KR20230054508A - 이중특이적 체크포인트 억제제 항체 - Google Patents

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그레고리 무어
존 데스자라이스
마이클 헤드밧
크리스틴 본존
알렉스 니스탈
우메쉬 에스. 무샬
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Abstract

본 발명은 이중특이적, 이종이량체성 체크포인트 항체에 관한 것이다.

Description

이중특이적 체크포인트 억제제 항체 {BISPECIFIC CHECKPOINT INHIBITOR ANTIBODIES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2016년 6월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/350,145, 2016년 6월 22일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/353,511, 및 2016년 11월 10일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/420,500에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 그 전문이 참고로 명확히 완전하게 편입되어 있다.
서열 목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입되어 있다. 2017년 6월 9일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 067461_5191WO_SL.txt로 명명되며, 32,442, 145 킬로바이트 크기이다.
발명의 배경
체크포인트 수용체 예컨대 CTLA-4, PD-1 (프로그래밍된 세포사 1), TIM-3 (T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 3), LAG-3 (림프구-활성화 유전자 3), TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)), 등은 T 세포 및 다른 세포 유형의 활성화, 증식, 및/또는 효과기 활성을 억제한다. 체크포인트 수용체가 종양 세포에 대한 내인성 T 세포 반응을 억제한다는 가설에 근거하여, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, 및 트레멜리무맙을 포함하는 항-CTLA4 및 항-PDl 항체의 전임상 및 임상 연구에서는 사실상, 체크포인트 차단가 놀라운 항-종양 반응을 초래하고, 종양 세포를 공격하도록 내인성 T 세포를 자극하여 다양한 악성종양을 갖는 환자의 일부에서 장기간 암에 차도가 있음을 실증하였다. 불행하게도, 환자의 일부만이 이들 요법에 반응하며, 징후 및 기타 인자에 따라 반응률은 일반적으로 10 내지 30%의 범위이며, 때때로 각각의 단일요법에 대해 더 높다. 이들 제제들의 치료적 조합, 예를 들어 이필리무맙 플러스 니볼루맙은 일부 경우에 60%에 이르는 더욱더 높은 반응률을 초래한다. 전임상 연구에서는 LAG-3, TIM-3, BTLA 및 TIGIT를 포함하는 보다 최근에 확인된 체크포인트 수용체의 차단과 더불어 항-PD-1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체 사이에 추가적 상승효과를 나타냈다. 다수의 체크포인트 차단 가능성은 매우 유망하지만, 그와 같은 제제와의 병용 요법은 재정적 부담이 높을 것으로 기대된다. 또한, 병용 요법, 예를 들어 니볼루맙 플러스 이필리무맙의 자가면역 독성은 단일요법과 비교하여 상당히 상승되어 많은 환자가 요법을 중단하게 한다.
종양-침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocyte; TIL)를 조사하는 수많은 연구 (Ahmadzadeh 등, Blood 114: 1537 (2009), Matsuzaki 등, PNAS 107(17):7875-7880 (2010), Fourcade 등, Cancer Res. 72(4):887-896 (2012) 및 Gros 등, J. Clinical Invest. 124(5):2246 (2014))에서는 TIL이 통상적으로 다수의 체크포인트 수용체를 발현시키는 것으로 나타났다. 또한, 다수의 체크포인트를 발현시키는 TIL은 사실상 종양-반응성이 가장 클 것이다. 그에 반해서, 주변부의 비-종양 반응성 T 세포는 단일 체크포인트를 발현할 가능성이 더 높다. 단일특이적 전장 항체로의 체크포인트 차단은 자가면역 독성에 기여하는 것으로 추정된 자가항원-반응성 단일 발현 T 세포 대비 종양-반응성 TIL의 탈-억압(de-repression)에 관하여 비차별적일 것이다.
따라서, 본 발명은 2개의 상이한 체크포인트 억제제 단백질에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다.
I. 발명의 간단한 요약
본 발명은 2개의 상이한 체크포인트 세포 표면 수용체 예컨대 인간 PD-1, 인간 CTLA-4, 인간 TIM-3, 인간 LAG-3 및 인간 TIGIT에 결합하는 이중특이적 이종이량체성 항체를 제공한다. 따라서, 일부 양태에서, 적합한 이중특이적 항체는 PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 TIM-3, PD-1 및 LAG-3, PD-1 및 TIGIT, PD-1 및 BTLA, CTLA-4 및 TIM-3, CTLA-4 및 LAG-3, CTLA-4 및 TIGIT, CTLA-4 및 BTLA, TIM-3 및 LAG-3, TIM-3 및 TIGIT, TIM-3 및 BTLA, LAG-3 및 TIGIT, LAG-3 및 BTLA 및 TIGIT 및 BTLA에 결합한다.
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 병 오프너(bottle opener) 포맷을 제공한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함)를 사용하여 연결된 가변 중질 및 가변 경질 도메인을 갖는 scFv, 스큐(skew) 변이체 S364K/E357Q, 절제(ablation) 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하는 Fc 도메인, 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머", 때때로 "scFv 중쇄"로도 지칭됨); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 갖는 Fc 도메인, 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머" 또는 "중쇄"); 및 c) 경쇄. 이러한 특정 구현예에서, 적합한 모노머 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG- 3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD- I, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3, LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
본 발명의 다른 양태가 본 명세서에 제공된다.
II. 도면의 간단한 설명
도 1a 내지 1i는 본 발명의 몇몇 포맷을 묘사한다. 첫 번째는 제1 및 제2 항-항원 결합 도메인을 갖는 "병 오프너" 포맷이다. 추가로, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심(Central)-scFv, 중심-Fv, 하나의 아암의(armed) 중심-scFv, 하나의 scFv-mAb, scFv-mAb 및 이중 scFv 포맷이 모두 도시된다. 묘사된 모든 scFv 도메인의 경우, 이들은 N-말단에서 C-말단 가변 중질-(선택적인 링커)-가변 경질이거나 또는 그 반대일 수 있다. 또한, 하나의 아암의 scFv-mAb의 경우, scFv는 중쇄 모노머의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 부착될 수 있다.
도 2 (도 2a, 2b, 2c 및 2d)는 임상 개발의 용이성을 위해 둘 모두에 결합하는 항원 결합 도메인의 개발을 용이하게 하기 위해 많은 경우에 인간 및 사이노몰구스 원숭이 둘 모두를 포함하는, 본 발명에서 사용되는 수많은 항원에 대한 항원 서열을 나타낸다.
도 3a-3f는 이종이량체화 변이체 세트 (스큐 및 pI 변이체 포함)의 유용한 쌍을 나타낸다. 도 3e에서, 상응하는 "모노머 2" 변이체가 없는 변이체가 존재하며; 이들은 모노머에서 단독으로 사용되거나, 또는 예를 들어, 병 오프너의 Fab 측에 포함될 수 있는 pI 변이체이며, 적절한 하전된 scFv 링커는 scFv를 제2 항원 결합 도메인으로서 이용하는 제2 모노머에서 사용될 수 있다. 적합한 하전된 링커는 도 7에서 보여준다.
도 4는 등전자(isosteric) 변이체 항체 불변 영역 및 그것의 각각의 치환 목록을 나타내며, pl_(-)은 더 낮은 pI 변이체를 나타내는 반면, pl_(+)은 더 높은 pI 변이체를 나타낸다. 이들은 선택적으로 그리고 독립적으로 본 발명의 다른 이종이량체화 변이체 (및 또한 본 명세서에서 설명된 바와 같은 다른 변이체 유형)와 조합될 수 있다.
도 5는 FcγR 결합이 제거된 유용한 절제 변이체 (때때로 "녹 아웃(knock out)" 또는 "KO" 변이체로 지칭됨)를 나타낸다. 일반적으로, 절제 변이체는 두 모노머 모두에서 발견되지만, 일부 경우에 그것은 하나의 모노머에만 있을 수 있다.
도 6은 도 1a 또는 도 1f의 포맷에 사용될 수 있는 2개의 특히 유용한 본 발명의 구현예를 보여준다. 도 1a 포맷의 경우, 이 구현예의 "비-Fv" 구성요소를 도 37a에서 보여주지만, 다른 포맷 (및 또한 도 38의 포맷)이 또한 사용될 수 있다.
도 7은 하나 이상의 scFv를 구성요소로서 이용하는 이종이량체성 항체의 pi를 증가 또는 감소시키는데 사용되는 수많은 하전된 scFv 링커를 나타낸다. (+H) 양성 링커는 특히 본 명세서에서 나타낸 항-CD3 vl 및 vh 서열과 함께 본 명세서에서 특정 용도를 발견한다. 단일 전하를 갖는 단일 선행기술 scFv 링커는 하기로부터 "휘틀로우(Whitlow)"로 언급된다: Whitlow et al, Protein Engineering 6(8):989-995 (1993). 이 링커는 scFv에서 응집을 감소시키고 단백분해 안정성을 향상시키기 위해 사용되었음을 유의해야 한다.
도 8은 이종이량체 수율 (HPLC-CIEX에 의해 결정됨) 및 열적 안정성 (DSC에 의해 결정됨)을 갖는 조작된 이종이량체-스큐잉(skewing) Fc 변이체의 목록을 나타낸다. 결정되지 않은 열적 안정성은 "n.d"로 표시된다.
도 9a 내지 9e는 선택된 수의 PD-1 ABD를 나타내며, 추가의 항-PD-1 ABD는 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146으로 기재되어 있다. CDR은 밑줄쳐져 있으며, scFv 링커는 이중으로 밑줄쳐져 있으며 (서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커 (서열번호: 37755)이지만, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 이 링커는 하전되지 않은 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 이들 중 일부는 도 7에 나타남), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 나타낸다. 또한, 명명 규칙은 N-말단에서 C-말단으로 scFv의 배향을 설명한다. 즉, "H1.279_L1.194"는 배향이 vh-scFv 링커-vl (N-말단에서 C-말단으로, 사용된 포맷에 따라 한쪽 또는 양쪽에 선택적인 도메인 링커가 있음)이지만, 이러한 서열은 또한 반대 배향, (N-말단에서 C-말단으로) vl-링커-vh로도 사용될 수 있음을 보여준다. 유사하게, "L1.194_H1.279"는 배향이 vl-scFv 링커-vh (N-말단에서 C-말단으로, 또 선택적인 도메인 링커를 가짐)이며, 반대 배향 또한 본 발명 내에 포함됨을 보여준다. 본 명세서에서 언급되고, CDR을 함유하는 본 명세서의 모든 서열에 대해 사실인 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에서 나타낸 바와 같이 사용된 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄쳐진 CDR 뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 vh 및 vl 도메인 내에 포함된 CDR도 본 명세서에 포함된다. 게다가, 도면의 모든 서열에 대해, 이러한 vh 및 vl 서열이 scFv 포맷 또는 Fab 포맷에서 사용될 수 있다.
도 10a 내지 10pp는 수많은 CTLA-4 ABD를 나타내며, 추가의 항-CTLA-4 ABD는 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416으로 기재되어 있다. CDR은 밑줄쳐져 있으며, scFv 링커는 이중으로 밑줄쳐져 있으며 (서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커 (서열번호: 37755)이지만, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 이 링커는 하전되지 않은 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 이들 중 일부는 도 7에 나타남), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 나타낸다. 상기와 같이, 명명 규칙은 N-말단에서 C-말단으로 scFv의 배향을 설명하며; 이 도면에 기재된 서열에서, 이들 모두는 vh-scFv 링커-vl (N-말단에서 C-말단으로)로 배향되지만, 이들 서열은 또한, 반대 배향, (N-말단에서 C-말단으로) vl-링커-vh로 사용될 수 있으며; 추가로, 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416의 서열 중 일부는 반대 배향이다. 본 명세서에서 언급되고, CDR을 함유하는 본 명세서의 모든 서열에 대해 사실인 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에서 나타낸 바와 같이 사용된 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄쳐진 CDR 뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 vh 및 vl 도메인 내에 포함된 CDR도 본 명세서에 포함된다. 게다가, 도면의 모든 서열에 대해, 이러한 vh 및 vl 서열이 scFv 포맷 또는 Fab 포맷에서 사용될 수 있다. 특히, 도면의 대부분은 scFv 포맷 뿐만 아니라 Fab 포맷 둘 모두에 대해 XENP 식별자를 포함하며; 예를 들어 XENP19235가 Fab 포맷을 사용한 분자이고, XENP19769가 scFv 분자임을 보여주는 도 10a를 참조한다.
도 11a 내지 11n은 수많은 LAG-3 ABD를 나타내며, 추가의 항-LAG-3 ABD는 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002로 기재되어 있다. CDR은 밑줄쳐져 있으며, scFv 링커는 이중으로 밑줄쳐져 있으며 (서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커이지만, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 이 링커는 하전되지 않은 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 이들 중 일부는 도 7에 나타남), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 나타낸다. 상기와 같이, 명명 규칙은 N-말단에서 C-말단으로 scFv의 배향을 설명하며; 이 도면에 기재된 서열에서, 이들 모두는 vh-scFv 링커-vl (N-말단에서 C-말단으로)로 배향되지만, 이들 서열은 또한, 반대 배향, (N-말단에서 C-말단으로) vl-링커-vh로 사용될 수 있으며; 추가로, 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002의 서열 중 일부는 반대 배향이다. 본 명세서에서 언급되고, CDR을 함유하는 본 명세서의 모든 서열에 대해 사실인 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에서 나타낸 바와 같이 사용된 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄쳐진 CDR 뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 vh 및 vl 도메인 내에 포함된 CDR도 본 명세서에 포함된다. 게다가, 도면의 모든 서열에 대해, 이러한 vh 및 vl 서열이 scFv 포맷 또는 Fab 포맷에서 사용될 수 있다.
도 12a 내지 12c는 수많은 BTLA ABD를 나타내며, 추가의 항-BTLA ABD는 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738로 기재되어 있다. CDR은 밑줄쳐져 있으며, scFv 링커는 이중으로 밑줄쳐져 있으며 (서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커이지만, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 이 링커는 하전되지 않은 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 이들 중 일부는 도 7에 나타남), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 나타낸다. 상기와 같이, 명명 규칙은 N-말단에서 C-말단으로 scFv의 배향을 설명하며; 이 도면에 기재된 서열에서, 이들 모두는 vh-scFv 링커-vl (N-말단에서 C-말단으로)로 배향되지만, 이들 서열은 또한, 반대 배향, (N-말단에서 C-말단으로) vl-링커-vh로 사용될 수 있으며; 추가로, 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738의 서열 중 일부는 반대 배향이다. 본 명세서에서 언급되고, CDR을 함유하는 본 명세서의 모든 서열에 대해 사실인 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에서 나타낸 바와 같이 사용된 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄쳐진 CDR 뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 vh 및 vl 도메인 내에 포함된 CDR도 본 명세서에 포함된다. 게다가, 도면의 모든 서열에 대해, 이러한 vh 및 vl 서열이 scFv 포맷 또는 Fab 포맷에서 사용될 수 있다.
도 13a 내지 13i는 수많은 TIM-3 ABD를 나타내며, 추가의 항-TIM-3 ABD는 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706로 기재되어 있다. CDR은 밑줄쳐져 있으며, scFv 링커는 이중으로 밑줄쳐져 있으며 (서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커이지만, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 이 링커는 하전되지 않은 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 이들 중 일부는 도 7에 나타남), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 나타낸다. 상기와 같이, 명명 규칙은 N-말단에서 C-말단으로 scFv의 배향을 설명하며; 이 도면에 기재된 서열에서, 이들 모두는 vh-scFv 링커-vl (N-말단에서 C-말단으로)로 배향되지만, 이들 서열은 또한, 반대 배향, (N-말단에서 C-말단으로) vl-링커-vh로 사용될 수 있으며; 추가로, 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706의 서열 중 일부는 반대 배향이다. 본 명세서에서 언급되고, CDR을 함유하는 본 명세서의 모든 서열에 대해 사실인 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에서 나타낸 바와 같이 사용된 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄쳐진 CDR 뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 vh 및 vl 도메인 내에 포함된 CDR도 본 명세서에 포함된다. 게다가, 도면의 모든 서열에 대해, 이러한 vh 및 vl 서열이 scFv 포맷 또는 Fab 포맷에서 사용될 수 있다.
도 14a 내지 14i는 병 오프너 포맷 (Fab-scFv-Fc)에서 특정 항-CTLA-4 X 항-PD-1 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 항체는 우선 Fab 가변 영역 및 두 번째로 scFv 가변 영역을 사용하고, 대시로 분리되고, 이어서 사슬 지정을 사용하여 명명된다 (Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄). CDR은 밑줄쳐져 있으며, 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 나타낸다. scFv 도메인은 표시된 바와 같이 vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh의 상이한 배향 (N-말단에서 C-말단으로)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 또한, 본 명세서에 설명된 각각의 서열은 혈청 내 더 긴 반감기를 초래하는, Fc 도메인 중 하나 또는 바람직하게는 둘 모두에서 M428L/N434S 변이체를 포함 또는 배제할 수 있다.
도 15a 내지 15i는 특정 항-LAG-3 X 항-PD-1 Fab-scFv-Fc 이중특이적 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 항체는 우선 Fab 가변 영역 및 두 번째로 scFv 가변 영역을 사용하고, 대시로 분리되고, 이어서 사슬 지정을 사용하여 명명된다 (Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄). CDR은 밑줄쳐져 있으며, 슬래시는 가변 영역의 경계(들)를 나타낸다. scFv 도메인은 배향 (N-말단에서 C-말단으로) vl-링커-vh를 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 또한, 본 명세서에 설명된 각각의 서열은 혈청 내 더 긴 반감기를 초래하는, Fc 도메인 중 하나 또는 바람직하게는 둘 모두에서 M428L/N434S 변이체를 포함 또는 배제할 수 있다.
도 16은 특정 항-BTLA X 항-PD-1 Fab-scFv-Fc 이중특이적 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 항체는 우선 Fab 가변 영역 및 두 번째로 scFv 가변 영역을 사용하고, 대시로 분리되고, 이어서 사슬 지정을 사용하여 명명된다 (Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄). CDR은 밑줄쳐져 있으며, 슬래시는 가변 영역의 경계(들)를 나타낸다. scFv 도메인은 배향 (N-말단에서 C-말단으로) vl-링커-vh를 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 또한, 본 명세서에 설명된 각각의 서열은 혈청 내 더 긴 반감기를 초래하는, Fc 도메인 중 하나 또는 바람직하게는 둘 모두에서 M428L/N434S 변이체를 포함 또는 배제할 수 있다.
도 17은 특정 항-LAG-3 X 항-CTLA-4 Fab-scFv-Fc 이중특이적 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 항체는 우선 Fab 가변 영역 및 두 번째로 scFv 가변 영역을 사용하고, 대시로 분리되고, 이어서 사슬 지정을 사용하여 명명된다 (Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄). CDR은 밑줄쳐져 있으며, 슬래시는 가변 영역의 경계(들)를 나타낸다. scFv 도메인은 배향 (N-말단에서 C-말단으로) vh-링커-vl을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 또한, 본 명세서에 설명된 각각의 서열은 혈청 내 더 긴 반감기를 초래하는, Fc 도메인 중 하나 또는 바람직하게는 둘 모두에서 M428L/N434S 변이체를 포함 또는 배제할 수 있다.
도 18은 일부 항-LAG-3 하이브리도마 스크리닝 결과를 나타낸다. 10 μL 중 1 μg의 인간 LAG-3-hIg를 실온에서 20분 동안 50 μL의 하이브리도마 상청액 (10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 2배, 8회 희석됨)과 혼합하였다. 40 μL의 다우디(Daudi) 또는 라모스(Ramos) 세포 (이들은 내생적으로 MHC-II를 발현시킴)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 상기 세포를 세정하고, 항-인간-Fc-알렉사(Alexa)647 2차 항체와 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 세정하고, 알렉사647에 대해 FACS로 분석하였다.
도 19a 및 19b는 인간 PBMC의 SEB 자극 및 항-CTLA-4 X 항-PD-1 이중특이적 항체로의 처리 후 사이토카인 방출 검정 (A:IL-2, B: IFNγ)을 도시한다.
도 20a 내지 20c는 0일에 인간 PBMC를 NSG 마우스에 생착(engraft)하고, 이어서 1일에 지시된 시험품으로 투약한 후 14일에 CD45+ 사건 및 CD8+ 사건을 도시한다.
도 21a 및 21b는 항-TIM-3 하이브리도마로부터 생성된 키메라성 항체에 의한 SEB-자극된 PBMC 검정에서 T 세포 결합을 나타낸다.
도 22는 3개의 실험으로부터의 일부 항-TIM-3 항원 결합 도메인 엔지니어링 데이터를 나타낸다. 이것은 2가 구현예에 대한 XENP 코드, 파생 클론, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, 옥텟(Octet)에 의해 측정된 인간 TIM-3에 대한 KD 결합 상수, 연합 상수(association constant) 및 해리 상수를 나타낸다.
도 23a 내지 23n은 일부 항-PD-1 항원 결합 도메인 엔지니어링 데이터를 나타낸다. 이것은 2가 및 scFv 구현예에 대한 XENP 코드, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, scFv 배향 (N-말단에서 C-말단으로), 옥텟에 의해 측정된 인간 PD-1에 대한 KD 결합 상수, 및 scFv의 Tm을 나타낸다.
도 24a 내지 24g는 일부 항-CTLA-4 Fab 스크리닝 결과를 도시한다. 이것은 Fab 및 scFv 구현예에 대한 XENP 코드, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, 옥텟에 의해 측정된 인간 및 사이노 CTLA-4에 대한 KD 결합 상수, 및 scFv 및 Fab의 Tm을 나타낸다. 추가로, 적어도 하나의 인간 VH 또는 VL 생식계열(germline)과 정확히 매치된 서열 9-mer의 수는 Fab 및 scFv 둘 모두의 가변 영역에 대한 인간성(humanness)의 척도로서 묘사된다.
도 25a 및 25b는 L-2 방출 by 니볼루맙 (Opdivo®로 시판되는 항-PD-1 단클론성 항체) 단독, 이필리무맙 단독 (Yervoy®로 시판되는 항-CTLA-4 단클론성 항체), 니볼루맙 및 이필리무맙 아암에 기반한 원형 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체 및 "하나의 아암의" 조합 대조군에 의한 IL-2 방출의 향상을 보이는 혼합된 림프구 반응을 도시한다.
도 26은 변이체 항-CTLA-4 Fab 아암 및 변이체 항-PD-1 scFv 아암을 갖는 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체, 뿐만 아니라 대조군으로서 니볼루맙 단독, 이필리무맙 단독, 및 니볼루맙 및 이필리무맙 아암에 기반한 원형 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 IL-2 방출의 향상을 보이는 혼합된 림프구 반응을 도시한다.
도 27은 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체가 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 (인간 CD45 카운트로 측정됨)을 향상시킴을 보여준다. 향상은 니볼루맙 (XENP16432) 단독 (점선)에서 보이는 것보다 더 크다.
도 28은 CD45 세포 수준이 질환을 예측한다는 것을 입증하는, 이식편 대 숙주(Graft-versus-Host) 질환에서 체중과 CD45 세포 카운트 사이의 상관관계를 도시한다.
도 29는 도 27에서 묘사된 연구에서 CD45 세포 카운트와 IFNγ 방출 사이의 상관관계를 도시한다.
도 30은 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체가 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 (인간 CD45 카운트로 측정됨)을 향상시킨다는 것을 보여준다. 향상은 니볼루맙 (XENP16432) 단독 (점선)에서 보이는 것보다 더 크다.
도 31은 도 30에서 묘사된 연구에서 CD45 세포 카운트와 IFNγ 방출 사이의 상관관계를 도시한다.
도 32는 니볼루맙 단독에 비해 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 체크포인트 항체의 일관된 우월성을 입증하는 도 27 및 30에서 묘사된 연구 사이의 시험품 효과의 비교를 보여준다.
도 33a 및 33b는 항-CTLA-4 x 항-PD-1, 항-LAG-3 x 항-PD-1, 및 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체를 평가하기 위한 혼합된 림프구 반응의 결과를 나타낸다. 피분석물 수준은 니볼루맙 단독에 의해 유도된 값으로 정규화되었다 (1보다 큰 값은 니볼루맙에 비해 향상을 나타냄).
도 34는 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체를 평가하기 위한 SEB 반응을 나타낸다. 상기 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체 자체는 대조군에 비해 IL-2 반응을 향상시키지만, 니볼루맙 단독보다 열등하다. 그러나, 니볼루맙과 조합된 상기 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체는 단독으로 사용했을 때보다 IL-2 반응이 상당히 더 높았다.
도 35 항-CTLA-4 x 항-PD-1, 항-LAG-3 x 항-PD-1, 항-BTLA x 항-PD-1, 및 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체는 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 (인간 CD45 카운트로 측정됨)을 향상시킨다. 향상은 니볼루맙 (XENP16432) 단독에서 보이는 것보다 더 크다. 또한, 상기 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체는 니볼루맙과 조합되어 가장 높은 생착 수준을 나타낸다.
도 36a 및 36b는 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체가 니볼루맙과 동등한 탈-억제 활성을 보유하기 위해 HVEM/BTLA 상호작용의 파괴를 필요로 한다는 것을 보여준다.
도 37a 내지 37e는 Fv 서열 (예를 들어 Fab 측에 대해 scFv 및 vh 및 vl) 없이 인간 IgG1을 기반으로 하는 몇 개의 유용한 병 오프너 포맷 백본의 서열을 나타낸다. 병 오프너 백본 1은 인간 IgG1 (356E/358M 동종이인자형(allotype))을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병 오프너 백본 2는 IgG1 (356E/358M 동종이인자형)을 기반으로 하며, 상이한 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병 오프너 백본 3은 인간 IgG1 (356E/358M 동종이인자형)을 기반으로 하며, 상이한 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병 오프너 백본 4는 인간 IgG1 (356E/358M 동종이인자형)을 기반으로 하며, 상이한 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병 오프너 백본 5는 인간 IgG1 (356D/358L 동종이인자형)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병 오프너 백본 6은 인간 IgG1 (356E/358M 동종이인자형)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체, 뿐만 아니라 양쪽 사슬에서의 N297A 변이체를 포함한다. 병 오프너 백본 7은 돌연변이가 N297S인 것을 제외하고는 6과 동일하다. 병 오프너 백본 6 및 7의 대안적인 포맷은 양쪽 사슬에서 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 배제할 수 있다. 백본 8은 인간 IgG4를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체, 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 바와 같이 Fab 아암 교환이 제거된 양쪽 사슬에서의 S228P (EU 넘버링, 이것은 카밧(Kabat)에서 S241P임) 변이체를 포함한다. 병 오프너 백본 8에 대한 대안적인 포맷은 양쪽 사슬에서 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 배제할 수 있다. 백본 9는 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체를 포함한다. 백본 10은 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 뿐만 아니라 양쪽 사슬에서의 S267K 변이체를 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고, 하기 설명된 바와 같이, 이들 서열은 본 명세서에 설명된 임의의 vh 및 vl 쌍과 함께 사용될 수 있으며, 하나의 모노머는 scFv (선택적으로 하전된 scFv 링커 포함)를 포함하고, 다른 모노머는 Fab 서열 (예를 들어 "Fab 측 중쇄"에 부착된 vh 및 "불변 경쇄"에 부착된 vl)을 포함한다. 즉, scFv (다시, 선택적으로 하전된 scFv 링커를 가짐) 또는 Fab로서의 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-LAG-3, 항-TIM-3, 항-TIGIT 및 항-BTLA에 대해 본 명세서에서 설명된 임의의 Fv 서열은 임의의 조합으로 이러한 도 37의 백본 내로 편입될 수 있다. 도 37a에 도시된 불변 경쇄는 도면의 모든 구조물에 대해 사용될 수 있지만, 카파 불변 경쇄가 또한 치환될 수 있다.
이러한 병 오프너 백본은 도 1f의 중심-scFv 포맷에 사용되며, 여기서 제1 Fab와 동일한 항원 결합을 갖는 추가의 제2 Fab (vh-CH1 및 vl-불변 경질)가 "병 오프너 측"에서 scFv의 N-말단에 첨가된다는 것을 유의해야 한다.
각각의 이들 백본 내에 포함되는 것은 열거된 서열과 90, 95, 98 및 99% 동일하고 (본 명세서에서 정의된 바와 같음), 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 추가의 아미노산 치환 (도면의 "모(parent)"와 비교되며, 이는 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 모계 인간 IgG1 (또는 백본에 따라 IgG2 또는 IgG4)과 비교하여 이미 수많은 아미노산 변형을 포함함)을 포함하는 서열이다. 즉, 열거된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 포함된 스큐, pI 및 절제 변이체에 더하여 추가의 아미노산 변형 (일반적으로 아미노산 치환)을 포함할 수 있다.
도 38a 내지 38d는 본 발명의 Fv 서열이 첨가된 본 발명에서 사용되는 mAb-scFv 백본의 서열을 나타낸다. mAb-scFv 백본 1은 인간 IgG1 (356E/358M 동종이인자형)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 2는 인간 IgG1 (356D/358L 동종이인자형)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 3은 인간 IgG1 (356E/358M 동종이인자형)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체, 뿐만 아니라 양쪽 사슬에서의 N297A 변이체를 포함한다. 백본 4는 돌연변이가 N297S인 것을 제외하고는 3과 동일하다. mAb-scFv 백본 3 및 4의 대안적인 포맷은 양쪽 사슬에서 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 배제할 수 있다. 백본 5는 인간 IgG4를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬에서의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체, 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 바와 같이 Fab 아암 교환이 제거된 양쪽 사슬에서의 S228P (EU 넘버링, 이것은 카밧에서 S241P임) 변이체를 포함한다. 백본 6은 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체를 포함한다. 백본 7은 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측에서의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 뿐만 아니라 양쪽 사슬에서의 S267K 변이체를 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고, 하기 설명된 바와 같이, 이들 서열은 본 명세서에 설명된 임의의 vh 및 vl 쌍과 함께 사용될 수 있으며, 하나의 모노머는 Fab 및 scFv 모두 (선택적으로 하전된 scFv 링커 포함)를 포함하고, 다른 모노머는 Fab 서열 (예를 들어 "Fab 측 중쇄"에 부착된 vh 및 "불변 경쇄"에 부착된 vl)을 포함한다. 즉, scFv (다시, 선택적으로 하전된 scFv 링커를 가짐) 또는 Fab로서의 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-LAG-3, 항-TIM-3, 항-TIGIT 및 항-BTLA에 대해 본 명세서에서 설명된 임의의 Fv 서열은 임의의 조합으로 이러한 도 38의 백본 내로 편입될 수 있다. 모노머 1 측은 Fab-scFv pI 음성 측이고, 이종이량체화 변이체 L368D/K370S, 등전자 pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (모두 IgG1에 대해)를 포함한다. 모노머 2 측은 scFv pI 양성 측이며, 이종이량체화 변이체 364K/E357Q를 포함한다. 그러나, 다른 스큐 변이체 쌍, 특히 [S364K/E357Q : L368D/K370S] ; [L368D/K370S : S364K] ; [L368E/K370S : S364K] ; [T41 1T/E360E/Q362E : D401K] ; [L368D/K370S : S364K/E357L], [K370S : S364K/E357Q], [T366S/L368A/Y407V : T366W] 및 [T366S/L368A/Y407V/Y394C : T366W/S354C]이 치환될 수 있다.
도 38a에 도시된 불변 경쇄는 도면의 모든 구조물에 대해 사용될 수 있지만, 카파 불변 경쇄가 또한 치환될 수 있다.
이러한 mAb-scFv 백본은 도 1h의 mAb-Fv 포맷 (여기서 하나의 모노머는 C-말단에서 vl을 포함하고, 다른 것은 C-말단에서 vh를 포함함)뿐만 아니라 도 1e의 scFv-mAb 포맷 (상기 모노머 중 하나의 C-말단에 첨가된 scFv 도메인을 가짐) 둘 모두에서 사용된다는 것을 유의해야 한다.
각각의 이들 백본 내에 포함되는 것은 열거된 서열과 90, 95, 98 및 99% 동일하고 (본 명세서에서 정의된 바와 같음), 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 추가의 아미노산 치환 (도면의 "모"와 비교되며, 이는 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 모계 인간 IgG1 (또는 백본에 따라 IgG2 또는 IgG4)과 비교하여 이미 수많은 아미노산 변형을 포함함)을 포함하는 서열이다. 즉, 열거된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 포함된 스큐, pI 및 절제 변이체에 더하여 추가의 아미노산 변형 (일반적으로 아미노산 치환)을 포함할 수 있다.
도 39a 및 39b는 본 발명의 이중특이적 체크포인트 항체에 대한 가능한 조합의 매트릭스를 나타낸다. 도 39a에서, 상기 조합은 포맷에 구속되지 않으며, 도 1의 임의의 포맷이 사용될 수 있다. 박스 안의 "A"는 제1 ABD (X 축에 열거됨)로부터의 CDR이 제2 ABD (Y 축에 열거됨)의 CDR과 조합될 수 있음을 의미한다. 박스 안의 "B"는 제1 ABD로부터의 vh 및 vl 사슬이 제2 ABD로부터의 vh 및 vl 사슬과 조합될 수 있음을 의미한다. 박스 안의 "C"는 제1 ABD로부터의 CDR이 제2 ABD로부터의 vh 및 vl 사슬과 조합될 수 있음을 의미한다. 박스 안의 "D"는 제1 ABD로부터의 vh 및 vl 사슬이 제2 ABD로부터의 CDR과 조합될 수 있음을 의미한다. 박스 안의 "E"는 PD-1 ABD가 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1의 그룹으로부터 선택됨을 의미한다. 박스 안의 "F"는 CTLA-4 ABD가 [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; 0[CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; 및 [CTLA-4]_H3_L0.74의 그룹으로부터 선택됨을 의미한다. 박스 안의 "G"는 TIM-3 ABD가 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0; 및 7C2 H0L0의 그룹으로부터 선택됨을 의미한다. 박스 안의 "H"는 LAG-3 ABD가 식별자 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8 H3L1의 그룹으로부터 선택됨을 의미한다. 박스 안의 "I"는 박스 안의 "J"가, BTLA ABD가 그룹 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1로부터 선택됨을 의미함을 의미한다. 도 39b는 도 39a와 동일하지만, 단 도 39b는 병 오프너 포맷에 특정하다. B에서, 제1 ABD가 PD-1에 결합하는 경우, 제1 ABD는 scFv 모노머이고, 다른 ABD (CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3 및 BTLA)는 Fab 모노머에 있다. B에서, 제1 ABD가 CTLA-4에 결합하는 경우, 그것은 scFv 모노머에 있으며 (PD-1와 조합되는 경우, Fab 측에 있는 경우는 제외함), 다른 ABD (CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3 및 BTLA)는 Fab 모노머에 있다.
