KR101247908B1 - 항-ｆｃ-감마 ｒｉｉｂ 수용체 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항-ｆｃ-감마 ｒｉｉｂ 수용체 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원은 다른 인간 FcγR, 예를 들어 인간 FcγRIIA에 거의 또는 전혀 결합하지 않으면서 인간 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체를 설명한다. 본 발명은 또한 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체, 및 활성화 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 항체를 포함하는 단리된 이중특이적 항체를 제공한다. 항-종양 항체의 투여, 및 면역 반응을 억제하고 히스타민 방출을 억제하는 방법을 포함하여 이들 항체에 대한 각종 용도 (치료 용도 포함)가 또한 설명된다.
인간 FcγR, 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIB, 항체, 활성화 수용체, 이중특이적 항체

Description

항-ＦＣ-감마 ＲＩＩＢ 수용체 항체 및 그의 용도{ANTI-FC-GAMMA RIIB RECEPTOR ANTIBODY AND USES THEREFOR}
본원은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 2005년 9월 2일 출원된 미국 가출원 60/606,851의 미국 특허법 35 USC §119(e) 하의 우선권을 주장하면서 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 정규 출원이다.
본 발명은 인간 FcγRIIA보다 인간 FcγRIIB에 우선적으로 결합하는 항체 및 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
항체는 항원에 결합하여 그의 내인성 표적 (예를 들어 수용체 또는 리간드)에 대한 항원의 결합을 억제하거나 항원 제거를 야기하는 효과기 반응을 유도함으로써 항원을 중화시킨다. 신체에 대해 외래 물질인 항원을 효율적으로 제거 및(또는) 파괴하기 위해서, 항체는 그의 항원에 대한 높은 친화도 및 효율적인 효과기 기능을 모두 보여야 한다. 다중특이성을 갖는 항체 (예를 들어 이중특이적 항체)는 여러 항원의 상보적인 또는 상승적인 반응 매개에 유용하다.
항체 효과기 기능은 항체 Fc 영역에 의해 매개된다. 효과기 기능은 2개의 카테고리로 분류된다: (1) 항체의 항원에 대한 결합 후에 작용하는 효과기 기능 (이 기능은 보체 캐스케이드 또는 Fc 수용체 (FcR) 함유 세포의 참여를 수반한다) ; 및 (2) 항원 결합과 무관하게 작용하는 효과기 기능 (이 기능은 순환계에서 항체의 존속 및 트랜스사이토시스 (transcytosis)에 의해 세포 장벽을 가로질러 전달되는 그의 능력을 부여한다) (예를 들어, Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunology 2:77-94 참조). 항체 및 항체-항원 복합체와 면역계 세포의 상호작용은 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)과 같은 반응을 야기한다 (Daeron, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234; Ward et al., 상기 문헌; Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492; 및 Ravetch et al., 2000, Science 290:84-89).
Fc 수용체는 수용체의 동족 (cognate) 항체의 Fc 영역에 결합함으로써 항체 효과기 기능을 매개하기 때문에, FcR은 면역글로불린 이소형(isotype)에 대한 그의 특이성에 의해 규정된다. IgG 항체에 특이적인 Fc 수용체는 FcγR로 언급되고; IgE 항체에 특이적인 Fc 수용체는 FcεR로 언급되고; IgA 항체에 특이적인 Fc 수용체는 FcαR로 언급된다.
FcγR의 3개의 서브클래스, 즉 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)가 확인되었다. 각각의 FcγR 서브클래스는 교대 RNA 스플라이싱을 거쳐 다중 전사체 및 FcγR 이소형의 큰 다양성의 존재를 야기하는 2 또는 3개의 유전자에 의해 코딩된다. 인간 FcγRI 서브클래스 (FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc)를 코딩하는 3개의 유전자는 염색체 1의 긴 암의 구역 1q21.1에 클러스터링되고; 인간 FcγRII 이소형 (FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIc)을 코딩하는 유전자는 구역 1q23-24에 클러스터링되고; 인간 FcγRIII (FcγRIIIa 및 FcγRIIIb)를 코딩하는 2개의 유 전자는 구역 1q22에 클러스터링된다. FcγRIIC는 FcγRIIA 및 FcγRIIB 사이의 불균등한 유전자 교차로부터 형성되고, FcγRIIB의 세포외 구역 및 FcγRIIA의 세포질 구역으로 이루어진다.
FcγRIIA는 트랜스멤브레인 수용체 FcγRIIA1을 코딩한다. 교대 RNA 스플라이싱은 트랜스멤브레인 구역이 결여된 FcγRIIA2를 생성시킨다. FcγRIIA 유전자의 대립유전자 변이체는 IgG에 결합하는 능력이 상이한 고반응 (HR) 또는 저반응 (LR) 분자를 생성시킨다. HR 및 LR FcγRIIA 분자는 위치 27 및 131에 대응하는 2개의 아미노산에서 상이하다. FcγRIIB는 스플라이스 (splice) 변이체 FcγRIIB1, FcγRIIB2 및 FcγRIIB3을 코딩한다. FcγRIIB1 및 FcγRIIB2는 FcγRIIB1의 세포질 도메인 내의 19개 아미노산 삽입에 의해 상이하고; FcγRIIB3은 FcγRIIB2와 동일하지만, 추정 시그날 펩티다제 절단 부위에 대한 정보가 결여되어 있다.
또한, 수용체는 IgG에 대한 그의 친화도에 의해 구분된다. FcγRI은 IgG에 대한 높은 친화도 (Ka =108-109M-1)를 보이고 (Ravetch et al., 2001, Ann. Rev. Immunol. 19:275-290), 단량체 IgG에 결합할 수 있다. 이와 대조적으로, FcγRII 및 FcγRIII은 단량체 IgG에 대한 비교적 약한 친화도 (Ka ≤107M-1)를 보이고 (Ravetch et al., 상기 문헌), 단지 다량체 면역복합체와만 효과적으로 상호작용한다. 상이한 FcγR 아형은 상이한 세포 종류 상에서 발현된다 (Ravetch, J.V. et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492). 예를 들어, 단지 FcγRIIIA만이 NK 세포 상에서 발현된다. 항체의 상기 수용체에 대한 결합은 NK 세포에 전형적인 ADCC 활성을 야기한다. 인간 FcγRIIIB는 호중구에서만 발견되는 반면에, FcγRIIIA는 대식세포, 단핵구, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 T-세포의 하위 집단 상에서 발견된다. 다른 한편으로, 단량체 IgG에 대한 낮은 친화도를 갖는 FcγRII 수용체는 가장 널리 분포된 FcR이고, 대체로 동일한 세포 상에서 동시 발현된다. FcγRII (CD32에 의해 코딩됨)는 B 세포, 단핵구, 과립구, 비만 세포 및 혈소판 상에서 강하게 발현되지만, 몇몇 T 세포는 수용체를 보다 낮은 수준으로 발현한다 (Mantzioris, B. X. et al., 1993, J. Immunol. 150:5175-5184; 및 Zola, H. et al., 2000, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 14:311-316). 예를 들어, 인간 FcγRIIB 수용체는 B 세포, 골수 세포 및 비만 세포 상에 우세하게 분포된다 (Ravetch J.V. and et al., 2000, Science 290:84-89).
FcγRIIA 및 FcγRIIB 이소형은 매우 유사한 세포외 도메인 (약 92% 아미노산 서열 동일성)을 포함하지만, 세포질 구역에서 상이하여 "활성화 수용체" (FcγRIIA) 및 "억제 수용체" (FcγRIIB)로서의 기능적 차이를 야기한다. FcγRI 및 FcγRIII 수용체는 또한 활성화 수용체로서 기능한다. 상기 활성화 수용체는 세포질 도메인에 19개 아미노산의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. ITAM 서열은 티로신 키나제의 src 및 syk 패밀리의 활성화를 촉발시키고, 이는 다시 다양한 세포 매개체, 예를 들어 P13K, PLCγ 및 Tec 키나제를 활성화시킨다. 상기 활성화의 순수한 결과는 소포체 저장물로부터 세포내 칼슘 방출을 증가시키고 용량 결합 (capacitance-coupled) 칼슘 채널을 개방시켜 지속적인 칼슘 반응을 생 성시키는 것이다. 상기 칼슘 유동은 과립 함유물의 세포외 유출, 포식작용 (phagocytosis)의 자극, ADCC 반응 및 특이적인 핵 전사 인자의 활성화에 중요하다.
FcγR 활성화에 의해 매개되는 세포 반응은 주변 관용성 (peripheral tolerance)의 유지, 활성화 반응 역치의 조절에서 및 최종적으로 IgG 매개 효과기 자극의 종결시에 억제성 FcγRIIB 수용체에 의해 조절된다 (Ravetch, J.V. et al., Annu. Rev. Immunol. 19:275-290 (2001)). 상기 조절은 항원-IgG 항체 면역복합체를 통한 활성화 수용체와 억제성 FcγRIIB 수용체의 가교결합에 의해 개시된다 (예를 들어, Ravetch, J.V. et al., 2000, 상기 문헌 참조). ITAM 함유 활성화 수용체의 가교결합은 FcγRIIB 세포질 도메인에서 13개 아미노산의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM) 내의 티로신 인산화를 야기한다. 상기 FcγRIIB의 "활성화"는 특이적인 SH2 함유 이노시톨 폴리포스페이트-5-포스파타제 (SHIP)의 동원을 개시시킨다. SHIP은 막 이노시톨 지질 PIP3의 가수분해를 촉매화하여 PLCγ 및 Tec 키나제의 활성화를 억제하고, 용량 결합 채널을 통한 칼슘의 유입에 의해 매개되는 지속적인 칼슘 유동을 차단시킨다. FcγRIIB가 ITAM 함유 활성화 수용체를 불리하게 조절하는 한편 (Daeron, M. et al., 1995, Immunity 3:635 - 646), RTK-매개 세포 증식의 조절에서 수용체 티로신 키나제 (RTK) c-kit도 불리하게 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Malbec, O. et al., 1999 J. Immunol. 162:4424-4429).
FcγRII 수용체에 결합하는 항체가 문헌 [Looney et al., (1986) J. Immunol. 136: 1641-1647; Zipf et al., (1983) J. Immunol. 131:3064-3072; Pulford et al., (1986) Immunology 57:71-76; Greenman et al., (1991) Mol. Immunol. 28:1243-1254; Ierino et al., (1993) J. Immunol. 150:1794-1803. Weinrich et al., (1996) Hybridoma, 15:109-116; Sonderman et al., (1999) Biochemistry, 38:8469-8477; Lyden, T.W. et al (2001) J. Immunol. 166:3882-3889; 및 국제 출원 공개 WO 2004/016750 (2004년 2월 26일 공개)]에 기재된 바 있다. 고친화도 IgER1 수용체인 FcεRI는 예를 들어 알레르기 반응 동안 IgE의 결합시에 항원 유도 히스타민 방출을 위한 신호전달을 매개한다 (von Bubnoff, D. et al., (2003) Clinical & Experimental Dermatology. 28(2): 184-187). FcγRIIB 수용체는 FcεRI과 상호작용하여 FcγRIIB ITIM 도메인을 통한 FcεRI의 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Daeron, M. et al., (1995) J. Clin. Invest. 95:577-585; Malbec, O. et al., (1998) J. Immunol 160:1647-1658); 및 Tam, S.W. et al., (2004) Allergy 59:772-780). 인간 FcγRIIB에 특이적으로 결합하는 항체가 연구 뿐만 아니라 질병 치료를 위한 FcγRIIB 및 FcεRI 활성의 조작을 위해 필요하다.
<본 발명의 요지>
본 발명은 인간 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체는 다른 인간 FcγR에 결합하는 것보다 유의하게 더 양호한 친화도로 인간 FcγRIIB에 결합하고, 일부 실시태양에서 본질적으로 인간 FcγRIIA와 교차반응할 수 없다.
일부 실시태양에서, 인간 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체는 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중의 적어도 하나 이상의 CDR (항체 상보성 결정 구역)을 포함하고, 추가의 실시태양에서 서열 1, 2 및 3의 중쇄 CDR 및(또는) 서열 4, 5 및 6의 경쇄 CDR을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중의 하나 이상의 CDR의 변이체인 하나 이상의 CDR을 포함하고, 상기 변이체는 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중의 하나 이상의 CDR과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 변이체 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체는 인간 FcγRIIA와 본질적으로 계속 교차반응할 수 없으면서, FcγRIIB에 대한 항체 5A6의 친화도보다 약 10배 미만 내지 약 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배 더 큰 친화도로 FcγRIIB에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체는 서열 7의 중쇄 가변 도메인 및(또는) 서열 8의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체는 모노클로날 항체, 키메릭 항체 또는 인간화 항체, 또는 모노클로날, 키메릭 또는 인간화 항체의 단편이다. 일부 실시태양에서, 모노클로날, 키메릭, 인간화 또는 다중특이적 항체, 또는 이들의 단편을 포함하는 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항체로부터 유도된다.
본 발명의 항원 결합 폴리펩티드 또는 항체는 치료 항체 또는 화학치료제에 의해 치료되는 질병 또는 질환의 치료 방법에서 치료 항체 또는 화학치료제와 함께 투여된다.
본 발명은 상기 설명한 것을 포함하여 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드 및 활성화 수용체, 예를 들어 FcεRI에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드를 포함하는 단리된 이중특이적 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 이중특이적 항체는 중쇄간 디술피드 연결이 불가능한 변이체 중쇄 힌지 구역을 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 예를 들어 알레르기, 천식 및 염증과 관련된 면역 반응 억제 및 히스타민 방출 억제 방법에 유용하다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 세포에서 FcγRIIB 수용체를 활성화 수용체와 함께 동시 응집시켜 포유동물 세포에서 FcγRIIB 수용체를 활성화시킬 때 유용하다. 일부 실시태양에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 추가의 실시태양에서, 인간 세포는 T 세포, B 세포, 비만 세포, 호염기구, 항원 제시 세포, 대식세포 및(또는) 단핵구이다. 일반적인 ITIM 단백질 매개 억제를 수반하는 실시태양에서, 상기 억제는 일반적으로 T 세포, B 세포, 비만 세포, 호염기구, 및 항원 제시 세포에서 발생한다. 억제가 FcγRIIB에 의해 매개되는 실시태양에서, 상기 억제는 일반적으로 비만 세포, 호염기구, 항원 제시 세포, 단핵구, 대식세포 및 B 세포에서 발생한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 FcεRI 수용체의 불활성화, 활성 억제 또는 발현의 하향조절에 유용하다. FcεRI이 억제되거나 하향조절되는 실시태양에서, 억제 또는 하향조절은 일반적으로 포유동물 비만 세포, 호염기구 및 항원 제시 세포에서 발생한다.
한 측면에서, 본 발명은 단리된 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체를 제약학상 담체 중에 포함하는 조성물을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 단리된 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체 및 단리된 항-IgE 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 조합 조성물 내의 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체 대 항-IgE 항체의 유용한 비율은 각각의 환자에 대해 용이하게 결정된다. 비율은 일반적으로 약 0.01:1 내지 100:1이다. 조성물의 항체는 모노클로날, 인간, 인간화 또는 키메릭 항체일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체를 투여함으로써 포유동물의 면역 질환을 치료하는 치료 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 포유동물은 인간 환자, 예를 들어 알레르기 질환, 천식 및(또는) 염증 치료를 필요로 하는 인간 환자이다. 다른 실시태양에서, 치료 방법은 본 발명의 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체를 면역 질환, 알레르기, 천식에 걸렸거나, 히스타민 방출 억제를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체는 항-IgE 항체와 조합되어 별개로 또는 동시에 투여된다. 한 실시태양에서, 항-IgE 항체는 모노클로날 항체이다. 추가의 실시태양에서, 항-IgE 항체는 졸레어 (Xolair)(등록상표)이다. 또다른 실시태양에서, 이중특이적 항체는 진행중인 면역 질환에 대한 치료적 처리의 일부 (예를 들어 동일한 치료 요법의 일부)로서 항-IgE 항체와 조합되어 투여되고, 여기서 이중특이적 항체는 항-IgE 항체와 별개로 (동시 투여가 아니라) 투여된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 항체 및 항- IgE 항체는 동시에 투여된다. 조합 투여에서 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체 대 항-IgE 항체의 유용한 비율은 (투여가 별개로 투여되는지 또는 동시에 투여되는지에 상관없이) 각각의 환자에 대해 용이하게 결정된다. 본 발명의 목적을 위해, 비율은 약 0.01:1 내지 100:1 및 환자에 대해 결정된 범위 내의 임의의 유용한 비율이다. 유용한 비율은 예를 들어 0.05:1, 0.1:1, 0.5:1, 1:1, 1:0.5, 1:0.1 및 1:0.05일 수 있지만, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있는 어떠한 유용한 비율도 배제되지 않는다.
본 발명은 추가로 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 또는 숙주 세포, 및 숙주 세포를 배양하고, 임의로 숙주 세포 배양액으로부터 (예를 들어 숙주 세포 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다.
도 1은 천연 IgG의 모식도이다. 디술피드 결합은 CH1과 CL 도메인 및 2개의 CH2 도메인 사이의 굵은 선으로 제시된다. V는 가변 도메인이고; C는 불변 도메인이고; L은 경쇄를 나타내고, H는 중쇄를 나타낸다.
도 2A는 바람직한 인간 FcγRIIA (서열 9); 인간 FcγRIIB2 (서열 10) 아미노산 서열을 정렬한 것이다. 도 2B는 FcγRIIB1 (서열 11)의 아미노산 서열을 보여준다.
도 3은 천연 서열 인간 항체 Fc 영역 서열을 정렬한 것이다. 상기 서열은 천연-서열 인간 IgG1 (서열 31), 비-A 동종이인자형; 천연-서열 인간 IgG2 (서열 32); 천연 서열 인간 IgG3 (서열 33); 및 천연-서열 인간 IgG4 (서열 34)이다.
도 4는 GST-huFcγRIIA 및 GST-huFcγRIII 융합 단백질에 비교한, GST-huFcγRIIB의 항체에 대한 상대적 결합을 보여주는 막대 그래프를 제시한다..
도 5는 GPI-huFcγRIIA를 발현하는 CHO 세포에 비교한, GPI-huFcγRIIB를 발현하는 CHO 세포에 대한 항체의 면역형광 결합에 의한 결합 특이성을 보여준다.
도 6-9는 GST-huFcγRIIB, GST-huFcγRIIA (H131) 또는 GST-huFcγRIIA (R131)에 대한 상이한 항-FcγRII (CD32) MAb의 결합을 위한 결합 친화도 곡선을 제시한다.
도 10은 모노클로날 항체 5A6.2.1의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
도 11-15는 5A6가 huFcγRIIA에 대한 E27-IgE 헥사머 결합을 차단하지 않고 5A6이 huFcγRIIB에 대한 E27-IgE 헥사머 결합을 차단함을 보여준다.
도 16은 천연 FcγRIIA를 발현하는 K562 적백혈병 세포주 (ATCC No. CCL-243)에 대한 5A6 MAb의 간접적인 면역형광 결합 분석을 제시한다.
도 17은 히스타민 방출 차단에 의해 정량적으로 측정한 활성화 수용체에 대한 FcγRIIB 가교결합의 효과를 보여준다.
도 18은 p5A6.11.Knob (knob 항-FcγRIIB) 및 p22E7.11.Hole (hole 항-FcεRI) 항체 성분 발현에 대한 항-Fab 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 19는 p5A6.11.Knob (knob 항-FcγRIIB) 및 p22E7.11.Hole (hole 항-Fcε RI) 항체 성분 발현에 대한 항-Fc 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 20은 야생형 또는 변이체 힌지 서열을 갖는 항체 성분의 발현에 대한 항-Fab 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 21은 야생형 또는 변이체 힌지 서열을 갖는 항체 성분에 대한 항-Fc 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 22는 실온에서 5A6Knob, 22E7Hole, 혼합된 5A6Knob 및 22E7Hole 및 5분 동안 50℃로 가열한 혼합물의 등전점 포커싱(isoelectric focusing)을 보여준다.
도 23은 5A6Knob/22E7Hole 이중특이적, 22E7Hole 및 5A6Knob 항체에 대한 FcγRIIB 친화도 컬럼 유동 통과를 보여준다.
도 24는 10분 동안 5O℃로 가열한 5A6Knob, 22E7Hole, 및 5A6Knob 및 22E7Hole 혼합물의 등전점 포커싱 분석을 보여준다.
도 25는 5A6 항체의 알칼린 포스파타제 프로모터 (phoA), STII 시그날 서열 및 전체 (가변 및 불변 도메인) 경쇄를 코딩하는 핵산 서열 (서열 35)을 보여준다.
도 26은 22E7 항체의 알칼린 포스파타제 프로모터 (phoA), STII 시그날 서열 및 전체 (가변 및 불변 도메인) 경쇄를 코딩하는 핵산 서열 (서열 36)을 보여준다.
도 27은 5A6 항체의 STII 시그날 서열의 마지막 3개의 아미노산 및 뮤린 중쇄 가변 도메인의 약 119개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열 (서열 37)을 보여준다.
도 28은 22E7 항체의 STII 시그날 서열의 마지막 3개의 아미노산 및 뮤린 중쇄 가변 도메인의 약 123개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열 (서열 38)을 보여준 다.
도 29 및 30은 5A6/22E7 힌지 부재 이중특이적 항체의 이중 결합 특이성을 보여주는 ELISA 결과를 제시한다.
도 31-33은 huFcγRIIB를 huFcεRI에 가교결합시키는 5A6/22E7 이중특이적 항체의 능력을 보여주는 히스타민 방출 분석 ELISA 데이타를 제시한다.
도 34는 5A6/22E7 이중특이적 항체의 huFcεRI ECD 및 huFcγRIIB ECD와의 예비인큐베이션에 의한, RBL-huFcεRI+FcγRIIB1 세포에서 항원-유도 히스타민 방출의 억제 차단을 보여주는 ELISA 히스타민 방출 분석 결과 그래프이다.
도 35는 huFcεRI ECD 및 huFcγRIIB ECD의 존재 하에 RBL-huFcεRI+FcγRIIB1 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체의 결합에 대한 FACS 데이타 그래프를 포함한다.
도 36은 5A6/22E7 이중특이적 항체의 huFcεRI ECD 및 huFcγRIIB ECD와의 예비인큐베이션에 의한, RBL-huFcεRI+FcγRIIB2 세포에서 항원-유도 히스타민 방출 억제의 차단을 보여주는 ELISA 히스타민 방출 분석 결과 그래프이다.
도 37은 huFcεRI ECD 및 huFcγRIIB ECD의 존재 하에 RBL huFcεRI+FcγRIIB2 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체의 결합에 대한 FACS 데이타 그래프를 포함한다.
도 38은 huFcεRI ECD, huFcγRIIB ECD, 또는 두 ECD 모두에 의한, RBL huFcεRI 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합의 차단을 보여주는 FACS 데이타 그래프를 포함한다.
도 39는 huFcεRI ECD, huFcγRIIB ECD, 또는 두 ECD 모두에 의한, RBL huFcγRIIB 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합의 차단을 보여주는 FACS 데이타 그래프를 포함한다.
도 40은 huFcεRI ECD, huFcγRIIB ECD, 또는 두 ECD 모두에 의한, RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합의 차단을 보여주는 FACS 데이타 그래프를 포함한다.
도 41은 huFcεRI ECD, huFcγRIIB ECD, 또는 두 ECD 모두에 의한, RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합의 차단을 보여주는 FACS 데이타 그래프를 포함한다.
도 42는 포화 미만 농도에서 5A6/22E7 이중특이적 항체에 의한, RBL huFcεRI+FcγRIIB1 세포에서 항원-유도 히스타민 방출의 억제를 보여주는 ELISA 히스타민 방출 분석 결과 그래프이다.
도 43은 RBL huFcεRI+FcγRIIB1 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합의 유동 세포 측정 데이타이다.
도 44는 포화 미만 농도에서 5A6/22E7 이중특이적 항체에 의한, RBL huFcεRI+FcγRIIB2 세포에서 항원-유도 히스타민 방출 억제를 보여주는 ELISA 히스타민 방출 분석 결과 그래프이다.
도 45는 RBL huFcεRI+FcγRIIB2 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합의 유동 세포 측정 데이타이다.
도 46A 및 46B는 RBL huFcεRI, RBL FcγRIIB 세포, RBL huFcεRI+FcγRIIB1 세포, 및 RBLhuFcε+FcγRIIB2 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합의 적정에 대한 유동 세포 측정 데이타이다.
도 47은 항체가 고갈되지 않았음을 나타내는, 이중특이적 항체의 존재 또는 부재 하에 IgE로 처리한 후에 7일에 걸쳐 RBL FcεRI 세포, RBL FcεRI + FcγRIIB1 세포, 및 RBL FcεRI + FcγRIIB2 세포의 세포 배양 배지에서 ELISA에 의해 검출된 이중특이적 항체 수준의 그래프이다.
도 48은 항체가 고갈되지 않았음을 나타내는, 이중특이적 항체의 존재 또는 부재 하에 IgE로 처리한 후에 7일에 걸쳐 RBL FcεRI 세포, RBL FcεRI + FcγRIIB1 세포, 및 RBL FcεRI + FcγRIIB2 세포의 세포 배양 배지에서 ELISA에 의해 검출된 IgE 수준의 그래프이다.
도 49 및 50은 RBL FcεRI 세포에서 FcεRI 표면 발현의 IgE-유도 상향조절에 대한 유동 세포 측정 데이타를 제시한다.
도 51 및 52는 RBL FcεRI + FcγRIIB1 세포에서 FcεRI 표면 발현의 IgE-유도 상향조절에 대한 유동 세포 측정 데이타를 제시한다.
도 53 및 54는 RBL FcεRI + FcγRIIB2 세포에서 FcεRI 표면 발현의 IgE-유도 상향조절에 대한 유동 세포 측정 데이타를 제시한다.
도 55는 IgE 제거 후에 RBL FcεRI 세포에서 FcεRI 표면 발현의 하향조절에 대한 이중특이적 항체의 효과를 보여주는 유동 세포 측정 데이타를 제시한다.
도 56은 IgE 제거 후에 RBL FcεRI + FcγRIIB1 세포에서 FcεRI 표면 발현의 하향조절에 대한 이중특이적 항체의 효과를 보여주는 유동 세포 측정 데이타를 제시한다.
도 57은 IgE 제거 후에 RBL FcεRI + FcγRIIB2 세포에서 FcεRI 표면 발현의 하향조절에 대한 이중특이적 항체의 효과를 보여주는 유동 세포 측정 데이타를 제시한다.
도 58-61은 비만 세포 RBL huFcεRI (huFcERIa로 명명), RBL huFcεRI+FcγRIIB1 세포 (huFcGRIIb1로 명명), 및 RBL huFcεRI+FcγRIIB2 세포 (huFcGRIIb2)에서 및 3명의 상이한 공여자로부터의 인간 호염기구 상에서 huFcεRIα, FcγRIIB1, FcγRIIB2, huRPL19 (대조군), 및 래트 FcεRIα의 mRNA 발현의 RT-PCR 데이타를 제시한다.
도 62는 1차 인간 호염기구에서 항-IgE-유도 히스타민 방출이 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체 5A6/22E7에 의해 억제된 분석 결과를 제시한다.
도 63은 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체 5A6/22E7가 0일, 3일 및 4일에 첨가될 때 RBL FcεRI + FcγRIIB2 세포에서 IgE-유도 FcεRI 표면 발현의 하향조절에 대한 이중특이적 항체의 효과를 보여주는 유동 세포 측정 데이타를 그래프로 제시한다.
도 64는 RBL FcεRI + FcγRIIB2 세포에서 IgE/항원-유도 시토킨 방출이 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체 5A6/22E7에 의해 억제된 분석 결과를 제시한다. 각각의 막대 그래프에서, 항원/IgE 단독 (NP(11)-OVA + IgE)은 암회색 막대이고; 항원/IgE + 이중특이적 항체 (NP(11)-OVA + IgE + BsAb)는 연회색 막대이다.
도 65는 RBL FcεRI + FcγRIIB1 세포에서 IgE/항원-유도 아라키돈산 캐스케 이드 자극이 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체 5A6/22E7에 의해 억제된 분석 결과를 제시한다.
I. 정의
알레르기는 환경 항원에 대한 면역 반응이 조직 염증 및 장기 기능부전을 야기하는 특정 질병을 의미한다. 알레르겐은 알레르기를 야기하는 임의의 항원이다. 따라서, 알레르겐은 항원 분자 자체 또는 그의 공급원, 예를 들어 화분립, 동물 비듬, 곤충 독액 또는 식품일 수 있다. IgE는 알레르기 질환에서 중요한 역할을 수행한다. IgE 고친화도 수용체 (FcεRI)는 비만 세포 및 호염기구에 위치하고, 이들은 알레르기 질병의 많은 증상을 생성시키는 염증 매개체의 추가 방출을 자극하는 항원 표적으로서 기능한다.
