CN113195523A - IL-12异源二聚体Fc融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新颖的IL‑12Fc融合蛋白、其制备和使用方法。所述IL‑12Fc融合蛋白可用于治疗癌症并且可以与检查点阻断组合使用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月3日提交的美国临时申请第62/740,813号、于2019年2月25日提交的美国临时申请第62/810,038号和于2019年5月15日提交的美国临时申请第62/848,512的权益，出于所有目的将所有这些美国临时申请特此通过引用以其全文并入本文。
背景技术
为了使T细胞发挥有效的抗肿瘤应答，必须发生三件事。T细胞必须首先在肿瘤环境中与由MHC呈递的抗原性肿瘤肽结合。第二，共刺激分子必须与T细胞结合。并且第三，T细胞必须由如IL-12和IL-2等细胞因子诱导以产生共刺激性细胞因子，如允许分化和扩增的IFNγ。在不存在细胞因子诱导的情况下，识别仅肿瘤肽会导致T细胞变得无反应性，由此导致具有耐受性。因此，在癌症免疫治疗中非常有前景的方法是基于细胞因子的治疗。实际上，IL-2已被批准用于转移性肾细胞癌和恶性黑色素瘤患者。然而，目前尚无批准的重组IL-12在人类体内的使用。
重组IL-12是有前景的基于细胞因子的治疗，因为其在活化免疫系统方面具有广泛的作用。然而，由于毒性，IL-12迄今为止在人类临床试验中面临障碍。与其它细胞因子一样，IL-12的半衰期短，这需要进行频繁的团注。
另外，IL-12由共价连接以形成具有生物活性的IL-12异源二聚体的α链(p35亚基；IL-12p35)和β链(p40亚基；IL-12p40)构成。通过与T细胞上由IL-12受体β1(IL-12Rβ1)和IL-12受体β2(IL-12Rβ2)构成的二聚体IL-12受体复合物结合并诱导IFNγ分泌，IL-12发挥其细胞信号传导功能。然而，IL-12p40亚基也可以以同源二聚体形式存在，据报道，所述同源二聚体通过竞争与IL-12受体的结合来拮抗IL-12活性。
本发明通过提供新颖的IL-12-Fc融合蛋白以及效力降低的新颖的IL-12变体来解决IL-12的短半衰期。
发明内容
在一方面中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括变体IL-12p40亚基结构域和第一Fc结构域，其中所述IL-12p40亚基结构域与所述第一Fc结构域的N端共价连接；以及b)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括IL-12p35亚基结构域和第二Fc结构域，其中所述IL-12p35亚基结构域与所述Fc结构域的N端共价连接；其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰。在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基与选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列具有至少90％的同一性，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ IDNO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ IDNO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ IDNO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K、L368D/K370S和S364K/E357L、L368D/K370S和S364K/E357Q、T411E/K360E/Q362E和D401K、L368E/K370S和S364K、K370S和S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V和T366W、T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基结构域使用第一结构域接头与所述第一Fc结构域连接和/或所述IL-12p35亚基结构域使用第二结构域接头与所述第二Fc结构域连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：
a)具有选自由以下组成的组的多肽序列的所述第一融合蛋白：i)SEQ ID NO:47(XENP27201链1)、ii)SEQ ID NO:85(XenD24752)、iii)SEQ ID NO:86(XenD24753)、iv)SEQID NO:87(XenD24754)、v)SEQ ID NO:88(XenD24755)、vi)SEQ ID NO:89(XenD24756)、vii)SEQ ID NO:90(XenD24757)、viii)SEQ ID NO:91(XenD24758)、ix)SEQ ID NO:92(XenD24759)、x)SEQ ID NO:93(XenD24760)、xi)SEQ ID NO:94(XenD24761)、xii)SEQ IDNO:95(XenD24762)、xiii)SEQ ID NO:96(XenD24763)、xiv)SEQ ID NO:97(XenD24764)、xv)SEQ ID NO:98(XenD24765)、xvi)SEQ ID NO:99(XenD24766)、xvii)SEQ ID NO:100(XenD24767)、xviii)SEQ ID NO:101(XenD24768)、xix)SEQ ID NO:102(XenD24769)、xx)SEQ ID NO:103(XenD24770)、xxi)SEQ ID NO:104(XenD24771)、xxii)SEQ ID NO:105(XenD24772)、xxiii)SEQ ID NO:106(XenD24773)、xxiv)SEQ ID NO:107(XenD24774)、xxv)SEQ ID NO:108(XenD24775)、xxvi)SEQ ID NO:109(XenD24776)、xxvii)SEQ ID NO:110(XenD24777)、xxviii)SEQ ID NO:111(XenD24778)、xxix)SEQ ID NO:112(XenD24792)、xxx)SEQ ID NO:215(XenD25922)、xxxi)SEQ ID NO:216(XenD25923)、xxxii)SEQ ID NO:217(XenD25924)、xxxiii)SEQ ID NO:218(XenD25925)、xxxiv)SEQ ID NO:219(XenD25926)、xxxv)SEQ ID NO:220(XenD25927)、xxxvi)SEQ ID NO:221(XenD25928)、xxxvii)SEQ ID NO:222(XenD25929)、xxxviii)SEQ ID NO:223(XenD25930)、xxxix)SEQ IDNO:224(XenD25931)、xl)SEQ ID NO:XXX(XenD26411)、xli)SEQ ID NO:XXX(XenD26412)、xlii)SEQ ID NO:XXX(XenD26413)、xliii)SEQ ID NO:XXX(XenD26414)、xliv)SEQ ID NO:XXX(XenD26415)、xlv)SEQ ID NO:XXX(XenD26416)、xlvi)SEQ ID NO:XXX(XenD26417)、xlvii)SEQ ID NO:XXX(XenD26418)、xlviii)SEQ ID NO:XXX(XenD27070)、xlix)SEQ IDNO:XXX(XenD27071)、l)SEQ ID NO:XXX(XenD27072)、li)SEQ ID NO:XXX(XenD27073)、lii)SEQ ID NO:XXX(XenD27074)、liii)SEQ ID NO:XXX(XenD27075)、liv)SEQ ID NO:XXX(XenD27076)、lv)SEQ ID NO:XXX(XenD27077)、lvi)SEQ ID NO:XXX(XenD27078)、lvii)SEQID NO:XXX(XenD28173)、lviii)SEQ ID NO:XXX(XenD24876)、lix)SEQ ID NO:XXX(XenD27162)、lx)SEQ ID NO:XXX(XenD27163)、lxi)SEQ ID NO:XXX(XenD27164)、lxii)SEQID NO:XXX(XenD27165)lxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP31582链1)、lxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP31583链1)、lxv)SEQ ID NO:XXX(XENP31584链1)、lxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32187链1)、lxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32188链1)、lxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP32189链1)、lxix)SEQ ID NO:XXX(XENP32190链1)、lxx)SEQ ID NO:XXX(XENP32191链1)、lxxi)SEQ ID NO:XXX(XENP32991链1)、lxxii)SEQ ID NO:XXX(XENP32992链1)、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP32993链1)、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP32994链1)、lxxv)SEQ ID NO:XXX(XENP32995链1)、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32996链1)、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32997链1)、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32998链1)、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32999链1)、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33000链1)、lxxix)SEQ ID NO:XXX(XENP33001链1)、lxxx)SEQ ID NO:XXX(XENP33002链1)、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(XENP33003链1)、lxxxii)SEQ IDNO:XXX(XENP33004链1)、lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP33005链1)、lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP33006链1)、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(XENP33007链1)、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链1)、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链1)、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33009链1)、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(XENP33010链1)和xc)SEQ ID NO:XXX(XENP33011链1)；以及
b)具有选自由以下组成的组的多肽序列的所述第二融合蛋白：i)SEQ ID NO:48(XENP27201链2)、ii)SEQ ID NO:126(XenD24779)、iii)SEQ ID NO:127(XenD24780)、iv)SEQ ID NO:128(XenD24781)、v)SEQ ID NO:129(XenD24782)、vi)SEQ ID NO:130(XenD24783)、vii)SEQ ID NO:131(XenD24784)、viii)SEQ ID NO:132(XenD24785)、ix)SEQID NO:133(XenD24786)、x)SEQ ID NO:134(XenD24787)、xi)SEQ ID NO:135(XenD24788)、xii)SEQ ID NO:136(XenD24789)、xiii)SEQ ID NO:137(XenD24790)、xiv)SEQ ID NO:138(XenD24791)、xv)SEQ ID NO:236(XenD25911)、xvi)SEQ ID NO:237(XenD25912)、xvii)SEQID NO:238(XenD25913)、xviii)SEQ ID NO:239(XenD25914)、xix)SEQ ID NO:240(XenD25915)、xx)SEQ ID NO:241(XenD25916)、xxi)SEQ ID NO:242(XenD25917)、xxii)SEQID NO:243(XenD25918)、xxiii)SEQ ID NO:244(XenD25919)、xxiv)SEQ ID NO:245(XenD25920)、xxv)SEQ ID NO:246(XenD25921)、xxvi)SEQ ID NO:XXX(XenD26427)、xxvii)SEQ ID NO:XXX(XenD26428)、xxviii)SEQ ID NO:XXX(XenD27089)、xxix)SEQ ID NO:XXX(XenD27090)、xxx)SEQ ID NO:XXX(XenD27091)、xxxi)SEQ ID NO:XXX(XenD27092)、xxxii)SEQ ID NO:XXX(XenD27093)、xxxiii)SEQ ID NO:XXX(XenD27094)、xxxix)SEQ ID NO:XXX(XenD24877)、xl)SEQ ID NO:XXX(XenD27166)、xli)SEQ ID NO:XXX(XENP31582链2)、xlii)SEQ ID NO:XXX(XENP31583链2)、xliii)SEQ ID NO:XXX(XENP31584链2)、xliv)SEQ ID NO:XXX(XENP32187链2)、xlv)SEQ ID NO:XXX(XENP32188链2)、xlvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32189链2)、xlvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32190链2)、xlviii)SEQ ID NO:XXX(XENP32191链2)、xlix)SEQ ID NO:XXX(XENP32991链2)、l)SEQ ID NO:XXX(XENP32992链2)、li)SEQ ID NO:XXX(XENP32993链2)、lii)SEQ ID NO:XXX(XENP32994链2)、liii)SEQ IDNO:XXX(XENP32995链2)、liv)SEQ ID NO:XXX(XENP32996链2)、lv)SEQ ID NO:XXX(XENP32997链2)、lvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32998链2)、lvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32999链2)、lviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33000链2)、lix)SEQ ID NO:XXX(XENP33001链2)、lx)SEQID NO:XXX(XENP33002链2)、lxi)SEQ ID NO:XXX(XENP33003链2)、lxii)SEQ ID NO:XXX(XENP33004链2)、lxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP33005链2)、lxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP33006链2)、lxv)SEQ ID NO:XXX(XENP33007链2)、lxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链2)、lxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链2)、lxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33009链2)、lxix)SEQ IDNO:XXX(XENP33010链2)和lxx)SEQ ID NO:XXX(XENP33011链2)。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白选自由以下组成的组：XENP27201、XENP28820、XENP28821、XENP28822、XENP28823、XENP28824、XENP28825、XENP28826、XENP28827、XENP28828、XENP28829、XENP28830、XENP28831、XENP28832、XENP28833、XENP28834、XENP28835、XENP28836、XENP28837、XENP28838、XENP28839、XENP28840、XENP28841、XENP28842、XENP28843、XENP28844、XENP28845、XENP28846、XENP28847、XENP28848、XENP28849、XENP28850、XENP28851、XENP28852、XENP29949、XENP29950、XENP29951、XENP29952、XENP30597、XENP30598、XENP30599、XENP30600、XENP30601、XENP30602、XENP30603、XENP30604、XENP30605、XENP30606、XENP30307、XENP30308、XENP30609、XENP31250、XENP31251、XENP31252、XENP31253、XENP31254、XENP31255、XENP31256、XENP31257、XENP31258、XENP31259、XENP31260、XENP31261、XENP31262、XENP31263、XENP31264、XENP31265、XENP31286、XENP31142、XENP31143、XENP31144、XENP31145、XENP31146、XENP31582、XENP31583、XENP31584、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190、XENP32191、XENP32991、XENP32992、XENP32993、XENP32994、XENP32995、XENP32996、XENP32997、XENP32998、XENP32999、XENP33000、XENP33001、XENP33002、XENP33003、XENP33004、XENP33005、XENP33006、XENP33007、XENP33008、XENP33008、XENP33009、XENP33010和XENP33011。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白选自由以下组成的组：XENP31251、XENP31254、XENP31258、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190和XENP32191。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白进一步包括选自由以下组成的组的对IL-12p40亚基的一种或多种修饰：N103Q、N113Q、N200Q和N281Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的异源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在另一方面中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域共价与所述第一Fc结构域连接的C端；以及b)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二蛋白质结构域和第二Fc结构域，其中所述第二蛋白质结构域与所述Fc结构域的C端共价连接；其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p40亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K、L368D/K370S和S364K/E357L、L368D/K370S和S364K/E357Q、T411E/K360E/Q362E和D401K、L368E/K370S和S364K、K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第一Fc结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第二Fc结构域连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。在一些实施例中，本发明提供了异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)具有SEQ ID NO:49(XENP27202链1)的多肽序列的所述第一融合蛋白，以及b)具有SEQ ID NO:50(XENP27202链2)的多肽序列的所述第二融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP27202。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的异源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第二蛋白质结构域共价连接，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一Fc结构域的N端共价连接；以及b)第二Fc结构域；其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p40亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K、L368D/K370S和S364K/E357L、L368D/K370S和S364K/E357Q、T411E/K360E/Q362E和D401K、L368E/K370S和S364K、K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K158、C252、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)具有SEQ ID NO:51(XENP27203链1)的多肽序列的所述融合蛋白，以及b)具有SEQ ID NO:52(XENP27203链2)的多肽序列的所述第二Fc结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP27203。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP31290。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的异源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第二蛋白质结构域共价连接，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一Fc结构域的N端共价连接；以及b)第二Fc结构域；其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p35亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p40亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R；E233P/L234V/L235A/G236_/S239K；E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G；E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G；E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和/或SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D；Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)具有SEQ ID NO:53(XENP27204链1)的多肽序列的所述融合蛋白，以及b)具有SEQ ID NO:54(XENP27204链2)的多肽序列的所述第二Fc结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP27204。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的异源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第一Fc结构域连接的C端，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一蛋白质结构域共价连接；以及b)第二Fc结构域；其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p40亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K、L368D/K370S和S364K/E357L、L368D/K370S和S364K/E357Q、T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K、K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的异源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第一Fc结构域连接的C端，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一蛋白质结构域共价连接；以及b)第二Fc结构域；其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p35亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p40亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K、L368D/K370S和S364K/E357L、L368D/K370S和S364K/E357Q、T411E/K360E/Q362E和D401K、L368E/K370S和S364K、K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的异源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对异源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，所述异源二聚体复合物包括：a)IL-12p40亚基，和b)IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基使用结构域接头与所述IL-12p35亚基共价连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ IDNO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ IDNO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的异源二聚体复合物。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对异源二聚体复合物进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对异源二聚体复合物进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备异源二聚体复合物的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体复合物的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化异源二聚体复合物的方法，所述方法包括：a)提供包括所述异源二聚体复合物的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述异源二聚体复合物的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种变体IL-12p40亚基，所述变体亚基对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p40亚基，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、C252、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p40亚基，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p40亚基，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p40亚基，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括变体IL-12p40亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种核酸，其对变体IL-12p40亚基进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括对变体IL-12p40亚基进行编码的所述核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备变体IL-12p40亚基的方法，所述方法包括在产生所述变体IL-12p40亚基的条件下培养根据权利要求H8所述的宿主细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种变体IL-12p35亚基，所述变体亚基对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p35亚基，其中选自由以下组成的组的氨基酸取代的所述变体IL-12p35亚基：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有氨基酸取代N71D/N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种核酸，其对变体IL-12p35亚基进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括对变体IL-12p35亚基进行编码的所述核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种变体IL-12p35亚基，所述方法包括在产生所述变体IL-12p35亚基的条件下培养宿主细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，所述异源二聚体蛋白包括：a)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括与第一Fc结构域共价连接的IL-12p40亚基结构域；以及b)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括与第二Fc结构域共价连接的IL-12p35亚基结构域；其中选自由以下组成的组的所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p40亚基结构域与所述第一Fc结构域连接的N端，并且所述IL-12p35亚基结构域与所述第二Fc结构域连接的N端。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p40亚基结构域与所述第一Fc结构域连接的C端，并且所述IL-12p35亚基结构域与所述第二Fc结构域连接的C端。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述Il-12p40亚基结构域使用结构域接头与所述第一Fc结构域连接和/或所述IL-12p35亚基结构域使用结构域接头与所述第二Fc结构域连接。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括IgG1铰链-CH2-CH3。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述第一融合蛋白从N端到C端包括IL-12p40亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3，并且所述第二融合蛋白从N端到C端包括IL-12p35亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述第一融合蛋白从N端到C端包括铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p40亚基结构域，并且所述第二融合蛋白从N端到C端包括铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ IDNO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)(IL-12p35(K158E))；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q),lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；lxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D),lxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和lxvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在另一方面中，本发明包括一种异源二聚体蛋白，所述异源二聚体蛋白包括：a)第一Fc结构域；以及b)融合蛋白，所述融合蛋白包括：i)第二Fc结构域；ii)IL-12p40亚基结构域；以及iii)IL-12p35亚基结构域；其中选自由以下组成的组的所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：IL-12p40亚基结构域-结构域接头-IL-12p35亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：IL-12p35亚基结构域-结构域接头-IL-12p40亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p35亚基结构域-结构域接头-IL-12p40亚基结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p40亚基结构域-结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ IDNO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q),lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；lxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D),lxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和lxvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p40亚基结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-任选的第二结构域接头-Fc结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:XX(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:XX(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:XX(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:XX(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p35亚基结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-任选的第二结构域接头-Fc结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-任选的第二结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-任选的第二结构域接头-IL-12p40亚基结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ IDNO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p40亚基结构域-第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-第二结构域接头-Fc结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p35亚基结构域-第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-第二结构域接头-Fc结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)(IL-12p35(E143Q))；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-第二结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，所述同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-第二结构域接头-IL-12p40亚基结构域。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
在一些实施例中，本发明提供了同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31289。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体是XENP31291。
在一些实施例中，本发明提供了一种同源二聚体Fc融合蛋白组合物，所述组合物包括在治疗受试者的癌症时使用的同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种或多种核酸，其对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
在一些实施例中，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述一种或多种对同源二聚体Fc融合蛋白进行编码的核酸。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种纯化同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
在另一方面中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白或同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中所述检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或皮地利珠单抗(pidilizumab)。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或度伐鲁单抗(durbalumab)。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中所述患者在施用之后表现出淋巴细胞的增加。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中所述患者在施用之后表现出外周CD8+T细胞的增加。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中在检查点抑制剂之前施用IL-12Fc融合蛋白，以增加治疗前的检查点表达。
在一些实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中在检查点抑制剂之前施用IL-12Fc融合蛋白，以增加治疗前的检查点表达。
在另一方面中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白或同源二聚体Fc融合蛋白。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，所述方法进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，其中所述检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗。
在一些其它另外的实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特朱单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗。
在一些另外的实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，其中所述T细胞扩增是T细胞增加至少2倍。
在一些实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，其中在检查点抑制剂之前施用IL-12Fc融合蛋白，以增加治疗前的检查点表达。
在一些实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，其中在检查点抑制剂之前施用IL-12Fc融合蛋白，以增加治疗前的检查点表达。
在一方面中，本发明提供了IL-12p40亚基。在另一方面中，本发明提供了IL-12p35亚基。在另外的方面中，本发明提供了一种异源二聚体复合物，所述异源二聚体复合物包括a)IL-12p40亚基和b)IL-12p35亚基。
附图说明
图1A和1B描绘了IL-12及其受体的序列。
图2A-2E描绘了Fc异源二聚化变体组(包含偏斜变体和pI变体)的有用对。没有对应的“单体2”的变体是可以在任一单体上单独使用的pI变体。
图3描绘了同配变体抗体恒定区和其相应取代的列表。pI_(-)指示较低pI变体，而pI_(+)指示较高pI变体。这些可以任选地且独立地与本发明的其它异源二聚化变体(以及其它变体类型，如本文所概述的)组合。
图4描绘了消融FcγR结合的有用消融变体(有时被称为“敲除”或“KO”变体)。通常，消融变体发现于这两个单体上，但是在一些情况下，所述消融变体可以仅在一个单体上。
图5示出了本发明的“非细胞因子”组分的特别有用的实施例。
图6描绘了许多示例性结构域接头。在一些实施例中，这些接头可用于将IL-12p35亚基、IL-12p40亚基或单链IL-12复合物与Fc区的N端连接。在一些实施例中，这些接头可用于在单链IL-12复合物中将IL-12p35亚基与IL-12p40亚基融合。重要的是，应注意，scIL-12复合物可以包括在N端与IL-12p40连接的IL-12p35或在N端与IL-12p35连接的IL-12p40。同样，在本文所描述的一些情况下，Fc结构域的铰链部分充当结构域接头，所述结构域接头也可以与这些接头中的任何接头组合。
图7A-7E示出了基于人IgG1的若干个有用IL-12-Fc融合主链的序列，其中没有细胞因子序列(例如，IL-12p35亚基、IL-12p40亚基或scIL-12复合物)。主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)并且包含两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)并且包含两条链上的C220S、S364K:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)并且包含两条链上的C220S、S364K:L368E/K370S偏斜变体、具有L368E/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)并且包含两条链上的C220S、D401K:K360E/Q362E/T411E偏斜变体、具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)并且包含两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)并且包含两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体以及两条链上的N297A变体。除了突变为N297S.之外，主链7与6相同。主链6和7的替代形式可以排除两条链中的消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主链8基于人IgG4并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421DpI变体以及两条链上的如本领域已知的那样消融Fab臂交换的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体。主链9基于人IgG2并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链10基于人IgG2并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S267K变体。除了主链11包含M428L/N434S Xtend突变之外，所述主链与主链1相同。主链12基于人IgG1(356E/358M同种异型)并且包含两条相同的链上的C220S、两条相同的链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链13基于人IgG1(356E/358M同种异型)并且包含两条链上的C220S、S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的P217R/P229R/N276K pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。
如本领域技术人员将了解并且在下文概述的，这些序列可以与本文概述的任何IL-12-Fc融合形式一起使用，包含但不限于IL-12-异源Fc、异源Fc-IL-12和scIL-12-Fc形式，如图8所示意性地描绘的。应当注意，对于异源Fc-IL-12融合，主链可以进一步包括K447的缺失。另外，可以将任何IL-12p35和/或IL-12p40变体以任何组合并入图7的这些主链中。