도 40은 가능한 병 오프너 포맷 조합의 매트릭스를 나타낸다. 박스 안의 "Q"는 제1 ABD 도메인 (다시, X 축에 열거됨)이 scFv이고, 제2 ABD (다시, Y 축에 열거됨)가 Fab 측임을 의미한다. 박스 안의 "R"은 제1 ABD가 Fab 측이고, 제2 ABD가 scFv임을 의미한다. 박스 안의 "S"는 제1 ABD가 항-PD-1이고, scFv 측임을 의미한다. 박스 안의 "T"는 제1 ABD가 항-CTLA-4이고, scFv 측임을 의미한다. 박스 안의 "U"는 제1 ABD가 항-TIM-3이고, scFv 측임을 의미한다. 박스 안의 "V"는 제1 ABD가 항 LAG-3이고, scFv 측임을 의미한다. 박스 안의 "W"는 제1 ABD가 항 TIGIT이고, scFv 측임을 의미한다. 박스 안의 "X"는 제1 ABD가 항-BTLA이고, scFv 측임을 의미한다. 또한, 도 39에서 설명된 각각의 조합은 도 38의 CDR, scFv 및 vh 및 vl 조합을 사용할 수 있다. 또한, 도 39의 병 오프너 백본의 특정 구현예는 도 36의 서열이다.
도 41a 및 41b는 이중특이적 체크포인트 항체가 2개의 상이한 항체 또는 약물을 사용한 병용 요법에 비해 제공될 수 있는 이점과 관련된 개략도를 나타낸다.
도 42는 종양 TIL이 다중 체크포인트를 공-발현시키기 때문에, 2가 결합은 결합능(avidity)을 향상시키면서 항-종양 활성을 향상시키고 주변 독성을 피한다는 것을 보여주는 유사한 개략도를 나타낸다.
도 43은 본 발명의 이중특이적 체크포인트 항체 (예를 들어 항-LAG- 3 x 항-CTLA-4)가 다른 단일특이적 체크포인트 항체 (예를 들어 니볼루맙, 페모브롤리주맙)와 조합될 수 있음을 보여준다.
도 44는 PD-1 및 CTLA-4가 방광, 유방, 결장, 전립선, 폐, 흑색종 및 난소암을 포함하는 여러 종양 유형에서 공발현된다는 것을 보여준다.
도 45a 내지 45c는 SEB-자극된 PBMC 검정뿐만 아니라 C) SEB 자극이 없는 대조 실험에서 B) 항-PD-1 2가 및 항-CTLA-4 x 항-PD-1 및 C) 및 하나의-아암 항-PD-1 + 하나의-아암 항-CTLA- 4 및 항-CTLA-4 x 항-PD-1에 의한 IL-2의 향상 비교를 나타낸다.
도 46a 및 46b는 하나의-아암 항-PD-1 및 하나의-아암 항-CTLA-4 항체와 비교하여 예시적인 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 대한 PD-1의 차단을 나타낸다.
도 47은 SEB-자극된 PBMC 검정에서 예시적인 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 T 세포 결합를 나타낸다.
도 48은 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체가 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 (인간 CD45 카운트로 측정됨)을 향상시킨다는 것을 보여준다. 향상은 니볼루맙 (XENP16432) 단독에서 보이는 것보다 더 크다.
도 49는 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 후보가 SEB-자극된 PBMC 검정에서 "하나의-아암의" 대조군에 비해 T 세포에 더 열렬히 결합한다는 것을 보여준다.
도 50a 및 50b는 항-BTLA x 항-PD-1 키메라성 이중특이적 항체가 SEB 자극된 PBMC로부터 IL-2 분비를 촉진시킨다는 것을 보여준다. PBMC를 3일 동안 10 ng/mL SEB로 자극하고, 지시된 시험품으로 처리하였다. 세포 상청액을 수집하고, 지시된 피분석물에 대해 MSD로 분석하였다. A: 20 μg/mL 시험품; B 5 μg/mL 시험품.
도 51a 및 51b는 항-BTLA x 항-PD-1 키메라성 이중특이적 항체가 SEB 자극된 PBMC로부터 IFNγ 분비를 촉진시킨다는 것을 보여준다. PBMC를 3일 동안 10 ng/mL SEB로 자극하고, 지시된 시험품으로 처리하였다. 세포 상청액을 수집하고, 지시된 피분석물에 대해 MSD로 분석하였다. A: 20 μg/mL 시험품; B 5 μg/mL 시험품.
도 52a 및 52b는 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체 (키메라 및 인간화된/최적화된 항-BTLA Fab 아암을 가짐)가 SEB 자극된 PBMC로부터 IL-2 분비 및 IFN-γ를 촉진시킨다는 것을 보여준다. 두 패널 모두 지시된 20 μg/mL 시험품으로 3일 동안 10 ng/mL SEB로 자극된 PBMC였다. 세포 상청액을 72시간 후 수집하고, 지시된 피분석물에 대해 분석하였다.
도 53a 내지 53f는 GVHD 연구에서 예시적인 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 CD45 세포 카운트 및 IFNγ 분비의 시간 경과 (10, 14 및 22일) 향상을 보여준다.
도 54는 일부 9C6 항-BTLA 항원 결합 도메인 엔지니어링 데이터를 나타낸다. 이것은 2가 구현예에 대한 XENP 코드, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, 및 옥텟에 의해 측정된 인간 BTLA에 대한 KD 결합 상수를 나타낸다.
도 55a 내지 55e는 일부 2A11 항-LAG-3 항원 결합 도메인 엔지니어링 데이터를 나타낸다. 이것은 Fab 구현예에 대한 XENP 코드, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, 옥텟에 의해 측정된 인간 LAG-3에 대한 KD 결합 상수, 및 Fab의 Tm을 나타낸다.
도 56a 내지 56k는 일부 7G8 항-LAG-3 항원 결합 도메인 엔지니어링 데이터를 나타낸다. 이것은 Fab 구현예에 대한 XENP 코드, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, 옥텟에 의해 측정된 인간 LAG-3에 대한 KD 결합 상수, 및 Fab의 Tm을 나타낸다.
도 57a 및 57b는 옥텟에 의해 측정된 최적화된 2A11 또는 7G8 항-LAG-3 Fab 아암을 기반으로 하는 항-LAG-3 X 항-CTLA-4 이중특이적, 이종이량체성 병 오프너 포맷에 대한 Kd를 나타낸다.
도 58은 항-LAG-3 (7G8) x 항-CTLA-4 및 항-LAG-3 (2A11) x 항-CTLA-4 이중특이적 항체가 하나의-아암의 항-LAG-3 대조군보다 더 열렬히 결합한다는 것을 보여준다. PBMC는 3일 동안 100 ng/mL SEB로 자극되었다. 이후 세포를 4℃에서 30분 동안 지시된 시험품으로 처리하고 2회 세정하였다. 이후 세포를 항-CD3-FITC 및 항-인간-Fc-APC 항체로 처리하였다. 이후 세포를 2회 세정하고, 유세포측정법법으로 분석하였다.
도 59a 및 59b는 7G8 기반 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체가 IL-2 및 IFNγ 방출의 향상으로 표시된 바와 같이 2A11 기반 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체보다 PBMC에서 더 선택적 기능을 나타낸다는 것을 보여준다. PBMC는 2일 동안 500 ng/mL의 SEB로 자극되었다. 이후 세포를 배양 배지에서 2회 세정하고, 지시된 양의 시험품과 함께 500 ng/mL SEB로 자극되었다. 처리 24시간 후 세포를 지시된 피분석물 (IL-2 또는 IFN-γ)에 대해 분석하였다. 각각의 점은 테크니컬 싱글렛(technical singlet)에서 시험된 고유한 공여체를 나타낸다.
도 60a 및 60b는 항-LAG-3 X 항-CTLA-4 이중특이적 항체와 혼합된 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction; MLR)을 나타낸다. 20 ug/mL의 지시된 시험품의 존재 하에 40개의 고유한 MLR 반응이 이루어졌다. 이후 세포 상청액을 처리 6일 후 A: IL-2 및 B: IFNγ에 대해 MSD로 분석하였다.
도 61a 및 61b는 SEB 검정에서 추가의 항-LAG-3 X 항-CTLA-4 후보에 의한 IL-2 및 IFNγ 방출의 향상을 보여준다. PBMC는 2일 동안 500 ng/mL SEB로 자극되었다. 이후 세포를 배양 배지에서 2회 세정하고, 지시된 양의 시험품과 함께 500 ng/mL SEB로 자극하였다. 세포를 처리 24시간 후 지시된 피분석물 (IL-2 또는 IFN-γ)에 대해 분석하였다. 각각의 점은 테크니컬 싱글렛에서 시험된 고유한 공여체를 나타낸다.
도 62a 및 62b는 옥텟에 의해 측정된 최적화된 2A11 또는 7G8 항-LAG-3 Fab 아암을 기반으로 하는 항-LAG-3 X 항-PD-1 이중특이적, 이종이량체성 병 오프너 포맷에 대한 Kd를 나타낸다.
도 63a 및 63b는 MHC-II를 내생적으로 발현시키는 다우디 세포에 대한 LAG-3 결합을 차단하는 인간화된/최적화된 7G8 및 2A11 항-LAG-3 클론의 능력을 나타낸다.
도 64a 및 64b는 SEB 자극된 T 세포에서 항-LAG-3 x 항-PD-1 후보 기능을 나타낸다. PBMC는 2일 동안 500 ng/ml SEB로 자극되었다. 이후 세포를 배양 배지에서 2회 세정하고, 지시된 양의 시험품과 함께 500 ng/mL SEB로 자극하였다. 세포를 치료 24시간 후 지시된 피분석물에 대해 분석하였다. 각각의 점은 테크니컬 싱글렛에서 시험된 고유한 공여체를 나타낸다.
도 65는 종양 침윤 림프구 (TIL)가 다양한 종양에서 다수의 체크포인트 수용체를 공-발현시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 특히, 상기 그래프는 다양한 종양이 PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 BTLA, PD-1 및 LAG-3; 및 LAG-3 및 CTLA-4를 공발현시킨다는 것을 보여준다. 나타낸 결과는 TCGA 리서치 네트워크에 의해 산출된 데이터에 근거한다: http://cancergenome.nih.gov/
도 66은 본 명세서에서 제공된 대상 이중특이적 항체가 이중-체크포인트 양성 T 세포를 선택적으로 표적화한다는 것을 보여준다. 이중특이적 PD-1 x LAG-3 항체는 음성 대조군과 비교하여 포도상구균 장독소 B (staphylococcal enterotoxin B; SEB)로 자극된 CD3+ T-세포에서 PD-1 및 LAG-3 수용체 점유를 보여주기 위해 사용된다.
도 67a 내지 67f는 본 명세서에서 제공된 대상 항체의 구성요소 항체 도메인이 체크포인트 수용체/리간드 상호작용을 차단할 수 있음을 보여주는 그래프이다. 특히, 1G6 항-PD-1 scFv 아암을 포함하는 이중특이적 항체는 PD-l/PD-Ll 및 PD-1/PD-L2 상호작용을 차단할 수 있으며; 7G8 항-LAG-3 하나의 아암은 LAG-3/MHC II 상호작용을 차단할 수 있으며; 예시적인 항-PD-1 Fab 아암을 포함하는 이중특이적 항체는 CTLA-4/CD80 및 CTLA-4/CD86 상호작용을 차단할 수 있으며; 9C6 항-BTLA Fab 아암을 포함하는 이중특이적 항체는 BTLA/HVEM 상호작용을 차단할 수 있다.
도 68은 예시적인 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체 및 니볼루맙에 의한 IL-2 방출 향상을 비교한 것이다.
도 69는 예시적인 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체, 니볼루맙과 조합된 동일한 이중특이적 항체, 및 니볼루맙 단독에 의한 IL-2 방출 향상을 비교한 것이다.
도 70은 예시적인 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체 및 니볼루맙에 의한 IL-2 방출 향상을 비교한 것이다.
도 71은 예시적인 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체 및 니볼루맙에 의한 IL-2 방출 향상을 비교한 것이다.
도 72는 예시적인 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체, 니볼루맙 단독, 및 이필리무맙과 조합된 니볼루맙에 의한 GVHD 향상 (CD45 세포 카운트로 표시됨)을 비교한 것이다.
도 73은 예시적인 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체 및 니볼루맙에 의한 GVHD 향상 (CD45 세포 카운트로 표시됨)을 비교한 것이다.
도 74는 예시적인 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체, 니볼루맙과 조합된 동일한 이중특이적 항체, 및 니볼루맙 단독에 의한 GVHD 향상 (CD45 세포 카운트로 표시됨)을 비교한 것이다.
도 75는 예시적인 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체 및 니볼루맙에 의한 GVHD 향상 (CD45 세포 카운트로 표시됨)을 비교한 것이다.
도 76a 내지 76d는 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체가 생체내 T 세포 매개된 항-종양 효능을 촉진시킬 수 있음을 보여주는 2개의 연구를 나타낸다. KG1a-luc 암 세포는 마우스 내로 생착되었다. 21일 후, huPMC를 동일한 마우스 내로 생착시키고, 매주 항체 치료제 (항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체; 항-PD-1 2가 항체; 또는 항-PD-1 2가 항체 + 항-CTLA-4 2가 항체)를 투여하였다. 상기 마우스에서 IVIS 암 세포 이미지화를 수행하여 종양 플럭스 변화에 의해 결정된 종양 크기를 평가하였다.
III. 본 발명의 상세한 설명
A. 물질의 혼입
1. 도면 및 범례
USSN 62,350,145, 62/353,511 및 62/420,500의 모든 도면 및 수반된 범례는 그 전문이, 특히 본 명세서에 나타낸 아미노산 서열에 대해 본 명세서에 참고로 명백하고 독립적으로 편입되어 있다.
2. 서열
다음과 같이 수반된 서열 목록을 참조한다: ABD로서 사용하기에 적합한 항-PD-1 서열은 서열번호: 6209-11464 (PD-1 scFv 서열, 그러나 그 안의 Fv 서열은 Fab로 포맷(format)될 수 있음), 서열번호: 11465-17134 (PD-1 Fab 서열, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 서열번호: 33003-33072 (추가의 PD-1 Fab 서열, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 서열번호: 33073-35394 (추가의 PD-1 scFv 서열, 그러나 그 안의 Fv 서열은 Fab로 포맷될 수 있음), 및 서열 번호: 36127-36146 (scFv 또는 Fab로 포맷될 수 있는, PD-1 2가 구조물)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-CTLA-4 서열은 서열번호: 21-2918 (CTLA-4 scFv 서열, 그러나 그 안의 Fv 서열은 Fab로 포맷될 수 있음), 서열번호: 2919-6208 (CTLA-4 Fab 서열, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 서열번호: 36739-36818 (추가의 CTLA-4 Fab 서열, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 및 서열번호: 35395-35416 (Fab 또는 scFv로 포맷될 수 있는, CTLA-4 하나의 아암의 구조물)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-LAG-3 서열은 서열번호: 17135-20764 (LAG-3 Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 서열번호: 36819-36962 (추가의 LAG-3 Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 서열번호: 35417-35606 (추가의 LAG-3 Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 서열번호: 25194-32793 (추가의 LAG-3 Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 및 서열번호: 32794-33002 (Fab 또는 scFv로 포맷될 수 있는, 하나의 아암의 LAG-3 구조물)를 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열번호: 20765-20884 (TIM-3 Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 서열번호: 37587-37698 (추가의 TIM-3 Fab, 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 및 서열번호: 36347-36706 (Fab 또는 scFv로 포맷될 수 있는 2가 TIM-3 구조물)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열번호: 20885-21503 (BTLA Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 및 서열번호: 36707-36738 (추가의 BTLA Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열번호: 21504-21523 (TIGIT Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음), 및 서열번호: 37435-37586 (추가의 TIGIT Fab, 그러나 그 안의 Fv 서열은 scFv로 포맷될 수 있음)을 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 서열번호: 35607-35866 및 서열번호: 21524-22620의 LAG3 X CTLA4 구조물을 포함한다. PD-1 X CTLA4 구조물은 서열번호: 36167-36346 및 서열번호: 23316-23735로 열거된 것들을 포함한다. PD-1 X TIM3 구조물은 서열번호: 25174-25193으로 열거된 것들을 포함한다. PD-1 X LAG3 구조물은 서열번호: 35867-36126 및 서열번호: 23736-25133으로 열거된 것들을 포함한다. PD-1 X TIGIT 구조물은 서열번호: 25134-25173으로 열거된 것들을 포함한다. PD-1 X BTLA 구조물은 서열번호: 22724-23315 및 서열번호: 36147-36166으로 열거된 것들을 포함한다. CTLA4 X BTLA 구조물은 서열번호: 22624-22723으로 열거된 것들을 포함한다. 마지막으로, XENP23552, XENP22841, XENP22842, XENP22843, XENP22844, XENP22845, XENP22846, XENP22847, XENP22848, XENP22849, XENP22850, XENP22851, XENP22852, XENP22858, XENP22854, XENP22855에 대한 명칭은 모두 표제에 "M428L/N434S" 표기법이 포함되어야 하며, 이는 본의 아니게 중단되었다.
B. 개요
면역 체크포인트 억제제 예컨대 PD-1을 겨냥한 치료 항체는 암 치료를 위한 클리닉의 제한된 상황에서 큰 가능성을 보여주고 있다. 암은 환자가 암성 세포를 인식하고 제거할 수 없는 것으로 간주될 수 있다. 많은 경우에, 이러한 형질전환된 (예를 들어 암성) 세포는 면역감시를 상쇄한다. 면역 반응을 회피하거나 억제하기 위해 암성 세포에 의해 이용될 수 있는, 억제되지 않은 T-세포 활성을 방지하기 위해 체내 T-세포 활성화를 제한하는 자연적인 제어 기전이 있다. 암을 인식하고 제거하기 위해 면역 효과기 세포, 특히 T 세포의 능력을 회복시키는 것이 면역요법의 목표이다. 때때로 "면역요법"으로도 불리는 면역-종양학 분야는 예르보이(Yervoy), 키트루다(Keytruda) 및 옵디보(Opdivo)와 같이 T 세포 체크포인트 억제 항체의 몇몇 최근 승인과 더불어 빠르게 발전하고 있다. 이들 항체는 보통 T 세포 면역의 음성 조절 인자를 차단하기 때문에 일반적으로 "체크포인트 억제제"로 지칭된다. 일반적으로, 공자극 및 공억제 둘 모두를 포함하는 여러 면역조절 신호가 최적의 항원-특이적 면역 반응을 조율하는데 사용될 수 있음이 이해된다.
일반적으로, 이러한 단클론성 항체는 체크포인트 억제제 단백질 예컨대 CTLA-4 및 PD-1에 결합하여 정상적인 상황하에 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cell; CTL)의 활성화를 방지 또는 억제한다. 예를 들어 이들 단백질에 결합하는 항체를 사용하여 체크포인트 단백질을 억제함으로써, 종양에 대해 증가된 T 세포 반응이 달성될 수 있다. 즉, 이러한 암 체크포인트 단백질은 면역 반응을 억제하고; 상기 단백질이 예를 들어 체크포인트 단백질에 대한 항체를 사용하여 차단되는 경우, 면역 시스템이 활성화되어 면역 자극을 유발하고, 결국 암 및 감염성 질환과 같은 병태가 치료된다.
그러나, 상기에 논의된 바와 같이, 연구에서는 TIL이 통상적으로 다수의 체크포인트 수용체를 발현시킨다는 것을 보여주며; 이것은 단일 체크포인트 차단이 완전한 T 세포 반응을 촉진시키는데 불충분할 수 있음을 시사할 수 있다. 또한, 다수의 체크포인트를 발현시키는 TIL이 사실상 가장 종양-반응성일 것이며, 따라서 하나 초과의 체크포인트 항원이 관여된 요법이 매우 유용할 수 있음을 시사한다.
따라서, 본 발명은 2개의 항원을 발현시키는 세포에 결합하는 이중특이적 체크포인트 항체, 및 질환 예컨대 암 및 감염성 질환, 및 증가된 면역 활성이 치료를 야기하는 다른 병태를 치료하기 위해 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 일부 경우에, 단일 세포 상에서 2개의 상이한 체크포인트 억제제 분자에 결합하고, 유리하게는 단 하나의 치료 물질의 투여를 요구하는 이중특이적 항체를 제공함으로써 다중 항체를 투여하는 독성 및 비용의 문제를 해결하는 것에 관한 것이다.
2개의 상이한 표적에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항체는 TIL 대 주변 T 세포를 표적화하는 선택성을 개선시킬 가능성을 제공하면서, 또한 치료 비용을 절감시킨다. 세포 표면에서 항체의 2개의 표적과의 2가 상호작용은, 일부 경우에, 한번에 하나의 표적과의 1가 상호작용에 비해 결합력(binding avidity)을 더 높일 것이다. 이 때문에, 정상의 2가 항체는 세포 표면에서 그것의 표적에 대해 높은 결합능을 갖는 경향이 있다. 이중특이적 항체에 의해, 두 표적에 대한 동시 결합에 의해 제공되는 더 높은 결합능을 이용하여 2개의 상이한 표적을 동시에 발현시키는 세포에 대한 선택성을 더 높일 수 있는 가능성이 존재한다.
따라서, 본 발명은 하나 초과의 체크포인트 항원 또는 리간드에 대한 결합을 허용하는, 예를 들어 이중특이적 결합을 허용하는 이종이량체성 항체를 제공하기 위한 신규한 구조물에 관한 것이다. 그러므로, 예를 들어, 항-PD1 x 항-CTLA4 (PD1 x CTLA4) 이중특이적 항체는 PD1+CTLA4+ 이중 양성 TIL 대 단일 양성 PDl-단독 또는 CTLA4-단독 T 세포에 대해 더 선택적일 것으로 기대된다. 따라서 이중-양성 TIL 대 단일 양성 T 세포의 선택적 차단은 조합된 체크포인트 차단의 치료 지수를 개선시킬 것으로 기대된다. 이것은 본 명세서에 설명된 다른 가능한 조합에 대해서도 유사하게 적용된다. 따라서, 본 발명의 적합한 이중특이적 항체는 PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 TIM-3, PD-1 및 LAG-3, PD-1 및 TIGIT, PD-1 및 BTLA, CTLA-4 및 TIM-3, CTLA-4 및 LAG-3, CTLA-4 및 TIGIT, CTLA-4 및 BTLA, TIM-3 및 LAG-3, TIM-3 및 TIGIT, TIM-3 및 BTLA, LAG-3 및 TIGIT, LAG-3 및 BTLA 및 TIGIT 및 BTLA에 결합한다. 일반적으로 이러한 이중특이적 항체는 "항-PD-1 X 항-CTLA-4", 또는 일반적으로는 단순하게 또는 용이함을 위해 (및 따라서 상호교환적으로) 각각의 쌍에 대해 "PD-1 X CTLA-4" 등으로 명명된다는 것을 유의한다.
본 발명의 이종이량체성 이중특이적 체크포인트 항체는 여러 가지 유형의 암을 치료하는데 유용하다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 종양 항원에 결합하는 전통적 단클론성 항체, 또는 예를 들어, CD3 및 종양 항원 (예를 들어 USSN 15/141,350에 기재됨)에 결합하는 신규한 부류의 이중특이적 항체와 달리, 체크포인트 항체는 면역 반응을 증가시키는데 사용되지만 일반적으로 그것의 작용이 종양 특이적이지 않다. 즉, 본 발명의 이중특이적 체크포인트 항체는 면역 시스템의 억제를 저해하여 일반적으로 T 세포 활성화를 유발하고, 이는 또한 암성 세포에 대한 면역 반응을 더욱 증가시켜 치료를 초래한다. 따라서 그와 같은 항체는 다양한 종양 유형의 치료에 유용할 것으로 기대될 수 있다. 예를 들어, FDA는 최근에, 종양 유형보다는 유전적 특징에 기초한 항-PD-1 단일특이적 항체인, Keytruda®를 승인하였다.
아래에 논의된 바와 같이, T 세포 활성화를 측정할 수 있는 여러 가지 방법이 있다. NK 및 T-세포에 대한 이중특이적 체크포인트 항체의 기능적 효과는 하기 파라미터의 변화를 측정함으로써 시험관내 (및 일부 경우에 생체내, 하기에서 보다 완전하게 기재됨)에서 평가될 수 있다: 증식, 사이토카인 방출 및 세포-표면 마커. NK 세포의 경우, 세포 증식, 세포독성 (CD 107a, 그란자임(granzyme), 및 페르포린 발현(perforin expression) 또는 표적 세포 사멸을 직접 측정함으로써 측정된 표적 세포를 사멸시키는 능력), 사이토카인 생산 (예를 들어 IFN-γ 및 TNF), 및 세포 표면 수용체 발현 (예를 들어 CD25)의 증가가 면역 조절을 나타내며, 예를 들어 암 세포의 강화된 사멸을 나타낸다. T-세포의 경우, 증식의 증가, 활성화의 세포 표면 마커 (예를 들어 CD25, CD69, CD137, 및 PD1)의 발현 증가, 세포독성 (표적 세포를 사멸시키는 능력), 및 사이토카인 생산 (예를 들어 IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-17A)의 증가가 면역 조절을 나타내며, 예를 들어 암 세포의 강화된 사멸을 나타낸다. 따라서, 치료 평가는 하기 중 하나 이상을 평가하는 검정을 사용하여 수행될 수 있다: (i) 면역 반응 증가, (ii) αβ 및/또는 γδ T 세포의 활성화 증가, (iii) 세포독성 T 세포 활성 증가, (iv) NK 및/또는 NKT 세포 활성 증가, (v) αβ 및/또는 γδ T-세포 억제의 완화, (vi) 전-염증 사이토카인 분비 증가, (vii) IL-2 분비 증가; (viii) 인터페론-γ 생산 증가, (ix) Th1 반응 증가, (x) Th2 반응 감소, (xi) 조절 T 세포 및 세포 중 적어도 하나의 세포 수 및/또는 활성의 감소, (xii) 종양 면역 침윤물의 증가.
따라서, 일부 구현예에서 본 발명은 그것이 필요한 대상체에서 하기 중 하나 이상을 수행하기 위한 이중특이적 체크포인트 항체의 용도를 제공한다: (a) 전-염증 사이토카인의 상향조절; (b) T-세포 증식, 팽창 또는 종양 침윤의 증가; (c) 인터페론-γ, TNF-α 및 T-세포에 의한 다른 사이토카인 생산의 증가; (d) IL-2 분비 증가; (e) 항체 반응 자극; (f) 암 세포 성장 억제; (g) 항원 특이적 T 세포 면역력 촉진; (h) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화 촉진; (i) T-세포 억제 완화; (j) NK 세포 활성 촉진; (k) 세포자멸사 또는 암 세포 용해 촉진; 및/또는 (l) 암 세포에 대한 세포독성 또는 세포증식억제 효과.
따라서, 본 발명은 이중특이적, 이종이량체성 체크포인트 항체를 제공한다. 이종이량체성 항체 구조물은 항체의 중쇄의 2개의 Fc 도메인, 예를 들어 "이량체"로 조립되는 2개의 "모노머"의 자가-조립 성질에 기초한다. 이종이량체성 항체는 하기 더 완전하게 논의된 바와 같이 각각의 모노머의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 제조된다. 따라서, 본 발명은 일반적으로, 이종이량체 형성을 촉진하고 및/또는 동종이량체에 대한 이종이량체의 정제를 용이하게 하기 위해 각각의 사슬에서 상이한 불변 영역의 아미노산 변형에 의존하는, 체크포인트 항원에 몇 가지 방식으로 동시에 관여될 수 있는 이종이량체성 항체의 생성에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 이중특이적 체크포인트 항체를 제공한다. 항체 기술에서 계속되는 문제는 2개 (또는 그 이상의) 상이한 항원에 동시에 결합하여, 일반적으로 상이한 항원이 근접하게 이동하도록 하고, 신규한 기능 및 신규한 치료법를 초래하는 "이중특이적" 항체에 대한 요망이다. 일반적으로, 이러한 항체는 숙주 세포 내로 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자 (일반적으로, 본 발명에서, 본 명세서에 설명된 바와 같이 2개의 중쇄 모노머 및 경쇄에 대한 유전자)를 포함시킴으로써 제조된다. 이것은 일반적으로 원하는 이종이량체 (A-B), 뿐만 아니라 2개의 동종이량체 (A-A 및 B-B)의 형성을 가져온다. 그러나, 이중특이적 항체의 형성에서 주요 장애물은 동종이량체성 항체로부터 이종이량체성 항체를 정제하고 및/또는 동종이량체의 형성에 대한 이종이량체의 형성을 바이어싱(biasing)하는 것이 어렵다는 것이다.
이 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 이종이량체를 생성하는데 사용될 수 있는 수많은 기전이 존재한다. 또한, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 이들 기전은 높은 이종이량체화(heterodimerization)를 보장하기 위해 조합될 수 있다. 따라서, 이종이량체성 항체의 생산을 유도하는 아미노산 변이체는 "이종이량체화 변이체"로도 지칭된다. 하기 논의된 바와 같이, 이종이량체화 변이체는 이종이량체로부터 동종이량체의 정제를 가능하게 하는, 입체 변이체 (예를 들어 하기 기재된 "노브(knob) 및 홀(hole)" 또는 "스큐" 변이체 및 하기 기재된 "전하 쌍(charge pair)" 변이체) 뿐만 아니라 "pI 변이체"를 포함할 수 있다.
이종이량체 형성을 선호하고 동종이량체성 형성을 비선호하도록 입체 및/또는 정전기 영향을 생성시키는 아미노산 엔지니어링으로 불리는 "노브 및 홀" ("KIH") 또는 때때로 본 명세서에서 "스큐" 변이체로 당해 분야에서 일반적으로 언급되는 하나의 기전이 다음에 기재된 바와 같이 선택적으로 사용될 수 있다: Ridgway 등, Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell 등, J. Mol. Biol. 1997 270:26; 미국 특허 번호 8,216,805, US 2012/0149876 (이들 모두는 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨). 도면은 "노브 및 홀" 아미노산 치환을 포함하는 수많은 "모노머 A - 모노머 B" 쌍을 식별한다. 또한, 문헌 (Merchant 등, Nature Biotech. 16:677 (1998))에 기재된 바와 같이, 이러한 "노브 및 홀" 돌연변이는 형성을 이종이량체화로 편향시키기 위해 디설파이드 결합과 조합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 것은 특히 하기 설명된 바와 같이 pI 변이체를 포함하는 다른 이종이량체화 변이체와 조합된, T366W와 쌍을 이루는 T366S/L368A/Y407V, 뿐만 아니라 브릿징 디설파이드를 갖는 이 변이체, T366W/S354C와 쌍을 이루는 T366S/L368A/Y407V/Y349C이다.
이종이량체성 항체의 생성에 사용되는 추가의 기전은 다음에 기재된 바와 같이 때때로 "정전기 스티어링(electrostatic steering)" 또는 "전하 쌍"으로 지칭된다: Gunasekaran 등, J. Biol. Chem. 285(25): 19637 (2010) (그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨). 이것은 때때로 본 명세서에서 "전하 쌍"으로 지칭된다. 이 구현예에서, 정전기학이 형성을 이종이량체화 쪽으로 편향시키는데 사용된다. 당해 분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 이들은 또한 pI, 및 따라서 정제에 영향을 줄 수 있으므로 일부 경우에 또한 pI 변이체로 간주될 수 있다. 그러나, 이들이 이종이량체화를 일으키기 위해 생성되고, 정제 툴로서 사용되지 않았기 때문에, 이들은 "입체 변이체"로 분류된다. 이들은, 비제한적으로, D221R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 D221E/P228E/L368E (예를 들어 이들은 "모노머 대응 세트임) 및 C220R/E224R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 C220E/P228E/368E 및 도면에 도시된 다른 것들을 포함한다.
본 발명에서, 일부 구현예에서, pI 변이체는 모노머 중 하나 또는 둘 모두의 pI의 변경시켜 A-A, A-B 및 B-B 이량체성 단백질의 등전위 분리를 가능하게 하는데 사용된다.
본 발명에서, 이종이량체성 단백질을 쉽게 정제할 수 있는 몇 가지 기본적인 기전이 존재하며; 하나는 각각의 모노머가 상이한 pI를 가져 A-A, A-B 및 B-B 이량체성 단백질의 등전위 정제를 가능하게 하는 pI 변이체의 사용에 의존한다. 대안적으로, "삼중 F" 포맷과 같이 일부 스캐폴드 포맷은 또한 크기에 기초하여 분리될 수 있다. 하기 추가로 설명된 바와 같이, 동종이량체에 비해 이종이량체의 형성으로 "편향"시키는 것도 가능하다. 따라서, 입체 이종이량체화 변이체와 pI 또는 전하 쌍 변이체의 조합이 본 발명에서 특히 유용하다. 추가로, 하기 더 완전하게 설명된 바와 같이, scFv(들)를 이용하는 스캐폴드 예컨대 삼중 F 포맷은 정제 목적을 위해 추가의 pI 부스트(boost)를 제공하는 하전된 scFv 링커 (양성 또는 음성)를 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 삼중 F 포맷은 추가의 pI 조정 없이 하전된 scFv 링커만으로도 유용하지만, 본 발명은 또한 하전된 scFv 링커를 갖는 스큐 변이체 (및 본 명세서에 논의된 Fc, FcRn 및 KO 변이체의 조합)의 사용을 제공한다.
이종이량체성 단백질의 정제를 가능하게 하는 분리 기전으로서 pI를 이용하는 본 발명에서, 아미노산 변형은 모노머 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다; 즉, 상기 모노머 중 하나 (본 명세서에서는 간단히 "모노머 A"로 지칭됨)의 pI는 모노머 B로부터 조작될 수 있거나, 또는 모노머 A 및 B 둘 모두가 변화될 수 있으며, 이때 모노머 A의 pI는 증가되고 모노머 B의 pI는 감소된다. 하기 더 완전하게 설명된 바와 같이, 두 모노머 중 하나 또는 둘 모두의 pI 변화는 하전된 잔기를 제거 또는 첨가하거나 (예를 들어 중성 아미노산을 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 대체함, 예를 들어 글리신을 글루탐산으로 대체함), 하전된 잔기를 양성 또는 음성에서 그 반대 전하로 변화시키거나 (예를 들어 아스파르트산을 라이신으로 변화시킴) 또는 하전된 잔기를 중성 잔기로 변화시킴으로써 (예를 들어 전하의 손실; 라이신에서 세린으로 변화시킴) 수행될 수 있다. 이들 변이체 중 다수가 도면에 나타나 있다. 또한, 본 명세서에서 이종이량체성 항체의 생성에 사용하기에 적합한 pI 변이체는 아이소타입인 것, 예를 들어 pI가 상당한 면역원성을 도입하지 않고 변화되도록 상이한 IgG 아이소타입으로부터의 pI 변이체가 도입된 것이며; 미국 공개 번호 20140288275 (그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨)로부터의 도 29를 참조한다.
