PL218428B1 - Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG - Google Patents

Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG

Info

Publication number
PL218428B1
PL218428B1 PL362520A PL36252001A PL218428B1 PL 218428 B1 PL218428 B1 PL 218428B1 PL 362520 A PL362520 A PL 362520A PL 36252001 A PL36252001 A PL 36252001A PL 218428 B1 PL218428 B1 PL 218428B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
cell
amino acid
protein
seq
Prior art date
Application number
PL362520A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362520A1 (pl
Inventor
Yutaka Kanda
Mitsuo Satoh
Kazuyasu Nakamura
Kazuhisa Uchida
Toyohide Shinkawa
Naoko Yamane
Emi Hosaka
Motoo Yamasaki
Nobuo Hanai
Kazuya Yamano
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18788817&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL218428(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Kk filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Kk
Publication of PL362520A1 publication Critical patent/PL362520A1/pl
Publication of PL218428B1 publication Critical patent/PL218428B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG.
Ponieważ przeciwciała mają duże powinowactwo wiązania, specyficzność wiązania i wysoką stabilność we krwi, próbowano je stosować w diagnostyce, profilaktyce i terapii różnych ludzkich schorzeń [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss In., Rozdział 2.1 (1995)]. Usiłowano także wytworzyć humanizowane przeciwciało, takie jak ludzkie przeciwciało chimeryczne lub ludzkie przeciwciało z przeszczepionym regionem determinującym dopasowanie (dalej określanym jako CDR) pochodzącym z przeciwciała od zwierzęcia nie będącego człowiekiem przy użyciu genetycznych technik rekombinacyjnych. Ludzkie przeciwciało chimeryczne jest przeciwciałem, którego region zmienny (dalej określany jako „region V”) pochodzi od przeciwciała zwierzęcia nie będącego człowiekiem, a jego region stały (dalej określany jako „region C”) pochodzi od ludzkiego przeciwciała. Przeciwciało ludzkie z przeszczepionym CDR jest przeciwciałem, w którym CDR z ludzkiego przeciwciała jest zastąpiony regionem CDR od zwierzęcia innego niż człowiek.
Wykazano, iż istnieje pięć klas przeciwciał pochodzących od ssaków: IgM, IgD, IgG, IgA oraz IgE. W diagnostyce, profilaktyce i terapii różnych schorzeń ludzkich przeważnie stosowane są przeciwciała klasy IgG, ponieważ mają cechy funkcjonalne takie jak długi okres półtrwania we krwi, wiele funkcji efektorowych i temu podobne [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss In., Rozdział 1 (1995)]. Ludzkie przeciwciała klasy IgG dzielą się na następujące 4 podklasy: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Przeprowadzono dotąd dużą liczbę badań dla scharakteryzowania komórkowej aktywności cytotoksycznej zależnej od przeciwciał (dalej zwanej „aktywnością ADCC”) i aktywności cytotoksycznej zależnej od dopełniacza (dalej zwanej „CDC”) jako funkcji efektorowych przeciwciał klasy IgG i doniesiono, że pośród ludzkich przeciwciał klasy IgG, podklasa IgG1 wykazuje najwyższą aktywność ADCC i CDC [Chemical Immunology, 65, 88 (1997)]. W związku z powyższym, większość humanizowanych przeciwciał przeciwnowotworowych, włącznie z komercyjnie dostępnymi Rituxanem i Herceptinem, które wymagają wysokiej funkcjonalności efektorowej dla uzyskania efektów ich działań, są przeciwciałami ludzkimi podklasy IgG1.
Ekspresja aktywności ADCC i CDC ludzkich przeciwciał podklasy IgG1 wymaga związania się regionu Fc przeciwciała z receptorem przeciwciała występującym na powierzchni komórki efektorowej, takiej jak komórka zabójca, komórka naturalny zabójca, aktywowany makrofag lub podobne (dalej określanym jako „FcyR”) i przyłączenia różnych składników dopełniacza. Odnośnie do wiązania, zasugerowano, że ważnych jest kilka reszt aminokwasowych w regionie zawiasowym i drugiej domenie regionu C (dalej zwaną „domeną Cy2”) przeciwciała [Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)], oraz że łańcuch cukrowy wiążący się z domeną Cy2 [Chemical Immunology, 65, 88 (1997)] jest również istotny.
Odnośnie do łańcucha cukrowego, Boyd et al. zbadali wpływ tego łańcucha cukrowego na aktywności ADCC i CDC przez potraktowanie ludzkiego przeciwciała CAMPATH-1H (ludzka podklasa IgG1) z przeszczepionym regionem CDR, wytworzonego przez komórki jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) lub komórki mysiego szpiczaka NS0 (komórka NS0) różnymi enzymami hydrolizującymi cukry i donieśli, że wyeliminowanie kwasu sialowego z nie-redukującego końca nie miało wpływu na obydwie aktywności, ale że dalsze usunięcie reszt galaktozowych wpłynęło na samą aktywność CDC, która została zmniejszona o około 50% i że całkowite usunięcie łańcucha cukrowego powoduje zanik obydwu aktywności [Molecular Immunol., 32, 1311 (1995)]. Lifely et al. zbadali łańcuch cukrowy związany z ludzkim przeciwciałem CAMPATH-1H (ludzka podklasa IgG1) z przeszczepionym CDR, wyprodukowanym przez komórki CHO, komórki NS0 lub komórki szczurzego szpiczaka YO, zmierzyli aktywność ADCC i donieśli że CAMPATH-H1 pochodzące z komórek YO wykazało najwyższą aktywność ADCC, co sugeruje że N-acetyloglukozamina (dalej zwana „GlcNAc”) w pozycji rozdzielającej (bisecting) jest ważna dla aktywności (Glycobiology, 5, 813 (1995); WO 99/54342]. Doniesienia te wskazują, że struktura łańcucha cukrowego odgrywa ważną rolę w funkcjach efektorowych ludzkich przeciwciał podklasy IgG1 oraz że można wytworzyć przeciwciało mające wyższą funkcję efektorową przez zmianę w strukturze łańcucha cukrowego. Jednak rzeczywiście, struktury łańcuchów cukrowych są różnorodne i złożone i nie można powiedzieć, że zidentyfikowano konkretną strukturę ważną dla funkcji efektorowej.
Łańcuchy cukrowe glikoprotein można z grubsza podzielić na dwa typy, mianowicie, łańcuch cukrowy, który wiąże się z asparaginą (łańcuch cukrowy związany N-glikozydowo) i łańcuch cukrowy,
PL 218 428 B1 który wiąże się z innym aminokwasem, takim jak seryna, treonina (łańcuchy cukrowe związane O-glikozydowo), na podstawie rodzaju wiązania z ugrupowaniem białka. Łańcuchy cukrowe związane N-glikozydowo mają różne struktury [Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Gakujutsu Shuppen Center), wydany przez Reiko Takahashi (1989)], ale wiadomo, że mają wspólną podstawową strukturę rdzeniową, pokazaną w następującym wzorze strukturalnym (I).
Wzór strukturalny (I)
Koniec łańcucha cukrowego, który wiąże się z asparaginą, jest nazwany końcem redukującym, a drugi koniec jest nazwany końcem nieredukującym. Wiadomo, że łańcuch cukrowy związany N-glikozydowo obejmuje typ bogaty w mannozę, w którym tylko mannoza wiąże się z nieredukującym końcem struktury rdzeniowej; typ złożony, w którym nieredukujący koniec struktury rdzeniowej ma przynajmniej jedno równoległe rozgałęzienie w postaci galaktozo-N-acetyloglukozaminy (dalej określany jako „Gal-GlcNAc”), a nieredukujący koniec Gal-Glc-NAc ma strukturę kwasu sialowego, rozdzielającej N-acetyloglukozaminy lub podobną; oraz typ hybrydowy, w którym nieredukujący koniec struktury rdzeniowej ma rozgałęzienia zarówno typu bogatego w mannozę jak i typu złożonego; i tym podobne.
W regionie Fc przeciwciała typu IgG istnieją dwa miejsca wiążące łańcuch cukrowy połączony N-glikozydowo. W IgG w surowicy do miejsca wiążącego łańcuch cukrowy zazwyczaj wiąże się łańcuch cukrowy typu złożonego mający wiele rozgałęzień i w których dodatek kwasu sialowego lub rozdzielającej N-acetyloglukozaminy jest niski. Wiadomo, że istnieje zróżnicowanie, jeśli chodzi o dodatek galaktozy do nieredukującego końca łańcucha cukrowego typu złożonego i dodatek fukozy do N-acetyloglukozaminy w końcu redukującym [Biochemistry, 36, 130 (1997)].
Uważa się, iż taka struktura łańcucha cukrowego jest zdeterminowana przez geny łańcucha cukrowego, mianowicie gen kodujący glikozylotransferazę, która syntetyzuje łańcuch cukrowy i gen kodujący enzym glikolityczny, który hydrolizuje łańcuch cukrowy.
Synteza łańcucha cukrowego wiążącego się wiązaniem N-glikozydowym opisana jest poniżej.
Glikoproteiny są modyfikowane łańcuchem cukrowym w świetle siateczki endoplazmatycznej (dalej określanej „ER”). Podczas etapu biosyntezy łańcucha cukrowego połączonego N-glikozydowo stosunkowo długi łańcuch cukrowy jest przenoszony do łańcucha polipeptydowego, który jest wydłużany w świetle ER. Podczas transformacji, łańcuch cukrowy jest najpierw dołączany kolejno do reszt fosforanowych długołańcuchowego nośnika lipidowego zawierającego około 20 jednostek a-izoprenowych, zwanego fosforanem dolicholu (dalej określanego jako „P-Dol”). N-acetyloglukozamina jest przenoszona do fosforanu dolicholu i tworzy GlcNAc-P-P-Dol , a następnie do niej przyłączona jest jeszcze jedna GlcNAc, tworząc GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol. Następnie dołączonych jest pięć mannoz (dalej zwanych „Man”) tworząc (Man)5-(GlcNAc)2-P-P-Dol, a następnie przenoszone są cztery Man i trzy glukozy (dalej zwane „Glc”). W ten sposób tworzy się prekursor łańcucha cukrowego (Glc)3(Man)9-(GlcNAc)2-P-P-Dol, zwany oligosacharydem rdzeniowym. W świetle ER prekursor łańcucha cukrowego złożony z 14 cukrów jest przenoszony do polipeptydu mającego sekwencję asparagina-X-seryna lub asparagina-X-treonina. W reakcji pirofosforan dolicholu (P-P-Dol) związany z oligosacharydem rdzeniowym jest uwolniony, ale ponownie staje się fosforanem dolicholu przez hydrolizę pirofosfatazą, i zostaje ponownie zawrócony do obiegu. Odcinanie reszt od łańcucha cukrowego odbywa się zaraz po przyłączeniu łańcucha cukrowego do polipeptydu. Mianowicie 3 Glc i 1 lub 2 Man są odcinane na ER, a wiadomo, że a-1,2-glukozydaza I, a-1,3-glukozydaza II i a-1,2-mannozydaza uczestniczą w eliminacji.
Glikoproteiny, które zostały poddane przycinaniu na ER, są przenoszone do aparatu Golgiego i są różnie modyfikowane. W części cis aparatu Golgiego obecna jest fosfotransferaza N-acetyloglukozaminowa związana z dołączaniem fosforanu mannozy, obecne również są a-N-acetyloglukozaminidaza N-acetyloglukozamino-1-fosfodiestrowa i a-mannozydaza I, które redukują reszty Man do 5. W środkowej części aparatu Golgiego obecne są: transferaza N-acetyloglukozaminowa I
PL 218 428 B1 (GnTI) związana z dołączeniem pierwszej zewnętrznej GlcNAc w łańcuchu cukrowym typu złożonego połączonym N-glikozydowo, α-mannozydaza II związana z eliminacją dwóch reszt Man, transferaza N-acetyloglukozaminowa II (GnTII) związana z dołączaniem drugiej reszty GlcNAc od zewnątrz i a-1,6-fukozylotransferaza, która jest związana z dołączaniem fukozy do redukującego końca N-acetyloglukozaminy. W części trans aparatu Golgiego obecne są: transferaza galaktozowa związana z dołączaniem galaktozy i sialotransferaza, która dołącza kwas sialowy, taki jak kwas N-acetyloneuraminowy lub podobne. Wiadomo, iż łańcuch cukrowy połączony N-glikozydowo jest utworzony przez aktywności tych różnych enzymów.
Zazwyczaj większość humanizowanych przeciwciał, których zastosowanie w terapii jest rozpatrywane, wytwarza się technikami rekombinacji genetycznej z zastosowaniem komórki CHO pochodzącej z tkanki jajnika chomika chińskiego jako komórki gospodarza. Jednak, jak opisano powyżej, ponieważ struktura łańcucha cukrowego odgrywa tak istotną rolę w funkcji efektorowej przeciwciał i obserwuje się różnice w strukturze łańcucha cukrowego glikoprotein wyrażanych przez komórki gospodarza, pożądane jest opracowanie komórki gospodarza, która może produkować przeciwciała o wyższej aktywności efektorowej.
Do modyfikacji struktury łańcucha cukrowego wytworzonej glikoproteiny stosuje się różne metody, np. takie jak 1) zastosowanie inhibitora enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, 2) wybór mutanta, 3) wprowadzenie genu kodującego enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego i tym podobne. Konkretne przykłady podane są poniżej.
Przykłady inhibitora enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego obejmują tunikamycynę, która selektywnie hamuje powstawanie GlcNAc-P-P-Dol, będące pierwszym etapem tworzenia się oligosacharydu rdzeniowego, który jest prekursorem łańcucha cukrowego połączonego N-glikozydowo, kastanosperminę i N-metylo-1-deoksynojirymycynę które są inhibitorami glikozydazy I, bromokondulitol, który jest inhibitorem glikozydazy II, 1-deoksynojirymycynę i 1,4-dioksy-1,4-imino-Dmannitol, które są inhibitorami mannozydazy I, swainsoninę, która jest inhibitorem mannozydazy II i tym podobne. Przykłady inhibitorów swoistych dla glukozylotransferazy obejmują deoksy pochodne substratów wobec transferazy N-acetyloglukozaminowej V (GnTV) i podobne [Glycobiology Series 2 Destiny of Sugar in Cell (Kodan-sha Scientific), pod redakcją Katasutaka Nagao, Senichiro Hakomori and Akira Kobata (1993)]. Ponadto, wiadomo, że 1-deoksynojirymycyna hamuje syntezę łańcucha cukrowego typu złożonego i zwiększa udział łańcuchów cukrowych typu wielomannozowego i mieszanego. Faktycznie, doniesiono, że struktura łańcucha cukrowego IgG została zmieniona i właściwości takie jak aktywność wiązania antygenu i podobne także zostały zmienione, gdy do pożywki zostały dodane inhibitory [Molecular Immunol., 26, 1113 (1989)].
Mutanty o zmienionej aktywności enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego są głównie wybierane i uzyskiwane jako linia komórkowa odporna na lektynę. Na przykład, mutanty komórek CHO wykazujące różne struktury łańcuchów cukrowych uzyskano jako linię-komórkową odporną na lektynę, stosując lektynę taką jak WGA (aglutynina z zarodków pszennych pochodząca z T. vulgaris), ConA (konkanawalina A pochodząca z C. ensiformis), RIC (toksyna z R. communis), L-PHA (leukoaglutynina z P. vulgaris), LCA (aglutynina z soczewicy L. culinaris), PSA (lektyna z groszku P. sativum) lub podobne [Somatic Cell Mol. Genet., 12, 51 (1986)].
Jako przykład modyfikacji struktury łańcucha cukrowego produktu otrzymanego przez wprowadzenie do komórki gospodarza genu kodującego enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego doniesiono że można uzyskać białko, w którym pewna ilość reszt kwasu sialowego jest dodana do nieredukującego końca łańcucha cukrowego, przez wprowadzenie szczurzej β-galaktozydo-α-2,6-sialilotransferazy do komórek CHO [J. Biol. Chem., 261, 13848 (1989)].
Ponadto potwierdzono że antygen H ^uca^Ga^l), w którym fukoza (zwana dalej określana jako „Fuc”) została dodana do nieredukującego końca łańcucha cukrowego, został wyrażony przez wprowadzenie ludzkiej β-galaktozydo-2-α-fukozylotransferazy do mysiej komórki L (Science, 252, 1668 (1991)]. Ponadto, bazując na wiedzy, że dodanie rozdzielającej N-acetyloglukozaminy do łańcucha cukrowego połączonego N-glikozydowo jest istotne dla aktywności ADCC przeciwciała, Umana et al. wytworzyli komórkę CHO, która wykazała ekspresję transferazy β-1,4-N-acetyloglukozaminowej III (GnTIII) i porównali ją z rodzicielską linią komórkową CHO pod kątem wyrażania GnTIII. Potwierdzono, że nie zaobserwowano wyrażania GnTIII w komórce rodzicielskiej linii komórkowej CHO [J. Biol. Chem., 261, 13370 (1984)], i że przeciwciało wytwarzane przez komórki CHO z ekspresją GnTIII wykazywało aktywność ADCC 16 razy wyższą niż przeciwciało wyprodukowane przez linię komórek rodzicielskich [Glycobiology., 5, 813 (1995): WO 99/54342]. W tym czasie Umana et al. również wyPL 218 428 B1 produkowali komórkę CHO, do której wprowadzili transferazę β-14-W-acetyloglukozaminową V(GnTV), i donieśli, że nadmierna ekspresja GnTIII i GnTV wykazuje toksyczność dla komórki CHO.
Zatem, w celu zmodyfikowania struktury łańcucha cukrowego wytwarzanej glikoproteiny, spróbowano kontrolować aktywność enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego w komórce gospodarza, ale struktury łańcuchów cukrowych są zróżnicowane i złożone, a rozwiązanie fizjologicznej roli łańcuchów cukrowych byłoby niewystarczające, tak że próby i błędy są powtarzane. Szczególnie, chociaż krok po kroku ujawniono, że na funkcję efektorową przeciwciał ma duży wpływ struktura łańcucha cukrowego, a żadna szczególnie istotna struktura łańcucha cukrowego nie została jeszcze sprecyzowana. Zatem, identyfikacja łańcucha cukrowego, który ma wpływ na funkcję efektorową przeciwciał i opracowanie komórki gospodarza, do której taka struktura łańcucha cukrowego może być dodana, jest wymagana do opracowywania leków.
Niniejszy wynalazek dotyczy komórki, która technikami inżynierii genetycznej ma zmienioną aktywność następujących enzymów:
(i) aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydocukru, GDP-fukozy, została zniesiona lub zmniejszona (ii) aktywność enzymu związanego z syntezą GDP-fukozy i aktywność a1,6-fukozylotransferazy została zniesiona, lub zmniejszona, przy czym enzym związany z syntezą GDP-fukozy jest enzymem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c);
(a) GMD (4,6-dehydrataza GDP-mannozowa);
(b) Fx (3,5-epimeraza, 4-reduktaza GDP-keto-6-deoksymannozowa);
(c) GFPP (pirofosforylaza GDP-beta-L-fukozowa), a technika inżynierii genetycznej jest wybrana z grupy składającej się z następujących (A), (B), (C) i (D):
(A) technika dysrupcji genu skierowana na gen kodujący enzym;
(B) technika wprowadzania dominującego negatywnego mutanta genu kodującego enzym;
(C) technika wprowadzenia mutacji do enzymu;
(D) technika zahamowania transkrypcji i/lub translacji genu kodującego enzym.
Korzystnie, GMD jest białkiem kodowanym przez jedno z następujących DNA (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 65;
(b) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 65 i kodujący białko mające aktywność GMD.
Korzystnie GMD jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 71;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD.
Korzystnie Fx jest białkiem kodowanym przez jedno z następujących DNA (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 48;
(b) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 48 i kodujący białko mające aktywność Fx.
Korzystnie Fx jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx.
Korzystnie GFPP jest białkiem kodowanym przez jeden z następujących DNA (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 51;
(b) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 51 i kodujący białko mające aktywność GFPP.
Korzystnie GFPP jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 73;
PL 218 428 B1 (b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 73 i mające aktywność GFPP;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 73 i mające aktywność GFPP.
Korzystnie a-1,6-fukozylotransferaza jest białkiem kodowanym przez jeden z następujących DNA (a), (b), (c) i (d):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 1;
(b) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 2;
(c) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 1 i kodujący białko mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
(d) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 2 i kodujący białko mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy.
Korzystnie a-1,6-fukozylotransferaza jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b), (c) (d) i (f):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 23;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 24;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
(d) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 24 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
(e) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
(f) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 24 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy.
Korzystnie komórka jest oporna co najmniej na lektynę rozpoznającą łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy związana jest z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy przez wiązanie a w końcu redukującym w N-glikozydowo związanym łańcuchu cukrowym.
Korzystnie komórka jest komórką wybraną z grupy składającej się z następujących od (a) do (i):
(a) komórka CHO pochodząca z tkanki jajnika chomika chińskiego;
(b) linia komórkowa szczurzego szpiczaka, komórka YB2/3HLP2G11.16Ag.20;
(c) linia komórkowa mysiego szpiczaka, komórka NSO;
(d) linia komórkowa mysiego szpiczaka, komórka SP2/0-Ag14;
(e) komórka BHK pochodząca z tkanki nerkowej chomika syryjskiego;
(f) komórka hybrydoma wytwarzająca przeciwciało;
(g) linia komórkowa ludzkiej białaczki, komórka Namalwa;
(h) embrionalna komórka macierzysta z wyjątkiem komórki ludzkiej;
(i) zapłodniona komórka jajowa z wyjątkiem komórki ludzkiej.
Korzystnie komórka jest komórką, do której wprowadzono gen kodujący cząsteczkę przeciwciała, korzystnie IgG.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania przeciwciała, który obejmuje hodowanie komórki, do której wprowadzono gen przeciwciała określonej powyżej, w pożywce z wytworzeniem i nagromadzeniem przeciwciała w hodowli, oraz odzyskanie przeciwciała z hodowli.
Korzystnie wytwarzane jest przeciwciało mające wyższą, zależną od przeciwciała komórkową aktywność cytotoksyczną, niż przeciwciało otrzymane z rodzicielskiej linii komórkowej,
W zakres wynalazku wchodzi również lek, który jako składnik aktywny zawiera przeciwciało wytworzone sposobem określonym powyżej.
PL 218 428 B1
Korzystnie lek jest lekiem diagnostycznym, lekiem zapobiegającym lub lekiem terapeutycznym w chorobach nowotworowych, chorobach alergicznych, chorobach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych, chorobach narządów krążenia, infekcjach wirusowych lub infekcjach bakteryjnych.
Wynalazek dotyczy również komórki CHO pochodzącej z tkanki jajnika chomika chińskiego, w której metodą taką jak:
(A) technika dysrupcji genu skierowanej na gen kodujący enzym;
(B) technika wprowadzania dominującego negatywnego mutanta genu kodującego enzym;
(C) technika wprowadzenia mutacji do enzymu;
(D) technika zahamowania transkrypcji i/lub translacji genu kodującego enzym;
(E) technika selekcji linii komórkowej opornej na lektynę, rozpoznającą łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy związana jest z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy przez wiązanie a w końcu redukującym w złożonym N-glikozydowo związanym łańcuchu cukrowym; została zmniejszona lub usunięta aktywność co najmniej jednego enzymu wybranego z (a) do (d) jest:
(a) GMD (4,6-dehydrataza GDP-mannozowa);
(b) Fx (3,5-epimeraza, 4-reduktaza GDP-keto-6-deoksymannozowa);
(c) GFPP (pirofosforylaza GDP-beta-L-fukozowa);
(d) alfa-1,6-fukozylotransferaza;
przy czym, jeżeli komórka ta zawiera gen kodujący cząsteczkę przeciwciała klasy IgG, to wytwarza przeciwciało mające złożone W-glikozydowo połączone łańcuchy cukrowe związane z regionem Fc przeciwciała, w którym łańcuch cukrowy, z którym fukoza nie jest związana, jest złożonym W-glikozydowo połączonym łańcuchem cukrowym, w którym pozycja 1 fukozy nie jest związana przez wiązanie a z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy w redukującym końcu, i w którym udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z W-acetyloglukozaminą w redukującym końcu łańcucha cukrowego wynosi więcej niż 20%.
Poniżej przedstawiono korzystne wykonania wynalazku dotyczącego komórki CHO.
Korzystnie GMD jest białkiem kodowanym przez DNA spośród następujących:
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. Nr: 65;
(b) DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 65 i koduje białko mające aktywność GMD.
Korzystnie GMD jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) (b) (c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 71; białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD;
białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD.
Korzystnie Fx jest białkiem kodowanym przez DNA spośród następujących: (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 48;
(b) DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 48 i koduje białko mające aktywność Fx.
Korzystnie Fx jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 72;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx.
Korzystnie GFPP jest białkiem kodującym DNA wybrane spośród następujących (a) lub (b):
DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 51;
DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 51 i koduje białko mające aktywność GFPP.
Korzystnie GFPP jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 73;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 73 i mające aktywność GFPP;
PL 218 428 B1 (c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 73 i mające aktywność GFPP.
Korzystnie a-1,6-fukozylotransferaza jest białkiem kodowanym przez jeden spośród następujących DNA (a), (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 1;
(b) DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją reprezentowaną przez SEK. ID. Nr: 1 i kodujący białko mające aktywność alfa-1,6-fukozylotransferazy.
Korzystnie w komórce CHO alfa-1,6-fukozylotransferaza jest wybrana z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. Nr: 23;
(b) białko, które obejmuje sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność alfa-1,6-fukozylotransferazy;
(c) białko, które obejmuje sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy.
Korzystnie komórka CHO jest oporna co najmniej na lektynę, która rozpoznaje łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy w redukującym końcu przez wiązanie a w złożonym N-glikozydowo połączonym łańcuchu cukrowym.
Korzystnie komórka wytwarza przeciwciało mające wyższą, zależną od przeciwciała, komórkową aktywność cytotoksyczną niż przeciwciało wytwarzane przez macierzystą komórkę CHO.
Korzystnie komórka wytwarza przeciwciało mające wyższą aktywność cytotoksyczną, w której pośredniczy komórka, zależną od przeciwciała niż przeciwciało, w którym wśród wszystkich złożonych N-glikozydowo połączonych łańcuchów cukrowych związanych z regionem Fc zawartym w przeciwciele, udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą w redukującym końcu łańcucha cukrowego, wynosi więcej niż 20%.
W zakres wynalazku wchodzi także sposób wytwarzania przeciwciała, który obejmuje hodowanie komórki CHO określonej powyżej w pożywce z wytworzeniem i gromadzeniem przeciwciała w hodowli i odzyskiwanie przeciwciała z hodowli.
Ponadto wynalazek dotyczy również przeciwciała określonego powyżej, które ma złożone N-glikozydowo połączone łańcuchy cukrowe związane z regionem Fc, które jest wytwarzane przez komórkę CHO określoną powyżej, w którym wśród wszystkich złożonych N-glikozydowo połączonych łańcuchów cukrowych związanych z regionem Fc, udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą przy końcu redukującym, wynosi 50% lub więcej.
W zakres wynalazku wchodzi lek zawierający powyżej ujawnione przeciwciało.
Korzystnie lek jest lekiem diagnostycznym, lekiem zapobiegającym lub lekiem terapeutycznym w chorobach, w chorobach nowotworowych, chorobach alergicznych, chorobach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych, chorobach narządów krążenia, infekcjach wirusowych lub infekcjach bakteryjnych.
Komórka CHO pochodząca z tkanki jajnika chomika chińskiego, do której wprowadzony jest gen kodujący cząsteczkę przeciwciała zgodnie z niniejszym wynalazkiem, może być dowolną komórką CHO, o ile jest ona komórką CHO pochodzącą z tkanki jajnika chomika chińskiego, do której wprowadzono gen kodujący cząsteczkę przeciwciała, która produkuje przeciwciało obejmujące złożone łańcuchy cukrowe połączone N-glikozydowo, związanej z regionem Fc cząsteczki przeciwciała, w których wśród wszystkich złożonych łańcuchów cukrowych połączonych N-glikozydowo, związanych z regionem Fc, udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą przy końcu redukującym łańcucha cukrowego, wynosi 20% lub więcej.
W niniejszym wynalazku cząsteczka przeciwciała obejmuje każdą cząsteczkę, o ile obejmuje ona fragment Fc przeciwciała. Przykłady obejmują przeciwciało, fragment przeciwciała, białko fuzyjne zawierające region Fc, i temu podobne.
Przeciwciało jest białkiem, które jest wytwarzane w żywym organizmie przez reakcję immunologiczną jako wynik stymulacji egzogennym antygenem i ma aktywność do specyficznego wiązania tego antygenu. Przykłady przeciwciała obejmują przeciwciało wydzielane przez komórkę hybrydoma wytworzoną z komórki śledziony zwierzęcia immunizowanego antygenem; przeciwciało wytworzone techniką rekombinacji genetycznej, a mianowicie przeciwciało uzyskane przez wprowadzenie genu
PL 218 428 B1 kodującego przeciwciało w wektorze ekspresyjnym dla przeciwciała do komórki gospodarza; i temu podobne. Konkretnymi przykładami są przeciwciała wyprodukowane przez hybrydoma, humanizowane przeciwciało i temu podobne.
Hybrydoma jest komórką, którą otrzymuje się przez fuzję komórki B otrzymanej przez immunizację antygenem zwierzęcia innego niż człowiek z komórką szpiczaka pochodzącą od myszy i temu podobne, i która może produkować monoklonalne przeciwciało o żądanej specyficzności względem antygenu.
Przykładami humanizowanego przeciwciała są ludzkie przeciwciała chimeryczne, ludzkie przeciwciała z przeszczepionym fragmentem CDR i temu podobne.
Ludzkie przeciwciało chimeryczne jest przeciwciałem złożonym z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała (dalej określanego jako „HV” lub „VH”, przy czym ciężki łańcuch jest „łańcuchem H”) i regionu obszaru zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała (dalej określanego jako „LV” lub „VL”, przy czym lekki łańcuch jest „łańcuchem L”), obydwa pochodzące od zwierzęcia innego niż człowiek, regionu stałego łańcucha ciężkiego przeciwciała ludzkiego (dalej także określanego jako „Ch”) i regionu stałego łańcucha lekkiego ludzkiego przeciwciała (dalej także określanego jako „CL”). Jako zwierzę inne niż człowiek można wykorzystać każde zwierzę, takie jak mysz, szczur, chomik, królik i podobne, jeżeli tylko możliwe jest z nich utworzenie hybrydomy.
Ludzkie przeciwciało chimeryczne można wyprodukować przez otrzymanie cDNA kodujących VH i VL z hybrydoma wytwarzającej przeciwciało monoklonalne, wprowadzenie ich do wektora ekspresyjnego dla komórki gospodarza mającej geny kodujące CH i CL ludzkiego przeciwciała w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego dla ludzkiego przeciwciała chimerycznego, a następnie wprowadzenie wektora do komórki gospodarza, aby umożliwić ekspresję przeciwciała.
Jako CH ludzkiego przeciwciała chimerycznego można zastosować jakiekolwiek CH, jeżeli tylko należy on do ludzkiej immunoglobuliny (dalej określanej jako hIg). Jednakże korzystne są CH z klasy IgG, i może być użyta każda z podklas należących do klasy hIgG, np. hIgG1, hIgG2, hIgG3 i hIgG4. Również każdy CL może być zastosowany jako CL w ludzkim przeciwciele chimerycznym, jeżeli tylko pochodzi on z klasy hIg, a także mogą być zastosowane te należące do podklas κ i λ.
Ludzkie przeciwciało z przeszczepionym regionem CDR jest przeciwciałem, w którym sekwencje aminokwasowe CDR w VH i VL przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek, są wszczepione w odpowiednie pozycje w VH i VL ludzkiego przeciwciała.
Ludzkie przeciwciało z przeszczepionym regionem CDR może być wytworzone przez skonstruowanie cDNA kodujących regiony V, w których CDR z VH i VL przeciwciała pochodzące od zwierzęcia innego niż człowiek, są wszczepione do CDR z VH i VL ludzkiego przeciwciała, wprowadzenie ich do wektora ekspresyjnego dla komórki gospodarza zawierającego geny kodujące CH ludzkiego przeciwciała i CL ludzkiego przeciwciała, aby w ten sposób skonstruować wektor ekspresyjny dla ludzkiego przeciwciała z wszczepionym CDR, a następnie wprowadzenie wektora ekspresyjnego do komórki gospodarza w celu uzyskania ekspresji ludzkiego przeciwciała z wszczepionym regionem CDR.
Jako CH ludzkiego przeciwciała z wszczepionym regionem CDR można zastosować jakikolwiek CH, jeżeli tylko należy on do hIg, ale te z klasy hIgG są korzystne i można zastosować każdą z podklas należących do klasy hIgG, np. hIgG1, hIgG2, hIgG3 i hIgG4. Również jako CL ludzkiego przeciwciała z wszczepionym CDR można zastosować każdy CL jeżeli tylko należy on do klasy hIg, ale mogą być również stosowane także te z podklas κ i λ.
Ludzkie przeciwciało jest oryginalnie przeciwciałem naturalnie istniejącym w ludzkim organizmie, ale obejmuje ono również przeciwciała otrzymane z fagowej biblioteki ludzkich przeciwciał, od zwierzęcia transgenicznego produkującego ludzkie przeciwciało i rośliny transgenicznej produkującej ludzkie przeciwciało, które są wytwarzane w oparciu o najnowszy postęp w inżynierii genetycznej, inżynierii komórkowej i metodach inżynierii rozwojowej.
Jeśli chodzi o przeciwciała istniejące w ludzkim organizmie można hodować limfocyt zdolny do produkowania przeciwciała przez izolację ludzkiego limfocytu z krwi obwodowej, unieśmiertelnienie go przez zakażenie wirusem EB lub podobnym, a następnie klonowanie go, a przeciwciało może być oczyszczone z hodowli.
Biblioteka fagowa ludzkich przeciwciał jest biblioteką, w której fragmenty przeciwciał, takie jak Fab, jednołańcuchowe przeciwciało i tym podobne, są wyrażane na powierzchni faga przez wprowadzenie genu kodującego przeciwciało wytworzone z ludzkiej komórki B do genu faga. Fag wyrażający fragment przeciwciała mającego żądaną aktywność wiązania antygenu może być odzyskany z biblioteki z wykorzystaniem jego aktywności wiązania się z substratem unieruchomionym z antygenem jako
PL 218 428 B1 znacznikiem. Fragment przeciwciała może być dalej przekształcony w cząsteczkę ludzkiego przeciwciała obejmującą dwa pełne łańcuchy H i dwa pełne łańcuchy L technikami inżynierii genetycznej.
Transgeniczne zwierzę nie będące człowiekiem produkujące ludzkie przeciwciała jest zwierzęciem, do którego komórek wprowadzono gen kodujący ludzkie przeciwciało. Konkretnie, transgeniczne zwierzę produkujące ludzkie przeciwciała może być wytworzone przez wprowadzenie genu ludzkiego przeciwciała do komórki ES myszy, przeszczepienie komórki ES do embrionu innej myszy na wczesnym etapie rozwoju i umożliwienie jego rozwoju. Wprowadzając gen ludzkiego chimerycznego przeciwciała do zapłodnionego jaja i jego rozwój można również wytworzyć transgeniczne zwierzę. W odniesieniu do sposobu wytwarzania ludzkiego przeciwciała przez transgeniczne zwierzę produkujące ludzkie przeciwciało, ludzkie przeciwciało może być produkowane i akumulowane w hodowli przez uzyskanie hybrydoma produkującej ludzkie przeciwciało metodą zazwyczaj stosowaną do wytwarzania hybrydoma, a następnie hodowanie jej.
Przykładami transgenicznych zwierząt innych niż ludzie jest bydło, owca, koza, świnia, koń, mysz, szczur, ptactwo domowe, małpa, królik i podobne.
Ponadto, w niniejszym wynalazku korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem rozpoznającym antygen związany z nowotworem, przeciwciałem, które rozpoznaje antygen związany z alergią lub zapaleniem, przeciwciałem rozpoznającym antygen związany z chorobą narządów krążenia, lub przeciwciałem rozpoznającym antygen związany z chorobą autoimmunologiczną, lub przeciwciałem, które rozpoznaje antygen związany z wirusową lub bakteryjną infekcją, a korzystne jest ludzkie przeciwciało należące do klasy IgG.
Fragment przeciwciała jest fragmentem, który zawiera region Fc przeciwciała. Przykłady fragmentu przeciwciała obejmują monomeryczny łańcuch H, dimer łańcucha H i tym podobne.
Białko fuzyjne składające się z regionu Fc jest układem, w którym przeciwciało zawierające region Fc przeciwciała lub fragment przeciwciała uległo fuzji z białkiem, takim jak enzym, cytokina lub tym podobne.
W niniejszym wynalazku, przykładami łańcucha cukrowego, który wiąże się z regionem Fc cząsteczki przeciwciała, jest łańcuch cukrowy połączony N-glikozydowo. Przykłady łańcucha cukrowego połączonego N-glikozydowo obejmują typ złożony, w którym nieredukująca część końcowa struktury rdzeniowej ma jedno lub wiele rozgałęzień galaktozo-N-acetyloglukoazaminy (dalej określanej jako „Gal-GlcNAc”), a nieredukujący koniec Gal-GlcNAc ma strukturę, taką jak kwas sialowy, rozdzielająca N-acetyloglukozamina lub podobne.
W jednym przeciwciele region Fc zawiera miejsca, z którymi wiąże się łańcuch cukrowy połączony N-glikozydowo, a które będą opisane poniżej. Zatem, dwa łańcuchy cukrowe są związane z jedną cząsteczką przeciwciała. Ponieważ łańcuch cukrowy połączony N-glikozydowo, który wiąże się z cząsteczką przeciwciała, zawiera dowolny łańcuch cukrowy mający strukturę rdzeniową przedstawianą przez wzór strukturalny (I), możliwych jest kilka kombinacji łańcuchów cukrowych połączonych N-glikozydowo, które wiążą się z przeciwciałem. Zatem, tożsamość substancji można określić z punktu widzenia struktury cukrowej związanej z regionem Fc.
W niniejszym opisie termin „kompozycja”, obejmuje cząsteczkę przeciwciała mającą złożone łańcuchy cukrowe połączone N-glikozydowo w regionie Fc (dalej określaną jako „kompozycja przeciwciała według niniejszego wynalazku”), która może mieć łańcuchy cukrowe o takiej samej strukturze lub cząsteczką przeciwciała mającego różne struktury łańcuchów cukrowych.
W niniejszym wynalazku, udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą na końcu redukującym łańcucha cukrowego, wśród wszystkich złożonych łańcuchów cukrowych połączonych N-glikozydowo związanych z regionem Fc, zawartych w kompozycji przeciwciała, jest stosunkiem liczby łańcuchów cukrowych, w których fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą na końcu redukującym łańcucha cukrowego do całkowitej liczby złożonych łańcuchów cukrowych połączonych N-glikozydowo, związanych z regionem Fc, zawartych w kompozycji.
W niniejszym wynalazku łańcuch cukrowy, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą na końcu redukującym złożonego łańcucha cukrowego połączonego N-glikozydowo, jest łańcuchem cukrowym, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo. Przykłady obejmują złożony N-glikozydowo połączony łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy nie jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy przez wiązanie a.
Kompozycja przeciwciała wykazuje dużą aktywność ADCC, gdy udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą na końcu redukującym łańcucha cukrowePL 218 428 B1 go wśród wszystkich złożonych N-glikozydowo połączonych łańcuchów cukrowych wiążących się z regionem Fc zawartych w przeciwciele według niniejszego wynalazku korzystnie wynosi 20% lub więcej, bardziej korzystnie 25% lub więcej, jeszcze bardziej korzystnie 30% lub więcej, bardziej korzystnie 40% lub więcej, lub najbardziej korzystnie 50% lub więcej. Gdy stężenie przeciwciała jest zmniejszone aktywność ADCC jest zmniejszona, ale wysoką aktywność ADCC można uzyskać, nawet jeżeli stężenie przeciwciała jest niskie, tak długo jak udział łańcucha cukrowego, w których fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą na końcu redukującym w łańcuchu cukrowym, wynosi 20% lub więcej.
Udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą na końcu redukującym łańcucha cukrowego zawartego w kompozycji składającej się z cząsteczki przeciwciała mającego złożone łańcuchy cukrowe połączone N-glikozydowo związane z regionem Fc, może być określony przez uwolnienie łańcucha cukrowego z przeciwciała z zastosowaniem znanej metody, takiej jak hydrazynoliza, trawienie enzymatyczne lub tym podobne [Biochemical Experimentation Methods 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar (Japan Scientific Societies Press) wydane przez Reiko Takahashi 1989)], przeprowadzenie znakowania fluorescencyjnego lub znakowania radioizotopowego uwolnionego łańcucha cukrowego, a następnie chromatograficzne oddzielenie oznakowanego łańcucha cukrowego. Uwolniony łańcuch cukrowy może być również określony przez analizę metodą HPAED-PAD [J. Liq. Chromatogr., 6, 1557 (1983)].
W niniejszym wynalazku, komórka CHO pochodząca z tkanki jajnika chomika chińskiego oznacza dowolną komórkę, która jest ustaloną linią komórkową z tkanki jajnika chomika chińskiego (Cricetulus griseus). Przykłady obejmują komórki CHO opisane w dokumentach takich jak Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900); i tym podobne. Ponadto przykładami mogą być CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUXB11 (ATCC CCL-9096) i Pro-5 (ATCC CCL1781) zarejestrowane w ATCC (American Type Culture Collection) i komercyjnie dostępna CHO-S (Life Technologies, Nr kat. 11619) lub sublinie komórkowe otrzymane przez adaptację linii komórkowych z zastosowaniem różnych pożywek.
W niniejszym wynalazku enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, może być każdym enzymem, o ile jest on enzymem związanym z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, jako źródła fukozy dla łańcucha cukrowego. Enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, jest enzymem, który ma wpływ na syntezę wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy.
Wewnątrzkomórkowy nukleotyd cukrowy, GDP-fukoza, jest dostarczany przez de novo szlak syntezy lub drogą z odzysku. Zatem, wszystkie enzymy związane ze szlakiem syntezy są objęte określeniem jako enzymy związane z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDPfukozy.
Przykładami enzymów związanych z de novo szlakiem syntezy wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, są 4,6-dehydrataza GDP-mannozowa (dalej określana jako „GMD”). 3,5-epimeraza GDP-keto-6-deoksymannozowa (dalej określana jako „Fx”) i tym podobne.
Przykładami enzymu związanego ze szlakiem syntezy odzyskującej wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, są pirofosforylaza GDP-beta-L-fukozowa (dalej określana jako „GFPP”), fukokinaza i tym podobne.
Enzymem, który ma wpływ na syntezę wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDPfukozy, jest także enzym wpływający na aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy i enzym, który ma wpływ na strukturę substancji, takich jak substrat enzymu.
W niniejszym wynalazku, enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy związana jest z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy w redukującym końcu przez wiązanie a w złożonym N-glikozydowo połączonym łańcuchu cukrowym, obejmuje dowolny enzym, o ile, jest on enzymem związanym z reakcją wiązania pozycji 1 fukozy z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy przy końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym i połączonym N-glikozydowo. Enzym związany z reakcją wiązania pozycji 1 fukozy z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy przy końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo oznacza en12
PL 218 428 B1 zym, który wpływa na reakcję wiązania pozycji 1 fukozy z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy w końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo.
Przykłady enzymów związanych z reakcją wiązania pozycji 1 fukozy z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, obejmują a-1,6-fukozylotransferazę, a-L-fukozydazę i podobne.
Przykłady również obejmują enzym, który ma wpływ na aktywność enzymu związanego z reakcją wiązania pozycji 1 fukozy z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo i enzym, który wpływa na strukturę substancji stosowanych jako substrat.
W niniejszym wynalazku DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach, jest to DNA otrzymany np. metodą taką jak hybrydyzacja kolonii, hybrydyzacja łysinek lub hybrydyzacja Southern blot przy zastosowaniu DNA, takiego jak DNA mający sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 1, 2, 48, 51 lub 65 lub częściowy jego fragment jako sondy i specyficznie obejmuje DNA, który może być zidentyfikowany przez przeprowadzenie hybrydyzacji w temperaturze 65°C w obecności 0,7 do 1,0 M chlorku sodu z użyciem filtra, na którym zostały unieruchomione fragmenty DNA pochodzące z kolonii lub łysinek, a następnie przemycie filtra w temperaturze 65°C z zastosowaniem 0,1 do 2 x roztworu SSC (kompozycja 1 x roztworu SSC zawierająca 150 mM chlorku sodu i 15 mM cytrynianu sodu). Hybrydyzację można przeprowadzić zgodnie z opisanymi metodami, np. w Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbour Laboratory Press (1989) (dalej określana jako „Molecular Cloning, wydanie drugie), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons 198701997 (dalej określone jako „Current Protocols in Molecular Biology”); DWA cloning 1: Core Techniques, a Practical Approach, wydanie drugie, Oxford University (1995); i tym podobnych. Przykłady hybrydyzującego DNA obejmują DNA mające co najmniej 60% homologii lub więcej, korzystnie 70% lub więcej, bardziej korzystnie 80% lub więcej, jeszcze bardziej korzystnie 90% lub więcej, dużo bardziej korzystnie 95% lub więcej, a najbardziej korzystnie 98% lub więcej homologii z sekwencją nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 1, 2, 48, 51 lub 65.
W niniejszym wynalazku białko, które obejmuje sekwencję aminokwasową, w której przynajmniej jeden aminokwas został usunięty, podstawiony, wstawiony i/lub dodany do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. ID. NR: 23, 24, 71, 72 lub 73 ma aktywność a-1,6-fukozylotransferazy, aktywność GMD, aktywność Fx lub aktywność GFPP, można otrzymać np. przez wprowadzenie mutacji ukierunkowanej do DNA kodującego białko mające sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 1, 2, 65, 48 lub 51, odpowiednio, przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej opisanej w np. Molecular Cloning Drugie Wydanie, Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) i tym podobnych. Ilość aminokwasów, które mają być wydeletowane, podstawione, wstawione i/lub dodane wynosi jeden lub więcej, i jest to ilość, która nie jest konkretnie ograniczona, ale jest to ilość, która może być wydeletowana, podstawiona lub dodana znaną techniką, taką jak mutageneza ukierunkowana, np. jest to do kilkudziesięciu, korzystnie 1 do 20, bardziej korzystnie 1 do 10, a najbardziej korzystnie 1 do 5.
Aby utrzymać aktywność a-1,6-fukozylotransferazy, GMD, Fx lub GFPP białko musi mieć co najmniej 80% lub więcej, korzystnie 85% lub więcej, bardziej korzystnie 90% lub więcej, jeszcze bardziej korzystnie 95% lub więcej, dużo bardziej korzystnie 97% lub więcej, a najbardziej korzystnie 99% lub więcej homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 23, 24, 71, 72 lub 73, obliczoną przy zastosowaniu oprogramowania, takiego jak BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)], FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)] lub podobnych.
Przykłady komórki CHO według niniejszego wynalazku obejmują komórkę, w której aktywność enzymatyczna jest zmniejszona lub usunięta.
(a) Komórka, w której aktywność enzymatyczna jest zmniejszona lub usunięta, obejmuje komórki, w których aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub aktywność enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo jest zmniejszona lub usunięta.
Linia komórkowa oporna na lektynę może być otrzymana przez hodowanie linii komórkowej na pożywce o uprzednio ustalonym stężeniu lektyny, a następnie przez selekcję takiej linii komórkowej,
PL 218 428 B1 której wskaźnik przeżywalności jest większy przynajmniej 2 razy, korzystnie 3 razy, a bardziej korzystnie 5 razy, niż linii rodzicielskiej, z istotnością statystyczną. Ponadto, może ona być otrzymana przez hodowanie linii komórkowej w pożywce zawierającej lektynę, a potem przez selekcję linii komórkowej o najwyższym wskaźniku przeżywalności, np. 80%, przy stężeniu lektyny 2 razy, korzystnie 5 razy, bardziej korzystnie 10 razy, i najbardziej korzystnie 20 razy lub więcej wyższym niż dla linii komórkowej rodzicielskiej.
Jako lektynę, która rozpoznaje łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, można zastosować każdą lektynę rozpoznającą strukturę łańcucha cukrowego. Przykłady obejmują lektynę z Lens culinaris LCA (aglutynina pochodząca z soczewicy Lens culinaris), lektynę z grochu PSA (lektyna z grochu Pisum sativum), lektynę VFA z fasoli (aglutynina pochodząca z Vicia faba), lektynę AAL z Aleuria aurantia i tym podobne.
Komórka CHO według niniejszego wynalazku może produkować przeciwciało wykazujące wyższą aktywność ADCC niż przeciwciało produkowane przez komórkę rodzicielską CHO przed zastosowaniem sposobu zmniejszania lub usuwania aktywności enzymu będącego przedmiotem zainteresowania.
Komórka CHO według niniejszego wynalazku może również produkować przeciwciało mające wyższą aktywność ADCC niż wykazywana przez przeciwciało, w którym wśród wszystkich złożonych łańcuchów cukrowych połączonych W-glikozydowo związanych z regionem Fc zawartym w kompozycji przeciwciała, udział łańcuchów cukrowych, w których fukoza nie jest związana z W-acetyloglukozaminą na końcu redukującym, jest mniejszy niż 20%.
Przykładem rodzicielskiej linii komórkowej, która może być stosowana w niniejszym wynalazku, jest komórka, w której aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub aktywność enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, nie jest zmniejszona. Konkretnie, stosowana jest komórka, która nie jest traktowana w celu zmniejszenia lub usunięcia aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub aktywnością enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo.
W niniejszym wynalazku, aktywność ADCC jest aktywnością cytotoksyczną, w której przeciwciało związane z antygenem powierzchniowym na komórce nowotworowej w żywym organizmie aktywuje komórkę efektorową przez receptor Fc istniejący na regionie Fc przeciwciała i na powierzchni komórki efektorowej, tym samym hamując komórkę nowotworową [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss Inc., Chapter 2.1 (1955)]. Przykładami komórki efektorowej są komórka zabójcy, komórka naturalnego zabójcy i zaktywowane makrofagi, i tym podobne.
Komórka według wynalazku, w której aktywność związana z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy lub aktywność enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo jest zmniejszona techniką inżynierii genetycznej, (określana jest dalej jako „komórka gospodarza” niniejszego wynalazku”). Komórka gospodarza według niniejszego wynalazku jest przydatna jako komórka produkująca przeciwciało wykazujące wysoką aktywność ADCC.
Komórka gospodarza według niniejszego wynalazku może być dowolnym gospodarzem, o ile wyraża cząsteczkę przeciwciała. Przykłady obejmują komórkę drożdżową, komórkę zwierzęcą, komórkę owadzią i komórkę roślinną itp. Korzystnie przykłady komórek zwierzęcych obejmują komórkę CHO pochodzącą z tkanki jajnika chomika chińskiego, komórkę YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 z linii komórkowej szczurzego szpiczaka, komórkę NS2) z linii komórkowej szpiczaka mysiego, komórkę SP2/0-Ag14 szpiczaka mysiego, komórkę BHK pochodzącą z tkanki nerki syryjskiego chomika, komórkę hybrydoma produkującą przeciwciała, komórki Namalwa ludzkiej linii komórek białaczkowych, embrionalną komórkę macierzystą, zapłodnioną komórkę jajową i tym podobne.
Niniejszy wynalazek jest opisany szczegółowo poniżej.
1. Wytworzenie komórki według niniejszego wynalazku.
Komórka gospodarza może być wytworzona następującymi technikami.
PL 218 428 B1 (1) Technika dysrupcji genu skierowana na gen kodujący enzym
Komórka gospodarza według niniejszego wynalazku może być wytworzona z zastosowaniem techniki dysrupcji genu kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Termin „gen”, jak tu stosowany, obejmuje DNA i RNA.
Metoda dysrupcji genu może być dowolną metodą, o ile, może ona zaburzyć gen docelowego enzymu. Przykłady obejmują metodę antysensowną, metodę rybozymową, metodę rekombinacji homologicznej, metodę RDO, metodę RNAi, metodę z zastosowaniem retrowirusa, metodę z zastosowaniem transpozonu, itp. Metody są opisane szczegółowo poniżej.
(a) Wytworzenie komórki według niniejszego wynalazku metodą antysensowną lub rybozymową
Komórka według niniejszego wynalazku może być wytworzona metodą rybozymową opisaną w Cell Technology, 12, 239 (1993); BIO/TECHNOLOGY, 17, 1097 (1999); Hum. Mol. Genet., 5, 1083 (1995); Cell Technology, 13, 255 (1994); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1886, (1999); itp. np. przez traktowanie docelowego enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Wytwarza się cDNA lub genomowy DNA kodujące enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Określa się sekwencję wytworzonego cDNA lub genomowego DNA.
W oparciu o określoną sekwencję DNA, projektuje się odpowiednią długość antysensownego genu lub struktury rybozymowej obejmującej resztę DNA kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, część jego nietranslacyjnego regionu lub intronu.
W celu doprowadzenia do ekspresji antysensownego genu lub rybozymu w komórce, wytwarza się wektor rekombinacyjny przez wprowadzenie fragmentu lub pełnej długości wytworzonego DNA poniżej promotora odpowiedniego wektora ekspresyjnego.
Transformanta uzyskuje się przez wprowadzenie wektora rekombinacyjnego do komórki gospodarza odpowiedniej dla wektora ekspresyjnego.
Komórkę według niniejszego wynalazku jako komórkę gospodarza można otrzymać przez wyselekcjonowanie transformanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo. Komórkę gospodarza można także otrzymać przez wyselekcjonowanie transformanta na podstawie struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny na błonie komórkowej lub struktury łańcucha cukrowego wytworzonej cząsteczki przeciwciała.
Jako komórka gospodarz według niniejszego wynalazku może być stosowana każda komórka, taka jak komórka drożdżowa, zwierzęca, owadzia lub roślinna, o ile ma gen kodujący docelowy enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym docelowy związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo. Przykłady obejmują komórki gospodarza, które będą opisane poniżej w punkcie 3.
Jako wektor ekspresyjny stosowany jest wektor, który replikuje się autonomicznie w komórce gospodarza, lub który może być zintegrowany z chromosomem i obejmuje promotor w takiej pozycji, że zaprojektowany gen antysensowny lub rybozym może być przekazany. Przykłady obejmują wektory ekspresyjne, które będą opisane poniżej w punkcie 3.
Jako metody wprowadzania genu do różnych komórek gospodarza, mogą być stosowane metody wprowadzania wektorów rekombinacyjnych odpowiednich dla różnych komórek gospodarza, które będą opisane dalej w punkcie 3.
PL 218 428 B1
Następująca metoda może być przykładem metody wyboru transformanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub aktywności enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Metoda Wyboru Transformanta
Przykłady metod wyboru komórki, w której zmniejszona jest aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub aktywność enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo obejmują metody biochemiczne lub techniki inżynierii genetycznej opisane w New Biochemical Experimentation Series 3 Saccharides I, Glycoprotein (Tokyo Kagaku Dojin), pod redakcją Japanese Biochemical Society (1998); Cell Engineering Supplement Experimental Protocol Series, Glycobiology Experimental Protocol, Glycoprotein, Glycolipid and Proteoglycan (Shujun-sha), pod redakcją Naoyuki Tanguchi, Akemi Suzuki, Kiyoshi Furukawa i Kazuyuki Sugawara (1996); Molecular Cloning, Drugie Wydanie, Current Protocols in Molecular Biology; itp. Przykłady metody biochemicznej obejmują metodę, w której aktywność enzymu jest oceniana z zastosowaniem substratu specyficznego dla enzymu i tym podobne. Przykłady technik inżynierii genetycznej obejmują analizę Northern, RT-PCR itp., w których mierzy się ilość mRNA genu kodującego enzym.
Przykłady metod wyboru transformanta na podstawie struktury łańcuchów cukrowych glikoproteiny na błonie komórkowej obejmują metody, które będą opisane poniżej w punkcie 1(5). Przykłady metod wyboru transformanta na podstawie struktury łańcuchów cukrowych produkowanych cząsteczek przeciwciał obejmują metody, które będą opisane poniżej w punktach 5 i 6.
Następująca metoda jest podana jako przykładowa metoda wytwarzania cDNA kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Wytwarzanie DNA
Całkowity RNA lub mRNA jest wyekstrahowany z ludzkiej lub zwierzęcej tkanki lub komórki.
Z uzyskanego całkowitego RNA lub mRNA przygotowuje się bibliotekę cDNA z wytworzonego.
Zdegenerowane startery są wytwarzane na podstawie sekwencji aminokwasowej enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, a fragment genu kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, uzyskuje się przez PCR z zastosowaniem wytworzonej biblioteki cDNA jako matrycy.
DNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDPfukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, można uzyskać przez skrining biblioteki cDNA z zastosowaniem otrzymanego fragmentu genu jako sondy.
Jako mRNA z ludzkiej lub zwierzęcej tkanki lub komórki można zastosować produkt dostępny komercyjnie (Clontech), lub można go wyizolować z tkanki lub komórki ludzkiej lub zwierzęcej następującą metodą. Przykłady metody izolacji całkowitego RNA z ludzkich lub zwierzęcych tkanek lub komórek obejmują metodę z tiocyjanianem guanidynytrifIuorooctanem cezu [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], metodę z tiocyjanianem guanidyny/fenolem/chloroformem (AGPC) [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental Medicine, 9, 1937 (1991)] itp.
Przykładem izolacji mRNA z całkowitego RNA jak poly (A)+ RNA jest metoda kolumienkowa z oligo(dT) unieruchomionymi na celulozie (Molecular Cloning, Drugie Wydanie) itp.
Ponadto mRNA można otrzymać przy użyciu zestawu takiego jak Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia) lub podobnych.
PL 218 428 B1
Bibliotekę cDNA wytwarza się z mRNA z ludzkiej lub zwierzęcej tkanki lub komórki. Przykładami metod wytwarzania bibliotek cDNA są metody opisane w Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); itp. lub metody stosujące komercyjnie dostępne zestawy, takie jak SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies), ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE) itp.
Jako wektor do klonowania do zastosowania w wytwarzaniu biblioteki cDNA można zastosować jakikolwiek wektor, taki jak wektor fagowy, wektor plazmidowy itp., jeżeli tylko może się on replikować autonomicznie w Escherichia coli K12. Przykładami są ZAP Express [STRATAGENE, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], Lambda ZAP II (Stratagene), Xgt10 i Xgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], XTriplEx (Clontech), XExCell (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] itp.
Jako mikroorganizm-gospodarz może być stosowany dowolny mikroorganizm, ale korzystnie stosowana jest Escherichia coli. Przykładami są Escherichia coli XL1-Blue MRF' [STRATAGENE, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]; Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] i podobne.
Biblioteka cDNA może być stosowana jako taka w dalszej analizie w celu uzyskania cDNA pełnej długości jak najbardziej wydajnie przez zmniejszenie stosunku niepełnego cDNA, może być zastosowana biblioteka cDNA wytworzona metodą z czapeczką oligo opracowana przez Sugano et al. [Gene, 138, 171 (1994); Gene, 200, 149 1996); Protein, Nucleic Acid and Protein, 41, 603 (1996); Experimental Medicine, 11, 2491 (1993); cDNA Cloning (Yodo-sha) (1996); Methods for Preparing Gene Libraries (Yodo-sha) (1994)].
Zdegenerowane startery specyficzne dla 5'-końcowych i 3'-końcowych sekwencji nukleotydowych sekwencji nukleotydowej uważanej za kodującą sekwencję aminokwasową, są przygotowane w oparciu o sekwencję aminokwasową enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym jest połączonym N-glikozydowo, a DNA jest amplifikowany przez PCR [PCR protocols, Academic Press (1990)] z użyciem wytworzonej biblioteki cDNA jako matrycy do uzyskania fragmentu genu kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Można potwierdzić, że uzyskany fragment genu jest to DNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, metodą zazwyczaj stosowaną do analizy nukleotydu, taką jak metoda dideoksy Sangera et al. [PNAS USA, 74, 5463 1977)], analizatorem sekwencji nukleotydowych, takim jak ABIPRISM 377 DNA Sequencer (PE Biosystems) itp.
DNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDPfukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo można otrzymać przeprowadzając hybrydyzację kolonii lub hybrydyzację łysinek (Molecular Cloning, Second Edition) dla cDNA lub biblioteki cDNA syntetyzowanych z mRNA zawartego w ludzkiej lub zwierzęcej tkance lub komórce, z zastosowaniem fragmentu genu jako sondy DNA.
Ponadto DNA kodujące enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo można również otrzymać przeprowadzając skrining metodą PCR stosując cDNA lub bibliotekę cDNA, syntetyzowane z mRNA zawartego w ludzkiej lub zwierzęcej tkance lub komórce jako matrycę i stosując startery stosowane do uzyskania fragmentu genu kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDPfukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest zwiąPL 218 428 B1 zana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Sekwencja nukleotydowa uzyskanego DNA kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, jest analizowana od jego końca i określana metodą zwykle stosowaną do analizy nukleotydów, taką jak metoda dideoksy opracowana przez Sanger et al. [PNAS USA, 74, 5463 (1977)], analizatorem sekwencji nukleotydowych ABIPRISM 377 DNA Sequencer (firma PE Biosystems) itp.
Gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDPfukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, można także określić na podstawie genów w bazach danych, przez przeszukiwanie baz danych sekwencji nukleotydowych takich jak GenBank, EMBL, DDBJ i podobne stosując program do szukania homologii, taki jak BLAST w oparciu o określoną sekwencję nukleotydową cDNA.
Przykładami sekwencji nukleotydowych genu otrzymanego tymi metodami, kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, są sekwencje reprezentowane przez SEK. ID. NR: 48, 51 lub 65. Przykładami sekwencji nukleotydowych genu kodującego enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, są sekwencje reprezentowane przez SEK. ID NR: 1 lub 2.
cDNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, można także otrzymać przez zsyntetyzowanie chemiczne syntetyzatorem DNA, takim jak DNA Synthesizer model 392 firmy Perkin Elmer lub podobnym, przy zastosowaniu metody fosfoamidytowej, w oparciu o określoną sekwencję nukleotydową DNA.
Jako przykład metody do wytwarzania DNA genomowego kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, podana jest poniższa metoda.
Wytwarzanie DNA genomowego
Przykłady metod wytwarzania genomowego DNA obejmują znane metody opisane w Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Biology; Ponadto, genomowy DNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, może także być izolowany z zastosowaniem zestawu takiego jak Genome DNA Library Screening System (Genome Systems), Universal Genome WalkerTM Kits (firma CLONTECH) itp.
Przykładami sekwencji nukleotydowej DNA genomowego otrzymanej tą metodą, kodującej enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, są sekwencje nukleotydowe reprezentowane przez SEK. ID. NR: 67 lub 70. Przykładem sekwencji nukleotydowej DNA genomowego, kodującej enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, jest sekwencja nukleotydowa reprezentowana przez SEK. ID. NR: 3.
Komórkę gospodarza można także otrzymać bez stosowania wektora ekspresyjnego, lecz przez bezpośrednie wprowadzenie antysensownego oligonukleotydu lub rybozymu do komórki gospodarza, który jest utworzony w oparciu o sekwencję nukleotydową kodującą enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy, jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Antysensowny oligonukleotyd lub rybozym może być zsyntetyzowany normalną metodą, lub przy zastosowaniu syntetyzatora DNA. Konkretnie, może być zsyntetyzowany w oparciu o informację
PL 218 428 B1 o sekwencji oligonukleotydu mającego odpowiadającą sekwencję od 5 do 150 zasad, korzystnie 5 do 60 zasad, bardziej korzystnie od 10 do 40 zasad wśród sekwencji nukleotydowych cDNA i genomowego DNA kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, przez zsyntetyzowanie oligonukleotydu, który odpowiada sekwencji komplementarnej do oligonukleotydu (oligonukleotyd antysensowny) lub rybozymu obejmującego sekwencję oligonukleotydową.
Przykłady oligonukleotydu obejmują oligo-RNA i pochodne oligonukleotydu. (Przykłady pochodnych oligonukleotydu obejmują pochodne oligonukleotydu, w których wiązanie fosfodiestrowe w oligonukleotydzie jest przekształcone w wiązanie fosforotioanowe, pochodną oligonukleotydu, w której wiązanie fosfodiestrowe w oligonukleotydzie jest przekształcone w wiązanie N3'-P5' fosfoamidatowe, pochodną oligonukleotydową, w której wiązanie rybozy i wiązanie fosfodiestrowe w oligonukleotydzie są przekształcone w wiązanie peptyd-kwas nukleinowy, pochodną oligonukleotydu, w której uracyl w oligonukleotydzie jest zastąpiony C-5 propynylouracylem, pochodną oligonukleotydu, w której uracyl w oligonukleotydzie jest zastąpiony C-5 tioazolouracylem, pochodną oligonukleotydu, w której cytozyna w oligonukleotydzie jest zastąpiona C-5 propynylocytozyną, pochodną oligonukleotydu, w której cytozyna w oligonukleotydzie jest zastąpiona cytozyną modyfikowaną fenoksazyną, pochodną oligonukleotydu, w której ryboza w oligonukleotydzie jest zastąpiona 2'-O-propylorybozą i pochodną oligonukleotydu, w której ryboza w oligonukleotydzie jest zastąpiona 2'-metoksyetoksyrybozą [Cell Technology, 16, 1463 (1997)].
(b) Wytwarzanie komórki gospodarza według niniejszego wynalazku przez rekombinację homologiczną
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć a modyfikując docelowy gen na chromosomie z zastosowaniem metody rekombinacji homologicznej, w której genem docelowym jest gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo.
Gen docelowy na chromosomie można zmodyfikować stosując metodę opisaną w Manipulationg the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995) itp., np. jak poniżej.
Wytwarzany jest genomowy DNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo.
W oparciu o sekwencję nukleotydową DNA genomowego wytwarza się docelowy wektor do rekombinacji homologicznej docelowego genu, który ma być modyfikowany (np. strukturalnego genu enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo lub genu promotorowego).
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć przez wprowadzenie docelowego wektora do komórki gospodarza i selekcję komórki, w której zaszła rekombinacja homologiczna między docelowym wektorem i docelowym genem.
Jako komórkę gospodarza można zastosować każdą komórkę taką jak drożdżowa, zwierzęca, owadzia lub roślinna, o ile ma ona gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo. Przykładami są komórki gospodarza opisane poniżej w punkcie 3.
Przykłady metod wytwarzania DNA genomowego kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu
PL 218 428 B1 redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, obejmują metody wytwarzania DNA genomowego opisane w punkcie 1(1) (a) itp.
Przykłady sekwencji nukleotydowej DNA genomowego, kodującej enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, obejmują sekwencje nukleotydowe reprezentowane przez SEK. ID. NR: 67 lub 70. Przykładem sekwencji nukleotydowej DNA genomowego, kodującej enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, jest sekwencja nukleotydowa reprezentowana przez SEK. ID. NR: 3.
Wektor docelowy do zastosowania w rekombinacji homologicznej genu docelowego może być wytworzony zgodnie z metodą opisaną w Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995); itp. Wektor docelowy można stosować jako wektor typu zastępującego lub insercyjnego.
Do wprowadzania wektora docelowego do różnych komórek gospodarza stosowane mogą być metody wprowadzania wektorów rekombinacyjnych odpowiednich dla różnych komórek gospodarza, które będą opisane poniżej w punkcie 3.
Przykłady metod wydajnej selekcji rekombinantów homologicznych obejmują metodę taką jak selekcja pozytywna, selekcja promotora, selekcja negatywna lub selekcja poli-A, opisane w Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995); itp. Przykładami metody selekcji rekombinanta homologicznego będącego przedmiotem zainteresowania z wybranych linii komórkowych są hybrydyzacja Southern dla DNA genomowego (Molecular Cloning, Second Edition), PCR [PCR protocols, Academic Press (1990)], itp.
(c) Wytwarzanie komórki gospodarza według niniejszego wynalazku metodą RDO
Komórka gospodarza według niniejszego wynalazku może być wytworzona metodą RDO (RNADNA oligonukleotydową) przez skierunkowaną na gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu: redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, na przykład następująco.
Wytwarza się cDNA lub genomowy DNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo.
Określana jest sekwencja nukleotydowa wytworzonego cDNA lub DNA genomowego.
W oparciu o określoną sekwencję DNA projektuje się i syntetyzuje odpowiednią długość konstruktu RDO obejmującego resztę DNA kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, lub część jego regionu nieulegającego translacji lub intron.
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można otrzymać przez wprowadzenie zsyntetyzowanego RDO do komórki, a następnie wyselekcjonowanie transformanta, w którym zaszła mutacja w enzymie docelowym, mianowicie w enzymie związanym z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub w enzymie związanym z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo.
Jako komórkę gospodarza można zastosować każdą komórkę taką jak drożdżowa, zwierzęca, owadzia lub roślinna, o ile tylko ma gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo. Przykładami są komórki gospodarza opisane poniżej w punkcie 3.
PL 218 428 B1
Przykłady metod wprowadzenia RDO do różnych komórek gospodarza obejmują metody do wprowadzania wektorów rekombinacyjnych odpowiednich dla różnych komórek, które są opisane poniżej w punkcie 3.
Przykładami metod wytwarzania cDNA kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo są metody wytwarzania DNA opisane w punkcie 1(1) (a) itp.
Przykładami metod wytwarzania DNA genomowego kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo są metody wytwarzania genomowego DNA opisane w punkcie 1(1) (a) itp.
Sekwencję nukleotydową DNA można określić przez trawienie jej odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, klonowanie fragmentów do plazmidu, takiego jak pBluescript SK(-) (firma Stratagene) itp., poddawanie klonów reakcji na ogół stosowanej jako metoda do analizowania sekwencji nukleotydowej, taka jak metoda dideoksy [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] opracowana przez Sanger et al., a następnie analizowanie klonów przy użyciu automatycznego analizatora sekwencji nukleotydowej, takiego jak A.L.F. DNA Sequencer (firma Pharmacia) lub podobne.
RDO można wytworzyć standardową metodą lub stosując syntetyzator DNA.
Przykłady metod selekcji komórki, w której zaszła mutacja, przez wprowadzenie RDO do komórki gospodarza, w genie kodującym enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, obejmują metody bezpośredniego wykrywania mutacji w genach chromosomowych opisane w Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology; itp. metody opisane w punkcie 1(1) (a) do selekcji transformantów przez badanie aktywności wprowadzonego enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo; metodę selekcji transformanta przy użyciu struktury łańcuchów cukrowych glikoprotein na błonie komórkowej, która będzie opisana poniżej w punkcie 1(5); i metodę selekcji transformanta na podstawie struktury łańcuchów cukrowych w wytworzonej cząsteczce przeciwciała, która zostanie opisana poniżej w punktach 5 i 6.
Konstrukt RDO może być zaprojektowany zgodnie z metodami opisanymi w Science, 213, 1386 (1996); Nature Medicine, 4, 285 (1998); Hepatology, 25, 1462 (1997); Gene Therapy, 5, 1960 (1999); J. Mol. Med, 75, 829, (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8774 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8768 (1999); Nuc. Acids. Res., 27, 1323 (1999); Invest. Dematol., 111, 1172 (1998); Nature Biotech., 18, 1343 (1998); Nature Biotech, 18, 43 (2000), Nature Biotech., 18, 555 (2000) itp.
(d) Wytworzenie komórki gospodarza metodą RNAi
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć metodą RNAi (RNA interference, interferencyjny RNA) skierunkowania na gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, na przykład jak następuje.
Wytwarza się cDNA kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Określa się sekwencję nukleotydową wytworzonego cDNA.
W oparciu o określoną sekwencję DNA zaprojektowana jest i syntetyzuje odpowiednią długość konstruktu genu modyfikowanego metodą RNAi (dalej określanego jako „gen RNAi”) genu składającego się z części kodującej DNA kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiąPL 218 428 B1 zanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, lub część jego regionu nieulegającego translacji.
W celu uzyskania ekspresji genu RNAi w komórce, wytwarza się wektor rekombinacyjny przez wprowadzenie fragmentu wytworzonego DNA lub DNA pełnej długości poniżej promotora odpowiedniego wektora ekspresyjnego.
Transformant uzyskuje się przez wprowadzenie wektora rekombinacyjnego do komórki gospodarza odpowiedniej dla wektora ekspresyjnego.
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można otrzymać przez wyselekcjonowanie transformanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, lub struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny na błonie komórkowej lub wytworzonej cząsteczce przeciwciała.
Jako komórkę gospodarza można zastosować każdą komórkę taką jak drożdżową, zwierzęcą, owadzią lub roślinną, o ile ma gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo. Przykłady obejmują komórki gospodarza opisane poniżej w punkcie 3.
Jako wektor ekspresyjny stosuje się wektor, który replikuje się samoistnie w komórce gospodarza lub który może być zintegrowany z chromosomem i składa się z promotora w takiej pozycji, aby wytworzony gen RNAi mógł być przeniesiony. Przykłady obejmują wektory ekspresyjne, opisane poniżej w punkcie 3.
Jako metodę wprowadzenia genu do różnych komórek gospodarza można zastosować metody wprowadzania wektorów rekombinacyjnych odpowiednich dla różnych komórek, opisane poniżej w punkcie 3.
Przykłady metody selekcji transformanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo obejmują metody opisane w punktach 1(1) (a).
Przykłady metody selekcji transformanta na podstawie struktury glikoprotein na błonie komórkowej obejmują metody, które będą opisane poniżej w punkcie 1(5). Przykłady metod wyboru transformanta na bazie struktury łańcucha cukrowego wytwarzanej cząsteczki przeciwciała obejmują metody, które będą poniżej opisane w punkcie 5 lub 6.
