KR20200085828A - 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이중특이적 이종이합체성 관문 항체에 관한 것이다.

Description

신규의 항-PD-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체

우선권 주장

본 출원은 2017년 11월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/583,438호; 2017년 12월 14일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/598,938호 및 2018년 4월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/658,227호의 우선권을 주장하고, 이들 모두는 도면, 범례 및 청구범위를 특히 참조하여 그 전체 내용이 본원에 명확히 인용되어 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된 서열 목록을 포함한다. 2018년 4월 16일에 작성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 067461_5215-PR_SL.txt이고 크기가 33,716,782 킬로바이트이다.

관문 수용체, 예컨대 CTLA-4, PD-1(예정 세포사 1), TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 3), LAG-3(림프구-활성화 유전자 3), TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체) 및 기타는 T 세포 및 다른 세포 유형의 활성화, 증식 및/또는 효과기(effector) 활성을 억제한다. 관문 수용체가 종양 세포에 대한 내인성 T 세포 반응을 억제한다는 가설에 근거하여, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 이필리무맙 및 트레멜리무맙을 포함한 항-CTLA4 및 항-PD1 항체의 전임상 연구 및 임상 연구는 실제로 관문 차단이 두드러진 항종양 반응을 유발하여 종양 세포를 공격하는 내인성 T 세포를 자극하여 다양한 악성상태를 가진 환자의 일부에서 장기적인 암의 차도를 유도한다는 것이 입증되었다. 불행하게도, 환자의 하위집합만이 이들 치료법에 반응하며, 반응률은 일반적으로 적응증 및 다른 요인에 따라 10% 내지 30%의 범위이고 때때로 각각의 단일요법의 경우에 더 높다. 이러한 제제의 치료학적 조합물, 예를 들어 이필리무맙과 니볼루맙은 훨씬 더 높은 반응률을 보이며, 일부 사례에서 약 60%에 근접한다. 전임상 연구는 항-PD-1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체와 LAG-3, TIM-3, BTLA 및 TIGIT를 포함하는 더 최근에 확인된 관문 수용체의 차단 사이의 추가적인 상승작용을 보여주었다. 다중 관문 차단의 가능성은 매우 유망하지만, 이러한 제제와의 병용요법은 재정적 부담이 높을 것으로 예상된다. 게다가, 병용요법, 예를 들어 니볼루맙과 이필리무맙의 자가면역 독성은 단일요법과 비교하여 유의미하게 증가하여 많은 환자가 그 요법을 중단하게 된다.

많은 연구(문헌[Ahmadzadeh et al., Blood 114:1537 (2009), Matsuzaki et al., PNAS 107(17):7875-7880 (2010)], 문헌[Fourcade et al., Cancer Res. 72(4):887-896 (2012)] 및 문헌[Gros et al., J. Clinical Invest. 124(5):2246 (2014)])는 종양 침윤성 림프구(TIL: tumor-infiltrating lymphocyte)를 조사하여 TIL이 공통적으로 다중 관문 수용체를 발현한다는 것을 보여주었다. 게다가, 다중 관문을 발현하는 TIL이 실제로 종양 반응성이 가장 높은 것 같다. 대조적으로, 말초에서의 비종양 반응성 T 세포는 단일 관문을 발현할 가능성이 더 크다. 단일특이적 전장 항체를 사용한 관문 차단은 자가면역 독성에 기여하는 것으로 가정되는 자가 항원 반응성 단일 발현 T 세포에 대해 종양 반응성 TIL의 탈억제와 관련하여 구별되지 않을 것 같다.

따라서, 본 발명은 인간 PD-1 및 제2의 상이한 관문 억제제 단백질에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 인간 PD-1에 결합하는 단일특이적 단일클론 항체가 또한 제공된다.

본 발명은 신규의 항-PD-1 항원 결합 도메인(ABD: antigen binding domain), 및 PD-1 및 CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, BTLA 및 ICOS로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 표적 항원에 결합하는 항-PD-1 1가 단일클론 항체 및 이종이합체성 이중특이적 항체의 생성에서의 이의 용도, 및 이 항체를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 일부 양태에서 본 발명은 항-PD-1 1가 단일클론 항체를 제공한다. 이 양태에서, 항-PD-1 단일클론 항체는 a) N 말단에서 C 말단으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄; 및 b) N 말단에서 C 말단으로 VL-CL을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3은 도 24에서의 XENP26940으로부터의 CDR 및 도 40에서의 XNE28652로부터의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가 양태에서, 항체는 도 24에 도시된 XENP26940으로부터의 VH 및 VL을 갖는다.

추가 양태에서, 항체는 도 40에 도시된 XENP28652로부터의 VH 및 VL을 갖는다.

어느 한 양태에서, 힌지-CH2-CH3은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터의 Fc 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 도메인일 수 있다. Fc 도메인은 IgG1 유래일 때 예를 들어 아미노산 치환 427L/434S를 포함하는 변이체 인간 IgG1 도메인일 수 있다. 추가로, 변이체 IgG1 Fc 도메인은 도 5에 도시된 것으로부터 선택된 절제(ablation) 변이체 및 특히 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 포함할 수 있다. Fc 도메인은 변이체 인간 IgG4 도메인일 때 S228P 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

추가 양태에서, 본 발명은 중쇄를 암호화하는 제1 핵산 및 경쇄를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터 및 상기 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터, 또는 상기 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하는 단일 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물이 또한 포함된다. 발현 벡터 조성물 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 추가로 포함된다. 항-PD-1 항체가 발현되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-PD-1 항체를 제조하는 방법이 또한 포함된다. 게다가, 본 발명은 상기 환자에게 항체를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

추가 양태에서, 이종이합체성 이중특이적 항체가 제공된다. 이 항체는 a) i) 인간 PD-1에 결합하는 단쇄 Fv 도메인(scFv)이되, 상기 scFv 도메인은 1) 제1 가변 중쇄 도메인(VH1); 2) scFv 링커; 및 3) 제1 가변 경쇄 도메인(VL1)을 포함하는 scFv; 및 ii) 제1 변이체 Fc 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) i) 제2 가변 중쇄 도메인 (VH2)-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제2 가변 경쇄 도메인(VL2) 및 불변 경쇄 도메인(CL)을 포함하는 경쇄를 포함하고; 여기서 상기 제1 가변 중쇄 도메인 및 상기 제1 가변 경쇄 도메인은 제1 항원 결합 도메인(ABD1)을 형성하고, 상기 제2 가변 중쇄 도메인 및 상기 제2 가변 경쇄 도메인은 인간 CTLA-4, 인간 LAG-3, 인간 TIM-3, 인간 TIGIT, 인간 BTLA 및 인간 ICOS로부터 선택된 항원에 결합하는 제2 ABD(ABD2)를 형성한다. ABD1은 도 13, 도 15, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40에 개략된 바와 같은 1C11 VH 도메인 및 VL 도메인 중 어느 하나일 수 있다.

특정 양태에서, ABD1은 도 15에서의 XENP25806으로부터의 1C11[PD-1]_H3.234_L3.144, 도 15에서의 XENP25812로부터의 1C11[PD-1]_H3.240_L3.148, 도 15에서의 XENP25813으로부터의 1C11[PD-1]_H3.241_L3.148 및 도 15에서의 XENP25819로부터의 1C11[PD-1]_H3.241_L3.92로 이루어진 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는다.

이 양태에서, 제1 단량체는 N 말단에서 C 말단으로 VH1-scFv 링커-VL1-힌지-변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다.

추가 양태에서, 제1 단량체는 N 말단에서 C 말단으로 VL1-scFv 링커-VH1-힌지-변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다.

특정 양태에서, ABD1은 도 15에서의 XENP25806으로부터의 1C11[PD-1]_H3.234_L3.144, 도 15에서의 XENP25812로부터의 1C11[PD-1]_H3.240_L3.148, 도 15에서의 XENP25813으로부터의 1C11[PD-1]_H3.241_L3.148 및 도 15에서의 XENP25819로부터의 1C11[PD-1]_H3.241_L3.92로 이루어진 쌍으로부터 선택된 서열을 갖고, ABD2는 인간 CTLA-4, 인간 LAG-3, 인간 TIM-3, 인간 TIGIT, 인간 BTLA 및 인간 ICOS로부터 선택된 항원에 결합한다.

추가 양태에서, 항-CTLA-4 ABD2는 서열 목록의 서열 번호 38134번과 38138번, 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는다.

추가 양태에서, 항-LAG-3 ABD2는 서열 번호 32755번과 32760번, 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번, 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는다.

추가 양태에서, 항-TIM-3 ABD2는 서열 번호 36508번과 36513번, 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번, 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는다.

추가 양태에서, 항-TIGIT ABD2는 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는다.

추가 양태에서, 항-ICOS ABD2는 a) 미국특허출원 공개US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 쌍; b) 도 49에서의 XENCS500의 VH 서열 및 VL 서열; 및 c) 도 49에서의 XENCS501의 VH 서열 및 VL 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.

추가 양태에서, 항-BTLA ABD2는 서열 번호 20936번과 20941번, 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는다.

많은 양태에서, 본 발명의 이종이합체성 항체는 아미노산 치환 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함하는 제2 변이체 IgG1 Fc 도메인을 갖고, 여기서 상기 제1 변이체 IgG1 Fc 도메인 및 제2 변이체 IgG1 Fc 도메인은 각각 아미노산 치환 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고; 상기 제1 변이체 IgG1 Fc 도메인은 아미노산 치환 S364K/E357Q를 포함하고, 제2 변이체 IgG1 Fc 도메인은 아미노산 치환 L368D/K370S를 포함하고, 넘버링은 카밧(Kabat)에서처럼 EU 인덱스에 따른다.

추가 양태에서, 본 발명은 a) 상기 제1 단량체를 암호화하는 제1 핵산; b) 상기 제2 단량체를 암호화하는 제2 핵산; 및 c) 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항의 상기 경쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 핵산 조성물을 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 a) 상기 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터; b) 상기 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및 c) 상기 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 조성물을 제공한다. 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포, 및 상기 항체가 발현되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하고 상기 항체를 회수하여 항체를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 환자에게 본 발명의 이종이합체성 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 추가로 제공된다.