따라서, 본 발명의 이 구현예에서 이종이량체가 동종이량체로부터 분리될 수 있도록 모노머 중 적어도 하나에서 pI의 충분한 변화를 일으키는 것을 제공된다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고 하기 추가로 논의된 바와 같이, 이것은 "야생형" 중쇄 불변 영역과, pI를 증가 또는 감소시키도록 조작된 변이체 영역 (wt A-+B 또는 wt A--B)을 사용하거나 또는 한 영역을 증가시키고 다른 영역을 감소시킴으로써 (A+ -B- 또는 A- B+) 수행될 수 있다.
따라서, 일반적으로, 본 발명의 일부 구현예의 구성요소는 상기 모노머 중 하나 또는 둘 모두에 아미노산 치환 ("pI 변이체" 또는 "pI 치환")을 도입함으로써 이량체성 단백질의 모노머 중 적어도 하나 (둘 모두가 아니라면)의 등전점 (pI)을 변경하여 "pI 이종이량체" (단백질이 항체인 경우, 이들은 "pI 항체"로 지칭됨)를 형성하도록 유도된 항체의 불면 영역에서의 아미노산 변이체이다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 2개의 모노머의 pI가 0.1 pH 단위만큼 상이하고, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 이상이 모두 본 발명에서 사용된다면 2개의 동종이량체로부터 이종이량체의 분리가 달성될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 양호한 분리를 위해 각각의 또는 모든 모노머(들)에 포함될 pI 변이체의 수는 관심 scFv 및 Fab의 개시 pI에 부분적으로 좌우될 것이다. 즉, 어떤 모노머가 조작될 것인지 또는 어느 "방향"인지 (예를 들어 더 양성 또는 더 음성)를 결정하기 위해, 2개의 표적 항원의 Fv 서열이 계산되고, 거기에서 결정이 이루어진다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 상이한 Fv는 본 발명에서 이용되는 상이한 개시 pI를 가질 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 설명된 바와 같이, pI는 각각의 모노머의 총 pI 차이가 적어도 약 0.1 log가 되도록 조작되며, 본 명세서에 설명된 바와 같이 0.2 내지 0.5가 바람직하다.
게다가, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고, 본 명세서에 설명된 바와 같이, 일부 경우에 (포맷에 따라) 이종이량체는 크기 (예를 들어 분자량)에 기초하여 동종이량체로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 도 1의 일부 구현예에서 나타낸 바와 같이, 일부 포맷은 크기가 상이한 동종이량체 및 이종이량체를 초래한다 (예를 들어 병 오프너의 경우, 하나의 동종이량체는 "이중 scFv" 포맷이고, 하나의 동종이량체는 표준 항체이고, 이종이량체는 하나의 Fab 및 및 하나의 scFv를 갖는다.
또한, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 일부 항원은 2가 결합될 수 있음 (예를 들어 단일 항원에 대한 2개의 항원 결합 부위)을 인식할 것이다. 알 수 있는 바와 같이, Fab 및 scFv의 임의의 조합이 원하는 결과 및 조합을 얻는데 이용될 수 있다.
pI 변이체가 중쇄(들)의 불변 영역(들)을 사용함으로써 동종이량체보다 정제된 이종이량체를 얻는데 사용되는 경우에, 항체를 포함하는 다중특이적 단백질의 설계 및 정제에 대해 보다 더 모듈식 접근법이 제공된다. 따라서, 일부 구현예에서, 이종이량체화 변이체 (스큐 및 정제 이종이량체화 변이체 포함)는 가변 영역에 포함되지 않으므로 각각의 개별 항체를 조작해야 한다. 또한, 일부 구현예에서, pI 변이체로부터 기인한 면역원성 가능성은 pI가 상당한 면역원성을 도입하지 않고 변화되도록 상이한 IgG 아이소타입으로부터의 pI 변이체를 도입함으로써 상당히 감소된다. 따라서, 해결되어야 할 추가적인 문제는 인간 서열 함량이 높은 낮은 pI 불변 도메인의 해명, 예를 들어 임의의 특정 위치에서 비-인간 잔기의 최소화 또는 회피이다.
이러한 pI 엔지니어링으로 인해 발생할 수 있는 부수적 이점은 또한 혈청 반감기의 연장 및 FcRn 결합의 증가이다. 즉, USSN 13/194,904 (그 전문이 참고로 편입됨)에 기재된 바와 같이, 항체 불변 도메인 (항체 및 Fc 융합물에서 발견되는 것들 포함)의 pI를 낮추어 생체내에서 더 긴 혈청 체류를 유도한다. 증가된 혈청 반감기를 위한 이들 pI 변이체는 또한 정제를 위해 pI 변화를 촉진시킨다.
또한, 이종이량체화 변이체의 pI 변이체는, 동종이량체가 존재할 때 제거, 최소화 및 구별하는 능력이 상당하기 때문에 이중특이적 항체의 분석 및 품질관리 과정에 추가의 이점을 제공한다는 것을 유의해야 한다. 마찬가지로, 이종이량체성 단백질 생산의 재현성을 신뢰할 수 있게 검사하는 능력이 중요하다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고 하기에서 더 완전하게 논의된 바와 같이, 본 발명의 이종이량체성 융합 단백질은 일반적으로 도 1에 나타낸 바와 같이 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 도면은 "단일 종료된(single ended)" 형태를 나타내며, 여기서 분자의 하나의 "아암"에는 하나의 특이성 유형이 있으며, 다른 "아암"에는 상이한 특이성이 있다. 다른 도면은 "이중 종료된(dual ended)" 형태를 나타내며, 여기서 분자의 "상부"에 적어도 하나의 특이성 유형이 있으며, 분자의 "하부"에 하나 이상의 상이한 특이성이 있다. 따라서, 본 발명은 제1 및 제2 항원에 동시에 관여되는 신규한 면역글로불린 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제1 및 제2 항원은 본 명세서에서 각각 항원-1 및 항원-2 (또는 "체크포인트-1" 및 "체크포인트-2")로 지칭된다.
본 발명에서 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1a에서 나타낸 바와 같이 "삼중 F" 또는 "병 오프너" 스캐폴드 포맷이다. 이 구현예에서, 상기 항체의 하나의 중쇄는 단일 사슬 Fv (하기 정의된 바와 같은 "scFv")를 포함하고, 다른 중쇄는 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 "규칙적" FAb 포맷이다. 이 구조는 때때로, 병-오프너와의 대략적인 시각적 유사성으로 인해 "삼중 F" 포맷 (scFv-FAb-Fc) 또는 "병-오프너" 포맷으로 본 명세서에서 지칭된다 (도 1a 참조). 2개의 사슬은 하기 더 완전하게 기재된 바와 같이 이종이량체성 항체의 형성을 촉진시키는 불변 영역 (예를 들어 Fc 도메인 및/또는 힌지 영역)에서의 아미노산 변이체를 사용하여 결합된다.
본 "삼중 F" 포맷에는 몇 가지 뚜렷한 이점이 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 2개의 scFv 구조물에 의존하는 항체 유사체는 종종 안정성 및 응집 문제를 가지며, 이는 "규칙적" 중쇄 및 경쇄 쌍의 첨가에 의해 본 발명에서 완화될 수 있다. 또한, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의존하는 포맷과는 달리, 중쇄 및 경쇄의 부정확한 짝짓기 (예를 들어 경쇄 2와 중쇄 1의 짝짓기, 등)로 인한 문제가 없다.
게다가, 본 명세서에 설명된 바와 같이, 추가 기능을 부가하기 위해 추가의 아미노산 변형이 본 발명의 이중특이적 항체에 도입될 수 있다. 예를 들어, ADCC 또는 CDC 증가(예를 들어 Fcγ 수용체에 대한 결합 변경)를 촉진시킬 뿐만 아니라 FcRn에 대한 결합을 증가시키고 및/또는 수득한 분자의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 Fc 영역 내에 아미노산 변화가 (하나의 모노머 또는 둘 모두에) 추가될 수 있다. 본 명세서에 추가로 기재되고 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 설명된 임의의 및 모든 변형은 선택적으로 및 독립적으로 다른 변형과 조합될 수 있다.
유사하게, 기능적 변이체의 또 다른 카테고리는 "Fcγ 절제 변이체" 또는 "Fc 녹 아웃 (FcKO 또는 KO) 변이체이다. 이들 구현예에서, 일부 치료적 적용을 위해, Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, 등) 중 하나 이상의 또는 모두에 대한 Fc 도메인의 일반적인 결합을 감소 또는 제거하여 추가의 작용 기전을 피하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어, FcγRIIIa 결합을 제거하여 ADCC 활성을 제거 또는 상당히 감소시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합한 절제 변이체는 도 5에서 보여준다.
C. 명명법
본 발명의 이중특이적 항체는 몇 가지 상이한 포멧으로 열거된다. 각각의 폴리펩타이드는 고유의 "XENP" 번호가 주어지지만, 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 더 긴 서열은 더 짧은 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 주어진 서열에 대한 병 오프너 포맷의 scFv 측 모노머의 중쇄는 첫 번째 XENP 번호를 가질 것이며, 한편 scFv 도메인은 상이한 XENP 번호를 가질 것이다. 일부 분자는 3개의 폴리펩타이드를 가지므로 구성요소와 함께 XENP 번호가 명칭으로 사용된다. 따라서, 병 오프너 포맷에 있는 분자 XENP20717은 일반적으로 "XENP20717 HC-Fab", XENP20717 HC-scFv" 및 "XENP20717 LC" 또는 동등물로 지칭되는 3개의 서열을 포함하지만, 당해 분야의 숙련가는 서열 정렬을 통해 이들을 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 이러한 XENP 번호는 서열 목록 뿐만 아니라 식별자에 있으며, 도면에서 사용된다. 또한, 3개의 구성요소를 포함하는 하나의 분자는 다중 서열 식별자를 야기한다. 예를 들어, Fab 모노머의 목록은 전장 서열, 가변 중질 서열 및 가변 중질 서열의 3개의 CDR을 가지며; 경쇄는 전장 서열, 가변 경질 서열 및 가변 경질 서열의 3개의 CDR을 가지며; scFv-Fc 도메인은 전장 서열, scFv 서열, 가변 경질 서열, 3개의 경질 CDR, scFv 링커, 가변 중질 서열 및 3개의 중질 CDR을 가지며; scFv 도메인을 갖는 본 명세서의 모든 분자는 단일 하전된 scFv 링커 (+H)를 사용하지만, 다른 것이 사용될 수 있다는 것을 유의한다. 또한, 특정 가변 도메인의 명명법은 "Hx.xx Ly.yy" 유형의 포맷을 사용하며, 번호는 특정 가변 사슬 서열에 대한 고유의 식별자이다. 따라서, XENP22841의 Fab 측의 가변 도메인은 "7G8_H3.30_L1.34"이며, 이는 가변 중질 도메인 H3.30이 경질 도메인 L1.34와 조합되었음을 나타낸다. 이들 서열이 scFv로서 사용되는 경우에, 명칭 "7G8_H3.30_L1.34"는 가변 중질 도메인 H3.30이 경질 도메인 L1.34와 조합되었고, N-말단에서 C-말단으로 vh-링커-vl 배향임을 나타낸다. 중질 및 경질 가변 도메인의 서열이 동일하지만 순서가 반대인 분자는 "7G8_L1.34_H3.30"으로 명명될 것이다. 유사하게, 상이한 구조물은 서열 목록 및 도면으로부터 명백한 바와 같이 중쇄 및 경쇄를 "혼합 및 매치"시킬 수 있다.
D. 정의
본원이 더 완전하게 이해될 수 있도록 몇 가지 정의가 하기에 기재된다. 그와 같은 정의는 문법적 등가물을 포함할 것이다.
본 명세서에서 "절제"는 활성의 감소 또는 제거를 의미한다. 따라서 예를 들어, "FcγR 결합의 제거"는 Fc 영역 아미노산 변이체가 특정 변이체를 함유하지 않는 Fc 영역과 비교하여 50% 미만의 개시 결합을 가짐을 의미하며, 70-80-90-95-98% 초과의 활성 손실이 바람직하며, 일반적으로, 상기 활성은 비아코어(Biacore), SPR 또는 BLI 검정에서 검출가능한 결합 수준 미만이다. FcγR 결합의 제거에서 특히 사용되는 것은 도 5에서 나타낸 것들이며, 이는 일반적으로 두 모노머 모두에 첨가된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "ADCC" 또는 "항체 의존적 세포-매개된 세포독성"은 FcγR을 발현시키는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고, 이어서 상기 표적 세포의 용해를 일으키는 세포-매개된 반응을 의미한다. ADCC는 FcγRIIIa에 대한 결합과 상관관계가 있으며; FcγRIIIa에 대한 증가된 결합은 ADCC 활성의 증가로 이어진다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "ADCP" 또는 항체 의존적 세포-매개된 식균작용은 FcγR을 발현시키는 비특이적 포식세포가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고, 이어서 상기 표적 세포의 식균작용을 일으키는 세포-매개된 반응을 의미한다.
본 명세서에서 "항원 결합 도메인" 또는 "ABD"는, 폴리펩타이드 서열의 일부로서 존재할 때, 본 명세서에서 논의된 바와 같은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 6개의 상보적 결정 영역 (CDR)의 세트를 의미한다. 따라서, "체크포인트 항원 결합 도메인"은 본 명세서에 설명된 바와 같이 표적 체크포인트 항원에 결합한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이들 CDR은 일반적으로 가변 중질 CDR (vhCDR 또는 VHCDR)의 제1 세트 및 가변성 경질 CDR (vlCDR 또는 VLCDR)의 제2 세트로서 존재하며, 각각은 3개의 CDR: 중쇄의 경우 vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 및 경쇄의 경우 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3을 포함한다. 상기 CDR은 각각 가변 중질 및 가변 경질 도메인에 존재하며, 함께 Fv 영역을 형성한다 (CDR 넘버링 체계에 대해서는 표 1 및 상기 관련된 논의 참조). 따라서, 일부 경우에, 항원 결합 도메인의 6개의 CDR은 가변 중질 및 가변 경질 도메인에 의해 기여된다. "Fab" 포맷에서, 6개의 CDR 세트는 2개의 상이한 폴리펩타이드 서열, 가변 중질 도메인 (vh 또는 VH; vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3 함유) 및 가변 경질 도메인 (vl 또는 VL; vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3 함유)에 의해 기여되며, vh 도메인의 C-말단은 중쇄의 CH1 도메인의 N-말단에 부착되고, vl 도메인의 C-말단은 불변 경질 도메인의 N-말단에 부착된다 (따라서 경쇄를 형성함). scFv 포맷에서, vh 및 vl 도메인은 일반적으로 본 명세서에 설명된 바와 같은 링커 ("scFv 링커")를 사용하여 단일 폴리펩타이드 서열에 공유결합되며, 이는 (N-말단에서 출발하여) vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh일 수 있으며, 전자가 일반적으로 바람직하다 (사용된 포맷 (예를 들어 도 1로부터)에 따라, 양쪽에 선택적인 도메인 링커를 포함함). 일반적으로, scFv 도메인의 C-말단은 제2 모노머의 힌지의 N-말단에 부착된다.
본 명세서에서 "변형"은 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실 또는 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티의 변경을 의미한다. 예를 들어, 변형은 단백질에 부착된 변경된 탄수화물 또는 PEG 구조물일 수 있다. 본 명세서에서 "아미노산 변형"은 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 의미한다. 명백하게 하기 위해, 달리 지적되지 않는 한, 상기 아미노산 변형은 항상 DNA에 의해 코팅된 아미노산, 예를 들어 DNA 및 RNA에 코돈을 갖는 20개의 아미노산에 대한 것이다.
본 명세서에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩타이드 서열 내 특정 위치에 있는 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체한 것을 의미한다. 특히, 일부 구현예에서, 상기 치환은 유기체 내에서 또는 임의의 유기체에서 자연적으로 발생하지 않은, 특정한 위치에서 자연적으로 발생하지 않은 아미노산에 대한 것이다. 예를 들어, 치환 E272Y는 변이체 폴리펩타이드, 이 경우에 272번 위치의 글루탐산이 티로신으로 대체된 Fc 변이체를 지칭한다. 명백하게 하기 위해, 핵산 코딩 서열을 변화시키지만 개시 아미노산을 변화시키지 않도록 조작된 단백질 (예를 들어 숙주 유기체 발현 수준을 증가시키기 위해 CGG (아르기닌을 인코딩함)를 CGA (여전히 아르기닌을 인코딩함)와 교환함)은 "아미노산 치환"이 아니며; 즉, 동일한 단백질을 인코딩하는 신규한 유전자의 생성에도 불구하고, 단백질이 시작하는 특정한 위치에서 동일한 아미노산을 갖는다면, 그것은 아미노산 치환이 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열이 첨가됨을 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 233번 위치 뒤에 그리고 234번 위치 전에 글루탐산이 삽입됨을 나타낸다. 추가로, -233ADE 또는 A233ADE는 233번 위치 뒤에 그리고 234번 위치 전에 AlaAspGlu가 삽입됨을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열이 제거됨을 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233#, E233() 또는 E233del은 233번 위치에서 글루탐산의 결실을 나타낸다. 추가로, EDA233- 또는 EDA233#은 233번 위치에서 시작되는 서열 GluAspAla의 결실을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체", 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 단백질의 것과 상이한 단백질을 의미한다. 상기 단백질 변이체는 모 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖지만, 하기 기재된 바와 같은 정렬 프로그램을 사용하여 모계 단백질과 정렬되지 않을 정도로 많지는 않다. 일반적으로, 본 명세서에 설명된 변이체 단백질 (예컨대 변이체 Fc 도메인, 등은 일반적으로 하기 기재된 정렬 프로그램, 예컨대 BLAST를 사용하여, 모 단백질과 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다.
하기 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서 모 폴리펩타이드, 예를 들어 Fc 모 폴리펩타이드는 중질 불변 도메인 또는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 Fc 영역과 같은 인간 야생형 서열이지만, 변이체를 갖는 인간 서열도 "모 폴리펩타이드"로서 사용될 수 있으며, 예를 들어 미국 공보 2006/0134105의 IgG1/2 하이브리드가 포함될 수 있다. 본 명세서에서 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모 단백질 서열과 적어도 약 80% 동일성을 가질 것이며, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 약 95-98-99% 동일성을 가질 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 항체와 상이한 항체를 의미하며, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 IgG (다시, 많은 경우에, 인간 IgG 서열로부터)와 상이한 항체를 의미하며, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 면역글로불린 서열의 것과 상이한 면역글로불린 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 도메인과 비교하여 Fc 도메인 내 아미노산 변형을 포함하는 단백질을 의미한다.
본 발명의 Fc 변이체는 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어, N434S 또는 434S는 모 Fc 폴리펩타이드에 대해 434번 위치에서 세린으로 치환된 Fc 변이체이며, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 마찬가지로, M428L/N434S는 모 Fc 폴리펩타이드에 대해 치환 M428L 및 N434S를 갖는 Fc 변이체를 정의한다. WT 아미노산의 정체(identity)가 불특정될 수 있으며, 이 경우에 상기 언급된 변이체는 428L/434S로 언급된다. 치환이 제공되는 순서는 임의적이라는 것을 유의하며, 다시 말해, 예를 들어, N434S/M428L은 M428L/N434S, 등과 동일한 Fc 변이체이다. 항체와 관련된 본 발명에서 논의된 모든 위치에 대해, 달리 지적되지 않는 한, 아미노산 위치 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 카밧 또는 EU 넘버링 체계에서와 같은 EU 인덱스 또는 EU 인덱스는 EU 항체의 넘버링을 지칭한다. 카밧 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 수많은 1차 서열을 수집하였다. 서열의 보존 정도에 기반하여, 이들은 개별 1차 서열을 CDR 및 프레임워크로 분류하고, 그것의 목록을 만들었다 (SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH 공보, No. 91-3242, E.A. Kabat 등 (전문이 참고로 편입됨)). 또한 하기를 참조한다: Edelman 등, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85 (본 명세서에 전문이 참고로 편입됨). 상기 변형은 첨가, 결실, 또는 치환일 수 있다.
본 명세서에서 "단백질"은 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 적어도 2개의 공유결합된 아미노산을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체를 구성하는 폴리펩타이드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 당화, 페길화, 원형 순열(circular permutation), 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합, 및 펩타이드 태그 또는 라벨의 첨가를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "잔기"는 단백질 내 위치 및 그것의 관련된 아미노산 동일성을 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297 (또한 일명 Asn297 또는 N297)은 인간 항체 IgG1 내 297번 위치의 잔기이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 일반적으로 2개의 상이한 폴리펩타이드 사슬 상에 VH, CH1, VL, 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 (예를 들어 하나의 사슬 상의 VH-CH1 및 다른 사슬 상의 VL-CL)를 의미한다. Fab는 이 영역을 단독으로 또는 본 발명의 이중특이적 항체와 관련하여 이 영역을 지칭할 수 있다. Fab와 관련하여, Fab는 CH1 및 CL 도메인 이외에 Fv 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "Fv 영역"은 ABD의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fv 영역은 Fab (상기에 논의된 바와 같음, 일반적으로 상기 설명된 불변 영역을 또한 포함하는 2개의 상이한 폴리펩타이드) 및 scFv (여기서 vl 및 vh 도메인은 조합되어 (일반적으로 본 명세서에서 논의된 링커와 함께) scFv를 형성함) 둘 모두로서 포맷될 수 있다.
본 명세서에서 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 scFv 또는 scFv 도메인을 형성하기 위해 일반적으로 본 명세서에서 논의된 scFv 링커를 사용하여 가변 경질 도메인에 공유결합된 가변 중질 도메인을 의미한다. scFv 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 배향될 수 있다 (vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh). 서열 목록 및 도면에 나타낸 서열에서, vh 및 vl 도메인의 순서는 명칭에서 지시되며, 예를 들어 H.X_L.Y는 N-말단에서 C-말단이 vh-링커-vl임을 의미하며, L.Y_H.X는 vl-링커-vh이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "IgG 서브클래스 변형" 또는 "아이소타입 변형"은 하나의 IgG 아이소타입의 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 아이소타입의 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, EU 위치 296번에서 IgG1은 티로신을 포함하고, IgG2는 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2에서의 F296Y 치환은 IgG 서브클래스 변형으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "비-자연 발생 변형"은 아이소타입이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, 인간 IgG가 434번 위치에서 세린을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 (또는 그것의 하이브리드)에서의 치환 434S는 비-자연 발생 변형으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "아미노산" 및 "아미노산 동일성"은 DNA 및 RNA에 의해 코딩된 20개의 자연 발생 아미노산 중 하나를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "효과기 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드와의 상호작용으로부터 초래되는 생화학적 사건을 의미한다. 효과기 기능은 비제한적으로 ADCC, ADCP, 및 CDC를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "IgG Fc 리간드"는 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하기 위해 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하는 임의의 유기체 유래 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 리간드는 비제한적으로 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcRn, Clq, C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 포도상구균 단백질 A, 연쇄상구균 단백질 G, 및 바이러스성 FcγR을 포함한다. Fc 리간드는 또한 FcγR에 상동인 Fc 수용체 계열인 Fc 수용체 동족체 (FcRH)를 포함한다 (Davis 등, 2002, Immunological Reviews 190: 123-136, 전문이 참고로 편입됨). Fc 리간드는 Fc에 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다. 특정 IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "Fc 리간드"는 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하기 위해 항체의 Fc 영역에 결합하는 임의의 유기체 유래 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "Fc 감마 수용체", "FcγR" 또는 "Fc감마R"은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고, FcγR 유전자에 의해 인코딩된 단백질 계열의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서 이 계열은 비제한적으로 동형체 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI (CD64); 동형체 FcγRIIa (동종이인자형 H131 및 R131 포함), FcγRIIb (FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함), 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII (CD32); 및 동형체 FcγRIIIa (동종이인자형 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb (동종이인자형 FcγRIIb-NA1 및 FcγRIIb-NA2 포함)를 포함하는 FcγRIII (CD16) (Jefferis 등, 2002, Immunol Lett 82:57-65, 전문이 참고로 편입됨), 뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 인간 FcγR 또는 FcγR 동형체 또는 동종이인자형을 포함한다. FcγR은 비제한적으로 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래할 수 있다. 마우스 FcγR은 비제한적으로 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), 및 FcγRIII-2 (CD16-2), 뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 마우스 FcγR 또는 FcγR 동형체 또는 동종이인자형을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "FcRn" 또는 "신생아(neonatal) Fc 수용체"는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고, FcRn 유전자에 의해 적어도 부분적으로 인코딩된 단백질을 의미한다. 상기 FcRn은 비제한적으로 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 기능적 FcRn 단백질은 종종 중쇄 및 경쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 상기 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 달리 본 명세서에서 지적되지 않는 한, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 지칭한다. FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키고, 일부 경우에, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 다양한 FcRn 변이체가 사용된다. "FcRn 변이체"는 FcRn 수용체에 대한 결합이 증가된 것이며, 적합한 FcRn 변이체는 하기에서 보여준다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "모 폴리펩타이드"는 변이체를 생성하기 위해 차후에 변형되는 개시 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 모 폴리펩타이드는 자연 발생 폴리펩타이드, 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "모 면역글로불린"은 변이체를 생성하도록 변형되는 비변형된 면역글로불린 폴리펩타이드를 의미하며, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "모 항체"는 변이체 항체를 생성하도록 변형되는 비변형된 항체를 의미한다. "모 항체"는 하기 설명된 바와 같이 공지된 상업적, 재조합으로 생산된 항체를 포함한다는 것을 유의해야 한다. 이와 관련하여, "모 Fc 도메인"은 인용된 변이체와 관련된 것일 것이며; 따라서, "변이체 인간 IgG1 Fc 도메인"은 인간 IgG1의 모 Fc 도메인과 비교되며, "변이체 인간 IgG4 Fc 도메인"은 모 Fc 도메인 인간 IgG4 등과 비교된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 IgG 분자의 CH2-CH3 도메인을 포함하고, 일부 경우에, 힌지를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 인간 IgG1에 대한 EU 넘버링에서, CH2-CH3 도메인은 아미노산 231 내지 447을 포함하며, 힌지는 216 내지 230이다. 따라서 "Fc 도메인"의 정의는 아미노산 231-447 (CH2-CH3) 또는 216-447 (힌지-CH2-CH3), 또는 이의 단편 모두를 포함한다. 이와 관련하여 "Fc 단편"은 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두로부터 보다 적은 아미노산을 함유할 수 있지만 일반적으로 크기에 기초한 표준 방법 (예를 들어 비-변성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 등)을 사용하여 검출될 수 있는 바와 같이 또 다른 Fc 도메인 또는 Fc 단편과 함께 이량체를 형성하는 능력을 여전히 보유한다. 인간 IgG Fc 도메인은 본 발명에 특히 유용하며, 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 Fc 도메인일 수 있다.
"변이체 Fc 도메인"은 모 Fc 도메인과 비교될 때 아미노산 변형을 포함한다. 따라서, "변이체 인간 IgG1 Fc 도메인"은 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교될 때 아미노산 변형 (일반적으로 아미노산 치환, 그러나 절제 변이체의 경우에, 아미노산 결실이 포함됨)을 포함하는 것이다. 일반적으로, 변이체 Fc 도메인은 상응하는 모 인간 IgG Fc 도메인과 적어도 약 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99 동일성 퍼센트를 갖는다 (하기 논의된 동일성 알고리즘을 사용함, 하나의 구현예는 디폴트 파라미터를 사용하여 당해 분야에 공지된 바와 같이 BLAST 알고리즘을 이용함). 대안적으로, 상기 변이체 Fc 도메인은 모 Fc 도메인과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 추가로, 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 상기 변이체 Fc 도메인은 여기서 본 명세서에서 기재된 공지된 기술, 예컨대 비-변성 겔 전기영동을 사용하여 측정된 바와 같이 또 다른 Fc 도메인와 이량체를 형성하는 능력을 여전히 보유한다.
본 명세서에서 "중쇄 불변 영역"은 가변 중질 도메인이 제외된 항체 (또는 이의 단편)의 CH1-힌지-CH2-CH3 부분을 의미하며; 인간 IgG1의 EU 넘버링에서 이것은 아미노산 118-447이다. 본 명세서에서 "중쇄 불변 영역 단편"은 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두로부터 보다 적은 아미노산을 함유하지만 또 다른 중쇄 불변 영역과 이량체를 형성하는 능력을 여전히 보유하는 중쇄 불변 영역을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "위치"는 단백질 서열 내 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 확립된 포맷, 예를 들어 항체 넘버링을 위한 EU 인덱스에 따라 넘버링될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "표적 항원"은 주어진 항체의 가변 영역을 포함하는 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 분자를 의미한다. 하기 논의된 바와 같이, 본 발명의 경우에 상기 표적 항원은 체크포인트 억제제 단백질이다.
본 명세서에서 본 발명의 이종이량체성 항체의 모노머와 관련하여 "스트랜디드니스(strandedness)"는 "매치"되는 DNA의 2개의 가닥과 유사하게, 이종이량체화 변이체가 각각의 모노머에 편입되어 이종이량체를 형성하기 위해 "매치"되는 능력을 보존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 pI 변이체가 모노머 A로 조작되면 (예를 들어 pI를 더 높게 만들면), 또한 이용될 수 있는 "전하 쌍"인 입체 변이체는 pI 변이체를 방해하지 않으며, 예를 들어 pI를 더 높게 만드는 전하 변이체는 두 기능을 보존하기 위해 동일한 "가닥" 또는 "모노머"에 놓인다. 유사하게, 하기 더 완전하게 설명된 바와 같이 세트의 쌍에 관여하는 "스큐" 변이체의 경우, 숙련가는 스큐의 pI를 사용하여 pI 분리가 또한 최대화되도록 한 세트의 쌍이 어느 가닥 또는 모노머로 갈지 결정하는데 있어서 pI를 고려할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "표적 세포"는 표적 항원을 발현시키는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 생산과 관련하여 "숙주 세포"는 이중특이적 항체의 구성요소를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하고, 적당한 조건하에 이중특이적 항체를 발현시킬 수 있는 세포를 의미한다. 적합한 숙주 세포는 하기 논의된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 각각 카파, 람다, 및 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 구성하는 Vκ, Vλ, 및/또는 VH 유전자 중 어느 것에 의해 실질적으로 인코딩된 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하고, 항원 특이성을 부여하는 CDR을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 따라서, "가변 중질 도메인"은 "가변 경질 도메인"과 쌍을 이루어 항원 결합 도메인 ("ABD")을 형성한다. 또한, 각각의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역 ("상보성 결정 영역", "CDR") (가변 중질 도메인의 경우 vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3, 및 가변 경질 도메인의 경우 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3) 및 아미노-말단에서 카복시-말단으로 하기 순서로 배열된 4개의 프레임워크 (FR) 영역: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함한다.
본 명세서에서 "야생형 또는 WT"는 대립유전자 변이를 포함하여, 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명은 인간 항체 도메인과 서열 동일성을 갖는 수많은 항체 도메인을 제공한다. 2개의 유사한 서열 (예를 들어, 항체 가변 도메인) 간의 서열 동일성은 하기와 같은 알고리즘에 의해 측정될 수 있다: Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Comparison Of Biosequences," Adv. Appl. Math. 2:482 [국부 상동성 알고리즘]; Needleman, S.B. & Wunsch, CD. (1970) "A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins," J. Mol. Biol.48:443 [상동성 정렬 알고리즘], Pearson, W.R. & Lipman, D.J. (1988) "Improved Tools For Biological Sequence Comparison," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 [유사성 방법 검색]; 또는 Altschul, S.F. 등, (1990) "Basic Local Alignment Search Tool," J. Mol. Biol. 215:403-10, "BLAST" 알고리즘, https://blast.ncbi.nlm.nih.go/Blast.cgi 참조. 상기 언급된 알고리즘 중 임의의 것을 사용할 때, 디폴트 파라미터 (윈도우 길이, 갭 페널티, 등에 대한)가 사용된다. 일 구현예에서, 서열 동일성은 디폴트 파라미터를 사용한 BLAST 알고리즘을 사용하여 수행된다.
본 발명의 항체는 일반적으로 단리되거나 재조합된다. "단리된"은, 본 명세서에 개시된 다양한 폴리펩타이드를 설명하기 위해 사용되는 경우, 그것이 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 폴리펩타이드를 의미한다. 통상적으로, 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. "재조합"은 항체가 외인성 숙주 세포에서 재조합 핵산 기술을 사용하여 생산되며, 그것은 또한 단리될 수 있음을 의미한다.
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 특정 항원 또는 에피토프에 "특이적인"은 비-특이적 상호작용과 분명하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
특정 항원 또는 에피토프에 특이적인 결합은, 예를 들어, 항원 또는 에피토프에 대한 KD가 적어도 약 10-4 M, 적어도 약 10-5 M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M, 적어도 약 10-12 M, 또는 그 초과인 항체에 의해 나타낼 수 있으며, 여기서 KD는 특정 항체-항원 상호작용의 해리율(dissociation rate)을 지칭한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 대해 대조 분자보다 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 그 이상 더 큰 KD를 가질 것이다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 특이적인 결합은, 예를 들어, 에피토프에 대해 대조군에 비해 적어도 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 그 이상 더 큰 항원 또는 에피토프에 대한 KA 또는 Ka를 갖는 항체에 의해 나타낼 수 있으며, 여기서 KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 결합율(association rate)을 지칭한다. 결합 친화도는 일반적으로 비아코어, SPR 또는 BLI 검정을 사용하여 측정된다.
E. 항체
본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같이 2개의 상이한 체크포인트 항원에 결합하는 이중특이적 체크포인트 항체의 생성에 관한 것이다. 하기 논의된 바와 같이, 용어 "항체"가 일반적으로 사용된다. 본 발명에 사용되는 항체는 본 명세서에서 기재되고 도면에 도시된, 전통적 항체뿐만 아니라 항체 유도체, 단편 및 모방체를 포함하는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 수많은 포맷을 취할 수 있다.
전통적 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 전형적으로 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 하나의 "경쇄" (전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 하나의 "중쇄" (전형적으로 약 50-70 kDa의 분자량을 가짐)를 갖는다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 본 발명은 일반적으로, 비제한적으로 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 몇 개의 서브클래스를 갖는 IgG 부류에 기초한 이중특이적 항체에 관한 것이다. 일반적으로, IgG1, IgG2 및 IgG4는 IgG3보다 더 빈번하게 사용된다. IgG1은 356 (D 또는 E) 및 358 (L 또는 M)에서 다형성을 갖는 상이한 동종이인자형을 갖는다는 것을 유의해야 한다. 본 명세서에 설명된 서열은 356E/358M 동종이인자형을 사용하지만, 다른 동종이인자형도 본 명세서에 포함된다. 즉, 본 명세서에 포함된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356E/358M 동종이인자형을 대체하는 356D/358L을 가질 수 있다.