Ponadto komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można także otrzymać nie stosując wektora ekspresyjnego lecz przez bezpośrednie wprowadzenie RNAi genu do komórki gospodarza zaprojektowanego na podstawie sekwencji nukleotydowej kodującej enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Gen RNAi można wytworzyć zwykłą metodą lub stosując syntetyzator DNA.
Konstrukt genu RNAi można zaprojektować zgodnie z metodami opisanymi w Nature, 391, 806 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15502 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 395, 854 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5049 (1999); Cell, 95, 1017 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1451 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959 (1998); Nature Cell Biol, 2, 70 (2000), itp.
(e) Wytworzenie komórki gospodarza według niniejszego wynalazku metodą z zastosowaniem systemu transpozonu
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć przez zaindukowanie mutacji z użyciem transpozonu, tak jak opisano w Nature. Genet., 25, 35 (2000) itp. a potem przez wyselekcjonowanie mutanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, lub na podstawie struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny wytworzonej cząsteczki przeciwciała lub na błonie komórkowej.
PL 218 428 B1
System transpozonu jest systemem, w którym mutacja jest indukowana przez losowe wstawienie egzogennego genu do chromosomu, przy czym egzogenny gen wstawiony między transpozony jest z reguły stosowany jako wektor do indukcji mutacji, a wektor ekspresyjny transpozazy dla losowego wprowadzenia genu do chromosomu jest wprowadzony do komórki w tym samym czasie.
Zastosowana może być każda transpozaza, o ile jest ona odpowiednia dla sekwencji transpozonu, który ma być zastosowany.
Jako gen egzogenny może być stosowany dowolny gen, o ile może on zaindukować mutację w DNA komórki gospodarza.
Jako komórkę gospodarza można zastosować dowolną komórkę, taką jak drożdżowa, zwierzęca, owadzia lub roślinna, o ile ma gen kodujący docelowy enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo. Przykłady obejmują komórki gospodarza opisane poniżej w punkcie 3.
Do wprowadzania genu do różnych komórek gospodarza można zastosować metodę wprowadzenia wektorów rekombinacyjnych odpowiednich dla różnych komórek gospodarza, opisane poniżej w punkcie 3.
Przykłady metody selekcji mutanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, obejmują metody opisane w punkcie 1(1) (a).
Przykłady metody wyselekcjonowania mutanta na podstawie struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny na błonie komórkowej obejmują metody opisane poniżej w punkcie 1(5). Przykłady metody wyselekcjonowania mutanta na podstawie struktury łańcuchów cukrowych wytworzonych cząsteczek przeciwciał są opisane poniżej w punktach 5 lub 6.
(2) Metoda wprowadzenia dominujących mutantów negatywnych genu kodującego enzym
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć stosując metodę wprowadzenia dominującej mutacji negatywnej przez nakierowanie na gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo. Przykłady enzymów związanych z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, obejmują GMD, Fx, GFPP, fukokinazę itp. Przykłady enzymów związanych z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo obejmują a-1,6-fukozylotransferazę, a-L-fukozydazę itp.
Enzymy katalizują specyficzne reakcje mające specyficzność substratową, a dominujące mutanty negatywne enzymów mogą być wytworzone przez dysrupcję centrów aktywnych enzymów, które katalizują aktywność katalityczną mającą specyficzność substratową. Metoda przygotowania dominującego mutanta negatywnego jest opisana poniżej jak następuje w odniesieniu do GMD, który jest jednym z enzymów docelowych.
W wyniku analizy trójwymiarowej struktury enzymu GMD pochodzącego z E. coli ujawniono, że 4 aminokwasy (treonina w pozycji 133, kwas glutaminowy w pozycji 135, tyrozyna w pozycji 157 i lizyna w pozycji 161) mają ważną funkcję dla aktywności enzymu [Structure, 8, 2, 2000). To znaczy, gdy mutanty zostały wytworzone przez substytucję 4 aminokwasów innymi aminokwasami w oparciu o informację o trójwymiarowej strukturze, aktywność enzymatyczna wszystkich mutantów była istotnie obniżona. Z drugiej strony, zmiany w zdolności wiązania GMD z NADP, koenzymem GMD, i jego substratem GDP-mannozą były ledwo zauważalne w mutantach. Zatem, dominujący mutant negatywny można wytworzyć przez substytucję 4 aminokwasów kontrolujących aktywność enzymatyczną GMD. Na przykład w GMD (SEK. ID. NR: 65) pochodzącym z komórki CHO, dominujący mutant negatywny może być wytworzony przez substytucję treoniny w pozycji 155, kwasu glutaminowego w pozycji 157, tyrozyny w pozycji 179 i lizyny w pozycji 183 innymi aminokwasami, przez porównanie homologii i przewidywanie trójwymiarowej struktury z wykorzystaniem informacji o sekwencji aminokwasowej opartej na wynikach z GMD pochodzącym z E. coli.
PL 218 428 B1
Taki gen, który prowadzi do substytucji aminokwasu, można wytworzyć przez ukierunkowaną mutagenezę opisaną w Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, itp.
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można otrzymać zgodnie z metodą opisaną w Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, lub podobną stosując wytworzony dominujący gen z negatywną mutacją dla genu docelowego enzymu, na przykład, w następujący sposób.
Wytwarza się gen kodujący dominującego negatywnego mutanta (odtąd zwany „dominującym negatywny gen mutantowy”) enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
W oparciu o wytworzony pełnej długości DNA dominującego negatywnego mutantowego genu, w miarę potrzeby wytworza się fragment DNA o właściwej długości zawierający resztę kodującą białko.
Wektor rekombinacyjny wytwarza się przez wprowadzenie fragmentu DNA lub DNA pełnej długości poniżej promotora w odpowiednim wektorze ekspresyjnym.
Transformanta otrzymuje się przez wprowadzenie wektora rekombinacyjnego do komórki gospodarza odpowiedniej dla wektora ekspresyjnego.
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć przez wyselekcjonowanie transformanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, lub na podstawie struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny w wytworzonej cząsteczce przeciwciała lub na błonie komórkowej.
Jako komórkę gospodarza można zastosować każdą komórkę taką jak drożdżowa, zwierzęca, owadzia lub roślinna, o ile ma ona gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo. Przykłady komórek gospodarza są opisane poniżej w punkcie 3.
Jako wektor ekspresyjny stosowany jest wektor który replikuje się samoistnie w komórce gospodarza, lub który może być zintegrowany z chromosomem i obejmuje promotor w takiej pozycji, przy której może nastąpić transkrypcja DNA kodującego dominującego negatywnego mutanta będącego przedmiotem zainteresowania. Przykłady obejmują wektory ekspresyjne, które będą opisane poniżej w punkcie 3.
Jako metodę wprowadzenia genu do różnych komórek gospodarza można zastosować metodę wprowadzenia wektorów rekombinacyjnych odpowiednich dla różnych komórek, opisaną poniżej w punkcie 3.
Przykłady metody selekcjonowania transformanta na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, obejmują metody opisane w punkcie 1(1) (a).
Przykłady metody selekcjonowania transformanta na podstawie struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny na błonie komórkowej obejmują metody, które będą opisane poniżej w punkcie 1(5). Przykłady metody selekcjonowania mutanta na podstawie struktury łańcucha cukrowego w wytworzonej cząsteczce przeciwciała obejmują metody, które będą opisane poniżej w punktach 5 lub 6.
(3) Sposób wprowadzania mutacji do enzymu
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć przez wprowadzenie mutacji do genu kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, a następnie wyselekcjonowanie linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania, w której zaszła mutacja w enzymie.
Przykłady enzymów związanych z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy obejmują GMD, Fx, GFpp, fukokinazę i podobne. Przykładami enzymów związanych
PL 218 428 B1 z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo są a-1,6-fukozylotransferaza, a-L-fukozydaza i podobne.
Przykłady metod obejmują: 1) metodę, w której żądana linia komórkowa jest wyselekcjonowana spośród mutantów otrzymanych przez traktowanie indukujące mutację rodzicielskiej linii komórkowej mutagenem, lub mutantów utworzonych spontanicznie, na podstawie aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, 2) metodę, w której żądana linia komórkowa jest wybrana spośród mutantów otrzymanych przez traktowanie indukujące mutację rodzicielskiej linii komórkowej mutagenem, lub mutantów wygenerowanych spontanicznie, na podstawie struktury łańcucha cukrowego cząsteczki wytworzonego przeciwciała i 3) metodę w której odpowiednia linia komórkowa jest wyselekcjonowana spośród mutantów otrzymanych przez traktowanie indukujące mutację rodzicielskiej linii komórkowej mutagenem, lub mutantów utworzonych spontanicznie, na podstawie struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny na błonie komórkowej.
Jako traktowanie indukujące mutację można zastosować dowolne traktowanie, o ile może ono zaindukować punktową mutację lub delecję lub mutację w postaci przesunięcia ramki odczytu w DNA komórek linii rodzicielskiej.
Przykłady obejmują traktowanie indukujące mutację nitrozomocznikiem, nitrozoguanidyną, benzopirenem, pigmentem akrydynowym lub traktowanie przez napromieniowanie. Ponadto jako mutageny mogą być użyte różne środki alkilujące i rakotwórcze. Przykładami metody umożliwiającej działanie mutagenu na komórki są metody opisane w Tissue Culture Techniques, 3rd edition (Asakura Shoten), pod redakcją Japanese Tissue Culture Association (1996), Nature Genet., 24, 314 (2000), itp.
Przykłady spontanicznie utworzonego mutanta obejmują mutanty wytwarzane spontanicznie przez ciągłą subkulturę w ogólnych warunkach hodowli komórek bez zastosowania traktowania indukującego mutację.
Przykładami metody pomiaru aktywności enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, są metody opisane w punkcie 1(1) (a). Przykłady metody rozróżniania struktury łańcucha cukrowego wytworzonej cząsteczki przeciwciała obejmują metody, które będą opisane poniżej w punktach 5 lub 6. Przykładami metody rozróżniania struktury łańcucha cukrowego glikoproteiny na błonie komórkowej są metody, które będą opisane poniżej w punkcie 1(5).
(4) Sposób hamowania transkrypcji i/lub translacji genu kodującego enzym
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć przez hamowanie transkrypcji i/lub translacji genu docelowego metodą taką jak technika antysensownego RNA/DNA [Bioscience and Industry, 50, 322 (1992); Chemistry, 46, 681 (1991); Biotechnology, 9, 358 (1992); Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992); Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992); Cell Engineering, 16, 1463 (1997)], metodą potrójnej helisy [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)] itp. stosując gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy i/lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo, jako gen docelowy.
Przykłady enzymów związanych z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy obejmują GMD, Fx, GFPP, fukokinazę i podobne. Przykłady enzymów związanych z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo obejmują a-1,6-fukozylotransferazę, a-L-fukozydazę i podobne.
(5) Metoda selekcjonowania linii komórkowej odpornej na lektynę, która rozpoznaje strukturę łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo.
Komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku można wytworzyć stosując metodę selekcji linii komórkowej odpornej na lektynę, która rozpoznaje strukturę łańcucha cukrowego, w którym pozyPL 218 428 B1 cja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo.
Przykłady metody selekcjonowania linii komórkowej odpornej na lektynę, która rozpoznaje strukturę łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo obejmują metody z zastosowaniem lektyny opisane w Somatic Cell Mol. Genet., 12, 51 (1986) itp. Jako lektynę można zastosować dowolną lektynę, o ile rozpoznaje łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo. Przykłady obejmują lektynę z Lens culinaris LCA (aglutynina pochodząca z soczewicy Lens culinaris), lektynę z grochu PSA (lektyna z grochu Pisum sativum), VFA z bobu (aglutynina pochodząca z Vicia faba), lektynę AAL z Aleuria aurantia (lektyna pochodząca z Aleuria aurantia) i tym podobne.
Konkretnie, linia komórkowa według niniejszego wynalazku odporna na działanie lektyny, która rozpoznaje łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo może być wyselekcjonowana przez hodowanie komórek przez 1 dzień do 2 tygodni, korzystnie od 1 dnia do 1 tygodnia, z zastosowaniem pożywki zawierającej lektynę w stężeniu od 1 μg/ml do 1 mg/ml, hodowanie komórek, które przeżyły komórek lub wybranie kolonii i przeniesienie jej do pojemnika do hodowli, a następnie kontynuację hodowli na pożywce zawierającej lektynę. Przykłady linii komórkowej otrzymanej tą metodą obejmują CHO/CCR4-LCA Nega-13 (FERM BP-7756) otrzymaną w przykładzie 14(2), który będzie opisany poniżej.
2. Komórkę według wynalazku można też zastosować do wytwarzania transgenicznych zwierząt niebędących ludźmi lub roślinnych komórek lub ich potomstwa
Transgeniczne zwierzę, nie będące człowiekiem lub roślinę lub ich potomstwo, w których gen genomowy jest zmodyfikowany w taki sposób, że aktywność enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego cząsteczki przeciwciała może być kontrolowana, i mogą być wytworzone metodą podobną do tej opisanej w punkcie 1, przy zastosowaniu genu kodującego enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo jako cel.
W transgenicznym zwierzęciu, innym niż człowiek, zarodkowe komórki macierzyste, w których kontrolowana jest aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, jest kontrolowana mogą być wytworzone z zastosowaniem metody podobnej do tej opisanej w punkcie 1 na zarodkowej komórce macierzystej zwierzęcia, innego niż człowiek, takiego jak bydło, owca, koza, świnia, koń, mysz, szczur, ptactwo domowe, małpa, królik lub podobne.
Konkretnie, wytwarza się zmutowany klon, w którym gen kodujący enzym związany z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo, jest inaktywowany lub podstawiony dowolną sekwencją, znaną techniką rekombinacji homologicznej [np. Nature, 326, 6110, 295 (1987); Cell, 51, 3, 503 (1987); itp.]. Stosując wytworzony zmutowany klon, można wytworzyć osobnika chimerowego obejmującego klon zarodkowej komórki macierzystej i normalnej komórki metodą iniekcji chimery do blastocysty zapłodnionego jaja zwierzęcego, lub przez metodę chimery agregacyjnej. Osobnik chimeryczny jest skrzyżowany z osobnikiem normalnym, tak że można otrzymać transgeniczne zwierzę, inne niż człowiek, u którego aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo jest zmniejszona lub zniesiona w komórkach całego organizmu.
Również, można wytworzyć zapłodnione jajo, w którym aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglu26
PL 218 428 B1 kozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo jest zmniejszona lub zniesiona, przez zastosowanie metody podobnej do opisanej w punkcie 1 do zapłodnionego jaja zwierzęcia nie będącego człowiekiem, takiego jak bydło, owca, koza, świnia, koń, mysz, szczur, ptactwo domowe, małpa, królik lub podobne.
Transgeniczne zwierzę, nie będące człowiekiem, u którego aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo jest zmniejszona lub zniesiona, można wytworzyć przez przeszczep wytworzonej zapłodnionej komórki jajowej do jajowodu lub macicy pseudociężarnej samicy stosując metodę transplantacji zarodków opisaną w Manipulating Mouse Embryo, Second Edition, itp., po czym następuje poród danego zwierzęcia.
Można wytworzyć transgeniczną roślinę przez wytworzenie kalusa, w którym aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo jest zmniejszona lub zniesiona stosując metodę podobną do tej opisanej w punkcie 1 do kalusa lub komórki danej rośliny.
Transgeniczną roślinę, w której aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydu cukrowego, GDP-fukozy, lub enzymu związanego z modyfikacją łańcucha cukrowego, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie a w złożonym łańcuchu cukrowym połączonym N-glikozydowo jest zmniejszona można wytworzyć przez hodowlę wytworzonego kalusa z zastosowaniem pożywki zawierającej auksynę i cytokininę do ponownego zróżnicowania zgodnie ze znaną metodą [Tissue Culture, 20 (1994); Tissue Culture, 21, (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)].
3. Sposób wytwarzania przeciwciała
Przeciwciało można otrzymać przez ekspresję w komórkach gospodarza stosując metody opisane w Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (odtąd zwane „Antibodies”); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Third Edition, Acad. Press, 1993; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, na przykład, jak poniżej.
Wytwarza się cDNA pełnej długości kodujący cząsteczkę przeciwciała, oraz fragment DNA odpowiedniej długości składający się z grupy prostetycznej kodującej cząsteczkę przeciwciała.
Wytwarza się wektor rekombinacyjny przez wprowadzenie fragmentu DNA lub pełnej długości cDNA poniżej promotora odpowiedniego wektora ekspresyjnego.
Transformanta, który produkuje cząsteczkę przeciwciała można wytworzyć przez wprowadzenie wektora rekombinacyjnego do komórki gospodarza odpowiedniej dla wektora ekspresyjnego.
Jako komórkę gospodarza można zastosować każdą komórkę, taką jak drożdżowa, zwierzęca, owadzia lub roślinna lub podobna, o ile, może w niej zachodzić ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Jako komórkę gospodarza można także zastosować komórkę drożdżową, zwierzęcą, owadzią lub roślinną lub podobną, do której metodą inżynierii genetycznej wprowadzono enzym związany z modyfikacją łańcucha cukrowego połączonego N-glikozydowo, który wiąże się z regionem Fc cząsteczki przeciwciała.
Jako wektor ekspresyjny stosowany jest wektor, który replikuje się samoistnie w komórce gospodarza, lub który może być zintegrowany z chromosomem i obejmuje promotor w takiej pozycji, żeby wytworzony DNA kodujący cząsteczkę przeciwciała może być przeniesiony.
cDNA może być wytworzony z ludzkiej lub nieludzkiej tkanki lub komórki, przy zastosowaniu np. startera specyficznego dla cząsteczki przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania, zgodnie z metodami wytwarzania DNA opisanymi w punkcie 1(1) (a).
Gdy jako komórka gospodarza stosowane są drożdże przykładami wektorów ekspresyjnych są YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) i podobne.
Można zastosować każdy promotor, o ile może on funkcjonować w drożdżach. Przykłady obejmują promotor genu szlaku glikolitycznego, takiego jak gen kinazy heksozowej, itp., promotor PH05, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH, promotor gal 1, promotor gal 10, promotor białka szoku cieplnego, promotor MFa1, promotor CUP1 i podobne.
PL 218 428 B1
Przykłady komórek gospodarza obejmują mikroorganizmy należące do rodzaju Saccharomyces, do rodzaju Schizosaccharomyces, do rodzaju Kluyveromyces, do rodzaju Trichosporon, do rodzaju Schwanniomyces, i podobnych, np. Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces pombe, Kluyveromyces Iactis, Trichosporon pullulans i Schwanniomyces alluvius etc.
Jako metoda wprowadzenia wektora rekombinacyjnego może być zastosowana każda metoda, o ile może ona wprowadzić DNA do drożdży. Przykłady obejmują elektroporację [Methods in Enzymology, 194, 182 (1990)], metodę sferoplastyzacji [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], metodę z zastosowaniem octanu litu [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] i metodę opisaną w [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)] i podobne.
Gdy jako gospodarz stosowana jest komórka zwierzęca, przykłady wektorów ekspresyjnych obejmują pcDNAI, pcDM8 (dostępne od firmy Funakoshi), pAGE107 [Opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie patentowe nr 22979/91; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie patentowe nr 227075/90), pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)], pcDNA1/Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210 itp.
Można zastosować każdy promotor ny, o ile może on funkcjonować w komórce zwierzęcej. Przykłady obejmują promotor genu IE (natychmiastowy wczesny) z cytomegalowirusa (CMV), wczesny promotor SV40, promotor retrowirusa, promotor metalotioneiny, promotor białka szoku cieplnego, promotor SRa itp. Ponadto razem z promotorem może być zastosowany wzmacniacz genu IE ludzkiego CMV.
Przykłady komórki gospodarza obejmują ludzką komórkę, taką jak komórka Namalwa, małpią komórkę jak COS, komórkę chomika chińskiego, taką jak komórka CHO lub HBT5637 (Opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie patentowe nr 299/88), komórkę szczurzego szpiczaka, komórkę mysiego szpiczaka, komórkę pochodzącą z nerki chomika syryjskiego, zarodkową komórkę macierzystą, zapłodnioną komórkę jajową i podobne.
Jako metoda wprowadzenia wektora rekombinacyjnego może być stosowana każda metoda, o ile może ona wprowadzić DNA do komórki zwierzęcej. Przykłady obejmują elektroporację [ Cytotechnology, 3, 133 (1990)], metodę z fosforanem wapnia (Opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie patentowe nr 227075/90), metodę lipofekcji, [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], metodę iniekcji [Manipulating the Mouse Embryo], metodę strzelby genowej (Opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie patentowe nr 2606856, japoński patent nr 2517813), metodę DEAE-dekstran [Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression Analysis (Yodo-sha), pod redakcją Takashi Yokota i Kenichi Aral (1994), metodę wektora wirusowego [Manipulating the Mouse Embryo) i podobne.
Gdy jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę owadzią można doprowadzić do wyrażania białka metodą opisaną w Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman i Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988) lub podobnymi.
Mianowicie można doprowadzić do wyrażania białka przez równoczesne wprowadzenie do komórki owadziej wektora zawierającego zrekombinowany gen i bakulowirusa, aby uzyskać zrekombinowanego wirusa w supernatancie hodowli komórek owadzich, a następnie przez zainfekowanie komórki owadziej zrekombinowanym wirusem.
Przykłady wektora wprowadzającego gen wykorzystanego w metodzie obejmują pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (wszystkie Invitrogen) itp.
Przykłady bakulowirusów obejmują wirus poliedrozy jądrowej () Autographa californica, którym infekuje się owada z rodziny Barathra.
Przykłady komórek owadzich obejmują oocyty Sf9 i Sf21 Spodoptera frugiperda [Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992)], oocyt High 5 Trichoplusia ni (Invitrogen) itp.
Przykłady metody do równoczesnego wprowadzania wektora wprowadzającego zrekombinowany gen i bakulowirusa w celu wytworzenia zrekombinowanego wirusa obejmują metodę z fosforanem wapnia (Opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie patentowe nr 227075/90) metodę lipofekcji [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] i podobne.
Gdy jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę roślinną, przykłady wektorów ekspresyjnych obejmują plazmidy Ti, wirusa mozaiki tytoniu, i podobne.
Jako promotor można zastosować dowolny promotor, o ile może on funkcjonować w komórce roślinnej. Przykłady obejmują promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), promotor ryżowej aktyny 1, itp.
PL 218 428 B1
Przykłady komórki gospodarza obejmują roślinne komórki tytoniu, ziemniaka, pomidora, marchwi, soi, rzepaku, lucerny, ryżu, pszenicy, jęczmienia itp.
Jako metodę wprowadzania zrekombinowanego wektora można zastosować dowolną metodę, o ile może ona wprowadzić DNA do komórki roślinnej. Przykłady obejmują metodę z zastosowaniem Agrobacterium (opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie nr 140885/84, opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie patentowe nr 70080/85, WO 94/94/00977), elektroporację (opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie nr 251887/85), metodę strzelby genowej (opublikowane i przebadane japońskie zgłoszenie nr 2606856, japoński patent No. 2517813) itp.
Metody do ekspresji genu, produkcji wydzielniczej, wyrażania białka fuzyjnego regionu Fc z innym białkiem itp. mogą być przeprowadzone zgodnie z metodą opisaną w Molecular Cloning, Second Edition itp., w dodatku do ekspresji bezpośredniej.
Podczas ekspresji genu w komórce bakteryjnej, drożdżowej, zwierzęcej, owadziej lub roślinnej, do której został wprowadzony gen związany z syntezą łańcucha cukrowego, można uzyskać cząsteczkę przeciwciała, do której dodany jest cukier lub łańcuch cukrowy przez wprowadzony gen.
Można uzyskać przeciwciało przez hodowlę otrzymanego transformanta w pożywce do wytwarzania i nagromadzenia cząsteczki przeciwciała w hodowli, a następnie odzyskiwania jej z uzyskanej hodowli. Metodę hodowli transformanta z zastosowaniem pożywki można przeprowadzić zgodnie z ogólną metodą hodowli komórek gospodarza.
Jako pożywkę do hodowli transformantów uzyskanych z zastosowaniem prokarionta, takiego jak Escherichia coli itp. lub eukarionta, takiego jak drożdże jako komórki gospodarza, można zastosować pożywkę naturalną lub syntetyczną, o ile obejmuje ona takie składniki jak źródło węgla, źródło azotu, sól nieorganiczną i podobne itp., które mogą być przyswajane przez organizm, a hodowanie transformanta można przeprowadzić skutecznie.
Jako źródło węgla mogą być stosowane te, które mogą być przyswajane przez organizm. Przykłady obejmują węglowodany, takie jak glukoza, fruktoza, sacharoza, zawierające je melasy, skrobia, hydrolizat skrobi, etc.; kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, kwas propionowy, etc.; alkohole, takie jak etanol, propanol, etc.; itp.
Przykładami źródła azotu są amoniak, sole amonowe kwasów nieorganicznych lub organicznych, takie jak chlorek amonu, siarczan amonu, octan amonu, fosforan amonu, itp.; inne związki zawierające azot; pepton; ekstrakt mięsny; ekstrakt drożdżowy; namok kukurydziany; hydrolizat kazeiny; mączka sojowa; hydrolizat mączki sojowej; różne sfermentowane komórki i ich hydrolizaty sojowe; itp.
Przykładami substancji nieorganicznej są dizasadowy fosforan potasu, fosforan dipotasu, fosforan magnezu, siarczan magnezu, chlorek sodu, siarczan żelazawy, siarczan magnezu, siarczan miedzi, węglan wapnia, itp.
Hodowlę przeprowadza się na ogół w warunkach tlenowych, np. jako hodowlę wstrząsaną, zanurzeniową hodowlę z mieszaniem i przewietrzanie, lub podobne. Temperatura hodowli korzystnie wynosi 15 do 40°C, a czas hodowania wynosi zazwyczaj 16 godzin do 7 dni.
Podczas hodowania pH jest utrzymywane na poziomie od 3,0 do 9,0. pH jest regulowane przez dodawanie organicznego lub nieorganicznego kwasu, roztworu zasady, mocznika, węglanu wapnia, amoniaku lub tym podobnych.
W miarę potrzeby, do pożywki podczas hodowania mogą być dodane antybiotyki, takie jak ampicylina, tetracyklina lub tym podobne.
Gdy hoduje się mikroorganizm transformowany rekombinowanym wektorem z otrzymanym z zastosowaniem indukowanego promotora, w razie potrzeby do pożywki może być dodany induktor. Na przykład, gdy jest hodowany mikroorganizm transformowany wektorem rekombinowanym otrzymanym z zastosowaniem promotora lac, do pożywki można dodać izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd, natomiast gdy hodowany jest mikroorganizm, transformowany rekombinowanym wektorem otrzymanym z użyciem promotora trp do pożywki można dodać kwas indoloakrylowy.
Gdy hoduje się transformant otrzymany z zastosowaniem komórek zwierzęcych jest hodowany, przykłady pożywki obejmują na ogół pożywkę RPMI 1640 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], pożywkę Eagle's MEM [Science, 122, 501 (1952)], pożywkę Dulbecco modyfikowaną MEM [Virology, 8, 396 (1959)], pożywkę 199 [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] i pożywkę Whittena [Developmental Engineering Experimentation ManualPreparation of Transgenic Mice, (KOdan-sha), pod redakcją M. Katshuki (1987)], pożywki do których często dodawana jest surowica cielęca, itp.
PL 218 428 B1
Hodowanie przeprowadza się zwykle w pH od 6 do 8 i w 30 do 40°C przez 1 do 7 dni w obecności 5% CO2. W miarę potrzeby do pożywki dodawane mogą być antybiotyki, takie jak kanamycyna, penicylina lub tym podobne.
Przykłady pożywki do hodowli transformantów otrzymanych z komórek owadzich obejmują pożywkę TNM-FH (firmy Pharmingen), pożywkę Sf-900 II SFM (firmy Life Technologies), pożywki ExCell 400 i ExCcell 405 (obydwie firmy JRH Biosciences), pożywkę Grace'a Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)] itp.
Hodowlę przeprowadza się w pH od 6 do 7 i w 25 do 30°C przez 1 do 5 dni.
Dodatkowo, w miarę potrzeby do pożywki podczas hodowli dodawane mogą być antybiotyki, takie jak gentamycyna.
Transformant otrzymany z użyciem komórki roślinnej jako komórki gospodarza, może być hodowany jako komórka lub przez zróżnicowanie do komórki roślinnej lub organu. Przykłady pożywki do hodowli transformantów obejmują zazwyczaj stosowaną pożywkę Murashige i Skoog (MS) i pożywkę Whitea, pożywki, do których dodawany jest hormon roślinny taki jak auksyna, cytokinina, itp.
Hodowlę przeprowadza się zazwyczaj przy pH 5 do 9 i w 20 do 40°C przez 3 do 60 dni.
Dodatkowo, w miarę potrzeby, do pożywki mogą być dodawane antybiotyki, takie jak kanamycyna, higromycyna, itp.
Zatem, k przeciwciało może być wytwarzane przez hodowlę transformanta pochodzącego z mikroorganizmu, komórki zwierzęcej lub roślinnej, która obejmuje zrekombinowany wektor, do którego wprowadzono DNA kodujący cząsteczkę przeciwciała, zgodnie ze zwykłą metodą hodowli, aby wytworzyć i nagromadzić przeciwciało, a następnie przez odzyskanie przeciwciała z hodowli.
Ekspresję genu, produkcję wydzielniczą, wyrażanie białka fuzyjnego i temu podobne można przeprowadzić zgodnie z metodą opisaną w Molecular Cloning, Second Edition itp., w dodatku do ekspresji bezpośredniej.
Przykłady sposobu wytwarzania przeciwciała obejmują sposób wewnątrzkomórkowej ekspresji w komórce gospodarza, sposób zewnątrzkomórkowego wydzielania z komórki gospodarza, oraz sposób wytwarzania na zewnętrznej otoczce błony komórkowej gospodarza. Sposób można wybrać przez zmianę stosowanej komórki gospodarza, lub struktury kompozycji wytwarzanego przeciwciała.
Gdy wytwarzane jest przeciwciało według niniejszego wynalazku w komórce gospodarza lub na zewnętrznej otoczce błony komórkowej gospodarza, może ono być wydzielane zewnątrzkomórkowo zgodnie z metodą Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], metodą Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], metodami opisanymi w japońskim badanym opublikowanym zgłoszeniu patentowym nr 336963/93 i japońskim badanym opublikowanym zgłoszeniu patentowym nr 823021/90.
Mianowicie, żądana cząsteczka przeciwciała może być efektywnie wydzielana zewnątrzkomórkowo z komórki gospodarza, gdy do wektora ekspresyjnego wprowadzi się DNA kodujący cząsteczkę przeciwciała i DNA kodującego peptyd sygnałowy odpowiedni dla ekspresji cząsteczki przeciwciała przez zastosowanie technik rekombinacji genetycznej, a następnie wprowadzi się wektor do komórki gospodarza, gdzie w wyniku ekspresji wytworzy się cząsteczka przeciwciała.
Poziom produkcji przeciwciała można zwiększyć zgodnie z metodą opisaną w japońskim badanym opublikowanym zgłoszeniu patentowym nr 227075/90 stosując system amplifikacji genu z genem reduktazy dihydrofolianowej.
Ponadto, przeciwciało może być wytwarzane przez wykorzystanie genu zwierzęcia z wprowadzonym genem (transgeniczne zwierzę nie będące człowiekiem) lub rośliny (transgeniczną roślinę), które są skonstruowane przez redyferencjację komórki zwierzęcej lub roślinnej, do której gen został wprowadzony.
Gdy transformant jest osobnikiem zwierzęcym lub rośliną, przeciwciało może być wytwarzane zgodnie z ogólną metodą przez hodowlę lub uprawę, i następnie odzyskanie nagromadzonego przeciwciała ze zwierzęcia lub rośliny.
W przypadku zwierzęcego osobnika, przeciwciało może być wytwarzane przez hodowanie transgenicznego zwierzęcia, do którego wprowadzono DNA kodujący cząsteczkę przeciwciała. Przykładami miejsca w zwierzęciu, w którym przeciwciało jest wytwarzane i kumulowane, jest mleko [japońskie opublikowane badane zgłoszenie patentowe nr 309192/88] i jaja zwierzęcia.
W tym przypadku jako promotor może być zastosowany dowolny promotor, o ile może on funkcjonować w zwierzęciu. Korzystne przykłady obejmują promotory specyficzne dla komórek gruczołów
PL 218 428 B1 mlecznych, takie jak promotor a kazeiny, promotor β kazeiny, promotor β laktoglobuliny, promotor kwaśnego białka serwatki, itp.
Przykładem procesu wytwarzania przeciwciała przez osobnika roślinnego jest metoda, w której przeciwciało jest produkowane przez uprawę transgenicznej rośliny, do której wprowadzono DNA kodujący cząsteczkę przeciwciała znaną metodą [Tissue Culture, 20 (1994); Tissue Culture, 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], nagromadzenie wytworzonego przeciwciała, a następnie odzyskania go z rośliny.
Odnośnie do oczyszczania przeciwciała wytworzonego przez transformanta, do którego został wprowadzony gen kodujący cząsteczkę przeciwciała, na przykład gdy przeciwciało jest wyrażane wewnątrzkomórkowo w stanie rozpuszczonym, po hodowaniu komórki są odzyskiwane przez wirowanie, zawieszane w buforze wodnym, a następnie są rozrywane przy użyciu oscylatora ultradźwiękowego, prasy francuskiej, homogenizatora Mantona Gaulina, młyna DYNOMILL lub im podobnych, w celu otrzymania ekstraktu wolnego od komórek. Oczyszczony produkt w postaci przeciwciała można uzyskać z supernatantu otrzymanego przez odwirowanie ekstraktu wolnego od komórek, przez zastosowanie ogólnych technik izolacji i oczyszczania enzymów takich jak ekstrakcja rozpuszczalnikiem; wysalanie; odsalanie siarczanem amonu, itp.; wytrącanie rozpuszczalnikiem organicznym; chromatografia anionowowymienna z zastosowaniem żywicy, takiej jak dietyloaminoetyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (firmy Mitsubishi Chemical) itp.; chromatografia kationowowymienna z zastosowaniem żywicy, takiej jak S-Sepharose FF (firmy Pharmacia) itp.; chromatografia hydrofobowa z zastosowaniem żywicy, takiej jak butyl-Sepharose, phenyl-Sepharose etc.; filtracja żelowa z sitem molekularnym; chromatografia powinowactwa; chromatoogniskowanie; elektroforeza taka jak ogniskowanie izoelektryczne, etc i podobne, które mogą być stosowane osobno lub w kombinacji.
Ponadto, gdy przeciwciało jest wyrażane wewnątrzkomórkowo przez utworzenie nierozpuszczalnej masy przeciwciała, komórki są odzyskiwane, rozrywane i wirowane w taki sam sposób, a nierozpuszczalną masę odzyskuje się jako frakcję wytrąconą. Odzyskiwaną nierozpuszczalną masę przeciwciała solubilizuje się z zastosowaniem środka do denaturacji białek. Przeciwciało jest przekształcone w normalną trójwymiarową strukturę przez rozcieńczenie lub dializę solubilizowanego roztworu, a następnie oczyszczony produkt w postaci przeciwciała otrzymuje się taką samą metodą izolacji i oczyszczania.
Gdy przeciwciało jest wydzielane zewnątrzkomórkowo, przeciwciało lub jego pochodne można odzyskiwać z supernatantu hodowli. Mianowicie hodowla jest traktowana techniką, taką jak wirowanie lub podobną, aby uzyskać rozpuszczalną frakcję, a następnie oczyszczony preparat przeciwciała otrzymuje się taką samą metodą izolacji i oczyszczania.
Przykłady tak otrzymanego przeciwciała obejmują przeciwciało, fragment przeciwciała, białko fuzyjne obejmujące region Fc przeciwciała i tym podobne.
Przykładem uzyskiwania przeciwciała jest sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała, szczegółowo opisany poniżej, ale inne kompozycje przeciwciała także mogą być uzyskane w sposób podobny do tej metody.
(1) Konstrukcja wektora do ekspresji humanizowanego przeciwciała
Wektor do ekspresji humanizowanego przeciwciała jest wektorem ekspresyjnym dla komórki zwierzęcej, do którego wprowadzono geny kodujące regiony C łańcucha ciężkiego (łańcuch H) i lekkiego (łańcuch L) ludzkiego przeciwciała, który może być skonstruowany przez sklonowanie każdego z genów kodujących regiony C łańcucha H i L regionów C ludzkiego przeciwciała do wektora ekspresyjnego dla komórki zwierzęcej.
Regiony C ludzkiego przeciwciała mogą być łańcuchami H i L dowolnego ludzkiego przeciwciała. Przykłady obejmują region C należący do podklasy IgG1 w łańcuchu H ludzkiego przeciwciała (dalej określany jako „hCy1”), region C należący do κ klasy w łańcuchu L ludzkiego przeciwciała (dalej określany jako „hCK”), itp.
Jako geny kodujące regiony C łańcucha H i L ludzkiego przeciwciała można zastosować chromosomalny DNA zawierający egzon i intron lub cDNA.
Jako wektor ekspresyjny może być zastosowany każdy wektor dla komórki zwierzęcej, jeżeli tylko gen kodujący region C ludzkiego przeciwciała może być do niego wprowadzony i w nim ulegać ekspresji. Przykłady obejmują pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)], pSG1 β d2-4 [Cytotechnology, 4, 173 (1990)], itp. Przykłady promotora i wzmacniacza w wektorze ekspresyjnym dla komórek zwierzęcych obejmują SV40 wczesny promotor i wzmacniacz [J. Biochem.,
PL 218 428 B1
101, 1307 (1987)], promotor LTR z mysiego wirusa białaczki Moloneya [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 149 (1987)], promotor łańcucha H immunoglobuliny [Cell, 41, 479 (1985)] i wzmacniacz [Cytotechnology, 33, 717 (1983)] itp.
Wektor ekspresyjny dla humanizowanego przeciwciała może być albo typu, w którym zarówno geny kodujące łańcuch H i łańcuch L są na osobnych wektorach, albo typu, w którym obydwa geny są na tym samym wektorze (typ tandemowy). Pod względem łatwości konstrukcji wektora ekspresyjnego dla humanizowanego przeciwciała, łatwości wprowadzenia go do komórek zwierzęcych, i równowagi stopnia ekspresji między łańcuchami L i H przeciwciała w komórkach zwierzęcych bardziej korzystny jest typ tandemowy wektora ekspresyjnego [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)].
Skonstruowany wektor ekspresyjny dla humanizowanego przeciwciała może być zastosowany do ekspresji ludzkiego przeciwciała chimerycznego lub przeciwciała z wszczepionym ludzkim CDR w komórkach zwierzęcych.
(2) Wytworzenie cDNA kodującego region V przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia nie będącego człowiekiem cDNA kodujący łańcuchy H i L regionów V przeciwciała pochodzące od zwierzęcia nie będącego człowiekiem, takiego, jak przeciwciała mysie można uzyskać w następujący sposób.
cDNA jest syntetyzowany przez ekstrakcję mRNA z komórki hybrydoma, która wytwarza przeciwciało mysie będące przedmiotem zainteresowania. Zsyntetyzowany cDNA jest wklonowany do wektora, takiego jak fag lub plazmid, w celu otrzymania biblioteki cDNA. Każdy rekombinowany fag lub rekombinowany plazmid obejmujący cDNA kodującego region V łańcucha H i rekombinowany fag lub rekombinowany plazmid obejmujący cDNA kodujący region V łańcucha L jest wyizolowywany z biblioteki przy użyciu części regionu C lub części regionu V istniejącego przeciwciała mysiego jako sondy. Określa się pełne sekwencje nukleotydowe regionów mysiego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania na rekombinowanym fagu lub rekombinowanym plazmidzie z sekwencji nukleotydowej wydedukowane są pełne sekwencje aminokwasowe regionów V łańcucha H i łańcucha L.
Jako zwierzę nie będące człowiekiem można wykorzystać każde zwierzę, takie jak mysz, szczur, chomik, królik itp., o ile można z nich wytworzyć hybrydoma. Przykłady metody wytwarzania całkowitego RNA z komórki hybrydoma obejmują metodę z trifIuorooctanem cezu i tiocyjanianem guanidyny [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)] itp., a przykłady metody wytwarzania mRNA z całkowitego RNA obejmują metodę kolumienkową z immobilizowanym oligo(dT) na celulozie (Molecular Cloning, Drugie wydanie) itp. Ponadto, przykładami zestawu do wytwarzania mRNA z komórki hybrydoma jest zestaw Fast Track mRNA Isolation Kit (firmy Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (firma Pharmacia) i podobne.
Przykłady metody syntetyzowania DNA i tworzenia biblioteki cDNA obejmują zwykle metody opisane w Molecular Cloning, Drugie Wydanie; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34; metody wykorzystujące komercyjnie dostępne zestawy, takie jak SuperScript™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (firmy GIBCO BRL), zestaw ZAP-cDNA Synthesis Kit (firma Stratagene) i podobne.
W wytwarzaniu biblioteki cDNA, wektorem, do którego ma być wprowadzony cDNA syntetyzowany z użyciem mRNA wyekstrahowanego z komórki hybrydoma jako matrycy, może być każdy wektor, o ile cDNA może być wprowadzony. Przykłady obejmują ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], XzapII (firma Stratagene), Xgt10 i Xgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], XBlueMid (firma Clontech), XExCell, pT7T318U (firma Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] i podobne.
Każda Escherischia coli, może być zastosowana jako Escherischia coli, do której wyprowadzana jest biblioteka cDNA skonstruowana na wektorze fagowym lub plazmidowym, o ile biblioteka cDNA może być wprowadzona, utrzymana i może ulegać ekspresji. Przykłady obejmują Escherischia coli XL1-Blue MRF', Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088 [Science, 222, 778 (1983)] i Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. BioI, 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]; JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] itp.
Jako metodę selekcjonowania klonu cDNA kodującego regiony V łańcucha H i łańcucha L przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia, innego niż człowiek, z biblioteki cDNA, można stosować hybrydyzację kolonii lub hybrydyzację łysinek z użyciem sondy znakowanej izotopowo lub fluorescencyjnie (Molecular Cloning, Second Edition). cDNA kodujący regiony V łańcuchów H i L może także być przygotowany przez wytworzenie starterów i przeprowadzenie reakcji łańcuchowej polimerazy (dalej zwa32
PL 218 428 B1 nej „PCR”; Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology, Suplement 1-34) stosując jako matrycę cDNA zsyntetyzowany z mRNA, lub biblioteki cDNA jako matrycy.
Sekwencje nukleotydowe cDNA można określić przez trawienie wybranych cDNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Wklonowanie fragmentów do plazmidu, takiego jak np. pBluescript SK(-) (firma Stratagene) lub podobnego, przeprowadzenie reakcji z reguły stosowanej jako metody do analizowania sekwencji nukleotydowej, takiej jak metoda dideoksy [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 5463 (1977)] opracowana przez Sanger et al., a następnie przeprowadzenie analizy klonów przy użycia automatycznego analizatora sekwencji nukleotydowej, takiego jak A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia) itp. To czy otrzymane cDNA kodują lub nie pełne sekwencje aminokwasowe regionów V łańcucha H i łańcucha L przeciwciała zawierającego wydzielniczą sekwencję sygnałową można potwierdzić przez wydedukowanie pełnej sekwencji aminokwasowej regionów V łańcucha H i łańcucha L z określonej sekwencji nukleotydowej i porównanie jej z pełną sekwencją aminokwasową regionów V łańcuchów H i L znanych przeciwciał [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)].
(3) Analiza sekwencji aminokwasowej regionu V przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek
W pewnych sekwencjach aminokwasowych regionów V łańcucha H i łańcucha L przeciwciała zawierającego wydzielniczą sekwencję sygnałową, długość wydzielniczej sekwencji sygnałowej i N-końcowej sekwencji aminokwasowej można wydedukować, a podgrupy do których należą można odnaleźć przez porównanie ich z pełnymi sekwencjami aminokwasowymi regionów V łańcuchów H i L znanych przeciwciał [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)]. Ponadto, sekwencje aminokwasowe regionów V łańcuchów H i L każdego CDR także można odnaleźć przez porównanie ich z sekwencjami aminokwasowymi regionów V łańcucha H i łańcucha L znanych przeciwciał [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)].
(4) Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla ludzkiego przeciwciała chimerycznego
Wektor ekspresyjny dla ludzkiego przeciwciała chimerycznego może być skonstruowany przez klonowanie cDNA kodujących regiony V łańcuchów H i L przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek w górę od regionu genów kodujących regiony C łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała w wektorze do ekspresji humanizowanego przeciwciała skonstruowanego jak w punkcie 3(1). Na przykład, wektor ekspresyjny dla ludzkiego chimerycznego przeciwciała można skonstruować przez połączenie każdego z cDNA kodujących regiony V łańcucha H i łańcucha L przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek z syntetycznym DNA obejmującym sekwencje nukleotydowe na końcach-3' regionów V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek i sekwencje nukleotydowe przy końcach-5' regionów C łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała i również mającymi sekwencję rozpoznawania przez odpowiedni enzym restrykcyjny na obydwu końcach, i przez wklonowanie ich w górę od genów kodujących regiony C łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała zawartych w wektorze skonstruowanym dla ekspresji przeciwciała humanizowanego opisanym w punkcie 3(1).
(5) Konstrukcja cDNA kodującego region V ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR cDNA kodujące regiony V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym
CDR można otrzymać w następujący sposób. Najpierw wybiera się sekwencje aminokwasowe zrębu (dalej określonego jako „FR”) regionów V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała dla przeszczepienia CDR z regionów V łańcucha H i łańcucha L przeciwciała pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek. Jako sekwencje aminokwasowe FR w regionach V łańcuchów H i L ludzkiego przeciwciała można stosować dowolne sekwencje aminokwasowe o ile pochodzą z ludzkiego przeciwciała. Przykłady obejmują sekwencje aminokwasowe FR z regionów V łańcuchów H i L ludzkich przeciwciał zarejestrowanych w bazach danych, takich jak Protein Data Bank, itp., sekwencje aminokwasowe wspólne w każdej podgrupie FR regionów V łańcucha H i łańcucha L ludzkich przeciwciał [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)] itp. W celu wytworzenia ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR o silnej aktywności korzystnie wybiera się sekwencję aminokwasową o możliwie wysokiej homologii (co najmniej 60% lub większej) z sekwencjami aminokwasowymi regionów V łańcucha H i łańcucha L przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek.
Następnie, sekwencje aminokwasowe CDR regionów V łańcucha H i łańcucha L przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania pochodzącego od zwierzęcia innego niż człowiek przeszczePL 218 428 B1 pia się na wybrane sekwencje aminokwasowe FR regionów V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała, aby skonstruować sekwencje aminokwasowe regionów V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR. Na podstawie tych sekwencji aminokwasowych ustala się sekwencje DNA, biorąc pod uwagę częstość występowania kodonów w sekwencjach n ukleotydowych genów przeciwciał [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)] i konstruuje się sekwencje DNA kodujące sekwencje aminokwasowe regionów V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR. W oparciu o skonstruowane sekwencje DNA syntetyzuje się kilka syntetycznych fragmentów DNA o długości około 100 zasad i przeprowadza się PCR stosując te fragmenty. W tym przypadku korzystnie dla każdego łańcucha H i L konstruuje się 6 syntetycznych DNA biorąc pod uwagę skuteczność reakcji PCR i długości DNA, które mogą być zsyntetyzowane.
Można je także łatwo wklonować do wektora skonstruowanego jak w punkcie 3(1) w celu ekspresji humanizowanego przeciwciała przez wprowadzenie sekwencji rozpoznawanych przez odpowiednie enzymy restrykcyjne do 5'-końców syntetycznego DNA obecnego na obu końcach. Po PCR amplifikowany produkt klonuje się do plazmidu, takiego jak pBluescript SK(-) (Stratagene) lub podobnego, a sekwencje nukleotydowe określa się metodą zgodnie z punktem 3(2) i w ten sposób otrzymuje się plazmid zawierający sekwencje DNA kodujące sekwencje aminokwasowe regionów V łańcucha H i łańcucha L żądanego ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR.
(6) Konstrukcja wektora do ekspresji ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR
Wektor ekspresyjny dla ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR można skonstruować przez wklonowanie cDNA kodujących regiony V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR skonstruowanego jak w punkcie 3(5), powyżej genu kodującego regiony C łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała w wektorze do ekspresji humanizowanego przeciwciała opisanego w punkcie 3(1). Na przykład, wektor ekspresyjny ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR można skonstruować przez wprowadzenie sekwencji rozpoznawanych przez odpowiednie enzymy restrykcyjne do końców-5' obu zakończeń fragmentu syntetycznego DNA, wybranego spośród syntetycznych fragmentów DNA, które są stosowane w PCR przeprowadzonej jak w punkcie 3(5) w celu skonstruowania regionów V łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR, tak że klonuje się je powyżej genów kodujących regiony C łańcucha H i łańcucha L ludzkiego przeciwciała w wektorze do ekspresji humanizowanego przeciwciała opisanego w punkcie 3(1) w taki sposób, że mogą być wyrażane w stabilnej formie.
(7) Stabilna produkcja humanizowanego przeciwciała
Transformant zdolny do stabilnej produkcji ludzkiego chimerowego przeciwciała i ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR (obydwa dalej są określane jako „humanizowane przeciwciało”) można wytworzyć przez wprowadzenie wektorów ekspresyjnych dla humanizowanego przeciwciała, opisanych w punktach 3(4) i (6) do odpowiedniej komórki zwierzęcej.
Przykładem metody wprowadzania wektora dla ekspresyjnego humanizowanego przeciwciała do komórki zwierzęcej jest elektroporacja [japońskie opublikowane i zbadane zgłoszenie patentowe nr 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] itp.
Jako komórkę zwierzęcą, do której wprowadza się wektor ekspresyjny dla humanizowanego przeciwciała, można stosować dowolną komórkę, o ile jest komórką zwierzęcą, która może produkować humanizowane przeciwciało.
Przykłady obejmują mysie komórki szpiczaka, takie jak komórki NSO i SP2/0, komórki jajnika chomika chińskiego, takie jak CHO/dhfr- i CHO/DG44, szczurze komórki szpiczaka, takie jak YB2/0 i IR983F, komórki BHK pochodzące z nerki chomika syryjskiego, ludzkie komórki szpiczaka, takie jak komórka Namalwa i podobne i komórki jajnika chomika chińskiego CHO/DG44; szczurze komórki szpiczaka YB2/0, a komórki gospodarza według niniejszego wynalazku opisane w punkcie 5 są szczególnie korzystne.
Po wprowadzeniu wektora ekspresyjnego dla humanizowanego przeciwciała można wybrać transformant zdolny do stabilnej produkcji humanizowanego przeciwciała stosując pożywkę do hodowli komórek zwierzęcych, zawierającą taki czynnik jak siarczan G418 (dalej określany jako „G418”; SIGMA) i podobne, zgodnie z metodą ujawnioną w japońskim opublikowanym i zbadanym zgłoszeniu patentowym nr 257891/90. Przykłady takich pożywek obejmują pożywkę RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical), pożywkę GIT (Nihon Pharmaceutical), pożywkę EX-CELL 302 (JRH), pożywkę IMDM (GIBCO BRL), pożywkę Hybridoma-SFM (GIBCO BRL), pożywkę uzyskaną przez wprowadzenie do tych pożywek różnych dodatków, takich jak płodowa surowica bydlęca (dalej określana jako „FBS”) i po34
PL 218 428 B1 dobne. Humanizowane przeciwciało można wytworzyć i zgromadzić w supernatancie z hodowli przez hodowanie otrzymanego transformanta w pożywce. Poziom ekspresji i aktywność wiązania antygenu humanizowanego przeciwciała w supernatancie z hodowli można zmierzyć taką metodą jak test immunosorpcyjny ze związanym enzymem (dalej określany jako „ELISA”; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Rozdział 14 (1998), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)] itp. Poziom ekspresji humanizowanego przeciwciała przez transformanta można również zwiększyć stosując system amplifikacji genu DHFR zgodnie z metodą ujawnioną w japońskim opublikowanym i zbadanym zgłoszeniu patentowym nr 257891/90.
Humanizowane przeciwciało można oczyścić z supernatantu z hodowli transformanta stosując kolumnę białkową A [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Rozdział 8 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)]. Ponadto, można także stosować metody oczyszczania zwykle stosowane do oczyszczania białek. Na przykład, można połączyć filtrację żelową, chromatografię jonowymienną i ultrafiltrację. Ciężar cząsteczkowy łańcucha H, łańcucha L lub całej cząsteczki oczyszczonego przeciwciała humanizowanego można zmierzyć np. przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym (dalej określaną jako „SDS-PAGE”; Nature, 227, 680 (1970)] metodą Western blotting Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Rozdział 14 (1998), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)] lub podobną.
Opisano zatem sposoby produkcji przeciwciała z użyciem komórki zwierzęcej jako gospodarza, ale jak opisano powyżej przeciwciało może być także produkowane przez komórkę drożdżową, komórkę owadzią, roślinną, przez zwierzę lub roślinę, tak samo jak przez komórkę zwierzęcą.
Gdy komórka gospodarza ma właściwą sobie zdolność wyrażania cząsteczki przeciwciała, przeciwciało według wynalazku można wytworzyć przez przygotowanie komórki wyrażającej cząsteczkę przeciwciała metodą opisaną w punkcie 1, hodowanie komórki, a następnie oczyszczenie przeciwciała z wytworzonej hodowli.
4. Ocena aktywności przeciwciała
Jako metodę pomiaru ilości oczyszczonego przeciwciała, aktywności wiązania i funkcji efektorowej oczyszczonego przeciwciała można stosować znaną metodę opisaną w Monoclonol Antibodies, Antibody Engineering i podobną.
Przykładowo, gdy przeciwciało jest humanizowanym przeciwciałem, aktywność wiązania z antygenem i aktywność wiązania z hodowaną dodatnią antygenowo linią komórkową, można mierzyć takimi metodami jak ELISA, metoda immunofIuorescencyjna [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)] i podobne. Aktywność cytotoksyczną wobec hodowanej dodatniej antygenowo linii komórkowej można ocenić przez pomiar aktywności CDC, aktywności ADCC [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)] i podobnych.
Także bezpieczeństwo i efekt terapeutyczny przeciwciała u człowieka można ocenić stosując odpowiedni model zwierzęcy stosunkowo bliski człowiekowi, taki jak Macaca fascicularis lub podobny.
5. Analiza łańcuchów cukrowych wiążących się z cząsteczkami przeciwciała wyrażanymi w różnych komórkach
Strukturę łańcuchów cukrowych wiążących się z cząsteczkami przeciwciała wyrażanymi w różnych komórkach można analizować zgodnie z ogólnymi zasadami analizy struktury łańcuchów cukrowych glikoprotein. Na przykład, łańcuch cukrowy, który jest związany z cząsteczką IgG, obejmuje obojętny cukier, taki jak galaktoza, mannoza, fukoza lub podobny, aminocukier, taki jak N-acetyloglukozamina lub podobny i cukier kwaśny, taki jak kwas sialowy lub podobny i może być analizowany metodą, taką jak analiza struktury łańcuchów cukrowych lub podobną, przez analizę składu cukrów, dwuwymiarowe mapowanie łańcuchów cukrowych lub podobne.
(1) Analiza składu obojętnych cukrów i aminocukrów
Skład łańcuchów cukrowych wiążących się z cząsteczką przeciwciała można analizować przez przeprowadzenie hydrolizy łańcuchów cukrowych kwasem, takim jak kwas trifI uorooctowy lub podobny, w celu uwolnienia obojętnego cukru lub aminocukru i zmierzenie jego udziału.
Przykładem jest metoda, w której stosuje się analizator składu cukru (BioLC) produkcji firmy Dionex. BioLC, jest to aparat, który analizuje skład cukru techniką HPAEC - PAD (wysokosprawna chromatografia anionowymienna - pulsacyjna amperometryczna detekcja) [J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1993)].
Udział cukru w łańcuchach można także analizować metodą znakowania fluorescencyjnego z użyciem 2-aminopirydyny. Konkretnie, udział kompozycji można obliczyć udział znaną metodą
PL 218 428 B1
[Agric. Biol. Chem., 55(1), 283-284 (1991)], przez znakowanie hydrolizowanej kwasem próbki znacznikiem fluorescencyjnym z 2-aminopirydylacją, a następnie analizowanie składu metodą HPLC.
(2) Analiza struktury łańcucha cukrowego
Strukturę łańcucha cukrowego wiążącego się z cząsteczką przeciwciała można analizować metodą dwuwymiarowego mapowania łańcuchów cukrowych [Anal. Biochem., 171, 73 (1988), Biochemical Experimentation Methods 23 - Methods for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Japan Scienties Societies Press) wydaną przez Reiko Takahashi (1989)]. Metoda dwuwymiarowego mapowania łańcucha cukrowego jest metodą dedukcji struktury łańcuchów cukrowych przez np. wykreślenie na osi X czasu retencji lub pozycji elucji łańcucha cukrowego oznaczonych przez chromatografię z odwróconymi fazami, a na osi Y czasu retencji lub pozycji elucji łańcucha cukrowego oznaczonych przez chromatografię z normalnymi fazami, odpowiednio, i porównanie ich z takimi wynikami dla znanych łańcuchów cukrowych.
Konkretnie, łańcuchy cukrowe są uwalniane z przeciwciała przez poddanie go hydrazynolizie, a uwolniony łańcuch cukrowy poddaje się fluorescencyjnemu znakowaniu za pomocą 2-aminopirydyny (dalej określonej jako „PA”) [J. Biochem., 95, 197 (1984)], po czym łańcuchy cukrowe oddziela się od nadmiaru reagenta traktującego-PA przez filtrację żelową i poddaje chromatografii z odwróconymi fazami. Następnie, każdy pik wydzielanych łańcuchów cukrowych poddaje się chromatografii z normalnymi fazami. Strukturę łańcucha cukrowego można wydedukować przez wykreślenie wyników na dwuwymiarowej mapie łańcucha cukrowego i porównanie ich z plamkami wzorca łańcuchów cukrowych (Takara Shuzo) lub z literaturą [Anal. Biochem. 171,73 (1988)].
Strukturę wydedukowaną metodą dwuwymiarowego mapowania łańcucha cukrowego można potwierdzić przez przeprowadzenie spektrometrii mas, takiej jak MALDI-TOF-MS każdego łańcucha cukrowego lub podobną:
6. Metoda immunologicznego oznaczenia różnicowania struktury łańcucha cukrowego w cząsteczce przeciwciała
Cząsteczka przeciwciała zawiera łańcuchy cukrowe związane z regionem Fc przeciwciała, które mają różne struktury. Przeciwciało, w którym ilość łańcuchów cukrowych, w których fukoza nie jest związana z W-acetyloglukozaminą w redukującym końcu wynosi 20% lub więcej całkowitej ilości złożonych łańcuchów cukrowych związanych W-glikozydowo, wiążących się do regionu Fc w redukującym końcu, ma silną aktywność ADCC. Przeciwciało można zidentyfikować stosując metodę analizy struktury łańcuchów cukrowych w cząsteczce przeciwciała opisaną w punkcie 6. Można ją także zidentyfikować metodą oznaczania immunologicznego stosując lektynę, zgodnie ze znaną metodą oznaczania immunologicznego, taką jak barwienie Westerna, IRA (test radioimmunologiczny), VIA (test wiroimmunologiczny), EIA (test enzymoimmunologiczny), FIA (test fIuoroimmunologiczny), MIA (test metaloimmunologiczny) i podobne opisane w Monoclonal Antibodies; Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc. (1995); Immunoassay, 3 wyd., Igakushoin (1987); Enzyme Antibody Method, Revised Edition, Gakusai Kikaku (1985); itp.
Lektynę, która rozpoznaje strukturę łańcucha cukrowego w cząsteczce przeciwciała, poddaje się znakowaniu, a poddaje się reakcji z przeciwciałem, które stanowi próbkę. Następnie mierzy się ilość kompleksu znakowanej lektyny z cząsteczką przeciwciała.
Przykłady lektyny stosowanej do identyfikacji struktury łańcucha cukrowego w cząsteczce przeciwciała obejmują WGA (aglutynina zarodków pszenicy pochodząca z T. vulgaris), ConA (kokanawalina pochodząca z C. ensiformis), RIC (toksyna pochodząca z R. communmis), L-PHA (leukoaglutynina pochodząca z P. vulgaris), LCA (aglutynina soczewicy pochodząca z L. culinaris), PSA (lektyna groszku pochodząca z P. sativum), AAL (lektyna z Aleuria aurantia), ACL (lektyna z Amaranthus caudatus), BPL (lektyna z Bauhinia purpurea), DSL lektyna z Datura stramonium), DBA (aglutynina z Dolichos biflorus), EBL (lektyna z bzu aptekarskiego), ECL (lektyna z Erythrina cristagalli), EEL (lektyna z Euonymus eoropaeus), GNL (lektyna z Galanthus nivalis), GSL (lektyna z Griffonia simplicifolia), aglutynina z (Helix pomatia), HHL (hybrydowa lektyna z Hippeastrum), Jacalin, LTL (lektyna z Lotus tetragonolohus), LEL (lektyna z Lycopersicon eseulentum), MAL (lektyna z Maackia amurensis), MPL (lektyna z Maclura pomifera), NPL (lektyna z Warcissus pseudonarcissus), PNA (aglutynina z orzeszków ziemnych, E-PHA (erytroaglutynina z Phaseolus vulgaris), PTL (lektyna z Psophocarpus tetragonolohus), RCA (aglutynina z Ricinus communis), STL (lektyna z Solanum tuberosum), SJA (aglutynina z Sophora japonica), SBA (aglutynina z soi), UEA (aglutynina z Ulex europaeus), VVL (lektyna z Vicia villosa) i WFA (aglutynina z Wisteria floribunda).
PL 218 428 B1
Korzystnie stosuje się lektynę, która specyficznie rozpoznaje strukturę łańcucha cukrowego, w którym fukoza wiąże się z N-acetyloglukozaminą w redukującym końcu w złożonym łańcuchu cukrowym, związanym N-glikozydowo. Przykłady obejmują lektynę LCA z Lens culinaris (aglutyninę soczewicy pochodząca z Lens culinaris), lektynę PSA z groszku (lektyna z groszku pochodząca z Pisum sativum), lektynę FA z bobu (aglutynina pochodząca z Vicia faba) i lektynę AAL z Aleuria aurantia.
7. Zastosowanie cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku
Przeciwciało według niniejszego wynalazku ma silną komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciał. Przeciwciało mające silną komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciała jest użyteczne w zapobieganiu i leczeniu rozlicznych chorób obejmujących raki, choroby zapalne, choroby immunologiczne takie jak choroby autoimmunologiczne, alergie i podobne, choroby narządów krążenia oraz infekcje wirusowe i bakteryjne.
W przypadku raka, mianowicie nowotworów złośliwych, komórki rakowe wzrastają. Powszechne czynniki przeciwnowotworowe hamują wzrost komórek rakowych. Natomiast, przeciwciało mające silną komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciała może leczyć przez uszkadzanie komórek rakowych, dzięki jego zdolności zabijania komórki, i dlatego jest bardziej skuteczne jako środek terapeutyczny niż inne powszechne środki przeciwnowotworowe. Obecnie, w środku leczniczym na raka, efekt przeciwnowotworowy leku zawierającego tylko przeciwciało jest niewystarczający, dlatego też prowadzi się terapię skojarzoną z chemioterapią [Science, 280, 1197 (1998)]. Jeżeli stwierdzi się skuteczne działanie przeciwnowotworowe przeciwciała według niniejszego wynalazku, zależność od chemioterapii będzie mniejsza i zmniejszone będą skutki uboczne.
W chorobach immunologicznych, takich jak choroby zapalne, choroby autoimmunologiczne, alergie i tym podobne reakcje in vivo są wywoływane przez uwolnienie przez immunocyty cząsteczek mediatora, w ten sposób, iż reakcja alergiczna może być zahamowana na drodze eliminacji immunocytów przy wykorzystaniu przeciwciała mającego silną komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciała.
Przykłady chorób narządów krążenia obejmują stwardnienie tętnic i tym podobne. Stwardnienie tętnic jest obecnie leczone zakładaniem cewników balonowych, ale można zapobiegać chorobom układu krążenia i je leczyć przez zahamowanie wzrostu komórek tętniczych w przewężeniach po leczeniu z zastosowaniem przeciwciała mającego silną komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciał.
Można zapobiegać i leczyć liczne choroby obejmujące infekcje wirusowe i bakteryjne przez zahamowanie proliferacji zakażonych wirusem bądź bakterią komórek z wykorzystaniem przeciwciała mającego silną komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciała.
Przykłady przeciwciała, które rozpoznaje związany z nowotworem antygen, przeciwciała, które rozpoznaje związany z alergią bądź stanem zapalnym antygen, przeciwciała, które rozpoznaje antygeny związane z chorobami układu krążenia i przeciwciała, które rozpoznaje antygen związany z infekcjami wirusowymi lub bakteryjnymi, opisano poniżej.
Przykłady przeciwciała, które rozpoznaje antygeny związane z nowotworem obejmują przeciwciało przeciwko GD2 (Ohta i wsp., Anticancer Res., 13, 331-336, 1993), przeciwciało przeciwko GD3 (Ohta i wsp., Cancer Immunol. Immunother., 36, 260-266, 1993), przeciwciało przeciwko GM2 (Nakamura i wsp., Cancer Res., 54, 1511-1516, 1994), przeciwciało przeciwko HER2 (Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992), przeciwciało przeciwko CD52 (Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992), przeciwciało przeciwko MAGE (Jungbluth i wsp., British J. Cancer, 88, 2909-2911, 2000), przeciwciało przeciwko HM1.24 (Ono i wsp., Molecular Immunol., 36, 387-395, 1999), przeciwciało przeciwko białku podobnemu do parathormonu (PTHrP) (Ogata i wsp., Cancer, 88, 2909-2911, 2000), przeciwciało przeciwko zasadowemu czynnikowi wzrostu fibroblastów i przeciwciało przeciwko FGF8 (Matsuzaki i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989), przeciwciało przeciwko receptorowi zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów i przeciwciało przeciwko receptorowi FGF (Kuo i wsp., J. Biol. Chem., 265, 16455-16463, 1990), przeciwciało przeciwko insulinopodobnemu czynnikowi wzrostu (Yao i wsp., J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995), przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu (Yao i wsp., J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995), przeciwciało przeciwko PMSA (Murphy i wsp., J. Urology, 160, 2396-2401, 1998), przeciwciało przeciwko czynnikowi wzrostu komórek nabłonka naczyń (Presta i wsp., Cancer Res., 57, 4593-4599, 1997), przeciwciało przeciwko receptorowi czynnika wzrostu komórek nabłonka naczyń (Kanno i wsp., Oncogene, 19, 2138-2146, 200) i tym podobne.
PL 218 428 B1
Przykłady przeciwciał, które rozpoznają antygeny związane z alergią bądź stanem zapalnym obejmują przeciwciało przeciwko interleukinie 6 (Abrams i wsp., Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 6 (Sato i wsp., Molecular Immunol., 31, 371-381, 1994), przeciwciało przeciwko interleukinie 5 (Abrams i wsp., Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 5 i przeciwciało przeciwko interleukinie 4 (Biord i wsp., Cytokine, 3, 562-567, 1991), przeciwciało przeciwko czynnikowi martwicy nowotworu (Tempest i wsp., Hybridoma, 13, 183-190, 1994), przeciwciało przeciwko receptorowi czynnika martwicy nowotworu (Amrani i wsp., Molecular Pharmacol., 58, 237-245, 2000), przeciwciało przeciwko CCR4 (Campbell i wsp., Nature, 400, 776-780, 1999), przeciwciało przeciwko chemokinie (Peri i wsp., J. Immuno. Meth., 174, 249-257, 1994), przeciwciało przeciwko receptorowi chemokiny (Wu i wsp., J. Exp. Med., 186, 1373-1381, 1997) i tym podobne. Przykłady przeciwciał, które rozpoznają antygeny związane z chorobami układu krążenia obejmują przeciwciało przeciwko GpIIb/IIIa (Co i wsp., J. Immunol., 152, 29682976, 1994), przeciwciało przeciwko płytkopochodnemu czynnikowi wzrostu (Ferns i wsp., Science, 253, 1129-1132, 1991), przeciwciało przeciwko receptorowi płytkopochodnego czynnika wzrostu (Shulman i wsp., J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 1997) i przeciwciało przeciwko czynnikowi krzepliwości krwi (Peter i wsp., Circulation, 101, 1158-1164, 2000) i tym podobne.
Przykłady przeciwciała, które rozpoznaje antygeny związane z infekcjami wirusowymi i bakteryjnymi, obejmują przeciwciało przeciwko gp120 (Tugarinov i wsp., Structure, 8, 385-395, 2000), przeciwciało G (Schulze-Koops i wsp., J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998), przeciwciało przeciwko CCR4 i przeciwciało przeciwko toksynie Vero (Karnali i wsp., J. Clin. Microbiol., 37, 396-399, 1999) i tym podobne.
Przeciwciała te można uzyskać z organizacji publicznych, takich jak ATCC (The American Type Culture Collection), Banku genów RIKEN przy Instytucie Badań Fizycznych i Chemicznych (RIKEN Gene Bank at The Institute of Physical and Chemical Research), Narodowego Instytutu Nauk Biologicznych i Ludzkich Technologii (National Institute of Bioscience and Human Technology), Agencji Nauki i Technologii Przemysłowej (Agency of Industrial Science and Technology) (obecna nazwa International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and technology) i tym podobnych, lub prywatnych spółek sprzedających odczynniki, takich jak Dainippon Pharmaceutical R&D SYSTEMS, PharMinegen, Cosmo Bio, Funakoshi i tym podobnych.
Lek zawierający przeciwciało według niniejszego wynalazku może być podawany jako czynnik terapeutyczny sam, lecz zazwyczaj, korzystnie jest dostarczany jako formulacja farmaceutyczna wytworzona odpowiednim sposobem dobrze znanym w dziedzinie produkcji farmaceutyków, przez zmieszanie go z przynajmniej jednym dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem.
Należy wybrać drogę podawania, która jest najskuteczniejsza w leczeniu. Przykłady obejmują podawanie doustne i podawanie pozajelitowe, takie jak dopoliczkowe, dotchawicze, doodbytnicze, podskórne, domięśniowe, dożylne i tym podobne. Korzystne jest podawanie dożylne.
Postaci dawek obejmują aerozole, kapsułki, tabletki, granulki, syropy, emulsje, czopki, iniekcje, maści, plastry i tym podobne.
Przykłady preparatów farmaceutycznych odpowiednich do podawania doustnego obejmują emulsje, syropy, kapsułki, tabletki, granulki i tym podobne.
Preparaty ciekłe, takie jak emulsje i syropy, mogą być wytworzone z zastosowaniem jako dodatków wody, węglowodanów, takich, jak sacharoza, sorbitol, fruktoza itp., glikoli, takich jak glikol polietylenowy, glikol propylenowy itp., olejów, takich jak olej sezamowy, olej z oliwek, olej sojowy itp., środków bakteriobójczych, takich jak estry kwasu p-hydroksybenzoesowego itp., aromatów, takich jak aromat truskawkowy, miętowy itp.
Kapsułki, tabletki, proszki, granulki i tym podobne mogą być wytworzone z wykorzystaniem, jako dodatku, wypełniaczy, takich jak laktoza, glukoza, sacharoza, mannitol itp., czynników dezintegrujących, takich jak skrobia, alginian sodu itp., środków smarujących, takich jak stearynian magnezu, talk itp., lepiszczy, takich jak polialkohol winylowy, hydroksypropyloceluloza, żelatyna itp., środków powierzchniowo czynnych, takich jak estry kwasów tłuszczowych itp., plastyfikatorów takich, jak gliceryna i podobnych.
Przykłady preparatów farmaceutycznych odpowiednich do podawania pozajelitowego obejmują środki do iniekcji, czopki, aerozole i tym podobne.
Środki do iniekcji mogą być wytworzone z zastosowaniem nośnika, takiego jak roztwór soli, roztwór glukozy, mieszanina obu lub podobne. Także, sproszkowane środki do iniekcji mogą być wytworzone przez liofilizację kompozycji przeciwciała ogólnie przyjętym sposobem i dodanie chlorku sodu.
PL 218 428 B1
Czopki mogą być wytworzone z zastosowaniem jako nośnika masła kakaowego, utwardzonego tłuszczu, kwasu karboksylowego i tym podobnych.
Także aerozole mogą być wytworzone z wykorzystaniem przeciwciała jako takiego lub z zastosowaniem nośnika, który nie drażni jamy ustnej i śluzówki nosowej pacjenta i może ułatwić absorpcję przeciwciała przez zdyspergowanie go w postaci drobniutkich cząstek.
Przykłady nośnika obejmują laktozę, glicerol i tym podobne. W zależności od właściwości przeciwciała i nośnika można wytworzyć preparaty farmaceutyczne, takie jak aerozole, suche proszki i tym podobne. Ponadto, składniki wymienione jako dodatki do preparatów do podawania doustnego mogą być także dodane do preparatów do podawania pozajelitowego.
Chociaż dawka kliniczna i częstotliwość podawania zmienia się w zależności od żądanego działania leczniczego, sposobu podawania, czasu leczenia, wieku, masy ciała i tym podobnych, zazwyczaj wynosi ona 10 ąg/kg do 20 ąg/kg na dzień, dla dorosłego pacjenta.