这些主链中的每个主链内包含与所列举序列90％、95％、98％和99％相同的序列(如本文所定义的)和/或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个另外的氨基酸取代(如与附图的“亲本”相比，所述另外的氨基酸取代如本领域的技术人员将了解的如与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比已经含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链内所含的偏斜变体、pI变体和消融变体之外，所列举主链可以含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图8A-8F描绘了本发明的IL-12-Fc融合蛋白的说明性形式。N端IL-12异源二聚体Fc融合或“IL-12-异源Fc”(图8A)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的N端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的N端重组融合的IL-12p35亚基。IL-12p35和IL-12p40亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。C端IL-12异源二聚体Fc融合或“异源Fc-IL-12”(图8B)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的C端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的C端重组融合的IL-12p35亚基。IL-12p35和IL-12p40亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。N端单链IL-12-Fc融合或“scIL-12-Fc”(图8C-D)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的N端(任选地通过结构域接头)重组融合的单链IL-12复合物(或“scIL-12复合物”)，其中分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”异源二聚体Fc。C端单链IL-12-Fc融合或“Fc-scIL-12”(图8E-F)形式包括与异源二聚体Fc的一侧的C端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物，其中分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”异源二聚体Fc。scIL-12复合物可以包括N端与IL-12p40连接的IL-12p35或N端与IL-12p35连接的IL-12p40，任选地但通常利用结构域接头。scIL-12复合物中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N端与IL-12p35亚基连接；或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N端与IL-12p40亚基连接。
图9描绘了“IL-12-异源Fc”形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白XENP27201的序列，XENP27201含有野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图10描绘了“异源Fc-IL-12”形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白XENP27202的序列，XENP27202含有野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图11描绘了“scIL-12-Fc”形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白XENP27203和XENP27204的序列，XENP27203和XENP27204含有野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图12A-12B描绘了A)色谱图，所述色谱图展示了XENP27201的纯化部分2(在蛋白A色谱法之后的阴离子交换色谱法)以及如图12A中所描绘的从阴离子交换分离中分离出的峰B相对于峰A的纯度和同质性，如通过B)利用多角度光散射的分析型尺寸排阻色谱法(aSEC-MALS)和C)分析型阴离子交换色谱法(分析型AIEX)测定的。图12B还描绘了如通过多角度光散射测定的峰中的蛋白质物种的分子量。
图13A-13C描绘了A)色谱图，所述色谱图展示了XENP27203的纯化部分2(在蛋白A色谱法之后的阴离子交换色谱法)以及如图13A中所描绘的从阴离子交换分离中分离出的峰B相对于峰A的纯度和同质性，如通过B)利用多角度光散射的分析型尺寸排阻色谱法(SEC-MALS)和C)分析型阴离子交换色谱法测定的。图13B还描绘了如通过多角度光散射测定的峰中的蛋白质物种的分子量。
图14A-14B描绘了A)二价IL-12p40-Fc融合物和B)二价IL-12p35-Fc融合物的动画示意图。每个融合物包括与同源二聚体Fc的N端重组融合的IL-12p40或IL-12p35亚基。亚基可以在其相应Fc区C端与N端之间具有结构域接头。
图15描绘了二价IL-12p40-Fc融合物XENP27560和二价IL-12p35-Fc融合物XENP27561的序列(图14中描绘的动画示意图)，XENP27560含有野生型IL-12p40和野生型IL-12p35序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图16A-16D描绘了在将活化的PBMC与指示的测试制品一起温育之后，A)CD4+CD45RA-CD25hi T细胞、B)CD8+CD45RA-CD25hi T细胞、C)γδT细胞和D)NK细胞上的STAT4磷酸化。
图17描绘了IL-12p40(基于IL-12p40成熟形式序列)上的预测有助于IL-12p40与IL-12受体的结合的残基。
图18描绘了在MOE中使用QuaSAR数据包鉴定为具有至少19的ASA评分(使用
的水分子半径和每个原子的多面体表示计算的水可及表面积)的IL-12p40(基于IL-12p40成熟形式序列)上的天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺残基。
图19描绘了IL-12p40(基于IL-12p40成熟形式序列)上的预期与IL-23受体接触的残基(基于保藏在登录号为5MZV的PDB中的晶体结构)以及预测的一种或多种接触类型。“D”指示基于接近度预测的接触。“H”指示基于潜在氢键预测的接触。“I”指示基于潜在盐桥预测的接触。“A”指示基于潜在芳烃结合预测的接触。
图20A-20I描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力和/或去除推定的糖基化位点而设计的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图21A-21J描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p40变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p40变体用斜体表示。
图22描绘了在MOE中使用QuaSAR数据包鉴定为具有至少103的ASA评分(使用
的水分子半径和每个原子的多面体表示计算的水可及表面积)的IL-12p35(基于IL-12p35成熟形式序列)上的天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺残基。
图23A-23C描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力和/或去除推定的糖基化位点而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图24A-24D描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p35变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p35变体用斜体表示。
图25A-25Q描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力或去除推定的糖基化位点而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图26A-26B描绘了在将活化的PBMC与包括被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40变体的IL-12-Fc融合物一起温育之后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图27A-27B描绘了在将活化的PBMC与包括被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育之后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图28描绘了EC50(用于STAT4磷酸化)作为包括IL-12p40或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物以及相对于野生型WT IL-12-Fc XENP27201的EC50减小倍数。27201-1和27201-2表示两个单独生产的批次的XENP27201。
图29A-29B描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图30A-30D描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p40变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p40变体用斜体表示。
图31A-31B描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图32A-32C描绘了具有Fc融合配偶体的说明性IL-12p35变体的氨基酸序列。结构域接头加双下划线，并且IL-12p35变体用斜体表示。
图33A-33P描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图34A和34B描绘了在将活化的PBMC与包括被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40变体的IL-12-Fc融合物一起温育之后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图35A和35B描绘了在将活化的PBMC与包括被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育之后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图36描绘了包括IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)以及相对于野生型WT IL-12-Fc XENP27201的EC50减小倍数。数据表明，通过包括IL-12p40亚基中的仅E59K取代的IL-12-Fc融合物，效力降低了至多12倍。
图37A-37B描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图38描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图39A-39I描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图40A-40B描绘了在将活化的PBMC与包括被工程化以降低亲和力和效力的Il-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育之后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图41描绘了包括IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)以及相对于野生型WT IL-12-Fc XENP27201的EC50减小倍数。数据表明，效力降低了至多100倍。
图42A-42B描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p40变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图43描绘了为降低IL-12异源二聚体复合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性IL-12p35变体的序列。经修饰的氨基酸加下划线并以粗体表示。
图44A-44K描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图45A-45C描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列，所述说明性变体IL-12-Fc融合物利用用于延长半衰期的Xtend Fc(M428L/N434S)进一步工程化。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。应当注意，提供这些序列是出于说明性目的提供的，并且在其它附图中描绘的序列中的任何序列也可以包含用于延长半衰期的XtendFc(M428L/N434S)。
图46A-46D描述了在将活化的PBMC与包括被工程化以降低亲和力和效力的IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物一起温育之后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞、B)CD4+CD45RA-CD25+T细胞、C)CD8+CD45RA+CD25+T细胞和D)CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。
图47描绘了包括IL-12p40和/或IL-12p35变体的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)以及相对于野生型WT IL-12-Fc XENP27201的EC50减小倍数。
图48A-48D描述了本发明的二价IL-12-Fc融合蛋白的说明性形式。二价N端单链(图48A-B)形式包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的N端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。二价C端单链(图48C-D)形式包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的C端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。scIL-12复合物可以包括N端与IL-12p40连接的IL-12p35或N端与IL-12p35连接的IL-12p40，任选地利用结构域接头。scIL-12复合物中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N端与IL-12p35亚基连接；或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N端与IL-12p40亚基连接。
图49描绘了(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白XENP31289和XENP31291的序列。XENP31289含有野生型IL-12p40和野生型IL-12p35亚基。XENP31291含有IL-12p40(E59K/K99E)变体和野生型IL-12p35亚基。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图50描绘了scIL-12(p40/p35)-Fc形式的说明性IL-12-Fc融合蛋白XENP31290的序列，XENP31290含有IL-12p40(E59K/K99E)变体和野生型IL-12p35亚基。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图51A-51D描述了在将活化的PBMC与具有WT IL-12p40亚基或变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的IL-12-Fc融合物一起温育之后，A)CD4+CD45RA+CD25+T细胞、B)CD4+CD45RA-CD25+T细胞、C)CD8+CD45RA+CD25+T细胞和D)CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的STAT4磷酸化。数据表明，包括变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc融合物的IL-12-Fc融合物相对于包括WTIL-12p40亚基的IL-12-Fc融合物展现出的效力有所降低。
图52描绘了具有WT IL-12p40亚基或变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的IL-12-Fc融合物的EC50(用于STAT4磷酸化)。
图53描绘了XENP16432、基于纳武单抗的抗PD-1mAb和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的序列。
图54A-54D描绘了在经过pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中，在A)第11天、B)第13天和C)第15天以及D)随时间推移的肿瘤体积变化(如通过卡尺测量测定的)，所述小鼠用PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)给药。如肿瘤体积变化所指示的，到第11天，XENP29952显著增强了抗肿瘤活性(使用未配对t检验对经过基线校正的数据进行的统计)。
图55A-55F描绘了在PBMC移植和第一剂量的PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在经过pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中在第14天的A)CD45细胞计数、B)CD3+T细胞计数、C)CD4+T细胞计数、D)CD8+T细胞计数、E)NK细胞计数以及F)CD4+T细胞与CD8+T细胞比。与PBS对照和通过XENP16432进行的检查点阻断两者相比，到第14天，XENP29952已经显著增强CD45+、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的扩增(使用未配对t检验对经过对数变换的数据进行的统计)。
图56A-56D描绘了在PBMC移植和第一剂量的PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在经过pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中在A)第7天和B)第14天的血清IFNγ浓度以及在C)第7天和D)第14天的血清CD25浓度。与通过XENP16432进行的检查点阻断相比，到第7天，XENP29952显著增强了IFNγ和CD25的分泌(使用未配对t检验对经过对数变换的日期进行的统计)。
图57A-57I描绘了在经过huPBMC移植的NSG小鼠中，到A)第3天、B)第6天、C)第10天、D)第13天、E)第17天、F)第20天、G)第24天和H)第27天以及I)随时间推移的体重变化(作为GVHD指标)，所述小鼠以0.3或0.03mg/kg用PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)给药。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同程度的GVHD。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，通过0.3mg/kg对0.03mg/kg增强的GVHD)。
图58A-58C描绘了在PBMC移植和0.3或0.03mg/kg第一剂量的PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在A)第7天、B)第10天和C)第14天在经过huPBMC移植的NSG小鼠中的CD8+T细胞上的PD-1表达(作为活化指标)。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同程度的CD8+T细胞活化。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，通过0.3mg/kg对0.03mg/kg增强的CD8+T细胞活化)。
图59A-59C描绘了在PBMC移植和0.3或0.03mg/kg第一剂量的PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在A)第7天、B)第10天和C)第14天在经过huPBMC移植的NSG小鼠中的CD4+T细胞上的PD-1表达(作为活化指标)。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同程度的CD4+T细胞活化。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，通过0.3mg/kg对0.03mg/kg增强的CD4+T细胞活化)。
图60A-60D描绘了在PBMC移植和0.3或0.03mg/kg第一剂量的PBS或XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)之后，在A)第7天、B)第10天、C)14和D)第31天在经过huPBMC移植的NSG小鼠中的IFNγ的血清浓度。值得注意的是，IL-12-Fc融合测试制品诱导了与其体外效力相关的不同水平的IFNγ分泌。另外，数据示出了测试制品的剂量应答(即，通过0.3mg/kg对0.03mg/kg增强的IFNγ分泌)。
图61A-61K描绘了在将活化的PBMC(来自第一供体；供体1)与重组人IL-12、XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)一起温育之后，A)CD4+CD45RA-CD25+T细胞、B)CD4+CD45RA+CD25+T细胞、C)CD4+CD45RA+CD25-T细胞、D)CD4+CD45RA-CD25-T细胞、E)CD8+CD45RA-CD25+T细胞、F)CD8+CD45RA+CD25+T细胞、G)CD8+CD45RA+CD25-T细胞、H)CD8+CD45RA-CD25-T细胞、I)Treg、J)γδT细胞和K)CD56+NK细胞上的STAT4磷酸化。数据示出了效力阶梯，其中XENP29952为最强效变体，XENP31254和XENP31258为最不强效变体，并且XENP30597和XENP31251介于两者之间。值得注意的是，如由效力降低的IL-12-Fc融合变体在体内诱导的GVHD和T细胞活化程度与体外效力相关。
图62A-62D描绘了在经过pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中，在A)第14天、B)第16天和C)第21天以及D)随时间推移的肿瘤体积变化(如通过卡尺测量测定的)，所述小鼠用PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)、XENP31258、XENP31251或XENP31251和XENP16432的组合给药。与用PBS治疗相比，XENP31258到第14天显著增强了抗肿瘤活性，XENP31251(单独或与XENP16432组合)到第16天显著增强了抗肿瘤活性；并且与用单独的XENP16432治疗相比，XENP31251与XENP16432组合到第21天显著增强了抗肿瘤活性(使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)对经过基线校正的数据进行的统计)。
图63A-63F描述了在PBMC移植和第一剂量的PBS、XENP16432(二价抗PD-1mAb)、XENP31258、XENP31251或XENP31251和XENP16432的组合之后，在经过pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中在第14天的A)CD45细胞计数、B)CD3+T细胞计数、C)CD4+T细胞计数、D)CD8+T细胞计数、E)NK细胞计数以及F)CD8+T细胞与CD4+T细胞比。值得注意的是，数据表明，与单独的XENP31251或XENP16432相比，用XENP31251与XENP16432组合的治疗显著增强了淋巴细胞扩增，从而表明IL-12-Fc融合物有效地与检查点阻断组合。
图64A-64C描绘了为降低IL-12-Fc融合物对IL-12受体的亲和力而设计的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列，所述说明性变体IL-12-Fc融合物利用用于延长半衰期的Xtend Fc(M428L/N434S)进一步工程化。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行了描绘)，并且斜线(/)指示Il-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。应当注意，提供这些序列是出于说明性目的提供的，并且在其它附图中描绘的序列中的任何序列也可以包含用于延长半衰期的Xtend Fc(M428L/N434S)。
图65A-C描绘了为去除游离半胱氨酸而用C252S工程化的说明性IL-12p40变体的序列(除了表达和亲和力/效力变体之外)。
图66A-66Q描绘了为去除游离半胱氨酸而用IL-12p40亚基中的C252S工程化的说明性变体IL-12-Fc融合物的序列(除了表达和亲和力/效力变体之外)。接头加双下划线(但是如本领域技术人员将了解的，接头可以被其它接头替代，其中的一些在图6中进行描绘)，并且斜线(/)指示IL-12p35、IL-12p40、接头和Fc区之间的一个或多个边界。
图67A-67D描绘了在将活化的PBMC与包括为去除游离半胱氨酸而具有或不具有另外的工程化的IL-12p40变体的IL-12-Fc一起温育之后，A)CD8+CD45RA-CD25+T细胞、B)CD8+CD45RA+CD25+T细胞、C)CD4+CD45RA-CD25+T细胞、D)CD4+CD45RA+CD25+T细胞和E)NK细胞上的STAT4磷酸化。数据表明，与没有C252S修饰的变体相比，包括IL-12p40亚基中的C252S的大多数变体展现出类似的效力，但是略有改善。
具体实施方式
I.概述
本发明涉及含有IL-12亚基和Fc结构域的新颖的异源二聚体融合蛋白构建体。如上文指出的，IL-12由共价连接以形成具有生物活性的IL-12异源二聚体的α链(p35亚基；IL-12p35)和β链(p40亚基；IL-12p40)构成。通过与T细胞上由IL-12受体β1(IL-12Rβ1)和IL-12受体β2(IL-12Rβ2)构成的二聚体IL-12受体复合物结合并诱导IFNγ分泌，IL-12发挥其细胞信号传导功能。然而，IL-12p40亚基也可以以同源二聚体形式存在，据报道，所述同源二聚体通过竞争与IL-12受体的结合来拮抗IL-12活性。因此，本发明通过提供IL-12-Fc融合蛋白以及效力降低的新颖的IL-12变体来解决IL-12的短半衰期和拮抗性IL12p40同源二聚体的潜在形成。如图8中通常所示，本发明的异源二聚体融合蛋白可以具有多种构象。
本申请通过引用并入于2018年10月3日提交的62/740,813和于2019年5月15日提交的62/828,512，更具体地针对62/740,813中的图17和62/828,512中的图62A-62K和图63A-63D以及图例和对应说明书中对这些图的提及。
II.定义
为了可以更加彻底地理解本申请，下文中阐述了若干定义。此类定义意在涵盖语法等同物。
本文中的“消融”意指结合和/或活性的降低或去除。因此，例如，“消融FcγR结合”意指Fc区氨基酸变体与不含有特异性变体的Fc区相比具有少于50％的起始结合，优选的是少于70％-80％-90％-95％-98％的结合损失，并且通常所述结合低于Biacore测定中可检测结合的水平。FcγR结合的消融中的特定用途如图4所示的那些特定用途。然而，除非另有说明，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合。
如本文所使用的，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导反应。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa增加的结合导致ADCC活性增加。如本文所讨论的，本发明的许多实施例完全消融ADCC活性。
本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是与蛋白质连接的经更改的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰总是用于由DNA编码的氨基酸，例如，在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸来替代亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。具体地，在一些实施例中，取代是用于并非天然发生在特定位置处或并非天然发生在生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代E272Y或272Y是指变体多肽，在这一情况下是指Fc变体，其中位置272处的谷氨酸用酪氨酸替代。为清楚起见，已经被工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则所述蛋白质不是氨基酸取代。
如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸残基或序列。例如，-233E指代在位置233之后且在位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE指代在位置233之后且在位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所使用的，“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸残基或序列。例如，E233-、E233#、E233()或E233del指代位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#指代开始于位置233的序列GluAspAla缺失。
如本文所使用的，“变体蛋白质”、“蛋白质变体”或“变体”意指由于至少一个修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可以指代蛋白质本身、包括所述蛋白质的组合物、对所述蛋白质进行编码的氨基酸序列或对所述蛋白质进行编码的DNA序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白相比具有至少一种氨基酸修饰，例如，与亲本相比，约一种到约七十种氨基酸修饰，并且优选地约一种到约五种氨基酸修饰。修饰可以是添加、缺失或取代。如下文所描述的，在一些实施例中，亲本多肽(例如，Fc亲本多肽)是人野生型序列，如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。本文中的蛋白质变体序列将与亲本蛋白质序列优选地具有至少约80％同一性并且最优选地至少约90％同一性，更优选地至少约95％到98％到99％同一性。
如本文所使用的，“蛋白质”意指至少两个共价连接氨基酸，包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。当生物功能单元包括两种或更多种蛋白质时，每种蛋白质可以被称为“单体”或“亚基”或“结构域”；并且生物功能分子可以被称为“复合物”。
如本文所使用的，“蛋白质”意指至少两个共价连接氨基酸，包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。当生物功能分子或复合物包括两种或更多种蛋白质时，每种蛋白质可以被称为“单体”或“亚基”或“结构域”；并且生物功能分子可以被称为“复合物”。在一些实施例中，功能复合物的两个或更多个蛋白质是非共价连接的。在一些实施例中，术语“单体”是指包括一种或多种蛋白质的一个或多个组分、片段或亚基的多肽或蛋白质，并且所述组分、片段或亚基是共价连接的。
如本文所使用的，“残基”意指蛋白质中的位置和其缔合的氨基酸同一性。例如，天冬酰胺297(还被称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
如本文所使用的，“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一个IgG同种型的一个氨基酸转换为不同的比对IgG同种型中的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为IgG1包括酪氨酸并且IgG2包括EU位置296处的苯基丙氨酸，因此IgG2的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
每个IgG链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。Kabat等人收集了重链和轻链的可变区的多个一级序列。基于序列的保守度，这些人将各个一级序列分类成CDR和框架并且做出其列表(参见《免疫学关注的序列(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICALINTEREST)》第5版,NIH出版号91-3242,E.A.Kabat等人,所述文献通过引用并入)。贯穿本说明书，在提及可变结构域中的残基(大致上，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统，并且EU编号系统用于Fc区(例如，Kabat等人,同上(1991)))。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，在重链中存在若干免疫球蛋白结构域。在本文中，“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区。本发明中关注的是重链结构域，包含恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的上下文中，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，在IgG的上下文中，“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的位置118-215。“铰链”是指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的位置231-340，并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的位置341-447。如表1所示，在不同的编号系统之间，重链结构域的精确编号和放置可以有所不同。如本文所示和下文所描述的，pI变体可以处于CH区的一个或多个CH区以及铰链区中，如下文所讨论的。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。在本文中，“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”意指包括抗体的第一重链恒定结构域与第二重链恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处结束，并且IgG CH2结构域开始于残基EU位置231。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中被定义为包含位置216(IgG1中的(E216到230(IgG1中的(P230，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施例中，例如在Fc区的上下文中，铰链包含在内，所述铰链通常指位置216-230。如本文所指出的，pI变体也可以处于铰链区中。
如本文所使用的，“非天然发生修饰”意指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为IgG均不包括位置434处的丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)的取代434S被视为非天然存在的修饰。
如本文所使用的，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的20个天然发生的氨基酸之一。
如本文所使用的，“效应子功能”意指造成抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用的生物化学事件。效应子功能包含但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所使用的，“IgG Fc配体”或“Fc配体”意指来自与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选地多肽。Fc配体包含但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒性FcγR。Fc配体还包含Fc受体同源物(FcRH)，所述Fc受体同源物是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,《免疫学评论(Immunological Reviews)》190:123-136,所述文献通过引用并入)。Fc配体可以包含结合Fc的未发现的分子。特别的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。
如本文所使用的，“Fcγ受体”、“FcγR”“或FcγR”意指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包含但不限于以下：FcγRI(CD64)，包含同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包含同种型FcγRIIa(包含同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,《免疫学快报(Immunol Lett)》82:57-65,所述文献通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包含但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
如本文所使用的，“FcRn”或“新生的Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区并至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知的，功能FcRn蛋白包括两种肽，常常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白(β-2-微球蛋白)，并且重链由FcRn基因编码。除非本文另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β2-微球蛋白的复合物。各种Fc变体可以用于增加与FcRn的结合并且在一些情况下用于增加血清半衰期。通常，除非另有说明，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合(并且，如下所述，可以包含氨基酸变体以增加与FcRn的结合)。
如本文所使用的，“亲本多肽”意指随后修饰以生成变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然发生的多肽或者天然发生的多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可以指多肽本身、包括亲本多肽的组合物或对所述亲本多肽进行编码的氨基酸序列。
如本文所使用的，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指多肽，所述多肽包括抗体的恒定区，在一些情况下不包含所有第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1)或其一部分，并且在一些情况下，任选地包含铰链的全部或一部分。对于IgG，Fc结构域包括免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)，以及任选地CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的铰链区的全部或一部分。因此，在一些情况下，Fc结构域从N端到C端包含CH2-CH3和铰链-CH2-CH3。在一些实施例中，Fc结构域是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的结构域，其中IgG1铰链-CH2-CH3和IgG4铰链-CH2-CH3在许多实施例中找到了特定的用途。另外，在人IgG1 Fc结构域的情况下，铰链常常包含C220S氨基酸取代。此外，在人IgG4 Fc结构域的情况下，铰链常常包含S228P氨基酸取代。虽然Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成在其羧基端包含残基E216、C226或A231，其中根据如Kabat中的EU索引进行编号。在一些实施例中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种FcγR或与FcRn的结合。
如本领域的技术人员将理解的，在不同的编号系统之间，重恒定区结构域的精确编号和放置可以有所不同。根据EU和Kabat的重恒定区编号的有用比较如下，参见Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》63:78-85，以及Kabat等人,1991,《免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》,第5版,美国公共卫生署(United States Public Health Service),国立卫生研究院(National Institute of Health),贝塞斯达(Bethesda)，所述文献通过引用整体并入。
表1
| <u>EU编号</u> | <u>Kabat编号</u> | |
| CH1 | 118-215 | 114-223 |
| 铰链 | 216-230 | 226-243 |
| CH2 | 231-340 | 244-360 |
| CH3 | 341-447 | 361-478 |
如本文所使用的，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。修饰可以是添加、缺失或取代。本发明的Fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽具有位置434处的丝氨酸取代的Fc变体，其中根据EU索引进行编号。同样地，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。可以未指定WT氨基酸的同一性，在此情况下，上述变体被称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与434S/428L相同的Fc变体等。对于本发明所讨论的涉及抗体或其衍生物和片段的所有位置，除非另外指出，否则根据EU索引进行氨基酸位置编号。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊》63:78-85，所述文献特此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。
如本文所使用的，“融合蛋白”是指至少两个蛋白质或蛋白质结构域的共价连接。融合蛋白可以包括人工序列，例如，结构域接头、变体Fc结构域、变体IL-12p40亚基结构域、变体IL-12p35亚基结构域等，如本文所描述的。本文中的“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”是指包括Fc区的蛋白质，所述Fc区通常(任选地通过结构域接头，如本文所描述的)与一个或多个不同的蛋白质结构域连接。因此，“IL-12Fc融合物”包括与(任选地但通常通过结构域接头)IL-12p40亚基、IL12p35亚基和/或单链IL-12复合物(scIL-12)连接的Fc区，如本文所描述的。在一些情况下，两个Fc融合蛋白可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异源二聚体Fc融合蛋白，在一些情况下后者是优选的。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白的一个单体包括单独的Fc结构域(例如，“空Fc结构域”)，并且另一个单体是Fc融合物，包括变体Fc结构域和一个或两个IL-12亚基结构域，如本文所概述的。
如本文所使用的“位置”意指蛋白质的序列中的位置。位置可以顺序地或根据已建立格式例如抗体编号的EU索引进行编号。
在本文中，在本发明的异源二聚体蛋白的单体的上下文中，“链型(strandedness)”意指，类似于DNA的“相匹配”的两个链，异源二聚化变体并入到每个单体中以便保持、产生和/或增强“相匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果一些pI变体被工程化为单体A(例如，使pI更高)，则作为也可以利用的“电荷对”的空间变体不干扰pI变体，例如使pI更高的电荷变体被放在同一个“链”或“单体”上以保存两种功能。类似地，对于如下文更充分地概述的以成对的组出现的“偏斜”变体，技术人员将认为pI决定会进入并入所述对中的一组的链或单体，从而使得还使用偏斜变体的pI使pI分离最大化。
在本文中，“野生型或WT”意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质具有尚未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明的异源二聚体蛋白通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”意指已经从表达多肽的细胞或细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收的多肽。通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。“分离的蛋白质”是指基本上不含来自细胞培养物的如宿主细胞蛋白等其它蛋白质的蛋白质。“重组”意指在外源性宿主细胞中使用重组核酸技术生成蛋白。
关于蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为，在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以实现最大序列同一性百分比之后并且在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中的与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以用本领域技术中的多种方式来实现出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的进行的比对，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包含在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一种特定程序是美国公开第20160244525号的[0279]到[0280]段落中所概述的ALIGN-2程序，所述公开特此通过引用并入。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲本氨基酸序列之间的同一性的程度被计算为在两个序列的比对中精确匹配的数除以“发明序列”的长度或亲本序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。
在一些实施例中，两个或更多个氨基酸序列是至少50％、60％、70％、80％或90％相同的。在一些实施例中，两个或更多个氨基酸序列是至少95％、97％、98％、99％或甚至100％相同的。
本文中的“IL-12p40亚基结构域”意指β链(p40亚基；IL-12p40)。如本文所讨论的，IL-12p40亚基结构域可以是野生型人序列(例如，来自图1的SEQ ID NO:XX)或其变体，如下文更全面地讨论(例如，参见例如图20、23和29)。
本文中的“IL-12p35亚基结构域”意指α-链(p35亚基；IL-12p35)。如本文所讨论的，IL-12p35亚基结构域可以是野生型人序列(例如，来自图1的SEQ ID NO:XX)或其变体，如下文更全面地讨论(例如，参见例如图20、23和29)。
当本发明的IL-12亚基结构域缔合在一起时，其与包括IL-12受体β1和IL-12受体β2的二聚体IL-12受体复合物特异性结合。可以在相互作用的解离常数(KD)方面表达特异性结合的强度或亲和力，其中更小的KD表示更大的亲和力并且更大的KD表示更小的亲和力。结合特性可以通过本领域众所周知的方法来确定，如生物层干涉法和基于表面等离振子共振的方法，包含Biacore和Octet方法。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原或受体/配体复合物缔合和解离的速率，其中速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力并且取决于在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可以确定缔合速率(ka)和解离速率(kd)两者，并且kd/ka的比率等于解离常数KD(参见《自然(Nature)》361:186-187(1993)和Davies等人,(1990)《生物化学年鉴(Annual Rev Biochem)》59:439-473)，所述两个文献通过引用以其针对其中的方法全文并入本文。