또한, 본 명세서의 항체 중 다수는 220번 위치에서 시스테인 중 적어도 하나가 세린으로 대체되며; 일반적으로 이것은 본 명세서에 설명된 서열의 대부분에 대해 "scFv 모노머" 측에 존재하지만, 그것은 또한 디설파이드 형성을 감소시키기 위해 "Fab 모노머" 측 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 본 명세서의 서열 내에 구체적으로 포함되는 것은 이들 시스테인 중 하나 또는 둘 모두가 대체된 것이다 (C220S).
따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "아이소타입"은 불변 영역의 화학적 및 항원 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 서브클래스를 의미한다. 치료 항체는 또한 아이소타입 및/또는 서브클래스의 하이브리드를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 참고로 편입된 미국 공보 2009/0163699에서 나타낸 바와 같이, 본 발명은 인간 IgG1/G2 하이브리드를 사용한다.
초가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역에서 약 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1; "L"은 경쇄를 나타냄), 50-56 (LCDR2) 및 89-97 (LCDR3), 및 중쇄 가변 영역에서 대략 31-35B (HCDR1; "H"는 중쇄를 나타냄), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)의 아미노산 잔기; Kabat 등, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 및/또는 초가변 루프를 형성하는 잔기 (예를 들어 경쇄 가변 영역에서 잔기 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) 및 91-96 (LCDR3), 및 중쇄 가변 영역에서 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) 및 96-101 (HCDR3); Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917을 포함한다. 본 발명의 구체적인 CDR은 하기 기재되어 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템 간에 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중질 및/또는 가변 경질 서열의 개시는 관련된 (고유한) CDR의 개시를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 각각의 가변 중질 영역의 개시는 vhCDR (예를 들어 vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시이며, 각각의 가변 경질 영역의 개시는 vlCDR (예를 들어 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 개시이다. CDR 넘버링의 유용한 비교는 아래와 같다. 다음을 참조한다: Lafranc 등, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003):
Figure pat00001
본 명세서 전체에서, 카밧 넘버링 시스템은 가변 도메인 (대략, 경쇄 가변 영역의 잔기 1-107 및 중쇄 가변 영역의 잔기 1-113)의 잔기를 언급할 때 일반적으로 사용되며, EU 넘버링 시스템은 Fc 영역에 대해 사용된다 (예를 들어, Kabat 등, 상동 (1991)).
중쇄의 또 다른 유형의 Ig 도메인은 힌지 영역이다. 본 명세서에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"은 항체의 제1 및 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 215번에서 종료되며, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 231번에서 개시된다. 따라서 IgG의 경우 항체 힌지는 216번 위치 (IgG1에서 E216) 내지 230번 위치 (IgG1에서 p230)를 포함하는 것으로 본 명세서에서 정의되며, 여기서 넘버링은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 경우에, 힌지 도메인의 N- 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에서 보다 적은 아미노산을 함유하는 "힌지 단편"이 사용된다. 본 명세서에서 언급된 바와 같이, pI 변이체는 또한 힌지 영역에서도 만들어질 수 있다.
경쇄는 일반적으로 2개의 도메인, 가변 경질 도메인 (경쇄 CDR 포함, 가변 중질 도메인과 함께 Fv 영역을 형성함), 및 불변 경쇄 영역 (종종 CL 또는 CK로 지칭됨)을 포함한다.
하기 설명된, 추가의 치환에 대한 또 다른 관심 영역은 Fc 영역이다.
본 발명은 다수의 상이한 CDR 세트를 제공한다. 이 경우에, "전체 CDR 세트"는 3개의 가변 경질 및 3개의 가변 중질 CDR, 예를 들어 vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3을 포함한다. 이들은 각각 더 큰 가변 경질 또는 가변 중질 도메인의 일부일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 더 완전하게 설명된 바와 같이, 가변 중질 및 가변 경질 도메인은 중쇄 및 경쇄가 사용되는 경우 (예를 들어 Fab가 사용되는 경우) 별개의 폴리펩타이드 사슬에 존재하거나, 또는 scFv 서열의 경우에 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재할 수 있다.
CDR은 항원-결합, 또는 더 구체적으로, 항체의 에피토프 결합 부위의 형성에 기여한다. "에피토프"는 파라토프(paratope)로 공지된 항체 분자의 가변 영역 내 특정 항원 결합 부위와 상호작용하는 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 그룹핑(grouping)이며, 일반적으로 특정 구조적 특징, 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다.
상기 에피토프는 결합에 직접적으로 관여된 아미노산 잔기 (또한 소위 에피토프의 면역우세 구성요소) 및 결합에 직접적으로 관여되지 않은 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며; 환언하면, 상기 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩타이드의 풋프린트(footprint) 내에 있다.
에피토프는 구조적(conformational) 또는 선형일 수 있다. 구조적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 나란히 놓인 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 구조적 및 비구조적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서 후자가 아닌 전자에 대한 결합이 상실된다는 점에서 구별될 수 있다.
에피토프는 전형적으로 특유의 공간 구조에서 적어도 3개, 및 더 일반적으로, 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 하나의 항체가 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 능력, 예를 들어 "비닝(binning)"을 보여주는 단순 면역검정법으로 확인될 수 있다. 하기 설명된 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에서 열거된 항원 결합 도메인 및 항체를 포함할 뿐만 아니라 열거된 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명은 상이한 항체 도메인을 제공한다. 본 명세서에 기재되고, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 이종이량체성 항체는 중쇄 및 경쇄 내에 상이한 도메인을 포함하며, 이는 또한 중첩될 수 있다. 이러한 도메인은, 비제한적으로, Fc 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 도메인, 중질 불변 도메인 (CH1-힌지-Fc 도메인 또는 CH1-힌지-CH2-CH3), 가변 중질 도메인, 가변 경질 도메인, 경질 불변 도메인, Fab 도메인 및 scFv 도메인을 포함한다.
따라서, "Fc 도메인"은 -CH2-CH3 도메인, 및 선택적으로 힌지 도메인 (-H-CH2-CH3)을 포함한다. 본 명세서의 구현예에서, scFv가 Fc 도메인에 부착되는 경우, 그것은 Fc 도메인의 힌지의 모두 또는 일부에 부착되는 scFv 구조물의 C-말단이며; 예를 들어, 그것은 일반적으로 힌지의 시작인 서열 EPKS에 부착된다. 중쇄는 CH2-CH3을 포함하는 CH1-선택적인 힌지-Fc 도메인을 포함하는, 가변 중질 도메인 및 불변 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 및 경질 불변 도메인을 포함한다. scFv는 가변 중쇄, scFv 링커, 및 가변 경질 도메인을 포함한다. 본 명세서에 설명된 구조물 및 서열의 대부분에서, 가변 중쇄의 C-말단은 scFv 링커의 N-말단에 부착되고, 이의 C-말단은 가변 경쇄의 N-말단에 부착되지만 (N-vh-링커-vl-C), 그것은 바뀔 수 있다 (N-vl-링커-vh-C).
본 발명의 일부 구현예는 자연적으로 발생하지 않지만, 일반적으로 scFv 링커에 의해 함께 연결되는 가변 중질 도메인 및 가변 경질 도메인을 포함하는 적어도 하나의 scFv 도메인을 포함한다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, scFv 도메인은 일반적으로, 포맷에 따라 한쪽 또는 양쪽 말단에서 선택적인 링커와 함께, N-말단에서 C-말단으로 vh-scFv 링커-vl로 배향되지만, 이것은 임의의 scFv 도메인 (또는 Fab로부터 vh 및 vl 서열을 사용하여 작제된 것들)에 대해 vl-scFv 링커-vh로 역전될 수 있다 (일반적으로 도 1 참조).
본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 재조합 기술에 의해 생성된, 전통적 펩타이드 결합을 포함하여, 인용된 도메인을 공유 결합시키는데 사용될 수 있는 다수의 적합한 링커 (도메인 링커 또는 scFv 링커로서 사용하기 위한)가 있다. 일부 구현예에서, 상기 링커 펩타이드는 다음의 아미노산 잔기: Gly, Ser, Ala, 또는 Thr를 주로 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 원하는 활성을 유지하도록 서로에 대해 정확한 형태를 취하는 방식으로 2개의 분자를 연결하기에 적절한 길이를 가져야 한다. 일 구현예에서, 상기 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산 길이, 바람직하게는 약 1 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 1 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는 링커가 사용될 수 있으며, 약 5 내지 약 10개의 아미노산이 일부 구현예에서 사용된다. 유용한 링커는 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n (서열번호: 37756), (GGGGS)n (서열번호: 37757), 및 (GGGS)n (서열번호: 37758) (여기서 n은 적어도 1의 정수 (및 일반적으로 3 내지 4임)임)을 포함하는 글리신-세린 폴리머, 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 다른 가요성 링커를 포함한다. 대안적으로, 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 코폴리머를 포함하는 다양한 비단백질성(nonproteinaceous) 폴리머가 링커로서 사용될 수 있다.
다른 링커 서열은 CL/CH1 도메인의 모든 잔기가 아닌 CL/CH1 도메인의 임의의 길이의 임의의 서열; 예를 들어 CL/CH1 도메인의 처음 5-12개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커는 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 Cκ 또는 Cλ로부터 유래될 수 있다. 링커는 예를 들어 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cαl, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를 포함하는, 임의의 아이소타입의 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 링커 서열은 또한, 다른 단백질 예컨대 Ig-유사 단백질 (예를 들어 TCR, FcR, KIR), 힌지 영역-유래된 서열, 및 다른 단백질 유래 다른 천연 서열로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 본 명세서에 설명된 바와 같은 임의의 2개의 도메인을 함께 연결시키는데 사용된 "도메인 링커"이다. 예를 들어, 도 1f에서, Fab의 CH1 도메인의 C-말단을 scFv의 N-말단에 부착시키는 도메인 링커가 존재할 수 있으며, 또 다른 선택적인 도메인 링커가 scFv의 C-말단을 CH2 도메인에 부착시킨다 (비록 많은 구현예에서 힌지가 이 도메인 링커로서 사용되지만). 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있지만, 많은 구현예에서는 도메인 링커로서 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n (서열번호: 37756), (GGGGS)n (서열번호: 37757), 및 (GGGS)n (서열번호: 37758) (여기서 n은 적어도 1의 정수 (및 일반적으로 3 내지 4 내지 5임)임)을 포함하는 글리신-세린 폴리머 뿐만 아니라 각각의 도메인이 그것의 생물학적 기능을 유지할 수 있도록 충분한 길이 및 유연성을 갖는 2개의 도메인의 재조합 부착을 허용하는 임의의 펩타이드 서열을 이용한다. 일부 경우에, 하기 설명된 바와 같이 "스트랜디드니스"에 주목하여, scFv 링커의 일부 구현예에서 사용된 바와 같은 하전된 도메인 링커가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 링커는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 vh 및 vl 도메인을 공유 결합시키는데 사용되는 scFv 링커이다. 많은 경우에, scFv 링커는 하전된 scFv 링커이며, 그 중 다수가 도 7에서 나타나 있다.
따라서, 본 발명은 제1 및 제2 모노머 사이의 pI 분리를 용이하게 하기 위해 하전된 scFv 링커를 추가로 제공한다. 즉, 양성 또는 음성 (또는 상이한 모노머 상에 scFv를 사용하는 스캐폴드의 경우에는 둘 모두)의 하전된 scFv 링커를 도입함으로써, 하전된 링커를 포함하는 모노머가 Fc 도메인에 추가적인 변화를 일으키지 않으면서 pI를 변화시키도록 한다. 이들 하전된 링커는 임의의 scFv 함유 표준 링커로 치환될 수 있다. 다시, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 하전된 scFv 링커는 pI의 원하는 변화에 따라 정확한 "가닥" 또는 모노머에서 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 삼중 F 포맷 이종이량체성 항체를 제조하기 위해, 원하는 항원 결합 도메인 각각에 대한 Fv 영역의 최초 pI가 계산되고, scFv를 제조하기 위해 하나가 선택되고, pI에 따라, 양성 또는 음성 링커가 선택된다.
하전된 도메인 링커는 또한 본 발명의 모노머의 pI 분리를 또한 증가시키는데 사용될 수 있으며, 따라서 도 7에 포함된 것들은 링커가 이용되는 본 명세서의 임의의 구현예에서 사용될 수 있다.
특히, 도 1에 도시된 포맷은 일반적으로 "이종이량체성 항체"로 지칭되는 항체이며, 단백질이 이종이량체성 Fc 도메인으로 자가-조립된 적어도 2개의 관련된 Fc 서열 및 Fab 또는 scFv로서 적어도 2개의 Fv 영역을 가짐을 의미한다.
F. 키메라 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 그와 같은 항체는 특정 생식계열 서열의 "산물인" 또는 "이로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물인" 또는 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 가까운 서열 (즉, 가장 큰 % 동일성)인 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 (본 명세서에 설명된 방법을 사용하여) 선택함으로써 그와 같이 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물인" 또는 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어, 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위 특이적 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 그러나, 인간화된 항체는 전형적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하며, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 쥣과 생식계열 서열)과 비교할 때 항체가 인간 서열로부터 유래된 것임을 밝히는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 경우에, 인간화된 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간화된 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 10-20개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다 (여기에 임의의 스큐, pI 및 절제 변이체의 도입 전에; 즉, 변이체의 수는 본 발명의 변이체의 도입 전에 일반적으로 낮음). 특정 경우에, 인간화된 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다 (다시, 여기에 임의의 스큐, pI 및 절제 변이체의 도입 전에; 즉, 변이체의 수는 본 발명의 변이체의 도입 전에 일반적으로 낮음).
일 구현예에서, 모 항체는 당해 분야에 공지된 바와 같이 친화도가 성숙되었다. 구조-기반 방법은 예를 들어 USSN 11/004,590에 기재된 바와 같이 인간화 및 친화도 성숙을 위해 이용될 수 있다. 선택 기반 방법은 비제한적으로 다음에 기재된 방법을 포함하여, 항체 가변 영역을 인간화 및/또는 친화도 성숙시키기 위해 이용될 수 있다: Wu 등, 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca 등, 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok 등, 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915; Krauss 등, 2003, Protein Engineering 16(10):753-759 (모두 전문이 참고로 편입됨). 다른 인간화 방법은 비제한적으로 다음에 기재된 방법을 포함하여, CDR의 일부만을 그라프팅하는 것을 포함할 수 있다: USSN 09/810,510; Tan 등, 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis 등, 2002, J. Immunol. 169:3076-3084 (모두 전문이 참고로 편입됨).
IV. 이종이량체성 항체
따라서, 일부 구현예에서 본 발명은 자가-조립되어 이종이량체성 Fc 도메인 및 이종이량체성 항체를 형성할, 2개의 상이한 중쇄 변이체 Fc 서열의 사용에 의존하는 이종이량체성 체크포인트 항체를 제공한다.
본 발명은 하나 초과의 체크포인트 항원 또는 리간드에 결합을 허용하는, 예를 들어 이중특이적 결합을 허용하는 이종이량체성 항체를 제공하기 위한 신규한 구조물에 관한 것이다. 이종이량체성 항체 구조물은 "이량체"로 조립되는 항체의 중쇄의 2개의 Fc 도메인, 예를 들어 2개의 "모노머"의 자가-조립 성질에 기초한다. 이종이량체성 항체는 하기 더 완전하게 논의된 바와 같이 각각의 모노머의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 만들어진다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 이종이량체 형성을 촉진시키고, 및/또는 동종이량체에 비해 이종이량체의 정제를 용이하게 하기 위해 각각의 사슬마다 상이한 불변 영역의 아미노산 변이체에 의존하는, 몇 가지 방식으로 항원에 동시에 관여될 수 있는 이종이량체성 체크포인트 항체의 생성에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공한다. 항체 기술에서 계속되는 문제는 2개의 상이한 항원에 동시에 결합하여 일반적으로 상이한 항원이 근접하게 이동하도록 하고, 신규한 기능 및 신규한 치료법를 초래하는 "이중특이적" 항체에 대한 요망이다. 일반적으로, 이들 항체는 숙주 세포 내로 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 포함시킴으로써 제조된다. 이것은 일반적으로 원하는 이종이량체 (A-B), 뿐만 아니라 2개의 동종이량체 (A-A 및 B-B (경쇄 이종이량체성 문제를 포함하지 않음))의 형성을 가져온다. 그러나, 이중특이적 항체의 형성에서 주요 장애물은 동종이량체성 항체로부터 이종이량체성 항체를 정제하고 및/또는 동종이량체의 형성에 대해 이종이량체의 형성을 바이어싱하는 것이 어렵다는 것이다.
본 발명의 이종이량체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 수많은 기전이 있다. 또한, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 이들 기전은 높은 이종이량체화를 보장하기 위해 조합될 수 있다. 따라서, 이종이량체의 생산을 유도하는 아미노산 변이체"는 "이종이량체화 변이체"로도 지칭된다. 하기 논의된 바와 같이, 이종이량체화 변이체는 이종이량체로부터 동종이량체의 정제를 가능하게 하는, 입체 변이체 (예를 들어 하기 기재된 "노브 및 홀" 또는 "스큐" 변이체 및 하기 기재된 "전하 쌍" 변이체) 뿐만 아니라 "pI 변이체"를 포함할 수 있다. "이종이량체화 변이체"의 논의를 위해 하기와 같이 그 전문이 그리고 구체적으로 본 명세서에 참고로 편입된 WO2014/145806에 일반적으로 기재된 바와 같이, 이종이량체화에 유용한 기전은 "노브 및 홀" ("KIH"; 때때로 본 명세서에서 "스큐" 변이체로서 (WO2014/145806의 논의 참조), WO2014/145806에 기재된 바와 같은 "정전기 스티어링" 또는 "전하 쌍", WO2014/145806에 기재된 바와 같은 pI 변이체, 및 WO2014/145806 및 하기에 기술된 바와 같은 일반적인 추가의 Fc 변이체를 포함한다.
본 발명에서, 이종이량체성 항체의 정제를 용이하게 할 수 있는 몇 개의 기본적인 기전이 존재하며; 하나는 각각의 모노머가 상이한 pI를 가져 A-A, A-B 및 B-B 이량체성 단백질의 등전위 정제를 가능하게 하는 pI 변이체의 사용에 의존한다. 대안적으로, "삼중 F" 포맷과 같이 일부 스캐폴드 포맷은 또한 크기에 기초하여 분리될 수 있다. 하기 추가로 설명된 바와 같이, 동종이량체에 비해 이종이량체의 형성으로 "편향"시키는 것도 가능하다. 따라서, 입체 이종이량체화 변이체와 pI 또는 전하 쌍 변이체의 조합이 본 발명에서 특히 유용하다.
일반적으로, 본 발명에서 특히 사용되는 구현예는 동종이량체로부터 이종이량체의 정제를 용이하게 하기 위해 2개의 모노머 간의 pI 차이를 증가시키는 pI 변이체와 커플링된, 동종이량체화 형성에 비해 이종이량체화 형성을 촉진시키는 스큐 변이체를 포함하는 변이체의 세트에 의존한다.
추가로, 하기 더 완전하게 설명된 바와 같이, 이종이량체 항체의 포맷에 따라, pI 변이체는 모노머의 불변 및/또는 Fc 도메인, 또는 하전된 링커 내에 포함될 수 있으며, 도메인 링커 또는 scFv 링커가 사용될 수 있다. 즉, scFv(들)를 이용하는 스캐폴드 예컨대 삼중 F 포맷은 정제 목적을 위해 추가의 pI 부스트를 제공하는 하전된 scFv 링커 (양성 또는 음성)를 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 삼중 F 포맷은 추가의 pI 조정 없이 하전된 scFv 링커만으로도 유용하지만, 본 발명은 모노머 중 하나 또는 둘 모두에 존재하는 pI 변이체, 및/또는 또한 하전된 도메인 링커를 제공한다. 또한, 대안적인 기능을 위한 추가의 아미노산 엔지니어링은 또한, Fc, FcRn 및 KO 변이체와 같이 pI 변화를 부여할 수 있다.
이종이량체성 단백질의 정제를 가능하게 하는 분리 기전으로서 pI를 이용하는 본 발명에서, 아미노산 변이체가 모노머 폴리펩타이드의 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있으며; 즉, 모노머 중 하나 (본 명세서에서는 간단히 "모노머 A"로 지칭됨)의 pI는 모노머 B로부터 조작될 수 있거나, 또는 모노머 A 및 B 모두 변화가 일어날 수 있으며, 이때 모노머 A의 pI는 증가되고 모노머 B의 pI는 감소된다. 논의된 바와 같이, 모노머 중 하나 또는 둘 모두의 pI 변화는 하전된 잔기를 제거 또는 첨가하거나 (예를 들어 중성 아미노산을 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 대체함, 예를 들어 글리신을 글루탐산으로 대체함), 하전된 잔기를 양성 또는 음성에서 그 반대 전하로 변화시키거나 (예를 들어 아스파르트산을 라이신으로 변화시킴) 또는 하전된 잔기를 중성 잔기로 변화시킴으로써 (예를 들어 전하의 손실; 라이신에서 세린으로 변화시킴) 수행될 수 있다. 이들 변이체 중 다수가 도면에 나타나 있다.
따라서, 본 발명의 이 구현예는 이종이량체가 동종이량체로부터 분리될 수 있도록 모노머 중 적어도 하나에서 pI의 충분한 변화를 일으키는 것을 제공한다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고 하기 추가로 논의된 바와 같이, 이것은 "야생형" 중쇄 불변 영역과, pI를 증가 또는 감소시키도록 조작된 변이체 영역 (wt A-+B 또는 wt A--B)을 사용하거나 또는 한 영역을 증가시키고 다른 영역을 감소시킴으로써 (A+ -B- 또는 A- B+) 수행될 수 있다.
따라서, 일반적으로, 본 발명의 일부 구현예의 구성요소는 상기 모노머 중 하나 또는 둘 모두에 아미노산 치환 ("pI 변이체" 또는 "pI 치환")을 도입함으로써 이량체성 단백질의 모노머 중 적어도 하나 (둘 모두가 아니라면)의 등전점 (pI)을 변경하여 "pI 항체"를 형성하도록 유도된 항체의 불면 영역에서의 아미노산 변이체이다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 2개의 모노머의 pI가 0.1 pH 단위만큼 상이하고, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 이상이 모두 본 발명에서 사용된다면 2개의 동종이량체로부터 이종이량체의 분리가 달성될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 양호한 분리를 위해 각각의 또는 모든 모노머(들)에 포함될 pI 변이체의 수는 상기 구성요소의 개시 pI, 예를 들어 삼중 F 포맷에서 관심 scFv 및 Fab의 개시 pI에 부분적으로 좌우될 것이다. 즉, 어떤 모노머가 조작될 것인지 또는 어느 "방향"인지 (예를 들어 더 양성 또는 더 음성)를 결정하기 위해, 2개의 표적 항원의 Fv 서열이 계산되고, 거기에서 결정이 이루어진다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 상이한 Fv는 본 발명에서 이용되는 상이한 개시 pI를 가질 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 설명된 바와 같이, pI는 각각의 모노머의 총 pI 차이가 적어도 약 0.1 log가 되도록 조작되며, 본 명세서에 설명된 바와 같이 0.2 내지 0.5가 바람직하다.
게다가, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고, 본 명세서에 설명된 바와 같이, 일부 구현예에서, 이종이량체는 동종이량체로부터 크기에 기초하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 몇 개의 포맷은 크기에 기초한 이종이량체 및 동종이량체의 분리를 가능하게 한다.
A. 이종이량체화 변이체
본 발명은 동종이량체로부터 이종이량체 형성 및/또는 정제를 가능하게 하기 위해 이종이량체성 변이체를 이용하는, 다양한 포맷의 이종이량체성 항체를 포함하는 이종이량체성 단백질을 제공한다.
이종이량체화 스큐 변이체 세트의 수많은 적합한 쌍이 있다. 이들 변이체는 "세트"의 "쌍"으로 도입된다. 즉, 한 세트의 쌍은 제1 모노머에 편입되고, 다른 세트의 쌍은 제2 모노머에 편입된다. 이들 세트는 반드시 "노브 인 홀(knobs in holes)" 변이체로 행동하지 않으며, 한 모노머 상의 잔기와 다른 모노머 상의 잔기 사이에 일-대-일 대응이 존재한다는 것에 유의해야 하며; 즉, 이들 세트의 쌍은 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 좌절시키는 2개의 모노머 사이의 계면을 형성하여 생물학적 조건하에 자발적으로 형성되는 이종이량체의 백분율이 기대된 50% (25% 동종이량체 A/A:50% 이종이량체 A/B:25% 동종이량체 B/B)가 아닌 90%가 넘도록 한다.
B. 입체 변이체
일부 구현예에서, 이종이량체의 형성은 입체 변이체를 첨가함으로써 촉진될 수 있다. 즉, 각각의 중쇄 내 아미노산을 변화시킴으로써, 상이한 중쇄는 Fc 아미노산 서열이 동일한 동종이량체를 형성하기보다는 이종이량체성 구조를 형성하도록 결합할 가능성이 더 높다. 적합한 입체 변이체가 도면에 포함된다.
이종이량체 형성을 선호하고 동종이량체성 형성을 비선호하도록 입체 영향을 생성시키는 아미노산 엔지니어링으로 불리는 "노브 및 홀"로 당해 분야에서 일반적으로 언급되는 하나의 기전이 또한 선택적으로 사용될 수 있으며; 이것은 때때로 다음에 기재된 바와 같은 "노브 및 홀"로 지칭된다: USSN 61/596,846, Ridgway 등, Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell 등, J. Mol. Biol. 1997 270:26; 미국 특허 번호 8,216,805 (이들 모두는 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨). 도면은 "노브 및 홀"에 따르는 수많은 "모노머 A - 모노머 B" 쌍을 식별한다. 또한, 문헌 (Merchant 등, Nature Biotech. 16:677 (1998))에 기재된 바와 같이, 이러한 "노브 및 홀" 돌연변이는 형성을 이종이량체화로 편향시키기 위해 디설파이드 결합과 조합될 수 있다.
이종이량체의 생성에 사용되는 추가의 기전은 때때로 다음에 기재된 바와 같이 "정전기 스티어링"으로 지칭된다: Gunasekaran 등, J. Biol. Chem. 285(25): 19637 (2010) (그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨). 이것은 때때로 본 명세서에서 "전하 쌍"으로 지칭된다. 이 구현예에서는, 형성을 이종이량체화 쪽으로 편향시키기 위해 정전기가 사용된다. 당해 분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 이들은 또한 pI, 및 따라서 정제에 영향을 줄 수 있으므로 일부 경우에 또한 pI 변이체로 간주될 수 있다. 그러나, 이들이 이종이량체화를 일으키기 위해 생성되고, 정제 툴로서 사용되지 않았기 때문에, 이들은 "입체 변이체"로 분류된다. 이들은, 비제한적으로, D221R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 D221E/P228E/L368E (예를 들어 이들은 "모노머 대응 세트임) 및 C220R/E224R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 C220E/P228E/368E를 포함한다.
선택적으로 및 독립적으로 임의의 양으로 다른 변이체와 조합될 수 있는 추가의 모노머 A 및 모노머 B 변이체, 예컨대 본 명세서에 설명된 pI 변이체 또는 다른 입체 변이체가 US 2012/0149876의 도 37 (이의 도면 및 범례 및 서열번호는 본 명세서에 명확히 참고로 편입됨)에서 보여준다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 설명된 입체 변이체는 선택적으로 및 독립적으로 임의의 pI 변이체 (또는 Fc 변이체, FcRn 변이체, 등과 같은 다른 변이체)와 함께 모노머 중 하나 또는 둘 모두에 편입될 수 있으며, 독립적으로 및 선택적으로 본 발명의 단백질에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있다.
적합한 스큐 변이체의 목록은 많은 구현예에서 특히 유용한 일부 쌍을 보여주는 도 3 및 도 8에서 발견된다. 많은 구현예에서 특히 사용되는 것은, 비제한적으로, 다음을 포함하는 세트의 쌍이다: S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q 및 T366S/L368A/Y407V : T366W (선택적으로 브릿징 디설파이드 포함, T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C). 명명법의 관점에서, 쌍 "S364K/E357Q : L368D/K370S"는, 모노머 중 하나가 이중 변이체 세트 S364K/E357Q이고 , 다른 모노머는 이중 변이체 세트 L368D/K370S를 가짐을 의미하며; 상기와 같이, 이들 쌍의 "스트랜디드니스"는 개시 pI에 좌우된다.
C. 이종이량체를 위한 pI (등전점) 변이체
일반적으로, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, pI 변이체의 2가지 일반적인 카테고리가 있다: 단백질의 pI를 증가시키는 것 (염기성 변화) 및 단백질의 pI를 감소시키는 것 (산성 변화). 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 이들 변이체의 모든 조합을 수행할 수 있으며; 하나의 모노머는 야생형이거나, 또는 야생형과 현저히 다른 pI를 나타내지 않는 변이체일 수 있으며, 다른 모노머는 더 염기성이거나 더 산성일 수 있다. 대안적으로, 각각의 모노머는 하나가 더 염기성이 되고, 하나가 더 산성이 되도록 변화된다.
pI 변이체의 바람직한 조합은 도 4에서 보여준다. 본 명세서에 설명되고 도면에 나타낸 바와 같이, 이러한 변화는 IgG1에 대해 나타나지만, 모든 아이소타입 뿐만 아니라 아이소타입 하이브리드도 이런 식으로 변경될 수 있다. 중쇄 불변 도메인이 IgG2-4인 경우에, R133E 및 R133Q도 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 예를 들어 도 1a, 1e, 1f, 1g, 1h 및 1i 포맷에서, pI 변이체의 바람직한 조합은 208D/295E/384D/418E/421D 변이체 (인간 IgG1과 비교될 때 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함하는 하나의 모노머 (음성 Fab 측) 및 (GKPGS)4 (서열번호: 37755)를 포함하는 양으로 하전된 scFv 링커를 포함하는 제2 모노머 (양성 scFv 측)를 갖는다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 제1 모노머는 208번 우 lcl를 포함하는 CH1 도메인을 포함한다. 따라서, CH1 도메인을 포함하는 않는 구조물에서 (예를 들어 도 1b, 1c 또는 1d에 나타낸 것과 같은 이중 scFv 포맷 또는 "하나의 아암의" 포맷에서 도메인 중 하나에서 CH1 도메인을 이용하지 않는 항체에 대해), 바람직한 음성 pI 변이체 Fc 세트는 295E/384D/418E/421D 변이체 (인간 IgG1과 비교될 때 Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 하나의 모노머는 도 4의 치환 세트를 가지며, 다른 모노머는 하전된 링커 (모노머가 scFv를 포함하므로 하전된 scFv 링커 또는 하전된 도메인 링커의 형태로, 도 7에 나타낸 것들로부터 선택될 수 있는, 포맷에 좌우됨)를 갖는다.
1. 아이소타입 변이체
또한, 본 발명의 많은 구현예는 특정 위치에서 하나의 IgG 아이소타입에서 또 다른 아이소타입으로 pI 아미노산의 "도입"에 의존하며, 따라서 변이체 내로 원치않는 면역원성이 도입될 가능성을 감소시키거나 제거한다. 이들 중 다수는 미국 공개 2014/0370013 (본 명세서에 참고로 편입됨)의 도 21에서 보여준다. 즉, IgG1은 높은 효과기 기능을 포함하여, 다양한 이유로 치료 항체에 대해 공통적인 아이소타입이다. 그러나, IgG1의 중질 불변 영역은 IgG2의 pI보다 더 높은 pI를 갖는다 (8.10 대 7.31). 특정 위치에서 IgG2 잔기를 IgG1 백본 내로 도입함으로써, 수득한 모노머의 pI는 낮아지고 (또는 증가되고), 추가로 더 긴 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들어, IgG1은 137번 위치에서 글리신 (pI 5.97)을 가지며, IgG2는 글루탐산 (pI 3.22)을 가지며; 글루탐산의 도입은 수득한 단백질의 pI에 영향을 줄 것이다. 하기 기재된 바와 같이, 변이체 항체의 pI에 상당히 영향을 주기 위해 수많은 아미노산 치환이 일반적으로 요구된다. 그러나, IgG2 분자의 변화도 혈청 반감기를 증가시킬 수 있음을 아래에 논의된 대로 유의해야 한다.
다른 구현예에서, 수득한 단백질의 총 전하 상태를 감소시키거나 (예를 들어 더 높은 pI 아미노산를 더 낮은 pI 아미노산으로 변화시킴으로써), 또는 하기 더 추가로 기재된 바와 같이 안정성 등을 위해 구조의 조정을 허용하기 위해 비-아이소타입 아미노산 변화가 이루어진다.
또한, 중질 및 경질 불변 도메인 모두를 pI 조작함으로써, 이종이량체의 각각의 모노머에서 현저한 변화가 발견될 수 있다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 2개의 모노머의 pI를 적어도 0.5만큼 상이하게 하여 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 전기영동, 또는 등전점에 민감한 다른 방법으로 분리할 수 있다.
D. pI의 계산
각각의 모노머의 pI는 변이체 중쇄 불변 도메인의 pI, 및 변이체 중쇄 불변 도메인 및 융합 파트너를 포함하는 총 모노머의 pI에 좌우될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, pI 변화는 미국 공보 2014/0370013의 도 19의 차트를 사용하여, 변이체 중쇄 불변 도메인에 기초하여 계산된다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 어떤 모노머가 조작될 것인지는 일반적으로 Fv 및 스캐폴드 영역의 고유 pI에 의해 결정된다. 대안적으로, 각각의 모노머의 pI를 비교할 수 있다.
E. 더 나은 FcRn 생체내 결합을 또한 제공하는 pI 변이체
pI 변이체가 모노머의 pI를 감소시키는 경우에, 그것은 생체내 혈청 체류를 개선시키는 추가 이점을 가질 수 있다.