Jako sposoby badania działania przeciwnowotworowego przeciwciała przeciw różnym komórkom nowotworowym testy in vitro obejmują sposób pomiaru aktywności CDC, sposób pomiaru aktywności ADCC i tym podobne, a testy in vivo obejmują eksperymenty przeciwnowotworowe z wykorzystaniem układu nowotworowego u zwierząt doświadczalnych, takich jak myszy.
Pomiary aktywności CDC i aktywności ADCC oraz eksperymenty przeciwnowotworowe można przeprowadzić zgodnie ze sposobami opisanymi w Cancer Immunology Immunotherapy, 36, 373 (1993); Cancer Research, 54, 1511 (1994) i tym podobnie.
Niniejszy wynalazek zostanie szczegółowo opisany poniżej w Przykładach, jednakże Przykłady stanowią jedynie ilustrację, a zakres niniejszego wynalazku nie jest do nich ograniczony.
Krótki opis Figur
Fig. 1 przedstawia obrazy uzyskane w wyniku elektroforezy SDS-PAGE pięciu oczyszczonych chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 (w gradiencie żelu od 4 do 15%). Fig. 1A i Fig. 1B przedstawiają odpowiednio wyniki elektroforezy prowadzonej w warunkach redukujących i w warunkach nieredukujących. Ścieżki 1 do 7 przedstawiają odpowiednio obrazy z elektroforezy znaczników o dużej masie cząsteczkowej, chimerycznego przeciwciała YB2/0-GD3, chimerycznego przeciwciała CHO/DG44-GD3, chimerycznego przeciwciała SP2/0-GD3, chimerycznego przeciwciała NS0-GD3 (302), chimerycznego przeciwciała NS0-GD3 (GIT) i znaczników o małej masie cząsteczkowej,
Fig. 2 przedstawia aktywność wiązania się do GD3 pięciu oczyszczonych chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3, mierzoną jako zmiana stężenia przeciwciała. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność wiążącą z GD3 i stężenie przeciwciała. „ o”, „·”, „□”, „”, „Δ” wskazują odpowiednio aktywności chimerycznego przeciwciała YB2/0-GD3, chimerycznego przeciwciała CHO/DG44-GD3, chimerycznego przeciwciała SP2/0-GD3, chimerycznego przeciwciała NS0-GD3 (302) i oraz chimerycznego przeciwciała NS0-GD3 (GIT).
Fig. 3 przedstawia aktywność ADDC pięciu oczyszczonych przeciwciał chimerycznych przeciw GD3 wobec linii komórkowej G-361 ludzkiego czerniaka. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „ o ”, „·”, „□”, „”, „Δ” wskazują odpowiednio aktywności chimerycznego przeciwciała YB2/0-GD3, chimerycznego przeciwciała CHO/DG44-GD3, chimerycznego przeciwciała SP2/0-GD3, chimerycznego przeciwciała NS0-GD3 (302) i chimerycznego przeciwciała NS0-GD3 (GIT).
Fig. 4 przedstawia obrazy z elektroforezy SDS-PAGE trzech oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym-CDR przeciwko hIL-5Ra (w gradiencie żelu od 4 do 15%). Fig. 4A i Fig. 4B przedstawiają odpowiednio wyniki elektroforezy przeprowadzonej w warunkach redukujących i w warunkach nieredukujących. Linie 1 do 5 przedstawiają odpowiednio obrazy z elektroforezy znaczników o dużej masie cząsteczkowej, przeciwciała YB2/0-hIL-5R CDR, przeciwciała CHO/d-hIL-5R CDR, przeciwciała NS0-hIL-5R CDR, i znaczników o małej masie cząsteczkowej.
Fig. 5 przedstawia aktywność trzech oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym-CDR przeciwko hIL-5Ra do wiązania się z hIL-5Ra mierzoną jako zmiana stężenia przeciwciała. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność wiążącą hIL-5Ra i stężenie przeciwciała, „ o ”, „·”, i „□” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała YB2/0-hIL-5R CDR, przeciwciała CHO/d-hIL-5R CDR, przeciwciała NS0-hIL-5R CDR.
Fig. 6 przedstawia aktywności ADDC trzech oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra wobec mysiej linii komórek T CTLL-2(h5R) wyrażających hIL-5R. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała, „o”, „·”, i „□”
PL 218 428 B1 wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała YB2/0-hIL-5RCDR, przeciwciała CHO/d-hIL-5R CDR i przeciwciała NS0-hIL-5R CDR.
Fig. 7 przedstawia aktywność hamującą trzech oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra w indukowanym hIL-5 modelu Macaca faseicularis zwiększenia eozynofilii. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio liczbę eozynofili we krwi obwodowej i liczbę dni (dzień rozpoczęcia podawania przeciwciała i z hIL-5 określono jako dzień 0). „101 i 102”, „301, 302 i 303”, „401 i 403” oraz „501, 502, i 503” wskazują wyniki w grupie, której nie podano przeciwciała, w grupie, której podano przeciwciało Yb2/0-hIL-5R CDR, w grupie, której podano przeciwciało CHO/d-hIL-5R CDR i w grupie, której podano przeciwciało NS0-hIL-5R CDR, odpowiednio.
Fig. 8 przedstawia wzory elucyjne z HPLC z odwróconymi fazami łańcucha cukrowego potraktowanego PA (lewa strona) i wzór elucyjny uzyskany przez traktowanie łańcucha cukrowego traktowanego PA a-L-fukozydazą, a następnie analizowanego za pomocą HPLC z odwróconymi fazami (prawa strona) oczyszczonego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra wytworzonego przez YB2/0 (Fig. 8A) i oczyszczonego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra wytworzonego przez NS0 (Fig. 8B). Rzędne i odcięte wskazują odpowiednio względną intensywność fIuorescencji i czas wymywania.
Fig. 9 przedstawia wzór elucyjny uzyskany przez otrzymanie łańcucha cukrowego traktowanego PA z oczyszczonego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra wytworzonego przez komórkę CHO/d i analizowanie go za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio względną intensywność fIuorescencji i czas wymywania.
Na Fig. 10, Fig. 10A przedstawia aktywności wiązania GD3 dla niezaadsorbowanej frakcji i części frakcji zaadsorbowanej mierzone jako zmianę stężenia przeciwciała. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność wiążącą GD3 i stężenie przeciwciała. „o” wskazują odpowiednio frakcję niezaadsorbowaną i część frakcji zaadsorbowanej. Fig. 10B przedstawia aktywności ADCC frakcji niezaadsorbowanej i części frakcji zaadsorbowanej dla linii G-361 ludzkiego czerniaka. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „·”, „o” wskazują odpowiednio frakcję niezaadsorbowaną i część frakcji zaadsorbowanej.
Fig. 11 przedstawia wzory elucyjne otrzymane przez przeanalizowanie łańcuchów cukrowych traktowanych PA wytworzonych z niezaadsorbowanej frakcji i części frakcji zaadsorbowanej za pomocą HPLC z odwróconymi fazami Fig. 11A i Fig. 11B przedstawiają odpowiednio wzór elucyjny dla niezaadsorbowanej frakcji i wzór elucyjny dla części frakcji zaadsorbowanej. Rzędne i odcięte wskazują odpowiednio względną intensywność fIuorescencji i czas wymywania.
Fig. 12 przedstawia wzory elucyjne potraktowanych PA-łańcuchów cukrowych wytworzonych z 6 przeciwciał chimerycznych przeciw GD3 (Fig. 12A do Fig. 12F) uzyskane przez przeanalizowanie ich za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio względną intensywność fIuorescencji i czas wymywania.
Fig. 13 przedstawia aktywności wiążące GD3 6-ciu chimerycznych przeciwciał przeciw GD3 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy mierzony przez zmianę stężenia przeciwciała. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność wiążącą GD3 i stężenie przeciwciała. „·”, „□”, „”, „Δ” „A” i „x” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (50%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (45%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (29%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (24%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (13%) i przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (7%).
Fig. 14 przedstawia aktywności ADCC sześciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wobec linii komórkowej G-361 ludzkiego czerniaka z wykorzystaniem komórki efektorowej donora A. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „·”, „□”, „”, „Δ”, „A” i „x” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (50%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (45%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (29%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (24%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (13%) i przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (7%).
Fig. 15 przedstawia aktywności ADCC sześciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wobec linii komórkowej G-361 ludzkiego efektora donora B. z wykorzystaniem komórki efektorowej donora B. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „·”, „□”, „”, „Δ” i „A” i „x” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (50%), przeciwciała
PL 218 428 B1 chimerycznego przeciwko GD3 (45%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (29%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (24%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (13%), przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (7%).
Fig. 16 przedstawia wzory elucyjne potraktowanych PA łańcuchów cukrowych wytworzonych z sześciu rodzajów przeciwciał chimerycznych przeciwko GD3, uzyskane przez analizę za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio względną intensywność fIuorescencji i czas wymywania.
Fig. 17 przedstawia aktywności wiążące CCR4 sześciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy mierzony zmianą stężenia przeciwciała. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność wiążącą CCR4 i stężenie przeciwciała. „”, „□”, „A”, „Δ”, „·” i „o” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (46%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (39%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (27%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (18%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (9%) i przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (8%).
Fig. 18 przedstawia aktywności ADCC sześciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wobec komórki CCR4/EL-4 z wykorzystaniem komórki efektorowej donora A. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „”, „□”, „A”, „Δ”, „·” i „o” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (46%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (39%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (27%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (18%), przeciwciała chimerycznego (9%), przeciwciała chimerycznego przeciw CCR4 przeciwko GD3 (8%).
Fig. 18A i 18B przedstawiają wyniki otrzymane z wykorzystaniem komórek efektorowych, odpowiednio donora A i donora B.
Fig. 19 przedstawia aktywności ADCC sześciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 mających różny udział łańcucha cukrowego wolnego od a-1,6-fukozy wobec komórki CCR4/EL-4, z wykorzystaniem komórki efektorowej donora B. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „”, „□”, „A”, „Δ”, „·” i „o” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (46%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (39%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (27%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (18%), przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 (9%) i przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 (8%).
Fig. 20 przedstawia konstrukcję plazmidów CHFT8-pCR2.1 i YBFT8-pCR2.1.
Fig. 21 przedstawia konstrukcję plazmidów CHAc-pBS i YBAc-pBs.
Fig. 22 przedstawia konstrukcję plazmidów CHFT8d-pCR2.1 i YBFT8d-pCR2.1.
Fig. 23 przedstawia konstrukcję plazmidów CHAcd-pBS i YBAcd-pBs.
Fig. 24 przedstawia wyniki oznaczania produktu transkrypcji FUT8 w każdej linii komórkowej gospodarza z zastosowaniem kompetycyjnej RT-PCR. Pokazane są ilości produktu transkrypcji FUT8 w każdej linii komórkowej gospodarza, gdy jako standard i wewnętrzną kontrolę zastosowano szczurzą sekwencję FUT8. „”, „□” wskazują wyniki, gdy jako komórka gospodarza były stosowane odpowiednio linia komórkowa CHO i linia komórkowa YB2/0.
Fig. 25 przedstawia konstrukcję plazmidu mfFUT8-pCR2.1.
Fig. 26 przedstawia konstrukcję plazmidu pBSmfFUT8.
Fig. 27 przedstawia konstrukcję plazmidu pAGEmfFUT8.
Fig. 28 przedstawia wyniki analizy poziomów ekspresji genu FUT8 przez linię komórkową w której zachodzi nadmierna ekspresja genu, uzyskane z wykorzystaniem kompetycyjnej RT-PCR. Rzędna wskazuje względne wartości poziomu transkrypcji genu FUT8 w stosunku do poziomu transkrypcji β-aktyny.
Fig. 29 przedstawia aktywności ADDC przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 oczyszczonego z linii komórkowej z nadmierną ekspresją genu FUT8 wobec linii komórkowej G-361 ludzkiego czerniaka. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała.
Fig. 30 przedstawia wzory elucyjne łańcuchów cukrowych potraktowanych PA wytworzonych z przeciwciał wytworzonych przez linie komórkowe z wprowadzonym mfFUT8-6 i pAGE249, uzyskane przez analizowanie ich za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Fig. 30A i Fig. 30B przedstawiają odpowiednio wzory elucyjne łańcuchów cukrowych potraktowanych PA otrzymanych z przeciwciała wytworzonego przez linię komórkową z wprowadzonym mfFUT8-6 i łańcuchów cukrowych traktowanych PA otrzymanych z przeciwciała wytworzonego przez linię komórkową z wprowadzonym
PL 218 428 B1 pAGE249, odpowiednio. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio na względną intensywność fIuorescencji i czas wymywania R, Fig. 31 przedstawia wzór elucyjny łańcuchów cukrowych traktowanych PA uzyskanych z Herpcetyny, uzyskany przez analizowanie ich za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio względną intensywność fIuorescencji i czas wymywania.
Fig. 32 przedstawia konstrukcję plazmidu CHfFUT8-pCR2.1.
Fig. 33 przedstawia konstrukcję plazmidu ploxPPuro.
Fig. 34 przedstawia konstrukcję plazmidu pKOFUT8gE2-1.
Fig. 35 przedstawia konstrukcję plazmidu pKOFUT8gE2-2.
Fig. 36 przedstawia konstrukcję plazmidu pscFUT8gE2-3.
Fig. 37 przedstawia konstrukcję plazmidu pKOFUT8gE2-3.
Fig. 38 przedstawia konstrukcję plazmidu pKOFUT8gE2-4.
Fig. 39 przedstawia konstrukcję plazmidu pKOFUT8gE2-5.
Fig. 40 przedstawia konstrukcję plazmidu pKOFUT8Puro.
Fig. 41 przedstawia wyniki analizy „Southern” 1 st. AFUT8 2-46-1 i 1st. AFUT8 2-46 jako linii komórkowych CHO z zaburzonym genem a-1,6-fukozylotransferazy.
Fig. 42 przedstawia aktywności ADCC chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 oczyszczonego z linii komórkowej z zaburzonym allelem genu FUT8. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „A” i „” wskazują odpowiednio aktywności oczyszczonego przeciwciała pochodzącego z linii komórki CHD 5-03 wytwarzającej przeciwciała chimeryczne przeciwko CCR4 i oczyszczonego przeciwciała pochodzącego z 1 st. AFUT8 2-46-1.
Fig. 43 przedstawia aktywności ADCC chimerycznych ludzkich przeciwciał przeciwko CCR4 wytworzonych przez linie komórkowe oporne na lektynę. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „□”, „”, i „A” wskazują odpowiednio aktywności przeciwciał wytwarzanych przez szczep 5-03, CHO/CCR4-LCA, CHO/CCR4-AAL i CHO/CCR4-PHA.
Fig. 44 przedstawia aktywności ADCC chimerycznych ludzkich przeciwciał przeciwko CCR4 wytworzonych przez linie komórkowe oporne na lektynę. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. „□”, „Δ”, i „·” odpowiadają odpowiednio aktywności przeciwciał wytwarzanych przez YB2/0 (KM2760 # 58-35-16), 5-03 i CHO/CCR4-LCA.
Fig. 45 przedstawia wzory elucyjne łańcuchów cukrowych potraktowanych PA uzyskanych z oczyszczonych ludzkich chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4, otrzymane przez ich analizę za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała. Fig. 45A, Fig. 45B, Fig. 45C i Fig. 45D przedstawiają wyniki analizy przeciwciała wytwarzanego odpowiednio przez szczep 5-03, przeciwciała wytwarzanego przez CHO/CCR4-LCA, przeciwciała wytwarzanego przez CHO/CCR4-AAL i przeciwciała wytwarzanego przez CHO/CCR4-PHA.
Fig. 46 przedstawia pierwszy etap konstruowania wektora ekspresyjnego dla GMD pochodzącego z komórek CHO (w sumie 6 etapów).
Fig. 47 przedstawia drugi etap konstruowania wektora ekspresyjnego dla GMD pochodzącego z komórek CHO (w sumie 6 etapów).
Fig. 48 przedstawia trzeci etap konstruowania wektora ekspresyjnego dla GMD pochodzącego z komórek CHO (w sumie 6 etapów).
Fig. 49 przedstawia czwarty etap konstruowania wektora ekspresyjnego dla GMD pochodzącego z komórek CHO (w sumie 6 etapów).
Fig. 50 przedstawia piąty etap konstruowania wektora ekspresyjnego dla GMD pochodzącego z komórek CHO (w sumie 6 etapów).
Fig. 51 przedstawia szósty etap konstruowania wektora ekspresyjnego dla GMD pochodzącego z komórek CHO (w sumie 6 etapów).
Fig. 52 przedstawia oporność CHO/CCR4-LCA wyrażających GMD na lektynę LCA. Pomiary przeprowadzono dwukrotnie przez zdefiniowanie wskaźnika przeżywalności grupy komórek hodowanych bez dodatku lektyny LCA jako 100%. Na rysunku, „249” pokazuje wskaźnik przeżywalności CHO/CCR4-LCA z wprowadzonym wektorem ekspresyjnym pAGE249 w obecności lektyny LCA. GMD pokazuje oporność CHO/CCR4-LCA z wprowadzonym wektorem ekspresyjnym pAGE249GMD na lektynę LCA.
PL 218 428 B1
Fig. 53 przedstawia aktywność ADCC przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 wytworzonego przez komórki linii komórkowej CHO/CCR4-LCA, w których zachodzi ekspresja GMD. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio aktywność cytotoksyczną i stężenie przeciwciała.
Fig. 54 przedstawia etap wytwarzania plazmidu CHO-GMD, w którym koniec-5' klonu 34-2 jest wprowadzony na końcu 5' klonu 22-8 cDNA GMD pochodzącego z komórki CHO.
Fig. 55 przedstawia wzór elucyjny łańcuchów cukrowych traktowanych PA uzyskanych z ludzkiego przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 oczyszczonego z CHO/CCR4-LCA z ekspresją genu GMD, otrzymany przez ich analizę za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Rzędna i odcięta wskazują odpowiednio względną intensywność fluorescencji i czas wymywania.
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie ludzkiego chimerycznego przeciwciała przeciwko gangliozydowi GD3:
1. Konstrukcja tandemowego wektora ekspresyjnego pChiLHGM4 dla ludzkiego chimerycznego przeciwciała przeciwko gangliozydowi GD3
Plazmid pChi641LGM40 skonstruowano przez ligację fragmentu około 4,03 kb obejmującego cDNA łańcucha L, otrzymanego przez trawienie wektora ekspresyjnego pChi641LGM4 dla łańcucha L [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)] ludzkiego chimerycznego przeciwciała przeciwko gangliozydowi-CD3 (określanego dalej jako „przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3”) enzymami restrykcyjnymi MluI (Takara Shuzo) i SalI (Takara Shuzo), z fragmentem około 3,40 kb obejmującym gen oporny na G418 i sygnał składania, otrzymanym przez trawienie wektora ekspresyjnego pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)] dla komórki zwierzęcej enzymami restrykcyjnymi MluI (Takara Shuzo) i SalI (Takara Shuzo), stosując zestaw DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie transformowanie E. coli HB101 (Molecular Cloning, Second Edition) produktem ligacji. Następnie fragment około 5,68 kb obejmujący cDNA łańcucha L, otrzymany przez trawienie skonstruowanego plazmidu pChi641LGM40 enzymem restrykcyjnym ClaI (Takara Shuzo), w którym stępiono końce stosując zestaw DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) i dalej trawiono MluI (Takara Shuzo), został zligowany z fragmentem około 8,40 kb obejmującym cDNA łańcucha H otrzymanym przez trawienie wektora ekspresyjnego pChi641HGM4 dla łańcucha H przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 [J. Immunol. Methods, 167, 371 (1994)] enzymem restrykcyjnym XhoI (Takara Shuzo), w którym stępiono końce stosując zestaw DNA Blunting Kit (produkowany przez Takara Shuzo) i dalej trawiono MluI (Takara Shuzo), stosując zestaw DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie E. coli HB101 (Molecular Cloning, Second Edition) stransformowano zligowanym produktem w celu skonstruowania tandemowego wektora ekspresyjnego pChi641HGM4 dla chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3.
2. Wytwarzanie komórek stabilnie produkujących przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3.
Komórki zdolne do stabilnej produkcji chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 przygotowano stosując tandemowy wektor ekspresyjny pChi641HGM4 dla chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 skonstruowanego jak w punkcie 1 Przykładu 1, jak opisano poniżej.
(1) Wytwarzanie komórek produkujących przeciwciała z zastosowaniem komórki YB2/0 szczurzego szpiczaka
Po wprowadzeniu przez elektroporację 5 μg wektora ekspresyjnego pChi641LHGM4 dla przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 do 4 x 106 komórek szczurzego szpiczaka YB2/0 [ATCC CRL1662, J.V. Kilmarin et al., J. Cell. Biol., 93, 576-582 (1982)] komórki zawieszono w 40 ml RPMI1640FBS (10) (pożywka RPMI1640 zawierająca 10% FBS (GIBCO BRL) i rozdzielono po 200 μl/studzienkę w 96-studzienkowej płytce do hodowli (Sumitomo Bakelite). Po okresie hodowli w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2 dodano G418 do stężenia 0,5 mg/ml, następnie hodowano dalej przez 1 do 2 tygodni. Supernatant hodowlany odzyskano ze studzienek, w których utworzyły się kolonie transformantów wykazujących oporność na G418 i obserwowano wzrost kolonii, a aktywność wiązania antygenu chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 mierzono w supernatancie testem ELISA pokazanym w punkcie 3 Przykładu 1.
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których zaobserwowano w supernatantach hodowli wytwarzanie przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3, w celu zwiększenia ilości wytwarzanego przeciwciała, z zastosowaniem systemu amplifikacji genu DHFR, każdy z nich zawieszono w pożywce RPMI1640-FBS9(10) zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 50 nM inhibitora DHFR, metotreksatu 5 (dalej określanego jako „MTX”, SIGMA) do uzyskania gęstości 1 do 2 x 105 komórek/ml, i zawiesinę rozdzielono po 2 ml do studzienek w 24-studzienkowej płytce (Greiner). Transformanty wykazujące oporność na 50 nM MTX zaindukowano przez hodowanie w 37°C przez 1 do 2 tygodni w inkubatorze z 5% CO2. Aktywność wiązania antygenu przez przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 w supernaPL 218 428 B1 tantach hodowli w studzienkach, w których zaobserwowano wzrost transformantów, zmierzono testem ELISA pokazanym w punkcie 3 Przykładu 1. Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których w supernatantach hodowli zaobserwowano wytwarzanie przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3, stężenie MTX zwiększono do 100 nM, a następnie do 200 nM, transformanty zdolne do wzrostu w pożywce RPMI1640-FBS(10) zawierającej 0,5 mg/ml GD418 i 200 nM MTX i wytwarzania chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 w dużej ilości w końcu uzyskano metodą opisaną powyżej. Spośród uzyskanych transformantów wybrano odpowiednie linie komórkowe i wytworzono pojedynczą komórkę (klonowanie) przez ograniczone dwukrotne rozcieńczenie. Stosując również metodę określania produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy pokazaną w Przykładzie 9, wybrano linię komórkową produkującą małą ilość produktu transkrypcji i zastosowano jako odpowiednią linię komórkową.
Uzyskany stransformowany klon komórkowy 7-9-51 produkujący chimeryczne przeciwciało przeciwko GD3 zdeponowano 5 kwietnia, 1999 jako FERM BP-6691 w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan (obecna nazwa: International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japan)).
(2) Wytwarzanie komórek produkujących przeciwciało z zastosowaniem komórki CHO/DG44
Po wprowadzeniu 4 gg wektora ekspresyjnego pChi641LHGM4 przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 do 1,6 x 106 komórek CHO/DG44 [G. Urlub i L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)] przez elektroporację (Cytotechnology, 3, 133 (1990)], komórki zawieszono w 10 ml IMDM-FBS (10) [pożywka IMDM zawierająca 10% FBS i 1 x stężenie dodatku HT (GIBCO BRL)] i dozowano po 200 gl/studzienkę w 96-studzienkowej płytce hodowlanej (Iwaki Glass). Po hodowaniu ich w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2, dodano G418, aby otrzymać stężenie 0,5 mg/ml, a następnie hodowano przez 1 do 2 tygodni. Supernatant hodowli odzyskano ze studzienek, w których tworzyły się kolonie transformantów wykazujące oporność na G418 i, zaobserwowano wzrost kolonii, a aktywność wiązania antygenu przez przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 w supernatancie zmierzono testem ELISA pokazanym w punkcie 3 Przykładu 1.
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których zaobserwowano w supernatantach hodowli wytwarzanie przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3, w celu zwiększenia ilości wytwarzanego przeciwciała, z zastosowaniem systemu amplifikacji genu DHFR, każdy z nich zawieszano w pożywce IMDM-dFBS(10) [pożywka IMDM zawiera 10% dializowanej bydlęcej surowicy płodowej (dalej określanej jako „dFBS”, GIBCO BRL)] zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 10 nM MTX, aby osiągnąć 5 gęstość 1 do 2 x 105 komórek/ml i zawiesinę rozdzielano po 0,5 ml do studzienek 24-studzienkowej płytki hodowlanej (Iwaki Glass). Transformanty wykazujące oporność na 10 nM MTX indukowano przez hodowanie w 37°C przez 1 do 2 tygodni w inkubatorze z 5% CO2. Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których zaobserwowano ich wzrost, stężenie MTX zwiększono do 100 nM, i w końcu uzyskano transformanty zdolne do wzrostu w pożywce IMDM-dFBS(10) zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 100 nM MTX i wytwarzania chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 w dużej ilości uzyskano w końcu metodą opisaną powyżej. Spośród uzyskanych transformantów wybrano odpowiednie linie komórkowe i wytworzono pojedyncze komórki (klonowanie) przez dwukrotne ograniczone rozcieńczenie. Stosując także metodę określania produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy pokazaną w Przykładzie 9, wybrano linię komórkową produkującą małą ilość produktu transkrypcji i zastosowano jako odpowiednią linię komórkową.
(3) Wytwarzanie komórki produkującej przeciwciało z zastosowaniem komórki NS0 mysiego szpiczaka
Po wprowadzeniu przez elektroporację 5 gg wektora ekspresyjnego pChi641LHGM4 przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 do 4 x 106 komórek mysiego szpiczaka NS0 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], komórki zawieszono w 40 ml pożywki EX-CELL302-FBS(10) (pożywka EXCELL302IMDM-FBS (10) zawierająca 10% FBS i 2 mM L-glutaminy [dalej określana jako „LGln”; produkowana przez GIBCO BRL)] i dozowano po 200 gl/studzienkę w 96 studzienkowej płytce hodowlanej (Sumitomo Bakelite). Po hodowaniu ich w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2, dodano G418, aby uzyskać stężenie 0,5 mg/ml, następnie hodowano przez 1 do 2 tygodni. Supernatant hodowli odzyskano ze studzienek, w których wytworzyły się kolonie transformantów wykazujące oporność na G418, i obserwowano wzrost kolonii, a aktywność wiązania antygenu przez przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 w supernatancie zmierzono testem ELISA pokazanym w punkcie 3 Przykładu 1.
PL 218 428 B1
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których zaobserwowano w supernatantach hodowli wytwarzanie przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3, w celu zwiększenia ilości wytwarzanego przeciwciała, z zastosowaniem systemu amplifikacji genu DHFR, każdy z nich zawieszono w pożywce EX-CELL302-dFBS(10) [pożywka EX-CELL302 zawierająca 10% dFBS i 2 mM L-Gln) 5 obejmującej 0,5 mg/ml G418 i 50 nM MTX, aby osiągnąć gęstość 1 do 2 x 105 komórek/ml, i zawiesinę rozdzielono po 2 ml/studzienkę do 24-studzienkowej płytki hodowlanej (Greiner). Transformanty wykazujące oporność na 50 nM MTX zaindukowano przez hodowanie w 37°C przez 1 do 2 tygodni w inkubatorze z 5% CO2. Aktywność wiązania antygenu przez chimeryczne przeciwciało przeciwko GD3 w hodowlanych supernatantach w studzienkach, w których zaobserwowano wzrost transformantów, zmierzono testem ELISA przedstawionym w punkcie 3 Przykładu 1. Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których w supernatantach hodowlanych zaobserwowano w dużych ilościach produkcję przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3, stężenie MTX zwiększono do 100 nM a następnie do 200 nM, i transformanty zdolne do wzrostu w pożywce EX-CELL302-dFBS(10) obejmującej 0,5 mg/ml G418 i 200 nM MTX i w końcu otrzymano transformanty produkujące chimeryczne przeciwciało przeciwko GD3 w dużej ilości tą samą metodą jak opisana powyżej. Spośród otrzymanych transformantów, wybrano elitę linii komórkowych i wyprowadzono pojedyncze komórki (klonowanie) przez dwukrotne ograniczone rozcieńczenie. Stosując również metodę określania produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy pokazaną w Przykładzie 9, wybrano linię komórkową produkującą stosunkowo małą ilość produktu transkrypcji i zastosowano jako odpowiednią linię komórkową.
3. Pomiar aktywności wiązania przeciwciała z GD3 (ELISA)
Aktywność wiązania przeciwciała z GD3 mierzono jak opisano poniżej.
W 2 ml roztworu etanolowego zawierającego 10 ąg dipalmitoilofosfatydylocholiny (produkowanej przez SIGMA) i 5 ąg cholesterolu (SIGMA), rozpuszczono 4 nmol GD3. Do każdej studzienki w 96-studzienkowej płytce do ELISA (Greiner), odmierzono po 20 ąl roztworu (w końcowym stężeniu 40 pmol/studzienkę), następnie wysuszono na powietrzu, dozowano 1% PBS (dalej zwany 1% BSAPBS”) zawierający albuminę surowicy bydlęcej (dalej zwanej „1% BSA”; SIGMA) po 100 μΙ/studzienkę, i dalej reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę blokując pozostałe grupy aktywne. Po odrzuceniu 1% BSA-PBS, supernatant hodowli transformanta lub rozcieńczony roztwór ludzkiego chimerycznego przeciwciała odmierzono po 50 ąl/studzienkę w celu przeprowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po reakcji, każdą studzienkę przemyto PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (Wako Pure Chemical Industries) (dalej zwany „Tween-PBS”), a roztwór znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG (H&L) (American Qualex) rozcieńczony 3000 razy 1% BSA-PBS odmierzono po 50 ąl/studzienkę jako roztwór drugorzędowego przeciwciała, następnie reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po reakcji, a następnie przemyciu Tween-PBS, roztwór substratu ABTS [roztwór przygotowany przez rozpuszczenie 0,55 g soli amonowej 2,2'-azyno-bis(kwasu 3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego) w 1 litrze 0,1 M buforu cytrynianowego pH 4,2 i dodanie 1 ąl/ml nadtlenku wodoru do roztworu tuż przed użyciem (dalej stosowany był ten sam roztwór)] odmierzono po 50 ąl/studzienkę w celu uzyskania zabarwienia, następnie mierzono absorbancję przy 415 nm (dalej określaną jako „OD415”).
4. Oczyszczanie chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 (1) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki YB2/0 i oczyszczanie przeciwciała
Klon stransformowanej komórki produkującej chimeryczne przeciwciało przeciwko GD3 otrzymany jak w punkcie 2 (1) Przykładu 1 zawieszono w podłożu Hybrydoma-SFM zawierającym 0,2% 5
BSA, 200 nM MTX i 100 nM trijodotyroniny (dalej zwanej „T3”; Sigma) do osiągnięcia gęstości 3 x 105 komórek/ml i hodowano z zastosowaniem obrotowej butli o pojemności 2 litrów (Iwaki Glass) przy szybkości mieszania 50 obr./min. Po hodowaniu ich w 37°C przez 10 dni w kontrolowanej temperaturze pokojowej odzyskiwano supernatant hodowli. Przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 oczyszczano z supernatantu hodowlanego stosując kolumnę Prosep-A (Bioprocessing) według instrukcji producenta. Oczyszczone chimeryczne przeciwciało przeciwko GD3 nazwano przeciwciałem chimerycznym YB2/0-GD3.
(2) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki CHO/DG44 i oczyszczanie przeciwciała
Klon stransformowanej komórki produkującej chimeryczne przeciwciało przeciwko GD3 otrzymany w punkcie 2(2) Przykładu 1 zawieszono w pożywce EX-CELL302 zawierającej 3 mM L-Gln, 0,5% stężonego roztworu kwasu tłuszczowego („CDLC” GIBCO BRL) i 0,3% Pluronic F68 („PF68”
PL 218 428 B1
GIBCO BRL) do otrzymania gęstości 1 x 106 komórek/ml, i zawiesinę odmierzono po 50 ml do 175 mm2 płaskich butelek (Greiner). Po hodowaniu komórek w 37°C przez 4 dni w inkubatorze z 5% CO2, supernatant hodowli odzyskano. Przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 oczyszczono z supernatantu hodowli stosując kolumnę Prosep-A (Bioprocessing) zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 nazwano CHO/DG44-GD3.
(3) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki NS0 i oczyszczanie przeciwciała
Klon stransformowanej komórki produkującej chimeryczne przeciwciało przeciwko GD3 otrzymany w punkcie 2(3) Przykładu 1 zawieszono w pożywce EX-CELL302 zawierającej 2 mM L-Gln,
0,5 mg/ml G418, 200 nM MTX i 1% FBS do otrzymania gęstości 1 x 106 komórek/ml, a zawiesinę od2 mierzono po 200 ml do 175 mm2 płaskich butelek (Greiner). Po hodowaniu komórek w 37°C przez 4 dni w inkubatorze z 5% CO2, odzyskano supernatant hodowli. Przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 oczyszczono z supernatantu hodowli stosując kolumnę Prosep-A (Bioprocessing) zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 nazwano przeciwciałem chimerycznym NS0-GD3 (302).
W pożywce GIT zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 200 nM MTX zawieszono klon stransformowanej komórki do uzyskania gęstości 3 x 105 komórek/ml, i zawiesinę odmierzono po 200 ml do 175 mm2 płaskich butelek (Greiner). Po hodowaniu komórek w 37°C przez 10 dni w inkubatorze z 5% CO2, odzyskano supernatant hodowli. Przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 oczyszczono z supernatantu hodowli stosując kolumnę Prosep-A (Bioprocessing) zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczone przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 nazwano przeciwciałem chimerycznym NS0-GD3 (GIT).
(4) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki SP2/0 i oczyszczanie przeciwciała
Klon stransformowanej komórki produkującej chimeryczne przeciwciało przeciw GD3 (KM-871 (FERM BP-3512)) opisany w Japońskim Niepublikowanym Zgłoszeniu Patentowym No 304989/93 (EP 533199) zawieszono w pożywce GIT zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 200 nM MTX do osiągnięcia gę52 stości 3 x 105 komórek/ml i zawiesinę rozdzielono po 200 ml do 175 mm2 płaskich butelek (Greiner)). Po hodowaniu komórek w 37°C przez 8 dni w inkubatorze z 5% CO2, supernatant hodowli odzyskiwano. Przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 oczyszczono z supernatantu hodowli stosując kolumnę Prosep-A (Bioprocessing) zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 nazwano przeciwciałem chimerycznym SP2/0-GG3.
5. Analiza oczyszczonego przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3
Zgodnie ze znaną metodą [Nature, 227, 680 (1970)], 4 ąg każdego z pięciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 produkowanych przez odpowiednie komórki zwierzęce i oczyszczanych z nich, otrzymanych jak w punkcie 4 Przykładu 1, poddano SDS-PAGE w celu analizy ciężaru cząsteczkowego i stopnia oczyszczenia. Wyniki przedstawiono na Fig. 1. Jak przedstawiono na Fig. 1 znaleziono pojedynczy prążek o ciężarze cząsteczkowym około 150 kilodaltonów (dalej określanych jako „Kd”) w nieredukujących warunkach, i dwa prążki około 50 Kd i około 25 Kd w redukujących warunkach, w każdym z oczyszczonych chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3. Ciężar cząsteczkowy prawie pokrywał się z ciężarem cząsteczkowym wydedukowanym z sekwencji nukleotydowej cDNA dla łańcucha L i łańcucha H przeciwciała (łańcuch H: około 49 Kd, łańcuch L: około 23 Kd, cała cząsteczka: około 144 Kd), i także pokrywał się z doniesieniami, że przeciwciało IgG ma ciężar cząsteczkowy około 150 Kd w warunkach nieredukujących i jest rozkładany na łańcuch H mający ciężar cząsteczkowy około 50 Kd i łańcuch L mający ciężar cząsteczkowy około 25 Kd w warunkach redukujących zgodnie z odcinaniem wiązania disulfidowego (dalej „wiązanie S-S”) w cząsteczce [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1998); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)], tak więc potwierdzono, że każde przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 zostało wyrażone i oczyszczone jako cząsteczka przeciwciała mająca prawdziwą strukturę.
P r z y k ł a d 2
Ocena aktywności chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3
1. Aktywność wiązania chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 z GD3 (ELISA)
Aktywność wiązania pięciu rodzajów oczyszczonych chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 otrzymanych zgodnie z punktem 4 Przykładu 1 z GD3 (Snow Brand Milk Products) mierzono metodą ELISA jak opisano w punkcie 3 Przykładu 1. Fig. 2 przedstawia wynik badania aktywności wiązania mierzonej przez zmianę stężenia dodawanego przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3. Jak po46
PL 218 428 B1 kazano na Fig. 2, pięć rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 wykazywało prawie tę samą aktywność wiązania z GD3. Wynik pokazuje, że aktywność wiązania antygenu przez te przeciwciała jest stała niezależnie od produkujących przeciwciało komórek zwierzęcych i sposobów ich hodowli. Sugerowano na podstawie porównania chimerycznego przeciwciała NS0-GD3 (302) z chimerycznym przeciwciałem NS0-GD3(GIT), że aktywności wiązania antygenu są stałe niezależnie od zastosowanych do hodowli pożywek.
2. In vitro cytotoksyczna aktywność (aktywność ADCC) przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3
W celu oceny in vitro aktywności cytotoksycznej pięciu rodzajów oczyszczonych przeciwciał chimerycznych przeciwko GD3 otrzymanych jak w punkcie 4 Przykładu 1, aktywność ADCC mierzono następującymi metodami.
(1) Wytwarzanie roztworu komórki docelowej
Hodowaną linię komórkową ludzkiego szpiczaka G-361 (ATCC CRL 1424) hodowano stosując pożywkę RPMI1640-FBS(10) do uzyskania 1 x 106 komórek, komórki znakowano radioizotopowo przez kontaktowanie ich z 3,7 MBq ekwiwalentów radioaktywnej substancji Na251CrO4 w 37°C przez 1 godzinę. Po reakcji komórki przemyto trzykrotnie przez zawieszanie ich w pożywce RPMI1640FBS(10) i odwirowanie, powtórne zawieszenie w pożywce i inkubację w 4°C przez 30 minut w lodzie w celu spontanicznego rozpuszczenia się substancji radioaktywnych. Po odwirowaniu osad doprowa5 dzono do 2 x 105 komórek/ml przez dodanie 5 ml pożywki RPMI1640-FBS(10) i stosowano jako roztwór komórki docelowej.
(2) Wytwarzanie roztworu komórki efektorowej
Od zdrowej osoby pobrano 50 ml krwi żylnej i łagodnie zmieszano z 0,5 ml heparyny sodowej (Takeda Pharmaceutical). Mieszaninę odwirowano, aby wyizolować warstwę komórek jednojądrzastych, stosując Lymphoprep (Nycomed Pharma AS) zgodnie z zaleceniami producenta. Po przemyciu pożywką RPMI1640-FBS(10) przez trzykrotne odwirowywanie, uzyskany osad zawieszono do osiągnięcia gęstości 2 x 106 komórek/ml stosowanej pożywki i zastosowano jako roztwór komórki efektorowej.
(3) Pomiar aktywności ADCC
Do każdej z 96 studzienek płytki o dnie w kształcie litery U (Falcon) rozdzielono po 50 ąl roztworu komórki docelowej wytworzonego jak powyżej (1) (do 1 x 104 komórek/studzienkę). Następnie do 5 tego roztworu dodano 100 ąl roztworu komórki efektorowej wytworzonego jak powyżej (2) (2 x 105 komórek/studzienkę, stosunek komórek efektorowych do komórek docelowych wynosił 20:1). Następnie dodano każde z chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3, do uzyskania końcowego stężenia od 0,0025 do 2,5 ąg/ml, potem następowała reakcja w 37°C przez 4 godziny. Po reakcji, płytkę odwiro51 51 wano i w supernatancie zmierzono ilość Cr stosując licznik γ. Ilość spontanicznie uwolnionego Cr obliczono za pomocą tej samej operacji stosując zamiast roztworu komórki efektorowej i roztworu
51 przeciwciała samą pożywkę, i mierząc ilość 51Cr w supernatancie. Całkowitą ilość uwolnionego 51Cr obliczano stosując tę samą operację z użyciem pożywki zamiast roztworu przeciwciała i dodając 1N kwas chlorowodorowy zamiast roztworu komórki efektorowej i mierząc ilość 51Cr w supernatancie. Aktywność ADCC obliczano z następującego wzoru
51 51Cr w próbce supernatantu - spontanicznie uwolniony 51Cr Aktywność ADCC (%) = ——-—F-;--5----:-:-—--x 100(II)
Całkowicie uwolniony 51Cr - spontanicznie uwolniony 51Cr
Wyniki pokazano na Fig. 3. Jak pokazano na Fig. 3 wśród pięciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3, przeciwciało chimeryczne YB2/0-GD3 wykazuje najsilniejszą aktywność ADCC, po czym w następującej kolejności chimeryczne przeciwciało SP2/0-GD3, chimeryczne przeciwciało NS0-GD3 i CHO-GD3. Nie znaleziono różnic w aktywności ADCC między chimerycznym przeciwciałem NS0-GD3 (302) a chimerycznym przeciwciałem NS0-GD3 (GIT) wytworzonym z zastosowaniem różnych pożywek w hodowli. Powyższe wyniki wykazują, że aktywność ADCC przeciwciał bardzo się różni w zależności od rodzaju komórek zwierzęcych stosowanych do ich wytwarzania. Odnośnie do jej mechanizmu, ponieważ ich aktywność wiązania z antygenem była identyczna, uważano, że jest to spowodowane różnicą w strukturze wiązania z regionem Fc przeciwciała.
P r z y k ł a d 3
Wytwarzanie łańcucha przeciwciała z przeszczepionym ludzkim CDR skierowanego przeciw łańcuchowi a receptora ludzkiej interleukiny 5:
PL 218 428 B1
1. Wytwarzanie komórki stabilnie produkującej przeciwciało z przeszczepionym ludzkim CDR skierowane przeciwko łańcuchowi α receptora ludzkiej interleukiny 5 (1) Przygotowanie komórki produkującej przeciwciało z zastosowaniem komórki YB2/0 szczurzego szpiczaka
Stosując wektor ekspresyjny pKANTEX1259HV3LV0 dla przeciwciała z przeszczepionym ludzkim CDR skierowanym przeciw łańcuchowi α receptora ludzkiej interleukiny 5 („przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra”) opisany w WO 97/10354, wytworzono komórki zdolne do stabilnej produkcji przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hlL-5Ra, wytworzono jak opisano powyżej.
Po wprowadzeniu 5 ąg wektora ekspresyjnego pKANTEX1259HV3LV0 dla przeciwciała z przeszczepionym ludzkim CDR przeciwko hIL-5Ra do 4 x 106 komórek szczurzego szpiczaka YB2/0 przez elektroporację [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], komórki zawieszono w 40 ml pożywki RPMI1640FBS(10) i rozdzielono po 200 ąl/studzienkę w 96-studzienkowej płytce hodowlanej (Sumitomo Bakelite). Po hodowaniu ich w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2, dodano G418 do uzyskania stężenia 0,5 mg/ml i dalej hodowano przez 1 do 2 tygodni. Supernatant hodowlany odzyskiwano ze studzienek, w których tworzyły się kolonie transformantów wykazujących oporność wobec G418 i obserwowano wzrost kolonii, a aktywność wiązania antygenu przez przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, mierzono w supernatancie za pomocą testu ELISA przedstawionego w punkcie 2 Przykładu 3.
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których w supernatantach hodowlanych zaobserwowano wytwarzanie przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, w celu zwiększenia ilości przeciwciał wytwarzanych z zastosowaniem systemu amplifikacji genu DHFR, każdy z transformantów zawieszono w pożywce RPMI1640-FBS (10) zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 50 nM MTX do 5 uzyskania gęstości 1 do 2 x 105 komórek/ml i zawiesinę rozdzielono po 2 ml do studzienek 24-studzienkowej płytki (Greiner). Transformanty wykazujące oporność na 50 nM MTX indukowano przez hodowanie w 37°C przez 1 do 2 tygodni w inkubatorze z 5% CO2. Zaobserwowano aktywność wiązania antygenu przez przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra w supernatantach hodowli w studzienkach, w których rosły transformanty i zmierzono za pomocą testu ELISA przedstawionego w punkcie 2 Przykładu 3. Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których w supernatantach hodowlanych zaobserwowano wytwarzanie przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, stężenie MTX zwiększono do 100 nM, a następnie do 200 nM, a na koniec otrzymano w ten sam sposób, jak opisany powyżej, transformanty zdolne do wzrostu w pożywce RPMI1640-FBS(10) zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 200 nM MTX i wytwarzania w dużej ilości przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra. Spośród otrzymanych transformantów wyselekcjonowano elitę linii k omórkowych i wyprowadzono do pojedynczej komórki (klonowanie) przez dwukrotne ograniczone rozcieńczenie. Także, stosując sposób określania produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy przedstawiony w Przykładzie 9, linię komórkową produkującą stosunkowo małą ilość produktu transkrypcji wybrano i zastosowano jako odpowiednią linię komórkową. Otrzymany klon Nr 3 stransformowanej komórki produkującej przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra zdeponowano 5 kwietnia 1999, jako FERM BP-6690 w National Institute of Biosciece and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan) (obecna nazwa: International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)).
(2) Wytwarzanie komórki produkującej przeciwciało z zastosowaniem komórki CHO/dhfr-
Po wprowadzeniu przez elektroporację [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 4 ąg wektora ekspresyjnego pKANTEX1259HV3LV0 dla ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hlL-5Ra, opisanego w WO 97/10354, do 1,6 x 106 komórek CHO/dhfr-, komórki zawieszono w 10 ml pożywki IMDM-FBS(10) i rozdzielono po 200 ąl/studzienkę do 96-studzienkowej płytki hodowlanej (Sumitomo Bakelite). Po hodowaniu komórek w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2, dodano G418 do uzyskania stężenia 0,5 mg/ml i dalej hodowano przez 1 do 2 tygodni. Supernatant hodowli odzyskano z odpowiedniej studzienki, w której wytworzyły się kolonie transformantów wykazujących oporność wobec G418 i obserwowano wzrost kolonii, a aktywność wiązania antygenu przez przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, mierzono w supernatancie testem ELISA przedstawionym w punkcie 2 Przykładu 3.
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których w supernatantach hodowlanych zaobserwowano produkcję przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, w celu zwiększenia
PL 218 428 B1 ilości produkowanego przeciwciała z zastosowaniem systemu amplifikacji genu DHFR, każdy z transformantów zawieszano w pożywce IMD-dFBS(10) zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 10 nM MTX w celu 5 uzyskania gęstości 1 do 2 x 105 komórek/ml i zawiesinę rozdzielano po 0,5 ml do studzienek w 24-studzienkowej płytce (Iwaki Glass). Transformanty wykazujące oporność na 10 nM MTX indukowano przez hodowanie w 37°C przez 1 do 2 tygodni w inkubatorze z 5% CO2. Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których zaobserwowano ich wzrost, stężenie MTX zwiększano do 100 nM, a następnie do 500 nM, i otrzymano w końcu transformanty zdolne do wzrastania w pożywce IMDdFBS(10) zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 500 nM MTX i produkowania w dużej ilości przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, w ten sam sposób, jak opisano powyżej. Spośród otrzymanych transformantów wybrano elitę linii komórkowych i wytworzono pojedyncze komórki (klonowanie) przez dwukrotne ograniczone rozcieńczenie. Także stosując metodę określenia produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy przedstawioną w Przykładzie 9, wybrano linię komórkową produkującą stosunkowo małą ilość produktu transkrypcji i zastosowano jako odpowiednią linię komórkową.
(3) Wytwarzanie komórki produkującej przeciwciało z zastosowaniem komórki NS0 mysiego szpiczaka
Wektor ekspresyjny dla przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra przygotowano zgodnie z metodą Yarranton i wsp. [BIO/TECHNOLOGY, 10, 169 (1992), stosując cDNA łańcucha H przeciwciała i cDNA łańcucha L na wektorze ekspresyjnym pKANTEX1259HV3LV0 dla ludzkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, opisanym w WO 97/10354, i transformowano komórkę NSO w celu uzyskania transformantów zdolnych do produkcji w dużej ilości przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra. Spośród otrzymanych transformantów, wybrano elitę linii komórkowych i wytworzono pojedyncze komórki (klonowanie) przez dwukrotne ograniczone rozcieńczenie. Także stosując metodę określenia produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy przedstawioną w Przykładzie 9, wybrano linię komórkową produkującą stosunkowo małą ilość produktu transkrypcji wybrano i zastosowano jako odpowiednią linię komórkową.
2. Pomiar aktywności wiązania przeciwciała z hIL-5Ra (ELISA)
Aktywność wiązania przeciwciała z hIL-5Ra zmierzono jak opisano poniżej.
Przygotowano roztwór przez rozcieńczenie PBS mysiego przeciwciała KM1257 przeciwko hIL-5Ra opisanego w WO 97/10354, aby otrzymać stężenie 10 ąg/ml, i dodano po 50 ąl uzyskanego roztworu do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki do ELISA (Greiner), po czym następowała reakcja w 4°C przez 20 godzin. Po tej reakcji 1% BSA-PBS rozdzielono po 100 ąg/studzienkę, a następnie reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby zablokować pozostające grupy aktywne. Po odrzuceniu 1% BSA-PBS roztwór przygotowany przez rozcieńczenie rozpuszczalnego hIL-5Ra, opisanego w WO 97/10354, 1% BSA-PBS do stężenia 0,5 ąg/ml został rozdzielony po 50 ąl/studzienkę, po czym prowadzono reakcję w 4°C przez 20 godzin. Po reakcji każdą studzienkę przemyto Tween-PBS, supernatanty hodowlane transformantów lub rozcieńczone roztwory oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym ludzkim CDR były rozdzielane po 50 ąg/studzienkę, aby przeprowadzić reakcję w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po tej reakcji, każdą studzienkę przemyto Tween-PBS, a roztwór znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała przeciw ludzkim IgG (H&L) (American Qualex) rozcieńczono 3000 razy 1% BSA-PBS i rozdzielono po 50 ąl/studzienkę jako roztwór drugorzędowego przeciwciała, następnie reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po reakcji, a następnie przemyciu roztworem Tween-PBS, roztwór substratu ABTS rozdzielano po 50 ąl/studzienkę w celu uzyskania zabarwienia, a następnie zmierzono absorbancję przy 415 nm (dalej określaną jako „OD415”).
3. Oczyszczanie przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra (1) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki YB2/0 i oczyszczanie przeciwciała
Klon komórek produkujących przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra otrzymany jak w punkcie 1(1) Przykładu 3 zawieszono w pożywce GIT zawierającej 0,5 mg/ml G418 i 200 nM MTX, do gęstości 3 x 105 komórek/ml i rozdzielano po 200 ml do 175 mm2 płaskich butelek (produkowanych przez Greiner). Po hodowaniu komórek w 37°C przez 8 dni w inkubatorze z 5% CO2 odzyskano supernatant hodowlany. Przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra oczyszczono z supernatantu hodowlanego stosując metodę chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Oczyszczone przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra nazwano przeciwciałem YB2/0-hIL-5R CDR.
PL 218 428 B1 (2) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki CHO/dhfr- i oczyszczanie przeciwciała
Klon stransformowanych komórek produkujących przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, otrzymany w punkcie 1(2) Przykładu 3, zawieszano w pożywce EX-CELL302 zawierac jącej 3 mM L-Gln, 0,5% CDLC i 0,3% PF68, do gęstości 3 x 105 komórek/ml i hodowano stosując obrotową butlę o pojemności 4 I (Iwaki Glass) przy szybkości obrotu 100 obr./min. Po hodowaniu komórek w 37°C przez 10 dni w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą, odzyskano supernatant hodowlany. Przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra oczyszczano z supernatantu hodowlanego stosując metodę chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Oczyszczone przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra nazwano przeciwciałem CHO/d-hIL-5R CDR.
(3) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki NS0 i oczyszczanie przeciwciała
Klon komórek produkujących przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, otrzymany w punkcie 1(3) Przykładu 3, przygotowano zgodnie z metodą Yarranton i wsp. [BIO/TECHNOLOGY, 10, 169 (1992)], a następnie odzyskano supernatant hodowlany. Przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra oczyszczono z supernatantu hodowlanego stosując metodę chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Oczyszczone przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra nazwano przeciwciałem NS0-hIL-5R CDR.
4. Analiza oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionymi CDR przeciwko hIL-5Ra
Zgodnie ze znaną metodą [Nature, 227, 680 (1970)], 4 μg każdego z trzech rodzajów przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra wyprodukowanych i oczyszczonych z poszczególnych komórek zwierzęcych, otrzymanych w punkcie 3 Przykładu 3, poddano SDS-PAGE w celu określenia ciężaru cząsteczkowego 1 stopnia oczyszczenia. Wyniki przedstawiono na Fig. 4. Jak przedstawiono na Fig. 4, znaleziono pojedynczy prążek o ciężarze cząsteczkowym około 150 Kd w warunkach nieredukujących i dwa prążki około 50 Kd i około 25 Kd w warunkach redukujących, w każdym z oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra. Ciężar cząsteczkowy prawie pokrywał się z ciężarami cząsteczkowymi wydedukowanymi z sekwencji nukleotydowej cDNA dla łańcucha H i łańcucha L przeciwciała (łańcuch H: około 49 Kd, łańcuch L: około 23 Kd, cała cząsteczka: około 144 Kd), i również pokrywał się z doniesieniami wskazującymi, że przeciwciało IgG ma ciężar cząsteczkowy około 150 Kd w warunkach nieredukujących i jest rozkładane na łańcuch H mający ciężar cząsteczkowy około 50 Kd i łańcuch L mający ciężar cząsteczkowy około 25 Kd w warunkach redukujących zgodnie z odcinaniem wiązania S-S w cząsteczce [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1998); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)], tak więc potwierdzono, że każde przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra zostało wyrażone i oczyszczone, jako cząsteczka przeciwciała mająca właściwą strukturę.
P r z y k ł a d 4
Ocena aktywności przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra
1. Aktywność wiązania przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra z hIL-5Ra [ELISA]
Za pomocą testu ELISA, jak opisano w punkcie 2 Przykładu 3, zmierzono aktywność wiązania z hIL-5Ra trzech rodzajów oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, otrzymanych jak w punkcie 3 przykładu 3. Na Fig. 5, przedstawiono wynik badania aktywności wiązania zmierzony przez zmianę stężenia dodanego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra. Jak przedstawiono na Fig. 5 trzy rodzaje przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra wykazały prawie taką samą aktywność wiązania z hIL-5Ra. Wynik wskazuje, że aktywności wiązania antygenu tych przeciwciał są stałe niezależnie od komórek zwierzęcych produkujących przeciwciała i sposobów ich hodowli, i podobne do wyniku uzyskanego w punkcie 1 w Przykładzie 2.
2. Cytotoksyczna aktywność in vitro (aktywność ADCC) przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra
W celu oceny aktywności cytotoksycznej in vitro trzech rodzajów oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, otrzymanych jak w punkcie w punkcie 3 Przykładu 3, zmierzono aktywność ADCC następującym sposobem.
(1) Przygotowanie roztworu komórek docelowych
Linię mysich limfocytów T CTLL-2(h5R) wyrażających łańcuch hIL-5Ra i łańcuch β, opisaną w WO 97/10354, hodowano stosując pożywkę RPMI1640-FBS(10) aż do gęstości 1 x 106 komórek/0,5 ml
PL 218 428 B1 i komórki znakowano radioizotopem przez reakcję z 3,7 MBq równoważnikami radioaktywnej substan51 cji Na251CrO4 w 37°C w ciągu 1,5 godziny. Po reakcji komórki przepłukano trzy razy pożywką RPMI1640-FBS(10) i odwirowano, ponownie zawieszono w pożywce, a następnie inkubowano w 4°C przez minut w lodzie w celu szybkiego rozpuszczenia substancji radioaktywnej. Po odwirowaniu do osa5 du dodano 5 ml pożywki RPMI1640-FBS(10) doprowadzając gęstość do wartości 2 x 105 komórek/ml i stosowano go jako roztwór komórek docelowych.
(2) Przygotowanie roztworu komórek efektorowych
Od zdrowej osoby pobrano 50 ml krwi żylnej i delikatnie zmieszano z 0,5 ml soli sodowej heparyny (Takeda Pharmaceutical). Mieszaninę odwirowano w celu oddzielenia warstwy komórek jednojądrzastych stosując Polymorphprep (Nycomed Pharma AS), zgodnie z instrukcją producenta. Po przepłukaniu pożywką RPMI1640-FBS(10) przez trzykrotne wirowanie, uzyskane komórki ponownie zawieszono w pożywce do gęstości 9 x 106 komórek/ml i stosowano jako roztwór komórek efektorowych.
(3) Pomiar aktywności ADCC
Do każdej studzienki z 96-studzienkowej płytki z dnem w kształcie litery U (firmy Falcon) wprowadzono 50 gl roztworu komórek docelowych przygotowanego jak powyżej (1) (1 x 104 komórek/studzienkę). Następnie rozdzielono po 100 gl roztworu komórek efektorowych przygotowanego jak powyżej (2) (9 x 105 komórek/studzienkę, uzyskując stosunek komórek efektorowych do komórek docelowych 90:1). Następnie dodano każdego z przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra do końcowego stężenia 0,001 do 0,1 gg/ml i prowadzono reakcję w 37°C przez 4 godziny. Po reakcji płytkę odwirowano i zmierzono ilość Cr w supernatancie stosując licznik γ. Obliczono ilość spontanicznie uwolnionego 51Cr tym samym sposobem, tylko zamiast roztworu komórek efektorowych i roztworu przeciwciała zastosowano pożywkę i zmierzono ilość 51Cr w supernatancie. Całkowita ilość uwolnionego 51Cr obliczono za pomocą tej samej operacji, tylko zamiast roztworu przeciwciała stosowano pożywkę, a zamiast roztworu komórek efektorowych dodano 1N kwasu solnego i zmierzono ilość 51Cr w supernatancie.
Aktywność ADCC obliczono z powyższego równania(II). Wyniki przedstawiono na Fig. 6. Jak pokazano na Fig. 6 spośród trzech rodzajów przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra największą aktywność ADCC, wykazywało przeciwciało YB2/0-hIL-5R CDR następnie w kolejności było przeciwciało CHO/d-hIL-5R CDR i NS0-hIL-5R CDR. Podobnie jak wynik uzyskany w punkcie 2 w Przykładzie 2, powyższe wyniki wykazują, że aktywność ADCC przeciwciał znacznie zmienia się w zależności od komórek zwierzęcych stosowanych do ich wytworzenia. Ponadto, ponieważ przeciwciała produkowane przez komórkę YB2/0 wykazywały najsilniejszą aktywność ADCC w obu przypadkach dwóch rodzajów humanizowanych przeciwciał, okazało się, że stosując komórkę YB2/0 można wyprodukować przeciwciało mające silną aktywność ADCC.
3. Ocena aktywności przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra in vivo
W celu oceny aktywności in vivo trzech rodzajów oczyszczonych przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, otrzymanych w punkcie 3 w Przykładzie 3, zbadano aktywność hamującą eozynofilię wywołaną przez hIL-5 w modelu Macaca faseicularis, następującym sposobem.
hIL-5 (sposób przygotowania jest opisany w WO 97/10354) podawano Macaca faseicularis pod skórę na grzbiecie w dawce 1 gg/kg od 1 dnia raz dziennie w sumie 14 razy. Każde przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra podawano dożylnie w dawce 0,3 mg/kg na 1 godzinę przed podaniem hIL-5 w dniu zero. Jako kontrolę wykorzystano grupę, której nie podawano przeciwciała. W grupach, którym podawano przeciwciało, w każdej grupie wykorzystano troje zwierząt Macaea faseicularis (Nr 301, 302, 303; Nr 401, 402, 403; Nr 501, 502, 503), a dwoje zwierząt (nr 101 i 102) wykorzystano w grupie, której nie podawano przeciwciała. Na 7 dni przed rozpoczęciem podawania i aż do 42 dni po podaniu okresowo pobierano około 1 ml krwi z żyły odpiszczelowej lub z żyły udowej i mierzono liczbę eozynofili w 1 gl krwi obwodowej. Wyniki są przedstawione na Fig. 7. Jak widać na Fig. 7 wzrost liczby eozynofili we krwi był całkowicie zahamowany w grupie, której podawano przeciwciało YB2/0-hIL-5R CDR. Z drugiej strony, całkowitą aktywność hamującą stwierdzono u jednego zwierzęcia w grupie, której podawano przeciwciało CHO/d-hlL-5R CDR, ale u pozostałych dwojga zwierząt aktywność hamująca nie była wystarczająca. W grupie, której podawano przeciwciało NS0hIL-5R CDR, nie stwierdzono całkowitej aktywności hamującej i jego działanie nie było wystarczające.
Powyższe wyniki pokazują, że aktywność przeciwciał in vivo znacznie zmienia się w zależności od komórek zwierzęcych stosowanych do ich produkcji. Ponadto, ponieważ stwierdzono pozytywną korelację między stopniem aktywności in vivo przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko
PL 218 428 B1 hIL-5Ra i stopniem jego aktywności ADCC, opisanej w punkcie 2 przykładu 4, wskazuje to, iż stopień aktywności ADCC jest bardzo ważny dla wyrażenia aktywności przeciwciała.
W oparciu o powyższe wyniki oczekuje się, że przeciwciało mające silną aktywność ADCC będzie przydatne także w klinicznym zastosowaniu do leczenia różnych chorób u ludzi.
P r z y k ł a d 5
Analiza łańcucha cukrowego, który zwiększa aktywność ADDC:
1. Wytwarzanie łańcucha cukrowego znakowanego 2-aminopirydyną (łańcuch cukrowy traktowany PA)
Humanizowane przeciwciało według niniejszego wynalazku hydrolizowano kwasem solnym w celu usunięcia kwasu sialowego. Po całkowitym usunięciu kwasu solnego łańcuch cukrowy odcięto od białka przez hydrazynolizę [Method of Enzymology, 83, 263 (1982)]. Hydrazynę usunięto i przeprowadzono N-acetylację dodając wodny roztwór octanu amonu i bezwodnik octowy. Po liofilizacji przeprowadzono fluoroscencyjne znakowanie 2-aminopirydyną [J. Biochem., 95, 197 (1984]. Znakowany fluorescencyjnie łańcuch cukrowy (łańcuch cukrowy traktowany PA) oddzielono od zanieczys zczeń stosując kolumnę Superdex Peptide HR 10/30 (firmy Pharmacia). Frakcję łańcucha cukrowego wysuszono stosując wirówkowy koncentrator i stosowano ją jako oczyszczony łańcuch cukrowy traktowany PA.
2. Analiza traktowanego PA łańcucha cukrowego oczyszczonego przeciwciała z przeszczepi onym CDR przeciwko hIL-5Ra metodą HPLC z odwróconymi fazami
Sposobem według punktu 1 w Przykładzie 5 różne przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, wytworzone w Przykładzie 3, poddano obróbce łańcuchem cukrowym traktowanym PA i przeprowadzono analizę HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie CLC-ODS (Shimadzu). Do łańcucha cukrowego traktowanego PA dodano a-L-fukozydazy w nadmiarze (pochodzącej z nerki bydlęcej, produkowanej przez SIGMA) W celu trawienia (37°C, 15 godzin), a następnie produkty analizowano HPLC z odwróconymi fazami (Fig. 8). Potwierdzono, że łańcuch cukrowy związany z asparaginą jest wymywany w ciągu 30 do 80 minut, gdy stosuje się wzorce łańcuchów cukrowych traktowanych PA produkcji Takara Shuzo. Obliczono udział łańcuchów cukrowych, których pozycje elucji w HPLC z odwróconymi fazami były przesunięte (łańcuchy cukrowe eluowane przez 48 do 78 minut) przez trawienie a-flukozydazą. Wyniki są przedstawione w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Komórka produkująca przeciwciało Łańcuch cukrowy związany z a-1,6-fukozą (%)
YB2/0 47
NSO 73
Łańcuchy cukrowe, w których pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy w redukującym końcu przez wiązanie a w łańcuchu cukrowym związanym N-glikozydowo (dalej zwane „łańcuchem cukrowym zawierającym a-1,6-fukozę”) stanowią około 47% przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5R wytworzonego przez komórkę YB2/0 i około 73% przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5R wytworzonego przez komórkę NS0. Zatem udział łańcuchów cukrowych, w których pozycja 1 fukozy nie jest związana z pozycją 6 N-(acetyloglukozaminy w redukującym końcu przez wiązanie a w łańcuchu cukrowym związanym N-glikozydowo (dalej zwanych „łańcuchem cukrowym wolnym od a-1,6-fukozy”), jest wyższy w przeciwciałach wyprodukowanych przez komórkę YB2/0 niż w przeciwciałach wyprodukowanych przez komórkę NS0.
3. Analiza składu monosacharydów oczyszczonego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra
Łańcuchy cukrowe przeciwciał z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, wytworzonych przez komórki YB2/0, NS0 i CHO/d, zhydrolizowano do monosacharydów kwasem trifIuorooctowym i przeprowadzono analizę składu monosacharydów stosując BioLC (firmy Dionex).
W łańcuchach cukrowych związanych N-glikozydowo są 3 jednostki mannozy w jednym łańcuchu cukrowym związanym N-glikozydowo typu złożonego. Względny udział każdego monosacharydu otrzymany przez obliczenie przy liczbie jednostek mannozy równej 3 przedstawiono w Tabeli 2.
PL 218 428 B1
T a b e l a 2
Komórka produkująca przeciwciało Fuc GlcNAc Gal Man Aktywność ADCC (%)*
YB2/0 0,60 4,98 0,30 3,00 42,27
NS0 1,06 3,94 0,66 3,00 16,22
CHO/dhFr- 0,85 3,59 0,49 3,00 25,73
CHO/dhFr- 0,91 3,80 0,27 3,00 25,73
* Stężenie przeciwciała: 0,01 ąg/ml
Ponieważ porządek względnych udziałów fukozy był następujący: YB2/0<CHO/d<NS0, łańcuch cukrowy uzyskany z przeciwciała produkowanego przez komórki YB2/0 wykazywał najniższą zawartość fukozy, jak to również przedstawiono w powyższych wynikach.
4. Analiza łańcuchów cukrowych przeciwciała produkowanego przez komórkę CHO/dhfr-
Łańcuchy cukrowe traktowane PA uzyskano z oczyszczonego przeciwciała z przeszczepionym CDR przeciw hIL-5Ra produkowanego przez komórki CHO/dhfr- i przeprowadzono analizę metodą HPLC z odwróconymi fazami stosując kolumnę CLC-ODS (Shimadzu) (Fig. 9). Na Fig. 9 czas elucji od 35 do 45 minut odpowiadał łańcuchom cukrowym nie mającym fukozy, a czas elucji od 45 do 60 minut odpowiadał łańcuchom cukrowym mającym fukozę. Podobnie jak w przypadku przeciwciała produkowanego przez mysie komórki szpiczaka NS0, przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra produkowane przez komórki CHO/dhfr- miało mniejszą zawartość łańcuchów cukrowych wolnych od fukozy niż przeciwciało produkowane przez szczurze komórki szpiczaka YB2/0.
P r z y k ł a d 6
Wyodrębnienie przeciwciała z silną aktywnością ADCC
Przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra produkowane przez szczurze komórki szpiczaka YB2/0 wyodrębniono stosując kolumnę z lektyną, z którą wiążą się łańcuchy cukrowe mające fukozę. HPLC przeprowadzono stosując LC-6A produkcji Shimadzu przy prędkości przepływu 1 ml/min i w temperaturze pokojowej jako temperaturze kolumny. Po zrównoważeniu kolumny za pomocą 50 mM buforu Tris-siarczan (pH 7,3), wstrzyknięto oczyszczone przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciwko hIL-5Ra, po czym eluowano liniowym gradientem gęstości (60 minut) 0,2 M a-metylomannozydu (Nacalai Tesque). Przeciwciało z przeszczepionym CDR przeciw hIL-5Ra wydzieliło się do frakcji niezaadsorbowanej i do frakcji zaadsorbowanej.
Pobrano próbki z frakcji niezaadsorbowanej i części frakcji zaadsorbowanej i zmierzono ich aktywności wiązania z hIL-5Ra, które, jak okazało się, są podobne (Fig. 10A). Gdy zmierzono aktywność ADCC, frakcja niezaadsorbowana wykazała silniejszą aktywność ADCC (100 do 1000 razy) niż aktywność części frakcji zaadsorbowanej (Fig. 10B). Ponadto uzyskano łańcuchy cukrowe traktowane PA z niezaadsorbowanej frakcji i z części frakcji zaadsorbowanej i przeprowadzono analizę HPLC z odwróconymi fazami stosując kolumnę CLC-ODS (firmy Shimadzu) (Fig. 11). We frakcji niezaadsorbowanej głównie obecne było przeciwciało wiążące łańcuchy cukrowe wolne od fukozy, a w części frakcji zaadsorbowanej obecne było głównie przeciwciało wiążące łańcuchy cukrowe z fukozą.
P r z y k ł a d 7
Ocena aktywności chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3 mającego różny udział łańcucha cukrowego wolnego od a-1,6-fukozy
1. Wytwarzanie przeciwciał chimerycznych przeciwko GD3 wykazujących różny udział łańcucha cukrowego wolnego od 1,6-fukozy
Sposobem opisanym w punkcie 2(1) Przykładu 1 otrzymano stransformowane klony pochodzące z komórek YB2/0, zdolne do produkcji chimerycznego przeciwciała przeciwko GD3. Przeciwciała wytworzono ze stransformowanych klonów pochodzących od komórki YB2/0 i oznaczono je jako partię 1, partię 2 i partię 3. Każdy łańcuch cukrowy, który jest związany z przeciwciałami chimerycznymi przeciwko GD3 partii 1, 2 i 3, przeanalizowano sposobem z Przykładu 11(6) i stwierdzono, że udziały łańcuchów cukrowych wolnych od 1,6-fukozy wynosiły odpowiednio 50%, 45% i 29%. Próbki te określono jako przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 (50%), przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 (45%) i przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 (29%).
Metodą według Przykładu 11(6) przeanalizowano łańcuchy cukrowe przeciwciała chimerycznego przeciwko GD3 pochodzącego z komórki CHO/DG44 wytworzonego jak w punkcie 2(2) Przykładu 1
PL 218 428 B1 i stwierdzono, że udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wynosił 7%. Próbkę określono jako przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 (7%).
Przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 (45%) i przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 (7%) zmieszano w stosunku 5:3 lub 1:7. Łańcuchy cukrowe próbek przeanalizowano zgodnie z metodą według Przykładu 10(6) i stwierdzono, że próbki miały udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy 24% i 13% (wartości obliczone). Określono je jako przeciwciało chimeryczne przeciwko GD3 (24%) i przeciwciało chimeryczne przeciw GD3 (13%).
Wyniki analizy łańcuchów cukrowych w każdej z próbek są przedstawione na Fig. 12. Udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy przedstawiono jako wartość średnią z wyników uzyskanych dla dwóch analiz łańcucha cukrowego.
2. Ocena aktywności wiązania z GD3 (ELISA)
Metodą ELISA przedstawioną w punkcie 3 Przykładu 1 zmierzono aktywności wiązania sześciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wytworzonych w punkcie 1 przykładu 7 z GD3 (Snow Brand Milk Products). W rezultacie wykazano, że wszystkie 6 rodzajów przeciwciał chimerycznych przeciwko GD3 ma prawie taką samą aktywność wiązania GD3, co przedstawiono na Fig. 13 i stwierdzono, że udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy nie ma wpływu na aktywność wiązania przeciwciała.
3. Ocena aktywności ADCC przeprowadzona na linii komórkowej ludzkiego czerniaka
Aktywność ADCC przeciwciał chimerycznych przeciwko GD3 przeprowadzonej na linii komórkowej ludzkiego czerniaka G-361 (ATCC CRL 1424) zmierzono w następujący sposób:
(1) Wytwarzanie zawiesiny komórek docelowych
Przygotowano 1 x 106 komórek linii komórkowej ludzkiego czerniaka G-361, dodano 3,7 MBq równoważnika radioaktywnej substancji Na251CrO4 i pozostawiono mieszaninę do przereagowania w 37°C przez 1 godzinę w celu oznakowania komórek radioizotopem. Po reakcji, komórki przepłukano trzy razy przez wytworzenie ich zawiesiny w pożywce i odwirowanie, ponownie zawieszono w pożywce i inkubowano w 4°C przez 30 minut w lodzie, aby wywołać spontaniczną dysocjację substancji ra5 dioaktywnej. Po odwirowaniu, gęstość komórek doprowadzono do wartości 2 x 105 komórek/ml dodatkiem 5 ml pożywki i zastosowano jako zawiesinę komórek docelowych.