IgE-매개 염증은 항원이 비만 세포 상의 FcεRI 수용체에 결합하는 IgE 항체에 결합할 때 발생한다. 수분 내에, 상기 결합에 의해 비만 세포가 탈과립화되어 특정한 예비형성(preformed) 매개체를 방출한다. 이어서, 탈과립화된 세포는 추가의 매개체를 드 노보 (de novo)로 합성하여 방출하기 시작한다. 그 결과는 2상 반응으로서, 혈관, 평활근 및 선 분비에 대한 초기 즉시 효과 (즉시형 과민증)와, 이어서 수시간 후에 관련 부위의 세포 침윤이 발생한다. IgE-매개 염증은 아토피성 알레르기 (예를 들어 고초열, 천식 및 아토피성 피부염), 전신 과민 반응 및 알레르기성 두드러기 (hives)가 발생하는 메카니즘이다. 상기 염증은 신속한 혈관 확장, 순환 가용성 인자 및 세포의 항원 접촉 부위로의 용이한 도입을 야기하기 때문에 통상 면역학적 방어의 제1선에서 기능을 수행할 수 있다. 알레르기 질병의 많은 가장 파괴적인 특성은 화학유인된 백혈구의 작용에 의한 것이다.
용어 "항체" 및 면역글로불린은 가장 넓은 의미로 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어 요구되는 생물학적 활성을 보이는 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 상세하게 설명되는 바와 같은), 예를 들어 항체의 단편일 수 있는 항원 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체 및 면역글로불린은 감소된 (보다 적은) 디술피드 연결을 갖는다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체 및 면역글로불린은 적어도 하나의 시스테인 잔기가 바람직하게는 분자간, 바람직하게는 2개의 중쇄 사이에 존재하는 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 만드는 힌지 구역을 포함한다. 힌지 시스테인은 시스테인 잔기의 결실 또는 시스테인의 다른 아미노산에 의한 치환을 포함하지만 이들에 한정되지는 않는, 당업계에 공지된, 그 일부가 본원에서 설명되는 임의의 다양한 적합한 방법에 의해 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 만들 수 있다.
항체 (면역글로불린)은 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류된다. 5개의 주요한 면역글로불린 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 설명된 바 있다. 이들은 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2 등으로 추가로 분류될 수 있다. 각각의 면역글로불린 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 IgA, D, E, G 및 M에 대해 α, δ, ε, γ 및 μ로 명명된다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 공지되어 있고, 일반적으로 문헌 [예를 들어, Abbas et al., 2000, Cellular and Mol. Immunology, 4th ed]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체". "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 아래에서 규정되는 항체 단편이 아니라 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 의미한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체 변이체는 전장 항체일 수 있다. 전장 항체는 인간, 인간화, 키메릭 및(또는) 친화도 성숙된 항체일 수 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변형(들)을 갖지 않는 모 항체에 비교할 때 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변형을 갖는 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 공지의 과정으로 제조된다 (예를 들어, 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있는 Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 참조). CDR 및(또는) 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이 유발은 예를 들어 문헌 [Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896]에 기재되어 있다.
"작용제 항체"는 항원, 예를 들어 수용체에 결합하여 활성화시키는 항체이다. 일반적으로, 작용제 항체의 수용체 활성화 능력은 수용체의 천연 작용제 리간드와 적어도 정성적으로 유사할 것이다 (본질적으로 정량적으로 유사할 수 있음).
"항체 단편"은 단지 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 상기 일부는 무손상 항체에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 관련된 기능의 적어도 하나를 보유하고, 기능의 대부분 또는 모두를 보유할 수 있다. 본 발명의 항체 단편은 예를 들어 중쇄간 디술피드 연결에 통상 관련되는 적어도 하나의 힌지 시스테인이 본원에서 설명되는 바와 같이 변경된, 디술피드 연결 능력이 감소된 중쇄의 이량체화 (또는 다량체화)를 허용하도록 불변 구역의 충분한 부분을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 도메인을 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 다른 실시태양에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체에 존재할 때 통상 Fc 영역과 관련된 적어도 하나의 생물학적 기능, 예를 들어 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및(또는) 보체 결합 (예를 들어 항체가 ADCC 기능 또는 보체 결합에 필요한 글리코실화 프로필을 갖는 경우)을 보유한다. 항체 단편의 예는 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 FcR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol 9:457-92]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 예를 들어 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 시험관내 ABCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA) 95:652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"항체-면역어드헤신 키메라"는 항체의 적어도 하나의 결합 도메인 (본원에서 정의된 바와 같은)과 적어도 하나의 면역어드헤신 (본원에서 정의된 바와 같은)을 조합한 분자를 포함한다. 예시적인 항체-면역어드헤신 키메라는 문헌 [Berg et al., 1991, PNAS (USA) 88:4723 및 Chamow et al., 1994, J. Immunol. 153:4268]에 기재된 바와 같은 이중특이적 CD4-IgG 키메라이다.
본원에서 사용되는 "자가면역 질병"은 개체의 자기 자신의 조직으로부터 자기 조직에 대해 발생하는 비악성 질병 또는 질환이다. 본원에서 설명되는 자가면역 질병에는 특히 악성 또는 암 질병 또는 병태, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 털세포 백혈병, 및 만성 골수모세포성 백혈병이 포함되지 않는다. 자가면역 질병 또는 질환의 예는 염증 반응, 예를 들어 염증성 피부 질환, 예를 들어 건선 및 피부염 (예를 들어, 아토피성 피부염); 전신 피부경화증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염) 관련 반응; 호흡 곤란 증후군 (예를 들어, 성인 호흡 곤란 증후군; ARDS); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알레르기 병태, 예를 들어 습진 및 천식 및 T 세포 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 다른 병태; 죽상경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스 관절염; 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 당뇨병 (예를 들어 I형 당뇨병 또는 인슐린 의존 당뇨병); 다발 경화증; 레이노 (Reynaud) 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기 뇌척수염; 쇼그렌 (Sjorgen) 증후군; 소아발병형 당뇨병; 및 일반적으로 결핵, 유육종증, 다발근육염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출 관련 질병; 중추신경계 (CNS) 염증성 질환; 다중 장기 손상 증후군; 용혈 빈혈 (크리오글로빈혈증 또는 쿰스 (Coombs) 양성 빈혈을 포함하고, 이로 제한되지 않음); 중증 근육무력증; 항원-항체 복합체 매개 질병; 항-사구체 기저막 질병; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발내분비병증; 라이터병; 근육 강직 증후군; 베체트병; 거대세포 동맥염; 면역복합체 신장염; IgA 신장병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판 감소 자색반 (ITP) 또는 자가면역 저혈소판증 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
"생물학적으로 활성인" 또는 "기능성" 면역글로불린은 구조적, 조절, 생화학적 또는 생물리학적 사건에서 그의 하나 이상의 천연 활성을 발휘할 수 있는 것이다. 예를 들어, 생물학적으로 활성인 항체는 특이적으로 항원에 결합하는 능력을 가질 수 있고, 결합은 세포 또는 분자 사건, 예를 들어 신호전달 또는 효소 활성을 유도 또는 변경시킬 수 있다. 생물학적으로 활성인 항체는 또한 수용체의 리간드 활성화를 차단하거나 작용제 항체로서 기능할 수 있다. 항체가 그의 하나 이상의 천연 활성을 발휘하는 능력은 폴리펩티드 사슬의 적절한 폴딩 및 조립을 포함하여 복수의 요인에 따라 결정된다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어 항체)와 그의 결합 파트너 (예를 들어 항원 또는 FcRn 수용체) 사이의 모든 비공유 상호작용의 강도를 의미한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에서 설명되는 것을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화도 항체는 약하게 항원 (또는 FcRn 수용체)에 결합하고, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고친화도 항체는 항원 (또는 FcRn 수용체)에 보다 강력하게 결합하고, 보다 오래 결합된 상태로 유지된다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 상기 차단은 임의의 수단에 의해, 예를 들어 수용체에 대한 리간드 결합, 수용체 복합체 형성, 수용체 복합체 내의 티로신 키나제 수용체의 티로신 키나제 활성 및(또는) 수용체 내의 또는 수용체에 의한 티로신 키나제 잔기(들)의 인산화를 저해함으로써 발생할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIB 길항제 항체는 FcγRIIB에 결합하고 FcγRIIB에 결합하는 IgG의 능력을 억제하여 면역 효과기 반응을 억제한다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 종류의 두경부암을 포함한다.
용어 "키메릭" 항체는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 및 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한 상기 항체의 단편을 의미한다 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 참조).
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"은 상호교환가능하게 사용되고, 모든 명칭은 자손체를 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 계대 횟수에 상관없이 그로부터 유도된 배양액을 포함한다. 또한, 모든 자손체는 의도적인 또는 우연한 돌연변이에 의해 DNA 함량이 정확히 동일하지 않을 수 있음이 이해된다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손체가 포함된다. 특유한 명명이 의도될 경우, 문장 맥락에서 분명히 알 수 있을 것이다.
표현 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵 세포에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
"질환"은 치료 항체를 사용한 처리에 의해 개선되는 임의의 병태이다. 이것은 포유동물을 문제되는 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태를 포함하여 만성 및 급성 질환 또는 질병을 포함한다. 한 실시태양에서, 질환은 암 또는 자가면역 질병이다.
"세포외 도메인"은 세포 외부에 존재하는, 트랜스멤브레인 폴리펩티드, 예를 들어 FcR의 구역으로서 본원에서 규정된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스 및 상기 수용체의 대립유전자 변이체 및 별법으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. 미래에 확인될 것을 포함하여 다른 FcR도 본원의 용어 "FcR"에 포함되다. 또한, 상기 용어는 모성 IgG의 태아로의 전달에 작용하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (Guyer et al., 1976, J. Immunol. 117:587 및 Kim et al., 1994, J. Immunol. 24:249 참조).
용어 "Fc 구역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 구역을 규정하기 위해 사용된다. "Fc 구역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대체로 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 그의 카르복실-말단에 걸치는 것으로 규정된다. 면역글로불린의 Fc 영역은 도 1에 도시된 바와 같이 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 및 CH3을 포함한다. "기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 하고, 본원에 개시된 것과 같은 다양한 분석을 사용하여 평가할 수 있다. "천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 도 3에 도시된 바와 같고, 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이인자형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 및 그의 자연발생 변이체를 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 본원에서 규정되는 적어도 하나의 "아미노산 변형"에 의해 천연 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 항체의 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 가질 수 있고, 천연 서열 Fc 영역에 또는 모 항체의 Fc 영역에 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및(또는) 모 항체의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 동일성을 가질 수 있고, 적어도 약 90%의 동일성 또는 적어도 약 95%의 동일성을 가질 수 있다.
달리 언급되지 않으면 용어 "FcγRIIA"는 인간 FcγRIIa 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드인 인간 FcγRIIA (huFcγRIIA)를 의미하고, FcγRIIA1 및 FcγRIIA2 및 그의 대립유전자 변이체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 인간 FcγRIIA는 "활성화" FcR이고, 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 가장 바람직한 인간 FcγRIIA는 그의 고반응 (HR) 또는 저반응 (LR) 대립유전자 변이체를 포함하여 서열 9의 아미노산 서열 또는 그의 대립유전자 변이체를 포함하는 인간 FcγRIIA1이다.
달리 언급되지 않으면, 용어 "FcγRIIB"는 인간 FcγRIIB 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 의미하고, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIB3, 및 그의 대립유전자 변이체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직한 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM) (I/V/Lx YxxL/V)를 포함하는 "억제성" FcR 수용체이다 (Sathish, et al., 2001, J. Immunol. 166, 1763). 바람직한 인간 FcγRIIB는 각각 서열 10 또는 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 인간 FcγRIIB2 (huFcγRIIB2) 또는 FcγRIIB1 (huFcγRIIB1) 및 그의 대립유전자 변이체이다. FcγRIIB1 및 B2 서열은 FcγRIIB1의 세포질 도메인에 19개의 아미노산 서열 삽입체 LPGYPECREMGETLPEKPA (서열 29)가 존재한다는 점에서 상이하다.
본원에서 사용되는 "FcR 의존성 상태"는 타입 II 염증, IgE-매개 알레르기, 천식, 과민증, 자가면역 질병, IgG-매개 세포독성 또는 발진을 포함한다.
본원에서 사용되는 "힌지 구역" 및 그의 변이체는 예를 들어 문헌 [Janeway et al., 1999, Immuno Biology: The Immune System in Health and Disease, Elsevier Science Ltd., NY. 4th ed.; Bloom et al., 1997, Protein Science, 6:407-415; Humphreys et al., 1997, J. Immunol. Methods, 209:193-202]에서 예시된 바와 같이 당업계에 공지된 의미를 갖는다.
"상동성"은 서열을 정렬시키고 최대 상동성 비율을 달성하도록 필요한 경우 갭 (gap)을 도입시킨 후 동일한 아미노산 서열 변이체 내의 잔기의 비율로서 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 공지되어 있다. 상기 컴퓨터 프로그램의 하나는 1991년 12월 10일에 미국 저작국 (United States Copyright Office, 미국 워싱턴 디. 씨. 20559)에 사용자 제출서류로 출원된 제넨테크 (Genentech) 소유의 "얼라인 2(Align 2)"이다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포" (또는 "재조합 숙주 세포")는 외인성 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 플라스미드 또는 벡터의 도입에 의해 유전적으로 변경되었거나 유전적으로 변경될 수 있는 세포를 의미한다. 상기 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 자손체도 의미함을 이해하여야 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 상기 자손체는 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위에 계속 포함된다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR를 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고, ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 본원에서 설명되는 바와 같이 천연 공급원, 예를 들어 혈액 또는 PBMC (말초혈 단핵 세포)로부터 단리될 수 있다.
비인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메릭 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수여 항체)를 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 구역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체나 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 우해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 구역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596 (1992))을 참고한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고(되거나) 본원에 개시되는 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 정의는 구체적으로는 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
본원에서 사용되는 용어 "고혈당 질환"은 인슐린 저항성에 의한 당뇨병 및 질환의 모든 형태, 예를 들어 1형 및 2형 당뇨병, 및 심한 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 및 고지혈증, 예를 들어 비만 대상, 및 인슐린-저항성 당뇨병, 예를 들어 멘델홀 (Mendenhall) 증후군, 워너 (Werner) 증후군, 레프리코니즘 (leprechaunism), 지방 위축성 당뇨병, 및 다른 지방위축증을 의미한다. 본원에 개시된 특정 고혈당 질환은 당뇨병, 특히 1형 및 2형 당뇨병이다. "당뇨병" 자체는 인슐린의 부적절한 생산 또는 이용을 수반하는 탄수화물 대사의 진행성 질병을 의미하고, 고혈당증 및 당뇨라는 특징을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 작용하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 서열 정렬에 의해 규정되는 경쇄 가변 도메인의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기, 예를 들어 경쇄 가변 도메인의 잔기 약 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)과 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및(또는) 구조적으로 규정되는, "초가변 루프"로부터의 잔기, 예를 들어 경쇄 가변 도메인의 잔기 약 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917)를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정되는 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
면역 및 염증 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병증, 전신 경화증 (피부경화증), 특발성 염증성 근육병증 (피부근육염), 전신 혈관염, 유육종증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역 저혈소판증 (특발성 혈소판 감소 자색반, 면역-매개 저혈소판증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모또 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축 갑상선염) 자가면역 염증 질환 (예를 들어 알레르기 뇌척수염, 다발 경화증, 인슐린-의존 당뇨병, 자가면역 포도막염, 갑상선 기능 항진증, 자가면역 갑상선 질환, 악성 빈혈, 자가이식 거부, 당뇨병, 및 면역-매개 신장병 (사구체신염, 세뇨관 간질성 신장염)), 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예를 들어 다발 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 기랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증; 간담즙성 질환, 예를 들어 감염성 간염 (간염 A, B, C, D, E 및 다른 비간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종 간염, 및 경화성 담관염, 글루텐 민감 장병증, 및 휘플 (Whipple) 병; 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 예를 들어 수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염, 건선; 알레르기 질환, 예를 들어 천식, 알레르기 비염, 아토피성 피부염, 춘계결막염, 습진, 음식 과민증 및 두드러기; 폐의 면역학적 질병, 예를 들어 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민증 폐렴; 이식 관련 질환, 예를 들어 이식편 거부 및 이식편 대 숙주 질환을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역어드헤신"은 이종성 "어드헤신" 단백질 (예를 들어, 수용체, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능과 조합한 항체 유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 어드헤신 아미노산 서열과, 항체 (즉 "이종성") 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 항원 인식 및 결합 부위 (항원 결합 부위) 이외의 다른 요구되는 결합 특이성의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 바람직하게는 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄로부터 유래하고, 이것은 상기 구역을 포함하는 면역어드헤신이 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있기 때문이다 (예를 들어, Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13 참조).
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원에 통상 존재하는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경과는 다른 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재할 경우, 항체를 통상 발현하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함한다.
용어 "포유동물"은 포유동물로 분류되는 임의의 동물, 예를 들어 인간, 소, 말, 개 및 고양이를 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 특이성이 높다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 수식 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., 1975, Nature 256:495]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메릭" 항체 (면역글로불린) 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 존재할 때 본원에서 사용되는 바와 같이 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전서열 (presequence) 또는 분비 리더 (secretory leader)에 대한 DNA는 항체의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되면 항체에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치하면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 판독상에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 상기 부위가 존재하지 않으면, 통상적인 실행에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (adapter) 또는 링커 (linker)가 사용된다.
본원의 목적을 위해, "제약 조성물"은 포유동물, 특히 인간에게 투여하도록 변형되고 투여에 적합한 것이다. 따라서, 조성물은 포유동물의 질병 또는 질환 치료에 사용될 수 있다. 또한, 조성물 내의 단백질은 그의 치료 용도를 방해할 수 있는 오염물(들)을 그로부터 분리하기 위해 하나 이상의 정제 또는 단리 단계를 거치게 된다. 일반적으로, 제약 조성물은 치료 단백질 및 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 조성물은 보통 멸균되고, 동결건조될 수 있다. 제약 제제는 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기 및(또는) 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기재일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체 조립 전 또는 후에 수행될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예를 들어 표지의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 종류의 변형은 예를 들어 "캡 (cap)", 하나 이상의 자연발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 매달린 잔기, 예를 들어 단백질 (예를 들어 뉴클레아제, 톡신, 항체, 시그날 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 갖는 것, 삽입물 (예를 들어 아크리딘, 소랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이터 (예를 들어 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화금속 등)를 갖는 것, 알킬화제를 갖는 것, 변형 연결 (예를 들어 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것, 및 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형 형태를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 표준 보호기에 의해 보호된 포스포네이트기, 포스페이트기로 치환되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대해 추가로 연결시키기 위해 활성화되거나, 고상 또는 반고상 지지체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캐핑기로 인산화되거나 치환될 수 있다. 또한, 다른 히드록실이 표준 보호기에 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르복실릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 라익소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아크릴릭 유사체, 및 무염기 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 대체 연결기로 대체될 수 있다. 상기 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(0)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 임의로 에테르 (-0-) 연결, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜을 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C)이다)로 대체되는 실시태양을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 내용은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드"는 반드시는 아니지만 일반적으로 약 200개 뉴클레오티드 미만의 길이의, 일반적으로 짧은, 일반적으로 단일 가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적인 것이 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 내용은 올리고뉴클레오티드에 동등하게 완전히 적용될 수 있다.
"분비 시그날 서열" 또는 "시그날 서열"은 원핵세포의 세포막, 대체로 내막 또는 내막 및 외막 모두를 통해 새로이 합성되는 목적하는 단백질을 유도하기 위해 사용될 수 있는 짧은 시그날 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 따라서, 목적하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드는 원핵 숙주세포의 주변세포질 또는 배양 배지 내로 분비된다. 분비 시그날 서열에 의해 코딩되는 시그날 펩티드는 발현되는 폴리펩티드에 천연성인 시그날 펩티드를 포함하여 숙주 세포에 내재성이거나, 외인성일 수 있다. 분비 시그날 서열은 일반적으로 발현되는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하고, 일반적으로 폴리펩티드의 생합성과 분비 사이에서 효소에 의해 세포질로부터 제거된다. 따라서, 시그날 펩티드는 대체로 성숙 단백질 생성물에 존재하지 않는다.
용어 "수용체 결합 도메인"은 세포 부착 분자를 포함하여 수용체에 대한 임의의 천연 리간드 또는 대응하는 천연 리간드의 적어도 정성적 수용체 결합 능력을 보유하는 상기 천연 리간드의 임의의 구역 또는 유도체를 표시하기 위해 사용된다. 상기 정의는 무엇보다도 상기한 수용체에 대한 리간드로부터의 결합 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료 항체"는 질병 또는 질환에 걸렸거나 걸리기 쉬운 포유동물에서 질병 또는 질환의 치료에 효과적인 항체이다. 예시적인 치료 항체는 본 발명의 5A6 항-FcγRIIB 항체 및 본 발명의 이중특이적 항-FcγRIIB/항-FcεRI 항체, 및 rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN(등록상표)) (Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289, 미국 특허 5,725,856); 항-CD20 항체, 예를 들어 미국 특허 5,736,137에 개시된 바와 같은 키메릭 항-CD20 "C2B8" (RITUXAN(등록상표)), 미국 특허 5,721,108 B1에 개시된 바와 같은 2H7 항체의 키메릭 또는 인간화 변이체 또는 토시투모맙 (BEXXAR(등록상표)); 항-IL-8 (St John et al., 1993, Chest, 103:932, 및 국제 특허 출원 공개 WO 95/23865); 항-VEGF 항체, 예를 들어 인간화 및(또는) 친화도 성숙 항-VEGF 항체, 예를 들어 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 AVASTIM™ (Kim et al., 1992, Growth Factors, 7:53-64, 국제 특허 출원 공개 WO 96/30046, 및 WO 98/45331, 1998년 10월 15일 공개); 항-PSCA 항체 (WO01/40309); 항-CD40 항체, 예를 들어 S2C6 및 그의 인간화 변이체 (WO00/75348); 항-CD11a (미국 특허 5,622,700, WO 98/23761, Steppe et al., 1991, Transplant Intl. 4:3-7, 및 Hourmant et al., 1994, Transplantation 58:377-380); 항-IgE (Presta et al., 1993, J. Immunol. 151:2623-2632, 및 국제 특허 출원 공개 WO 95/19181); 항-CD18 (미국 특허 5,622,700, 1997년 4월 22일 등록, 또는 WO 97/26912, 1997년 7월 31일 공개); 항-IgE (1998년 2월 3일 등록된 미국 특허 5,714,338 또는 1992년 2월 25일 등록된 미국 특허 5,091,313, 1993년 3월 4일 공개된 WO 93/04173 또는 1998년 6월 30일 출원된 국제 특허 출원 PCT/US98/13410, 미국 특허 5,714,338); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793, 1998년 11월 19일 공개); 항-TNF-α 항체, 예를 들어 cA2 (REMICADE(등록상표)), CDP571 및 MAK-195 (1997년 9월 30일 등록된 미국 특허 5,672,347, Lorenz et al., 1996, J. Immunol. 156(4): 1646-1653, 및 Dhainaut et al., 1995, Crit. Care Med. 23(9): 1461-1469); 항-조직 인자 (TF) (1994년 11월 9일 허여된 유럽 특허 0420 937 B1); 항-인간 α4-β7 인테그린 (1998년 2월 19일 공개된 WO 98/06248); 항-EGFR (1996년 12월 19일 공개된 WO 96/40210에서와 같은 키메릭 또는 인간화 225 항체); 항-CD3 항체, 예를 들어 OKT3 (1985년 5월 7일 등록된 미국 특허 4,515,893); 항-CD25 또는 항-tac 항체, 예를 들어 CHI-621 (SIMULECT(등록상표)) 및 (ZENAPAX(등록상표)) (1997년 12월 2일 등록된 미국 특허 5,693,762); 항-CD4 항체, 예를 들어 cM-7412 항체 (Choy et al., 1996, Arthritis Rheum 39(1):52-56); 항-CD52 항체, 예를 들어 CAMPATH-1H (Riechmann et al 1988, Nature 332:323-337; 항-Fc 수용체 항체, 예를 들어 FcγRI에 대해 작용하는 M22 항체 (Graziano et al.1995, J. Immunol. 155(10):4996-5002; 항-암배아 항원 (CEA) 항체, 예를 들어 hMN-14 (Sharkey et al., 1995, Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s; 유방 상피 세포에 대해 작용하는 항체, 예를 들어 huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6 (Ceriani etal. 1995, Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s; 및 Richman et al., 1995, Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s); 결장 암종 세포에 결합하는 항체, 예를 들어 C242 (Litton et al 1996, Eur J. Immunol. 26(1):1-9); 항-CD38 항체, 예를 들어 AT 13/5 (Ellis et al., 1995, J. Immunol. 155(2):925-937); 항-CD33 항체, 예를 들어 Hu M195 (Jurcic et al 1995, Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체, 예를 들어 LL2 또는 LymphoCide (Juweid et al 1995, Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s; 항-EpCAM 항체, 예를 들어 17-1A (PANOREX(등록상표)); 항-GpIIb/IIIa 항체, 예를 들어 압식시맙 또는 c7E3 Fab (REOPRO(등록상표)); 항-RSV 항체, 예를 들어 MEDI-493 (SYNAGIS(등록상표)); 항-CMV 항체, 예를 들어 PROTOVTR(등록상표); 항-HIV 항체, 예를 들어 PRO542; 항-간염 항체, 예를 들어 항-Hep B 항체 OSTAVIR(등록상표); 항-CA 125 항체 OvaRex; 항-개별특이형 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 VITAXIN(등록상표); 항-인간 신장 세포 암종 항체, 예를 들어 ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드에 대해 작용하는 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포 암종 (SF-25); 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예를 들어 Smart ID1O 및 항-HLA DR 항체 Oncolym (Lym-1)를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "치료 유효량"은 대상 또는 포유동물에서 질병 또는 질환의 "완화" 또는 "치료"에 효과적인 본 발명의 조성물의 양을 의미한다. 한 실시태양에서, 치료되는 면역 질병이 B-세포 매개 질병일 경우, 치료 유효량은 포유동물에서 B 세포 수의 감소 (B 세포 고갈)를 야기하는 양이다.
"치료"는 대상 또는 포유동물에서 질병 또는 질환의 "치료" 또는 "치료하기"에 효과적인 본 발명의 용도를 의미한다. 일반적으로, 질병 또는 질환의 치료는 질병 또는 질환에 관련된 하나 이상의 증상 또는 의료적 문제의 경감을 수반한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체 및 조성물은 대상 또는 포유동물에서 질병 또는 질환의 발병 또는 재발을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질병에 걸린 대상에서, 본 발명의 항체는 급격한 재발의 억제 또는 치료에 사용될 수 있다. 연속적인 치료 또는 투여는 1일 이상의 치료 중단 없이 적어도 1일을 기준으로 한 치료를 의미한다. 간헐적 치료 또는 투여, 또는 간헐 방식의 치료 또는 투여는 연속적이 아니라 특성상 주기적인 치료를 의미한다. 치료법은 본원에서 연속적이거나 간헐적일 수 있다.
본원에서 사용되는 "변이체" 또는 "변형" 중쇄는 일반적으로 예를 들어 적어도 하나의 시스테인 잔기가 디술피드 연결 형성이 불가능하도록 된, 디술피드 연결 능력이 감소된 중쇄를 의미한다. 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 시스테인은 중쇄의 힌지 구역에 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 연결되는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하고자 한 것이다. 벡터의 한 종류는 그 내부에 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 "플라스미드", 즉 환식 이중가닥 DNA 루프이다. 다른 종류의 벡터는 파지 벡터이다. 또다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터로서, 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 벡터가 그 내부에 도입되는 숙주 세포 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터) 내에서 자가복제될 수 있다. 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "재조합 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태를 갖는다. 본원에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 이것은 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문이다.
"인간 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는" 항체는 다른 인간 FcγR에 결합하는 것보다 유의하게 더 우수한 친화도로 인간 FcγRIIB에 결합한다. 일부 실시태양에서, 인간 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체는 FcγRIIB1 및 FcγRIIB2 모두에 결합하고, FcγRIIA, FcγRI 및 FcγRIII, 및 그의 대립유전자 변이체에 거의 또는 전혀 결합하지 않는다. 상대적 결합 및(또는) 결합 친화도는 효소 결합 면역흡수 분석 (ELISA) 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 포함하되 이로 제한되지 않는, 당업계에서 인정된 다양한 방법으로 입증될 수 있다. 일반적으로, 이것은 본 발명의 항체가 ELISA로 측정시에 FcγRIIA에 결합하는 것보다 적어도 약 1 log 더 높은 농도 반응성으로 FcγRIIB에 결합함을 의미한다. 바람직하게는, 인간 FcγRIIA보다 인간 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체는 본질적으로 인간 FcγRIIA와 교차반응할 수 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "본질적으로 인간 FcγRIIA와 교차반응할 수 없는" 항체는 인간 FcγRIIA에 대한 결합 정도가 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성 면역침전 분석 (RIA)으로 측정시에 FcγRIIB 결합 수준의 10% 미만, 별법으로 8% 미만, 별법으로 6% 미만, 별법으로 4% 미만, 별법으로 2% 미만, 별법으로 1% 미만인 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 FcγRIIB에 대한 Fc 영역의 결합을 길항하는" 항체는 인간 FcγRIIB에 대한 Fc 영역 (예를 들어, 항체, 예를 들어 IgG, 또는 면역어드헤신 또는 다른 Fc 함유 구성체의 Fc 영역)의 결합을 차단 또는 방해한다. 상기 길항 활성은 예를 들어 ELISA에 의해 결정할 수 있다.