도 1a 내지 도 1o는 본 발명의 몇몇 형식을 도시한다. 처음은 제1 항-항원 결합 도메인 및 제2 항-항원 결합 도메인을 갖는 "병 오프너(bottle opener)" 형식이다. 추가로, mAb-Fv, mAb-scFv, 중앙-scFv, 중앙-Fv, 1-아암 중앙-scFv, 하나의 scFv-mAb, scFv-mAb, 이중 scFv 형식, DVD-Ig, 트라이던트 및 mAb-(scFv2)가 모두 도시된다. 도시된 모든 scFv 도메인에 대해, 이들은 N 말단에서 C 말단으로 가변 중쇄-(선택적 링커)-가변 경쇄 또는 그 반대일 수 있다. 또한, 1-아암 scFv-mAb의 경우, scFv는 중쇄 단량체의 N 말단 또는 경쇄의 N 말단 중 어느 하나에 부착될 수 있다.
도 2a 내지 도 2d는 임상 개발의 용이성을 위해 둘 다에 결합하는 항원 결합 도메인의 발생을 촉진하도록 많은 경우에 인간 및 사이노몰거스 원숭이 둘 다를 포함하여 본 발명에 사용되는 다수의 항원에 대한 항원 서열을 도시한다. 달리 기재되지 않는 한, 이 항원의 모든 언급은 인간 항원에 대한 것이다. 인간 ICOS의 서열(sp|Q9Y6W8)은 국제공개 WO/2018/045110호의 서열 번호 26246호에 기재되어 있다. 세포외 도메인인 인간 ICOS의 서열(sp|Q9Y6W8|21-140)은 국제공개 WO/2018/045110호의 서열 번호 26247번이다.
도 3a 내지 도 3f는 이종이합체화 변이체 세트(비대칭 변이체 및 pI 변이체 포함)의 유용한 쌍을 도시한다. 도 3e에서, 상응하는 "단량체 2" 변이체가 없는 변이체가 존재하고, 이들은 단량체들 중 어느 하나에 단독으로 사용되거나 예를 들어 병 오프너의 Fab 측에 포함될 수 있는 pI 변이체이고, 적절한 하전된 scFv 링커는 제2 항원 결합 도메인으로서 scFv를 사용하는 제2 단량체에서 사용될 수 있다. 적합한 하전된 링커는 도 7에 도시된다.
도 4는 등전자 변이체 항체 불변 영역 및 이들의 각각의 치환의 목록을 도시한다. pI_(-)는 더 낮은 pI 변이체를 나타내는 반면, pI_(+)는 더 높은 pI 변이체를 나타낸다. 이들은 선택적으로 및 독립적으로 본 발명의 다른 이종이합체화 변이체(및 본원에 개략된 바와 같은 다른 변이체 유형)와 조합될 수 있다.
도 5는 (때때로 "넉아웃" 변이체 또는 "KO" 변이체라고 지칭되는) FcγR 결합을 절제하는 유용한 절제 변이체를 도시한다. 일반적으로, 절제 변이체는 단량체 둘 다에 발견되지만, 일부 경우에 이들은 오직 하나의 단량체에 있을 수 있다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 2개의 특히 유용한 실시형태를 보여준다.
도 7a 및 도 7b는 하나 이상의 scFv를 성분으로서 사용하는 이종이합체성 항체의 pI를 증가시키거나 감소시키는 용도를 갖는 다수의 하전된 scFv 링커를 도시한다. (+H) 양성 링커는 특히 본원에 기재된 항-CD3 vl 및 vh 서열과 본원에서 특히 사용된다. 단일 전하를 갖는 단일의 종래 기술의 scFv 링커는 문헌[Whitlow et al., Protein Engineering 6(8):989-995 (1993)]로부터 "휘트로우(Whitlow)"라고 지칭된다. 이러한 링커는 scFv에서 응집을 감소시키고 단백질 분해 안정성을 향상시키는 데 사용된다는 점에 주목해야 한다.
도 8은 (HPLC-CIEX에 의해 결정된) 이종이합체 수율 및 (DSC에 의해 결정된) 열 안정성을 갖는 조작된 이종이합체-비대칭 Fc 변이체의 목록을 도시한다. 결정되지 않은 열 안정성은 "n.d."로 표시된다.
도 9는 중쇄에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 하이브리도마 클론 1C11의 가변 영역 및 인간 IgG1에 기초한 키메라 항-PD-1 항체인 XENP21575의 서열을 도시한다. CDR은 볼드체이며, 슬래시는 가변 도메인의 경계를 나타낸다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 10은 PD-1 형질주입된 HEK293T 세포에서 항-PD-1 클론 1C11에 의한 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 도시한다.
도 11은 SEB 자극된 T 세포에 대한 항-PD-1 클론 1C11의 결합을 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 인간 PBMC의 SEB 자극 및 항-PD-1 클론 1C11에 의한 치료 후에 사이토카인 방출 검정(a: IL-2; b: IFNγ)을 도시한다.
도 13a 내지 도 13c는 중쇄에서 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 인간 IgG1 형식의 항-PD-1 클론 1C11의 예시적인 Fab 인간화된 변이체에 대한 서열을 도시한다. CDR은 볼드체이며, 슬래시는 가변 도메인의 경계를 나타낸다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 체계를 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, VH 도메인 및 VL 도메인은 Fab 또는 scFv로서 형식화될 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 14는 Octet(및 관련된 센서그램(sensorgram))에 의해 결정된 바와 같이 PD-1에 대한 XENP22553의 친화도를 도시한다.
도 15a 내지 도 15t는 항-PD-1 클론 1C11의 예시적인 scFv 변이체에 대한 서열을 도시한다. CDR은 밑줄 표시되고, scFv 링커는 이중 밑줄 표시되고(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이러한 링커는 비하전되거나 음으로 하전된 링커를 포함한 다른 링커로 대체될 수 있지만, 서열에서 scFv 링커는 양으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커임), 슬래시는 가변 도메인의 경계를 나타낸다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 명명 관례는 N 말단에서 C 말단으로 scFv의 배향을 예시하고, 이 도면에서 일부 서열은 (N 말단에서 C 말단으로) VH-scFv 링커-VL로 배향되는 반면, 일부 서열은 (N 말단에서 C 말단으로) VL-scFv 링커-VH로 배향되지만, 당업자에 의해 이해되는 것처럼 이들 서열은 또한 본원에서의 이들의 도시와는 반대 배향으로 사용될 수 있다. 게다가, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, VH 도메인 및 VL 도메인은 Fab 또는 scFv로서 형식화될 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 16a 및 도 16h는 실시예 XD에 기재된 바와 같은 scFv로부터 선택된 VH 도메인 및 VL 도메인을 갖는 예시적인 변이체 항-PD-1 mAb에 대한 서열을 도시한다. CDR은 볼드체이며, 슬래시는 가변 도메인의 경계를 나타낸다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, VH 도메인 및 VL 도메인은 Fab 또는 scFv로서 형식화될 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 17a 내지 도 17q는 DSF에 의해 결정된 바와 같은 변이체 항-PD-1 scFv의 안정성 및 Octet에 의해 결정된 바와 같은 변이체 scFv로부터의 VH/VL에 기초한 항-PD-1 mAb의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 도시한다. ScFv에 대한 XENP는 볼드체이고, 전장 mAb에 대한 XENP는 괄호 안에 있다.
도 18a 내지 도 18g는 클론 1C11에 기초한 예시적인 변이체 항-PD-1 mAb에 대한 서열을 도시한다. CDR은 볼드체이며, 슬래시는 가변 도메인의 경계를 나타낸다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, VH 도메인 및 VL 도메인은 Fab 또는 scFv로서 형식화될 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 19는 Octet에 의해 결정된 바와 같은 변이체 항-PD-1 mAb의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 도시한다.
도 20a 내지 도 20l은 XENP22553의 중쇄에 기초한 변이체 중쇄에 대한 서열을 도시한다. CDR은 볼드체이다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 VH 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, VH 도메인은 Fab 또는 scFv에서 사용될 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 21a 내지 도 21g는 XENP22553의 경쇄에 기초한 변이체 경쇄에 대한 서열을 도시한다. CDR은 볼드체이다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 체계를 사용하여 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, VL 도메인은 Fab 또는 scFv에서 사용될 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 22a 내지 도 22e는 Octet에 의해 결정된 바와 같은 변이체 항-PD-1 mAb의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 도시한다. 변이체는 도 20 및 도 21에 도시된 바와 같은 중쇄 XenD 및 경쇄 XenD에 의해 정의된다.
도 23은 Octet에 의해 결정된 바와 같은 변이체 항-PD-1 mAb의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 도시한다. 변이체는 도 20 및 도 21에 도시된 바와 같은 중쇄 XenD 및 경쇄 XenD에 의해 정의된다.
도 24a 내지 도 24j는 클론 1C11에 기초한 예시적인 추가 변이체 항-PD-1 mAb에 대한 서열을 도시한다. CDR은 밑줄 표시되어 있고, 슬래시는 가변 도메인의 경계를 표시한다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, VH 도메인 및 VL 도메인은 Fab 또는 scFv로서 형식화될 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 25는 Octet에 의해 결정된 바와 같은 변이체 항-PD-1 mAb의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 도시한다.
도 26은 Biacore에 의해 결정된 바와 같은 항-PD-1 1C11 변이체의 친화도(KD)를 도시한다.
도 27은 SEB 자극된 T 세포에 대한 친화도 최적화된 항-PD-1 1C11 변이체의 결합을 도시한다.
도 28은 Octet를 사용하여 탠덤 에피토프 비닝 검정에서 정규화된 BLI 반응에 의해 결정된 바와 같은 항-PD-1 1C11 변이체에 의한 PD-L1 및 PD-L2 결합의 차단을 도시한다.
도 29는 표시된 시험 물품과 항온처리 후 SEB 자극된 PBMC 검정에서의 IFNγ 분비를 도시한다.
도 30은 표시된 시험 물품과 항온처리 후 SEB 자극된 PBMC 검정에서의 IFNγ 분비를 도시한다.
도 31은 20 μg/mL의 표시된 시험 물품과 항온처리 후 MLR 검정에서의 IFNγ 분비를 도시한다.
도 32는 표시된 농도의 표시된 시험 물품과 항온처리 후 MLR 검정에서의 IFNγ 분비를 도시한다.
도 33은 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267k") 및 Xtend 변이체(M428L/N434S)를 갖는 2가 항-PD-1 mAb인 XENP26842에 대한 서열을 도시한다. CDR은 밑줄 표시된다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 V_H 도메인 및 V_L 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 34는 0일에 인간 PBMC에 의한 생착 및 1일 및 8일에 표시된 시험 물품에 의한 투여 후 14일에 NSG 마우스의 전혈에서의 CD45⁺ 세포 계수치를 도시한다.
도 35은 0일에 인간 PBMC에 의한 생착 및 1일에 표시된 시험 물품에 의한 투여 후 7일에 NSG 마우스의 혈청에서의 IFNγ 농도를 도시한다.
도 36a 및 도 36b는 pp65 반응성 huPBMC에 의한 생착 및 표시된 시험 물품에 의한 처리 후 pp65를 발현하는 MCF-7 세포에 의해 생착된 NSG 마우스에서의 a) 평균 종양 용적 및 b) 종양 용적 변화를 도시한다.
도 37a 내지 도 37d는 pp65 반응성 huPBMC에 의한 생착 및 표시된 시험 물품에 의한 처리 후 pp65를 발현하는 MCF-7 세포에 의해 생착된 NSG 마우스의 전혈에서의 a) CD45⁺ 세포, b) CD4⁺ T 세포, c) CD8⁺ T 세포 및 d) NK 세포 계수치를 도시한다.
도 38은 표시된 시험 물품이 투여된 huPBMC가 생착된 NSG 마우스에서의 (초기 체중의 백분율로서) 시간에 따른 체중 변화를 도시한다.
도 39a 내지 도 39c는 표시된 시험 물품에 의한 투여 후 huPBMC가 생착된 NSG 마우스에서의 a) 인간 CD45⁺, b) 인간 CD4⁺ T 세포 및 c) 인간 CD8⁺ T 세포 계수치를 도시한다.
도 40a 내지 도 40bb는 클론 1C11에 기초한 예시적인 추가 변이체 항-PD-1 mAb에 대한 서열을 도시한다. CDR은 밑줄 표시되어 있고, 슬래시는 가변 도메인의 경계를 표시한다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 V_H 도메인 및 V_L 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, V_H 도메인 및 V_L 도메인은 Fab 또는 scFv로서 형식화될 수 있다. 추가로, 이들 서열은 M428L/N434S Xtend 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가로, 각각의 CDR은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖고, 각각의 VH 도메인 및 VL 도메인은 서열 목록에서 그 자체의 서열 번호를 갖는다.
도 41은 Octet에 의해 결정된 바와 같은 인간 PD-1에 대한 항-PD-1 1C11 변이체의 친화도/해리 상수(K_D), 결합 속도(k_a) 및 해리 속도(k_d)를 도시한다.
도 42는 Octet에 의해 결정된 바와 같은 인간 PD-1에 대한 항-PD-1 1C11 변이체의 친화도/해리 상수(K_D), 결합 속도(k_a) 및 해리 속도(k_d)를 도시한다.
도 43은 Octet에 의해 결정된 바와 같은 인간 PD-1에 대한 항-PD-1 1C11 변이체의 친화도/해리 상수(K_D), 결합 속도(k_a) 및 해리 속도(k_d)를 도시한다.
도 44는 Octet에 의해 결정된 바와 같은 인간 PD-1에 대한 항-PD-1 1C11 변이체의 친화도/해리 상수(K_D), 결합 속도(k_a) 및 해리 속도(k_d)를 도시한다.
도 45는 Octet에 의해 결정된 바와 같은 인간 PD-1 및 사이노몰거스 PD-1에 대한 항-PD-1 1C11 변이체의 친화도/해리 상수(K_D), 결합 속도(k_a) 및 해리 속도(k_d)를 도시한다.
도 46은 SEB 자극된 PBMC 검정에서 표시된 1C11 변이체(및 PBS 및 대조군으로서의 니볼루맙에 기초한 항-PD-1 XENP16432)에 의한 IFNγ의 유도를 도시한다. p-값을 대응 t-검정에서 얻어 동일한 도너로부터의 PBMC에 의한 IFNγ 분비를 비교한다.
도 47은 SEB 자극된 PBMC 검정에서 표시된 1C11 변이체(및 PBS 및 대조군으로서의 니볼루맙에 기초한 항-PD-1 XENP16432)에 의한 IL-2의 유도를 도시한다. p-값을 대응 t-검정에서 얻어 동일한 도너로부터의 PBMC에 의한 IL-2 분비를 비교한다.
도 48은 SEB 자극된 PBMC 검정에서 니볼루맙 및 XENP28652에 기초한 표시된 항-PD-1 mAb XENP16432에 의한 IFNγ의 유도를 도시한다. p-값을 대응 t-검정에서 얻어 동일한 도너로부터의 PBMC에 의한 IFNγ 분비를 비교한다.
도 49a 내지 도 49kk는 "XENCS" 넘버링을 사용하여 명명된 "병 오프너" 형식에서 본 발명의 다수의 이종이합체성 항체의 서열을 도시한다. 3개의 폴리펩타이드 사슬이 각각의 ("Fab 사슬, scFv 사슬 및 경쇄")에 대해 표시되는데, CDR은 밑줄 표시되고, 링커는 이중 밑줄 표시되고, 도메인 사이의 연결부는 "/"로 표시된다. 이들의 각각은 그 자체의 서열을 갖고 이에 따라 식별자를 갖는다.
도 50a 내지 도 50e는 몇몇 유용한 "병 오프너" 형식 "골격"의 서열을 도시하는데, 몇몇 특정 항-PD-1 ABD에 대해 scFv 측의 Fv는 지향되지만, "Fab" 측에 대한 Fv 서열은 그렇지 않다. 당업자에 의해 이해되고 하기에 개략될 바와 같이, 이들 "골격" 서열은 본원에 개략되고 서열 목록 내에 함유된 임의의 Fab 서열(예를 들어, "Fab 측 중쇄" 또는 "Fab 단량체"에 부착된 VH 및 불변 경쇄에 부착된 VL)과 사용될 수 있다. 이 병 오프너 골격 서열이 본원에 기재된 바와 같은 제2 VH 및 CH1 도메인의 첨가와 함께 도 1f의 중앙-scFv 형식(때때로 "2+1" 형식이라고도 지칭됨)에 사용됨에 또한 주목해야 한다. 본원에 기재된 바와 같은 ABD로부터의 VH 도메인이 전장 중쇄를 형성하도록 N 말단으로 융합되도록 각각의 Fab 사슬이 CH1 도메인의 시작을 기술하는 "/"로 시작하고, Fab가 Fab 사슬과 경쇄로 형성되도록 ABD로부터의 상응하는 VL 도메인이 경쇄에서 CL 도메인의 시작을 기술하는 "/"에 N 말단으로 융합된다. scFv 사슬은 특정 항-PD-1 ABD에 개략되어 있고, CDR은 밑줄 표시되고, scFv 링커는 이중 밑줄 표시되고, "/"는 도메인의 연결부를 나타낸다. BO 골격 1 내지 BO 골격 4(XENCS556 내지 559)는 BO 골격 5 내지 BO 골격 8(XENCS560 내지 563)은 동일한데, 후자가 428L/434S "XTend®" Fc 변이체를 포함한다는 점을 제외하고는 동일하다.
도 51은 해당 이중특이적 항체 XmAb20717(항-CTLA-4 x 항-PD-1)이 PD1 및 CTLA4를 동시발현하는 293 T를 선택적으로 표적화한다는 것을 보여준다.
도 52는 XmAB20717의 결합 결합능이 T 세포 활성화에 기여한다는 것을 보여준다. 특히, 인간 PBMC가 0일에 NSG 마우스에 생착된 후, 1일에 표시된 시험 물품으로 투여된 후 14일에 IFNγ 수준이 보여진다.
도 53은 XmAB20717이 항-PD1 2가 항체와 비교하여 우수한 T 세포 활성화를 촉진한다는 것을 보여준다. 특히, 인간 PBMC가 0일에 NSG 마우스에 생착된 후, 1일에 표시된 시험 물품으로 투여된 후 14일에 CD45+ 세포 계수치 및 IFNγ 수준이 보여진다.
도 54는 XmAb20717이 마우스에서 동종이계 항종양 반응을 향상시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. NSG 마우스는 KG1a-luc가 생착된 후, huPBMC가 생착된다. 제시된 종양 부담은 KG1a-luc의 IVIS 영상화에 의해 획득된 기하 평균 플럭스로부터 도출된다.
도 55는 PD1 x CTLA4 이중특이적 항체가 CD45+ 세포 계수치에서 측정된 바와 같이 관문 차단에 대한 마우스 모델에서 고도로 활성이라는 것을 보여주는 그래프이다.
도 56은 이중특이적 CTLA4 x LAG3이 관문 차단에 대한 마우스 모델에 대해 삼중 차단에 대해 활성이고 항-PD-1과 조합한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 57a 및 도 57b는 염색에 의해 나타낸 바와 같은 비점유된 CTLA-4 및/또는 LAG-3 수용체와 함께 CTLA-4 및 PD-1 둘 다를 발현하는 HEK293T 세포의 집단의 백분율로 표시된 바와 같은 표시된 시험 물품에 의한 관문 수용체 점유를 도시한다.
도 58은 표시된 시험 물품에 의한 처리 이후에 (Q1) CTLA-4-PD-1+, (Q2) CTLA-4+PD-1+, (Q3) CTLA-4-PD-1+ 및 (Q4) CTLA-4-PD-1- 세포의 집단을 도시하는 FACS 산점도를 보여준다.
도 59a 및 도 59b는 KG1a-luc가 생착되고, XmAb20717에 의한 치료 이후에 huPBMC가 생착된 NSG 마우스에서의 (KG1a-luc의 IVIS 영상화에 의해 획득된 기하 평균 플럭스로부터 도출된) 종양 부담을 도시한다.
도 60은 CTLA-4 및 LAG-3을 발현하는 HEK293T 세포에 대한 XmAb22841의 결합을 도시한다.
도 61a 내지 도 61d는 염색에 의해 나타낸 바와 같은 비점유된 CTLA-4 및/또는 LAG-3 수용체와 함께 CTLA-4 및 LAG-3 둘 다를 발현하는 HEK293T 세포의 집단의 백분율로 표시된 바와 같은 표시된 시험 물품에 의한 관문 수용체 점유를 도시한다.
도 62a 및 도 62b는 표시된 시험 물품에 의한 처리 이후에 CTLA-4 및 LAG-3 둘 다를 발현하는 HEK293T 세포에서 비점유된 a) LAG-3 및 b) CTLA-4 수용체의 양을 보여준다.
도 63a 내지 도 63f는 6개의 별개의 PBMC 도너(a 내지 f)로부터의 SEB 자극된 T 세포에 대한 표시된 시험 물품의 결합을 도시한다.
도 64는 항-RSV mAb(XENP15074)에 의한 처리에 비해 XENP16432, XmAb20717, XmAb22841 및 XENP16432와 조합된 XmAb22841에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 IL-2 방출의 배수 증가를 도시한다.
도 65는 항-RSV mAb(XENP15074)에 의한 처리에 비해 XENP16432, XmAb20717, XmAb22841 및 XENP16432와 조합된 XmAb22841에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 IFNγ 방출의 배수 증가를 도시한다.
도 66은 항-RSV mAb(XENP15074)에 의한 처리에 비해 항-PD-1 mAb(XENP16432)에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 면역 관련 유전자의 발현의 배수 변화(x축)를 도시한다. y축은 유의도를 도시한다.
도 67은 항-RSV mAb(XENP15074)에 의한 처리에 비해 XmAb20717에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 면역 관련 유전자의 발현의 배수 변화(x축)를 도시한다.
도 68은 항-RSV mAb(XENP15074)에 의한 처리에 비해 XmAb22841에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 면역 관련 유전자의 발현의 배수 변화(x축)를 도시한다.
도 69는 항-PD-1 mAb(XENP16432)에 의한 처리에 비해 XmAb20717에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 면역 관련 유전자의 발현의 배수 변화(x축)를 도시한다.
도 70은 항-PD-1 mAb(XENP16432)에 의한 처리에 비해 XmAb22841에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 면역 관련 유전자의 발현의 배수 변화(x축)를 도시한다.
도 71은 항-RSV mAb(XENP15074)에 의한 처리에 비해 항-PD-1 mAb(XENP16432)와 조합된 XmAb22841에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 면역 관련 유전자의 발현의 배수 변화(x축)를 도시한다.
도 72는 항-PD-1 mAb(XENP16432) 단독에 의한 처리에 비해 항-PD-1 mAb(XENP16432)와 조합된 XmAb22841에 의한 처리 이후에 SEB 자극된 T 세포에 의한 면역 관련 유전자의 발현의 배수 변화(x축)를 도시한다.
도 73은 항-RSV 항체에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열이 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267k")와 함께 인간 IgG1에 기초하여 생성되었음에 주목하는 것이 중요하다. CDR은 밑줄 표시된다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 74는 니볼루맙으로부터의 가변 영역을 갖는 항-PD-1 항체에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열이 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267k")와 함께 인간 IgG1에 기초하여 생성되었음에 주목하는 것이 중요하다. CDR은 밑줄 표시된다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 75는 펨브롤리주맙으로부터의 가변 영역을 갖는 항-PD-1 항체에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열이 S228P 변이체와 함께 인간 IgG4에 기초하여 생성되었음에 주목하는 것이 중요하다. CDR은 밑줄 표시된다. 본원에 표시되고 CDR을 포함하는 본원에서의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 확인은 표 1에 기재된 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 밑줄 표시된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 도메인 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 76a 및 도 76b는 hFcRn (Tg276) 마우스에서 2 mg/kg의 단일 i.v. 투여 후 개별 마우스에서의 a) XENP20053 및 b) XmAb20717에 대한 약동학적 프로파일을 도시한다.
도 77은 hFcRn (Tg276) 마우스에서 2 mg/kg의 단일 용량 i.v. 투여 후 XENP20053 및 XmAb20717(개별 동물)의 반감기를 도시한다.
도 78은 hFcRn (Tg276) 마우스에서 2 mg/kg의 단일 용량 i.v. 투여 후 XENP20053 및 XmAb20717(개별 동물)의 C_max를 도시한다.
도 79는 hFcRn (Tg276) 마우스에서 2 mg/kg의 단일 용량 i.v. 투여 후 XmAb20717 및 XENP20053의 선택된 PK 매개변수의 평균을 도시한다.
도 80a 내지 도 80j는 PBS, 플레이트 결합된 XmAb20717, 가용성 XmAb20717 및 플레이트 결합된 항-CD3 항체(OKT3)로 치료된 인간 PBMC로부터의 a) IFNγ, b) IL-1β, c) IL-2, d) IL-4, e) IL-8, f) IL-6, g) IL-10, h) IL-12p70, i) IL-13 및 j) TNFα의 방출을 도시한다.
도 81a 및 도 81b는 a) 인간 CTLA-4 및 b) 사이노몰거스 CTLA-4에 대한 XmAb20717의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 82a 및 도 82b는 a) 인간 PD-1 및 b) 사이노몰거스 PD-1에 대한 XmAb20717의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 83은 인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 및 PD-1에 대한 XmAb20717의 결합에 대한 평형 해리 상수(K_D), 결합 속도(k_a) 및 해리 속도(k_d)를 도시한다.
도 84는 XmAb20717 예비항온처리의 존재 하에 및 부재 하에 CTLA-4 및 리간드인 CD80 및 CD86의 경쟁 결합 실험으로부터의 센서그램을 도시한다.
도 85는 XmAb20717 예비항온처리의 존재 하에 및 부재 하에 PD-1 및 리간드인 PD-L1 및 PD-L2의 경쟁 결합 실험으로부터의 센서그램을 도시한다.
도 86은 A) 인간 FcγRI, B) 인간 FcγRIIb, C) 인간 FcγRIIA(131H), D) 인간 FcγRIIA(131R), E) 인간 FcγRIIIA(158V) 및 F) 인간 FcγRIIIA(158F)에 대한 XmAb20717(실선) 및 인간 IgG 비교자(네이티브 IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체; 점선)의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 87은 A) 사이노몰거스 FcγRI, B) 사이노몰거스 FcγRIIA, C) 사이노몰거스 FcγRIIb 및 D) 사이노몰거스 RcγRIIIA에 대한 XmAb20717(실선) 및 인간 IgG 비교자(네이티브 IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체; 점선)의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 88은 A) 쥣과 FcγRI, B) 쥣과 FcγRIIb, C) 쥣과 FcγRIII 및 D) 쥣과 FcγRIV에 대한 XmAb20717(실선) 및 인간 IgG 비교자(IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체; 점선)의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 89는 pH 6.0에서 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn에 대한 XmAb20717 및 XENP20053의 결합에 대한 평형 해리 상수(K_D)를 도시한다.
도 90은 pH 6.0에서 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn(1000 nM, 500 nM, 250 nM 및 125 nM)에 대한 XmAb20717 및 XENP20053의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 91은 PD-1이 로딩되고, XmAb20717 또는 완충액에 침지된 후, CTLA-4 항원에 최종 침지된 바이오센서를 보여주는 탠덤식 BLI 실험을 도시한다.
도 92는 항-RSV mAb XENP15074, 항-PD-1 mAb XENP16432 및 XmAb20717에 의한 치료 이후에 SEB 자극된 인간 PBMC에 의한 IL-2 분비를 도시한다. 각각의 점은 고유한 인간 도너를 나타냈다.
도 93은 항-RSV mAb XENP15074, 항-PD-1 mAb XENP16432 및 XmAb20717에 의한 치료 이후에 비자극된 인간 PBMC에 의한 IL-2 분비를 도시한다. 각각의 점은 고유한 인간 도너를 나타냈다.
도 94는 항-RSV mAb XENP15074, XENP20111과 XENP20059의 조합(XmAb20717의 항-PD-1 및 항-CTLA-4 결합 도메인에 기초한 1가 mAb) 및 XmAb20717에 의한 치료 이후에 비자극된 인간 PBMC에 의한 IL-2 분비를 도시한다. 각각의 점은 고유한 인간 도너를 나타냈다.
도 95는 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스에서의 (초기 체중의 백분율로서의 ) 시간에 따른 체중 변화를 도시한다. 죽은 마우스를 70% 초기 체중으로 설정하였다. *는 p<0.05, 비대응 Student's t-검정을 나타내고, 각각의 그룹은 huPBMC와 비교된다. 삼각형은 투여 일자를 나타낸다.
도 96은 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스에서의 생존을 도시한다.
도 97은 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스에서의 시간에 따른 혈청 IFNγ 농도를 도시한다.
도 98a 내지 98c는 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스의 혈액에서의 시간에 따른 a) 인간 CD45⁺ 세포, b) 인간 CD4⁺ T 세포 및 c) 인간 CD8⁺ T 세포 계수치를 도시한다.
도 99는 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267k")를 갖는 아테졸리주맙에 기초한 2가 항-PD-L1 mAb인 XENP16434에 대한 서열을 도시한다.
도 100은 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스에서의 (초기 체중의 백분율로서의 ) 시간에 따른 체중 변화를 도시한다. 죽은 마우스를 70% 초기 체중으로 설정하였다.
도 101은 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스에서의 생존을 도시한다.
도 102a 내지 도 102c는 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스의 혈액에서의 14일에 a) 인간 CD45⁺ 세포, b) 인간 CD4⁺ T 세포 및 c) 인간 CD8⁺ T 세포 계수치를 도시한다.
도 103은 표시된 농도의 표시된 시험 물품으로 전처리된 PD-1⁺CTLA-4⁺ 세포에 대한 XmAb20717의 결합을 도시한다.
도 104는 표시된 농도의 표시된 시험 물품으로 전처리된 PD-1⁺CTLA-4⁺ 세포에 대한 XmAb20717의 결합을 도시한다.
도 105는 PD-1⁺CTLA-4⁺ 세포에 대한 XmAb20717 결합의 차단에 대한 펨브롤리주맙의 EC₅₀을 도시한다. EC₅₀ 값은 최소 자승법을 사용하여 곡선 피트로 Prism 소프트웨어로부터 도출된다.
도 106a 내지 도 106j는 PBS, 플레이트 결합된 XmAb22841, 가용성 XmAb22841 및 플레이트 결합된 항-CD3 항체(OKT3)로 치료된 인간 PBMC로부터의 a) IFNγ, b) IL-1β, c) IL-2, d) IL-4, e) IL-8, f) IL-6, g) IL-10, h) IL-12p70, i) IL-13 및 j) TNFα의 방출을 도시한다.
도 107은 인하우스 제조된 TGN1412인 XENP29154에 대한 서열을 도시한다.
도 108a 내지 도 108j는 공기 건조된 XmAb22841, 공기 건조된 XENP15074(아이소타입 대조군) 및 공기 건조된 XENP29154(양성 대조군)로 치료된 인간 PBMC로부터의 a) IFNγ, b) IL-1β, c) IL-2, d) IL-4, e) IL-8, f) IL-6, g) IL-10, h) IL-12p70, i) IL-13 및 j) TNFα의 방출을 도시한다.
도 109a 및 도 109b는 a) 인간 CTLA-4 및 b) 사이노몰거스 CTLA-4에 대한 XmAb22841의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 110a 및 도 110b는 a) 인간 LAG-3 및 b) 사이노몰거스 LAG-3에 대한 XmAb22841의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 111은 인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 및 LAG-3에 대한 XmAb22841의 결합에 대한 평형 해리 상수(K_D), 결합 속도(k_a) 및 해리 속도(k_d)를 도시한다.
도 112는 XmAb22841 예비항온처리의 존재 하에 및 부재 하에 CTLA-4 및 리간드인 CD80 및 CD86의 경쟁 결합 실험으로부터의 센서그램을 도시한다.
도 113은 XmAb22841에 의한 Ramos 세포에서의 세포 표면 MHC 클래스 II에 대한 가용성 LAG-3-Fc 결합의 차단을 도시한다.
도 114는 A) 인간 FcγRI, B) 인간 FcγRIIb, C) 인간 FcγRIIA(131H), D) 인간 FcγRIIA(131R), E) 인간 FcγRIIIA(158V) 및 F) 인간 FcγRIIIA(158F)에 대한 XmAb22841(실선) 및 인간 IgG 비교자(네이티브 IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체; 점선)의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 115는 A) 사이노몰거스 FcγRI, B) 사이노몰거스 FcγRIIA, C) 사이노몰거스 FcγRIIb 및 D) 사이노몰거스 RcγRIIIA에 대한 XmAb22841(실선) 및 인간 IgG 비교자(네이티브 IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체; 점선)의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 116은 A) 쥣과 FcγRI, B) 쥣과 FcγRIIb, C) 쥣과 FcγRIII 및 D) 쥣과 FcγRIV에 대한 XmAb22841(실선) 및 인간 IgG 비교자(IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체; 점선)의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 117은 pH 6.0에서 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn에 대한 XmAb22841 및 XENP22602의 결합에 대한 평형 해리 상수(K_D)를 도시한다.
도 118은 pH 6.0에서 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn(1000 nM, 500 nM, 250 nM 및 125 nM)에 대한 XmAb22841 및 XENP22602의 결합을 보여주는 센서그램을 도시한다.
도 119는 LAG-3이 로딩되고, XmAb22841 또는 완충액에 침지된 후, CTLA-4 항원에 최종 침지된 바이오센서를 보여주는 탠덤식 BLI 실험을 도시한다.
도 120은 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스에서의 (초기 체중의 백분율로서의 ) 시간에 따른 체중 변화를 도시한다. 죽은 마우스를 70% 초기 체중으로 설정하였다.
도 121은 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스에서의 생존을 도시한다.
도 122a 및 도 122b는 인간 PBMC에 의해 i.v. OSP 생착되고, 표시된 시험 물품에 의해 투여된 NSG 마우스의 혈청에서의 7일 및 14일에 혈청 a) IFNγ 농도 및 b) IL-10 농도를 도시한다.

A. 자료의 포함

1. 도면 및 범례

2017년 11월 8일에 출원된 미국 특허 출원 제62/583,438호; 2017년 12월 14일에 출원된 미국 특허 출원 제62/598,938호; 2018년 4월 16일에 출원된 미국 특허 출원 제62/658,227호; 2016년 11월 10일에 출원된 미국 특허 출원 제62/420,500호; 2018년 6월 22일에 출원된 미국 특허 출원 제62/353,511호; 2016년 6월 14일에 출원된 미국 특허 출원 제62/350,145호, 2017년 6월 14일에 출원된 미국 특허 출원 제15/623,314호 및 2017년 6월 14일에 출원된 국제출원 PCT/US17/37555호(이들 모두는 특히 이들에 도시된 아미노산 서열에 대해 그 전체 내용이 명확히 독립적으로 본원에 인용되어 포함됨)의 (식별자 및/또는 설명과 함께) 모든 도면, 동반된 범례 및 서열.

2. 서열

하기한 바와 같은 동반된 서열 목록을 참조한다: ABD로서 사용하기에 적합한 항-PD-1 서열은 서열 번호 6209번 내지 11464번(여기서 Fv 서열이 Fab로 형식화될 수 있지만, PD-1 scFv 서열), 서열 번호 11465번 내지 17134번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, PD-1 Fab 서열), 서열 번호 33003번 내지 33072번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 PD-1 Fab 서열), 서열 번호 33073번 내지 35394번(여기서 Fv 서열이 Fab로 형식화될 수 있지만, 추가 PD-1 scFv 서열) 및 서열 번호 36127번 내지 36146번(scFv 또는 Fab 중 어느 하나로 형식화될 수 있는 PD-1 2가 작제물). ABD로서 사용하기에 적합한 항-CTLA-4 서열은 서열 번호 21번 내지 2918번(여기서 Fv 서열이 Fab로 형식화될 수 있지만, CTLA-4 scFv 서열), 서열 번호 2919번 내지 6208번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, CTLA-4 Fab 서열), 서열 번호 36739번 내지 36818번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 CTLA-4 Fab 서열) 및 서열 번호 35395번 내지 35416번(Fab 또는 scFv 중 어느 하나로 형식화될 수 있는 CTLA-4 1-아암 작제물)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-LAG-3 서열은 서열 번호 17135번 내지 20764번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, LAG-3 Fab), 서열 번호 36819번 내지 36962번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 LAG-3 Fab), 서열 번호 35417번 내지 35606번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 LAG-3 Fab), 서열 번호 25194번 내지 32793번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 LAG-3 Fab) 및 서열 번호 32794번 내지 33002번(Fab 또는 scFv 중 어느 하나로 형식화될 수 있는 1-아암 LAG-3 작제물)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, TIM-3 Fab), 서열 번호 37587번 내지 37698번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 TIM-3 Fab) 및 서열 번호 36347번 내지 36706번(Fab 또는 scFv 중 어느 하나로 형식화될 수 있는 2가 TIM-3 작제물)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, BTLA Fab) 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 BTLA Fab)을 포함한다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, TIGIT Fab) 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 TIGIT Fab)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

본 발명의 이중특이적 항체는 서열 번호 35607번 내지 35866번 및 서열 번호 21524번 내지 22620번의 LAG3 x CTLA4 작제물을 포함한다. PD-1 x CTLA4 작제물은 서열 번호 36167번 내지 36346번 및 서열 번호 23316번 내지 23735번으로 기재된 것을 포함한다. PD-1 x TIM3 작제물은 서열 번호 25174번 내지 25193번으로 기재된 것을 포함한다. PD-1 x LAG3 작제물은 서열 번호 35867번 내지 36126번 및 서열 번호 23736번 내지 25133번으로 기재된 것을 포함한다. PD-1 x TIGIT 작제물은 서열 번호 25134번 내지 25173번으로 기재된 것을 포함한다. PD-1 x BTLA 작제물은 서열 번호 22724번 내지 23315번 및 서열 번호 36147번 내지 36166번으로 기재된 것을 포함한다. CTLA4 x BTLA 작제물은 서열 번호 22624번 내지 22723번으로 기재된 것을 포함한다. 마지막으로, XENP23552, XENP22841, XENP22842, XENP22843, XENP22844, XENP22845, XENP22846, XENP22847, XENP22848, XENP22849, XENP22850, XENP22851, XENP22852, XENP22858, XENP22854, XENP22855에 대한 명칭은 모두 제목에 "M428L/N434S"의 표기를 포함해야 하는데, 이들은 주의 깊게 쓰이지는 않는다.