(2) Przygotowanie zawiesiny komórki efektorowej ml porcję krwi obwodowej pobrano od osoby zdrowej i łagodnie zmieszano z 0,5 ml soli sodowej heparyny (Shimizu Pharmaceutical). Stosując Lymphoprep (AXIS SHIELD), odwirowano (800 g, 20 minut) zgodnie z instrukcją producenta, aby oddzielić warstwę komórek jednojądrzastych. Komórki przemyto trzykrotnie przez odwirowywanie (1200 obr./min., 5 minut) stosując pożywkę, a następnie ponownie zawieszono w pożywce, aby uzyskać gęstość 2 x 106 komórek/ml i zastosowano jako zawiesinę ludzkich komórek efektorowych.
(3) Pomiar aktywności ADCC
Zawiesinę docelowych komórek wytworzonych w (1) rozdzielono po 50 ąl (1 x 104 komórek /ml) do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki (Falcon). Następnie dodano 100 ąl zawiesiny ludzkich komórek efektorowych wytworzonej w (2) (2 x 105 komórek na studzienkę; stosunek ludzkich komórek efektorowych do komórek docelowych wyniósł 20:1). Dodano każde z chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 dodawano do niej, aby uzyskać końcowe stężenie 0,0005 do 5 ąl/ml, po czym prowadzono reakcję w 37°C przez 4 godziny. Po reakcji, płytkę odwirowywano i zmierzono w supernatancie
51 ilość Cr stosując licznik γ. Ilość spontanicznie dysocjującego Cr obliczano przez przeprowadzenie tej samej procedury przy użyciu samej pożywki zamiast zawiesiny ludzkich komórek efektorowych i roztworu przeciwciała i zmierzenia ilości 51Cr w supernatancie. Ilość całkowitego zdysocjowanego 51Cr obliczono przez przeprowadzenie tej samej procedury stosując taką samą pożywkę zamiast roztworu przeciwciała i 1 mol/l roztworu kwasu chlorowodorowego, zamiast zawiesiny ludzkich komórek efektorowych i mierząc ilość 51Cr w supernatancie. Aktywność cytotoksyczną (%) obliczono stosując równanie (II).
Na Figurach 14 i 15 pokazano wyniki pomiaru aktywności ADCC sześciu rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy w różnych stężeniach (0,0005 do 5 ąg/ml) stosując komórki efektorowe od dwóch zdrowych dawców A i B) odpowiednio. Jak przedstawiono na Fig. 14 i 15, aktywność ADCC chimerycznych przeciwciał przeciwko GD3 wykazywała tendencję do wzrostu proporcjonalnie do udziału łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy w każdym stężeniu przeciwciała. Aktywność ADCC zmniejsza się, gdy stężenie przeciwciała jest niskie. Przy stężeniu przeciwciała 0,05 ąg/ml, przeciwciało, w którym
PL 218 428 B1 udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wynosi 24%, 29%, 45% lub 50% wykazywało prawie tak samo silną aktywność ADCC, ale aktywność ADCC była niższa w przeciwciele (13%) lub (7%), w którym udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy jest niższy niż 20%. Wyniki te były takie same, gdy dawca komórki efektorowej był zmieniony.
P r z y k ł a d 8
Ocena aktywności chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4, mającego różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy:
1. Wytwarzanie komórek trwale produkujących chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4
Komórki zdolne do trwałej produkcji chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 przygotowano następująco, stosując tandemowy wektor ekspresyjny pKANTEX2160 dla chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 opisanego w WO 01/64754.
(1) Wytwarzanie komórki produkującej chimeryczne przeciwciało z zastosowaniem komórki YB2/0 szczurzego szpiczaka
Po wprowadzeniu 10 gg wektora ekspresyjnego pKANTEX2160 dla chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 do 4 x 106 komórek YB2/0 szczurzego szpiczaka (ATCC CRL 1662) przez elektroporację [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], komórki zawieszono w 40 ml Hybrydoma-SFM-FBS(5) [podłoże Hybrydoma-SFM (Invitrogen) obejmujące 5% FBS (PPA Laboratories)] i rozdzielono po 200 gl/studzienkę w 96-studzienkowej płytce (Sumitomo Bakelite). Po hodowaniu ich w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2, dodano G418, do stężenia 1 mg/ml, następnie hodowano przez 1 do 2 tygodni. Supernatanty hodowli odzyskano ze studzienek, w których zaobserwowano tworzenie się kolonii przez wzrost transformantów wykazujących oporność na G418 i w supernatantach testem ELISA, opisanym w punkcie 2 Przykładu 8, mierzono zdolność przeciwciała chimerycznego przeciwko CCR4 do wiązania antygenu.
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których w supernatantach z hodowli zaobserwowano produkcję chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4, w celu zwiększenia ilości produkowanego przeciwciała z zastosowaniem systemu amplifikacji genu DHFR, każdy z nich zawieszono w podłożu Hybrydoma-SFM-FBS (5) obejmującym 1 mg/ml G418 i 50 nM MTX inhibitora DHFR (pro5 dukowanego przez SIGMA), do gęstości 1 do 2 x 105 komórek/ml i zawiesinę rozdzielano po 1 ml do studzienek 24-studzienkowej płytki (Greiner). Po hodowaniu ich w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2, indukowano transformanty wykazujące oporność na 50 nM MTX. Aktywność wiązania antygenu przeciwciała chimerycznego przeciwko CCDR4 mierzono testem ELISA, opisanym w punkcie 2 Przykładu 8, w supernatantach hodowlanych w studzienkach, w których obserwowano wzrost transformantów.
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których w supernatantach z hodowli zaobserwowano produkcję chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4, stężenie MTX zostało zwiększone tą samą metodą i w końcu otrzymywano transformanty zdolne do wzrostu w pożywce HybrydomaSFM-FBS (5) obejmującej 200 nM MTX i produkujące w dużej ilości chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4. Otrzymany transformant przeprowadzono w pojedynczą kolonię komórkową (klonowanie) przez dwukrotne ograniczone rozcieńczanie, a otrzymane sklonowane linie nazwano KM2760#58-35-16. W tym przypadku, stosując metodę do określania produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy przedstawioną w Przykładzie 9, wyselekcjonowano linię komórkową produkującą stosunkowo niewielką ilość produktu transkrypcji i stosowano jako odpowiednią linię komórkową.
(2) Wytwarzanie komórki produkującej przeciwciało z zastosowaniem komórki CHO/DG44
Po wprowadzeniu 4 gg wektora ekspresyjnego pKANTEX2160 dla chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 do 1,6 x 106 komórek CHO/DG44 przez elektroporację [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], komórki zawieszono w 10 ml IMDM-dFBS(10) (podłoże IMDM produkowane przez Invitrogen) obejmującego 10% dFBS (Invitrogen) i 1 x stężenie dodatku HT (Invitrogen) i rozdzielono po 100 gl//studzienkę w 96-studzienkowej płytce (produkowanej przez Iwaki Glass). Po hodowaniu ich w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2 zmieniono pożywkę na IMDM-dFBS(10) (pożywka IMDM obejmująca 10% dializowanej FBS), następnie hodowano przez 1 do 2 tygodni. Supernatanty hodowlane odzyskiwano ze studzienek, w których zaobserwowano wzrost spowodowany tworzeniem się transformanta wykazującego wzrost niezależny od HT, a poziom ekspresji chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 w supernatancie mierzono testem ELISA opisanym w punkcie 2 Przykładu 8.
Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których zaobserwowano wytwarzanie chimerycznego przeciwciała anty-CCR4 w hodowlanych supernatantach, w celu zwiększenia wytwarzania przeciwciała, przy zastosowaniu układu amplifikacji genów DHFR, każdy z nich został zawieszony
PL 218 428 B1 5 w pożywce IMDM-dFBS(10) zawierającej 50 nM MTX do uzyskania gęstości 1 do 2 x 105 komórek/ml, po czym zawiesinę rozdzielono po 0,5 ml do studzienek w 24-studzienkowej płytce (Iwaki Glass). Po hodowaniu ich w 37°C przez 1 do 2 tygodni w inkubatorze zawierającym 5% CO2, zaindukowano transformanty wykazujące oporność wobec 50 nM MTX. Odnośnie do transformantów w studzienkach, w których zaobserwowano wzrost, za pomocą tej samej metody zwiększono stężenie MTX do 200 nM i w końcu uzyskano transformanta zdolnego do wzrostu w pożywce IMDM-dFBS(10) zawierającej 200 nM MTX i wytwarzającej w dużych ilościach chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4. Otrzymanego transformanta nazwano 5-03. W tym przypadku, przy zastosowaniu metody oznaczania produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy, przedstawionej w Przykładzie 9, wyselekcjonowano linię komórek wytwarzających stosunkowo niewielkie ilości produktu transkrypcji i zastosowano jako odpowiednią linię komórkową.
2. Zdolność przeciwciał do wiązania z częścią peptydu CCR4 (ELISA)
Związek 1 (Sek. Nr ID: 25) został wybrany jako peptyd zewnątrzkomórkowego regionu ludzkiego CCR4 zdolny do reagowania z chimerycznym przeciwciałem przeciwko CCR4. W celu zastosowania go do pomiaru aktywności metodą ELISA, wytworzono koniugat z BSA (albuminą surowicy bydlęcej) (Nacalai Tesque) z zastosowaniem poniższej metody, a następnie użyto go jako antygenu. To znaczy, 100 ml roztworu DMSO zawierającego 25 mg/ml SMCC [N-hydroksysukcynoimidowy ester kwasu 4-(N-maleimidometylo)-cykloheksano-1-karboksylowego] (produkowany przez Sigma) wkroplono do 900 ml roztworu PBS zawierającego 10 mg BSA podczas mieszania stosując mieszalnik (vorteks), a następnie delikatnie mieszano przez 30 minut. 1 ml porcję roztworu reakcyjnego naniesiono na kolumnę do filtracji żelowej, taką jak kolumna NAP-10 lub podobna, zrównoważoną 25 ml PBS, a następnie wyeluowano 1,5 ml PBS, a uzyskany eluat zastosowano jako roztwór BSA-SMCC (stężenie BSA obliczono na podstawie pomiaru A280). Następnie, do 0,5 mg Związku 1 dodano 250 ml PBS, po czym całkowicie go rozpuszczono przez dodanie 250 ml DMF i do tego dodano roztwór BSASMCC podczas mieszania w mieszalniku typu vortex, po czym delikatnie mieszano przez 3 godziny. Roztwór reakcyjny dializowano względem PBS w temperaturze 4°C przez noc, po czym dodano do niego azydek sodu do uzyskania końcowego stężenia 0,05%, po czym mieszaninę filtrowano przez filtr 0,22 mm, celem zastosowania jako roztwór związek 1-BSA.
Wytworzony koniugat rozdzielono przy 0,05 ąg/ml i objętości 50 ąl/studzienkę do 96-studzienkowej płytki EIA (wyprodukowanej przez Greiner) i inkubowano, aby przez noc uzyskać adhezję w 4°C. Po przepłukaniu każdej studzienki PBS, dodano 1% BSA-PBS w objętości 100 ąl/studzienkę i pozostawiono do przereagowania w temperaturze pokojowej, aby zablokować pozostałe grupy aktywne. Po przepłukaniu każdej studzienki PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (zwanym tu dalej „Tween-PBS”), dodano supernatant z hodowli transformantu w objętości 50 ąl/studzienkę i pozostawiono do przereagowania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po reakcji każdą studzienkę przepłukano Tween-PBS, a następnie jako drugorzędowe przeciwciało dodano roztwór znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu IgG(Y) (przez American Qualex) 6000 razy rozcieńczonego w 1% BSA-PBS, w objętości po 50 ąl na studzienkę i pozostawiono do przereagowania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po reakcji, a następnie przepłukaniu za pomocą Tween-PBS, w celu uzyskania zabarwienia dodano roztwór substratu ABTS po 50 ąl na studzienkę, a 20 minut później zatrzymano reakcję przez dodanie po 50 ąl na studzienkę 5% roztworu SDS. Następnie, zmierzono absorpcję przy OD415. Chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 otrzymane w punkcie 1 Przykładu 8 wykazało aktywność wiązania z CCR4.
3. Oczyszczanie chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 (1) Hodowanie komórki produkującej przeciwciało pochodzącej z komórki YB2/0 i oczyszczanie przeciwciała
Uzyskany w punkcie 1(1) Przykładu 8 klon transformowanej komórki KM2760 # 58-35-16 wyrażający chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 zawieszono w pożywce Hybridoma-SFM (przez
Invitrogen) zawierającej 200 nM MTX i 5% Daigo GF21 (Wako Pure Chemical Industries), do uzyska5 nia gęstości 2 x 105 komórek/ml i poddano wstrząsanej hodowli okresowej z zasilaniem przy zastosowaniu butelki obrotowej (Iwaki Glass) w komorze o stałej temperaturze 37°C. Po hodowli trwającej 8 do 10 dni, chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 oczyszczono z odzyskanego supernatantu z hodowli przez Millipore) i filtrację żelową. Oczyszczone chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 nazwano KM2760-1.
(2) Hodowanie komórki wytwarzającej przeciwciało pochodzącej z komórki CHO-DG44 i oczyszczanie przeciwciała
PL 218 428 B1
Uzyskaną w punkcie 1(2) Przykładu 8 transformowaną linię komórkową 5-03 produkującą chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 hodowano w temperaturze 37°C w inkubatorze zawierającym 2
5% CO2 z zastosowaniem pożywki IMDM-dFBS(10) w 182 cm2 płaskiej butelce (Greiner). Po kilku dniach, gdy gęstość komórek osiągnęła konfluencję, supernatant hodowli został usunięty, a komórki przepłukano 25 ml buforu PBS, po czym zmieszano z 35 ml pożywki EXCELL 301 (wytwarzanej przez JHR). Po hodowaniu ich w 37°C przez 7 dni w inkubatorze zawierającym 5% CO2 odzyskano supernatant z hodowli. Chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 oczyszczono z supernatantu hodowli przy zastosowaniu kolumny Prosep-A (Millipore) zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczone chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 nazwano KM3060.
Aktywności wiązania przeciwciał KM2760-1 i KM3060 z CCR4, zmierzone metodą ELISA były takie same.
4. Analiza oczyszczonych chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4
Każde (4 ąg) z dwóch rodzajów chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 uzyskanych w punkcie 1 tego Przykładu, wytworzonych i oczyszczonych z różnych komórek zwierzęcych, poddano elektroforezie SDS-PAGE zgodnie ze znaną metodą [Nature, 227, 680 (1970)] i oznaczono ich ciężar cząsteczkowy i stopień oczyszczenia. Dla każdego z oczyszczonych chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4, stwierdzono w warunkach nieredukujących pojedynczy prążek odpowiadający ciężarowi cząsteczkowemu 150 Kd, a w warunkach redukujących stwierdzono dwa prążki o około 50 Kd i 25 Kd. Ciężary cząsteczkowe prawie całkowicie odpowiadały ciężarom cząsteczkowym wydedukowanym na podstawie nukleotydowej sekwencji cDNA łańcuchów H i L przeciwciała (łańcuch H: około 49 Kd, łańcuch L: około 23 Kd, cała cząsteczka: około 144 Kd) i były zgodne z doniesieniami stwierdzającymi, że przeciwciało typu IgG ma ciężar cząsteczkowy około 150 Kd w warunkach nieredukujących, i jest degradowane do łańcucha H mającego ciężar cząsteczkowy około 50 Kd i łańcucha L mającego ciężar cząsteczkowy około 25 Kd w warunkach redukujących spowodowany przez odcięcie wiązania S-S w cząsteczce [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Rozdział 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)], co tym samym potwierdza że oczyszczone chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 zostało wyrażone i oczyszczone jako cząsteczka przeciwciała mająca prawidłową strukturę.
5. Wytworzenie chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 mającego różny udział łańcuchów cukrowych bez a-1,6-fukozy.
Łańcuchy cukrowe, które są związane z chimerycznym przeciwciałem przeciwko CCR4 KM2760-1 pochodzącym z komórki YB2/0 wytworzonym jak w punkcie 3(1) Przykładu 8 i z chimerycznym przeciwciałem przeciwko CCR4 KM3060 pochodzącym z komórki CHO/DG44, wytworzonym jak w punkcie 3(2) Przykładu 8, przeanalizowano zgodnie z metodą przedstawioną w Przykładzie 10(6). Udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wynosił 87% i 8%, odpowiednio w KM2760 i KM3060. Próbki określane są dalej jako chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (87%) i chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (8%).
Chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (87%) i chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (8%) 1 : 39, 16 : 67, 22 : 57, 32 : 47 lub 42 : 37. Łańcuchy cukrowe tych próbek przebadano zgodnie z metodą opisaną w Przykładzie 10(6). Udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wynosił odpowiednio 9%, 18%, 27%, 39% i 46%. Próbki oznaczono tu, jako chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (9%), chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (18%), chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (27%), chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (39%) i chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 (46%).
Wyniki analizy łańcucha cukrowego z każdej próbki są pokazane na Fig. 16. Udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy przedstawiono jako wartość średnią wyników z dwóch analiz łańcucha cukrowego.
6. Ocena aktywności wiązania z częściowym peptydem CCR4 (ELISA)
Aktywność wiązania sześciu rodzajów różnych chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 mających różny łańcuch cukrowy wolny od a-1,6-fukozy, wytworzonych w punkcie 5 Przykładu 8, z częściowym peptydem CCR4, zmierzono zgodnie z metodą opisaną w punkcie 2 Przykładu 8.
W rezultacie, jak przedstawiono na Fig. 17, sześć rodzajów różnych chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 wykazywało niemal jednakową aktywność wiązania z CCR4, co świadczy, że udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy nie ma wpływu na aktywność wiązania antygenu przez przeciwciało.
PL 218 428 B1
7. Ocena aktywności ADCC na ludzkiej linii komórkowej o wysokiej ekspresji CCR4
Aktywność ADCC chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 ludzkiej komórce CCR4/ELL-4 (WO 01/64754) o wysokiej ekspresji CCR4 zmierzono w sposób opisany poniżej.
(1) Wytworzenie zawiesiny komórek docelowych
Wytworzono komórki (1,5 x 106) należące do linii ludzkich komórek wyrażających CCR4, CCR4/EL-4, opisane w WO 01/64754 i dodano do nich ekwiwalent 5,55 MBq radioaktywnej substancji
Na251CrO4, a potem prowadzono reakcję w 37°C przez 1,5 godziny, w celu znakowania komórek radioizotopem. Po przeprowadzeniu reakcji, komórki trzykrotnie przepłukano przez zawieszenie w pożywce, a następnie wirowanie, ponowne zawieszenie w pożywce i inkubację w 4°C przez 30 minut w lodzie w celu spowodowania spontanicznej dysocjacji substancji radioaktywnej. Po odwirowaniu, do 5 komórek dodano 7,5 ml pożywki do uzyskania gęstości 2 x 105 komórek/ml i stosowano jako zawiesinę komórek docelowych.
(2) Wytwarzanie zawiesiny ludzkich komórek efektorowych
Od zdrowej osoby pobrano 60 ml krwi obwodowej, dodano do niej 0,6 ml soli sodowej heparyny (Shimizu Pharmaceutical), a następnie delikatnie mieszano. Mieszaninę odwirowano (800 g, 20 minut) celem wyizolowania warstwy komórek jednojądrzastych przy zastosowaniu Lymphoprep (AXIS SHIELD) zgodnie z instrukcją producenta. Komórki trzykrotnie przepłukano pożywką i odwirowano (1400 obr./min., 5 minut), a następnie ponownie zawieszono w pożywce do gęstości 5 x 106 komórek/ml i stosowano jako zawiesinę ludzkich komórek efektorowych.
(3) Pomiar aktywności ADCC
Zawiesinę komórek docelowych wytworzoną w (1) odmierzono po 50 μl (1 x 104 komórek/studzienkę) do każdej studzienki z 96-studzienkowej płytki o kształcie U (Falcon). Następnie, do5 dano do nich po 100 μl zawiesiny ludzkich komórek efektorowych wytworzonej w punkcie (2) (5 x 10 komórek/studzienkę, stosunek ludzkich komórek efektorowych do komórek docelowych wynosił 50:1. Ponadto, każde z chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 dodano w takiej ilości, aby otrzymać końcowe stężenie 0,0001 do 10 μg/ml, a następnie prowadzono reakcję w temperaturze 37°C przez godziny. Po reakcji płytkę odwirowano, a w supernatancie zmierzono ilość Cr stosując licznik γ.
Ilość spontanicznie dysocjującego 51Cr obliczono przez przeprowadzenie tej samej procedury z zastosowaniem samej pożywki zamiast zawiesiny ludzkich komórek efektorowych i roztworu przeciwciała
51 i zmierzenie ilości 51Cr w supernatancie. Ilość całkowitego zdysocjowanego 51Cr obliczono przez przeprowadzenie tej samej procedury z użyciem 1 mol/l roztworu kwasu chlorowodorowego zamiast roz51 tworu przeciwciała i zawiesiny ludzkich komórek efektorowych i zmierzenia ilości 51Cr w supernatancie. Aktywność ADCC (%) obliczono w oparciu o równanie (II).
Figury 18 i 19 pokazują wyniki pomiaru aktywności ADCC chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 mających różny udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy w różnych stężeniach (0,001 do 10 μg/ml) z zastosowaniem komórek efektorowych od dwóch zdrowych dawców (A i B), odpowiednio. Jak pokazano na Fig. 18 i 19, aktywność ADCC chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 wykazała tendencję do wzrostu proporcjonalnie łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy przy każdym stężeniu przeciwciała. Aktywność ADCC zmniejsza się, gdy stężenie przeciwciała jest niskie. Przy stężeniu przeciwciała 0,01 μg/ml, przeciwciało, w którym łańcuchy cukrowe wolne od 1,6-fukozy stanowiły 27%, 39% lub 46% wykazywało niemal taką samą silną aktywność ADCC, ale aktywność ADCC była niska dla przeciwciała, w którym poziom łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy, był mniejszy niż 20%. Wyniki były takie same jak w przypadku, gdy zmieniono dawcę komórek efektorowych.
P r z y k ł a d 9
Oznaczanie produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy w linii komórek gospodarza:
(1) Wytworzenie jednoniciowego cDNA z różnych linii komórkowych
Próbki jednoniciowego cDNA wytworzono z komórek CHO/DG44 z wydeletowanym genem reduktazy dihydrofolianowej (dhfr) pochodzących z jajnika chomika chińskiego i z komórek szpiczaka YB2/0 szczura według poniższej procedury.
Komórki CHO/DG44 zawieszono w pożywce IMDM (Life Technologies) uzupełnionej 10% roztworem płodowej surowicy wołowej (wytwarzanej przez Life Technologies) i suplementem HT (Life
Technologies) o stężeniu 1 x, następnie 15 ml zawiesiny komórkowej zainokulowano do adhezyjnej 5 hodowli komórkowej w kolbie T75 (Greiner) przy gęstości 2 x 105 komórek/ml. Również komórki YB2/0 zawieszono w pożywce 1640 RPMI (Life Technologies) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies) i 4 mmol/l L-GLN (Life Technologies), i 15 ml zawiesiny zainokulowano kolbę T75
PL 218 428 B1 5 do hodowli zawiesiny komórkowej (Greiner) przy gęstości 2 x 105 komórek/ml. Komórki hodowano w 37°C w inkubatorze z 5% CO2, i 1 x 107 odpowiednich komórek gospodarza odzyskiwano 1-szego, 2-giego, 3-ciego, 4-tego i 5-tego dnia hodowli, aby wyizolować całkowity RNA stosując zestaw RNAeasy (QIAGEN) zgodnie z instrukcją producenta.
Całkowity RNA rozpuszczono w 45 ąl sterylnej wody, dodano 1 ąl RQ1 DNazy wolnej od RNazy (Promega), 5 ąl załączonego 10 x buforu DNazy i 0,5 ąl inhibitora rybonukleazy RNAsin (Promega), a następnie prowadzono reakcję w 37°C przez 30 minut w celu rozłożenia genomowego DNA zanieczyszczającego próbkę. Po reakcji, całkowity RNA oczyszczono ponownie przy użyciu RNAzy (QIAGEN) i rozpuszczono w 50 ąl sterylnej wody.
W 20 ąl mieszaniny reakcyjnej, z użyciem oligo(dT) jako startera, zsyntetyzowano jednoniciowy cDNA z 3 ąg z każdej z otrzymanych próbek całkowitego RNA przez reakcję odwrotnej transkrypcji stosując SuperScript® Preamplification System for First Strand cDNA SUPERSCRIPT™ (Life Technologies), zgodnie z instrukcją producenta. Do klonowania a-1,6-fukozylotransferazy (określanej dalej jako „FUT8”) i β-aktyny pochodzącej z odpowiednich komórek, zastosowano jednokrotnie zatężony roztwór reakcyjny, a do określenia poziomu transkrypcji każdego genu przez kompetytywny PCR stosowano 50-krotnie rozcieńczony roztwór wodny mieszaniny reakcyjnej i, roztwory przechowywano w temperaturze -80°C aż do użycia.
(2) Przygotowanie częściowych fragmentów cDNA FUT8 chińskiego chomika i FUT8 szczura
Częściowe fragmenty cDNA FUTB chińskiego chomika i FUT8 szczura zostały przygotowane według następującej procedury (Fig. 20).
Po pierwsze, zaprojektowano startery (pokazane w SEK. ID. NR: 4 i 5) specyficzne dla nukleotydowej sekwencji typowej dla ludzkiego cDNA FUTB [J. Biochem., 121, 626 (1997)] i z świńskiego cDNA FUT8 [J. Biol. Chem., 271, 27810 (1995)].
Następnie, przygotowano 25 ąl roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTPs i 0,5 ąmol/l genowo specyficznych starterów (SEK. ID. NR: 4 i 5)] zawierającego 1 ąl cDNA wytworzonego z komórki CHO i cDNA wytworzonego z komórki YB2/0, obu otrzymanych jak w punkcie (1) 2 dni po hodowli, przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) przy zastosowaniu polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo). PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 1 minutę, następnie przez 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 2 minuty jako jeden cykl i końcowe ogrzewanie 72°C przez 10 minut.
Po PCR, roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i konkretny powielony fragment o wielkości 979 bp oczyszczono przy użyciu zestawu GENECLEAN Spin Kit (BIO 101) i przepłukano 10 ąl sterylnej wody (dalej tę metodę stosowano do oczyszczania fragmentów DNA z żelu agarozowego). 4 ąl powielonego fragmentu włączono do plazmidu pCR2.1 zgodnie z instrukcją producenta TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), a następnie XL1-Blue E. coli została stransformowana roztworem reakcyjnym zgodnie z metodą Cohena i in. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] (dalej tę metodę stosowano do transformacji E. coli). Próbki DNA plazmidu wyizolowano zgodnie ze znaną metodą [Nucleic Acid Research, 7, 1513 (1979)] (dalej metodę tę stosowano do izolacji plazmidów) z wstawek cDNA 6 klonów spośród otrzymanych kolonii opornych na kanamycynę.
Sekwencja nukleotydowa każdego cDNA włączonego do plazmidu została określona przy użyciu DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) i terminatora cyklicznego sekwencjonowania BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer) zgodnie z metodą według instrukcji producenta. Potwierdzono, że wszystkie z wstawionych cDNA, których sekwencje zostały określone powyższą metodą, kodowały otwarte ramki odczytu (ORF) częściowych sekwencji FUT8 chomika chińskiego lub FUT8 szczura (pokazane w SEK. ID. NR: 6 i 7). Spośród nich, wyselekcjonowano próbki DNA plazmidowego niezawierające absolutnie żadnych błędów odczytu w sekwencjach przez PCR. Plazmidy te będą określone jako CHFUT8-pCR2.1 i YBFUT8-pCR2.1.
(3) Przygotowania cDNA β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura cDNA β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura przygotowano według następującej procedury (Fig. 21).
Najpierw zaprojektowano starter przedni specyficzny dla typowej sekwencji zawierającej kodon inicjacji translacji (pokazana na SEK. ID. NR: 8) i startery wsteczne specyficzne dla odpowiednich sekwencji zawierających kodon terminacji translacji (pokazane w SEK. ID. NR: 9 i 10), z sekwencji genomowej β-aktyny chomika chińskiego (GenBank, U20114) i z sekwencji genomowej β-aktyny szczura [Nucleic Acids Research, 11, 1759 (1983)].
PL 218 428 B1
Następnie, przygotowano 25 gl roztworu reakcyjnego [bufor KOD #1 (Toyobo), 0,2 mmol/l dNTPs, 1 mmol/l MgCl2, 0,4 gmol/l genowo-specyficznych starterów (SEK. ID. NR: 8 i 9 lub SEK. ID. NR: 8 i 10) i 5% DMSO] zawierającego po 1 gl cDNA wytworzonego z komórki CHO i cDNA wytworzonego z komórki YB2/0, obu otrzymanych jak w punkcie (1) 2 dni po hodowli, a PCR przeprowadzono stosując polimerazę DNA KOD (Toyobo). PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 1 minutę, następnie 25 cykli ogrzewania w 98°C przez 15 sekund, 65°C przez 2 sekundy i 74°C przez 30 sekund jako jeden cykl.
Po PCR roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i oczyszczono specyficzny powielony fragment o wielkości 1128 bp. Ten fragment DNA poddano fosforylacji na 5'-końcu przy użyciu MEGALABEL (Takara Shuzo) zgodnie z instrukcją producenta. Fragment DNA wyizolowano z roztworu reakcyjnego stosując metodę wytrącania etanolem i rozpuszczono w 10 gl sterylnej wody.
Odrębnie, 3 gg plazmidu pBluescrit II KS (+) (Stratagene) rozpuszczono w 35 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs) i dodano 16 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRV (Takara Shuzo), żeby przeprowadzić reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Do roztworu reakcyjnego dodano 35 gl 1 mol/l buforu Tris-HCl (pH 8,0) i 3,5 gl alkalicznej fosfatazy pochodzącej z E. Coli C15 (Takara Shuzo), a następnie prowadzono reakcję w 65°C przez 30 minut, żeby zdefosforylować koniec DNA. Roztwór reakcyjny wyekstrahowano fenolem/chloroformem, następnie wytrącono etanolem, a uzyskany fragment DNA rozpuszczono w 100 gl sterylnej wody.
Każde 4 gl powielonego fragmentu wytworzonego z cDNA chomika chińskiego lub powielonego fragmentu z cDNA szczura (1192 bp.) zmieszano z 1 gl fragmentu EcoRV-EcoRV (około 3 Kb) wytworzonego z plazmidu pBluescript II KS(+) i 5 gl Ligation High (Toyobo) do reakcji ligacji w 16°C przez 30 minut. Stosując roztwór reakcyjny stransformowano E. coli XL1-Blue, a próbki DNA plazmidowego odpowiednio wyizolowano zgodnie ze znaną metodą z otrzymanych klonów opornych na ampicylinę.
Sekwencję nukleotydową każdego cDNA włączonego do plazmidu zsekwencjonowano przy użyciu DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) i terminatora cyklicznego sekwencjonowania BigDye FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer) zgodnie z metodą według instrukcji producenta. Potwierdzono, że wszystkie włączone cDNA z każdej sekwencji określone wyżej opisaną metodą, kodowały otwarte ramki odczytu (ORF) pełnych sekwencji β-aktyny chińskiego chomika i β-aktyny szczura. Spośród nich zostały wybrane na podstawie PCR próbki DNA plazmidowego niezawierające absolutnie żadnych błędów odczytu zasad w sekwencjach przez PCR. Plazmidy te nazwano CHAc-pBS i YBAc-pBS.
(4) Wytwarzanie standardu i wewnętrznej kontroli FUT8
W celu zmierzenia poziomu transkrypcji mRNA genu FUT8 w każdej komórce, CHFT8-pCR2.1 lub YBFT8-pCR2.1 jako plazmidy, w których częściowe fragmenty cDNA wytworzone jak w punkcie (2) z FUT8 chińskiego chomika lub FUT8 szczura zostały włączone do pCR2.1, odpowiednio, trawiono enzymem restrykcyjnym EcoRl, a otrzymane liniowe DNA zostały użyte jako standardy do przygotowania krzywej kalibracyjnej. CHFT8d-pCR2.1 i YBFT8d-pCR2.1, które otrzymano z CHFT8-pCR2.1 i YBFT8-pCR2.1 przez wydeletowanie 203 bp między Scal i HindIII, wewnętrznej sekwencji nukleotydowej w FUT8 chomika chińskiego i FUT8 szczura, odpowiednio, trawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI, a otrzymane liniowe DNA zostały użyte jako wewnętrzne standardy do określania ilości FUT8. Szczegóły są opisane poniżej.
Standardy FUT8 chomika chińskiego i FUT8 szczura wytworzono w następujący sposób. W 40 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs) rozpuszczono 2 gg plazmidu CHFT8-pCR2.1, dodano 24 jednostki enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo), następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Oddzielnie, 2 gg plazmidu YBFT8-pCR2.1 rozpuszczono w 40 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodano 24 jednostki enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo) i prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Przez poddanie porcji każdego z roztworów reakcyjnych elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym, potwierdzono, że fragment EcoRlEcoRI (około 1 Kb) zawierający każdy z częściowych fragmentów cDNA FUT8 chińskiego chomika i FUT8 szczura został wyizolowany z plazmidów CHFT8-pCR2.1 i YBFT8-pCR2.1 przez reakcję trawienia enzymami restrykcyjnymi. Do każdego z roztworów reakcyjnych dodano 1 gg/ml roztworu t-RNA drożdży piekarskich (SIGMA), aby uzyskać stężenie 0,02 fg/gl, 0,2 fg/gl, 1 fg/gl, 2 fg/gl, 10 fg/gl, 20 fg/gl, 100 fg/gl i zastosowano je jako standardy FUT8 chomika chińskiego i FUT8 szczura.
Wewnętrzne standardy FUT8 chomika chińskiego i FUT8 szczura wytworzono następująco (Fig. 22). Wytworzono roztwór reakcyjny [bufor KOD #1 (Toyobo), 0,2 mmol/l dNTPs, 1 mmol/l MgCl2, 0,4 gmol/l genowo-specyficznych starterów (SEK. ID. NR: 11 i 12) i 5% DMSO] zawierający 5 ng
PL 218 428 B1
CHFT8-pCR2.1 lub YBFT8-pCR2.1 i przeprowadzono PCR stosując polimerazę DNA KOD (Toyobo). PCR przeprowadzono ogrzewając w 94°C przez 4 minuty, następnie 25 cykli ogrzewania w 98°C przez 15 sekund, 65°C przez 2 sekundy i 74°C przez 30 sekund jako jeden cykl. Po PCR, roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i oczyszczono ściśle określony powielony fragment o wielkości 4,7 bp. DNA ufosforylowano na końcu-5' stosując MEGALABEL (Takara Shuzo) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie fragment DNA wyizolowano z roztworu reakcyjnego przez wytrącanie etanolem i rozpuszczono w 50 ąl sterylnej wody. Uzyskany fragment DNA (5 ąl, około 4,7 Kb) i 5 ąl Ligation High (Toybo) zmieszano, po czym prowadzono reakcję auto-cyklizacji w 16°C przez 30 minut.
Stosując roztwór reakcyjny stransformowano E. coli DH5a i z otrzymanych klonów odpornych na ampicylinę wyizolowano próbki DNA plazmidowego zgodnie ze znaną metodą. Sekwencję nukleotydową każdego DNA plazmidowego oznaczono przy użyciu DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) i terminatora cyklicznego sekwencjonowania BigDye FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer) i potwierdzono, że został wydeletowany wewnętrzny fragment sekwencji nukleotydowej między Scal i HindIlI FUT8 chomika chińskiego i FUT8 szczura. Otrzymane plazmidy są nazywane jako CHFT8d-pCR2.1 i YBFT8d-pCR2.1, odpowiednio.
Następnie, 2 ąg plazmidu CHFT8d-pCR2.1 rozpuszczono w 40 ąl buforu NEBuffer (New England Biolabs), dodano 24 jednostki enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo), po czym prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Oddzielnie, 2 ąg plazmidu YBFT8d-pCR2.1 rozpuszczono w 40 ąl buforu NEBuffer (New England Biolabs), dodano 24 jednostki enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo), po czym prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Przez poddanie porcji każdego z roztworów reakcyjnych elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym, potwierdzono, że fragment EcoRI-EcoRI (około 800 bp) zawierający fragment, z którego wydeletowano 203 bp z wewnętrznych sekwencji nukleotydowych częściowych fragmentów FUT8 chomika chińskiego lub FUT8 szczura, został wyizolowany z plazmidów CHFT8d-pCR2.1 lub YBFT8d-pCR2.1 przez reakcje trawienia enzymem restrykcyjnym. Z roztworów reakcyjnych wytworzono rozcieńczenia 2 fg/ąl przy użyciu 1 ąg/ml drożdży piekarskich (SIGMA) i użyto ich jako wewnętrznych kontroli FUT8 chomika chińskiego i FUT8 szczura.
(5) Wytwarzanie standardu i wewnętrznej kontroli β-aktyny
W celu zmierzenia poziomu transkrypcji mRNA genu β-aktyny w różnych komórkach gospodarza, użyto CHAc-pBS i YBAc-pBS, jako plazmidów, w których pełnej długości ORF cDNA β-aktyny chomika chińskiego i cDNA β-aktyny szczura wytworzone jak w punkcie (3) wstawiono do pBluescript II KS (+), odpowiednio, były trawione enzymami restrykcyjnymi HindIII i PstI i enzymami restrykcyjnymi HindIII i KpnI, odpowiednio, a liniowe DNA po trawieniu były stosowane jako standardy do wytworzenia krzywej kalibracyjnej. CHAcd-pBS i YBAcd-pBS, które otrzymano z CHAc-pBS i YBAc-pBS przez wydeletowanie odcinka 180 bp między Dralll i Dralll wewnętrznej sekwencji nukleotydowej β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura, trawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Pstl i enzymami restrykcyjnymi HindIII i Kpnl, odpowiednio, a strawione liniowe DNA zastosowano jako wewnętrzne standardy do określania ilości β-aktyny. Szczegóły opisano poniżej.
Standardy β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura zostały wytworzone w następujący sposób. W 40 ąl buforu NEBuffer (New England Biolabs) rozpuszczono 2 ąg plazmidu CHAc-pBS, dodano 25 jednostek enzymu restrykcyjnego HindlII (Takara Shuzo) i 20 jednostek PstI (Takara Shuzo), a następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Oddzielnie, 2 ąg plazmidu YBAc-pBS rozpuszczono w 40 ąl buforu NEBuffer (New England Biolabs), dodano 25 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (Takara Shuzo) i 20 jednostek PstI (Takara Shuzo) i prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Porcję każdej z mieszanin reakcyjnych poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i potwierdzono, że fragment Hindlll-PstI i fragment HindIII-Kpnl (około 1,2 Kb) zawierające ORF pełnej długości każdego z cDNA β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura, zostały wydzielone z plazmidów SHAc-pBSi YBAc-pBS przez reakcje trawienia enzymami restrykcyjnymi. Każdy z roztworów reakcyjnych rozcieńczono 1 ąg/ml t-RNA drożdży piekarskich (SIGMA), aby uzyskać stężenia 2 pg/ąl, 1 pg/ąl, 200 fg/ąl, 100 fg/ąl i 20 fg/ąl i stosowano jako standardy β-aktyny chomika chińskiego i/lub β-aktyny szczura.
Wewnętrzne standardy β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura zostały wytworzone następująco (Fig. 23). W 100 ąl buforu NEBuffer 3 (New England Biolabs) zawierającego 100 ng/ąl BSA (New England Biolabs), rozpuszczono 2 ąg CHAc-pBS i dodano 10 jednostek enzymu restrykcyjnego DraIII (New England Biolabs), a następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny.
PL 218 428 B1
Fragmenty DNA odzyskano z roztworu reakcyjnego przez wytrącanie etanolem, a końce DNA zmieniono w „tępe” końce stosując DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) zgodnie z instrukcją producenta, a następnie roztwór reakcyjny podzielono na dwie równe części. Po pierwsze, do jednej części roztworu reakcyjnego dodano 35 ąl 1 mol/l buforu Tris-HCl (pH 8,0) i 3,5 ąl alkalicznej fosfatazy pochodzącej z E. coli C15 (Takara Shuzo), a następnie prowadzono reakcję defosforylacji końców DNA w 65°C przez 30 minut. Fragment DNA po defosforylacji odzyskano przez ekstrakcję fenolem//chloroformem i precypitację etanolem, a następnie rozpuszczono go w 10 ąl sterylnej wody. Pozostałą część roztworu reakcyjnego poddano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym, żeby oczyścić fragment DNA o wielkości około 1,1 Kb zawierający częściowy fragment ORF β-aktyny chomika chińskiego.
Zmieszano zdefosforylowany fragment DraIII-DraIII (4,5 ąl), 4,5 ąl fragmentu DraIII-DraIII o wielkości około 1,1 Kb i 5 ąl Ligation High (Toyobo) i prowadzono ligację w 16°C przez 30 minut. Stosując roztwór reakcyjny transformowano E. coli DH5a i znaną metodą izolowano DNA plazmidów z otrzymanych klonów opornych na ampicylinę. Sekwencję nukleotydową każdego plazmidowego DNA określono stosując Sequencer 377 (Parkin Elmer) i terminator cyklicznego sekwencjonowania BigDye FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer) i potwierdzono, że został usunięty fragment DraIII-DraIII o wielkości 180 bp β-aktyny chomika chińskiego włączony do plazmidu. Otrzymany plazmid został nazwany CHAcd-pBS. Stosując te same etapy jak w przypadku CHAcd-pBS, wytworzono także plazmid, w którym fragment DraIII-DraIII o wielkości około 180 bp β-aktyny szczura został usunięty. Plazmid ten nazwano YBAcd-pBS.
Następnie, 2 ąg plazmidu CHAcd-pBS rozpuszczono w 40 ąl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodano 25 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (Takara Shuzo) i 20 jednostek PstI (Takara Shuzo) i prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Oddzielnie, 2 ąg plazmidu YBAcd-pBS rozpuszczono w 40 ąl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodano 25 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (Takara Shuzo) i 24 jednostki Kpnl (Takara Shuzo) i prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 3 godziny. Porcja każdego z roztworów reakcyjnych została poddana elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i potwierdzono, że przez trawienie enzymami restrykcyjnymi wyizolowano z plazmidów CHAcd-pBS i YBAcd-pBS fragment HindIII-PstI i fragment HindIII-KpnI (około 1,0 Kb) zawierający fragment, w którym usunięto 180 bp wewnętrznej sekwencji nukleotydowej ORF pełnej długości cDNA β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura. Wytworzono rozcieńczenia 200 fg/ąl z roztworów reakcyjnych stosując 1 ąg/ml t-RNA drożdży piekarskich (SIGMA) i użyto je jako wewnętrzne kontrole β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura.
(6) Określanie poziomu transkrypcji przez kompetycyjny PCR
Kompetycyjny PCR prowadzono używając DNA wytworzonego w punkcie (4) jako wewnętrznej kontroli FUT8 i cDNA pochodzącego z komórki gospodarza otrzymanego w punkcie (1) jako matryc, określona wielkość produktu transkrypcji genu FUT8 w linii komórek gospodarza została obliczona na podstawie względnych wielkości powielonego produktu pochodzącego z każdej matrycy. Z drugiej strony, ponieważ uważa się, że gen β-aktyny jest stale transkrybowany w każdej komórce i poziom jego transkrypcji jest w przybliżeniu taki sam w różnych komórkach, poziom transkrypcji genu β-aktyny został określony jako miara wydajności reakcji syntezy cDNA w każdej linii komórek gospodarza. To znaczy, PCR prowadzono stosując DNA kontroli wewnętrznej β-aktyny wytworzony jak w punkcie (5) i cDNA pochodzący z komórek gospodarza otrzymany jak w punkcie (1) jako matryce, a ilość produktu transkrypcji β-aktyny w linii komórek gospodarza obliczono ze względnej ilości powielonego produktu na każdej matrycy. Szczegóły opisano poniżej.
Produkt transkrypcji FUT8 określono w następującej procedurze. Najpierw, zaprojektowano zestaw starterów (pokazanych w SEK. ID NR: 13 i 14) specyficznych wobec często występujących wewnętrznych sekwencji częściowych sekwencji ORF FUT8 chomika chińskiego i FUT8 szczura, otrzymanych w punkcie (2).
Następnie, przeprowadzono PCR używając polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo) w 20 ąl całkowitej objętości roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTPs oraz 0,5 ąmol/l genowo-specyficznych starterów (SEK. ID. NR: 13 i 14) i 5% DMSO] zawierającego 5 ąl 50-krotnie rozcieńczonego roztworu cDNA wytworzonego z każdej odpowiedniej linii komórek gospodarza jak w punkcie (1) i 5 ąl (10 fg) plazmidu do kontroli wewnętrznej. PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 3 minuty i następnie 32 cykle ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, 60°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę jako jeden cykl.
Przeprowadzono również serię reakcji PCR, w których zamiast cDNA pochodzącego z linii komórek gospodarza dodano po 5 ąl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg i 1 pg) standardowego
PL 218 428 B1 plazmidu FUT8 otrzymanego w punkcie (4) i użyto ich do przygotowania krzywej kalibracyjnej dla poziomu transkrypcji FUT8.
Produkt transkrypcji β-aktyny określono w następującej procedurze. Po pierwsze, zaprojektowano dwa zestawy starterów specyficznych wobec genu wspólnych z wewnętrznymi sekwencjami ORF pełnej długości i β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura, otrzymanych w punkcie (3) (te pierwsze pokazane w SEK. ID. NR: 15 i 16, a drugie w SEK. ID. NR: 17 i 18).
Następnie, przeprowadzono PCR używając polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo) w 20 ąl całkowitej objętości roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTPs oraz 0,5 ąmol/l genowo specyficznych starterów (SEK. ID. NR: 15 i 16 lub SEK. ID. NR: 17 i 18) i 5% DMSO] zawierającego 5 ąl 50-krotnie rozcieńczonego roztworu cDNA wytworzonego z odpowiedniej linii komórek gospodarza jak w punkcie (1) i 5 ąl (1 pg) plazmidu jako kontroli wewnętrznej. PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 3 minuty i następnie 17 cykli ogrzewania w 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty jako jeden cykl.
Przeprowadzono również serię reakcji PCR, w których zamiast cDNA pochodzącego z każdej linii komórek gospodarza dodano po 5 ąl (10 pg, 5 pg, 1 pg, 500 fg i, 100 fg) standardowego plazmidu β-aktyny otrzymanego w punkcie (5) i użyto ich do wytworzenia krzywej kalibracyjnej poziomu transkrypcji β-aktyny.
Gen docelowy
T a b e l a 3
Zestaw starterów
Wielkość (bp) namnożonego produktu PCR
Docelowy Współzawod.
FUT8 F: 5'-GTCCATGGTGATCCTGCAGTGTGG-3'
R: 5'-CACCAATGATATCTCCAGGTTCC-3' β-aktyna F: 5'-GATATCGCTGCGCTCGTTGTCGAC-3'
R: 5'-CAGGAAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3' (Chiński chomik) β-aktyna F: 5'-GATATCGCTGCGCTCGTCGTCGAC-3'
R: 5'-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAGC-3' (Szczur)
638 431
789 609
789 609 *F: starter przedni, R: starter wsteczny
Przez przeprowadzenie reakcji PCR z zestawem starterów opisanym w Tabeli 3, fragment DNA o wielkości przedstawionej w kolumnie „Docelowy” w Tabeli 3 może być namnożony z każdego produktu transkrypcji genu i każdego standardu, a każdy fragment DNA o wielkości przedstawionej w kolumnie „Współzawod.” (Współzawodniczący) można powielić z każdej kontroli wewnętrznej.
Porcje o objętości 7 ąl każda roztworów po reakcji PCR zostały poddane elektroforezie na 1,75% żelu agarozowym, a następnie żel był barwiony przez moczenie go przez 30 minut w barwniku do żeli kwasów nukleinowych o stężeniu 1 x SYBR Green I (Molecular Probes). Ilość powielonego fragmentu DNA zmierzono przez obliczenie intensywności luminescencji każdego powielonego DNA za pomocą fIuoroimagera (FluoroImager SI; Molecular Dynamics).
Ilość powielonego produktu PCR ze standardowym plazmidem jako matrycą zmierzono tą metodą i przygotowano krzywą kalibracyjną, przez wykreślenie zmierzonych wartości w funkcji ilości standardowego plazmidu. Stosując krzywą kalibracyjną, obliczono ilość cDNA genu będącego przedmiotem zainteresowania w każdej linii komórkowej na podstawie ilości namnożonego produktu, gdy jako matrycy użyto cDNA pochodzącego z linii komórkowej z ekspresją i tę ilość określono jako poziom transkrypcji mRNA w każdej linii komórkowej.
Ilość produktu transkrypcji FUT8 w każdej linii komórkowej, gdy zastosowano sekwencję FUT8 szczura jako standard i kontrolę wewnętrzną, pokazano na Fig. 24. Przez cały okres hodowli linia koPL 218 428 B1 mórek CHO wykazywała poziom transkrypcji 10-krotny lub wyższy niż linia komórek YB2/0. Tę samą tendencję stwierdzono, gdy stosowano sekwencję FUT8 chomika chińskiego jako standard i kontrolę wewnętrzną.
Poziomy transkrypcji FUT8 są pokazane w Tabeli 4 jako wartości względne, wobec ilości produktu transkrypcji β-aktyny. Przez cały okres hodowli poziom transkrypcji FUT8 w linii komórek YB2/0 wynosił około 0,1% β-aktyny, podczas gdy w linii komórek CHO wynosił od 0,5% do 2%.
Uzyskane wyniki pokazują, że ilość produktu transkrypcji FUT8 w linii komórek YB2/0 była znacząco mniejsza od ilości w linii komórek CHO.
T a b e l a 4
Dni hodowli
Linia komórkowa 1-szy 2-gi 3-ci 4-ty 5-ty
CHO 1,95 0,90 0,57 0,52 0,54
YB2/0 0,12 0,11 0,14 0,08 0,07
P r z y k ł a d 10
Określanie produktu transkrypcji genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) w linii komórek produkujących chimeryczne przeciwciało przeciw gangliozydowi GD3 (1) Wytworzenie jednoniciowego cDNA z różnych linii komórek produkujących przeciwciała
Jednoniciowe cDNA wytworzono z linii komórek DCHl01-20 i 61-33 produkujących chimeryczne przeciwciało przeciw gangliozydowi GD3 w następujący sposób. DCHI01-20 jest klonem transformanta pochodzącego z komórki CHO/DG44 opisanej w punkcie 2(2) Przykładu 1. Także 61-33 jest klonem uzyskanym przez przeprowadzenie adaptacji w warunkach bez surowicy komórki 7-9-51 pochodzącej z transformacji komórki YB2/0 (FERM BP-3391, International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tskuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tskuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japonia)) i następnie przeprowadzenie izolacji pojedynczych komórek przez dwa ograniczone rozcieńczenia.
Komórki DCHI01-20 zawieszono w roztworze EXCELL 302 (JRH BIOSCIENCES), uzupełnionym 3 mmol/l L-GLN (Life Technologies), 0,3% PLURONIC F-68 (Life Technologies) i 0,5% koncentratem kwasu tłuszczowego (Life Technologies) i 15 ml zawiesiny umieszczono w płaskiej butelce T75 5 do zawiesinowej hodowli komórek (Greiner) przy gęstości 2 x 105 komórek/ml. Także komórki 61-33 zawieszono w pożywce Hybridoma-SFM (Life Technologies), uzupełnionej 0,2% frakcją V albuminy surowicy wołowej (Life Technologies) (dalej określaną jako „BSA”) i 15 ml zawiesiny umieszczono 5 w płaskiej butelce T75 do zawiesinowej hodowli komórek (Greiner) przy gęstości 2 x 105 komórek/ml. Hodowlę prowadzono w 37°C w inkubatorze z 5% CO2 i po 1, 2, 3, 4 i 5 dniach hodowli pobierano 1 x 107 odpowiednich komórek w celu ekstrakcji całkowitego RNA z użyciem RNAzy (QIAGEN) zgodnie z instrukcjami producenta.
Całkowity RNA rozpuszczono w 45 ąl sterylnej wody, dodano 1 ąl RQ1 DNAzy wolnej od RNAzy (Promega), 5 ąl załączonego 10 x buforu DNAzy i 0,5 ąl inhibitora rybonukleazy RNA (Promega), a następnie prowadzono reakcję w 37°C przez 30 minut w celu zdegradowania genomowego DNA zanieczyszczającego próbkę. Po reakcji, całkowity RNA oczyszczono ponownie stosując RNAAzy (QIAGEN) i rozpuszczono w 50 ąl sterylnej wody.
W 20 ąl mieszaniny reakcyjnej, stosując oligo(dT) jako starter, syntetyzowano jednoniciowy cDNA z 3 ąg z każdej z otrzymanych próbek całkowitego RNA przez reakcję odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem systemu preamplifikacji SUPERSCRIPT™ (Life Technologies) dla syntezy pierwszej nici cDNA, zgodnie z instrukcjami producenta. Roztwór reakcyjny rozcieńczono 50-krotnie wodą i przechowywano w temperaturze -80°C aż do użycia.
(2) Określenie poziomów transkrypcji każdego genu przez kompetycyjną PCR
Poziom transkrypcji każdego z genów na cDNA pochodzący z linii komórek produkujących przeciwciała otrzymany w punkcie (1) określono przez kompetycyjną PCR zgodnie z Przykładem 9(6).
Poziom transkrypcji mRNA pochodzącego z genu FUT8 w każdej linii komórkowej produkującej przeciwciała został określony według następującej procedury.
PL 218 428 B1
CHFT8-pCR2.1 i YFTB8-pCR2.1, jako plazmidy w których do pCR2.1 włączono częściowe fragmenty cDNA, wytworzone w Przykładzie 9(2), odpowiednio, z FUT8 chomika chińskiego i z FUT8 szczura, były trawione enzymem restrykcyjnym EcoRl, a otrzymane liniowe DNA zostały użyte jako standardy do przygotowania krzywej kalibracyjnej określającej poziom transkrypcji FUT8.
CHFT8d-pCR2.1 i YFTB8d-pCR2.1, które otrzymano przez delecję 203 bp między Scal i HindIII wewnętrznej sekwencji nukleotydowej, odpowiednio, chomika chińskiego i szczurzego FUT8 w Przykładzie 9(4) trawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI, a otrzymane linearne DNA zastosowano jako wewnętrzne standardy dla określenia ilości FUT8.
Przeprowadzono PCR używając polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo) w 20 ąl całkowitej objętości roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/I dNTP oraz 0,5 ąmol/l specyficznych wobec genu FUT8 starterów (SEK. ID. NR: 13 i 14) i 5% DMSO] zawierającego 5 ąl 50-krotnie rozcieńczonych roztworów cDNA wytworzonych z każdej linii komórek produkujących przeciwciała w punkcie (1) i 5 ąl (10 fg) plazmidu jako kontrolę wewnętrzną. PCR przeprowadzono ogrzewając w 94°C przez 3 minuty i następnie wykonując 32 cykle ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, 60°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę jako jeden cykl.
Przeprowadzono również serię reakcji PCR, w których zamiast cDNA z poszczególnych linii komórek produkujących przeciwciała, dodano po 5 ąl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg i 1 pg) standardowego plazmidu FUT8 i użyto ich do przygotowania krzywej kalibracyjnej dla poziomu transkrypcji FUT8. W tym przypadku, użyto 1 ąg/ml t-RNA drożdży piekarskich (SIGMA), aby otrzymać rozcieńczenia standardowego plazmidu.
Z drugiej strony, ponieważ uważa się, że gen β-aktyny jest stale transkrybowany w każdej komórce i poziom jego transkrypcji jest w przybliżeniu taki sam w różnych komórkach, poziom transkrypcji genu β-aktyny został określony jako wskaźnik wydajności reakcji syntezy cDNA w każdej linii komórek produkujących przeciwciała.
CHAc-pBS i YBAc-pBS, jako plazmidy zawierające pełnej długości ORF cDNA β-aktyny chomika chińskiego i cDNA β-aktyny szczura wytworzone w Przykładzie 9(3), wstawione do pBluescript II KS (+), odpowiednio, były trawione enzymami restrykcyjnymi HindIII i KpnI, a otrzymane liniowe DNA po trawieniu były użyte jako standardy do przygotowania krzywej kalibracyjnej określającej poziom transkrypcji β-aktyny.
CHAcd-pBS i YBAcd-pBS, które otrzymano przez wydeletowanie odcinka 180 bp. między DraIII i DraIII wewnętrznej sekwencji nukleotydowej β-aktyny chomika chińskiego i β-aktyny szczura, odpowiednio, w Przykładzie 9(5), trawiono enzymami restrykcyjnymi HindIll i KpnI, a strawionych liniowych DNA użyto jako wewnętrznych kontroli do określania ilości β-aktyny.
Przeprowadzono PCR stosując polimerazę DNA ExTaq (Takara Shuzo) w 20 ąl całkowitej objętości roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (wytwarzany przez Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTPs i 0,5 ąmol/l specyficznych dla β-aktyny starterów (SEK. ID. NR: 17 i 18) i 5% DMSO] zawierającego 5 ąl 50-krotnie rozcieńczonego roztworu cDNA wytworzonego z każdej linii komórek produkujących przeciwciała i 5 ąl (1 pg) plazmidu jako kontroli wewnętrznej. PCR wykonano ogrzewając w 94°C przez 3 minuty i następnie wykonując 17 cykli ogrzewania w 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Przeprowadzono również serię reakcji PCR, w których zamiast cDNA pochodzącego z każdej linii komórek produkujących przeciwciała dodano po 10 pg, 5 pg, 1 pg, 500 fg i 100 fg standardowego plazmidu β-aktyny i użyto do przygotowania krzywej kalibracyjnej poziomu transkrypcji β-aktyny. W tym przypadku, użyto 1 ąg/ml t-RNA drożdży piekarskich (SIGMA) do rozcieńczenia standardowego plazmidu.
Przez przeprowadzenie reakcji PCR z zestawem starterów opisanym w Tabeli 3, fragment DNA mający wielkość przedstawioną w kolumnie „Docelowy” w Tabeli 3 może być namnożony z każdego produktu transkrypcji genu i każdego standardu, a każdy fragment DNA mający wielkość pokazaną w kolumnie „Współzawod.” można powielić z każdej kontroli wewnętrznej.
Porcje 7 ąl każdego z roztworów po PCR poddano elektroforezie na 1,75% żelu agarozowym, a następnie żel barwiono przez moczenie przez 30 minut w barwniku do żeli kwasów nukleinowych o stężeniu 1 x SYBR Green I (Molecular Probes). Ilość namnożonego fragmentu DNA zmierzono przez obliczenie intensywności luminescencji każdego powielonego DNA stosując fluoroimager (FluoroImager SI; produkowany przez Molecular Dynamics).
Ilość powielonego produktu utworzonego przez PCR ze standardowym plazmidem jako matrycą została zmierzona tą metodą i przygotowano krzywą kalibracyjną, na której wykreślono zmierzone wartości w stosunku do ilości standardowego plazmidu. Stosując krzywą kalibracyjną, obliczono ilość
PL 218 428 B1 cDNA genu będącego przedmiotem zainteresowania w każdej linii komórkowej z ilości namnożonego produktu, gdy cDNA pochodzący z każdej z linii komórek produkujących przeciwciała był stosowany jako matryca, i wartość tę określono jako poziom transkrypcji mRNA w każdej linii komórek.
Poziomy transkrypcji FUT8 są przedstawione w Tabeli 5 jako wartości względne w stosunku do ilości produktu transkrypcji β-aktyny. Przez cały okres hodowli poziom transkrypcji FUT8 w linii komórek 61-33 produkujących przeciwciała, pochodzących z komórek YB2/0, wynosił około 0,3% lub mniej β-aktyny, podczas gdy w linii komórek produkujących przeciwciała, pochodzących od komórek CHO, wynosił od 0,7% do 1,5%.
Wyniki pokazują, że ilość produktu transkrypcji FUT8 w linii komórek produkujących przeciwciała, pochodzących z komórek YB2/0, była znacząco mniejsza niż w linii komórek produkujących przeciwciała, pochodzących z komórek CHO.
T a b e l a 5
Dni hodowli
Linia komórek 1-szy 2-gi 3-ci 4-ty 5-ty
DCHl01-20 0,75 0,73 0,99 1,31 1,36
61-33 0,16 0,19 0,24 0,30 <0,10
P r z y k ł a d 11
Przygotowanie linii komórek z nadekspresją genu mysiej a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) (1) Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego dla mysiej a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8)
Z 1 x 107 komórek NSO mysiego szpiczaka (RCB0213, Cell Bank AT The Institute of Physical and Chemical Research) hodowanych na pożywce IMDM (Life Technologies) zawierającej 10% płodowej surowicy wołowej (Life Technologies) wyekstrahowano całkowity RNA z użyciem RNAzy (QIAGEN) zgodnie z instrukcją producenta. Całkowity RNA rozpuszczono w 45 μl sterylnej wody i dodano 1 μl RQ1 DNAzy wolnej od RNAzy (Promega), 5 μl załączonego 10 x buforu DNazy i 0,5 μl inhibitora rybonukleazy RNA (Promega), a następnie prowadzono reakcję w 37°C przez 30 minut w celu zdegradowania genomowego DNA zanieczyszczającego próbkę. Po reakcji, całkowity RNA oczyszczono ponownie przy użyciu RNAzy (QIAGEN) i rozpuszczono w 50 μl sterylnej wody. W 20 μl mieszaniny reakcyjnej, używając oligo(dT) jako startera, zsyntetyzowano jednoniciowy cDNA z 3 μg uzyskanego całkowitego RNA przez reakcję odwrotnej transkrypcji stosując system preamplifikacji SUPERSCRIPT™ (Life Technologies) dla syntezy pierwszej nici cDNA, postępując według instrukcji producenta.
Wytworzono cDNA mysiego FUT8 według następującej procedury (Fig. 25).
Najpierw, zaprojektowano na podstawie sekwencji cDNA mysiego FUT8 (GenBank, AB025198) starter przedni specyficzny dla sekwencji zawierającej kodon inicjacji translacji (pokazany w SEK. ID. NR: 19) i starter wsteczny specyficzny dla sekwencji zawierającej kodon terminacji translacji (pokazany w SEK. ID. NR: 20).
Następnie, wytworzono 25 μl roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (wytwarzany przez Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTPs, 4% DMSO i 0,5 μmol/l specyficznych starterów (SEK. ID. NR: 19 i SEK. ID. NR: 20)] zawierającego 1 μl cDNA pochodzącego z komórek NS0 i przeprowadzono reakcję PCR używając polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo). PCR przeprowadzono ogrzewając w 94°C przez 1 minutę i kolejne 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 30 sekund, i po jednym cyklu w 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 2 minuty i końcowe ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.
Po PCR, roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym i oczyszczono specyficzny namnożony fragment o wielkości 1728 bp. W celu wprowadzenia go do plazmidu pCR2.1 użyto 4 μl fragmentu DNA, zgodnie z instrukcjami producenta załączonymi do TOPO Cloning Kit (Invitrogen), a następnie roztworem reakcyjnym transformowano E. coli DH5a. Plazmidowe DNA izolowano według znanej metody z 6 klonów z wstawionym cDNA spośród otrzymanych kolonii opornych na kanamycynę.
Sekwencja nukleotydowa każdego cDNA włączonego do plazmidu została określona przy użyciu DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) i terminatora cyklicznego sekwencjonowania BigDye FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer) zgodnie z metodą według instrukcji producenta. Zostało potwierdzo66
PL 218 428 B1 ne, że wszystkie z wstawionych cDNA, których sekwencje zostały określone, kodują pełną sekwencję ORF mysiego FUT8. Spośród nich wyselekcjonowano DNA plazmidowy niezawierający absolutnie żadnych błędów odczytu zasad w PCR w sekwencjach (jego sekwencja DNA i sekwencja aminokwasowa są pokazane w SEK. ID. NR: 2 i 24, odpowiednio). W badanej sekwencji, gdy porównano ją z sekwencją mysiego FUT8 zarejestrowaną w GenBanku, znaleziono również niezgodność 3 zasad spowodowaną substytucją aminokwasów. Dalej, plazmid ten określany jest jako mfFUT8-pCR2.1.
Następnie, skonstruowano plazmid pBSmfFUT8, zawierający pełną sekwencję ORF mysiego FUT8, w następujący sposób (Fig. 26). Najpierw, 1 gg plazmidu pBluescript II KS (+) (Stratagene) rozpuszczono w 35 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs) i dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo), następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Do roztworu reakcyjnego dodano 35 gl 1 mol/l buforu Tris-HCl (pH 8,0) i 3,5 gl alkalicznej fosfatazy pochodzącej z E. coli C15 (Takara Shuzo), a następnie prowadzono reakcję w 65°C przez 30 minut, w celu defosforylacji końców DNA. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem/chloroformem, następnie wytrącano etanolem, a otrzymany fragment DNA rozpuszczono w 10 gl sterylnej wody.
Oddzielnie, 1 gg plazmidu mfFUT8-pCR2.1 rozpuszczono w 35 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo), a następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym, w celu oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 1,7 Kb zawierającego pełną sekwencję ORF cDNA mysiego FUT8.
Zmieszano otrzymany fragment EcoRI-EcoRI (1 gl, 2,9 Kb) pochodzący z plazmidu pBluescript KS(+) zawierający, 4 gl fragmentu EcoRI-EcoRI (1,7 Kb) wytworzonego z plazmidu mfFUT8-pBR2.1 i 5 gl Ligation High (Toyobo) i prowadzono reakcję ligacji w 16°C przez 30 minut. Stosując roztwór reakcyjny stransformowano E. coli DH5a i wyizolowano DNA plazmidowe zgodnie ze znaną metodą z otrzymanych klonów opornych na ampicylinę. Dalej plazmid ten jest określany jako pBSmfFUT8.
Stosując pBSmfFUT8 i pAGE249 skonstruowano pAGEmfFUT8, mysi wektor ekspresyjny FUT8, według następującej procedury (Fig. 27). pAGE249 jest pochodną pAGE248 [J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)], w którym usunięto fragment SphI-SphI (2,7 Kb) zawierający jednostkę ekspresyjną genu reduktazy dihydrofolianowej (dhfr).
W 50 gl uniwersalnego Buforu H (Takara Shuzo) rozpuszczono 1 gg pAGE249, dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego SalI (New England Biolabs) i następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Z roztworu reakcyjnego odzyskano fragment DNA przez wytrącanie etanolem i rozpuszczono go w 35 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs) i dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego BamHI (New England Biolabs), a następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia do roztworu reakcyjnego dodano 35 gl 1 mol/l buforu Tris-HCl (pH 8,0) i 3,5 gl alkalicznej fosfatazy pochodzącej z E. coli C15 (Takara Shuzo), a następnie prowadzono reakcję w 65°C przez 30 minut, w celu defosforylacji końców DNA. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem/chloroformem, następnie wytrącano etanolem, a otrzymany fragment DNA rozpuszczono w 10 gl sterylnej wody.
Oddzielnie, 1 gg pBSmfFUT8 rozpuszczono w 50 gl uniwersalnego Buforu H (Takara Shuzo), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego Sall (New England Biolabs), a następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Z roztworu reakcyjnego odzyskano fragment DNA przez wytrącenie etanolem, rozpuszczono go w 35 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego BamHI (New England Biolabs), a następnie prowadzono reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia roztwór poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym w celu oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 1,7 Kb zawierającego pełną sekwencję ORF cDNA mysiego FUT8.
Zmieszano otrzymany z plazmidu pAGE249 fragment BamHl-SalI (1 gl, 6,5 Kb), 4 gl fragmentu BamHI-Sall (1,7 Kb) uzyskanego z plazmidu pBSmfFUT8 i 5 gl Ligation High (Toyobo), po czym przeprowadzono reakcję ligacji w temperaturze 16°C przez 30 minut. Za pomocą roztworu reakcyjnego stransformowano E. coli DH5a i z otrzymanych opornych na ampicilinę klonów wyizolowano plazmid DNA zgodnie ze znaną metodyką. Dalej plazmid określano jako pAGmfFUT8.
(2) Wytworzenie mysiej linii komórek wykazujących nadmierną ekspresję genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8)
Uzyskano stabilną linię komórek wykazujących ekspresję genu FUT8 przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego pAGEmfFUT8 dla mysiego genu FUT8 skonstruowanego jak w punkcie (1) do 61-33. 61-33 jest klonem otrzymanym przez przeprowadzenie, bez surowicy, adaptacji komórki transPL 218 428 B1 formanta 7-9-51 (FERM BP-6691, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) pochodzącej z komórki YB2/0 produkującej dużą ilość chimerycznego przeciwciała przeciw gangliozydowi GD3, a następnie przeprowadzenie izolacji pojedynczej komórki z wykorzystaniem dwukrotnego ograniczonego rozcieńczenia.
Plazmid pAGEmfFUT8 przeniesiono na 61-33 za pomocą następującej procedury opartej na elektroporacji [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Najpierw, rozpuszczono 30 ąg plazmidu pAGEmfFUT8 w 600 ąl buforu NEBuffer 4 (New England Biolabs), do którego dodano 100 jednostek enzymu restrykcyjnego FspI (New England Biolabs), reakcję trawienia prowadzono w 37°C przez dwie godziny celem uzyskania fragmentu liniowego. Roztwór reakcyjny poddano strącaniu etanolem, a odzyskany plazmid w formie liniowej rozcieńczono do stężenia 1 ąg/ąl w roztworze wodnym. Następnie, 61-33 zawieszono w buforze K-PBS (137 mol/l KCl, 2,7 mol/l NaCl, 8,1 mol/l Na2HPO4, 1,5 mol/l KH2PO4, 4,0 mol/l MgCl2) do gęstości komórek wynoszącej 2 x 107 komórek/ml, a 200 ąl zawiesiny komórkowej (4 x 106 komórek) zmieszano z 10 ąl (10 ąg) plazmidu liniowego. Mieszaninę komórek z DNA przenoszono do Gene Pulser Cuvette (odległość między elektrodami 2 mm) (BIO-RAD), a następnie przeprowadzono elektroporację za pomocą urządzenia do fuzjowania komórek Gene Pulser (BIO-RAD) przy napięciu impulsu 0,2 KV i pojemności elektrycznej - 250 ąF. Zawiesina komórek została zmieszana z 10 ml pożywki Hybridoma-SFM (Life Technologies) z dodatkiem 5% dializowanej surowicy bydlęcej (Life Technologies) oraz 0,2% BSA (wyprodukowanej przez Life Technologies), a następnie rozprowadzona w 100 ąl porcjach na 96-studzienkowej płytce dla zawiesin komórkowych (Greiner). Po trwającej 24 godziny w 37°C hodowli komórek w obecności 5% CO2, 50 ąl supernatantu hodowli usuwano, a pożywkę Hybrydoma-SFM (Life Technologies) uzupełnioną 0,5 mg/ml higromycyny B (Wako Pure Chemical Industries), 5% dializowaną surowicą bydlęcą (Life Technologies) oraz 0,2% BSA (Life Technologies) rozprowadzano w porcjach po 100 ąl. Komórki hodowano przez 3 tygodnie wymieniając pożywkę co 3 do 4 dni, ostatecznie uzyskując 14 komórkowych linii wykazujących oporność na higromycynę.
Oprócz tego przygotowano linię komórek stanowiącą kontrolę negatywną przez wprowadzenie plazmidu pAGE249 jako wektora rodzicielskiego plazmidu pAGEmfFUT8 do komórek 61-33. Zgodnie z powyższą procedurą 10 ąg plazmidu pAGE249, przekształconego za pomocą enzymu restrykcyjnego FspI do postaci plazmidu liniowego, wprowadzono przy wykorzystaniu elektroporacji do komórek 61-33 w liczbie 4 x 106. Komórki zmieszano z 15 ml pożywki Hybridoma-SFM (Life Technologies) z dodatkiem 5% dializowanej surowicy bydlęcej (Life Technologies) oraz 2% BSA (Life Technologies), przeniesiono do płaskiej butelki T75 stosowanej do zawiesin komórkowych (Greiner) i hodowano przez 24 godziny w 5% CO2.
Po hodowaniu komórek połowę supernatantu (7,5 ml) usunięto przez odwirowanie przy 800 obr.//min. przez 4 minuty i komórki zawieszono w 7,5 ml pożywki Hybridoma -SFM (Life Technologies) uzupełnionej 0,5 mg/ml higromycyny B (Wako Pure Chemical Industries), 5% płodową bydlęcą dializowaną surowicą (Life Technologies) i 0,2% BSA (Life Technologies) i przeniesiono do płaskiej butelki T75 w celu uzyskania zawiesiny komórkowej. Komórki hodowano przez 3 tygodnie wymieniając pożywkę co 3 do 4 dni uzyskując linię komórek opornych na higromycynę.
(3) Analiza poziomu ekspresji genu a-1,6-fukozylotransferazy w liniach komórek, w których zachodzi nadekspresja tego genu linii komórkowych ewentualnie wybranych spośród 14 mysich linii komórkowych wykazujących nadekspresję FUT-8 uzyskanych z 61-33 jak w punkcie (2) oraz linię komórek stanowiących kontrolę negatywną porównano pod względem poziomu ekspresji FUT-8 za pomocą metody kompetycyjnego RT-PCR.