II. 본 발명을 수행하는 방식
A. 항- Fc γ RIIB 항체의 생산
(i) FcγRIIB 항원
임의로 다른 분자에 컨쥬게이팅된 가용성 인간 FcγRIIB 또는 그의 단편은 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 예시적인 면역원은 FcγRIIB1 또는 FcγRIIB2의 세포외 도메인을 캐리어 단백질 또는 친화도 태그, 예를 들어 GST 또는 His6와 함께 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 인간 FcγRIIB를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 세포는 천연 공급원으로부터 유도될 수 있거나, 인간 FcγRIIB를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 형태의 인간 FcγRIIB는 당업자가 분명하게 알 수 있을 것이다.
(ii) 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보강제의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성시킬 수 있다. 이 항체는 이중기능성제 또는 유도화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 컨쥬게이션), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 관련 항원을 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제에 컨쥬게이팅시키기 위해 유용할 수 있다.
동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트 (Freund) 완전 보강제와 합한 후 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트, 또는 유도체에 대해 면역처리된다. 1개월 후에, 동물은 프로인트 완전 보강제 중의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 처음 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 부스터된다. 7일 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 동물은 역가 평탄역까지 부스터한다. 바람직하게는, 동물은 상이한 단백질에 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 컨쥬게이팅된 동일한 항원의 컨쥬게이트로 부스터된다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양으로 제조될 수도 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 응집제, 예를 들어 명반을 적절하게 사용한다.
(iii) 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., 1975, Nature 256: 495]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이는 면역처리를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역처리된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역처리될 수 있다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, 1986, Monoclonal antibody: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press)).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배지는 일반적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 라인, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection))에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 (Kozbor, 1984, J. Immunol., 133: 3001; Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker,Inc., New York)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다.
목적하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법(Goding, 상기 문헌)으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 DMEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 본래 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 항체의 재조합 생산은 아래에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
추가의 실시태양에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348: 552-554]에 기재된 기술을 이용하여 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., 1991 Nature, 352: 624-628 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581-597]에서는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 문헌은 사슬 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783), 및 매우 큰 파지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266)을 설명하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.
또한, DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 4,816,567; Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 비-면역글로불린 물질의 코딩 서열의 전부 또는 일부 (예를 들어 단백질 도메인)를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.
대체로, 상기 비-면역글로불린 물질은 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메릭 2가 항체를 생성시킨다.
(iv) 인간화 및 인간 항체
인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 일반적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 1988, 239:1534-1536)을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메릭 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 비인간, 예를 들어 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 서열은 이어서 인간화 항체의 인간 프레임워크 구역 (FR)으로서 허용된다 (Sims et al., 1993, J. Immunol., 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al., 1993, J. Immunol., 151:2623).
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
별법으로, 면역처리시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 구역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험접종시에 인간 항체의 생성을 야기할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551; Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immune, 7:33; 및 Duchosal et al., 1992, Nature 355:258]를 참조한다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수 있다 (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14:309).
(v) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 상기 분자는 정상적으로는 단지 2개의 항원 (즉, 이중특이적 항체, BsAb)에 결합할 것이지만, 추가의 특이성을 갖는 항체, 예를 들어 삼중특이적 항체가 본원에서 사용되는 상기 표현에 포함된다. BsAb의 예는 FcγRIIB에 대해 작용하는 한 항원 결합 부위, 및 예를 들어 B-세포 수용체 (BCR), CD79α 및(또는) CD79β, 종양 세포 상에서 발현되는 항원, IgE 수용체 (FcεR), 예를 들어 비만 세포 및(또는) 호염기구 상에서 IgER에 커플링된 IgE, 예를 들어 NK 및 단핵구 및 대식세포 상의 IgG 수용체 RI (FcγRI) 및 RIII (FcγRIII), 수용체 티로신 키나제 c-kit에 대해 작용하는 다른 항원 결합 부위를 갖는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, BsAb는 FcγRIIB에 대한 제1 결합 특이성 및 세포질 ITAM 모티프를 갖는 활성화 수용체에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. ITAM 모티프 구조는 9-11개 아미노산의 스페이서에 의해 분리된 2개의 티로신을 갖는다. 일반적인 컨센서스 서열은 YxxL/I(x)6-8YxxL이다 (Isakov, N., 1997, J. Leukoc. Biol., 61:6-16). 예시적인 활성화 수용체는 FcεRI, FcγRIII, FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIC를 포함한다. 다른 활성화 수용체는 예를 들어 CD3, CD2, CD1O, CD161, DAP-12, KAR, KARAP, FcεRII, Trem-1, Trem-2, CD28, p44, p46, B 세포 수용체, LMP2A, STAM, STAM-2, GPVI 및 CD40을 포함한다 (예를 들어 Azzoni, et al., 1998, J. Immunol. 161:3493; Kita, et al., 1999, J. Immunol. 162:6901; Merchant, et al., 2000, J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey, et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng, et al., 2001, J. Biol Chem. 276:12999; Propst, et al., 2000, J. Immunol. 165:2214 참조).
한 실시태양에서, BsAb는 FcγRIIB에 대한 제1 결합 특이성 및 FcεRI에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 이중특이적 항체는 추가로 놉-인 홀 (knobs-in-holes) 또는 힌지 부재 항체로서 제조될 수 있다. 이중특이적 항체는 문헌 [Segal et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:1-6]에서 검토된 바 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, 1983, Nature, 305:537-539). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10: 3655-3659]에 개시되어 있다.
상이한 방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 항체 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 항체 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 항체 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특히 중요하지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 항체 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 반쪽에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210]을 참조한다.
W096/27011에 기재된 다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치 않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
3가 이상의 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 문헌 (Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60)에 따라 제조할 수 있다.
(vi) 변이체 힌지 구역을 갖는 항체
본 발명의 항체는 또한 예를 들어 2003년 10월 30일 출원된 미국 특허 출원 10/697,995에 기재된 변이체 중쇄를 포함할 수 있다. 변이체 중쇄를 포함하는 항체는 시스테인 잔기가 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 적어도 하나의 디술피드 형성 시스테인 잔기의 변형을 포함한다. 한 측면에서, 상기 시스테인(들)은 중쇄의 힌지 구역에 존재한다 (따라서, 상기 힌지 구역은 "변이체 힌지 구역"으로 언급되고, 추가로 "힌지 부재"로도 언급될 수 있다).
일부 측면에서, 상기 면역글로불린에는 분자간 (예를 들어 2개의 중쇄 사이에) 또는 분자내 (예를 들어 단일 폴리펩티드 사슬 내의 2개의 시스테인 잔기 사이에) 디술피드 연결을 정상적으로 형성할 수 있는 중쇄 시스테인 잔기의 완전한 레퍼토리가 결여되어 있다. 일반적으로, 바람직하게는, 변형된 (즉, 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된) 시스테인 잔기(들)에 의해 형성되는 디술피드 연결은 항체에 존재하지 않을 경우 면역글로불린의 정상적인 물리화학적 및(또는) 생물학적 특성을 실질적으로 상실시키는 것이다. 반드시는 아니지만, 바람직하게는, 디술피드 연결을 형성할 수 없게 된 시스테인 잔기는 항체의 힌지 구역의 시스테인이다.
변이체 중쇄 또는 변이체 힌지 구역을 갖는 항체는 일반적으로 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 2 내지 11개의 중쇄간 디술피드 연결이 제거된 항체를 숙주 세포에서 발현시키고 상기 항체를 숙주 세포로부터 회수함으로써 제조된다. 상기 항체는 항체 코딩 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있고, 상기 항체는 디술피드 연결 능력이 감소된 변이체 중쇄를 포함하고, 상기 항체는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로부터 회수할 수 있다. 바람직하게는, 상기 중쇄는 면역글로불린 중쇄의 변이체 힌지 구역을 포함하고, 상기 변이체 힌지 구역의 적어도 하나의 시스테인은 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 된 것이다.
변형이 실질적으로 면역글로불린의 생물학적 기능을 감소시키지 않는다면, 면역글로불린 중쇄 내의 임의의 시스테인을 본원에서 설명되는 힌지 시스테인과 유사하게 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 만들 수 있음이 또한 예상된다. 예를 들어, IgM 및 IgE에는 힌지 구역이 결여되어 있지만, 이들은 각각 여분의 중쇄 도메인을 포함하고; 중쇄의 적어도 하나의 (일부 실시태양에서 모든) 시스테인은 중쇄 및(또는) 중쇄를 포함하는 항체의 생물학적 기능을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 본 발명의 방법에서 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 만들 수 있다.
중쇄 힌지 시스테인은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Kabat, 1991, "Sequences of proteins of immunological interest," 상기 문헌). 당업계에 공지된 바와 같이, 힌지 시스테인의 수는 면역글로불린의 클래스 및 서브클래스에 따라 상이하다 (예를 들어, Janeway, 1999, Immunobiology, 4th Ed., (Garland Publishing, NY) 참조). 예를 들어, 인간 IgG1에서, 2개의 힌지 시스테인은 2개의 프롤린에 의해 분리되고, 이들은 통상 분자간 디술피드 연결에서 인접 중쇄 상의 그의 대응물과 페어링된다. 다른 예는 4개의 힌지 시스테인을 포함하는 인간 IgG2, 11개의 힌지 시스테인을 포함하는 IgG3, 및 2개의 힌지 시스테인을 포함하는 IgG4를 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법은 숙주 세포에서 변이체 힌지 구역 (변이체 힌지 구역의 적어도 하나의 시스테인은 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 됨)을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현시키고, 중쇄를 경쇄와 복합체화시켜 생물학적으로 활성인 항체를 형성시키고, 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시태양은 변이체 힌지 구역의 적어도 2, 3 또는 4개의 시스테인이 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 된 것, 변이체 힌지 구역의 약 2 내지 약 11개의 시스테인이 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 된 것 및 변이체 힌지 구역의 모든 시스테인이 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 된 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 본 발명의 항체를 구성하는 경쇄 및 중쇄는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
디술피드 연결 형성에 통상 관련되는 시스테인은 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법, 또는 본원에 기재되는 기준에 비추어 당업자에게 자명한 방법에 의해 디술피드 연결을 형성할 수 없도록 만들 수 있다. 예를 들어, 힌지 시스테인은 다른 아미노산, 예를 들어 디술피드 결합을 형성할 수 없는 세린으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환은 표준 분자생물학 기술, 예를 들어 변형되는 힌지 구역을 코딩하는 핵산 서열의 부위 지정 돌연변이에 의해 달성할 수 있다. 적합한 기술은 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.]에 기재된 것을 포함한다. 변이체 힌지 구역을 갖는 면역글로불린을 생성시키기 위한 다른 기술은 치환되는 시스테인의 코돈이 대체 아미노산의 코돈으로 치환된, 힌지 구역을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함한다. 이어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 다른 적합한 항체 서열, 예를 들어 적절한 경우, 가변 영역 및 Fc 서열을 포함하는 벡터 주쇄 내로 라이게이션될 수 있다.
다른 실시태양에서, 힌지 시스테인은 결실될 수 있다. 아미노산 결실은 표준 분자생물학 기술, 예를 들어 변형되는 힌지 구역을 코딩하는 핵산 서열의 부위 지정 돌연변이에 의해 달성할 수 있다. 적합한 기술은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 것을 포함한다. 변이체 힌지 구역을 갖는 면역글로불린을 생성시키기 위한 다른 기술은 변형되는 시스테인의 코돈이 결실된 힌지 구역을 코딩하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함한다. 이어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 다른 적합한 항체 서열, 예를 들어 적절한 경우, 가변 영역 및 Fc 서열을 포함하는 벡터 주쇄 내로 라이게이션될 수 있다.
(vii) "캐비티 내로의 돌기 (protuberance-into-cavity)" 전략을 사용하여 형성된 이중특이적 항체.
일부 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 이종올리고머화를 위해 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 계면을 공학처리하기 위해 사용되는, "놉 인투 홀 (knobs into holes)"로도 언급되는 "캐비티 내로의 돌기" 전략을 사용하여 형성된다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 적어도 일부의 CH3 도메인을 포함한다. Fc 서열의 CH3 도메인 내의 "놉 인투 홀" 돌연변이는 동종이량체의 형성을 크게 감소시키는 것으로 보고되었다 (예를 들어, Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology, 16:677-681 참조). "돌기"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어 티로신 또는 트립토판)으로 치환함으로써 제조된다. 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티"는 보다 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)을 치환함으로써 제2 폴리펩티드의 계면 상에 임의로 생성된다. 적합하게 위치하고 적합한 치수를 갖는 돌기 또는 캐비티가 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면에 존재할 경우, 단지 각각 대응하는 캐비티 또는 돌기를 인접한 계면에서 공학처리하는 것이 필요하다. 돌기 및 캐비티는 합성 수단, 예를 들어 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 변형 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 놉 인투 홀에 대한 추가의 설명에 대해서는, 미국 특허 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333을 참조한다.
일부 실시태양에서, 전장 이중특이적 항-FcγRIIB 및 항-"활성화 수용체" (예를 들어 IgER) 항체를 생성시키기 위해 "놉 인투 홀" 기술을 사용하여 이종이량체화 (이종이량체화)를 촉진시켰다. 한 실시태양에서, "knob" 돌연변이 (T366W)를 Fc 영역에 도입함으로써 항-FcγRIIB 성분 (예를 들어 p5A6.11.Knob), 및 "hole" 돌연변이 (T366S, L368A, Y407V)를 도입함으로써 항-IgER 성분 (예를 들어 p22E7.11.Hole)에 대한 구성체를 제조하였다. 다른 실시태양에서, 예를 들어 본원에 개시된 방법 또는 문헌 [Merchant et al., (1998), 상기 문헌, 또는 미국 특허 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333]에 개시된 방법에 의해 "hole" 돌연변이를 그의 Fc 영역에 도입함으로써 항-FcγRIIB 성분 (예를 들어 p5A6.11.Hole), 및 "knob" 돌연변이를 그의 Fc 영역에 도입함으로써 항-IgER 성분 (예를 들어 p22E7.11.Knob)에 대한 구성체를 제조하였다.
"캐비티 내로의 돌기" 전략을 사용하여 이종다량체를 제조하는 일반적인 방법은 돌기를 코딩하도록 본래의 폴리뉴클레오티드로부터 변형된 제1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 캐비티를 코딩하도록 본래의 폴리뉴클레오티드로부터 변형된 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 하나의 또는 별개의 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 공통의 숙주 세포에서 발현되어 숙주 세포 배양액으로부터 이종다량체를 회수하거나, 별개의 숙주 세포로부터 발현되어 회수 및 정제된 후, 이종다량체를 형성하게 된다. 일부 실시태양에서, 형성된 이종다량체는 다량체 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 힌지 부재 이중특이적 항체를 제조하기 위해 놉 인투 홀 전략을 변이체 힌지 구역 구성체와 조합한다.
B. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명은 또한 본원에 개시되는 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체 제조를 위한 재조합 기술을 제공한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체 코딩 폴리뉴클레오티드는 단리되어 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입된다. 항체 코딩 DNA는 쉽게 단리되고, 예를 들어 항체 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 통상적인 과정에 의해 서열결정된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상 (이로 제한되지 않음)을 포함한다.
(i) 시그날 서열 성분
본 발명의 항체는 직접 및 이종성 항체와의 융합 항체로서 재조합 방법으로 제조할 수 있다. 한 실시태양에서, 이종성 항체는 시그날 서열 또는 성숙 단백질 또는 항체의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 항체이다. 선택되는 이종성 시그날 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 시그날 펩티다제에 의한 분해)되는 것이다. 천연 항체 시그날 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 시그날 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 시그날 서열에 의해 치환된다. 효모 분비를 위해, 천연 시그날 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 팩터 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 알파-팩터 리더), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, WO 90/13646에 기재된 시그날에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 시그날이 이용가능하다. 상기 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션된다.
다른 실시태양에서, 항체의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 발생하고, 따라서 각각의 시스트론 내에 분비 시그날 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 세포질 내에서 발현되고, 폴딩되고 조립되어 기능성 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 조립을 허용한다 (Proba and Plukthun, 1995, Gene, 159:203).
(ii) 복제 기점 성분
발현 및 클로닝 벡터는 모두 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 벡터 클로닝시에 상기 서열은 숙주 염색체 DNA에 무관하게 벡터가 복제하도록 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포에 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).
(iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커로도 언급되는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.
선택 방식의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택법에서 생존할 수 있다. 상기 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉세이트(Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 또는 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어, 아미노글리코사이드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 포함하는 배지에서 세포의 성장에 의해 선택될 수 있다 (미국 특허 4,965,199를 참조).
효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., 1979, Nature, 282:39). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, 1977, Genetics, 85:12). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병소의 존재는 트립토판 부재시의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 기탁 번호 20,622 또는 38,626의 균주)는 Leu2 유전자를 포함하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1에서 유래한 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 문헌 [K. lactis. 1990, Van den Berg, Bio/Technology, 8:135]에 보고되었다. 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 개시되어 있다 (Fleer et al., 1991, Bio/Technology, 9: 968-975).
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 특정 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 또한 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 포함할 것이다.
프로모터 서열이 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 당단백질 유전자는 전사가 개시되는 부위의 약 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 당단백질 유전자의 3' 말단에 존재한다. 상기 모든 서열은 당단백질 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소용 프로모터 영역을 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 항체 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 조기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 베타-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대해서는 문헌 [Reyes et al., 1982, Nature 297: 598-601]을 참조한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 엘리먼트 성분
보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 당단백질 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 엘리먼트는 문헌 [Yaniv, 1982, Nature 297: 17-18]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항체 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터부터 부위 5'에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. W094/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 번역 강도의 조절
본 발명의 면역글로불린은 또한 분비되어 적절하게 조립된 전장 항체의 수율을 최대화하기 위해 발현된 경쇄 및 중쇄의 정량적 비율이 조절될 수 있는 발현 시스템으로부터 발현될 수 있다. 상기 조절은 경쇄 및 중쇄의 번역 강도를 동시에 조절함으로써 달성된다.
번역 강도를 조절하기 위한 한 기술은 문헌 [Simmons et al., 미국 특허 5, 840,523 및 Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147]에 개시되어 있다. 이 기술은 시스트론 내의 번역 개시 구역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 제시된 TIR에 대해, 일정 범위의 번역 강도를 갖는 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체를 생성시켜 특정 사슬의 요구되는 발현 수준을 위해 상기 인자를 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 변경을 야기하는 통상적인 돌연변이 생성 기술에 의해 생성될 수 있지만, 뉴클레오티드 서열의 침묵 (silent) 변경이 바람직하다. TIR의 변경은 예를 들어 시그날 서열의 변형과 함께 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격의 변형을 포함할 수 있다. 돌연변이체 시그날 서열을 생성시키기 위한 바람직한 한 방법은 시그날 서열의 아미노산 서열을 변경시키지 않는 코딩 서열의 시작부에 "코돈 은행 (codon bank)"을 생성시키는 것이다 (즉, 변경은 침묵 변경이다). 이것은 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치를 변경시킴으로써 달성될 수 있고, 추가로, 일부 아미노산, 예를 들어 류신, 세린 및 아르기닌은 코돈 은행 제조시에 복잡성을 추가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 상기 돌연변이 생성 방법은 문헌 [Yansura et al., 1992, METHODS: A Companion to Methods in Enzymol, 4:151-158]에 상세하게 기재되어 있다.
바람직하게는, 그 내부의 각각의 시스트론에 대한 특정 범위의 TIR 강도를 갖는 한 세트의 벡터가 생성된다. 상기 제한된 세트는 상이한 TIR 강도 조합 하에서 각각의 사슬의 발현 수준 및 전장 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 문헌 [Simmons et al., 미국 특허 5, 840,523 및 Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147]에 기재된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 결정될 수 있다. 본 발명을 위해, 벡터 내의 특정 쌍의 TIR에 대한 번역 강도 조합은 (N-경쇄, M-중쇄)로 표시되고, N은 경쇄의 상대 TIR 강도이고, M은 중쇄의 상대 TIR 강도이다. 예를 들어, (3-경쇄, 7-중쇄)는 경쇄 발현을 위해 약 3의 상대 TIR 강도 및 중쇄 발현을 위해 약 7의 상대 TIR 강도를 제공한다. 번역 강도 비교를 기초로 하여, 발명의 발현 벡터 구성체를 조합하기 위해 요구되는 개개의 TIR을 선택한다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터 내에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 상기한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵생물은 원시세균 및 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 또한, 바람직하게는 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비하고, 추가의 프로테아제 억제제가 세포 배양액에 도입되는 것이 바람직할 수 있다. 원핵생물 숙주 세포는 또한 티오레독신 및(또는) 글루타치온 경로에 돌연변이(들)을 포함할 수 있다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트성 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통의 제빵용 효모가 저등 진핵 숙주 미생물 사이에 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 일반적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다,
글리코실화 항체 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포성 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 초파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 이용가능하고, 상기 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 이용할 수 있다. 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 감자의 식물 세포 배양액도 숙주로서 이용할 수 있다.
척추동물 숙주 세포가 널리 사용되고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 마우스 골수종 세포, 예를 들어 NSO (예를 들어 RCB0213, 1992, Bio/Technology 10:169) 및 SP2/0 세포 (예를 들어 SP2/0-Ag14 세포, ATCC CRL 1581); 래트 골수종 세포, 예를 들어 YB2/0 세포 (예를 들어 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O 세포, ATCC CRL 1662); 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다. CHO 세포가 본 발명의 실시에 바람직한 세포주이고, CHO-K1, DUK-B11, CHO-DP12, CHO-DG44 (Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555 (1986)), 및 Lec13이 예시적인 숙주 세포주이다. CHO-K, DUK-B11, DG44 또는 CHO-DP12 숙주 세포의 경우에, 이들은 그 내부에서 발현되는 단백질을 푸코실화시키는 능력이 결핍되도록 변경될 수 있다.
본 발명은 하이브리도마 세포에도 적용될 수 있다. 용어 "하이브리도마"는 면역학적 기원의 불사 세포주와 항체 생산 세포의 융합에 의해 생성되는 하이브리드 세포주를 의미한다. 상기 용어는 혈장 세포와 후속 융합되는, 인간 세포와 뮤린 골수종 세포주의 융합 결과인, 트리오마 (trioma) 세포주로 공지된 헤테로하이브리드 골수종 융합체의 자손체를 포함한다. 또한, 상기 용어는 항체를 생산하는 임의의 불사 하이브리드 세포주, 예를 들어 쿠아드로마를 포함하는 의미이다 (예를 들어, Milstein et al., 1983, Nature, 537:3053 참조). 하이브리드 세포주는 인간 및 마우스를 포함하여 임의의 종에서 유도될 수 있다.
가장 바람직한 실시태양에서, 포유동물 세포는 목적하는 항체를 코딩하는 단리된 외인성 핵산으로 형질전환된 비-하이브리도마 포유동물 세포이다. "외인성 핵산" 또는 "이종성 핵산"은 세포에 대해 외래 물질이거나, 세포에 상동성이지만 핵산이 통상 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내에 위치하는 핵산 서열을 의미한다.
(viii) 숙주 세포의 배양
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마(Sigma)), 최소 영양 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58:44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102:225], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 외피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
모든 배양 배지는 일반적으로 다음 카테고리의 하나 이상으로부터의 적어도 하나의 성분을 제공한다:
1) 대체로 탄수화물 형태의 에너지원, 예를 들어 글루코스;
2) 모든 필수 아미노산, 및 대체로 20개의 아미노산의 기본적인 세트 + 시스틴;
3) 저농도로 요구되는 비타민 및(또는) 다른 유기 화합물;
4) 유리 지방산; 및
5) 일반적으로 매우 낮은 농도, 대체로 마이크로몰 범위로 요구되는 무기 화합물 또는 자연발생 성분으로서 정의되는 미량 원소.
배양 배지는 바람직하게는 혈청이 존재하지 않고, 예를 들어 약 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만, 보다 바람직하게는 0 내지 0.1%의 혈청, 및 다른 동물-유래 단백질을 포함한다. 그러나, 이들 성분은 필요한 경우 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 배양 배지는 과량의 아미노산을 포함한다. 과량으로 제공되는 아미노산은 예를 들어 Asn, Asp, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Asn, Asp, Lys, Met, Ser 및 Trp이 과량으로 제공된다. 예를 들어, 아미노산, 비타민, 미량 원소 및 다른 배지 성분은 유럽 특허 EP 307,247 또는 미국 특허 6,180,401에 제시된 범위의 1배 또는 2배의 양으로 사용될 수 있다. 상기 두 특허는 본원에 참고로 포함된다.
요구되는 단백질을 발현하고 요구되는 탄수화물을 특정 위치에 부가할 수 있는 포유동물 세포의 배양을 위해, 배양되는 숙주 세포에 따라 많은 배양 조건을 사용할 수 있다. 포유동물 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있거나 (W. Louis Cleveland et al., 1983, J. Immunol. Methods 56:221-234) 또는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있고 (예를 들어, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B.D., eds. Oxford University Press, New York (1992) 참조), 선택되는 특정 숙주 세포에 따라 상이할 수 있다.
(ix) 항체 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167]에는 이. 콜라이의 주변 세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차가 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 세포 페이스트는 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore) 펠리콘(Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al., 1986, EMBO J. 5:15671575). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적 안정성 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX (등록상표) 수지 (J.T. Baker, 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (등록상표) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 당단백질은 제제로부터 푸코스 함유 당단백질을 제거하여 푸코스 미함유 당단백질을 농축하기 위해 렉틴 기재 (예를 들어 렉틴 친화도 컬럼) 상의 흡착을 이용하여 정제할 수 있다.
(x) 항체 활성 분석
본 발명의 면역글로불린은 당업계에 공지된 상이한 분석에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능에 대해 특성화될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 항체가 다른 결합 표적에 비해 면역원에 결합하는 선택성을 비교하는 것은 중요하다. 특히, FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 다른 FcγR, 특히 FcγRIIA에 대해 결합하지 않거나 불량한 결합 친화도를 보일 것이다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 본원에서 생산된 면역글로불린은 이들의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 면역글로불린은 이들의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 당업계에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 분석은 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석, ELISA (효소-결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 형광 면역분석, 및 단백질 A 면역분석과 같은 기술을 사용한 임의의 직접 또는 경쟁적 결합 분석을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 항원 결합 분석은 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
정제된 면역글로불린은 N-말단 서열 결정, 아미노산 분석, 비변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하여 이로 제한되지 않는 일련의 분석에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 단백질의 정량화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 발현된 단백질의 샘플은 쿠마시 (Coomassie) 염색 SDS-PAGE 상에서 그의 정량적 강도에 대해 비교할 수 있다. 별법으로, 목적하는 특이적 밴드(들) (예를 들어 전장 밴드)는 예를 들어 웨스턴 블롯 겔 분석 및(또는) AME5-RP 분석에 의해 검출할 수 있다.
C. 제약 제제
항체의 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수성 용액의 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 완충액, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 미만의 잔기) 항체; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈(등록상표), PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제제는 추가로 다른 항체 또는 화학치료제를 포함할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 함께 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내의 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용하는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 성형 용품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태인 항체 함유 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장기간 동안 그 내부에 유지될 때, 항체는 37℃에서 습기에 노출되어 변성 또는 응집하여 생물학적 활성을 상실하고, 가능하게는 면역원성이 변경될 수 있다. 합리적인 전략은 수반되는 메카니즘에 따라 안정화를 고안할 수 있다. 예를 들어, 티오-디술파이드 상호 교환을 통해 분자간 S-S 결합 형성이 되도록 하는 응집 메카니즘이 밝혀질 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다.
D. 항체에 대한 비치료적 용도
본 발명의 항체는 친화도 정제제로서 사용할 수 있다. 본 공정에서, 항체를 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 세파덱스(Sephadex)(등록상표) 수지 또는 여과지와 같은 고체상에 고정화시킨다. 고정화 항체를 정제하려는 항원을 함유하는 시료와 접촉시킨 후, 고정화 항체에 결합된 정제하려는 항원을 제외한 시료 내의 실질적으로 모든 물질을 제거시킬 적합한 용매로 지지체를 세척한다. 마지막으로, 지지체를 항체로부터 항원을 유리시킬 다른 적합한 용매, 예를 들어 글리신 완충액, pH 5.0으로 세척한다.
항체는 또한 진단 분석, 예를 들어 특이적 세포, 조직, 또는 혈청에서 목적하는 항원의 발현 검출에 유용할 수 있다. 진단 용도를 위해, 항체는 일반적으로 검출가능 잔기로 표지될 것이다. 많은 표지가 이용가능하고, 일반적으로 다음 범주로 분류될 수 있다.
(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I. 항체는 문헌 [예를 들어 Current Protocols in Immunology Volumes 1 and 2, Coligen et al. Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사성은 신틸레이션 계수를 사용하여 측정할 수 있다.