B. 명명법

본 발명의 이중특이적 항체는 몇몇 상이한 형식으로 기재된다. 각각의 폴리펩타이드는 고유한 "XENP" 번호(또는 일부 경우에 "XENCS" 번호)가 주어지지만, 당업계에서 이해되는 것처럼, 더 긴 서열이 더 짧은 것을 포함할 것이다. 예를 들어, 주어진 서열에 대한 병 오프너 형식의 scFv 측 단량체의 중쇄는 처음의 XENP 번호를 가지는 반면, scFv 도메인은 다른 XENP 번호를 가질 것이다. 일부 분자는 3개의 폴리펩타이드를 가져 이 성분과 함께 XENP 번호가 명칭으로 사용된다. 따라서, 병 오프너 형식에서 3개의 서열을 포함하는 분자 XENP20717은 일반적으로 "XENP20717 HC-Fab", "XENP20717 HC-scFv" 및 "XENP20717 LC" 또는 동의어로 지칭되지만, 당업자는 서열 정렬을 통해 이것을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 이 XENP 번호는 식별자와 서열 목록에 있고, 도면에서 사용된다. 또한, 3개의 성분을 포함하는 1개의 분자는 다수의 서열 식별자를 생성시킨다. 예를 들어, Fab 단량체의 목록은 전장 서열, 가변 중쇄 서열 및 가변 중쇄 서열의 3개의 CDR을 갖고, 경쇄는 전장 서열, 가변 경쇄 서열 및 가변 경쇄 서열의 3개의 CDR을 갖고, scFv-Fc 도메인은 전장 서열, scFv 서열, 가변 경쇄 서열, 3개의 경쇄 CDR, scFv 링커, 가변 중쇄 서열 및 3개의 중쇄 CDR을 갖고, 다른 것을 사용할 수는 있지만, scFv 도메인과 함께 본원에서의 모든 분자가 단일의 하전된 scFv 링커(+H)를 사용한다는 것에 주목한다. 또한, 특정 가변 도메인이 명칭 명명법은 "Hx.xx_Ly.yy" 형식의 유형을 사용하고, 숫자는 특정 가변 사슬 서열에 대한 고유한 식별자이다. 따라서, XENP22841의 Fab 측의 가변 도메인은 "7G8_H3.30_L1.34"이고, 이는 가변 중쇄 도메인 H3.30이 경쇄 도메인 L1.34와 조합된다는 것을 나타낸다. 이 서열이 scFv로서 사용되는 경우, "7G8_H3.30_L1.34"의 지칭은 가변 중쇄 도메인 H3.30이 경쇄 도메인 L1.34와 조합되고, N 말단에서 C 말단으로 vh-링커-vl 배향에 있음을 나타낸다. 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 동일한 서열을 갖지만 반대의 순서인 이 분자는 "7G8_ L1.34_ H3.30"이라 명칭될 것이다. 유사하게, 상이한 작제물은 서열 목록 및 도면으로부터 명확한 것처럼 중쇄 및 경쇄를 "혼합하고 매칭"할 것이다.

C. 정의

본 출원을 더 완벽하게 이해할 수 있도록 몇 가지 정의를 하기에 설명하였다. 이러한 정의는 문법적 등가물을 포함하도록 의도된다.

본원에서 "절제"란 활성의 감소 또는 제거를 의미한다. 따라서, 예를 들어 "FcγR 결합을 절제하는 것"은 Fc 영역 아미노산 변이체가 상기 특정 변이체를 포함하지 않는 Fc 영역과 비교하여 50% 미만의 시작 결합을 갖는 것을 의미하며, 70-80-90-95-98% 초과의 활성 손실이 바람직하고, 일반적으로 상기 활성은 Biacore, SPR 또는 BLI 검정에서 검출 가능한 결합 수준보다 낮다. 일반적으로 단량체 둘 다에 추가된 도 5에 도시된 것이 FcγR 결합의 절제에 특히 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 "ADCC" 또는 "항체 의존적 세포 매개 세포독성"이란 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고, 후속하여 표적 세포를 용해시키는 세포 매개 반응을 의미한다. ADCC는 FcγRIIIa에 대한 결합과 상관되고, FcγRIIIa에 대한 결합 증가는 ADCC 활성을 증가시킨다.

본원에 사용된 바와 같은 "ADCP" 또는 항체 의존적 세포 매개 포식작용(phagocytosis)이란 FcγR을 발현하는 비특이적 식세포가 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 표식작용을 야기하는 세포 매개 반응을 의미한다.

본원에서 "항원 결합 도메인" 또는 "ABD"란 본원에 기술된 바와 같이 폴리펩타이드 서열의 일부로서 존재할 때 표적 항원에 특이적으로 결합하는 6개의 상보성 결정 영역(CDR: Complementary Determining Region)의 세트를 의미한다. 따라서, "관문 항원 결합 도메인"은 본원에 개략된 바와 같은 표적 관문 항원에 결합한다. 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이, 이 CDR은 일반적으로 제1 집합의 가변 중쇄 CDR(vhCDR 또는 VHCDR) 및 제2 집합의 가변 경쇄 CDR(vlCDR 또는 VLCDR)로 존재하고, 각각은 중쇄의 경우 vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 및 경쇄의 경우 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3인 3개의 CDR을 포함한다. CDR은 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인에 각각 존재하며, 함께 Fv 영역을 형성한다. (CDR 넘버링 체계에 대해 표 1 및 상기 관련 논의를 참조한다). 따라서, 일부 경우에 항원 결합 도메인의 6개의 CDR은 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인에 기인한다. "Fab" 형식에서, 6개의 CDR의 세트는 가변 중쇄 도메인(vh 또는 VH; vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3을 포함) 및 가변 경쇄 도메인(vl 또는 VL; vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3을 포함)인 2개의 상이한 폴리펩타이드 서열에 기인하고, vh 도메인의 C 말단은 중쇄의 CH1 도메인의 N 말단에 부착되고, vl 도메인의 C 말단은 불변 경쇄 도메인의 N 말단에 부착된다(이에 따라 경쇄를 형성함). scFv 형식에서, vh 도메인 및 vl 도메인은 일반적으로 본원에 개략된 바와 같은 링커("scFv 링커")의 사용을 통해 단일한 폴리펩타이드 서열 내로 공유 결합되고, 이는 (N 말단에서 시작하여) vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh일 수 있고, 일반적으로 전자가 바람직하다(사용된 형식에 따라 각각의 측에 선택적 도메인 링커를 포함함(예를 들어, 도 1로부터 나옴)). 일반적으로, scFv 도메인의 C 말단은 제2 단량체에서의 힌지의 N 말단에 부착된다.

본원에서 "변형"이란 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실 또는 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티로의 변경을 의미한다. 예를 들어, 변형은 단백질에 부착된 변경된 탄수화물 또는 PEG 구조일 수 있다. 본원에서 "아미노산 변형"이란 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 명확하게 하기 위해, 달리 언급하지 않는 한, 아미노산 변형은 항상 DNA에 의해 암호화된 아미노산, 예를 들어 DNA 및 RNA에서 코돈을 갖는 20개의 아미노산에 관한 것이다.

본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"이란 모체 폴리펩타이드 서열에서의 특정 위치의 아미노산을 상이한 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 특히, 일부 실시형태에서, 치환은 유기체 내에 자연 발생하지 않거나 임의의 유기체에서 자연 발생하지 않는 특정 위치에서 자연 발생하지 않은 아미노산에 관한 것이다. 예를 들어, 치환 E272Y는 변이체 폴리펩타이드를 언급하고, 이 경우에는 Fc 변이체를 언급하며, 여기서 272번 위치에서의 글루탐산은 티로신으로 대체된다. 명확하게 하기 위해, 핵산 암호화 서열을 변화시키지만 출발 아미노산을 변화시키지 않도록 조작된 단백질(예를 들어, CGG(아르기닌을 암호화함)를 CGA(여전히 아르기닌을 암호화함)와 교환하여 숙주 유기체 발현 수준을 증가시킴)은 "아미노산 치환"이 아니며; 즉 동일한 단백질을 암호화하는 새로운 유전자의 생성에도 불구하고, 단백질이 시작하는 특정 위치에서 동일한 아미노산을 가지면, 이는 아미노산 치환이 아니다.

본원에 사용된 바와 같은 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"이란 모체 폴리펩타이드 서열에서의 특정 위치에서 아미노산 서열을 첨가하는 것을 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 233번 위치 후의 글루탐산 삽입과 234번 위치 전의 글루탐산 삽입을 지칭한다. 추가로, -233ADE 또는 A233ADE는 233번 위치 후의 AlaAspGlu 삽입과 234번 위치 전의 AlaAspGlu 삽입을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "아미노산 결실" 또는 "결실"이란 모체 폴리펩타이드 서열에서의 특정 위치에서 아미노산 서열을 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233#, E233 () 또는 E233del은 233번 위치의 글루탐산 결실을 지칭한다. 또한, EDA233- 또는 EDA233#은 233번 위치에서 시작하는 GluAspAla 서열의 결실을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체" 또는 "변이체"란 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 단백질과 다른 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 모체 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖지만, 그렇게 많지는 않아서 변이체 단백질은 하기에 기재된 것과 같은 정렬 프로그램을 사용하여 모체 단백질을 따라 정렬되지 않을 것이다. 일반적으로, 변이체 단백질(예컨대, 본원에 개략된 변이체 Fc 도메인 등)은 일반적으로 모체 단백질과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다(하기에 기재된 정렬 프로그램, 예컨대 BLAST를 사용함).

하기에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 모체 폴리펩타이드, 예를 들어 Fc 모체 폴리펩타이드는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 중쇄 불변 도메인 또는 Fc 영역과 같은 인간 야생형 서열이지만, 변이체를 갖는 인간 서열이 또한 "모체 폴리펩타이드"의 역할을 할 수 있으며, 예를 들어 미국 특허출원공개 2006/0134105호의 IgG1/2 하이브리드가 포함될 수 있다. 본원에서의 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모체 단백질 서열과 약 80% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 95-98-99% 이상의 동일성을 보유할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"란 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 항체와 다른 항체를 의미하며, 본원에 사용된 바와 같은 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 IgG(다시 말하면, 많은 경우에서, 인간 IgG 서열)와 다른 항체를 의미하고, 본원에 사용된 바와 같은 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 면역글로불린 서열과 다른 면역글로불린 서열을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 도메인과 비교하여 Fc 도메인에서 아미노산 변형을 포함하는 단백질을 의미한다.

본 발명의 Fc 변이체는 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어 N434S 또는 434S는 모체 Fc 폴리펩타이드에 비해 434번 위치에서 세린을 치환한 Fc 변이체이며, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 마찬가지로, M428L/N434S는 모체 Fc 폴리펩티드에 비해 M428L 및 N434S를 치환한 Fc 변이체를 한정한다. WT 아미노산의 정체는 특정되지 않을 수 있으며, 이 경우 전술한 변이체는 428L/434S로 지칭된다. 치환이 제공되는 순서는 임의적임을 주목하며, 다시 말하면, 예를 들어 N434S/M428L은 M428L/N434S와 동일한 Fc 변이체이고, 기타 등등이다. 항체와 관련하여 본 발명에서 기술된 모든 위치에 대해, 달리 언급하지 않는 한, 아미노산 위치 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. EU 인덱스, 또는 카밧이나 EU 넘버링 체계에서와 같은 EU 인덱스는 EU 항체의 넘버링을 말한다. 카밧 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 수많은 1차 서열을 수집하였다. 서열의 보존 정도에 기초하여, 이들은 개별 1차 염기 서열을 CDR 및 프레임워크로 분류하고 이의 목록을 작성하였다(문헌[SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al.](이의 전문이 인용되어 포함됨) 참조). 또한 문헌[Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85](그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)을 참조한다. 그 변형은 추가, 결실 또는 치환일 수 있다.

본원에서 "단백질"이란 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 적어도 2개의 공유 결합된 아미노산을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체를 구성하는 폴리펩타이드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, PEG화(PEGylation), 원형 치환, 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합, 및 펩타이드 태그 또는 표지의 첨가를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "잔기"는 단백질에서의 위치 및 이의 관련된 아미노산 정체를 의미한다. 예를 들어, 297번 아스파라긴(Asn297 또는 N297이라고도 지칭됨)은 인간 항체 IgG1에서의 297번 위치에서의 잔기이다.

본원에 사용되는 바와 같은 "Fab" 또는 "Fab 영역"이란 일반적으로 2개의 상이한 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 하나의 사슬에서 VH-CH1 및 다른 사슬에서 VL-CL)에서 VH 면역글로불린 도메인, CH1 면역글로불린 도메인, VL 면역글로불린 도메인 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fab는 이 영역을 별개로 지칭하거나, 이 영역을 본 발명의 이중특이적 항체의 맥락에서 지칭할 수 있다. Fab의 맥락에서, Fab는 CH1 도메인 및 CL 도메인 이외에 Fv 영역을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "Fv 영역"이란 ABD의 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. Fv 영역은 Fab(상기 기술된 바와 같이, 상기 개괄된 바와 같은 불변 영역을 또한 포함하는 일반적으로 2개의 상이한 폴리펩타이드) 및 scFv(여기서, vl 도메인 및 vh 도메인은 (일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 링커와) 조합되어 scFv를 형성함) 둘 다로 형식화될 수 있다.

본원에서 "단쇄 Fv" 또는 "scFv"란 일반적으로 scFv 도메인 또는 scFv 도메인을 형성하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 scFv 링커를 사용하여 가변 경쇄 도메인에 공유 부착된 가변 중쇄 도메인을 의미한다. ScFv 도메인은 N 말단에서 C 말단으로의 배향(vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh)으로 있을 수 있다. 서열 목록 및 도면에 도시된 서열에서, vh 도메인 및 vl 도메인의 순서는 명칭으로 표시되고, 예를 들어 H.X_L.Y은 N 말단에서 C 말단이 vh-링커-vl이라는 것을 의미하고, L.Y_H.X는 vl-링커-vh이다.

본원에 사용된 바와 같은 "IgG 하위종류 변형" 또는 "아이소타입 변형"이란 하나의 IgG 아이소타입의 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 아이소타입에서 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, EU 296번 위치에서 IgG1은 티로신을 포함하고 IgG2는 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2에서의 F296Y 치환은 IgG 하위종류 변형으로 간주된다.

본원에 사용된 바와 같은 "비자연 발생 변형"이란 아이소타입이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, 인간 IgG는 434번 위치에서 세린을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4(또는 이들의 하이브리드)에서의 치환 434S는 비자연 발생 변형으로 간주된다.

본원에 사용된 바와 같은 "아미노산" 및 "아미노산 정체"란 DNA 및 RNA에 의해 암호화된 20개의 자연 발생 아미노산들 중 하나를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 "효과기 기능"이란 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 생긴 생화학적 사건을 의미한다. 효과기 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 "IgG Fc 리간드"란 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 리간드는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 스타필로코커스 단백질 A, 스타필로코커스 단백질 G 및 바이러스 FcγR을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. Fc 리간드는 또한 FcγR과 상동성인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)를 포함한다(문헌[Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136](이의 전체 내용이 인용되어 포함됨)). Fc 리간드는 Fc에 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다. 특정 IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본원에 사용된 바와 같은 "Fc 리간드"란 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 "Fc 감마 수용체", "FcγR" 또는 "Fc감마R"이란 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 FcγR 유전자에 의해 암호화된 단백질 패밀리의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서, 이 패밀리는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(동종이인자형 H131 및 R131을 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(동종이인자형 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb(동종이인자형 FcγRIIb-NA1 및 FcγRIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)(문헌[Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65](이의 전체 내용이 인용되어 포함됨)), 및 임의의 발견되지 않은 인간 FcγR 또는 FcγR 아이소폼 또는 동종이인자형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. FcγR은 비제한적인 예로서 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 마우스 FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 임의의 발견되지 않은 마우스 FcγR 또는 FcγR 아이소폼 또는 동종이인자형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 "FcRn" 또는 "신생아 Fc 수용체"란 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 암호화된 단백질을 의미한다. FcRn은 비제한적인 예로서 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 기능성 FcRn 단백질은 종종 중쇄 및 경쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 암호화된다. 본원에 달리 언급하지 않는 한, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 지칭한다. 다양한 FcRn 변이체는 FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키고, 일부 경우에서 혈청 반감기를 증가시키는 데 사용될 수 있다. "FcRn 변이체"는 FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키는 것이고, 적합한 FcRn 변이체가 하기에 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "모체 폴리펩타이드"란 변이체를 생성하기 위해 후속적으로 변형되는 출발 폴리펩타이드를 의미한다. 모체 폴리펩타이드는 자연 발생 폴리펩타이드 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 변이체 또는 조작된 자연 발생 폴리펩타이드 버전일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "모 면역글로불린"이란 변이체를 생성하도록 변형되는 비변형된 면역글로불린 폴리펩타이드를 의미하고, 본원에 사용된 바와 같은 "모체 항체"란 변이체 항체를 생성하도록 변형되는 비변형된 항체를 의미한다. "모체 항체"는 하기에 개략된 바와 같이 공지된 시판되는 재조합으로 제조된 항체를 포함하는 것에 주목해야 한다. 이 맥락에서, "모체 Fc 도메인"은 기재된 변이체에 관련될 것이고, 따라서 "변이체 인간 IgG1 Fc 도메인"은 인간 IgG1의 모체 Fc 도메인과 비교되고, "변이체 인간 IgG4 Fc 도메인"은 모체 Fc 도메인 인간 IgG4 등과 비교된다.

본원에 사용된 바와 같은 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"이란 IgG 분자의 CH2-CH3 도메인을 포함하는, 일부 경우에 힌지를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 인간 IgG1에 대한 EU 넘버링에서, CH2-CH3 도메인은 231번 내지 447번 아미노산을 포함하고, 힌지는 216번 내지 230번이다. 따라서, "Fc 도메인"의 정의는 231번 내지 447번 아미노산(CH2-CH3) 또는 216번 내지 447번 아미노산(힌지-CH2-CH3) 둘 다, 또는 이들의 단편을 포함한다. 이 맥락에서 "Fc 단편"은 N 말단 및 C 말단 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 더 적은 아미노산을 함유할 수 있지만, 일반적으로 크기(예를 들어, 비변성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등)에 기초하여 표준 방법을 사용하여 검출될 수 있는 다른 Fc 도메인 또는 Fc 단편과 이합체를 형성하는 능력을 여전히 보유한다. 인간 IgG Fc 도메인은 본 발명에 특히 사용되고, 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 Fc 도메인일 수 있다.

"변이체 Fc 도메인"은 모체 Fc 도메인과 비교하여 아미노산 변형을 함유한다. 따라서, "변이체 인간 IgG1 Fc 도메인"은 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 아미노산 변형(절제 변이체의 경우에 아미노산 결실이 포함되기는 하지만, 일반적으로 아미노산 치환)을 함유하는 것이다. 일반적으로, 변이체 Fc 도메인은 (디폴트 매개변수를 사용하여 하기에 기술된 동일성 알고리즘을 사용하여(일 실시형태는 당해 기술분야에 공지된 BLAST 알고리즘을 사용함)) 상응하는 모체 인간 IgG Fc 도메인과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는다. 대안적으로, 변이체 Fc 도메인은 모체 Fc 도메인과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 바와 같이, 변이체 Fc 도메인은 본원에서 본원에 기재된 바와 같은 공지된 기법, 예컨대 비변성 겔 전기영동을 사용하여 측정된 바와 같이 다른 Fc 도메인과 이합체를 형성하는 능력을 여전히 보유한다.

본원에서 "중쇄 불변 영역"이란 가변 중쇄 도메인을 배제한 항체의 CH1-힌지-CH2-CH3 부분(또는 이의 단편)을 의미하고, 인간 IgG1의 EU 넘버링에서 이것은 118번 내지 447번 아미노산이다. 본원에서 "중쇄 불변 영역 단편"이란 N 말단 및 C 말단 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 더 적은 아미노산을 함유하지만, 다른 중쇄 불변 영역과 이합체를 형성하는 능력을 여전히 보유하는 중쇄 불변 영역을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 "위치"란 단백질의 서열에서의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 형식, 예를 들어 항체 넘버링에 대한 EU 인덱스에 따라 넘버링될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "표적 항원"이란 주어진 항체의 가변 영역을 포함하는 항원 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 하기에 기술된 바대로, 본 경우에 표적 항원은 관문 단백질이다.

본 발명의 이종이합체성 항체의 단량체의 맥락에서 "가닥 배열(strandedness)"이란 "매칭"하는 DNA의 2개의 가닥과 유사하게 이종이합체화 변이체가 이종이합체를 형성하기 위해 "매칭"하는 능력을 보존하도록 각각의 단량체에 도입된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 pI 변이체가 단량체 A로 조작되면(예를 들어, pI를 더 높게 만들면), 사용될 수 있는 "하전 쌍"인 변이체는 또한 pI 변이체를 방해하지 않으며, 예를 들어 pI 를 더 높게 만드는 전하 변이체는 기능 둘 다를 보존하기 위해 동일한 "가닥" 또는 "단량체"에 있다. 유사하게, 하기에 보다 완전히 개략된 바와 같은 한 쌍의 세트로 된 "비대칭(skew)" 변이체에 대해, 당업자라면 그 쌍의 하나의 세트인 어떤 가닥 또는 단량체가 진행할지를 결정하는 데 pI를 고려할 것이고, pI 분리는 또한 비대칭체의 pI를 사용하여 극대화된다.

본원에 사용된 바와 같은 "표적 세포"란 표적 항원을 발현하는 세포를 의미한다.