Każdą spośród linii komórkowych wykazujących nadekspresję zawieszono w pożywce Hybridoma-SFM (Life Technologies) wzbogaconej 0,5 mg/ml Hygromycyny B (Wako Pure Chemical Industries), 5% dializowaną surowicą bydlęcą (Life Technologies) oraz 0,2% BSA (Life Technologies) ce5 lem uzyskania gęstości komórek wynoszącej 3 x 105/ml, a następnie przeniesiono do płaskiej butelki T75 stosowanej do hodowli komórek w zawiesinie (Greiner). Hodowano je w temperaturze 37°C przez 24 godziny w obecności 5% CO2, po czym 1 x 107 komórek nietraktowanych odzyskiwano celem ekstrakcji całkowitego RNA za pomocą RNAeasy (QIAGEN) zgodnie z instrukcją producenta. Całkowity RNA rozpuszczono w 45 ąl wody sterylizowanej, po czym do roztworu dodano 0,5 U/ąl RQ1, DNAzy pozbawionej RNAzy (Promega), 5 ąl dołączonego buforu 10 x DNAzay oraz 0,5 ąl inhibitora RNasin rybonukleazy (Promega), następnie przeprowadzono reakcję degradacji genomowego DNA zanie68
PL 218 428 B1 czyszczającego próbkę w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po reakcji, całkowity RNA oczyszczano ponownie za pomocą RNAeasy (QIAGEN) i rozpuszczono w 50 ąl sterylizowanej wody.
Posługując się oligo(dT) jako starterem w 20 ąl mieszaniny reakcyjnej zsyntetyzowano cDNA o pojedynczej nici z 2,5 ąg otrzymanego całkowitego RNA za pomocą reakcji odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem układu Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis SUPERSCRIPTTM (Life Technologies) zgodnie z instrukcją producenta. Roztwór reakcyjny rozcieńczono 50-krotnie wodą i oznaczono poziom transkrypcji każdego z genów przy zastosowaniu kompetycyjnego PCR zgodnie z Przykładem 9(6).
Poziom transkrypcji mRNA genu FUT8 w każdej spośród linii komórkowych określano za pomocą następującej procedury.
YBFT8-pCR2.1, jako plazmid, w którym częściowy fragment cDNA przygotowany jak w przykładzie 9(2) ze szczurzego FUT8 wstawiono do pCR2.1, strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI, a otrzymany liniowy DNA zastosowano jako standard przy wyznaczaniu krzywej kalibracji w celu określenia poziomu transkrypcji FUT8.
Spośród YBFT8-pCR2.1 przygotowanych w Przykładzie 9(4), YBFT8d-pCR2.1 otrzymany przez usunięcie 203 bp pomiędzy Scal i HindIII w wewnętrznej sekwencji nukleotydowej szczurzego FUT8, był strawiony enzymem restrykcyjnym EcoRI, a otrzymany linearny DNA zastosowano jako wewnętrzny standard dla oznaczenia FUT8.
Przeprowadzono reakcję PCR przy wykorzystaniu polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo) w całkowitej objętości 20 ąl roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTP, 0,5 ąmol/l specyficznych dla genu FUT8 starterów (numery SEK. ID. Nr: 13 i 14) oraz 5% DMSO) zawierającego 5 ąl 50-krotnie rozcieńczonego roztworu cDNA pochodzącego z odpowiedniej linii komórkowej, jak powyżej, oraz 5 ąl (10 fg) plazmidu dla kontroli wewnętrznej. Przeprowadzono reakcję PCR ogrzewając roztwór w temperaturze 94°C przez 3 minuty i kolejne 32 cykle ogrzewania w temperaturze 94°C przez 1 minutę oraz po jednym cyklu w 60°C przez 1 minutę oraz 72°C przez 1 minutę.
Przeprowadzono również PCR w serii reakcji, w których 5 ąl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg, lub 1 pg) standardowego plazmidu FUT8 dodawano zamiast cDNA pochodzącego z każdej z linii komórkowych z ekspresją i stosowano do wyznaczania krzywej kalibracji dla poziomu transkrypcji FUT8. W tym przypadku, do rozcieńczania plazmidu standardowego stosowano t-RNA drożdży piekarniczych w stężeniu 1 ąg/ml (SIGMA).
Z drugiej strony, skoro uważa się, że gen β-aktyny transkrybowany jest stale w każdej spośród linii komórkowych i jego poziom transkrypcji w przybliżeniu nie różni się pomiędzy komórkami, poziom transkrypcji genu β-aktyny określany jest jako wskaźnik wydajności reakcji syntezy cDNA w każdej, komórkowej linii ekspresyjnej.
YBAc-pBS, plazmid, w którym całkowitą sekwencję ORF cDNA dla szczurzej β-aktyny wstawiono do pBluescript II KS(+) przygotowanego jak w Przykładzie 9(3), strawiono za pomocą enzymów restrykcyjnych HindIII oraz Kpnl, a otrzymany liniowy fragment DNA zastosowano jako standard przy wyznaczaniu krzywej kalibracji celem określenia poziomu transkrypcji genu β-aktyny.
YBAcd-pBS uzyskany z YBAc-pBS przez delecję 180 bp pomiędzy Dral a Dral wewnętrznej sekwencji nukleotydowej szczurzej β-aktyny, strawiono za pomocą enzymów restrykcyjnych Hindlll oraz Kpnl, a otrzymany liniowy fragment DNA zastosowano jako wewnętrzny standard dla określenia ilości β-aktyny.
PCR przeprowadzono za pomocą polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo) w całkowitej objętości roztworu reakcyjnego wynoszącej 20 ąl [ExTaq (Takara Shuzo)], 0,2 mmol/l dNTP, 0,5 ąmol/l starterów specyficznych dla β-aktyny (SEK. ID. NR: 17 i 18 oraz 5% DMSO) zawierającego 5 ąl 50-krotnie rozcieńczonego roztworu cDNA uzyskanego z każdej spośród ekspresyjnych linii komórkowych oraz 5 ąl (1 pg) plazmidu dla celów kontroli wewnętrznej. PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 3 minuty, a następnie 17 cykli podgrzewania w 94°C przez 30 sekund, po jednym cyklu w temperaturze 60°C przez 1 minutę oraz w 72°C przez 2 minuty.
Przeprowadzono również serię reakcji PCR, w których stosowano standardowy plazmid β-aktyny w ilości 10 pg, 5 pg, 1 pg, 500 fg, lub 100 fg zamiast cDNA pochodzącego z każdej ekspresyjnej linii komórkowej i na tej podstawie sporządzono krzywą kalibracji poziomu transkrypcji β-aktyny. W celu rozcieńczenia plazmidu standardowego wykorzystano t-RNA drożdży piekarskich (SIGMA) w stężeniu 1 ąg/ml.
W wyniku przeprowadzenia PCR z wykorzystaniem zestawu starterów opisanych w Tabeli 3, można amplifikować fragment DNA o wielkości pokazanej w kolumnie „Docelowy” w Tabeli 3 z każdePL 218 428 B1 go spośród produktu transkrypcji genów i z każdego standardu, i fragment DNA o wielkości pokazanej w kolumnie „Współzawod . ” w Tabeli 3 może być zamplifikowany z każdej wewnętrznej kontroli.
Każdy roztwór (7 ąl) otrzymany w rezultacie reakcji PCR poddano elektroforezie w 1,75% żelu agarozowym, następnie żel barwiono przez płukanie przez 30 minut w jednokrotnym rozcieńczeniu barwnika SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (Molecular Probes). Ilość zamplifikowanego fragmentu DNA mierzono obliczając intensywność luminescencji każdej z amplifikowanych cząsteczek DNA za pomocą urządzenia fluoroimager (FluoroImager SI; Molecular Dynamics).
Tą metodą zmierzono ilość zamplifikowanego produktu uzyskanego w wyniku PCR przy wykorzystaniu jako matrycy standardowego plazmidu i sporządzono krzywą kalibracji wykreślając wartości zmierzone w funkcji ilości plazmidu stanowiącego standard. Wykorzystując krzywą kalibracji ilość cDNA badanego genu w każdej z linii komórkowych obliczano z ilości zamplifikowanego produktu, o ile jako matryc użyto cDNA pochodzący z każdej spośród ekspresyjnych linii komórkowych, a ilość określano jako poziom transkrypcji mRNA w każdej linii komórkowej.
Figura 28 przedstawia poziomy transkrypcji FUT8 jako wartości względne w stosunku do ilości produktu transkrypcji genu β-aktyny. Trzy linie komórkowe mfFUT8-1, mfFUT8-2 oraz mfFUT8-4, a także linia komórkowa z wstawionym pAEG249 wykazywały się stosunkowo niskim poziomem transkrypcji FUT8, równym 0,3 do 10% poziomu transkrypcji β-aktyny. Z drugiej strony, trzy pozostałe linie komórkowe mfFUT8-3, mfFUT8-6 oraz mfFUT8-7, wykazywały się stosunkowo wysokim poziomem transkrypcji FUT8, stanowiącym 20 do 40% poziomu transkrypcji β-aktyny.
(4) Oczyszczanie przeciwciała wytwarzanego przez linię komórkową wykazującą nadekspresję genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8)
Każdą spośród sześciu linii komórkowych wykazujących nadekspresję genu FUT8 oraz stanowiącą kontrolę negatywną jedną linię komórkową uzyskaną w punkcie (2) zawieszono w pożywce
Hybridoma-SFM (Life Technologies) wzbogaconej 200 nmol/l MTX, 0,5 mg/ml higromycyny B (Wako 5
Pure Chemical Industries) oraz 0,2% BSA (Life Technologies) celem osiągnięcia gęstości 2 x 105 komórek/ml, po czym 100 ml całkowitej zawiesiny przeniesiono do trzech płaskich butelek T225 stosowanych do zawiesinowej hodowli komórek (IWA KI) . Po przeprowadzeniu hodowli komórek w temperaturze 37°C trwającej od 7 do 9 dni w inkubatorze z 5% CO2, zliczano liczbę komórek nietraktowanych, celem potwierdzenia, że ich żywotność pozostała niemal taka sama (w każdej linii wynosiła 30% lub mniej), a następnie każdą zawiesinę komórkową odzyskano. Każdą spośród zawiesin komórek poddawano wirowaniu przy 3000 obr./min. w 4°C przez 10 minut, a odzyskany supernatant odwirowywano przy 10000 obr./min w 4°C przez 1 godzinę, po czym filtrowano za pomocą PES Filter Unit (NALGENE) o średnicy porów 0,22 ąm i pojemności 150 ml.
Złoże Prosep-A High Capacity (bioPROCESSING) umieszczano w kolumnie o średnicy 0,8 cm do grubości 2 cm i przemywano 10 ml 0,1 mol/l buforu cytrynianowego (pH 3,0) i 10 ml buforu 1 mol/l glicyny/NaOH-0,15 mol/l NaCl (pH 8,6) w tej kolejności, celem zrównoważenia nośnika. Następnie, po 100 ml supernatantu każdej hodowli przepuszczono przez kolumnę i przemywano buforem 1 mol/l glicyny/NaOH-0,15 mol/l NaCl w objętości 50 ml (pH 8,6). Po płukaniu przeciwciało związane do złoża Prosep-A eluowano za pomocą 2.5 ml buforu cytrynianowego 0,1 mol/l (pH 3,0), eluat rozdzielano po 500 ąl, a każdą frakcję neutralizowano przez zmieszanie ze 100 ąl Tris-HCl w stężeniu 2 mol/l (pH 8,5). Dwie frakcje zawierające przeciwciało w wysokim stężeniu (1,2 ml w całkowitej objętości) selekcjonowano za pomocą metody BCA [Anal. Biochem., 150, 76 {1985}], łączono i następnie dializowano do buforu cytrynianowego (pH 6,0) w stężeniu 10 mol/l w 4°C przez cały dzień i całą noc. Po przeprowadzeniu dializy roztwór przeciwciała odzyskiwano i poddawano jałowej filtracji za pomocą Millex GV o wielkości porów 0,22 ąm ^ILLIPORE).
(5) Cytotoksyczna aktywność (aktywność ADCC) in vitro przeciwciała wytworzonego przez linię mysich komórek wykazujących nadekspresję genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8).
Celem oznaczenia cytotoksycznej aktywności in vitro przeciwciał przeciwko GD3 oczyszczonych jak w punkcie (4), aktywność ADCC mierzono przy wykorzystaniu komórki GD3-dodatniej linii ludzkich komórek melanomy G-361 posiadających GDS (RCB0991, Cell Bank at The Institute of Physical and Chemical Research).
Komórki G-361 hodowane w pożywce RPMI1640 (Life Technologies) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (Life Technologies) (określanej dalej jako „RPMI1640-FBS(10)”) zawieszono w 500 ąl RPMI1640-FBS(10), z gęstością komórek 1 x 106 komórek, po czym dodawano 3,7 MBq
Na251CrO4, a następnie hodowano w 37°C przez 30 minut celem wyznakowania komórek radioizotopem. Po odwirowaniu przy 1200 obr./min. przez 5 minut, supernatant usuwano, a komórki docelowe
PL 218 428 B1 zawieszano w 5 ml RPMI1640-FBS(10). Etap płukania powtarzano 3-krotnie, a następnie zawiesina komórek była inkubowana przez 30 minut na lodzie celem spowodowania spontanicznej dysocjacji substancji radioaktywnej. Etap płukania był ponownie powtarzany dwukrotnie, po czym komórki za5 wieszano w 5 ml RPMI1640-FBS(10) uzyskując 2 x 105 komórek/ml docelowej zawiesiny komórek.
Od osoby zdrowej, pobrano 30 ml krwi obwodowej i delikatnie zmieszano z 0,5 ml sodowej soli heparyny (Shimizu Pharmaceutical), po czym zmieszano z 30 ml roztworu soli fizjologicznej (Otsuka Pharmaceutical). Po zmieszaniu, 10 ml mieszaniny ostrożnie nałożono na 4 ml preparatu Lymphoprep (NYCOMED PHARMA AS) i poddano wirowaniu w temperaturze pokojowej przy 2000 obr./min. przez 30 minut. Z probówek wirowniczych zebrano oddzielone frakcje komórek jednojądrzastych, zmieszano, a następnie zawieszono w 30 ml RPMI1640-FBS(10). Po odwirowaniu w temperaturze pokojowej przy 1200 obr./min. przez 5 minut, supernatant usunięto, a komórki zawieszono w 20 ml RPMI1640FBS(10). Etap płukania powtórzono dwukrotnie, po czym sporządzono zawiesinę komórek efektorowych w stężeniu 2 x 106 komórek/ml z wykorzystaniem RPMI1640-FBS(10).
Zawiesinę komórek docelowych rozdzielono po 50 ąl do każdej studzienki (1 x 104 komórek/studzienek) na 96-studzienkowej płytce mającej denka w kształcie U (Falcon). Następnie, zawiesi5 nę komórek efektorowych rozdzielono po 100 ąl do każdej studzienki (2 x 105 komórek/studzienkę), aby uzyskać stosunek komórek efektorowych do docelowych wynoszący 20:1. Następnie, przy wykorzystaniu 10 M buforu cytrynianowego (pH 6,0) sporządzono serię rozcieńczeń każdego przeciwciała przeciwko GD3 uzyskanego jak w punkcie (4) wynoszących 0,01 ąg/ml, 0,1 ąg/ml, 1 ąg/ml oraz 10 ąg/ml, po czym rozprowadzono je w objętości po 50 ąl do studzienek na płytce celem otrzymania końcowych rozcieńczeń wynoszących odpowiednio 0,0025 ąg/ml, 0,025 ąg/ml, 0,25 ąg/ml oraz 2,5 ąg/ml. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 4 godziny w obecności 5% CO2, płytkę poddano wirowaniu przy 1200 obr./min. przez 5 minut. 50 ąl supernatantu z każdej studzienki przeniesiono do probówki RIA o średnicy 12 mm (IWAKI) i dokonano pomiaru ilości zdysocjowanego 51Cr za pomocą licznika auto-gamma ΜΙΝΑΧ-γ 550 (PACKARD).
Wyliczono także ilość spontanicznie zdysocjowanego 51Cr przez przeprowadzenie tej samej reakcji w mieszaninie reakcyjnej, w której zamiast zawiesiny komórek efektorowych i roztworu przeciw51 ciał zastosowano 150 ąl RPMI1640-FBS(10). Ilość całkowicie zdysocjowanego 51Cr obliczono przeprowadzając tę samą reakcję w mieszaninie reakcyjnej, w której dodano 100 ąl 1N kwasu chlorowodorowego i 50 ąl RPMI1640-FBS(10) zamiast zawiesiny komórek efektorowych i roztworu przeciwciała za pomocą tych wartości obliczono aktywność ADCC na podstawie wzoru (II) opisanego w punkcie 2(3) Przykładu 2.
Fig. 29 przedstawia aktywność ADCC każdego z przeciwciał przeciwko GD3 względem komórek G-361. Trzy linie komórek mfFUT8-1, mfFUT8-2 oraz mfFUT8-4 wykazujące niski poziom ekspresji FUT8, jak przedstawiono to na Figurze 28, wykazywały potencjalną aktywność ADCC równą aktywności dla linii komórkowej stanowiącej kontrolę negatywną, do której wstawiono pAGE249. Z drugiej strony, pozostałe trzy linie komórkowe mfFUT8-3, mfFUT8-6 oraz mfFUT8-7 wykazujące wysoki poziom ekspresji FUT8, jak pokazano na Figurze 28, miały niską aktywność ADCC, równą aktywności przeciwciała przeciwko GD3 wytworzonego przez komórkę CHO. Na podstawie tych wyników wykazano, że aktywność ADCC produkowanych przeciwciał można kontrolować przez regulację poziomu ekspresji FUT8 w komórkach gospodarza.
(6) Analiza łańcucha cukrowego przeciwciała wytworzonego przez mysie komórki linii wykazującej nadekspresję a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8)
Poddano analizie łańcuchy cukrowe oczyszczone jak w punkcie (4) przeciwciał przeciwko GD3. Łańcuchy cukrowe związane z przeciwciałami produkowanymi przez linie komórkowe, do których wprowadzono mfFUT8-6 i pAGE249, odcięto od białek przez poddanie przeciwciał hydrazynolizie [Method of Enzymology, 83, 263 (1982)]. Po usunięciu hydrazyny przez odparowanie pod obniżonym ciśnieniem, przeprowadzono N-acetylację przez dodanie wodnego roztworu octanu amonu i bezwodnika octowego. Po przeprowadzeniu liofilizacji wykonano znakowanie fluorescencyjne z wykorzystaniem 2-aminopirydyny [J. Biochem., 95, 197 (1984)]. Wyznakowana fluorescencyjnie grupa łańcucha cukrowego (traktowana PA grupa łańcucha cukrowego) została oddzielona od nadmiaru reagentów za pomocą kolumny Superdex Peptide HR 10/30 (Pharmacia). Frakcje łańcuchów cukrowych wysuszono za pomocą zagęszczarki wirówkowej i zastosowano, jako oczyszczoną, traktowaną PA grupę łańcucha cukrowego. Następnie, oczyszczona, traktowana PA grupa łańcucha cukrowego została poddana analizie za pomocą HPLC z odwróconymi fazami z wykorzystaniem kolumny CLC-ODS (Schimadzu) (Fig. 30). Zawartość łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy w mfFUT8-6 wynosiła 10%
PL 218 428 B1 w przypadku obliczania na podstawie obszaru piku, zaś zawartość łańcuchów cukrowych związanych z α-1,6-fukozą wynosiła 90%. Zawartość łańcuchów cukrowych wolnych od α-1,6-fukozy w pAGE249 wynosiła 20%, zaś zawartość łańcuchów cukrowych związanych z a-1,6-fukozą wynosiła 80%. Opierając się na tych wynikach stwierdzono, że zawartość łańcuchów cukrowych związanych z a-1,6-fukozą w wytwarzanym przeciwciele wzrasta w rezultacie nadekspresji genu FUT8.
Fig. 30 przedstawia wzory elucji uzyskane po przeprowadzeniu analizy HPLC z odwróconymi fazami każdego z traktowanych PA łańcuchów cukrowych otrzymanych z przeciwciał wytwarzanych przez linie komórkowe z wprowadzonym mfFUT8-6 i pAGE249. Fig. 30A oraz 30B przedstawiają wzory elucji odpowiednio dla mfFUT8-6 oraz pAGE249. Względna intensywność fIuorescencji i czas elucji są podawane odpowiednio na osi rzędnych i odciętych. Przy zastosowaniu buforu opartego na fosforanie sodu (pH 3,8), jako buforu A oraz buforu na fosforanie sodu (pH 3,8) + 0,5% 1-butanolu, jako buforu B, przeprowadzono analizę w następującym gradiencie (poniżej).
Czas (minuty) 0 80 90 90,1 120
Bufor B (%) 0 60 60 0 0
Piki (i) do (ix) pokazane na Fig. 30 i Fig. 31 odpowiadają związkom o następujących strukturach.
PL 218 428 B1 (νί)
Gd β 1 ~4GcNAc β l”2Man ff ί,
CłcMAcjS l-™2Nfaial
Fuc£¥l^
V 6 ” Man$ l-4GlcNAc$1 —4GcNAc_PA
Z (vii)
GcNAc3l-2fkbrial
FucO?
Mm# I-OćNAc β l-4QcNAc-PA
Gal β 1 -MGlcNAc β i-2Nfena T
Fucflfl.
Mii) GaliHacNAc^i-atoOfl
Mm# 1 “MG<NAc$ 1 ”4QcNAc“PA
Gal#l -~4QcNAc# 1—2MariQfl· (lx)
GkNAc#l“2Mnal
Fuedf
GcNAc β 1—4 1 —431cNAc β 1 —4GłcNAe-PA z
QcNAc#l-~2Mnar
GlcNAc, Gal, Man, Fuc oraz PA oznaczają odpowiednio N-acetyloglukozoaminę, galaktozę, mannozę, fukozę i grupę pirydyloaminową. Na Fig. 30 i 31 udział grupy łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wyliczono z powierzchni zajmowanej przez piki od (i) do (iv) spośród (i) do (ix), zaś udział grupy łańcuchów cukrowych związanych z a-1,6-fukozą wyliczono z powierzchni zajmowanej przez piki od (v) do (ix) spośród (i) do (ix).
P r z y k ł a d 12
Przygotowanie genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) komórek CHO:
(1) Uzyskanie sekwencji cDNA a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) komórek CHO
Z cDNA o pojedynczej nici uzyskanego z komórek CHO/DG44 drugiego dnia hodowli jak w Przykładzie 9(1), otrzymano cDNA dla FUT8 chomika chińskiego przy wykorzystaniu poniższej procedury (Fig. 32).
Najpierw wykorzystując mysią sekwencję cDNA dla FUT8 (GenBank, AB025198) zaprojektowano przedni starter specyficzny dla 5'-końcowego regionu nie podlegającego translacji (przedstawionego w SEK. ID. NR: 21) oraz starter wsteczny specyficzny dla niepodlegającego translacji regionu 3'-końcowego (przedstawionego w SEK. ID. NR: 22).
PL 218 428 B1
Następnie sporządzono 25 μl roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTP, 4% DMSO oraz 0,5 μmol/l specyficznych starterów (SEK. ID. NR: 21 i 22)] zawierającego 1 μl cDNA pochodzącego z komórki CHO/DG44, przeprowadzono reakcję PCR z wykorzystaniem polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo). Reakcja PCR przeprowadzana była w temperaturze 94°C przez 1 minutę, po czym następowało 30 cykli ogrzewania w temperaturze 94°C przez 30 sekund, po jednym cyklu w temperaturze 55°C przez 30 sekund i w 72°C przez 2 minuty, w końcu w 72°C przez 10 minut.
Po zakończeniu PCR roztwór reakcyjny poddano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym i oczyszczono zamplifikowany fragment o wielkości około 2 Kb. Fragment tego DNA wstawiono do plazmidu pCR2.1 zgodnie z instrukcją załączoną do zestawu TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), wykorzystując do tego celu 4 μl DNA, po czym roztworem reakcyjnym transformowano E. coli DH5a. Zgodnie z zasadami znanej metodyki plazmidowy DNA wyizolowano z 8 klonów posiadających wstawkę cDNA wybranych spośród otrzymanych kolonii opornych na kanamycynę.
Sekwencję nukleotydową każdej z cząsteczek cDNA wstawionych do plazmidu określano za pomocą sekwencjonera DNA Sequencer 377 (Perkin Elmer) i zestawu BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) zgodnie z metodyką zawartą w instrukcji producenta. Potwierdziło to, że wszystkie wstawione cząsteczki cDNA zawierają pełną sekwencję otwartej ramki odczytu genu FUT8 z komórek CHO. Spośród nich wybrano plazmidowy DNA niezawierający absolutnie żadnego błędu w sekwencji nukleotydów powstałego podczas reakcji PCR. Tutaj plazmid ten oznaczono jako CHfFUT8-pCR2.1. Określoną sekwencję nukleotydową oraz odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową cDNA genu CHO FUT8 przedstawiono odpowiednio w nr SEK. ID. Nr: 1 oraz 23.
(2) Otrzymywanie genomowej sekwencji a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) komórek CHO
Dzięki wykorzystaniu jako sondy - fragmentu cDNA pełnej długości otwartej ramki odczytu (ORF) FUT8 komórek CHO uzyskanego w punkcie (1), otrzymano genomowy klon FUT8 komórek CHO zgodnie ze znaną metodą przeszukiwania genomowego opisaną np. w Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, A Laboratory Manual, Second Edition (1989). Następnie, po strawieniu otrzymanego klonu genomowego za pomocą różnych enzymów restrykcyjnych, przeprowadzono hybrydyzację typu Southern przy wykorzystaniu fragmentu AfaI-Sau3AI (około 280 bp) zawierającego kodon zapoczątkowujący cDNA FUT8 komórek CHO, jako sondy, a następnie spośród fragmentów powstałych w wyniku działania enzymów restrykcyjnych wykazujących reakcję pozytywną - wybrano fragment Xbal-XbaI (około 2,5 Kb) oraz fragment SacI-SacI (około 6,5 Kb) i wstawiono do pBluescript II KS(+) (Stratagen).
Sekwencję nukleotydową każdego z uzyskanych fragmentów genomowych określano za pomocą sekwencjonera DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) i przy wykorzystaniu zestawu BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) zgodnie z metodyką zawartą w instrukcji producenta. Potwierdzono zatem, że fragment Xbal-Xbal zawiera sekwencję intronu w kierunku 3' o wielkości około 2,5 Kb, w której obecny jest egzon 2 genu FUT8 komórek CHO, zaś fragment SacISacI zawiera sekwencję intronu w kierunku 5' o wielkości około 6,5 Kb, w której obecny jest egzon 2 genu FUT komórek CHO. Plazmid zawierający fragment XbaI-Xbal oznaczono jako pFUT8fgE2-2, zaś plazmid zawierający fragment SacI-SacI oznaczono jako pFUT8fgE2-4. Określoną sekwencję nukleotydową (około 9,0 Kb) genomowego regionu zawierającego egzon 2 genu FUT8 komórek CHO przedstawionej w SEK. ID. NR: 3.
P r z y k ł a d 13
Otrzymywanie komórki CHO, w której gen transferazy a-1,6-fukozy został zniszczony i wytwarzanie przeciwciał przy zastosowaniu tej komórki:
Przygotowano komórkę CHO, w której genomowy region zawierający egzon 2 genu a-1,6-fukozylotransferazy wydeletowano, a następnie określono aktywność ADCC przeciwciała wytwarzanego przez tę komórkę.
1. Konstruowanie plazmidu wektorowego pKOFUT8Puro dla egzonu 2 a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) chomika chińskiego.
(1) Konstruowanie plazmidu plcpxPPuro
Plazmid ploxPPuro skonstruowano w sposób następujący (Fig. 33).
W 35 μl buforu NEBuffer 4 (New England Biolabs) rozpuszczono 1,0 μg plazmidu pKOSelectPuro (Lexicon), po czym dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego AscI (New England Biolabs), reakcja trawienia w temperaturze 37°C trwała 2 godziny. Po jej przeprowadzeniu, roztwór poddano
PL 218 428 B1 elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o ciężarze około 1,5 Kb zawierającego jednostkę ekspresyjną genu oporności na puromycynę.
W 35 ąl buforu NEBuffer 4 (New England Biolabs) rozpuszczono 1,0 ąg plazmidu ploxP, opisanego w japońskie przebadane opublikowane zgłoszenie patentowe Nr 314512/99, po czym do roztworu dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego AscI (New England Biolabs) umożliwiając zajście reakcji trawienia w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia roztwór poddano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 2,0 Kb.
Zmieszano otrzymany z plazmidu pKOSelectPuro fragment AscI-AscI (4,5 ąl, około 1,5 Kb), 0,5 ąl fragmentu AscI-AscI (około 2,0 Kb) uzyskanego z plazmidu ploxP oraz 5,0 ąl Ligation High (Toyobo), po czym przeprowadzono reakcję ligacji w temperaturze 16°C przez 30 minut. Przy wykorzystaniu roztworu reakcyjnego stransformowano E. coli DH5a, po czym, zgodnie ze znaną techniką, wyizolowano plazmid DNA z otrzymanych klonów opornych na ampicilinę. Plazmid oznaczono tutaj jako ploxPPuro.
(2) Konstruowanie plazmidu pKOFUT8gE2-1
Plazmid pKOFUT8gE2-1 skonstruowano według poniższej procedury (Fig. 34) z wykorzystaniem plazmidu pFUT8fgE2-2 uzyskanego w Przykładzie 12(2) posiadającego genomowy region zawierający egzon 2 FUT8 chomika chińskiego.
2,0 ąg plazmidu pFUT8fgE2-2 rozpuszczono w 35 ąl NEBuffer 1 (New England Biolabs), po czym dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego SacI (New England Biolabs), reakcję trawienia przeprowadzono w 37°C przez 2 godziny. Fragment DNA odzyskano z roztworu reakcyjnego przez precypitację etanolem i rozpuszczono w 35 ąl NEBuffer 2 (New England Biolabs) zawierającego 100 ąg/ml BSA (New England Biolabs), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRV (New England Biolabs), reakcję trawienia przeprowadzono w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia, roztwór poddano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 1,5 Kb.
Osobno, 1,0 ąg plazmidu LITMUS28 (New England Biolabs) rozpuszczono w 35 ąl NEBuffer 1 (New England Biolabs) zawierającego 100 ąg/ml BSA (New England Biolabs), po czym dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego SacI (New England Biolabs), reakcję trawienia przeprowadzano w 37°C przez 2 godziny. Za pomocą precypitacji etanolem z roztworu reakcyjnego odzyskano fragment DNA, który następnie rozpuszczono w 35 ąl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs) zawierającego 100 ąg/ml BSA (New England Biolabs), po czym dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRV (New England Biolabs), reakcję trawienia przeprowadzano w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia roztwór poddano elektroforezie w 0.8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 2,8 Kb.
Zmieszano otrzymany fragment EcoRV-SacI (4,5 ąl, około 1,5 Kb) uzyskany z plazmidu pFUT8fgE2-2, 0,5 ąl fragmentu EcoRV-SacI (około 2,8 Kb) otrzymanego z plazmidu LITMUS28 oraz 5,0 ąl Ligation High (Toyobo), po czym przeprowadzono reakcję ligacji w 16°C przez 30 minut. Komórki E. coli DH5a stransformowano stosując roztwór reakcyjny, a z otrzymanych opornych na ampicilinę klonów wyizolowano DNA plazmidowy zgodnie z zasadami metodyki. Plazmid oznaczono tutaj, jako pKOFUT8gE2-1.
(3) Konstruowanie plazmidu pKOFUT8gE2-2
Plazmid pKOFUT8gE2-2 skonstruowano według poniższej procedury (Fig. 35), przy wykorzystaniu plazmidu pKOFUT8gE2-1 uzyskanego w punkcie (2).
2,0 ąg plazmidu pKOFUT8gE2-1 rozpuszczono w 30 ąl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs) zawierającego 100 ąg/ml BSA (New England Biolabs), po czym dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRV (New England Biolabs) i przeprowadzano reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Fragment DNA odzyskiwano z roztworu reakcyjnego przez precypitację etanolem i rozpuszczano w 30 ąl NEBuffer 1 (New England Biolabs) zawierającego 100 ąg/ml BSA (New England Biolabs), po czym dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego KpnI (New England Biolabs) i przeprowadzano reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia roztwór poddano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 1,5 Kb.
Osobno, 1,0 ąg plazmidu ploxPPuro rozpuszczano w 30 ąl buforu NEBuffer 4 (New England Biolabs), dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HpaI (New England Biolabs) i przeprowadzano reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Fragment DNA odzyskiwano z roztworu reakcyjnego przez precypitację etanolem i rozpuszczano w 30 ąl NEBuffer 1 (New England Biolabs) zawierającego 100 ąg/ml BSA (New England Biolabs), dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego KpnI (New
PL 218 428 B1
England Biolabs) i przeprowadzano reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 3,5 Kb.
Zmieszano 4,0 ąl otrzymanego fragmentu EcoRV-KpnI (około 1,5 Kb), uzyskanego z plazmidu pKOFUT8gE2-1, 1,0 ąl fragmentu HpaI-KpnI (około 3,5 Kb) uzyskanego z plazmidu ploxPPuro oraz 5,0 ąl Ligation High (Toyobo) i umożliwiono zajście reakcji ligacji w 16°C przez 30 minut. Komórki E. coli DH5a stransformowano przy wykorzystaniu roztworu reakcyjnego, a z otrzymanych, opornych na ampicylinę, klonów wyizolowano DNA plazmidowy zgodnie z zasadami metodyki. Plazmid oznaczono tutaj, jako pKOFUT8gE2-2.
(4) Konstruowanie plazmidu pscFUT8gE2-3
Plazmid pscFUT8gE2-3 skonstruowano przy wykorzystaniu poniższej procedury (Fig. 36) i zastosowaniu otrzymanego w Przykładzie 12(2) plazmidu pFUT8fgE2-4, posiadającego genomowy region zawierający egzon 2 genu FUT8 chomika chińskiego.
2,0 ąg plazmidu pFUT8fgE2-4 rozpuszczono w 35 ąl buforu NEBuffer 1 (New England Biolabs), dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HpaII (New England Biolabs) i przeprowadzano reakcję trawienia w 37°C przez 2 godziny. Fragment DNA odzyskiwano z roztworu reakcyjnego przez precypitację etanolem, po czym zmieniano sekwencje terminalne DNA na tępe końce przy zastosowaniu Blunting High (Toyobo) zgodnie z instrukcją producenta. Fragment DNA odzyskiwano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i precypitację etanolem i rozpuszczano w 35 ąl buforu NEBufer 2 (New England Biolabs), dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (New England Biolabs), po czym następowała reakcja trawienia w 37°C przez 2 godziny. Po reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 3,5 Kb.
1,0 ąg plazmidu LITMUS39 (New England Biolabs) rozpuszczono w 35 ąl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), roztwór zmieszano z 20 jednostkami enzymu restrykcyjnego EcoRV (New England Biolabs) oraz 20 jednostkami enzymu restrykcyjnego HindIII (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczania fragmentu DNA o wielkości około 2,8 Kb.
Otrzymany fragment Hpall-Hindlll (4,0 ąl, około 3,5 Kb) uzyskany z plazmidu pFUT8fgE2-4, 1,0 ąl fragmentu EcoRV-HindIII (około 2,8 Kb) uzyskanego z plazmidu LITMUS39 oraz 5,0 ąl Ligation High (Toyobo) zmieszano, po czym przeprowadzono reakcję ligacji w temperaturze 16°C przez 30 minut. Komórki E. coli DH5a stransformowano stosując roztwór reakcyjny, a z otrzymanych, opornych na ampicylinę, klonów, wyizolowano plazmid DNA zgodnie z zasadami metodyki. Plazmid oznaczono tutaj, jako pscFUT8gE2-3.
(5) Konstruowanie plazmidu pKOFUT8gE2-3
Plazmid pKOFUT8gE2-3 skonstruowano za pomocą poniższej procedury (Fig. 37), przy wykorzystaniu plazmidu pFUT8fgE2-4 otrzymanego w Przykładzie 12(2) posiadającego genomowy region zawierający egzon 2 genu FUT8 chomika chińskiego.
W 35 ąl buforu NEBuffer do EcoRI, (New England Biolabs) rozpuszczono 2,0 ąg plazmidu pFUT8fgE2-4, dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRI (New England Biolabs) oraz 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 1,8 Kb.
Oddzielnie, 1,0 mg plazmidu pBluescript II KS(+) (Stratagene) rozpuszczono w 35 ąl buforu NEBuffer do EcoRI (New England Biolabs), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRI (New England Biolabs) i 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia cząsteczki DNA o masie cząsteczkowej około 3,0 Kb.
Otrzymany fragment HindIII-EcoRI (4,0 ąl, około 1,8 Kb) uzyskany z plazmidu pFUT8fgE2-4, 1,0 ąl fragmentu HindIII-EcoRI (około 3,0 Kb) uzyskanego z plazmidu pBluescript II KS (+) oraz 5,0 ąl Ligation HigH (Toyobo) zmieszano, po czym przeprowadzano reakcję ligacji w temperaturze 16°C przez 30 minut. Komórki E. coli DH5a stransformowano przy wykorzystaniu roztworu reakcyjnego, a z otrzymanych, opornych na ampicilinę klonów, wyizolowano plazmid DNA zgodnie z zasadami metodyki. Plazmid oznaczono tutaj, jako pKOFUT8gE2-3.
PL 218 428 B1
6) Konstruowanie plazmidu pKOFUT8gE2-4
Plazmid pKOFUT8gE2-4 skonstruowano przy zastosowaniu poniższej procedury (Fig. 38), wykorzystując plazmidy pscFUT8fgE2-3 oraz pKOFUT8gE2-3, otrzymane w punktach (4) i (5).
W 35 gl buforu NEBuffer do SalI (New England Biolabs) zawierającego 100 gg/ml BSA (New England Biolabs), rozpuszczono 1,0 gg plazmidu pscFUT8fgE2-3, dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego Sall (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Z roztworu reakcyjnego odzyskano fragment DNA za pomocą precypitacji etanolem i rozpuszczono w 30 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs) zawierającego 100 gg/ml BSA (New England Biolabs), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 3,6 Kb.
Oddzielnie, 1,0 gg plazmidu pKOFUT8gE2-3 rozpuszczono w 35 gl buforu NEBuffer do Sall: (New England Biolabs), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego Sall (New England Biolabs) poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Z roztworu reakcyjnego odzyskano fragment DNA za pomocą precypitacji etanolem i rozpuszczono w 30 gl NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego HindIII (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez godziny. Po przeprowadzeniu trawienia dodano 35 gl 1 mol/l buforu Tris-HCl (pH 8,0) oraz 3,5 gl fosfatazy alkalicznej otrzymanej z E. coli C15 (Takara Shuzo), po czym poddawano reakcji defosforylacji końców DNA w warunkach 65°C przez 30 minut. Po przeprowadzeniu reakcji defosforylacji fragment DNA odzyskano na drodze ekstrakcji fenolem/chloroformem i precypitacji etanolem i rozpuszczano w 10 gl wody sterylnej.
Otrzymany fragment SalI-HindIII (4,0 gl, około 3,1 Kb) uzyskany z plazmidu pscFUT8gE2-3, 1,0 gl fragmentu SalI-HindIII (około 4,8 Kb) uzyskanego z plazmidu pKOFUT8gE2-3 oraz 5,0 gl Ligation High (Toyobo) zmieszano, po czym przeprowadzano reakcję ligacji w temperaturze 16°C przez 30 minut. Komórki E. coli DH5a strasformowano przy wykorzystaniu roztworu reakcyjnego, a z otrzymanych, opornych na ampicylinę klonów wyizolowano plazmid DNA zgodnie z zasadami metodyki. Plazmid oznaczono tutaj jako pKOFUT8gE2-4.
(7) Konstruowanie plazmidu pKOFUT8gE2-5
Plazmid pKOFUT8gE2-5 skonstruowano w sposób podany poniżej (Fig. 39) przy wykorzystaniu plazmidów pKOFUT8gE2-2 i pKOFUT8gE2-4 otrzymanych w punktach (3) i (6).
W 35 gl NEBuffer 4 (New England Biolabs) rozpuszczono 1,0 gg plazmidu pKOFUT8gE2-2, dodano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego Smal (New England Biolabs) i przeprowadzano trawienie w 25°C przez 2 godziny. Cząsteczkę DNA odzyskano z roztworu reakcyjnego metodą precypitacji etanolem i rozpuszczano w 30 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego BamHI (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu trawienia dodano 35 gl 1 mol/l buforu Tris-HCl (pH 8,0) oraz 3,5 gl fosfatazy alkalicznej otrzymanej z E. coli C15 (Takara Shuzo), po czym poddawano reakcji defosforylacji końców DNA w warunkach 65°C przez 1 godzinę. Po przeprowadzeniu reakcji defosforylacji fragment DNA odzyskano na drodze ekstrakcji fenolem/chloroformem i precypitacji etanolem i rozpuszczano w 10 gl wody sterylizowanej.
Oddzielnie, 1,0 gg plazmidu pKOFUT8gE2-4 rozpuszczano w 30 gl buforu NEBuffer 4 (New England Biolabs), dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego Smal (New England Biolabs) i poddawano trawieniu w 25°C przez 2 godziny. Fragment DNA odzyskano z roztworu reakcyjnego metodą precypitacji etanolem i rozpuszczano w 30 gl buforu NEBuffer 2 (New England Biolabs), dodawano 20 jednostek enzymu restrykcyjnego BamHI (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (w/v) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 5,2 Kb.
Otrzymany fragment SmaI-BamHI (0,5 gl, około 5,0 Kb) uzyskanego z plazmidu pKOFUT8gE2-2, 4,5 gl fragmentu SmaI-BamHI (około 4,5 Kb) uzyskanego z plazmidu pKOFUT8gE2-4 oraz 5,0 gl Ligation High (Toyobo) zmieszano i poddawano ligacji w temperaturze 16°C przez 15 godzin. Komórki E. coli DH5a stransformowano przy wykorzystaniu roztworu reakcyjnego, a z otrzymanych, opornych na ampicylinę, klonów wyizolowano plazmid DNA zgodnie z zasadami metodyki. Plazmid oznaczono tutaj, jako pKOFUT8gE2-5.
(8) Konstruowanie plazmidu pKOFUT8Puro
Plazmid pKOFUT8Puro skonstruowano przy zastosowaniu poniższej procedury (Fig. 40), wykorzystując plazmid pKOFUT8gE2-5 otrzymany w punkcie (7).
PL 218 428 B1
W 50 ąl buforu NEBuffer 4 (New England Biolabs) rozpuszczono 1,0 ąg plazmidu pKOSelectDT (Lexicon), dodano 16 jednostek enzymu restrykcyjnego RsrII (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji trawienia roztwór poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia cząsteczki DNA o masie cząsteczkowej około 12 Kb zawierającej jednostkę ekspresyjną toksyny dyfterytu.
Oddzielnie, 1,0 ąg plazmidu pKOFUT8gE2-5 rozpuszczono w 50 ąl buforu NEBuffer 4 (New England Biolabs), dodano 16 jednostek enzymu restrykcyjnego^RsrlI (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 2 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji trawienia do roztworu reakcyjnego dodano 30 ąl buforu 1 mol/l Tris-HCl (pH 8,0) oraz 3,0 ąl fosfatazy alkalicznej otrzymanej z E. coli C15 (Takara Shuzo), po czym końce DNA poddawano reakcji defosforylacji w warunkach 65°C przez 1 godzinę. Po przeprowadzeniu reakcji defosforylacji fragment DNA odzyskano na drodze ekstrakcji fenolem/chloroformem i precypitacji etanolem i rozpuszczono w 10 ąl wody sterylnej.
Otrzymany fragment Rsrll-Rsrll (1,0 ąl, około 1,2 Kb) uzyskaną z plazmidu pKOSelectDT, 1,0 ąl cząsteczki RsrII-RsrII (około 10,4 Kb) otrzymanego z plazmidu pKOFUT8gE2-5, 3,0 ąl wody sterylnej oraz 5,0 ąl Ligation High (Toyobo) zmieszano i poddawano ligacji w temperaturze 16°C przez 30 minut. Komórki E. coli DH5a stransformowano przy wykorzystaniu roztworu reakcyjnego, a z otrzymanych, opornych na ampicylinę klonów wyizolowano plazmidowy DNA zgodnie z zasadami metodyki. Plazmid oznaczono tutaj, jako pKOFUT8Puro.
2. Otrzymywanie komórki CHO, w której jedna kopia genomowego regionu zawierającego egzon 2 genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) uległa dysrupcji (1) Wstawienie docelowego wektora
Wektor pKOFUT8Puro, będący wektorem docelowym dla rejonu genomowego FUT8 chomika chińskiego, skonstruowany w punkcie 1 niniejszego Przykładu, wprowadzono do szczepu 5-03 przygotowanego w punkcie 1(2) Przykładu 8.
Gen na plazmidzie pKOFUT8Puro wprowadzono do szczepu 5-03 w sposób opisany poniżej, zgodnie z techniką elektroporacji [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Najpierw, 150 ąg plazmidu pKOFUT8Puro rozpuszczono w 1,8 ml buforu NEBuffer dla SalI (New England Biolabs), dodano 600 jednostek enzymu restrykcyjnego SalI (New England Biolabs) i poddano trawieniu w 37°C przez 5 godzin celem uzyskania liniowego fragmentu. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem/chloroformem, następnie wytrącono etanolem, a odzyskany plazmid w formie liniowej przygotowano w roztworze wodnym o stężeniu 1 ąg/ąl. Oddzielnie, szczep 5-03 zawieszono w buforze K-PBS (137 mmol/l KCl, 2,7 mmol/l NaCl, 8,1 mmol/l Na2HPO4, 1,5 mmol/l KH2PO4, 4,0 mmol/l MgCl2) celem uzyskania zagęszczenia 8 x 107 komórek/ml. Po zmieszaniu 200 ąl zawiesiny komórek (1,6 x 106 komórek) z 4 ąl (4 ąg) plazmidu liniowego, całkowitą objętość mieszaniny komórki-DNA przeniesiono do pulsatora Gene Pulser Cuvette (odległość między elektrodami, 2 mm) (BIO-RAD) i przeprowadzono elektroporację przy zastosowaniu przyrządu do fuzji komórek Gene Pulser (BIO-RAD) przy napięciu pulsu wynoszącym 350 V i pojemności elektrycznej 250 ąF. Po przeprowadzeniu elektroporacji przy użyciu 30 kuwet w identyczny sposób, zawiesinę komórek zawieszono w pożywce IMDM (Life Technologies) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (Life Technologies) i jednokrotnie zagęszczonego dodatku HT (Life Technologies) i wysiano na 30 płytek do hodowli komórek adhezyjnych o średnicy 10 cm (Falcon). Po hodowli trwającej 24 godziny w temperaturze 37°C i obecności 5% CO2, z hodowli usunięto supernatant, a dodano po 10 ml pożywki IMDM (Life Technologies) wzbogaconej puromycyną w stężeniu 15 ąg/ml (SIGMA) i 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies). Po trwającej 10 dni hodowli i wymianie pożywki co 3 do 4 dni, uzyskano linie komórek opornych na puromycynę.
(2) Przygotowanie linii komórek z wprowadzonym wektorem docelowym
Z linii komórkowej opornej na puromycynę uzyskanej jak w punkcie (1) otrzymano 900 dowolnych kolonii w sposób przedstawiony poniżej.
Najpierw, z 10 cm płytek, na których wyrosły kolonie linii komórek opornych na puromycynę, usunięto supernatant i dodano 7 ml buforu fosforanowego, po czym płytkę taką umieszczano pod stereoskopowym mikroskopem. Następnie, każdą kolonię zeskrobano, pobierano za pomocą pipety Pipetteman (GILSON) i przenoszono na 96-studzienkową płytkę okrągłodenną (Falcon). Po potraktowaniu trypsyną, każdy klon przenoszono na 96-studzienkową płaskodenną płytkę służącą do hodowli adhezyjnych komórek (Iwaki Glass) i hodowano przez 1 tydzień przy zastosowaniu pożywki IMDM (Life Technologies) wzbogaconej puromycyną w stężeniu 15 ąg/ml (SIGMA) i 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies).
PL 218 428 B1
Po zakończeniu hodowli każdy klon na płytce traktowano trypsyną i mieszano z dwiema objętościami pożywki do liofilizacji (20% DMSO, 40% płodowa surowica bydlęca, 40% IMDM). Połowa mieszaniny została przeniesiona na 96-studzienkową płytkę do hodowli adhezyjnych komórek o płaskich denkach (Iwaki Glass) służącą do powtórzeń, zaś pozostała połowa mieszaniny, umieszczona na płytkach macierzystych, została poddana zamrożeniu. Komórki na płytce replikacyjnej hodowano przez tydzień w pożywce IMDM (Life Technologies) wzbogaconej puromycyną w stężeniu 15 ąg/ml (SIGMA) i 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies).
(3) Badanie rekombinacji homologicznej metodą genomowej PCR
Badanie rekombinacji homologicznej w 900 klonach otrzymanych w punkcie (2) przeprowadzono metodą genomowej PCR.
Najpierw, genomowy DNA każdego klonu przygotowywano z płytki replikacyjnej przygotowanej w punkcie (2) zgodnie ze znaną metodą [Analytical Biochemistry 201, 331 (1992)] i rozpuszczano w ciągu nocy w 30 ąl buforze TE-RNasy (pH 8,0) (10 mmol/l TrisHCl, 1 mmol/EDTA, 200 ąg/ml RNAzy A). Zaprojektowano także starter przedstawiony w SEK. ID. NR: 26), który wiąże się z sekwencją leżącą poza homologicznym do genomowego regionu FUT8 uzyskanego w Przykładzie 12 regionem wektora docelowego i starterem (przedstawiony w SEK. ID. Nr 27), który wiąże się z sekwencją Iox P w wektorze.
Stosując polimerazę DNA ExTAq (Takara Shuzo), 25 ąl roztworu reakcyjnego [ExTaq bufor (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTPs i 0,5 ąmol/l starterów genowo specyficznych (Sek. Id. NR: 26 i SEK. ID. NR: 27)] zawierających 10 ąl przygotowanego jak powyżej każdego roztworu genomowego DNA i przeprowadzono PCR. PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 3 minuty z następującymi 38 cyklami ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, i 60°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty.
Po PCR, roztwór reakcyjny poddano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym, i specyficznie amplifikowany fragment około 1,7 Kb zawierający graniczny region pomiędzy genomowym regionem komórki CHO i regionem homologicznym docelowego wektora zidentyfikowano jako klon pozytywny. Metodą tą znaleziono jeden klon pozytywny.
(4) Badanie homologicznej rekombinacji z użyciem genomowego Southern blotting
Badanie homologicznej rekombinacji w klonie 1, którego pozytywny sygnał potwierdzono w punkcie (3), przeprowadzono genomowym Southern blotting.
Wśród płytek macierzystych poddanych zamrożeniu jak w punkcie (2) wybrano 96-studzienkową płytkę obejmującą pozytywny klon znaleziony w punkcie (3) i inkubowano w 37°C przez 10 minut z 5% CO2. Po inkubacji komórki zebrano ze studzienek odpowiadających klonom pozytywnym i przeniesiono na 24-studzienkową płaskodenną płytkę do hodowli komórek adhezyjnych (Greiner). Po trwającej 1 tydzień hodowli tych komórek w pożywce IMDM (Life Technologies) wzbogaconej 15 ąg/ml puromycyny (SIGMA) oraz 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej (Life Technologies), komórki przeniesiono na 6-studzienkową płaskodenną płytkę do hodowli komórek adhezyjnych (Greiner). Genomowy DNA uzyskano z klonu na płytce zgodnie ze znaną metodyką [Nucleic Acids Research, 3, 2303 (1976)] i rozpuszczono przez noc w 150 ąl buforu TE-RNase (pH 8,0) (10 mmol/l TrisHCl, 1 mmol/l EDTA, 200 ąg/ml RNAzy A).
W 120 ąl buforu NEBuffer 3 (New England Biolabs) rozpuszczono 12 ąg otrzymanego DNA genomowego, dodano 25 jednostek enzymu restrykcyjnego PstI (New England Biolabs) i przeprowadzano reakcję trawienia w 37°C przez noc. Fragment DNA odzyskiwano z roztworu reakcyjnego przez precypitację etanolem, rozpuszczano w 20 ąl buforu TE (pH 8,0) (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA) i poddawano elektroforezie w 0,8% (wag./obj.) żelu agarozowym. Po przeprowadzeniu elektroforezy, genomowy DNA przenoszono na nylonową błonę zgodnie ze znaną techniką [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 16, 3863 (1979)]. Po zakończeniu transferu nylonową błonę ogrzewano w 80°C przez 2 godziny.
Oddzielnie, w sposób opisany poniżej przygotowano sondę do Southern blotting. Najpierw, zaprojektowano startery (SEK. ID. NR: 28 i 29) wiążące się do sekwencji leżącej poza homologicznym do genomowego rejonu FUT8 uzyskanego w Przykładzie 12 rejonem wektora docelowego. Następnie, przy zastosowaniu polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo), sporządzono 20 ąl roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTP oraz 0,5 ąmol/l specyficznych genowo starterów (SEK. ID. NR: 28 oraz 29)] zawierającej 4,0 ng plazmidu pFUT8fgE2-2 uzyskanego w Przykładzie 12(2) i przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 1 minutę, a następnie 25 cykli podgrzewania w 94°C przez 30 sekund, po 1 cyklu w 55°C przez 30 sekund i w 74°C przez 1 minutę. Po zakończeniu PCR, roztwór reakcyjny poddawano elektroforezie w 1,75% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA sondy
PL 218 428 B1 o długości około 230 bp. Otrzymany roztwór DNA sondy (5 ąl) znakowano radioizotopem za pomocą 1,75 MBq [a- P]dCTP i układu Megaprime DNA Labeling System, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech).
Hybrydyzację przeprowadzono w sposób następujący. Najpierw, błona nylonowa została szczelnie zamknięta w roller-bottle butelce i przeprowadzono pre-hybrydyzację w temperaturze 65°C przez 3 godziny przez dodanie 15 ml roztworu hybrydyzacyjnego [5 x SSPE, 50 x roztwór Denhaldta,
0.5% (wag./obj.) SDS, 100 ąg/ml DNA spermy łososia]. Następnie, DNA sondy znakowane 32P denaturowano przez ogrzewanie i umieszczono w butelce. Potem, nylonową błonę ogrzewano w 65°C przez noc.
Po przeprowadzeniu hybrydyzacji nylonową błonę zamoczono w 50 ml 2 x SSC-0,1% (wag./obj.) SDS i ogrzewano w 65°C przez 15 minut. Po powtórzeniu płukania, błonę zamoczono w 50 ml 0,2 x SSC-0,1% (wag./obj.) SSC i ogrzewano w 65°C przez 15 minut. Po zakończeniu płukania, nylonową błoną eksponowano na kliszę rentgenowską w temperaturze -80°C przez 2 noce.
W wyniku traktowania enzymem restrykcyjnym PstI powstaje fragment DNA o wielkości około 4,4 Kb uzyskany z allelu FUT8 typu dzikiego. Z drugiej strony, z allelu, w którym dokonano rekombinacji homologicznej z wektorem docelowym, powstał fragment DNA o wielkości 6,0 Kb.
Tą metodą znaleziono takie konkretne fragmenty o wielkości około 4,4 Kb i około 6,0 Kb uzyskane z genomowego DNA pozytywnego klonu jak w punkcie (3). Ponieważ ilościowy stosunek obu fragmentów wynosił 1:1, potwierdzono, że klon jest to klon, w którym dokonano dysrupcji 1 kopii allelu FUT8. Tutaj, klon oznaczono jako szczep 1st.AFUT8 2-46.
3. Delecja genu oporności na lek w komórkach CHO, w których 1 kopia genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8) uległa dysrupcji (1) Wprowadzenie wektora ekspresyjnego dla rekombinazy Cre
Wektor ekspresyjny dla rekombinazy Cre pBS185 (Life Technologies) wprowadzono do szczepu 1st.AVFUT8 2-46 przygotowanego jak w punkcie 2 tego Przykładu.
Gen na plazmidzie pBS185 wprowadzono do szczepu 1st.AVFUT8 2-46 w sposób następujący, zgodnie z techniką elektroporacji [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Najpierw, szczep 1st.AFUT8 2-46 zawieszono w buforze K-PBS (137 mmol/l KCl, 2,7 mmol/l NaCl, 8,1 mmol/l Na2HPO4, 1,5 mmol/l KH2PO4, 4,0 mmol/l MgCl2), by otrzymać zagęszczenie 8 x 107 komórek/ml. Po zmieszaniu 200 ąl zawiesiny komórkowej (1.6 x 106) z 4 ąg plazmidu pBS185, całkowitą objętość mieszaniny komórkiDNA przeniesiono do pulsatora Gene Pulser Cuvette (odległość pomiędzy elektrodami, 2 mm) (BIORAD), a następnie wykonano transfer genu przy użyciu przyrządu do fuzji komórek Gene Pulser (BIORAD) przy napięciu pulsu wynoszącym 350 V i pojemności elektrycznej 250 ąF. Po przeprowadzeniu transferu genowego zawiesinę komórek zawieszono w 10 ml pożywki IMDM (Life Technologies) wzbogaconej 10% płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies) i 1 x zagęszczonym dodatkiem HT (Life Technologies), a następnie rozcieńczono 20000 krotnie stosując tę samą pożywkę. Komórki przeniesiono na 7 szalek do hodowli komórek adhezyjnych o średnicy 10 cm (Falcon), po czym prowadzono hodowlę w 37°C przez 24 godziny w obecności 5% CO2. Po zakończeniu hodowli, supernatant usuwano i nakładano pożywkę IMDM (Life Technologies) wzbogaconą 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies) w objętości 10 ml. Hodowlę prowadzono przez 10 dni zmieniając pożywkę co 3-4 dni.
(2) Przygotowanie linii komórek z wprowadzonym wektorem ekspresyjnym dla rekombinazy Cre
Z linii komórek otrzymanej(ych) w punkcie (1) otrzymano dowolnych 400 kolonii.
Najpierw, z 10 cm szalki usunięto supernatant i dodano 7 ml buforu fosforanowego, po czym płytkę wstawiono pod mikroskop stereoskopowy. Następnie, każdą kolonię zeskrobano i zasysano za pomocą Pipetteman (GILSON), po czym przenoszono na 96-studzienkową płytkę okrągłodenną (Falcon). Po potraktowaniu trypsyną każdy klon przeszczepiono na 96-studzienkową płytkę płaskodenną do hodowli komórek adhezyjnych (Iwaki Glass) i hodowano przez 1 tydzień w pożywce IMDM (Life Technologies) wzbogaconej 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies).
Po przeprowadzeniu hodowli każdy klon na płytce traktowano trypsyną i mieszano z dwiema objętościami pożywki liofilizującej (20% DMSO, 40% płodowej surowicy bydlęcej, 40% IMDM). Połowę mieszaniny przeniesiono na 96-studzienkową płytkę o płaskich denkach stosowaną do hodowli komórek adhezyjnych (Iwaki Glass) celem sporządzenia płytki replikacyjnej, zaś pozostałą połowę stanowiącą płytkę macierzystą poddano krioprezerwacji.
Następnie, komórki na płytce replikacyjnej hodowano przez 6 dni na pożywce IMDM (Life Technologies) wzbogaconej 15 ąg/ml puromycyny (SIGMA) i 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą
PL 218 428 B1 (Life Technologies). Klon pozytywny, z którego gen oporności na puromycynę wstawiony pomiędzy sekwencjami LOP, został wyeliminowany, ponieważ rekombinaza Cre przestaje działać w obecności puromycyny. Metodą selekcji znaleziono 91 klonów pozytywnych.
(3) Badanie eliminacji genu oporności na lek przez Southern blotting genomu
Badanie eliminacji oporności na lek przez Southern blotting genomu przeprowadzono na wybranych 6 klonach spośród klonów pozytywnych znalezionych w punkcie (2).
Spośród płytek macierzystych liofilizowanych w punkcie (2), wybrano 96-studzienkowe płytki zawierające 6 klonów pozytywnych i inkubowano w 37°C przez 10 minut w obecności 5% CO2. Po inkubacji komórki zebrano ze studzienek odpowiadających pozytywnym klonom i przeszczepiono na 24-studzienkową płaskodenną płytkę do hodowli komórek adhezyjnych (Greiner). Po prowadzeniu hodowli przez 1 tydzień w pożywce IMDM (Life Technologies) wzbogaconej 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies), komórki przeszczepiono na 6-studzienkową płaskodenną płytkę stosowaną do hodowli komórek adhezyjnych (Greiner). Genomowe DNA uzyskano z poszczególnych klonów na płytce zgodnie ze znaną techniką [Nucleic Acids Research, 3, 2303 (1976)] i rozpuszczano przez noc w 150 μl buforu TE-Rnase (pH 8,0) (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, 200 μl RNAzy A).
W 120 μl buforu NEBuffer do SamHI (New England Biolabs) rozpuszczono 12 μg otrzymanego, DNA genomowego i zmieszano z 20 jednostkami enzymu restrykcyjnego BamHl (New England Biolabs) i przeprowadzono reakcję trawienia w 37°C przez noc. Fragment DNA odzyskano z roztworu reakcyjnego przez precypitację etanolem, rozpuszczono w 20 μl buforu TE (pH 8,0) (10 mmol/l TrisHCl, 1 mmol/l EDTA) i poddano elektroforezie w 0,4% (wag./obj.) żelu agarozowym. Po przeprowadzeniu elektroforezy genomowe DNA przeniesiono na błonę nylonową zgodnie ze znaną metodyką [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3683 (1976)]. Po zakończeniu transferu błonę nylonową ogrzewano przez 2 godziny w 80°C.
Jednocześnie, przygotowano sondę stosowaną do Southern blotting w sposób następujący. Najpierw, zaprojektowano startery (SEK. ID. NR: 30 i 31) wiążące się do sekwencji leżącej poza homologicznym do genomowego regionu FUT8, uzyskanego w Przykładzie 12, regionem wektora docelowego. Następnie przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) przy zastosowaniu polimerazy DNA ExTaq (Takara Shuzo) przez sporządzenie 20 μl roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTP oraz 0,5 μmol/l specyficznych genowo starterów (SEK. ID. NR: 30 i 31)] zawierających 4,0 ng plazmidu pFUT8fgE2-2 uzyskanego w Przykładzie 12(2). Reakcję PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 1 minutę, a następnie 25 cykli ogrzewania w 94°C przez 30 sekund, po 1 cyklu w 55°C przez 30 sekund i 74°C przez 1 minutę. Po przeprowadzeniu reakcji PCR roztwór reakcyjny poddano elektroforezie w 1,75% (wag./obj.) żelu agarozowym celem oczyszczenia fragmentu DNA o wielkości około 230 bp, stanowiącego sondę. 5 μl porcja otrzymanego roz32 tworu DNA sondy została oznakowana radioizotopowo za pomocą 1,75 MBq [a-32P]dCTP i zestawu Megaprime DNA Labeling System, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech).
Hybrydyzacja została przeprowadzona w sposób następujący. Najpierw, po umieszczeniu nylonowej błony w roller bottle butelce, prowadzono prehybrydyzację w temperaturze 65°C przez 3 godziny przez dodanie 15 ml roztworu hybrydyzacyjnego [5 x SSPE, 50 x roztwór Denhaldta, 0,5% (w/v)
SDS, 100 μg/ml DNA spermy łososia]. Następnie, wyznakowany P DNA sondy zdenaturowano przez ogrzanie i umieszczono w butelce, przy czym błona nylonowa ogrzewana była przez noc w 65°C.
Po hybrydyzacji błonę nylonową zamoczono w 50 ml 2 x SSC-0,1% (wag./obj.) SDS i ogrzewano w temperaturze 65°C przez 15 minut. Po dwukrotnym przepłukaniu błonę zamoczono w 50 ml 0,2 x SSC-0.1% (wag./obj.) SDS i ogrzewano w 65°C przez 15 minut. Po przepłukaniu, nylonową błonę eksponowano na kliszę rentgenowską przez 2 noce w temperaturze -80°C celem wywołania.
Przez traktowanie enzymem restrykcyjnym BamHI uzyskano z allelu dzikiego typu FUT8 fragment DNA o wielkości około 19,0 Kb. Ponadto, uzyskano cząsteczkę DNA o wielkości około 12,5 Kb z allelu, w którym zaszła rekombinacja homologiczna, w ten sam sposób otrzymano fragment DNA o wielkości około 11,0 Kb.
Tą samą metodą uzyskano takie konkretne fragmenty o wielkości około 19,0 Kb oraz około 11,0 Kb z DNA genomowego 5 spośród 6 klonów. Ponieważ ilościowy stosunek obu fragmentów wynosił 1:1, wykazano że gen oporności na puromycynę został wydeletowany z linii komórek, w których 1 kopia regionu genomu FUT8 uległa dusrupcji. Tutaj i dalej jeden z klonów oznaczono jako 1st.AFUT8 2-46-1. Na Fig. 41 przedstawiono wyniki Southern blotting genomu szczepów 1st.AFUT8 2 -46-1, 1st.AFUT8 2-46 oraz 5-03. Ponadto, szczep 1st.AFUT8 2-46-1, pod nazwą 2-46-1, został zdeponowany 26 września 2001 jako FERM BP-7755 w International Patent Organism Depositary,
PL 218 428 B1
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
4. Oczyszczanie przeciwciała wytworzonego przez linię komórkową z genem a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8), który uległ dysrupcji
1st.AFUT8 2-46-1 otrzymany w punkcie 3 tego Przykładu przez dysrupcję jednej kopii allelu FUT8 zawieszono w pożywce IMDM (Life Technologies) wzbogaconej puromycyną w stężeniu 15 gg/ml (SIGMA) i 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies) do gęstości 3 x 105 komórek/ml, a następnie 60 ml całkowitej zawiesiny umieszczono w dwóch płaskich butelkach T182 stosowanych do hodowli komórek adhezyjnych (Greiner). Po prowadzeniu hodowli przez 3 dni, supernatant usunięto i zastąpiono pożywką EXCELL301 (JRH Biosciences) w ilości dającej całkowitą objętość 60 ml.
Po prowadzeniu hodowli w temperaturze 37°C przez 7 dni w inkubatorze zawierającym CO2 w stężeniu 5%, zliczono liczbę komórek nienaruszonych celem potwierdzenia, że ich żywotność pozostała niemal taka sama (30% lub mniej), po czym każda zawiesina komórek była odzyskiwana. Zawiesinę komórek wirowano przy 3000 obr./min. w 4°C przez 10 minut, a odzyskany supernatant wirowano przy 10000 obr./min. w 4°C przez 1 godzinę, a następnie filtrowano stosując PES Filter Unit (NALGENE) o pojemności 150 ml posiadający pory o średnicy 0,22 gm.
W kolumnie o średnicy 0,8 cm umieszczono złoże Prosep-A HighCapacity (bioPROCESSING) do grubości 2 cm i przemyto je 10 ml buforu cytrynianowego w stężeniu 0,1 mol/l (pH 3,0) i 10 ml buforu 1 mol/l glicyny/NaOH-0.15 mol/l NaCl (pH 8,6) w powyższej kolejności celem zrównoważenia nośnika. Następnie, objętością 100 ml supernatantu każdej hodowli przepuszczano przez kolumnę i przemywano 50 ml buforu 1 mol/l glicyny/NaOH-0,15 mol/l NaCl (pH 8,6). Po przepłukaniu, przeciwciało zaadsorbowane do złoża Prosep-A eluowano za pomocą 2,5 ml buforu cytrynianowego w stężeniu 0,1 mol/l (pH 3,0), eluat frakcjonowano na 500 gl porcje, a każdą frakcję neutralizowano przez zmieszanie ze 100 gl 2 mol/l Tris-HCl (pH 8,5). Metodą BCA [Anal. Biochem., 150, 76 (1985)] wybrano dwie frakcje zawierające przeciwciało w wysokim stężeniu (1,2 ml w całości), połączono i dializowano względem 10 mol/l buforu cytrynianowego-0,15 mol/l NaCl (pH 6,0) w temperaturze 4°C przez cały dzień i noc. Po zakończeniu dializy roztwór przeciwciał odzyskiwano i poddawano jałowej filtracji za pomocą filtra o średnicy porów 0,22 gm Millex GV (MILLIPORE).
5. Aktywność cytotoksyczna (ADCC) in vitro przeciwciała wytworzonego w komórkach linii z dysrupcją genu a-1,6-fukozylotransferazy (FUT8).
Celem określenia aktywności cytotoksycznej in vitro przeciwciał przeciwko CCR4 oczyszczonych jak w punkcie 4 niniejszego Przykładu, aktywność ADCC mierzono przy wykorzystaniu linii komórkowej CCR4/EL-4 opisanej w Przykładzie 8, CCR4-pozytywnej.
Komórki CCR4/EL-4 hodowane w pożywce RPMI1640 (Life Technologies) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (Life Technologies) (oznaczonej dalej, jako „RPMI1640-FBS(10)”) zawieszono w 500 gl RPMI1640-FBS(10) do gęstości 1 x 106 komórek, dodano 3,7 MBq Na251CrO4, po czym hodowano je w 37°C przez 90 minut tak, aby wyznakować komórki radioizotopem. Po odwirowaniu przy 1200 obr./min. przez 5 minut, supernatant usunięto, a komórki docelowe zawieszono w 5 ml RPMI1640-FBS(10). Etap płukania powtarzano trzykrotnie, po czym zawiesinę komórek inkubowano przez 30 minut na lodzie dla umożliwienia zajścia spontanicznej dysocjacji substancji radioaktywnej. Etap płukania był ponownie powtarzany dwukrotnie, następnie komórki zawieszono w 5 ml 5
RPMI1640-FBS(10) w taki sposób, by uzyskać 2,0 x 105 komórek/ml zawiesiny docelowych komórek.
Oddzielnie, od zdrowej osoby pobrano 30 ml krwi żylnej, ostrożnie zmieszano z 0,5 ml soli sodowej heparyny (Shimizu Pharmaceutical), a następnie zmieszano z 30 ml roztworu soli fizjologicznej (Otsuka Pharmaceutical). Po zmieszaniu, 10 ml mieszaniny delikatnie nałożono na 4 ml Lymphoprep (NYCOMED PHARMA AS) i wirowano w temperaturze pokojowej przy 2000 obr./min. przez 30 minut. Oddzielone frakcje komórek jednojądrzastych zebrano z probówek wirówkowych, połączono, po czym zawieszono w 30 ml RPMI1640-FBS(10). Po żwirowaniu w temperaturze pokojowej przy 1200 obr.//min. przez 15 minut, supernatant usunięto, a komórki zawieszono w 20 ml RPMI1640-FBS(10). Po dwukrotnym płukaniu sporządzono zawiesinę komórek efektorowych w stężeniu 2,5 x 106 komórek/ml przy wykorzystaniu RPMI1640-FBS(10).
Zawiesina komórek docelowych została rozdzielona i po 50 gl (1 x 104 komórek/studzienkę) do
96-studzienkowej płytki o denkach w kształcie U (Falcon). Następnie, zawiesina komórek efektoro5 wych została rozdzielona w objętości 100 gl (2,5 x 105 komórek/studzienkę) do każdej studzienki tak, aby osiągnąć stosunek komórek efektorowych do docelowych wynoszący 25:1. Następnie, z użyciem
PL 218 428 B1
RPMI1640-FBS(10) sporządzono serię rozcieńczeń wynoszących 0,01 ąg/ml, 0,1 ąg/ml, 1 ąg/ml oraz 10 ąg/ml przeciwciał przeciwko CCR4 otrzymanych w punkcie 5 Przykładu 13, a tak rozcieńczone roztwory rozdzielono w 50 ąl porcjach do studzienek tak, by uzyskać rozcieńczenie końcowe wynoszące odpowiednio 0,0025 ąg/ml, 0,025 ąg/ml, 0,25 ąg/ml oraz 2,5 ąg/ml. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 4 godziny w obecności 5% CO2, płytkę wirowano przy 1200 obr./min. przez 5 minut. 75 ąl supernatantu z każdej studzienki umieszczono w probówce RIA o średnicy 12 mm (IWAKI) po czym zliczono ilość zdysocjowanego Cr za pomocą licznika ΜΙΝΑΧ-γ auto gamma counter 5550 (PACKARD).
Ponadto, obliczono ilość 51Cr zdysocjowanego spontanicznie przeprowadzając tę samą reakcję w mieszaninie reakcyjnej, do której zamiast zawiesiny komórek efektorowych i roztworu przeciwciał dodano 150 ąl RPMI1640-FBS(10). Ilość całkowicie zdysocjowanego 51Cr obliczono przeprowadzając tę samą reakcję w mieszaninie reakcyjnej, do której dodano 100 ąl 1N kwasu chlorowodorowego i 50 ąl RPMI1640-FBS(10) zamiast zawiesiny komórek efektorowych i roztworu przeciwciał. Wykorzystując te wartości na podstawie równania (II) obliczono aktywność ADCC.
Fig. 42 przedstawia aktywność ADCC każdego spośród przeciwciał przeciwko CCR4. Przeciwciało uzyskane ze szczepu 1st.DFUT8 2-46-1, w którym 1 kopia allelu FUT8 uległa dysrupcja, wykazywało istotnie większą aktywność ADCC niż przeciwciało wyprodukowane przez szczep 5-03, który stanowi linia komórkowa CHO przed dysrupcją genu. Ponadto, nie obserwowano zmian w aktywności wiązania antygenu przez te przeciwciała. Na podstawie tych wyników potwierdzono, że aktywność ADCC wyprodukowanych przeciwciał może być poprawiona przez dysrupcję allelu FUT8 w komórkach gospodarza.