(b) 형광 라벨, 예를 들어 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민 (Lissamine), 파이코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)가 이용가능하다. 형광 라벨은 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 사용하여 항체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 형광은 형광계(fluorimeter)를 사용하여 정량할 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 라벨이 이용가능하고, 미국 특허 4,275,149에서는 이들 중 일부를 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서 색 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광광도계로 측정할 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하기 위한 기술은 상기하였다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전기적으로 여기된 다음, 측정할 수 있는 (예를 들어, 화학발광분석기를 사용하여) 광을 방출하거나 형광 수여체에 에너지를 공여한다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제; 미국 특허 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 컨쥬게이팅시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Method in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3', 5,5'-테트라메틸 벤지딘 염산염 (TMB))를 산화시키기 위해서 수소 퍼옥시다제를 이용한다;
(ii) 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼리성 포스파타제 (AP); 및
(iii) 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-베타-D-갈락토시다제와 베타-D-갈락토시다제 (베타-D-Gal)
를 포함한다.
많은 다른 효소-기질 조합물이 당업계의 숙련인에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 리뷰를 위해, 미국 특허 4,275,149 및 4,318,980를 참조한다.
때때로, 표지는 항체에 간접적으로 컨쥬게이팅된다. 당업자는 이를 달성하는 다양한 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 컨쥬게이팅될 수 있고, 상기 표지의 3개의 넓은 범위 중의 어떠한 표지도 아비딘과, 또는 그 반대 형태로 컨쥬게이팅될 수 있다. 비오틴은 아미딘에 선택적으로 결합하고, 따라서, 표지는 상기 간접적인 방식으로 항체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 별법으로, 표지와 항체의 간접적인 컨쥬게이팅을 달성하기 위해서, 항체는 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 컨쥬게이팅되고, 상기한 상이한 표지 종류 중의 하나가 항-합텐 항체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 컨쥬게이팅된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 컨쥬게이팅을 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 항체는 표지될 필요가 없고, 그의 존재는 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 공지의 분석 방법, 예를 들어 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역 침전 분석에 사용할 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].
또한, 항체는 생체내 진단 분석에 이용될 수 있다. 일반적으로, 항체는 면역섬광조영술을 사용하여 항원 또는 이를 발현하는 세포를 편재화할 수 있도록 방사성 핵종 (예를 들어 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지된다.
E. 항체의 생체내 용도
(i) FcγRIIB (CD32B)의 억제 활성 감소: 항체 Fc 결합의 방해
다른 실시태양에서, 항-FcγRIIB 항체는 치료제의 기능을 향상시키기 위해서 치료제와 동시 투여된다. 예를 들어, 항-FcγRIIB는 FcγRIIB에 대한 IgG 결합을 차단하여 면역 반응의 FcγRIIB-매개 억제를 방지하기 위해서 포유동물에 투여된다. 이것은 IgG 치료 항체의 세포독성을 향상시킨다. 예를 들어, 치료 항체가 종양 항원에 특이적인 경우에, 본 발명의 항-FcγRIIB와 항-종양 항원 항체의 동시 투여는 항-종양 항원 항체의 세포독성을 향상시킨다.
상기 설명한 바와 같은 많은 치료 항체가 개발되었고, 다양한 질병, 예를 들어 암의 치료를 위해 승인되었다. 예를 들어, RITUXAN(등록상표)(리툭시맙) (이덱 팜(IDEC Pharm)/제넨테크 인크.)은 B 세포 림프종 치료에 사용되고, AVASTIN™(베바치주맙) (제넨테크 인크.)은 전이성 결직장암 치료에 사용되고, HERCEPTIN(등록상표)(트라추맙) (제넨테크 인크.)은 전이성 유방암 치료에 사용되는 인간화 항-HER2 모노클로날 항체이다. 상기 치료를 위해 개발된 모든 모노클로날 항체에 의한 암의 치료 메카니즘이 완전히 이해된 것은 아니지만, 적어도 몇몇 경우에, 항체 요법의 유효성의 일부는 면역 효과기 기능의 동원에 기인한 것일 수 있다 (Houghton et al., 2000, Nature Medicine, 6:313-374; Clynes et al., 2000, Nature Medicine, 6:433-446). 졸레어(등록상표) (오말리주맙) (제넨테크 인크.)은 알레르기 치료에 사용되는 항-IgE 항체이다.
FcγRIIB는 림프양 및 골수계 세포 상에서 발현되지만, 자연 킬러 세포 상에서는 발현되지 않고, 억제 수용체이다. 활성화시에, FcγRIIB는 예를 들어 대식세포, 자연 킬러 및 비만 세포를 활성화시키는 FcγRIII 신호전달을 억제한다. FcγRIIB의 억제 (예를 들어 FcγRIIB에 대한 Fc 결합의 차단)은 면역 효과기 기능에 대한 그의 억제 효과를 약화시켜 MAb 요법을 돕는다. 문헌 [Ravetch, J., WO O1/79299]에는 FcγRIIB에 대한 Fc 영역의 친화도를 감소시켜 세포 활성화의 SHIP-매개 억제를 제한함으로써 항-종양 항체의 세포독성을 향상시키는 방법이 기재되어 있다.
한 실시태양에서, FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체는 그 치료를 필요로 하는 포유동물에서 항-종양 항체와 함께 투여된다. FcγRIIA를 포함하여 다른 FcγR에 의한 면역 효과기 반응 활성화가 손상되지 않도록 FcγRIIB에 대한 선택성이 요구된다. FcγRIIA와의 교차반응에 실패함으로써, FcγRIIB의 억제 기능은 보다 효율적으로 차단되고, 이에 의해 동시치료제의 효과를 더욱 향상시킨다.
한 실시태양에서, 본 발명의 항-FcγRIIB 항체는 IgG 항체의 결합을 차단하여 FcγRIIB의 억제 효과를 차단하고, 예를 들어 B 세포 증식을 향상시키기 위해 포유동물에게 투여된다.
(ii) FcγRIIB의 억제 활성: 활성화 수용체와의 동시 응집:
생체 내에서, FcγRIIB는 비제한적인 예로서 B 세포 항원 수용체 (BCR), IgE에 대한 고친화도 수용체 (IgER 또는 FcεRI), FcγRIIA, 및 c-kit 수용체 (FcγRIII)을 포함하여 다양한 활성화 수용체와 동시 응집될 수 있다. 비제한적인 예로서 활성화 수용체는 면역 효과기 반응에 대해 활성화 활성을 갖는 트랜스멤브레인 단백질이고, ITAM 활성화 모티프를 포함한다. FcγRIIB는 FcγRIIB와 활성화 수용체의 동시 응집에 의해 활성화되고, 활성화 수용체를 통해 전달되는 시그날을 약화시킨다. 현재까지, FcγRIIB는 자가응집 또는 동종이량체화에 의해 인산화되는 것으로 밝혀지지 않았다. FcγRIIB 수용체는 인산화된 ITAM (활성화 모티프)를 발현하는 다른 수용체와 실험적으로 이종이량체화되거나 또는 동시 응집 (또는 동시 라이게이션)되었고, 단백질 티로신 키나제 (PTK)와의 간접적인 회합에 의해 FcγRIIB ITIM이 인산화될 수 있다. 인산화된 FcγRIIB ITIM은 SH2 도메인 함유 포스파타제 SHIP (이노시톨 폴리포스페이트 5'-포스파타제)을 동원하고, ITAM-촉발 칼슘 이동 및 세포 증식을 억제한다 (Daeron et al., 1995, Immunity 3, 635; Malbec et al., 1998, J. Immunol. 169, 1647; Ono et al., 1996, Nature, 383, 263). 순 효과는 칼슘 유입을 차단하고, 지속적인 칼슘 신호전달을 억제하여 칼슘-의존성 과정, 예를 들어 탈과립화, 포식작용, ADCC 및 시토킨 방출을 억제하지만 (Ravetch et al., 2000, Science, 290:84-89), 신호전달의 일부 FcγRIIB-매개 차단은 또한 칼슘과 무관할 수 있다. B 세포에서 증식의 정지는 ITIM 경로에 의존적이다.
FcγRIIB 억제 활성의 활성화는 FcγRIIB에 특이적인 모노클로날 항체 및 관련 활성화 수용체의 간접적인 가교결합에 의해 달성되었다. 간접적인 가교결합 시약은 비오티닐화 모노클로날 항체, 뮤린 모노클로날 IgG의 Fc 부분에 특이적인 폴리클로날 항체 및 억제제와 활성화 수용체를 연결시키는 면역복합체를 형성하는 다가 항원에 대한 아비딘을 포함한다. 대부분의 실험 모델은 뮤린 B 세포 또는 비만 세포 및 뮤린 FcγRII 및 FcγRIII 수용체 모두와 교차반응하는 모노클로날 항체 (래트 G4.2)의 사용을 설명한 바 있다.
본 발명에 따르면, 모노클로날 항-인간 FcγRIIB Fab 및 활성화 수용체에 특이적인 모노클로날 Fab를 포함하는 이종-2기능성 항체는 당업계에 공지된 화학적 또는 유전공학적 방법으로 제조한다.
상기 2기능성 항체의 치료 효능은 염증 및 알레르기에 관련되는 시그날의 약화를 포함할 것이다. IgE 및 알레르겐 (FcεR을 통한)에 의해 활성화될 때, 비만 세포 및 호염기구는 혈관 및 근육 세포에 대해 작용하고 염증성 세포를 동원하는 염증 매개체 및 시토킨을 분비한다. 다시, 염증성 세포는 연속적인 과정에서 염증 매개체를 분비하고, 염증성 세포를 동원하여 장기간 지속되는 염증을 야기한다. 따라서, IgE 유도 비만 세포 활성화 조절 수단은 염증 반응의 개시를 방해함으로써 알레르기 질환의 치료를 위한 치료 방법을 제공한다. 상기한 바와 같이, FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편 및 예를 들어 FcεRI 또는 IgE에 의해 결합된 FcεRI에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 추가로 포함하는 2기능성 항체는 FcγRIIB의 억제 활성을 통한 IgE-매개 활성화를 약화시킨다.
추가의 2기능성 항체의 예 (예를 들어 이중특이적 항체)는 FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편, 및 천식 (모노클로날 항-인간 FcγRIIB Fab 및 FcεRI에 특이적인 모노클로날 Fab, IgE에 의해 결합된 FcεRI, 또는 CD23), 류마티스 관절염 및 전신 홍반성 루푸스 (모노클로날 항-인간 FcγRIIB Fab 및 FcγRI에 특이적인 모노클로날 Fab), 건선 (모노클로날 항-인간 FcγRIIB Fab 및 CD11a에 특이적인 모노클로날 Fab), 면역 매개 저혈소판증, 류마티스 관절염 및 전신 홍반성 루푸스 (모노클로날 항-인간 FcγRIIB Fab 및 FcγRIII에 특이적인 모노클로날 Fab (CD16) 또는 CD4), 크론병 및 궤양성 대장염 (모노클로날 항-인간 FcγRIIB Fab 및 알파4베타7 인테그린, 베타7 인테그린 서브유닛, 또는 알파 4 인테그린 서브유닛에 특이적인 모노클로날 Fab 또는 상기 모노클로날 항체의 결합 부분), 및 비만 세포, 호염기구, B 세포, 단핵구, 자연 킬러 세포, 호중구 및 수지상 세포와 같은 세포가 능동적으로 관여되는 다른 자가면역 질환에 관련되는 활성화 수용체에 결합하는 제2 항체 또는 그의 단편의 조합물을 포함한다. 상이한 자가면역 질병이 상기 정의 섹션에서 설명된 바 있다. 또한, 항체는 질병과 관련된 유의한 면역복합체 성분이 존재하는 자가면역 질병의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 염증 촉진 시그날 및(또는) 활성화 수용체에 의해 매개되는 B 세포 활성화를 억제하기 위해서 항체로 치료되는 포유동물에서 억제성 FcγRIIB 수용체의 활성화를 위해 사용된다. 따라서, 항체는 상기한 바와 같은 염증성 질환 및(또는) 자가면역 질병 치료에 사용된다. FcγRIIB 억제 기능의 활성화는 FcγRIIB 및 활성화 수용체를 직접 가교결합시키는 본 발명의 이중특이적 항체 또는 FcγRIIB 및 활성화 수용체를 간접적으로 가교결합시키는 항체에 의해 달성된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 활성화-관련 탈과립화를 억제한다. 활성화-관련 탈과립화의 억제는 히스타민 방출 억제와 관련되고 히스타민 방출 억제에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 총 히스타민에 대해 적어도 70%의 히스타민 방출을 억제한다. 추가의 실시태양에서, 히스타민 방출의 억제는 70% 내지 100%의 각각의 연속적인 정수를 포함하여 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%이고, 히스타민 방출의 100% 감소는 백그라운드 히스타민 방출과 동일하다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적합한 투여량은 치료되는 질병의 종류, 질병의 심도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전에 시행된 요법, 항체에 대한 환자의 임상력 및 반응, 의사의 판단에 따라 결정될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 적절하게 투여된다.
질병의 종류 및 심도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1-20 mg/kg)이 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 일반적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 상태에 따라 수일에 걸쳐 또는 더 긴 기간에 걸친 반복 투여를 위해, 치료는 바람직한 질병 증상 억제가 발생할 때까지 유지된다. 그러나, 다른 투여 요법도 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 종래의 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
항체 조성물은 우수 의료 실무에 따른 방식으로 제제화, 투여 단위화되고 투여될 것이다. 이러한 측면에서 고려 인자는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개인 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여되는 항체의 "치료 유효량"은 상기 고려 사항에 의해 결정되고, 질병 또는 질환의 예방, 경감 또는 치료에 필요한 최소량이다. 항체는 임의로 문제되는 질환의 예방 또는 치료에 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제제화되지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 유효량의 상기 제제는 제제에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 상기 논의한 다른 인자에 의해 결정된다. 이들은 일반적으로 상기 사용한 것과 동일한 투여량 및 투여 경로 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 진입구를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는 스토퍼 (stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 주입된다.
본 발명은 추가로 예를 들어 암 치료에 유용한 물질을 포함하는 제조품 및 키트를 제공한다. 제조품은 라벨이 존재하는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 기재된 항체를 그 내부에 포함하는 조성물을 보유한다. 조성물 내의 활성제는 특정 항체이다. 용기 상의 라벨은 조성물이 특정 질병 또는 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용됨을 나타내고, 상기한 바와 같은 생체 내 사용을 위한 지시 사항을 나타낼 수도 있다.
본 발명의 키트는 상기한 용기 및 완충액을 포함하는 제2 용기를 포함한다. 키트는 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 지시서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 염증성 세포 (예를 들어 백혈구) 부착, 이동 및 활성화가 수반되는 자가면역 질병, 예를 들어 류마티스 관절염 및 루푸스의 치료를 위해, 본 발명의 항체는 예를 들어 항-LFA-1 항체 (예를 들어 항-CD11a 또는 항-CD18 항체) 또는 항-ICAM 항체 예를 들어 ICAM-1, -2, 또는 -3과 동시 투여될 수 있다. 본 발명의 항체와 조합되어 류마티스 관절염을 치료하기 위한 추가의 약제는 Enbrel™, DMARDS, 예를 들어 메토트렉세이트 및 NSAID (비스테로이드성 항-염증성 약물)을 포함한다. 본 발명의 항체보다는 하나 초과의 상기 다른 활성제가 사용될 수도 있다. 추가로, 인슐린은 당뇨병 치료에, 항-IgE는 천식 치료에, 항-CD11a는 건선 치료에, 항-알파4베타7 및 성장 호르몬 (GH)은 염증성 장 질환 치료에 사용될 수 있다.
또한, 제제는 유효량의 혈당강하제와 함께 적합하게 투여된다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "혈당강하제"는 글루코스 대사 조절에 유용한 화합물, 바람직하게는 경구 약제를 의미한다. 인슐린 및 췌장에 의한 인슐린의 분비를 야기하는 경구 혈당강하제의 술포닐우레아 클래스가 인간에게 사용하기에 보다 바람직하다. 그 예는 글리부리드, 글리피지드 및 글리클라지드를 포함한다. 또한, 인슐린 감수성을 향상시키거나 인슐린 감수성인 약제, 예를 들어 비구아니드 (메트포르민 및 펜포르민 포함) 및 티아졸리덴디온, 예를 들어 REZULINTM™ (트로글리타존) 브랜드 인슐린-감작제, 및 PPAR-감마 핵 수용체에 결합하는 다른 화합물이 상기 정의에 포함되고, 역시 바람직하다.
혈당강하제는 비경구, 비내, 경구 또는 다른 임의의 효과적인 경로를 포함하여 임의의 적합한 기술에 의해 포유동물에게 투여된다. 가장 바람직하게는, 투여는 경구 경로로 투여된다. 예를 들어, 업존 (Upjohn)에서 1.25, 2.5 및 5 mg 정제 농도로 시판하는 MICRONASE™ 정제 (글리부리드)가 경구 투여에 적합하다. 상기 요법에서 2형 당뇨병에 대한 통상적인 유지 용량은 일반적으로 약 1.25 내지 20 mg/일이고, 단일 투여로 또는 적절한 경우 1일에 걸쳐 분할 투여될 수 있다[Physician's Desk Reference, 2563-2565 (1995)]. 처방전에 의해 입수가능한 글리부리드계 정제의 다른 예는 GLYNASE™ 브랜드 약물 (업존) 및 DIABETA™ 브랜드 약물 (획스트-로우셀 (Hoechst-Roussel))을 포함한다. GLUCOTROL™ (프라트 (Pratt))는 5- 및 10-mg 강도로 입수가능한 글리피지드 (1-시클로헥실-3-(p-(2-(5-메틸피라진 카르복스아미드)에틸)페닐)술포닐)우레아) 정제의 상표명이고, 섭생 조절 후에 혈당강하 요법을 필요로 하는 2형 당뇨병 환자 또는 다른 술포닐우레아에 반응하지 않는 환자에게 처방된다 [Physician's Desk Reference, 1902-1903 (1995)]. 술포닐우레아 이외의 다른 혈당강하제, 예를 들어 비구아니드 (예를 들어 메트포르민 및 펜포르민) 또는 티아졸리딘디온 (예를 들어 트로글리토존), 또는 인슐린 작용에 영향을 주는 다른 약물도 사용할 수 있다. 티아졸리딘디온이 펩티드와 함께 사용될 경우, 현재 사용되는 것과 동일한 수준으로 또는 다소 낮은 수준으로 사용되고, 이 수준은 펩티드 단독 사용시에 또는 디온과 함께 사용시에 보이는 효과에 대해 조정될 수 있다. 단독으로 사용되는 트로글리타존 (REZULINTM™)의 전형적인 용량은 약 100-1000 mg/일, 보다 바람직하게는 200-800 mg/일이고, 이 범위는 본 발명에 적용될 수 있다 [예를 들어, Ghazzi et ah, Diabetes, 46:433-439 (1997) 참조]. 트로글리타존보다 더 강력한 인슐린-감작제인 다른 티아졸리딘디온은 보다 작은 용량으로 사용될 것이다.
F. 물질의 기탁
다음 하이브리도마 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC, 미국 20110-2209 버지니아주 매내사스 10801 유니버시티 불리바드)에 기탁하였다:
하이브리도마/항체 명칭 ATCC 번호 기탁일
FcγRIIB 5A6.2.1 PTA-4614 2002년 8월 28일
상기 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약 (부다페스트 조약)의 규정 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존가능한 배양의 유지를 보장한다. 세포주는 부다페스트 조약의 규정 하에 ATCC로부터 이용가능할 것이고, 이는 제넨테크와 ATCC 사이의 협정에 따르고, (a) 37 CFR §1.14 및 35 USC §122 하에 청장에 의해 자격이 인정된 사람이 특허 출원 계류 동안 배양액을 이용할 수 있고, (b) 기탁된 배양액의 공중 이용성에 대한 모든 제한은 특허 부여시에 제거되고, 이는 취소할 수 없음을 보장한다.
본원의 양수인은 기탁물질의 배양물이 적절한 조건 하에 배양시에 사멸 또는 상실 또는 파괴될 경우 기탁물질을 동일한 다른 배양물로 신속하게 교체할 것임을 동의하였다. 기탁물질의 이용가능성은 해당국 특허법에 따라 임의의 정부 당국에서 승인된 권리를 위배하여 본 발명의 실시할 권리로서 간주되지는 않는다.
상기 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 간주된다. 기탁된 실시태양은 본 발명의 한 측면의 하나의 예시로서 의도되고 기능상 동등한 임의의 배양물은 본 발명의 범위 내에 있으므로 본 발명은 기탁된 배양물에 의해 범위가 제한되어서는 안 된다. 물질의 기탁은 본원에 포함된 상세한 설명이 그의 최상의 방식을 포함하여 본 발명의 임의의 측면의 실시에 부적합하다고 인정하는 것이 아니며, 나타내는 구체적인 설명으로 청구의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 나타내고 설명한 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형은 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고 청구의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 보다 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 언급된 모든 문헌 및 특허 인용문은 명백하게 참고로 포함한다.
III. 실시예
기능상 반대되지만, 인간 FcγRIIA (활성화 수용체) 및 인간 FcγRIIB (억제 수용체)는 IgG1 및 3 결합 도메인에서 약 9개 아미노산이 상이한 고도 상동성 단백질 (상동성 영역을 도 2A에서 박스로 표시한다)이다. 시판 모노클로날 항체는 인간 FcγRIIA 및 FcγRIIB에 모두 결합한다. FcγRIIB에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 유용할 것이고, IgG 결합을 차단하는 추가의 능력이 또한 바람직하다.
실시예 및 지지 도면에서, FcγRIIB는 인간 FcγRIIB이고, 달리 구체적으로 설명하지 않으면 일반적으로 인간 FcγRIIB1을 의미한다. FcγRIIB는 FcgRIIB, FcGRIIb, huFcγRIIB, huFcGRIIb, hFcRIIB, Fcγ-RIIb, FcγR2B, FcγR2b 또는 IgGR로 상호교환가능하게 언급될 수 있다. 특이적 대립유전자 변이체는 숫자 1, 2 또는 3을 추가하여, 예를 들어 huFcGRIIb1로 명명한다. FcεRI은 인간 FcεRI이고, 인간 FcεRIα를 의미한다. FcεRI은 FceRI, FceRIa, FcERI, IgER, IgE-R FcεRIα, Fcε-RI 또는 FcεRIa로 상호교환가능하게 언급될 수 있다.
임의의 상기 단백질의 항체는 명칭에 의해, 또는 일반적으로 관련 단백질 항원에 "항"-을 붙여, 예를 들어 항-FcγRIIB, 항-IgER 등으로 명명된다. 단백질의 세포외 도메인은 단백질 명칭에 ECD를 추가하여, 예를 들어 FcγRIIB ECD로 명명된다. 관심있는 단백질(들)을 발현하는 세포는 세포주 명칭에 단백질 명칭의 변형을 포함하도록 서술적으로 명명될 수 있고, "세포"로 언급된다.
실시예 1.0 물질 및 방법
1.1 물질
역전사효소-PCR은 퍼킨 엘머 라이프 사이언스 (Perkin Elmer Life Sciences)의 GeneAmp™를 사용하여 수행하였다. pGEX-4T2 플라스미드, 단백질 A 컬럼 및 시약, 및 단백질 G FcγRIII: 컬럼 및 시약은 아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech)로부터 입수하였다. Ni-NTA 컬럼 및 시약은 퀴아겐 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아)으로부터 입수하였다. 센트리프렙(Centriprep)-30 농축기는 밀리포어 (Millipore, 미국 매사추세츠주 베드포드)로부터 입수하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막은 노벡스 (NOVEX, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수하였다. FuGENE(등록상표) 6은 로슈 (Roche)로부터 입수하였다.
인간 FcγRIIA (CD32A; His131 동종이인자형), FcγRIIB (CD32B), 및 FcγRIIIA (CD16A; Val158 동종이인자형); 및 FcγRIIB, 및 FcγRIIA의 글루코스-6-포스페이트-이소머라제 (GPI) 이소형의 세포외 및 트랜스멤브레인 도메인을 코딩하는 cDNA는 라베치 박사 (Dr. J. Ravetch, 록키펠러 유니버시티 (Rockefeller University, 뉴욕))에게 제공받았다. FcγRIIA-Arg131 동종이인자형 및 FcγRIIIA-Phe158 동종이인자형은 부위-지정 돌연변이에 의해 생성하였다 (31). FcγRIIB1 (서열 11)에 대한 서열 정보는 기탁 번호 NP_003992; FcγRIIB2 (서열 10)은 기탁 번호 NP_001002273; FcγRIIA (서열 9)는 기탁 번호 NP_067674, 및 FcγRIII (2개의 이소형)은 기탁 번호 NP_000560 및 NP_000561에서 입수가능하다.
항체 AT1O은 바이오소스 인터내셔날 (Biosource International, 미국 캘리포니아주 카미릴로)로부터 입수하였다. 항체 mopc21은 비디 파마겐 (BD Pharmagen)으로부터 입수하였다. 뮤린 모노클로날 항체는 다음 공급처로부터 입수하였다: 32.2 (항-FcγRI), IV.3 (항-FcγRII) 및 3G8 (항-FcγRIII)은 메다렉스 (Medarex, 미국 뉴저지주 앤난데일)로부터; B1G6 (항-b2-마이크로글로불린)은 벡맨 코울터 (Beckman Coulter, 미국 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 입수하였다. 항-GST 항체는 자이메드 래보래토리스 인크. (Zymed Laboratories Inc)로부터 입수하였다. 항-GST-비오틴은 제넨테크 클론 15H4.1.1이었다. JW8.5.13은 세로텍 인크. (Serotec Inc., 미국 노스캐롤라이나조 랄레이이)로부터 입수하였다.
ELISA 플레이트, 예를 들어 Nunc(등록상표) 맥시소브(maxisorb) 플레이트는 날지-눙크 (Nalge-Nunc, 미국 일리노이주 내퍼빌)로부터 입수하였다. 조직 배양판은 예를 들어 린브로 (Linbro) 또는 피셔 (Fisher)로부터 입수하였다. 소 혈청 알부민 (BSA), 트윈 20(등록상표), 트리톤 X-100, EMEM (이글 최소 필수 배지), 이오노마이신, 프로타민 술페이트 및 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (OPD), 프로피듐 요오다이드는 시그마 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수하였다. 스트렙타비딘 및 카제인 차단제 (Prod # 37528)는 피어스 (Pierce, 미국 일리노이주 록포드)로부터 입수하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제 토끼 항-마우스 IgG 항체 컨쥬게이트, 및 염소 항-인간 F(ab')2-특이적 IgG의 퍼옥시다제-컨쥬게이팅된 F(ab')2 단편은 잭슨 이뮤노리서치 래보래토리스 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브)로부터 입수하였다. 퍼옥시다제-컨쥬게이팅된 단백질 G는 바이오-라드 (Bio-Rad)로부터 입수하였다. 스트렙타비딘-HRP은 베링거 만하임 (Boehringer Mannheim) 또는 자이메드로부터 입수하였다. TMB 기질 (Prod # TMBW-0100-01) 및 정지 용액 (Prod # BSTP-0100-01)은 바이오에프엑스 래보래토리 (BioFx Laboratory)로부터 입수하였다. 염소 항-마우스 IgG-플루오레세인은 아메리칸 콸렉스 랩스 (American Qualex Labs)로부터 입수하였다. NP-(11)-OVA 및 TNP-(11)-OVA는 바이오서치 테크놀로지스 인크. (Biosearch Technologies, Inc., 미국 캘리포니아주 노바도)로부터 입수하였다. 스트렙타비딘-PE 및 래트 항-마우스 IgG-PE 또는 플루오레세인 컨쥬게이트는 비디 파마겐으로부터 입수하였다.
유동 세포 측정은 FACScan™ 또는 FACSCalibur™ 유동세포 측정기 (BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)로 수행하였다. 흡광도는 몰레큘라 디바이시스 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)의 Vmax 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 히스타민 ELISA는 알디아, 인크 (RDI, Inc. 미국 뉴저지주)에서 공급하는, 아이비엘 이뮤노바이얼라지컬 랩스 (IBL Immunobiological Labs, 독일 함부르크)로부터 입수한 히스타민 ELISA 키트로 수행하였다.
1.2 GST - Fc 수용체 융합 단백질의 제조
α-사슬 세포외 도메인을 코딩하는 단편을 생성시킨 프라이머를 사용하여 U937 세포로부터 올리고(dT)- 프라이밍된 RNA의 역전사효소-PCR에 의해 FcγRI (CD64)에 대한 cDNA를 단리하였다. 모든 수용체의 코딩 영역을 문헌에 설명된 pRK 포유동물 세포 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다 (Eaton, D. et al., 1986, Biochemistry 25:8343-8347). 모든 FcγR pRK 플라스미드에 대해, 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 Gly-His6 태그 및 인간 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST)를 코딩하는 DNA로 대체하였다. 234개 아미노산의 GST 서열은 각각 5' 및 3' 말단에 NheI 및 XbaI 제한 부위를 갖는 pGEX-4T2 플라스미드로부터 PCR에 의해 얻었다. 따라서, 발현된 단백질은 FcγRI, His292; FcγRIIA, Met216; FcγRIIB, Met195; FcγRIIIA, Gln191 (잔기 번호는 시그날 펩티드를 포함함)과 같은 아미노산 위치 에서 Gly/His6/GST에 그의 카르복실 말단에서 융합된 α-사슬의 세포외 도메인을 포함하였다.