特定分子的特异性结合可以例如通过针对配体(在这种情况下通常为受体)的KD为以下的分子来表现：至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大。典型地，与其受体特异性地结合的分子的KD是对照分子相对于受体的KD的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
而且，特定分子的特异性结合可以例如通过针对配体或受体的ka或缔合速率为以下的分子来表现：针对相对于对照物的受体大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
本文中“融合”或“共价连接”是指组分(例如，IL-12亚基和Fc结构域)通过肽键直接或间接地通过结构域接头连接，如本文所概述的。
如本文所使用的，术语“单链”是指包括通过肽键线性连接的氨基酸结构域的分子。在某些实施例中，生物功能IL-12是单链IL-12复合物或“scIL-12”，即，将IL-12p35亚基和IL-12p40亚基融合以形成单肽链。在特定的此类实施例中，IL-12p35亚基的C端与IL-12p40亚基的N端连接，指定为“scIL-12(p35/p40)”。在另一个特定的此类实施例中，IL-12p40亚基的C端与IL-12p35亚基的N端连接，指定为“scIL-12(p40/p35)”。另外，当这些复合物进一步融合到Fc结构域时，其仍然是“单链”。应注意的是，其中p35和p40亚基位于同一氨基酸链上的这些单链构建体仍然是含有两个氨基酸链的异源二聚体复合物的一部分(例如，如图8C和8D所示，scIL-12(p35/p40)组分和“空臂(empty arm)”Fc组分)。换句话说，存在组成异源二聚体复合物的两条单链。
本发明的融合蛋白可以采取多种形式，包含异源二聚体形式，如图8所描绘的那些，以及同源二聚体形式，如图14和图48所描绘的那些。
III.异源二聚体Fc融合蛋白
在一些方面中，本发明涉及包含Fc区的异源二聚体Fc融合蛋白，所述Fc区通常(任选地通过结构域接头)与一个或多个不同的IL-12蛋白质结构域连接。这些异源二聚体融合蛋白可以采用大量不同形式，如图8所通常描绘的。在一方面中，异源二聚体Fc融合蛋白是IL-12异源二聚体Fc融合蛋白，包含处于不同取向的IL-12p40和IL-12p35亚基，使得其一起存在以与IL-12Rβ1/β2的IL-12受体复合物结合。Fc结构域可以衍生自IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域，其中IgG1和IgG4 Fc结构域在本发明中找到特定用途。如本文所描述的，IgG1 Fc结构域可以经常但不总是与消融变体结合使用以消融效应子功能。类似地，当期望低效应子功能时，可以使用IgG4 Fc结构域。
如本文所描述以及本领域已知的，本发明的异源二聚体蛋白包括不同结构域，所述结构域也可以重叠。这些结构域包含但不限于Fc结构域、CH2结构域、CH3结构域和铰链结构域、IL-12p40亚基结构域和Il-12p35亚基结构域。如本文所描述的，这些结构域以不同的形式连接在一起，如图8所概述的。
在本文中的实施例中的一些实施例中，当蛋白质片段，例如，IL-12p40或IL-12p35与Fc结构域连接时，蛋白质片段的C端与Fc结构域的铰链的全部或部分连接；例如，其通常与作为IgG1铰链的开始的序列EPKS连接。在本文中的实施例中的其它实施例中，当蛋白质片段，例如，IL-12p40或IL-12p35与Fc结构域连接时，蛋白质片段的N端与CH3结构域的C端连接。
在本文概述的Fc结构域蛋白的构建体和序列中的一些构建体和序列中，IL-12p40或IL-12p35蛋白质片段的C端与结构域接头的N端连接，其C端与恒定Fc结构域(N-IL-12p40或IL-12p35蛋白质片段-接头-Fc结构域-C)的N端连接，尽管可以将其切换为(N-Fc结构域-接头-IL-12p40或IL-12p35蛋白质片段-C)。在本文概述的其它构建体和序列中，第一蛋白质片段的C端与第二蛋白质片段的N端连接，任选地通过结构域接头，第二蛋白质片段的C端与恒定Fc结构域的N端连接，任选地通过结构域接头。在又另一个构建体中，第一蛋白质片段的N端与第二蛋白质片段的C端连接，任选地通过结构域接头，第二蛋白质片段的N端与恒定Fc结构域的C端连接，任选地通过结构域接头。在本文概述的又其它构建体和序列中，提供了未与第一蛋白质片段或第二蛋白质片段连接的恒定Fc结构域。异源二聚体Fc融合蛋白可以含有本文所描述的示例性单体Fc结构域蛋白中的两个或更多个单体Fc结构域蛋白。
因此，在一些实施例中，本发明提供了依赖于使用将自组装形成异源二聚体Fc结构域融合多肽的两个不同的重链变体Fc序列的异源二聚体Fc融合蛋白。在一个实施例中，异源二聚体Fc融合蛋白含有至少两个恒定结构域，其可以被工程化以产生异源二聚体，如pI工程化。可以使用的其它Fc结构域包含含有本发明的被pI工程化的CH1、CH2、CH3和铰链结构域中的一个或多个的片段。具体地，图8A-F中所描绘的形式是异源二聚体Fc融合蛋白，意味着蛋白具有两个缔合的Fc序列，所述序列自组装成异源二聚体Fc结构域和至少一个蛋白片段(例如，1、2或更多个蛋白片段)。在一些情况下，第一蛋白质片段与第一Fc序列连接，并且第二蛋白质片段与第二Fc序列连接。在一些情况下，异源二聚体Fc融合蛋白含有与第二蛋白质片段以及第二Fc序列连接的第一蛋白质片段，所述第二蛋白质片段与第一Fc序列连接，所述第二Fc序列不与第一蛋白质片段或第二蛋白质片段连接。
本发明涉及提供允许与一个或多个结合配偶体、配体或受体结合的异源二聚体Fc融合蛋白的新颖构建体。异源二聚体Fc融合构建体基于抗体的重链的两个Fc结构域的自组装性质，例如，组装成“二聚体”的两个“单体”。通过更改每个单体的氨基酸序列来形成异源二聚体Fc融合物，如下文中更加充分地讨论的。因此，本发明总体上涉及产生异源二聚体Fc融合蛋白，所述异源二聚体Fc融合蛋白可以以若干方式共同接合一个或多个结合配偶体或一个或多个配体或一个或多个受体，这依赖于恒定区中的在每个链上有所不同的促进异源二聚体形成和/或允许相比于同源二聚体易于纯化异源二聚体的氨基酸变体。存在多种机制可以用于生成本发明的异源二聚体。另外，如本领域技术人员将了解的，这些机制可以组合以确保高异源二聚化。因此，导致异源二聚体产生的氨基酸变体被称为“异源二聚化变体”。如下文所讨论的，异源二聚化变体可以包含空间变体(例如，下文所描述“旋钮与孔(knobs and holes)”或“偏斜”变体和下文所描述“电荷对”)以及“pI变体”，这允许纯化同源二聚体远离异源二聚体。如在特此通过引用以其全文并入的WO2014/145806中通常描述的，并且具体如下文所讨论的“异源二聚化变体”，异源二聚化的有用机制包含“隆凸与孔”(“KIH”；有时在本文中所描述的被称为“偏斜”变体(参见WO2014/145806中的讨论))、如WO2014/145806中所描述的“静电转向”或“电荷对”、如WO2014/145806中所描述的pI变体以及如WO2014/145806以及下文中所概述的一般另外的Fc变体。
在本发明中，存在可以使纯化异源二聚体蛋白和抗体变得容易的若干种基本机制；一种机制依赖于使用pI变体，使得每个单体以及随后每个二聚体物种具有不同pI，从而允许等电纯化A-A、A-B和B-B二聚体蛋白。可替代地，一些形式也允许基于大小的分离。如下文中进一步概述的，还可能相比于同源二聚体“偏斜”异源二聚体的形成。因此，空间异源二聚化变体与pI或电荷对变体的组合特别用于本发明。
通常，特别用于本发明的实施例依赖于包含偏斜变体的变体组，所述偏斜变体相比于同源二聚化形成鼓励异源二聚化形成、与pI变体偶联，所述pI变体增加两个单体与每个二聚体物种之间的pI差。
另外，如下文更全面地概述的，取决于异源二聚体Fc融合蛋白的形式，pI变体可以包含在单体的恒定结构域和/或Fc结构域内或者可以使用结构域接头。换句话说，本发明提供了在单体中的一个或两个单体和/或带电结构域接头上的pI变体。另外，用于替代性功能的另外的氨基酸工程化还可以赋予pI变化，如Fc、FcRn和KO变体。
在将pI用作分离机制以允许纯化异源二聚体蛋白的本发明中，可以将氨基酸变体引入到单体多肽中的一个或两个中；也就是说，可以使单体之一(为了简单起见，在本文中被称为“单体A”)的pI工程化远离单体B，或者单体A和单体B两者均可以随着单体A的pI增加和单体B的pI降低而改变。如所讨论的，任一个单体或两个单体的pI变化可以通过以下进行：去除或添加带电荷残基(例如，由带正电荷的氨基酸残基或带负电荷的氨基酸残基替代中性氨基酸，例如，谷氨酰胺到谷氨酸)、将带电荷残基从带正电或带负电改变为相反电荷(例如，天冬氨酸到赖氨酸)或将带电荷残基改变为中性残基(例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸)。多种这些变体示出在附图中。
因此，本发明的这个实施例提供了产生单体中的至少一个单体的充分pI变化，从而使得异源二聚体可以与同源二聚体分离。如本领域技术人员将了解的并且如下文中进一步讨论的，这可以通过以下来完成：使用“野生型”重链恒定区和已经工程化以增大或减小其pI的变体区(wt A:B+或wt A:B-)或增大一个区并减小另一个区(A+:B-或A-:B+)。
因此，通常，本发明的一些实施例的组分是恒定区中的氨基酸变体，所述氨基酸变体涉及通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入到单体中的一个或两个单体中来更改二聚体蛋白的单体中的至少一个单体(如果不是两个单体的话)的等电点(pI)。异源二聚体与两个同源二聚体的分离可以在两个单体的pI相差少至0.1个pH单位时完成，0.2个、0.3个、0.4个和0.5个或更多个pH单位可用于本发明。
如本领域技术人员将了解的，每一个或两个单体上要包含的用于得到良好分离的pI变体数量将部分地取决于组分的起始pI。换句话说，为了确定对哪个单体进行工程化或处于哪个“取向”(例如，更具阳性或更具阴性)，计算Fc结构域的序列，并且在一些情况下，计算与Fc结构域连接的一个或多个蛋白质结构域，并据此做出决定。如本领域已知的，不同的Fc结构域和/或蛋白质结构域将具有用于本发明中的不同起始pI。通常，如本文所概述的，pI被工程化以使各个单体的总pI差为至少约0.1log，如本文所概述的优选的是0.2到0.5。
此外，如本领域技术人员将了解的并且如本文所概述的，在一些实施例中，可以基于大小来使异源二聚体与同源二聚体分离。如图所示，例如，若干种形式允许基于大小来分离异源二聚体和同源二聚体。
在pI变体用于实现异源二聚化的情况下，通过使用一个或多个Fc结构域的一个或多个恒定区，提供了用于设计和纯化异源二聚体Fc融合蛋白的更模块化方法。因此，在一些实施例中，异源二聚化变体(包含偏斜和纯化异源二聚化变体)必须被工程化。另外，在一些实施例中，通过从不同的IgG同种型输入pI变体，由pI变体造成免疫原性的可能性显著降低，使得在未引入显著免疫原性的情况下改变pI。因此，要解决的另一个问题是阐明具有较高人序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置处的非人残基。
可能与这个pI工程化一起发生的负效应同样是血清半衰期延长和FcRn结合增加。换句话说，如USSN 13/194,904(通过引用以其全文并入)所描述的，降低抗体恒定结构域(包含在抗体和Fc融合中找到的那些)的pI可能导致血清保留在体内更长时间。具有增加的血清半衰期的这些pI变体也促进了pI变化以进行纯化。
另外，应注意，异源二聚化变体的pI变体给予了Fc融合蛋白的分析和质量控制过程另外的益处，因为在同源二聚体存在时消除、最小化和进行区分的能力是显著的。类似地，能够可靠地测试异源二聚体Fc融合蛋白产生的可重现性很重要。
A.异源二聚化变体
本发明提供了包含呈各种形式的异源二聚体Fc融合蛋白的异源二聚体蛋白，所述异源二聚体蛋白利用异源二聚体变体以允许异源二聚体形成和/或远离同源二聚体而纯化。异源二聚体融合构建体基于两个Fc结构域的自组装性质，例如，组装成“二聚体”的两个“单体”。
存在适合的多对异源二聚化偏斜变体组。这些变体以成“对”的“组”出现。换句话说，所述对中的一组并入第一单体中并且所述对中的另一组并入第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“孔中旋钮”变体，一个单体上的残基与另一个单体上的残基一一对应；也就是说，这些对组形成了两个单体之间的界面，所述界面鼓励异源二聚体形成并且不鼓励同源二聚体形成，从而允许在生物学条件下自发形成的异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚体A/A:50％异源二聚体A/B:25％同源二聚体B/B)。
B.空间变体
在一些实施例中，可以通过添加空间变体来促进异源二聚体形成。换句话说，通过改变每个重链中的氨基酸，相比于与相同的Fc氨基酸序列形成同源二聚体，不同的重链更有可能缔合形成异源二聚体结构。合适的空间变体包含在USSN 15/141,350的图29中以及图2中，所有所述文献特此通过引用以其全文并入。
一种机制在本领域中通常被称为“隆凸与孔”，是指产生空间影响以有利于异源二聚体形成并且不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846；Ridgway等人,《蛋白质工程化(Protein Engineering)》9(7):617(1996)；Atwell等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》1997 270:26；美国专利第8,216,805号，所有所述文献均特此通过引用以其全文并入。附图标识了依赖于“隆凸与孔”的多个“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等人,《自然生物技术(Nature Biotech.)》16:677(1998)所描述，这些“旋钮与孔”突变可以与二硫键组合以使形成向异源二聚化偏斜。
用于生成异源二聚体的另外的机制有时被称为“静电转向”，如Gunasekaran等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》285(25):19637(2010)所述，所述文献特此通过引用以其全文并入。这在本文中有时被称为“电荷对”。在此实施例中，静电用于使形成朝异源二聚化偏斜。如本领域的技术人员将理解的，这些电荷对还可能影响pI并因此影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些电荷对被生成为迫使异源二聚化并且不用作纯化工具，因此其被分类为“空间变体”。这些电荷包含但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如，这些是“单体”对应组)和与C220R/E224R/P228R/K409R.配对的C220E/P228E/368E
另外的单体A和单体B变体可以任选且独立地以任何数量与其它变体组合，如本文所概述的pI变体或US 2012/0149876的图37所示的其它空间变体，所有所述文献通过引用明确地并入本文。
在一些实施例中，本文所概述的空间变体可以任选且独立地与任何pI变体(或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等)并入到一个或两个单体中，并且可以独立且任选地包含在本发明的蛋白质中或并不包含在内。
合适的偏斜变体的列表在图2中找到。包含但不限于以下的成对的组特别用于一些实施例中：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。就命名法而言，“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指单体之一具有双变体组S364K/E357Q并且另一个具有双变体组L368D/K370S；如上，这些“链型”对取决于起始pI。
C.异源二聚体的pI(等电点)变体
通常，如本领域技术人员将了解的，存在两种一般类别的pI变体：增大蛋白质的pI(碱性变化)的变体和减小蛋白质的pI(酸性变化)的变体。如本文所描述的，可以使用这些变体的所有组合：一个单体可以属于野生型或是不显示出与野生型显著不同的pI的变体，并且另一个可以更具碱性或更具酸性。可替代地，可以改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。
pI变体的优选组合示出在USSN 15/141,350的图30中，所述所有文献通过引用以其全文并入本文。如本文所概述且如图中所示，这些变化是相对于IgG1示出的，但是所有同种型以及同种型杂交体均可以按此方式改变。在重链恒定结构域是来自IgG2-4的情况下，还可以使用R133E和R133Q。
在一个实施例中，如果Fc单体之一包含CH1结构域，则pI变体的优选的组合具有包括208D/295E/384D/418E/421D变体(N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，相对于人IgG1)的一个单体。在一些情况下，第二单体包括带正电的结构域接头，包含(GKPGS)4。在一些情况下，第一单体包含CH1结构域，包含位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体(例如，针对不在结构域之一上利用CH1结构域的异源二聚体Fc融合蛋白)中，优选的负pI变体Fc组包含295E/384D/418E/421D变体当相对于人IgG1时是(Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
在一些实施例中，在Fc结构域的铰链中进行突变，包含位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，pI突变以及特别地取代可以在位置216-230中的一个或多个位置中进行，其中1个、2个、3个、4个或5个突变可用于本发明中。同样，设想了单独或与其它结构域中的其它pI变体一起的所有可能的组合。
可用于降低铰链结构域的pI的特定取代包含但不限于位置221处的缺失、位置222处的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223处的缺失、位置224处的非天然谷氨酸、位置225处的缺失、位置235处的缺失和位置236处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，在铰链结构域中进行仅pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加到其它结构域中的其它pI变体。
在一些实施例中，可以在CH2区中进行突变，包含位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。应注意，可以进行233-236的改变以增加IgG2主链中的效应子功能(以及327A)。再次，可以对这14个位置进行所有可能的组合；例如，pI抗体可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个CH2 pI取代。
可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包含但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯基丙氨酸、位置300处的非天然苯基丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及CH2内和与其它结构域的所有可能的组合。
在此实施例中，突变可以独立地并且任选地选自位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444和447。可用于降低CH3结构域的pI的特定取代包含但不限于位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然甲硫氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸和位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。
D.同种型变体
另外，本发明的许多实施例依赖于特定位置处的pI氨基酸从一个IgG同种型到另一个的“输入”，由此降低或消除将不想要的免疫原性引入变体中的可能性。多个这些示出在通过引用合并在本文中的美国公开申请第2014/0370013的图21中，所述美国公开申请特此通过引用并入。也就是说，出于多种原因，IgG1是治疗性抗体的常用同种型，包含高效应子功能。然而，IgG1的重恒定区具有比IgG2的pI更高的pI(8.10对7.31)。通过将特定位置处的IgG2引入到IgG1主链中，所得单体的pI降低(或增高)并且另外表现出更长的血清半衰期。例如，IgG1具有位置137处的甘氨酸(pI为5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI为3.22)；输入谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所描述的，通常需要多个氨基酸取代来显著影响变体Fc融合蛋白的pI。然而，应注意，如下文所讨论的，即便是IgG2分子发生变化也会使血清半衰期增加。
在其它实施例中，进行了非同种型氨基酸改变，以便降低所得蛋白质的总电荷状态(例如，通过将较高pI氨基酸改为较低pI氨基酸)或为了稳定而调节结构等，如下文中更进一步描述的。
另外，通过pI工程化重恒定结构域和轻恒定结构域两者，可以看到异源二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。
E.计算pI
每个单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，所述总单体包含变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施例中，使用美国公开申请第2014/0370013号中的图19的图表，基于变体重链恒定结构域来计算pI变化。如本文所讨论的，要工程化哪个单体通常由每个单体的固有pI来决定。
F.还赋予了更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体减小单体的pI的情况下，其可以具有提高体内血清固位的附加益处。
虽然仍在审查中，但是据信，Fc区在体内具有较长的半衰期，因为在核内体中以pH6与FcRn的结合螯合了Fc(Ghetie和Ward,1997《今日免疫学(Immunol Today.)》18(12):592-598，所述文献特此通过引用整体并入)。核内体区室然后使Fc循环到细胞表面。一旦区室向胞外空间打开，则约7.4的较高pH诱导将Fc释放回到血液中。在小鼠中，Dall'Acqua等人示出了，在pH为6和pH为7.4时具有增加的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall'Acqua等人,2002,《免疫学杂志(J.Immunol.)》169:5171-5180，所述文献特此通过引用整体并入)。据认为，在pH为7.4时FcRn的Fc的增加的亲和力阻止将Fc释放回到血液中。因此，会增加Fc的体内半衰期的Fc突变将理想地增加较低pH时的FcRn结合，同时仍允许在较高pH时释放Fc。氨基酸组氨酸改变了其在6.0到7.4的pH范围下的电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置处发现His残基不足为奇。
存在多个如特此通过引用整体并入的USSN 12/341,769中具体公开的可用于增加与FcRn受体的结合并且增加血清半衰期的Fc取代包含但不限于434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I、434S、252Y/428L、252Y/434S、428L/434S、436V/428L和259I/308F/428L。
G.用于另外功能的另外Fc变体
除了pI氨基酸变体之外，存在出于各种原因可以进行的许多有用的Fc氨基酸修饰，包含但不限于更改与一个或多个FcγR的结合、与FcRn的更改结合等。
因此，本发明的蛋白质可以包含氨基酸修饰，包含本文所概述的异源二聚化变体，所述异源二聚化变体包含pI变体和空间变体。每组变体可以独立且任选地包含在任何特定异源二聚体蛋白中或不包含在内。
H.FcγR变体
因此，存在可以更改与Fcγ受体中的一个或多个的结合而进行的多个有用Fc取代。导致增加的结合以及减少的结合的取代可以是有用的。例如，已知与FcγRIIIa增加的结合导致了增加的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；其中表达FcγR的非特异性毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导的反应)。类似地，与FcγRIIb(抑制性受体)的减少结合在一些情形下也可以是有益的。用于本发明的氨基酸取代包含USSN11/124,620(尤其是图41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406所列出的氨基酸取代，所有所述文献均通过引用以其全文明确地并入本文中并且特别用于本文所公开的变体。所使用的特定变体包含但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
另外，在本文概述的Fc结构域变体中还可以包含增加对FcγRIIc的亲和力的氨基酸取代。在例如USSN 11/124,620和14/578,305中描述的取代是有用的。
I.消融变体
类似地，另一类别的功能变体是“FcγR消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施例中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其它作用机制。也就是说，例如，在许多实施例中，尤其是在使用免疫调节蛋白时，期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性使得Fc结构域之一包括一个或多个Fcγ受体消融变体。USSN15/141,350的图31中描绘了这些消融变体，所有所述文献通过引用以其全文并入本文，并且所述消融变体各自可以独立且任选地包含在内或不包含在内，优选的方面利用了选自由以下组成的组的消融变体：根据EU索引的G236R/L328R,E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应注意本文中提及的消融变体消融FcγR结合，但是通常不消融FcRn结合。
J.异源二聚体变体和Fc变体的组合
如本领域技术人员将了解的，所有所列举的异源二聚化变体(包含偏斜变体和/或pI变体)可以以任何方式任选且独立地组合，只要其保持其“链型”或“单体分隔”即可。另外，所有这些变体可以组合成异源二聚化形式中的任何异源二聚化形式。
在pI变体的情况下，虽然附图中示出了特别有用的实施例，但是可以遵循改变两个单体之间的pI差以促进纯化的基本规则，生成其它组合。
另外，如本文总体上概述的，异源二聚化变体、偏斜和pI中的任何一个也可以都与Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体独立地且任选地组合。
另外，单体Fc结构域可以包括包含C220S/S267K/L368D/K370S或C220S/S267K/S364K/E357Q.的一组氨基酸取代
另外，异源二聚体Fc融合蛋白可以包括偏斜变体(例如，USSN 15/141,350的图1A-1C中所示的一组氨基酸取代，所有所述文献全部通过引用以其全文并入本文)，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V:T366W；和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，任选地消融变体，任选地带电结构域接头；以及任选地pI变体。
在一些实施例中，Fc结构域包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：根据EU索引的236R、S239D、S239E、F243L、M252Y、V259I、S267D、S267E、S67K、S298A、V308F、L328F、L328R、330L、I332D、I332E、M428L、N434A、N434S、236R/L328R、S239D/I332E、236R/L328F、V259I/V308F、S267E/L328F、M428L/N43S、Y436I/M428L、N436V/M428L、V436I/N434S、Y436V/N434S、S239D/I332E/330L、M252Y/S54T/T256E、V259I/V308F/M428L、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K。
在一个实施例中，用于本发明的偏斜变体和pI变体的特定组合是T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，其中一种单体包括Q295E/N384D/Q418E/N481D，并且另一种单体包括带正电的结构域接头。如本领域将了解的，“孔中旋钮”变体不改变pI，并且因此可以用在任一单体上。
IV.同源二聚体Fc融合蛋白
在一些方面中，本发明涉及包含Fc区的同源二聚体Fc融合蛋白，所述Fc区通常(任选地通过结构域接头)与一个或多个不同的蛋白质结构域连接。图14和图48通常示出了这些形式。在一方面中，同源二聚体Fc融合蛋白是IL-12同源二聚体Fc融合蛋白，包含处于不同取向的IL-12p40和IL-12p35亚基，使得其一起存在以与IL-12Rβ1/β2的IL-12受体复合物结合。Fc结构域可以衍生自IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域，其中IgG1和IgG4 Fc结构域在本发明中找到特定用途。如本文所描述的，IgG1 Fc结构域可以经常但不总是与消融变体结合使用以消融效应子功能。类似地，当期望低效应子功能时，可以使用IgG4 Fc结构域。
在一方面中，同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述蛋白从N端到C端包括IL-12p40亚基-任选的接头-IL-12p35亚基-任选的接头-Fc结构域。在一些实施例中，同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述蛋白从N端到C端包括IL-12p40亚基-接头-IL-12p35亚基-接头-Fc结构域。在图48A中提供了实施例的实例。
在另一方面中，同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述蛋白从N端到C端包括IL-12p35亚基-任选的接头-IL-12p40亚基-任选的接头-Fc结构域。在一些实施例中，同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述蛋白从N端到C端包括IL-12p35亚基-接头-IL-12p40亚基-接头-Fc结构域。在图48B中提供了实施例的实例。
在另一方面中，同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述蛋白从N端到C端包括Fc结构域-任选的接头-IL-12p40亚基-任选的接头-IL-12p35亚基。在一些实施例中，包括第一单体和第二单体的同源二聚体Fc融合蛋白从N端到C端包括Fc结构域-接头-IL-12p40亚基-接头-IL-12p35亚基。在图48C中提供了实施例的实例。
在另一方面中，同源二聚体Fc融合蛋白包括第一单体和第二单体，所述蛋白从N端到C端包括Fc结构域-任选的接头-IL-12p35亚基-任选的接头-IL-12p40亚基。在一些实施例中，包括第一单体和第二单体的同源二聚体Fc融合蛋白从N端到C端包括Fc结构域-接头-IL-12p35亚基-接头-IL-12p40亚基。在图48D中提供了实施例的实例。
在一些实施例中，二价IL-12p40-Fc形式提供了同源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)IL-12p40结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)第一变体Fc结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)IL-12p40结构域蛋白；ii)任选地第二结构域接头；iii)第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，二价IL-12p35-Fc形式提供了同源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)IL-12p35结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)第一变体Fc结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)IL-12p35结构域蛋白；ii)任选地第二结构域接头；iii)第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式提供了同源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)IL-12p40结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p35结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)第一变体Fc结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)IL-12p40结构域蛋白；ii)任选地第三结构域接头；iii)IL-12p35结构域蛋白；iv)任选地第四结构域接头；v)第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，(scIL-12(p35/p40))2-Fc形式提供了同源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)IL-12p35结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p40结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)第一变体Fc结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)IL-12p35结构域蛋白；ii)任选地第三结构域接头；iii)IL-12p40结构域蛋白；iv)任选地第四结构域接头；v)第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，Fc-(scIL-12(p40/p35))2形式提供了同源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)第一变体Fc结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p40结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)IL-12p35结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)第二变体Fc结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p40结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)IL-12p35结构域蛋白。
在一些实施例中，Fc-(scIL-12(p35/p40))2形式提供了同源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)第一变体Fc结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p35结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)IL-12p40结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)第二变体Fc结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p35结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)IL-12p40结构域蛋白。
在一些实施例中，第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一结构域接头和所述第二结构域接头具有不同的氨基酸序列。
在一些实施例中，Fc变体包括如本文提供的一种或多种偏斜、pI和消融变体。在一个实施例中，Fc变体包括特定的偏斜、pI和消融变体。在一些实施例中，促进第一Fc结构域和第二Fc结构域的同源二聚化的修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
以此形式，有用的IL-12p40蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p35蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，有用的实施例包含但不限于图14A-14B和图15中找到的那些。
同源二聚体Fc融合蛋白的潜在实施例可以使用上文标题为“异源二聚体Fc融合蛋白”的部分中描述的方法和组合物，如出于适当地产生同源二聚体而不是异源二聚体的目的。同源二聚体Fc融合蛋白的潜在实施例可以使用本文描述的方法和组合物的任何组合。
V.白介素12
本发明涉及白介素12的生物功能形式。与野生型IL-12(包含p40/p35异源二聚体和p40同源二聚体)相比，包括IL-12p40变体和/或IL-12p35变体的IL-12异源二聚体Fc蛋白与IL-12受体的结合亲和力降低或下降。与野生型IL-12相比，本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白的效力降低或下降。IL-12异源二聚体Fc蛋白的血清半衰期延长或增加。IL-12异源二聚体Fc蛋白的毒性潜力降低或下降。本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白在诱导如但不限于T细胞和NK细胞等免疫细胞的STAT4磷酸化方面的效力降低或下降。IL-12p40变体包括去除潜在的N-糖基化位点的氨基酸修饰(例如，取代、添加和缺失)。IL-12p35变体包括去除潜在的N-糖基化位点的氨基酸修饰(例如，取代、添加和缺失)。在一些实施例中，与野生型IL-12相比，本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白的糖基化降低或下降。在一些实施例中，本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白的糖基化状态不同于野生型IL-12蛋白的糖基化状态。与野生型IL-12相比，本发明的IL-12异源二聚体Fc蛋白的药代动力学改善了。而且，与野生型IL-12相比，此类IL-12异源二聚体Fc蛋白在治疗上有效并且具有改善的治疗指数。IL-12本发明的异源二聚体Fc蛋白可以促进/诱导T细胞活化。在一些实施例中，向患者施用IL-12异源二聚体Fc蛋白中的任一种诱导了患者中的T细胞活化。在一些情况下，施用诱导患者中的IFN-γ分泌。在一些情况下，施用IL-12异源二聚体Fc蛋白诱导患者淋巴细胞的扩增。IL-12异源二聚体Fc蛋白可用于治疗癌症，如实体瘤癌症或液体瘤癌症。在一些实施例中，向患者施用IL-12异源二聚体Fc蛋白中的任一种，并且在某些情况下，与检查点阻断剂组合施用减小了肿瘤大小。
如上所述，白介素12或“IL-12”的生物功能形式是异源二聚体，由IL-12p35亚基(IL-12亚基α)和IL-12p40亚基(IL-12亚基β)构成，在此被指定为“IL-12异源二聚体复合物”。此复合物可以以两种不同的形式使用。如图8A-B所示，IL-12p40亚基和IL-12p35亚基彼此不共价连接，而是与组装作为异源二聚体的第一Fc结构域和第二Fc结构域分别共价连接。可替代地，可以任选地使用(如本文所描述的)结构域接头共价连接IL-12p35和IL-12p40亚基，如图8C-F通常所示，在此被指定为单链IL-12复合物或“scIL-12”。scIL-12中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p35亚基连接，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p40亚基连接。
在一些实施例中，人IL-12p35蛋白具有在NCBI参考Seq.No.NP_000873.2或SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列(如图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)。在一些情况下，人IL-12p35的编码序列在NCBI参考Seq.No.NM_000882.3中示出。本文概述的Fc融合异源二聚体蛋白的示例性IL-12p35蛋白可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(如图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)或SEQ ID NO:1的氨基酸23-219。在一些实施例中，IL-12p35蛋白与SEQ ID NO:2具有至少90％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。Fc融合蛋白的IL-12p35蛋白可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸突变。
在一些实施例中，人IL-12p40蛋白具有在NCBI参考Seq.No.NP_002178.3或SEQ IDNO:3中列出的氨基酸序列(如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)。在一些情况下，人IL-12p40的编码序列在NCBI参考Seq.No.NM_002187.3中示出。本文概述的Fc融合二聚体蛋白的示例性IL-12p40蛋白可以具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)或SEQ ID NO:3的氨基酸23-328。在一些实施例中，IL-12p40蛋白与SEQ ID NO:4具有至少90％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。Fc融合蛋白的IL-12p40蛋白可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸突变。
本发明还提供了变体IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基。这些变体可用于本文描述的生物功能IL-12复合物以及IL-12-Fc融合物中的任何融合物的一部分。
A.表达变体
作为引文，本发明的IL-12p40和IL-12p35亚基还包含用于去除旨在减少异质性的潜在的N-糖基化位点的变体。
可以引入氨基酸修饰的IL-12p40上的此类潜在的N-糖基化位点包含N103、N113、N200和N281(根据如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)。这些位点中的一个或多个位点处的说明性修饰可以选自由以下组成的组：N103D、N103Q、N113D、N113Q、N200D、N200Q、N281D和N281Q。IL-12p40表达变体可以包含这些位点处的一个或多个修饰。因此，在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D/N200D/N281D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N200D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N281D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N113D/N200D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N113D/N281D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N200D/N281D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D/N200D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D/N281D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N/103D/N200D/N281D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N113D/N200D/N281D。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N113Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N200Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N281Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N113Q/N200Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N113Q/N281Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N113Q/N200Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N113Q/N281Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N200Q/N281Q。在一个实施例中，IL-12p40变体包括N113Q/N200Q/N281Q。这些修饰可以单独使用，或者与任何其它IL-12p40变体(如亲和力变体)组合使用。
IL-12p35上的位点中的一个或多个位点处可以引入氨基酸修饰的此类潜在N-糖基化位点选自由以下组成的组：N71、N85和N195(根据如图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列进行编号)。这些位点处的说明性修饰包含N71D、N71Q、N85D、N85Q、N195D和N195Q。IL-12p35表达变体可以包含这些位点处的一个或多个修饰。因此，在一个实施例中，IL-12p35变体包括N71D/N85D/N195D。这些修饰可以单独使用或与任何其它IL-12p35变体(如亲和性变体)组合使用。
IL-12p40亚基在位置252处具有游离半胱氨酸(根据如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)，所述半胱氨酸可以与其它游离半胱氨酸结合，至少导致异质性并且导致免疫原性差。因此，例如通过引入C252S修饰(尽管也可以使用其它取代)来工程化IL-12p40变体以去除游离半胱氨酸。C252的修饰(例如，C252S)可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力或表达变体)组合使用。在图65中描绘了说明性IL-12p40变体，其包括C252处的修饰以去除游离半胱氨酸。说明性IL-12-Fc融合蛋白与另外的变体IL-12p40亚基一起产生，其序列在图66中进行了描绘，并如实例1B中通常描述的来产生。这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力变体)组合使用。
B.亲和力变体和效力变体
本发明提供了IL-12p40变体和IL-12p35变体，所述变体形成对IL-12受体的结合亲和力发生改变(降低或增加)的生物功能IL-12。在一些情况下，变体IL-12p40亚基对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变(降低或增加)的结合亲和力。在一些情况下，变体IL-12p35对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变(降低或增加)的结合亲和力。本发明还提供了IL-12p40变体和IL-12p35变体，相对于野生型IL-12p40和IL-12p35，所述变体形成效力发生改变(降低或增加)的生物功能IL-12。
