EP2814841A4 (en) * 2012-01-31 2015-06-17 Univ Osaka HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES FOR WIDE PROTECTION AGAINST INFLUENZA B VIRUS AND METHOD OF USE THEREOF
MX360056B (es) * 2012-03-08 2018-10-19 Janssen Vaccines & Prevention Bv Moléculas de unión humanas que pueden unirse a los virus de la influenza b y neutralizarlos, y sus usos.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101821290A (zh) * 2007-10-08 2010-09-01 赛诺菲巴斯德有限公司 流感病毒血细胞凝集素特异性单克隆抗体

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Publication number Publication date
SG11201405226TA (en) 2014-11-27
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US20150037345A1 (en) 2015-02-05
PH12015502553A1 (en) 2017-04-10
US9200064B2 (en) 2015-12-01
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US20140341929A1 (en) 2014-11-20
MY170407A (en) 2019-07-27
JP2015518369A (ja) 2015-07-02

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