본원에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 생산하는 것의 맥락에서 "숙주 세포"란 이중특이적 항체의 성분을 암호화하는 외인성 핵산을 함유하고, 적합한 조건 하에 이중특이적 항체를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 적합한 숙주 세포는 하기에 기술되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 카파 면역글로불린 유전 좌위, 람다 면역글로불린 유전 좌위 및 중쇄 면역글로불린 유전 좌위를 각각 구성하는 임의의 Vκ 유전자, Vλ 유전자 및/또는 VH 유전자에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하고, 항원 특이성을 부여하는 CDR을 함유하는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 따라서, "가변 중쇄 도메인"은 "가변 경쇄 도메인"과 쌍을 지어 항원 결합 도메인("ABD")을 형성한다. 또한, 각각의 가변 도메인은 하기 순서로 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 3개의 초가변 영역("상보성 결정 영역", "CDR")(가변 중쇄 도메인에 대한 vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3 및 가변 경쇄 도메인에 대한 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3) 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

본원에서 "야생형 또는 WT"란 대립유전자 변이를 포함하는 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명은 인간 항체 도메인에 대한 서열 동일성을 갖는 다수의 항체 도메인을 제공한다. 2개의 유사한 서열(예를 들어, 항체 가변 도메인) 사이의 서열 동일성은 문헌[Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Comparison Of Biosequences," Adv. Appl. Math. 2:482][국소 상동성 알고리즘]; 문헌[Needleman, S.B. & Wunsch, CD. (1970) "A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins," J. Mol. Biol.48:443][상동성 정렬 알고리즘], 문헌[Pearson, W.R. & Lipman, D.J. (1988) "Improved Tools For Biological Sequence Comparison," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444][유사성 방법에 대한 조사]; 또는 "BLAST" 알고리즘인 문헌[Altschul, S.F. et al, (1990) "Basic Local Alignment Search Tool," J. Mol. Biol. 215:403-10]의 알고리즘과 같은 알고리즘에 의해 측정될 수 있고, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi를 참조한다. 임의의 상기 언급된 알고리즘을 사용할 때, 디폴트 매개변수(윈도우 길이에 대해, 갭 패널티 등)를 사용한다. 일 실시형태에서, 서열 동일성은 BLAST 알고리즘을 사용하여 디폴트 매개변수를 사용하여 수행된다.

본 발명의 항체는 일반적으로 단리되거나 재조합된다. "단리된"은 본원에 개시된 다양한 폴리펩타이드를 기재하는 데 사용될 때 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 확인되고/되거나, 단리되고/되거나, 회수된 폴리펩타이드를 의미한다. 보통, 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다. "재조합"은 항체가 외인성 숙주 세포에서 재조합 핵산 기법을 사용하여 생성되고, 이들이 또한 단리될 수 있음을 의미한다.

특정 항원 또는 에피토프에 대해 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적인"은 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 다른 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.

특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 항원 또는 에피토프에 대해 적어도 약 10^-4 M, 적어도 약 10^-5 M, 적어도 약 10^-6 M, 적어도 약 10^-7 M, 적어도 약 10^-8 M, 적어도 약 10^-9 M, 대안적으로 적어도 약 10^-10 M, 적어도 약 10^-11 M, 적어도 약 10^-12 M 또는 초과의 KD를 갖는 항체로 나타날 수 있고, 여기서 KD는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프와 비교하여 대조군 분자에 대해 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 초과인 KD를 가질 것이다.

또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 항원 또는 에피토프에 대한 대조군과 비교하여 적어도 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배 또는 10,000배 또는 초과의 KA 또는 Ka를 갖는 항체로 나타날 수 있고, 여기서 KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 결합 친화도는 일반적으로 Biacore, SPR 또는 BLI 분석을 사용하여 측정된다.

D. 항체

본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 2개의 상이한 관문 항원에 결합하는 이중특이적 관문 항체의 생성에 관한 것이다. 하기에 기술된 바와 같이, "항체"라는 용어가 일반적으로 사용된다. 본 발명에 사용되는 항체는 전통적인 항체, 및 본원에 기재되고 도면에 도시된 항체 유도체, 단편 및 모방체를 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 다수의 형식을 취할 수 있다.

전통적인 항체 구조 단위는 전형적으로 사합체를 포함한다. 각각의 사합체는 전형적으로 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(전형적으로 분자량이 약 25 kDa임) 및 하나의 "중쇄"(전형적으로 분자량이 약 50 내지 70 kDa임)를 갖는다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 본 발명은 비제한적인 예로서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 몇몇 하위종류를 갖는 IgG 종류에 일반적으로 기초한 이중특이적 항체에 관한 것이다. 일반적으로, IgG1, IgG2 및 IgG4는 IgG3보다 자주 사용된다. IgG1이 356(D 또는 E) 및 358(L 또는 M)에서 다형성을 갖는 상이한 동종이인자형을 가짐에 주목해야 한다. 본원에 도시된 서열은 356E/358M 동종이인자형을 사용하지만, 다른 동종이인자형도 본원에 포함된다. 즉, 본원에 포함된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356E/358M 동종이인자형을 대체하는 356D/358L을 가질 수 있다.

또한, 본원에서 많은 항체는 세린에 의해 대체되는 220번 위치에서 적어도 하나의 시스테인을 가지며; 일반적으로, 이것은 본원에 도시된 서열의 대부분에 대해 "scFv 단량체" 측에 있지만, 디설파이드 형성을 감소시키도록 "Fab 단량체" 측 또는 둘 다에 또한 있을 수 있다. 대체된 이들 시스테인(C220S) 중 하나 또는 둘 다는 본원에서 서열 내에 특히 포함된다.

따라서, 본원에 사용되는 바와 같은 "아이소타입"은 이들의 불변 영역의 화학 특징 및 항원 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 하위종류를 의미한다. 치료학적 항체가 아이소타입 및/또는 하위종류의 하이브리드를 또한 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 2009/0163699호(인용되어 포함됨)에 기재된 바와 같이, 본 발명은 인간 IgG1/G2 하이브리드의 사용을 포괄한다.

초가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역에서 약 24번 내지 34번 아미노산 잔기(LCDR1; "L"은 경쇄를 표시함), 50번 내지 56번 아미노산 잔기(LCDR2) 및 89번 내지 97번 아미노산 잔기(LCDR3)로부터의 아미노산 잔기 및 중쇄 가변 영역에서 약 31번 내지 35B번 아미노산 잔기(HCDR1; "H"는 중쇄를 표시함), 50번 내지 65번 아미노산 잔기(HCDR2) 및 95번 내지 102번 아미노산 잔기(HCDR3)(문헌[Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 초가변 루프를 형성하는 이들 잔기들(예를 들어, 경쇄 가변 영역에서 26번 내지 32번 잔기(LCDR1), 50번 내지 52번 잔기(LCDR2) 및 91번 내지 96번 잔기(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역에서 26번 내지 32번 잔기(HCDR1), 53번 내지 55번 잔기(HCDR2) 및 96번 내지 101번 잔기(HCDR3)(문헌[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917])을 포함한다. 본 발명의 특정 CDR은 하기에 기재된다.

당업자에 의해 이해되는 것처럼, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템들 중에서 다를 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 개시내용은 연관된 (고유한) CDR의 개시내용을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 각각의 가변 중쇄 영역의 개시내용은 vhCDR(예를 들어, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시내용이며, 각각의 가변 경쇄 영역의 개시내용은 vlCDR(예를 들어, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 개시내용이다. CDR 넘버링의 유용한 비교는 하기와 같고, 문헌[Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003)]을 참조한다.

본 명세서에 걸쳐, 카밧 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인에서의 잔기(대략적으로, 경쇄 가변 영역의 1번 내지 107번 잔기 및 중쇄 가변 영역의 1번 내지 113번 잔기)를 언급할 때 사용되고, Fc 영역의 경우 EU 넘버링 시스템이 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌(1991) 참조).

다른 유형의 중쇄의 Ig 도메인은 힌지 영역이다. 본원에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"이란 항체의 제1 불변 도메인과 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 215번 위치에서 종결되고, IgG CH2 도메인은 EU 231번 잔기 위치에서 시작된다. 따라서, IgG의 경우 항체 힌지는 본원에서 216번(IgG1에서 E216) 내지 230번(IgG1에서 p230) 위치를 포함하도록 정의되며, 넘버링은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 경우에, 힌지 도메인의 N 말단 및 C 말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 더 적은 아미노산을 함유하는 "힌지 단편"을 사용한다. 본원에서 언급된 바와 같이, pI 변이체는 또한 힌지 영역에서 만들어질 수 있다.

경쇄는 일반적으로 2개의 도메인, 즉 가변 경쇄 도메인(경쇄 CDR을 Fv 영역을 형성하는 가변 중쇄 도메인과 함께 포함함) 및 불변 경쇄 영역(종종 CL 또는 Cκ라고 지칭됨)을 포함한다.

본원에 개략된 추가 치환에 대한 관심 있는 다른 영역은 Fc 영역이다.

본 발명은 매우 많은 상이한 CDR 세트를 제공한다. 이 경우에, "완전 CDR 세트"는 3개의 가변 경쇄 CDR 및 3개의 가변 중쇄 CDR, 예를 들어 vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3을 포함한다. 이들은 각각 더 큰 가변 경쇄 도메인 또는 가변 중쇄 도메인의 일부일 수 있다. 또한, 본원에서 보다 완전하게 개략된 바와 같이, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 중쇄 및 경쇄가 사용될 때(예를 들어, Fab가 사용될 때) 별개의 폴리펩타이드 사슬에 존재하거나 scFv 서열의 경우 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재할 수 있다.

CDR은 항원 결합 또는 보다 구체적으로 항체의 에피토프 결합 부위의 형성에 기여한다. "에피토프"는 파라토프(paratope)로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 결정부위를 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 그룹화이며, 보통 특정한 구조 특징 및 특정한 전하 특징을 갖는다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.

에피토프는 특이적으로 항원 결합하는 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기와 같은 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기(에피토프의 면역우세 성분이라고도 칭함) 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있고; 바꾸어 말하면 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩타이드의 풋프린트(footprint) 내에 있다.

에피토프는 입체구조 또는 선형일 수 있다. 입체구조적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생산된 것이다. 입체구조적 에피토프 및 비입체구조적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 비입체구조적 에피토프에 대한 결합이 아니라 입체구조적 에피토프에 대한 결합이 손실된다는 점에서 구별될 수 있다.

에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조에서 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 단순한 면역검정에서 입증될 수 있는데, 이는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력, 예를 들어 "비닝(binning)"을 보여준다. 하기에 개략된 바와 같이, 본 발명은 본원에서 열거된 항원 결합 도메인 및 항체를 포함할 뿐만 아니라 열거된 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프와 결합에 경쟁하는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명은 상이한 항체 도메인을 제공한다. 본원에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같이, 본 발명의 이종이합체성 항체는 또한 중첩할 수 있는 중쇄 및 경쇄 내에 상이한 도메인을 포함한다. 이들 도메인은 Fc 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 도메인, 중쇄 불변 도메인(CH1-힌지-Fc 도메인 또는 CH1-힌지-CH2-CH3), 가변 중쇄 도메인, 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, Fab 도메인 및 scFv 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

따라서, "Fc 도메인"은 -CH2-CH3 도메인 및 선택적으로 힌지 도메인을 포함한다(-H-CH2-CH3). IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3(Cγ2 및 Cγ3) 및 CH1(Cγ1)과 CH2(Cγ2) 사이의 하부 힌지 영역을 포함한다. Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 카르복실 말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되며, 넘버링은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 따라서, IgG의 맥락에서 "CH" 도메인은 다음과 같다: "CH1"은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 118번 내지 215번 위치를 지칭한다. "힌지"는 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 216번 내지 230번 위치를 지칭한다. "CH2"는 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 231번 내지 340번 위치를 지칭하고, "CH3"은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 341번 내지 447번 위치를 지칭한다. 따라서, "Fc 도메인"은 -CH2-CH3 도메인 및 선택적으로 힌지 도메인을 포함한다(힌지-CH2-CH3). 본원에서의 실시형태에서, scFv가 Fc 도메인에 부착되는 경우, 이것은 일반적으로 Fc 도메인의 힌지의 전부 또는 일부에 부착된 scFv 구조물의 C 말단이고, 예를 들어 이것은 일반적으로 힌지의 시작인 서열 EPKS에 부착된다. 일부 실시형태에서, 하기에 보다 완전히 기재된 바와 같이, 예를 들어 하나 이상의 FcγR 수용체 또는 FcRn 수용체에 대한 결합을 변경시키고, 본원에 개략된 바와 같이 이종이합체 형성 및 정제가 가능하게 하도록 Fc 영역에 대해 아미노산 변형은 이루어진다.

중쇄는 가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함하며, 이는 CH2-CH3를 포함하는 CH1-선택적 힌지-Fc 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. scFv는 가변 중쇄, scFv 링커 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 본원에 개략되는 대부분의 작제물 및 서열에서, 가변 중쇄의 C 말단은 scFv 링커의 N 말단에 부착되며, 이의 C 말단은 가변 경쇄의 N 말단에 부착되지만(N-vh-링커-vl-C), 전환될 수 있다(N-vl-링커-vh-C).

본 발명의 일부 실시형태는 자연 발생적이지 않지만, 일반적으로 scFv 링커에 의해 함께 연결된 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 적어도 하나의 scFv 도메인을 포함한다. 본원에 개략된 바와 같이, scFv 도메인은 일반적으로 N 말단에서 C 말단으로 vh-scFv 링커-vl로 배향되지만, 이것은 임의의 scFv 도메인(또는 Fab로부터의 vh 서열 및 vl 서열을 사용하여 작제된 도메인)의 경우 vl-scFv 링커-vh에 역전될 수 있으며, 선택적 링커는 형식에 따라 하나 또는 둘 다의 말단에 있다(일반적으로 도 1 참조).

본원에 나타낸 바와 같이, 재조합 기법에 의해 생성되는 전통적인 펩타이드 결합을 포함하여 언급된 도메인을 공유 부착시키도록 사용될 수 있는 (도메인 링커 또는 scFv 링커로 사용하기 위한) 다수의 적합한 링커가 존재한다. 일부 실시형태에서, 링커 펩타이드는 우세하게 다음의 아미노산 잔기를 포함한다: Gly, Ser, Ala 또는 Thr. 링커 펩타이드는 원하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 입체구조를 취하는 방식으로 2개의 분자를 연결하기에 적절한 길이를 가져야 한다. 일 실시형태에서, 이 링커는 약 1개 내지 50개의 아미노산 길이이고, 바람직하게는 약 1개 내지 30개의 아미노산 길이이다. 일 실시형태에서, 1개 내지 20개 아미노산 길이의 링커를 사용할 수 있으며, 약 5개 내지 약 10개의 아미노산이 일부 실시형태에서 사용된다. 유용한 링커는 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n(서열 번호 37756번), (GGGGS)n(서열 번호 37757번) 및 (GGGS)n(서열 번호 37758번)(여기서, n은 적어도 1(일반적으로 3 내지 4)의 정수임)을 비롯한 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 다른 가요성 링커를 포함한다. 대안적으로, 비제한적인 예로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하는 다양한 비단백질성 중합체는 링커로서 사용될 수 있다.

다른 링커 서열은 CL/CH1 도메인의 모든 잔기가 아니라 임의의 길이의 CL/CH1 도메인의 임의의 서열, 예를 들어 CL/CH1 도메인의 처음의 5개 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커는 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 Cκ 또는 Cλ로부터 유래될 수 있다. 링커는 예를 들어 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε 및 Cμ를 포함하여 임의의 아이소타입의 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 링커 서열은 또한 다른 단백질, 예컨대 Ig-유사 단백질(예를 들어, TCR, FcR, KIR), 힌지 영역 유래된 서열 및 다른 단백질로부터의 다른 자연 서열로부터 유래될 수 있다.

일부 실시형태에서, 링커는 본원에 개략된 바와 같은 임의의 2개의 도메인을 함께 연결하는 데 사용된 "도메인 링커"이다. 예를 들어, 도 1f에서, Fab의 CH1 도메인의 C 말단을 scFv의 N 말단에 부착시키는 도메인 링커가 존재할 수 있고, (많은 실시형태에서 힌지가 이 도메인 링커로서 사용되지만) 다른 선택적 도메인 링커는 scFv의 C 말단을 CH2 도메인에 부착시킨다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있는 한편, 많은 실시형태는 도메인 링커로서 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n(서열 번호 37756호), (GGGGS)n(서열 번호 37757호) 및 (GGGS)n(서열 번호 37758호)(여기서, n은 적어도 1(일반적으로 3으로부터 4 내지 5까지)의 정수임)을 포함하는 글리신-세린 중합체, 및 각각의 도메인이 이의 생물학적 기능을 보유하도록 충분한 길이 및 가요성을 갖는 2개의 도메인의 재조합 부착을 허용하는 임의의 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 하기에 개략된 바와 같이 "가닥 배열"에 주의를 기울이면서, scFv 링커의 일부 실시형태에서 사용된 바와 같은 하전된 도메인 링커가 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 링커는 본원에 기술된 바와 같은 vh 도메인 및 vl 도메인을 공유 부착시키도록 사용된 scFv 링커이다. 많은 경우에, scFv 링커는 하전된 scFv 링커이고, 이들 중 다수는 도 7에 도시된다. 따라서, 본 발명은 제1 단량체와 제2 단량체 사이의 pI에서 분리를 용이하게 하기위해 하전된 scFv 링커를 추가로 제공한다. 즉, 양성 또는 음성 중 어느 하나(또는 상이한 단량체에서 scFv를 사용하는 스캐폴드의 경우는 둘 다)인 하전된 scFv 링커를 도입하여, 이것은 Fc 도메인에서 추가 변화를 만들지 않고도 하전된 링커를 포함하는 단량체가 pI를 변경하도록 허용한다. 이들 하전된 링커는 표준 링커를 포함하는 임의의 scFv로 치환될 수 있다. 다시 말하면, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 하전된 scFv 링커는 원하는 pI 변화에 따라 정확한 "가닥" 또는 단량체에서 사용된다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 삼중 F 형식 이종이합체성 항체를 만들기 위해, 원하는 항원 결합 도메인의 각각에 대한 Fv 영역의 원래의 pI가 계산되고, 하나가 scFv를 만들기 위해 선택되고, pI에 따라 양성 또는 음성 링커 중 어느 하나가 선택된다.

하전된 도메인 링커는 또한 마찬가지로 본 발명의 단량체, 및 따라서 에 포함된 단량체의 pI 분리를 증가시키는 데 사용될 수 있다.

도 7은 링커가 사용되는 본원에서의 임의의 실시형태에서 사용될 수 있다.

특히, 도 1에 도시된 형식은 보통 "이종이합체성 항체"라고 지칭되는 항체이고, 단백질이 Fab로든 또는 scFv로든 이종이합체성 Fc 도메인 및 적어도 2개의 Fv 영역에 자가 조립된 적어도 2개의 연관된 Fc 서열을 갖는다는 것을 의미한다.

E. 키메라 항체 및 인간화된 항체

특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열(germline) 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 이러한 항체는 특정 생식계열 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래된" 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 (본원에 개략된 방법을 사용하여 )인간 항체의 서열과 가장 가까운 서열(예를 들어, 가장 높은 % 동일성)의 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택하여 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래된" 인간 항체는 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위 특이적 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 그러나, 인간화된 항체는 전형적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열에서 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 마우스 생식계열 서열)과 비교할 때 항체를 인간 서열로부터 유래된 것으로 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간화된 항체는 아미노산 서열에서 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래되는 인간화된 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 10개 내지 20개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다(본원에서 임의의 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체의 도입 이전에, 즉 본 발명의 변이체의 도입 이전에 변이체의 수는 일반적으로 낮음). 특정 경우에서, 인간화된 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열로부터 5개 이하 또는 심지어 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다(다시 말하면, 본원에서 임의의 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체의 도입 이전에, 즉 본 발명의 변이체를 도입하기 이전에 변이체의 수는 일반적으로 낮음).

일 실시형태에서, 모체 항체는 당업계에 공지된 바와 같이 친화도 성숙된다. 구조 기반 방법은 예를 들어 미국 특허 출원 USSN 11/004,590호에 기재된 바와 같이 인간화 및 친화도 성숙을 위해 사용될 수 있다. 선택 기반 방법이 항체 가변 영역을 인간화하고/하거나 친화도 성숙시키기 위해 사용될 수 있고, 이는 문헌[Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162]; 문헌[Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684]: 문헌[Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618]; 문헌[Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915]; 문헌[Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759](이들은 모두 그 전체 내용이 인용되어 포함됨)에 기재된 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 인간화 방법은 CDR의 일부만의 이식을 수반할 수 있고, 미국 특허 출원 USSN 09/810,510호; 문헌[Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125]; 문헌[De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084](이들은 모두 그 전체 내용이 인용되어 포함됨)에 기재된 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

VII. 이종이합체성 항체

따라서, 일부 실시형태에서 본 발명은 자가 조립되어 이종이합체성 Fc 도메인 및 이종이합체성 항체를 형성하는 2개의 상이한 중쇄 변이체 Fc 서열의 사용에 의존하는 이종이합체성 관문 항체를 제공한다.

본 발명은 하나 초과의 관문 항원 또는 리간드에 대한 결합을 허용하는, 예를 들어 이중특이적 결합을 허용하는 이종이합체성 항체를 제공하는 신규의 작제물에 관한 것이다. 이종이합체성 항체는 항체의 중쇄의 2개의 Fc 도메인, 예를 들어 "이합체"로 조립되는 2개의 "단량체"의 자가 조립 특성에 기초한다. 이종이합체 항체는 하기에 보다 완전히 기술된 바와 같이 각각의 단량체의 아미노산 서열을 변경하여 만들어진다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 이종이합체의 형성을 촉진하고/거나 동종이합체에 비해 이종이합체의 용이한 정제를 허용하도록 각각의 사슬에서 상이한 불변 영역의 아미노산 변이체에 의존하여 여러 방식으로 항원을 공동 결합시킬 수 있는 이종이합체성 관문 항체의 생성에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공한다. 항체 기술에서의 계속 진행 중인 문제는 동시에 2개의 상이한 항원에 결합하여, 일반적으로 상이한 항원이 가깝게 근접하게 하고 새로운 기능 및 새로운 치료제를 생성시키는 "이중특이적" 항체에 대한 바람이다. 일반적으로, 이 항체는 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 숙주 세포에 포함시켜 제조된다. 이는 일반적으로 원하는 이종이합체(A-B), 및 2개의 동종이합체(A-A 및 B-B(경쇄 이종이합체성 문제를 포함하지 않음))를 형성시킨다. 그러나, 이중특이적 항체의 형성에서의 주요 장애는 동종이합체성 항체로부터의 이종이합체성 항체의 정제 및/또는 동종이합체의 형성에 비해 이종이합체의 형성의 바이어스에서의 어려움이다.

본 발명의 이종이합체를 생성하는 데 사용될 수 있는 다수의 메커니즘이 존재한다. 또한, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이러한 메커니즘은 높은 이종이합체화를 보장하도록 조합될 수 있다. 따라서, 이종이합체의 생산을 유도하는 아미노산 변이체는 "이종이합체화 변이체"라고 지칭된다. 하기에 기술된 바와 같이, 이종이합체화 변이체는 입체 변이체(예를 들어, 하기에 기재되는 "손잡이 및 구멍" 또는 "비대칭" 변이체 및 하기에 기재되는 "하전 쌍" 변이체), 및 "pI 변이체"를 포함할 수 있으며, 이는 이종이합체로부터 동종이합체의 정제를 허용한다. 국제공개 WO2014/145806호(이의 전문이 본원에 인용되어 포함됨)에서 일반적으로 기재된 바와 같이, 상세하게는 하기에 "이종이합체화 변이체"의 논의에 관하여, 유용한 메커니즘은 "손잡이 및 구멍"("KIH"; 때때로 본원에서 "비대칭" 변이체(국제공개 WO2014/145806호의 논의 참조), 국제공개 WO2014/145806호에 기재된 바와 같은 "정전기 스티어링" 또는 "하전 쌍", 국제공개 WO2014/145806호에 기재된 바와 같은 pI 변이체, 및 국제공개 WO2014/145806호 및 하기에 개략된 바와 같은 일반적인 추가 Fc 변이체를 포함한다.