여전히 검토 중이지만, Fc 영역은, 엔도솜 내 pH 6에서 FcRn에 대한 결합이 Fc를 격리시키기 때문에 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는 것으로 여겨진다 (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598, 전문이 참고로 편입됨). 이후 엔도솜 구획은 Fc를 세포 표면으로 재순환시킨다. 상기 구획이 세포외 공간에 개방되면, 더 높은 pH, ~7.4는 혈액 내로 다시 Fc의 방출을 유도한다. 마우스에서, Dall' Acqua 등은 pH 6 및 pH 7.4에서 FcRn 결합이 증가된 Fc 돌연변이체가 감소된 혈청 농도 및 야생형 Fc와 동일한 반감기를 나타냈음을 보여주었다 (Dall' Acqua 등 2002, J. Immunol. 169:5171 -5180, 전문이 참고로 편입됨). pH 7.4에서 FcRn에 대한 Fc의 친화도 증가는 혈액 내로 다시 Fc를 방출시키지 못하게 하는 것으로 사료된다. 따라서, 생체내에서 Fc의 반감기를 증가시킬 Fc 돌연변이는 더 높은 pH에서 여전히 Fc의 방출을 허용하면서 더 낮은 pH에서 FcRn 결합을 이상적으로 증가시킬 것이다. 아미노산 히스티딘은 6.0 내지 7.4의 pH 범위에서 그것의 전하 상태를 변화시킨다. 따라서, Fc/FcRn 복합체의 중요한 위치에서 His 잔기를 발견하는 것은 놀라운 일이 아니다.
최근에, 더 낮은 등전점을 갖는 가변 영역을 갖는 항체가 또한 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있음이 제안되었다 (Igawa 등, 2010 PEDS. 23(5): 385-392, 전문이 참고로 편입됨). 그러나, 이의 기전은 여전히 잘 이해되지 못하고 있다. 또한, 가변 영역은 항체마다 상이하다. pI가 감소되고 반감기가 연장된 불변 영역 변이체는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 항체의 약동학적 특성을 개선시키는 보다 모듈식 접근법을 제공할 것이다.
F. 추가 기능을 위한 추가의 Fc 변이체
pI 아미노산 변이체 이외에, 비제한적으로, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합 변경, FcRn 수용체에 대한 결합 변경, 등을 포함하는 다양한 이유로 수많은 유용한 Fc 아미노산 변형이 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 단백질은 pI 변이체 및 입체 변이체를 포함하는, 본 명세서에 설명된 이종이량체화 변이체를 포함하는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 각각의 변이체 세트는 독립적으로 및 선택적으로 임의의 특정 이종이량체성 단백질에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있다.
G. FcγR 변이체
따라서, FcγR 수용체 중 하나 이상에 대한 결합을 변경시키기 위해 수많은 유용한 Fc 치환이 이루어질 수 있다. 결합을 증가시킬 뿐만 아니라 결합을 감소시키는 치환이 유용할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa에 대한 결합이 증가가면 ADCC (항체 의존적 세포-매개된 세포독성; FcγR을 발현시키는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 일으키는 세포-매개된 반응)가 증가하는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, FcγRIIb (억제 수용체)에 대한 감소된 결합은 일부 상황에서 또한 유익할 수 있다. 본 발명에 사용되는 아미노산 치환은 USSN 11/124,620 (특히 도 41), 11/174,287, 11/396,495, 11/538,406 (이들 모두는 그 전문이 그리고 구체적으로는 본 명세서에 개시된 변이체에 대해 본 명세서에 참고로 명확히 편입됨)에 열거된 것들을 포함한다. 사용되는 특정 변이체는, 비제한적으로, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243A, 243L, 264A, 264V 및 299T를 포함한다.
또한, 비제한적으로, 434S, 434A, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I 또는 V/434S, 436V/428L 및 259I/308F/428L을 포함하는, 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입된 USSN 12/341,769에 구체적으로 개시된 바와 같은, FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키고 혈청 반감기를 증가시키는데 사용되는 추가의 Fc 치환이 있다.
H. 절제 변이체
유사하게, 기능적 변이체의 또 다른 카테고리는 "FcγR 절제 변이체" 또는 "Fc 녹 아웃 (FcKO 또는 KO)" 변이체이다. 이들 구현예에서, 일부 치료적 적용을 위해, Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, 등) 중 하나 이상의 또는 모두에 대한 Fc 도메인의 일반적인 결합을 감소 또는 제거하여 추가의 작용 기전을 피하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어, 많은 구현예에서, 특히 이중특이적 체크포인트 항체의 사용시, Fc 도메인 중 하나가 하나 이상의 Fcγ 수용체 절제 변이체를 포함하도록 ADCC 활성을 제거 또는 현저히 감소시키기 위해 FcγRIIIa 결합을 제거하는 것이 바람직하다. 이들 절제 변이체는 도 5에서 나타냈으며, 각각은 독립적으로 및 선택적으로 포함되거나 배제될 수 있으며, 절제 변이체를 이용하는 바람직한 양태는 G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 및 E233P/L234V/L235A/G236del로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서에 언급된 절제 변이체는 일반적으로 FcRn 결합이 아닌 FcγR 결합을 제거한다는 것을 유의해야 한다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 인간 IgG1의 Fc 도메인은 Fcγ 수용체에 대해 가장 높은 결합을 가지므로 절제 변이체는 이종이량체성 항체의 백본의 불변 도메인 (또는 Fc 도메인)이 IgG1인 경우에 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 IgG1 배경의 절제 변이체 이외에, 당화 위치 297번에서 (일반적으로 A 또는 S로의) 돌연변이는 예를 들어 FcγRIIIa에 대한 결합을 상당히 제거할 수 있다. 인간 IgG2 및 IgG4는 자연적으로 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키므로 이들 백본은 절제 변이체와 함께 또는 절제 변이체 없이 사용될 수 있다.
I. 이종이량체성 및 Fc 변이체의 조합
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 모든 인용된 이종이량체화 변이체 (스큐 및/또는 pI 변이체 포함)는 그것이 "스트랜디드니스" 또는 "모노머 파티션"을 보유하는 한 어떤 식으로든 선택적으로 및 독립적으로 조합될 수 있다. 또한, 이들 변이체 모두는 임의의 이종이량체화 포맷으로 조합될 수 있다.
pI 변이체의 경우에, 특히 유용한 구현예가 도면에서 제시되지만, 정제를 용이하게 하기 위해 2개의 모노머 간의 pI 차이를 변경시키는 기본 규칙에 따라 다른 조합을 생성할 수 있다.
또한, 임의의 이종이량체화 변이체, 스큐 및 pI는 또한, 본 명세서에서 일반적으로 설명된 바와 같이 Fc 절제 변이체, Fc 변이체, FcRn 변이체와 독립적으로 및 선택적으로 조합된다.
V. 본 발명의 유용한 포맷
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고 하기 더 완전하게 논의된 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 이종이량체성 항체는 일반적으로 도 1에 나타낸 바와 같이, 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 도면은 "단일 종료된" 형태를 나타내며, 여기서 분자의 하나의 "아암"에는 하나의 특이성 유형이 있으며, 다른 "아암"에는 상이한 특이성이 있다. 다른 도면은 "이중 종료된" 형태를 나타내며, 여기서 분자의 "상부"에 적어도 하나의 특이성 유형이 있으며, 분자의 "하부"에 하나 이상의 상이한 특이성이 있다. 따라서, 본 발명은 상이한 제1 및 제2 항원에 동시에 관여되는 신규한 면역글로불린 조성물에 관한 것이다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 이종이량체성 포맷은 상이한 원자가를 가질 뿐만 아니라 이중특이적일 수 있다. 즉, 본 발명의 이종이량체성 항체는 2가이고 이중특이적일 수 있으며, 여기서 하나의 체크포인트 표적은 하나의 ABD에 의해 결합되고, 다른 체크포인트 표적은 제2 ABD에 의해 결합된다. 이종이량체성 항체는 또한 3가이고 이중특이적일 수 있으며, 여기서 제1 항원은 2개의 ABD에 의해 결합되고, 제2 항원은 제2 ABD에 의해 결합된다.
A. 병 오프너 포맷
본 발명에 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1a에서 나타낸 바와 같이 "삼중 F" 또는 "병 오프너" 스캐폴드 포맷이다. 이 구현예에서, 상기 항체의 하나의 중쇄는 단일 사슬 Fv (하기 정의된 바와 같은 "scFv")를 포함하고, 다른 중쇄는 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 "규칙적" FAb 포맷이다. 이 구조는 때때로, 병-오프너와의 대략적인 시각적 유사성으로 인해 "삼중 F" 포맷 (scFv-Fab-Fc) 또는 "병-오프너" 포맷으로 본 명세서에서 지칭된다 (도 1a 참조). 2개의 사슬은 하기 더 완전하게 기재된 바와 같이 이종이량체성 항체의 형성을 촉진시키는 불변 영역 (예를 들어 Fc 도메인, CH1 도메인 및/또는 힌지 영역)에서의 아미노산 변이체를 사용하여 결합된다.
본 "삼중 F" 포맷에는 몇 가지 뚜렷한 이점이 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 2개의 scFv 구조물에 의존하는 항체 유사체는 종종 안정성 및 응집 문제를 가지며, 이는 "규칙적" 중쇄 및 경쇄 쌍의 첨가에 의해 본 발명에서 완화될 수 있다. 또한, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의존하는 포맷과는 달리, 중쇄 및 경쇄의 부정확한 짝짓기 (예를 들어 경쇄 2와 중쇄 1의 짝짓기, 등)로 인한 문제가 없다.
본 명세서에 설명된 구현예 중 다수는 일반적으로, scFv 링커 (모든 경우는 아니지만 많은 경우에 하전됨)를 사용하여 공유결합된, 가변 중질 및 가변 경질 도메인을 포함하는, scFv를 포함하는 제1 모노머를 포함하는 병 오프너 포맷에 의존하며, 여기서 scFv는 일반적으로 도메인 링커 (본 명세서에 설명된 바와 같이 이는 비-하전되거나 하전될 수 있으며, 외인성이거나 내인성 (예를 들어 원상태 힌지 도메인의 전부 또는 일부)일 수 있음)를 통해 제1 Fc 도메인의 N-말단에 공유결합된다. 병 오프너 포맷의 제2 모노머는 중쇄이며, 상기 조성물은 경쇄를 추가로 포함한다.
또한, 병 오프너 포맷의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, 병 오프너 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이러한 특정 구현예에서, 적합한 모노머 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 이들 변이체를 갖는 병 오프너는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 측을 가지며, 이는 특히 유용하다. 이러한 특정 구현예에서, 이들 변이체를 갖는 병 오프너는 CTLA-4에 결합하는 [CTLA-4]_H3.23_L0.129 ABD를 포함하는 scFv 측을 가지며, 이는 특히 유용하다.
일부 구현예에서, 특히 병 오프너 포맷에서 특히 사용되는 것은 CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, TIM-3 X PD-1 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
일부 구현예에서, 병 오프너 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이러한 특정 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 이들 변이체를 갖는 병 오프너는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 측을 가지며, 이는 특히 유용하다. 이러한 특정 구현예에서, 이들 변이체를 갖는 병 오프너는 CTLA-4에 결합하는 [CTLA-4]_H3.23_L0.129 ABD를 포함하는 scFv 측을 가지며, 이는 특히 유용하다.
일부 구현예에서, 특히 병 오프너 포맷에서 특히 사용되는 것은 CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, TIM-3 X PD-1 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
구체적으로, 도 37은 본 발명에서 사용될 수 있는 Fv 서열이 결여된 일부 병 오프너 "백본" 서열을 나타낸다. 즉, scFv 부분 및 Fab 부분에 대한 Fv 서열은 PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 TIM-3, PD-1 및 LAG-3, PD-1 및 TIGIT, PD-1 및 BTLA, CTLA-4 및 TIM-3, CTLA-4 및 LAG-3, CTLA-4 및 TIGIT, CTLA-4 및 BTLA, TIM-3 및 LAG-3, TIM-3 및 TIGIT, TIM-3 및 BTLA, LAG-3 및 TIGIT, LAG-3 및 BTLA 및 TIGIT 및 BTLA의 임의의 조합으로부터 사용될 수 있다. 상기 서열은 본 명세서의 서열 목록 및/또는 도 9 내지 13에서 개시된 임의의 것일 수 있다.
도 37의 병 오프너 백본 1의 경우, 본 발명에서 사용되는 특정 Fv 조합은 PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 TIM-3, PD-1 및 LAG-3, PD-1 및 TIGIT, PD-1 및 BTLA, CTLA-4 및 TIM-3, CTLA-4 및 LAG-3, CTLA-4 및 TIGIT, CTLA-4 및 BTLA, TIM-3 및 LAG-3, TIM-3 및 TIGIT, TIM-3 및 BTLA, LAG-3 및 TIGIT, LAG-3 및 BTLA 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다. 상기 서열은 본 명세서의 서열 목록 및/또는 도 9 내지 13에서 개시된 임의의 것일 수 있다.
도 37의 병 오프너 백본 1의 경우, 본 발명에서 사용되는 특정 Fv 조합은 CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) 및 LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv)를 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 428L/434S 변이체 포함)의 경우, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 428L/434S 변이체 포함)의 경우, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 428L/434S 변이체 포함)의 경우, 인간 LAG-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 428L/434S 변이체 포함)의 경우, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 428L/434S 변이체 포함)의 경우, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1 L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
특정 병 오프너 구현예는 하기에서 설명된다.
B. mAb-Fv 포맷
본 발명에서 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1h에 나타낸 mAb-Fv 포맷이다. 이 구현예에서, 상기 포맷은 하나의 모노머에 "여분의" 가변 중질 도메인의 C-말단 부착 및 다른 모노머에 "여분의" 가변 경질 도메인의 C-말단 부착을 사용하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하는 것에 의존하며, 여기서 2개의 도메인의 Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고, "여분의" scFv 도메인은 상이한 체크포인트 표적에 결합한다.
이 구현예에서, 제1 모노머는 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 C-말단에 공유결합된 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중질 도메인 및 제1 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다 (vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적인 링커]-vl2). 제2 모노머는 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중질 도메인의 제2 가변 중질 도메인, 및 도메인 링커를 사용하여 제2 Fc 도메인의 C-말단에 공유결합된 제3 가변 중질 도메인을 포함한다 (vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적인 링커]-vh2. 2개의 C-말단 부착된 가변 도메인은 scFv를 구성한다. 이 구현예는 추가로, 중쇄와 결합하여 2개의 동일한 Fab를 형성하는, 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 일반적인 경쇄를 이용한다. 본 명세서의 많은 구현예에서와 같이, 이들 구조물은 필요에 따라 본원에 기재된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가의 Fc 변이체, 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
또한, mAb-Fv 포맷의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, mAb-Fv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 포맷의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
일부 구현예에서, mAb-Fv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 포맷의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 LAG-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
C. mAb-scFv
본 발명에서 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1i에 나타낸 mAb-scFv 포맷이다. 이 구현예에서, 상기 포맷은 모노머 중 하나에 scFv의 C-말단 부착을 사용하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하는 것에 의존하며, 여기서 2개의 모노머의 Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고, "여분의" scFv 도메인은 상이한 체크포인트 표적에 결합한다.
이 구현예에서, 제1 모노머는 어느 하나의 배향 (vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적인 링커]-vh2-scFv 링커-vl2 또는 vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적인 링커]-vl2-scFv 링커-vh2)에서 scFv 가변 경질 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중질 도메인을 포함하는 C-말단 공유결합된 scFv와 함께, 제1 중쇄 (가변 중질 도메인 및 불변 도메인 포함)를 포함한다. 이 구현예는 추가로, 중쇄와 결합하여 표적 항원 중 하나에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하는, 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 일반적인 경쇄를 이용한다. 본 명세서의 많은 구현예에서와 같이, 이들 구조물은 필요에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가의 Fc 변이체, 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
또한, mAb-scFv 포맷의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, mAb-scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 포맷의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
일부 구현예에서, mAb-scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. mAb-scFv 포맷에서, 본 발명에 사용되는 특정 Fv 조합은 CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) 및 LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv)를 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)에서, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)에서, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)에서, 인간 LAG-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)에서, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)에서, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
D. 중심 scFv
본 발명에서 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1f에 나타낸 중심-scFv 포맷이다. 이 구현예에서, 상기 포맷은 삽입된 scFv 도메인을 사용하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하는 것에 의존하며, 여기서 2개의 모노머의 Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고, "여분의" scFv 도메인은 또 다른 체크포인트 표적에 결합한다. 상기 scFv 도메인은 모노머 중 하나의 Fc 도메인 및 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되어 제3 항원 결합 도메인을 제공한다.
이 구현예에서, 하나의 모노머는 scFv 가변 경질 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중질 도메인을 포함하는 scFv와 함께, 제1 가변 중질 도메인, CH1 도메인 (및 선택적인 힌지) 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. scFv는 선택적인 도메인 링커를 사용하여 중질 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에서 공유결합된다 (vh1-CH1-[선택적인 링커]-vh2-scFv 링커-vl2-[힌지를 포함하는 선택적인 링커]-CH2-CH3, 또는 scFv에 대한 반대 배향, vh1-CH1-[선택적인 링커] -vl2-scFv 링커-vh2-[힌지를 포함하는 선택적인 링커]-CH2-CH3). 다른 모노머는 표준 Fab 측이다. 이 구현예는 추가로, 중쇄와 결합하여 체크포인트 억제제에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하는, 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 일반적인 경쇄를 이용한다. 본 명세서의 많은 구현예에서와 같이, 이들 구조물은 필요에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가의 Fc 변이체, 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
또한, 중심 scFv 포맷의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, 중심 scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG- 3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4를 포함한다.
일부 구현예에서, 중심 scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4를 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한/을 이용한 중심-scFv 서열의 경우, 본 발명에 사용되는 특정 Fv 조합은 CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) 및 LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv)를 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한/을 이용한 중심-scFv 서열의 경우, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9 H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한/을 이용한 중심-scFv 서열의 경우, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한/을 이용한 중심-scFv 서열의 경우, 인간 LAG- 3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한/을 이용한 중심-scFv 서열의 경우, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
도 37의 병 오프너 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)과 유사한/을 이용한 중심-scFv 서열의 경우, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
E. 중심-Fv 포맷
본 발명에서 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1g에 나타낸 중심-Fv 포맷이다. 이 구현예에서, 상기 포맷은 삽입된 scFv 도메인을 사용하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하는 것에 의존하며, 여기서 2개의 모노머의 Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고, "여분의" scFv 도메인은 또 다른 체크포인트 표적에 결합한다. 상기 scFv 도메인은 모노머의 Fc 도메인 및 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되어 제3 항원 결합 도메인을 제공하며, 여기서 각각의 모노머는 scFv의 구성요소를 포함한다 (예를 들어 하나의 모노머는 가변 중질 도메인을 포함하고, 다른 모노머는 가변 경질 도메인을 포함함).
이 구현예에서, 하나의 모노머는 제1 가변 중질 도메인, CH1 도메인, 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄 및 추가의 가변 경질 도메인을 포함한다. 경질 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중질 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유결합된다 (vh1-CH1-[선택적인 링커]-vl2-힌지-CH2-CH3). 다른 모노머는 제1 가변 중질 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄 및 추가의 가변 중질 도메인을 포함한다 (vh1-CH1-[선택적인 링커]-vh2-힌지-CH2-CH3). 경질 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중질 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유결합된다. 이 구현예는 추가로, 중쇄와 결합하여 TTA에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하는, 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 일반적인 경쇄를 이용한다. 본 명세서의 많은 구현예에서와 같이, 이들 구조물은 필요에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가의 Fc 변이체, 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
중심-scFv 포맷에서, 본 발명에 사용되는 특정 Fv 조합은 CTLA-4 (Fab) X PD-1 (scFv), PD-1 (Fab) X CTLA-4 (scFv), LAG-3 (Fab) X PD-1 (scFv), BTLA (Fab) X PD-1 (scFv) 및 LAG-3 (Fab) X CTLA-4 (scFv)를 포함한다.
중심-scFv 포맷에서, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
중심-scFv 포맷에서, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
중심-scFv 포맷에서, 인간 LAG-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
중심-scFv 포맷에서, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
중심-scFv 포맷에서, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
F. 하나의 아암의 중심-scFv
본 발명에 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1c에 나타낸 하나의 아암의 중심-scFv 포맷이다. 이 구현예에서, 하나의 모노머는 Fc 도메인만을 포함하지만, 다른 모노머는 삽입된 scFv 도메인을 사용하여 제2 항원 결합 도메인을 형성한다. 이 포맷에서, Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고, scFv는 또 다른 체크포인트 표적에 결합한다. scFv 도메인은 모노머 중 하나의 Fc 도메인 및 CH1-Fv 영역 사이에 삽입된다.
이 구현예에서, 하나의 모노머는 scFv 가변 경질 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중질 도메인을 포함하는 scFv와 함께, 제1 가변 중질 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. scFv는 도메인 링커를 사용하여 중질 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유결합된다. 제2 모노머 Fc 도메인을 포함한다. 이 구현예는 추가로, 중쇄와 결합하여 Fab를 형성하는 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄를 이용한다. 본 명세서의 많은 구현예에서와 같이, 이들 구조물은 필요에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가의 Fc 변이체, 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
또한, 하나의 아암의 중심-scFv 포맷의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나의 아암의 중심-scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나의 아암의 중심-scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG- 3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG- 3 X CTLA-4를 포함한다.
하나의 아암의 중심-scFv 포맷에서, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 중심-scFv 포맷에서, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 중심-scFv 포맷에서, 인간 LAG-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 중심-scFv 포맷에서, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 중심-scFv 포맷에서, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
G. 하나의 아암의 scFv-mAb
본 발명에 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1d에 나타낸 하나의 아암의 scFv-mAb 포맷이다. 이 구현예에서, 하나의 모노머는 Fc 도메인만을 포함하지만, 다른 모노머는 일반적으로 링커: vh-scFv 링커-vl-[선택적인 도메인 링커] -CH1-힌지-CH2-CH3 또는 (반대 배향으로) vl-scFv 링커-vh-[선택적인 도메인 링커] -CH1-힌지-CH2-CH3를 사용하여 중쇄의 N-말단에 부착된 scFv 도메인을 사용한다. 이 포맷에서, Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고, scFv는 또 다른 체크포인트 표적에 결합한다. 이 구현예는 추가로, 중쇄와 결합하여 Fab를 형성하는, 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄를 이용한다. 본 명세서의 많은 구현예에서와 같이, 이들 구조물은 필요에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가의 Fc 변이체, 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG- 3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
또한, Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나의 아암의 scFv-mAb 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나의 아암의 scFv-mAb 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, the pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) CTLA-4 X PD-1, PD-1 X CTLA-4, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4를 포함한다.
하나의 아암의 scFv-mAb 포맷에서, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 scFv-mAb 포맷에서, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 scFv-mAb 포맷에서, 인간 LAG-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 scFv-mAb 포맷에서, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
하나의 아암의 scFv-mAb 포맷에서, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
H. scFv-mAb 포맷
본 발명에 특히 유용한 이종이량체성 스캐폴드 중 하나는 도 1e에 나타낸 mAb-scFv 포맷이다. 이 구현예에서, 상기 포맷은 모노머 중 하나에 scFv의 N-말단 부착을 사용하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하는 것에 의존하며, 여기서 2개의 모노머의 Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고, "여분의" scFv 도메인은 상이한 체크포인트 표적에 결합한다.
이 구현예에서, 제1 모노머는 어느 하나의 배향 ((vh1-scFv 링커-vl1 -[선택적인 도메인 링커]-vh2-CH1-힌지-CH2-CH3) 또는 (반대 배향으로 scFv와 함께) ((vl1-scFv 링커-vh1-[선택적인 도메인 링커]-vh2-CH1-힌지-CH2-CH3))에서 scFv 가변 경질 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중질 도메인을 포함하는 N-말단 공유결합된 scFv와 함께, 제1 중쇄 (가변 중질 도메인 및 불변 도메인 포함)를 포함한다. 이 구현예는 추가로, 중쇄와 결합하여 표적 항원 중 하나에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하는 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 일반적인 경쇄를 이용한다. 본 명세서의 많은 구현예에서와 같이, 이들 구조물은 필요에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가의 Fc 변이체, 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (Fab는 처음에 열거되고, scFv는 두 번째 열거됨) PD-1 및 CTLA-4, CTLA-4 및 PD-1, PD-1 및 TIM-3, TIM-3 및 PD-1, PD-1 및 LAG-3, LAG-3 X PD1, PD-1 및 TIGIT, TIGIT 및 PD-1, PD-1 및 BTLA, BTLA 및 PD-1, CTLA-4 및 TIM-3, TIM-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 LAG-3, LAG-3 및 CTLA-4, CTLA-4 및 TIGIT, TIGIT 및 CTLA-4, CTLA-4 및 BTLA, BTLA 및 CTLA-4, TIM-3 및 LAG-3, LAG-3 및 TIM-3, TIM-3 및 TIGIT, TIGIT 및 TIM-3, TIM-3 및 BTLA, BTLA 및 TIM-3. LAG-3 및 TIGIT, TIGIT 및 LAG-3, LAG-3 및 BTLA, BTLA 및 LAG-3, BTLA 및 TIGIT, 및 TIGIT 및 BTLA를 포함한다.
이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
또한, scFv-mAb 포맷의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, mAb-scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 포맷의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
일부 구현예에서, mAb-scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 포맷의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
도 38의 mAb-scFv 포맷 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)의 경우, 인간 PD-1에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1, 뿐만 아니라 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 포맷 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)의 경우, 인간 CTLA-4에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; [CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67 및 [CTLA-4]_H3_L0.74, 뿐만 아니라 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 포맷 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)의 경우, 인간 LAG-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 2A11_H0L0; ; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1, 뿐만 아니라 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 포맷 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)의 경우, 인간 BTLA에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1, 뿐만 아니라 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 열거된 것을 포함한다.
도 38의 mAb-scFv 포맷 백본 1 (선택적으로 M428L/N434S를 포함함)의 경우, 인간 TIM-3에 결합하는 특정 ABD는, 비제한적으로, 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0 및 7C2_H0L0, 뿐만 아니라 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 열거된 것을 포함한다.
I. 이중 scFv 포맷
본 발명은 또한 당해 분야에 공지되고, 도 1b에 나타낸 바와 같은 이중 scFv 포맷을 제공한다. 이 구현예에서, 이종이량체성 이중특이적 항체는 2개의 scFv-Fc 모노머 (둘 모두 (vh-scFv 링커-vl-[선택적인 도메인 링커]-CH2-CH3) 포맷 또는 (vl-scFv 링커- vh- [선택적인 도메인 링커]-CH2-CH3) 포맷 중 어느 하나, 또는 하나의 모노머는 한 배향이고, 다른 모노머는 다른 배향임)로 구성된다.
이 경우에, 모든 ABD는 scFv 포맷이며, PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 TIM-3, PD-1 및 LAG-3, PD-1 및 TIGIT, PD-1 및 BTLA, CTLA-4 및 TIM-3, CTLA-4 및 LAG-3, CTLA-4 및 TIGIT, CTLA-4 및 BTLA, TIM-3 및 LAG-3, TIM-3 및 TIGIT, TIM-3 및 BTLA, LAG-3 및 TIGIT, LAG-3 및 BTLA 및 TIGIT 및 BTLA의 임의의 조합이 유용하다. 이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도 9 내지 13에서 나타낸 바와 같이, 그리고 도 39 및 도 40에서 나타낸 바와 같은 임의의 조합으로 개시될 수 있다.
또한, 이중 scFv 포맷의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로 하전된 scFv 링커 (도 7에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 포맷의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
일부 구현예에서, 이중 scFv 포맷은 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경질 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중질 도메인을 포함하는 제1 모노머; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중질 도메인, 및 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 모노머; 및 c) 제1 가변 경질 도메인 및 불변 경질 도메인을 포함하는 경쇄. 이 포맷의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서) CTLA-4 X PD-1, LAG-3 X PD-1, BTLA X PD-1, 및 LAG-3 X CTLA-4이다.
J. 비-이종이량체성 이중특이적 항체
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 설명된 Fv 서열은 또한, 단일특이적 항체 (예를 들어 "전통적 단클론성 항체") 또는 비-이종이량체성 이중특이적 포맷 모두에 사용될 수 있다.
적합한 비-이종이량체성 이중특이적 포맷은 당해 분야에 공지되어 있으며, 다음에 일반적으로 묘사된 바와 같은 수많은 상이한 포맷을 포함한다: Spiess 등, Molecular Immunology (67):95-106 (2015) 및 Kontermann, mAbs 4:2, 182-197 (2012) (이 둘 모두는 특히 그 안의 포맷에 대한 도면, 범례 및 인용에 대해 참고로 명확히 편입됨).
K. 단일특이적, 단클론성 항체
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 설명된 신규한 Fv 서열은 또한 단일특이적 항체 (예를 들어 "전통적 단클론성 항체") 또는 비-이종이량체성 이중특이적 포맷 둘 모두로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역을 갖는, 도면으로부터 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 서열을 포함하는 단클론성 (단일특이적) 항체를 제공하며, IgG1, IgG2 및 IgG4 (S228P 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 불변 영역 포함)가 일부 구현예에서 특히 유용하다. 즉, "H_L"의 표시를 갖는 본 명세서의 임의의 서열은 인간 IgG1 항체의 불변 영역에 연결될 수 있다.
VI. 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인
본 발명의 이중특이적 항체는 일반적으로 도 1에 나타낸 바와 같이 2가, 이중특이적 포맷 또는 3가, 이중특이적 포맷으로 2개의 상이한 표적 체크포인트 항원 ("표적 쌍")에 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 도메인 (ABD)을 갖는다. 적합한 표적 체크포인트 항원은 인간 (및 때때로 사이노(cyno)) PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT 및 BTLA를 포함하며, 이의 서열은 도 2에 제시된다. 따라서, 적합한 이중특이적 항체는 PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 TIM-3, PD-1 및 LAG-3, PD-1 및 TIGIT, PD-1 및 BTLA, CTLA-4 및 TIM-3, CTLA-4 및 LAG-3, CTLA-4 및 TIGIT, CTLA-4 및 BTLA, TIM-3 및 LAG-3, TIM-3 및 TIGIT, TIM-3 및 BTLA, LAG-3 및 TIGIT, LAG-3 및 BTLA 및 TIGIT 및 BTLA에 결합한다. 일반적으로 이들 이중특이적 항체는 "항-PD-1 X 항-CTLA-4"로 명명되거나, 또는 일반적으로 각각의 쌍에 대해 "PD-1 X CTLA-4", 등으로 단순화하여 또는 용이하게 (따라서 상호교환적으로) 명명된다는 것을 유의한다. 본 명세서에 명시되지 않는 한, 명칭에서 항원 목록의 순서는 구조를 부여하지 않으며, 즉 PD-1 X CTLA-4 병 오프너 항체는 PD-1 또는 CTLA-4에 결합된 scFv를 가질 수 있지만, 일부 경우에, 순서는 구조를 표시된 대로 지정한다는 것을 유의한다.
본 명세서에 더 완전하게 설명된 바와 같이, ABD의 이들 조합은 하기 설명된 바와 같이 다양한 포맷일 수 있으며, 일반적으로 하나의 ABD가 Fab 포맷이고, 다른 것은 scFv 포맷인 조합일 수 있다. 본 명세서에서 논의되고, 도 1에 나타낸 바와 같이, 일부 포맷은 단일 Fab 및 단일 scFv를 사용하며 (도 1a, 1c 및 1d), 일부 포맷은 2개의 Fab 및 단일 scFv를 사용한다 (도 1e, 1f, 1g, 1h 및 1i).
A. 항원 결합 도메인
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 체크포인트 이종이량체성 항체는 2개의 항원 결합 도메인 (ABD)을 포함하며, 이들 각각은 상이한 체크포인트 단백질에 결합한다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 이들 이종이량체성 항체는 이중특이적 및 2가 (각각의 항원은, 예를 들어, 도 1a에 묘사된 포맷에서 단일 ABD에 의해 결합됨), 또는 이중특이적 및 3가 (예를 들어 도 1f에 묘사된 바와 같이, 하나의 항원은 단일 ABD에 의해 결합되고, 다른 것은 2개의 ABD에 의해 결합됨)일 수 있다.
또한, 일반적으로, ABD 중 하나는 vh-scFv 링커-vl 또는 vl-scFv 링커-vh의 N-말단에서 C-말단으로의 배향으로 본 명세서에 설명된 바와 같은 scFv를 포함한다. 상기 포맷에 따르는 다른 ABD 중 하나 또는 둘 모두는 일반적으로 하나의 단백질 사슬에서 vh 도메인 (일반적으로 중쇄의 구성요소로서) 및 또 다른 단백질 사슬에서 vl (일반적으로 경쇄의 구성요소로서)을 포함하는 Fab이다.
본 발명은 아래에 설명된 바와 같이 수많은 상이한 체크포인트 단백질에 결합하는 수많은 ABD를 제공한다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 6개의 CDR 또는 vh 및 vl 도메인의 임의의 세트는 scFv 포맷 또는 Fab 포맷일 수 있으며, 이어서 이는 중질 및 경질 불변 도메인에 첨가되고, 여기서 중질 불변 도메인은 변이체 (H1 도메인 뿐만 아니라 Fc 도메인 내에 포함함)를 포함한다. 서열 목록에 포함된 scFv 서열은 특정 하전된 링커를 이용하지만, 본 명세서에 설명된 바와 같이, 도 7에 나타낸 것을 포함하는 비하전된 또는 다른 하전된 링커가 사용될 수 있다.
또한, 상기에 논의된 바와 같이, CDR의 식별을 위해 서열 목록에서 사용된 넘버링은 카밧이지만, 상이한 넘버링이 사용될 수 있으며, 이는 표 1에서 나타낸 바와 같이 CDR의 아미노산 서열을 변화시킬 것이다.
본 명세서에 열거된 모든 가변 중질 및 경질 도메인에 대해, 추가의 변이체가 만들어질 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 일부 구현예에서 6개의 CDR 세트는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변형 (아미노산 치환이 특히 유용함), 뿐만 아니라 프레임워크 (CDR 제외)가 미국 특허 번호 7,657,380의 도 1 (도 및 범례는 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입됨)에 열거된 것으로부터 선택된 인간 생식계열 서열과 적어도 약 80, 85 또는 90% 동일성을 유지하는 한, 가변 중질 및 경질 도메인의 프레임워크 영역의 변화를 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 동일한 CDR은, 프레임워크 영역이 미국 특허 번호7,657,380의 도 1에 열거된 것으로부터 선택된 인간 생식계열 서열과 적어도 80, 85 또는 90% 동일성을 유지하는 한, 인간 생식계열 서열과 상이한 프레임워크 서열과 조합될 수 있다. 대안적으로, 상기 CDR은 CDR 세트 (즉, 6개의 CDR 세트에서 변화의 총 수가 6개 아미노산 변형보다 적은 한 CDR이 변형될 수 있으며, CDR의 임의의 조합이 변경되며; 예를 들어 vlCDR1에는 하나의 변화가 있으며, vhCDR2에는 2개의 변화가 있고, vhCDR3, 등에는 변화가 없을 수 있음)에서 아미노산 변형 (예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변형), 뿐만 아니라 프레임워크 영역이 미국 특허 번호7,657,380의 도 1에 열거된 것으로부터 선택된 인간 생식계열 서열과 적어도 80, 85 또는 90% 동일성을 유지하는 한 프레임워크 영역 변화를 가질 수 있다.