IL-12p40上的可以引入氨基酸修饰的合适位点选自由以下组成的组：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299(根据如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)。这些位点处的说明性修饰可以选自由以下组成的组：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。IL-12p40亲和力变体可以包含这些位点中的一个或多个位点处的修饰。因此，在一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D/N200D/N281D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括Q42E/E45Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E45Q/Q56E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括Q42E/E59Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括Q56E/E59Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括Q42E/E45Q/Q56E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E45Q/Q56E/E59Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E32Q/E59Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括D34N/E59K。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括D34N/E59K/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括D34K/E59K/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E32Q/D34N/E59K/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E32K/D34N/E59K/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括D34N/E59Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59Q/E187Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括S43E/E59Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括S43K/E49Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59Q/K163E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59Q/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59Q/K258E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59Q/K260E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括D18K/E59K/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99Y。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59Y/K99Y。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59Y/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E45K/E59K/K99E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/Q144E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/Q144K。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/R159E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括D18K/E59K/K99E/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括DI8K/E59K/K99E/C252S。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括D18K/E59K/K99E/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99Y/C252S。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/C252S。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N200D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N281D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N113D/N200D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N113D/N281D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N200D/N281D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D/N200D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N113D/N281D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103D/N200D/N281D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N113D/N200D/N281D。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N113Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N200Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N281Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N113Q/N200Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N113Q/N281Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N200Q/N281Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N113Q/N200Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N113Q/N281Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N200Q/N281Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N113Q/N200Q/N281Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括N103Q/N113Q/N200Q/N281Q。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。在另一个实施例中，IL-12p40变体包括E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
另外，这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如表达变体)组合使用。
IL-12p40亚基在位置252处具有游离半胱氨酸(根据如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)，所述半胱氨酸可以与其它游离半胱氨酸结合，至少导致异质性并且导致免疫原性差。因此，例如通过引入C252S修饰(尽管也可以使用其它取代)来工程化IL-12p40变体以去除游离半胱氨酸。C252的修饰(例如，C252S)可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力或表达变体)组合使用。在图65中描绘了说明性IL-12p40变体，其包括C252处的修饰以去除游离半胱氨酸。说明性IL-12-Fc融合蛋白与另外的变体IL-12p40亚基一起产生，其序列在图66中进行了描绘，并如实例1B中通常描述的来产生。另外，这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如表达变体)组合使用。
IL-12p35上的可以引入氨基酸修饰的合适位点选自由以下组成的组：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、F96、M97、L89、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193和A196(根据如图1所描绘的人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列进行编号)。说明性修饰选自由以下组成的组：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。IL-12p35亲和力变体可以包含这些位点中的一个或多个位点处的修饰。因此，在一个实施例中，IL-12p35变体包括N71D/N85D/N195D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N151D/E153Q。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N151D/D165N。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括Q130E/N151D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N151D/K158E。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括E79Q/N151D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括D55Q/N151D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N136D/N151D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N21D/N151D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括E143Q/N151D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N71Q/N85Q。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N71Q/N195Q。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N85Q/N195Q。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N71Q/N85Q/N195Q。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N71D/N85D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N71D/N195D。在另一个实施例中，IL-12p35变体包括N85D/N195D。
另外，这些修饰可以单独使用或者与其它任何IL-12p35变体(如表达变体)组合使用。
生物功能IL-12异源二聚体复合物可以包括野生型IL-12p40亚基和野生型IL-12p35亚基、变体IL-12p40亚基和野生型IL-12p35亚基、野生型IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基或变体IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基。
生物功能IL-12二价同源二聚体复合物可以包括野生型IL-12p40亚基和野生型IL-12p35亚基、变体IL-12p40亚基和野生型IL-12p35亚基、野生型IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基或变体IL-12p40亚基和变体IL-12p35亚基。
VI.结构域接头
在一些实施例中，IL-12p35和IL-12p40亚基通过接头连接在一起。任选地，亚基不通过接头连接。在其它实施例中，IL-12p35和IL-12p40亚基不共价连接。在一些实施例中，IL-12p35亚基通过接头与Fc结构域连接。在某些实施例中，IL-12p35亚基直接与Fc结构域连接，如不通过接头。在其它实施例中，IL-12p40亚基通过接头与Fc结构域连接。在其它实施例中，IL-12p40亚基直接与Fc结构域连接。在一些情况下，不使用接头将IL-12p35亚基或IL-12p40亚基与Fc结构域连接。
在一些实施例中，接头是“结构域接头”，用于将本文概述的任何两个结构域连接在一起。虽然可以使用任何适合的接头，但是许多实施例利用甘氨酸-丝氨酸聚合物以及允许以足够允许每个结构域保持其生物功能的长度和柔性来重组连接这两个结构域的任何肽序列，所述甘氨酸-丝氨酸聚合物包含例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为0(并且通常为0到1到2到3到4到5)的整数。在某些情况下，有用的接头包含(GGGGS)0或(GGGGS)1或(GGGGS)2。图6中描绘了说明性结构域接头。在一些情况下并且在注意“链型”时，如下文所概述的，如本文所讨论的可以使用带电荷的结构域接头。
另外，先前已经报道Fc融合物中的Gly-Ser接头中的丝氨酸可能经受O-糖基化。因此，降低异质性的最终方法(在Fc融合物的上下文中)是用Gly-Ala接头替代迄今为止使用的Gly-Ser接头。
VII.本发明的有用形式
如图8A-F所示，本发明的异源二聚体融合蛋白存在许多有用的形式。通常，本发明的异源二聚体融合蛋白具有两个功能组分：IL-12异源二聚体组分和Fc组分，两者都可以采取与本文概述的形式不同的形式，并且两者都可以以任何配置与其它组分组合。
在一些实施例中，IL-12p35和IL-12p40亚基任选地用结构域接头共价连接，并且在本文中被称为单链IL-12复合物或“scIL-12”。scIL-12可以包括在N端与IL-12p40连接的IL-12p35或在N端与IL-12p35连接的IL-12p40，任选地具有结构域接头。scIL-12中两个亚基的顺序可以指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p35亚基连接，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p340亚基连接。
在一些实施例中，IL-12p35亚基和IL-12p40亚基不共价连接，而是与组装作为异源二聚体的第一Fc结构域和第二Fc结构域分别共价连接。
第一Fc结构域和第二Fc结构域可以具有选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的a)L368D/K370S和S364K；b)L368D/K370S和S364K/E357L；c)L368D/K370S和S364K/E357Q；d)S267K/L368D/K370S；e)T411E/K360E/Q362E和D401K；f)L368E/K370S和S364K；g)K370S和S364K/E357Q；和h)T366S/L368A/Y407V和T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C)。
在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
任选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
任选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有用于延长半衰期的428L/434S变体。
A.IL-12-异源Fc形式
在一个实施例中，本发明提供了N端IL-12异源二聚体Fc融合物或“IL-12-异源Fc”形式。在此实施例中，如图8A所示，异源二聚体融合蛋白包括两个单体。第一单体(从N端到C端)包括IL-12p40-任选的结构域接头-Fc。第二单体(从N端到C端)包括IL-12p35-任选的结构域接头-Fc。
在IL-12-异源Fc形式中，优选的实施例利用了偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在IL-12-异源Fc形式中，优选的实施例示出在图9中(XENP27201包含链1链2)。
在一些实施例中，IL-12-异源Fc形式提供了异源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)IL-12p40结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)第一变体Fc结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)IL-12p35结构域蛋白；ii)任选地第二结构域接头；iii)第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，Fc变体包括如本文提供的一种或多种偏斜、pI和消融变体。在一个实施例中，Fc变体包括特定的偏斜、pI和消融变体。在一些实施例中，促进第一Fc结构域和第二Fc结构域异源二聚化的修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
以此形式，有用的IL-12p40蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p35蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于IL-12p40(E59K/K99Y)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E)和IL-12p35(SEQ IDNO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99Y/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)和IL-12p40(E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于包括SEQID NO:2的IL-12p35(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)和变体IL-12p40的组合，所述变体包含以下一个或多个取代，包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p40和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包含SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)的IL-12p40和包括以下的IL-12p35的组合：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，IL-12p40变体和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代的IL-12p40变体的组合：E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E；并且IL-12p35变体包括选自由以下组成的组的一个或多个取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，有用的实施例包含但不限于其中变体IL-12p40亚基结构域使用第一结构域接头与所述第一Fc结构域连接和/或所述IL-12p35亚基结构域使用第二结构域接头与所述第二Fc结构域连接的实施例。
以此形式，有用的实施例包含但不限于XENP31251、XENP31254、XENP31258、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190和XENP32191。在另外的实施例中，XENP31251、XENP31254、XENP31258、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190和XENP32191包含另外的糖工程化。
以此形式，有用的实施例包含但不限于图44A-44K和图66A-66Q中找到的那些。
B.异源Fc-IL-12形式
在另一个实施例中，本发明提供了C端IL-12异源二聚体Fc融合物或“异源Fc-IL-12”形式。在此实施例中，如图8B所示，异源二聚体融合蛋白包括两个单体。第一单体(从N端到C端)包括Fc-任选的结构域接头-IL-12p40。第二单体(从N端到C端)包括Fc-任选的结构域接头-IL-12p35。
在异源Fc-IL-12形式中，优选的实施例利用了偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在IL-12-异源Fc形式中，优选的实施例示出在图10中(XENP27202包含链1链2)。
在一些实施例中，异源Fc-IL-12形式提供了异源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)第一变体Fc结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p40结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括：i)第二变体Fc结构域蛋白；ii)任选地第二结构域接头；iii)IL-12p35结构域蛋白。
在一些实施例中，Fc变体包括如本文提供的一种或多种偏斜、pI和消融变体。在一个实施例中，Fc变体包括特定的偏斜、pI和消融变体。在一些实施例中，促进第一Fc结构域和第二Fc结构域异源二聚化的修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
以此形式，有用的IL-12p40蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p35蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于IL-12p40(E59K/K99Y)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E)和IL-12p35(SEQ IDNO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99Y/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)和IL-12p40(E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于包括SEQID NO:2的IL-12p35(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)和变体IL-12p40的组合，所述变体包含以下一个或多个取代，包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p40和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包含SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)的IL-12p40和包括以下的IL-12p35的组合：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，IL-12p40变体和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代的IL-12p40变体的组合：E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E；并且IL-12p35变体包括选自由以下组成的组的一个或多个取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，有用的实施例包含但不限于图10中找到的那些。
C.scIL-12-Fc形式
在另外的实施例中，本发明提供了N端单链IL-12-Fc融合物或“scIL-12-Fc”形式。在此实施例中，如图8C-D所示，异源二聚体融合蛋白包括两个单体。第一单体(从N端到C端)包括scIL-12-任选的结构域接头-Fc。第二单体包括“空”Fc，其包括铰链-CH2-CH3的全部或部分。scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p35亚基连接，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p40亚基连接。
在scIL-12-Fc形式中，优选的实施例利用了偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在scIL-12-Fc形式中，优选的实施例在图11中示出为XENP24203(包含链1和链2)和XENP24204(包含链1和链2)。
在scIL-12-Fc形式中，优选的实施例在图50中示出为XENP31290(包含链1和链2)。
在一些实施例中，scIL-12-Fc形式是二价IL-12-Fc融合物。在一些实施例中，二价IL-12-Fc融合形式(图48A-B)包括两个相同的单体，每个单体各自包括与同源二聚体Fc链的N端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。
在一些实施例中，scIL-12-Fc形式异源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)IL-12p40结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p35结构域蛋白；iv)任选的第二接头；v)第一变体Fc结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体包括第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，scIL-12-Fc形式异源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)IL-12p35结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p40结构域蛋白；iv)任选的第二接头；v)第一变体Fc结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体包括第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，Fc变体包括如本文提供的一种或多种偏斜、pI和消融变体。在一个实施例中，Fc变体包括特定的偏斜、pI和消融变体。在一些实施例中，促进第一Fc结构域和第二Fc结构域异源二聚化的修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
以此形式，有用的IL-12p40蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p35蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于IL-12p40(E59K/K99Y)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E)和IL-12p35(SEQ IDNO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99Y/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)和IL-12p40(E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于包括SEQID NO:2的IL-12p35(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)和变体IL-12p40的组合，所述变体包含以下一个或多个取代，包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p40和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包含SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)的IL-12p40和包括以下的IL-12p35的组合：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，IL-12p40变体和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代的IL-12p40变体的组合：E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E；并且IL-12p35变体包括选自由以下组成的组的一个或多个取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，有用的实施例包含但不限于图11中找到的那些。
D.Fc-scIL-12形式
在另外的实施例中，本发明提供了C端单链IL-12-Fc融合物或“Fc-scIL-12”形式。在此实施例中，如图8E-F所示，异源二聚体融合蛋白包括两个单体。第一单体(从N端到C端)包括Fc-任选的接头-scIL-12。第二单体包括“空”Fc，其包括铰链-CH2-CH3的全部或部分。如上所述，scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p35亚基连接，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p40亚基连接。
在Fc-scIL-12形式中，优选的实施例利用了偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。
在一些实施例中，scIL-12-Fc形式是二价IL-12-Fc融合物。在一些实施例中，二价IL-12-Fc融合形式(图48C-D)包括两个相同的单体，每个单体各自包括与同源二聚体Fc链的C端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。
在一些实施例中，scIL-12-Fc形式提供了异源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)第一变体Fc结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p40结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)IL-12p35结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体包括第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，scIL-12-Fc形式提供了异源二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白包括：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括：i)第一变体Fc结构域蛋白；ii)任选的第一结构域接头；iii)IL-12p35结构域蛋白；iv)任选的第二结构域接头；v)IL-12p40结构域蛋白；以及b)第二单体，所述第二单体包括第二变体Fc结构域蛋白。
在一些实施例中，Fc变体包括如本文提供的一种或多种偏斜、pI和消融变体。在一个实施例中，Fc变体包括特定的偏斜、pI和消融变体。在一些实施例中，促进第一Fc结构域和第二Fc结构域异源二聚化的修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
以此形式，有用的IL-12p40蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。以此形式，有用的IL-12p40变体包含但不限于N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p35蛋白质结构域包含但不限于SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。以此形式，有用的IL-12p35变体包含但不限于N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于IL-12p40(E59K/K99Y)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E)和IL-12p35(SEQ IDNO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99Y/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)、IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)和IL-12p40(E59K/K99E/C252S)和IL-12p35(SEQ ID NO:2)。
以此形式，变体IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的有用组合包含但不限于包括SEQID NO:2的IL-12p35(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)和变体IL-12p40的组合，所述变体包含以下一个或多个取代，包含但不限于E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
以此形式，IL-12p40和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包含SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)的IL-12p40和包括以下的IL-12p35的组合：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
以此形式，IL-12p40变体和IL-12p35变体的有用组合包含但不限于包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代的IL-12p40变体的组合：E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q、E299Q、N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E；并且IL-12p35变体包括选自由以下组成的组的一个或多个取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D、N195Q、N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
VIII.本发明的有用实施例
如本领域的技术人员将理解的并且如下文更全面地讨论的，本发明的异源二聚体融合蛋白可以采取各种配置，如图8A-F中总体上描绘的。示例性融合蛋白的氨基酸序列在图9-11中提供。
本文概述的实施例中的许多实施例通常依赖于包括第一单体(第一融合蛋白)和第二单体(第二融合蛋白)的形式，所述第一单体包括共价连接(任选地通过结构域接头)到第一Fc结构域的N端的IL-12p35亚基结构域，所述第二单体包括共价连接(任选地通过结构域接头)到第二Fc结构域的N端的IL-12p40亚基结构域。此形式的示例性实施例包含但不限于XENP27201。在另外的实施例中，第一单体具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQID NO:XX(XENP27201链1)、ii)SEQ ID NO:XX(XenD24752)；iii)SEQ ID NO:XX(XenD24753)；iv)SEQ ID NO:XX(XenD24754)；v)SEQ ID NO:XX(XenD24755)；vi)SEQ IDNO:XX(XenD24756)；vii)SEQ ID NO:XX(XenD24757)；viii)SEQ ID NO:XX(XenD24758)；ix)SEQ ID NO:XX(XenD24759)；x)SEQ ID NO:XX(XenD24760)；xi)SEQ ID NO:XX(XenD24761)；xii)SEQ ID NO:XX(XenD24762)；xiii)SEQ ID NO:XX(XenD24763)；xiv)SEQ ID NO:XX(XenD24764)；xv)SEQ ID NO:XX(XenD24765)；xvi)SEQ ID NO:XX(XenD24766)；xvii)SEQID NO:XX(XenD24767)；xviii)SEQ ID NO:XX(XenD24768)；xix)SEQ ID NO:XX(XenD24769)；xx)SEQ ID NO:XX(XenD24770)；xxi)SEQ ID NO:XX(XenD24771)；xxii)SEQID NO:XX(XenD24772)；xxiii)SEQ ID NO:XX(XenD24773)；xxiv)SEQ ID NO:XX(XenD24774)；xxv)SEQ ID NO:XX(XenD24775)；xxvi)SEQ ID NO:XX(XenD24776)；xxvii)SEQ ID NO:XX(XenD24777)；xxviii)SEQ ID NO:XX(XenD24778)；xxix)SEQ ID NO:XX(XenD24792)；xxx)SEQ ID NO:XX(XenD25922)；xxxi)SEQ ID NO:XX(XenD25923)；xxxii)SEQ ID NO:XX(XenD25924)；xxxiii)SEQ ID NO:XX(XenD25925)；xxxiv)SEQ ID NO:XX(XenD25926)；xxxv)SEQ ID NO:XX(XenD25927)；xxxvi)SEQ ID NO:XX(XenD25928)；xxxvii)SEQ ID NO:XX(XenD25929)；xxxviii)SEQ ID NO:XX(XenD25930)和xxxix)SEQ IDNO:XX(XenD25931)；并且第二单体具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:XX(XENP27201链2)；ii)SEQ ID NO:XX(XenD24779)；iii)SEQ ID NO:XX(XenD24780)；iv)SEQID NO:XX(XenD24781)；v)SEQ ID NO:XX(XenD24782)；vi)SEQ ID NO:XX(XenD24783)；vii)SEQ ID NO:XX(XenD24784)；viii)SEQ ID NO:XX(XenD24785)；ix)SEQ ID NO:XX(XenD24786)；x)SEQ ID NO:XX(XenD24787)；xi)SEQ ID NO:XX(XenD24788)；xii)SEQ IDNO:XX(XenD24789)；xiii)SEQ ID NO:XX(XenD24790)；xiv)SEQ ID NO:XX(XenD24791)；xv)SEQ ID NO:XX(XenD25911)；xvi)SEQ ID NO:XX(XenD25912)；xvii)SEQ ID NO:XX(XenD25913)；xviii)SEQ ID NO:XX(XenD25914)；xix)SEQ ID NO:XX(XenD25915)；xx)SEQID NO:XX(XenD25916)；xxi)SEQ ID NO:XX(XenD25917)；xxii)SEQ ID NO:XX(XenD25918)；xxiii)SEQ ID NO:XX(XenD25919)；xxiv)SEQ ID NO:XX(XenD25920)和xxv)SEQ ID NO:XX(XenD25921)。特定的此类实施例包含但不限于：XENP27201、XENP28820、XENP28821、XENP28822、XENP28823、XENP28824、XENP28825、XENP28826、XENP28827、XENP28828、XENP28829、XENP28830、XENP28831、XENP28832、XENP28833、XENP28834、XENP28835、XENP28836、XENP28837、XENP28838、XENP28839、XENP28840、XENP28841、XENP28842、XENP28843、XENP28844、XENP28845、XENP28846、XENP28847、XENP28848、XENP28849、XENP28850、XENP28851、XENP28852、XENP29949、XENP29950、XENP29951、XENP29952、XENP30597、XENP30598、XENP30599、XENP30600、XENP30601、XENP30602、XENP30603、XENP30604、XENP30605、XENP30606、XENP30307、XENP30308、XENP30609、XENP31250、XENP31251、XENP31252、XENP31253、XENP31254、XENP31255、XENP31256、XENP31257、XENP31258、XENP31259、XENP31260、XENP31261、XENP31262、XENP31263、XENP31264、XENP31265、XENP31286、XENP31142、XENP31143、XENP31144、XENP31145、XENP31146、XENP31582、XENP31583、XENP31584、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190、XENP32191、XENP32991、XENP32992、XENP32993、XENP32994、XENP32995、XENP32996、XENP32997、XENP32998、XENP32999、XENP33000、XENP33001、XENP33002、XENP33003、XENP33004、XENP33005、XENP33006、XENP33007、XENP33008、XENP33008、XENP33009、XENP33010和XENP33011。异源二聚体Fc融合蛋白的有用实施例包括第一单体(第一融合蛋白)和第二单体(第二融合蛋白)的形式，所述第一单体包括共价连接(任选地通过结构域接头)到第一Fc结构域的C端的IL-12p35亚基结构域，所述第二单体包括共价连接(任选地通过结构域接头)到第二Fc结构域的C端的IL-12p40亚基结构域。此形式的示例性实施例包含但不限于XENP27202。
异源二聚体Fc融合蛋白的另一个有用的实施例包括第一单体(第一融合蛋白)和第二Fc结构域(例如，空的Fc结构域)，所述第一单体包括共价连接(任选地通过结构域接头)到第一Fc结构域的N端的单链IL-12复合物(“scIL-12”)。scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p35亚基连接，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p40亚基连接。此形式的示例性实施例包含但不限于XENP27203和XENP27204。
异源二聚体Fc融合蛋白的另外的有用的实施例包括第一单体(第一融合蛋白)和第二Fc结构域(例如，空的Fc结构域)，所述第一单体包括共价连接(任选地通过结构域接头)到第一Fc结构域的C端的单链IL-12复合物(“scIL-12”)。scIL-12可以是“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p35亚基连接，或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35(使用或者不使用结构域接头)在N端与IL-12p40亚基连接。
对于本文概述的异源二聚体Fc融合蛋白中的任何异源二聚体Fc融合蛋白，在第一单体、第二单体上和/或scIL-12中使用的任选的结构域接头可以相同或不同。另外，异源二聚体蛋白的第一Fc结构域和第二Fc结构域的氨基酸序列可以不同。
本发明的Fc结构域包括IgG Fc结构域，例如，IgG1 Fc结构域。在一些实施例中，第一Fc结构域和第二Fc结构域包括选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。在一些情况下，本文概述的异源二聚体Fc融合形式中的任何异源二聚体Fc融合形式的第一Fc结构域和/或第二Fc结构域可以具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。在一些实施例中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
另外的异源二聚化变体或同源二聚化变体可以独立地并且任选地包含并选自附图中概述的变体。这些组合物可以进一步包括消融变体、pI变体、带电荷变体、同种型变体等。
A.IL-12p40变体
在一些实施例中，IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基。在一些特定此类实施例中，IL-12p40亚基是异质性降低的变体IL-12p40亚基。在其它特定此类实施例中，IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基，所述亚基对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变(降低或增加)的结合亲和力。在一些实施例中，变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299(根据人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)。
在一些实施例中，变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。在一些实施例中，变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
在一些实施例中，IL-12p40变体具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ IDNO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ IDNO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ IDNO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ IDNO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
B.IL-12p35变体
在一些实施例中，IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。在一些特定此类实施例中，IL-12p35亚基是异质性降低的变体IL-12p35亚基。在其它特定此类实施例中，IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基，所述亚基对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变(降低或增加)的结合亲和力。在一些实施例中，变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196(根据人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列进行编号)。在一些实施例中，变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。在一些实施例中，变体IL-12p35亚基具有以下氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。在一些实施例中，变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX IL-12p35(D55Q)；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)(IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ IDNO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q),lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D),lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