본 발명에서, 이종이합체성 항체의 용이한 정제를 유도할 수 있는 여러 기본 메카니즘이 있으며; 하나는 pI 변이체의 사용에 의존하여 각각의 단량체가 상이한 pI를 가지며, 따라서 A-A 이합체성 단백질, A-B 이합체성 단백질 및 B-B 이합체성 단백질의 등전위 정제를 허용한다. 대안적으로, 일부 스캐폴드 형식, 예컨대 "삼중 F" 형식은 또한 크기에 기초한 분리를 허용한다. 하기에 추가로 개략된 바와 같이, 동종이합체에 비해 이종이합체의 형성도 역시 "비대칭화"할 수 있다. 따라서, 입체적 이종이합체화 변이체와 pI 또는 하전 쌍 변이체의 조합은 본 발명에 특히 사용된다.

일반적으로, 본 발명의 특정한 용도의 실시형태는 비대칭 변이체를 포함하는 변이체의 세트에 의존하는데, 이것은 pI 변이체와 결합되어 동종이합체화 형성에 비해 이종이합체화 형성을 장려하고, 이는 동종이합체로부터 이종이합체의 정제를 용이하게 하도록 2개의 단량체 사이의 pI 차이를 증가시킨다.

추가로, 하기에 보다 완전히 개략된 바와 같이, 이종이합체성 항체의 형식에 따라, pI 변이체는 어느 하나가 단량체의 불변 도메인 및/또는 Fc 도메인 내에 포함될 수 있거나, 도메인 링커 또는 scFv 링커 중 어느 하나인 하전된 링커가 사용될 수 있다. 즉, 삼중 F 형식과 같은 scFv(들)를 사용하는 스캐폴드는 정제 목적을 위해 추가의 pI 부스트를 부여하도록 하전된 scFv 링커(양성 또는 음성 중 어느 하나)를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본 발명이 또한 단량체, 및/또는 하전된 도메인 링커의 하나 또는 둘 다에 있는 pI 변이체를 제공하지만, 일부 삼중 F 형식은 단지 하전된 scFv 링커에 의해 추가 pI 조정 없이 유용하다. 또한, 대안적인 기능을 위한 추가 아미노산 조작은 또한 Fc 변이체, FcRn 변이체 및 KO 변이체와 같은 pI 변화를 또한 부여할 수 있다.

이종이합체성 단백질의 정제를 허용하도록 분리 메커니즘으로서 pI를 이용하는 본 발명에서, 아미노산 변이체는 단량체 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 즉 하나의 단량체(본원에서 단순하게 "단량체 A"라고 지칭됨)의 pI는 단량체 B로부터 멀어지게 조작될 수 있거나, 단량체 A 및 단량체 B 둘 다는 단량체 A의 pI는 증가하고 단량체 B의 pI는 감소한 상태로 변화될 수 있다. 단량체들 중 하나 또는 둘 다의 pI 변화는 기술된 바와 같이 하전된 잔기(예를 들어, 중성 아미노산이 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기에 의해 대체되며, 예를 들어 글리신에서 글루탐산으로)를 제거하거나 첨가하고, 하전된 잔기를 양의 전하 또는 음의 전하에서 반대 전하로 변경하거나(예를 들어, 아스파르트산에서 라이신으로), 하전된 잔기를 중성 잔기로 변경하는 것(예를 들어, 전하 손실; 라이신에서 세린으로)에 의해 수행될 수 있다. 다수의 이들 변이체들은 도면에 도시된다.

따라서, 본 발명의 이 실시형태는 이종이합체가 동종이합체로부터 분리될 수 있도록 적어도 하나의 단량체에서 충분한 pI 변화의 생성을 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 또한 하기에 기술된 바와 같이, 이것은 "야생형" 중쇄 불변 영역 및 이의 pI를 증가 또는 감소시키도록 조작되었던 변이체 영역을 사용하여(야생형 A-+B 또는 야생형 A - -B) 수행되거나, 하나의 영역을 증가시키고 다른 영역을 감소시켜(A+ -B- 또는 A- B+) 수행될 수 있다.

따라서, 일반적으로, 본 발명의 일부 실시형태의 구성성분은 항체의 불변 영역에서의 아미노산 변이체인데, 이것은 아미노산 치환("pI 변이체" 또는 "pI 치환체")을 단량체의 하나 또는 둘 다에 도입하여 "pI 항체"를 형성하도록 이합체성 단백질의 단량체의 둘 다가 아니면 적어도 하나의 등전점 (pI)을 변경시키도록 지시된다. 본원에 기재된 바와 같이, 2개의 동종이합체로부터 이종이합체를 분리시키는 것은 2개의 단량체의 pI가 0.1 pH 단위만큼 작게 다르면 달성될 수 있으며, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 또는 초과는 모두 본 발명에 사용된다.

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 양호한 분리를 얻기 위해 각각의 또는 둘 다의 단량체(들)에 포함되는 pI 변이체의 수는 부분적으로 구성성분의 출발 pI, 예를 들어 삼중 F 형식에서 관심 있는 scFv 및 Fab의 출발 pI에 의존할 것이다. 즉, 어떤 단량체를 조작할지 또는 어떤 "방향"인지(예를 들어, 더 큰 양성인지 또는 더 큰 음성인지)를 결정하기 위해, 2개의 표적 항원의 Fv 서열이 계산되고, 이것으로부터 결정이 이루어진다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 상이한 Fv는 본 발명에 사용되는 상이한 출발 pI를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 개략된 바와 같이, pI는 적어도 약 0.1 로그의 각각의 단량체의 총 pI 차이를 유도하도록 조작되며, 본원에 개략된 바와 같이 0.2 내지 0.5가 바람직하다.

또한, 당업자에 의해 이해되고 본원에 개략된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 이종이합체는 크기에 기초하여 동종이합체로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 것처럼, 여러 형식은 크기에 기초하여 이종이합체 및 동종이합체의 분리를 허용한다.

A. 이종이합체화 변이체

본 발명은 다양한 형식의 이종이합체성 항체를 포함하는 이종이합체성 단백질을 제공하고, 이것은 동종이합체로부터 이종이합체 형성 및/또는 정제를 허용하도록 이종이합체성 변이체를 사용한다.

다수의 적절한 쌍의 이종이합체화 비대칭 변이체의 세트가 존재한다. 이들 변이체는 "세트"의 "쌍"으로 나타난다. 즉, 하나의 쌍의 세트는 제1 단량체에 도입되고, 나머지 쌍의 세트는 제2 단량체에 도입된다. 이들 세트는 하나의 단량체 상의 잔기와 다른 단량체 상의 잔기 사이에서 일대일 대응을 갖는 "구멍 내 손잡이(knob in hole)" 변이체로 반드시 작동할 필요가 없는 점이 주목되어야 하고, 즉 이들 쌍들의 세트는 이종이합체 형성을 장려하고 동종이합체 형성을 방해하는 2개의 단량체 사이에 인터페이스를 형성하여, 생물학적 조건 하에 자발적으로 형성되는 이종이합체의 백분율이 예상된 50%(25%의 동종이합체 A/A: 50%의 이종이합체 A/B: 25%의 동종이합체 B/B)가 아니라 90%를 초과하는 것을 허용한다.

B. 입체 변이체

일부 실시형태에서, 이종이합체의 형성은 입체 변이체의 첨가에 의해 용이하게 될 수 있다. 즉, 각각의 중쇄에서 아미노산을 변화시켜, 상이한 중쇄는 동일한 Fc 아미노산 서열을 갖는 동종이합체를 형성하기보다 이종이합체성 구조를 형성하도록 좀더 회합할 것이다. 적합한 입체 변이체는 도면에 포함된다.

하나의 메카니즘은 일반적으로 당해 기술분야에서 "손잡이 및 구멍"이라고 지칭되고, 이종이합체 형성을 선호하고 동종이합체 형성을 선호하지 않는 입체적 영향을 생성하는 아미노산 조작이 또한 선택적으로 사용될 수 있는 것을 말하며, 이것은 때때로 미국 특허 출원 USSN 61/596,846호, 문헌[Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996)]; 문헌[Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26]; 미국 특허 제8,216,805호(이들은 모두 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 바와 같이 "손잡이 및 구멍"이라고 지칭된다. 도면은 "손잡이 및 구멍"에 의존하는 다수의 "단량체 A - 단량체 B" 쌍을 알아보게 한다. 또한, 문헌[Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)]에 기재된 바와 같이, 이 "손잡이 및 구멍" 돌연변이는 디설파이드 결합과 조합하여 이종이합체화에 대한 형성을 비대칭화할 수 있다.

이종이합체의 생성에 사용되는 추가 메커니즘은 때때로 문헌[Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)](그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 바와 같이 "정전기 스티어링"이라고 지칭된다. 이것은 때때로 본원에서 "전하 쌍"이라고 지칭된다. 이러한 실시형태에서, 정전기는 이종이합체화로의 형성을 비대칭화하는 데 사용된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들은 또한 pI 및 이에 따른 정제에 효과를 미칠 수 있고, 따라서 일부 경우에서 또한 pI 변이체로서 간주될 수 있을 것이다. 그러나, 이들이 이종이합체화를 강제하기 위해 생성되었고 정제 도구로서 사용되지 않으면서, 이들은 "입체 변이체"로 분류된다. 이들은 D221R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 D221E/P228E/L368E(예를 들어, 이들은 "단량체 대응 세트") 및 C220R/E224R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 C220E/P228E/368E를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

추가 단량체 A 및 단량체 B는, 본원에 개략되는 pI 변이체 또는 미국 특허출원공개 US 2012/0149876호(이의 도면 및 범례 및 서열번호는 명확히 본원에 인용되어 포함됨)의 도 37에 도시된 다른 입체 변이체와 같은, 선택적으로 및 독립적으로 임의의 양의 다른 변이체와 조합될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 개략된 입체 변이체는 선택적으로 및 독립적으로 임의의 pI 변이체(또는 Fc 변이체, FcRn 변이체 등과 같은 다른 변이체)와 하나 또는 둘 다의 단량체로 도입될 수 있고, 독립적으로 및 선택적으로 본 발명의 단백질로부터 포함되거나 배제될 수 있다.

적합한 비대칭 변이체의 목록은 많은 실시형태에서 특히 사용되는 일부 쌍을 보여주는 도 3 및 도 8에서 발견된다. 많은 실시형태에서, 비제한적인 예로서 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q 및 T366S/L368A/Y407V: T366W(선택적으로, 브리징 디설파이드 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C를 포함)를 포함하는 세트의 쌍이 특히 사용된다. 명명법에 관하여, 쌍 "S364K/E357Q: L368D/K370S"는 하나의 단량체가 이중 변이체 세트 S364K/E357Q를 갖고 나머지는 이중 변이체 세트 L368D/K370S를 갖는 것을 의미하며, 상기와 같이 이들 쌍의 "가닥 배열"은 출발 pI에 의존한다.

C. 이종이합체를 위한 pI(등전점) 변이체

일반적으로, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 단백질의 pI를 증가시키는 변이체(염기성 변화) 및 단백질의 pI를 감소시키는 변이체(산성 변화)의 pI 변이체에 대한 두 가지 일반적인 분류가 존재한다. 본원에서 기재된 바와 같이, 이들 변이체의 모든 조합이 수행될 수 있는데, 하나의 단량체는 야생형 또는 야생형과 유의미하게 다른 pI를 나타내지 않는 변이체일 수 있고, 나머지 하나는 더 염기성이거나 더 산성일 수 있다. 대안적으로, 각각의 단량체는 1개 이상 염기성으로 변하고 1개 이상 산성으로 변한다.

PI 변이체의 바람직한 조합은 도 4에 도시된다. 본원에 개략되고 도면에 도시된 바와 같이, 이들 변화는 IgG1에 대해 표시되지만, 모든 아이소타입뿐만 아니라 아이소타입 하이브리드가 이러한 방식으로 변경될 수 있다. 중쇄 불변 도메인이 IgG2 내지 IgG4 유래인 경우, R133E 및 R133Q를 또한 사용할 수 있다.

일 실시형태에서, 예를 들어 도 1a, 도 1e, 도 1f, 도 1g, 도 1h 및 도 1i 형식에서, pI 변이체의 바람직한 조합은 208D/295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1에 대한 것일 때 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함하는 하나의 단량체(음성 Fab 측) 및 (GKPGS)₄ (서열 번호 37755번)를 포함하는 양으로 하전된 scFv 링커를 포함하는 제2 단량체(양성 scFv 측)를 갖는다. 그러나, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 제1 단량체는 208번 위치를 포함하는 CH1 도메인을 포함한다. 따라서, CH1 도메인을 포함하지 않는 작제물에서(예를 들어, 도 1b, 도 1c 또는 도 1d에 도시된 것과 같은 이중 scFv 형식 또는 "1-아암" 형식에서 예를 들어 도메인들 중 하나에서 CH1 도메인을 사용하지 않는 항체에 대해), 바람직한 음성 pI 변이체 Fc 세트는 295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1에 대한 것일 때 Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함한다.

따라서, 일부 실시형태에서, 하나의 단량체는 도 4로부터의 치환의 세트를 갖고, 다른 단량체는 하전된 링커(단량체가 그 형식이 기술하는 것처럼 도 7에 도시된 것으로부터 선택될 수 있는 scFv 또는 하전된 도메인 링커를 포함하므로, 하전된 scFv 링커의 형태의 어느 하나)를 갖는다.

1. 아이소타입 변이체

또한, 본 발명의 많은 실시형태는 특정 위치에서 하나의 IgG 아이소타입으로부터 다른 아이소타입으로의 pI 아미노산의 "이입(importation)"에 의존하며, 따라서 원치 않는 면역원성이 변이체로 도입될 가능성을 감소시키거나 제거한다. 다수의 것들이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허공개번호 2014/0370013호의 도 21에 도시된다. 즉, IgG1은 높은 효과기 기능을 포함하여 다양한 이유로 치료학적 항체를 위한 공통 아이소타입이다. 그러나, IgG1의 중쇄 불변 영역은 IgG2보다 pI가 더 높다(8.10 대 7.31). IgG2 잔기를 특정 위치에서 IgG1 골격에 도입하여, 생성된 단량체의 pI는 감소하고(또는 증가하고), 추가적으로 더 긴 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들어, IgG1은 137번 위치에서 글리신(pI 5.97)을 갖고, IgG2는 글루탐산(pI 3.22)을 가지며, 글루탐산을 이입하는 것은 생성된 단백질의 pI에 영향을 미칠 것이다. 하기에 기재된 바와 같이, 다수의 아미노산 치환은 일반적으로 변이체 항체의 pI에 유의미하게 영향을 미칠 것이 요구된다. 그러나, 하기에 기술된 바와 같이, 심지어 IgG2 분자 변화가 혈청 반감기의 증가를 허용한다는 점에 주목해야 한다.

다른 실시형태에서, 하기에 더 추가로 기재된 바와 같이 (예를 들어, 더 높은 pI 아미노산을 더 낮은 pI 아미노산으로 변경하여) 생성된 단백질의 전반적 하전 상태를 감소시키거나, 안정성을 위해 구조에서의 조절을 허용하도록 비아이소타입 아미노산 변화가 만들어진다.

또한, 중쇄 불변 도메인 및 경쇄 불변 도메인 둘 다를 pI 조작하여 이종이합체의 각각의 단량체의 유의미한 변화가 관찰될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 2개의 단량체의 pI를 적어도 0.5만큼 다르게 하는 것은 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전위 포커싱 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 허용할 수 있다.

D. pI 계산

각각의 단량체의 pI는 변이체 중쇄 불변 도메인의 pI 및 변이체 중쇄 불변 도메인 및 융합 파트너를 포함하는 전체 단량체의 pI에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, pI의 변화는 미국 특허공개번호 2014/0370013호의 도 19에서의 도표를 사용하여 변이체 중쇄 불변 도메인을 기준으로 계산된다. 본원에 기술된 바와 같이, 어떤 단량체를 조작할 것인지는 일반적으로 Fv 및 스캐폴드 영역의 고유한 pI에 의해 결정된다. 대안적으로, 각각의 단량체의 pI는 비교될 수 있다.

E. 더 양호한 FcRn 생체내 결합을 또한 부여하는 pI 변이체

pI 변이체가 단량체의 pI를 감소시키는 경우에, 이들은 생체내 혈청 보유를 개선하는 추가 이점을 가질 수 있다.

여전히 조사 중이지만, 엔도솜에서 pH 6에서의 FcRn에 대한 결합이 Fc를 격리하기 때문에, Fc 영역이 생체내 더 긴 반감기를 갖는 것으로 생각된다(문헌[Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598](전문이 인용되어 포함됨)). 이후, 엔도솜 구획은 Fc를 세포 표면으로 재순환시킨다. 이 구획이 세포외 공간에 개방되면, 더 높은 pH, 약 7.4는 다시 혈액으로의 Fc 방출을 유도한다. 마우스에서, Dall' Acqua 등은 pH 6 및 pH 7.4에서 FcRn 결합이 증가된 Fc 돌연변이체가 실제로 감소된 혈청 농도 및 야생형 Fc와 동일한 반감기를 가진다는 것을 보여주었다(문헌[Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180](전문이 인용되어 포함됨)). pH 7.4에서 FcRn에 대한 Fc의 친화도 증가는 다시 혈액으로의 Fc의 방출을 금지하는 것으로 생각된다. 따라서, 생체내 Fc의 반감기를 증가시키는 Fc 돌연변이는 더 높은 pH에서 여전히 Fc의 방출을 허용하면서 더 낮은 pH에서 FcRn 결합을 이상적으로 증가시킬 것이다. 아미노산 히스티딘은 6.0 내지 7.4의 pH 범위에서 이의 하전 상태를 변화시킨다. 따라서, Fc/FcRn 복합체에서의 중요한 위치에서 His 잔기를 발견하는 것은 놀라운 일이 아니다.

최근에, 더 낮은 등전점을 갖는 가변 영역을 갖는 항체가 또한 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있는 것으로 제안되었다(문헌[Igawa et al., 2010 PEDS. 23(5): 385-392](그 전체 내용이 인용되어 포함됨)). 그러나, 이의 메커니즘은 여전히 불량하게 이해된다. 게다가, 가변 영역은 항체마다 다르다. pI가 감소되고 반감기가 연장된 불변 영역 변이체는 본원에 기재된 바와 같이 항체의 약동학적 특성을 개선하기 위한 더 모듈식인 접근법을 제공할 것이다.

F. 추가 기능성을 위한 추가 Fc 변이체

pI 아미노산 변이체에 추가로, 비제한적인 예로서 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합 변경, FcRn 수용체에 대한 결합 변경 등을 포함하는 다양한 이유로 만들어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 아미노산 변형이 존재한다.

따라서, 본 발명의 단백질은 pI 변이체 및 입체 변이체를 포함하는 본원에 개략되는 이종이합체화 변이체를 포함하는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 각각의 변이체 세트는 독립적으로 및 선택적으로 임의의 특정한 이종이합체성 단백질로부터 포함되거나 배제될 수 있다.

G. FcγR 변이체

따라서, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합을 변경하기 위해 만들어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 치환이 존재한다. 결합 증가뿐만 아니라 결합 감소를 유도하는 치환이 유용할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa에 대한 증가된 결합은 증가된 ADCC(항체 의존성 세포 매개 세포독성; FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서의 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응)를 유도하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, FcγRIIb(억제 수용체)에 대한 결합 감소는 일부 상황에서 마찬가지로 유익할 수 있다. 본 발명에 사용되는 아미노산 치환은 미국 특허 출원 USSN 11/124,620호(상세하게 도 41), 미국 특허 출원 11/174,287호, 미국 특허 출원 11/396,495호, 미국 특허 출원 11/538,406호(이들 모두는 상세하게는 여기에 개시된 변이체들에 대해 본원에 그 전체 내용이 명확히 인용되어 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 본원에 사용되는 특정한 변이체는 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243A, 243L, 264A, 264V 및 299T를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

또한, 비제한적인 예로서 434S, 434A, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I 또는 V/434S, 436V/428L 및 259I/308F/428L을 포함하는 미국 특허 출원 USSN 12/341,769호(그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 구체적으로 개시되는 바와 같은, FcRn 수용체에 대한 증가된 결합 및 증가된 혈청 반감기에 사용되는 추가적인 Fc 치환체가 존재한다.

H. 절제 변이체

유사하게, 기능적 변이체의 다른 카테고리는 "FcγR 절제 변이체" 또는 "Fc 녹아웃(FcKO 또는 KO)"변이체이다. 이들 실시형태에서, 일부 치료 용도를 위해, Fcγ 수용체(예를 들어, FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 등) 중 하나 이상 또는 전부에 대한 Fc 도메인의 정상적인 결합을 감소시키거나 제거하여 추가적인 작용 메커니즘을 회피하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어 많은 실시형태에서, 하나의 Fc 도메인이 하나 이상의 Fcγ 수용체 절제 변이체를 포함하도록 ADCC 활성을 제거하거나 유의미하게 감소시키기 위해 FcγRIIIa 결합을 절제하는 것이 바람직한 이중특이성 관문 항체가 특히 사용된다. 이들 절제 변이체는 도 5에 도시되고, 각각은 독립적으로 및 선택적으로 포함되거나 배제될 수 있으며, 바람직한 양태는 G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 및 E233P/L234V/L235A/G236del로 이루어진 군으로부터 선택되는 절제 변이체를 사용한다. 본원에 언급된 절제 변이체는 FcγR 결합을 절제하지만 일반적으로 FcRn 결합은 절제하지 않음에 주목해야 한다.

당해 기술분야에 공지된 것처럼, 이종이합체성 항체의 골격에서 불변 도메인(또는 Fc 도메인)이 IgG1일 때 인간 IgG1의 Fc 도메인은 Fcγ 수용체에 대해 가장 높은 결합을 가지고, 이에 따라 절제 변이체가 사용될 수 있다. IgG1 배경에서의 절제 변이체에 대안적으로 또는 이것 이외에, (일반적으로 A 또는 S로) 당화 297번 위치에서의 돌연변이는 예를 들어 FcγRIIIa에 대한 결합을 상당히 절제할 수 있다. 인간 IgG2 및 IgG4는 Fcγ 수용체에 대해 자연히 결합이 감소하고, 이에 따라 이 골격은 절제 변이체와 함께 또는 이것 없이 사용될 수 있다.

I. 이종이합체성 변이체와 Fc 변이체의 조합

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 모든 언급된 이종이합체화 변이체(비대칭 변이체 및/또는 pI 변이체를 포함)는 이들이 "가닥 배열" 또는 "단량체 분할"을 유지하는 한 선택적으로 및 독립적으로 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 모든 이들 변이체는 임의의 이종이합체화 형식으로 조합될 수 있다.

pI 변이체의 경우에, 특히 사용되는 실시형태가 도면에 도시되지만, 정제를 용이하게 하도록 2개의 단량체 사이의 pI 차이를 변경하는 기본 규칙에 따라 다른 조합이 생성될 수 있다.

또한, 임의의 이종이합체화 변이체, 비대칭 변이체 및 pI 변이체는 또한 본원에서 일반적으로 개략된 바와 같이 Fc 절제 변이체, Fc 변이체, FcRn 변이체와 독립적으로 및 선택적으로 조합된다. 바람직한 조합은 도 6에 도시된다.