P r z y k ł a d 14
Przygotowanie komórek CHO/DG44 opornych na lektynę i produkcja przeciwciał przy wykorzystaniu komórek:
(1) Przygotowanie CHO/DG44 opornych na lektynę
Komórki CHO/DG44 hodowano do momentu tuż przed stadium konfIuencji w płaskich butelkach 2 o powierzchni 75 cm2 stosowanych do hodowli komórek adhezyjnych (Greiner), z wykorzystaniem pożywki IMDM-FBS(10) [pożywka IMDM zawierająca 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 1 x rozcieńczony suplement HT (GIBCO BRL)]. Po przepłukaniu komórek 5 ml PBS Dulbecco (Invitrogen), dodano 1,5 ml 0,05% trypsyny (Invitrogen) rozpuszczonej w PBS Dulbecco i inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut, aby spowodować oderwanie komórek od dna butelki. Oderwane komórki odzyskano odwirowując je w sposób ogólnie stosowany w hodowlach komórkowych i zawieszono 5 w pożywce IMDM-FBS(10) do uzyskania zagęszczenia wynoszącego 1 x 105 komórek/ml, po czym do roztworu ewentualnie dodano 0,1 ąg/ml czynnika alkilującego, N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyny (zwanego tu dalej „MNNG”, Sigma). Po inkubacji przez 3 dni w temperaturze 37°C w inkubatorze zawierającym CO2 (TABAI), supernatant z hodowli usunięto, komórki ponownie przepłukano, odczepiono od dna butelek hodowlanych i odzyskano w sposób taki jak powyżej, zawieszono w pożywce IMDMFBS(10) i wysiano na 96-studzienkową płytkę do hodowli komórek adhezyjnych (IWAKI Glass) tak, by uzyskać zagęszczenie 1000 komórek/studzienkę. Do każdej studzienki dodano aglutyninę Lens culinaris (zwaną tu dalej „LCA”, Vector) w końcowym stężeniu w pożywce 1 mg/ml, aglutyninę Aleuria aurantia (lektyna pochodząca z Aleuria aurantia; zwana tu dalej „AAL”, Vector) w stężeniu końcowym 1 mg/ml, bądź aglutyninę pochodzącą z fasoli (leukoaglutynina Phaseolus vulgaris; zwana tu dalej „L-PHA”, Vector) w stężeniu końcowym 1 mg/ml. Po przeprowadzeniu hodowli komórek w temperaturze 37°C przez dwa tygodnie w inkubatorze zawierającym CO2, kolonie, które pojawiły się, były koloniami komórek CHO/DG44 opornymi na lektynę. Z uwagi na otrzymane, oporne na lektynę komórki CHO/DG44, linię komórek oporną na LCA nazwano CHO-LCA, linię komórek oporną na AAL nazwano CHO-AAL, zaś linię komórek oporną na L-PHA nazwano CHO-PHA. Kiedy zbadano oporność tych linii komórkowych na rozmaite rodzaje lektyn, okazało się, że CHO-LCA były również oporne na AAL, zaś CHO-AAL były także oporne na LCA. Ponadto, CHO-LCA oraz CHO-AAL wykazały także oporność na lektynę rozpoznającą strukturę łańcucha cukrowego identyczną ze strukturą łańcucha cukrowego rozpoznawaną przez LCA i AAL, mianowicie lektynę, która rozpoznaje strukturę łańcucha cukrowego, w której pozycja 1 fukozy związana jest z pozycją 6 reszty N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym przez wiązanie α w łańcuchu cukrowym połączonym W-glikozydowo. Wykazano, że CHO-LCA oraz CHO-AAL charakteryzują się opornością i mogą przeżyć nawet w pożywce suplementowanej aglutyniną grochu o stężeniu końcowym wynoszącym 1 mg/ml (aglutynina Pisum sativum; zwana dalej „PSA”, Vector). Ponadto, nawet jeśli nie dodawano czynnika alkilującego MNNG, można było otrzyPL 218 428 B1 mać linie komórek opornych na lektynę przez zwiększanie liczby komórek traktowanych. Linie te zastosowano dalej do analizy.
(2) Przygotowanie komórki produkującej ludzkie chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4.
Plazmid ekspresyjny ludzkiego chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR pKANTEX2160 wprowadzono do trzech opornych na lektynę linii komórkowych otrzymanych w punkcie (1), w sposób opisany w Przykładzie (8), po czym przeprowadzono amplifikację genu za pomocą MTX celem uzyskania linii komórkowej produkującej ludzkie chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4. Ilościowy pomiar ekspresji przeciwciał dokonany za pomocą metody ELISA opisanej w Przykładzie 8-2, umożliwił uzyskanie transformantów wyrażających przeciwciała z każdej spośród linii CHO-LCA, CHO-AAL oraz CHO-PHA. Transformant pochodzący z CHO-LCA nazwano CHO/CCR4-LCA, transformant pochodzący z CHO-AAL nazwano CHO/CCR4-AAL, zaś transformant pochodzący z CHO-PHA nazwano CHO/CCR4-PHA. Ponadto, CHO/CCR4-LCA zdeponowano pod nazwą Nega-13 26 września, 2001, jako FERM BP-7756 w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japan).
(3) Wytwarzanie przeciwciał o wysokiej aktywności ADCC przez komórki CHO oporne na lektynę
Stosując trzy transformanty otrzymane w punkcie (2) i przy wykorzystaniu metody opisanej w Przykładzie 8-3, uzyskano oczyszczone przeciwciała. Aktywność wiązania antygenu przez każde z oczyszczonych ludzkich chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 oceniano przy zastosowaniu ELISA opisanej w Przykładzie 8-2. Przeciwciała wytworzone przez wszystkie transformanty wykazywały aktywność wiązania antygenów podobną do aktywności przeciwciał wytworzonych przez linię komórek rekombinowanych (szczep 5-03) przygotowanych w Przykładzie 8 z zastosowaniem komórek CHO/DG44 jako gospodarza. Wykorzystując te oczyszczone przeciwciała oceniano aktywność ADCC każdego z oczyszczonych ludzkich chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4, zgodnie z metodą opisaną w Przykładzie 8-7. Wyniki przedstawiono na Fig. 43. W porównaniu z przeciwciałami wytworzonymi przez szczep 5-03 przeciwciała wytworzone przez CHO/CCR4-LCA oraz CHO/CCR4-AAL wykazują około 100-krotnie wyższą aktywność ADCC. Z drugiej strony, nie obserwowano znaczącego wzrostu aktywności ADCC przeciwciał wytworzonych przez CHO/CCR4-PHA. Ponadto, kiedy porównano aktywność ADCC przeciwciał wytworzonych przez CHO/CCR4-LCA i YB2/0, zgodnie z metodyką opisaną w Przykładzie 8-7, okazało się, że przeciwciało wytworzone przez CHO/CCR4-LCA wykazuje większą aktywność ADCC niż przeciwciało wytworzone przez szczep 5-03, podobnie jak w przypadku przeciwciała KM2760-1 wytworzonego przez linię komórkową YB2/0 przygotowaną w Przykładzie 8-1 (Fig. 44).
(4) Analiza łańcuchów cukrowych przeciwciał wytworzonych przez komórki CHO oporne na lektynę
Analizowano łańcuchy cukrowe ludzkich chimerycznych przeciwciałach przeciwko CCR4 oczyszczonych w punkcie (3). Roztwór każdego z oczyszczonych przeciwciał został wymieniony na 10 mM KH2PO4 za pomocą Ultra Free 0.5-10K (Millipore). Wymianę przeprowadzono w taki sposób, że stosunek wymiany wyniósł 80 krotność bądź więcej. Stężenie przeciwciał po wymianie roztworu mierzono za pomocą UV-1600 (Shimadzu). Molowy współczynnik absorpcji wyliczano z sekwencji aminokwasowej każdego z przeciwciał na podstawie następującego równania (III) [Advances in Protein Chemistry, 12, 303 (1962)], zaś stężenie oznaczono przyjmując absorbancję przy 280 nm jako 1,38 mg/ml.
E1mol/l = A x n1 + B x n2 + C x n3 (III)
E1mol/I = E1mol/I/MW
-1 -1
E1mol/l: współczynnik absorpcji przy 280 nm (mg-1 ml cm-1)
-1 -1
E1mol/l: molowy współczynnik absorpcji przy 280 nm (M-1 cm-1)
-1 -1
A: molowy współczynnik absorpcji tryptofanu przy 280 nm = 5550 (M-1 cm-1)
-1 -1
B: molowy współczynnik absorpcji tyrozyny przy 280 nm = 134 0 (M-1 cm-1)
-1 -1
C: molowy współczynnik absorpcji cystyny przy 280 nm = 200 (M-1 cm-1) n1: liczba cząsteczek tryptofanu w 1 cząsteczce przeciwciała n2: liczba cząsteczek tyrozyny w 1 cząsteczce przeciwciała n3: liczba cząsteczek cystyny w 1 cząsteczce przeciwciała
MW: masa cząsteczkowa przeciwciała (g/mol)
W probówce Hydraclub S-204 umieszczono po 100 ąg każdego przeciwciała i wysuszono za pomocą wyparki wirówkowej. Wysuszona próbka w probówce została poddana hydrazynolizie przy zastosowaniu przyrządu Hydraclub wyprodukowanego przez Hohen. Próbkę poddano reakcji z hydra84
PL 218 428 B1 zyną w temperaturze 110°C przez 1 godzinę przy wykorzystaniu reagenta do hydrazynolizy wyprodukowanego przez Hohen hydrazynolysis [Method of Enzymology, 83, 263 (1982)]. Po przeprowadzeniu reakcji hydrazynę odparowano pod obniżonym ciśnieniem, a probówkę reakcyjną doprowadzono do temperatury pokojowej odstawiając ją na 30 minut. Następnie, dodano 250 ąl reagenta acetylującego wyprodukowanego przez Hohen i 25 ąl bezwodnika octowego, po czym dokładnie wymieszano celem umożliwienia zajścia reakcji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, dodano kolejne 250 ąl reagenta acetylującego i 25 ąl bezwodnika octowego, po czym dokładnie wymieszano celem umożliwienia zajścia reakcji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Próbkę zamrożono w temperaturze -80°C w zamrażarce i liofilizowano przez około 17 godzin. Łańcuchy cukrowe odzyskano z liofilizowanej próbki za pomocą zestawu Cellulose Cartridge Glycan Preparation Kit wyprodukowanego przez Takara Shuzo Co., Ltd. Roztwór łańcuchów cukrowych z próbki wysuszono za pomocą wyparki wirówkowej, a następnie poddano znakowaniu fluorescencyjnemu przy zastosowaniu 2-aminopirydyny [J. Biochem., 95, 197 (1984)]. Roztwór 2-aminopirydyny sporządzono przez dodanie 760 ąl HCl na 1 g 2-aminopirydyny (1 x roztwór PA) oraz rozcieńczenie roztworu 10-krotnie przy wykorzystaniu wody oczyszczonej metodą odwróconej osmozy (roztwór PA rozcieńczony 10-krotnie). Roztwór cyjanowego borowodorku sodu sporządzono przez dodanie 20 ąl roztworu 1 x PA i 430 ąl wody oczyszczonej metodą odwróconej osmozy na 10 mg cyjanoborowodorku sodu. Do próbki dodano 67 ąl 10-krotnie rozcieńczonego roztworu PA, po czym prowadzono reakcję w 100°C przez 15 minut, a następnie spontanicznie mieszaninę reakcyjną schłodzono, dodawano znów 2 ąl cyjanoborowodorku sodu, po czym prowadzono reakcję przez 12 godzin w 90°C celem wyznakowania łańcuchów cukrowych próbki. Grupę łańcuchów cukrowych wyznakowanych fluorescencyjnie (grupa łańcuchów cukrowych traktowana PA) oddzielono od nadmiaru reagenta przy zastosowaniu kolumny Superdex Peptide HR 10/30 (Pharmacia). Etap ten przeprowadzono przy zastosowaniu jako eluenta 10 mM wodorowęglanu amonu przy tempie przepływu 0,5 ml/min i temperaturze kolumny równej temperaturze pokojowej oraz przy zastosowaniu detektora fluorescencji o długości fali wzbudzenia 320 nm i fali świecenia fluorescencyjnego 400 nm. Eluat odzyskiwano 20 do 30 minut po dodaniu próbki i suszono w wyparce wirówkowej celem stosowania jako oczyszczone łańcuchy cukrowe traktowane PA. Następnie, przeprowadzono analizę HPLC z odwróconymi fazami oczyszczonych łańcuchów cukrowych traktowanych PA przy zastosowaniu kolumny CLC-ODS (Shimadzu, 0 6,0 nm x 159 nm). Etap ten przeprowadzono na kolumnie o temperaturze 55°C i przy tempie przepływu 1 ml/min oraz z detektorem fIuorescencji o fali wzbudzenia 320 nm i fali świecenia fluorescencyjnego 400 nm. Kolumnę zrównoważono 10 mM w roztworze buforu fosforanowego (pH 3,8), elucję przeprowadzono przez 80 minut liniowym gradientem 0,5% 1-butanolu. Każdy z łańcuchów cukrowych traktowanych PA identyfikowano przez analizę każdego z pików rozdzielonych łańcuchów cukrowych traktowanych PA przy zastosowaniu spektrometrii mas z użyciem desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą z analizatorem czasu przelotu (MALDI-TOF-MS) po rozpadzie źródła, porównanie pozycji elucji ze standardami łańcuchów cukrowych traktowanych PA wyprodukowanych przez Takara Shuzo oraz analizę HPLC z odwróconymi fazami po trawieniu każdego z traktowanych PA łańcuchów cukrowych różnymi enzymami (Fig. 45). Zawartość każdego łańcucha cukrowego obliczano z każdego obszaru piku łańcucha cukrowego traktowanego PA przez analizę HPLC z odwróconymi fazami. Z obliczeń z obszaru piku wyłączano łańcuch cukrowy traktowany PA, którego koniec redukujący nie stanowiła N-acetyloglukozamina, ponieważ było to zanieczyszczenie lub produkt uboczny powstały podczas uzyskiwania łańcucha cukrowego traktowanego PA.
Analizy przeprowadzono w ten sam sposób jak w Przykładzie 11(6) bufor oparty na fosforanie sodu (pH 3,8), jako buforu A oraz bufor oparty na fosforanie sodu (pH 3,8) + 0,5% 1-butanolu, jako buforu B.
Na Fig. 45 udział grupy łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wyliczono z obszaru zajmowanego przez piki (i) do (iv) spośród (i) a (viii), zaś udział grupy łańcuchów cukrowych związanych z a-1,6-fukozą wyliczono z obszaru zajmowanego przez piki (v) do (viii) spośród (i) do (viii).
Wyniki analizy struktury łańcucha cukrowego oczyszczonych ludzkich chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 wytworzonych przez linie komórkowe oporne na lektynę przedstawiono w Tabeli 6. Wynik przedstawia analizę łańcuchów cukrowych ludzkich chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 wytworzonych przez linie komórkowe oporne na lektynę. W tabeli przedstawiono % udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wyliczony z obszarów pików przez analizę metodą opisaną w Przykładzie d(4).
PL 218 428 B1
T a b e l a 6
Komórki produkujące przeciwciało wolny od a-1,6-fukozy złożony podwójny łańcuch cukrowy (%)
Szczep 5-03 9
Szczep CHO/CCR4-LCA 48
Szczep CHO/CCR4-AAL 27
Szczep CHO/CCR4-PHA 8
W porównaniu z przeciwciałem wytworzonym przez szczep 5-03 udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wzrósł z 9% do 48% w przypadku przeciwciał wytworzonych przez CHO/CCR4-LCA, przy wyliczeniu z analizowanego obszaru piku. Udział łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy wzrósł z 9% do 27% w przypadku przeciwciał wytworzonych przez CHO/CCR4AAL. Natomiast, prawie nie można było znaleźć zmiany we wzorze łańcucha cukrowego i w udziale łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy w komórkach linii opornej na PHA, gdy porównywano je ze szczepem 5-03.
P r z y k ł a d 15
Analiza linii komórkowej CHO opornej na lektynę:
1. Analiza poziomu ekspresji enzymu GMD w linii komórkowej CHO/CCR4-LCA wytwarzającej ludzkie chimeryczne przeciwciała przeciwko CCR4
Poziom ekspresji każdego z genów GMD (GDP- 4,6-dehydratazamannozowa), GFFP (GDP-3,5-epimeraza keto-6-deoksymannozowa, 4-reduktaza) oraz FX (GDP- pirofosforylaza beta-L-fukozowa) znanych jako enzymy biosyntezy fukozy oraz FUT8 (a-1 ,6-fukozylotransferaza) jako transferazy fukozowej w linii komórkowej CHO/CCR4-LCA uzyskanej w Przykładzie 14 i wytwarzającej ludzkie chimeryczne przeciwciała przeciwko CCR4 analizowano metodą RT-PCR.
(1) Przygotowanie RNA z różnych linii komórkowych
Każdą spośród komórki CHO/DG44, linii komórkowej 5-03 uzyskanej w Przykładzie 8-1(2) wytwarzającej ludzkie chimeryczne przeciwciała przeciwko CCR4 oraz linii komórkowej CHO/CCR4-LCA uzyskanej w Przykładzie 14(2) wytwarzającej ludzkie chimeryczne przeciwciała przeciwko CCR4 hodowano w 37°C w inkubatorze zawierającym CO2 w stężeniu 5%, po czym hodowlę prowadzono przez kolejne 4 dni. Po zakończeniu hodowli pozyskiwano całkowite RNA z 1 x 107 komórek każdej linii przy zastosowaniu zestawu RNeasy Protect Mini Kit (QIAGEN) zgodnie z instrukcją producenta. Następnie, syntetyzowano jednoniciowe cDNA stosując po 5 μg każdego RNA w 20 μl roztworu reakcyjnego przy zastosowaniu zestawu SUPER SCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR (GIBCO BRL) zgodnie z instrukcją producenta.
(2) Analiza poziomu ekspresji genu GMD przy zastosowaniu RT-PCR
W celu zamplifikowania cDNA dla GMD metodą RT-PCR sporządzono 24-merowy syntetyczny starter DNA mający sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEK. ID NR: 32 oraz 26-merowy syntetyczny starter DNA posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEK. ID NR: 33 na podstawie sekwencji cDNA dla GMD pochodzącej z komórek CHO, przedstawionej w Przykładzie 17-1.
Następnie, przygotowano 20 μl roztworu reakcyjnego [1 x bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy ExTaq (Takara Shuzo) oraz 0,5 μΜ syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 32 i 33] zawierającej 0,5 μl jednoniciowego cDNA uzyskanego z komórek każdej linii w punkcie (1) stanowiącego matrycę i przeprowadzono PCR przy zastosowaniu termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i kolejne 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę oraz 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Po poddaniu 10 μl roztworu reakcyjnego PCR elektroforezie w żelu agarozowym, fragmenty DNA wybarwiono stosując Cyber Green (BMA), a następnie dokonano pomiaru ilościowego cząsteczki DNA o wielkości około 350 bp przy zastosowaniu Fluor Imager SI (Molecular Dynamics).
(3) Analiza poziomu ekspresji genu GFPP przy zastosowaniu RT-PCR
W celu zamplifikowania cDNA dla GFPP metodą PCR sporządzono 27-merowy syntetyczny starter DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK. ID. NR: 34 oraz 23-merowy syntetyczny starter DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK. ID. NR: 35 na podstawie sekwencji cDNA dla GFPP pochodzącej z komórek CHO, przedstawionej w Przykładzie 16-2.
Następnie, przygotowano 20 μl mieszaniny reakcyjnej [1 x bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo) oraz 0,5 μΜ syntetycznych starterów
PL 218 428 B1
DNA o Sek. ID Nr: 34 i 35] zawierającej 0,5 ąl jednoniciowego cDNA uzyskanego z każdej linii komórkowej w punkcie (1) jako matrycę i przeprowadzono PCR przy zastosowaniu termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i kolejne 24 cykle ogrzewania w 94°C przez 1 minutę oraz 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Po poddaniu 10 ąl roztworu reakcyjnego PCR elektroforezie w żelu agarozowym, fragmenty DNA wybarwiono stosując Cyber Green (BMA), a następnie dokonano pomiaru ilościowego fragmentu DNA o wielkości około 600 bp przy zastosowaniu Fluor Imager SI (Molecular Dynamics).
(4) Analiza poziomu ekspresji genu FX przy zastosowaniu RT-PCR
W celu zamplifikowania cDNA dla FX metodą PCR sporządzono 28-merowy syntetyczny starter DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK. ID. NR: 36 oraz 28-merowy syntetyczny starter DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK. ID. NR: 37 na podstawie sekwencji cDNA dla FX pochodzącej z komórek CHO, przedstawionej w Przykładzie 16-1.
Następnie, przygotowano 20 ąl mieszaniny reakcyjnej [1 x bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo) oraz 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o Sek. ID Nr: 36 oraz Sek. ID Nr: 37] zawierającej 0,5 ąl jednoniciowego cDNA uzyskanego z każdej linii komórkowej w punkcie (1) stanowiącego matrycę i przeprowadzono PCR przy zastosowaniu termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut kolejne 22 cykle ogrzewania w 94°C przez 1 minutę oraz 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Po poddaniu 10 ąl roztworu reakcyjnego PCR elektroforezie w żelu agarozowym, fragmenty DNA wybarwiono Cyber Green (BMA), a następnie dokonano pomiaru ilościowego fragmentu DNA o wielkości około 300 bp przy zastosowaniu Fluor Imager SI (Molecular Dynamics).
(5) Analiza poziomu ekspresji genu FUT8 przy zastosowaniu RT-PCR
W celu zamplifikowania cDNA dla FUT8 metodą PCR przygotowano 20 ąl mieszaniny reakcyjnej [1 x bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo) oraz 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o Sek. ID Nr: 13 oraz 14] zawierającej 0,5 ąl jednoniciowego cDNA uzyskanego z każdej linii komórkowej w punkcie (1) stanowiącego matrycę i przeprowadzono PCR przy zastosowaniu termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i kolejne 20 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę oraz 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Po poddaniu 10 ąl roztworu reakcyjnego PCR elektroforezie w żelu agarozowym, fragmenty DNA wybarwiono Cyber Green (BMA), a następnie dokonano pomiaru ilościowego fragmentu DNA o wielkości około 600 bp przy zastosowaniu Fluor Imager SI (Molecular Dynamics).
(6) Analiza poziomu ekspresji genu β-aktyny przy zastosowaniu RT-PCR
W celu zamplifikowania cDNA dla β-aktyny metodą PCR przygotowano 20 ąl mieszaniny reakcyjnej [1 x bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo) oraz 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o Sek. ID Nr: 15 oraz 16] zawierającej 0,5 ąl jednoniciowego cDNA uzyskanego z każdej linii komórkowej w punkcie (1) stanowiącego matrycę i przeprowadzono PCR przy zastosowaniu termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i kolejne 14 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę oraz 68°C przez minuty jako jeden cykl. Po poddaniu 10 ąl roztworu reakcyjnego PCR elektroforezie w żelu agarozowym, fragmenty DNA wybarwiono Cyber Green (BMA), a następnie dokonano pomiaru ilościowego fragmentu DNA o wielkości około 800 bp przy zastosowaniu Fluor Imager SI (Molecular Dynamics).
(7) Poziomy ekspresji genów GMD, GFPP, FX oraz FUT8 w każdej linii komórkowej
Liczba zamplifikowanych metodą PCR fragmentów każdego z genów w szczepie 5-03 oraz CHO/CCR4-LCA została wyliczona przez podzielenie liczby amplifikowanych metodą PCR fragmentów uzyskanych z cDNA dla GMD, GFPP, FX oraz FUT w każdej linii komórkowej mierzonej w punktach od (2) do (6) przez liczbę fragmentów zamplifikowanych metodą PCR uzyskanych z cDNA dla β-aktyny w każdej linii komórkowej, przy czym ilość zamplifikowanych metodą PCR fragmentów w komórce CHO/DG44 określono jako 1. Wyniki przedstawiono w Tabeli 7.
T a b e l a 7
GMD GEPP FX FUT8
Szczep CHO/DG44 1 1 1 1
Szczep 5-03 1,107 0,793 1,093 0,901
Komórka CHO/CCR4-LCA oporna na LCA pochodząca ze szczepu 5-03 0,160 0,886 0,920 0,875
PL 218 428 B1
Jak przedstawiono w Tabeli 1 poziom ekspresji genu GMD w CHO/CCR4-LCA spadł do około 1/10 w porównaniu z pozostałymi liniami komórkowymi. W tym przypadku test przeprowadzono niezależnie dwukrotnie i stosowano wartości średnie.
2. Analiza przy zastosowaniu CHO/CCR4-LCA wytwarzających ludzkie chimeryczne przeciwciała przeciwko CCR4, w których wymuszono ekspresję genu GMD (1) Konstruowanie wektora ekspresyjnego pAGE249GMD genu GMD pochodzącego z komórek CHO
Na podstawie sekwencji cDNA dla GMD pochodzącej z komórek CHO otrzymanej w Przykładzie 17-1, sporządzono 28-merowy starter o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK. ID. NR: 38 oraz 29-merowy starter o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK. ID. NR: 39. Następnie, przygotowano 20 ąl mieszaniny reakcyjnej [1 x bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo) oraz 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 38 oraz 39] zawierającej 0,5 ąl jednoniciowego cDNA dla GMD pochodzącego z komórek CHO stanowiącego matrycę, sporządzonego w punkcie 1(1) tego Przykładu 1 przeprowadzono PCR przy zastosowaniu termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i kolejne 8 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę oraz jeden cykl w 72°C przez 1 minutę jako jeden cykl, a następnie 22 cykle ogrzewania w 94°C przez 1 minutę i jeden cykl w 68°C. Po zakończeniu reakcji roztwór reakcyjny PCR frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 600 bp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskany fragment DNA połączono z wektorem pT7Blue(R) (Novagen) przy zastosowaniu zestawu DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie uzyskanym rekombinacyjnym DNA plazmidowym transformowano E. coli DH5a (Toyobo) celem uzyskania plazmidu mt-C (cf. Fig. 46).
Następnie, na podstawie sekwencji cDNA dla GMD pochodzącej z komórek CHO otrzymanej w Przykładzie 17-1, sporządzono 45-merowy starter o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK. ID. NR: 40 oraz 31-merowy starter mający sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEK. ID. NR: 41. Następnie, przygotowano 20 ąl mieszaniny reakcyjnej [1 x bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo) oraz 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o Sek. ID Nr: 40 oraz 41] zawierającej 0,5 ąl jednoniciowego cDNA dla GMD pochodzącego z komórek CHO stanowiącego matrycę, sporządzonego w punkcie 1(1) tego Przykładu i przeprowadzono PCR przy zastosowaniu termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) poprzez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i kolejne 8 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, w 57°C przez 1 minutę oraz jeden cykl w 72°C przez 1 minutę, a następnie 22 cykle ogrzewania w 94°C przez 1 minutę i jeden cykl w 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Po zakończeniu reakcji roztwór reakcyjny PCR frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 150 bp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskany fragment DNA zligowano z wektorem pT7Blue(R) (Novagen) przy zastosowaniu zestawu DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie uzyskanym rekombinacyjnym plazmidem DNA transformowano E. coli DH5a (Toyobo) celem uzyskania plazmidowego ATG (cf. Fig. 47).
Następnie, 3 ąg plazmidu GHO-GMD sporządzonego w Przykładzie 17-1 pozostawiono do reakcji z enzymem restrykcyjnym SacI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, DNA odzyskano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i precypitację etanolem i poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 900 bp. przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid mt-C (1,4 ąg) poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym SacI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, DNA odzyskano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i precypitację etanolem i poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 3,1 kbp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskane fragmenty DNA ligowano przy zastosowaniu zestawu DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie uzyskanym rekombinacyjnym plazmidowym DNA transformowano E. coli DH5a (Toyobo) celem uzyskania plazmidu WT-N(-) (cf. Fig. 48).
Następnie, 2 ąg plazmidu WT-N(-) poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym BamHI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, DNA odzyskano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i precypitację etanolem i poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez
PL 218 428 B1 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 1 kbp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid pBluescript SK(-) (3 gg; Stratagene) poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym BamHI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, DNA odzyskano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i precypitację etanolem i poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym EcoRl (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 3 kbp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskane odpowiednie fragmenty DNA ligowano przy zastosowaniu zestawu DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie uzyskanym rekombinacyjnym plazmidowym DNA transformowano E. coli DH5a (Toyobo) celem uzyskania plazmidu WT-N(-) W pBS (cf. Fig. 49).
Następnie, plazmid WT-N(-) w pBS poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym HindlIl (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, DNA odzyskano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i precypitację etanolem i poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 4 kbp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. 2 gg plazmidu ATG poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym Hindlll (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, DNA odzyskano przez ekstrakcję w fenolem/chloroformem i precypitację etanolem i poddano reakcji z enzymem restrykcyjnym EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 150 bp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskane odpowiednie fragmenty DNA ligowano przy zastosowaniu zestawu DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie uzyskanym rekombinacyjnym plazmidowym DNA transformowano E. coli DH5a (Toyobo) celem uzyskania plazmidu WT w pBS (cf. Fig. 50).
Następnie, 2 gg plazmid pAGE249 poddano reakcji z enzymami restrykcyjnymi Hindlll oraz BamHl (oba wyprodukowane przez Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 6,5 kbp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid WT (2 gg) w pBS poddano reakcji z enzymami restrykcyjnymi HindIII oraz BamHl (oba wyprodukowane przez Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, strawione DNA frakcjonowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym, po czym odzyskano fragment DNA o wielkości około 1,2 kbp przy zastosowaniu zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskane odpowiednie fragmenty DNA ligowano przy zastosowaniu zestawu DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), a następnie uzyskanym rekombinacyjnym plazmidowym DNA transformowano E. coli DH5a (Toyobo) celem uzyskania plazmidu pAGE249GMD (cf. Fig. 51).
(2) Stabilna ekspresja genu GMD w CHO/CCR4-LCA
Wektor ekspresyjny pAGE249GMD (5 gg) genu GMD pochodzącego z komórek CHO doprowadzony do postaci linearnej przez strawienie enzymem restrykcyjnym Fspl (NEW ENGLAND BIOLABS) wprowadzono do 1,6 x 106 komórek CHO/CCR4-LCA metodą elektroporacji [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Następnie, komórki zawieszono w 30 ml pożywki IMDM-dFBS(10) [pożywka IMDM wzbogacona w 10% FBS zawierającej 200 nM< MTX (SIGMA)] i hodowano w butelce płaskiej 182 cm2 (Greiner) w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze zawierającym 5% CO2. Po zakończeniu hodowli pożywka została wymieniona na IMDM-dFBS (10) zawierającą 0,5 mg/ml higromycyny i 200 nM MTX (SIGMA), po czym hodowla trwała 19 dni aż do uzyskania kolonii transformantów opornych na higromycynę. W ten sam sposób, tą samą metodą wektor pAGE249 został wprowadzony do CHO/CCR4LCA w celu uzyskania kolonii transformantów opornych na higromycynę.
(3) Hodowla CHO/CCR4-LCA wyrażających gen GMD i oczyszczanie przeciwciała
Przy zastosowaniu pożywki IMDM-dFBS(10) zawierającej 200 nM MTX (SIGMA) i 0,5 mg/ml higromycyny otrzymane w punkcie (2) transformowane komórki wyrażające GMD hodowano w płaskiej 2 butelce 182 cm2 (Greiner) w 37°C w inkubatorze zawierającym 5% CO2. Kilka dni później, kiedy zagęszczenie komórek doszło do konfIuencji, że stykały się one ze sobą, supernatant usunięto, a komórki przepłukano 25 ml buforu PBS (GIBCO BRL) i zmieszano z 35 ml pożywki EXCELL301 (JRH). Po 7-dniowym okresie hodowli w 37°C w inkubatorze zawierającym 5% CO2, zebrano supernatant hodowlany. Chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 oczyszczono z supernatantu hodowlanego przy zastosowaniu Prosep-A (Millipore) zgodnie z instrukcjami producenta.
PL 218 428 B1
W ten sam sposób transformowane komórki, do których wprowadzono wektor pAGE249, hodowano tą samą techniką, po czym odzyskano chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 i oczyszczono z supernatantu hodowlanego.
(4) Pomiar oporności na lektynę w transformowanych komórkach
Otrzymane w punkcie (2) transformowane komórki wyrażające GMD zawieszono w pożywce IMDM-dFBS(10) zawierającej 200 nM MTX (SIGMA) i 0,5 mg/ml higromycyny do gęstości 6 x 104 komórek/ml, po czym zawiesina została rozdzielona w 50 ąl porcjach na 96-studzienkową płytkę (Iwaki Glass). Następnie, pożywkę przygotowaną przez zawieszenie LCA (aglutynina Lens culinaris: produkowana przez Vector Laboratories) w stężeniu 0 mg/ml, 0,4 mg/ml, 1,6 mg/ml lub 4 mg/ml pożywki IMDM-dFBS(10) zawierającej 200 nM MTX (Sigma) i 0,5 mg/ml higromycyny, dodano w objętości 50 ąl/studzienkę płytki hodowlanej, po czym hodowano w 37°C przez 96 godzin w inkubatorze zawierającym 5% CO2. Po zakończeniu hodowli dodano WST-I (Boehringer) w objętości 10 ąl/studzienkę i inkubowano w 37°C przez 30 minut w inkubatorze zawierającym 5% CO2 celem uzyskania zabarwienia, a następnie mierzono absorbancję przy 450 nm i 595 nm (zwanych dalej odpowiednio „OD450” i „OD595”) przy zastosowaniu czytnika Microplate Reader (BIO-RAD). Tą samą techniką dokonywano pomiaru w transformowanych komórkach, do których wprowadzono wektor pAGE249. Badanie przeprowadzono dwukrotnie w sposób niezależny.
Fig. 52 przedstawia w procentach liczbę komórek, które przeżyły w każdej studzience, gdzie jako liczbę komórek każdej grupy, które przeżyły, uznaje się wartość wyliczoną przez odejmowanie zmierzonych jak powyżej, od OD595 od OD450 od, zaś liczbę komórek, które przeżyły w każdej studzience niezawierającej LCA uznaje się za 100%. Jak przedstawiono na Fig. 52, spadek oporności na LCA obserwowano w CHO/CCR4-LCA wyrażających GMD, a współczynnik przeżywalności wynosił około 40% w obecności 0,2 mg/ml LCA, zaś w obecności 0,8 mg/ml LCA współczynnik przeżywalności wynosił 20%. Z kolei w CHO/CCR4-LCA, do których wprowadzono wektor pAGE249, współczynnik przeżywalności wynosił 100% w obecności 0,2 mg/ml LCA, zaś w obecności LCA wynoszącym nawet współczynnik przeżywalności wynosił 0,8 mg/ml około 80%. Na podstawie tych rezultatów zasugerowano, że poziom ekspresji genu GMD w CHO/CCR4-LCA był obniżony, w wyniku czego uzyskano oporność na LCA.
(5) Aktywność cytotoksyczna in vitro (aktywność ADCC) chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 otrzymanych z CHO/CCR4-LCA wyrażających GMD.
W celu oszacowania aktywności cytotoksycznej in vitro oczyszczonych chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 otrzymanych w punkcie (3), aktywność ADCC mierzono zgodnie z następującą metodyką.
(i) Przygotowywanie zawiesiny komórek docelowych
Do 1 x 106 komórek CCR4-EL4 (cf. Przykład 8-7) hodowanych przy zastosowaniu pożywki sporządzonej przez dodanie 500 ąg/ml siarczanu G418 (Nacalai Tesque) do pożywki RPMI1640-FBS(10), dodano 3,7 MBq równoważnika substancji radioaktywnej Na251CrO4, po czym reakcję prowadzono w 37°C przez 90 minut celem wyznakowania komórek radioizotopem. Po zakończeniu reakcji komórki przepłukano trzykrotnie przez zawieszenie w pożywce RPMI1640-FBS(10), i odwirowanie, ponownie zawieszone w pożywce i inkubowano w 4°C przez 30 minut w lodzie celem umożliwienia spontanicz5 nej dysocjacji substancji radioaktywnej. Po odwirowaniu komórki doprowadzono do 2,5 x 105 komórek/ml przez dodanie 5 ml pożywki RPMI1640-FBS(10) i stosowano jako zawiesinę komórek docelowych.
(ii) Przygotowywanie zawiesiny komórek efektorowych
Od osoby zdrowej pobrano 50 ml krwi żylnej i delikatnie zmieszano z 0,5 ml soli sodowej heparyny (Takeda Pharmaceutical). Przy zastosowaniu Lymphoprep (Nycomed Pharma AS), mieszaninę odwirowano zgodnie z instrukcjami producenta celem oddzielenia warstwy komórek jednojądrzastych. Komórki przepłukano trzykrotnie przez wirowanie w pożywce RPMI1640-FBS(10) i następnie ponownie zawieszono w pożywce do gęstości 2 x 106 komórek/ml i stosowano jako zawiesinę komórek efektorowych.
(iii) Pomiar aktywności ADCC
Zawiesinę komórek docelowych przygotowanych w 1) rozdzielono po 50 ąl (1 x 104 komórek/studzienkę) do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki o denkach w kształcie U (Falcon). Na5 stępnie, dodano po 100 ąl zawiesiny komórek efektorowych przygotowanych w 2) (2 x 105 komórek na studzienkę, stosunek komórek efektorowych do docelowych wynosił 25:1). Następnie dodano każdego spośród różnych chimerycznych przeciwciał przeciwko CCR4 (chimeryczne przeciwciało przeciwko CCR4 oczyszczone w punkcie (3) oraz KM2760-1 i KM3060) tak, by uzyskać stężenia końcowe od
PL 218 428 B1
0,0025 do 2,5 ąg/ml, po czym reakcję prowadzono w 37°C przez 4 godziny. Po zakończeniu reakcji płytkę poddawano wirowaniu i mierzono ilość Cr w supernatancie przy zastosowaniu licznika γ. Ilość spontanicznie zdysocjowanego 51Cr wyliczano wykorzystując tę samą procedurę z zastosowaniem samej pożywki zamiast zawiesiny komórek efektorowych i roztworu przeciwciał i zmierzono ilość 51Cr w supernatancie. Ilość całkowicie zdysocjowanego 51Cr wyliczano wykorzystując tę samą procedurę z zastosowaniem samej pożywki zamiast roztworu przeciwciał i dodanie 1 N chlorowodorowego za51 miast zawiesiny komórek efektorowych i zmierzono ilość 51Cr w supernatancie. Aktywność ADCC wyliczano na podstawie wzoru (II).
Wyniki pomiaru aktywności ADCC przedstawiono na Fig. 53. Jak pokazano na Fig. 53, aktywność ADCC oczyszczonego chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 otrzymanego z CHO//CCR4-LCA wyrażających GMD spadła w stopniu podobnym jak w przypadku KM3060 otrzymanych w Przykładzie 8. Z kolei aktywność ADCC oczyszczonego chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 otrzymanego z CHO/CCR4-LCA z wprowadzonym wektorem pAGE249 była podobna do aktywności ADCC oczyszczonego chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 otrzymanego z CHO/CCR4-LCA. Na podstawie tych rezultatów zasugerowano, że poziom ekspresji genu GMD w CHO/CCR4-LCA jest obniżony, w wyniku czego możliwe jest wytwarzanie przeciwciała wykazującego silną aktywność ADCC.
(6) Analiza łańcuchów cukrowych chimerycznego przeciwciała anty-CCR4 pochodzącego z CHO/CCR4-LCA wyrażających GMD
Łańcuchy cukrowe wiążące się do oczyszczonego chimerycznego przeciwciała przeciwko CCR4 otrzymanego w punkcie (3) analizowano zgodnie z metodą przedstawioną w Przykładzie 14(4), a wyniki analizy przedstawiono na Fig. 55. W porównaniu z oczyszczonym chimerycznym przeciwciałem przeciwko CCR4 uzyskanym z CHO/CCR4-LCA w Przykładzie 14, wyliczany z powierzchni piku udział łańcuchów cukrowych nie posiadających a-1,6-fukozy w oczyszczonych chimerycznych przeciwciałach przeciwko CCR4 pochodzących z CHO/CCR4-LCA wyrażających GMD, obniżył się do 9%. Zatem wykazano, że udział łańcuchów cukrowych niemających a-1,6-fukozy w przeciwciałach wytworzonych przez komórkę jest obniżony do podobnego poziomu, jak w przypadku przeciwciała wytwarzanego przez szczep 5-03, dzięki ekspresji w CHO/CCR4-LCA genu GMD.
P r z y k ł a d 16
Przygotowywanie rozmaitych genów kodujących enzymy związane z syntezą łańcuchów cukrowych w komórce CHO:
1. Określanie pochodzącej z komórek CHO sekwencji cDNA dla FX (1) Ekstrakcja całkowitego RNA z komórki CHO/DG44.
Komórki CHO/DG44 zawieszono w pożywce IMDM zawierającej 10% płodową bydlęcą surowicę (Life Technologies) i 1 x rozcieńczony suplement HT (Life Technologies), a 15 ml zawiesiny umieszczono w płaskiej butelce T75 stosowanej do hodowli komórek adhezyjnych (Greiner) tak, by 5 uzyskać zagęszczenie 2 x 105 komórek/ml. Drugiego dnia od rozpoczęcia hodowli w 37°C w inkubatorze zawierającym 5% CO2, pobrano 1 x 107 komórek i poddano ekstrakcji całkowitego RNA przy zastosowaniu RNAeasy (QIAGEN) zgodnie z instrukcjami producenta.
(2) Przygotowanie całkowitego jednoniciowego cDNA z komórek CHO/DG44
Całkowity RNA przygotowany w punkcie (1) rozpuszczono w 45 ąl wody sterylizowanej, dodano 1 ąl RQ1 RNase-Free DNase (Promega), 5 ąl załączonego buforu 10 x DNase buffer oraz 0,5 ąl Rnasin Ribonuclease Inhibitor (Promega), po czym prowadzono reakcję w 37°C przez 30 minut celem zdegradowania genomowego DNA zanieczyszczającego próbkę. Po zakończeniu reakcji całkowity RNA oczyszczono ponownie przy zastosowaniu RNAeasy (QIAGEN) i rozpuszczono w 50 ąl wody sterylizowanej.
W 20 ąl mieszaniny reakcyjnej przy zastosowaniu oligo(dT) jako startera, zsyntetyzowano jednoniciowe DNA z 3 ąg otrzymanych próbek całkowitego RNA przeprowadzając reakcję odwrotnej transkrypcji przy zastosowaniu SUPERSCRIPT™ Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Life Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta. Do klonowania GFPP oraz FX zastosowano 50-krotne wodne rozcieńczenie roztworu reakcyjnego. Przechowywano je w -80°C do momentu zastosowania.
W 20 ąl mieszaniny reakcyjnej stosując jako starter oligo(dT), zsyntetyzowano jednoniciowy DNA z 3 ąg uzyskanych próbek całkowitego RNA przez przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkrypcji stosując zestaw SUPERSCRIPT Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (wyprodukowany przez Life Technologies) według instrukcji produkcyjnej. W przypadku klonowania GFPP
PL 218 428 B1 i Fx stosowano 50-krotnie rozcieńczony wodny roztwór mieszaniny reakcyjnej. Był on przechowywany w -80°C aż do czasu zastosowania.
(3) Przygotowanie częściowego fragmentu cDNA dla Fx pochodzącego od chińskiego chomika
Częściowy fragment cDNA Fx chomika chińskiego uzyskano według następującej procedury.
Najpierw, projektowano startery (przedstawione w SEK. ID. NR: 42 i 43) specyficzne dla wspólnych sekwencji nukleotydowych zarejestrowanych w publicznej bazie danych, mianowicie ludzkiego cDNA Fx (Genebank nr akcesji U58766) i mysiego cDNA (Genebank nr akcesji M30127).
Następnie, przygotowano 25 ąl roztworu reakcyjnego [bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mmol/l dNTP i 0,5 ąmol/l starterów genowo-specyficznych (SEK. ID. NR: 42 i 43)] zawierającego 1 ąl jednoniciowego cDNA uzyskanego z CHO/DG44 w punkcie (2) i przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) stosując polimerazę DNA Ex Taq (Takara Shuzo). PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut, następnie 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, 58°C przez 2 minuty i 72°C przez 3 minuty jako jeden cykl i końcowe ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.
Po reakcji PCR, roztwór reakcyjny poddawano elektroforezie w 2% żelu agarozowym, a specyficznie zamplifikowany fragment 301 bp oczyszczano stosując zestaw Quiaex II Gel Extracytion Kit (wyprodukowany przez Quiagen) i eluując 20 ąl sterylnej wody (później, sposób ten stosowano do oczyszczania fragmentów DNA z żelu agarozowego). 4 ąl zamplifikowanego fragmentu wstawiano do plazmidu pCR2.1 według instrukcji dołączonych do zestawu do klonowania TOPO TA Cloning Kit (wyprodukowanego przez Invitrogen), i E. coli DH5a transformowano roztworem reakcyjnym zgodnie ze sposobem Cohen'a i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] (później, sposób stosowano do transformacji E. coli). Plazmidowy DNA izolowano zgodnie ze znanym sposobem [Nucleic Acids Research, 7, 1513 (1979)] (później, sposób stosowano do izolacji plazmidu) z kilku uzyskanych kolonii opornych na kanamycynę, aby uzyskać 2 kolonie, w których częściowe fragmenty cDNA FX były odpowiednio wstawione. Określane są one jako pCRFX klon 8 i pCRFX klon 12.
Sekwencja nukleotydowa cDNA wstawionego do każdego spośród klonu 8 FX i klonu 12 FX była określana z użyciem Sekwencera DNA 377 (Parkin Elmer) i zestawu reakcyjnego do sekwencjonowania (BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (wyprodukowany przez Parkin Elmer) zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdzono, że każdy z wstawionych cDNA, których sekwencję ustalono koduje otwartą ramkę odczytu (ORF) częściowej sekwencji FX chomika chińskiego.
(4) Synteza jednoniciowego cDNA dla RACE.
Próbki jednoniciwego cDNA dla 5' i 3' RACE wytworzono z całkowitego ekstraktu RNA CHO/DG44 w punkcie (1) stosując zestaw do amplifikacji SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH) zgodnie z instrukcjami producenta. Jako odwrotnej transkryptazy użyto PowerScriptTM Reverse Transcriptase (CLONTECH). Po wytworzeniu, każdy jednoniciowy cDNA rozcieńczano 10-krotnie buforem Tricin-EDTA dołączonym do zestawu i stosowano jako matrycę do PCR.
(5) Ustalenie pełnej długości cDNA Fx uzyskanego od chomika chińskiego metodą RACE
W oparciu o częściową sekwencję Fx uzyskaną od chomika chińskiego ustaloną w punkcie 93), zaprojektowano startery FXGSP1-1 (SEK. ID. NR: 44) i FXGSP1-2 (SEK. ID. NR: 45) dla 5' RACE specyficznego dla FX chomika chińskiego i startery FXGSP2-1 (SEK. ID. NR: 46) i FXGSP2-2 (SEK. ID. NR: 47) dla 3' RACE specyficznego dla FX chomika chińskiego.
Następnie, przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) stosując zestaw do PCR Advantage2 PCR Kit (CLONTECH), przez przygotowanie 50 ąl roztworu reakcyjnego [bufor do PCR Advantage2 (CLONTECH), 0,2 mM dNTPs, 0,2 ąmol/l startery specyficzne dla FX chomika chińskiego dla RACE i 1 x stężenie wspólnych starterów (CLONTECH) zawierających 1 ąl jednoniciowego cDNA uzyskanego z CHO/DG44 dla RACE sporządzonego z punkcie (4).
PCR przeprowadzono przez powtarzanie 20 cykli ogrzewania w 94°C przez 5 minut, 68°C przez 10 sekund i 72°C przez 2 minuty jako jeden cykl.
Po przeprowadzeniu reakcji, 1 ąl roztworu reakcyjnego rozcieńczano 50-krotnie buforem TricinEDTA, i 1 ąl rozcieńczonego roztworu zastosowano jako matrycę. Roztwór reakcyjny sporządzano ponownie i przeprowadzono PCR w takich samych warunkach. Matryce, kombinacje starterów stosowanych w pierwszym i drugim PCR i długość zamplifikowanych za pomocą PCR fragmentów DNA przedstawiono w Tabeli 8.
PL 218 428 B1
T a b e l a 8
Kombinacja starterów stosowanych w RACE PCR FX cDNA chińskiego chomika i wielkości produktów PCR
5' RACE Startery specyficzne dla FX Startery wspólne Wielkość amplifikowanego produktu PCR
Pierwszy FXGSP1-1 UPM (Mieszanina uniwersalnych starterów)
Drugi FXGSP1-2 NUP (Uniwersalny starter zagnieżdżający) 300 bp
3' RACE Startery specyficzne dla FX Startery wspólne Wielkość zamplifikowanego produktu PCR
Pierwszy FXGSP2-1 UPM (Mieszanina uniwersalnych starterów)
Drugi FXGSP2-2 NUP (Uniwersalny starter zagnieżdżający) 1100 bp
Po reakcji PCR, roztwór reakcyjny poddawano elektroforezie w 1% żelu agarozowym, a specyficznie zamplifikowane fragmenty będące przedmiotem zainteresowania oczyszczono stosując zestaw QuiaexII Gel Extraction Kit (Quiagen) i eluowano 20 ml sterylnej wody. 4 μl zamplifikowanego fragmentu wstawiono do plazmidu pCR2.1 i transformowano E. coli DH5a stosując roztwór reakcyjny zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu do klonowania TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen).
Plazmidowy DNA izolowano z kilku uzyskanych kolonii opornych na kanamycynę i uzyskano 5 klonów cDNA zawierających 5' region Fx chomika chińskiego. Klony oznaczone są jako FX5' klon 25, FX5' klon 26, FX5' klon 27, FX5' klon 28, FX5' klon 31 i FX5' klon 32.
W ten sam sposób uzyskano 5 klonów cDNA zawierających rejon 3' FX. Te klony FX3' oznaczone są jako FX3' klon 1, FX3' klon 3, FX3' klon 6, FX3' klon 8, FX3' klon 9.
Sekwencję nukleotydową części cDNA każdej z kolonii uzyskanych za pomocą 5' i 3' RACE ustalono stosując Sekwencer DNA 377 (Parkin Elmer) zgodnie z instrukcjami producenta. Przez porównanie sekwencji nukleotydowych cDNA ustalonych tym sposobem, wykluczono błędy odczytu zasad nukleotydowych spowodowane reakcją PCR i ustalono pełnej długości sekwencję nukleotydową cDNA FX chomika chińskiego. Ustaloną sekwencję przedstawiono w SEK. ID. NR: 48.
2. Ustalanie sekwencji cDNA GFPP uzyskanej z komórki CHO (1) Wytworzenie częściowego fragmentu cDNA GFPP uzyskanego od chomika chińskiego
Częściowy fragment cDNA GFPP uzyskany od chomika chińskiego wytworzono za pomocą następującej procedury. Najpierw, porównano sekwencje nukleotydowe ludzkiego cDNA dla GFPP (Genebank numer dostępu AF017445), mysich sekwencji EST mających wysoką homologię do sekwencji (Genebank numery dostępu AI467195, AA422658, BE304325 i AI466474) oraz szczurze sekwencje EST (Genebank numery sekwencji BF546372, AI058400 oraz AW144783) zarejestrowane w publicznych bazach danych i zaprojektowano startery GFPP FW9 i GFPP RV9 (SEK. ID. NR: 49 i 50) specyficzne względem szczurzego GFPP na podstawie regionu silnie zakonserwowanego wśród tych trzech gatunków.
Następnie, przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) stosując polimerazę DNA ExTaq (Takara Shuzo), przez sporządzenie 25 μl roztworu reakcyjnego [bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP i 0,5 μmol/l specyficznych względem GFPP starterów GFPP FW9 oraz GFPP RV9 (SEK. ID. NR: 49 i 50)], zawierającego 1 μl jednoniciowego cDNA pochodzącego z CHO/DG44 sporządzonego w punkcie 1(2). PCR przeprowadzono przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut, kolejne 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, w 58°C przez 2 minuty i w 72°C przez 3 minuty jako jeden cykl oraz końcowe ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.
Po przeprowadzeniu reakcji PCR, roztwór reakcyjny poddano elektroforezie w 2% żelu agarozowym i stosując zestaw QuiaexII Gel Extracion Kit (Quiagen) oczyszczono specyficzny zamplifikowany fragment o wielkości 1,4 Kbp, który eluowano 20 μl wody sterylnej. Do plazmidu pCR2.1 wstawiono 4 μl amplifikowanego fragmentu zgodnie z instrukcjami załączonymi do zestawu TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), a E. coli DH5a transformowano przy użyciu roztworu reakcyjnego.
PL 218 428 B1
Plazmidowy DNA wyizolowano z kilku powstałych opornych na kanamycynę kolonii celem uzyskania 3 klonów, do których odpowiednio wprowadzono częściowe fragmenty cDNA dla GFPP. Nazwano je GFPP klon 8, GFPP klon 11 oraz GFPP klon 12.
Sekwencję nukleotydową cDNA wstawionego do GFPP klonu 8, GFPP klonu 11 i GFPP klonu 12 ustalono stosując sekwencjoner DNA Sequencer 377 (Parkin Elmer) i zestaw BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (Parkin Elmer) zgodnie z metodyką opisaną w instrukcjach producenta. Potwierdzono, że wstawiony cDNA, którego sekwencja została ustalona koduje częściową sekwencję otwartej ramki odczytu (ORF) GFPP chomika chińskiego.
(2) Oznaczanie cDNA pełnej długości dla GFPP chomika chińskiego metodą RACE
Na podstawie częściowej sekwencji FX chomika chińskiego określonej w 2(1), zaprojektowano startery GFPP GSP1-1 (SEK. ID. NR: 52) i GFPP GSP1-2 (SEK. ID. NR: 53) dla 5' RACE specyficznej względem FX chomika chińskiego oraz startery GFPP GSP2-1 (SEK. ID. NR: 54) i GFPP GSP2-2 (SEK ID. NR: 55) dla 3' RACE specyficznej wobec GFPP chomika chińskiego.
Następnie, przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) stosując zestaw do PCR Advantage2 PCR Kit (CLONTECH), przez przygotowanie 50 gl roztworu reakcyjnego [bufor do PCR Advantage2 (wyprodukowany przez CLONTECH), 0,2 mM dNTPs, 0,2 gmol/l GFPP-specyficzne startery chomika chińskiego dla RACE i 1 x stężenie wspólnych starterów (wyprodukowanych przez CLONTECH) zawierających 1 gl jednoniciowego cDNA uzyskanego z CHO/DG44 dla RACE sporządzonego w punkcie (4).
PCR przeprowadzono przez powtarzanie 20 cykli podgrzewania w 94°C przez 5 minut, 68°C przez 10 sekund i 72°C przez 2 minuty jako jeden cykl.
Po zakończeniu reakcji, 1 gl roztworu reakcyjnego rozcieńczano 50-krotnie buforem TricinEDTA, i 1 gl rozcieńczonego roztworu zastosowano jako matrycę. Roztwór reakcyjny sporządzano ponownie i przeprowadzano PCR w takich samych warunkach. Matryce, kombinacje starterów stosowanych w pierwszym i drugim PCR i długość zamplifikowanych za pomocą PCR fragmentów DNA przedstawiono w Tabeli 9.
T a b e l a 9
Kombinacja starterów stosowanych w RACE PCR GFPP cDNA chińskiego chomika i wielkości produktów PCR
5' RACE Startery specyficzne dla GFPP Startery wspólne Wielkość zamplifikowa- nego produktu PCR
Pierwszy GFPPGSP1-1 UPM (Mieszanina uniwersalnych starterów)
Drugi GFPPGSP1-2 NUP (Uniwersalny starter zagnieżdżający) 1100 bp
3' RACE Startery specyficzne dla GFPP Startery wspólne Wielkość zamplifikowa- nego produktu PCR
Pierwszy GFPPGSP2-1 UPM (Mieszanina uniwersalnych starterów)
Drugi GFPPGSP2-2 NUP (Uniwersalny starter zagnieżdżający) 1400 pz
Po reakcji PCR, roztwór reakcyjny poddawano elektroforezie w 1% żelu agarozowym, a specyficznie zamplifikowany fragment będący przedmiotem zainteresowania oczyszczono stosując zestaw QuiaexII Gel Extraction Kit (Quiagen) i eluowano 20 gl sterylnej wody. 4 gl zamplifikowanego fragmentu wstawiano do plazmidu pCR2.1 i transformowano E. coli DH5a stosując roztwór reakcyjny zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu do klonowania TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen).
Plazmidowe DNA izolowano z kilku uzyskanych kolonii opornych na kanamycynę i uzyskano 4 klony cDNA zawierające region 5' GFPP chomika chińskiego. Oznaczone są one jako GFPP5' klon 1, GFPP5' klon 2, GFPP5' klon 3, GFPP5' klon 4.
W ten sam sposób uzyskano 5 klonów cDNA zawierających region 3' GFPP. Oznaczono je jako GFPP3' klon 10, GFPP3' klon 16 i GFPP3' klon 20.
PL 218 428 B1
Sekwencję nukleotydową cDNA każdej z kolonii uzyskanych za pomocą 5' i 3' RACE ustalano stosując Sekwencer DNA 377 (Parkin Elmer) zgodnie z instrukcją producenta. Przez porównanie sekwencji nukleotydowych cDNA ustalonych za pomocą tego sposobu, wykluczono błędy odczytu w zasadach nukleotydowych spowodowane reakcją PCR i ustalono pełnej długości sekwencję nukleotydową cDNA GFPP chomika chińskiego. Ustaloną sekwencję przedstawiono w SEK. ID. NR: 51.
P r z y k ł a d 17
Wytwarzanie genu GMD uzyskanego z komórki CHO:
1. Ustalenie sekwencji cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO.
(1) Wytwarzanie cDNA genu GMD uzyskanego z komórki CHO (wytwarzanie częściowego cDNA z wyłączeniem sekwencji końcowych 5' i 3')
Przeszukiwano publiczną bazę danych (BLAST) pod kątem cDNA GMD pochodzącego od gryzonia stosując sekwencję cDNA GMD pochodzącą od człowieka (Nr dostępu GeneBank AF042377) wprowadzoną do GeneBank jako zapytanie i uzyskano trzy mysie sekwencje EST (Nr dostępu GeneBank BE986856, BF158988 i BE284785). Ustalono przypuszczalną sekwencję cDNA mysiego GMD przez zligowanie tych sekwencji EST.
Na podstawie sekwencji cDNA GMD pochodzącego od myszy wytworzono 28-merowy starter mający sekwencję reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 56, 27 merowy starter mający sekwencję reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 57, 25-merowy starter mający sekwencję reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 59 i 25-merowy starter mający sekwencję reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 60.
Następnie, w celu amplifikacji cDNA GMD pochodzącego z komórki CHO, przeprowadzono PCR według następującego sposobu. Sporządzono porcję 20 ąl roztworu reakcyjnego [1 x bufor EX Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Taq (Takara Shuzo) i 0,5 ąΜ dwóch syntetycznych starterów DNA] zawierającą 0,5 ąl jednoniciowego cDNA uzyskanego z komórki CHO wytworzonego w Przykładzie 15-1(1) jako matrycy. W tym przypadku, jako syntetyczne startery DNA stosowano kombinację SEK NR ID: 56 z SEK NR ID: 57, SEK NR ID: 58 z SEK NR ID: 57, SEK NR ID: 56 z SEK NR ID: 59 oraz SEK NR ID: 56 z SEK NR ID: 60. Reakcję przeprowadzano stosując DNA Termal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i następnie 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę i 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl.
Roztwór reakcyjny PCR frakcjonowano za pomocą elektroforezy agarozowej, aby stwierdzić, że w reakcji PCR zamplifikowany został produkt o wielkości około 1,2 kbp gdy stosowano syntetyczne startery DNA SEK. ID. NR: 56 i 57, fragment o wielkości 1,1 kbp był amplifikowany, gdy zastosowano syntetyczne startery DNA SEK. ID.: 57 i 59, fragment o wielkości 350 bp był amplifikowany, gdy zastosowano syntetyczne startery DNA SEK. ID. NR: 56 i 59, a fragment o wielkości 1 kbp był amplifikowany w przypadku syntetycznych starterów DNA SEK NR ID: 56 i 60. Fragmenty DNA odzyskiwano stosując zestaw Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskane fragmenty DNA zligowano z wektorem pT7Blue® (Novagen) stosując zestaw do ligacji DNA:DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) i stransformowano E. coli DH (Toyobo) stosując uzyskane próbki DNA zrekombinowanego plazmidu, aby uzyskać plazmidy 22-8 (mający fragment DNA około 1,2 kbp zamplifikowany z użyciem syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 56 i 57), 23-3 (mający fragment DNA około 1,1 kbp zamplifikowany z użyciem syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 58 i 57), 31-5 (fragment DNA około 350 bp zamplifikowany z użyciem syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 56 i 59) i z 34-2 (mający fragment DNA około 1 kpz zamplifikowany z użyciem syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 56 i 60). Sekwencja cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO zawarta w tych plazmidach była ustalana w zwyczajny sposób z zastosowaniem sekwencera DNA ABI PRISM 377 (Parkin Elmer) (jeżeli sekwencja 28 zasad położonych w kierunku 3' od inicjacyjnego kodonu metioninowego na końcu 5' i sekwencja 27 zasad położonych w kierunku 5' od terminacyjnego kodonu na końcu 3' pochodzą z syntetycznych sekwencji oligo DNA, są one sekwencjami cDNA mysiego GMD).
Ponadto, w celu wytworzenia plazmidu, w którym fragmenty cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO znajdujące się na plazmidach 22-8 i 34-2, są połączone. Plazmid 22-8 (1 ąg) poddano działaniu enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, produkt trawienia poddano elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie fragment DNA o wielkości około 4 kbp odzyskano stosując zestaw Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid 34-2 (2 ąg) poddano działaniu enzymu restrykcyjnego EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez 16 godzin, produkt trawienia poddano elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie fragment DNA o wielkości około 150 bp odzyskano stosując zestaw Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskane fragmenty DNA kolejno poddawano końcowej defosforylacji stosując cielęcą jelitową fosfaPL 218 428 B1 tazę alkaliczną (Takara Shuzo) a następnie zligowano stosując zestaw do ligacji DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) i stransformowano E. coli DH5a (Toyobo) stosując uzyskany zrekombinowany plazmidowy DNA w celu otrzymania plazmidu CHO-GMD (porównaj Fig. 54).
(2) Ustalenie 5'-końcowej sekwencji cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO
Starter 24-merowy mający sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 61, z 5'-końcowej strony niekodującego regionu sekwencji nukleotydowych cDNA ludzkiego i mysiego GMD pochodzącego uzyskanego z komórki CHO, a starter 32-merowy mający sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 62 z sekwencji cDNA GMD pochodzącego z komórki CHO i przeprowadzono PCR następującą metodą w celu amplifikacji cDNA. Następnie, sporządzono 20 ąl roztworu reakcyjnego [1 x bufor Ex Taq (Takra Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo) i 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o sekwencji SEK. ID. NR: 61 i SEK. ID. NR: 62], zawierającego 0,5 ąl jednoniciowego cDNA wytworzonego w Przykładzie 15-1(1) wytworzono jako matrycę i przeprowadzono reakcję z użyciem termocyklera DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut, kolejne 20 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, w 55°C przez 10 minut i w 72°C przez 2 minuty jako jeden cykl i dalsze 18 cykli ogrzewania w 94°C przez 10 minut, i 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Po frakcjonowaniu roztworu reakcyjnego PCR za pomocą elektroforezy agarozowej, fragment DNA o około 300 bp odzyskano stosując zestaw Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskany fragment DNA zligowano z wektorem pT7Blue(R) (Novagen) stosując zestaw do ligacji DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) i transformowano E. coli DH5a (Toyobo) stosując uzyskane próbki zrekombinowanego plazmidowego DNA, aby otrzymać plazmid 5'GMD. Stosując sekwencer DNA 377 (Parkin Elmer) ustalono sekwencję nukleotydową 28 zasad azotowych położoną poniżej początkowej metioniny cDNA GMD uzyskanego z komórek CHO, zawartego w plazmidzie.
(3) Ustalenie 3'-końcowej sekwencji cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO.
W celu uzyskania 3'-końcowej sekwencji cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO, przeprowadzono metodę RACE według następującego sposobu. Jednoniciowe cDNA dla 3' RACE wytworzono z RNA pochodzącego z komórki CHO uzyskanego w Przykładzie 15-1(1) stosując zestaw SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH) zgodnie z instrukcjami producenta. W tym przypadku jako odwrotną transkryptazę zastosowano PowerScript™ reverse Transcriptase (CLONTECH). Po wytworzeniu jednoniciowy cDNA rozcieńczono 10-krotnie w buforze Tricin-EDTA dołączonym do zestawu i zastosowano jako matrycę do PCR.
Następnie, sporządzono 20 ąl roztworu reakcyjnego [bufor Ex Taq (Takra Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo), 0,5 ąΜ syntetycznego 25-merowego startera DNA o sekwencji SEK. ID. NR: 63 [wytworzonego na podstawie sekwencji cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO w punkcie (1)] i 1 x stężenie uniwersalnej mieszaniny starterowej (Universal Primer Mix) (dołączonego do SMART™ RACE cDNA Amplification Kit; wyprodukowanego przez CLONTECH], zawierającego 1 ąl cDNA dla 3' RACE jako matrycy i przeprowadzono PCR stosując termocykler DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut, następnie 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, i 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl.
Po zakończeniu reakcji, 1 ąl roztworu reakcyjnego PCR rozcieńczno 20-krotnie buforem TricinEDTA (CLONTECH). Następnie, sporządzono 20 ąl roztworu reakcyjnego [bufor Ex Taq (Takra Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy Ex Taq (Takara Shuzo), 0,5 ąΜ syntetycznego 25-merowego startera DNA o sekwencji SEK. ID. NR: 64 [wytworzonego na podstawie sekwencji cDNA GMD uzyskanego z komórki CHO w punkcie (1)] i 0,5 ąΜ Nested Universal Primer (dołączonego do SMART™ RACE cDNA Amplification Kit; wyprodukowanego przez CLONTECH], zawierającego 1 ąl 20-krotnie rozcieńczonego wodnego roztworu jako matrycy] i przeprowadzono reakcję stosując termocykler DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut, następnie 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę, i w 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl.
Po zakończeniu reakcji, roztwór reakcyjny PCR frakcjonowano za pomocą elektroforezy agarozowej, a następnie fragment DNA o około 700 bp odzyskano stosując Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami produkcyjnymi. Odzyskany fragment DNA zligowano z wektorem pT7Blue(R) (Novagen) stosując zestaw do ligacji DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) i stransformowano E. coli DH5a (Toyobo) stosując uzyskany zrekombinowany plazmidowy DNA, aby otrzymać plazmid 3'GMD. Stosując sekwencer DNA 377 (Parkin Elmer) ustalono sekwencję nukleotydową 27 zasad azotowych położonych powyżej kodonu terminacyjnego cDNA GMD uzyskanego z komórek CHO, zawartego w plazmidzie.
PL 218 428 B1
Całkowita długość sekwencji genu GMD pochodzącego z komórki CHO ustalona w punktach (1), (2) i (3) i odpowiadająca im sekwencja aminokwasowa są przedstawione odpowiednio jako SEK. ID. NR: 65 i 71.
2. Ustalenie sekwencji genomowej zawierającej gen GMD uzyskany z komórki CHO/DG44.
Wytworzono 25-merowy starter mający sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 66 na podstawie sekwencji cDNA mysiego GMD ustalonej w Przykładzie 17-1. Następnie otrzymano genomowy DNA pochodzący z komórki CHO za pomocą następującego sposobu. KC861 pochodzące z komórki CHO/DG44 zawieszano w pożywce IMDM-dFBS(10)-HT(1) [pożywka IMDMdFBS(10) obejmuje 1 x stężenie suplementu HT (Invitrogen)] w celu uzyskania gęstości wynoszącej 5
3x105 komórek/ml, zawiesinę rozdzielano po 2 ml/studzienkę w 6-studzienkowej płaskodennej płytce przeznaczonej do stosowania w adhezji komórkowej (Greiner). Po ich hodowli w 37°C w inkubatorze z 5% CO2 do czasu, gdy komórki osiągnęły konfIuencję na płytce, wytworzono genomowy DNA z komórek na płytce za pomocą znanej metody [Nucleic Acids Research, 3, 2303 (1976)] i rozpuszczano przez noc w 150 ml buforu TeRNase (pH 8,0) (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, 200 ąg/ml RNase A).
Sporządzono roztwór reakcyjny (20 ąl) [1 x bufor ExTaq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy EXTaq (Takara Shuzo) i 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 59 i SEK. ID. NR: 66] zawierającej 100 ng uzyskanego genomowego DNA pochodzącego z komórki CHO/DG44 i przeprowadzono PCR stosując termocykler DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut i następnie 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę i 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl. Po zakończeniu reakcji, roztwór reakcyjny PCR frakcjonowano za pomocą elektroforezy agarozowej, a następnie fragment DNA o około 100 bp odzyskano za pomocą zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskany fragment DNA zligowano z wektorem pT7Blue(R) (Novagen) stosując zestaw do ligacji DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) i stransformowano E. coli DH5a (Toyobo) stosując uzyskany zrekombinowany plazmidowy DNA, otrzymując plazmid ex3. Stosując sekwencer DNA 377 (Parkin Elmer) ustalono sekwencję nukleotydową genomowego DNA pochodzącego z komórki CHO zawartego w plazmidzie. Wynik przedstawiono w SEK. ID. NR: 67.
Następnie wytworzono 25-merowy starter mający sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 69 i 25-merowy starter mający sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 69 na podstawie sekwencji cDNA GMD pochodzącego z komórki CHO ustalonej w Przykładzie 17-1. Następnie, sporządzono 20 ąl roztworu reakcyjnego [1 x bufor Ex Taq (Takara Shuzo), 0,2 mM dNTP, 0,5 jednostki polimerazy ExTaq (Takara Shuzo) i 0,5 ąΜ syntetycznych starterów DNA o SEK. ID. NR: 68 i SEK. ID. NR: 69], zawierającego 100 ng genomowego DNA pochodzącego z komórki CHO/DG44 i przeprowadzono PCR stosując termocykler DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) przez ogrzewanie w 94°C przez 5 minut, a następnie 30 cykli ogrzewania w 94°C przez 1 minutę i w 68°C przez 2 minuty jako jeden cykl.
Po zakończeniu reakcji, roztwór reakcyjny PCR frakcjonowano za pomocą elektroforezy agarozowej, a następnie fragment DNA o około 200 bp odzyskano za pomocą zestawu Gene Clean II Kit (BIO 101) zgodnie z instrukcjami producenta. Odzyskany fragment DNA zligowano z wektorem pT7Blue(R) (Novagen) stosując zestaw do ligacji DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) i transformowano E. coli DH5a (Toyobo) stosując uzyskany zrekombinowany plazmidowy DNA, otrzymując plazmid ex4. Stosując sekwencer DNA 377 (Parkin Elmer) ustalono sekwencję nukleotydową genomowego DNA pochodzącego z komórki CHO zawartego w plazmidzie. Wynik przedstawiono w SEK. ID. NR: 70.
P r z y k ł a d 18
Badanie łańcucha cukrowego konwencjonalnie dostępnych przeciwciał:
Wiązanie się łańcuchów cukrowych z konwencjonalnie dostępnym przeciwciałem przeciwko HER2/neu Herceptin (GENETECH i Roche) wytwarzanym przez komórkę CHO jako komórkę gospodarza przebadano zgodnie ze sposobem z Przykładu 10(6) (Fig. 31). Obliczona z obszaru każdego piku diagramu elucyjnego zawartość łańcuchów cukrowych Herceptyny wolnych od a-1,6-fukozy wynosiła 16%, a zawartość łańcuchów cukrowych związanych z a-1,6-fukozą wynosiła 84%. To samo badanie przeprowadzono z wykorzystaniem innych dostępnych handlowo przeciwciał, Rituxanu (GENETECH, Roche i IDEC) i Zenepaxu (Roche i PDL) i zawartość łańcuchów cukrowych wolnych od a-1,6-fukozy była niższa niż w przypadku Herceptyny.
Fig. 31 przedstawia wykres pokazujący wzór elucji łańcuchów cukrowych traktowanych PA sporządzonych z Herceptyny, otrzymany przy zastosowaniu analizy HPLC z odwróconymi fazami.
PL 218 428 B1
Względna intensywność fIuorescencji i czas elucji są wykreślone odpowiednio jako rzędne i odcięte. Warunki analizy HPLC z odwróconymi fazami, analiza struktury łańcuchów cukrowych i wyliczenia udziału grupy łańcuchów cukrowych niezawierających łańcucha cukrowego a-1,6-fukozy przeprowadzono przy wykorzystaniu tych samych metod, jak w Przykładzie 11(6).
ZASTOSOWANIE PRZEMYSŁOWE
Niniejszy wynalazek dostarcza komórki(ek) zdolnej(ych) do wytwarzania kompozycji przeciwciała, procesu wytwarzania kompozycji przeciwciała przy zastosowaniu komórki, kompozycji przeciwciała i ich zastosowania.