C.另外的选项
在一些实施例中，scIL-12-Fc形式是二价IL-12-Fc融合物。在一些实施例中，二价IL-12-Fc融合形式(图48A-B)包括两个相同的单体，每个单体各自包括与同源二聚体Fc链的N端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。在一些实施例中，二价IL-12-Fc融合形式(图48C-D)包括两个相同的单体，每个单体各自包括与同源二聚体Fc链的C端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。实例包含但不限于XENP31289和XENP31291(图49)。
在一些实施例中，通过包括M428L和N434S的取代，进一步工程化IL-12Fc融合蛋白以延长半衰期。在一些实施例中，通过包括M428L/N434S.的取代，进一步工程化IL-12Fc融合蛋白以延长半衰期。本文列出的IL-12Fc融合物中的任何融合物都可以被工程化以延长半衰期。实例包含但不限于XENP31582、XENP31583和XENP31584(图65)。
在一些实施例中，异源二聚体Fc融合蛋白的实例包含以下：XENP27201、XENP28820、XENP28821、XENP28822、XENP28823、XENP28824、XENP28825、XENP28826、XENP28827、XENP28828、XENP28829、XENP28830、XENP28831、XENP28832、XENP28833、XENP28834、XENP28835、XENP28836、XENP28837、XENP28838、XENP28839、XENP28840、XENP28841、XENP28842、XENP28843、XENP28844、XENP28845、XENP28846、XENP28847、XENP28848、XENP28849、XENP28850、XENP28851、XENP28852、XENP29949、XENP29950、XENP29951、XENP29952、XENP30597、XENP30598、XENP30599、XENP30600、XENP30601、XENP30602、XENP30603、XENP30604、XENP30605、XENP30606、XENP30307、XENP30308、XENP30609、XENP31250、XENP31251、XENP31252、XENP31253、XENP31254、XENP31255、XENP31256、XENP31257、XENP31258、XENP31259、XENP31260、XENP31261、XENP31262、XENP31263、XENP31264、XENP31265、XENP31286、XENP31142、XENP31143、XENP31144、XENP31145、XENP31146、XENP31582、XENP31583、XENP31584、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190、XENP32191、XENP32991、XENP32992、XENP32993、XENP32994、XENP32995、XENP32996、XENP32997、XENP32998、XENP32999、XENP33000、XENP33001、XENP33002、XENP33003、XENP33004、XENP33005、XENP33006、XENP33007、XENP33008、XENP33008、XENP33009、XENP33010和XENP33011。
在一些实施例中，异源二聚体Fc融合蛋白的实例包括具有选自由以下组成的组的多肽序列的第一融合蛋白：i)SEQ ID NO:47(XENP27201链1)、ii)SEQ ID NO:85(XenD24752)；iii)SEQ ID NO:86(XenD24753)；iv)SEQ ID NO:87(XenD24754)；v)SEQ IDNO:88(XenD24755)；vi)SEQ ID NO:89(XenD24756)；vii)SEQ ID NO:90(XenD24757)；viii)SEQ ID NO:91(XenD24758)；ix)SEQ ID NO:92(XenD24759)；x)SEQ ID NO:93(XenD24760)；xi)SEQ ID NO:94(XenD24761)；xii)SEQ ID NO:95(XenD24762)；xiii)SEQ ID NO:96(XenD24763)；xiv)SEQ ID NO:97(XenD24764)；xv)SEQ ID NO:98(XenD24765)；xvi)SEQ IDNO:99(XenD24766)；xvii)SEQ ID NO:100(XenD24767)；xviii)SEQ ID NO:101(XenD24768)；xix)SEQ ID NO:102(XenD24769)；xx)SEQ ID NO:103(XenD24770)；xxi)SEQID NO:104(XenD24771)；xxii)SEQ ID NO:105(XenD24772)；xxiii)SEQ ID NO:106(XenD24773)；xxiv)SEQ ID NO:107(XenD24774)；xxv)SEQ ID NO:108(XenD24775)；xxvi)SEQ ID NO:109(XenD24776)；xxvii)SEQ ID NO:110(XenD24777)；xxviii)SEQ ID NO:111(XenD24778)；xxix)SEQ ID NO:112(XenD24792)；xxx)SEQ ID NO:215(XenD25922)；xxxi)SEQ ID NO:216(XenD25923)；xxxii)SEQ ID NO:217(XenD25924)；xxxiii)SEQ ID NO:218(XenD25925)；xxxiv)SEQ ID NO:219(XenD25926)；xxxv)SEQ ID NO:220(XenD25927)；xxxvi)SEQ ID NO:221(XenD25928)；xxxvii)SEQ ID NO:222(XenD25929)；xxxviii)SEQ IDNO:223(XenD25930)；xxxix)SEQ ID NO:224(XenD25931)；xl)SEQ ID NO:XXX(XenD26411),xli)SEQ ID NO:XXX(XenD26412)；xlii)SEQ ID NO:XXX(XenD26413),xliii)SEQ ID NO:XXX(XenD26414)；xliv)SEQ ID NO:XXX(XenD26415)；xlv)SEQ ID NO:XXX(XenD26416)；xlvi)SEQ ID NO:XXX(XenD26417),xlvii)SEQ ID NO:XXX(XenD26418)；xlviii)SEQ IDNO:XXX(XenD27070),xlix)SEQ ID NO:XXX(XenD27071),l)SEQ ID NO:XXX(XenD27072),li)SEQ ID NO:XXX(XenD27073)；lii)SEQ ID NO:XXX(XenD27074),liii)SEQ ID NO:XXX(XenD27075),liv)SEQ ID NO:XXX(XenD27076),lv)SEQ ID NO:XXX(XenD27077)lvi)SEQID NO:XXX(XenD27078),lvii)SEQ ID NO:XXX(XenD28173),lviii)SEQ ID NO:XXX(XenD24876),lix)SEQ ID NO:XXX(XenD27162),lx)SEQ ID NO:XXX(XenD27163),lxi)SEQID NO:XXX(XenD27164),lxii)SEQ ID NO:XXX(XenD27165)lxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP31582链1),lxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP31583链1),lxv)SEQ ID NO:XXX(XENP31584链1),lxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32187链1)、lxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32188链1),lxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP32189链1)、lxix)SEQ ID NO:XXX(XENP32190链1)、lxx)SEQ ID NO:XXX(XENP32191链1),lxxi)SEQ ID NO:XXX(XENP32991链1),lxxii)SEQ ID NO:XXX(XENP32992链1),lxxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP32993链1),lxxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP32994链1),lxxv)SEQ ID NO:XXX(XENP32995链1),lxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32996链1)、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32997链1)、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32998链1),lxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32999链1),lxxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33000链1)、lxxix)SEQ ID NO:XXX(XENP33001链1)、lxxx)SEQ ID NO:XXX(XENP33002链1)、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(XENP33003链1)、lxxxii)SEQ ID NO:XXX(XENP33004链1)、lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP33005链1),lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP33006链1)、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(XENP33007链1)、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链1)、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链1),lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33009链1),lxxxix)SEQ ID NO:XXX(XENP33010链1)和xc)SEQ ID NO:XXX(XENP33011链1)；以及具有选自由以下组成的组的多肽序列的所述第二融合蛋白：i)SEQ ID NO:48(XENP27201链2),ii)SEQ ID NO:126(XenD24779)；iii)SEQ ID NO:127(XenD24780)；iv)SEQ ID NO:128(XenD24781)；v)SEQ IDNO:129(XenD24782)；vi)SEQ ID NO:130(XenD24783)；vii)SEQ ID NO:131(XenD24784)；viii)SEQ ID NO:132(XenD24785)；ix)SEQ ID NO:133(XenD24786)；x)SEQ ID NO:134(XenD24787)；xi)SEQ ID NO:135(XenD24788)；xii)SEQ ID NO:136(XenD24789)；xiii)SEQID NO:137(XenD24790)；xiv)SEQ ID NO:138(XenD24791)；xv)SEQ ID NO:236(XenD25911)；xvi)SEQ ID NO:237(XenD25912)；xvii)SEQ ID NO:238(XenD25913)；xviii)SEQ ID NO:239(XenD25914)；xix)SEQ ID NO:240(XenD25915)；xx)SEQ ID NO:241(XenD25916)；xxi)SEQ ID NO:242(XenD25917)；xxii)SEQ ID NO:243(XenD25918)；xxiii)SEQ ID NO:244(XenD25919)；xxiv)SEQ ID NO:245(XenD25920)；xxv)SEQ ID NO:246(XenD25921),xxvi)SEQ ID NO:XXX(XenD26427)；xxvii)SEQ ID NO:XXX(XenD26428),xxviii)SEQ ID NO:XXX(XenD27089),xxix)SEQ ID NO:XXX(XenD27090),xxx)SEQ ID NO:XXX(XenD27091),xxxi)SEQ ID NO:XXX(XenD27092)；xxxii)SEQ ID NO:XXX(XenD27093),xxxiii)SEQ ID NO:XXX(XenD27094),xxxix)SEQ ID NO:XXX(XenD24877),xl)SEQ ID NO:XXX(XenD27166),xli)SEQ ID NO:XXX(XENP31582链2),xlii)SEQ ID NO:XXX(XENP31583链2)、xliii)SEQ ID NO:XXX(XENP31584链2)、xliv)SEQ ID NO:XXX(XENP32187链2)、xlv)SEQID NO:XXX(XENP32188链2)、xlvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32189链2)、xlvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32190链2)、xlviii)SEQ ID NO:XXX(XENP32191链2)、xlix)SEQ ID NO:XXX(XENP32991链2)、l)SEQ ID NO:XXX(XENP32992链2)、li)SEQ ID NO:XXX(XENP32993链2)、lii)SEQ ID NO:XXX(XENP32994链2)、liii)SEQ ID NO:XXX(XENP32995链2)、liv)SEQ IDNO:XXX(XENP32996链2)、lv)SEQ ID NO:XXX(XENP32997链2)、lvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32998链2)、lvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32999链2)、lviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33000链2)、lix)SEQ ID NO:XXX(XENP33001链2)、lx)SEQ ID NO:XXX(XENP33002链2)、lxi)SEQID NO:XXX(XENP33003链2)、lxii)SEQ ID NO:XXX(XENP33004链2)、lxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP33005链2)、lxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP33006链2)、lxv)SEQ ID NO:XXX(XENP33007链2)、lxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链2)、lxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链2)、lxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33009链2)、lxix)SEQ ID NO:XXX(XENP33010链2)和lxx)SEQ ID NO:XXX(XENP33011链2)。
优选的实施例包含XENP31251、XENP31254、XENP31258、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190和XENP32191。在另外的实施例中，XENP31251、XENP31254、XENP31258、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190和XENP32191包含另外的糖工程化。
IX.本发明的核酸
本发明进一步提供了核酸组合物，所述核酸组合物对本发明的异源二聚体Fc融合蛋白、IL-12亚基和IL-12异源二聚体复合物进行编码(或者，在单体Fc结构域蛋白的情况下，也对所述蛋白进行编码的核酸)。
如本领域的技术人员将理解的，核酸组合物将取决于异源二聚体蛋白的形式。因此，例如，当形式需要三个氨基酸序列时，三个核酸序列可以并入到一个或多个表达载体中以进行表达。类似地，仅两种核酸需要一些形式；再次，所述两种核酸可以被放入到一个或多个表达载体中。
如本领域已知的，对本发明的组分进行编码的核酸可以并入到如本领域已知并且取决于用于产生本发明的异源二聚体Fc融合蛋白的宿主细胞的表达载体中。通常，核酸与任何数量的调节元件(启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等)可操作地连接。表达载体可以是染色体外载体或整合载体。
本发明的核酸和/或表达载体然后可以转化成如本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞，包含哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)用于许多实施例中。
在一些实施例中，如果取决于形式适用的话，对每个单体进行编码的核酸通常在不同或相同的启动子对照条件下各自包含在单个表达载体内。在特别用于本发明的实施例中，这两种或这三种核酸中的每一种包含在不同表达载体上。
通过培养包括如本领域众所周知的一个或多个表达载体的宿主细胞来制备本发明的异源二聚体Fc融合蛋白。一旦产生，就进行传统的融合蛋白或抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异源二聚体也具有不同的pI，从而促进异源二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法)。这些取代还有助于确定和监测纯化后任何污染的同源二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)。
X.IL-12异源二聚体免疫调节Fc融合蛋白的生物和生化功能
通常，本发明的Fc融合蛋白施用于患有癌症的患者，并且以如本文所描述的多种方式对功效进行评估。因此，在可以进行标准功效测定时，如癌症负载、肿瘤大小、对存在或转移程度的评估等，可以也可以基于免疫状态评估来估计免疫肿瘤学治疗。这可以以多种方式进行，包含体外和体内测定两者。例如，可以进行免疫状态改变评估(例如，ipi治疗之后ICOS+CD4+T细胞的存在)与“旧式”测量，如肿瘤负荷、大小、侵袭性、LN参与、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：PVRIG对CD4+T细胞活化或增殖、CD8+T(CTL)细胞活化或增殖、CD8+T细胞介导的细胞毒活性和/或CTL介导的细胞衰竭、NK细胞活性和NK介导的细胞衰竭的抑制作用、PVRIG对Treg细胞分化和增殖和Treg衍生或髓样衍生抑制细胞(MDSC)介导的免疫抑制或免疫耐受的增强作用、和/或PVRIG对通过免疫细胞产生的促炎性细胞因子的作用，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生的IL-2、IFN-γ或TNF-α。
在一些实施例中，通过使用例如CFSE稀释方法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色和3H-胸腺掺入法评估免疫细胞增殖来进行治疗估计。
在一些实施例中，通过评估基因表达增加或活化相关标志物的增加的蛋白质水平来进行治疗估计，包含以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A.的表面表达测量的细胞脱粒
通常，如本领域已知的，进行基因表达测定。
通常，如本领域已知的，还类似地进行蛋白质表达测量。
在一些实施例中，通过评估各种细胞参数如酶活性(包含蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生和核苷酸摄取活性来估计通过靶细胞活力检测测量的细胞毒活性进行治疗估计。这些测定的具体实例包含但不限于Trypan Blue或PI染色、51Cr或35S释放方法、LDH活性、MTT和/或WST测定、钙黄绿素-AM测定、发光基测定以及其它测定。
在一些实施例中，通过估计由细胞因子产生测量的T细胞活性、使用包含但不限于IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13的细胞因子在培养上清液中进行细胞内测量来使用众所周知的技术进行治疗估计。
因此，可以使用评估以下中的一种或多种的测定法来评估治疗：(i)免疫应答增加；(ii)αβ和/或γδT细胞的活化增加；(iii)细胞毒性T细胞活性增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌增加；(vii)IL-2分泌增加；(viii)干扰素-γ产生增加；(ix)Th1应答增加；(x)Th2应答减少；(xi)调节T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性减少。
A.测量功效和效力的测定
在一些实施例中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应(MLR)测定来估计T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过不同因素的磷酸化或去磷酸化测量或通过其它转译后修饰测量的免疫应答的增加或减少。IL-12通过STAT4的磷酸化介导IFNγ表达和分泌(Morinobu等人,2002)。因此，在优选实施例中，如STAT4的磷酸化所指示的，信号传导途径测定测量免疫应答的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的αβ和/或γδT细胞的活化的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的毒性T细胞活性的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物如例如CD107a等的表达测量的NK和/或NKT细胞活性的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的促炎性细胞因子分泌的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的IL-2分泌的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的干扰素-γ产生的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的Th1应答的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的Th2应答的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过流式细胞术或通过IHC测量的调节T细胞(Treg)中至少一个的细胞数量和/或活性的增加或减少。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过流式细胞术或通过IHC测量的M2巨噬细胞数量的增加或减少。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的M2巨噬细胞促致癌基因活性的增加或减少。应答减少指示免疫刺激活性。
下文概述的适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过流式细胞术或通过IHC测量的N2中性粒细胞增加的增加或减少。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的N2中性粒细胞促致癌基因活性的增加或减少。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的T细胞抑制的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的CTL活化抑制的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过改变活化标志物的表达测量的αβ和/或γδT细胞耗竭的增加或减少。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的αβ和/或γδT细胞应答的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD45RA、CCR7等的表达测量的刺激抗原特异性记忆应答的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的癌细胞的凋亡或裂解的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的直接杀伤的癌细胞的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物的表达测量的Th17活性的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，信号传导途径测定测量如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的对补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。
在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量T细胞活化。对于T细胞，增殖增加、细胞表面活化标志物(例如，CD25、CD69、CD137、PD1),)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如，IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)将指示免疫调节，其与增强的癌细胞杀伤作用相一致。
在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD107a等的表达测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖增加、细胞毒性(杀伤靶细胞并增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如，IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)将指示免疫调节，其与增强的癌细胞杀伤作用相一致。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物的表达来测量γδT细胞活化。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达来测量Th1细胞活化。
活性或应答的适当增加(或减少，如上文所概述的视情况而定)比参考样品或对照样品例如不含有本发明的IL-12异源二聚体融合蛋白的测试样品中的信号增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％到99％。类似地，与参考样品或对照样品相比增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍示出了功效。
XI.组合疗法
在一些方面，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白与另一种治疗剂组合施用。如本文所用，“组合”施用意味着在受试者患有病症的过程期间向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者已经被诊断为患有所述病症之后并且在所述病症已经治愈或消除或治疗由于其它原因已经停止之前递送所述两种或更多种治疗。在一些实施例中，对一种治疗的递送在对第二治疗的递送开始时仍然发生，使得在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“同时递送”。在其它实施例中，对一种治疗的递送在对另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施例中，治疗由于组合施用而更有效。例如，第二治疗更有效，例如，在较少的第二治疗的情况下看到相当的效果，或者相比于在不存在第一治疗的情况下施用第二治疗的情形下将看到的程度，第二治疗在更大程度上减少症状，或者在第一治疗的情况下看到类似情形。在一些实施例中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送的一种治疗将观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分加性的、完全加性的或大于加性的。递送可以使得在递送第二治疗时仍然可以检测到所递送的第一治疗的效果。
本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)和至少一种另外的治疗剂可以在相同或单独的组合物中同时施用或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)，并且可以其次施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。
本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)和/或其它治疗剂、手术或方式可以在活动性病症期间，或在疾病缓解期间或活动性疾病较轻期间施用。IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)可以在其它治疗之前、与治疗同时、在治疗之后或在病症缓解期间施用。
A.检查点阻断抗体
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白与包含检查点阻断抗体的其它治疗剂组合，如但不限于PD-1抑制剂、TIM3抑制剂、CTLA4抑制剂、PD-L1抑制剂、TIGIT抑制剂、LAG3抑制剂或其组合。
1.抗PD-1抗体
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与抗PD-1抗体组合施用于患有癌症的受试者。在一些情况下，抗PD-1抗体包含XENP16432(二价抗PD-1mAb、检查点抑制剂，通过抑制所植入的人T细胞来增强抗肿瘤活性；图53中所描绘的序列)。
在一些实施例中，本发明的Il-12-Fc融合蛋白与
或
组合施用。
示例性非限制性抗PD-1抗体分子公开于2015年7月30日公开的标题为“PD-1的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof)”的US 2015/0210769中，所述文献通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包含恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包含恒定区)或两者，包括BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E的氨基酸序列；或如US 2015/0210769的表1中所描述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗PD-1抗体分子任选地包括来自重链、轻链或两者的前导序列，如US 2015/0210769的表4中所示；或与其基本上相同的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自本文所描述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自以下中的任何一种：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D和BAP049-Clone-E；或如表1中所描述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述重链可变区包括US 2015/0210769的表1中所示的或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2015/0210769的表1中所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链CDR中的取代，例如，轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链CDR3中的在轻可变区的位置102处的取代，例如，根据表1在轻可变区的位置102处将半胱氨酸取代为酪氨酸，或将半胱氨酸取代为丝氨酸残基(例如，未修饰的小鼠或嵌合的SEQ ID NO:16或24；或经修饰的序列的SEQ ID NO:34、42、46、54、58、62、66、70、74或78中的任何序列。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或共同地所有CDR)，所述可变区包括US 2015/0210769的表1中所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0210769的表1中；
(b)VH，所述VH包括选自SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0210769的表1中；
(c)VH，所述VH包括SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0210769的表1中；或者
(d)VH，所述VH包括SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0210769的表1中。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括以下：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2或SEQID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0210769的表1中。
在其它实施例中，PD-1抑制剂是选自纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的抗PD-1抗体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的替代名称包含MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗是特异性阻断PD1的完全人IgG4单克隆抗体。与PD1特异性结合的纳武单抗(克隆5C4)和其它人单克隆抗体公开于US 8,008,449和WO2006/121168中。在一个实施例中，PD-1的抑制剂是尼武单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。在一些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(也被称为兰伯丽珠单抗(lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或
默克公司(Merck))是与PD-1结合的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其它人源化抗PD-1抗体公开于Hamid、O.等人,《新英格兰医学杂志((2013)New England Journal of Medicine)》369(2):134–44、US 8,354,509和WO2009/114335中。
在一个实施例中，PD-1的抑制剂是在例如US 8,354,509和WO 2009/114335中公开的派姆单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是皮地利珠单抗。皮地利珠单抗(CT-011；治疗科技公司(Cure Tech))是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。皮地利珠单抗和其它人源化抗PD-1单克隆抗体公开于US 8,747,847和WO2009/101611中。
其它抗PD1抗体包含AMP 514(阿帕里免疫公司(Amplimmune))等，例如，公开于US8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中的抗PD1抗体。
在一些实施例中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如，包括与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg；阿帕里免疫公司；例如，公开于WO2010/027827和WO2011/066342中)，是阻断PD-1与B7-H1之间的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体可以与本发明的IL-12Fc融合蛋白组合使用。存在若干种抗PD-1抗体，包含但不限于目前经FDA批准的两种抗体，派姆单抗和纳武单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包含但不限于替雷利珠单抗(tislelizumab)、Sym021、REGN2810(由Rengeneron开发)、JNJ-63723283(由J和J开发)、SHR-1210、皮地利珠单抗、AMP-224、MEDIo680、PDR001和CT-001以及Liu等人,《血液学和肿瘤学杂志(J.Hemat.&Oncol.)》(2017)10:136中概述的其它抗体，其中的抗体通过引用明确并入。
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与抗PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体)组合使用。在某些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗PD-1抗体组合施用。
2.抗TIM3抗体
在一些实施例中，本发明的IL-12-Fc融合蛋白与抗TIM3抗体组合施用。
在一些实施例中，本发明的Il-12-Fc融合蛋白与LY3321367(礼来公司(Eli Lillyand Company))、MBG453(诺华制药(Novartis Pharmaceuticals))和TSR-022(特萨罗公司(Tesaro，Inc.))组合施用。
示例性非限制性抗TIM-3抗体分子公开于2015年8月6日公开的标题为“TIM-3的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to TIM-3and Uses Thereof)”的US 2015/0218274中，所述文献通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包含恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包含恒定区)或两者，包括以下的氨基酸序列：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如US 2015/0218274的表1-4中所描述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗TIM-3抗体分子任选地包括来自重链、轻链或两者的前导序列，如US 2015/0218274中所示；或与其基本上相同的序列。
在又另一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含来自本文所描述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自以下中的任何一种：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如US 2015/0218274的表1-4中所描述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又另一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述重链可变区包括US 2015/0218274的表1-4中所示的或由表1-4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1-4所示或由表1-4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2015/0218274的表1-4中所示的或由表1-4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1-4所示或由表1-4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施例中，抗TIM-3抗体分子包含轻链CDR中的取代，例如，轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在另一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或共同地所有CDR)，所述可变区包括US 2015/0218274的表1-4中所示或由表1-4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1-4所示或由表1-4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在一个实施例中，抗TIM-3抗体分子包含以下：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包括选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ IDNO:10的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQID NO:14的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0218274的表1-4中；
(b)VH，所述VH包括选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:4的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0218274的表1-4中；
(c)VH，所述VH包括选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:25的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ IDNO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0218274的表1-4中；
(d)VH，所述VH包括选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:24的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ IDNO:6的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0218274的表1-4中；
(e)VH，所述VH包括选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:31的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ IDNO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0218274的表1-4中；或者
(f)VH，所述VH包括选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:30的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，所述VL包括SEQ IDNO:6的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0218274的表1-4中。
示例性抗TIM-3抗体公开于美国专利第8,552,156号、WO 2011/155607、EP2581113和美国公开第2014/044728号中。
在一些实施例中，抗TIM-3抗体可以与本发明的IL-12Fc融合蛋白组合使用。在临床开发中存在若干种TIM-3抗体，包含但不限于MBG453和TSR-022。
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与抗TIM-3抑制剂(例如，抗TIM3抗体)组合使用。在某些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗TIM3抗体组合施用。
3.抗CTLA4抗体
示例性抗CTLA4抗体包含曲美母单抗(tremelimumab)(IgG2单克隆抗体，可从辉瑞公司(Pfizer)获得，以前称为替西木单抗(ticilimumab)，CP-675,206)；和伊匹单抗(ipilimumab)(CTLA-4抗体，也被称为MDX-010，CAS编号477202-00-9)。其它示例性抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利第5,811,097号中。
在一个实施例中，抗CTLA4抗体是公开于US 5,811,097、US 7,605,238、WO00/32231和WO97/20574中的伊匹单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一个实施例中，抗CTLA4抗体是公开于US 6,682,736和WO00/37504中的曲美母单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗CTLA-4抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。因此，本文所概述的用于联合疗法的合适的抗CTLA-4抗体包含但不限于一种当前经FDA批准的抗体伊匹单抗，以及另外若干种正在开发中的抗体，包含CP-675,206和AGEN-1884。
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与CTLA-4抑制剂(例如，抗CTLA-4抗体)组合使用。在某些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗CTLA-4抗体组合施用。
4.抗PD-L1抗体
示例性非限制性抗PD-L1抗体分子公开于2016年4月21日公开的标题为“PD-L1的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to PD-L1 and Uses Thereof)”的US 2016/0108123中，所述文献通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包含恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包含恒定区)或两者，包括以下的任一种的氨基酸序列：BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O；或如US 2016/0108123的表1中所描述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自本文所描述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自以下中的任何一种：BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O；或如US 2016/0108123的表1中所描述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述重链可变区包括US 2016/0108123的表1中所示的或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2016/0108123的表1中所示的或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施例中，抗PD-L1抗体分子包含轻链CDR中的取代，例如，轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或共同地所有CDR)，所述可变区包括表1中所示或由US2016/0108123的表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含以下：