플라스미드는 칼슘 포스페이트 침전에 의해 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 내로 형질감염시켰다 (Gorman et al., 1990, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10). 10 mg/리터의 재조합 소 인슐린, 1 mg/리터의 인간 트랜스페린 및 미량 원소로 보충된 혈청 무첨가 PSO4 배지로 전환한 지 72시간 후에 상등액을 수거하였다. 단백질을 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 크로마토그래피로 정제하고, 센트리프렙-30 농축기를 사용하여 완충액을 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 교체하였다. 단백질을 4-20% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분석하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드막에 이송하고, 적절한 시그날 서열 절단을 확인하기 위해 이들의 아미노 말단 서열을 분석하였다. 수용체 형태는 뮤린 모노클로날 32.2 (항-FcγRI), IV.3 (항-FcγRII), 3G8 (항-FcγRIII) 및 B1G6 (항-b2-마이크로글로불린)을 사용하여 ELISA에 의해 평가하였다. 수용체 농도는 아미노산 조성 분석에 의해 유도된 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도에 의해 결정하였다.
1.3 FcγRIIB 항체의 생산
수용체에 의한 IgG Fc 결합을 차단하는 인간 FcγRIIB-특이적 항체를 FcγRIIB-His6-GST 융합 단백질에 대해 생성시켰다. BALB/c 마우스를 2 ㎍의 huFcγRIIB-His6-GST를 발바닥에 투여하여 면역화시켰다. 면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포를 P3X63Ag8U1 골수종 세포 [문헌 (Oi VT, Herzenberg LA., 1981, Immunoglobulin producing hybrid cell lines. In: Selected methods in cellular immunology (Mishell BB, Shiigi SM, eds), pp 351-372. San Francisco: Freeman)에 기재된 세포]에 융합시켜 약 900개의 하이브리도마를 얻었다.
ELISA는 일반적으로 다음과 같이 수행한다: PBS (pH 7.4) 중의 약 1.5 mg/ml의 수용체 융합 단백질을 ELISA 플레이트 상에 18시간 동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 분석 완충액으로 25℃에서 1시간 동안 차단시켰다. 스크리닝되는 항체 및 대조 항체의 3배 연속 희석액 (10.0-0.0045 mg/ml)를 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 분석 완충액으로 세척한 후, 수용체에 결합된 IgG를 염소 항-인간 F(ab')2-특이적 IgG의 퍼옥시다제-컨쥬게이팅된 F(ab')2 단편 또는 퍼옥시다제-컨쥬게이팅된 단백질 G로 검출하였다. 사용된 기질은 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드이었다. 490 nm에서 흡광도를 Vmax 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
1.4 FcγRIIB 특이적 항체에 대한 1차 스크린
1차 스크린에서, 하이브리도마 서브클론에서 발현된 항체를 포함하는 상등액을 FcγRIIB-HiS6-GST에 대한 양성 결합에 대해 스크리닝하였다. ELISA에 의해 FcγRIIB-HiS6-GST에 반응성인 항체는 ELISA에 의해 FcγRIIB-His6-GST에 대한 결합 및 FcγRIIA(R131 변이체)-His6-GST 및 FcγRIII(F158 변이체)-His6-GST에 대한 음성 결합에 대해 재스크리닝하였다. 약 50개의 항체가 추가 분석을 위해 1차 스크린으로부터 선택되었다.
1.5 FcγRIIB 특이적 항체에 대한 2차 스크린
2차 스크린에서, 항체는 ELISA 및 글루코스-6-포스페이트-이소머라제 (GPI) 연결 FcγRIIB 및 FcγRIIA를 발현하는 CHO 세포주를 이용하는 세포 결합 분석에 의해 수용체 특이성에 대해 재스크리닝하였다. ELISA를 사이한 바와 같이 수행하고, 그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에서, 막대 그래프는 GST-huFcγRIIA 및 GST-huFcγRIII 융합 단백질에 비해 GST-huFcγRIIB에 대한 항체의 상대적 결합을 나타낸다. 항체 1D1, 5A6, 5H11 및 6A5는 GST-huFcγRIIA 및 GST-huFcγRIII 융합 단백질보다 GST-huFcγRIIB에 선택적으로 결합한다. 항체 5B9는 GST-huFcγRIII보다 GST-huFcγRIIB 및 GST-huFcγRIIA 모두에 선택적으로 결합한다.
도 5는 GPI-huFcγRIIA를 발현하는 CHO 세포에 비해 GPI-huFcγRIIB를 발현하는 CHO 세포에 대한 항체의 면역형광 결합에 의한 결합 특이성을 보여준다. CHO 세포의 분리된 분취액을 mIgG1 이소형 대조군 (mopc 21), 또는 (항-인간 FcγRIIB) 모노클로날 항체, ID1, 5A6, 5B9, 5D11 및 6A5로 염색하였다. 결합은 플루오레세인 컨쥬게이팅된 F(ab)'2 염소 항-마우스 IgG (F(ab)'2 특이적 항체)와 함께 2차 인큐베이팅하여 간접적으로 검출하고, 유동 세포 측정으로 분석하였다. 항체 5A6은 GPI-huFcγRIIA를 발현하는 CHO 세포에 비해 GPI-huFcγRIIB를 발현하는 CHO 세포에 우선적으로 결합한다. 이 결과는 GST 구성체에 대한 결합과 유사하다.
추가의 ELISA 결합 데이타를 도 6-9에 제시한다. 도 6-9는 다양한 항-FcγRII (CD32) MAb의 GST-huFcγRIIB, GST-huFcγRIIA(H131) 또는 GST-huFcγRIIA(R131)에 대한 결합의 결합 친화도 곡선을 제시한다. AT1O은 FcγRIIA에 특이적인 mIgG이고, mopc21은 mIgG 이소형 대조군이다. 도 6에 도시된 GST-huFcγRIIB에 대한 결합에 대해 측정된 5A6 mIgG1의 EC50은 0.06 nM이었다. 이와 대조적으로, GST-huFcγRIIA(H131)에 대한 결합에 대한 5A6 mIgG1의 EC50은 50 ㎍/ml보다 컸고 (도 9), GST-huFcγRIIA(R131)에 대한 결합에 대한 EC50은 2.5 ㎍/ml이었다 (도 8).
1.6 항체 발현 및 정제
항체 5A6.2.1 (본원에서 5A6.2.1 또는 5A6로 상호교환가능하게 언급됨)을 복수에 대해 선택하고, 단백질 G 크로마토그래피 (아머샴 파마시아 바이오테크)를 사용하여 정제하였다. 5A6.2.1을 코딩하는 DNA를 단리하고, 통상적인 방법으로 서열결정하였다. 중쇄 (서열 7) 및 경쇄 (서열 8)의 아미노산 서열 및 CDR을 도 10에 제시한다. 중쇄 CDR은 DAWMD (서열 1), EIRSKPNNHATYYAESVKG (서열 2) 및 FDY (서열 3)이었다. 경쇄 CDR은 RASQEISGYLS (서열 4), AASALDS (서열 5) 및 LQYVSYPL (서열 6)이었다.
5A6 모노클로날 항체의 추정 결합 에피토프는 아미노산 잔기 K158-V161 및 F174-N180을 포함하고, 여기서 넘버링은 도 2A (FcγRIIB2, 서열 10)에서 FcγRIIB2에 대해 나타낸 것이다. FcγRIIB1 및 FcγRIIB2 수용체는 잔기 T43-P123에서 IgG-유사 도메인 1로서 및 잔기 W132-P217에서 IgG-유사 도메인 3으로서 도 2A 및 2B (FcγRIIB2에 의해 제시됨)에 나타낸 구조적 도메인을 갖는다. FcγRIIB2에 대한 ITIM 모티프는 도 2A에 도시되고, 잔기 N269-M277을 포함한다. 최근에, 도 2A에 FSRLDPT (서열 39)로 나타낸 FcγRIIA F165-T171의 아미노산 서열이 FSHLDPT (서열 40)일 수 있고, 이것은 항체 5A6에 대한 FcγRIIB 추정 결합 에피토프에서 FcγRIIA와 FcγRIIB 사이의 보다 큰 서열 차이를 나타낸다는 것이 보고되었다 (도 2 및 기탁 번호 NP_067674, 서열 30 참조, 아미노산 서열은 또한 FcγRIIA의 N-말단 부분의 잔기 변화를 포함한다).
1.7 E27:IgE 복합체와의 경쟁
본 분석은 IgG1의 FcγRIIA 및 FcγRIIB에 대한 결합을 방해하는 5A6 MAb의 능력을 스크리닝한다. FcγRII는 단량체 IgG1에 대한 약한 친화도를 갖고, 따라서 IgG1 결합은 3개의 IgE 및 3개의 항-IgE 분자, 예를 들어 IgE에 결합하는 인간화 IgG1 항체인 E27의 안정한 헥사머 복합체를 사용하여 분석한다 (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem., 276:6591-6604 (2001)). 5A6 MAb는 E27-IgE 헥사머 복합체의 인간 FcγRIIA 및 FcγRIIB에 대한 결합과 경쟁하는 항체의 능력을 평가함으로써 IgG 결합의 중화에 스크리닝하였다. 경쟁 분석을 아래와 같이 수행하고, 결과를 도 11 및 12에 도시하였다.
PBS (pH 7.4) 중의 1 mg/ml의 FcγRIIB 및 FcγRIIA 융합 단백질을 ELISA 플레이트 상에 48시간 동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 Tris-완충 염수, 0.5% 소 혈청 알부민, 0.05% 폴리소르베이트-20, 2 mM EDTA, pH 7.45 (분석 완충액)로 25℃에서 1시간 동안 차단하였다. 등몰량의 E27 및 인간 골수종 IgE (Nilsson, K., Bennich, H., Johansson, S.G.O., and Ponten, J., (1970) Clin. Exp. Immunol. 7:477-489)를 25℃에서 1시간 동안 혼합함으로써 E27-IgE 헥사머 복합체를 분석 완충액 중에서 제조하였다. E27-IgE (분석 완충액 중의 10.0 mg/ml)를 플레이트에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 세척하여 비결합 E27-IgE를 제거하였다. 5A6 MAb, 5A6 F(ab)2, 5A6 Fab, mIgG1 (대조군) 및 5B9 (항-FcγRIIA/B)을 분석 완충액 중에서 0.01 nM 내지 10O nM의 다양한 농도로 제조하였다. 항체를 개별 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 분석 완충액으로 세척한 후, 경쟁 항체의 존재 하에 FcγRIIA 또는 FcγRIIB에 결합된 상태로 유지된 E27-IgE 헥사머 복합체의 검출을 수행하였다. 검출은 E27의 IgG1 부분에 대한 염소 항-인간 F(ab')2-특이적 IgG의 퍼옥시다제-컨쥬게이팅된 F(ab')2 단편의 결합을 수반하였다. 사용된 검출가능한 퍼옥시다제 기질은 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드이었다. 490 nm에서 흡광도를 Vmax 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 도 11은 경쟁 항체 (5A6 MAb, 5A6 F(ab)2, 5A6 Fab, mIgG1 및 5B9)의 농도가 증가하면서 E27-IgE 헥사머의 FcγRIIA에 대한 지속적인 결합에 의해 나타나는 바와 같이 5A6이 huFcγRIIA에 대한 E27-IgE 헥사머 결합을 차단하지 않음을 보여준다. FcγRIIA 및 FcγRIIB (도 4 및 5 참조) 모두에 결합하는 것으로 알려진 항체 5B9만이 E27-IgE 헥사머 결합과 경쟁할 수 있었다. 도 12는 5A6 항체, Fab 또는 F(ab)2이 증가하면서 E27-IgE 헥사머 결합의 감소에 의해 나타나는 바와 같이 5A6이 FcγRIIB에 대한 E27-IgE 헥사머 결합과 경쟁함을 보여준다. 예상된 바와 같이, 대조군 IgG1 항체는 경쟁하지 않았다. huFcγRIIB (5A6, 5A5, 5H11.1 및 5A6 Fab'2)에 대한 항체의 결합 및 FcγRIIB, FcγRIIA(R131) 또는 FcγRIIA(H131)에 대한 IgG1 (E27-IgE 헥사머)의 결합을 추가로 도 13-16에 도시하였다. 도 14는 항체 5A6.2.1 및 6A5의 존재 하에 FcγRIIB에 대한 IgG의 결합이 억제되는 반면, 도 13에 도시된 바와 같이 FcγRIIA(R131)에 대한 IgG 결합, 및 도 15에 도시된 바와 같이 FcγRIIA(H131)에 대한 IgG 결합이 차단되지 않음을 보여준다.
1.8 면역형광 결합 분석
K562 적백혈병 세포 (ATCC No. CCL-243) 상에 발현된 천연 FcγRIIA에 대한 5A6 MAb의 간접적 면역형광 결합 분석을 도 16에 제시한다. K562 세포의 분리된 분취액을 mIgG1 이소형 대조군 (mopc 21), 5A6 (항-인간 FcγRIIB) 모노클로날 항체 또는 Medarex 4.3 MAb (항-인간 FcγRIIA/B) 모노클로날 항체로 염색하였다. 결합은 플루오레세인 컨쥬게이팅된 F(ab)'2 염소 항-마우스 IgG (F(ab)'2 특이적 항체)와 함께 2차 인큐베이팅하여 간접적으로 검출하고, 유동 세포 측정으로 분석하였다. huFcγRIIA (CD32A)에 결합한 Medarex 4.3 MAb는 도 16에 도시한 바와 같다. 항-huFcγRIIB (항-CD32B) 항체인 5A6은 huFcγRIIA (CD32A)에 결합하지 않았고, 이는 도 4에 점선으로 표시된 바와 같이 huFcγRIIA (CD32A)에 역시 결합하지 않은 이소형 대조군인 mopc 21 항체와 일치하였다.
실시예 2.0 항- Fc γ RIIB 항체의 특성
2.1 물질
항-FcεRI MAb인 22E7 MAb는 수용체에 결합된 IgE가 존재하거나 존재하지 않으면서 FcεRI에 결합한다. 22E7 MAb는 호프만-라로슈 (Hoffman-LaRoche) 세포주 IGE4R:22E7.2D2.1D11로부터 정제하였다 (Risek, F., et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 11245-11251). 22E7 MAb를 발현하는 호프만-라로슈 세포를 10x FBS, lxPen-Strep 및 1x글루타민이 첨가된 이스코베 개질 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Media)에서 성장시켰다. 단백질 A 및 단백질 G 크로마토그래피를 사용하여 22E7 MAb를 정제하였다. 22E7 추출물을 모아서 FcεRI에 대한 친화도를 확인하였다.
2.2 RBL 세포주
모 래트 비만 세포주 RBL-2H3 (ATCC# CRL-2256)으로부터 유도된 RBL48 세포주는 고친화도 인간 IgE 수용체 (FcεRI)의 α-서브유닛을 발현한다 (Gilfillian A.M. et al., 1992, Immunology, 149, 2445-2451). 푸로마이신 선택가능 발현 벡터 (Morgenstern, J. P., et al., 1990, Nucleic Acid Research, 18:3587-3596)에 서브클로닝된 인간 FcγRIIB1의 전장 α-서브유닛의 cDNA 클론 (Muta T., et al., 1994, Nature 368:70-73)을 사용하여 RBL48 세포주를 전기천공에 의해 형질감염시켰다. 클론을 1 μM 푸로마이신에서 선택하고, 항-인간 FcγRIIB 모노클로날 항체인 5A6.2.1을 사용한 면역형광 염색에 의해 FcγRIIB 세포 표면 발현에 대해 분석하였다. 선택된 서브클론을 RBL48.C.4로 명명하였다.
2.3 히스타민 방출
활성화 수용체에 대한 FcγRIIB 가교결합 (본원에서 동시 가교결합, 동시 응집 또는 동시 라이게이션과 상호교환가능하게 언급됨)의 효과는 알레르겐 감수성 RBL48.C.4 세포로부터 히스타민 방출을 차단하는 항체의 능력을 기초로 하여 정량적으로 측정된다. 분석 방법은 아래에 설명하고, 그 결과는 도 17에 추가로 제시한다.
RBL48.C.4 클론을 0.002 내지 2 ㎍/ml의 상이한 농도의 2 ㎍/ml 항-FcεRI MAb 22E7 및 mIgG1 이소형 대조군 (mopc21) 또는 5A6 MAb와 함께 평저 96웰 미량역가판 내에서 분석 완충액 (2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, O.1 mM 비필수 아미노산, 1.5 g/L 중탄산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신, 15% 소 태아 혈청이 첨가된 EMEM (얼 (Earle) BSS가 첨가된 이글 최소 필수 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium)) 중에서 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 분석 완충액으로 2회 세척하고, F(ab)'2 염소 항-마우스 Fc 특이적 가교결합 항체와 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 상등액을 수거하고, 히스타민 ELISA 키트를 사용하여 일반적으로 상기 설명한 바와 같은 ELISA에 의해 히스타민 함량에 대해 분석하였다.
히스타민 방출값은 3개의 웰에 대한 평균 및 SEM으로 표현되고, 도 5에 그래프로 제시된다. 가교결합 항체와 5A6 및 22E7이 히스타민 방출 억제에 필요하였다. 히스타민 방출은 5A6의 FcγRIIB에 대한 결합 및 22E7의 FcεRI에 대한 결합에 의해 억제되었고, 여기서 5A6 및 22E7은 또한 염소 항-마우스 Fc 특이적 가교결합 항체에 의해 가교결합된다. 5A6 대 22E7의 1:1 비율이 히스타민 방출 억제에 가장 효과적이었고, 1:10, 1:100 및 1:1000의 비율에서도 식별가능한 억제가 관찰되었다.
실시예 3.0 이중특이적 항체의 생산
본 실시예는 디술피드 형성 시스테인 잔기가 결여된 ("힌지 부재") 변이체 힌지 구역을 갖는 이중특이적 항체의 제조 및 정제를 설명한다. 야생형 힌지 서열을 갖는 이중특이적 항체의 제조도 설명되고, 상기 항체는 항체 복합체의 상이한 종류를 얻기 위한 효율을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
3.1 발현 벡터의 제조
전장 항체 발현을 위한 모든 플라스미드는 중쇄 및 경쇄의 전사를 위한 별개의 phoA 프로모터 (AP) (Kikuchi et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9: 5671-5678), 이어서 번역 개시를 위한 trp 샤인-달가노 서열 (Yanofsky et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 및 Chang et al., 1987, Gene, 55: 189-196)을 이용하여 별개의 시스트론 시스템을 기초로 하였다 (Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147; Simmons et al., 미국 특허 5,840,523). 추가로, 열 안정성 장독소 II 시그날 서열 (STII) (Picken et al., 1983, Infect. Immun., 42: 269-275 및 Lee et al., 1983, Infect. Immun., 42: 264-268)을 중쇄 및 경쇄의 주변세포질 분비를 위해 사용하였다. 두 사슬에 대한 우수한 번역 조절은 번역 개시 구역 (TIR)에 침묵 코돈 변경을 포함하는, 측정된 상대 번역 강도의 STII 시그날 서열 변이체를 사용하여 달성하였다 (Simmons and Yansura, 1996, Nature Biotechnol, 14: 629-634 및 Simmons et al., 상기 문헌). 본 발명의 목적을 위해, 벡터 내의 특정 쌍의 TIR의 번역 강도 조합은 (N-경쇄, M-중쇄)로 표시되고, N은 경쇄의 상대 TIR 강도이고, M은 중쇄의 상대 TIR 강도이다. 마지막으로, λt0 전사 터미네이터 (Schlosstissek and Grosse, 1997, Nucleic Acids Res., 15: 3185)는 두 사슬의 코딩 서열의 하류에 위치하였다. 모든 플라스미드는 pBR322-계 벡터 시스템의 프레임워크를 이용한다 (Sutcliffe, 1978, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90).
이중특이적 폴리펩티드 사슬의 회합을 향상시키기 위해서, "놉-앤드-홀 (knob-and-hole)" 돌연변이를 이량체화 구역 내에 도입하였다. 어느 한 사슬은 "knob" 돌연변이를 포함할 수 있고, 다른 사슬은 상보성 "hole" 돌연변이를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 두 실시태양을 모두 포함한다. 본 발명의 예시적인 실시예에서, 이중특이적 항체의 5A6 암은 "knob" 돌연변이를 포함하도록 제조되고, 이중특이적 항체의 22E7 암은 상보성 "hole" 돌연변이를 포함하도록 제조된다.
(i) 플라스미드 p5A6 .11.Knob.Hg-
요구되는 p5A6.11.Knob.Hg-플라스미드를 생성시키기 위해서 2개의 매개 플라스미드가 필요하다. 매개 플라스미드 p5A6.1.L.VG.1.H.Knob을 생성시키기 위해 5A6 (항-FcγRIIB) 키메릭 경쇄의 가변 도메인을 먼저 pVG11.VNERK.Knob 플라스미드 상에 전달하였다. 이어서, 매개 플라스미드 p5A6.11.Knob 플라스미드를 생성시키기 위해서 5A6 키메릭 중쇄의 가변 도메인을 p5A6.1.L.VG.1.H.Knob 플라스미드 상에 전달하였다. 다음은 상기 매개 플라스미드 p5A6.1.LC.VG.1.HC.Knob 및 p5A6.11.Knob의 제조, 이어서 p5A6.11.Knob.Hg-의 제조를 설명한다.
p5A6.1.L.VG.1.H.Knob
5A6 항체의 뮤린 경쇄 가변 도메인을 전장 항체 중쇄-경쇄 (H/L) 단량체 항체 생성에 적합한 플라스미드에 전달하기 위해서 상기 플라스미드를 제조하였다. 상기 플라스미드의 제조는 2개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 EcoRI-PacI 단편이 제거된 pVG11.VNERK.Knob 벡터이었다. 플라스미드 pVG11.VNERK.Knob은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 "knob" 돌연변이 (T366W)를 갖는 항-VEGF 항체 (VNERK)로 변경되고 (Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology, 16:677-681) 모든 조절 성분이 상기한 바와 같은, 상대 TIR 강도가 1 - 경쇄 및 1 - 중쇄인 별개의 시스트론 벡터 (Simmons et al., 2002, 상기 문헌)이 유도체이다. 라이게이션의 제2 부분은 도 25에 도시된 서열 (서열 35)을 상기한 EcoRI-PacI 소화 pVG11.VNERK.Knob 벡터 내로 라이게이션시키는 것을 수반하였다. 상기 서열은 알칼린 포스파타제 프로모터 (phoA), STII 시그날 서열 및 5A6 항체의 전체 (가변 및 불변 도메인) 경쇄를 코딩한다.
p5A6.11.Knob
상기 플라스미드는 키메릭 전장 중쇄/경쇄 (H/L) 단량체 항체를 생성시키기 위해 5A6 항체의 뮤린 중쇄 가변 도메인을 인간 중쇄 프레임워크에 도입하기 위해서 제조하였다. p5A6.11.Knob의 제조는 2개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 MluI-PspOMI 단편이 제거된 상기 p5A6.1.L.VG.1.H.Knob 벡터이었다. 제2 단편은 도 27에 도시된 서열 (서열 37)을 MluI-PspOMI 소화된 p5A6.1.L.VG.1.H.Knob 벡터 내로 라이게이션하는 것을 수반하였다. 상기 서열은 STII 시그날 서열의 마지막 3개의 아미노산 및 5A6 항체의 뮤린 중쇄 가변 도메인의 약 119개 아미노산을 코딩한다.
p5A6.11.Knob.Hg-
p5A6.11.Knob.Hg-플라스미드는 전장 키메릭 5A6 힌지 부재 Knob 중쇄/경쇄 (H/L) 단량체 항체를 발현하기 위해 제조하였다. 플라스미드의 제조는 2개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 PspOMI-SacII 단편이 제거된 p5A6.11.Knob 벡터이었다. 제2 단편은 2개의 힌지 시스테인이 세린 (C226S, C229S, EU numbering scheme of Kabat, E.A. et al., (eds.), 1991, page 671 in Sequences of proteins of Immunological interest, 5th ed. Vol. 1. NIH, Bethesda MD.)으로 전환된 인간 중쇄의 약 171개의 아미노산을 코딩하는 p4D5.22.Hg-로부터의 약 514개 염기쌍의 PspOMI-SacII 단편이었다. 플라스미드 p4D5.22.Hg-는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 항-HER2 항체로 변경되고 2개의 힌지 시스테인이 세린 (C226S, C229S)으로 전환된, 상대 TIR 강도가 2 - 경쇄 및 2 - 중쇄인 별개의 시스트론 벡터의 유도체이다 (Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)).
(ii) 플라스미드 p5A6 .22.Knob. Hs -
요구되는 p5A6.22.Knob.Hg-플라스미드를 생성시키기 위해서 하나의 매개 플라스미드가 필요하였다. 매개 플라스미드 p5A6.21.Knob.Hg-를 생성시키기 위해서 phoA 프로모터 및 STII 시그날 서열 (경쇄의 상대 TIR 강도: 2)을 먼저 p5A6.11.Knob.Hg-플라스미드 상에 전달하였다. 다음은 매개 플라스미드 p5A6.21.Knob.Hg-의 제조, 이어서 p5A6.22.Knob.Hg-의 제조를 설명한다.
p5A6.21.Knob.Hg-
경쇄의 STII 시그날 서열 (상대 TIR 강도: 2)를 도입하기 위해 상기 플라스미드를 제조하였다. p5A6.21.Knob.Hg-의 제조는 3개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 EcoRI-PacI 단편이 제거된 p5A6.11.Knob.Hg- 벡터이었다. 제2 단편은 키메릭 5A6 항체의 경쇄를 코딩하는 p5A6.11.Knob.Hg- 플라스미드로부터의 약 658개 염기쌍의 NsiI-PacI 단편이었다. 라이게이션의 제3 부분은 하기 프라이머를 사용하여 p1H1.22.Hg- 플라스미드로부터 생성된 약 489 염기쌍의 EcoRI-NsiI PCR 단편이었다.
5' - AAAGGGAAAGAATTCAACTTCTCCAGACTTTGGATAAGG (서열 27)
5' - AAAGGGAAAATGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAA (서열 28)
플라스미드 p1H1.22.Hg-는 2개의 힌지 시스테인이 세린 (C226S, C229S)으로 전환된 래트 항-조직 인자 항체로 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 변경된, 상대 TIR 강도가 2 - 경쇄 및 2 - 중쇄인 별개의 시스트론 벡터의 유도체이다 (Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)).
p5A6.22.Knob.Hg-
상기 플라스미드는 중쇄의 상대 TIR 강도가 2인 STII 시그날 서열을 도입하기 위해서 제조하였다. p5A6.22.Knob의 제조는 2개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 PacI-MluI 단편이 제거된 p5A6.21.Knob.Hg- 벡터이었다. 라이게이션의 제2 부분은 경쇄의 λt0 전사 터미네이터, phoA 프로모터 및 STII 시그날 서열 (중쇄의 상대 TIR 강도: 2)를 코딩하는 p1H1.22.Hg- 플라스미드로부터의 약 503개 염기쌍의 PacI-MluI 단편이다.