B. PD-1 항원 결합 도메인
일부 구현예에서, ABD 중 하나는 PD-1에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트, 뿐만 아니라 scFv 서열은 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146에 나타나 있다. 일부 구현예에서 특히 관심있는 ABD 서열은 도 9에 나타나 있으며, 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1을 갖는 서열 목록의 서열을 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 항-PD-1 ABD는, 밑줄이 그어져 있거나, 본 명세서에 기재되고 표 1에서 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에, 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146의 vh 및 vl 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한, scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 PD-1에 Fv를 함유하는 많은 구현예에서, 그것은 PD-1에 결합하는 scFv 모노머이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, PD-1이 항원 중 하나인 경우 표적 쌍 중 다른 하나는 다음으로부터 선택된다: CTLA-4 (적합한 서열은 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), TIM-3 (적합한 서열은 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), LAG-3 (적합한 서열은 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), BTLA (적합한 서열은 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), 및 TIGIT (적합한 서열은 서열번호: 21504-21523 및 서열번호: 37435-37586 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨).
인간 PD-1에 결합하는 특히 유용한 ABD는, 비제한적으로, 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1을 포함한다.
PD-1에 대해 ABD를 형성하는 서열 목록에 개시된 모 CDR 세트 이외에, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는, ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법(biolayer interferometry), 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화를 가질 수 있다.
PD-1에 대해 ABD를 형성하는 본 명세서에 개시된 모 가변 중질 및 가변 경질 도메인 이외에, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인 각각은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 각각의 모 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 37의 임의의 병 오프너 포맷 백본 내에 포함되는, scFv 포맷의 1G6_L1.194_H1.279 항-PD-1 Fv를 포함한다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 38의 임의의 mAb-scFv 포맷 백본 내에 포함되는, scFv 포맷의 1G6_L1.194_H1.279 항-PD-1 Fv를 포함한다.
C. CTLA-4 항원 결합 도메인
일부 구현예에서, ABD 중 하나는 CTLA-4에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트, 뿐만 아니라 scFv 서열은 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416에 나타나 있다. 일부 구현예에서 특히 관심있는 ABD 서열은 도 10에 나타나 있으며, 또한 식별자 [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; 0[CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; 및 [CTLA-4]_H3_L0.74를 갖는 서열 목록의 서열을 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 항-CTLA-4 ABD는, 밑줄이 그어져 있거나, 본 명세서에 기재되고 표 1에서 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에, 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416의 vh 및 vl 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한, scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 CTLA-4에 Fv를 함유하는 많은 구현예에서, 그것은 CTLA-4에 결합하는 scFv 모노머이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, CTLA-4가 항원 중 하나인 경우 표적 쌍 중 다른 하나는 다음으로부터 선택된다: PD-1 (적합한 서열은 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), TIM-3 (적합한 서열은 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), LAG-3 (적합한 서열은 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), BTLA (적합한 서열은 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), 및 TIGIT (적합한 서열은 서열번호: 21504-21523 및 서열번호: 37435-37586 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨).
CTLA-4에 대해 ABD를 형성하는 서열 목록에 개시된 모 CDR 세트 이외에, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는, ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화를 가질 수 있다.
CTLA-4에 대해 ABD를 형성하는 본 명세서에 개시된 모 가변 중질 및 가변 경질 도메인 이외에, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인 각각은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 각각의 모 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 37의 임의의 병 오프너 포맷 백본 내에 포함되는, Fab 포맷의 [CTLA-4]_H3_L0.22 항-CTLA-4 Fv를 포함한다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 37의 임의의 병 오프너 포맷 백본 내에 포함되는, scFv 포맷의 [CTLA-4]_H3_L0.22 항-CTLA-4 Fv를 포함한다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 38의 임의의 mAb-scFv 포맷 백본 내에 포함되는, scFv 포맷의 [CTLA-4]_H3_L0.22 항-CTLA-4 Fv를 포함한다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 38의 임의의 mAb-scFv 포맷 백본 내에 포함되는, Fab 포맷의 [CTLA-4]_H3_L0.22 항-CTLA-4 Fv를 포함한다.
D. TIM-3 항원 결합 도메인
일부 구현예에서, ABD 중 하나는 TIM-3에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트, 뿐만 아니라 scFv 서열은 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706에 나타나 있다. 일부 구현예에서 특히 관심있는 ABD 서열은 식별자 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7Bllvar_H0L0; 및 7C2_H0L0를 갖는 서열 목록의 서열을 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 항-TIM-3 ABD는, 밑줄이 그어져 있거나, 본 명세서에 기재되고 표 1에서 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에, 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706의 vh 및 vl 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한, scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 TIM-3에 Fv를 함유하는 많은 구현예에서, 그것은 TIM-3에 결합하는 Fab 모노머이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, TIM-3이 항원 중 하나인 경우 표적 쌍 중 다른 하나는 다음으로부터 선택된다: PD-1 (적합한 서열은 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), CTLA-4 (적합한 서열은 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), LAG-3 (적합한 서열은 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), BTLA (적합한 서열은 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), 및 TIGIT (적합한 서열은 서열번호: 21504-21523 및 서열번호: 37435-37586 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨).
TIM-3에 대해 ABD를 형성하는 서열 목록에서 개시된 모 CDR 세트 이외에, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화를 가질 수 있다.
TIM-3에 대해 ABD를 형성하는 본 명세서에 개시된 모 가변 중질 및 가변 경질 도메인 이외에, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인 각각은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 각각의 모 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.
LAG-3 항원 결합 도메인
일부 구현예에서, ABD 중 하나는 LAG-3에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트, 뿐만 아니라 scFv 서열은 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002에 나타나 있다. 일부 구현예에서 특히 관심있는 ABD 서열은 식별자 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1을 갖는 서열 목록의 서열을 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 항-LAG-3 ABD는, 밑줄이 그어져 있거나, 본 명세서에 기재되고 표 1에서 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에, 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002의 vh 및 vl 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한, scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. LAG-3에 Fv를 함유하는 본 명세서의 많은 구현예에서, 그것은 LAG-3에 결합하는 Fab 모노머이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, LAG-3이 항원 중 하나인 경우 표적 쌍 중 다른 하나는 다음으로부터 선택된다: PD-1 (적합한 서열은 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), CTLA-4 (적합한 서열은 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), TIM-3 (적합한 서열은 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), BTLA (적합한 서열은 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), 및 TIGIT (적합한 서열은 서열번호: 21504-21523 및 서열번호: 37435-37586 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨).
LAG-3에 대해 ABD를 형성하는 서열 목록에서 개시된 모 CDR 세트 이외에, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화를 가질 수 있다.
LAG-3에 대해 ABD를 형성하는 본 명세서에 개시된 모 가변 중질 및 가변 경질 도메인 이외에, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인 각각은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 각각의 모 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 37의 임의의 병 오프너 포맷 백본 내에 포함되는, Fab 포맷의 7G8_H3.30_L1.34 항-LAG-3 Fv를 포함한다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 37의 임의의 병 오프너 포맷 백본 내에 포함되는, scFv 포맷의 7G8_H3.30_L1.34 항-LAG-3 Fv를 포함한다.
E. BTLA 항원 결합 도메인
일부 구현예에서, ABD 중 하나는 BTLA에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트, 뿐만 아니라 scFv 서열은 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738에 나타나 있다. 일부 구현예에서 특히 관심있는 ABD 서열은 도 12에 나타나 있으며, 또한 식별자 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1을 갖는 서열 목록의 서열을 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 항-BTLA ABD는, 밑줄이 그어져 있거나, 본 명세서에 기재되고 표 1에서 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에, 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738의 vh 및 vl 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한, scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. BTLA에 Fv를 함유하는 본 명세서의 많은 구현예에서, 그것은 BTLA에 결합하는 Fab 모노머이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, LAG-3이 항원 중 하나인 경우 표적 쌍 중 다른 하나는 다음으로부터 선택된다: PD-1 (적합한 서열은 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), CTLA-4 (적합한 서열은 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), TIM-3 (적합한 서열은 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), LAG-3 (적합한 서열은 서열번호: 17135-20764, 서열번호: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), 및 TIGIT (적합한 서열은 서열번호: 21504-21523 및 서열번호: 37435-37586 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨).
BTLA에 대해 ABD를 형성하는 서열 목록에 개시된 모 CDR 세트 이외에, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변화를 가질 수 있다.
BTLA에 대해 ABD를 형성하는 본 명세서에 개시된 모 가변 중질 및 가변 경질 도메인 이외에, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인 각각은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 모 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 ABD가 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나에 의해 측정된 바와 같이, 표적 항원에 계속해서 결합할 수 있는 한, 각각의 모 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 37의 임의의 병 오프너 포맷 백본 내에 포함되는, Fab 포맷의 9C6_H1.1_L1 항-LAG-3 Fv를 포함한다.
구체적인 바람직한 구현예는 도 37의 임의의 병 오프너 포맷 백본 내에 포함되는, scFv 포맷의 7G8_H3.30_L1.34 항-LAG-3 Fv를 포함한다.
F. TIGIT 항원 결합 도메인
일부 구현예에서, ABD 중 하나는 TIGIT에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트, 뿐만 아니라 scFv 서열은 서열번호: 21504-21523 및 서열번호: 37435-37586에 나타나 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 항-TIGIT ABD는, 밑줄이 그어져 있거나, 본 명세서에 기재되고 표 1에서 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에, 서열번호: 21504-21523 및 서열번호: 37435-37586의 vh 및 vl 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한, scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. TIGIT에 Fv를 함유하는 본 명세서의 많은 구현예에서, 그것은 TIGIT에 결합하는 Fab 모노머이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, LAG-3이 항원 중 하나인 경우 표적 쌍 중 다른 하나는 다음으로부터 선택된다: PD-1 (적합한 서열은 서열번호: 6209-11464, 서열번호: 11465-17134, 서열번호: 33003-33072, 서열번호: 33073-35394 및 서열번호: 36127-36146 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), CTLA-4 (적합한 서열은 서열번호: 21-2918, 서열번호: 2919-6208, 서열번호: 36739-36818 및 서열번호: 35395-35416 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), TIM-3 (적합한 서열은 서열번호: 20765-20884, 서열번호: 37587-37698 및 서열번호: 36347-36706 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), LAG-3 (적합한 서열은 서열번호: 17135-20764, 서열 번호s: 36819-36962, 서열번호: 35417-35606, 서열번호: 25194-32793 및 서열번호: 32794-33002 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨), 및 BTLA (적합한 서열은 서열번호: 20885-21503 및 서열번호: 36707-36738 (이는 scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 기재됨).
G. 특정 이중특이적 구현예
본 발명은 하기 설명된 바와 같이 수많은 특정 이중특이적 항체를 제공한다.
1. LAG-3 X CTLA-4
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 LAG-3에 결합하는 제1 ABD, 및 인간 CTLA-4에 결합하는 제2 ABD를 포함하는 이중특이적 이종이량체성 항체를 제공하며, 도 1에 나타낸 임의의 포맷일 수 있다. 본 개시의 대부분은 Fab가 LAG-3 측이고, CLTA-4 측이 scFv 측인 병 오프너 포맷을 지칭하지만, 이것은 본 명세서의 모든 구현예에서 역전될 수 있다.
일 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 이중특이적 항체는 도 1a의 병 오프너 포맷이며, 여기서 CTLA-4 ABD는 scFv이다. 또 다른 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, LAG-3 ABD는 Fab 구성요소이다. 또 다른 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, CTLA-4 ABD는 scFv이다.
LAG-3 X CTLA-4 이중특이적 항체 (병 오프너 포맷 또는 중심-scFv 포맷으로)는 일반적으로 본 명세서에 설명된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 즉, 어느 포맷이든, 2개의 모노머의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함할 수 있으며, Fab 측 (예를 들어 중쇄 불변 도메인)을 포함하는 모노머는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 이중특이적 항체는 스큐 변이체를 갖는 Fc 도메인을 포함하며, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 CTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129를 이용하지만, 서열 목록의 CTLA-4 또는 LAG-3 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적이 예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 CTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129를 이용하지만, 서열 목록의 CTLA-4 또는 LAG-3 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
추가의 구현예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 CTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129를 갖는 도 37의 임의의 백본을 포함한다.
추가의 구현예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 CTLA-4 scFv [CTLA-4]_H3.23_L0.129를 갖는 도 38의 임의의 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 X CLTA-4 이중특이적 항체의 경우, LAG-3 Fab 측에 대한 Fv는 식별자 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1을 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다. CTLA-4 scFv 측에 대한 Fv는 식별자 [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; 0[CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; 및 [CTLA-4]_H3_L0.74를 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 이중특이적 항체는 서열번호: 35607-35866 및 서열번호: 21524-22620에 열거된 구조물로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LAG-3 X CTLA-4 이중특이적 항체는 XENP20206, XENP21582, XENP21584, XENP21588, XENP22123, XENP22124, XENP22125, XENP22604, XENP22672, XENP22847, XENP22847, XENP22841 및 XENP22849로부터 선택된다.
2. BTLA X PD-1
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 BTLA에 결합하는 제1 ABD 및 인간 PD-1에 결합하는 제2 ABD를 포함하는 이중특이적 이종이량체성 항체를 제공하며, 도 1에 나타낸 임의의 포맷일 수 있다. 본 개시의 대부분은 Fab가 BTLA 측이고, PD-1 측이 scFv 측인 병 오프너 포맷을 지칭하지만, 이것은 본 명세서의 모든 구현예에서 역전될 수 있다.
일 구현예에서, BTLA X PD-1 이중특이적 항체는 도 1a의 병 오프너 포맷이며, 여기서 PD-1 ABD는 scFv이다. 또 다른 구현예에서, BTLA X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, BTLA ABD는 Fab 구성요소이다. 또 다른 구현예에서, BTLA X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, PD-1 ABD는 scFv이다.
BTLA X PD-1 이중특이적 항체 (병 오프너 포맷 또는 중심-scFv 포맷으로)는 일반적으로 본 명세서에 설명된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 즉, 어느 포맷이든, 2개의 모노머의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함하며, Fab 측 (예를 들어 중쇄 불변 도메인)을 포함하는 모노머는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, BTLA X PD-1 이중특이적 항체는 스큐 변이체를 갖는 Fc 도메인을 포함하며, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, BTLA X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 BTLA Fab 9C6_H1.1_L1 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 이용하지만, 서열 목록의 BTLA 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, BTLA X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 BTLA Fab 9C6_H1.1_L1 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H 1.279를 이용하지만, 서열 목록의 BTLA 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
추가의 구현예는 BTLA Fab 9C6_H1.1_L1 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 37의 임의의 백본을 포함한다.
추가의 구현예는 Fab 9C6_H1.1_L1 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 38의 임의의 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, BTLA X PD-1 이중특이적 항체의 경우, BTLA Fab 측에 대한 Fv는 식별자 9C6_H0L0, 9C6_H1.1_L1, 9C6_H1.11_L1을 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다. PD-1 scFv 측에 대한 Fv는 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_HlL1을 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, BTLA X PD-1 이중특이적 항체는 서열번호: 22724-23315 및 서열번호: 36147-36166과 같이 열거된 것을 포함하는 구조물로부터 선택된다.
일부 구현예에서, BTLA X PD-1 이중특이적 항체는 XENP20895, XENP21220, XENP21221 및 XENP22858로부터 선택된다.
3. CTLA-4 X PD-1
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 CTLA-4에 결합하는 제1 ABD 및 인간 PD-1에 결합하는 제2 ABD를 포함하는 이중특이적 이종이량체성 항체를 제공하며, 도 1에 나타낸 임의의 포맷일 수 있다. 본 개시의 대부분은 Fab가 CTLA-4 측이고, PD-1 측이 scFv 측인 병 오프너 포맷을 지칭하지만, 이것은 본 명세서의 모든 구현예에서 역전될 수 있다.
일 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1a의 병 오프너 포맷이며, 여기서 PD-1 ABD는 scFv이다. 또 다른 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, CTLA-4 ABD는 Fab 구성요소이다. 또 다른 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, PD-1 ABD는 scFv이다.
CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체 (병 오프너 포맷 또는 중심-scFv 포맷으로)는 일반적으로 본 명세서에 설명된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 즉, 어느 포맷이든, 2개의 모노머의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함할 수 있으며, Fab 측 (예를 들어 중쇄 불변 도메인)을 포함하는 모노머는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체는 스큐 변이체를 갖는 Fc 도메인을 포함하며, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 CTLA-4 Fab [CTLA-4]_H3_L0.22 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 포함하지만, 서열 목록의 CTLA-4 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 CTLA-4 Fab [CTLA-4]_H3_L0.22 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 이용하지만, 서열 목록의 CTLA-4 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
추가의 구현예는 CTLA-4 Fab [CTLA-4]_H3_L0.22 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 37의 임의의 백본을 포함한다.
추가의 구현예는 CTLA-4 Fab [CTLA-4]_H3_L0.22 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 38의 임의의 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체의 경우, CTLA-4 Fab 측에 대한 Fv는 식별자 [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; 0[CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; 및 [CTLA-4]_H3_L0.74를 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다. PD-1 scFv 측에 대한 Fv는 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1을 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체는 서열번호: 36167-36346 및 서열번호: 23316-23735와 같이 열거된 것으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CTLA-4 X PD-1 이중특이적 항체는 XENP19738, XENP19739, XENP19741, XENP20053, XENP20066, XENP20130, XENP20146, XENP20717 및 XENP22836으로부터 선택된다.
4. LAG-3 X PD-1
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 LAG-3에 결합하는 제1 ABD 및 인간 PD-1에 결합하는 제2 ABD를 포함하는 이중특이적 이종이량체성 항체를 제공하며, 도 1에 나타낸 임의의 포맷일 수 있다. 본 개시의 대부분은 Fab가 LAG-3 측이고, PD-1 측이 scFv 측인 병 오프너 포맷을 지칭하지만, 이것은 본 명세서의 모든 구현예에서 역전될 수 있다.
일 구현예에서, LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1a의 병 오프너 포맷이며, 여기서 PD-1 ABD는 scFv이다. 또 다른 구현예에서, LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, LAG-3 ABD는 Fab 구성요소이다. 또 다른 구현예에서, LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, PD-1 ABD는 scFv이다.
LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체 (병 오프너 포맷 또는 중심-scFv 포맷으로)는 일반적으로 본 명세서에 설명된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 즉, 어느 포맷이든, 2개의 모노머의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함할 수 있으며, Fab 측 (예를 들어 중쇄 불변 도메인)을 포함하는 모노머는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체는 스큐 변이체를 갖는 Fc 도메인을 포함하며, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LAG-3 X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 이용하지만, 서열 목록의 LAG-3 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, LAG-3 X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 이용하지만, 서열 목록의 LAG-3 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
추가의 구현예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 37의 임의의 백본을 포함한다.
추가의 구현예는 LAG-3 Fab 7G8_H3.30_L1.34 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 38의 임의의 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체의 경우, LAG-3 Fab 측에 대한 Fv는 식별자 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1을 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다. PD-1 scFv 측에 대한 Fv는 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1을 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체는 서열번호: 35867-36126 및 서열번호: 23736-25133과 같이 열거된 것을 포함하는 구조물로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LAG-3 X PD-1 이중특이적 항체는 XENP20206, XENP21582, XENP21584, XENP21588, XENP22123, XENP22124, XENP22125, XENP22604, XENP22672, XENP22847, XENP22847 및 XENP22849로부터 선택된다.
5. TIGIT X PD-1
일부 구현예에서, TIGIT X PD-1 이중특이적 항체는 서열번호: 25134-25173에 열거된 구조물로부터 선택된다.
6. TIM-3 X PD-1
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 TIM-3에 결합하는 제1 ABD 및 인간 PD-1에 결합하는 제2 ABD를 포함하는 이중특이적 이종이량체성 항체를 제공하며, 도 1에 나타낸 임의의 포맷일 수 있다. 본 개시의 대부분은 Fab가 TIM-3 측이고, PD-1 측이 scFv 측인 병 오프너 포맷을 지칭하지만, 이것은 본 명세서의 모든 구현예에서 역전될 수 있다.
일 구현예에서, TIM-3 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1a의 병 오프너 포맷이지만, 여기서 PD-1 ABD는 scFv이다. 또 다른 구현예에서, TIM-3 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, TIM-3 ABD는 Fab 구성요소이다. 또 다른 구현예에서, TIM-3 X PD-1 이중특이적 항체는 도 1f의 중심-scFv 포맷이며, PD-1 ABD는 scFv이다.
TIM-3 X PD-1 이중특이적 항체 (병 오프너 포맷 또는 the 중심-scFv 포맷으로)는 일반적으로 본 명세서에 설명된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 즉, 어느 포맷이든, 2개의 모노머의 Fc 도메인은 스큐 변이체 (예를 들어 도 3 및 도 8에서 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 세트), 선택적으로 절제 변이체 (도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함할 수 있으며, Fab 측 (예를 들어 중쇄 불변 도메인)을 포함하는 모노머는 pI 변이체 (도 4에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, TIM-3 X PD-1 이중특이적 항체는 스큐 변이체를 갖는 Fc 도메인을 포함하며, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, TIM-3 X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, the pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 이용하지만, 서열 목록의 TIM-3 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, TIM-3 X PD-1 항체는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병 오프너 포맷을 포함한다: a) 하전된 scFv 링커 (일부 구현예에서는 도 7의 +H 서열이 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 본 명세서에 설명된 바와 같이 체크포인트 수용체에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 모노머 ("scFv 모노머"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 가변 경질 도메인과 함께, 본 명세서에 설명된 바와 같이 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중질 도메인을 포함하는 제2 모노머 ("Fab 모노머"); 및 c) 경쇄. 이 구현예의 구체적인 예는 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 이용하지만, 서열 목록의 TIM-3 또는 PD-1 Fv 중 임의의 것은 임의의 조합으로 쌍을 이루고 사용될 수 있다.
추가의 구현예는 TIM-3 Fab 측 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 37의 임의의 백본을 포함한다.
추가의 구현예는 TIM-3 Fab 측 및 PD-1 scFv 1G6_L1.194_H1.279를 갖는 도 38의 임의의 백본을 포함한다.
일부 구현예에서, TIM-3 Fab 측 X PD-1 이중특이적 항체의 경우, TIM-3 Fab 측에 대한 Fv는 식별자 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B1lvar_HOLO; 및 7C2_H0L0를 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다. PD-1 scFv 측에 대한 Fv는 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1을 갖는 서열 목록의 서열로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 항체는 본 명세서에 설명된 항원 결합 도메인과 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 본 명세서에 설명된 항원 결합 도메인과의 결합에 대해 경쟁하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 체크포인트 항체는 본 명세서에 설명된 ABD 중 하나 및 본 명세서에 설명된 ABD 중 하나와 결합에 대해 경쟁하는 제2 ABD를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 두 ABD는 본 명세서에 설명된 상응하는 ABD와 결합에 대해 경쟁한다. 결합 경쟁은 일반적으로 비아코어, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (바이오층 간섭계법, 예를 들어 옥텟 검정) 검정 (후자가 많은 구현예에서 특히 유용함) 중 적어도 하나를 사용하여 결정된다.
VII. 유용한 구현예
일 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 스큐 및 pI 변이체의 특정 조합은 T366S/L368A/Y407V : T366W (선택적으로 브릿징 디설파이드, T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C 포함)이며, 하나의 모노머는 Q295E/N384D/Q418E/N481D를 포함하며, 다른 하나는 양으로 하전된 scFv 링커 (상기 포맷이 scFv 도메인을 포함하는 경우)를 포함한다. 당해 분야에 이해되는 바와 같이, "노브 인 홀" 변이체는 pI를 변화시키지 않으며, 따라서 어느 모노머에도 사용될 수 있다.
VIII. 본 발명의 핵산
본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산 조성물 (또는, "단일특이적" 항체의 경우, 또한 단일특이적 항체를 인코딩하는 핵산)을 추가로 제공한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 핵산 조성물은 이종이량체성 단백질의 포맷 및 스캐폴드에 좌우될 것이다. 따라서, 예를 들어, 포맷이, 예컨대 이중 scFv 포맷을 제외하고 도 1에 나타낸 모든 포맷에 대해, 3개의 아미노산 서열을 필요로 하는 경우, 3개의 핵산 서열은 발현을 위한 하나 이상의 발현 벡터 내로 편입될 수 있다. 유사하게, 일부 포맷 (예를 들어 도 1에 개시된 바와 같은 이중 scFv 포맷)만이 2개의 핵산이 필요하며; 다시, 이들은 1 또는 2개의 발현 벡터에 도입될 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 구성요소를 인코딩하는 핵산은 당해 분야에 공지된 바와 같이, 그리고 본 발명의 이종이량체성 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포에 따라 발현 벡터 내로 편입될 수 있다. 일반적으로 상기 핵산은 임의의 수의 조절 요소 (프로모터, 복제 기원, 선별 마커, 리보솜 결합 부위, 유발인자, 등)에 작동가능하게 연결된다. 상기 발현 벡터는 염색체외(extra-chromosomal) 또는 통합 벡터(integrating vector)일 수 있다.
이후 본 발명의 핵산 및/또는 발현 벡터는 포유동물, 박테리아, 효모, 곤충 및/또는 진균 세포 (포유동물 세포 (예를 들어 CHO 세포)가 많은 구현예에서 사용됨)를 포함하여, 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이 임의의 수의 상이한 유형의 숙주 세포 내로 형질전환된다.
일부 구현예에서, 포맷에 따라 적용가능한 경우, 각각의 모노머를 인코딩하는 핵산 및 경쇄를 인코딩하는 선택적인 핵산은 각각, 일반적으로 상이하거나 동일한 프로모터의 통제 하에 단일 발현 벡터 내에 함유된다. 본 발명에서 특히 사용되는 구현예에서, 각각의 이들 2개 또는 3개의 핵산은 상이한 발현 벡터에 함유된다. 본 명세서 및 62/025,931 (본 명세서에 참고로 편입됨)에 나타낸 바와 같이, 상이한 벡터 비는 이종이량체 형성을 유도하는데 사용될 수 있다. 즉, 놀랍게도, 단백질이 제1 모노머:제2 모노머:경쇄 (이종이량체성 항체를 포함하는 3개의 폴리펩타이드를 갖는 본 명세서의 많은 구현예의 경우)를 1:1:2 비로 포함하지만, 이것은 최상의 결과를 제공하는 비는 아니다.
본 발명의 이종이량체성 항체는 당해 분야에 공지된 바와 같은 발현 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 일단 생산되면, 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 전통적 항체 정제 단계가 수행된다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 2개의 모노머의 pI를 적어도 0.5만큼 상이하게 하여 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 전기영동, 또는 등전점에 민감한 다른 방법으로 분리할 수 있다. 즉, pI 치환의 포함은 각각의 모노머의 등전점 (pI)을 변경시켜 각각의 모노머가 상이한 pI를 갖고, 이종이량체가 또한 뚜렷이 다른 pI를 갖도록 하며, 따라서 "삼중 F" 이종이량체의 등전위 정제 (예를 들어, 음이온 교환 칼럼, 양이온 교환 칼럼)를 용이하게 한다. 이러한 치환은 또한 정제 (예를 들어, IEF 겔, cIEF, 및 분석적 IEX 칼럼) 후 이중 scFv-Fc 및 mAb 동종이량체를 오염시키는 것을 결정하고 모니터링하는 것을 돕는다.
IX. 이종이량체성 체크포인트 항체의 생물학적 및 생화학적 기능
일반적으로 본 발명의 이중특이적 체크포인트 항체는 암 환자에게 투여되고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 수많은 방식으로 효능을 평가한다. 따라서, 암 부하(cancer load), 종양의 크기, 존재의 평가 또는 전이 정도, 등과 같은 효능의 표준 검정이 수행될 수 있지만, 면역-종양학 치료는 또한 면역 상태 평가에 기초하여 평가될 수 있다. 이것은 시험관내 및 생체내 검정 둘 모두를 포함하는 수많은 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 종양 부담(tumor burden), 크기, 침입성, LN 관여, 전이, 등과 같은 "구식(old fashioned)" 측정과 더불어 면역 상태 변화 평가 (예를 들어 ipi 처리 후 ICOS+ CD4+ T 세포의 존재)가 수행될 수 있다. 따라서, 하기 중 어느 것 또는 모두가 평가될 수 있다: CD4+ T 세포 활성화 또는 증식, CD8+ T (CTL) 세포 활성화 또는 증식, CD8+ T 세포-매개된 세포독성 활성 및/또는 CTL 매개된 세포 고갈, NK 세포 활성 및 NK 매개된 세포 고갈에 대한 체크포인트의 억제 효과, Treg 세포 분화 및 증식 및 Treg- 또는 골수 유래된 억제제 세포 (myeloid derived suppressor cell; MDSC)-매개된 면역억제 또는 면역 내성에 대한 체크포인트의 강화 효과, 및/또는 면역 세포에 의한 전염증 사이토카인 생산, 예를 들어, T 또는 다른 면역 세포에 의한 IL-2, IFN-γ 또는 TNF-α 생산에 대한 체크포인트의 효과.
일부 구현예에서, 치료 평가는 예를 들어, CFSE 희석 방법, 면역 효과기 세포의 Ki67 세포내 염색, 및 3H-티미딘 혼입 방법을 사용하여 면역 세포 증식을 평가함으로써 수행된다.
일부 구현예에서, 치료 평가는 CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40 중 하나 이상을 포함하는 활성화-관련 마커의 유전자 발현 증가 또는 단백질 수준 증가, 및 CD107A의 표면 발현에 의해 측정된 세포 탈과립화를 평가함으로써 수행된다.
일반적으로, 유전자 발현 검정은 당해 분야에 공지된 바와 같이 수행된다.
일반적으로, 단백질 발현 측정은 또한 당해 분야에 공지된 바와 유사하게 수행된다.
일부 구현예에서, 치료 평가는 수많은 세포 파라미터 예컨대 효소 활성 (프로테아제 활성 포함), 세포막 투과도, 세포 부착, ATP 생산, 조효소 생산, 및 뉴클레오타이드 흡수 활성을 평가하여 표적 세포 생존력 검출에 의해 측정된 세포독성 활성을 평가함으로써 수행된다. 이러한 검정의 구체적인 예는, 비제한적으로, 트립판 블루(Trypan Blue) 또는 PI 염색, 51Cr 또는 35S 방출 방법, LDH 활성, MTT 및/또는 WST 검정, 칼세인(Calcein)-AM 검정, 발광성 기반 검정, 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 평가는 잘 알려진 기술을 사용하여, 비제한적으로, IFNγ, TNFα, GM-CSF, IL2, IL6, IL4, IL5, IL10, IL13을 포함하는 사이토카인을 사용하여 세포 상청액 중에서 세포내에서 측정한, 사이토카인 생산에 의해 측정된 T 세포 활성를 평가함으로써 수행된다.
따라서, 치료 평가는 다음 중 하나 이상을 평가하는 검정을 사용하여 수행될 수 있다: (i) 면역 반응의 증가, (ii) αβ 및/또는 γδ T 세포의 활성화 증가, (iii) 세포독성 T 세포 활성의 증가, (iv) NK 및/또는 NKT 세포 활성의 증가, (v) αβ 및/또는 γδ T-세포 억제의 경감, (vi) 전염증 사이토카인 분비 증가, (vii) IL-2 분비 증가; (viii) 인터페론-γ 생산의 증가, (ix) Th1 반응의 증가, (x) Th2 반응의 감소, (xi) 조절 T 세포 중 적어도 하나 (Treg)의 세포 수 및/또는 활성 감소 또는 제거.
효능을 측정하기 위한 검정
일부 구현예에서, T 세포 활성화는 당해 분야에 공지된 바와 같이 혼합된 림프구 반응 (MLR) 검정을 사용하여 평가된다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 상이한 인자의 인산화 또는 탈-인산화에 의해, 또는 다른 번역후 변형을 측정함으로써 측정된 바와 같은 면역 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같이 αβ 및/또는 γδ T 세포의 활성화 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 사멸 또는 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 세포독성 T 세포 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 사멸, 사이토카인 분비 또는 예를 들어 CD107a, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 NK 및/또는 NKT 세포 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 예를 들어 신호전달 경로 검정은 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 αβ 및/또는 γδ T-세포 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스(Luminex) 또는 멀티플렉스(Multiplex) 비드 기반 방법 또는 세포내 염색 및 FACS 분석 또는 알리스폿(Alispot) 등에 의해 측정된 바와 같은 전-염증 사이토카인 분비의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스 또는 멀티플렉스 비드 기반 방법 또는 세포내 염색 및 FACS 분석 또는 알리스폿 등에 의해 측정된 바와 같은 IL-2 분비의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스 또는 멀티플렉스 비드 기반 방법 또는 세포내 염색 및 FACS 분석 또는 알리스폿 등에 의해 측정된 바와 같은 인터페론-γ 생산의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 Th1 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 Th2 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 유세포측정법 또는 IHC에 의해 측정된 바와 같은, 조절 T 세포 중 적어도 하나 (Treg)의 세포 수 및/또는 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 지시한다. 적절한 감소는 하기 설명된, 증가와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 유세포측정법 또는 IHC에 의해 측정된 바와 같은, M2 대식세포 세포 수의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 지시한다. 적절한 감소는 하기 설명된, 증가와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은, M2 대식세포 전-종양형성(pro-tumorigenic) 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 지시한다. 적절한 감소는 하기 설명된, 증가와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 유세포측정법 또는 IHC에 의해 측정된 바와 같은, N2 중성구 증가의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 지시한다. 적절한 감소는 하기 설명된, 증가와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은, N2 중성구 전-종양형성 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 지시한다. 적절한 감소는 하기 설명된, 증가와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은, T 세포 활성화 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 사멸 또는 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 CTL 활성화 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 αβ 및/또는 γδ T 세포 고갈의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 지시한다. 적절한 감소는 하기 설명된, 증가와 동일하다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 αβ 및/또는 γδ T 세포 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD45RA, CCR7 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 항원-특이적 메모리 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신(Calcine) AM과 같은 세포독성 검정, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 아이오다이드 염색 등과 같은 유세포측정 기반 검정에 의해 측정된 바와 같은 암 세포의 세포자멸사 또는 용해의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신 AM과 같은 세포독성 검정, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 아이오다이드 염색 등과 같은 유세포측정 기반 검정에 의해 측정된 바와 같은, 암 세포에 대한 세포독성 또는 세포증식억제 효과의 자극 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신 AM과 같은 세포독성 검정, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 아이오다이드 염색 등과 같은 유세포측정 기반 검정에 의해 측정된 바와 같은 암 세포의 직접적인 사멸의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된 바와 같은 Thl7 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, 신호전달 경로 검정은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신 AM과 같은 세포독성 검정, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 아이오다이드 염색 등과 같은 유세포측정 기반 검정에 의해 측정된 바와 같은, 보체 의존적 세포독성 및/또는 항체 의존적 세포-매개된 세포독성의 유도 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 지시한다. 활성의 적절한 증가는 하기 설명된다.