(i)重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，每个公开于US 2016/0108123的表1中；以及
(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO:9的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:11的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2016/0108123的表1中。
在另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含以下：
(i)重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2016/0108123的表1中；以及
(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ IDNO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2016/0108123的表1中。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包括SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包括SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包括SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列，每个都公开于US 2016/0108123的表1中。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂是抗体分子。在一些实施例中，抗PD-L1抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDX-1105、阿特朱单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗或BMS936559。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体是阿特朱单抗。阿特朱单抗(也被称为MPDL3280A和
罗氏公司(Roche))是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿特朱单抗和其它人源化抗PD-L1抗体公开于US 8,217,149中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗。阿维鲁单抗(也被称为A09-246-2；默克雪兰诺公司(Merck Serono))是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿维鲁单抗和其它人源化抗PD-L1抗体公开于US 9,324,298和WO2013/079174中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。度伐鲁单抗(也被称为MEDI4736；阿斯利康公司(AstraZeneca))是与PD-L1结合的单克隆抗体。度伐鲁单抗和其它人源化抗PD-L1抗体公开于US 8,779,108中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体是BMS-936559。BMS-936559(也被称为MDX-1105；BMS公司)是与PD-L1结合的单克隆抗体。BMS-936559和其它人源化抗PD-L1抗体公开于US7,943,743和WO2007005874中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。存在若干种抗PD-L1抗体，包含目前经FDA批准的三种抗体，阿特朱单抗、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包含但不限于LY33000054和CS1001以及Liu等人,《血液学和肿瘤学杂志》(2017)10:136中概述的其它抗体，其中的抗体通过引用明确并入。
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以与PD-L1或PD-L2抑制剂(例如，抗PD-L1抗体)组合使用。
5.抗TIGIT抗体
在一些实施例中，抗TIGIT抗体是OMP-313M32。OMP-313M32(安可医疗制药公司(OncoMed Pharmaceuticals))是与TIGIT结合的单克隆抗体。OMP-313M32和其它人源化抗TIGIT抗体公开于US20160376365和WO2016191643中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体是BMS-986207。BMS-986207(也被称为ONO-4686；百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))是与TIGIT结合的单克隆抗体。BMS-986207和其它人源化抗TIGIT抗体公开于US20160176963和WO2016106302中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体是MTIG7192。MTIG7192(基因科技公司(Genentech))是与TIGIT结合的单克隆抗体。MTIG7192和其它人源化抗TIGIT抗体公开于US2017088613、WO2017053748和WO2016011264中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。临床开发中存在若干种TIGIT抗体，BMS-986207、OMP-313M32和MTIG7192A。
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以用于与TIGIT抑制剂(例如，抗TIGIT抗体)组合使用。在某些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗TIGIT抗体组合施用。
6.抗LAG3抗体
示例性非限制性抗LAG-3抗体分子公开于2015年9月17日公开的标题为“LAG-3的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to LAG-3and Uses Thereof)”的US 2015/0259420中，所述文献通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包含恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包含恒定区)或两者，包括以下的任一种的氨基酸序列：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I或BAP050-Clone-J；或如US 2015/0259420的表1中所描述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又另一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含来自本文所描述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自以下中的任何一种：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I或BAP050-Clone-J；或如US 2015/0259420的表1中所描述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与上述序列中的任何上述序列基本上相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又另一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述重链可变区包括US 2015/0259420的表1中所示的或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或共同地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2015/0259420的表1中所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施例中，抗PD-L1抗体分子包含轻链CDR中的取代，例如，轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在另一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或共同地所有CDR)，所述可变区包括表1中所示或由US2015/0259420的表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或共同地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下：
(i)重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；以及SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，每个公开于US 2015/0259420的表1中；以及
(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:12的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0259420的表1中。
在另一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包含以下：
(i)重链可变区(VH)，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0259420的表1中；以及
(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ IDNO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15的VLCDR3氨基酸序列；每个都公开于US 2015/0259420的表1中。
在一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包括SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包括SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又另一个实施例中，抗LAG-3抗体分子包括SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列，每个都公开于US 2015/0259420的表1中。
在一些实施例中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。BMS-986016(也被称为BMS986016；百时美施贵宝公司)是与LAG-3结合的单克隆抗体。BMS-986016和其它人源化抗LAG-3抗体公开于US 2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218中。
在一些实施例中，抗LAG3抗体是LAG525。LAG525(也被称为IMP701；诺华公司)是与LAG3结合的单克隆抗体。LAG525和其它人源化抗LAG3抗体公开于US 9,244,059和WO2008132601中，并具有本文公开的序列(或与其基本上相同或类似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同的序列)。
其它示例性抗LAG3抗体公开于例如US2011150892和US2018066054中。
在一些实施例中，抗LAG-3抗体可以与本发明的IL-12-Fc融合蛋白组合使用。临床开发中存在若干种抗LAG-3抗体，包含再生元公司(Regeneron)的REGN3767、BMS-986016(百时美施贵宝公司)、MK-4280(默克公司)、LAG525(诺华公司)和TSR-033(特萨罗公司)。
在一些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白可以用于与LAG3抑制剂(例如，抗LAG3抗体)组合使用。在某些实施例中，本文所描述的IL-12-Fc融合蛋白(例如，本文所描述的任何XENP序列)与抗LAG3抗体组合施用。
XII.治疗
一旦制成，在与本发明的异源二聚体Fc融合蛋白结合的情况下，通过治疗癌症、通常促进T细胞活化(例如，不再抑制T细胞)，本发明的组合物可以用于许多肿瘤学应用。
因此，本发明的异源二聚体组合物可以用于治疗这些癌症。
A.体内施用的融合蛋白组合物
通过将具有期望程度的纯度的融合蛋白与任选的药学上可接受的呈冻干调配物或水性溶液的形式的载体、赋形剂或稳定剂(如《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》、第16版、Osol、A.编辑[1980])中所概述的)进行混合来制备根据本发明使用的融合蛋白的调配物以供储存。
B.施用方式
本发明的融合蛋白和化疗剂根据已知的方法，如静脉内施用(作为团注物(bolus)或通过在一段时间内连续输注)向受试者施用。
B.治疗方式
在本发明的方法中，用疗法来提供对疾病或病状的阳性治疗应答。“阳性治疗应答”旨在改善疾病或病状和/或改善与疾病或病状相关联的症状。例如，阳性治疗应答将指对疾病的以下改善中的一种或多种：(1)减少赘生性细胞的数量；(2)增加赘生性细胞死亡；(3)抑制赘生性细胞存活；(5)抑制(即减慢到某种程度并且优选地停止)肿瘤生长；(6)增加患者存活率；以及(7)与疾病或病状相关联的一个或多个症状的一些缓解。
可以通过对那个疾病或病状具有特异性的标准化应答标准来确定任何给定疾病或病状的阳性治疗应答。可以使用筛选技术如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包含骨髓吸出(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来估计针对肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)改变的肿瘤应答。
除了这些阳性治疗应答之外，正经受疗法的受试者可能经历与疾病相关联的症状的改善的有益效果。
根据本发明的治疗包含所使用的“治疗有效量的”药物。“治疗有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的治疗结果的有效的量。
治疗有效量可以根据因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别、以及体重、以及药物在个体中引发希望的应答的能力。治疗有效量也是蛋白或蛋白部分的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。
肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病的进展的能力测量。可以在预示人类肿瘤的功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。
可替代地，通过熟练的从业者已知的体外测定，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小或以其它方式减轻受试者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者症状的严重程度和特定的组合物或所选择的施用途径这种因素确定这种量。
调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单个团注物，或者可以随时间施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所表明的成比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按剂量单位调配。如本文使用的剂量单位是指作为针对要治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有与所需药物载体缔合的、经计算产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。
针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。
用于本发明的异源二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病状并且可以由本领域的技术人员确定。
用于本发明的治疗有效量的异源二聚体蛋白的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。
所有引用的参考文献通过引用以其全部内容明确地并入本文。
尽管出于说明的目的已经在上文描述了本发明的具体实施例，但是本领域技术人员将了解的是，在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的情况下可以做出许多细节变化。
实例
下文提供的实例旨在说明本发明。这些实例并非意在将本发明约束到任何具体应用或操作理论。对于本发明所讨论的所有恒定区位置，编号是根据如Kabat的EU索引的(Kabat等人,1991,《免疫学关注的蛋白质的序列》、第5版、美国公共卫生署、国立卫生研究院、贝塞斯达，其通过引用以其全部内容并入本文)。抗体领域的技术人员将了解，这种转化由免疫球蛋白序列的特异性区域的无序编号组成，从而使能够标准化参考免疫球蛋白家族的保守位置。因此，如由EU索引限定的任何给定免疫球蛋白的位置将不一定对应于其顺序序列。
美国公开2015/0307629、2014/0288275和WO2014/145806中概述了通用和特定科学技术，所有所述公开通过引用以其全部内容明确地并入并且特别用于在此概述的技术。
实例1：IL-12-Fc融合蛋白
与其它细胞因子一样，IL-12的半衰期短，并且进行高剂量治疗以克服短半衰期会导致全身毒性。另外，据报道，抗肿瘤作用需要通过IL-12持续诱导IFNγ的产生(Gollob、JA等人,2000)。进一步地，据报道，IL-12p40亚基，无论是单体还是同源二聚体，都通过竞争与IL-12受体的结合来拮抗IL-12活性(Gillessen、S等人,1995)；因此，使IL-12p40和IL-12p35亚基预复合是有利的。为了解决这两个警告，将IL-12异源二聚体工程化为Fc融合蛋白(在此统称为IL-12-Fc融合物)，所述Fc融合蛋白既可以通过FcRn介导的再循环增强循环，也可以使IL-12p40和IL-12p35亚基预复合。
1A：将各种形式的IL-12-Fc融合物工程化
产生了N端IL-12异源二聚体Fc融合或“IL-12-异源Fc”形式，其包括与异源二聚体Fc的一侧的N端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的N端重组融合的IL-12p35亚基(图8A)。IL-12p40和IL-12p35亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。此形式的说明性蛋白质为XENP27201，其序列如图9所描绘。
产生了C端IL-12异源二聚体Fc融合或“异源Fc-IL-12”形式，其包括与异源二聚体Fc的一侧的C端重组融合的IL-12p40亚基和与异源二聚体Fc的另一侧的C端重组融合的IL-12p35亚基(图8B)。IL-12p30和IL-12p35亚基可以通过结构域接头与其相应Fc链连接。此形式的说明性蛋白质为XENP27202，其序列如图10所描绘。
进一步产生了N端单链IL-12-Fc融合或“scIL-12-Fc”形式，其包括与异源二聚体Fc的一侧的N端(任选地通过结构域接头)重组融合的单链IL-12复合物(或“scIL-12复合物”)，其中分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”异源二聚体Fc(图8C-D)。scIL-12复合物可以包括N端与IL-12p40连接的IL-12p35或N端与IL-12p35连接的IL-12p40，任选地利用结构域接头。scIL-12复合物中两个亚基的顺序指定如下：“scIL-12(p40/p35)”，其中IL-12p40亚基在N端与IL-12p35亚基连接；或“scIL-12(p35/p40)”，其中IL-12p35在N端与IL-12p35亚基连接。scIL-12-Fc形式的说明性蛋白质包含XENP27203和XENP27204，其序列如图11所描绘。
图8描绘了设想使用的另外的IL-12-Fc形式的动画示意图。
1B：说明性IL-12-Fc融合物的产生和物理表征
1B(a)：IL-12-异源Fc
通过以下来构建对IL-12p35和IL-12p40亚基进行编码的质粒：标准基因合成、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体的pTT5表达载体中(例如，如图7所描绘的恒定区)。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染产生了蛋白质，并且通过包括蛋白A色谱法(纯化部分1)然后是阴离子交换色谱法(纯化部分2)的两步纯化工艺对所述蛋白质进行了纯化。图12A中描绘了描绘说明性IL-12-异源Fc XENP27201的纯化部分2的色谱图。色谱图示出了两个峰的分离(峰A和峰B)，通过利用多角度光散射的分析型尺寸排阻色谱法(aSEC-MALS)和分析型阴离子交换色谱法(分析型AIEX)来进一步表征所述峰的纯度和同质性，如下文所描述的。
使用aSEC-MALS分析了从纯化部分2中分离出的峰A和峰B的XENP27201，以推断出其组分蛋白物种。在Agilent 1200高效液相色谱(HPLC)系统上进行分析。利用280nM的UV检测波长，使用1×PBS，pH 7.4作为流动相在4℃下以1.0毫升/分钟的速度将样品注射到SuperdexTM 200 10/300GL柱(通用医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences))上，持续25分钟。在带有
T-rEX折射率检测器的
(加利福尼亚州圣塔芭芭拉的怀雅特技术公司(Wyatt Technology、Santa Barbara、Cali.))上进行MALS。使用Agilent OpenLab色谱数据系统(CDS)ChemStation版AIC C.01.07版本和ASTRA6.1.7.15版本进行分析。图12B中描绘了峰A和峰B的aSEC分离曲线的色谱图以及由MALS确定的组分物种的MW。曲线示出峰A包括分子量为约299kD和约140kD的物种，而峰B主要包括分子量为约118kD的物种，考虑到聚糖贡献的另外质量，这与XENP27201(基于氨基酸序列)的经计算的分子量110.4kDa相一致。
还使用分析型AIEX对来自纯化部分2的峰进行了分析，以进一步评估峰B的纯度和同质性。在Agilent 1200高效液相色谱(HPLC)系统上进行分析。利用280nM的UV检测波长，在20mM Tris、pH 8.5缓冲液中使用0-40％NaCl梯度以1.0毫升/分钟将样品注入到Proteomix SAX-NP5 5μM无孔柱(特拉华州纽瓦克的赛分科技有限公司(SepaxTechnologies、Inc.、Newark、Del.))上。使用Agilent OpenLAB CDS ChemStation版AICC.01.07版本进行分析。图12C中描绘了描绘峰A和B的分析型AIEX分离的色谱图。与峰B的aSEC分离曲线一致，峰B的分析型AIEX分离曲线展示了峰B中物种的纯度和同质性。从此处开始，XENP27201表示从纯化部分2中分离出的峰B，如图12A所描绘的。
1B(b)：scIL-12(p40/p35)-Fc
通过以下来构建对通过接头与IL-12p35重组融合的IL-12p40进行编码的质粒：标准基因合成、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体的pTT5表达载体中(例如，如图7所描绘的恒定区)。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染产生了蛋白质，并且通过包括蛋白A色谱法(纯化部分1)以及阴离子交换色谱法(纯化部分2)的两步纯化工艺对所述蛋白质进行了纯化。
图13A中描绘了描绘说明性scIL-12(p40/p35)-Fc融合物XENP27203的纯化部分2的色谱图。如上所述，色谱图示出了两个峰的分离，通过aSEC-MALS和分析型AIEX来进一步表征所述峰的纯度和同质性，如实例1B(a)所描述，其色谱图在图13B-C中描述。
从XENP27203的纯化部分2分离出的峰A和峰B的aSEC分离曲线示出峰A包括分子量为约396kD、约188kD和约118kD的物种，而峰B主要包括分子量为约118kD的物种，考虑到聚糖贡献的另外质量，这与XENP27203(基于氨基酸序列)的经计算的分子量111.3kDa相一致。如实例1B(a)所描述的，还使用分析型AIEX对峰进行了分析，以进一步研究峰B的纯度和同质性。与峰B的aSEC分离曲线一致，峰B的分析型AIEX分离曲线(图13C)展示了峰B中物种的纯度和同质性。从此处开始，XENP27203表示从阴离子交换中分离出的峰B，如图13A所描绘的。
1C：IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化中的体外活性
在细胞因子与其受体结合后，与细胞因子受体缔合的Janus激酶(JAK)使STAT蛋白磷酸化，然后所述STAT蛋白转运到细胞核中以调节进一步的下游过程。具体地，IL-12通过STAT4的磷酸化介导IFNγ表达和分泌(Morinobu等人,2002)。因此，研究了上文所描述的IL-12-异源Fc(XENP27201)和scIL-12(p40/p35)-Fc(XENP27203)在各种淋巴细胞群体中诱导STAT4磷酸化的能力。使用二价IL-12p35-Fc融合物和IL-12p40-Fc融合物(图14-15中描绘了其动画示意图和序列)以及重组IL-12作为对照物。
通过与板结合的抗CD3(100ng/ml)温育3天来活化新鲜的PBMC。在活化之后，然后在37℃下在所指示的浓度下将新鲜的PBMC与所指示的测试制品一起温育，持续15分钟。在温育之后，将PBMC首先用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD14-APC/Fire750(M5E2)、抗CD20-PerCP/5.5(2H7)、抗CD25-BV421(M-A251)和抗CD56-PE抗体染色。在第一次染色之后，使用PerFix EXPOSE(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter、Indianapolis、Ind.)使细胞透化。在透化之后，将细胞用抗CD45RA-BV510(HI100)、抗FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)抗体染色。在第二次染色之后，通过流式细胞术对细胞进行分析以研究各种淋巴细胞群体上的STAT4磷酸化。图16中描绘了描绘各种淋巴细胞群体上的pSTAT4 MFI的数据，所述数据指示通过IL-12受体由IL-12-Fc融合物进行的信号传导。
数据示出XENP27201和XENP27203两者在将各种淋巴细胞群体中的STAT4磷酸化诱导到与由重组IL-12诱导的水平类似的水平具有活性，而二价IL-12p40-Fc(XENP27560)和二价IL-12p35-Fc(XENP27561)融合物没有活性。值得注意的是，两种IL-12-Fc融合形式表现出类似的效力。另外，与XENP27560和XENP27561相比，经纯化的IL-12-Fc融合蛋白诱导STAT4磷酸化的能力证实了从XENP27201和XENP27203两者的纯化部分2分离出的峰B(如实例1B中所描述的)由包括完整的IL-12异源二聚体的活性物种组成。
实例2：被工程化以得到降低的效力的IL-12变体
为了进一步延长半衰期并降低毒性潜力，以对IL-12受体减少的结合亲和力将IL-12变体工程化，因为推断这会减少抗原沉默(antigen sink)并降低效力。
2A(a)：将IL-12p40变体工程化
首先将W15、P17、D18、A19、P20、G21、M23、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Y66和K84标识为IL-12p40上的用于引入亲和力调节取代的潜在位点(图17所描绘的残基)。
作为第二策略，通过在MOE软件中使用QuaSAR数据包来标识IL-12p40晶体结构(PDB码3HMX)中的高度暴露的天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基(根据使用
的水分子半径和每个原子的多面体表示计算的水可及表面积)，从而推断这些残基可以有助于IL-12p40受体与IL-12受体之间的结合。具体地，将搜索的重点放在可以并入同配取代(即，Asn和Asp；以及Gln和Glu)的残基上，目的是使免疫原性潜力最小化。因此，标识了ASA评分为至少19的E3、D7、E12、D14、D18、E22、D29、E32、E33、D41、Q42、E45、Q56、E59、D62、Q65、E73、E86、D93、D97、E100、N103、E110、D129、D142、Q144、E156、D161、N162、E166、E170、Q172、D174、E187、N200、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、Q256、E262、D265、D270、N281、Q289和E299(图18中所描绘的残基和ASA评分)。
如上文所描述的，p40亚基由IL-12和IL-23共享。Bloch等人(2018)报道了供IL-23与IL-23R和Nb22E11复合的晶体结构。作为第三策略，推断IL-12p40亚基上的与IL-23R接触的残基也可以涉及结合IL-12受体复合物中类似受体IL-12Rβ2。因此，使用Bloch等人报道的晶体结构(PDB码5MZV)并在MOE软件中进行建模，将D87、G88、I89、W90、K104和F106标识为IL-12p40上的可能与IL-12Rβ2接触的残基(图19中所描绘的残基和预测的接触类型)。
最后，为了确保不干扰IL-12p40与IL-12p35亚基之间的自然相互作用，基于Luo等人(2010)报道的晶体结构来标识(2010)上的可能与K102接触的以下残基：K102、Y114、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、S204、F206、R208、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、D290、R291、Y292和Y293。
考虑到上述情况，设计了许多IL-12p40变体，具体地如上所描述的位于可以引入同配取代的残基处的变体，目的是降低IL-12异源二聚体与IL-12受体的亲和力。还设计了用于去除p40中潜在的N-糖基化位点的取代，以检查糖基化对蛋白质异质性的影响。图20中描绘了说明性变体的序列。通过以下来构建对IL-12p40变体进行编码的质粒：标准基因合成、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图7所描绘的恒定区)的pTT5表达载体中，所述质粒的对应的氨基酸序列在图21中描绘。
2A(b)：将IL-12p35变体工程化
与上文描述的第二策略一样，在MOE软件中使用QuaSAR数据包来标识IL-12p35晶体结构(PDB码3HMX)中的高度暴露的天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基，从而推断这些残基可以有助于IL-12异源二聚体复合物与IL-12受体之间的结合。再次，此处具体地将重点放在可以并入同配取代以使免疫原性潜力最小化的残基上。标识ASA评分为至少103的Q35、E38、E46、D55、E67、N71、N76、N85、Q135、Q146、N151、E153、E162和E163(图22中所描绘的残基和ASA评分)。
如上，为了确保不干扰IL-12p40与IL-12p354亚基之间的自然相互作用，基于Luo等人(2010)报道的晶体结构来标识S44上的可能与(2010)接触的以下残基：Q20、S44、E45、E46、H49、K54、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、S73、C74、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193和A196。
考虑到上述情况，设计了具有同配取代的许多IL-12p35变体，目的是降低IL-12异源二聚体与IL-12受体的亲和力。还设计了用于去除p35中潜在的N-糖基化位点的取代，以检查糖基化对蛋白质异质性的影响。图23中描绘了说明性变体的序列。通过以下来构建对IL-12p35变体进行编码的质粒：标准基因合成、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图7所描绘的恒定区)的pTT5表达载体中，所述质粒的对应的氨基酸序列在图24中描绘。
2A(c)：筛选效力降低的IL-12-Fc融合蛋白
设计具有上述变体IL-12亚基的示例性变体IL-12-Fc融合蛋白，这是为了生成对IL-12受体的亲和力降低以降低效力的IL-12-Fc融合物，其序列在图25中描绘。如实例1B中总体上描述的，产生并纯化IL-12-Fc融合物，并在pSTAT4测定中研究其活性。
用100ng/ml抗CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后将活化的PBMC与指示的测试制品在37℃下温育15分钟。然后使用PerFix EXPOSE试剂盒(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter、Indianapolis、Ind.))将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45RA-BV421(HI100)、抗CD56-PE(N901)、抗FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。
图26和27中分别描绘了示出通过具有IL-12p35或IL-12p40变体的IL-12-Fc融合物在CD4+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA+CD25+T细胞上诱导STAT4磷酸化的数据。图28描绘了各种变体IL-12-Fc融合物的EC50和相对于WT IL-12-Fc XENP27201的EC50减小倍数。数据表明，包括变体IL-12p40亚基或IL-12p30亚基的大多数IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出减少的效力。值得注意的是，IL-12p40亚基中的E59Q和E235Q取代以及IL-12p35取代中的E153Q和N151D取代能够分别使变体IL-12-Fc融合物的效力降低2倍以上。另外，包括E59Q的IL-12p40双突变体和三突变体使效力降低至多6.5倍。
令人惊讶地，包括IL-12p40(D87N)或IL-12p40(E262Q)的两种变体IL-12-Fc融合物表现出效力增加。虽然所关注的是减少效力，其目的是减少抗原沉默并且由此增加IL-12-Fc融合物的半衰期，但效力增加的IL-12-Fc融合物可以在其它背景下使用。
2B：将IL-12p40和IL-12p35变体工程化(第2轮)
为了工程化另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其目的是降低所述变体对IL-12受体的亲和力并降低生物活性IL-12复合物的效力，用扩展标准来重新应用实例2A中所描述的策略。例如，使用比实例2A中定义的阈值更低的ASA评分阈值以用于标识引入取代的IL-12p40和IL-12p35残基。还将标准扩展成包含另外的氨基酸残基，具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸上，在所述残基处，引入取代更可能破坏IL-12p35、IL-12p40和/或IL-12复合物与IL-12受体的相互作用。
类似地，引入具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸上的非同配取代，以破坏IL-12p35、IL-12p40和/或IL-12复合物与IL-12受体的相互作用。使用这些方法，进一步将IL-12p40亚基中的D34、K99、K163、K258和K260以及IL-12p35亚基中的N21、E79、Q130、N136、E143、K158和D165标识为适于将取代工程化的残基。另外，生成另外的组合变体，所述组合变体并入了实例2中标识的对最大效力降低有贡献的取代。
鉴于上述情况，设计了另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其说明性序列分别在图29和31中进行了描绘。如上，通过以下来构建对IL-12p40和IL-12p35变体进行编码的质粒：标准基因合成、然后亚克隆到含有Fc融合配偶体的pTT5表达载体中，所述质粒的对应的氨基酸序列分别在图30和32描绘。生成并且如实例1B中总体上描述的那样产生具有另外的变体IL-12亚基的IL-12-Fc融合蛋白，所述融合蛋白的序列在图33中进行了描绘。
如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究另外的变体IL-12-Fc融合物的活性。具体地，用100ng/ml抗CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后将活化的PBMC与指示的测试制品在37℃下温育15分钟。然后将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45RA-BV421(HI100)和抗CD56-PE(N901)染色。接下来，使用PerFix EXPOSE(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司)将细胞透化。在透化之后，将细胞用抗FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。图34-35中描绘了描绘CD4+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且图36中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-FcXENP27201的减小倍数)的数据。数据表明，包括变体IL-12p40亚基和/或IL-12p30亚基的大多数IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出减少的效力。
2C：将IL-12p40和IL-12p35变体工程化(第3轮)
在实例2B中，发现相较于效力降低仅约2倍的包括IL-12p40(E59Q)的IL-12-Fc融合物XENP28825，包括IL-12p40(E59K)的IL-12-Fc融合物XENP29952实现约12倍的降低。另外，注意到，包括IL-12p40亚基中E59Q的若干个双突变体展现出>3.5倍的效力降低(例如，XENP29953、XENP29954和XENP29959)。进一步地，注意到，虽然包括IL-12p35(N151D)的XENP28846实现增加的效力，但IL-12p35(D55Q/N151D)实际上实现约2倍的效力降低，这表明对IL-12p35亚基中D55的修饰大大有助于效力降低。因此，为了进一步降低IL-12-Fc融合物的效力，生成另外的组合变体，所述组合变体并入了实例2B中的对最大效力降低有贡献的取代。另外，如实例2B中，进一步包含非同配取代，具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸上。
鉴于上述情况，设计了另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其说明性序列分别在图37和38中进行了描绘。生成并且如实例1B中总体上描述的那样产生具有另外的变体IL-12亚基的IL-12-Fc融合蛋白，所述融合蛋白的序列在图39中进行了描绘。如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究另外的变体IL-12-Fc融合物的活性。图40中描绘了描绘CD4+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA+CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且图41中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-Fc XENP27201的减小倍数)的数据。数据表明，包括变体IL-12p40亚基和/或IL-12p30亚基的所有新颖IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出显著减少的效力。值得注意的是，与XENP27201相比，XENP30607和XENP30608表现出约100倍的效力减少。
2D：将IL-12p40和IL-12p35变体工程化(第4轮)
通过并入实例2中发现的另外的变体对效力变化有贡献以及通过进一步使用非同配取代破坏IL-12p35、IL-12p40和/或IL-12复合物与IL-12受体的相互作用来进一步工程化IL-12p40和IL-12p35亚基，所述非同配取代具体地将重点放在较大的残基如赖氨酸和酪氨酸上。
另外，在MOE软件中基于表面暴露进行另外的结构分析，以标识IL-12p40和IL-12p35亚基中的引入修饰的另外的残基。进一步标识IL-12p40亚基中的残基R159和K264以及IL-12p35亚基中的残基L75、L89、F96、M97、L124、M125和I171。使用较早描述的方法以及丙氨酸取代(与丙氨酸扫描诱变技术相一致)来初步研究这些另外标识的残基处的修饰的作用。
鉴于上述情况，设计了另外的IL-12p40和IL-12p35变体，其说明性序列分别在图42和43中进行了描绘。生成并且如实例1B中总体上描述的那样产生具有另外的变体IL-12亚基的IL-12-Fc融合蛋白，所述融合蛋白的序列在图44中进行了描绘。
如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究另外的变体IL-12-Fc融合物的活性。图46中描绘了描绘CD4+CD45RA+CD25+、CD4+CD45RA-CD25+、CD8+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且图47中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-FcXENP27201的减小倍数)的数据。数据表明，包括变体IL-12p40亚基和/或IL-12p35亚基的所有新颖IL-12-Fc融合物在诱导STAT4磷酸化方面表现出显著减少的效力。
实例3：二价IL-12-Fc融合物
还设想了二价IL-12-Fc融合物。一种此类形式是二价N端IL-12-Fc融合形式(图48A-B)，其包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的N端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。另一种此类形式是二价C端IL-12-Fc融合形式(图48C-D)，其包括两个相同的单体，每个单体包括与同源二聚体Fc链的C端(任选地通过结构域接头)重组融合的scIL-12复合物。
实例4：替代IL-12-Fc融合形式的效力降低的IL-12变体
还在另外的IL-12-Fc融合形式的上下文中研究了IL-12变体。scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc形式的融合物是用WT IL-12p40亚基或变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基产生的并且如实例1B中通常描述的产生(并且其序列在图49-50中描绘)。
如上文总体上描述的，在pSTAT4测定中研究IL-12-Fc融合物的活性。具体地，在37℃下用100ng/ml抗CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后在37℃下将经活化的PBMC与所指示的测试制品一起温育，持续15分钟。然后将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV711(M-A251)、抗CD45RA-BV421(HI100)和抗CD56-PE(N901)染色。接下来，使用PerFix EXPOSE(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司)将细胞透化。在透化之后，将细胞用抗FoxP3-V450(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。在图51中描绘了描绘CD4+CD45RA+CD25+、CD4+CD45RA-CD25+、CD8+CD45RA+CD25+和CD8+CD45RA-CD25+T细胞上的pSTAT4 MFI的数据，并且在图52中示出了描绘EC50(以及相对于WT IL-12-Fc XENP27201的倍数减小)的数据。数据示出各种形式的IL-12-Fc融合物显示出非常类似的效力，并且包括变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的scIL-12(p40/p35)-Fc和(scIL-12(p40/p35))2-Fc融合物中的IL-12-Fc融合物显示出与包括变体IL-12p40(E59K/K99E)亚基的呈IL-12异源Fc形式的IL-12-Fc融合物非常类似的效力。
实例5：IL-12-Fc融合物增强体内T细胞的同种异体抗肿瘤作用
接下来，研究了本发明的IL-12-Fc融合物的体内抗肿瘤作用。在第-15天，将NODSCIDγ(NSG)小鼠右腹皮下植入3×106个pp-65表达MCF-7细胞。在第0天，将小鼠腹膜内植入1.5×106个人PBMC。然后在第0天、第7天、第14天和第21天用0.03mg/kg XENP29952对小鼠(n＝15)进行治疗，即，包括变体IL-12p40(E59K)的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物。使用的对照物(n＝10)是PBS和XENP16432(二价抗PD-1mAb，通过抑制所植入的人T细胞来增强抗肿瘤活性的检查点抑制剂；图53中所描绘的序列)。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图54中示出了其数据(第1剂量后的天数)。在第7天、第14天和第21天抽取血液和血清，并通过流式细胞术进行分析，以研究人淋巴细胞的扩增，其数据如图55所示，并通过U-PLEX Biomarker第1组人类测定(马里兰州罗克维尔市的Meso Scale公司(MesoScale、Rockville、Md.))对血清细胞因子浓度进行分析，数据如图56所描绘。
数据表明，与PBS对照和通过XENP16432进行的检查点阻断两者相比，到第14天，IL-12-异源Fc融合物XENP29952已经显著增强CD45+、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的扩增(使用未配对t检验对经过对数变换的数据进行的统计)。值得注意的是，如肿瘤体积变化所指示的，到第11天，XENP29952显著增强了抗肿瘤活性(使用未配对t检验对经过基线校正的数据进行的统计)。此外，与通过XENP16432进行的检查点阻断相比，到第7天，XENP29952显著增强了IFNγ和CD25的分泌(使用未配对t检验对经过对数变换的日期进行的统计)。
除了抗肿瘤活性之外，移植的人PBMC还发展出针对小鼠细胞的自身免疫应答，并且随后引发了移植物抗宿主病(GVHD)。因此，应当注意，尽管用XENP29952治疗的所有动物到第19天均死亡，但这可能是由于人淋巴细胞的显著增强的扩增加剧了所述动物患有GVHD。这突显了效力降低的IL-12变体不仅对于改善药代动力学而且对于改善治疗指数的重要性。
实例6：IL-12-Fc融合物表现出与体外效力相关的体内调节活性
由于实例5中用XENP29952治疗的所有动物均因GVHD而死亡，因此在GVHD研究中研究了用效力降低的IL-12变体工程化的IL-12-Fc融合物的体内活性。