(iii) 플라스미드 p22E7.11.Hole.Hs-
요구되는 p22E7.11.Hole.Hg- 플라스미드를 생성시키기 위해 2개의 매개 플라스미드가 필요하였다. 매개 플라스미드 p22E7.1.L.VG.1.H.Hole를 생성시키기 위해서 22E7 (항-FcεRI) 키메릭 경쇄의 가변 도메인을 먼저 pVG11.VNERK-Hole 플라스미드 상에 전달하였다. 이어서, 매개 플라스미드 p22E7.11.Hole 플라스미드를 생성시키기 위해 22E7 키메릭 중쇄의 가변 도메인을 p22E7.1.L.VG.1.H.Hole 플라스미드 상에 전달하였다. 다음은 상기 매개 플라스미드 p22E7.1.L. VG.1.H.Hole 및 p22E7.11.Hole의 제조, 이어서 p22E7.11.Hole.Hg-의 제조를 설명한다.
p22E7.1.L.VG.1.H.Hole
상기 플라스미드는 전장 중쇄/경쇄 (H/L) 단량체 항체 생성에 적합한 플라스미드에 22E7 항체의 뮤린 경쇄 가변 도메인을 전달하기 위해서 제조하였다. 상기 플라스미드의 제조는 2개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 EcoRI-PacI 단편이 제거된 pVG11.VNERK.Hole 벡터이었다. 플라스미드 pVG1 1.VNERK.Hole은 "hole" 돌연변이 (T366S, L368A, Y407V) (Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998))를 갖는 항-VEGF 항체 (VNERK)로 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 변경되고 모든 조절 성분이 상기한 바와 같은, 상대 TIR 강도가 1 - 경쇄 및 1 - 중쇄인 별개의 시스트론 벡터의 유도체이다 (Simmons et ah, J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)). 라이게이션의 제2 부분은 도 26에 도시된 서열 (서열 36)을 상기한 바와 같은 EcoRI- PacI 소화 pVG11.VNERK.Hole 벡터 내로 라이게이션하는 것을 수반하였다. 서열은 알칼린 포스파타제 프로모터 (phoA), STII 시그날 서열 및 22E7 항체의 전체 (가변 및 불변 도메인) 경쇄를 코딩한다.
p22E7.11.Hole
키메릭 전장 중쇄/경쇄 H/L 단량체 항체를 생성하기 위해 22E7 항체의 뮤린 중쇄 가변 도메인을 인간 중쇄 프레임워크에 도입하기 위해서 상기 플라스미드를 제조하였다. p22E7.11.Knob은 2개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 MluI-PspOMI 단편이 제거된 p22E7.1.L.VG.1.H.Hole 벡터이었다. 라이게이션의 제2 부분은 도 28에 도시된 서열 (서열 38)을 MluI-PspOMI 소화 p22.E7.1.L.VG.1.H.Hole 벡터에 라이게이션하는 것을 수반하였다. 서열은 STII 시그날 서열의 마지막 3개의 아미노산 및 22E7 항체의 뮤린 중쇄 가변 도메인의 약 123개의 아미노산을 코딩한다.
p22E7.11.Hole.Hg-
p22E7.11.Hole.Hg- 플라스미드는 전장 키메릭 22E7 힌지 부재 Hole 중쇄/경쇄 (H/L) 단량체 항체를 발현하기 위해 제조하였다. 플라스미드의 제조는 2개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 PspOMI-SacII 단편이 제거된 p22E7.11.Hole 벡터이었다. 라이게이션의 제2 부분은 2개의 힌지 시스테인이 세린 (C226S, C229S)으로 전환된 인간 중쇄의 약 171개 아미노산을 코딩하는 p4D5.22.Hg-로부터의 약 514개 염기쌍의 PspOMI-SacII 단편이었다.
(iv) 플라스미드 p22E7 .22.Hole.Hg-
요구되는 p22E7.22.Hole.Hg- 플라스미드를 생성시키기 위해서 하나의 매개 플라스미드가 필요하다. 매개 플라스미드 p22E7.21.Hole.Hg-를 생성시키기 위해서 경쇄의 phoA 프로모터 및 STII 시그날 서열 (상대 TIR 강도: 2)을 먼저 p22E7.11.Hole.Hg- 플라스미드 상에 전달하였다. 다음은 매개 플라스미드 p22E7.21.Hole.Hg-의 제조, 이어서 p22E7.22.Hole.Hg-의 제조를 설명한다.
p22E7.21.Hole.Hg-
상기 플라스미드는 경쇄의 STII 시그날 서열 (상대 TIR 강도: 2)을 도입하기 위해 제조하였다. p22E7.21.Hole.Hg-의 제조는 3개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 EcoRI-PacI 단편이 제거된 p22E7.11.Hole.Hg- 벡터이었다. 제2 단편은 키메릭 22E7 항체의 경쇄를 코딩하는 p22E7.11.Hole.Hg- 플라스미드로부터의 약 647개 염기쌍의 EcoRV-PacI 단편이었다. 제3 단편은 알칼린 포스파타제 프로모터 (phoA) 및 STII 시그날 서열을 코딩하는 p1H1.22.Hg- 플라스미드로부터의 약 500개 염기쌍의 EcoRI-EcoRV 단편이었다.
p22E7.22Hole.Hg-
상기 플라스미드는 중쇄의 STII 시그날 서열 (상대 TIR 강도: 2)을 도입하기 위해 제조하였다. p22E7.22.Hole.Hg-의 제조는 3개의 DNA 단편의 라이게이션을 수반하였다. 제1 단편은 작은 EcoRI-MluI 단편이 제거된 p22E7.21.Hole.Hg-이었다. 제2 단편은 알칼린 포스파타제 프로모터, STII 시그날 서열 및 키메릭 22E7 항체의 경쇄를 코딩하는 p22E7.21.Hole.Hg- 플라스미드로부터의 약 1141개 염기쌍의 EcoRI-PacI 단편이었다. 제3 단편은 경쇄의 λt0 전사 터미네이터 및 중쇄의 STII 시그날 서열 (상대 TIR 강도: 2)를 코딩하는 p1H1.22.Hg- 플라스미드로부터의 약 503개 염기쌍의 PacI-MluI 단편이었다.
3.2 항체 발현 - 5A6 Knob 및 22E7 Hole
항-FcγRIIB (5A6)/항-FcεRI (22E7) 항체의 생성시에 이종이량체화를 촉진하기 위해서 "놉 인투 홀" 기술을 실시하여 전장 이중특이적 항체를 형성하였다. Fc 서열의 CH3 도메인에서의 "놉 인투 홀" 돌연변이는 동종이량체 형성을 크게 감소시키는 것으로 보고되었다 (Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)). "knob" 돌연변이 (T366W)를 Fc 영역에 도입함으로써 항-FcγRIIB 성분 (p5A6.11.Knob) 및 "hole" 돌연변이 (T366S, L368A, Y407V) (Merchant, 1998, 상기 문헌)를 도입함으로써 항-FcεRI 성분 (p22E7.11.Hole)에 대한 구성체를 제조하였다.
항체의 소규모 합성은 knob 항-FcγRIIB 단량체 항체의 제조를 위해 플라스미드 p5A6.11.Knob을, hole 항-FcεRI 단량체 항체의 제조를 위해 p22E7.11.Hole을 사용하여 수행하였다. 각각의 플라스미드의 상대 TIR 강도는 경쇄 및 중쇄 모두에 대해 1이었다. 각각의 구성체의 소규모 발현을 위해, 이. 콜라이 균주 33D3 (W3110 △fhuA(△tonA) ptr3 lac Iq lacL8 △ompT △(nmpc-fepE) degP41 kanR)을 숙주 세포로서 사용하였다. 형질전환 후에, 선택된 형질전환체를 카르베니실린 (50 ㎍/mL)으로 보충된 5 mL 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 배지에 접종하고, 배양 휠에서 30℃에서 철야 성장시켰다. 이어서, 각각의 배양액을 C.R.A.P. 포스페이트-제한 배지 (Simmons et al., J. Immunol. Methods 263: 133-147 (2002)) 내로 희석하였다 (1:100). 이어서, 카르베니실린을 50 ㎍/mL의 농도에서 유도 배양액에 첨가하고, 배양 휠에서 약 24시간 동안 30℃에서 성장시켰다. 달리 설명되지 않으면, 모든 진탕 플라스크 유도는 5 mL 부피에서 수행하였다.
유도 배양액으로부터 비환원된 전체 세포 용해물을 다음과 같이 제조하였다: (1) 1 OD600-mL 유도 샘플을 미세원침관에서 원심분리하고; (2) 각각의 펠렛을 90 ㎕ TE (10 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA)에 재현탁시키고; (3) 10 ㎕의 100 mM 요오도아세트산 (시그마 I-2512)을 각각의 샘플에 첨가하여 임의의 유리 시스테인을 차단하고, 디술피드 셔플링을 억제하고; (4) 20 ㎕의 10% SDS를 각각의 샘플에 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱하여 약 90℃로 3분 동안 가열한 후, 다시 볼텍싱하였다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 후, 750 ㎕ 아세톤을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 샘플을 볼텍싱하여 실온에서 약 15분 동안 정치시켰다. 마이크로원심분리기에서 5분 동안 원심분리한 후, 각각의 샘플의 상등액을 흡인 제거하고, 각각의 단백질 펠렛을 50 ㎕ dH20 + 50 ㎕ 2X 노벡스 SDS 샘플 완충액에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 4분 동안 약 90℃에서 가열하고, 볼텍싱한 후, 실온으로 냉각시켰다. 마지막으로 5분의 원심분리를 수행하고, 상등액을 새 튜브에 옮겼다.
유도 배양액으로부터 환원된 전체 세포 용해물을 다음과 같이 제조하였다: (1) 1 OD600-mL 유도 샘플을 미세원침관에서 원심분리하고; (2) 각각의 펠렛을 90 ㎕ TE (10 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA)에 재현탁시키고; (3) 10 ㎕의 1 M 디티오트레이톨 (시그마 D-5545)을 각각의 샘플에 첨가하여 디술피드 결합을 환원시키고; (4) 20 ㎕의 10% SDS를 각각의 샘플에 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱하여 약 90℃로 3분 동안 가열한 후, 다시 볼텍싱하였다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 후, 750 ㎕ 아세톤을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 샘플을 볼텍싱하여 실온에서 약 15분 동안 정치시켰다. 마이크로원심분리기에서 5분 동안 원심분리한 후, 각각의 샘플의 상등액을 흡인 제거하고, 각각의 단백질 펠렛을 10 ㎕ 1 M 디티오트레이톨 + 40 ㎕ dH20 + 50 ㎕ 2X 노벡스 SDS 샘플 완충액에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 4분 동안 약 90℃에서 가열하고, 볼텍싱한 후, 실온으로 냉각시켰다. 마지막으로 5분의 원심분리를 수행하고, 상등액을 새 튜브에 옮겼다.
제조 후에, 5 내지 8 ㎕의 각각의 샘플을 10웰, 1.0 mm 12% Tris-글리신 SDS-PAGE (노벡스)에 로딩하고, ~120볼트에서 1.5 - 2시간 동안 전기영동시켰다. 이어서, 생성되는 겔을 쿠마시 블루 (Coomassie Blue)로 염색하거나 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, SDS-PAGE 겔을 10 mM CAPS 완충액, pH 11 + 3% 메탄올 중의 니트로셀룰로스막 (노벡스) 상에 전기블로팅하였다. 1X NET (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7.4, 0.05% 트리톤 X-100) + 0.5% 젤라틴의 용액을 사용하여 약 30분 - 1시간 동안 실온에서 진동시키면서 상기 막을 차단하였다. 차단 단계 후에, 막을 항-Fab 웨스턴 블롯 분석을 위해 1X NET/0.5% 젤라틴/항-Fab 항체 (인간 IgG Fab에 대한 퍼옥시다제-컨쥬게이팅된 염소 IgG 분획; CAPPEL #55223)의 용액에 넣었다. 항-Fab 항체 희석 비율은 항체의 로트 (lot)에 따라 1:50,000 내지 1:1,000,000이었다. 별법으로, 막을 항-Fc 웨스턴 블롯 분석을 위해 1X NET/0.5% 젤라틴/항-Fc 항체 (인간 Fc 단편에 대한 퍼옥시다제-컨쥬게이팅된 염소 IgG 분획; BETHYL #A80-104P-41)의 용액에 넣었다. 항-Fc 항체 희석 비율은 항체의 로트에 따라 1:50,000 내지 1:250,000이었다. 각각의 경우에, 막은 실온에서 진동시키면서 항체 용액 중에 철야 방치하였다. 다음날 아침에, 막을 1X NET/0.5% 젤라틴으로 3 x 10분, 이어서 TBS (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl)로 1 x 15분의 최소한으로 세척하였다. 항-Fab 항체 및 항-Fc 항체에 의해 결합된 단백질 밴드는 아머샴 파마시아 바이오테크 ECL 검출 키트를 사용하여 가시화시킨 후, 막을 X-선 필름에 노출시켰다.
p5A6.11.Knob (knob 항-FcγRIIB) 및 p22E7.11.Hole (hole 항-FcεRI) 항체 발현에 대한 항-Fab 웨스턴 블롯 결과를 도 18에 도시하였다. 이들은 레인 1에 knob 항-FcγRIIB 항체에 대한 충분히 폴딩되고 조립된 중쇄-경쇄 (HL) 종 및 레인 2에 hole 항-FcεRI 항체의 발현을 보인다. 항-Fab 항체는 경쇄의 상이한 가변 도메인에 대해 상이한 친화도를 갖는다. 항-Fab 항체는 일반적으로 중쇄에 더 낮은 친화도를 갖는다. 비환원된 샘플의 경우, 각각의 항체의 발현은 중쇄-경쇄 종의 검출을 가능하게 한다. 주목할 것은, 전장 항체 동종이량체 종이 hole 항-FcεRI 항체에 대해 검출될 수 있지만, 이것은 충분히 폴딩되고 조립된 전체 항체 종의 일부에 불과하다는 것이다. 전장 항체 동종이량체 종의 폴딩 및 조립은 항-FcγRIIB 항체에 대한 "knob" 돌연변이 및 항-FcεRI 항체에 대한 "hole" 돌연변이의 포함 때문에 유리하지 않다. 환원된 샘플의 경우, 경쇄는 knob 항-FcγRIIB 항체 및 hole 항-FcεRI 항체에 대해 검출되었다.
유사하게, 항-Fc 웨스턴 블롯 결과는 도 19에 도시하였고, 이들은 레인 1에 knob 항-FcγRIIB 항체에 대한 충분히 폴딩되고 조립된 중쇄-경쇄 (HL) 종 및 레인 2에 hole 항-FcεRI 항체의 발현을 보인다. 항-Fc 항체는 경쇄에 결합할 수 없고, 따라서 경쇄는 검출되지 않는다. 비환원된 샘플의 경우, 각각의 항체의 발현은 다시 중쇄-경쇄종은 검출하지만, 전장 항체 동종이량체 종은 검출하지 않는다. 환원된 샘플의 경우, knob 항-FcγRIIB 항체 및 hole 항-FcεRI 항체에 대해 유사한 양의 중쇄가 검출된다.
3.3 5A6 Knob 힌지 변이체 및 22E7 Hole 힌지 변이체 항체의 발현
p5A6.11.Knob 및 p22E7.1 1.Hole 구성체의 발현에서 얻은 1차 항체종은 충분히 폴딩되고 조립된 중쇄-경쇄 (HL) 종이었다. 그러나, 이중특이적 항-FcγRIIB/항-FcεRI (5A6/22E7) 항체에 대해 본원에서 설명한 제조 방법을 용이하게 하기 위해서, 2개의 힌지 시스테인을 세린으로 치환시켜 (C226S, C229S, 카바트 (Kabat, E.A.) 등의 상기 문헌의 EU 넘버링 방식) 2개의 중쇄의 힌지 서열을 변형시켰다. 힌지 변이체는 또한 "힌지 부재"로도 아래에서 언급된다.
C226S, C229S 치환을 갖는 힌지 변이체를 포함하는 knob 항-Fcγ-RIIb (5A6) 항체 및 hole 항-FcεRI (22E7) 항체에 대한 플라스미드 구성체를 제조하였다. 2개의 플라스미드 구성체를 각각의 항체에 대해 제조하였다. 한 구성체의 경쇄 및 중쇄 모두에 대한 상대 TIR 강도는 1이었고, 제2 구성체의 경쇄 및 중쇄 모두에 대한 상대 TIR 강도는 2이었다.
이어서, knob 항-FcγRIIB 항체 (p5A6.11.Knob 플라스미드로부터의), hole 항-FcεRI 항체 (p22E7.11.Hole), knob 힌지 부재 항-Fcγ-RIIb 항체 (p5A6.11.Knob.Hg- 및 p5A6.22.Knob.Hg-), 및 hole 힌지 부재 항-FcεRI 항체 (p22E7.11.Hole.Hg- 및 p22E7.22.Hole.Hg-)를 상기한 바와 같이 이들 각각의 플라스미드로부터 발현시켰다. 전체 세포 용해물을 제조하고, SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로스에 이송하고, 상기한 바와 같이 염소 항-인간 Fab 컨쥬게이팅된 항체 및 염소 항-인간 Fc 컨쥬게이팅된 항체를 사용하여 검출하였다.
항-Fab 웨스턴 블롯 결과를 도 20에 도시하였고, 이들은 레인 2에서 knob 힌지 부재 항-Fcγ-RIIB 단량체 항체 (상대 TIR 강도 - 경쇄에 대해 1 및 중쇄에 대해 1) 및 레인 5에서 hole 힌지 부재 항-FcεRI 단량체 항체 (상대 TIR 강도 - 경쇄에 대해 1 및 중쇄에 대해 1)에 대한 중쇄-경쇄 (HL) 종의 폴딩 및 조립의 유의한 개선을 보인다. 또한, 항-Fab 웨스턴 블롯 결과는 경쇄 및 중쇄의 상대 TIR 강도가 1에서 2로 증가할 때 단량체 HL knob 힌지 부재 항-Fcγ-RIIB 항체 (레인 3) 및 단량체 HL hole 힌지 부재 항-FcεRI 항체 (레인 6)에 대한 중쇄-경쇄 (HL) 종의 폴딩 및 조립의 증가를 보인다. 항-Fab 항체는 경쇄의 상이한 가변 도메인에 대해 상이한 친화도를 갖고, 일반적으로 중쇄에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 비환원된 샘플의 경우, 각각의 항체의 발현은 중쇄-경쇄종의 발현은 검출하지만, 힌지 시스테인의 세린으로의 전환 때문에 전장 항체종은 검출하지 못한다. 2개의 힌지 시스테인이 세린으로 전환되고 경쇄 및 중쇄에 대한 상대 TIR 강도가 1에서 2로 증가할 때, 각각의 knob 힌지 부재 항-Fcγ-RIIb 및 hole 힌지 부재 항-FcεRI 항체에 대한 중쇄-경쇄 (HL) 종의 폴딩 및 조립의 유의한 개선이 존재한다. 환원된 샘플의 경우, 경쇄 뿐만 아니라 중쇄가 상이한 항-Fcγ-RIIb 및 항-FcεRI 항체에 대해 검출된다. 상대 TIR 강도가 1에서 2로 증가할 때 중쇄 및 경쇄의 양의 증가가 검출된다.
유사하게, 도 21의 항-Fc 웨스턴 블롯 결과는 2개의 중쇄 (HC) 힌지 시스테인이 세린으로 전환되고 경쇄 및 중쇄의 상대 TIR 강도가 1에서 2로 증가할 때 knob 힌지 부재 항-Fcγ-RIIB 및 hole 힌지 부재 항-FcεRI 항체 모두에 대한 중쇄-경쇄 (HL) 단량체종의 폴딩 및 조립의 유의한 개선을 보인다. 항-Fc 항체는 경쇄에 결합할 수 없고, 따라서 경쇄는 검출되지 않는다. 환원된 샘플의 경우, 중쇄는 상이한 항-Fcγ-RIIb 및 항-FcεRI 항체에 대해 검출된다. 상대 TIR 강도가 1에서 2로 증가할 때, 중쇄의 양의 증가가 검출된다.
3.4 이중특이적 항체 성분의 정제
정제된 기능성의 이중특이적 항체의 제조 용이성 및 효율을 상기한 바와 같이 변이체 힌지 구역을 갖는 항체의 측면에서 추가로 평가하였다.
1. 이. 콜라이 페이스트로부터의 추출
냉동 이. 콜라이 페이스트를 해동시키고, 5 부피 (v/w)의 증류수에 현탁시키고, HCl로 pH를 5로 조정하여 원심분리시키고, 상등액을 버렸다. 폴리트론 (polytron) (브링크만 (Brinkman))을 사용하여 불용성 펠렛을 pH 9에서 5-10 부피의 완충액에 재현탁시키고, 상등액을 원심분리 후에 유지시켰다. 상기 단계를 1회 반복하였다.
이어서, 불용성 펠렛을 5-10 부피의 동일한 완충액에 재현탁시키고, 미세유화기 (마이크로플루이딕스 (Microfluidics))를 통과시켜 세포를 붕괴시켰다. 상등액을 원심분리 후에 유지시켰다.
상등액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯에 의해 평가하고, 단일 암 항체를 포함하는 것 (즉, 단일 중쇄 + 경쇄의 분자량에 대응하는 밴드)을 모았다.
2. 단백질-A 친화도 크로마토그래피
모은 상등액을 pH 8로 조정하고, ProSep™-A 비드 (밀리포어)를 첨가하였다 (약 250 ml 비드/10리터). 혼합물을 24 - 72시간 동안 4℃에서 교반하고, 비드를 정치시키고, 상등액을 부어 버렸다. 비드를 크로마토그래피 컬럼 (아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences) XK50™)에 이송하고, 1O mM tris 완충액 (pH7.5)으로 세척하였다. 이어서, 컬럼을 5O mM 시트레이트, 0.1 M NaCl 완충액 중에서 pH 구배를 사용하여 용출시켰다. 출발 완충액을 pH6으로 조정하고, pH2 완충액을 사용한 선형 희석에 의해 구배를 형성시켰다.
8M 우레아 및 tris 염기를 첨가하여 분획을 pH5 및 2M 우레아로 조정하고, SDS-PAGE로 평가하고, 모았다.
3. 양이온 교환 크로마토그래피
S-세파로스 패스트 플로우(Fast Flow)™ 컬럼 (아머샴 바이오사이언시즈)를 2M 우레아, 25 mM MES pH5.5로 평형화시켰다. ProSep™-A 용출액 풀을 등부피의 평형 완충액으로 희석하고, 컬럼에 로딩하였다. 평형 완충액으로, 이어서 25 mM MES pH5.5로 세척한 후에, 컬럼을 25 mM MES, pH5.5 중의 0 - 1M NaCl의 선형 구배를 사용하여 전개시켰다. SDS-PAGE 분석을 기초로 하여 분획을 모았다.
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피
HI-프로필™ 컬럼 (J.T.Baker)을 0.5 M 황산나트륨, 25 mM MES pH6으로 평형화시켰다. S-패스트 플로우™ 용출액을 0.5M 황산나트륨을 사용하여 pH6으로 조정하고, 컬럼에 로딩하고, 25 mM MES, pH6 중의 0.5 - OM 황산나트륨의 구배를 사용하여 컬럼을 전개시켰다. SDS-PAGE 분석을 기초로 하여 분획을 모았다.
J. 크기 배제 크로마토그래피
센트리프렙™ YM1O 농축기 (아미콘)를 사용하여 HI-프로필™ 용출액 풀을 농축하고, 0.1M NaCl, pH6 중의 1O mM 숙시네이트 또는 1O mM 히스티딘으로 평형화시킨 수퍼덱스(Superdex)™ SX200 컬럼 (아머샴 바이오사이언시즈)에 로딩하고, 컬럼을 2.5 ml/m으로 전개시켰다. SDS-PAGE 분석을 기초로 하여 분획을 모았다.
3.5 이중특이적 항체를 생성시키기 위한 항체 성분의 어닐링
2개의 유사한 (동일하지는 않은) 어닐링 방법을 아래에서 설명한다. 두 방법은 이중특이적 항체의 우수한 수율을 달성하였다. 항체의 중쇄 및 아래에서 설명하는 항체 성분은 상기한 바와 같은 변이체 힌지 구역을 포함한다.
어닐링 힌지 변이체 5A6Knob 및 힌지 변이체 22 E7Hole - 방법 1
25 mM MES pH5.5, 0.5 M NaCl 중의 정제된 5A6Knob 및 22E7Hole 중쇄/경쇄 단량체 항체를 이들의 농도를 기초로 하여 등몰 비율로 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 50℃에서 5분 내지 1시간 동안 가열하였다. 상기 어닐링 온도는 상기 CH3 변이체에 대해 문헌에 기재된 용융 곡선으로부터 유도된 것이었다 (Atwell, S., et al., 1997, J. Mol. Biol., 270:26-35). 이어서, 그의 이중특이성을 결정하기 위해서 어닐링된 항체를 분석하였다.
이중특이성의 분석
1) 등전점 포커싱
어닐링된 항체는 샘플을 등전점 포커싱 분석에 적용하여 이중특이적인 것으로 확인되었다. 5A6Knob 항체의 pI는 7.13인 반면, 22E7Hole의 pI는 9.14이다. 이중특이적 5A6Knob/22E7Hole 항체의 pI는 8.67이다. 도 22는 쿠마시 블루로 염색한 후에 등전점 포커싱 겔 (인비트로겐 (Invitrogen), 노벡스 pH3-10 IEF) 상에서 5A6Knob, 22E7Hole 및 이중특이적 5A6Knob/22E7Hole (가열 전 및 후) 항체의 이동을 보여준다. 실온에서 혼합시에 일부 어닐링이 존재하지만, 5O℃로 가열하면 어닐링 과정의 완성을 촉진하는 것으로 보인다. pI가 5A6Knob과 22E7Hole 사이인 새로운 단백질 밴드의 발생을 통해 이중특이적 항체의 형성을 확인할 수 있다.
2) 친화도 컬럼 분석
5A6Knob, 22E7Hole, 및 이중특이적 5A6Knob/22E7Hole 항체의 거동을 FcγRIIB 친화도 컬럼 상에서 관찰하였다. 인간 FcγRIIB (세포외 도메인)-GST 융합 단백질을 제조사의 지시에 따라 (피어스, UltraLink™ 고정 키트 #46500) 작은 컬럼 내의 고상 지지체에 커플링시켰다. PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2P04 pH 7.2) 중의 5A6Knob, 22E7Hole, 및 이중특이적 5A6Knob/22E7Hole 항체를 3개의 별개의 FcγRIIB 친화도 컬럼에 각각의 컬럼의 이론적 결합 용량의 약 10-20%로 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 16 컬럼 부피의 PBS로 세척하였다. 로딩 및 세척시의 컬럼 유동 통과액을 수거하고 합하여 Centricon™ 미세농축기 (아미콘)로 약 10배 농축하였다. 동일한 부피의 각각의 농축액을 2X SDS 샘플 완충액으로 2배로 희석하고, SDS-PAGE (인비트로겐, 노벡스 Tris-글리신)으로 분석하였다. 2O mM Na2HPO4 (pH 6.5)로 전기블로팅하여 단백질 밴드를 니트로셀룰로스에 이송하고, 항-인간 IgG Fab 퍼옥시다제 컨쥬게이팅된 항체 (CAPPELL#55223)로 프로빙하였다. 이어서, 항체 밴드를 아머샴 파마시아 바이오테크 ECL™ 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 검출하였다.
상기 분석 결과를 도 23에 도시하였다. FcγRIIB 친화도 컬럼은 5A6Knob 항체 및 5A6Knob/22E7Hole 이중특이적 항체를 보유하여야 한다. 22E7Hole 항체는 도 23에 도시된 바와 같이 컬럼을 통해 유동하여야 한다. 5A6Knob/22E7Hole 이중특이적 레인에서 검출되는 항체의 결여는 이중특이성을 나타내었다.
5A6Knob, 22E7Hole, 및 이중특이적 5A6Knob/22E7Hole 항체의 거동은 또한 FcεRI 친화도 컬럼에서 관찰할 수 있다. IgE 융합 친화도 컬럼을 제조하여 FcγRIIB 친화도 컬럼에 대해 상기한 바와 같이 이용할 수 있다. FcεRI 친화도 컬럼은 22E7Hole 항체 및 5A6Knob/22E7Hole 항체를 보유하여야 한다. 5A6Knob 항체는 컬럼을 통해 유동하여야 한다. 5A6Knob/22E7Hole 항체 레인에서 검출되는 항체의 결여는 이중특이성을 나타내었다.
힌지 변이체 5A6Knob 및 힌지 변이체 22 E7Hole 의 어닐링 - 방법 2
항체 성분 (단일 암 5A6Knob 및 22E7Hole)을 상기한 바와 같이 정제하였다.
'이종이량체'는 약간 몰 과량의 5A6을 사용하여 50℃에서 어닐링하여 형성시킨 후, 양이온 교환 컬럼 상에서 정제하였다.
5A6(Knob) 5 mg 및 22E7(Hole) 4.5 mg H/L 단량체 항체를 총 부피 10 ml의 8 mM 숙시네이트, 8O mM NaCl 완충액에 합하고, 2O mM tris, pH7.5로 조정하였다.
단량체 항체는 이중특이적 항체를 형성하기 위해서 혼합물을 수조에서 50℃로 10분 동안 가열한 후, 4℃로 냉각시켜 어닐링시켰다.
이중특이성의 분석
1. 등전점 포커싱
등전점 포커싱 겔 (Cambrex, pH7-11) 상의 분석은 어닐링 혼합물에서 pI ~8.5에서 단일 밴드의 형성을 보여주었고, 이는 이중특이적 항체 (계산된 pI: 8.67)에 대응하는 것이다 (도 24 참조).
2. 양이온 교환 컬럼 상에서의 정제
5 ml CM-패스트 플로우 컬럼 (HiTrap, 아머샴 바이오사이언시즈)을 pH 5.5에서 완충액 (3O mM MES, 2O mM hepes, 2O mM 이미다졸, 2O mM tris, 25 mM NaCl)으로 평형화시켰다. 어닐링된 풀을 등부피의 평형 완충액으로 희석하고, pH5.5로 조정하고, 컬럼에 로딩하고, 평형 완충액으로 세척하였다. 컬럼을 동일한 완충액에서 pH 5.5 내지 pH 9.0의 구배를 사용하여 30분에 걸쳐 1 ml/m으로 전개시켰다.
분획을 IEF로 분석한 결과, 5A6는 이종이량체보다 앞서 용출되는 것으로 밝혀졌다. 이종이량체를 포함하는 한데 모은 분획의 광 산란에 의한 분석을 통해 단량체는 보이지 않았다.