일 구현예에서, T 세포 활성화는 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 사멸 또는 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다. T-세포의 경우, 증식, 활성화 (예를 들어 CD25, CD69, CD137, PD1), 세포독성 (표적 세포를 사멸시키는 능력), 및 사이토카인 생산 (예를 들어 IL-2, IL-4, IL-6, IFNγ, TNF-a, IL-10, IL-17A)의 세포 표면 마커의 증가는 암 세포의 향상된 사멸과 일치할 면역 조절을 나타낼 것이다.
일 구현예에서, NK 세포 활성화는 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적인 사멸 또는 사이토카인 분비 또는 예를 들어 CD107a, 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다. NK 세포의 경우, 증식, 세포독성 (표적 세포를 사멸시키고 CD107a, 그란자임, 및 페르포린 발현을 증가시키는 능력), 사이토카인 생산 (예를 들어 IFNγ 및 TNF), 및 세포 표면 수용체 발현 (예를 들어 CD25)의 증가는 암 세포의 향상된 사멸과 일치할 면역 조절을 나타낼 것이다.
일 구현예에서, γδ T 세포 활성화는 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다.
일 구현예에서, Th1 세포 활성화는 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정된다.
활성 또는 반응의 적절한 증가 (또는 상기 설명된 바와 같이 적절한 경우, 감소)는 참조 샘플 또는 대조 샘플, 예를 들어 본 발명의 항체를 포함하지 않는 시험 샘플에서의 신호에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98 내지 99% 퍼센트 증가이다. 유사하게, 참조 또는 대조 샘플과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 증가가 효능을 나타낸다.
X. 치료
일단 제조되면, 본 발명의 조성물은 일반적으로 본 발명의 이중특이적 체크포인트 항체의 결합으로 T 세포 활성화의 억제를 억제하여 (예를 들어 T 세포는 더 이상 억제되지 않음) 암을 치료함으로써 수많은 종양학 적용에 사용된다.
따라서, 본 발명의 이종이량체성 조성물은 이러한 암의 치료에 사용된다.
XI. 병용 요법
일부 구현예에서, 이중특이적 체크포인트가 항-PD-1 항원 결합 도메인을 포함하지 않는 경우, 상기 이중특이적 항체는 펨브롤리주맙 (키트루다®) 또는 니볼루맙 (옵디보®)과 같은 별개의 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다. 공-투여는 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
즉, 본 명세서에 개시되거나, 또는 서열 목록의 항-LAG-3 서열 및 항-CTLA-4 서열을 포함하는 임의의 것과 같은 CTLA-4 X LAG-3 이중특이적 체크포인트 항체, 특히 XENP22602, XENP22675, XENP22841 또는 XENP22843은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
유사하게, 본 명세서에 개시되거나, 또는 서열 목록의 항-BTLA 서열 및 항-CTLA-4 서열을 포함하는 임의의 것과 같은 BTLA X CTLA-4 이중특이적 체크포인트는 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
CTLA-4 X TIM-3 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-TIM-3 서열 및 항-CTLA-4 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
CTLA-4 및 TIGIT 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-CTLA-4 및 항-TIGIT 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
TIM-3 및 LAG-3 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-TIM-3 서열 및 항-LAG-3 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
TIM-3 및 TIGIT 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-TIM-3 서열 및 항-TIGIT 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
TIM-3 및 BTLA 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-TIM-3 및 항-BTLA 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
LAG-3 및 TIGIT 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-LAG-3 서열 및 항-TIGIT 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
LAG-3 및 BTLA 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-LAG-3 서열 및 항-BTLA 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
TIGIT 및 BTLA 이중특이적 체크포인트 항체 예컨대 서열 목록의 항-TIGIT 서열 및 항-BTLA 서열을 포함하는 임의의 것은 항-PD-1 항체와 공-투여될 수 있다.
XII. 생체내 투여를 위한 항체 조성물
본 발명에 따라서 사용된 항체의 제형은 저장을 위해 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로, 원하는 순도를 갖는 항체를 선택적인 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제 (일반적으로 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]에 설명됨)와 혼합함으로써 제조된다. 허용가능한 캐리어, 완충액, 부형제, 또는 안정화제는 투약량 및 이용된 농도에서 수령체에 비독성이며, 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 염화물; 헥사메토늄 염화물; 벤즈알코늄 염화물, 벤즈에토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
투여 양식
본 발명의 항체 및 화학치료제는 공지된 방법, 예컨대 볼러스로서의 정맥내 투여에 따라 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해 대상체에게 투여된다.
치료 양식
본 발명의 방법에서, 치료법은 질환 또는 병태에 대해 긍정적인 치료 반응을 제공하기 위해 사용된다. "긍정적인 치료 반응"은 질환 또는 병태의 개선, 및/또는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선이 의도된다. 예를 들어, 긍정적인 치료 반응은 다음의 질환 개선 중 하나 이상을 지칭할 것이다: (1) 신생물 세포 수의 감소; (2) 신생물 세포사의 증가; (3) 신생물 세포 생존의 억제; (5) 종양 성장의 억제 (즉, 어느 정도까지 느려지고, 바람직하게는 정지됨); (6) 증가된 환자 생존율; 및 (7) 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 일부 완화.
임의의 주어진 질환 또는 병태에 긍정적인 치료 반응은 그 질환 또는 병태에 특화된 표준화된 반응 기준에 의해 결정될 수 있다. 종양 반응은 자기 공명 영상 (MRI) 스캔, x-방사선 영상, 컴퓨터 단층 (computed tomographic; CT) 촬영, 골 스캔 영상, 내시경술, 및 골수 흡인 (bone marrow aspiration; BMA)을 포함하는 종양 생검 샘플링 및 순환계 중 종양 세포의 계수와 같은 스크리닝 기술을 사용하여 종양 형태의 변화 (즉, 전체적인 종양 부담, 종양 크기, 및 기타 동종의 것)에 대해 평가될 수 있다.
이러한 긍정적인 치료 반응 이외에, 치료를 받는 대상체는 질환과 관련된 증상의 개선에 유익한 효과를 경험할 수 있다.
본 발명에 따른 치료는 사용된 약제의 "치료적으로 효과적인 양"을 포함한다. "치료적으로 효과적인 양"은 원하는 치료 결과를 얻는데 필요한 투약량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
치료적으로 효과적인 양은 질환 상태, 연령, 성별, 및 개체의 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 약제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적으로 효과적인 양은 또한, 치료적으로 유익한 효과가 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 더 큰 양이다.
종양 요법을 위한 "치료적으로 효과적인 양"은 또한 질환의 진행을 안정화시키는 능력에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다.
대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 당업자에게 공지된 시험관내 검정에 의해 세포 성장을 억제하거나 세포자멸사를 유도하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있다. 치료 화합물의 치료적으로 효과적인 양은 종양 크기를 감소시키거나, 또는 달리 대상체에서 증상을 완화시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 대상체의 사이즈, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인에 기초하여 그와 같은 양을 결정할 수 있을 것이다.
투약 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있거나, 몇 개의 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나 또는 용량이 치료 상황의 긴급도에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이함 및 투약량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 투약 단위 형태는 치료될 대상체를 위한 단일 투약량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 캐리어와 공동으로 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 예정된 양을 함유한다.
본 발명의 투약 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성될 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감수성의 치료를 위해 그와 같은 활성 화합물을 배합하는 분야에 고유한 제한에 의해 좌우되고, 직접적으로 의존한다.
본 발명에 사용된 이중특이적 항체를 위해 효율적인 투약량 및 투약 요법은 치료될 질환 또는 병태에 의존하며, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 사용된 이중특이적 항체의 치료적으로 효과적인 양에 대한 예시적이고 비제한적인 범위는 약 0.1-100 mg/kg이다.
인용된 모든 참조문헌은 본 명세서에 그 전문이 명확히 참고로 편입되어 있다.
본 발명의 특정 구현예가 예시 목적으로 상기 기재되었지만, 당해 분야의 숙련가는, 첨부된 청구항들에 기재된 바와 같은 본 발명을 벗어나지 않으면서 세부사항에서 수많은 변화가 이루어질 수 있음을 알 것이다.
실시예
실시예는 본 발명을 예시하기 위해 하기 제공된다. 이러한 실시예는 본 발명을 임의의 특정 적용 또는 작동 이론에 제한하려는 것은 아니다. 본 발명에 논의된 모든 불변 영역 위치에 대해서는, 카밧에서와 같은 EU 인덱스를 따른다 (Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 전문이 참고로 편입됨). 항체 분야의 숙련가는, 이 규칙(convention)이 면역글로불린 서열의 특정 영역에서 비순차적인 넘버링으로 구성되어 면역글로불린 계열에서 보존된 위치에 대한 표준화된 참조를 가능하게 한다는 것을 알 것이다. 따라서, EU 인덱스에 의해 정의된 바와 같이 임의의 주어진 면역글로불린의 위치는 반드시 그것의 순차적인 서열과 일치하지 않을 것이다.
일반 및 특정 과학 기술은 US 공보 2015/0307629, 2014/0288275 및 WO2014/145806 (이들 모두는 그 전문이, 특히 본 명세서에 설명된 기술에 대해 참고로 명확히 편입됨)에 설명된다.
A. 실시예 1 : 다수의 암 유형 유래 TIL은 면역 체크포인트 수용체를 공-발현시킴
PD-1, CTLA-4, LAG-3, 및 BTLA 사이에 잠재적인 관련성을 조사하기 위해, 암 게놈 아틀라스 프로젝트 (The Cancer Genome Atlas; TCGA)로부터의 RNA 서열분석 데이터가 분석을 위해 사용되었다. FireBrowse (http://firebrowse.org/)에서 V2 RSEM 데이터를 다운로드하였다. 분석은 커스텀 루틴(custom routine)으로 R을 사용하여 수행되었다. PD-1 및 CTLA-4 발현 사이의 상관관계는 계산된 R2 값 (도 1; 피어슨 상관 계수의 제곱)과 함께 도 66에 나타냈다. 도 66은 PD-1 및 LAG-3 발현, PD-1 및 BTLA 발현, 및 LAG-3 및 CTLA-4 발현 사이의 상관관계를 추가로 보여준다.
도 44는, PD-1 및 CTLA-4가 방광, 유방, 결장, 전립선, 흑색종, 난소 및 폐암을 포함하는 암에서 공-발현되었음을 보여주며, 세트 PD-1 및 CTLA-4, PD-1 및 LAG-3, PD-1 및 BTLA, 및 LAG-3 및 CTLA-4는 방광, 유방, 결장, 두경부, 신장, 폐-아데노(lung-adeno), 폐 편평상피(lung squamous), 난소, 췌장, 전립선, 및 흑색종 암을 포함하는 암에서 공-발현되었음을 보여준다.
B. 실시예 2: 이중특이적 면역 체크포인트 항체는 단일특이적 면역 체크포인트 항체보다 우수함
원형 면역 체크포인트 항체 (예를 들어 니볼루맙 및 이필리무맙) 및 상기 원형 항체에 기반한 이중특이적 면역 체크포인트 항체는 이중 체크포인트 차단의 효과를 입증하기 위해 생산되었다. 달리 언급되지 않는 한, 이중특이적 항체는 본 명세서에서 Fab 가변 영역을 먼저 사용하고 scFv 가변 영역을 두 번째로 사용하여 명명된다. 원형 항체에 대한 아미노산 서열은 서열 목록에 열거된다. 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA는 유전자 합성 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, Wash.)에 의해 생성되고, 2가 또는 이중특이적 불변 영역을 포함하는 발현 벡터 pTT5 내로 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 서브클로닝되고, HEK293E 세포에 일시적으로 형질감염되었다. 항체는 단백질 A 크로마토그래피 (및 이중특이적 항체의 경우 양이온 교환 크로마토그래피)에 의해 정제되었다. 순도는 크기 배제 크로마토그래피, 분석용 양이온 교환 크로마토그래피 및 모세관 등전점 전기영동에 의해 평가되었다.
1. 이중-양성 세포는 이중특이적 면역 체크포인트 항체에 의해 선택적으로 점유됨
단일 면역 체크포인트 수용체를 발현시키는 비-종양 반응성 T 세포에 비해 다중 면역 체크포인트 수용체를 발현시키는 종양-반응성 TIL (실시예 1에 나타낸 바와 같음)의 선택적 표적화는 주변 독성을 피하면서 항-종양 활성을 향상시킬 수 있었다 (도 42에 나타냄).
SEB-자극된 PBMC 검정은 T 세포에 대한 이중특이적 면역 체크포인트 항체의 결합을 조사하기 위해 사용되었다. SEB-자극된 PBMC 검정은 T 헬퍼 (TH) 세포 증식을 검정하고, 세포독성 T 림프구 (CTL) 집단을 생성하기 위한 시험관내 방법이다. PBMC가 포도상구균 장독소 B (staphylococcal enterotoxin B; SEB)로 자극되는 경우, TH 세포 집단이 팽창되고, 이어서 CTL 집단이 팽창된다. PBMC는 3일 동안 100 ng/mL SEB로 자극되고, 그 다음 4℃에서 30분 동안 원형 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체 및 음성 대조군 (누맥스 2가(Numax bivalent))으로 처리되었다. 처리 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 APC-표지된 하나의-아암 항-LAG-3 항체, FITC-표지된 하나의-아암 항-PD-1 항체 및 BV605-표지된 항-CD3 항체로 인큐베이션하였다. CD3+ T 세포의 산포도는 도 67에 도시된다. 데이터는, PD-1 및 LAG-3 둘 모두를 발현시키는 이중-양성 세포가 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의해 선택적으로 점유되며, 이는 이중특이적 면역 체크포인트 항체가 다중 체크포인트 수용체를 발현시키는 T 세포를 선택적으로 표적화한다는 것을 입증함을 보여준다.
2. 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체는 혼합된 림프구 반응에서 IL-2 반응을 향상시킴
원형 면역 체크포인트 항체 XENP16432 (니볼루맙) 및 XENP16433 (이필리무맙), 니볼루맙 및 이필리무맙에 기반한 이중특이적 면역 체크포인트 항체 XENP16004, 및 하나의-아암 (단일특이적, 1가) 조합 대조군을 혼합된-림프구 반응 (혼합된-백혈구 반응 또는 MLR로도 공지됨)에서 시험하였다. MLR은 T 헬퍼 (TH) 세포 증식을 검정하고, 세포독성 T 림프구 (CTL) 집단을 생성하기 위한 또 다른 시험관내 방법이다. 동종이계 (상이한 MHC 일배체형) 림프구가 함께 배양되는 경우, TH 세포 집단이 팽창되고, 이어서 CTL 집단이 팽창된다. T 세포 활성화를 모니터링하기 위해 인터류킨-2 (IL-2) 분비가 사용되었다.
상이한 세트의 인간 PBMC를 피콜-파케(Ficoll-Paque)™ 플러스 밀도 구배를 사용하여 상이한 익명의 건강한 지원자의 백혈구성분채집(leukapheresis) (HemaCare, VanNuys, CA)으로부터 정제하였다. 2개의 공여체로부터의 PBMC를 혼합하고, 그 다음 20 μg/mL의 지시된 시험품으로 처리하였다. 상청액을 수집하고, IL-2의 농도를 IL-2 ELISA를 사용하여 측정하고, 데이터는 일부 항-CTLA-4 Fab 스크리닝 결과를 나타낸다. 이것은 Fab 및 scFv 구현예에 대한 XENP 코드, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, 옥텟에 의해 측정된 인간 및 사이노 CTLA-4에 대한 KD 결합 상수, 및 scFv 및 Fab의 Tm을 나타낸다. 추가로, 적어도 하나의 인간 VH 또는 VL 생식계열에 정확히 매치된 서열 9-머(mer)의 수는 Fab 및 scFv 둘 모두의 가변 영역에 대한 인간성의 척도로서 묘사된다.
도 25a. 각각의 열에 대해, 각각의 데이터 점은 상이한 공여체-공여체 조합에 의한 별개의 반응이다.
데이터는, 원형 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체가 니볼루맙 및 이필리무맙 단독보다 더 큰 정도로 IL-2 반응을 향상시켰음을 보여준다. 현저하게, 하나의-아암 조합 (상기 이중특이적 항체의 각각의 1가 아암이 별도로 첨가됨)은 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체보다 열등하며, 이는 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체에 대해 도 67에 나타낸 발견과 일치하는 이중-양성 PD-1+CTLA-4+ 세포에 대한 이중특이적 항체의 보다 열렬한 결합을 시사한다.
3. 추가의 이중특이적 면역 체크포인트 항체는 혼합된 림프구 반응에서 IL-2 반응을 향상시킴
추가의 면역 체크포인트 수용체에 대한 추가의 원형 면역 체크포인트 항체 및 이중특이적 면역 체크포인트 항체를 상기에 기재된 바와 같이 MLR 검정으로 시험하였다. 2 세트의 MLR을 생성하였고, 여기서 20개의 공여체는 1개의 수령 공여체를 표적화하고, 또 다른 세트의 20개의 공여체는 또 다른 1개의 수령 공여체를 표적화하며, 총 40개의 MLR 반응이었다. 반응물을 6일 동안 20 μg/mL의 지시된 시험품과 인큐베이션하였다. 항-PD-1 2가 (XENP16432)로의 처리에 비해 지시된 시험품으로의 처리 후 IL-2 및 IFNγ의 배수 증가를 나타내는 데이터 (ELISA에 의해 분석됨)를 도 32에 나타낸다. 데이터는, 추가의 이중특이적 면역 체크포인트 항체가 또한 T 세포의 활성화에 있어서 니볼루맙 단독보다 우수하였음을 보여준다.
4. 삼중 면역 체크포인트 차단 - 항-PD-1 2가 및 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체는 SEB-자극된 PBMC 검정에서 IL-2 반응을 향상시키는데 상승작용적임
예컨대 도 43에 나타낸 바와 같이 항-PD-1 2가 및 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체로의 삼중 면역 체크포인트 차단이 T 세포 활성화를 향상시키는데 추가의 이점을 제공할 것이라는 가설이 세워졌다. 상기 가설을 시험하기 위해, 원형 면역 체크포인트 항체 XENP16432 (니볼루맙), 25F7 및 이필리무맙에 기반한 원형 이중특이적 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 면역 체크포인트 항체 XENP16430, 및 XENP16432 및 XENP16430의 조합을 SEB-자극된 PBMC 검정에서 시험하였다.
다중 공여체로부터의 인간 PBMC를 27시간 동안 10 ng/ml의 SEB로 자극하고, 20 μg/mL의 지시된 시험품으로 처리하였다. 처리 후, 세포 상청액을 ELISA에 의해 IL-2에 대해 분석하였다. 누맥스 2가에 대한 IL-2의 배수 증가에 대한 데이터를 도 33에서 나타냈다. 각각의 점은 기술 단일항(technical singlet)에 표시된 공여체를 나타낸다.
데이터는, 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 체크포인트 항체 (XENP16430) 단독이 대조군 (누맥스 2가)에 비해 IL-2 반응을 향상시켰지만, 향상은 니볼루맙 (XENP16432) 단독보다 더 낮음을 보여준다. 그러나, 니볼루맙과 조합된 항-CTLA-4 x 항-LAG-3 이중특이적 항체는 단독으로 사용하는 것보다 상당히 더 높은 IL-2 반응을 유발시킨다.
5. 체크포인트 수용체/리간드 상호작용의 차단은 T 세포 활성화에 필요함
원형 항-BTLA 항체 4A7, E8D9 및 8D5는 바이오층 간섭계법 (BLI)-기반 방법인 옥텟을 사용하여 BTLA가 그것의 리간드 HVEM과 상호작용하는 것을 차단하는 능력에 대해 스크리닝되었다. 시험품의 1가 친화도를 결정하기 위한 옥텟의 실험 단계는 일반적으로 다음을 포함하였다: 고정화 (바이오센서 상에 리간드 또는 시험품의 포획); 결합 (상응하는 시험품 또는 리간드의 연속 희석물을 포함하는 웰들 내로 리간드- 또는 시험품-코팅된 바이오센서의 침지); 및 해리 (바이오센서를 완충액을 포함하는 웰로 복귀시킴). 완충액만을 포함하는 참조 웰이 또한 데이터 처리 동안 배경 보정을 위한 방법에 포함되었다. 500 nM의 각각의 항-BTLA 항체 및 100 nM BTLA-Fc를 1시간 넘게 인큐베이션하였다. 항-펜타-HIS (HIS1K) 바이오센서를 사용하여 HVEM-Fc-His를 포획하고, 그 다음 항체/BTLA 혼합물 내로 침지시켜 잔존 BTLA/HVEM 결합을 측정하였다. 도 35b에 도시된 바와 같이, 8D5는 BTLA/HVEM 상호작용을 차단하지 못했지만 4A7 및 E8D9는 BTLA/HVEM 상호작용을 차단하였다.
원형 항-BTLA 항체 및 원형 항체에 기반한 항-BTLA Fab 아암을 갖는 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체를 SEB-자극된 PBMC 검정에서 시험하였다. 구체적으로, 인간 PBMC를 72시간 동안 20 ng/mL의 SEB로 자극하고, 20 μg/mL의 시험품으로 처리하였다. 처리 후, 세포 상청액을 ELISA에 의해 IL-2에 대해 분석하였다. 누맥스 2가에 대한 IL-2의 배수 증가에 대한 데이터를 도 35a에서 나타냈다 (각각의 점은 단일항(singlet)에서 시험된 개별 PBMC 공여체를 나타냄). 데이터는 비-차단 8D5 항-BTLA Fab 아암을 갖는 이중특이적 항체가 니볼루맙보다 IL-2를 상당히 더 낮게 유도하여 BTLA/HVEM 상호작용을 차단하는 것이 T 세포 활성화를 향상시키는데 필요하다는 것을 보여준다.
6. 이중특이적 면역 체크포인트 항체는 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 및 질환 활성을 향상시킴
이중특이적 체크포인트 항체는 NSG (NOD-SCID-감마) 면역결핍된 마우스에서 수행되는 이식편 대 숙주 질환 (Graft-versus-Host Disease; GVHD) 모델에서 평가되었다. NSG 마우스에 인간 PBMC가 주입되는 경우, 인간 PBMC는 마우스 세포에 대해 자가면역 반응을 나타냈다. 인간 PBMC가 주입된 NSG 마우스의 처리에 이어서 면역 체크포인트 억제제로 처리하여 생착된 T 세포를 탈-억제하고, 생착을 향상시킨다.
0일에 천 만개의 인간 PBMC를 IV-OSP를 통해 NSG 마우스 내로 생착시키고, 이어서 1일에 지시된 시험품 (5 mg/kg 또는 지시한 대로)으로 투약하였다. 14일에 CD45+ 사건을 측정하였다 (도 34). GVHD는 직접적으로 측정될 수 있지만, 증가된 CD45+ 세포 수준은 감소된 체중과 관련 있다 (니볼루맙 (항-PD-1 단클론성 항체, 옵디보®로 시판됨) 단독, 이필리무맙 단독 (항-CTLA-4 단클론성 항체, 예르보이®로 시판됨) 단독, 니볼루맙 및 이필리무맙 아암에 기반한 원형 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체, 및 "하나의-아암의" 조합 대조군에 의한 IL-2 방출의 향상을 보이는 혼합된 림프구 반응을 나타냄).
도 26b)는 질환을 예측한다.
데이터는, 본 발명의 이중특이적 체크포인트 항체가 대조군 (PBS + PBMC)과 비교하여 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 CD45+ 세포의 증식을 향상시킨다는 것을 보여준다. 또한, 니볼루맙 (XENP16432) 단독으로 나타낸 것보다 본 발명의 항체를 사용하는 것이 더 큰 향상을 나타낸다. 게다가, 니볼루맙과 조합된 항-CTLA-4 x 항-LAG-3 이중특이적 항체 (XENP16430)는 실시예 2d의 데이터와 일치하는 가장 높은 생착 수준을 야기했다.
C. 실시예 3: 하이브리도마
1. 하이브리도마 생성
본 발명의 이중특이적 면역 체크포인트 항체에 대한 PD-1, LAG-3 및 BTLA 표적화 아암을 개발하기 위해, 단클론성 항체는 우선 표준 방법 또는 신속한 프라임 방법(Rapid Prime Method)을 통해, 이뮤노프리사이스(ImmunoPrecise)를 통한 하이브리도마 기술에 의해 생성되었다.
표준 방법의 경우, 항원(들)을 3마리의 BALB/c 마우스에 주입하였다. 하이브리도마 생성을 위해 희생되기 7-10일 전에, 면역화된 마우스에 항원 부스트를 투여하였다. 항원에 대한 항체 역가를 ELISA로 평가하고, 가장 잘 반응하는 마우스가 융합을 위해 선택된다. 최종 항원 부스트는 융합 4일 전에 주어진다. 마우스로부터의 림프구를 풀링하고, 정제한 다음 SP2/0 골수종 세포와 융합시킨다. 융합된 세포는 10-12일 동안 HAT 선택적 단일-단계 클로닝 배지에서 성장시키며, 이 시점에서 하이브리도마는 스크리닝에 대해 준비되었다.
신속한 프라임 방법의 경우, 항원(들)을 3마리의 BALB/c 마우스에 주입하였다. 19일 후, 모든 마우스로부터의 림프구를 풀링하고, 정제한 다음 SP2/0 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포는 10-12일 동안 HAT 선택적 단일-단계 클로닝 배지에서 성장시키며, 이 시점에서 하이브리도마는 스크리닝에 대해 준비되었다.
항-PD-1 하이브리도마의 생성을 위해, 표준 및 신속한 프라임 방법이 사용되었으며, 사용된 항원(들)은 인간 PD-1의 마우스 Fc 융합 (huPD-l-mFc), 사이노 PD-1의 마우스 Fc 융합 (사이노PD-l-mFc), His-태그된 인간 PD-1 (huPD-l-His), His-태그된 사이노 PD-1 (사이노PD-l-His) 또는 이들의 혼합물이었다.
항-BTLA 하이브리도마의 생성을 위해, 표준 및 신속한 프라임 방법이 사용되었으며, 사용된 항원은 인간 BTLA의 마우스 Fc 융합 (huBTLA-mFc), 사이노 BTLA의 마우스 Fc 융합 (사이노BTLA-mFc), His-태그된 인간 BTLA (huBTLA-His), 또는 huBTLA-mFc와 사이노BTLA-mFc의 혼합물이었다.
항-LAG-3 하이브리도마의 생성을 위해, 신속한 프라임 방법이 사용되었으며, 사용된 항원은 인간 LAG-3의 마우스 Fc 융합 (huLAG-3-mFc), 사이노 LAG-3의 마우스 Fc 융합 (cynoLAG-3-mFc), His-태그된 인간 LAG-3 (huLAG-3-His), huLAG-3-mFc와 사이노LAG-3-mFc의 혼합물, 또는 huLAG-3-His와 사이노LAG-3-His의 혼합물이었다.
항-TIM-3 하이브리도마의 생성을 위해, 표준 및 신속한 프라임 방법이 사용되었으며, 사용된 항원(들)은 인간 TIM-3의 마우스 Fc 융합 (huTIM-3-mFc), 사이노 TIM-3의 마우스 Fc 융합 (사이노TIM-3-mFc), His-태그된 인간 TIM-3 (huTIM-3-His), His-태그된 사이노 TIM-3 (사이노TIM-3-His) 또는 이들의 혼합물이었다.
2. 항-PD-1 하이브리도마 클론의 스크리닝
상기에 기재된 바와 같이 생성된 항-PD-1 하이브리도마 클론은 옥텟을 사용하여 2 라운드 스크리닝하였다. 제1 라운드의 경우, 항-마우스 Fc (AMC) 바이오센서를 사용하여 클론을 포획하고, 500 nM의 2가 인간 및 사이노 PD-1-Fc-His에 침지시켰다. 제2 라운드의 경우, 제1 라운드에서 인간 및 사이노 PD-1 둘 모두에 대해 양성인 것으로 확인된 클론을 AMC 바이오센서에서 포획하고, 500 nM 1가 인간 및 사이노 PD-l-His에 침지시켰다. 예시적인 항-PD-1 항체의 서열은 서열 목록에 있다.
3. 항-BTLA 하이브리도마 클론의 스크리닝
상기에 기재된 바와 같이 생성된 항-BTLA 하이브리도마 클론은 옥텟을 사용하여 2 라운드 스크리닝하였다. 제1 라운드의 경우, AMC 바이오센서를 사용하여 클론을 포획하고, 다중 농도의 인간 및 사이노 BTLA-His에 침지시켜 KD를 결정하였다. 제2 라운드의 경우, 차단 검정을 사용하여 BTLA/HVEM 상호작용을 차단한 클론을 확인하였다. 항-펜타-HIS (HIS1K) 바이오센서를 사용하여 HVEM-Fc-His를 포획하고, 25 nM BTLA-Fc 단독 또는 25 nM BTLA-Fc + 하이브리도마 샘플의 1:1 희석물에 침지시켜 잔존 BTLA/HVEM 결합을 측정하였다. 예시적인 항-BTLA 항체의 서열은 서열 목록에 있다.
4. 항-LAG-3 하이브리도마 클론의 스크리닝
상기에 기재된 바와 같이 생성된 항-LAG-3 하이브리도마 클론은 MHC-II를 내인성으로 발현시키는 라모스 세포에 대한 LAG-3 결합을 차단하고, 25F7 mAb와 상이한 에피토프에 결합하는, 높은 친화성을 갖는 클론을 확인하기 위해 몇 라운드 스크리닝하였다.
친화성은 옥텟을 사용하여 결정되었다. AMC 바이오센서를 사용하여 클론을 포획하고, 단일 농도의 인간 LAG-3-Fc 및 사이노 LAG-3-Fc에 침지시켰다. AG-3/MHC-II 상호작용을 차단하는 클론을 확인하기 위해, 10 μL 중 1 μg의 인간 LAG-3-hIg를 실온에서 20분 동안 50 μL의 하이브리도마 상청액 (10% FBS를 포함한 RPMI 배지에 2배, 8회 희석됨)과 혼합하였다. 40 μL의 다우디 또는 라모스 세포 (MHC-II를 내인성으로 발현시킴)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 상기 세포를 세정하고, 항-인간-Fc-알렉사647 2차 항체와 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 세정하고, 알렉사647에 대해 FACS로 분석하였다. 데이터는 도 62에 나타나 있다. 25F7 mAb와 상이한 에피토프에 결합하는 클론을 확인하기 위해, AMC 바이오센서를 사용하여 클론을 포획하고, 100 nM 인간 LAG-3-hFc 또는 500 nM 25F7을 갖는 100 nM LAG-3-hFc에 침지시켜 잔존 결합을 측정한다. 예시적인 항-LAG-3 항체의 서열은 서열 목록에 있다.
5. 항-TIM-3 하이브리도마 클론의 스크리닝
상기에 기재된 바와 같이 생성된 항-TIM-3 하이브리도마 클론은 2 라운드 스크리닝하였다. 제1 라운드는 IgG 샘플 및 IgM 클론에 대한 스크린으로 나뉘었다. IgG 클론의 경우, AMC 바이오센서를 사용하여 클론을 포획하고, 다중 농도의 인간 및 사이노 TIM-3-His에 침지시켰다. IgM 클론의 경우, 항-IgM mAb는 AR2G를 사용하여 바이오센서에서 커플링되고, 상기 바이오센서는 다중 농도의 인간 및 사이노 TIM-3-His에 침지시켰다. IgM 샘플 중 어느 것도 기준선보다 더 높은 결합 신호를 생성하지 않았다. 제1 라운드의 스크리닝 후, 인간 및 사이노 TIM-3 모두와 결합된 IgG 클론을 2가 인간 및 사이노 TIM-3-Fc의 2가 버전으로 재스크리닝하였다. 예시적인 항-TIM-3 항체의 서열은 서열 목록에 있다.
몇 개의 클론을 키메라화시키고, SEB-자극된 PBMC 검정에서 T 세포 결합에 대해 평가하였다. 인간 PBMC를 100 ng/mL SEB로 3일 동안 자극하였다. 자극 후, 세포를 4˚에서 30분 동안 지시된 시험품으로 처리하였다. CD3 세포 상의 결합을 항-인간-Fc 2차 항체로 검출하였고, 도 21에 나타냈다.
6. 하이브리도마로부터 유래된 구성요소 항체 도메인은 체크포인트 수용체/리간드 상호작용을 차단함
실시예 2e에 기재된 바와 같이, 체크포인트 수용체/리간드 상호작용의 차단은 T 세포 활성화에 필요하다. 하이브리도마로부터 유래된 도메인을 포함하는 예시적인 항체의 차단 능력은, 본 명세서에 제공된 대상 항체의 구성요소 항체 도메인이 체크포인트 수용체/리간드 상호작용을 차단할 수 있음을 보여주는 그래프에서 나타낸 바와 같이 세포 결합 검정 또는 옥텟을 사용하여 조사되었다. 특히, 1G6 항-PD-1 scFv 아암을 포함하는 이중특이적 항체는 PD-l/PD-Ll 및 PD-1/PD-L2 상호작용을 차단할 수 있으며; 7G8 항-LAG-3 하나의 아암은 LAG-3/MHC II 상호작용을 차단할 수 있으며; 예시적인 항-PD-1 Fab 아암을 포함하는 이중특이적 항체는 CTLA-4/CD80 및 CTLA-4/CD86 상호작용을 차단할 수 있으며; 9C6 항-BTLA Fab 아암을 포함하는 이중특이적 항체는 BTLA/HVEM 상호작용을 차단할 수 있다.
도 68.
PD-1을 외인성으로 발현시키는 HEK293T를 XENP20717과 인큐베이션하여 PD-L1 및 PD-L2에 의한 PD-1에 대한 결합을 용량 의존 방식으로 방지하였다. LAG-3을 XENP22606과 인큐베이션하여 MHC-II를 내인성으로 발현시키는 다우디 세포에 대한 그것의 결합을 방지하였다. CTLA-4를 XENP20066과 인큐베이션하여 CD80 및 CD86에 대한 잔존 결합을 방지하였다. BTLA를 XENP20895와 인큐베이션하여 HVEM에 대한 잔존 결합을 방지하였다.