NSG小鼠在第-1天通过IV-OSP移植了10×106个人PBMC，并在第0天、第7天、第14天和第21天腹膜内以0.3或0.03mg/kg给药以下测试制品：XENP29952(包括变体IL-12p40(E59K))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP30597(包括变体IL-12p40(E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31254(包括变体IL-12p40(D18K/E59K/K99E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)、XENP31251(包括变体IL-12p40(E59K/K99Y))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)或XENP31258(包括变体IL-12p40(E59K/K99E/K264E))的呈IL-12-异源Fc形式的效力降低的IL-12-Fc融合物)。每周评估两次体重作为GVHD的指标，其数据在图57中描述为体重变化(相对于初始体重)。另外，在第7天、第10天、第14天和第31天抽血以研究PD-1表达水平所指示的各种T细胞群体的活化(其数据在图58和59中描绘)，并抽取血清以研究细胞因子分泌(其数据在图60中描绘)。值得注意的是，数据示出了测试制品的剂量应答(即，与0.03mg/kg剂量相比，0.3mg/kg剂量增强了GVHD、T细胞活化和IFNγ分泌)。
令人惊讶的是，XENP31251似乎是体外诱导CD4+T细胞上STAT4磷酸化的最弱变体之一(参见图46A-46B)，是GVHD的更强诱导剂之一。因此，使用两个单独的PBMC供体，在如上文通常所描述的STAT4磷酸化测定中重新研究了相同的示例性效力降低的IL-12-Fc的体外活性。在37℃下用1μg/ml抗CD3(OKT3)活化人PBMC持续2天。然后将活化的PBMC与指示的测试制品在37℃下温育15分钟。
然后将细胞用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPAT4)、抗CD8-AF700(SK1)、抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45-BV785、抗CD45RA-BV421(HI100)、抗CD16-PE(B73)和抗CD56-PE(N901)染色。接下来，使用PerFix EXPOSE(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司)将细胞透化。在透化之后，将细胞用抗FoxP3-AF488(259D)和抗pSTAT4-AF647(38/p-Stat4)染色，并通过流式细胞术进行分析。在图61中描绘了来自两个供体的PBMC中各种淋巴细胞群体上的STAT4磷酸化的诱导(数据未示出第二供体，但通过引用从图62并入62/848,512)中。来自两个供体并且跨不同的淋巴细胞群体的数据示出了效力阶梯，其中XENP29952为最强效变体，XENP31254和XENP31258为最不强效变体，并且XENP30597和XENP31251介于两者之间。值得注意的是，如由效力降低的IL-12-Fc融合变体在体内诱导的GVHD、T细胞活化程度和IFNγ分泌与体外效力相关。例如，在0.03mg/kg剂量下，相较于所有效力降低的IL-12-Fc融合物，XENP29952诱导的GVHD、T细胞活化和IFNγ分泌更高，而XENP31254和XENP31258诱导的GVHD、T细胞活化和IFNγ分泌最低。
实例7：IL-12-Fc融合物具有抗肿瘤活性，并与检查点阻断有效组合
接下来，研究了与另外的IL-12-Fc融合物结合的体内抗肿瘤作用以及IL-12-Fc融合物与检查点阻断结合的作用。在第-15天，将NSG小鼠右腹皮下植入3×106个pp-65表达MCF-7细胞。在第0天，将小鼠腹膜内植入5×106个人PBMC。然后在第0天、第7天、第14天和第21天用单独的0.1mg/kg XENP31251或与3.0mg/kg抗PD-1mAb XENP16432组合治疗小鼠。使用的对照物是PBS、单独的3.0mg/kg XENP16432和XENP31258。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图62中示出了其数据(第1剂量后的天数)。在第7天、第14天和第21天抽血，并通过流式细胞术进行分析，以研究人淋巴细胞的扩增，第14天的数据如图63所描绘。
数据表明，与用PBS治疗相比，XENP31258到第14天显著增强了抗肿瘤活性，并且XENP31251(单独或与XENP16432组合)到第16天显著增强了抗肿瘤活性(如肿瘤体积的变化所指示的)(使用曼-惠特尼检验对经过基线校正的数据进行的统计)。值得注意的是，数据表明，与单独使用XENP16432治疗相比，XENP31251与XENP16432的组合在第21天显著增强了抗肿瘤活性；并且与单独的XENP31251或XENP16432相比，用XENP31251与XENP16432组合的治疗显著增强了淋巴细胞扩增，从而表明IL-12-Fc融合物有效地与检查点阻断组合。
实例8：去除IL-12p40亚基中的游离半胱氨酸
IL-12p40亚基在位置252处具有游离半胱氨酸(根据如图1所描绘的人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列进行编号)，所述半胱氨酸可以与其它游离半胱氨酸结合，至少导致异质性并且导致免疫原性差。因此，例如通过引入C252S修饰(尽管也可以使用其它取代)来工程化IL-12p40变体以去除游离半胱氨酸。C252的修饰(例如，C252S)可以单独使用或者与其它任何IL-12p40变体(如亲和力或表达变体)组合使用。在图65中描绘了说明性IL-12p40变体，其包括C252处的修饰以去除游离半胱氨酸。说明性IL-12-Fc融合蛋白与另外的变体IL-12p40亚基一起产生，其序列在图66中进行了描绘，并如实例1B中通常描述的来产生。
如上文通常所描述的，在pSTAT4测定中研究了为去除游离半胱氨酸而工程化的IL-12p40变体的活性，以确定去除游离半胱氨酸不会引起活性的任何变化。将经活化的PBMC与指示的测试制品一起温育，并评估各种群体上的pSTAT4 MFI，其数据如图67所描绘。数据表明，包括C252S修饰的变体表现出与不包含C252S修饰的对应变体的活性类似的活性。值得注意的是，对于测试的4个变体中的3个，将具有和不具有C252S突变的版本(即，D18K/E59K/K99E；D18K/E59K/K99E/K264E；和E59K/K99E)工程化，C252S突变似乎会稍微提高IL-12-Fc融合物的效力。
提供上述实例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物、系统和方法的实施例的完整公开和描述，而不是旨在限制发明人认为是其发明的范围。对用于实施本发明的以上描述的模式进行的对于本领域的技术人员来说是显而易见的修改旨在处于以下权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个参考文献已经以全文引用的方式单独地并入。
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在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，如对本领域技术人员而言是明显的。本文描述的具体实施例和实例仅通过举例的方式提供，并且本申请仅受所附权利要求的条款以及权利要求有权获得的等效物的全部范围的限制。
Claims (239)
1.一种异源二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括变体IL-12p40亚基结构域和第一Fc结构域，其中所述IL-12p40亚基结构域与所述第一Fc结构域的N端共价连接；以及
b)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括IL-12p35亚基结构域和第二Fc结构域，其中所述IL-12p35亚基结构域与所述Fc结构域的N端共价连接；
其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰。
2.根据权利要求1所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：E59K、E59Q、D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
3.根据权利要求1或2所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ IDNO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基与选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列具有至少90％的同一性，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
6.根据权利要求1到4中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
7.根据权利要求1到4和6中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
8.根据权利要求6到7中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
9.根据权利要求6到8中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
10.根据权利要求6到9中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ IDNO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ IDNO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述变体IL-12p40亚基结构域使用第一结构域接头与所述第一Fc结构域连接和/或所述IL-12p35亚基结构域使用第二结构域接头与所述第二Fc结构域连接。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：
a)具有选自由以下组成的组的多肽序列的所述第一融合蛋白：i)SEQ ID NO:47(XENP27201链1)、ii)SEQ ID NO:85(XenD24752)；iii)SEQ ID NO:86(XenD24753)；iv)SEQID NO:87(XenD24754)；v)SEQ ID NO:88(XenD24755)；vi)SEQ ID NO:89(XenD24756)；vii)SEQ ID NO:90(XenD24757)；viii)SEQ ID NO:91(XenD24758)；ix)SEQ ID NO:92(XenD24759)；x)SEQ ID NO:93(XenD24760)；xi)SEQ ID NO:94(XenD24761)；xii)SEQ IDNO:95(XenD24762)；xiii)SEQ ID NO:96(XenD24763)；xiv)SEQ ID NO:97(XenD24764)；xv)SEQ ID NO:98(XenD24765)；xvi)SEQ ID NO:99(XenD24766)；xvii)SEQ ID NO:100(XenD24767)；xviii)SEQ ID NO:101(XenD24768)；xix)SEQ ID NO:102(XenD24769)；xx)SEQ ID NO:103(XenD24770)；xxi)SEQ ID NO:104(XenD24771)；xxii)SEQ ID NO:105(XenD24772)；xxiii)SEQ ID NO:106(XenD24773)；xxiv)SEQ ID NO:107(XenD24774)；xxv)SEQ ID NO:108(XenD24775)；xxvi)SEQ ID NO:109(XenD24776)；xxvii)SEQ ID NO:110(XenD24777)；xxviii)SEQ ID NO:111(XenD24778)；xxix)SEQ ID NO:112(XenD24792)；xxx)SEQ ID NO:215(XenD25922)；xxxi)SEQ ID NO:216(XenD25923)；xxxii)SEQ ID NO:217(XenD25924)；xxxiii)SEQ ID NO:218(XenD25925)；xxxiv)SEQ ID NO:219(XenD25926)；xxxv)SEQ ID NO:220(XenD25927)；xxxvi)SEQ ID NO:221(XenD25928)；xxxvii)SEQ ID NO:222(XenD25929)；xxxviii)SEQ ID NO:223(XenD25930)；xxxix)SEQ IDNO:224(XenD25931)；xl)SEQ ID NO:XXX(XenD26411)；xli)SEQ ID NO:XXX(XenD26412)；xlii)SEQ ID NO:XXX(XenD26413)；xliii)SEQ ID NO:XXX(XenD26414)；xliv)SEQ ID NO:XXX(XenD26415)；xlv)SEQ ID NO:XXX(XenD26416)；xlvi)SEQ ID NO:XXX(XenD26417)；xlvii)SEQ ID NO:XXX(XenD26418)；xlviii)SEQ ID NO:XXX(XenD27070)；xlix)SEQ IDNO:XXX(XenD27071)；l)SEQ ID NO:XXX(XenD27072)；li)SEQ ID NO:XXX(XenD27073)；lii)SEQ ID NO:XXX(XenD27074)；liii)SEQ ID NO:XXX(XenD27075)；liv)SEQ ID NO:XXX(XenD27076)；lv)SEQ ID NO:XXX(XenD27077)；lvi)SEQ ID NO:XXX(XenD27078)；lvii)SEQID NO:XXX(XenD28173)；lviii)SEQ ID NO:XXX(XenD24876)；lix)SEQ ID NO:XXX(XenD27162)；lx)SEQ ID NO:XXX(XenD27163)；lxi)SEQ ID NO:XXX(XenD27164)；lxii)SEQID NO:XXX(XenD27165)lxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP31582链1)、lxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP31583链1)、lxv)SEQ ID NO:XXX(XENP31584链1)、lxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32187链1)、lxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32188链1)、lxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP32189链1)、lxix)SEQ ID NO:XXX(XENP32190链1)、lxx)SEQ ID NO:XXX(XENP32191链1)、lxxi)SEQ ID NO:XXX(XENP32991链1)、lxxii)SEQ ID NO:XXX(XENP32992链1)、lxxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP32993链1)、lxxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP32994链1)、lxxv)SEQ ID NO:XXX(XENP32995链1)、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32996链1)、lxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32997链1)、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32998链1)、lxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32999链1)、lxxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33000链1)、lxxix)SEQ ID NO:XXX(XENP33001链1)、lxxx)SEQ ID NO:XXX(XENP33002链1)、lxxxi)SEQ ID NO:XXX(XENP33003链1)、lxxxii)SEQ IDNO:XXX(XENP33004链1)、lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP33005链1)、lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP33006链1)、lxxxv)SEQ ID NO:XXX(XENP33007链1)、lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链1)、lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链1)、lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33009链1)、lxxxix)SEQ ID NO:XXX(XENP33010链1)和xc)SEQ ID NO:XXX(XENP33011链1)；以及
b)具有选自由以下组成的组的多肽序列的所述第二融合蛋白：i)SEQ ID NO:48(XENP27201链2)、ii)SEQ ID NO:126(XenD24779)；iii)SEQ ID NO:127(XenD24780)；iv)SEQ ID NO:128(XenD24781)；v)SEQ ID NO:129(XenD24782)；vi)SEQ ID NO:130(XenD24783)；vii)SEQ ID NO:131(XenD24784)；viii)SEQ ID NO:132(XenD24785)；ix)SEQID NO:133(XenD24786)；x)SEQ ID NO:134(XenD24787)；xi)SEQ ID NO:135(XenD24788)；xii)SEQ ID NO:136(XenD24789)；xiii)SEQ ID NO:137(XenD24790)；xiv)SEQ ID NO:138(XenD24791)；xv)SEQ ID NO:236(XenD25911)；xvi)SEQ ID NO:237(XenD25912)；xvii)SEQID NO:238(XenD25913)；xviii)SEQ ID NO:239(XenD25914)；xix)SEQ ID NO:240(XenD25915)；xx)SEQ ID NO:241(XenD25916)；xxi)SEQ ID NO:242(XenD25917)；xxii)SEQID NO:243(XenD25918)；xxiii)SEQ ID NO:244(XenD25919)；xxiv)SEQ ID NO:245(XenD25920)；xxv)SEQ ID NO:246(XenD25921)；xxvi)SEQ ID NO:XXX(XenD26427)；xxvii)SEQ ID NO:XXX(XenD26428)；xxviii)SEQ ID NO:XXX(XenD27089)；xxix)SEQ ID NO:XXX(XenD27090)；xxx)SEQ ID NO:XXX(XenD27091)；xxxi)SEQ ID NO:XXX(XenD27092)；xxxii)SEQ ID NO:XXX(XenD27093)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(XenD27094)；xxxix)SEQ ID NO:XXX(XenD24877)；xl)SEQ ID NO:XXX(XenD27166)；xli)SEQ ID NO:XXX(XENP31582链2)、xlii)SEQ ID NO:XXX(XENP31583链2)、xliii)SEQ ID NO:XXX(XENP31584链2)、xliv)SEQ ID NO:XXX(XENP32187链2)、xlv)SEQ ID NO:XXX(XENP32188链2)、xlvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32189链2)、xlvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32190链2)、xlviii)SEQ ID NO:XXX(XENP32191链2)、xlix)SEQ ID NO:XXX(XENP32991链2)、l)SEQ ID NO:XXX(XENP32992链2)、li)SEQ ID NO:XXX(XENP32993链2)、lii)SEQ ID NO:XXX(XENP32994链2)、liii)SEQ IDNO:XXX(XENP32995链2)、liv)SEQ ID NO:XXX(XENP32996链2)、lv)SEQ ID NO:XXX(XENP32997链2)、lvi)SEQ ID NO:XXX(XENP32998链2)、lvii)SEQ ID NO:XXX(XENP32999链2)、lviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33000链2)、lix)SEQ ID NO:XXX(XENP33001链2)、lx)SEQID NO:XXX(XENP33002链2)、lxi)SEQ ID NO:XXX(XENP33003链2)、lxii)SEQ ID NO:XXX(XENP33004链2)、lxiii)SEQ ID NO:XXX(XENP33005链2)、lxiv)SEQ ID NO:XXX(XENP33006链2)、lxv)SEQ ID NO:XXX(XENP33007链2)、lxvi)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链2)、lxvii)SEQ ID NO:XXX(XENP33008链2)、lxviii)SEQ ID NO:XXX(XENP33009链2)、lxix)SEQ IDNO:XXX(XENP33010链2)和lxx)SEQ ID NO:XXX(XENP33011链2)。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白选自由以下组成的组：XENP27201、XENP28820、XENP28821、XENP28822、XENP28823、XENP28824、XENP28825、XENP28826、XENP28827、XENP28828、XENP28829、XENP28830、XENP28831、XENP28832、XENP28833、XENP28834、XENP28835、XENP28836、XENP28837、XENP28838、XENP28839、XENP28840、XENP28841、XENP28842、XENP28843、XENP28844、XENP28845、XENP28846、XENP28847、XENP28848、XENP28849、XENP28850、XENP28851、XENP28852、XENP29949、XENP29950、XENP29951、XENP29952、XENP30597、XENP30598、XENP30599、XENP30600、XENP30601、XENP30602、XENP30603、XENP30604、XENP30605、XENP30606、XENP30307、XENP30308、XENP30609、XENP31250、XENP31251、XENP31252、XENP31253、XENP31254、XENP31255、XENP31256、XENP31257、XENP31258、XENP31259、XENP31260、XENP31261、XENP31262、XENP31263、XENP31264、XENP31265、XENP31286、XENP31142、XENP31143、XENP31144、XENP31145、XENP31146、XENP31582、XENP31583、XENP31584、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190、XENP32191、XENP32991、XENP32992、XENP32993、XENP32994、XENP32995、XENP32996、XENP32997、XENP32998、XENP32999、XENP33000、XENP33001、XENP33002、XENP33003、XENP33004、XENP33005、XENP33006、XENP33007、XENP33008、XENP33008、XENP33009、XENP33010和XENP33011。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的异源二聚体Fc融合物，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白选自由以下组成的组：XENP31251、XENP31254、XENP31258、XENP32186、XENP32187、XENP32188、XENP32189、XENP32190和XENP32191。
19.根据权利要求17到18中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其进一步包括选自由以下组成的组的对所述IL-12p40亚基的一个或多个修饰：N103Q、N113Q、N200Q和N281Q。
20.一种组合物，其包括根据权利要求1到19中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
21.一种或多种核酸，其对根据权利要求1到19中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
22.一种宿主细胞，其包括根据权利要求21所述的一种或多种核酸。
23.一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求22所述的宿主细胞。
24.一种纯化根据权利要求1到19中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
25.一种异源二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第一Fc结构域的C端共价连接；以及
b)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二蛋白质结构域和第二Fc结构域，其中所述第二蛋白质结构域与所述Fc结构域的C端共价连接；
其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p40亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p35亚基。
26.根据权利要求25所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K、L368D/K370S和S364K/E357L、L368D/K370S和S364K/E357Q、T411E/K360E/Q362E和D401K、L368E/K370S和S364K、K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
27.根据权利要求25或26所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第一Fc结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第二Fc结构域连接。
28.根据权利要求25到27中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
29.根据权利要求25到28中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
30.根据权利要求25到29中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
31.根据权利要求25到30中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
32.根据权利要求25到31中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
33.根据权利要求25到32中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
34.根据权利要求25到33中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
35.根据权利要求25到34中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
36.根据权利要求25到35中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
37.根据权利要求25到36中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
38.根据权利要求25到37中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
39.根据权利要求25到38中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
40.根据权利要求25到39中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D、N85D/N195D。
41.根据权利要求25到40中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
42.根据权利要求25到40中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：
a)具有SEQ ID NO:49(XENP27202链1)的多肽序列的所述第一融合蛋白，以及
b)具有SEQ ID NO:50(XENP27202链2)的多肽序列的所述第二融合蛋白。
43.根据权利要求25到41中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP27202。
44.一种组合物，其包括根据权利要求25到42中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
45.一种或多种核酸，其对根据权利要求25到42中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
46.一种宿主细胞，其包括根据权利要求44所述的一种或多种核酸。
47.一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求45所述的宿主细胞。
48.一种纯化根据权利要求25到42中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
49.一种异源二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第二蛋白质结构域共价连接，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一Fc结构域的N端共价连接；以及
b)第二Fc结构域；
其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p40亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p35亚基。
50.根据权利要求48所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
51.根据权利要求48或49所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
52.根据权利要求48到50中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
53.根据权利要求48到51中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
54.根据权利要求48到52中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
55.根据权利要求48到53中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
56.根据权利要求48到53中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
57.根据权利要求48到55中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
58.根据权利要求48到56中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、K158、C252、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
59.根据权利要求48到57中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
60.根据权利要求48到58中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
61.根据权利要求48到59中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ IDNO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ IDNO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
62.根据权利要求48到60中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
63.根据权利要求48到61中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
64.根据权利要求48到62中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D、N85D/N195D。
65.根据权利要求48到63中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ IDNO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
66.根据权利要求48到64中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：
a)具有SEQ ID NO:51(XENP27203链1)的多肽序列的所述融合蛋白，以及
b)具有SEQ ID NO:52(XENP27203链2)的多肽序列的所述第二Fc结构域。
67.根据权利要求48到65中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP27203。
68.根据权利要求48到65中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP31290。
69.一种组合物，其包括根据权利要求48到66中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
70.一种或多种核酸，其对根据权利要求48到67中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
71.一种宿主细胞，其包括根据权利要求69所述的一种或多种核酸。
72.一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求70所述的宿主细胞。
73.一种纯化根据权利要求48到67中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
74.一种异源二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第二蛋白质结构域共价连接，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一Fc结构域的N端共价连接；以及
b)第二Fc结构域；
其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p35亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p40亚基。
75.根据权利要求73所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L、L368D/K370S和S364K/E357Q、T411E/K360E/Q362E和D401K、L368E/K370S和S364K、K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
76.根据权利要求73或74所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
77.根据权利要求73到75中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
78.根据权利要求73到76中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
79.根据权利要求73到77中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和/或SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
80.根据权利要求73到78中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
81.根据权利要求73到79中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
82.根据权利要求73到80中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
83.根据权利要求73到81中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
84.根据权利要求73到82中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
85.根据权利要求73到83中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
86.根据权利要求73到84中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ IDNO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
87.根据权利要求73到85中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
88.根据权利要求73到86中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
89.根据权利要求73到87中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
90.根据权利要求73到88中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
91.根据权利要求73到89中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白包括：
a)具有SEQ ID NO:53(XENP27204链1)的多肽序列的所述融合蛋白，以及
b)具有SEQ ID NO:54(XENP27204链2)的多肽序列的所述第二Fc结构域。
92.根据权利要求73到90中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述异源二聚体Fc融合蛋白是XENP27204。
93.一种组合物，其包括根据权利要求73到91中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
94.一种或多种核酸，其对根据权利要求73到91中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
95.一种宿主细胞，其包括根据权利要求93所述的一种或多种核酸。
96.一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求94所述的宿主细胞。
97.一种纯化根据权利要求73到91中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
98.一种异源二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第一Fc结构域的C端连接，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一蛋白质结构域共价连接；以及
b)第二Fc结构域；
其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p40亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p35亚基。
99.根据权利要求97所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
100.根据权利要求97或98所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
101.根据权利要求97到99中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
102.根据权利要求97到100中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
103.根据权利要求97到101中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
104.根据权利要求97到102中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
105.根据权利要求97到103中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
106.根据权利要求97到104中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
107.根据权利要求97到105中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
108.根据权利要求97到106中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
109.根据权利要求97到107中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
110.根据权利要求97到1081中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
111.根据权利要求97到109中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
112.根据权利要求97到110中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
113.根据权利要求97到111中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
114.根据权利要求97到112中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ IDNO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ IDNO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
115.一种组合物，其包括根据权利要求97到113中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
116.一种或多种核酸，其对根据权利要求97到113中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
117.一种宿主细胞，其包括根据权利要求115所述的一种或多种核酸。
118.一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求116所述的宿主细胞。
119.一种纯化根据权利要求97到113中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
120.一种异源二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)融合蛋白，所述融合蛋白包括第一蛋白质结构域、第二蛋白质结构域和第一Fc结构域，其中所述第一蛋白质结构域与所述第一Fc结构域的C端连接，并且其中所述第二蛋白质结构域与所述第一蛋白质结构域共价连接；以及
b)第二Fc结构域；
其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的修饰，并且其中所述第一蛋白质结构域包括IL-12p35亚基，并且所述第二蛋白质结构域包括IL-12p40亚基。
121.根据权利要求119所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域异源二聚化的所述修饰是选自由以下组成的组的一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥连二硫键T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)。
122.根据权利要求119或120所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一蛋白质结构域使用第一结构域接头与所述第二蛋白质结构域连接和/或所述第二蛋白质结构域使用第二结构域接头与所述第一Fc结构域连接。
123.根据权利要求119到121中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的另外一组氨基酸取代。
124.根据权利要求119到122中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
125.根据权利要求119到123中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
126.根据权利要求119到124中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
127.根据权利要求119到125中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
128.根据权利要求119到126中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
129.根据权利要求119到127中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
130.根据权利要求119到128中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
131.根据权利要求119到129中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
132.根据权利要求119到130中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
133.根据权利要求119到131中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
134.根据权利要求119到132中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
135.根据权利要求119到133中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ IDNO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ IDNO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
136.一种组合物，其包括根据权利要求119到134中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