Lista sekwencji Sek. Nr ID: 4 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 5 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 8 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 9 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 10 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 11 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 12 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 13 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 14 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 15 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 16 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 17 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 18 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 19 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 20 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 21 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 22 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 26 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 27 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 28 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 29 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 30 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 31 Syntetyczne DNA
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
PL 218 428 B1
Sek. Nr ID: 32 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 33 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 34 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 35 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 36 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 37 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 38 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 39 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 40 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 41 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 42 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 43 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 44 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 45 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 46 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 49 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 50 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 52 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 53 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 54 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 55 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 56 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 57 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 58 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 59 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 60 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 61 Syntetyczne DNA Sek. Nr ID: 62 Syntetyczne DNA
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej: Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
PL 218 428 B1
Sek. Nr ID: 63 - Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Syntetyczne DNA
Sek. Nr ID: 64 - Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Syntetyczne DNA
Sek. Nr ID: 66 - Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Syntetyczne DNA
Sek. Nr ID: 68 - Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Syntetyczne DNA
Sek. Nr ID: 69 - Wyjaśnienie sekwencji syntetycznej:
Syntetyczne DNA
100
PL 218 428 B1
LISTA SEKWENCJI <110> KYOffA HAKKO KOGYO CO., LTD.
< 12O> KOMÓRKA PRODUKUJĄCA KOMPOZYCJĘ PRZECIWCIAŁA <13O> P-38524 <150> JP 2000-308526 <151> 2000-10-06 <160> 73 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2008 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt 60 tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc 120 tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180 catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240 gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300 cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360 gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420 ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480 ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540 catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat gacagatcta 600 tactacctca gtcaaacaga tggagcaggt gagtggcggg aaaaagaagc caaagatctg 660
PL 218 428 B1
101
acagagctgg tccagcggag aataacatat . ctgcagaatc : ccaaggactg cagcaaagcc : 720
agaaagctgg tatgtaatat caacaaaggc tgtggctatg ; gatgtcaact . ccatcatgtg ; 780
gtttactgct tcatgattgc ttatggcacc cagcgaacac tcatcttgga atctcagaat 840
tggcgctatg ctactggagg atgggagact gtgtttagac ctgtaagtga gacatgcaca 900
gacaggtctg gcctctccac tggacactgg tcaggtgaag tgaaggacaa aaatgttcaa 960
gtggtcgagc tccccattgt agacagcctc catcctcgtc ctccttactt acccttggct 1020
gtaccagaag accttgcaga tcgactcctg agagtccatg gtgatcctgc agtgtggtgg 1080
gtatcccagt ttgtcaaata cttgatccgt ccacaacctt ggctggaaag ggaaatagaa 1140
gaaaccacca agaagcttgg cttcaaacat ccagttattg gagtccatgt cagacgcact 1200
gacaaagtgg gaacagaagc agccttccat cccattgagg aatacatggt acacgttgaa 1260
gaacattttc agcttctcga acgcagaatg aaagtggata aaaaaagagt gtatctggcc 1320
actgatgacc cttctttgtt aaaggaggca aagacaaagt actccaatta tgaatttatt 1380
agtgataact ctatttcttg gtcagctgga ctacacaacc gatacacaga aaattcactt 1440
cggggcgtga tcctggatat acactttctc tcccaggctg acttccttgt gtgtactttt 1500
tcatcccagg tctgtagggt tgcttatgaa atcatgcaaa cactgcatcc tgatgcctct 1560
gcaaacttcc attctttaga tgacatctac tattttggag gccaaaatgc ccacaaccag 1620
attgcagttt atcctcacca acctcgaact aaagaggaaa tccccatgga acctggagat 1680
atcattggtg tggctggaaa ccattggaat ggttactcta aaggtgtcaa cagaaaacta 1740
ggaaaaacag gcctgtaccc ttcctacaaa gtccgagaga agatagaaac agtcaaatac 1800
cctacatatc ctgaagctga aaaatagaga tggagtgtaa gagattaaca acagaattta 1860
gttcagacca tctcagccaa gcagaagacc cagactaaca tatggttcat tgacagacat 1920
gctccgcacc aagagcaagt gggaaccctc agatgctgca ctggtggaac gcctctttgt : 1980
102
PL 218 428 B1 gaagggctgc tgtgccctca agcccatg 2008 <210> 2 <211> 1728 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2
atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc 60
ttgttatttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga tcactccagc 120
agagaactct ccaagattct tgcaaagctt gaacgcttaa aacagcaaaa tgaagacttg 180
aggcgaatgg ctgagtctct ccgaatacca gaaggcccca ttgaccaggg gacagctaca 240
ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac 300
aagaaacaag ctagaaatgg tctggggaag gatcatgaaa tcttaagaag gaggattgaa 360
aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagcgaac tgaagaaatt aaagcattta 420
gaaggaaatg aactccaaag acatgcagat gaaattcttt tggatttagg acaccatgaa 480
aggtctatca tgacagatct atactacctc agtcaaacag atggagcagg ggattggcgt 540
gaaaaagagg ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataacata tctccagaat 600
cctaaggact gcagcaaagc caggaagctg gtgtgtaaca tcaataaagg ctgtggctat 660
ggttgtcaac tccatcacgt ggtctactgt ttcatgattg cttatggcac ccagcgaaca 720
ctcatcttgg aatctcagaa ttggcgctat gctactggtg gatgggagac tgtgtttaga 780
cctgtaagtg agacatgtac agacagatct ggcctctcca ctggacactg gtcaggtgaa 840
gtaaatgaca aaaacattca agtggtcgag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgg 900
cctccttact taccactggc tgttccagaa gaccttgcag accgactcct aagagtccat 960
ggtgaccctg cagtgtggtg ggtgtcccag tttgtcaaat acttgattcg tccacaacct 1020
PL 218 428 B1
103 tggctggaaa aggaaataga agaagccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagttatt 1080 ggagtccatg tcagacgcac agacaaagtg ggaacagaag cagccttcca ccccatcgag 1140 gagtacatgg tacacgttga agaacatttt cagcttctcg cacgcagaat gcaagtggat 1200 aaaaaaagag tatatctggc tactgatgat cctactttgt taaaggaggc aaagacaaag 1260 tactccaatt atgaatttat tagtgataac tctatttctt ggtcagctgg actacacaat 1320 cggtacacag aaaattcact tcggggtgtg atcctggata tacactttct ctcacaggct 1380 gactttctag tgtgtacttt ttcatcccag gtctgtcggg ttgcttatga aatcatgcaa 1440 accctgcatc ctgatgcctc tgcgaacttc cattctttgg atgacatcta ctattttgga 1500 ggccaaaatg cccacaatca gattgctgtt tatcctcaca aacctcgaac tgaagaggaa 1560 attccaatgg aacctggaga tatcattggt gtggctggaa accattggga tggttattct 1620 aaaggtatca acagaaaact tggaaaaaca ggcttatatc cctcctacaa agtccgagag 1680 aagatagaaa cagtcaagta tcccacatat cctgaagctg aaaaatag 1728 <210> 3 <211> 9196 <212> DNA <213> Cricetulus griseus
<400> 3 tctagaccag gctggtctcg aactcacaga gaaccacctg cctctgccac ctgagtgctg 60
ggattaaagg tgtgcaccac caccgcccgg cgtaaaatca tatttttgaa tattgtgata 120
atttacatta taattgtaag taaaaatttt cagcctattt tgttatacat ttttgcgtaa 180
attattcttt tttgaaagtt ttgttgtcca taatagtcta gggaaacata aagttataat 240
ttttgtctat gtatttgcat atatatctat ttaatctcct aatgtccagg aaataaatag 300
ggtatgtaat agcttcaaca tgtggtatga tagaattttt cagtgctata taagttgtta 360
104
PL 218 428 B1
cagcaaagtg ttattaattc atatgtccat atttcaattt tttatgaatt attaaattga 420
atccttaagc tgccagaact agaattttat tttaatcagg aagccccaaa tctgttcatt 480
ctttctatat atgtggaaag gtaggcctca ctaactgatt cttcacctgt tttagaacat 540
ggtccaagaa tggagttatg taaggggaat tacaagtgtg agaaaactcc tagaaaacaa 600
gatgagtctt gtgaccttag tttctttaaa aacacaaaat tcttggaatg tgttttcatg 660
ttcctcccag gtggatagga gtgagtttat ttcagattat ttattacaac tggctgttgt 720
tacttgtttc tatgtcttta tagaaaaaca tatttttttt gccacatgca gcttgtcctt 780
atgattttat acttgtgtga ctcttaactc tcagagtata aattgtctga tgctatgaat 840
aaagttggct attgtatgag acttcagccc acttcaatta ttggcttcat tctctcagat 900
cccaccacct ccagagtggt aaacaacttg aaccattaaa cagactttag tctttatttg 960
aatgatagat ggggatatca gatttatagg cacagggttt tgagaaaggg agaaggtaaa 1020
cagtagagtt taacaacaac aaaaagtata ctttgtaaac gtaaaactat ttattaaagt 1080
agtagacaag acattaaata ttccttggga ttagtgcttt ttgaattttg ctttcaaata 1140
atagtcagtg agtatacccc tcccccattc tatattttag cagaaatcag aataaatggt 1200
gtttctggta cattcttttg tagagaattt attttctttg ggtttttgtg catttaaagt 1260
caataaaaat taaggttcag taatagaaaa aaaactctga tttttggaat cccctttctt 1320
cagcttttct atttaatctc ttaatgataa tttaatttgt ggccatgtgg tcaaagtata 1380
tagccttgta tatgtaaatg ttttaaccaa cctgccttta cagtaactat ataattttat 1440
tctataatat atgacttttc ttccatagct ttagagttgc ccagtcactt taagttacat 1500
tttcatatat gttctttgtg ggaggagata attttatttc taagagaatc ctaagcatac 1560
tgattgagaa atggcaaaca aaacacataa ttaaagctga taaagaacga acatttggag 1620
PL 218 428 B1
105
tttaaaatac atagccaccc taagggttta actgttgtta gccttctttt ggaattttta . 1680
ttagttcata tagaaaaatg gattttatcg tgacatttcc atatatgtat ataatatatt 1740
tacatcatat ccacctgtaa ttattagtgt ttttaaatat atttgaaaaa ataatggtct 1800
ggtttgatcc atttgaacct tttgatgttt ggtgtggttg ccaattggtt gatggttatg 1860
ataacctttg cttctctaag gttcaagtca gtttgagaat atgtcctcta aaaatgacag 1920
gttgcaagtt aagtagtgag atgacagcga gatggagtga tgagaatttg tagaaatgaa 1980
ttcacttata ctgagaactt gttttgcttt tagataatga acatattagc ctgaagtaca 2040
tagccgaatt gattaattat tcaaagatat aatcttttaa tccctataaa agaggtatta 2100
cacaacaatt caagaaagat agaattagac ttccagtatt ggagtgaacc atttgttatc 2160
aggtagaacc ctaacgtgtg tggttgactt aaagtgttta ctttttacct gatactgggt 2220
agctaattgt ctttcagcct cctggccaaa gataccatga aagtcaactt acgttgtatt 2280
ctatatctca aacaactcag ggtgtttctt actctttcca cagcatgtag agcccaggaa 2340
gcacaggaca agaaagctgc ctccttgtat caccaggaag atctttttgt aagagtcatc 2400
acagtatacc agagagacta attttgtctg aagcatcatg tgttgaaaca acagaaactt 2460
attttcctgt gtggctaact agaaccagag tacaatgttt ccaattcttt gagctccgag 2520
aagacagaag ggagttgaaa ctctgaaaat gcgggcatgg actggttcct ggcgttggat 2580
tatgctcatt ctttttgcct gggggacctt attgttttat ataggtggtc atttggttcg 2640
agataatgac caccctgacc attctagcag agaactctcc aagattcttg caaagctgga 2700
gcgcttaaaa caacaaaatg aagacttgag gagaatggct gagtctctcc ggtaggtttg 2760
aaatactcaa ggatttgatg aaatactgtg cttgaccttt aggtataggg tctcagtctg 2820
ctgttgaaaa atataatttc tacaaaccgt ctttgtaaaa ttttaagtat tgtagcagac 2880
tttttaaaag tcagtgatac atctatatag tcaatatagg tttacatagt tgcaatctta 2940
106
PL 218 428 B1
ttttgcatat gaatcagtat atagaagcag : tggcatttat ; atgcttatgt tgcatttaca i 3000
attatgttta gacgaacaca aactttatgt gatttggatt agtgctcatt aaattttttt . 3060
attctatgga ctacaacaga gacataaatt ttgaaaggct tagttactct taaattctta 3120
tgatgaaaag caaaaattca ttgttaaata gaacagtgca tccggaatgt gggtaattat 3180
tgccatattt ctagtctact aaaaattgtg gcataactgt tcaaagtcat cagttgtttg 3240
gaaagccaaa gtctgattta aatggaaaac ataaacaatg atatctattt ctagatacct 3300
ttaacttgca gttactgagt ttacaagttg tctgacaact ttggattctc ttacttcata 3360
tctaagaatg atcatgtgta cagtgcttac tgtcacttta aaaaactgca gggctagaca 3420
tgcagatatg aagactttga cattagatgt ggtaattggc actaccagca agtggtatta 3480
agatacagct gaatatatta ctttttgagg aacataattc atgaatggaa agtggagcat 3540
tagagaggat gccttctggc tctcccacac cactgtttgc atccattgca tttcacactg 3600
cttttagaac tcagatgttt catatggtat attgtgtaac tcaccatcag ttttatcttt 3660
aaatgtctat ggatgataat gttgtatgtt aacactttta caaaaacaaa tgaagccata 3720
tcctcggtgt gagttgtgat- ggtggtaatt gtcacaatag gattattcag caaggaacta 3780
agtcagggac aagaagtggg cgatactttg ttggattaaa tcattttact ggaagttcat 3840.
cagggagggt tatgaaagtt gtggtctttg aactgaaatt atatgtgatt cattattctt 3900
gatttaggcc ttgctaatag taactatcat ttattgggaa tttgtcatat gtgccaattt 3960
gtcatgggcc agacagcgtg ttttactgaa tttctagata tctttatgag attctagtac 4020
tgttttcagc cattttacag atgaagaatc ttaaaaaatg ttaaataatt tagtttgccc 4080
aagattatac gttaacaaat ggtagaacct tctttgaatt ctggcagtat ggctacacag 4140
tccgaactct tatcttccta agctgaaaac agaaaaagca atgacccaga aaattttatt - 4200
PL 218 428 B1
107
taaaagtctc aggagagact tcccatcctg agaagatctc ttttcccttt tataatttag 4260
gctcctgaat aatcactgaa ttttctccat gttccatcta tagtactgtt atttctgttt 4320
tccttttttc ttaccacaaa gtatcttgtt tttgctgtat gaaagaaaat gtgttattgt 4380
aatgtgaaat tctctgtccc tgcagggtcc cacatccgcc tcaatcccaa ataaacacac 4440
agaggctgta ttaattatga aactgttggt cagttggcta gggcttctta ttggctagct 4500
ctgtcttaat tattaaacca taactactat tgtaagtatt tccatgtggt cttatcttac 4560
caaggaaagg gtccagggac ctcttactcc tctggcgtgt tggcagtgaa gaggagagag 4620
cgatttccta tttgtctctg cttattttct gattctgctc agctatgtca cttcctgcct 4680
ggccaatcag ccaatcagtg ttttattcat tagccaataa aagaaacatt tacacagaag 4740
gacttccccc atcatgttat ttgtatgagt tcttcagaaa atcatagtat cttttaatac 4800
taatttttat aaaaaattaa ttgtattgaa aattatgtgt atatgtgtct gtgtgtcgat 4860
ttgtgctcat aagtagcatg gagtgcagaa gagggaatca gatctttttt taagggacaa 4920
agagtttatt cagattacat tttaaggtga taatgtatga ttgcaaggtt atcaacatgg 4980
cagaaatgtg aagaagctgg tcacattaca tccagagtca agagtagaga gcaatgaatt 5040
gatgcatgca ttcctgtgct cagctcactt ttcctggagc tgagctgatt gtaagccatc 5100
tgatgtcttt gctgggaact aactcaaagg caagttcaaa acctgttctt aagtataagc 5160
catctctcca gtccctcata tggtctctta agacactttc tttatattct tgtacataga 5220
aattgaattc ctaacaactg cattcaaatt acaaaatagt ttttaaaagc tgatataata 5280
aatgtaaata caatctagaa catttttata aataagcata ttaactcagt aaaaataaat 5340
gcatggttat tttccttcat tagggaagta tgtctcccca ggctgttctc tagattctac 5400
tagtaatgct gtttgtacac catccacagg ggttttattt taaagctaag acatgaatga 5460
tggacatgct tgttagcatt tagacttttt tccttactat aattgagcta gtatttttgt 5520
108
PL 218 428 B1
gctcagtttg atatctgtta attcagataa atgtaatagt aggtaatttc tttgtgataa . 5580
aggcatataa attgaagttg gaaaacaaaa gcctgaaatg acagttttta agattcagaa 5640
caataatttt caaaagcagt tacccaactt tccaaataca atctgcagtt ttcttgatat 5700
gtgataaatt tagacaaaga aatagcacat tttaaaatag ctatttactc ttgatttttt 5760
tttcaaattt aggctagttc actagttgtg tgtaaggtta tggctgcaaa catctttgac 5820
tcttggttag ggaatccagg atgatttacg tgtttggcca aaatcttgtt ccattctggg 5880
tttcttctct atctaggtag ctagcacaag ttaaaggtgt ggtagtattg gaaggctctc 5940
aggtatatat ttctatattc tgtatttttt tcctctgtca tatatttgct ttctgtttta 6000
ttgatttcta ctgttagttt gatacttact ttcttacact ttctttggga tttattttgc 6060
tgttctaaga tttcttagca agttcatatc actgatttta acagttgctt cttttgtaat 6120
atagactgaa tgccccttat ttgaaatgct tgggatcaga aactcagatt tgaacttttc 6180
ttttttaata tttccatcaa gtttaccagc tgaatgtcct gatccaagaa tatgaaatct 6240
gaaatgcttt gaaatctgaa acttttagag tgataaagct tccctttaaa ttaatttgtg 6300
ttctatattt tttgacaatg tcaacctttc attgttatcc aatgagtgaa catattttca 6360
atttttttgt ttgatctgtt atattttgat ctgaccatat ttataaaatt ttatttaatt 6420
tgaatgttgt gctgttactt atctttatta ttatttttgc ttattttcta gccaaatgaa 6480
attatattct gtattatttt agtttgaatt ttactttgtg gcttagtaac tgccttttgt 6540
tggtgaatgc ttaagaaaaa cgtgtggtct actgatattg gttctaatct tatatagcat 6600
gttgtttgtt aggtagttga ttatgctggt cagattgtct tgagtttatg caaatgtaaa 6660
atatttagat gcttgttttg ttgtctaaga acaaagtatg cttgctgtct cctatcggtt 6720
ctggtttttc cattcatctc ttcaagctgt tttgtgtgtt gaatactaac tccgtactat 6780
PL 218 428 B1
109 cttgttttct gtgaattaac cccttttcaa aggtttcttt tctttttttt tttaagggac 6840 aacaagttta ttcagattac attttaagct gataatgtat gattgcaagg ttatcaacat 6900 ggcagaaatg tgaagaagct aggcacatta catccacatg gagtcaagag cagagagcag 6960 tgaattaatg catgcattcc tgtggtcagc tcacttttcc tattcttaga tagtctagga 7020 tcataaacct ggggaatagt gctaccacaa tgggcatatc cacttacttc agttcatgca 7080
atcaaccaag gcacatccac aggaaaaact gatttagaca acctctcatt gagactcttc 7140
ccagatgatt agactgtgtc aagttgacaa ttaaaactat cacacctgaa gccatcacta 7200
gtaaatataa tgaaaatgtt gattatcacc ataattcatc tgtatccctt tgttattgta 7260
gattttgtga agttcctatt caagtccctg ttccttcctt aaaaacctgt tttttagtta 7320
aataggtttt ttagtgttcc tgtctgtaaa tactttttta aagttagata ttattttcaa 7380
gtatgttctc ccagtctttg gcttgtattt tcatcccttc aatacatata tttttgtaat 7440
ttattttttt tatttaaatt agaaacaaag ctgcttttac atgtcagtct cagttccctc 7500
tccctcccct cctcccctgc tccccaccta agccccaatt ccaactcctt tcttctcccc 7560
aggaagggtg aggccctcca tgggggaaat cttcaatgtc tgtcatatca tttggagcag 7620
ggcctagacc ctccccagtg tgtctaggct gagagagtat ccctctatgt ggagagggct 7680
cccaaagttc atttgtgtac taggggtaaa tactgatcca ctatcagtgg ccccatagat 7740
tgtccggacc tccaaactga cttcctcctt cagggagtct ggaacagttc tatgctggtt 7800
tcccagatat cagtctgggg tccatgagca accccttgtt caggtcagtt gtttctgtag 7860
gtttccccag cccggtcttg acccctttgc tcatcacttc tccctctctg caactggatt 7920
ccagagttca gctcagtgtt tagctgtggg tgtctgcatc tgcttccatc agctactgga 7980
tgagggctct aggatggcat ataaggtagt catcagtctc attatcagag aagggctttt 8040
aaggtagcct cttgattatt gcttagattg ttagttgggg tcaaccttgt aggtctctgg ; 8100
110
PL 218 428 B1
acagtgacag aattctcttt aaacctataa tggctccctc tgtggtggta tcccttttct 8160
tgctctcatc cgttcctccc ctgactagat cttcctgctc cctcatgtcc tcctctcccc 8220
tccccttctc cccttctctt tcttctaact ccctctcccc tccacccacg atccccatta 8280
gcttatgaga tcttgtcctt attttagcaa aacctttttg gctataaaat taattaattt 8340
aatatgctta tatcaggttt attttggcta gtatttgtat gtgtttggtt agtgttttta 8400
accttaattg acatgtatcc ttatatttag acacagattt aaatatttga agtttttttt 8460
tttttttttt ttaaagattt atttattttt tatgtcttct gcctgcatgc cagaagaggg 8520
caccagatct cattcaaggt ggttgtgagc caccatgtgg ttgctgggaa ttgaactcag 8580
gacctctgga agaacagtca gtgctcttaa ccgctgagcc atctctccag cccctgaagt 8640
gtttctttta aagaggatag cagtgcatca tttttccctt tgaccaatga ctcctacctt 8700
actgaattgt tttagccatt tatatgtaat gctgttacca ggtttacatt ttcttttatc 8760
ttgctaaatt tcttccctgt ttgtctcatc tcttattttt gtctgttgga ttatataggc 8820
ttttattttt ctgtttttac agtaagttat atcaaattaa aattatttta tggaatgggt 8880
gtgttgacta catgtatgtc tgtgcaccat gtgctgacct ggtcttggcc agaagaaggt 8940
gtcatattct ctgaaactgg tattgtggat gttacgaact gccatagggt gctaggaatc 9000
aaaccccagc tcctctggaa aagcagccac tgctctgagc cactgagtcc tctcttcaag 9060
caggtgatgc caacttttaa tggttaccag tggataagag tgcttgtatc tctagcaccc 9120
atgaaaattt atgcattgct atatgggctt gtcacttcag cattgtgtga cagagacagg 9180
aggatcccaa gagctc 9196
<210> 4 <211> 25 <212> DNA
PL 218 428 B1
111 <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 4 actcatcttg gaatctcaga attgg 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 5 cttgaccgtt tctatcttct ctcg 24 <210> 6 <211> 979 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 6 actcatcttg gaatctcaga attggcgcta tgctactgga ggatgggaga ctgtgtttag 60 acctgtaagt gagacatgca cagacaggtc tggcctctcc actggacact ggtcaggtga 120 agtgaaggac aaaaatgttc aagtggtcga gctccccatt gtagacagcc tccatcctcg 180 tcctccttac ttacccttgg ctgtaccaga agaccttgca gatcgactcc tgagagtcca 240 tggtgatcct gcagtgtggt gggtatccca gtttgtcaaa tacttgatcc gtccacaacc 300 ttggctggaa agggaaatag aagaaaccac caagaagctt ggcttcaaac atccagttat 360 tggagtccat gtcagacgca ctgacaaagt gggaacagaa gcagccttcc atcccattga 420 ggaatacatg gtacacgttg aagaacattt tcagcttctc gaacgcagaa tgaaagtgga 480
112
PL 218 428 B1 taaaaaaaga gtgtatctgg ccactgatga cccttctttg ttaaaggagg caaagacaaa 540 gtactccaat tatgaattta ttagtgataa ctctatttct tggtcagctg gactacacaa 600 ccgatacaca gaaaattcac ttcggggcgt gatcctggat atacactttc tctcccaggc 660 tgacttcctt gtgtgtactt tttcatccca ggtctgtagg gttgcttatg aaatcatgca 720 aacactgcat cctgatgcct ctgcaaactt ccattcttta gatgacatct actattttgg 780 aggccaaaat gcccacaacc agattgcagt ttatcctcac caacctcgaa ctaaagagga 840 aatccccatg gaacctggag atatcattgg tgtggctgga aaccattgga atggttactc 900 taaaggtgtc aacagaaaac taggaaaaac aggcctgtac ccttcctaca aagtccgaga 960 gaagatagaa acggtcaag 979 <210> 7 <211> 979 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 7 actcatcttg gaatctcaga attggcgcta tgctactggt ggatgggaga ctgtgtttag 60 acctgtaagt gagacatgca cagacagatc tggcctctcc actggacact ggtcaggtga 120 agtgaatgac aaaaatattc aagtggtgga gctccccatt gtagacagcc ttcatcctcg 180 gcctccttac ttaccactgg ctgttccaga agaccttgca gatcgactcg taagagtcca 240 tggtgatcct gcagtgtggt gggtgtccca gttcgtcaaa tatttgattc gtccacaacc 300 ttggctagaa aaggaaatag aagaagccac caagaagctt ggcttcaaac atccagtcat 360 tggagtccat gtcagacgca cagacaaagt gggaacagag gcagccttcc atcccatcga 420 agagtacatg gtacatgttg aagaacattt tcagcttctc gcacgcagaa tgcaagtgga 480 taaaaaaaga gtatatctgg ctaccgatga ccctgctttg ttaaaggagg caaagacaaa 540
PL 218 428 B1
113 gtactccaat tatgaattta ttagtgataa ctctatttct tggtcagctg gactacacaa 600 tcggtacaca gaaaattcac ttcggggcgt gatcctggat atacactttc tctctcaggc 660 tgacttccta gtgtgtactt tttcatccca ggtctgtcgg gttgcttatg aaatcatgca 720 aaccctgcat cctgatgcct ctgcaaactt ccactcttta gatgacatct actattttgg 780 aggccaaaat gcccacaacc agattgccgt ttatcctcac aaacctcgaa ctgatgagga 840 aattccaatg gaacctggag atatcattgg tgtggctgga aaccattggg atggttattc 900 taaaggtgtc aacagaaaac ttggaaaaac aggcttatat ccctcctaca aagtccgaga 960 gaagatagaa acggtcaag 979 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 8 aagtataagc ttacatggat gacgatatcg ctgcgetcgt 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 9 atttaactgc aggaagcatt tgcggtggac gatggagggg 40 <210> 10 <211> 40
114
PL 218 428 B1 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 10 atttaaggta ccgaagcatt tgcggtgcac gatggagggg 40 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 11 ctccaattat gaatttatta gtg 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA’ <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 12 ggatgtttga agccaagctt cttgg 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 13
PL 218 428 B1
115 gtccatggtg atcctgcagt gtgg 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 14 caccaatgat atctccaggt tcc 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 15 gatatcgctg cgctcgttgt cgac 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 16 caggaaggaa ggctggaaaa gagc 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA
116
PL 218 428 B1 <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 17 gatatcgctg cgctcgtcgt cgac <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 18 caggaaggaa ggctggaaga gagc <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 19 atgcgggcat ggactggttc ctgg <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJĄ <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 20 ctatttttca gcttcaggat atgtggg
PL 218 428 B1
117 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 21 gtctgaagca ttatgtgttg aagc 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA rthetic DNA <400> 22 gtgagtacat tcattgtact gtg 23 <210> 23 <211> 575 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 23
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
20 25 30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gin Gin Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
50 55 60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gin Gly Thr Ala Thr
118
PL 218 428 B1
70 75 80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gin Leu Val Lys Ala . Lys Glu Gin
85 90 95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gin Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His
100 105 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
115 120 125
Phe Leu Gin Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu
130 135 140
Leu Gin Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145 150 155 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gin Thr Asp Gly Ala
165 170 175
Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gin
180 185 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gin Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
195 200 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gin Leu
210 215 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gin Arg Thr
225 230 235 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gin Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
245 250 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
260 265 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gin Val
275 280 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
290 295 300
PL 218 428 B1
119
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305 310 315 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gin Phe Val Lys Tyr Leu Ile
325 330 335
Arg Pro Gin Pro Trp Leu Glu Arg Glu Ile Glu Glu Thr Thr Lys Lys
340 345 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
355 360 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro He Glu Glu Tyr Met Val
370 375 380
His Val Glu Glu His Phe Gin Leu Leu Glu Arg Arg Met Lys Val Asp 385 390 395 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
420 425 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu 435 His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
440 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gin Ala Asp Phe Leu Val
450 455 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gin Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gin
465 470 475 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gin Asn Ala His Asn Gin Ile Ala Val Tyr Pro
500 505 510
His Gin Pro Arg Thr Lys Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
515 520 525
120
PL 218 428 B1
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asn Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
530 535 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545 550 555 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
565 570 575 <210> 24 <211> 575 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 24
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
20 25 30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gin Gin Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro He Asp Gin Gly Thr Ala Thr
70 75 80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gin Leu Val Lys Ala Lys Glu Gin
90 95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gin Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125
Phe Leu Gin Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140
PL 218 428 B1
121
Leu Gin Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160
Arg Ser Ile Met Thr 165 Asp Leu Tyr Tyr Leu 170 Ser Gin Thr Asp Gly Ala 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gin
180 185 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gin Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
195 200 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gin Leu
210 215 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gin Arg Thr
225 230 235 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gin Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
245 250 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
260 265 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gin Val
275 280 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
290 295 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305 310 315 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gin Phe Val Lys Tyr Leu Ile
325 330 335
Arg Pro Gin Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
340 345 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
355 360 365
122
PL 218 428 B1
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
370 375 380
His Val Glu Glu His Phe Gin Leu Leu Ala Arg Arg Met Gin Val Asp
385 390 395 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu
405 410 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
420 425 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
435 440 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gin Ala Asp Phe Leu Val
450 455 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gin Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gin
465 470 475 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gin Asn Ala His Asn Gin Ile Ala Val Tyr Pro 500 505 510
His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu He Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn
530 535 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Yal Arg Glu
545 550 555 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
565 570 575 <210> 25 <211> 18 <212> PRT
PL 218 428 B1
123 <213> Homo sapiens <40Q> 25
Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys 15 10 15
Pro Cys <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 26 cttgtgtgac tcttaactct cagag 25 <21O> 27 <2Π> 23 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 27 ccctcgagat aacttcgtat agc 23 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI; SYNTETYCZNE DNA <400> 28
124
PL 218 428 B1 ggtaggcctc actaactg <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <22O>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 29 catagaaaca agtaacaaca gccag 25 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <22O>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 30 gagacttcag cccacttcaa ttattggc 28 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213 > SZTUCZNA SEKWENCJA.
<220>
<223> iQPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 31 gaggccactt gtgtagcgcc aagtg 25 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA
PL 218 428 B1
125 <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 32 aggaaggtgg cgctcatcac gggc <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <22O>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 33 taaggccaca agtcttaatt gcatcc <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 34 caggggtgtt cccttgagga ggtggaa <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 35 cccctcacgc atgaagcctg gag
126
PL 218 428 B1 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 36 ggcaggagac caccttgcga gtgcccac 28 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 37 ggcgctggct tacccggaga ggaatggg 28 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 38 aaaaggcctc agttagtgaa ctgtatgg 28 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
PL 218 428 B1
127 <223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 39 cgcggatcct caagcgttgg ggttggtcc 29 <210> 40 <211> 45 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 40 cccaagcttg ccaccatggc tcacgctccc gctagctgcc cgagc 45 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 41 ccggaattct gccaagtatg agccatcctg g 31 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 42 gccatccaga aggtggt 17 <210> 43
128
PL 218 428 B1 <211> 17 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <22O>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 43 gtcttgtcag ggaagat <21O> 44 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <22O>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 44 ggcaggagac caccttgcga gtgcccac 28 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 45 gggtgggctg taccttctgg aacagggc 28 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA
PL 218 428 B1
129 <400> 46 ggcgctggct tacccggaga ggaatggg 28 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 47 ggaatgggtg tttgtctcctc caaagatgc 28
<210> 48
<211> 1316 <212> DNA <213> Cricetulus griseus
<400> 48 gccccgcccc ctccacctgg accgagagta gctggagaat tgtgcaccgg aagtagctct 60
tggactggtg gaaccctgcg caggtgcagc aacaatgggt gagccccagg gatccaggag 120
gatcctagtg acagggggct ctggactggt gggcagagct atccagaagg tggtcgcaga 180
tggcgctggc ttacccggag aggaatgggt gtttgtctcc tccaaagatg cagatctgac 240
ggatgcagca caaacccaag ccctgttcca gaaggtacag cccacccatg tcatccatct 300
tgctgcaatg gtaggaggcc ttttccggaa tatcaaatac aacttggatt tctggaggaa 360
gaatgtgcac atcaatgaca acgtcctgca ctcagctttc gaggtgggca ctcgcaaggt 420
ggtctcctgc ctgtccacct gtatcttccc tgacaagacc acctatccta ttgatgaaac 480
aatgatccac aatggtccac cccacagcag caattttggg tactcgtatg ccaagaggat 540
gattgacgtg cagaacaggg cctacttcca gcagcatggc tgcaccttca ctgctgtcat 600
ccctaccaat gtctttggac ctcatgacaa cttcaacatt gaagatggcc atgtgctgcc 660
130
PL 218 428 B1 tggcctcatc cataaggtgc atctggccaa gagtaatggt tcagccttga ctgtttgggg 720 tacagggaaa ccacggaggc agttcatcta ctcactggac ctagcccggc tcttcatctg 780 ggtcctgcgg gagtacaatg aagttgagcc catcatcctc tcagtgggcg aggaagatga 840 agtctccatt aaggaggcag ctgaggctgt agtggaggcc atggacttct gtggggaagt 900 cacttttgat tcaacaaagt cagatgggca gtataagaag acagccagca atggcaagct 960 tcgggcctac ttgcctgatt tccgtttcac acccttcaag caggctgtga aggagacctg 1020 tgcctggttc accgacaact atgagcaggc ccggaagtga agcatgggac aagcgggtgc 1080 tcagctggca atgcccagtc agtaggctgc agtctcatca tttgcttgtc aagaactgag 1140 gacagtatcc agcaacctga gccacatgct ggtctctctg ccagggggct tcatgcagcc 1200 atccagtagg gcccatgttt gtccatcctc gggggaaggc cagaccaaca ccttgtttgt 1260 ctgcttctgc cccaacctca gtgcatccat gctggtcctg ctgtcccttg tctaga 1316 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 49 gatcctgctg ggaccaaaat tgg 23 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA
PL 218 428 B1
131 <400> 50 cttaacatcc caagggatgc tg 22 <210> 51 <211> 1965 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 51 acggggggct cccggaagcg gggaccatgg tgcggcgctt ttccgagatg agaggcaaac ttgtaataac agcagctgac gaaaagcagg agctgaagag aaaggaattg ccccttggag gaaccaaaat tggaaatgga ggatcaacac atggagacaa gtggaattcc ttcacagtcc gacttcccaa tgcaagcgct ttaggaaaaa tttatcagat gttggactta aaactagcca ctggagtttt ggtcacctgt gcagatgata ccattgcatt tgagcagcct ggctttactg gcaccacaca tggagtattt gtattggact agtacaggca atgccaccgt ttcctccata atgccgtgca tagactagga agctttggtc gtcatccatt gcactctgag tatgtctaca cagccaaaaa gctacttgat ttctatgaaa cctatggtga ctttctgcag gcactgggac cgtctctgcg cgaagcgagc ctgcggaagc 60 ctgtggcaac tgggaaattc tgggatgtag 120 agcttgctta caagcaacag ttgtcggaga 180 ttaactacca tgttttcact gatcctcctg 240 tttgttctct tcagtgcctg gaaagcctct 300 tgttaattca ctctggtggc tacagtcaac 360 tcttcacggc tttaccactt ggtgagccca 420 tgtacatgga tttcccctca cgcatgaagc 480 ttgaactata cagcattggg gactctgagt 540 ccctagccca tccatctagt ctggctgtag 600 ctgccggttc tttgcaacat ggtgacctag 660 agcccagcat tgaaaacatg caccacttta 720 aacaggactt gagtgggggt gacaccacct 780 cagatagcct attttacatg gatcataaat 840 gtgtaggccc actgaactgt gaaatagatg 900 ctggagcaac tgcagagtac accaagaaca 960
132
PL 218 428 B1 cctcacacgt cactaaagag gaatcacact tgttggacat gaggcagaaa atattccacc 1020 tcctcaaggg aacacccctg aatgttgttg tccttaataa ctccaggttt tatcacattg 1080 gaacaacgga ggagtatctg ctacatttca cttccaatgg ttcgttacag gcagagctgg 1140 gcttgcaatc catagctttc agtgtctttc caaatgtgcc tgaagactcc catgagaaac 1200 cctgtgtcat tcacagcatc ctgaattcag gatgctgtgt ggcccctggc tcagtggtag 1260 aatattccag attaggacct gaggtgtcca tctcggaaaa ctgcattatc agcggttctg 1320 tcatagaaaa agctgttctg cccccatgtt ctttcgtgtg ctctttaagt gtggagataa 1380 atggacactt agaatattca actatggtgt ttggcatgga agacaacttg aagaacagtg 1440 ttaaaaccat atcagatata aagatgcttc agttctttgg agtctgtttc ctgacttgtt 1500 tagatatttg gaaccttaaa gctatggaag aactattttc aggaagtaag acgcagctga 1560 gcctgtggac tgctcgaatt ttccctgtct gttcttctct gagtgagtcg gttgcagcat 1620 cccttgggat gttaaatgcc attcgaaacc attcgccatt cagcctgagc aacttcaagc 1680 tgctgtccat ccaggaaatg cttctctgca aagatgtagg agacatgctt gcttacaggg 1740 agcaactctt tctagaaatc agttcaaaga gaaaacagtc tgattcggag aaatcttaaa 1800 tacaatggat tttgcctgga aacaggattg caaatgcagg catattctat agatctctgg 1860 gttcttcttt ctttctcccc tctctccttt cctttccctt tgatgtaatg acaaaggtaa 1920 aaatggccac ttctgatgga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1965 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA
PL 218 428 B1
133 <400> 52 caggggtgtt cccttgagga ggtggaa 27 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 53 cactgagcca ggggccacac agcatcc 27 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> I OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 54 cccctcacgc atgaagcctg gag 23 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 55 tgccaccgtt tcctccataa gcccagc 27 <210> 56 <211> 28 <212> DNA
134
PL 218 428 B1 <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 56 atggctcaag ctcccgctaa gtgcccga 28 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 57 tcaagcgttt gggttggtcc tcatgag 27 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 58 tccggggatg gcgagatggg caagc 25 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223>OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 59 cttgacatgg ctctgggctc caag 24
PL 218 428 B1
135 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 60 ccacttcagt cggtcggtag tattt 25 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> .OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 61 cgctcacccg cctgaggcga catg 24 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 62 ggcaggtgct gtcggtgagg tcaccatagt gc 32 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA
136
PL 218 428 B1 <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 63 ggggccatgc caaggactat gtcg 24 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 64 atgtggctga tgttacaaaa tgatg 25 <210> 65 <211> 1504 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220>
<221> CDS <222> (1)..(1119) <400> 65
atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tet ggg gac 48
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp
1 5 10 15
ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc atc acc 96
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
20 25 30
ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac 144
Gly Gin Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
35 40 45
gag gtt cat gga att gta cgg ega tcc agt tca ttt aat aca ggt ega 192
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
PL 218 428 B1
137
50 55 60
att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg 240
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gin Ala His Ile Glu Gly Asn Met
65 70 75 80
aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc eta gta aaa atc 288
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
85 90 95 100
atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc cag agc 336
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gin Ser
105 110 115
cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat gtt gat 384
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
120 125 130
gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt ggc ctt 432
Gly Yal Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
135 140 145
ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg tat gga 480
Ile Asn Ser Yal Lys Phe Tyr Gin Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
150 155 160
aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat cca agg
Lys 165 Yal Gin Glu Ile Pro 170 Gin Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
175 180
teg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta gtg aac
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Yal Yal Asn
185 190 195
ttt ega gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc ttc aat 624
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Yal Asn Gly Ile Leu Phe Asn
200 205 210
cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act ega aaa att agc 672
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Yal Thr Arg Lys Ile Ser
215 220 225
cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720
138
PL 218 428 B1
Arg Ser 230 Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gin Leu Glu Cys Phe Ser Leu
235 240
gga aat ctg gac gcc aaa ega gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc 768
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
245 250 255 260
gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc 816
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gin Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
265 270 275
ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag aaa tea 864
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
280 285 290
ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat 912
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
295 300 305
gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act gtg gat 960
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp
310 315 320
ctg aaa tac tac ega cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga gac tgc 1008
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gin Gly Asp Cys
325 330 335 340
tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc ege gtt gcc ttt gac 1056
Ser Lys Ala Gin Gin Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Yal Ala Phe Asp
345 350 355
gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg aga acc 1104
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gin Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
360 365 370 aac ccc aac gcc tga gcacctctac aaaaaaattc gcgagacatg gactatggtg 1159 Asn Pro Asn Ala
375 cagagccagc caaccagagt ccagccactc ctgagaccat cgaccataaa ccctcgactg 1219 cctgtgtcgt ccccacagct aagagctggg ccacaggttt gtgggcacca ggacggggac 1279 actccagagc taaggccact tcgcttttgt caaaggctcc tctcaatgat tttgggaaat 1339 caagaagttt aaaatcacat actcatttta cttgaaatta tgtcactaga caacttaaat 1399
PL 218 428 B1
139 ttttgagtct tgagattgtt tttctctttt cttattaaat gatctttcta tgacccagca 1459 aaaaaaaaaa aaaaaaggga tataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1504 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 66 atgaagttgc actatggtga cctca 25 <210> 67 <211> 59 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 67 ccgacagcac ctgcctagta aaaatcatca atgaagtcaa acctacagag atctacaat 59 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
<223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 68 gacttagcag agtacactgc agatg 25 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> SZTUCZNA SEKWENCJA <220>
140
PL 218 428 B1 <223> OPIS SZTUCZNEJ SEKWENCJI: SYNTETYCZNE DNA <400> 69 accttggata gaaaggggtg gtctc 25 <210> 70 <211> 125 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 70 ttgatggagt tggcaccttg cggcttctgg atgcaattaa gacttgtggc cttataaatt 60 ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg aactgtatgg aaaagtgcaa gaaatacccc 120 agaaa 125 <210> 71 <211> 376 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 71
Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 15 10 15
Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30
Gly Gin Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
50 55 60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gin Ala His Ile Glu Gly Asn Met
65 70 75 80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
85 90 95 100
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gin Ser
105 110 115
PL 218 428 B1
141
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
120 125 130
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu
135 140 145
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gin Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
150 155 160
Lys Val Gin Glu Ile Pro Gin Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
165 170 175 180
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
185 190 195
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
200 205 210
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 215 220 225
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gin Leu Glu Cys 240 Phe Ser Leu
230 235
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
245 250 255 260
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gin Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
265 270 275
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
280 285 290
Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
295 300 305
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp
310 315 320
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gin Gly Asp Cys
325 330 335 340
142
PL 218 428 B1
Ser Lys Ala Gin Gin Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
345 350 355
Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gin Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
360 365 370
Asn Pro Asn Ala
375 <210> 72 <211> 321 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 72
Met Gly 1 Glu Pro Gin 5 Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser
10 15
Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gin Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
35 40 45
Thr Asp Ala Ala Gin Thr Gin Ala Leu Phe Gin Lys Val Gin Pro Thr
50 55 60
His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn
85 90 95
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys
100 105 110
Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
115 120 125
Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
130 135 140
PL 218 428 B1
143
Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gin Asn Arg Ala . Tyr Phe Gin Gin
145 150 155 160
His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
165 170 175
His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
180 185 190
His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
195 200 205
Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gin Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
210 215 220
Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Vał Glu Pro Ile
225 230 235 240
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp
260 265 270
Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gin Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys
275 280 285
Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gin Ala
290 295 300
Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gin Ala Arg
305 310 315 320
Lys
<210 » 73
<211 > 59 0
<212 :> PR I
<213 > Cr icet ulus gri seus
<400 > 73
Met Ala Ser Leu . Arg i Glu . Ala Ser Leu , Arg Lys Leu , Arg , Arg 1 3he Ser
144
PL 218 428 B1
5 10 15
Glu Met Arg Gly Lys Pro Val Ala Thr Gly Lys Phe Trp Asp Val Val 20 25 30
Val Ile Thr Ala Ala Asp Glu Lys Gin Glu Leu Ala Tyr Lys Gin Gin 35 40 45
Leu Ser Glu Lys Leu Lys Arg Lys Glu Leu Pro Leu Gly Val Asn Tyr 50 55 60
His Val Phe Thr Asp Pro Pro Gly Thr Lys Ile Gly Asn Gly Gly Ser
70 75 80
Thr Leu Cys Ser Leu Gin Cys Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Asp Lys Trp
90 95
Asn Ser Phe Thr Val Leu Leu Ile His Ser Gly Gly Tyr Ser Gin Arg
100 105 110
Leu Pro Asn Ala Ser Ala Leu Gly Lys Ile Phe Thr Ala Leu Pro Leu
115 120 125
Gly Glu Pro Ile Tyr Gin Met Leu Asp Leu Lys Leu Ala Met Tyr Met
130 135 140
Asp Phe Pro Ser Arg Met Lys Pro Gly Val Leu Val Thr Cys Ala Asp
145 150 155 160
Asp Ile Glu Leu Tyr Ser Ile Gly Asp Ser Glu Ser Ile Ala Phe Glu
165 170 175
Gin Pro Gly Phe Thr Ala Leu Ala His Pro Ser Ser Leu Ala Val Gly
180 185 190
Thr Thr His Gly Val Phe Val Leu Asp Ser Ala Gly Ser Leu Gin His
195 200 205
Gly Asp Leu Glu Tyr Arg Gin Cys His Arg Phe Leu His Lys Pro Ser
210 215 220
Ile Glu Asn Met His His Phe Asn Ala Val His Arg Leu Gly Ser Phe
225 230 235 240
PL 218 428 B1
145
Gly Gin Gin Asp Leu Ser Gly Gly Asp Thr Thr Cys His Pro Leu His 245 250 255
Ser Glu Tyr Val Tyr Thr Asp Ser Leu Phe Tyr Met Asp His Lys Ser 260 265 270
Ala Lys Lys Leu Leu Asp Phe Tyr Glu Ser Val Gly Pro Leu Asn Cys 275 280 285
Glu Ile Asp Ala Tyr Gly Asp Phe Leu Gin Ala Leu Gly Pro Gly Ala 290 295 300
Thr Ala Glu Tyr 305 Thr Lys Asn Thr Ser His Val Thr Lys Glu Glu Ser 320
310 315
His Leu Leu Asp Met Arg Gin Lys Ile Phe His Leu Leu Lys Gly Thr
325 330 335
Pro Leu Asn Val Val Val Leu Asn Asn Ser Arg Phe Tyr His Ile Gly
340 345 350
Thr Thr Glu Glu Tyr Leu Leu His Phe Thr Ser Asn Gly Ser Leu Gin
355 360 365
Ala Glu Leu Gly Leu Gin Ser Ile Ala Phe Ser Val Phe Pro Asn Val
370 375 380
Pro Glu Asp Ser His Glu Lys Pro Cys Val Ile His Ser Ile Leu Asn
385 390 395 400
Ser Gly Cys Cys Val Ala Pro Gly Ser Val Val Glu Tyr Ser Arg Leu
405 410 415
Gly Pro Glu Val Ser Ile Ser Glu Asn Cys Ile Ile Ser Gly Ser Val
420 425 430
Ile Glu Lys Ala Val Leu Pro Pro Cys Ser Phe Val Cys Ser Leu Ser
435 440 445
Val Glu Ile Asn Gly His Leu Glu Tyr Ser Thr Met Val Phe Gly Met
450 455 460
146
PL 218 428 B1
Glu Asp Asn Leu Lys Asn Ser Val Lys Thr Ile Ser Asp Ile Lys Met 465 470 475 480
Leu Gin Phe Phe Gly Val Cys Phe Leu Thr Cys Leu Asp Ile Trp Asn 485 490 495
Leu Lys Ala Met 500 Glu Glu Leu Phe Ser Gly Ser Lys Thr Gin Leu Ser
505 510
Leu Trp Thr Ala Arg Ile Phe Pro Vał Cys Ser Ser Leu Ser Glu Ser
515 520 525
Val Ala Ala Ser Leu Gly Met Leu Asn Ala Ile Arg Asn His Ser Pro
530 535 540
Phe Ser Leu Ser Asn Phe Lys Leu Leu Ser Ile Gin Glu Met Leu Leu
545 550 555 560
Cys Lys Asp Val Gly Asp Met Leu Ala Tyr Arg Glu Gin Leu Phe Leu
565 570 575
Glu Ile Ser Ser Lys Arg Lys Gin Ser Asp Ser Glu Lys Ser
580 585 590
Zastrzeżenia patentowe

Claims (33)

1. Komórka, znamienna tym, że technikami inżynierii genetycznej ma zmienioną aktywność następujących enzymów:
(i) aktywność enzymu związanego z syntezą wewnątrzkomórkowego nukleotydocukru, GDP-fukozy, została zniesiona lub zmniejszona (ii) aktywność enzymu związanego z syntezą GDP-fukozy i aktywność a-1,6-fukozylotransferazy została zniesiona, lub zmniejszona, przy czym enzym związany z syntezą GDP-fukozy jest enzymem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c);
(a) GMD (4,6-dehydrataza GDP-mannozowa);
(b) Fx (3,5-epimeraza,4-reduktaza GDP-keto-6-deoksymannozowa);
(c) GFPP (pirofosforylaza GDP-beta-L-fukozowa), a technika inżynierii genetycznej jest wybrana z grupy składającej się z następujących (A), (B), (C) i (D):
(A) technika dysrupcji genu skierowana na gen kodujący enzym;
(B) technika wprowadzania dominującego negatywnego mutanta genu kodującego enzym;
(C) technika wprowadzenia mutacji do enzymu;
(D) technika zahamowania transkrypcji i/lub translacji genu kodującego enzym.
2. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że GMD jest białkiem kodowanym przez jedno z następujących DNA (a) lub (b):
PL 218 428 B1
147 (a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 65;
(b) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 65 i kodujący białko mające aktywność GMD.
3. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że GMD jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 71;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD.
4. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że Fx jest białkiem kodowanym przez jedno z następujących DNA (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 48;
(b) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 48 i kodujący białko mające aktywność Fx.
5. Komórka według zastrzeżenia 1, znamienna tym, że Fx jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx.
6. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że GFPP jest białkiem kodowanym przez jeden z następujących DNA (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 51;
(b) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 51 i kodujący białko mające aktywność GFPP.
7. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że GFPP jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 73;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 73 i mające aktywność GFPP;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 73 i mające aktywność GFPP.
8. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że a-1,6-fukozylotransferaza jest białkiem kodowanym przez jeden z następujących DNA (a), (b), (c) i (d):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 1;
(b) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 2;
(c) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 1 i kodujący białko mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
(d) DNA hybrydyzujący w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 2 i kodujący białko mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy.
9. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że a-1,6-fukozylotransferaza jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b), (c), (d) i (f):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 23;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 24;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
148
PL 218 428 B1 (d) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 24 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
(e) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy;
(f) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 24 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy.
10. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że jest oporna co najmniej na lektynę rozpoznającą łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy związana jest z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy przez wiązanie a w końcu redukującym w N-glikozydowo związanym łańcuchu cukrowym.
11. Komórka według zastrz. 1-10, znamienna tym, że jest komórką wybraną z grupy składającej się z następujących od (a) do (i):
(a) komórka CHO pochodząca z tkanki jajnika chomika chińskiego;
(b) linia komórkowa szczurzego szpiczaka, komórka YB2/3HLP2G11.16Ag.20;
(c) linia komórkowa mysiego szpiczaka, komórka NSO;
(d) linia komórkowa mysiego szpiczaka, komórka SP2/0-Ag14;
(e) komórka BHK pochodząca z tkanki nerkowej chomika syryjskiego;
(f) komórka hybrydoma wytwarzająca przeciwciało;
(g) linia komórkowa ludzkiej białaczki, komórka Namalwa;
(h) embrionalna komórka macierzysta z wyjątkiem komórki ludzkiej;
(i) zapłodniona komórka jajowa z wyjątkiem komórki ludzkiej.
12. Komórka według zastrz. 1, do której wprowadzono gen kodujący cząsteczkę przeciwciała.
13. Komórka według zastrz. 12, znamienna tym, że cząsteczka przeciwciała należy do klasy IgG.
14. Sposób wytwarzania przeciwciała, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki określonej w zastrz. 12 w pożywce z wytworzeniem i nagromadzeniem przeciwciała w hodowli, oraz odzyskanie przeciwciała z hodowli.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wytwarzane jest przeciwciało mające wyższą komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciała, niż przeciwciało otrzymane z rodzicielskiej linii komórkowej.
16. Lek, znamienny tym, że jako składnik aktywny zawiera przeciwciało wytworzone sposobem określonym w zastrz. 14.
17. Lek według zastrz. 16, znamienny tym, że jest lekiem diagnostycznym, lekiem zapobiegającym lub lekiem terapeutycznym w chorobach nowotworowych, chorobach alergicznych, chorobach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych, chorobach narządów krążenia, infekcjach wirusowych lub infekcjach bakteryjnych.
18. Komórka CHO pochodząca z tkanki jajnika chomika chińskiego, znamienna tym, że metodą taką jak:
(A) technika dysrupcji genu skierowanej na gen kodujący enzym;
(B) technika wprowadzania dominującego negatywnego mutanta genu kodującego enzym;
(C) technika wprowadzenia mutacji do enzymu;
(D) technika zahamowania transkrypcji i/lub translacji genu kodującego enzym;
(E) technika selekcji linii komórkowej opornej na lektynę, rozpoznającą łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy związana jest z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy przez wiązanie a w końcu redukującym w złożonym N-glikozydowo związanym łańcuchu cukrowym;
została zmniejszona lub usunięta aktywność co najmniej jednego enzymu wybranego z (a) do (d) jest:
(a) (GMD (4,6-dehydrataza GDP-mannozowa);
(b) Fx (3,5-epimeraza, 4-reduktaza GDP-keto-6-deoksymannozowa);
(c) GFPP (pirofosforylaza GDP-beta-L-fukozowa);
(d) alfa-1,6-fukozylotransferaza;
przy czym, jeżeli komórka ta zawiera gen kodujący cząsteczkę przeciwciała klasy IgG, to wytwarza przeciwciało mające złożone N-glikozydowo połączone łańcuchy cukrowe związane z regionem Fc przeciwciała, w którym łańcuch cukrowy, w którym fukoza nie jest związana, jest złożonym N-glikozydowo połączonym łańcuchem cukrowym, w którym pozycja 1 fukozy nie jest związana przez
PL 218 428 B1
149 wiązanie a z pozycją 6 W-acetyloglukozaminy w redukującym końcu, i w którym udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą w redukującym końcu łańcucha cukrowego wynosi więcej niż 20%.
19. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że GMD jest białkiem kodowanym przez DNA spośród następujących:
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. Nr: 65;
(b) DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z DNA obejmującym sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 65 i koduje białko mające aktywność GMD.
20. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że GMD jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 71;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 71 i mające aktywność GMD.
21. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że Fx jest białkiem kodowanym przez DNA spośród następujących: (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 48;
(b) DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 48 i koduje białko mające aktywność Fx.
22. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że Fx jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 72;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 72 i mające aktywność Fx.
23. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że GFPP jest białkiem kodującym DNA wybrane spośród następujących (a) lub (b):
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 51;
(b) DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 51 i koduje białko mające aktywność GFPP.
24. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że GFPP jest białkiem wybranym z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 73;
(b) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 73 i mające aktywność GFPP;
(c) białko obejmujące sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 3 i mające aktywność GFPP.
25. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że a-1,6-fukozylotransferaza jest białkiem kodowanym przez jeden spośród następujących DNA (a), (b);
(a) DNA obejmujący sekwencję nukleotydową reprezentowaną przez SEK. ID. NR: 1;
(b) DNA, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją reprezentowana przez SEK. ID. Nr: 1 i kodujący białko mające aktywność alfa-1,6-fukozylotransferazy.
26. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że alfa-1,6-fukozylotransferaza jest wybrana z grupy składającej się z następujących (a), (b) i (c):
(a) białko obejmujące sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEK. ID. Nr: 23;
(b) białko, które obejmuje sekwencję aminokwasową, w której co najmniej jeden aminokwas uległ delecji, podstawieniu, insercji i/lub dodaniu do sekwencji aminokwasowej reprezentowanej przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność alfa-1,6-fukozylotransferazy;
150
PL 218 428 B1 (c) białko, które obejmuje sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową reprezentowaną przez SEK. NR ID.: 23 i mające aktywność a-1,6-fukozylotransferazy.
27. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że jest oporna co najmniej na lektynę, która rozpoznaje łańcuch cukrowy, w którym pozycja 1 fukozy jest związana z pozycją 6 N-acetyloglukozaminy w redukującym końcu przez wiązanie a w złożonym N-glikozydowo połączonym łańcuchu cukrowym.
28. Komórka CHO według zastrz. 18, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało mające wyższą komórkową aktywność cytotoksyczną, zależną od przeciwciała niż przeciwciało wytwarzane przez macierzystą komórkę CHO.
29. Komórka według zastrz. 12, która wytwarza przeciwciało mające wyższą komórkową aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciała niż przeciwciało, w którym wśród wszystkich złożonych N-glikozydowo połączonych łańcuchów cukrowych związanych z regionem Fc zawartym w przeciwciele, udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą w redukującym końcu łańcucha cukrowego, wynosi więcej niż 20%.
30. Sposób wytwarzania przeciwciała, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki CHO określonej w zastrz. 18 w pożywce z wytworzeniem i gromadzeniem przeciwciała w hodowli i odzyskiwanie przeciwciała z hodowli.
31. Przeciwciało określone w zastrz. 18, znamienne tym, że ma złożone N-glikozydowo połączone łańcuchy cukrowe związane z regionem Fc, które jest wytwarzane przez komórkę CHO określoną w zastrz. 18, w którym wśród wszystkich złożonych N-glikozydowo połączonych łańcuchów cukrowych związanych z regionem Fc, udział łańcucha cukrowego, w którym fukoza nie jest związana z N-acetyloglukozaminą przy końcu redukującym, wynosi 50% lub więcej.
32. Lek, znamienny tym, że zawiera jako składnik aktywny przeciwciało określone w zastrz. 31.
33. Lek według zastrz. 32, znamienny tym, że jest lekiem diagnostycznym, lekiem zapobiegającym lub lekiem terapeutycznym w chorobach nowotworowych, chorobach alergicznych, chorobach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych, chorobach narządów krążenia, infekcjach wirusowych lub infekcjach bakteryjnych.
PL362520A 2000-10-06 2001-10-05 Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG PL218428B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000308526 2000-10-06
PCT/JP2001/008804 WO2002031140A1 (fr) 2000-10-06 2001-10-05 Cellules produisant des compositions d'anticorps

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362520A1 PL362520A1 (pl) 2004-11-02
PL218428B1 true PL218428B1 (pl) 2014-12-31

Family

ID=18788817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362520A PL218428B1 (pl) 2000-10-06 2001-10-05 Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG

Country Status (14)

Country Link
EP (5) EP1331266B1 (pl)
JP (12) JP4290423B2 (pl)
KR (1) KR100877676B1 (pl)
CN (3) CN102311986B (pl)
AU (2) AU9419801A (pl)
BR (1) BR0114475A (pl)
CA (3) CA2785941C (pl)
DK (1) DK2314686T4 (pl)
EA (2) EA013563B1 (pl)
ES (3) ES2651952T3 (pl)
HU (2) HU231090B1 (pl)
MX (1) MXPA03002974A (pl)
PL (1) PL218428B1 (pl)
WO (1) WO2002031140A1 (pl)

Families Citing this family (901)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270149T3 (en) 1999-04-09 2016-05-09 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCEDURE TO CONTROL THE ACTIVITY OF IMMUNOLOGICAL FUNCTIONAL MOLECULE.
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN102311986B (zh) * 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003085102A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose
WO2003084570A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
EP1498491A4 (en) * 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
PL373256A1 (pl) * 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Komórki, których genom jest zmodyfikowany
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
WO2004022597A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3の血中可溶化ｎ端ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞに対する抗体
WO2003085118A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
EP2298805A3 (en) 2002-09-27 2011-04-13 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
AR042145A1 (es) * 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
JP4739954B2 (ja) 2003-03-13 2011-08-03 中外製薬株式会社 変異受容体に対するアゴニスト活性を有するリガンド
JP2010220615A (ja) * 2003-03-18 2010-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
JP2004298180A (ja) * 2003-03-18 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
DE602004028249D1 (de) * 2003-06-18 2010-09-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fucosetransporter
FR2858235B1 (fr) 2003-07-31 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'anticorps optimises en adcc pour traiter les patients faibles repondeurs
JP4643450B2 (ja) 2003-08-08 2011-03-02 株式会社ペルセウスプロテオミクス 癌高発現遺伝子
EP1666501A4 (en) 2003-08-11 2008-12-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-HM1.24 ANTIBODIES WITH MODIFIED SUGAR CHAIN
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
JPWO2005035582A1 (ja) * 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 Ｃｃｒ４に特異的に結合する抗体組成物
EP1688437A4 (en) * 2003-10-08 2007-09-26 Kyowa Hakko Kogyo Kk SPECIALLY BINDING ANTIBODY COMPOSITION TO IL-5 RECEPTOR
JPWO2005035586A1 (ja) * 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
WO2005035577A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
JPWO2005035581A1 (ja) * 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ヒトＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１に特異的に結合する抗体組成物
US7691810B2 (en) * 2003-10-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of producing recombinant antithrombin III composition
US20090028877A1 (en) * 2003-10-09 2009-01-29 Shigeru Iida Antibody Composition Specifically Binding to Ganglioside Gm
EP1705251A4 (en) * 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
JPWO2005035741A1 (ja) * 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
CA2542035C (en) * 2003-10-09 2013-02-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antithrombin iii composition
WO2005035740A1 (ja) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 無血清馴化したゲノム改変細胞
FR2861395B1 (fr) 2003-10-23 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs
JP2007512846A (ja) 2003-12-04 2007-05-24 ゼンコー・インコーポレイテッド 増加した宿主ストリング含有量を有する変異体タンパク質の生成方法およびその組成物
US8491902B2 (en) 2003-12-04 2013-07-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Medicament comprising recombinant antibody against chemokine receptor CCR4
WO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US7329353B2 (en) 2004-01-23 2008-02-12 Amgen Inc. LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2006006693A1 (ja) 2004-07-09 2006-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
CN101014367B (zh) 2004-08-24 2012-07-04 中外制药株式会社 使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的辅助疗法
CA2585196C (en) * 2004-10-26 2015-01-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody having modified sugar chain
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
JP4652414B2 (ja) 2004-11-12 2011-03-16 ゼンコー・インコーポレイテッド ＦｃＲｎとの変化した結合を有するＦｃ変異体
PL1853718T3 (pl) 2005-02-15 2016-01-29 Univ Duke Przeciwciała anty-CD19 i zastosowania w onkologii
WO2006109695A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えハプトグロビン組成物
WO2006109698A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えエリスロポイエチン組成物
WO2006109696A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え卵胞刺激ホルモン組成物
EP1885755A4 (en) 2005-05-05 2009-07-29 Univ Duke TREATMENTS OF AUTOIMMUNE DISEASES BY ANTI-CD19 ANTIBODIES
WO2007021841A2 (en) 2005-08-10 2007-02-22 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using same
WO2007041635A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
WO2007044616A2 (en) 2005-10-06 2007-04-19 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
US8716557B2 (en) 2006-01-17 2014-05-06 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for inhibition of fucosyltransferase and xylosyltransferase expression in plants
EP2540741A1 (en) 2006-03-06 2013-01-02 Aeres Biomedical Limited Humanized anti-CD22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
US20080118978A1 (en) 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
CA2658276A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Sanofi-Aventis Antagonist antibody for the treatment of cancer
EP2050466B1 (en) 2006-08-14 2015-10-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibodies
CA2658557C (en) 2006-08-14 2015-12-01 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target cd19
US8394374B2 (en) 2006-09-18 2013-03-12 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target HM1.24
NZ601022A (en) 2006-10-12 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
WO2008047925A1 (fr) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps anti-hb-egf comme ingrédient actif
CL2007003411A1 (es) 2006-11-28 2008-07-04 Centelion Proteina fusion que consiste en una region fc de una inmunoglobulina con un fragmento o dominio soluble de un receptor para fgf; polinucleotido que la codifica y vector y celula que lo comprenden; composicion farmaceutica que comprende la proteina fu
AU2007332473B2 (en) 2006-12-14 2012-09-27 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Claudin-3 monoclonal antibody, and treatment and diagnosis of cancer using the same
CA2672979A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Selection method
US20100111851A1 (en) 2007-01-05 2010-05-06 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer by using anti-prg-3 antibody
JPWO2008090960A1 (ja) 2007-01-24 2010-05-20 協和発酵キリン株式会社 ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組成物
ES2538990T3 (es) 2007-01-24 2015-06-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Composición de anticuerpo genéticamente recombinante que tiene una actividad efectora mejorada
AU2008216495A1 (en) 2007-02-09 2008-08-21 Genentech, Inc. Anti-Robo4 antibodies and uses therefor
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
DK2447719T3 (en) 2007-02-26 2016-10-10 Oxford Biotherapeutics Ltd proteins
CN101641115B (zh) 2007-03-08 2013-04-24 卡罗拜奥斯制药公司 用于实体瘤治疗的EphA3抗体
JPWO2008114733A1 (ja) 2007-03-16 2010-07-01 協和発酵キリン株式会社 抗Ｃｌａｕｄｉｎ−４抗体
JP5575636B2 (ja) 2007-05-07 2014-08-20 メディミューン，エルエルシー 抗ｉｃｏｓ抗体ならびに、腫瘍、移植および自己免疫疾患の治療におけるその使用
PT2068927E (pt) 2007-05-14 2016-02-10 Medimmune Llc Métodos para reduzir os níveis de eosinófilos
EP3392273A1 (en) 2007-05-30 2018-10-24 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells
MX2009013816A (es) 2007-06-21 2010-02-24 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos.
EP2175016A4 (en) 2007-06-25 2012-03-28 Forerunner Pharma Res Co Ltd ANTI-PROMININ-1 ANTIBODIES WITH ADCC ACTIVITY OR CDC ACTIVITY
CN101883850B (zh) 2007-07-12 2014-11-12 桑格摩生物科学股份有限公司 用于失活α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)基因表达的方法和组合物
EP2626371A1 (en) 2007-07-31 2013-08-14 MedImmune, LLC Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
RU2525133C2 (ru) 2007-08-30 2014-08-10 Дайити Санкио Компани, Лимитед Антитело к epha2
TWI563002B (en) 2007-09-26 2016-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region mutant
CN104109208A (zh) 2007-11-14 2014-10-22 中外制药株式会社 使用抗gpr49抗体的癌症的诊断和治疗
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
KR101620539B1 (ko) 2007-12-21 2016-05-13 메디뮨 리미티드 인터루킨-4 수용체 알파(ＩＬ-4Ｒα)에 대한 결합 구성원-173
DK2235059T3 (en) 2007-12-26 2015-03-30 Xencor Inc FC-VERSIONS OF MODIFIED BINDING TO FcRn
EP2241578B1 (en) 2008-01-11 2016-04-20 The University of Tokyo Anti-cldn6 antibody
MX2010007767A (es) 2008-01-18 2010-08-09 Medimmune Llc Anticuerpos manipulados con cisteina para conjugacion especifica de sitio.
KR101606386B1 (ko) 2008-04-02 2016-03-25 마크로제닉스, 인크. Ｈｅｒ2/ｎｅｕ-특이적 항체 및 그것의 사용 방법
EP2252631B1 (en) 2008-04-02 2016-04-13 MacroGenics, Inc. Bcr-complex-specific antibodies and methods of using same
CL2009000647A1 (es) 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
CN103251948A (zh) 2008-04-11 2013-08-21 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
US9758594B2 (en) 2008-04-25 2017-09-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Stable multivalent antibody
CN102036683A (zh) * 2008-05-20 2011-04-27 株式会社钟化 细胞毒性组合物
WO2009147781A1 (ja) 2008-06-02 2009-12-10 国立大学法人東京大学 抗がん剤
EP2282770B1 (en) 2008-06-04 2018-03-07 MacroGenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
CA2729567C (en) 2008-06-30 2018-04-24 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd27 antibody
US8268592B2 (en) 2008-07-17 2012-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Anti-system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2) antibody
WO2010018847A1 (ja) 2008-08-13 2010-02-18 協和発酵キリン株式会社 遺伝子組換えプロテインs組成物
EP3581588B1 (en) 2008-09-17 2022-06-15 Xencor, Inc. Novel compositions and methods for treating ige-mediated disorders
CN102264763B (zh) 2008-09-19 2016-04-27 米迪缪尼有限公司 定向于dll4的抗体及其用途
EP2340305A1 (en) 2008-09-26 2011-07-06 Eureka Therapeutics, Inc. Cell lines and proteins with variant glycosylation pattern
PE20150682A1 (es) 2008-10-14 2015-05-20 Genentech Inc Variantes de inmunoglobulinas y sus usos
WO2010056804A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Medimmune, Llc Antibody formulation
MX348166B (es) 2008-12-19 2017-06-01 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos.
WO2010074049A1 (ja) 2008-12-22 2010-07-01 株式会社 未来創薬研究所 抗hs6st2抗体及びその用途
JP6039183B2 (ja) 2008-12-23 2016-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド プロテインａに対する結合が変化した免疫グロブリン変異体
US9139647B2 (en) 2008-12-25 2015-09-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-TM4SF20 antibody
CA2748990A1 (en) 2008-12-26 2010-07-01 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody
PL2374883T3 (pl) 2008-12-26 2017-05-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Przeciwciało anty-CD4
AU2010207552A1 (en) 2009-01-21 2011-09-01 Oxford Biotherapeutics Ltd. PTA089 protein
CN102405237A (zh) 2009-03-06 2012-04-04 卡罗拜奥斯制药公司 利用EphA3抗体治疗白血病和慢性骨髓增生性疾病
UA106070C2 (uk) 2009-03-20 2014-07-25 Дженентек, Інк. Антитіло, що специфічно зв'язується з egfr і her3
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
WO2010111254A1 (en) 2009-03-25 2010-09-30 Genentech, Inc. Novel anti-alpha5beta1 antibodies and uses thereof
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
KR101690340B1 (ko) 2009-04-09 2016-12-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체
ES2571235T3 (es) 2009-04-10 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para el tratamiento de un tumor sanguíneo que utiliza el anticuerpo anti-TIM-3
WO2010119691A1 (ja) 2009-04-16 2010-10-21 国立大学法人東京大学 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療
PT2423228E (pt) 2009-04-20 2016-02-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anticorpo contendo igg2 em que foram introduzidas mutações de aminoácidos
KR101732201B1 (ko) 2009-04-27 2017-05-02 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 혈액 종양 치료를 목적으로 하는 항ＩＬ－３Ｒα 항체
WO2010131733A1 (ja) 2009-05-15 2010-11-18 中外製薬株式会社 抗axl抗体
WO2010137654A1 (ja) 2009-05-29 2010-12-02 株式会社未来創薬研究所 Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
PL2438171T3 (pl) * 2009-06-02 2015-04-30 Regeneron Pharma Komórki z niedoborem fukozylacji
ES2697535T3 (es) 2009-06-11 2019-01-24 Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems Procedimiento para la producción de proteína
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2711018A1 (en) 2009-06-22 2014-03-26 MedImmune, LLC Engineered Fc regions for site-specific conjugation
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
SG177679A1 (en) 2009-08-07 2012-02-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Humanized anti-amyloid-b oligomer antibody
CN102597233B (zh) 2009-08-07 2014-10-29 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
AU2010285974A1 (en) 2009-08-17 2012-03-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
CA2772715C (en) 2009-09-02 2019-03-26 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CA2773579C (en) 2009-09-10 2019-01-15 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Medicament including antibody composition specifically bound to human cc chemokine receptor 4 (ccr4)
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
MX2012003404A (es) * 2009-09-22 2012-09-12 Volker Sandig Procedimiento para producir moleculas que contienen estructuras de glicano especializadas.
JP6077745B2 (ja) * 2009-09-30 2017-02-08 富士フイルムＲｉファーマ株式会社 抗ポドプラニン抗体、及び抗ポドプラニン抗体を含む医薬組成物
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
HUE036549T2 (hu) 2009-10-07 2018-07-30 Macrogenics Inc A fukozilezés mértékének megváltozása miatt javított effektor funkciót mutató, Fc-régiót tartalmazó polipeptidek, valamint eljárások alkalmazásukra
US20120282177A1 (en) 2009-11-02 2012-11-08 Christian Rohlff ROR1 as Therapeutic and Diagnostic Target
NO2504364T3 (pl) 2009-11-24 2018-01-06
EP2509626B1 (en) 2009-12-11 2016-02-10 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-vegf-c antibodies and methods using same
MY161868A (en) 2009-12-23 2017-05-15 Genentech Inc Anti-bv8 antibodies and uses thereof
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
US9127071B2 (en) 2010-01-29 2015-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-DLL3 antibody
WO2011097527A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Xencor, Inc. Immunoprotection of therapeutic moieties using enhanced fc regions
MX341687B (es) 2010-02-10 2016-08-30 Immunogen Inc "anticuerpos cd20 y su utilización".