표적 항원에 대한 항원 결합 도메인

본 발명의 이중특이적 항체는 일반적으로 도 1에 도시된 바와 같은 2가 이중특이적 형식 또는 3가 이중특이적 형식의 2개의 상이한 표적 항원("표적 쌍")에 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 도메인(ABD)을 갖는다. 본 발명에서, 이중특이적 이종이합체성 항체는 하나의 측에서의 표적 인간 PD-1을 표적화하고, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT, ICOS 및 BTLA(이들의 서열은 도 2에 도시됨)로부터 선택된 다른 측에서의 제2 항원을 표적화한다. 따라서, 적합한 이중특이적 항체는 PD-1 및 CTLA-4, PD-1과 TIM-3, PD-1과 LAG-3, PD-1과 TIGIT, PD-1과 BTLA, 및 PD-1과 ICOS에 결합한다. 일반적으로 이 이중특이적 항체가 각각의 쌍에 대해 "항-PD-1 x 항-CTLA-4"로 또는 일반적으로 단순하게 또는 용이하게(그리고 이에 따라 상호 교환적으로) "PD-1 x CTLA-4" 등으로 명명됨에 유의한다. 본원에 달리 기재되지 않는 한, 명칭에서 항원 목록의 순서가 구조를 부여하지 않음에, 즉 일부 경우에 그 순서가 표시된 바와 같은 구조를 기술하지만, PD-1 x CTLA-4 병 오프너 항체가 scFv가 PD-1 또는 CTLA-4에 결합하게 할 수 있음에 유의한다.

본원에 더 완전히 개략된 것처럼, 이 ABD 조합은 일반적으로 하나의 ABD가 Fab 형식이고 다른 것이 scFv 형식인 조합으로 하기에 개략된 것처럼 다양한 형식으로 있을 수 있다. 본원에 기술되고 도 1에 도시된 것처럼, 일부 형식은 단일 Fab 및 단일 scFv(도 1a, 도 1c 및 도 1d)를 사용하고, 일부 형식은 2개의 Fab 및 단일 scFv(도 1e, 도 1f, 도 1g, 도 1h 및 도 1i)를 사용한다.

VIII. 항원 결합 도메인

하기에 기술된 것처럼, 본 발명의 이중특이적 이종이합체성 항체는 각각 상이한 표적 단백질에 결합하는 2개의 항원 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 하기에 개략된 것처럼, 이 이종이합체성 항체는 이중특이적 및 2가(각각의 항원은 예를 들어 도 1a에 도시된 형식의 단일 ABD에 의해 결합됨)이거나, 이중특이적 및 3가(도 1f에 도시된 것처럼 하나의 항원은 단일 ABD에 의해 결합되고, 다른 것은 2개의 ABD에 의해 결합됨)일 수 있다.

또한, 일반적으로, ABD 중 하나는 N 말단에서 C 말단으로 vh-scFv 링커-vl 또는 vl-scFv 링커-vh의 배향으로 하기에 개략된 바와 같은 scFv를 포함한다. 이 형식에 따르면 다른 ABD 중 하나 또는 둘 다는 일반적으로 (일반적으로 중쇄의 성분으로서) 하나의 단백질 사슬에서 vh 도메인을 포함하고, (일반적으로 경쇄의 성분으로서) 다른 단백질 사슬에서 vl 도메인을 포함하는 Fab이다.

본 발명은 하기에 개략된 것처럼 다수의 상이한 표적 단백질에 결합하는 다수의 ABD를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 세트의 6개의 CDR 또는 vh 도메인 및 vl 도메인은 scFv 형식 또는 Fab 형식일 수 있고, 이것은 이후 중쇄 불변 도메인 및 경쇄 불변 도메인에 첨가되고, 여기서 중쇄 불변 도메인은 변이체(CH1 도메인 및 Fc 도메인 내를 포함)를 포함한다. 서열 목록에 함유된 scFv 서열은 특정한 하전된 링커를 사용하지만, 하기에 개략된 것처럼, 도 7에 도시된 것을 포함하여 비하전된 링커 또는 다른 하전된 링커가 사용될 수 있다.

또한, 상기 기술된 바대로, CDR의 확인을 위해 서열 목록에 사용된 넘버링은 카밧이지만, 표 1에 기재된 바와 같은 CDR의 아미노산 서열을 변화시키는 상이한 넘버링을 이용할 수 있다.

본원에 기재된 모든 가변 중쇄 도메인 및 경쇄 도메인에 대해, 추가의 변이체가 만들어질 수 있다. 하기 개략된 것처럼, 일부 실시형태에서 (CDR을 배제한) 프레임워크가 미국 특허 제7,657,380호(도면 및 범례는 본원에 그 전문이 참고로 원용됨)의 도 1에 기재된 것으로부터 선택된 인간 생식계열 서열과 적어도 약 80%, 85% 또는 90%의 동일성을 보유하는 한 6개의 CDR의 세트는 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변형(아미노산 치환이 특히 사용됨), 및 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인의 프레임워크 영역에서의 변화를 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어 프레임워크 영역이 미국 특허 제7,657,380호의 도 1에 기재된 것으로부터 선택된 인간 생식계열 서열과 적어도 80%, 85% 또는 90%의 동일성을 보유하는 한, 본원에 기재된 바와 같은 동일한 CDR은 인간 생식계열 서열과 다른 프레임워크 서열과 조합될 수 있다. 대안적으로, CDR은 아미노산 변형(예를 들어, CDR의 세트에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 변형(즉, 6개의 CDR의 세트에서 변화의 총 수가 6개 미만의 아미노산 변형인 한 CDR이 변형될 수 있고, CDR의 임의의 조합은 변하고; 예를 들어 vlCDR1에서 1개의 변화, vhCDR2에서 2개의 변화, vhCDR3에서의 무변화 등이 있음))을 가질 뿐만 아니라 프레임워크 영역이 미국 특허 제7,657,380호의 도 1에 기재된 것으로부터 선택된 인간 생식계열 서열과 적어도 80%, 85% 또는 90%의 동일성을 보유하는 한 프레임워크 영역 변화를 가질 수 있다.

A. PD-1 항원 결합 도메인

본 발명의 실시형태에서, ABD 중 하나는 인간 PD-1에 결합한다. 국제공개 WO 2017/218707호(항-PD-1 서열을 도시하는 이의 도면 및 범례 및 서열 식별자에 대해서는 구체적으로 하여 그 전체 내용이 명확히 본원에 인용되어 포함됨)는 다른 관문 억제제에 대해 ABD와 조합되어 사용될 수 있는 많은 수의 항-PD-1 ABD를 개략한다. 그러나, 본 개시내용은 도 13, 도 15, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40에 도시된 1C11 클론에 기초한 추가 항-PD-1 ABD와 관련된다.

당해 기술분야에 공지된 바대로, 가변 도메인의 안정성은 형식에 기초하여 변할 수 있다. 즉, Fab 형식으로 식별되고/되거나 유용한 VH 도메인 및 VL 도메인은 scFv 형식에서 안정하지 않을 수 있어, 이에 따라 때때로 안정성(예를 들어, Tm)을 증가시키기 위해 추가 조작이 발생한다.

유용한 실시형태에서, 본 발명은 아미노산 서열 HYG(M/I)N을 포함하는 VHCDR1; 아미노산 서열 WINT(Y/H)TGEP(T/Y)YA(D/P)GF(T/Q)(G/E)를 포함하는 VHCDR2; 아미노산 서열 DY(F/Y)GSSPY를 포함하는 VHCDR3; 아미노산 서열 VLCDR1 R(S/A)SQSIV(F/H)SNGNTYLE를 포함하는 VLCDR1; 아미노산 서열 KVSNRF(S/T)를 포함하는 VLCDR2; 및 아미노산 서열 FQGSHVPN을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 항-PD-1 ABD를 제공한다. 공지된 것처럼, "(S/T)"로 도시된 아미노산은 아미노산 중 어느 하나가 이 위치에 있을 수 있다는 것을 의미한다. 또한, **GG를 포함

유용한 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 인간 PD-1에 대한 ABD를 포함한다. 이들 실시형태에서, PD-1에 대한 결합을 부여하는 6개의 CDR은 임의의 도 13, 도 15, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40에 도시된 것으로부터 선택된다. 대안적으로, 이들 실시형태에서, PD-1에 대한 결합을 부여하는 VH 도메인 및 VL 도메인은 임의의 도 13, 도 15, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40에 도시된 것으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 Fab 형식의 PD-1에 대한 ABD를 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1에 대한 ABD는 도 13, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40의 임의의 ABD의 6개의 CDR, 또는 도 13, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40의 임의의 ABD로부터의 VH 도메인 및 VL 도메인을 함유한다.

PD-1에 대한 Fab ABD를 갖는 많은 실시형태에서 도 24의 XENP26940 1C11[PD-1]_H3.303_L3.152의 ABD가 특히 사용된다. 따라서, XENP026940으로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 본 발명의 작제물에 사용될 수 있다.

PD-1에 대한 Fab ABD를 갖는 많은 실시형태에서 도 40의 XENP28652 1C11[PD-1]_H3.328_L3.153의 ABD가 특히 사용된다. 따라서, XENP28652로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 본 발명의 작제물에 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 scFv 형식의 PD-1에 대한 ABD를 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1에 대한 ABD는 도 15의 임의의 ABD의 6개의 CDR, 또는 도 15의 임의의 ABD로부터의 VH 도메인 및 VL 도메인을 함유한다.

PD-1에 대해 scFv ABD를 갖는 많은 실시형태에서 도 15에 도시된 바와 같은 XENP025806 1C11[PD-1]_H3.234_L3.144의 ABD가 특히 사용된다. 따라서, XENP025806으로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 본 발명의 작제물에 사용될 수 있다.

PD-1에 대해 scFv ABD를 갖는 많은 실시형태에서 도 15에 도시된 바와 같은 XENP025812 1C11[PD-1]_H3.240_L3.148의 ABD가 특히 사용된다. 따라서, XENP025812로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 본 발명의 작제물에 사용될 수 있다.

PD-1에 대해 scFv ABD를 갖는 많은 실시형태에서 도 15에 도시된 바와 같은 XENP025813 1C11[PD-1]_H3.241_L3.148의 ABD가 특히 사용된다. 따라서, XENP025813으로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 본 발명의 작제물에 사용될 수 있다.

PD-1에 대해 scFv ABD를 갖는 많은 실시형태에서 도 15에 도시된 바와 같은 XENP025819 1C11[PD-1]_H3.241_L3.92의 ABD가 특히 사용된다. 따라서, XENP025819로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 본 발명의 작제물에 사용될 수 있다.

B. CTLA-4 항원 결합 도메인

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 수의 항-CTLA-4 ABD 서열은 이중특이적 항체의 생성에서 본 발명의 scFv 항-PD-1 서열과 조합되어 사용될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-CTLA-4 서열은 서열 번호 21번 내지 2918번(여기서 Fv 서열이 Fab로 형식화될 수 있지만, CTLA-4 scFv 서열), 서열 번호 2919번 내지 6208번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, CTLA-4 Fab 서열), 서열 번호 36739번 내지 36818번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 CTLA-4 Fab 서열) 및 서열 번호 35395번 내지 35416번(Fab 또는 scFv 중 어느 하나로 형식화될 수 있는 CTLA-4 1-아암 작제물)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다.

본 발명에서 VH(서열 번호 38134번, VHCDR(서열 번호 38135번, 38136번 및 38137번)을 가짐) 및 VL(서열 번호 38138번, VLCDR(서열 번호 38139번, 38140번 및 38141번)을 가짐)을 포함하는 CTLA-4 H3_L0.22의 Fab CTLA-4 ABD의 서열이 특히 관심있다.

C. LAG-3 항원 결합 도메인

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 수의 항-LAG-3 ABD 서열은 이중특이적 항체의 생성에서 본 발명의 scFv 항-PD-1 서열과 조합되어 사용될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-LAG-3 서열은 서열 번호 17135번 내지 20764번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, LAG-3 Fab), 서열 번호 36819번 내지 36962번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 LAG-3 Fab), 서열 번호 35417번 내지 35606번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 LAG-3 Fab), 서열 번호 25194번 내지 32793번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 LAG-3 Fab) 및 서열 번호 32794번 내지 33002번(Fab 또는 scFv 중 어느 하나로 형식화될 수 있는 1-아암 LAG-3 작제물)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번, 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택된다.

본 발명에서 VH(서열 번호 32755번, VHCDR(서열 번호 32756번, 32757번 및 32758번)을 가짐) 및 VL(서열 번호 32760번, VLCDR(서열 번호 32761번, 32762번 및 32763번)을 가짐)을 포함하는 XENP22594의 LAG-3 Fab ABD의 서열이 특히 관심있다.

본 발명에서 VH(서열 번호 28815번, VHCDR(서열 번호 28816번, 28817번 및 28118번)을 가짐) 및 VL(서열 번호 28820번, VLCDR(서열 번호 28821번, 28822번 및 28823번)을 가짐)을 포함하는 XENP22656의 LAG-3 Fab ABD의 서열이 특히 관심있다.

D. TIM-3 항원 결합 도메인

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 수의 항-TIM-3 ABD 서열은 이중특이적 항체의 생성에서 본 발명의 scFv 항-PD-1 서열과 조합되어 사용될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, TIM-3 Fab), 서열 번호 37587번 내지 37698번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 TIM-3 Fab) 및 서열 번호 36347번 내지 36706번(Fab 또는 scFv 중 어느 하나로 형식화될 수 있는 2가 TIM-3 작제물)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

일부 실시형태에서, 항-TIM-3 ABD는 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번, 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된다.

본 발명에서 VH(서열 번호 36508호, VHCDR(서열 번호 36509호, 36510호 및 36511호)을 가짐) 및 VL(서열 번호 36513호, VLCDR(서열 번호 36514호, 36515호 및 36516호)을 가짐)을 포함하는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열이 특히 관심있다.

E. BTLA 항원 결합 도메인

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 수의 항-BTLA ABD 서열은 이중특이적 항체의 생성에서 본 발명의 scFv 항-PD-1 서열과 조합되어 사용될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, BTLA Fab) 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 BTLA Fab)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 항-BTLA ABD는 서열 번호 36707번과36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번, 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된다.

본 발명에서 VH(서열 번호 20936호, VHCDR(서열 번호 20937호, 20938호 및 20939호)을 가짐) 및 VL(서열 번호 20941호, VLCDR(서열 번호 20942호, 20943호 및 20944호)을 가짐)을 포함하는 XENP20269의 항-BTLA ABD의 Fab 서열이 특히 관심있다.

F. ICOS 항원 결합 도메인

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 임의의 수의 항-ICOS ABD 서열은 이중특이적 항체의 생성에서 본 발명의 scFv 항-PD-1 서열과 조합되어 사용될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-ICOS 서열은 미국 특허출원공개 US2018/0127501호(범례 및 도 19, 도 20 및 도 24, 여기에 도시된 서열에 대해서는 구체적으로 하여 그 전체 내용이 명확히 본원에 인용되어 포함됨)에 개시된 바와 같은 많은 것, 및 명칭 명명법에 표시된 바와 같은 다수의 ICOS Fab 서열(중쇄 VH1-CH1 및 경쇄 VL1-CL)을 함유하는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 번호 27869번 내지 28086번을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 항-ICOS ABD는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452 및 26353번과 26358로부터 선택된다.

본 발명에서 VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0과 함께도 49에서 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD의 Fab 서열이 특히 관심있다.

본 발명에서 VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0과 함께도 49에서 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD의 Fab 서열이 특히 관심있다.

G. TIGIT 항원 결합 도메인

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다.

IX. 1가 항-PD-1 항체

또한, 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본원에 개략된 신규의 Fv 서열은 또한 단일특이적 항체(예를 들어, "전통적인 단일클론 항체") 또는 비이종이합체성 이중특이적 형식 둘 다로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 도면으로부터의 6개의 CDR 및/또는 vh 서열 및 vl 서열을 포함하는 단일클론(단일특이적) 항체를 제공하고, 일반적으로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역, IgG1, IgG2 및 IgG4(S228P 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 불변 영역을 포함)이 일부 실시형태에서 특히 사용된다. 즉, 본원에서 "H_L" 지정이 있는 임의의 서열은 인간 IgG1 항체의 불변 영역에 연결될 수 있다.

A. 항-PD-1 단일클론 항체

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본원에 개략된 신규의 Fv 서열은 또한 단일특이적 항체(예를 들어, "전통적인 단일클론 항체") 또는 비이종이합체성 이중특이적 형식 둘 다로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도면으로부터의 6개의 CDR 및/또는 vh 서열 및 vl 서열을 포함하는 단일클론(단일특이적) 항체를 제공하고, 일반적으로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역, IgG1, IgG2 및 IgG4(S228P 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 불변 영역을 포함)이 일부 실시형태에서 특히 사용된다. 즉, 본원에서 "H_L" 지정이 있는 임의의 서열은 인간 IgG1 항체의 불변 영역에 연결될 수 있다.

일부 실시형태에서, 단일클론 항체는 도 13, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40에 도시된 것으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항체는 도 24의 XENP26940 1C11[PD-1]_H3.303_L3.152로부터의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 따라서, XENP026940으로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 단일클론 항체의 생성에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, XENP026940으로부터의 VH 및 VL은 IgG1 불변 도메인과 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, XENP026940으로부터의 VH 및 VL은 추가 Fc 변이체, 특히 428L/434S FcRn 변이체를 함유할 수 있는 IgG1 불변 도메인과 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, XENP026940으로부터의 VH 및 VL은 특히 S228P 아미노산 치환을 갖는 IgG4 불변 도메인과 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 XENP26940이다.

일부 실시형태에서, 항체는 도 40의 XENP28652 1C11[PD-1]_H3.328_L3.153으로부터의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 따라서, XENP28652로부터의 6개의 CDR 및/또는 VH 도메인 및 VL 도메인은 단일클론 항체의 생성에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, XENP28652로부터의 VH 및 VL은 IgG1 불변 도메인과 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, XENP28652로부터의 VH 및 VL은 추가 Fc 변이체, 특히 428L/434S FcRn 변이체를 함유할 수 있는 IgG1 불변 도메인과 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, XENP28652로부터의 VH 및 VL은 특히 S228P 아미노산 치환을 갖는 IgG4 불변 도메인과 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 XENP28652이다.

X. 본 발명의 유용한 형식

당업자에 의해 이해되고 하기에 보다 완전히 기술된 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 이종이합체성 항체는 일반적으로 도 1에 도시된 바와 같이 매우 다양한 입체구조를 취할 수 있다. 일부 도면은 "단일 말단" 입체구조를 도시하고, 여기서 분자의 하나의 "아암"에 하나의 유형의 특이성이 있고 다른 "아암"에 상이한 특이성이 있다. 다른 도면은 "이중 말단" 입체구조를 도시하고, 여기서 분자의 "상부"에서 적어도 하나의 유형의 특이성 및 분자의 "바닥"에서 하나 이상의 상이한 특이성이 있다. 따라서, 본 발명은 상이한 제1 항원 및 제2 항원에 공동 결합된 신규의 면역글로불린 조성물에 관한 것이다.

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본 발명의 이종이합체성 형식은 상이한 원자가를 가질 수 있을 뿐만 아니라 이중특이적일 수 있다. 즉, 본 발명의 이종이합체성 항체는 2가 및 이중특이적일 수 있고, 여기서 하나의 관문 표적은 하나의 ABD에 의해 결합되고, 다른 관문 표적은 제2 ABD에 의해 결합된다. 이종이합체성 항체는 또한 3가 및 이중특이적일 수 있고, 여기서 제1 항원은 2개의 ABD에 의해 결합되고, 제2 항원은 제2 ABD에 의해 결합된다.

A. 병 오프너 형식

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 바와 같은 "삼중 F" 또는 "병 오프너" 스캐폴드 형식이다. 이 실시형태에서, 항체의 하나의 중쇄는 단쇄 Fv(본원에 정의된 바와 같은 "scFv")를 함유하고, 다른 중쇄는 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 "규칙적인 " Fab 형식이다. 이 구조는 "병-오프너"와 개략적인 시각적 유사성 때문에 본원에서 때때로 "삼중 F" 형식(scFv-Fab-Fc) 또는 "병-오프너"(BO) 형식이라 지칭된다(도 1a 참조). 하기에 보다 완전히 기재된 바와 같이, 2개의 사슬은 이종이합체성 항체의 형성을 촉진하는 불변 영역(예를 들어, Fc 도메인, CH1 도메인 및/또는 힌지 영역)에서의 아미노산 변이체의 사용에 의해 모인다.

본 "삼중 F" 형식에는 몇몇 명확한 이점이 있다. 당해 기술분야에 공지된 바대로, 2개의 scFv 작제물에 의존하는 항체 유사체는 대개 안정성 및 응집 문제를 갖는데, 이는 "정기적인" 중쇄 및 경쇄 쌍 짓기의 추가에 의해 본 발명에서 완화될 수 있다. 또한, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의존하는 형식과 반대로, 중쇄 및 경쇄의 부정확한 쌍 짓기(예를 들어, 경쇄 2와 쌍을 짓는 중쇄 1 등)에 의한 문제가 없다.

본원에 개략된 많은 실시형태는 일반적으로 병 오프너 형식에 의존하며, 이는 scFv(때때로 본원에서 BO 형식의 "scFv 단량체" 또는 "scFv 사슬"이라 지칭함)를 포함하고, (모든 경우는 아니지만 많은 경우에 하전된) scFv 링커를 사용하여 공유 부착된 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체를 포함하고, 여기서 scFv는 보통 도메인 링커(하기에 개략된 것처럼 비하전 또는 하전될 수 있고, 내인성 또는 외인성일 수 있음)(예를 들어, 네이티브 힌지 도메인의 전부 또는 일부)를 통해 제1 Fc 도메인의 N 말단에 공유 부착된다. 따라서, scFv 단량체는 N 말단에서 C 말단으로 VH1-scFv 링커-VL1-선택적 링커-CH2-CH3, VL1-scFv 링커-VH1-선택적 링커-CH2-CH3, VH1-scFv 링커-VL1-힌지-CH2-CH3 및 VL1-scFv 링커-VH1-힌지-CH2-CH3으로부터 선택된 구조를 가질 수 있다. 병 오프너 형식의 제2 단량체는 중쇄(VH2-CH1-힌지-CH2-CH3)이고, 이 조성물은 경쇄(VL2-CL)를 추가로 포함한다.

또한, 병 오프너 형식의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 3 및 도 8에 도시된 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V: T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체(도 5에 도시된 것을 포함), 선택적으로 하전된 scFv 링커(도 7에 도시된 것을 포함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 4에 도시된 것을 포함)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 병 오프너 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 하전된 scFv 링커(도 7의 +H 서열은 일부 실시형태에서 바람직함), 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 하기에 개략된 것처럼 PD-1에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 단량체("scFv 단량체"); b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, 및 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 제2 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체("Fab 단량체"); 및 c) 경쇄를 포함하는 병 오프너 형식을 포함한다.

다수의 적합한 조합은 이 형식에 대해 국제공개 WO2017/218707호에 개략되어 있다. 일반적으로, 본 발명은 1C11인 새로 확인된 클론에 기초한 새로운 항-PD-1 ABD의 용도에 관한 것이다. 이 경우에, 이종이합체성 항체는 PD-1 및 CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, TIGIT(모두 관문 수용체로 분류됨) 및 ICOS(활성자임)로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 표적 항원에 결합한다.