137.一种或多种核酸，其对根据权利要求119到134中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
138.一种宿主细胞，其包括根据权利要求136所述的一种或多种核酸。
139.一种制备异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求137所述的宿主细胞。
140.一种纯化根据权利要求119到134中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述异源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述异源二聚体Fc融合蛋白的级分。
141.一种异源二聚体复合物，其包括：
a)IL-12p40亚基，以及
b)IL-12p35亚基。
142.根据权利要求140所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基使用结构域接头与所述IL-12p35亚基共价连接。
143.根据权利要求140或141所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，和/或所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ IDNO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
144.根据权利要求140到142中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
145.根据权利要求140到143中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
146.根据权利要求140到144中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
147.根据权利要求140到145中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252、Q256、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
148.根据权利要求140到146中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
149.根据权利要求140到147中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
150.根据权利要求140到148中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ IDNO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
151.根据权利要求140到149中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
152.根据权利要求140到150中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
153.根据权利要求140到151中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
154.根据权利要求140到152中任一项所述的异源二聚体复合物，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ IDNO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
155.一种组合物，其包括根据权利要求140到153中任一项所述的异源二聚体复合物，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
156.一种或多种核酸，其对根据权利要求140到153中任一项所述的异源二聚体复合物进行编码。
157.一种宿主细胞，其包括根据权利要求155所述的一种或多种核酸。
158.一种制备异源二聚体复合物的方法，所述方法包括在产生所述异源二聚体复合物的条件下培养根据权利要求156所述的宿主细胞。
159.一种变体IL-12p40亚基，其对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力。
160.根据权利要求1所述的变体IL-12p40亚基，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、Q256、C252、K258、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
161.根据权利要求158或159所述的变体Il-12p40亚基，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
162.根据权利要求158到160中任一项所述的变体IL-12p40亚基，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
163.根据权利要求158到161中任一项所述的变体IL-12p40，其中所述变体IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ IDNO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ IDNO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
164.一种组合物，其包括根据权利要求158到162中任一项所述的变体IL-12p40亚基。
165.一种核酸，其对根据权利要求158到162中任一项所述的变体IL-12p40亚基进行编码。
166.一种宿主细胞，其包括根据权利要求164所述的核酸。
167.一种制备变体IL-12p40亚基的方法，所述方法包括在产生所述变体IL-12p40亚基的条件下培养根据权利要求165所述的宿主细胞。
168.一种变体IL-12p35亚基，其对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力。
169.根据权利要求167所述的变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
170.根据权利要求167或168所述的变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
171.根据权利要求167到169中任一项所述的变体IL-12p35亚基，其中选自由以下组成的组的氨基酸取代的所述变体IL-12p35亚基：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
172.根据权利要求167到170中任一项所述的变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有氨基酸取代N71D/N85D/N195D。
173.根据权利要求167到171中任一项所述的变体IL-12p35亚基，其中所述变体IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：
i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；
v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ IDNO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
174.一种组合物，其包括根据权利要求167到172中任一项所述的变体IL-12p35亚基。
175.一种核酸，其对根据权利要求167到172中任一项所述的变体IL-12p35亚基进行编码。
176.一种宿主细胞，其包括根据权利要求174所述的核酸。
177.一种制备变体IL-12p35亚基的方法，所述方法包括在产生所述变体IL-12p35亚基的条件下培养根据权利要求175所述的宿主细胞。
178.一种异源二聚体蛋白，其包括：
a)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括与第一Fc结构域共价连接的IL-12p40亚基结构域；以及
b)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括与第二Fc结构域共价连接的IL-12p35亚基结构域；
其中选自由以下组成的组的所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
179.根据权利要求177所述的异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p40亚基结构域与所述第一Fc结构域的N端连接，并且所述IL-12p35亚基结构域与所述第二Fc结构域的N端连接。
180.根据权利要求177所述的异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p40亚基结构域与所述第一Fc结构域的C端连接，并且所述IL-12p35亚基结构域与所述第二Fc结构域的C端连接。
181.根据权利要求177到179中任一项所述的异源二聚体蛋白，其中所述Il-12p40亚基结构域使用结构域接头与所述第一Fc结构域连接，并且所述IL-12p35亚基结构域使用结构域接头与所述第二Fc结构域连接。
182.根据权利要求177到180中任一项所述的异源二聚体蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包括IgG1铰链-CH2-CH3。
183.根据权利要求177所述的异源二聚体蛋白，其中所述第一融合蛋白从N端到C端包括IL-12p40亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3，并且所述第二融合蛋白从N端到C端包括IL-12p35亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3。
184.根据权利要求177所述的异源二聚体蛋白，其中所述第一融合蛋白从N端到C端包括铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p40亚基结构域，并且所述第二融合蛋白从N端到C端包括铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
185.一种异源二聚体蛋白，其包括：
a)第一Fc结构域；以及
b)融合蛋白，所述融合蛋白包括：
i)第二Fc结构域；
ii)IL-12p40亚基结构域；以及
iii)IL-12p35亚基结构域；
其中选自由以下组成的组的所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域一组氨基酸取代：根据EU编号的L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V和T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C和T366W/S354C。
186.根据权利要求184所述的异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：IL-12p40亚基结构域-结构域接头-IL-12p35亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3。
187.根据权利要求184所述的异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：IL-12p35亚基结构域-结构域接头-IL-12p40亚基结构域-结构域接头-铰链-CH2-CH3。
188.根据权利要求184所述的异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p35亚基结构域-结构域接头-IL-12p40亚基结构域。
189.根据权利要求184所述的异源二聚体蛋白，其中所述融合蛋白从N端到C端包括：铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-12p40亚基结构域-结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
190.根据权利要求177到188中任一项所述的异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQ ID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ IDNO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQ ID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ ID NO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQ ID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ IDNO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
191.根据权利要求177到188中任一项所述的异源二聚体蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ ID NO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ ID NO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ ID NO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q),lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；lxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D),lxiv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；lxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和lxvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
192.根据权利要求177到190中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
193.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p40亚基结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-任选的第二结构域接头-Fc结构域。
194.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p35亚基结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-任选的第二结构域接头-Fc结构域。
195.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-任选的第二结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
196.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-任选的第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-任选的第二结构域接头-IL-12p40亚基结构域。
197.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p40亚基结构域-第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-第二结构域接头-Fc结构域。
198.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括IL-12p35亚基结构域-第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-第二结构域接头-Fc结构域。
199.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-第一结构域接头-IL-12p40亚基结构域-第二结构域接头-IL-12p35亚基结构域。
200.一种同源二聚体Fc融合蛋白，其包括第一单体和第二单体，所述第一单体和所述第二单体各自从N端到C端包括Fc结构域-第一结构域接头-IL-12p35亚基结构域-第二结构域接头-IL-12p40亚基结构域。
201.根据权利要求192到199所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中促进所述Fc结构域的同源二聚化的所述修饰是选自由根据EU编号的L368D/K370S；S364K；S364K/E357L；S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E；D401K；T366S/L368A/Y407V；T366W；T366S/L368A/Y407V/Y349C；和T366W/S354C,组成的组的一组氨基酸取代。
202.根据权利要求192到200所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一结构域接头和所述第二结构域接头具有相同的氨基酸序列。
203.根据权利要求192到201中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有包括根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D,的另外一组氨基酸取代。
204.根据权利要求192到202中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域具有选自由根据EU编号的G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K、E233P/L234V/L235A/G236_/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236_和E233P/L234V/L235A/G236_/S267K,组成的组的另外一组氨基酸取代。
205.根据权利要求192到203中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由SEQ ID NO:3(人IL-12亚基β(IL-12p40)前体序列)和SEQ ID NO:4(人IL-12亚基β(IL-12p40)成熟形式序列)组成的组的多肽序列，并且所述IL-12p35亚基具有选自由SEQ ID NO:1(人IL-12亚基α(IL-12p35)前体序列)和SEQ ID NO:2(人IL-12亚基α(IL-12p35)成熟形式序列)组成的组的多肽序列。
206.根据权利要求192到204中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域中的每个Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
207.根据权利要求192到205中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是变体IL-12p40亚基和/或所述IL-12p35亚基是变体IL-12p35亚基。
208.根据权利要求192到206中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p40亚基；和/或所述IL-12p35亚基是对IL-12受体亚基β-1(IL-12Rβ1)、IL-12受体亚基β-2(IL-12Rβ2)和/或IL-12受体复合物具有改变的亲和力的变体IL-12p35亚基。
209.根据权利要求192到207中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的在氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰：E3、D7、E12、D14、W15、P17、D18、A19、P20、G21、E22、M23、D29、E32、E33、D34、L40、D41、Q42、S43、E45、L47、T54、I55、Q56、K58、E59、F60、G61、D62、Q65、Y66、E73、K84、E86、D87、G88、I89、W90、D93、D97、K99、E100、K102、N103、K104、F106、E110、N113、Y114、D129、D142、Q144、E156、R159、D161、N162、K163、D166、D170、Q172、D174、A176、C177、P178、A179、A180、E181、S183、P185、E187、N200、S204、F206、R208、D209、D214、N218、Q220、N226、Q229、E231、E235、T242、P243、S245、Y246、F247、S248、C252S、Q256、K158、K260、E262、K264、D265、D270、N281、Q289、D290、R291、Y292、Y293和E299。
210.根据权利要求192到208中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：D18N、D18K、E32Q、E33Q、D34N、D34K、Q42E、S43E、S43K、E45Q、Q56E、E59Q、E59K、D62N、E73Q、D87N、K99E、K99Y、E100Q、N103D、N103Q、N113D、N113Q、Q144E、D161N、R159E、K163E、E187Q、N200D、N200Q、N218Q、Q229E、E235Q、C252S、Q256N、K258E、K260E、E262Q、K264E、N281D、N281Q和E299Q。
211.根据权利要求192到209中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N103D/N113D/N200D/N281D、Q42E/E45Q、E45Q/Q56E、Q42E/E59Q、Q56E/E59Q、Q42E/E45Q/Q56E、E45Q/Q56E/E59Q、E32Q/E59Q、D34N/E59K、D34N/E59K/K99E、D34K/E59K/K99E、E32Q/D34N/E59K/K99E、E32K/D34N/E59K/K99E、D34N/E59Q、E59Q/E187Q、S43E/E59Q、S43K/E49Q、E59Q/K163E、E59Q/K99E、E59Q/K258E、E59Q/K260E、E59K/K99E、D18K/E59K/K99E、E59K/K99E/K264E、E59K/K99Y、E59Y/K99Y、E59Y/K99E、E45K/E59K/K99E、E59K/K99E/Q144E、E59K/K99E/Q144K、E59K/K99E/R159E、E59K/K99E/K264E、D18K/E59K/K99E/K264E、DI8K/E59K/K99E/C252S、D18K/E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99Y/C252S、E59K/K99E/C252S/K264E、E59K/K99E/C252S、N103D/N113D、N103D/N200D、N103D/N281D、N113D/N200D、N113D/N281D、N200D/N281D、N103D/N113D/N200D、N103D/N113D/N281D、N103D/N200D/N281D、N113D/N200D/N281D、N103Q/N113Q、N103Q/N200Q、N103Q/N281Q、N113Q/N200Q、N113Q/N281Q、N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q、N103Q/N113Q/N281Q、N103Q/N200Q/N281Q、N113Q/N200Q/N281Q、N103Q/N113Q/N200Q/N281Q、E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E、E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E和E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E。
212.根据权利要求192到210中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p40亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:57(IL-12p40(N103D))；ii)SEQ ID NO:58(IL-12p40(N113D))；iii)SEQ ID NO:59(IL-12p40(N200D))；iv)SEQ ID NO:60(IL-12p40(N281D))；v)SEQ ID NO:61(IL-12p40(N103D/N113D/N200D/N281D))；vi)SEQID NO:62(IL-12p40(Q42E))；vii)SEQ ID NO:63(IL-12p40(E45Q))；viii)SEQ ID NO:64(IL-12p40(Q56E))；ix)SEQ ID NO:65(IL-12p40(E59Q))；x)SEQ ID NO:66(IL-12p40(D62N))；xi)SEQ ID NO:67(IL-12p40(Q42E/E45Q))；xii)SEQ ID NO:68(IL-12p40(E45Q/Q56E))；xiii)SEQ ID NO:69(IL-12p40(Q42E/E59Q))；xiv)SEQ ID NO:70(IL-12p40(Q56E/E59Q))；xv)SEQ ID NO:71(IL-12p40(Q42E/E45Q/Q56E))；xvi)SEQ ID NO:72(IL-12p40(E45Q/Q56E/E59Q))；xvii)SEQ ID NO:73(IL-12p40(D161N))；xviii)SEQ ID NO:74(IL-12p40(E73Q))；xix)SEQ ID NO:75(IL-12p40(Q144E))；xx)SEQ ID NO:76(IL-12p40(E262Q))；xxi)SEQ ID NO:77(IL-12p40(E100Q))；xxii)SEQ ID NO:78(IL-12p40(D18N))；xxiii)SEQ ID NO:79(IL-12p40(E33Q))；xxiv)SEQ ID NO:80(IL-12p40(Q229E))；xxv)SEQID NO:81(IL-12p40(E235Q))；xxvi)SEQ ID NO:82(IL-12p40(Q256N))；xxvii)SEQ ID NO:83(IL-12p40(E299Q))；xxviii)SEQ ID NO:84(IL-12p40(D87N))；xxix)IL-12p40(E32Q)；xxx)IL-12p40(D34N)；xxxi)IL-12p40(S43E)；xxxii)IL-12p40(S43K)；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；xxxiv)SEQ ID NO:205(IL-12p40(E59K))；xxxv)IL-12p40(K99E)；xxxvi)IL-12p40(K163E)；xxxvii)IL-12p40(E187Q)；xxxviii)IL-12p40(K258E)；xxxix)IL-12p40(K260E)；xl)SEQ ID NO:206(IL-12p40(E32Q/E59Q))；xli)SEQ ID NO:207(IL-12p40(D34N/E59Q))；xlii)SEQ ID NO:208(IL-12p40(E59Q/E187Q))；xliii)SEQ ID NO:209(IL-12p40(S43E/E59Q))；xliv)SEQ IDNO:210(IL-12p40(S43K/E49Q))；xlv)SEQ ID NO:211(IL-12p40(E59Q/K163E))；xlvi)SEQID NO:212(IL-12p40(E59Q/K99E))；xlvii)SEQ ID NO:213(IL-12p40(E59Q/K258E))；xlviii)SEQ ID NO:214(IL-12p40(E59Q/K260E))；xlix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K))；l)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E))；li)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E))；lii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；liii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y))；liv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99E))；lv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E45K/E59K/K99E))；lvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144E))；lvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/Q144K))；lviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/R159E))；lix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/K264E))；lx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/K264E))；lxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(C252S))；lxii)SEQID NO:XXX(IL-12p40(DI8K/E59K/K99E/C252S))；lxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D18K/E59K/K99E/C252S/K264E))；lxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99Y/C252S))；lxv)SEQID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S/K264E))；lxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/C252S))；lxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D))；lxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D))；lxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N281D))；lxx)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D))；lxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N281D))；lxxii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200D/N281D))；lxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p50(N103D/N113D/N200D))；lxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N113D/N281D))；lxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103D/N200D/N281D))；lxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113D/N200D/N281D))；lxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q))；lxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q))；lxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q))；lxxx)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N281Q))；lxxxi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q))；lxxxii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q))；lxxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N281Q))；lxxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q))；lxxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N281Q))；lxxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N200Q/N281Q))；lxxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q))；lxxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N281Q))；lxxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N200Q/N281Q))；xc)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N113Q/N200Q/N281Q))；xci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(N103Q/N113Q/N200Q/N281Q))；xcii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34N/E59K/K99E))；xciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(D34K/E59K/K99E))；xciv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32Q/D34N/E59K/K99E))；xcv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E32K/D34N/E59K/K99E))；xcvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59Y/K99Y))；xcvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/C252S/K264E))；xcviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/C252S/K264E))；xcix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/C252S/K264E))；c)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N281Q/C252S/K264E))；ci)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/C252S/K264E))；cii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/C252S/K264E))；ciii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N281Q/C252S/K264E))；civ)SEQ IDNO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N281Q/C252S/K264E))；cvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N200Q/N281Q/C252S/K264E))；cvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N113Q/N200Q/C252S/K264E))；cviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N103Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))和cix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p40(E59K/K99E/N113Q/N200Q/N281Q/C252S/K264E))。
213.根据权利要求192到211中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的作为氨基酸残基的一个或多个氨基酸修饰：Q20、N21、Q35、E38、S44、E45、E46、H49、K54、D55、T59、V60、E61、C63、L64、P65、E67、L68、N71、S73、C74、L75、N76、E79、N85、L89、F96、M97、L124、M125、Q130、Q135、N136、E143、Q146、N151、E153、K158、E162、E163、D165、I171、R181、I182、R183、V185、T186、D188、R189、V190、S192、Y193、N195和A196。
214.根据权利要求192到212中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：N21D、Q35D、E38Q、D55Q、D55K、N71D、N71Q、L75A、N76D、E79Q、N85D、N85Q、L89A、F96A、M97A、L124A、M125A、Q130E、Q135E、N136D、E143Q、Q146E、N151D、N151K、E153K、E153Q、K158E、E162Q、E163Q、D165N、I171A、N195D和N195Q。
215.根据权利要求192到213中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：N71D/N85D/N195D、N151D/E153Q、N151D/D165N、Q130E/N151D、N151D/K158E、E79Q/N151D、D55Q/N151D、N136D/N151D、N21D/N151D、E143Q/N151D、N71Q/N85Q、N71Q/N195Q、N85Q/N195Q、N71Q/N85Q/N195Q、N71D/N85D、N71D/N195D和N85D/N195D。
216.根据权利要求192到214中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述IL-12p35亚基具有选自由以下组成的组的多肽序列：i)SEQ ID NO:113(IL-12p35(N71D))；ii)SEQ ID NO:114(IL-12p35(N85D))；iii)SEQ ID NO:115(IL-12p35(N195D))；iv)SEQ IDNO:116(IL-12p35(N71D/N85D/N195D))；v)SEQ ID NO:117(IL-12p35(E153Q))；vi)SEQ IDNO:118(IL-12p35(E38Q))；vii)SEQ ID NO:119(IL-12p35(N151D))；viii)SEQ ID NO:120(IL-12p35(Q135E))；ix)SEQ ID NO:121(IL-12p35(Q35D))；x)SEQ ID NO:122(IL-12p35(Q146E))；xi)SEQ ID NO:123(IL-12p35(N76D))；xii)SEQ ID NO:124(IL-12p35(E162Q))；xiii)SEQ ID NO:125(IL-12p35(E163Q))；xiv)IL-12p35(N21D)；xv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))；xvi)IL-12p35(E79Q)；xvii)IL-12p35(Q130E)；xviii)IL-12p35(N136D)；xix)IL-12p35(E143Q)；xx)SEQ ID NO:227(IL-12p35(N151K))；xxi)SEQ ID NO:226(IL-12p35(E153K))；xxii)IL-12p35(K158E)；xxiii)IL-12p35(D165N)；xxiv)SEQ ID NO:225(IL-12p35(N151D/E153Q))；xxv)SEQ ID NO:228(IL-12p35(N151D/D165N))；xxvi)SEQ IDNO:229(IL-12p35(Q130E/N151D))；xxvii)SEQ ID NO:230(IL-12p35(N151D/K158E))；xxviii)SEQ ID NO:231(IL-12p35(E79Q/N151D))；xxix)SEQ ID NO:232(IL-12p35(D55Q/N151D))；xxx)SEQ ID NO:233(IL-12p35(N136D/N151D))；xxxi)SEQ ID NO:234(IL-12p35(N21D/N151D))；xxxii)SEQ ID NO:235(IL-12p35(E143Q/N151D))；xxxiii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(F96A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M97A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L89A))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L124A))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(M125A))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(L75A))；xxxiv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(I171A))；xxxv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q))；xxxvi)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q))；xxxvii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N195Q))；xxxviii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q))；xxxix)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N195Q))；xl)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N85Q/N195Q)；xli)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71Q/N85Q/N195Q))；xlii)SEQ IDNO:XXX(IL-12p35(N71D/N85D))；xliii)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(N71D/N195D)；xliv)SEQID NO:XXX(IL-12p35(N85D/N195D))；xlv)SEQ ID NO:XXX(IL-12p35(D55Q))和xlvi)SEQID NO:XXX(IL-12p35(D55K))。
217.根据权利要求192或196所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体为XENP31289。
218.根据权利要求192或196中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一单体和所述第二单体为XENP31291。
219.一种组合物，其包括根据权利要求192到217中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白，所述组合物用于在治疗受试者的癌症时使用。
220.一种或多种核酸，其对根据权利要求192到217中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白进行编码。
221.一种宿主细胞，其包括根据权利要求219所述的一种或多种核酸。
222.一种制备同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述同源二聚体Fc融合蛋白的条件下培养根据权利要求220所述的宿主细胞。
223.一种纯化根据权利要求192到217中任一项所述的同源二聚体Fc融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述同源二聚体Fc融合蛋白的组合物；
b)将所述组合物上样到离子交换柱上；以及
c)收集含有所述同源二聚体Fc融合蛋白的级分。
224.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白或同源二聚体Fc融合蛋白。
225.根据权利要求223所述的方法，其进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。
226.根据权利要求224所述的方法，其中所述检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
227.根据权利要求225所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或皮地利珠单抗(pidilizumab)。
228.根据权利要求225所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或度伐鲁单抗(durbalumab)。
229.根据权利要求223到227中任一项所述的方法，其中所述患者在施用之后表现出淋巴细胞增加。
230.根据权利要求223到228中任一项所述的方法，其中所述患者在施用之后表现出外周CD8+T细胞增加。
231.一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白或同源二聚体Fc融合蛋白。
232.根据权利要求230所述的方法，其进一步包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。
233.根据权利要求231所述的方法，其中所述检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
234.根据权利要求232所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗。
235.根据权利要求232所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特朱单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗。
236.根据权利要求230到234中任一项所述的方法，其中所述T细胞扩增是T细胞增加至少2倍。
237.根据权利要求224到229和230到235中任一项所述的方法，其中在检查点抑制剂之前施用IL-12Fc融合蛋白，以增加治疗前的检查点表达。
238.根据权利要求226、228、229、233和235中任一项所述的方法，其中在检查点抑制剂之前施用IL-12Fc融合蛋白，以增加治疗前的检查点表达。
239.根据权利要求119到124中任一项所述的异源二聚体Fc融合蛋白，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域进一步包括氨基酸取代M428L/N424S。
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