D. 실시예 4: 친화성 및 안정성 최적화
1. 항-PD-1 mAb 1G6 및 2E9
실시예 3에서 생성된 항-PD-1 하이브리도마 클론 1G6 및 2E9는 이중특이적 면역 체크포인트 억제제에 사용하기 위한 scFv 또는 Fab와 관련하여 최적의 친화성 및 안정성을 갖도록 조작되었다. 클론은 우선 스트링 컨텐트 최적화(string content optimization)를 사용하여 인간화되었다 (예를 들어, 2010년 2월 2일자로 발행된, 미국 특허 번호 7,657,380 참조). 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA를 유전자 합성 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, Wash.)으로 생성하고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 발현 벡터 pTT5 내로 서브클로닝하였다. scFv의 C-말단은 폴리히스티딘 태그를 포함하였다. Fv 변이체의 라이브러리는 표준 돌연변이유발 (QuikChange, Stratagene, Cedar Creek, Tx.)에 의해 전장 2가, Fab-His 및/또는 scFv-His 포맷으로 작제되었다. 2가 mAb는 표준 단백질 A 크로마토그래피로 정제하고, Fab-His 및 scFv-His는 Ni-NTA 크로마토그래피로 정제하였다. 본 발명의 예시적인 1G6 및 2E9 2가 항체, Fab 및 scFv의 서열은 서열 목록에 열거된다 (Fab 및 scFv에 대해 폴리히스티딘 태그가 제거되었지만). 초기 스크린 후, 관심 변이체의 조합이 만들어졌고, 이들을 발현시키고, 정제하고, 친화성 및 안정성에 대해 재검사하였다.
2가 항체의 친화성 스크린은 옥텟을 사용하여 수행되었다. 항-인간 Fc (AHC) 바이오센서를 사용하여 시험품을 포획하고, KD 결정을 위해 다중 농도의 PD-l-His에 침지시켰다. scFv-His의 안정성은 시차 주사 형광측정법 (DSF)을 사용하여 평가되었다. DSF 실험은 바이오-래드 CFX 커넥트 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR Detection System)을 사용하여 수행되었다. 단백질을 사이프로(SYPRO) 오렌지 형광 염료와 혼합하고, PBS에서 0.2 mg/mL로 희석하였다. 사이프로 오렌지의 최종 농도는 1OX였다. 25℃의 초기 10분 인큐베이션 기간 후, 단백질을 1℃/min의 가열 속도를 사용하여 25℃에서 95℃로 가열하였다. 매 30초마다 형광을 측정하였다. 기기 소프트웨어를 사용하여 용융 온도 (Tm)을 계산하였다. 친화성 및 안정성 결과는 도 23에 나타냈다.
2. 항-CTLA-4 mAb
항-CTLA-4 항체의 모 가변 영역은 다양한 이중특이적 항체의 구성요소로서 사용하기 위해 조작되었다. 개선된 특성을 갖는 변이체를 식별하려는 시도를 위해 2가지 접근법을 채택하였다: (1) QuikChange (Stratagene, Cedar Creek, Tx.) 돌연변이유발을 통해 단일, 이중, 및 삼중 아미노산 치환이 이루어졌고, (2) 대안적인 인간 생식계열 (IGHV3-7, IGHV3-13, IGHV3-21, IGHV3-64, IGKV3D-20, IGKV3-15)과 교환된 프레임워크를 갖는 재-그라프팅된 서열은 DNA 합성 및 서브클로닝에 의해 작제되었다. 변이체 Fab 및 scFv를 설계하고, 발현시키고, 정제하였다. 인간 및 사이노 CTLA-4에 대한 친화성을 옥텟을 사용하여 Fab에 대해 측정하였다. AHC 바이오센서를 사용하여 인간 또는 사이노 CTLA-4의 Fc 융합물을 포획하고, KD 결정을 위해 다중 농도의 Fab 시험품에 침지시켰다. DSF를 사용하여 Fab 및 scFv 둘 모두에 대한 열 안정성을 측정하였다. 추가로, 적어도 하나의 인간 VH 또는 VL 생식계열과 정확히 매치한 서열 9-머의 수를 Fab 및 scFv 모두의 가변 영역에 대한 인간성의 척도로서 계수하였다 (예를 들어, 2010년 2월 2일자로 발행된 미국 특허 번호 7,657,380 참조). 초기 스크린 후, 관심 변이체의 조합이 만들어졌고, 이들을 발현시키고, 정제하고, 친화성 및 안정성에 대해 재검사하였다. 결과는 도 24에 요약된다. 몇 개의 변이체는 인간 및 사이노 CTLA-4 모두에 대해 유사한 친화성을 유지하면서 모 가변 영역의 열 안정성에 비해 열 안정성이 증가되었다. 추가로, 인간 생식계열 매칭 서열 9-머의 수에 의해 측정된 서열 인간성의 증가는 몇 개의 변이체에 대해 확인되었다. 바람직한 변이체는 다음을 포함한다: H0.25_L0, H0.26_L0, H0.27_L0, H0.29_L0, H0.38_L0, H0.39_L0, H0.40_L0, H0.70_L0, H0_L0.22, H2_L0, H3_L0, H3_L0.22, H3_L0.67, H3_L0.74, H3_L0.44, H3.4_L0.118, H3.4_L0.119, H3.4_L0.120, H3.4_L0.121, H3.4_L0.122, H3.4_L0.123, H3.4_L0.124, H3.4_L0.125, H3.4_L0.126, H3.4_L0.127, H3.4_L0.128, H3.4_L0.129, H3.4_L0.130, H3.4_L0.131, H3.4_L0.132, H3.5_L2.1, H3.5_L2.2, H3.5_L2.3, H3.21_L0.124, H3.21_L0.129, H3.21_L0.132, H3.23_L0.124, H3.23_L0.129, H3.23_L0.132, H3.25_L0.124, H3.25_L0.129, 및 H3.25_L0.132.
3. 항-BTLA mAb 9C6
실시예 3에서 생성된 항-BTLA 하이브리도마 클론 9C6을 인간화하고, 상기 실시예 4a에 일반적으로 기재된 바와 같이 2가 항체 포맷에서 최적의 친화성 및 안정성을 갖도록 조작하였다. 본 발명의 예시적인 항-BTLA 2가 항체의 서열은 서열 목록에 열거된다.
변이체 2가 항체에 대한 친화성 스크린은 옥텟을 사용하여 수행되었다. AHC 바이오센서를 사용하여 시험품을 포획하고, KD 결정을 위해 다중 농도의 BTLA-His를 포함한 웰들에 침지시켰다 (항-BTLA x 항-PD-1 키메라성 이중특이적 항체가 SEB 자극된 PBMC로부터 IFNγ 분비를 촉진시키는다 것을 보여주는 A 및 B에서 나타냄). PBMC를 3일 동안 10 ng/mL SEB로 자극하고, 지시된 시험품으로 처리하였다. 세포 상청액을 수집하고, 지시된 피분석물에 대해 MSD로 분석하였다. A: 20 μg/mL 시험품; B 5 μg/mL 시험품.
도 52).
4. 항-LAG-3 mAb 7G8 및 2A11
실시예 3에서 생성된 항-LAG-3 하이브리도마 클론 7G8 및 2A11을 인간화하고, 상기 실시예 4a에 일반적으로 기재된 바와 같이 이중특이적 면역 체크포인트 억제제에 사용하기 위한 Fab와 관련하여 최적의 친화성 및 안정성을 갖도록 조작하였다. 본 발명의 예시적인 항-BTLA 2가 항체 및 Fab의 서열은 서열 목록에 열거된다.
변이체 항-LAG-3 Fab에 대한 친화성 및 안정성을 상기 실시예 4a에 일반적으로 기재된 바와 같이 결정하였다. AMC 바이오센서를 사용하여 인간 LAG-3의 마우스 Fc 융합물을 포획하고, KD 결정을 위해 다중 농도의 시험품을 함유하는 웰들에 침지시켰다. 결과는 2A11 변이체에 대해 도 53에 그리고 7G8 변이체에 대해 도 54에 나타냈다.
예시적인 변이체 2A11 및 7G8 항-LAG-3 2가 항체는 MHC-II를 내인성으로 발현시키는 다우디 세포에 대한 LAG-3 결합을 차단하는 능력에 대해 추가로 스크리닝되었다. 1 μg의 LAG-3-mFc를 실온에서 30분 동안 지시된 농도의 mAb와 혼합하였다. 그 다음 다우디 세포를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. LAG-3-mFc 결합을 항-쥣과-Fc 2차 항체로 검출하였다. 데이터는 도 63에 나타냈다.
5. 항-TIM-3 mAb
실시예 3에서 생성된 항-TIM-3 하이브리도마 클론을 인간화하고, 상기 실시예 4a에 일반적으로 기재된 바와 같이 2가 항체 포맷에서 최적의 친화성 및 안정성을 갖도록 조작하였다. 본 발명의 예시적인 항-TIM-3 2가 항체의 서열은 서열 목록에 열거된다.
변이체 2가 항체에 대한 친화성 스크린은 옥텟을 사용하여 수행되었다. AHC 바이오센서를 사용하여 시험품을 포획하고, KD 결정을 위해 다중 농도의 TIM-3-His를 포함한 웰들에 침지시켰다 (도 22에 나타냄).
최적화된 변이체를 또한 SEB-자극된 PBMC 검정에서 T 세포 결합에 대해 시험하였다. 인간 PBMC를 100 ng/mL SEB로 72시간 동안 자극하였다. 자극 후, 세포를 지시된 시험품으로 처리하였다. CD3+ 세포 상의 3H3_H1_L2.1 (XENP21189)의 결합을 항-인간-Fc 2차 항체로 검출하였고, 도 21에 나타냈다. CD3 세포 상의 7B11_HJ1_L1.1 (XENP21196)의 결합을 항-인간-IgG-APC 2차 항체로 검출하였고, 도 21에 나타냈다.
6. 변이체 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 Fab-scFv 이중특이적 항체의 친화성 스크린
실시예 4b에 기재된 예시적인 항-CTLA-4 scFv 및 실시예 4d에 기재된 최적화된 항-LAG-3 2가 항체로부터 유래된 항-LAG-3 Fab를 포함하는 이중특이적 항체를 일반적으로 상기 기재된 바와 같이 옥텟을 사용하여 친화성에 대해 스크리닝하였다. 구체적으로, AMC 또는 HIS1K 바이오센서를 사용하여 인간 LAG-3의 마우스 Fc 융합물 또는 인간 LAG-3의 His-Avi 태그된 TEV-Fc 융합물을 포획하고, KD 결정을 위해 시험품을 포함하는 웰에 침지시켰다. 결과는 도 55에 나타냈다.
7. 변이체 항-LAG-3 x 항-PD-1 Fab-scFv 이중특이적 항체의 친화성 스크린.
실시예 4a에 기재된 예시적인 항-PD-1 scFv 및 실시예 4d에 기재된 최적화된 항-LAG-3 2가 항체로부터 유래된 항-LAG-3 Fab를 포함하는 이중특이적 항체를 일반적으로 상기 기재된 바와 같이 옥텟을 사용하여 친화성에 대해 스크리닝하였다. 구체적으로, AMC 또는 HIS1K 바이오센서를 사용하여 인간 LAG-3의 마우스 Fc 융합물 또는 인간 LAG-3의 His-Avi 태그된 TEV-Fc 융합물을 포획하고, KD 결정을 위해 시험품을 포함하는 웰에 침지시켰다. 결과는 도 61에 나타냈다.
E. 실시예 5: 친화성 및 안정성 최적화된 아암을 갖는 이중특이적 면역 체크포인트 항체의 시험관내 평가
1. 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체
a. 이중특이적 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체는 PD-1이 PD-L1 및 PD-L2와 상호작용하는 것을 차단함
PD-1을 발현시키는 HEK293T 세포를 4℃에서 30분 동안 XENP20717 (항-PD-1 x 항-CTLA-4) 및 하나의-아암 항-PD-1 및 항-CTLA-4 대조군 (각각 XENP20111 및 XENP20059)과 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, PD-Ll-mFc 또는 PD-L2-mFc를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 추가로 인큐베이션하였다. PD-L1-mFc 및 PD-L2-mFc를 항-쥣과-IgG 2차 항체로 검출하였다.
도 45는 XENP20717이 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 용량 의존 방식으로 차단할 수 있었음을 보여준다. XENP20111은 또한 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 차단할 수 있었지만, XENP20559는 그것의 리간드에 대한 PD-1 결합을 차단하지 못했다.
b. CD3+ 세포 상에 이중특이적 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체의 T 세포 결합
인간 PBMC를 500 ng/mL SEB로 3일 동안 자극하고, 배양 배지에서 2회 세정하고, 그 다음 500 ng/mL SEB로 추가 24시간 동안 재-자극하였다. 그 다음 PBMC를 4℃에서 30분 동안 XENP20717 (항-CTLA-4 x 항-PD-1)로 처리하였다. 처리 후, PBMC를 세정하고, 항-CD3-FITC (UCHT1) mAb를 갖는 CD3+ 세포 상의 항-인간-Fc-(Fab 단편 특이적)-APC 2차 항체 (Jackson Labs)와 인큐베이션하였다. 그 다음 PBMC를 2회 세정하고, 유세포측정법으로 분석하였다. 도 45는 7개의 고유한 PBMC 공여체의 평균 MFI를 나타내며, CD3+ T 세포 상에 XENP20717의 결합을 보여주며, 그 결합은 용량-의존 방식이었다.
c. T 세포 활성화에 대한 변이체 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체의 평가
변이체 항-CTLA-4 Fab 아암을 갖는 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체를 MLR 검정에서 시험하였다. 등몰 PD-1 결합 농도에 대해 혼합된 PBMC를 69.5 nM의 2가 항체 (예를 들어 니볼루맙) 또는 139 nM의 이중특이적 항체 (예를 들어 XENP16004)로 처리하였다. 데이터는 일부 항-CTLA-4 Fab 스크리닝 결과를 나타낸다. 이것은 Fab 및 scFv 구현예에 대한 XENP 코드, vh 및 vl 조작된 도메인의 명칭, 옥텟에 의해 측정된 인간 및 사이노 CTLA-4에 대한 KD 결합 상수, 및 scFv 및 Fab의 Tm을 나타낸다. 추가로, 적어도 하나의 인간 VH 또는 VL 생식계열에 정확히 매치된 서열 9-머의 수는 Fab 및 scFv 둘 모두의 가변 영역에 대한 인간성의 척도로서 묘사된다.
도 25b는 다수의 이중특이적 항체가 니볼루맙 단독보다 우수한 IL-2 유도를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
SEB-자극된 PBMC 검정에서, PBMC를 500 ng/mL SEB로 2일 동안 처리하였다. 그 다음 세포를 세정하고, 20 μg/mL의 XENP16432 (니볼루맙) 또는 XENP20717 및 500 ng/mL SEB로 처리하였다. 상청액을 T 세포 활성화의 지표로서 IL-2에 대해 분석하였다. 도 69에 나타낸 데이터는, 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체가 니볼루맙 단독보다 상당히 더 많은 IL-2 방출을 유도한다는 것을 보여준다.
또 다른 연구에서, XENP16432, XENP20717 및 하나의-아암 조합 대조군을 SEB-자극된 PBMC 검정에서 시험하였다. PBMC를 500 ng/mL SEB로 2일 동안 자극하였다. 그 다음 세포를 PBS로 1회 세정하고, 그 다음 20 μg/mL의 지시된 시험품 및 500 ng/mL SEB를 포함한 배양 배지를 첨가하였다. 상청액을 24시간 후 수집하고, IL-2에 대해 분석하였다. SEB 자극이 없는 대조 실험에서는, PBMC를 지시된 시험품으로 3일 동안 처리한 후 상청액을 IL-2에 대해 분석하였다. IL-2 농도의 배수-변화는 도 45a-c에 도시된다. 도 45b에서 나타낸 바와 같이, XENP20717은 니볼루맙보다 IL-2 분비를 상당히 더 향상시켰다. 데이터는, XENP20717이 항-PD-1 2가 단독 뿐만 아니라 하나의-아암 항-PD-1 및 하나의-아암 항-CTLA-4의 조합보다 T 세포를 더 강하게 활성화시킨다는 것을 보여주며, 이는 다중 면역 체크포인트 수용체를 발현시키는 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 이점을 입증한다. 현저하게, 그리고 실시예 2b에 기재된 발견과 일치하게, 이중특이적 XENP20717은 XENP20717로부터 유래된 하나의-아암 항체의 조합보다 IL-2 분비를 크게 향상시켰다.
항-CTLA-4 scFv 아암 및 변이체 2E9 항-PD-1 Fab 아암을 갖는 CTLA-4 및 PD-1을 표적화하는 추가의 이중특이적 항체 및 대조 시험품을 SEB-자극된 PBMC 검정에서 시험하였다. 인간 PBMC를 100 ng/mL SEB로 2일 동안 자극하였다. 세포를 세정하고, 20 μg/mL의 지시된 시험품과 함께 100 ng/mL SEB로 재자극하였다. 상청액을 처리 24시간 후 IL-2 및 IFNγ에 대해 분석하였다 (각각 도 19a 및 19b에 도시됨).
2. 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 체크포인트 항체의 시험관내 평가
a. T 세포 활성화에 대한 변이체 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체의 평가
SEB-자극된 PBMC 검정에서, PBMC를 500 ng/mL SEB로 2일 동안 처리하였다. 그 다음 세포를 세정하고, 20 μg/mL의 XENP16432 (니볼루맙) 또는 XENP22604 및 500 ng/mL SEB로 처리하였다. 상청액을 T 세포 활성화의 지표로서 IL-2에 대해 분석하였다 (도 69에 도시됨).
최적화된 2A11 항-LAG-3 Fab 아암 (실시예 4에 기재된 바와 같이 생성된 변이체 mAb로부터 유래됨)을 갖는 추가의 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체를 또한 SEB-자극된 PBMC 검정에서 T 세포 활성화에 대해 평가하였다. 다중 공여체로부터의 인간 PBMC를 500 ng/ml의 SEB로 2일 동안 자극하였다. 그 다음 세포를 배양 배지에서 2회 세정하고, 10 μg/mL의 지시된 시험품과 함께 500 ng/mL SEB로 자극하였다. 처리 24시간 후, 세포 상청액을 IL-2 및 IFNγ에 대해 분석하였다. 누맥스 2가에 대한 IL-2 및 IFNγ의 배수 증가에 대한 데이터를 도 64에서 나타냈다. 각각의 점은 기술 단일항(technical singlet)에 표시된 공여체를 나타낸다.
데이터는, 다수의 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체가 니볼루맙 단독 또는 항-LAG-3 2가 단독보다 T 세포를 더 강하게 활성화시킨다는 것을 보여준다.
3. 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 체크포인트 항체의 시험관내 평가
a. CD3+ 세포 상의 이중특이적 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체의 T 세포 결합
최적화된 항- BTLA Fab 아암 (실시예 4에 기재된 바와 같이 생성된 변이체 mAb로부터 유래됨)을 갖는 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체를 T 세포 상의 결합에 대해 평가하였다. 인간 PBMC를 100 ng/mL SEB로 3일 동안 자극하고, 그 후 PBMC를 4℃에서 30분 동안 지시된 시험품으로 처리하였다. 그 다음 PBMC를 4℃에서 30분 동안 항-인간-Fc 2차 항체와 인큐베이션하였다. 도 47은 CD3+ 세포 상의 지시된 시험품의 결합을 보여준다.
데이터는, 본 발명의 항-PD-1 x 항-BTLA 이중특이적 체크포인트 항체 (예를 들어 XENP20895, XENP21220 및 XENP21221)가 하나의-아암의 대조군 (예를 들어 XENP21446 및 XENP16011)과 비교하여 T-세포에 더 열렬히 결합한다는 것을 보여준다. 이것은 인간 T 세포에 대한 결합이 1가, 단일특이적 항체 예컨대 하나의-아암의 대조군보다 이중 특이적 항체 (각각의 아암은 상이한 항원에 1가 결합함)에서 일반적으로 더 낫다는 것을 입증한다.
b. T 세포 활성화에 대한 변이체 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체의 평가
원형 항-BTLA (예를 들어 4C7, 8D5 및 E8D9) 및 9C6 Fab 아암을 갖는 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체를 SEB-자극된 PBMC 검정에서 T 세포 활성화에 대해 평가하였다. 다중 공여체로부터의 인간 PBMC를 5 μg/mL 또는 20 μg/mL의 지시된 시험품과 함께 10 ng/ml의 SEB로 72시간 동안 자극하였다. 처리 후, 세포 상청액을 각각 도 1j 및 1k에 나타낸, ELISA에 의해 IL-2 및 IFNγ에 대해 분석하였다. 데이터는, 9C6 하이브리도마 유래된 아암을 포함하는 이중특이적 항체가 T 세포 활성화를 항-PD-1 2가 단독보다 더 크게 향상시킬 뿐만 아니라 원형 항-BTLA Fab 아암을 갖는 이중특이적 항체보다 더 크게 향상시켰음을 보여준다.
예시적인 항-BTLA x 항-PD-1 XENP21220 및 XENP16432 (니볼루맙)을 SEB-자극된 PBMC 검정에서 평가하였다. PBMC를 500 ng/mL SEB로 2일 동안 처리하였다. 그 다음 세포를 세정하고, 20 μg/mL의 XENP16432 또는 XENP21220 및 500 ng/mL SEB로 처리하였다. 상청액을 T 세포 활성화의 지표로서 IL-2에 대해 분석하였다 (도 69에 도시됨).
변이체 9C6 항-BTLA Fab 아암 및 하나의-아암 변이체 9C6 항체를 갖는 추가의 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체 (단독 및 하나의-아암 항-PD-1 항체와 함께)를 상기에 기재된 바와 같이 SEB-자극된 PBMC 검정에서 T 세포 활성화에 대해 평가하였다. PBS로의 처리에 대한 IL-2 및 IFNγ 분비의 배수 증가에 대한 데이터를 도 1l에 나타냈다.
4. 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 체크포인트 항체의 시험관내 평가
a. CD3+ 세포 상의 이중특이적 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체의 T 세포 결합
변이체 항-LAG-3 Fab 아암 및 하나의-아암 변이체 항-LAG-3 항체를 갖는 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체를 T 세포 상의 결합에 대해 평가하였다. 인간 PBMC를 100 ng/mL SEB로 3일 동안 자극하고, 그 후 PBMC를 4℃에서 30분 동안 지시된 시험품으로 처리하였다. 처리 후, PBMC를 4℃에서 30분 동안 항-CD3-FITC 및 항-인간-Fc-APC 항체와 인큐베이션하였다. 그 다음 PBMC를 2회 세정하고, 유세포측정법으로 분석하였다. 도 56은 CD3+ T 세포 상의 지시된 시험품의 결합을 보여준다.
데이터는, 본 발명의 수많은 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 체크포인트 항체 (예를 들어 XENP22505 및 XENP21896)가 하나의-아암의 대조군 (예를 들어 XENP22516)과 비교하여 T-세포에 더 열렬히 결합한다는 것을 보여준다. 이것은 인간 T 세포에 대한 결합이 1가, 단일특이적 항체 예컨대 하나의-아암의 대조군보다 이중 특이적 항체 (각각의 아암은 상이한 항원에 1가 결합함)에서 더 나을 수 있다는 것을 입증한다.
b. 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화
항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체를 MLR 및 SEB-자극된 PBMC 검정에서 T 세포 활성화에 대해 평가하였다.
40 MLR 반응은 20 μg/mL의 지시된 시험품의 존재 하에 이루어졌으며, 세포 상청액을 처리 6일 후 IL-2 및 IFNγ에 대해 분석하였다. 도 59는 항-RSV 2가 (XENP 15074)에 대한 IL-2 및 IFNγ의 배수 유도를 도시한다.
SEB-자극된 PBMC 검정에서, PBMC를 500 ng/mL SEB로 2일 동안 처리하였다. 그 다음 세포를 세정하고, 20 μg/mL의 XENP16432 (니볼루맙), XENP22602 또는 XENP16432와 XENP22602의 조합 및 500 ng/mL SEB로 처리하였다. 상청액을 T 세포 활성화의 지표로서 IL-2에 대해 분석하였다 (도 69에 도시됨).
또 다른 SEB-자극된 PBMC 검정에서, 추가의 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체를 평가하였다. 다중 공여체로부터의 인간 PBMC를 500 ng/ml의 SEB로 2일 동안 자극하였다. 그 다음 세포를 배양 배지에서 2회 세정하고, 20 μg/mL의 지시된 시험품과 함께 500 ng/mL SEB로 자극하였다. 처리 24시간 후, 세포 상청액을 IL-2 및 IFNγ에 대해 분석하였다. 누맥스 2가에 대한 IL-2 및 IFNγ의 배수 증가에 대한 데이터를 도 57 및 도 58 및 도 60에서 나타냈다. 각각의 점은 기술 단일항에 표시된 공여체를 나타낸다.
데이터는, 항-PD-1 2가 및 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체의 조합이 T 세포 활성화에서 상승작용 효과를 발휘한다는 것을 보여준다는 것에서 실시예 2d와 일치한다. 또한, 데이터는, 7G8 기반 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체가 2A11 기반 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체보다 PBMC에 대해 더 선택적 기능을 나타냄을 보여준다.
F. 실시예 6: 이중특이적 면역 체크포인트 항체의 생체내 평가
1. 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체는 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 및 질환 활성을 향상시킴
몇몇 GVHD 연구에서, 본 발명의 예시적인 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체는 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 및 질환 활성을 향상시키는 것으로 나타났다.
제1 연구에서, 0일에 천 만개의 인간 PBMC를 IV-OSP를 통해 NSG 마우스 내로 생착시켰다. 1일에, 상기 마우스에 XENP16432 (2.89 mg/kg), XENP20053 (2 mg/kg) 및 XENP16432와 XENP16433 (2.89 + 2.92 mg/kg)의 조합을 투약하였다. CD45+ 세포 카운트를 14일에 측정하였다 (도 70에 도시됨).
변이체 항-CTLA-4 Fab 및 항-PD-1 scFv 아암을 갖는 추가의 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체를 평가하였다. 0일에 천 만개의 인간 PBMC를 IV-OSP를 통해 NSG 마우스 내로 생착시키고, 이어서 1일에 지시된 시험품 (5 mg/kg 또는 지시한 대로)으로 투약하였다. 14일에 CD45+ 카운트를 측정하였다 (도 1qa, 도 1ra 및 도 1s). GVHD의 추가의 지표로서 IFNγ 수준이 또한 측정되었고, CD45+ 세포 수준에 대해 플롯팅되었다 (변이체 항-CTLA-4 Fab 아암 및 변이체 항-PD-1 scFv 아암을 갖는 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체, 뿐만 아니라 니볼루맙 단독, 이필리무맙 단독, 및 대조군으로서 니볼루맙 및 이필리무맙에 기반한 원형 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 IL-2 방출의 향상을 보이는 혼합된 림프구 반응을 나타냄).
도 27 및 도 30).
데이터는, 본 발명의 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 체크포인트 항체가 대조군 (PBS + PBMC)과 비교하여 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 CD45+ 세포의 증식을 향상시킨다는 것을 보여준다. 또한, 니볼루맙 (XENP16432) 단독으로 나타낸 것보다 본 발명의 항체를 사용하는 것이 더 큰 향상을 나타낸다. 도 31은 연구 160314 (도 26에 제시됨) 및 160331 (도 29에 제시됨) 사이에 CD45+ 세포 증식에 대한 시험품 효과의 비교를 보여준다. 두 연구 모두 니볼루맙 단독에 비해 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 체크포인트 항체의 우수성을 일관되게 입증한다.
또 다른 연구에서, Xtend Fc를 갖는 항-CTLA-4 x 항-PD-1 이중특이적 항체를 평가하였다. PBMC-생착된 마우스에 지시된 농도의 지시된 시험품을 투약하고, CD45+, CD4+ 및 CD8+ 사건을 14일에 측정하였다 (도 20에 도시됨).
2. 항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 항체는 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 및 질환 활성을 향상시킴
제1 연구에서, 0일에 천 만개의 인간 PBMC를 IV-OSP를 통해 NSG 마우스 내로 생착시켰다. 1일에, 상기 마우스에 XENP16432 (2.89 mg/kg) 및 XENP20895 (5 mg/kg)를 투약하였다. CD45+ 세포 카운트를 14일에 측정하였다 (도 70에 도시됨).
항-BTLA x 항-PD-1 이중특이적 XENP20895를 제2 GVHD 연구에서 평가하였다. 0일에 천 만개의 인간 PBMC를 IV-OSP를 통해 NSG 마우스 내로 생착시키고, 이어서 1일에 지시된 시험품 (지시된 농도에서)으로 투약하였다. 10, 14 및 22일에 CD45+ 세포 카운트를 측정하였다 (각각 도 51에 도시됨).
3. 항-LAG-3 x 항-PD-1 이중특이적 항체는 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 및 질환 활성을 향상시킴
GVHD에서, 0일에 천 만개의 인간 PBMC를 IV-OSP를 통해 NSG 마우스 내로 생착시켰다. 1일에, 상기 마우스에 XENP16432 (2.89 mg/kg) 및 XENP22672 (5 mg/kg)를 투약하였다. CD45+ 세포 카운트를 14일에 측정하였다 (도 70에 도시됨).
실시예 6a에 기재된 제2 연구에서, 또 다른 예시적인 항-LAG-3 x 항-PD-1 (XENP22847)을 또한 평가하였다 (도 20c).
4. 항-LAG-3 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체는 인간 PBMC-생착된 NSG 마우스에서 생착 및 질환 활성을 향상시킴
GVHD에서, 0일에 천 만개의 인간 PBMC를 IV-OSP를 통해 NSG 마우스 내로 생착시켰다. 1일에, 상기 마우스에 XENP16432 (2.89 mg/kg), XENP22675 (5 mg/kg) 및 XENP16432 및 XENP22675 (5 + 5 mg/kg)의 조합을 투약하였다. CD45+ 세포 카운트를 14일에 측정하였다 (도 70에 도시됨).
데이터는, XENP22675가 니볼루맙 단독으로의 투약에 비해 생착 및 질환 활성을 향상시킨다는 것을 보여준다. 현저하게, 니볼루맙과 병용된 XENP22675는 상승적으로 작용하여 생착을 추가로 향상시킨다.
G. 실시예 7: 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체는 KG1A-luc 암 세포 및 인간 PBMC로 생착된 NSG 마우스에서 항종양 활성을 나타냄
NOD SCID 감마 (NSG) 마우스를 0일에 KG1A-luc 암 세포로 생착시켰다. 21일에, 인간 PBMC를 마우스에 복강내로 생착시켰다. PBMC 생착 후, 지시된 시험품을 복강내 주사로 매주 투약하였다 (대조군은 PBS로 투약됨). 종양 성장은 생체내 영상 시스템 (IVIS® Lumina III)을 사용하여 마우스당 총 플럭스를 측정함으로써 모니터링하고, 데이터는 도 71에 나타냈다 (제1 투약 후 일)
XIII. 참고에 의한 편입
USSN 62/420,500으로부터의 "항-CTLA-4", 청구항 세트 A1 내지 A30, "항-PD-1", 청구항 세트 B1 내지 B30, "항-LAG-3", 청구항 세트 C1 내지 C28, "항-TIM-3", 청구항 세트 D1 내지 D28, "항-TIGIT", 청구항 세트 E1 내지 E28, "항-BTLA" 청구항 세트 F1 내지 F28, "백본 플러스 Fv", 청구항 세트 Y1 내지 Y5, 및 "특정 분자", 청구항 세트 X1 내지 X16의 청구항 세트는 그 전문이 참고로 명확히 편입되어 있다.

Claims (9)

  1. 이종이량체성 항체로서,
    a) 하기를 포함하는 제1 중쇄:
    i) 제1 변이체 Fc 도메인; 및
    ii) 제1 항원에 결합하는 단일 사슬 Fv 영역 (scFv)으로서, 상기 scFv 영역은 제1 가변 중질 도메인, 제1 가변 경질 도메인 및 하전된 scFv 링커를 포함하고, 상기 하전된 scFv 링커는 상기 제1 가변 중질 도메인 및 상기 가변 경질 도메인에 공유결합된, 단일 사슬 Fv 영역; 및
    b) VH-CH1-힌지-CH2-CH3 모노머를 포함하는 제2 중쇄로서, VH는 제2 가변 중질 도메인이고, CH2-CH3은 제2 변이체 Fc 도메인인, 제2 중쇄; 및
    c) 제2 가변 경질 도메인 및 경질 불변 도메인을 포함하는 경쇄
    를 포함하고,
    여기서 상기 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N241D를 포함하고, 상기 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고; 상기 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 S364K/E357Q를 포함하고, 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 L368D/K370S를 포함하고, 상기 제1 가변 중질 도메인 및 제1 가변 경질 도메인은 서열 번호: 11376 및 서열 번호: 11377, 서열 번호:22970 및 서열 번호:22971, 서열 번호: 11394 및 서열 번호: 11395, 서열 번호: 11367 및 서열 번호: 11368 및 서열 번호: 11412 및 서열 번호: 11413을 포함하는 세트로부터 선택되고, 여기서 넘버링은 카밧(Kabat)에서와 같이 EU 인덱스에 따르는, 이종이량체성 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 제2 중쇄의 CH1-힌지-CH2-CH3 구성요소는 서열 번호:37725를 갖고, 상기 제1 변이체 Fc 도메인은 서열 번호:37726을 갖고, 상기 불변 경질 도메인은 서열 번호:37727을 갖는, 이종이량체성 항체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 제2 가변 중질 도메인 및 상기 제2 가변 경질 도메인은 그룹 인간 CTLA-4, 인간 LAG-3, 인간 TIM-3 및 인간 TIGIT로부터의 인간 체크포인트 수용체에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하는, 이종이량체성 항체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가변 중질 도메인은 서열 번호: 11394를 갖고, 제1 가변 경질 도메인은 서열 번호: 11395를 갖는, 이종이량체성 항체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄는 서열 번호:23581을 갖고, 상기 제2 중쇄는 서열 번호: 23576을 갖고, 상기 경쇄는 서열 번호:23591을 갖는, 이종이량체성 항체.
  6. 핵산 조성물로서, 각각
    a) 청구항 1 내지 5의 상기 제1 중쇄를 인코딩하는 제1 핵산;
    b) 청구항 1 내지 5의 상기 제2 중쇄를 인코딩하는 제2 핵산; 및
    c) 청구항 1 내지 5의 상기 경쇄를 인코딩하는 제3 핵산
    을 포함하는, 핵산 조성물
  7. 발현 벡터 조성물로서,
    a) 청구항 6의 상기 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
    b) 청구항 6의 상기 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
    c) 청구항 6의 상기 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터
    를 포함하는, 발현 벡터 조성물.
  8. 청구항 7의 상기 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  9. 청구항 8의 상기 숙주 세포를, 상기 항체가 발현되는 조건하에 배양하는 단계, 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 5에 따른 이종이량체성 항체의 제조 방법.
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