일부 실시형태에서, 항-PD-1 ABD는 병 오프너 형식의 scFv 측이다. 따라서, 적합한 ABD 쌍은 (첫째에 scFv, 둘째에 Fab), PD-1 x CTLA-4, PD-1 x LAG-3, PD-1 x TIM-3, PD-1 x BTLA, PD-1 x TIGIT 및 PD-1 x ICOS를 포함한다. 적합한 CDR 세트 및 ABD는 하기에 기재되어 있고, 특히 유용한 조합은 유사하게 하기에 기재되어 있다.

일부 실시형태에서, 병 오프너 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 하전된 scFv 링커(도 7의 +H 서열은 일부 실시형태에서 바람직함), 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 하기에 개략된 것처럼 PD-1에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 단량체("scFv 단량체"); b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체("Fab 단량체"); 및 c) 경쇄를 포함하는 병 오프너 형식을 포함한다.

구체적으로, 도 50은 PD-1 scFv 단량체를 갖지만, 다른 측에서 사용될 수 있는 Fab 서열이 손실된 일부 병 오프너 "골격" 서열을 보여준다. 즉, 하기에 기술된 것처럼 CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA-, TIGIT 및 ICOS에 대한 임의의 ABD의 Fab 부분에 대한 Fv 서열.

특정한 병 오프너 실시형태가 하기에 개략되어 있다.

B. mAb-Fv

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 mAb-Fv 형식이다. 이 실시형태에서, 이 형식은 제3 항원 결합 도메인을 형성하도록 하나의 단량체에 대한 "추가" 가변 중쇄 도메인의 C 말단 부착 및 다른 단량체에 대한 "추가" 가변 경쇄 도메인의 C 말단 부착의 사용에 의존하고, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 PD-1에 결합한다.

이 실시형태에서, 제1 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인 및 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하고, 제1 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 C 말단에 공유 부착된다(vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vl2). 제2 단량체는 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인의 제2 가변 중쇄 도메인 및 도메인 링커를 사용하여 제2 Fc 도메인의 C 말단에 공유 부착된 제3 가변 중쇄 도메인을 포함한다(vj1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vh2. 2개의 C 말단으로 부착된 가변 도메인은 PD-1에 결합하는 Fv를 구성한다. 이 실시형태는 표적 항원에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 사용한다. 본원에서 많은 실시형태에 대해서, 이 작제물은 요망되고 본원에 기재된 바대로 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.

또한, mAb-Fv 형식의 Fc 도메인은 비대칭 변이체(예를 들어, 도 3 및 도 8에 도시된 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V: T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체(도 5에 도시된 것을 포함), 선택적으로 하전된 scFv 링커(도 7에 도시된 것을 포함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 4에 도시된 것을 포함)를 포함한다.

일부 실시형태에서, mAb-Fv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제2 가변 중쇄 도메인과 함께 PD-1에 결합하는 Fv(ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 mAb-Fv 형식을 포함한다.

일부 실시형태에서, mAb-Fv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제1 단량체의 제2 가변 중쇄 도메인과 함께 PD-1에 결합하는 Fv(ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 mAb-Fv 형식을 포함한다.

C. mAb-scFv

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 mAb-scFv 형식이다. 이 실시형태에서, 이 형식은 제3 항원 결합 도메인을 형성하도록 단량체들 중 하나에 대한 scFv의 C 말단 부착의 사용에 의존하고, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 본원에 개략된 항원들 중 하나에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 PD-1에 결합한다. 따라서, 제1 단량체는 (가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함하는) 제1 중쇄를 포함하고, C 말단으로 공유 부착된 scFv는 어느 한 배향으로 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다(vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vh2-scFv 링커-vl2 또는 vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vl2-scFv 링커-vh2). 이 실시형태는 항원에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 사용한다. 본원에서 많은 실시형태에 대해서, 이 작제물은 요망되고 본원에 기재된 바대로 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.

또한, mAb-scFv 형식의 Fc 도메인은 비대칭 변이체(예를 들어, 도 3 및 도 8에 도시된 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V: T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체(도 5에 도시된 것을 포함), 선택적으로 하전된 scFv 링커(도 7에 도시된 것을 포함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 4에 도시된 것을 포함)를 포함한다.

일부 실시형태에서, mAb-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 mAb-scFv 형식을 포함한다.

일부 실시형태에서, mAb-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 mAb-scFv 형식을 포함한다.

D. 중앙-scFv

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 중앙-scFv 형식이다(또한 때때로 "2 + 1" 형식이라 지칭됨). 이 실시형태에서, 이 형식은 제3 항원 결합 도메인을 형성하도록 삽입된 scFv 도메인의 사용에 의존하고, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 표적 항원에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 PD-1에 결합한다. ScFv 도메인은 단량체들 중 하나의 Fc 도메인과 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되어 제3 항원 결합 도메인을 제공한다. 이는 실제로 병 오프너 형식에 부가로 생각될 수 있고, 여기서 공통 경쇄를 사용하는 scFv의 N 말단에 첨가된 추가 VH-CH1 도메인이 있다.

이 실시형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인(및 선택적 힌지) 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하고, scFv는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다. ScFv는 선택적 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유 부착된다(vh1-CH1-[선택적 링커]-vh2-scFv 링커-vl2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3, 또는 scFv에 대한 반대 배향, vh1-CH1-[선택적 링커]-vl2-scFv 링커-vh2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3). 다른 단량체는 표준 Fab 측이다. 이 실시형태는 표적 항원에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 사용한다. 본원에서 많은 실시형태에 대해서, 이 작제물은 요망되고 본원에 기재된 바대로 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.

또한, 중앙 scFv 형식의 Fc 도메인은 비대칭 변이체(예를 들어, 도 3 및 도 8에 도시된 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V: T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체(도 5에 도시된 것을 포함), 선택적으로 하전된 scFv 링커(도 7에 도시된 것을 포함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 4에 도시된 것을 포함)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 중앙-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 중앙 scFv 형식을 포함한다.

일부 실시형태에서, 중앙-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 SSTR2에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 중앙 scFv 형식을 포함한다.

E. 중앙-Fv

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1g에 도시된 중앙-Fv 형식이다. 이 실시형태에서, 이 형식은 제3 항원 결합 도메인을 형성하도록 삽입된 Fv 도메인(즉, 중앙 Fv 도메인)의 사용에 의존하고, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 표적 항원에 결합하고, "중앙 Fv" scFv 도메인은 PD-1에 결합한다. ScFv 도메인은 단량체의 Fc 도메인과 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되어, 제3 항원 결합 도메인을 제공하고, 여기서 각각의 단량체는 scFv의 성분을 함유한다(예를 들어, 하나의 단량체는 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 다른 것은 가변 경쇄 도메인을 포함함).

이 실시형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인, 및 추가 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유 부착된다(vh1-CH1-[선택적 링커]-vl2-힌지-CH2-CH3). 다른 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인, 및 추가 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다(vh1-CH1-[선택적 링커]-vh2-힌지-CH2-CH3). 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유 부착된다.

이 실시형태는 표적 항원에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 사용한다. 본원에서 많은 실시형태에 대해서, 이 작제물은 요망되고 본원에 기재된 바대로 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.

F. 1-아암 중앙-scFv

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 1-아암 중앙-scFv 형식이다. 이 실시형태에서, 하나의 단량체는 바로 Fc 도메인을 포함하는 한편, 다른 단량체는 삽입된 scFv 도메인을 사용하여 제2 항원 결합 도메인을 형성한다. 이 형식에서, Fab 부분 중 어느 하나는 표적 항원에 결합하고, scFv는 PD-1에 결합하거나, 그 반대도 같다. scFv 도메인은 단량체들 중 하나의 CH1-Fv 영역과 Fc 도메인 사이에 삽입된다.

이 실시형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하고, scFv는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다. scFv는 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C 말단과 제1 Fc 도메인의 N 말단 사이에 공유 부착된다. 제2 단량체는 Fc 도메인을 포함한다. 이 실시형태는 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 추가로 사용한다. 본원에서 많은 실시형태에 대해서, 이 작제물은 요망되고 본원에 기재된 바대로 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.

또한, 1-아암 중앙-scFv 형식의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 3 및 도 8에 도시된 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V: T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체(도 5에 도시된 것을 포함), 선택적으로 하전된 scFv 링커(도 7에 도시된 것을 포함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 4에 도시된 것을 포함)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 1-아암 중앙-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 중앙-scFv 형식의 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개략된 바와 같은 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 실시형태에서, 1-아암 중앙-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 중앙-scFv 형식의 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개략된 바와 같은 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 FcRn 변이체 M428L/N434S를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.

G. 1-아암 scFv-mAb

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1에 도시된 1-아암 scFv-mAb 형식이다. 이 실시형태에서, 하나의 단량체는 바로 Fc 도메인을 포함하는 한편, 다른 단량체는 일반적으로 링커의 사용을 통해 중쇄의 N 말단에 부착된 scFv 도메인을 사용한다: vh-scFv 링커-vl-[선택적 도메인 링커]-CH1-힌지-CH2-CH3 또는 (반대 배향으로) vl-scFv 링커-vh-[선택적 도메인 링커]-CH1-힌지-CH2-CH3. 이 형식에서, Fab 부분은 각각 표적 항원에 결합하고, scFv는 PD-1에 결합한다. 이 실시형태는 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 추가로 사용한다. 본원에서 많은 실시형태에 대해서, 이 작제물은 요망되고 본원에 기재된 바대로 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.

또한, 1-아암 scFv-mAb 형식의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 3 및 도 8에 도시된 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V: T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체(도 5에 도시된 것을 포함), 선택적으로 하전된 scFv 링커(도 7에 도시된 것을 포함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 4에 도시된 것을 포함)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 1-아암 scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 scFv-mAb 형식의 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개략된 바와 같은 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 실시형태에서, 1-아암 scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 scFv-mAb 형식의 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개략된 바와 같은 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 FcRn 변이체 M428L/N434S를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.

H. scFv-mAb

본 발명에 특히 사용되는 하나의 이종이합체성 스캐폴드는 도 1e에 도시된 mAb-scFv 형식이다. 이 실시형태에서, 이 형식은 제3 항원 결합 도메인을 형성하도록 단량체들 중 하나에 대한 scFv의 N 말단 부착의 사용에 의존하고, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 표적 항원에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 PD-1에 결합한다.

이 실시형태에서, 제1 단량체는 (가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함하는) 제1 중쇄를 포함하고, N 말단으로 공유 부착된 scFv는 어느 한 배향으로 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다((vh1-scFv 링커-vl1-[선택적 도메인 링커]- vh2-CH1-힌지-CH2-CH3) 또는 (반대 배향으로 scFv를 갖는) ((vl1-scFv 링커-vh1-[선택적 도메인 링커]-vh2-CH1-힌지-CH2-CH3)). 이 실시형태는 표적에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하도록 중쇄와 회합하는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 사용한다. 본원에서 많은 실시형태에 대해서, 이 작제물은 요망되고 본원에 기재된 바대로 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다.

또한, scFv-mAb 형식의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 3 및 도 8에 도시된 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L, K370S: S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V: T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 선택적으로 절제 변이체(도 5에 도시된 것을 포함), 선택적으로 하전된 scFv 링커(도 7에 도시된 것을 포함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 4에 도시된 것을 포함)를 포함한다.

일부 실시형태에서, scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 scFv-mAb 형식을 포함한다.

일부 실시형태에서, scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 PD-1에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 하기에 개략된 것처럼 표적 항원에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 scFv-mAb 형식을 포함한다.

I. 이중 scFv 형식

본 발명은 또한 당해 기술분야에 공지되고 도 1b에 도시된 바와 같은 이중 scFv 형식을 제공한다. 이 실시형태에서, SSTR2 x CD3 이종이합체성 이중특이적 항체는 2개의 scFv-Fc 단량체로 구성된다(둘 다 (vh-scFv 링커-vl-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3) 형식 또는 (vl-scFv 링커-vh-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3) 형식 중 어느 하나로, 또는 하나의 배향으로 1개의 단량체와 그리고 다른 배향으로 다른 단량체와).

일부 실시형태에서, 이중 scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 PD-1 또는 표적 항원 중 어느 하나에 결합하는 제1 scFv를 포함하는 제1 단량체; 및 b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 PD-1 또는 다른 표적 항원 중 어느 하나에 결합하는 제2 scFv를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 이중 scFv 형식을 포함한다.

[00334]일부 실시형태에서, 이중 scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중 scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 제1 scFv를 포함하는 제1 단량체; 및 b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S , 및 제2 scFv를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 이중 scFv 형식을 포함한다.

XI. 본 발명의 특정 실시형태

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본 발명은 본 발명의 상이한 형식에서 항-PD-1 scFv 서열과 상이한 표적 항원에 대한 ABD의 많은 수의 가능한 조합을 제공한다.

일부 실시형태에서, 도 13, 도 15, 도 16, 도 18, 도 20, 도 21, 도 24, 도 33 및 도 40의 임의의 PD-1 ABD는 도 1의 임의의 형식에서 임의의 항-TIM-3 ABD, 임의의 항-CTLA-4 ABD, 임의의 항-ICOS ABD, 임의의 항-TIM-3 ABD, 임의의 항-LAG-3 ABD 또는 임의의 항-BTLA ABD와 조합될 수 있다. 이 ABD에 대한 서열 목록의 Fab ABD와 조합된 도 15의 항-PD-1 scFv 서열이 특히 사용된다. 일부 실시형태에서, 이 조합은 미국 특허출원공보 제2016/0355608호의 도 162에 도시된 바와 같은 병 오프너 형식에 대한 "골격" 서열(중앙-scFv 형식에 또한 사용될 수 있음)을 사용하여 이루어지거나, 미국 특허출원공보 제2016/0355608호(이들의 도면 둘 다(및 동반된 범례)는 본원에 명확히 인용되어 포함됨)의 도 163에 도시된 바와 같은 "mAb-scFv" 형식에 대한 "골격" 서열을 사용하여 이루어진다.

A. PD-1 x CTLA-4 병 오프너 실시형태

일부 실시형태에서, 본 발명은 인간 PD-1 및 인간 CTLA-4 둘 다에 결합하는 이중특이적 이종이합체성 항체를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, CTLA-4에 대한 항-PD-1 scFv 서열과 ABD의 다수의 가능한 조합이 있다.

일부 실시형태에서, PD-1 ABD는 scFv이고, CTLA-4 ABD는 Fab 작제물이다. 이들 실시형태에서, 도 15로부터의 임의의 scFv ABD는 임의의 항-CTLA-4 ABD 서열과 조합될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항-CTLA-4 ABD 서열은 서열 번호 21번 내지 2918번(여기서 Fv 서열이 Fab로 형식화될 수 있지만, CTLA-4 scFv 서열), 서열 번호 2919번 내지 6208번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, CTLA-4 Fab 서열), 서열 번호 36739번 내지 36818번(여기서 Fv 서열이 scFv로 형식화될 수 있지만, 추가 CTLA-4 Fab 서열) 및 서열 번호 35395번 내지 35416번(Fab 또는 scFv로 형식화될 수 있지만, CTLA-4 1-아암 작제물)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 이종이합체성 항체는 CTLA-4 ABD가 본 서열 목록의 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 35395번 내지 35416번으로부터 쌍으로부터 선택될 때 scFv로서의 도 15로부터의 PD-1 ABD 및 Fab Fv로서의 CTLA-4 ABD를 사용하여 병 오프너 형식으로 제조된다. 일부 실시형태에서, CTLA-4 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 471호에 첨가되고, CTLA-4 Fab의 VL은 서열 번호 473호에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 472호에 첨가된다. 일부 실시형태에서, CTLA-4 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 474호에 첨가되고, CTLA-4 Fab의 VL은 서열 번호 476호에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 475호에 첨가된다. 일부 실시형태에서, CTLA-4 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 477호에 첨가되고, CTLA-4 Fab의 VL은 서열 번호 479호에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 478호에 첨가된다. 일부 실시형태에서, CTLA-4 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 480호에 첨가되고, CTLA-4 Fab의 VL은 서열 번호 482호에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 481호에 첨가된다.

일부 실시형태에서, CTLA-4 Fab는 서열 번호 38134호의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138호의 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS556이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS556의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS556의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS557이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS557의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS557의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS558이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS558의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS558의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS559이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS559의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS559의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS560이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS560의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS560의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS561이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS561의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS561의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS562이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS562의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS562의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 본원에서 서열 번호 2919번 내지 6208번 및 서열 번호 36739번 내지 36818번 중 어느 하나로부터 선택되고, 서열 번호 38134번의 가변 중쇄 도메인 및 서열 번호 38138번의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CTLA-4 Fab가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS563이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS563의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS563의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS556이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS556의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS556의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS557이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS557의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS557의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS558이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS558의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS558의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS559이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS559의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS559의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS560이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS560의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS560의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS561이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS561의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS561의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS562이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS562의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS562의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-CTLA-4 Fab는 서열 목록의 서열 번호 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS563이고; 즉 CTLA-4로부터의 VH는 XENCS563의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, CTLA-4로부터의 VL은 XENCS563의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 PD-1 x CTLA-4 이종이합체성 항체는 XENCS502, XENCS509, XENCS516, XENCS523, XENCS530, XENCS537, XENCS544 및 XENCS551로 이루어진 군으로부터 선택된다.

B. PD-1 x ICOS 병 오프너 실시형태

일부 실시형태에서, 본 발명은 인간 PD-1 및 인간 ICOS 둘 다에 결합하는 이중특이적 이종이합체성 항체를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, ICOS에 대한 항-PD-1 scFv 서열과 ABD의 다수의 가능한 조합이 있다.

일부 실시형태에서, PD-1 ABD는 scFv이고, ICOS ABD는 Fab 작제물이다. 이들 실시형태에서, 도 15로부터의 임의의 scFv ABD는 임의의 항-ICOS ABD 서열과 조합될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-ICOS 서열은 미국 특허출원공개 US2018/0127501호(범례 및 도 19, 도 20 및 도 24, 여기에 도시된 서열에 대해서는 구체적으로 하여 그 전체 내용이 명확히 본원에 인용되어 포함됨)에 개시된 바와 같은 많은 것, 및 명칭 명명법에 표시된 바와 같은 다수의 ICOS Fab 서열(중쇄 VH1-CH1 및 경쇄 VL1-CL)을 함유하는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 번호 27869번 내지 28086번을 포함한다. 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍의 항-ICOS ABD가 추가로 포함된다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생긴다.

본 발명에서 VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0과 함께도 49에서 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD의 Fab 서열이 특히 관심있다. 본 발명에서 VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0과 함께도 49에서 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD의 Fab 서열이 특히 관심있다.

일부 실시형태에서, ICOS Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 471번에 첨가되고, ICOS Fab의 VL은 서열 번호 473번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 472번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, ICOS Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 474번에 첨가되고, ICOS Fab의 VL은 서열 번호 476번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 475번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, ICOS Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 477번에 첨가되고, ICOS Fab의 VL은 서열 번호 479번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 478번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, ICOS Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 480번에 첨가되고, ICOS Fab의 VL은 서열 번호 482번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 481번에 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS556이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS556의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS556의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS557이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS557의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS557의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS558이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS558의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS558의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS559이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS559의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS559의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS560이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS560의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS560의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS561이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS561의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS561의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS562이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS562의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS562의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-ICOS Fab는 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 VH/VL 쌍으로부터 선택되고, 도 49에서의 XENCS500으로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0_L0 및 VL_ICOS_H0_L0) 및 도 49에서의 XENCS501로부터의 항-ICOS ABD(VH_ICOS_H0.66_L0 및 VL_ICOS_H0.66_L0)의 Fab 서열이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS563이고; 즉 ICOS로부터의 VH는 XENCS563의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, ICOS로부터의 VL은 XENCS563의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 PD-1 x ICOS 이종이합체성 항체는 XENCS500, XENCS501, XENCS507, XENCS508, XENCS514, XENCS515, XENCS521, XENCS522, XENCS528, XENCS529, XENCS535, XENCS526, XENCS542, XENCS543, XENCS549 및 XENCS550으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

C. PD-1 x LAG-3 병 오프너 실시형태

일부 실시형태에서, 본 발명은 인간 PD-1 및 인간 LAG-3 둘 다에 결합하는 이중특이적 이종이합체성 항체를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, LAG-3에 대한 항-PD-1 scFv 서열과 ABD의 다수의 가능한 조합이 있다.

일부 실시형태에서, PD-1 ABD는 scFv이고, LAG-3 ABD는 Fab 작제물이다. 이들 실시형태에서, 도 15로부터의 임의의 scFv ABD는 임의의 항-LAG-3 ABD 서열과 조합될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-LAG-3 서열은 서열 번호 17135번 내지 20764번; 서열 번호 36819번 내지 36962번; 서열 번호 35417번 내지 35606번; 서열 번호 25194번 내지 32793번; 서열 번호 32794번 내지 33002번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택된 항-LAG-3 Fab, 및 VH(서열 번호 32755번, VHCDR(서열 번호 32756번, 32757번 및 32758번)을 가짐) 및 VL(서열 번호 32760번, VLCDR(서열 번호 32761번, 32762번 및 32763번)을 가짐)을 포함하는 XENP22594의 LAG-3 Fab ABD의 서열 및 VH(서열 번호 28815번, VHCDR(서열 번호 28816번, 28817번 및 28118번)을 가짐) 및 VL(서열 번호 28820번, VLCDR(서열 번호 28821번, 28822번 및 28823번)을 가짐)을 포함하는 XENP22656의 LAG-3 Fab ABD의 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, LAG-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 471번에 첨가되고, LAG-3 Fab의 VL은 서열 번호 473번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 472번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, LAG-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 474번에 첨가되고, LAG-3 Fab의 VL은 서열 번호 476번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 475번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, LAG-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 477번에 첨가되고, LAG-3 Fab의 VL은 서열 번호 479번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 478번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, LAG-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 480번에 첨가되고, LAG-3 Fab의 VL은 서열 번호 482번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 481번에 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS556이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS556의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS556의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS557이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS557의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS557의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS558이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS558의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS558의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS559이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS559의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS559의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS560이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS560의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS560의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS561이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS561의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS561의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS562이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS562의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS562의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 항-LAG-3 Fab는 서열 번호 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택되고; XENP22594의 VH/VL(VH 서열 번호 32755번 및 VL 서열 번호 32760번) 및XENP22656의 VH/VL(VH 서열 번호 28815번 및 VL 서열 번호 28820번)이 특히 사용된다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS563이고; 즉 LAG-3 Fab로부터의 VH는 XENCS563의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, LAG-3 Fab로부터의 VL은 XENCS563의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이종이합체성 항체는 XENCS503, XENCS504, XENCS510, XENCS511, XENCS517, XENCS518, XENCS521, XENCS524, XENCS525, XENCS531, XENCS532, XENCS538, XENCS539, XENCS545, XENCS546, XENCS552 및 XENCS553으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

D. PD-1 x TIM-3 병 오프너 실시형태

일부 실시형태에서, 본 발명은 인간 PD-1 및 인간 TIM-3 둘 다에 결합하는 이중특이적 이종이합체성 항체를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, TIM-3에 대한 항-PD-1 scFv 서열과 ABD의 다수의 가능한 조합이 있다.

일부 실시형태에서, PD-1 ABD는 scFv이고, TIM-3 ABD는 Fab 작제물이다. 이들 실시형태에서, 도 15로부터의 임의의 scFv ABD는 임의의 항-TIM-3 ABD 서열과 조합될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다.