실시예 4.0 5A6/22 E7 놉 인 홀 이중특이적 항체의 특성화
본 실시예의 목적은 5A6 또는 22E7 단독이 아니라 5A6/22E7이 이중특이적 항체임을 입증하는 것이다. 5A6/22E7는 샌드위치 ELISA 분석에서 인간 FcγRIIB-His6-GST 및 FcεRI-ECD-Fc에 대한 이중 결합 특이성을 갖는다. 그 결과는 도 29 및 30에 제시한다. 5A6(A) 및 5A6(B)는 5A6의 2개의 단백질 제제를 명명한 것이다. 아래에서 설명되는 5A6/22E7 이중특이적 항체는 야생형 힌지를 갖거나 힌지가 없는 놉 인 홀 이종이량체 항체이다. 이중특이적 항체는 BsAb로 상호교환가능하게 언급된다.
5A6/22E7 힌지 부재 이중특이적 항체의 huFcγRIIB-His6-GST 및 huFcεRI-ECD-Fc (IgE 수용체 융합체)에 대한 이중 결합 특이성을 ELISA로 입증하였고, 그 결과를 도 29에 제시하였다. ELISA 플레이트를 PBS, pH 7.4 중의 FcγRIIB-His6-GST 용액 (1 ㎍/ml) 1OO ㎕로 4℃에서 철야 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고, PBS 중의 1% 카제인 차단제로 차단하였다. 웰을 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 3회 세척하였다. 10 ㎍/ml의 CD4-IgG를 ELISA 희석 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)에 제조하고, 시험 항체 5A6 (A)/22E7 놉 인 홀, 야생형 힌지, 이중특이적 항체; 5A6 (B)/22E7 놉 인 홀, 야생형 힌지, BsAb; 5A6/22E7 놉 인 홀, 힌지 부재 BsAb;5A6 MAb; 및 22E7 MAb 각각의 Fc 부분에 대한 FcγRIIB-His6-GST 결합을 차단하기 위해 100 ㎕/웰로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 3회 세척한 후, 3개의 5A6/22E7 BsAb, 5A6 MAb 및 22E7 MAb의 연속 희석액을 ELISA 희석 완충액에 제조하고, 100 ㎕/웰로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 3회 세척한 후, 1OO ㎕의 1 ㎍/ml huFcεRI-ECD-Fc를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 3회 세척한 후, 100 ㎕의 1 ㎍/ml IgE-비오틴을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 세척하고, ELISA 희석 완충액 중의 100 ㎕/웰의 1:2000 스트렙타비딘-HRP와 함께 30분 동안 인큐베이팅하였다. PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 세척한 후, 플레이트를 100 ㎕ TMB 기질과 함께 5분 동안 인큐베이팅하였다. 100 ㎕/웰 정지 용액을 사용하여 반응액을 켄칭시키고, 96웰 플레이트 밀도계 (몰레큘라 디바이시스)로 플레이트를 630 nm에서 판독하였다. 그 결과는 IgE가 5A6/22E7 이중특이적 항체를 포함하는 웰에 결합하였음을 보여준다. 이중특이적 항체: 5A6 (A) + 22E7 BsAb, 5A6 (B) + 22E7 BsAb, 및 5A6+22E7 힌지 부재 knob-hole BsAb는 FcγRIIB-GST 및 IgE-비오틴에 성공적으로 결합하였다 (도 29 참조).
상보성 ELISA 실험을 수행하고, 그 결과를 도 30에 제시하였다. ELISA 플레이트를 PBS, pH 7.4 중의 1 ㎍/ml의 huFcεRI-ECD-Fc 용액 100 ㎕로 4℃에서 철야 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고, PBS 중의 1% 카제인 차단제로 차단하였다. 웰을 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 3회 세척하였다. 5A6/22E7 이중특이적 항체, 5A6 항체 또는 22E7 항체의 연속 희석액을 ELISA 희석 완충액에 제조하고, 100 ㎕/웰로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 3회 세척한 후, 시험 항체 huFcεRI-ECD-Fc 및 2차 항체 (항-GST-비오틴)의 Fc 부분에 대한 FcγRIIB-His6-GST 결합을 차단하기 위해 10 ㎍/ml의 CD4-IgG의 존재 하에 1 ㎍/ml FcγRIIB-His6-GST 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 3회 세척한 후, 100 ㎕의 1 ㎍/ml 항-GST-비오틴을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 세척하고, ELISA 희석액 완충액 중의 1:2000 스트렙타비딘-HRP의 100 ㎕/웰과 함께 30분 동안 인큐베이팅하였다. PBS/0.05% 트윈(등록상표)로 세척한 후, 플레이트를 100 ㎕ TMB 기질과 5분 인큐베이팅하였다. 반응을 100 ㎕/웰 정지 용액으로 켄칭시키고, 플레이트를 630 nm에서 판독하였다. 그 결과, 항-GST 비오틴이 5A6/22E7 이중특이적 항체를 포함하는 웰에 결합하였음이 밝혀졌다. 이중특이적 항체: 5A6 (A) + 22E7 및 5A6 (B) + 22E7 힌지 부재 이중특이적 항체, 및 5A6+22E7 knob-hole 이중특이적 항체는 huFcεRI-ECD-Fc 및 FcγRIIB-GST에 성공적으로 결합하였다 (도 30 참조).
두 실험의 곡선 그래프를 도 29 및 30에 제시한다. FcγRIIB-GST 및 huFcεRI-ECD-Fc에 대한 성공적인 결합은 5A6 (A) + 22E7 및 5A6 (B) + 22E7 힌지 부재 이중특이적 항체에서만 입증되었다. 도 29 및 30에 제시된 결과에 대한 IC50 값은 표 1에 제시한다.
FcγRIIB-GST에 대한 IC50 값 (ng/ml)
(도 29)		 huFcεRI-ECD-Fc에 대한 IC50 값 (ng/ml)
(도 30)
BsAb-놉 인 홀, 야생형 힌지 BsAb-놉 인 홀, 야생형 힌지
5A6 (A)+22E7: 55.2 5A6 (A)+22E7: 490
5A6 (B)+22E7: 76.0 5A6 (B)+22E7: 291.5
MAb MAb
5A6 (A): 3.3e+06 5A6 (A): 5.3e+06
5A6 (B): 1.4e+07 5A6 (B): 1.0e+07
22E7: 1.0e+05 22e7: 2.8e+06
BsAb-놉 인 홀, 힌지 부재 BsAb-놉 인 홀, 힌지 부재
5A6+22E7 힌지 부재 Knob-hole: 23 5A6+22E7 Knob-hole: 76.5
실시예 5.0: 5A6/22 E7 힌지 부재, 놉 인 홀, 이중특이적 항체의 특성
5.1 물질
선행 실시예에서, FcγRIIB는 3가지 인간 FcγRIIB 스플라이스 (splice) 변이체 중 하나인 huFcγRIIB1이다. 나머지 실시예에서, FcγRIIB1 및 추가의 스플라이스 변이체 FcγRIIB2가 사용되고 또한 그와 같이 지명된다.
JW8.5.13은 NP (니트로페놀, 항원)에 특이적인 마우스 가변 영역 및 인간 IgE Fc 영역으로 이루어진 키메릭 항체이다. JW8.5.13 IgE의 가변 영역은 NP에 특이적이고, TNP와 교차반응하지 않는다. JW8.5.13의 인간 IgE 부분은 huFcεRI에 특이적으로 결합하고, RBL 유래 세포주에서 내재성 래트 FcεRI에 결합하지 않는다. huFcεRI에 대한 JW8.5.13의 결합은 그의 발현을 상향조절하고 항원-특이적 IgE에 로딩시킨다.
RBL 유도체 세포주를 생성시키기 위해서 고친화도 인간 IgE 수용체 (FcεRI)의 α-서브유닛인 FcεRIα를 발현하는 RBL-2H3 (ATCC# CRL-2256) 세포 (Gilfillan et al., (1995) Int Arch Allergy Immunol. 107(1-3): 66-68)를 huFcγRIIB1 및(또는) huFcγRIIB2로 형질감염시켰다. 비디-클론테크 (BD-Clontech)로부터 입수가능한 pQCXIR (Retro-X Q 벡터) 벡터 시리즈와 유사한, 미국 미주리주 소재의 워싱턴 대학에서 입수한 레트로바이러스 발현 벡터를 사용하여 인간 FcγRIIB1 또는 FcγRIIB2에 의한 RBL 2H3 세포의 레트로바이러스 형질도입에 의해 RBL 2H3 세포주 변이체를 생성시켰다. 2개의 유전자의 이중시스트론 동시-형질감염 및 동시-발현을 위해 전장 인간 유전자의 cDNA를 단독으로 또는 IRES (Internal Ribosomal Entry Sequence)와 함께 레트로바이러스 벡터 내로 서브클로닝하였다. 레트로바이러스 형질도입 방법에 대한 추가의 설명을 아래 제공한다.
PG13 패키징 세포 (ATCC CRL-10686)를 배양판당 2x106 세포로 10 cm 조직 배양판 (DMEM 고농도 글루코스, 10% FCS, 페니실린, 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민)에 24시간 동안 씨딩하였다. FuGENE 6을 사용하여 세포를 pMSCV DNA 구성체로 형질감염시키고, 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 배양하였다. 레트로바이러스 입자를 포함하는 세포 배양 상등액을 수거하고, 0.4 미크론 필터를 통해 여과하였다. 멸균 프로타민 술페이트를 최종 농도 10 ㎍/ml로 첨가하고, 4 ml의 상등액을 사용하여 32℃에서 90분 동안 스핀 감염에 의해 약 1x1O6 RBL 세포를 감염시킨 후, 5% CO2 중에서 37℃에서 3-4시간 동안 레트로바이러스 상등액에서 계속 배양하였다. 감염된 RBL 세포를 회수하여 RBL 배지에 옮기고, 분류를 위해 팽창시켰다. 양성 형질감염 세포는 각각 인간 FcεRIA 및 인간 FcγRIIB를 검출하기 위해서 22E7 및(또는) 5A6 항체를 사용하여 FACS에 의해 확인하였다.
생성되는 세포주는 다음과 같이 명명하였다: 인간 FcεRIα를 표면 발현하는 RBL huFcεRI 세포; 인간 FcγRIIB1을 표면 발현하는 RBL huFcγRIIB 세포, 인간 FcεRIα 및 인간 FcγRIIB1을 표면 발현하는 RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포; 및 인간 FcεRIα 및 인간 FcγRIIB2를 표면 발현하는 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포.
PBS 중에서 2Ox 몰 과량의 EZ-link™ NHS-PE04-비오틴 (피어스)을 이중특이적 항체에 커플링시켜 비오티닐화 5A6/22E7 이중특이적 항체 (놉 인 홀, 힌지 부재)를 제조하였다.
바큘로바이러스 발현 시스템에 서브클로닝하여 huFcεRIα 세포외 도메인 (huFcεRIα ECD)를 생성시키고, CNBr-세파로스 연결 컬럼 및 세파덱스 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다. C-말단 His6 태그와 인 프레임으로 서브클로닝시킨 후, 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현시켜 huFcγRIIB 세포외 도메인 (huFcγRIIB ECD)를 제조하였다. huFcγRIIB ECD를 NiNTA 수지로 정제하였다.
5.2 히스타민 방출 분석
huFcγRIIB1 또는 huFcγRIIB2를 세포 표면 상의 huFcεRI에 가교결합시키는 5A6/22E7 이중특이적 항체의 능력은 다음 분석에 따라 히스타민 방출을 선택적으로 차단함으로써 입증되었다. 하기 설명은 도 31-33에 의해 추가로 지지된다.
형질감염된 RBL 48 세포 (상기 문헌)를 가습 5% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 표준 조직 배양 플라스크 내의 EMEM (얼 BSS가 첨가된 이글 최소 필수 배지) (2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, O.1 mM 비필수 아미노산, 1.5 g/L 중탄산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신, 15% 소 태아 혈청이 첨가됨)에서 성장시켰다. 세포를 PBS/0.05% 트립신/0.53 mM EDTA의 4 mL 용액에 37℃에서 2분 동안 노출시킨 후 원심분리 (400 x g, 10분)하여 회수하고, 신선한 EMEM에 재현탁시켰다. 현탁액 중의 세포를 혈구계 (레이허트-중 (Reichert-Jung))로 계수하고, 밀도를 약 105 내지 106 세포/ml로 조정하였다.
상기한 형질감염된 RBL 세포, 즉 RBL huFcεRI, RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포를 200 ㎕의 EMEM에 105 세포/웰로 96웰 평저 조직 배양판에 씨딩하였다. 세포를 1 ㎍/ml의 JW8.5.13 ("NP-특이적 인간 IgE")의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 신선한 배지로 3회 세척하여 결합하지 않은 NP-특이적 인간 IgE를 제거하였다. 일부 세포를 포화 조건 하에 1-5 ㎍/ml의 이중특이적 항체로 처리하고, 항원을 사용한 활성화 전에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다.
세포를 IgE인 JW8.5.13에 결합하는 항원인 니트로페놀 (NP)-컨쥬게이팅된 오발부민 (NP (11)-OVA), 또는 비관련 항원인 TNP (11)-OVA와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이중특이적 항체가 존재하거나 존재하지 않는 RBL huFcεRI, RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포의 NP-(11)-OVA 및 TNP에 의한 활성화-관련 탈과립화 (히스타민 방출)를 0.0001 내지 10 ㎍/ml의 항원 농도에서 시험하였다. 인큐베이션 후, 세포 상등액 (세포 배양 배지) 중 히스타민 수준을 상기한 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다. 또한, 활성화와 무관한 양성 대조군으로서 기능하는 세포의 총 히스타민 수준은 트리톤 X-1OO을 사용한 세포 용해에 의해 또는 이오노마이신을 사용한 자극에 의한 총 히스타민 방출을 촉발시켜 얻었다. RBL 세포에 의한 백그라운드 히스타민 방출을 또한 얻었다. 히스타민 방출 수준은 히스타민 ELISA 키트 (케이엠아이 다이아그노틱스 (KMI Diagnostics, 미국 미네소타주 미네아폴리스))를 사용하여 ELISA에 의해 정량하였다.
히스타민 방출 분석의 결과를 도 31-33에 제시한다. 히스타민 방출은 특이적으로 억제되지 않으면 hIgE (JW8.5.13) 및 NP (11)-OVA 항원 ("NP")의 존재 하에 증가할 것으로 예상된다. 도 31은 TNP 또는 NP (11)-OVA의 상이한 농도에서 RBL huFcεRI 세포의 히스타민 방출 데이타를 제시한다. RBL huFcεRI 세포에서, 히스타민 방출은 NP 및 hIgE에 촉발된다. 예상한 바와 같이, 이중특이적 항체는 huFcγRIIB의 부재 하에 히스타민 방출에 영향 (즉 억제 또는 저해)을 주지 않는다 (도 31 그래프 A에서 각각의 샘플에 대한 우측의 먼쪽의 암회색 컬럼, "+hIgE+NP+이중특이적").
도 32는 RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포의 히스타민 방출 데이타를 제시하고, 도 33은 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포의 히스타민 방출 데이타를 제시한다. RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포에서, 이중특이적 항체는 히스타민 방출을 억제한다 (도 32의 그래프 A 및 도 33의 그래프 A에서 밝은 회색 "+hIgE+NP" 막대를 암회색 "+hIgE+NP+이중특이적" 막대와 비교).
모든 RBL 세포주에서 히스타민 방출의 활성화는 인간 FcεRI에 결합한 인간 IgE를 통해 용량 의존적 방식으로 항원 특이적이다. 세포는 인간 IgE의 부재 하에 활성화되지 않고, 비관련 항원 (즉 TNP)를 사용한 촉발시에도 활성화되지 않았다. 5A6/22E7 이중특이적 항체의 첨가는 RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포에서 히스타민 방출을 억제하지만 (백그라운드 수준까지), RBL huFcεRI 세포에서는 억제하지 않았고, 이것은 FcγRIIB의 존재가 억제 기능에 필요함을 나타낸다. 유사한 결과가 huFcεRI의 존재 하에 huFcγRIIB1 및 huFcγRICB2 모두에 의해 관찰되었다.
또한, 본 발명의 이중특이적 항체는 1차 인간 호염기구에서 항-IgE-유도 히스타민 방출을 억제한다. 1차 호염기구는 동의를 얻은 6명의 정상 인간 혈액 공여자로부터 단리하였다. 덱스트란 침강 프로토콜을 사용하여 호염기구를 인간 혈액으로부터 농축시켰다. 간단히 설명하면, 침강되는 공여자 혈액 40 ml에 대해, 50 ml 원뿔형 관, 375 mg의 덱스트로스, 5.0 ml 0.1 M EDTA 및 12.5 ml 6% 임상 덱스트란을 혼합하였다. 혼합물을 2개의 50 ml 원뿔형 관에 나누고, 각각의 관에 20 ml 혈액을 넣었다. 혈액을 60-90분 동안 침강시키고, 이때 혈장층이 분리되면 110 x g, 4℃에서 8분 동안 원심분리시키고, 펠렛화된 세포를 분리하여 재현탁시키고 PAG (덱스트로스 1 g/L: 1X PIPES, pH7.3: 0.003% 인간 혈청 알부민)로 세척하고, PAG에 재현탁시켰다. 세포를 덱스트란-농축 제제로서 또는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후 원심분리하여 세포를 펠렛화시켜 밀테니이 (Miltenyi) 자기 비드 분리 (밀테니이 바이오텍 (Miltenyi Biotec, 미국 캘리포니아주 오스번); 예를 들어, Kepley, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 102:304-315 (1998) 참조)를 사용한 후속 정제 후에 항-IgE 항체로 자극하였다. 분석을 위해 상등액을 보관하였다. 호염기구는 표준 절차, 예를 들어 문헌 [Kepley, CL. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 106(2): 337-348 (2000)]에 기재된 방법에 의해 단리할 수 있다. 농축된 호염기구는 자기 비드 분리 (밀테니이 바이오텍; Kepley, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 102:304-315 (1998)) 및(또는) 유동 세포 측정 분류 (Kepley, C. et al., (1994), 상기 문헌)에 의해 추가로 정제될 수 있다. 염소 항-인간 IgE는 칼태그(Caltag) (칼태그 래보래토리즈 (Caltag Laboratories), 미국 캘리포니아주 벌링게임)로부터 입수하였다. huFcγRIIB 및 huFcεRI을 동시-발현하는 단리된 호염기구를 항-IgE (염소 항-인간 IgE (칼태그 래보래토리즈))와 함께 또는 5A6/22E7 이중특이적 항체 항체를 추가로 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 염소 항-IgE의 1:100 희석액 (부피비)을 사용하여 시험 용액 중의 0 내지 20000 ng/ml의 5A6/22E7 이중특이적 항체의 존재 하에 호염기구를 자극하였다. 히스타민 방출을 상기 개시한 바와 같이 분석하였다. 도 62의 막대 그래프는 히스타민 방출이 항-인간 IgE의 존재 하에 유도되었음을 나타낸다. 5A6/22E7 이중특이적 항체의 첨가는 거의 용량 의존적 방식으로 히스타민 방출을 억제하였다. 항체의 부재 하에 또는 5A6/22E7 이중특이적 항체 단독의 존재 하에 제한된 백그라운드 히스타민 방출이 존재하였다. 6명의 정상 인간 혈액 공여자로부터의 호염기구 샘플의 분석을 기초로 하여, 5A6/22E7 이중특이적 항체에 의한 히스타민 방출의 평균 억제는 67%±9이었다. 졸레어(등록상표) 환자의 호염기구로부터의 평균 히스타민 방출은 FcεRI 발현의 하향조절을 기초로 하여 90일 후에 약 50%까지 억제된 것으로 보고되었다 (MacGlashan, D.W. et al., J. Immunol. 158:1438-1445 (1997)). 이들 결과는 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체가 FcγRIIB와의 가교결합을 통해 FcεRI의 활성을 억제함으로써 인간 환자의 면역 반응 (예를 들어 호염기구에서 히스타민 방출)을 신속하게 억제하는 치료 분자로서 유용함을 입증한다. 또한, 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체는 항-IgE 항체와의 조합 요법에도 유용하다. 조합 요법을 사용하여, 항-huFcγRIIB/항-huFcεRI 이중특이적 항체는 FcγRIIB와의 가교결합, 이어서 항-IgE 항체 (예를 들어 졸레어(등록상표) 항-IgE 항체, 제넨테크 인크.)에 의한 FcεRI 발현의 하향조절에 의해 히스타민 방출을 신속하게 억제하는 작용을 한다.
5.3 이중특이적 항체에 의한 huFcεRI 및 huFcγRIIB의 가교결합
본 실시예의 목적은 5A6/22E7 이중특이적 항체에 의한 세포 표면 상의 인간 FcεRI 및 인간 FcγRIIB의 동시-가교결합에 대한 히스타민 억제의 의존성을 보여주는 것이다. 분석 방법은 아래에서 설명되고, 그 결과는 도 34-41에 추가로 제시하였다.
RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포를 5 ㎍/ml의 NP-특이적 인간 IgE와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅한 후, 비결합된 NP-특이적 인간 IgE를 제거하기 위해 신선한 배지 EMEM으로 3회 세척하였다. RBL 세포에 첨가하기 전에, 5A6/22E7 이중특이적 항체를 상이한 몰비로 정제된 huFcεRIα ECD 및 huFcγRIIB ECD와 함께 30분 동안 예비인큐베이팅하였다. 예비인큐베이팅된 5A6/22E7 이중특이적 항체를 5 ㎍/ml 5A6/22E7 이중특이적 항체의 최종 농도에서 RBL 세포 배양 배지에 첨가하고, 추가로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 37℃에서 NP-컨쥬게이팅된 오발부민과 1시간 동안 인큐베이팅하여 활성화시켰다. 활성화-관련 탈과립화는 일반적으로 상기한 바와 같은 ELISA를 사용하여 세포 배양 배지 내로의 히스타민 방출을 정량화하여 측정하였다. 본 발명의 이중특이적 항체에 의한 인간 FcεRI 및 인간 FcγRIIB 동시-가교결합에 대한 히스타민 방출 억제의 의존성은 도 34 (RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포) 및 도 36 (RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포)에 제시되었다.
또한, 이중특이적 항체의 RBL-유래 세포에 대한 결합은 유동 세포 측정을 사용하여 huFcεRIα ECD 및 huFcγRIIB ECD의 존재 하에 평가하였다. 세포 및 물질은 상기한 바와 같다. 세포를 수거하여 105-106 세포의 분취액 내로 분류하였다. 세포를 세척하고, FACS 완충액 (2% FCS가 존재하는 PBS)에 재현탁시켰다. 세포를 다시 세척하고, 10% 래트 혈청, 2 ㎍/ml 인간 IgG 및 1 ㎍/mL 비오티닐화 이중특이적 항체로 보충된 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 30분 동안 빙상에서 인큐베이팅하고 세척한 후, 스트렙타비딘-PE가 존재하는 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 추가로 30' 동안 빙상에서 인큐베이팅한 후, 혼합물을 차가운 FACS 완충액으로 세척하고, 원심침강시켜 0.1% 프로피듐 요오다이드가 존재하는 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 샘플을 유동 세포 측정으로 분석하고, 그 결과를 상대 형광 단위 (RFU)로 표시하였다. 이들 결합 연구의 결과를 도 35, 및 37-41에 제시하고, ECD 대 이중특이적 항체의 비율을 나타내었다. 도 35 및 37은 huFcεRI ECD 및 huFcγRIIB ECD의 존재 하에 5A6/22E7 이중특이적 항체의 RBL huFcεRI+FcγRIIB1 세포 (도 35) 또는 RBL huFcεRI+FcγRIIB2 세포 (도 37)에 대한 결합의 유동 세포 측정 데이타 그래프를 포함한다. 예상한 바와 같이, 높은 비율의 ECD 대 이중특이적 항체는 세포에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시켰다. 밝은 피크 (ECD의 존재 하에 BsAb에 의해 결합된 세포) 대 어두운 피크 (양성 대조군 - ECD의 부재 하에 BsAb에 의해 결합된 세포)를 비교하면 이를 알 수 있다.
도 38-41에서, 유동 세포 측정을 사용하여 huFcεRI ECD, huFcγRIIB ECD 또는 huFcεRI ECD 및 huFcγRIIB ECD 모두의 존재 하에 5A6/22E7 이중특이적 항체의 상이한 RBL-유래 세포에 대한 결합을 분석하였다. 도 38-41에서, 흑색 피크는 ECD의 존재 하에 5A6/22E7의 세포-표면 수용체 결합이다. 밝은 회색 피크 (BsAb에 의해 결합되지 않은 세포) 및 암회색 피크 (ECD의 부재 하에 BsAb에 의해 결합된 세포)를 비교하면 알 수 있다. 예상한 바와 같이, RBL huFcεRI 세포에 대한 5A6/22E7 결합 (도 38 참조)은 huFcεRI ECD의 농도 증가와 함께 차단되지만, huFcγRIIB ECD에 의해서는 차단되지 않고, 두 ECD의 차단은 huFcεRI ECD와 유사한 결과를 보였다. RBL huFcγRIIB 세포에 대한 5A6/22E7 결합 (도 39 참조)은 huFcεRI ECD에 의해 영향받지 않았고, huFcγRIIB ECD에 의해 차단되었다. 유사한 결합 결과가 RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포 (도 40) 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포 (도 41)에서 관찰되었다. 예상된 바와 같이, 5A6/22E7의 결합은 huFcεRI ECD 또는 huFcγRIIB ECD의 10:1 비율에 의해 감소되었고, 두 ECD의 단지 10:1 비율 (포화 농도)에서 5A6/22E7의 RBL huFcεRI+huFcγRIIB(1 또는 2) 세포에 대한 완전한 차단이 관찰되었다.
이들 실험은 5A6/22E7 이중특이적 항체와 10배 몰 과량의 huFcεRIα 및 huFcγRIIB 세포외 도메인의 예비인큐베이션시에 히스타민 반응의 억제가 관찰되지 않았기 때문에 히스타민 방출의 억제는 세포 표면 FcεRI 및 FcγRIIB의 동시-가교결합에 의존적임을 입증한다. 상기 조건에서, 5A6/22E7 이중특이적 항체의 세포 표면에 대한 결합은 유동 세포 측정에 의해 평가할 때 완전히 차단되었다. 낮은 몰비의 huFcεRI ECD 및 huFcγRIIB ECD (2:2:1, 1:1:1 또는 0.1:0.1:1의 huFcεRI:huFcγRIIB:이중특이적)는 RBL 세포에 대한 5A6/22E7 이중특이적 결합의 불완전한 차단 및 히스타민 방출의 불완전한 억제를 야기하였다. 따라서, 비만 세포에서 히스타민 방출의 억제는 세포 표면 FcεRIα 및 FcγRIIB의 가교결합을 필요로 한다.
포화 미만의 농도에서 5A6/22E7 이중특이적 항체에 의한 히스타민 방출의 억제는 목적하는 억제 달성을 위해 수용체의 완전한 점유를 필요로 하지 않음을 시사한다.
5.4 포화 미만 농도에서 이중특이적 항체의 억제
다음 방법에 의해 RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포의 히스타민 방출 및 결합의 5A6/22E7 이중특이적 항체 억제를 결합 포화 미만의 농도에서 측정하고, 그 결과를 도 42-46에 제시하였다.
RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 또는 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포를 5 ㎍/ml의 NP-특이적 인간 IgE와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅한 후, 신선한 배지로 3회 세척하여 비결합된 NP-특이적 인간 IgE를 제거하였다. 항원을 사용한 활성화 전에, 세포를 상이한 농도의 5A6/22E7 이중특이적 항체와 함께 37℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 유동 세포 측정 또는 히스타민 발현에 의한 분석을 위해 나누었다.
이중특이적 항체 결합의 정도는 상기한 바와 같이 유동 세포 측정에 의해 평가하였다. 스트렙타비딘-PE로 검출된 비오티닐화 이중특이적 항체의 대등한 농도를 사용하여 유동 세포 측정을 수행하였다.
상기 예비인큐베이팅된 세포를 0.1 ㎍/ml 또는 1 ㎍/ml NP-컨쥬게이팅된 오발부민과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅함으로써 활성화시켰다. 활성화-관련 탈과립화는 상기한 바와 같이 세포 배양 배지 내로 방출된 히스타민 수준을 정량화함으로써 측정하였다.
RBL huFcεRI + huFcγRIIB1 세포에 대한 히스타민 방출 데이타 및 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합을 각각 도 42 및 43에 제시하고, RBL huFcεRI + huFcγRIIB2 세포에 대한 히스타민 방출 및 5A6/22E7 이중특이적 항체 결합을 각각 도 44 및 45에 제시한다. 백그라운드 수준까지의 히스타민 방출의 억제는 RBL huFcεRI + huFcγRIIB1 세포 및 RBL huFcεRI + huFcγRIIB2 세포 모두에서 0.0025 ㎍/mL 초과의 이중특이적 항체 농도에서 입증되었다.
RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포에 대한 이중특이적 항체 결합의 유동 세포 측정 연구는 결합 포화가 약 2.5 ㎍/ml의 이중특이적 항체에서 도달함을 나타내었다. 도 46은 4개의 RBL-유래 세포주, 즉 RBL huFcεRI 세포, RBL huFcγRIIB 세포, RBL huFcεRI + huFcγRIIB1 세포, 및 RBL huFcεRI + huFcγRIIB2 세포에 걸쳐 O.1 ㎍/ml 내지 2.5 ㎍/ml의 이중특이적 항체의 유동 세포 측정에 의한 적정을 제시한다. 진한 피크는 비오티닐화 이중특이적 항체와 결합한 세포에 대응한다. RBL-유래 세포주에 대한 이중특이적 항체 결합의 적정은 RBL huFcεRI + huFcγRIIB1 세포 및 RBL huFcεRI + huFcγRIIB2 세포에 대한 이중특이적 항체의 결합이 이중특이적 항체의 보다 낮은 농도에서 감소하고, 0.0025 ㎍/ml 미만에서 검출가능하지 않음을 나타낸다. 도 42 및 44에 도시된 바와 같이, RBL 히스타민 방출의 이중특이적 항체 억제는 2개의 상이한 농도의 NP-항원 자극을 사용하여 이중특이적 항체의 결합 포화 미만의 농도에서 유지되었다.
5.5 FcεRIα 표면 발현 수준에 대한 이중특이적 효과
비만 세포 및 호염기구 상의 FcεRI 발현 수준의 하향조절은 항원-유도 활성화에 대한 비만 세포 및 호염기구 감수성을 감소시키는 수단이고, 천식 또는 알레르기에서 치료제가 그에 의해 유익한 효과를 보일 수 있는 한 메카니즘이다.
FcεRI의 표면 발현 수준을 조절하는 이중특이적 항체의 능력은 다음 절차를 이용하여 이중특이적 항체의 존재 및 부재 하에 IgE-유도 FcεRI 상향조절 및 하향조절 실험을 수행하여 평가하였다.
RBL huFceRI+huFcγRIIB1 및 RBL huFceRI+huFcγRIIB2 세포를 2 ㎍/ml 이중특이적 항체의 존재 또는 부재 하에 1 ㎍/ml U266 IgE (ATCC TIB196)와 함께 1, 2, 3 또는 7일 동안 인큐베이팅하였다. 도 47 및 48은 7일 동안 검출을 위해 인간 IgG1 및 IgE를 사용한 ELISA로 검출할 때 5A6/22E7 이중특이적 항체 및 IgE 농도가 변하지 않은 상태로 유지되었음을 보여주고, 이것은 시약이 세포 배양 배지로부터 고갈되지 않았음을 나타낸다. 세포 표면 인간 FcεRI의 총 수준은 모든 FcεRI 수용체를 빙상에서 U266 IgE로 포화시킨 후에 인간 IgE (칼태그 래보래토리즈)에 대한 항체를 사용한 유동 세포 측정에 의해 결정하였다.
FcεRI 상향조절에 대한 유동 세포 측정 데이타를 도 49-54에 도시하였다. 이중특이적 항체는 도 49 및 50에 도시한 바와 같이 RBL huFcεRI 세포의 2개의 샘플에서 및 도 51 및 52에 도시한 바와 같이 RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포의 2개의 샘플에서 FcεRI 표면 발현 수준의 IgE-유도 상향조절에 대해 효과를 갖지 않는다. 그러나, 이중특이적 항체는 도 53 및 54에 도시한 바와 같이 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포의 2개의 샘플에서 huFcεRI 및 huFcγRIIB2의 동시-가교결합시에 FcεRI 상향조절의 정도를 감소시켰다.
IgE의 제거 후에 FcεRIα 하향조절에 대한 이중특이적 항체의 효과도 측정하고, 그 결과를 도 55-57에 도시하였다. RBL 세포에 대한 FcεRIα는 1 ㎍/ml U266 IgE를 사용하여 7일 동안 상향조절되었다. IgE를 세포 배양 배지로부터 세척하고, FcεRIα 하향조절을 IgE의 제거 후에 1, 2, 3 및 7일에 이중특이적 항체의 존재 또는 부재 하에 관찰하였다. 이중특이적 항체는 도 55 및 56에 도시된 바와 같이 RBL huFcεRI 및 RBL huFcεRI+huFcγRIIB1 세포에서 FcεRIα 하향조절에 대한 효과를 갖지 못하였다. 그러나, FcεRIα 하향조절의 비율은 도 57에 도시된 바와 같이 RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포에서 이중특이적 항체에 의해 증가하였다. RBL huFcεRI+huFcγRIIB2 세포를 사용한 실험을 반복하되, 5A6/22E7 이중특이적 항체를 0, 3 또는 4일에 IgE의 존재하에 첨가하였다 (도 63 참조). 그 결과는 이중특이적 항체가 이들 세포에서 FcεRI의 IgE-유도 발현을 감소시킴을 보여준다. 이들 연구에서 huFcγRIIB1 이소형이 huFcεRI 발현을 하향조절하지 않음이 또한 밝혀졌다.
이들 연구는 이중특이적 항체가 FcεRI를 FcγRIIB의 B2 이소형과 동시-가교결합시킬 때 비만 세포 및 호염기구 상의 FcεRI의 표면 발현 수준을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. huFcεRIα, FcγRIIB1, FcγRIIB2, huRPL19 (대조군) 및 래트 FcεRIα, 비만 세포: RBL huFcεRI (huFcERIa로 명명), RBL huFcεRI+FcγRIIB1 세포 (huFcGRIIb1로 명명) 및 RBLhuFcε+FcγRIIB2 세포 (huFcGRIIb2로 명명)의 mRNA 발현; 및 3명의 상이한 공여자로부터의 인간 호염기구에 대한 RT-PCR 데이타.
FcγRIIB1 및 FcγRIIB2 이소형의 실시간 RT-PCR 확인을 3명의 상이한 인간 공여자로부터의 정제된 말초혈 호염기구로부터 제조한 mRNA에 대해 수행하였다. 인간 혈액 호염기구는 자기 비드 정제 (MACs 인간 호염기구 단리 키트, 밀테니이)를 이용하여 100 ml의 혈액으로부터 단리하였다. 106 호염기구로부터의 mRNA는 RNeasy™ 미니 키트 (퀴아겐)를 사용하여 제조하였다. 실시간 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머/프로브 세트를 표 2에 열거한다.
Figure 112007022701531-pct00001
RNA는 제조사의 추천 프로토콜에 따라 TaqMan(등록상표) 원-스텝(One-Step) RT-PCR 마스터 믹스(Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))를 사용하는 ABI PRISM(등록상표) 7700 서열 검출 시스템 상에서 분석하였다. FcγRIIB의 B1 및 B2 이소형이 모두 도 58-61에 나타낸 바와 같이 인간 호염기구에서 발현된다. 세포에서 FcγRIIB2에 동시 가교결합될 때 FcεRI 표면 발현 수준을 하향조절하는 이중특이적 항체의 증명된 능력으로 인해 본 발명의 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체를 사용하는 방법은 FcεRI의 억제 및(또는) 하향조절이 질환으로부터 완화를 제공하는 질환에 걸린 환자의 치료에 특히 유용하다.
5.6 이중특이적 항체는 RBL 세포주에서 시토킨 방출을 억제한다
시토킨 MCP-I (단핵구 화학주성 단백질-1), IL-4 (인터루킨-4), 및 TNF-α (종양 괴사 인자-α)의 방출은 다음 분석에서 증명되는 바와 같이 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체 5A6/22E7의 존재 하에 억제되었다. RBL 세포를 huFcγRIIB2 또는 huFcγRIIB1 및 huFcεRI을 코딩하는 cDNA로 형질감염시키고 상기 실시예 5에 설명된 절차에 따라 배양하였다. 세포를 히스타민 방출 분석에 대해 상기 실시예 5에 설명된 바와 같이 니트로페놀 (NP)-컨쥬게이팅된 오발부민 (NP(11)-OVA) 및 IgE (항-NP 인간 IgE)에 노출시켜 시토킨을 방출하도록 자극하였다. 5A6/22E7 이중특이적 항체는 시험 샘플에 5 ㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 각각의 관심있는 시토킨의 검출 및 정량은 관심있는 시토킨에 대해 다음과 같이 수행하였다. MCP-1 및 IL-4는 비드라이트 래트 멀티-시토킨 비드마스터(Beadlyte Rat Multi-cytokine Beadmaster) 키트 (카탈로그 48-200, 업스테이트 (Upstate, 미국 버지니아주 샬롯데빌))를 사용하여 검출하였다. 래트 TNF 알파는 항-래트 TNF 알파 ELISA 키트를 제조사의 지시에 따라 사용하여 검출하였다. 분석은 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 도 64는 huFcγRIIB2 및 huFcεRI로 형질감염된 RBL 세포에서 시토킨 방출에 대한 결과를 도시하지만, 결과는 huFcγRIIB1 및 huFcεRI로 형질감염된 RBL 세포에 대한 것과 동일하였다. 래트 비만 세포 시토킨 방출은 5A6/22E7 이중특이적 항체 (5 ㎍/ml, 연한 막대)의 존재 하에 억제된 반면, 시토킨 방출은 억제되지 않고 세포 배양액에서 5시간에 걸쳐 증가하였다 (진한 막대).
5.7 이중특이적 항체는 RBL 세포주에서 아라키돈산 대사체의 합성 및 방출을 억제한다
알레르겐의 존재는 비만 세포로부터 소위 "예비-형성된 (pre-formed)" 염증 매개체, 예를 들어 히스타민의 방출, 아라키돈산의 생산 및 그의 소위 "에이코사노이드" 매개체, 예를 들어 프로스타글란딘으로의 전환, 및 시토킨 및 케모킨의 생산 및 방출을 포함하는 다수의 면역 반응을 개시시킨다. 예비-형성된 매개체는 노출 즉시 방출되는 반면, 에이코사노이드 매개체는 대략 30분 내지 2시간 지연되고, 시토킨 및 케모킨은 대략 5 내지 24시간 지연된다. 아라키돈산 캐스케이드로 불리는 신체 방어 기전 중 하나는 에이코사노이드로서 총체적으로 알려져 있는 3가지의 새로 형성된 염증 매개체, 즉 프로스타글란딘, 트롬복산 및 류코트리엔을 생산하는 것이다. 알레르겐에 대한 노출의 상기 하류 효과를 억제하는 5A6/22E7 이중특이적 항체의 능력을 시험하기 위해 아라키돈산의 대사체의 방출을 모니터링하였다. RBL 세포를 huFcγRIIB1 또는 huFcγRIIB2 및 huFcεRI를 코딩하는 cDNA로 형질감염시키고 상기 실시예 5에 설명한 바와 같이 배양하였다. 히스타민 방출 분석에 대해 실시예 5에 설명된 바와 같이 IgE (항-NP 인간 IgE)와 조합하여 항원으로서 니트로페놀 (NP)-컨쥬게이팅된 오발부민 (NP(11)-OVA)에 노출시켜 아라키돈산 캐스케이드를 자극하였다. 대사체 류코트리엔 C4 (LTC4)의 정량은 EIA 키트 (카탈로그 #520211, 케이만 케미칼 컴퍼니 (Cayman Chemical Company, 미국 미시간주 앤 아버)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 대사체 프로스타글란딘 D2 (PGD2)의 정량은 MOX EIA 키트 (카탈로그 #212011, 케이만 케미칼 컴퍼니)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 도 65의 결과는 huFcγRIIB1 및 FcεRI를 발현하는 RBL 세포에서, LTC4 및 PGD2의 생산에 의해 증명되는 바와 같이 아라키돈산 대사는 IgE + 항원의 존재 하에 시간에 따라 증가하였지만, 비관련 항원 (TNP(11)-OVA)의 존재 하에 증가하지 않았음을 보여준다. 5 ㎍/ml의 5A6/22E7 이중특이적 항체의 존재 하에 아라키돈산 대사가 억제되었다. huFcγRIIB2 및 FcεRI을 발현하는 RBL 세포를 사용하여 동일한 결과를 얻었다 (데이타 비제시). 이들 결과는 중요한 면역 경로가 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체에 의해 억제됨을 증명한다.
5.8 이중특이적 항체는 IgE-유도된 비만 세포 생존을 억제한다
인간 골수 유래 비만 세포 (huBMMC) 생존은 뮤린 IgE에 의해 유도된다. 5A6/22E7 이중특이적 항체가 그러한 생존을 억제하는지 시험하기 위해, 다음 분석을 수행하였다. 인간 조혈 전구 줄기 세포 (CD34+)는 알셀즈 (Allcells) (카탈로그 # ABM012, 알셀즈, 엘엘씨. (Allcells, LLC, 미국 캘리포니아주 버클리))로부터 입수하였다. 3명의 공여자 각각으로부터의 세포를 IL-3 (30 ng/ml), IL-6 (200 ng/ml) 및 줄기 세포 인자 (SCF, 100 ng/ml)을 함유하는 StemPro-34(등록상표) 혈청 무첨가 배지 (깁코 세포 배양 시스템스 (Gibco Cell Culture Systems), 인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드))에서 2주 배양하였다. 비만 세포 생존은 다음 시험 조건 하에 아넥신/7-AAD (7-아미노-악티노마이신 D) 염색 (비디/파밍겐 (BD/Pharmingen) 유동 세포 측정 키트, 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 (Becton Dickenson & Company, 미국 뉴저지주 플랭클린 레이크))에 의해 평가하였다: (1) StemPro(등록상표) 배지 단독, (2) StemPro(등록상표) 배지 + 30 ng/ml IL-3, 200 ng/ml IL-6, 및 100 ng/ml SCF, (3) StemPro(등록상표) 배지 + 5 ㎍/ml SPE-7 (마우스 IgE 항-DNP 모노클로날 항체 (SPE-7, 시그마), (4) StemPro(등록상표) 배지 + 5 ㎍/ml 비등, 변성 SPE-7, 및 (5) StemPro(등록상표) 배지 + 5 ㎍/ml SPE-7 + 5 ㎍/ml 5A6/22E7 이중특이적 항체. 세포 생존은 초기 2주 배양기 후 10일 동안 모니터링하였다. 세포를 두 페이스 동안 37℃, 5% CO2에서 유지하였다. 시험 배양 개시 후 4일과 7일 사이에 세포 생존을 결정하였다. 3개의 공여 세포 샘플에 대한 세포 생존의 평균 억제%는 65%±9였다. 이들 결과는 항-FcγRIIB-항-FcεRI 이중특이적 항체를 사용한 FcγRIIB 수용체와의 가교결합에 의한 FcεRI 수용체 활성의 억제가 인간 골수 유래 비만 세포의 뮤린 IgE-유도된 생존을 억제하는 것을 나타낸다.
상기 설명, 실시예 및 데이타는 본 발명의 조성물의 제조 및 용도에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 많은 실시태양을 구현할 수 있기 때문에, 본 발명은 첨부하는 청구의 범위에 의해 규정된다.
Sequence Listing <110> GENENTECH, INC. <120> ANTI-FC-GAMMA RIIB RECEPTOR ANTIBODY AND USES THEREFOR <130> P1935R1-PCT <140> PCT/US2005/031281 <141> 2005-09-01 <150> US 60/606,851 <151> 2004-09-02 <160> 40 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 1 Asp Ala Trp Met Asp 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 Glu Ile Arg Ser Lys Pro Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 3 Phe Asp Tyr <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 4 Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 5 Ala Ala Ser Ala Leu Asp Ser 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 6 Leu Gln Tyr Val 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17 Ala Gly Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys 20 25 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 18 Thr Gly Cys Thr Gly Thr Ala Gly Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr 1 5 10 15 Gly Ala Thr Cys Thr 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 19 Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Cys 20 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 20 Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Cys Cys Ala 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 21 Gly Cys Gly Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Ala 1 5 10 15 Ala Cys Ala Cys Ala 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 22 Gly Gly 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Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala 575 580 585 Gly Cys Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr 590 595 600 Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly 605 610 615 Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Ala Gly Ala 620 625 630 Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Thr Gly 635 640 645 Cys Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Gly 650 655 660 Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala 665 670 675 Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly 680 685 690 Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Thr Thr 695 700 705 Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 710 715 720 Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Ala Thr Gly 725 730 735 Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Gly Gly Gly Ala Ala Thr Thr Thr 740 745 750 Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Thr Ala Cys Ala Gly Thr 755 760 765 Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Thr 770 775 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980 985 990 Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala 995 1000 1005 Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala 1010 1015 1020 Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly Cys 1025 1030 1035 Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr 1040 1045 1050 Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly 1055 1060 1065 Thr Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Ala Ala Gly 1070 1075 1080 Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys 1085 1090 1095 Thr Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala 1100 1105 1110 Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala 1115 1120 1125 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr 1130 1135 1140 Thr <210> 37 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 37 Ala Cys Gly Cys Gly Thr Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Thr 20 25 30 Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly 35 40 45 Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr 50 55 60 Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr 65 70 75 Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr 80 85 90 Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly 95 100 105 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly 110 115 120 Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly 125 130 135 Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr 140 145 150 Gly Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala 155 160 165 Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Ala Ala Thr Ala 170 175 180 Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Thr Ala Cys Thr 185 190 195 Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala 200 205 210 Ala Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 215 220 225 Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr 230 235 240 Cys Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr 245 250 255 Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala 260 265 270 Gly Cys Thr Thr Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly 275 280 285 Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Thr Thr Gly 305 310 315 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly 320 325 330 Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly 335 340 345 Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala 350 355 360 Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys 365 370 <210> 38 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 38 Ala Cys Gly Cys Gly Thr Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr 20 25 30 Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Ala Gly 35 40 45 Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Thr 50 55 60 Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr 65 70 75 Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr 80 85 90 Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Cys Thr 95 100 105 Ala Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly Gly 110 115 120 Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly 125 130 135 Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr 140 145 150 Gly Gly Gly Thr Cys Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala 155 160 165 Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr 170 175 180 Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly 185 190 195 Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Cys 200 205 210 Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala 215 220 225 Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala 230 235 240 Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys 245 250 255 Ala Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala 260 265 270 Gly Gly Thr Cys Thr Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Cys Gly Gly 275 280 285 Cys Cys Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly 290 295 300 Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys 305 310 315 Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Thr 320 325 330 Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala 335 340 345 Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr 350 355 360 Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Gly Ala 365 370 375 Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys 380 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 39 Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 40 Phe Ser His Leu Asp Pro Thr 5

Claims (86)

  1. 서열 1의 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 2의 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 서열 3의 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 4의 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 5의 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 6의 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하고, FcγRIIB2 수용체에 선택적으로 결합하며 FcγRIIA에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, FcγRIIB2 수용체에 선택적으로 결합하며 FcγRIIA에는 결합하지 않는 단리된 항체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 항체 Fc 영역의 FcγRIIB에 대한 결합을 길항하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항체의 결합 특징을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마 세포주로부터 생산된, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. a) 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, FcγRIIB에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 아암(arm); 및
    b) FcεRIα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제2 아암
    을 포함하는 단리된 이중특이적 항체.
  10. 제9항에 있어서, 세포 상에서 FcγRIIA를 하향조절하지 않으면서 FcεRIα 발현을 하향조절하는 단리된 이중특이적 항체.
  11. 제9항에 있어서, 제2 아암이 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 단리된 이중특이적 항체.
  12. 제10항에 있어서, 세포가 B 세포 또는 비만 세포(mast cell)인 단리된 이중 특이적 항체.
  13. 제12항에 있어서, 세포가 인간 세포인 단리된 이중특이적 항체.
  14. 제9항에 있어서, FcεRIα가 IgE에 결합할 때 제2 아암이 FcεRIα에 결합하는 것인 단리된 이중특이적 항체.
  15. 제9항에 있어서, 이중특이적 항체의 제1 아암이 ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마에 의해 분비된 항-FcγRIIB 항체의 FcγRIIB에 대한 결합을 차단하는 것인 단리된 이중특이적 항체.
  16. a) ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마 세포주로부터 생산된, FcγRIIB에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, FcγRIIB에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 아암; 및
    b) FcεRIα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제2 아암
    을 포함하는 단리된 이중특이적 항체.
  17. 제16항에 있어서, 제2 아암이 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 단리된 이중특이적 항체.
  18. 제16항에 있어서, 제1 아암이 ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항체의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 단리된 이중특이적 항체.
  19. 제16항에 있어서, 제1 아암이 ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마 세포주로부터 생산된 항체의 모든 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 것인 단리된 이중특이적 항체.
  20. 제16항에 있어서, 제1 또는 제2 아암이 Fab, Fab', Fab2, Fab'2, Fd, Fd', scFv, scFv2 및 dAb로 이루어진 군 중에서 선택되는 항체 단편인 단리된 이중특이적 항체.
  21. 제16항에 있어서, 제1 아암이 제2 아암에 공유결합된 것인 단리된 이중특이적 항체.
  22. 제16항에 있어서, 제1 및 제2 아암이 5개 이상의 아미노산을 포함하는 링커를 통해 공유결합된 것인 단리된 이중특이적 항체.
  23. 제16항에 있어서, 중쇄간 디술피드 연결 능력이 없는 변이체 중쇄 힌지 영역을 포함하는 단리된 이중특이적 항체.
  24. 제16항에 있어서, 제1 아암이 인간 FcγRIIB에 결합하고 인간 FcγRIIA에 결합하지 않는 것인 단리된 이중특이적 항체.
  25. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제약 담체를 포함하는, 알레르기 장애를 치료하기 위한 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 항-IgE 항체를 추가로 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 항-IgE 항체가 오말리주맙(omalizumab)인 조성물.
  28. 제25항의 조성물을 포함하고, 추가로 용기 및 라벨을 포함하는 키트.
  29. 제26항의 조성물을 포함하며, 항-IgE 항체가 오말리주맙인 키트.
  30. 제26항의 조성물을 포함하고, 추가로 용기 및 라벨을 포함하는 키트.
  31. 제29항에 있어서, 이중특이적 항체 대 항-IgE 항체의 비율이 0.01:1 내지 100:1인 키트.
  32. 제31항에 있어서, 비율이 0.05:1인 키트.
  33. 제31항에 있어서, 비율이 0.1:1인 키트.
  34. 제31항에 있어서, 비율이 0.5:1인 키트.
  35. 제31항에 있어서, 비율이 1:1인 키트.
  36. 제29항에 있어서, 이중특이적 항체 대 항-IgE 항체의 비율이 1:0.5인 키트.
  37. 제29항에 있어서, 이중특이적 항체 대 항-IgE 항체의 비율이 1:0.1인 키트.
  38. 제29항에 있어서, 이중특이적 항체 대 항-IgE 항체의 비율이 1:0.05인 키트.
  39. 제16항에 있어서, 제1 아암이 키메릭 또는 인간화 항체인 단리된 이중특이적 항체.
  40. FcγRIIB 및 FcεRIα에 특이적으로 결합하며 (a) FcγRIIA 발현을 하향조절하지 않고 (b) FcγRIIB1을 가교결합시키지 않는 이중특이적 항체 유효량과 세포를 접촉시킴으로써 FcεRIα와 FcγRIIB2를 가교결합시키는 것을 포함하는, 세포 상에서 FcεRIα 발현을 하향조절하기 위한 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법.
  41. 제40항에 있어서, FcεRIα 발현이 IgE로부터의 사전 자극에 의해 상향조절되는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  42. 제40항에 있어서, 세포가 B 세포 또는 비만 세포인 시험관내 또는 생체외 방법.
  43. 제42항에 있어서, 세포가 인간 세포인 시험관내 또는 생체외 방법.
  44. 제41항에 있어서, IgE에 의한 자극이 비만 세포 생존을 유도하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  45. 제40항에 있어서, 이중특이적 항체의 FcγRIIB 결합 성분이 항-FcγRIIB 항체 5A6의 FcγRIIB에 대한 결합을 차단하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  46. 제40항에 있어서, 이중특이적 항체의 FcγRIIB 결합 성분이 ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마에 의해 분비된 항-FcγRIIB 항체의 FcγRIIB에 대한 결합을 차단하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  47. 제40항, 제41항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, FcεRIα가 IgE에 결합할 때, 이중특이적 항체의 FcεRIα 결합 성분이 FcεRIα에 결합하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  48. 제47항에 있어서, 이중특이적 항체가 항-FcγRIIB 성분에서 T366W 돌연변이, 및 FcεRIα 결합 성분에서 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  49. 제48항에 있어서, 이중특이적 항체가 힌지 영역에서 C226S 및 C229S 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 제40항, 제41항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 항-FcγRIIB 결합 성분이 (i) 서열 1, 2 및 3의 CDR 영역을 포함하는 중쇄 서열, (ii) 서열 4, 5 및 6의 CDR 영역을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  55. 제54항에 있어서, 이중특이적 항체의 중쇄가 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고, 이중특이적 항체의 경쇄가 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  56. 삭제
  57. (i) FcγRIIB 및 FcεRIα 둘 다에 특이적으로 결합하며, FcγRIIB2를 FcεRIα와 가교결합시키고, FcγRIIA 발현을 하향조절하지 않으며, FcγRIIB1을 가교결합시키지 않고; (ii) FcεRIα가 IgE에 결합할 때 FcεRIα에 결합하고; (iii) 이중특이적 항체의 하나의 결합 성분에서 위치 366에 knob 돌연변이 및 다른 결합 성분에서 위치 366, 368 및 407에 상응하는 hole 돌연변이를 갖고; (iv) 힌지 영역에서 C226S 및 C229S 돌연변이를 갖는 치료 유효량의 이중특이적 항체를 포함하는, 히스타민 방출을 억제하기 위한 제약 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 이중특이적 항체가 항-FcγRIIB 항체 5A6의 FcγRIIB에 대한 결합을 차단하는 것인 제약 조성물.
  59. 제57항에 있어서, 이중특이적 항체가 ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마에 의해 분비된 항-FcγRIIB 항체의 FcγRIIB에 대한 결합을 차단하는 것인 제약 조성물.
  60. (i) FcγRIIB 및 FcεRIα 둘 다에 특이적으로 결합하며, FcγRIIB2를 FcεRIα와 가교결합시키고, FcγRIIA 발현을 하향조절하지 않으며, FcγRIIB1을 가교결합시키지 않고; (ii) FcεRIα가 IgE에 결합할 때 FcεRIα에 결합하고; (iii) 이중특이적 항체의 하나의 결합 성분에서 위치 366에 knob 돌연변이 및 다른 결합 성분에서 위치 366, 368 및 407에 상응하는 hole 돌연변이를 갖고; (iv) 힌지 영역에서 C226S 및 C229S 돌연변이를 갖는 치료 유효량의 이중특이적 항체를 포함하는, 포유동물에서 알레르기 장애를 치료하기 위한 제약 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 이중특이적 항체가 항-FcγRIIB 항체 5A6의 FcγRIIB에 대한 결합을 차단하는 것인 제약 조성물.
  62. 제60항에 있어서, 이중특이적 항체가 ATCC 기탁 번호 PTA-4614의 하이브리도마에 의해 분비된 항-FcγRIIB 항체의 FcγRIIB에 대한 결합을 차단하는 것인 제약 조성물.
  63. 제60항에 있어서, 항-IgE 항체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 이중특이적 항체 대 항-IgE 항체의 비율이 0.01:1 내지 100:1인 제약 조성물.
  65. 제60항에 있어서, 알레르기 장애가 아토피성 알레르기인 제약 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 아토피성 알레르기가 건초열, 천식 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 아토피성 알레르기가 건초열인 제약 조성물.
  68. 제66항에 있어서, 아토피성 알레르기가 천식인 제약 조성물.
  69. 제66항에 있어서, 아토피성 알레르기가 아토피성 피부염인 제약 조성물.
  70. 제60항에 있어서, 알레르기 장애가 전신성 과민증인 제약 조성물.
  71. 제60항에 있어서, 알레르기 장애가 두드러기인 제약 조성물.
  72. FcγRIIB 및 FcεRIα에 특이적으로 결합하며, FcγRIIB2를 FcεRIα와 가교결합시키고, FcγRIIA 발현을 하향조절하지 않으며, FcγRIIB1을 가교결합시키지 않는 이중특이적 항체 유효량을 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 FcγRIIB 발현은 IgE로부터의 자극에 의해 상향조절되는, 세포로부터의 히스타민 방출을 억제하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법.
  73. 제72항에 있어서, 히스타민 방출이 배경 수준에 비해 70％ 이상 감소하는 것인 시험관내 또는 생체외 방법.
  74. 제73항에 있어서, 감소된 수준이 75％ 이상인 시험관내 또는 생체외 방법.
  75. 제74항에 있어서, 감소된 수준이 80％ 이상인 시험관내 또는 생체외 방법.
  76. 제75항에 있어서, 감소된 수준이 85％ 이상인 시험관내 또는 생체외 방법.
  77. 제76항에 있어서, 감소된 수준이 90％ 이상인 시험관내 또는 생체외 방법.
  78. 제77항에 있어서, 감소된 수준이 95％ 이상인 시험관내 또는 생체외 방법.
  79. 제78항에 있어서, 감소된 수준이 100％인 시험관내 또는 생체외 방법.
  80. 삭제
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