RU2577125C2 (ru) 2010-02-10 2016-03-10 Фуджифилм Ри Фарма Ко., Лтд. Меченное радиоактивным металлом антитело против кадгерина
SG183333A1 (en) 2010-02-18 2012-09-27 Genentech Inc Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
JPWO2011105573A1 (ja) 2010-02-26 2013-06-20 株式会社 未来創薬研究所 抗ｉｃａｍ３抗体およびその用途
EP2543727B1 (en) 2010-03-02 2016-08-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Modified antibody composition
BR112012022210B1 (pt) 2010-03-04 2021-08-17 Macrogenics, Inc Anticorpo isolado ou seu fragmento imunorreativo, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica, e, uso do anticorpo isolado
TW201138823A (en) 2010-03-24 2011-11-16 Genentech Inc Anti-LRP6 antibodies
JP5767207B2 (ja) 2010-03-26 2015-08-19 協和発酵キリン株式会社 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント
CN102971340A (zh) 2010-03-29 2013-03-13 酵活有限公司 具有增强的或抑制的效应子功能的抗体
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
US9169329B2 (en) 2010-06-01 2015-10-27 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies directed to the receptor tyrosine kinase c-Met
PT2581113T (pt) 2010-06-11 2018-07-04 Univ Kyushu Nat Univ Corp Anticorpo anti-tim-3
TW201204388A (en) 2010-06-18 2012-02-01 Genentech Inc Anti-Axl antibodies and methods of use
DK3323830T3 (da) 2010-06-19 2023-09-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-gd2 antibodies
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
EP2592161B1 (en) 2010-07-08 2016-02-03 Honda Motor Co., Ltd. High frequency heating coil
RU2571226C2 (ru) 2010-07-09 2015-12-20 Дженентек, Инк. Антитела против нейропилина и способы их применения
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
CN105585630B (zh) 2010-07-29 2020-09-15 Xencor公司 具有修改的等电点的抗体
BR112013002533A2 (pt) 2010-08-02 2021-09-08 Macrogenics, Inc Polipeptídeo de ligação de proteína sérica e diacorpo complexado ao polipeptídeo de ligação de proteína sérica
MX2013001302A (es) 2010-08-03 2013-03-08 Hoffmann La Roche Biomarcadores de leucemia linfocitica (cll).
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
JP2013541937A (ja) 2010-08-05 2013-11-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｍｈｃ抗体−抗ウイルス性サイトカイン融合タンパク質
NO2603530T3 (pl) 2010-08-13 2018-04-07
WO2012020038A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Roche Glycart Ag Anti-tenascin-c a2 antibodies and methods of use
TW201215405A (en) 2010-08-25 2012-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-18R1 and uses thereof
US20130224191A1 (en) 2010-08-27 2013-08-29 Robert A. Stull Notum protein modulators and methods of use
DK2612151T3 (en) 2010-08-31 2017-10-02 Genentech Inc BIOMARKETS AND METHODS OF TREATMENT
CN106620693A (zh) 2010-09-03 2017-05-10 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 新型调节剂及使用方法
WO2012043747A1 (ja) 2010-09-30 2012-04-05 独立行政法人理化学研究所 グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤
US9228023B2 (en) 2010-10-01 2016-01-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Anti-ROR1 antibodies and methods of use for treatment of cancer
US8481680B2 (en) 2010-10-05 2013-07-09 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
AU2011321374B2 (en) 2010-10-29 2016-04-28 Daiichi Sankyo Company,Limited Novel anti-DR5 antibody
PE20140238A1 (es) 2010-11-10 2014-03-07 Genentech Inc Metodos y composiciones para inmunoterapia para enfermedad neural
JP6013915B2 (ja) 2010-11-17 2016-10-25 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
CN107973851A (zh) 2010-11-30 2018-05-01 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
MX356400B (es) 2010-12-08 2018-05-28 Abbvie Stemcentrx Llc Moduladores novedosos y metodos de uso.
SG191124A1 (en) 2010-12-15 2013-07-31 Kek High Energy Accelerator Protein production method
EP2653541B1 (en) 2010-12-15 2017-11-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for producing proteins
TW201732294A (zh) 2010-12-16 2017-09-16 建南德克公司 關於ｔｈ２抑制作用之診斷及治療
BR112013014527A2 (pt) 2010-12-20 2017-03-07 Genentech Inc anticorpo isolado, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso do imunoconjugado, método para tratamento de um indivíduo que tem um câncer positivo para mesotelina, para inibição de proliferação de uma célula positiva para mesotelina, para detecção de mesotelina humana em uma amostra biológica e para detectar um câncer positivo para mesotelina
KR20130118925A (ko) 2010-12-22 2013-10-30 제넨테크, 인크. 항-pcsk9 항체 및 사용 방법
WO2012090939A1 (ja) 2010-12-27 2012-07-05 国立大学法人名古屋大学 受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する方法
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
FR2971250A1 (fr) 2011-02-07 2012-08-10 Univ Nantes Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associees a l'angiogenese
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
BR112013019975A2 (pt) 2011-02-28 2017-08-01 Hoffmann La Roche proteínas de ligação de antígeno, composição farmacêutica, uso de uma proteína de ligação de antígeno, método para o tratamento de um paciente e método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira"
AU2012226398B9 (en) * 2011-03-06 2017-04-13 Merck Serono S.A. Low fucose cell lines and uses thereof
EP2691417B1 (en) 2011-03-29 2018-08-01 Roche Glycart AG Antibody fc variants
JP2014516511A (ja) 2011-04-07 2014-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｆｇｆｒ４抗体及び使用方法
WO2012144208A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 国立大学法人東京大学 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療
CN103703026B (zh) 2011-04-19 2015-08-26 梅里麦克制药股份有限公司 单特异性和双特异性抗igf-1r和抗erbb3抗体
TWI561531B (en) 2011-04-25 2016-12-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti b7-h3 antibody
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
RU2638806C2 (ru) 2011-05-12 2017-12-15 Дженентек, Инк. Lc-ms/ms способ мониторинга множественных реакций для выявления терапевтических антител в образцах животных с помощью каркасных сигнатурных пептидов
RS56090B1 (sr) 2011-05-16 2017-10-31 Hoffmann La Roche Fgfr1 agonisti i načini primene
UA111612C2 (uk) 2011-05-21 2016-05-25 Макродженікс, Інк. Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці
KR20140033152A (ko) 2011-06-20 2014-03-17 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항erbB3 항체
JP6246711B2 (ja) 2011-06-22 2017-12-13 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 複合体を含むｍｈｃクラスｉを用いてウイルス特異的細胞傷害性ｔ細胞を循環させることによる標的細胞の除去
PT2726094T (pt) 2011-06-28 2017-02-10 Oxford Biotherapeutics Ltd Alvo terapêutico e de diagnóstico
JP2014522843A (ja) 2011-06-30 2014-09-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃ−ｍｅｔ抗体製剤
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
WO2013022855A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering
EP2744824A1 (en) 2011-08-17 2014-06-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Neuregulin antibodies and uses thereof
KR20140048292A (ko) 2011-08-23 2014-04-23 로슈 글리카트 아게 항-mcsp 항체
EP2748197A2 (en) 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
BR112014005720A2 (pt) 2011-09-15 2017-12-12 Genentech Inc método de seleção e/ou identificação de um antagonista de usp1, antagonista de uaf1 e/ou um antagonista de id que promove uma alteração no destino celular do dito método
BR112014006419A2 (pt) 2011-09-19 2018-08-07 Genentech Inc métodos para tratar um paciente com câncer, kit e artigo
KR102239138B1 (ko) 2011-09-30 2021-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
US20130089562A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genenthech, Inc. Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
AU2012323287B2 (en) 2011-10-10 2018-02-01 Xencor, Inc. A method for purifying antibodies
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US9738727B2 (en) 2011-10-14 2017-08-22 Genentech, Inc. Anti-HtrA1 antibodies and methods of use
JP6254087B2 (ja) 2011-10-15 2017-12-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド 癌を治療するためのｓｃｄ１アンタゴニスト
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
SG11201401815XA (en) 2011-10-28 2014-05-29 Genentech Inc Therapeutic combinations and methods of treating melanoma
EP3603671A3 (en) 2011-10-28 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell-specific molecule
JP6326371B2 (ja) 2011-11-04 2018-05-16 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメインにおける変異を有する安定なヘテロ二量体抗体デザイン
AR088920A1 (es) 2011-11-21 2014-07-16 Genentech Inc Purificacion de anticuerpos anti-c-met
WO2013083497A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
WO2013087789A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Glykos Finland Ltd. Antibody isoform arrays and methods thereof
CA2854246A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Full length antibody display system for eukaryotic cells and its use
CA3149402A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 F. Hoffman-La Roche Ag Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
PL2794878T3 (pl) 2011-12-22 2020-07-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Organizacja wektora ekspresyjnego, nowe sposoby generowania komórek produkcyjnych i ich zastosowanie do rekombinowanej produkcji polipeptydów
CA3111357A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
AR089434A1 (es) 2011-12-23 2014-08-20 Genentech Inc Procedimiento para preparar formulaciones con alta concentracion de proteinas
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
JP6242813B2 (ja) 2012-01-18 2017-12-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｌｒｐ５抗体及び使用方法
MX2014008699A (es) 2012-01-18 2014-11-21 Genentech Inc Metodos para utilizar moduladores de fgf19.
KR20140119777A (ko) 2012-01-31 2014-10-10 제넨테크, 인크. 항-ig-e m1'' 항체 및 그의 사용 방법
EP2813568A4 (en) 2012-02-09 2016-04-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd MODIFIED FC REGION OF ANTIBODY
CN113398268A (zh) 2012-02-11 2021-09-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 R-spondin易位及其使用方法
CA2860600C (en) 2012-02-15 2022-07-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
JP6200437B2 (ja) 2012-03-16 2017-09-20 ユニバーシティ ヘルス ネットワーク Ｔｏｓｏ活性を調節するための方法および組成物
SG11201406079TA (en) 2012-03-27 2014-10-30 Genentech Inc Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
JP6059205B2 (ja) 2012-03-30 2017-01-11 第一三共株式会社 ＣＤＲ改変抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体
CA2868965A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-siglec-15 antibody
WO2013154206A1 (ja) 2012-04-09 2013-10-17 第一三共株式会社 抗ｆｇｆｒ２抗体
WO2013155346A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 The Regents Of The University Of California Diagnostic tools for response to 6-thiopurine therapy
CN104768973B (zh) 2012-04-27 2019-01-22 第一三共株式会社 抗robo4抗体
KR20150006000A (ko) 2012-05-01 2015-01-15 제넨테크, 인크. 항-pmel17 항체 및 면역접합체
EP2847230B1 (en) 2012-05-10 2020-08-12 Zymeworks Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the fc domain
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
EP2848633B1 (en) 2012-05-11 2019-02-06 Microbial Chemistry Research Foundation Anti-cxadr antibody
RU2625771C2 (ru) 2012-05-23 2017-07-18 Дженентек, Инк. Способ отбора терапевтических средств
KR20150016579A (ko) 2012-05-30 2015-02-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 조직 특이적 항원 결합 분자
KR101566539B1 (ko) 2012-06-08 2015-11-05 국립암센터 신규한 Ｔｈ2 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도
WO2013188855A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
US20140004121A1 (en) 2012-06-27 2014-01-02 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
WO2014007198A1 (ja) 2012-07-02 2014-01-09 協和発酵キリン株式会社 抗ｂｍｐ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤
EP3138578B1 (en) 2012-07-04 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-theophylline antibodies and methods of use
BR112014029403A2 (pt) 2012-07-04 2018-10-09 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugados, anticorpo e formulação farmacêutica
CN104411725B (zh) 2012-07-04 2018-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗生物素抗体及使用方法
CA3188124A1 (en) 2012-07-05 2014-01-09 Genentech, Inc. Expression and secretion system
EP2870973B1 (en) 2012-07-06 2022-08-31 St. Marianna University School of Medicine Remedy for htlv-1-associated myelopathy patients
CA2874856A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd79b antibodies
EP2869850B1 (en) 2012-07-09 2017-08-23 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd79b antibodies
PE20150615A1 (es) 2012-07-09 2015-05-28 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-cd22 ligado a una pirrolobenzodiazepina
MX2015000315A (es) 2012-07-09 2015-07-06 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd22 e inmunoconjugados.
EP3495387B1 (en) 2012-07-13 2021-09-01 Roche Glycart AG Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
CN104812775B (zh) 2012-07-25 2019-05-03 塞尔德克斯医疗公司 抗kit抗体及其用途
GB201213652D0 (en) 2012-08-01 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
CN107501413A (zh) 2012-09-27 2017-12-22 中外制药株式会社 Fgfr3融合基因和以其作为标靶的药物
JP6273205B2 (ja) 2012-10-05 2018-01-31 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
SI2907824T1 (en) 2012-10-11 2018-06-29 Daiichi Sankyo Company, Limited THE HEALTHY KJUBIER OF THE PROTITEL
US9872924B2 (en) 2012-10-19 2018-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate produced by binding through linker having hydrophilic structure
AU2013337277B2 (en) 2012-11-05 2018-03-08 Foundation Medicine, Inc. Novel NTRK1 fusion molecules and uses thereof
CA2884431A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
EA201590731A1 (ru) 2012-11-13 2015-11-30 Дженентек, Инк. Антитела к гемагглютинину и способы применения
JP6310397B2 (ja) 2012-12-06 2018-04-11 国立大学法人金沢大学 中皮腫の治療方法
KR20150094617A (ko) 2012-12-07 2015-08-19 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항 ｆｏｌｒ１ 항체
AU2013360775B2 (en) 2012-12-21 2018-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Disulfide-linked multivalent MHC class I comprising multi-function proteins
EP4119947A1 (en) 2012-12-21 2023-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
EP2943506B1 (en) 2013-01-10 2024-03-13 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014110601A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
WO2014113510A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EP2945652B1 (en) 2013-01-18 2021-07-07 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
PL2953972T3 (pl) 2013-02-05 2021-03-08 Engmab Sàrl Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
JP6357113B2 (ja) 2013-02-08 2018-07-11 株式会社医学生物学研究所 ヒトｎｒｇ１タンパク質に対する抗体
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
CA2900097A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cancer and preventing drug resistance
CN104936987A (zh) 2013-02-26 2015-09-23 罗切格利卡特公司 抗mcsp抗体
US9925240B2 (en) 2013-03-06 2018-03-27 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
BR112015021462A2 (pt) 2013-03-06 2017-10-10 Adimab Llc anticorpos biespecíficos anti-c-met tandem fc
KR20150127203A (ko) 2013-03-14 2015-11-16 제넨테크, 인크. Mek 억제제 화합물과 her3/egfr 억제제 화합물의 조합물 및 사용 방법
CN105189552B (zh) 2013-03-14 2019-08-02 基因泰克公司 抗b7-h4抗体和免疫缀合物
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
JP2016516046A (ja) 2013-03-14 2016-06-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの治療方法及びがん薬物耐性を阻止する方法
WO2014144763A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center High affinity anti-gd2 antibodies
EP2970486B1 (en) 2013-03-15 2018-05-16 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
BR112015021521A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Genentech Inc anticorpos anti-crth2 e métodos para seu uso
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
JP6568514B2 (ja) 2013-03-15 2019-08-28 エーシー イミューン エス．エー． 抗タウ抗体及び使用方法
WO2014145016A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use
DK3587448T3 (da) 2013-03-15 2021-08-09 Xencor Inc Heterodimere proteiner
ES2761260T3 (es) 2013-03-15 2020-05-19 Hoffmann La Roche Biomarcadores y procedimientos de tratamiento de afecciones relacionadas con PD-1 y PD-L1
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US9550829B2 (en) 2013-03-15 2017-01-24 Genentech, Inc. Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9260527B2 (en) 2013-03-15 2016-02-16 Sdix, Llc Anti-human CXCR4 antibodies and methods of making same
MX2015011899A (es) 2013-03-15 2016-05-05 Genentech Inc Metodos para el tratamiento de cáncer y prevención de resistencia a los fármacos para el cáncer.
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2014174596A1 (ja) 2013-04-23 2014-10-30 株式会社医学生物学研究所 ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子に対する機能性モノクローナル抗体
SG10201810481UA (en) 2013-04-29 2018-12-28 Hoffmann La Roche Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
PL2992010T3 (pl) 2013-04-29 2021-08-23 F.Hoffmann-La Roche Ag Modyfikowane asymetryczne przeciwciała wiążące receptor Fc i sposoby ich stosowania
CA2904806C (en) 2013-04-29 2021-11-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
EA038367B1 (ru) 2013-05-20 2021-08-16 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА (TfR) И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
EP3004161B1 (en) 2013-05-31 2019-10-02 Genentech, Inc. Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
EA201592078A1 (ru) 2013-05-31 2016-04-29 Дженентек, Инк. Антитела против тейхоевых кислот клеточной стенки и их конъюгаты
JPWO2014208482A1 (ja) 2013-06-24 2017-02-23 中外製薬株式会社 ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
SI3027651T1 (sl) 2013-08-01 2019-05-31 Five Prime Therapeutics, Inc. Afukozilirana protitelesa proti fgfr2iiib
KR20160055252A (ko) 2013-09-17 2016-05-17 제넨테크, 인크. 항-lgr5 항체의 사용 방법
MX2016003643A (es) 2013-09-30 2016-12-20 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo anti-lps o11.
EP3056215B1 (en) 2013-10-08 2019-11-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-fgfr2 antibody and other agent
CA2926084A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Genentech, Inc. Nsp4 inhibitors and methods of use
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
WO2015054691A2 (en) 2013-10-11 2015-04-16 The United States Of America, As Pepresented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tem8 antibodies and their use
EA036927B1 (ru) 2013-10-11 2021-01-15 Оксфорд Биотерепьютикс Лтд Конъюгированные антитела против ly75 для лечения рака
RU2016114074A (ru) 2013-10-18 2017-11-23 Дженентек, Инк. Анти-rspo антитела и способы применения
JP6715767B2 (ja) 2013-10-23 2020-07-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 好酸球性疾患の診断及び治療方法
WO2015068781A1 (ja) 2013-11-06 2015-05-14 国立大学法人大阪大学 インフルエンザウイルスａ型のグループ１に対して広域な中和活性を有する抗体
KR102399292B1 (ko) 2013-11-21 2022-05-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-알파-시누클레인 항체 및 사용 방법
AU2014358191B2 (en) 2013-12-04 2020-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
SG11201604784XA (en) 2013-12-13 2016-07-28 Genentech Inc Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
JP2017501157A (ja) 2013-12-17 2017-01-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及び抗ｃｄ２０抗体を使用してがんを治療する方法
KR20240017102A (ko) 2013-12-17 2024-02-06 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 이용한 암 치료 방법
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
CA2934028A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
BR122021025085B1 (pt) 2013-12-17 2023-04-04 Genentech, Inc Anticorpo anti-cd3, célula hospedeira procariótica, método de produção do anticorpo biespecífico, imunoconjugado, composição, uso do anticorpo biespecífico e kit
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
KR102088169B1 (ko) 2013-12-25 2020-03-12 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트
US9758578B2 (en) 2013-12-26 2017-09-12 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Human anti-IL-33 neutralizing monoclonal antibody
US10391081B2 (en) 2013-12-27 2019-08-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FGFR gatekeeper mutant gene and drug targeting same
JP6476194B2 (ja) 2014-01-03 2019-02-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 二重特異性抗ハプテン／抗血液脳関門受容体抗体、それらの複合体、及び血液脳関門シャトルとしてのそれらの使用
RU2682754C2 (ru) 2014-01-03 2019-03-21 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты полипептидного токсина и антитела, соединенных ковалентной связью
WO2015101587A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
EP3092251B1 (en) 2014-01-06 2021-01-20 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent blood brain barrier shuttle modules
JP6786392B2 (ja) 2014-01-15 2020-11-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ＦｃＲｎ結合特性が改変され、プロテインＡ結合特性が保持されているＦｃ領域変異体
CN106413756A (zh) 2014-01-24 2017-02-15 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗steap1抗体和免疫缀合物的方法
KR102190548B1 (ko) 2014-01-31 2020-12-14 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항-her2 항체-약물 접합체
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
SG10201901076WA (en) 2014-02-08 2019-03-28 Genentech Inc Methods of treating alzheimer's disease
KR20210121288A (ko) 2014-02-08 2021-10-07 제넨테크, 인크. 알츠하이머 질환을 치료하는 방법
TWI631135B (zh) 2014-02-12 2018-08-01 建南德克公司 抗ｊａｇｇｅｄ１抗體及使用方法
CR20160379A (es) 2014-02-21 2016-10-07 Genentech Inc Anticuerpos biespecificos anti-il 13/il-17 y sus usos
US20150252434A1 (en) 2014-03-07 2015-09-10 University Health Network Methods and compositions for detection of targets involved in cancer metastasis
HRP20211748T1 (hr) 2014-03-14 2022-02-18 F. Hoffmann - La Roche Ag Postupci i sastavi za sekreciju heterolognih polipeptida
US20170107294A1 (en) 2014-03-21 2017-04-20 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
RU2016141385A (ru) 2014-03-24 2018-04-28 Дженентек, Инк. Лечение рака антагонистами с-мет и их корреляция с экспрессией hgf
PL3122781T3 (pl) 2014-03-28 2020-06-15 Xencor, Inc. Dwuswoiste przeciwciała, które wiążą się z CD38 i CD3
JP6588461B2 (ja) 2014-03-31 2019-10-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗血管新生剤及びｏｘ４０結合アゴニストを含む併用療法
PE20161571A1 (es) 2014-03-31 2017-02-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-ox40 y metodos de uso
KR20240008415A (ko) 2014-04-10 2024-01-18 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항her3 항체-약물 콘주게이트
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
EP3141603A4 (en) 2014-05-08 2017-12-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeted therapeutic agent for administration to patients for whom gpc3-targeted therapeutic agent therapy is effective
WO2015179658A2 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Genentech, Inc. Anti-gpc3 antibodies and immunoconjugates
CN106661622B (zh) 2014-05-23 2020-08-21 豪夫迈·罗氏有限公司 Mit生物标志物和使用它们的方法
ES2894867T3 (es) 2014-06-03 2022-02-16 Xbiotech Inc Composiciones y procedimientos de tratamiento y prevención de infecciones por estafilococo áureo
WO2015191715A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Genentech, Inc. Anti-lgr5 antibodies and uses thereof
US20230190750A1 (en) 2014-06-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
MX2016015280A (es) 2014-06-26 2017-03-03 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-bromodesoxiuridina(brdu) y metodos de uso.
DK3309174T3 (da) 2014-07-11 2022-06-07 Ventana Med Syst Inc ANTI-PD-L1-antistoffer og diagnostiske anvendelser deraf
CA2952315A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Genentech, Inc. Notch pathway inhibition
AU2015292326A1 (en) 2014-07-24 2017-02-23 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
ES2913865T3 (es) 2014-08-28 2022-06-06 Bioatla Inc Receptores de antígeno quimérico condicionalmente activos para células T modificadas
TWI805109B (zh) 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
AR101846A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados
WO2016040724A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
PL3191135T3 (pl) 2014-09-12 2021-01-25 Genentech, Inc. Przeciwciała i immunokoniugaty anty-HER2
MX2017003472A (es) 2014-09-17 2017-10-31 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-her2.
SI3262071T1 (sl) 2014-09-23 2020-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Način uporabe imunokonjugatov proti CD79b
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3207057A2 (en) 2014-10-16 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
WO2016070001A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind b7-h4
MX2017005751A (es) 2014-11-03 2018-04-10 Genentech Inc Métodos y biomarcadores para predecir la eficacia y evaluación de un tratamiento con agonista de ox40.
SG11201703448QA (en) 2014-11-03 2017-05-30 Genentech Inc Assays for detecting t cell immune subsets and methods of use thereof
CA2963974A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
AR102521A1 (es) 2014-11-06 2017-03-08 Hoffmann La Roche Variantes de región fc con unión de fcrn modificada y métodos de utilización
BR112017006591A2 (pt) 2014-11-06 2018-01-16 Hoffmann La Roche polipeptídeo heterodimérico, formulação farmacêutica e uso de um polipeptídeo heterodimérico
CA2960297A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
EP3552488A1 (en) 2014-11-10 2019-10-16 F. Hoffmann-La Roche AG Animal model for nephropathy and agents for treating the same
EP3875481A1 (en) 2014-11-14 2021-09-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
WO2016081384A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
WO2016081643A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
EP3221364B1 (en) 2014-11-19 2020-12-16 Genentech, Inc. Antibodies against bace1 and use thereof for neural disease immunotherapy
CN107250158B (zh) 2014-11-19 2022-03-25 基因泰克公司 抗转铁蛋白受体/抗bace1多特异性抗体和使用方法
ES2835823T3 (es) 2014-11-20 2021-06-23 Hoffmann La Roche Politerapia de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T para CD3 y para el receptor de folato 1 (FolR1) y antagonistas de la unión al eje de PD-1
BR112017011092A2 (pt) 2014-11-26 2017-12-26 Xencor Inc anticorpos heterodiméricos que ligam cd3 e antígenos de tumor
EA037065B1 (ru) 2014-11-26 2021-02-01 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, связывающие cd3 и cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
KR20170086536A (ko) 2014-12-03 2017-07-26 제넨테크, 인크. 항-스타필로코커스 아우레우스 항체 리파마이신 접합체 및 이의 용도
RU2017118792A (ru) 2014-12-03 2019-01-09 Дженентек, Инк. Конъюгаты антитела к staphylococcus aureus с рифамицином и их применение
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
EA201790984A1 (ru) 2014-12-05 2018-05-31 Дженентек, Инк. Анти-cd79b антитела и способы их применения
CA2966365A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Genentech, Inc. Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
PL3233921T3 (pl) 2014-12-19 2022-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016111947A2 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
EP3245231B1 (en) 2015-01-16 2020-08-12 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
CN113956354A (zh) 2015-01-22 2022-01-21 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
US10330683B2 (en) 2015-02-04 2019-06-25 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
EP3256164B1 (en) 2015-02-09 2020-03-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Multi-specific antibodies with affinity for human a33 antigen and dota metal complex
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
JP2018511797A (ja) 2015-03-16 2018-04-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＩＬ−１３の検出方法及び定量方法並びにＴｈ２関連疾患の診断及び治療における使用
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
RS60270B1 (sr) 2015-03-20 2020-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizacija antitela do gp120 i njihova upotreba
US10023635B2 (en) 2015-03-23 2018-07-17 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to ICOS
EP3590961A1 (en) 2015-03-25 2020-01-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific multivalent fusion proteins
SG11201707490SA (en) 2015-04-03 2017-10-30 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
EP3286315B1 (en) 2015-04-24 2021-05-26 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of identifying bacteria comprising binding polypeptides
AU2016253886B2 (en) 2015-04-28 2019-05-16 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation RGMa binding protein and use thereof
CN107709363A (zh) 2015-05-01 2018-02-16 基因泰克公司 掩蔽抗cd3抗体和使用方法
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
WO2016179517A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
CN107592812A (zh) 2015-05-11 2018-01-16 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗狼疮性肾炎的组合物和方法
CA2983282A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
JP6587696B2 (ja) * 2015-05-13 2019-10-09 ズムトール バイオロジクス、インコーポレイテッド アフコシル化タンパク質、前記タンパク質を発現する細胞、及び関連する方法
EP3302563A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Humanized anti-ebola virus glycoprotein antibodies and methods of use
JP7144935B2 (ja) 2015-05-29 2022-09-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 癌のための治療方法及び診断方法
WO2016196679A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for using anti-il-34 antibodies to treat neurological diseases
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
MA44955A (fr) 2015-06-05 2019-03-20 Ac Immune Sa Anticorps anti-tau et leurs méthodes d'utilisation
CA2988420A1 (en) 2015-06-08 2016-12-15 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
JP2018521019A (ja) 2015-06-08 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体を使用して癌を治療する方法
US10017577B2 (en) 2015-06-15 2018-07-10 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
EP3310811B1 (en) 2015-06-16 2021-06-16 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
MY189840A (en) 2015-06-16 2022-03-11 Genentech Inc Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
WO2016205200A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and methods of use
MX2017016169A (es) 2015-06-17 2018-08-15 Genentech Inc Anticuerpos anti-her2 y metodos de uso.
JP6896650B2 (ja) 2015-06-17 2021-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及びタキサンを使用した局所進行性または転移性乳癌の治療方法
CN113999312A (zh) 2015-06-24 2022-02-01 豪夫迈·罗氏有限公司 具有定制亲和力的抗转铁蛋白受体抗体
MX2017016645A (es) 2015-06-29 2018-11-09 Genentech Inc Anticuerpo anti-cd20 de tipo ii para su uso en el trasplante de órganos.
BR112017027690A2 (pt) 2015-06-29 2018-10-09 Daiichi Sankyo Co Ltd “método para produção de uma composição de conjugado anticorpo-fármaco, e, composição de conjugado anticorpo-fármaco
EP3514174B1 (en) 2015-06-29 2021-03-31 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
EP3331910B1 (en) 2015-08-03 2019-12-11 EngMab Sàrl Monoclonal antibodies against human b cell maturation antigen (bcma)
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN108026180B (zh) 2015-08-28 2022-06-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗羟腐胺赖氨酸抗体及其用途
TWI621628B (zh) 2015-09-18 2018-04-21 日商中外製藥股份有限公司 Ｉｌ－８結合抗體及其用途
EP3353206A1 (en) 2015-09-22 2018-08-01 Spring Bioscience Corporation Anti-ox40 antibodies and diagnostic uses thereof
KR20180053315A (ko) 2015-09-23 2018-05-21 제넨테크, 인크. 항-vegf 항체의 최적화된 변이체들
EP3352791B1 (en) 2015-09-24 2019-10-30 AbVitro LLC Hiv antibody compositions and methods of use
FI3354729T3 (fi) 2015-09-24 2024-04-23 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-garp-vasta-aine
BR112018005862A2 (pt) 2015-09-25 2018-10-16 Genentech, Inc. anticorpos, anticorpos isolados, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção do anticorpo, imunoconjugado, composição, usos dos anticorpos, métodos para tratar ou retardar a progressão de um câncer e de uma doença e para aumentar, potencializar ou estimular uma resposta ou função imune e kit
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
PE20181004A1 (es) 2015-10-02 2018-06-26 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos contra el cd20 humano y el receptor de transferrina humano y metodos de uso
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
US10392441B2 (en) 2015-10-07 2019-08-27 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services IL-7R-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
KR20180066236A (ko) 2015-10-22 2018-06-18 조운스 테라퓨틱스, 인크. Icos 발현을 계측하기 위한 유전자 특질
MX2018005036A (es) 2015-10-29 2018-08-01 Hoffmann La Roche Anticuerpos y metodos de uso de anti-regiones de fragmentos cristalizables (fc) variantes.
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
CN108289951A (zh) 2015-10-30 2018-07-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体和缀合物
ES2870141T3 (es) 2015-10-30 2021-10-26 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-HtrA1 y procedimientos de uso de los mismos
AU2016349392B2 (en) 2015-11-03 2023-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Neutralizing antibodies to HIV-1 gp41 and their use
JP6998869B2 (ja) 2015-11-08 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体のスクリーニング方法
CA3004794A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr2 inhibitors alone or in combination with immune stimulating agents in cancer treatment
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
WO2017104779A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
CA3006529A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
CN108602883A (zh) 2016-01-20 2018-09-28 基因泰克公司 用于阿尔茨海默氏病的高剂量治疗
CN109071625A (zh) 2016-02-04 2018-12-21 柯瑞斯公司 平滑化突变体和其使用方法
MX2018010361A (es) 2016-02-29 2019-07-08 Genentech Inc Métodos terapéuticos y de diagnóstico para el cáncer.
AU2017235097B2 (en) 2016-03-15 2023-08-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-GPC3 antibodies
WO2017165734A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
US11046778B2 (en) 2016-03-31 2021-06-29 Tohoku University Anti-podocalyxin antibody that targets tumor microenvironment
EP3865511A1 (en) 2016-04-14 2021-08-18 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-rspo3 antibodies and methods of use
SG11201808994YA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Bioatla Llc Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
CA3019921A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
EP3443120A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods for monitoring and treating cancer
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
BR112018069890A2 (pt) 2016-05-02 2019-02-05 Hoffmann La Roche polipeptídio de fusão que se liga de forma específica a um alvo, polipeptídio de fusão dimérico, ácido nucleico isolado, par de ácidos nucleicos isolados, célula hospedeira, método para produzir um polipeptídio de fusão, imunoconjugado, formulação farmacêutica, polipeptídio de fusão e uso do polipeptídio de fusão
WO2017194441A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified anti-tenascin antibodies and methods of use
SI3455261T1 (sl) 2016-05-13 2023-01-31 Bioatla, Inc. Protitelesa proti ROR2, fragmenti protitelesa, njihovi imunokonjugati in uporabe le-teh
KR20230021765A (ko) 2016-05-18 2023-02-14 젠맵 비. 브이 항체 및 감염성 질환의 치료에서의 그의 사용 방법
ES2858151T3 (es) 2016-05-20 2021-09-29 Hoffmann La Roche Conjugados de PROTAC-anticuerpo y procedimientos de uso
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
CA3026880A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Paul Foster Treatment of igg4-related diseases with anti-cd19 antibodies crossbinding to cd32b
KR20230054508A (ko) 2016-06-14 2023-04-24 젠코어 인코포레이티드 이중특이적 체크포인트 억제제 항체
EP3475298A1 (en) 2016-06-24 2019-05-01 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
KR20190020341A (ko) 2016-06-28 2019-02-28 젠코어 인코포레이티드 소마토스타틴 수용체 2에 결합하는 이종이량체 항체
WO2018013917A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and materials for assessing response to plasmablast- and plasma cell-depleting therapies
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
KR102553195B1 (ko) 2016-07-29 2023-07-07 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 항-cd19 항체에 대한 항-이디오타입 항체
WO2018021450A1 (ja) 2016-07-29 2018-02-01 中外製薬株式会社 増強されたｆｖｉｉｉ補因子機能代替活性を有する二重特異性抗体
NL2017270B1 (en) 2016-08-02 2018-02-09 Aduro Biotech Holdings Europe B V New anti-hCTLA-4 antibodies
RU2766112C2 (ru) 2016-08-05 2022-02-08 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Композиция для профилактики или лечения связанных с il-8 заболеваний
WO2018029124A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3510046A4 (en) 2016-09-07 2020-05-06 The Regents of the University of California ANTIBODIES AGAINST OXIDATION-SPECIFIC EPITOPES
US20190270821A1 (en) 2016-09-13 2019-09-05 Humanigen, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of pulmonary fibrosis
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
CN109689682B (zh) 2016-09-19 2022-11-29 豪夫迈·罗氏有限公司 基于补体因子的亲和层析
TWI787203B (zh) 2016-09-23 2022-12-21 美商建南德克公司 Il-13拮抗劑用於治療異位性皮炎之用途
EP3519433A1 (en) 2016-10-03 2019-08-07 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
KR20190072528A (ko) 2016-10-06 2019-06-25 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
CN109789211A (zh) 2016-10-07 2019-05-21 第一三共株式会社 基于抗her2抗体-药物偶联物施予的耐性癌的治疗
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
CN110214147A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 Xencor股份有限公司 IL15/IL15Rα异源二聚体FC-融合蛋白
JP2019535250A (ja) 2016-10-29 2019-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｍｉｃ抗体及び使用方法
BR112019008702A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-16 Genmab B.V. polipeptídeo, método de diminuição de uma função fc efetora de um polipeptídeo, composição, método de tratamento, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou composição.
AU2017353427A1 (en) 2016-11-02 2019-05-16 Bristol-Myers Squibb Company Bispecific antibody against BCMA and CD3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma
LT3535298T (lt) 2016-11-02 2021-12-27 Jounce Therapeutics, Inc. Antikūnai prieš pd-1 ir jų panaudojimas
MX2019005438A (es) 2016-11-15 2019-08-16 Genentech Inc Dosificacion para tratamiento con anticuerpos bispecificos anti-cd20 / anti-cd3.
EP3468991A1 (en) 2016-11-21 2019-04-17 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
WO2018101448A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method of treating cancer using anti-ccr4 antibody and anti-pd-1 antibody
MX2019006334A (es) 2016-12-07 2019-08-01 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso.
CA3045294A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
EP3551663A1 (en) 2016-12-12 2019-10-16 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-pd-l1 antibodies and antiandrogens
EP3552626A4 (en) 2016-12-12 2020-06-10 Daiichi Sankyo Company, Limited ASSOCIATION OF AN ANTIBODY DRUG CONJUGATE AND AN IMMUNE CONTROL POINT INHIBITOR
JP7202185B2 (ja) 2016-12-22 2023-01-11 第一三共株式会社 抗ｃｄ３抗体及び該抗体を含む分子
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
EP3560955A4 (en) 2016-12-26 2020-12-23 Kyowa Kirin Co., Ltd. ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO MYELIN OLIGODENDROCYTE GLYCOPROTEIN
US20180230218A1 (en) 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
US10174122B2 (en) 2017-01-06 2019-01-08 Eutilex Co., Ltd. Anti-human 4-1BB antibodies and uses thereof
WO2018132597A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting histone h3 peptide/mhc complexes and uses thereof
CN110382535A (zh) 2017-01-17 2019-10-25 第一三共株式会社 抗-gpr20抗体以及抗-gpr20抗体-药物缀合物
US11208491B2 (en) 2017-01-24 2021-12-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Treatment or prevention method of radiation damage by administration of IL-5 receptor alpha chain binding antibody
KR20190133160A (ko) 2017-02-07 2019-12-02 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항-gprc5d 항체 및 항-gprc5d 항체를 포함하는 분자
US11021535B2 (en) 2017-02-10 2021-06-01 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
SG11201907242TA (en) 2017-02-10 2019-09-27 Eutilex Co Ltd IFN-γ-INDUCIBLE REGULATORY T CELL CONVERTIBLE ANTI-CANCER (IRTCA) ANTIBODY AND USES THEREOF
CA3053222A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
AU2018217816A1 (en) 2017-02-10 2019-08-15 Genentech, Inc. Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof
KR20190120764A (ko) 2017-02-28 2019-10-24 갓코 호진 긴키 다이가쿠 항 her3 항체-약물 콘주게이트 투여에 의한 egfr-tki 저항성의 비소세포 폐암의 치료 방법
WO2018160841A1 (en) 2017-03-01 2018-09-07 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
CA3054778A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Kyowa Kirin Co., Ltd. Preventive or therapeutic agent for htlv-1 associated myelopathy using low-dose of anti-ccr4 antibody
KR20190138636A (ko) 2017-03-22 2019-12-13 제넨테크, 인크. 안구 장애의 치료를 위한 최적화된 항체 조성물
CN110494446A (zh) 2017-03-28 2019-11-22 基因泰克公司 治疗神经退行性疾病的方法
AU2018243020B2 (en) 2017-03-29 2020-04-16 Osaka University Medicinal composition for treating cancer
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
JP6847434B2 (ja) 2017-03-30 2021-03-24 国立大学法人東北大学 抗ポドプラニン抗体
JP2020516253A (ja) 2017-04-14 2020-06-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんのための診断及び治療方法
MA49131A (fr) 2017-04-21 2020-03-25 Hoffmann La Roche Utilisation d'antagonistes de klk5 pour le traitement d'une maladie
WO2018200586A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
SG10201913677SA (en) 2017-04-27 2020-03-30 Tesaro Inc Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
WO2018209125A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Epstein barr virus antibodies, vaccines, and uses of the same
TWI794230B (zh) 2017-05-15 2023-03-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法
US11091555B2 (en) 2017-05-16 2021-08-17 Five Prime Therapeutics, Inc. Method of treating gastric cancer with anti-FGFR2-IIIb antibodies and modified FOLFOX6 chemotherapy
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
KR20200029469A (ko) 2017-07-18 2020-03-18 쿄와 기린 가부시키가이샤 항인간 ccr1 모노클로날 항체
TWI823859B (zh) 2017-07-21 2023-12-01 美商建南德克公司 癌症之治療及診斷方法
SG11202000658PA (en) 2017-07-26 2020-02-27 Forty Seven Inc Anti-sirp-alpha antibodies and related methods
EP3660155A4 (en) 2017-07-27 2021-04-07 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-CD147 ANTIBODY
MA49987A (fr) 2017-08-23 2020-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Préparation de conjugué anticorps-médicament et lyophilisation associée
SG11202000387YA (en) 2017-08-25 2020-03-30 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibodies and methods of use thereof
CN111065621B (zh) 2017-08-31 2024-01-26 第一三共株式会社 制备抗体-药物缀合物的新方法
SG11202000997YA (en) 2017-08-31 2020-03-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Improved method for producing antibody-drug conjugate
EP3684413A1 (en) 2017-09-20 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dosage regimen for combination therapy using pd-1 axis binding antagonists and gpc3 targeting agent
IL301638B1 (en) 2017-09-29 2024-05-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugation of an antibody with a pyrrolobenzodiazepine derivative
EP4215543A3 (en) 2017-10-03 2023-10-11 Juno Therapeutics, Inc. Hpv-specific binding molecules
CA3078436A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Composition for cytotoxic t cell depletion
CA3185107A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Immunowake Inc. Vegfr-antibody light chain fusion protein
JP7256197B2 (ja) 2017-11-01 2023-04-11 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂ細胞成熟抗原に特異的な抗体およびキメラ抗原受容体
TW201923089A (zh) 2017-11-06 2019-06-16 美商建南德克公司 癌症之診斷及治療方法
US11773180B2 (en) 2017-11-08 2023-10-03 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody which binds to CD40 and EpCAM
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
AU2018375331A1 (en) 2017-12-01 2020-05-14 Pfizer Inc. Anti-CXCR5 antibodies and compositions and uses thereof
CN111527106A (zh) 2017-12-12 2020-08-11 协和麒麟株式会社 抗bmp10抗体和以该抗体为有效成分的对高血压和高血压性疾病的治疗剂
MA51184A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Juno Therapeutics Inc Molécules de liaison à l'anti-cct5 et procédés d'utilisation associés
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
EA202091540A1 (ru) 2017-12-22 2021-03-22 Джаунс Терапьютикс, Инк. Антитела к lilrb2
EP3728321A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 F. Hoffmann-La Roche AG Use of pilra binding agents for treatment of a disease
EP3732203A4 (en) 2017-12-28 2021-12-15 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST PD-L1
AU2018396970A1 (en) 2017-12-28 2020-08-13 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against TIGIT
EP3724223A1 (en) 2018-01-02 2020-10-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
KR20200106525A (ko) 2018-01-05 2020-09-14 에이씨 이뮨 에스.에이. 미스폴딩된 tdp-43 결합 분자
US11713353B2 (en) 2018-01-15 2023-08-01 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against PD-1
EP3740505A1 (en) 2018-01-16 2020-11-25 Lakepharma Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
RS63812B1 (sr) 2018-01-26 2023-01-31 Hoffmann La Roche Il-22 fc kompozicije i postupci primene
JP7349995B2 (ja) 2018-01-26 2023-09-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＩＬ－２２ Ｆｃ融合タンパク質及び使用方法
JP7438953B2 (ja) 2018-02-01 2024-02-27 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 完全ヒト化抗ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）の単鎖抗体およびその応用
US11866498B2 (en) 2018-02-08 2024-01-09 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
MX2020008291A (es) 2018-02-09 2020-09-25 Genentech Inc Metodos terapeuticos y diagnosticos para enfermedades inflamatorias mediadas por mastocitos.
EP3752530A1 (en) 2018-02-14 2020-12-23 ABBA Therapeutics AG Anti-human pd-l2 antibodies
WO2019165077A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibody formulations
BR112020016990A2 (pt) 2018-02-21 2021-02-23 Five Prime Therapeutics, Inc. regimes de dosagem de anticorpos contra b7-h4
WO2019165122A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
SG11202007694UA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Genentech Inc DOSING FOR TREATMENT WITH IL-22 Fc FUSION PROTEINS
JP7391027B2 (ja) 2018-02-26 2023-12-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ及び抗ｐｄ－ｌ１アンタゴニスト抗体による治療のための投薬
AU2019228600A1 (en) 2018-03-02 2020-09-24 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-H4 antibodies and methods of use thereof
CN111836643A (zh) 2018-03-05 2020-10-27 学校法人埼玉医科大学 用于治疗或预防异位骨化的药物组合物
US11485782B2 (en) 2018-03-14 2022-11-01 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. Anti-claudin 18.2 antibodies
CN112334484A (zh) 2018-03-14 2021-02-05 诺维莫尼公司 抗-CD3ε抗体及其应用方法
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
KR20200132938A (ko) 2018-03-15 2020-11-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법
US11958903B2 (en) 2018-03-30 2024-04-16 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies against LAG-3 and uses thereof
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US11471489B2 (en) 2018-04-05 2022-10-18 Juno Therapeutics, Inc. T cell receptors and engineered cells expressing same
CN110373374B (zh) * 2018-04-12 2023-07-07 上海颢哲信息科技有限公司 一种降低抗体核心岩藻糖基化的方法和组合物
JP2021520829A (ja) 2018-04-18 2021-08-26 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ Ｆｃ融合タンパク質およびＴＩＭ−３抗原結合ドメインを含む、ＴＩＭ−３標的化ヘテロ二量体融合タンパク質
CA3097593A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
US20210230255A1 (en) 2018-04-27 2021-07-29 Fondazione Ebri Rita Levi-Montalcini Antibody directed against a tau-derived neurotoxic peptide and uses thereof
WO2019211472A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
KR20210014660A (ko) 2018-05-28 2021-02-09 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her2 항체-약물 콘쥬게이트 투여에 의한 her2 변이암의 치료
KR20210018192A (ko) 2018-05-31 2021-02-17 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항인간 tlr7 항체
US11987629B2 (en) 2018-06-01 2024-05-21 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and uses thereof for treating disease or condition
WO2019235426A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 中外製薬株式会社 細胞質内での半減期が変化した抗原結合分子
KR102170788B1 (ko) * 2018-06-07 2020-10-28 한국생명공학연구원 무당질 항체 생산용 형질전환 마우스 및 이로부터 생산된 무당질 항체의 용도
WO2019245991A1 (en) 2018-06-18 2019-12-26 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (psma) and uses thereof
TWI819011B (zh) 2018-06-23 2023-10-21 美商建南德克公司 以pd-1 軸結合拮抗劑、鉑劑及拓撲異構酶ii 抑制劑治療肺癌之方法
US11873337B2 (en) 2018-06-26 2024-01-16 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to cell adhesion molecule 3
WO2020004490A1 (ja) 2018-06-26 2020-01-02 協和キリン株式会社 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン－５に結合する抗体
MA53094A (fr) 2018-07-02 2021-05-12 Amgen Inc Protéine de liaison à l'antigène anti-steap1
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
JP2021524276A (ja) 2018-07-13 2021-09-13 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３８抗体のバリアントおよびその使用
JP2021530502A (ja) 2018-07-18 2021-11-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト、代謝拮抗剤、及びプラチナ製剤で肺がんを治療する方法
EP3823673A4 (en) 2018-07-20 2022-05-11 Surface Oncology, Inc. ANTI-CD112R COMPOSITIONS AND METHODS
KR20210038904A (ko) 2018-07-25 2021-04-08 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘쥬게이트의 효과적인 제조 방법
AU2019315177A1 (en) 2018-07-31 2021-02-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
EP3831854A4 (en) 2018-08-03 2022-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH TWO LINKED ANTIGEN-BINDING DOMAINS
BR112021001750A2 (pt) 2018-08-06 2021-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited composição farmacêutica
CA3051549A1 (en) 2018-08-09 2020-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
SG10202106830VA (en) 2018-08-10 2021-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-cd137 antigen-binding molecule and utilization thereof
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
JP7481255B2 (ja) 2018-08-23 2024-05-10 第一三共株式会社 抗体薬物複合体の感受性マーカー
KR102596303B1 (ko) * 2018-08-29 2023-10-30 유나이티드 바이오파마, 인크. 비푸코실화된 항체 및 그의 제조법
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP4268831A3 (en) 2018-09-12 2024-05-22 Fred Hutchinson Cancer Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
AU2019342099A1 (en) 2018-09-19 2021-04-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
BR112021005246A2 (pt) 2018-09-20 2021-06-15 Daiichi Sankyo Company, Limited agente terapêutico, e, método de tratamento para câncer
ES2955032T3 (es) 2018-09-21 2023-11-28 Hoffmann La Roche Métodos de diagnóstico para el cáncer de mama triple negativo
US20230038521A1 (en) 2018-09-21 2023-02-09 National University Corporation Tokyo Medical An D Dental University Human Monoclonal Antibody Binding Specifically to Human Hmgb1, and Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Alzheimer's Disease Containing Said Human Monoclonal Antibody
EP3858994A4 (en) 2018-09-28 2022-06-22 Kyowa Kirin Co., Ltd. ANTIBODY COMPOSITION
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
KR20210074286A (ko) 2018-10-05 2021-06-21 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. 항-fgfr2 항체 제형
MX2021004226A (es) 2018-10-15 2021-07-15 Five Prime Therapeutics Inc Terapia combinada contra el cáncer.
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CA3116324A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
WO2020089437A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Engmab Sàrl Combination therapy
CA3119956A1 (en) 2018-11-14 2020-05-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-cdh6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CN113366022A (zh) 2018-11-16 2021-09-07 纪念斯隆凯特琳癌症中心 针对粘蛋白-16的抗体及其使用方法
JP2022511502A (ja) 2018-12-05 2022-01-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの免疫療法のための診断方法及び診断用組成物
KR20210100668A (ko) 2018-12-06 2021-08-17 제넨테크, 인크. 항-CD79b 면역접합체, 알킬화제 및 항-CD20 항체를 포함하는 미만성 큰 B-세포 림프종의 조합 요법
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
CN113271942A (zh) 2018-12-11 2021-08-17 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物与parp抑制剂的组合
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
EP3898667A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Modified antibody fcs and methods of use
EP3883609A2 (en) 2018-12-20 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
AR123405A1 (es) 2018-12-21 2022-11-30 23Andme Inc Anticuerpos anti-il-36 y métodos de uso de estos
AU2019407426A1 (en) 2018-12-21 2021-07-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
US20220064312A1 (en) 2018-12-27 2022-03-03 Shionogi & Co., Ltd. Novel Anti-CCR8 Antibody
KR20210108961A (ko) 2018-12-28 2021-09-03 쿄와 기린 가부시키가이샤 TfR에 결합하는 이중 특이적 항체
EP3902830A1 (en) 2018-12-30 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-rabbit cd19 antibodies and methods of use
WO2020150152A1 (en) 2019-01-14 2020-07-23 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine
WO2020153467A1 (ja) 2019-01-24 2020-07-30 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CN113365660A (zh) 2019-01-29 2021-09-07 朱诺治疗学股份有限公司 对受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)具特异性的抗体及嵌合抗原受体
JP2022521773A (ja) 2019-02-27 2022-04-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体と抗ｃｄ２０抗体又は抗ｃｄ３８抗体とによる処置のための投薬
KR20210134725A (ko) 2019-03-01 2021-11-10 젠코어 인코포레이티드 Enpp3과 cd3에 결합하는 이종이량체 항체
TW202101000A (zh) 2019-03-08 2021-01-01 美商建南德克公司 用於偵測且量化膜相關蛋白之方法
CN113631578A (zh) 2019-03-14 2021-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 用her2xcd3双特异性抗体联合抗her2 mab治疗癌症
EP3943108A4 (en) 2019-03-19 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN
EP3950061A4 (en) 2019-03-25 2022-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY PYRROLOBENZODIAZEPINE DERIVATIVE CONJUGATE
AU2020246448A1 (en) 2019-03-25 2021-10-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-HER2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
US20220168438A1 (en) 2019-03-27 2022-06-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate and parp inhibitor
WO2020198731A2 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Danisco Us Inc Engineered antibodies
BR112021020867A2 (pt) 2019-04-19 2022-01-04 Genentech Inc Anticorpos, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, usos do anticorpo, método de tratamento de um indivíduo com câncer e método para reduzir a depuração
EP3962523A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
CN114269376A (zh) 2019-05-03 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用抗pd-l1抗体治疗癌症的方法
JP2022536602A (ja) 2019-05-14 2022-08-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 濾胞性リンパ腫を処置するための抗ｃｄ７９ｂ免疫複合体の使用方法
TW202108625A (zh) 2019-05-15 2021-03-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體
EP3970743A4 (en) 2019-05-15 2023-02-15 Kyowa Kirin Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODIES BINDING TO CD40 AND FAP
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
MX2021014274A (es) 2019-05-23 2022-01-06 Ac Immune Sa Moleculas de union anti-tdp-43 y usos de las mismas.
AU2020285681A1 (en) 2019-05-29 2022-01-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate
CN114269783B (zh) 2019-07-02 2024-03-26 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 结合egfrviii的单克隆抗体及其应用
EP4008350A4 (en) 2019-07-26 2023-06-14 Saitama Medical University ANTIBODY RECOGNIZING THE EXTRACELLULAR REGION OF ALK2/ACVR1
CN114641490B (zh) 2019-08-06 2023-06-06 新旭生技股份有限公司 结合至病理性tau种类的抗体及其用途
WO2021050645A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
BR112022004590A2 (pt) 2019-09-13 2022-06-14 Kyowa Kirin Co Ltd Variante dcr3
CR20220149A (es) 2019-09-20 2022-05-23 Genentech Inc Dosis para anticuerpos anti-triptasa
CR20220127A (es) 2019-09-27 2022-05-27 Genentech Inc Administración de dosis para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1
AU2020365836A1 (en) 2019-10-18 2022-04-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of using anti-CD79b immunoconjugates to treat diffuse large B-cell lymphoma
TW202128761A (zh) 2019-10-25 2021-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗garp抗體與免疫調節劑之組合
JP2022553803A (ja) 2019-11-06 2022-12-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 血液がんの処置のための診断方法及び治療方法
JP2023504740A (ja) 2019-12-06 2023-02-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂｃｍａ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法
CN115335399A (zh) 2019-12-06 2022-11-11 朱诺治疗学股份有限公司 针对gprc5d靶结合结构域的抗独特型抗体以及相关组合物和方法
EP4072584A1 (en) 2019-12-13 2022-10-19 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
US20230075422A1 (en) 2019-12-20 2023-03-09 Bristol-Myers Squibb Company Use of fucosylation inhibitor for producing afucosylated antibody
AR120898A1 (es) 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
MX2022007840A (es) 2019-12-27 2022-07-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti antigeno-4 asociado al linfocito t citotoxico (ctla4) y uso del mismo.
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
CN114945385A (zh) 2020-01-15 2022-08-26 国立大学法人大阪大学 痴呆症的预防或治疗剂
US20230055626A1 (en) 2020-01-15 2023-02-23 Osaka University Agent for prevention or treatment of diabetic autonomic neuropathy
EP4090366A1 (en) 2020-01-16 2022-11-23 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
JP2023512654A (ja) 2020-01-31 2023-03-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ－１軸結合アンタゴニストおよびｒｎａワクチンを用いてネオエピトープ特異的ｔ細胞を誘導する方法
WO2021155295A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 The Cleveland Clinic Foundation Anti-müllerian hormone receptor 2 antibodies and methods of use
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
TWI832035B (zh) 2020-02-14 2024-02-11 美商基利科學股份有限公司 結合ccr8之抗體及融合蛋白及其用途
TW202140561A (zh) 2020-02-14 2021-11-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd3結合之雙特異性抗體
US20230348568A1 (en) 2020-02-20 2023-11-02 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
KR20220148209A (ko) 2020-02-28 2022-11-04 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항cd137 작제물 및 그 용도
WO2021170071A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-cd137 constructs, multispecific antibody and uses thereof
US11760797B2 (en) 2020-03-13 2023-09-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
IL296427A (en) 2020-03-19 2022-11-01 Genentech Inc Isoform-selective anti-tgf antibodies and methods of use
IL296528A (en) 2020-03-24 2022-11-01 Genentech Inc Tie2 binding agents and methods of use
JPWO2021200131A1 (pl) 2020-03-30 2021-10-07
EP4144370A4 (en) 2020-03-30 2024-05-15 Univ Mie BISPECIFIC ANTIBODY
AU2021249888A1 (en) 2020-04-01 2022-10-27 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition
JP2023520515A (ja) 2020-04-03 2023-05-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんに対する治療方法及び診断方法
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
EP4139359A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
AU2021262744A1 (en) 2020-04-27 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Isoform-independent antibodies to lipoprotein(a)
EP4143345A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for non-small cell lung cancer immunotherapy
IL297830A (en) 2020-05-03 2023-01-01 Levena Suzhou Biopharma Co Ltd Anti-drug compounds (adcs) comprising an anti-trop-2 antibody, compounds comprising such adcs, as well as methods for their production and use
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
CN115697491A (zh) 2020-05-17 2023-02-03 阿斯利康(英国)有限公司 Sars-cov-2抗体及其选择和使用方法
WO2021238886A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
AU2021281417A1 (en) 2020-05-29 2022-12-08 23Andme, Inc. Anti-CD200R1 antibodies and methods of use thereof
TW202210515A (zh) 2020-06-02 2022-03-16 美商當康生物科技有限公司 抗ｃｄ３９之構築體及其用途
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
JP2023529206A (ja) 2020-06-12 2023-07-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド がん免疫療法のための方法及び組成物
WO2021257503A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
MX2022015881A (es) 2020-06-18 2023-01-24 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-tigit y antagonistas de union al eje de pd-1.
JP2023531222A (ja) 2020-06-22 2023-07-21 アルミラル・ソシエダッド・アノニマ 抗ｉｌ－３６抗体およびその使用方法
CN116670285A (zh) 2020-06-23 2023-08-29 江苏康缘药业股份有限公司 抗cd38抗体及其用途
JP2023539715A (ja) 2020-06-24 2023-09-19 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲートとａｔｍ阻害剤との組合わせ
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
TW202216208A (zh) 2020-06-24 2022-05-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及atr抑制劑之組合
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
TW202216207A (zh) 2020-06-24 2022-05-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及cdk9抑制劑之組合
US20230256092A1 (en) 2020-06-30 2023-08-17 Shionogi & Co., Ltd. Combined use of anti-ccr8 antibody and chemotherapeutic agent
BR112023000711A2 (pt) 2020-07-17 2023-01-31 Daiichi Sankyo Co Ltd Método para produzir uma composição de conjugado de anticorpo-fármaco, e, composição de conjugado de anticorpo-fármaco
US20230293714A1 (en) 2020-07-20 2023-09-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-her2 antibody-drug conjugate with her dimerization inhibitor
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
KR20230133832A (ko) 2020-07-29 2023-09-19 다이내믹큐어 바이오테크놀로지 엘엘씨 항-cd93 구축물 및 그의 용도
CN116568824A (zh) 2020-08-03 2023-08-08 基因泰克公司 淋巴瘤的诊断和治疗方法
KR20230095918A (ko) 2020-08-05 2023-06-29 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ror1-표적 결합 도메인에 대한 항이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법
AR123158A1 (es) 2020-08-07 2022-11-02 Genentech Inc Proteínas de fusión del ligando para flt3 y métodos de uso
IL300257A (en) 2020-08-10 2023-03-01 Astrazeneca Uk Ltd SARS-COV-2 antibodies for the treatment and prevention of COVID-19
US20230322908A1 (en) 2020-08-14 2023-10-12 Ac Immune Sa Humanized Anti-TDP-43 Binding Molecules and Uses Thereof
KR20230166150A (ko) 2020-08-19 2023-12-06 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
EP4204448A2 (en) 2020-08-27 2023-07-05 cureab GmbH Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
JP2023545359A (ja) 2020-09-12 2023-10-30 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド 抗ｈｅｒ２抗体－薬物複合体治療のためのスコアリング方法
JP2023541627A (ja) 2020-09-14 2023-10-03 イシュノス サイエンシズ ソシエテ アノニム Ｉｌ１ｒａｐに結合する抗体及びその使用
TWI836278B (zh) 2020-10-05 2024-03-21 美商建南德克公司 用抗fcrh5/抗cd3雙特異性抗體進行治療之給藥
IL301921A (en) 2020-10-09 2023-06-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Combining an antibody-drug conjugate and a selective 1PARP inhibitor
CA3192306A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Burkhard Ludewig Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof
CN116685325A (zh) 2020-10-20 2023-09-01 豪夫迈·罗氏有限公司 Pd-1轴结合拮抗剂和lrrk2抑制剂的组合疗法
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
WO2022098638A2 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2022098648A2 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
MX2023005130A (es) 2020-11-04 2023-05-25 Genentech Inc Dosis subcutanea de anticuerpos biespecificos anti-cd20/anti-cd3.
KR20230106645A (ko) 2020-11-11 2023-07-13 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트와 항 SIRPα 항체의 조합
US20230398230A1 (en) 2020-11-12 2023-12-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of mesothelioma by administration of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate
MX2023005864A (es) 2020-11-30 2023-06-05 Ono Pharmaceutical Co Agente dirigido al receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (her2).
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
JPWO2022124247A1 (pl) 2020-12-09 2022-06-16
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
TW202245844A (zh) 2021-01-13 2022-12-01 紀念斯隆凱特琳癌症中心 抗dll3抗體-藥物結合物
EP4277664A1 (en) 2021-01-13 2023-11-22 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
EP4284422A1 (en) 2021-01-28 2023-12-06 Vaccinvent GmbH Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
KR20230142790A (ko) 2021-02-09 2023-10-11 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 코로나바이러스 스파이크 단백질(spike protein)을 타겟팅하는 항체
EP4291306A1 (en) 2021-02-09 2023-12-20 University of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
MX2023009497A (es) 2021-02-15 2023-08-23 Takeda Pharmaceuticals Co Composiciones y metodos de terapia celular para modular la se?alizacion del factor de crecimiento transformador-beta (tgf-beta).
AR124914A1 (es) 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4
US20220378929A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 MediBoston Limted Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CA3210069A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Tong Zhu Antibody-drug conjugates comprising an anti-bcma antibody
JP2024509191A (ja) 2021-03-05 2024-02-29 ダイナミキュア バイオテクノロジー エルエルシー 抗ｖｉｓｔａ構築物およびその使用
KR20230156079A (ko) 2021-03-09 2023-11-13 젠코어 인코포레이티드 Cd3과 cldn6에 결합하는 이종이량체 항체
KR20230148226A (ko) 2021-03-10 2023-10-24 이뮤노웨이크 인크. 면역조절 분자 및 이의 용도
US11859012B2 (en) 2021-03-10 2024-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and GPC3
MX2023010812A (es) 2021-03-15 2023-09-27 Genentech Inc Composiciones y metodos para tratar la nefritis lupica.
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
US20240150466A1 (en) 2021-03-25 2024-05-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-igfbp7 constructs and uses thereof
WO2022210485A1 (ja) 2021-03-29 2022-10-06 第一三共株式会社 安定な多重特異性分子及びその利用
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
JP2024517535A (ja) 2021-04-30 2024-04-23 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体と抗ｃｄ７９ｂ抗体薬物コンジュゲートを用いた併用治療の投与
JP2024520901A (ja) 2021-05-12 2024-05-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための抗ｃｄ７９ｂイムノコンジュゲートを使用する方法
JP2024518545A (ja) 2021-05-14 2024-05-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔｒｅｍ２のアゴニスト
EP4155321A1 (en) 2021-06-04 2023-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ddr2 antibodies and uses thereof
EP4351582A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
WO2022266660A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
CA3221833A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody
AU2022297107A1 (en) 2021-06-25 2024-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of anti-ctla-4 antibody
TW202317633A (zh) 2021-07-08 2023-05-01 美商舒泰神（加州）生物科技有限公司 特異性識別ｔｎｆｒ２的抗體及其用途
KR20240058075A (ko) 2021-07-14 2024-05-03 스테이드슨 (베이징) 바이오팔마슈티칼스 캄퍼니 리미티드 Cd40을 특이적으로 식별하는 항체 및 이의 응용
WO2023004386A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Genentech, Inc. Brain targeting compositions and methods of use thereof
TW202337499A (zh) 2021-08-07 2023-10-01 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物治療瀰漫性大ｂ細胞淋巴瘤之方法
EP4384553A1 (en) 2021-08-13 2024-06-19 Genentech, Inc. Dosing for anti-tryptase antibodies
WO2023021055A1 (en) 2021-08-19 2023-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent anti-variant fc-region antibodies and methods of use
WO2023027177A1 (ja) 2021-08-26 2023-03-02 協和キリン株式会社 Ｃｄ１１６およびｃｄ１３１に結合するバイスペシフィック抗体
KR20240049296A (ko) 2021-08-27 2024-04-16 제넨테크, 인크. 타우 병증을 치료하는 방법
TW202325727A (zh) 2021-08-30 2023-07-01 美商建南德克公司 抗聚泛素多特異性抗體
US20230109496A1 (en) 2021-09-06 2023-04-06 Genmab B.V. Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
AU2022347380A1 (en) 2021-09-15 2024-04-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
CA3232223A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Ying Fu Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
AR127269A1 (es) 2021-10-08 2024-01-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulación de anticuerpo anti-hla-dq2.5
TW202330041A (zh) 2021-10-18 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗cd37抗體-藥物結合物
AU2022379952A1 (en) 2021-11-05 2024-05-16 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
WO2023086807A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
TW202334202A (zh) 2021-11-16 2023-09-01 瑞士商Ａｃ免疫有限公司 用於治療和診斷的新分子
WO2023091887A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating systemic lupus erythematosus (sle) with mosunetuzumab
WO2023089527A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
CA3240565A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Wenfeng Xu Anti-ox40 antibodies and methods of use
CA3240585A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Wenfeng Xu Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
CA3240724A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atr inhibitor
TW202333800A (zh) 2021-12-28 2023-09-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及rasg12c抑制劑之組合
WO2023131901A1 (en) 2022-01-07 2023-07-13 Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc. Materials and methods of il-1beta binding proteins
WO2023139292A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Cambridge Enterprise Limited Tau therapy
WO2023154824A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
TW202342519A (zh) 2022-02-16 2023-11-01 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途
TW202342520A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 美商樂天醫藥生技股份有限公司 抗計畫性死亡配體１（ｐｄ—ｌ１）抗體分子、編碼多核苷酸及使用方法
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
WO2023180353A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023192827A1 (en) 2022-03-26 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
JP2024517042A (ja) 2022-04-13 2024-04-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の薬学的組成物及び使用方法
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
WO2023203177A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
TW202400140A (zh) 2022-04-27 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與ezh1及/或ezh2抑制劑之組合
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
TW202406934A (zh) 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途
TW202400650A (zh) 2022-05-11 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體與cd47抑制劑之組合
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
WO2024015897A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020407A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing b- and t-lymphocyte attenuator (btla) and uses thereof
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024037633A2 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Formulations comprising g-csf and uses thereof
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024054929A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2024091991A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for multiple myeloma
WO2024097741A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Anticancer therapies using anti-ccr8 antibody, chemo and immunotherapy combinations
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024108053A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024116094A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugates and dnmt inhibitors
CN116200329B (zh) * 2023-02-22 2023-08-29 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 一种无血清昆虫培养基及应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5613352A (en) 1979-07-02 1981-02-09 Tokan Kogyo Co Ltd Easily openable container
ATE282692T1 (de) 1983-01-13 2004-12-15 Max Planck Gesellschaft Nichtonkogenisches ti-plasmidvektorsystem und für das einschleusen expressionsfähiger gene in pflanzengenomen verwendbare rekombinante dna- moleküle
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS60123857A (ja) 1983-12-09 1985-07-02 Konishiroku Photo Ind Co Ltd 画像形成方法
EP0164575B1 (de) 1984-05-11 1992-03-18 Novartis AG Transformation von Pflanzenerbgut
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
IL84459A (en) 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
EP1983056A1 (en) 1992-07-07 2008-10-22 Japan Tobacco Inc. Method for transforming monocotyledons
JP3154564B2 (ja) * 1992-09-07 2001-04-09 科学技術振興事業団 モノクローナル抗体の改変方法
JP3946256B2 (ja) 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
DE69736261T2 (de) * 1996-01-24 2007-06-06 Toyo Boseki K.K. Alpha-1-6-fucosyltransferasen
JP3527250B2 (ja) * 1996-04-10 2004-05-17 ニオズ テクノロジーズ インコーポレイティド Ｇｄｐ―フコースピロホスホリラーゼをコードする核酸
US5728568A (en) 1996-11-22 1998-03-17 Genetics Institute, Inc. Human GDP-mannose 4,6 dehydratase
JP4550947B2 (ja) * 1997-03-19 2010-09-22 協和発酵キリン株式会社 ガングリオシドｇｍ２に対するヒト型相補性決定領域（ｃｄｒ）移植抗体
DE69942021D1 (de) * 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
JP3991294B2 (ja) 1998-05-06 2007-10-17 株式会社ヴァレオサーマルシステムズ 自動車用空気調和装置のファンユニット
US20020012979A1 (en) * 1998-06-08 2002-01-31 Alan Berry Vitamin c production in microorganisms and plants
DK2270149T3 (en) * 1999-04-09 2016-05-09 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCEDURE TO CONTROL THE ACTIVITY OF IMMUNOLOGICAL FUNCTIONAL MOLECULE.
JP2000308526A (ja) 1999-04-28 2000-11-07 Yoshihiro Inomura 鐙型ブラシ
WO2001064754A1 (fr) 2000-03-03 2001-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps a recombinaison genique et son fragment
JP5623683B2 (ja) * 2000-03-22 2014-11-12 フィトン ホールディングス，リミティド ライアビリティ カンパニー 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞
CN102311986B (zh) * 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US20090028877A1 (en) * 2003-10-09 2009-01-29 Shigeru Iida Antibody Composition Specifically Binding to Ganglioside Gm
JP6109648B2 (ja) * 2013-05-29 2017-04-05 株式会社ぐるなび 鉄道を利用した商品販売支援システム

Also Published As

Publication number Publication date
CA2785941A1 (en) 2002-04-18
ES2639222T3 (es) 2017-10-25
DK2314686T4 (da) 2023-08-21
ES2651952T3 (es) 2018-01-30
JP2013231032A (ja) 2013-11-14
EP3263702A1 (en) 2018-01-03
AU2001294198B9 (en) 2008-08-07
CN103333860B (zh) 2015-07-08
CA2953239A1 (en) 2002-04-18
EA200300443A1 (ru) 2003-10-30
CN1894406A (zh) 2007-01-10
BR0114475A (pt) 2003-12-23
KR100877676B1 (ko) 2009-01-09
JP5547754B2 (ja) 2014-07-16
JP2008113663A (ja) 2008-05-22
CA2424602C (en) 2012-09-18
JP4290423B2 (ja) 2009-07-08
JP6010147B2 (ja) 2016-10-19
JP2012087131A (ja) 2012-05-10
JP4740931B2 (ja) 2011-08-03
ES2639222T5 (es) 2023-11-24
JP2018078890A (ja) 2018-05-24
CA2424602A1 (en) 2003-04-02
JP5384677B2 (ja) 2014-01-08
EP2314686A1 (en) 2011-04-27
JP2012085655A (ja) 2012-05-10
AU2001294198C1 (en) 2019-04-04
CN103333860A (zh) 2013-10-02
JP4741011B2 (ja) 2011-08-03
EA013224B1 (ru) 2010-04-30
EP1331266A4 (en) 2005-07-13
JP2014043455A (ja) 2014-03-13
MXPA03002974A (es) 2004-05-05
JP2011092203A (ja) 2011-05-12
JP6270930B2 (ja) 2018-01-31
JP6523404B2 (ja) 2019-05-29
CN102311986B (zh) 2015-08-19
AU9419801A (en) 2002-04-22
AU2001294198B2 (en) 2007-11-29
EP2314685B1 (en) 2017-09-20
HUS2000035I1 (hu) 2022-11-28
JP5301525B2 (ja) 2013-09-25
JP2012075441A (ja) 2012-04-19
HUP0402066A2 (hu) 2005-01-28
EA013563B1 (ru) 2010-06-30
KR20030081312A (ko) 2003-10-17
EP2314686B1 (en) 2017-07-05
EP2314686B2 (en) 2023-06-21
EP3690043A1 (en) 2020-08-05
EA200600469A1 (ru) 2006-08-25
JP5815641B2 (ja) 2015-11-17
JP2009142288A (ja) 2009-07-02
EP1331266A1 (en) 2003-07-30
HUP0402066A3 (en) 2012-09-28
EP1331266B1 (en) 2017-01-04
PL362520A1 (pl) 2004-11-02
JP5770783B2 (ja) 2015-08-26
EP2314685A1 (en) 2011-04-27
JP2015131807A (ja) 2015-07-23
JPWO2002031140A1 (ja) 2004-02-19
JP5384601B2 (ja) 2014-01-08
DK2314686T3 (en) 2017-09-11
CA2785941C (en) 2017-01-10
JP2016185163A (ja) 2016-10-27
WO2002031140A1 (fr) 2002-04-18
CN102311986A (zh) 2012-01-11
HU231090B1 (hu) 2020-07-28
ES2620359T3 (es) 2017-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2424602C (en) Antibody composition-producing cell
US20030115614A1 (en) Antibody composition-producing cell
US20040110704A1 (en) Cells of which genome is modified
US20040259150A1 (en) Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
US20040132140A1 (en) Production process for antibody composition