일부 실시형태에서, TIM-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 471번에 첨가되고, TIM-3 Fab의 VL은 서열 번호 473번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 472번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, TIM-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 474번에 첨가되고, TIM-3 Fab의 VL은 서열 번호 476번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 475번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, TIM-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 477번에 첨가되고, TIM-3 Fab의 VL은 서열 번호 479번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 478번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, TIM-3 Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 480번에 첨가되고, TIM-3 Fab의 VL은 서열 번호 482번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 481번에 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS556이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS556의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS556의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS557이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS557의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS557의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS558이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS558의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS558의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS559이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS559의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS559의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS560이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS560의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS560의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS561이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS561의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS561의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS562이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS562의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS562의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIM-3 서열은 서열 번호 20765번 내지 20884번; 서열 번호 37587번 내지 37698번; 서열 번호 36347번 내지 36706번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 서열 번호 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 항-TIM-3 ABD; 및 특히 사용되는 XENP21189의 항-TIM-3 ABD의 Fab 서열(VH 서열 번호 36508번 및 VL 서열 번호 36513번)을 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS563이고; 즉 TIM-3으로부터의 VH는 XENCS563의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIM-3으로부터의 VL은 XENCS563의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 PD-1 x TIM-3 이종이합체성 항체는 XENCS505, XENCS512, XENCS519, XENCS526, XENCS533, XENCS540, XENCS547 및 XENCS554로 이루어진 군으로부터 선택된다.

E. PD-1 x TIGIT 병 오프너 실시형태

일부 실시형태에서, 본 발명은 인간 PD-1 및 인간 TIGIT 둘 다에 결합하는 이중특이적 이종이합체성 항체를 제공한다. 당업자에 의해 이해되는 것처럼, TIGIT에 대한 항-PD-1 scFv 서열과 ABD의 다수의 가능한 조합이 있다.

일부 실시형태에서, PD-1 ABD는 scFv이고, TIGIT ABD는 Fab 작제물이다. 이들 실시형태에서, 도 15로부터의 임의의 scFv ABD는 임의의 항-TIGIT ABD 서열과 조합될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다.

일부 실시형태에서, TIGIT Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 471번에 첨가되고, TIGIT Fab의 VL은 서열 번호 473번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 472번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, TIGIT Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 474번에 첨가되고, TIGIT Fab의 VL은 서열 번호 476번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 475번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, TIGIT Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 477번에 첨가되고, TIGIT Fab의 VL은 서열 번호 479번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 478번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, TIGIT Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 480번에 첨가되고, TIGIT Fab의 VL은 서열 번호 482번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 481번에 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS556이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS556의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS556의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS557이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS557의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS557의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS558이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS558의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS558의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS559이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS559의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS559의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS560이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS560의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS560의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS561이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS561의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS561의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS562이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS562의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS562의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-TIGIT 서열은 서열 번호 21504번 내지 21523번 및 서열 번호 37435번 내지 37586번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김), 및 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 TIGIT ABD를 포함한다.이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS563이고; 즉 TIGIT로부터의 VH는 XENCS563의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, TIGIT로부터의 VL은 XENCS563의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

F. PD-1 x BTLA 병 오프너 실시형태

일부 실시형태에서, PD-1 ABD는 scFv이고, BTLA ABD는 Fab 작제물이다. 이들 실시형태에서, 도 15로부터의 임의의 scFv ABD는 임의의 항-BTLA ABD 서열과 조합될 수 있다. ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다.

일부 실시형태에서, BTLA Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 471번에 첨가되고, BTLA Fab의 VL은 서열 번호 473번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 472번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, BTLA Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 474번에 첨가되고, BTLA Fab의 VL은 서열 번호 476번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 475번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, BTLA Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 477번에 첨가되고, BTLA Fab의 VL은 서열 번호 479번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 478번에 첨가된다. 일부 실시형태에서, BTLA Fab의 VH 도메인은 미국 특허출원공개 US2016/0355608호의 서열 번호 480번에 첨가되고, BTLA Fab의 VL은 서열 번호 482번에 첨가되고, PD-1 scFv는 서열 번호 481번에 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS556이고; 즉 BTLA로부터의 VH는 XENCS556의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS556의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS557이고; 즉 BTLA로부터의 VH는 XENCS557의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS557의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS558이고; 즉 BTLA로부터의 VH는 XENCS558의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS558의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS559이고; 즉 BTLA로부터의 VH는XENCS559의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS559의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS560이고; 즉 BTLA로부터의 VH는 XENCS560의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS560의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS561이고; 즉 BTLA로부터의 VH는 XENCS561의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS561의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS562이고; 즉 BTLA로부터의 VH는 XENCS562의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS562의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

ABD로서 사용하기에 적합한 항-BTLA 서열은 서열 번호 20885번 내지 21503번 및 서열 번호 36707번 내지 36738번(당업자에 의해 이해되는 것처럼, 이들 서열 식별자는 서열 식별자로부터 명확한 것처럼 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 "쌍"으로 생김); 서열 번호 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 항-BTLA ABD를 포함하고; XENP20269의 Fab 항-BTLA ABD(VH 서열 번호 20936번 및 VL 서열 번호 20941번)가 특히 사용된다. 이들 실시형태에서, 이종이합체성 항체의 나머지는 도 50으로부터의 XENCS563이고; 즉 BTLA로부터의 VH는 XENCS563의 Fab 사슬의 N 말단에 첨가되고, BTLA로부터의 VL은 XENCS563의 경쇄에 N 말단으로 첨가된다.

XII. 본 발명의 핵산

본 발명은 본 발명의 이종이합체성 이중특이적 항체 및 본원에 개략된 단일특이적 항체를 암호화하는 핵산 조성물을 추가로 제공한다.

당업자에 의해 이해되는 것처럼, 핵산 조성물은 이종이합체성 단백질의 형식 및 스캐폴드에 따라 달라질 것이다. 따라서, 예를 들어 이 형식이 예컨대 삼중 F 형식에 대한 3개의 아미노산 서열을 요할 때(예를 들어, Fc 도메인 및 scFv를 포함하는 제1 아미노산 단량체, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제2 아미노산 단량체), 3개의 핵산 서열은 발현을 위해 하나 이상의 발현 벡터에로 도입될 수 있다. 유사하게, 일부 형식(예를 들어, 도 1에 개시된 것과 같은 이중 scFv 형식)에서 오직 2개의 핵산이 필요하고; 다시 말하면, 이들은 1개 또는 2개의 발현 벡터에 있을 수 있다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 성분을 암호화하는 핵산은 당해 기술분야에 공지된 발현 벡터로 도입될 수 있고, 숙주 세포에 의존하여 본 발명의 이종이합체성 항체를 생산하는 데 사용된다. 일반적으로, 핵산은 임의의 수의 조절 요소(프로모터, 복제 기점, 선택 가능한 마커, 리보솜 결합 부위, 인듀서 등)에 작동 가능하게 연결된다. 발현 벡터는 염색체외 벡터 또는 혼입 벡터일 수 있다.

이후, 본 발명의 핵산 및/또는 발현 벡터는 포유동물 세포, 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및/또는 곰팡이 세포를 포함하여 당해 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 임의의 수의 다른 유형의 숙주 세포로 형질전환되고, 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포)가 많은 실시형태에서 사용된다.

일부 실시형태에서, 형식에 따라 적용 가능한 경우, 각각의 단량체를 암호화하는 핵산 및 경쇄를 암호화하는 선택적인 핵산은 일반적으로 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터 조절 하에 단일 발현 벡터 내에 각각 포함된다. 본 발명에 특히 사용되는 실시형태에서, 이들 2개 또는 3개의 핵산은 각각 상이한 발현 벡터에 함유된다. 본원에 기재되고 미국 특허출원공개 62/025,931호(본원에 인용되어 포함됨)에 기재된 바대로, 이종이합체 형성을 추진하도록 상이한 벡터 비율이 사용될 수 있다. 즉, 놀랍게도, (이종이합체성 항체를 포함하는 3개의 폴리펩타이드를 갖는 본원에서의 많은 실시형태의 경우에) 단백질이 1:1:2의 비율로 제1 단량체:제2 단량체:경쇄를 포함하지만, 이들은 최고의 결과를 생성하는 비율은 아니다.

본 발명의 이종이합체성 항체는 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 발현 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 제조된다. 일단 제조되면, 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 전통적인 항체 정제 단계가 수행된다. 본원에 기술된 바와 같이, 2개의 단량체의 pI를 적어도 0.5만큼 다르게 하는 것은 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전위 포커싱 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 허용할 수 있다. 즉, pI 치환의 포함은 각각의 단량체가 상이한 pI를 갖고 이종이합체가 또한 구별된 pI를 가지도록 각각의 단량체의 등전점(pI)을 변경시키며, 따라서 "삼중 F" 이종이합체(예를 들어, 음이온 교환 칼럼, 양이온 교환 칼럼)의 등전위 정제를 용이하게 한다. 이들 치환은 또한 정제(예를 들어, IEF 겔, cIEF 및 분석 IEX 칼럼) 후 임의의 오염 이중 scFv-Fc 및 mAb 동종이합체의 측정 및 모니터링을 돕는다.

XIII. 이종이합체성 관문 항체의 생물학적 기능 및 생화학적 기능

일반적으로, 본 발명의 이중특이적 항체는 암을 가진 환자에게 투여되고, 효능은 본원에 기재된 바와 같은 다수의 방법으로 평가된다. 따라서, 암 부하, 종양의 크기, 전이의 존재 또는 정도의 평가 등과 같은 효능의 표준 검정이 수행될 수 있으며, 면역-종양학 치료는 또한 면역 상태 평가에 기초하여 평가될 수 있다. 이는 시험관내 검정 및 생체내 검정을 비롯한 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 종양 부하, 크기, 침습성, LN 수반, 전이 등과 같은 "구식" 측정과 함께 면역 상태의 변화(예를 들어, ipi 치료 후 ICOS+ CD4+ T 세포의 존재)를 평가할 수 있다. 따라서, 다음 중 일부 또는 전부가 평가될 수 있다: CD4+ T 세포 활성화 또는 증식, CD8+ T(CTL) 세포 활성화 또는 증식, CD8+ T 세포 매개 세포독성 활성 및/또는 CTL 매개 세포 고갈, NK 세포 활성 및 NK 매개 세포 고갈에 미치는 관문의 억제 효과.

일부 실시형태에서, 치료의 평가는 예를 들어 CFSE 희석 방법, 면역 효과기 세포의 Ki67 세포내 염색 및 3H-티미딘 도입 방법을 사용하여 면역 세포 증식을 평가함으로써 수행된다.

일부 실시형태에서, 치료의 평가는 CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40 중 하나 이상을 포함하는 활성화 관련 마커의 유전자 발현의 증가 또는 이의 단백질 수준의 증가 및 CD107A의 표면 발현에 의해 측정된 세포 탈과립을 평가하여 수행된다.

일반적으로, 유전자 발현 검정은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 수행된다.

일반적으로, 단백질 발현 측정은 또한 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 유사하게 수행된다.

일부 실시형태에서, 치료의 평가는 효소 활성(프로테아제 활성을 포함), 세포막 투과성, 세포 부착성, ATP 생산, 조효소 생산 및 뉴클레오티드 흡수 활성과 같은 수많은 세포 매개변수를 추정하여 표적 세포 생존력 검출에 의해 측정된 세포독성 활성을 평가함으로써 수행된다. 이들 검정의 특정 예는 트립판 블루 또는 PI 염색, 51Cr 또는 35S 방출 방법, LDH 활성, MTT 및/또는 WST 검정, 칼세인-AM 검정, 발광 기반 검정 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일부 실시형태에서, 치료의 평가는 널리 공지된 기술을 사용하여 비제한적인 예로서 IFNγ, TNFα, GM-CSF, IL2, IL6, IL4, IL5, IL10, IL13를 포함하는 사이토카인을 사용하는 배양 상청액에서 세포내 측정인 사이토카인 생성에 의해 측정된 T 세포의 활성을 평가함으로써 수행된다.

^** 제제 등

^** EE

^** TT

XIV. 실시예

A. 실시예 1 XmAb22841의 시험관내 결합의 조사

1. 1A: XmAb20717은 세포의 표면에서 발현된 PD-1 및 CTLA-4를 동시에 점유한다

[001] CTLA-4를 안정하게 발현하는 HEK293T 세포(Crown Bioscience(캘리포니아주 산타 클라라))를 PD-1을 암호화하는 pCMV6-AC-GFP 벡터(OriGene(메릴랜드주 락빌))로 형질주입하였다. 형질주입 3일 후, 세포를 표시된 시험 물품으로 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 항온처리 이후에, 세포를 2회 세척하고, 4℃에서 30분 동안 Pacific Blue-접합된 XENP20111(XmAb20717로부터의 항-PD-1 아암에 기초한 1-아암 scFv-Fc) 및 APC-접합된 XENP20059(XmAb20717로부터의 항-CTLA-4 아암에 기초한 1-아암 Fab-Fc)로 염색하고, 유세포분석법에 의해 평가하였다. 도 57 및 도 58은 염색에 의해 표시된 바대로 비점유된 CTLA-4 및/또는 PD-1 수용체에 의한 GFP+(CTLA-4+PD-1+) HEK293T 세포의 다양한 집단의 백분율에 의해 도시된 바대로 다양한 시험 물품에 의한 처리 이후에 수용체 점유를 보여준다. 예를 들어, CTLA-4 수용체의 점유는 PD-1⁺CTLA-4⁺ 및 PD-1^-CTLA-4⁺ 집단의 백분율을 감소시키고, PD-1⁺CTLA-4^- 및 PD-1^-CTLA-4^- 집단의 백분율을 증가시킨다. 도 57a 내지 도 57b는 PD-1⁺CTLA-4⁺ 및 PD-1^-CTLA-4^-의 발생률을 보여준다. 도 58은 12.5 μg/mL의 표시된 시험 물품에 의한 치료 이후에 다양한 집단의 발생률을 도시하는 산점도를 보여준다. 데이터는 XmAb20717이 PD-1 및 CTLA-4를 동시에 발현하는 세포를 선택적으로 표적화한다는 것을 보여준다.

B. 실시예 2: XmAb20717은 마우스에서 동종이계 항종양 반응을 향상시킨다

NOD SCID 감마(NSG) 마우스에 0일에 KG1A-luc 암 세포를 생착하였다. 21일에, 인간 PBMC를 마우스에 복강내로 생착하였다. PBMC 생착 후, 표시된 시험 물품은 4주(또는 총 4회 용량) 동안 복강내 주사에 의해 매주 투여되었다(대조군 마우스는 PBS가 투여됨). 종양 성장은 생체내 영상화 시스템(IVIS® Lumina III)을 사용하여 마우스마다 총 플럭스를 측정하여 모니터링되고, 데이터는 도 59에 도시된다(제1 용량 후 일자).

C. 실시예 3 XmAb22841의 시험관내 결합의 조사

1. CTLA-4 및 LAG-3을 발현하는 HEK293T에 대한 XmAb22841 결합

CTLA-4를 안정하게 발현하는 HEK293T 세포(Crown Bioscience(캘리포니아주 산타 클라라))를 LAG-3을 암호화하는 pCMV6-AC-GFP 벡터(OriGene(메릴랜드주 락빌))로 형질주입하였다. 형질주입 후 3일에, 세포를 4℃에서 30분 동안 표시된 농도의 하기 시험 물품과 항온처리하였다: XmAb22841; XENP16433(XmAb22841의 항-CTLA-4 아암이 유래된 모체 클론에 기초한 2가 mAb); XENP16436(XmAb22841의 항-LAG-3 아암이 유래된 모체 클론에 기초한 2가 mAb); XENP24893(XmAb22841로부터의 항-CTLA-4 아암에 기초한 1-아암 scFv-Fc); XENP24895(XmAb22841로부터의 항-LAG-3에 기초한 1-아암 Fab-Fc); 및 대조군으로서의 XENP15074(2가 항-RSV mAb). 항온처리 이후에, 세포를 2회 세척하고, 항-인간-Fc-A647 접합된 2차 항체(Jackson Immunoresearch(펜실베니아주 웨스트 그로브))에 의해 결합을 검출하였다. GFP+ 세포(즉, CTLA-4+LAG-3+)에 대한 시험 물품의 결합을 표시하는 MFI는 도 60에 도시된다.

2. XmAb22841에 의한 CTLA-4 및 LAG-3을 발현하는 HEK293T에 대한 CTLA-4 및 LAG-3의 점유

CTLA-4를 안정하게 발현하는 HEK293T 세포(Crown Bioscience(캘리포니아주 산타 클라라))를 LAG-3을 암호화하는 pCMV6-AC-GFP 벡터(OriGene(메릴랜드주 락빌))로 형질주입하였다. 형질주입 후 3일에, 세포를 하기 시험 물품으로 4℃에서 30분 동안 처리하였다: XmAb22841, XENP16433, XENP16436, XENP24893, XENP24895 및 XENP15074. 항온처리 이후에, 세포를 2회 세척하고, Pacific Blue 접합된 XENP24895 및 A647 접합된 XENP23552로 염색하였다. 도 61a 내지 도 61d는 염색에 의해 표시된 바대로 비점유된 CTLA-4 및/또는 LAG-3 수용체에 의한 GFP+ (CTLA-4+LAG-3+) HEK293T 세포의 다양한 집단의 백분율에 의해 도시된 바대로 다양한 시험 물품에 의한 처리 이후에 수용체 점유를 보여준다. 예를 들어, CTLA-4 수용체의 점유는 LAG-3⁺CTLA-4⁺ 및 LAG-3^-CTLA-4⁺ 집단의 백분율을 감소시키고, LAG-3⁺CTLA-4^- 및 LAG-3^-CTLA-4^- 집단의 백분율을 증가시킨다. 도 62a 내지 도 62b는 각각 XENP24895 및 XENP23552 결합에 의해 표시된 바대로 시험 물품에 의한 처리 이후에 GFP+ 세포에서 비점유된 LAG-3 및 CTLA-4 수용체의 양을 보여준다.

3. SEB 자극된 T 세포에 대한 XmAb22841 결합

XmAb22841의 T 세포에 대한 결합은 SEB 자극된 PBMC 검정에서 측정되었다. 스태필로코커스 엔테로톡신 B(SEB)는 LAG-3 및 CTLA-4와 같은 관문 수용체의 발현을 포함하여 T 세포 수용체(TCR)를 통한 활성화에 의해 달성되는 것과 유사한 방식으로 T 세포 활성화 및 증식을 일으키는 슈퍼항원이다. 따라서, 6개의 도너로부터의 인간 PBMC를 3일 동안 500 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이후, 세포를 표시된 농도의 표시된 시험 물품으로 30분 동안 처리하였다. 항온처리 이후에, 세포를 세척하고, 항-인간-Fc-A647 항체(Jackson Immunoresearch)로 염색하였다. CD3⁺ T 세포에 대한 시험 물품의 결합을 나타내는 MFI는 각각의 도너에 대해 각각 도 63a 내지 도 63f에 도시된다.

데이터는 각각의 도너로부터의 PBMC에서 XmAb22841이 단일특이적 대조군과 비교하여 CD3⁺ T 세포에 보다 강력히 결합한다는 것을 보여주어, 인간 T 세포에 대한 결합이 단일특이적 항체보다 이중특이적 항체 XmAb22841에 의해 유의미하게 더 양호하다는 것을 입증하고, 여기서 각각의 아암은 상이한 항원에 1가로 결합한다.

D. 실시예 4: 이중특이적 관문 항체에 의한 치료 이후의 사이토카인 방출 및 면역 관련된 유전자 발현 프로파일의 조사

인간 PBMC를 2일 동안 100 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 자극 이후에, 세포를 2회 세척한 후, 100 ng/mL의 SEB 및 20 μg/mL의 표시된 시험 물품으로 재자극하였다. 세포 상청액을 처리 후 24시간에 수집하고, MULTI-SPOT 384-Well Spot 플레이트(Meso Scale Discovery(메릴랜드주 락빌))에서 다중화 검정에 의해 IL-2 및 IFNγ에 대해 평가하였다. RNA를 세포로부터 추출하고, 면역 반응을 다루는 770개의 표적 유전자를 평가하는 nCounter® PanCancer Immune Profiling Panel(NanoString Technologies(워싱턴주 시애틀))에 의해 평가되었다.

도 64 및 도 65는 항-RSV mAb(XENP15074)와 비교하여 항-PD-1 mAb(XENP16432), XmAb20717 및 XmAb22841, 및 항-PD-1 mAb와 조합된 XmAb22841에 의한 치료 이후에 IL-2 및 IFNγ의 배수 증가를 각각 도시한다. 특히, XmAb22841과 항-PD-1 mAb의 조합은 어떤 단독에 의한 것보다 유의미하게 더 사이토카인을 방출시켜, 삼중 면역 관문 차단의 이점을 입증한다. 도 66 내지 도 72는 이중특이적 관문 항체, 항-PD-1 mAb와 항-RSV mAb 사이의 (Nanostring nCounter®에 의해 결정된 바와 같은) 다양한 유전자의 발현의 배수 변화를 보여준다.

E. 실시예 5: 항-PD-1 클론 1C11의 생성

1. 항-PD-1 하이브리도마의 생성 및 스크리닝

추가적인 PD-1 표적화 아암을 개발하기 위해, 단일클론 항체를 처음에 ImmunoPrecise를 통한 하이브리도마 기술에 의해 표준 방법 및 신속한 프라임 방법을 통해 생성하였다. 표준 방법의 경우, 3마리의 BALB/c 마우스에 항원(들)을 주사하였다. 하이브리도마 생성을 위해 희생되기 7일 내지 10일 전에, 면역화된 마우스는 항원 부스트(antigen boost)를 받았다. 항체 역가는 항원에 대한 ELISA에 의해 평가되며, 융합을 위해 최고의 반응 마우스가 선택된다. 최종 항원 부스트는 융합 4일 전에 주어진다. 마우스로부터의 림프구를 혼주하고 정제한 후 SP2/0 골수종 세포와 융합하였다. 융합된 세포를 10일 내지 12일 동안 HAT 선택적 단일 단계 클로닝 배지에서 성장시키고, 이때 하이브리도마는 스크리닝에 대해 준비되었다. 신속한 프라임 방법의 경우, 3마리의 BALB/c 마우스에 항원(들)을 주사하였다. 19일 후, 모든 마우스로부터의 림프구를 혼주하고 정제한 후 SP2/0 골수종 세포와 융합하였다. 융합된 세포를 10일 내지 12일 동안 HAT 선택적 단일 단계 클로닝 배지에서 성장시키고, 이때 하이브리도마는 스크리닝에 대해 준비되었다. 사용된 항원(들)은 인간 PD-1(huPD-1-mFc), 사이노 PD-1의 마우스 Fc 융합체(cynoPD-1-mFc), His-태그화 인간 PD-1(huPD-1-His), His-태그화 사이노 PD-1(cynoPD-1-His) 또는 이들의 혼합물이었다.

상기 기재된 바와 같이 생성된 항-PD-1 하이브리도마 클론을 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet을 사용하여 두 번의 스크리닝으로 처리하였다. Octet용 실험 단계는 일반적으로 시험 물품의 친화도를 결정하기 위해 다음을 포함하였다: 고정화(바이오센서에 리간드 또는 시험 물품을 포획하는 것); 결합 (리간드 코팅된 바이오센서 또는 시험 물품 코팅된 바이오센서를 상응하는 시험 물품 또는 리간드의 연속 희석액을 포함하는 웰에 침지시키는 것); 및 해리(완충액을 포함하는 웰로 바이오센서를 돌려보내는 것). 완충액만을 함유하는 기준 웰이 또한 데이터 처리 동안 배경 보정을 위해 이 방법에 포함되었다.

첫 번째 시행의 경우, 항-마우스 Fc(AMC) 바이오센서를 사용하여 500 nM의 2가의 인간 PD-1-Fc-His 및 사이노 PD-1-Fc-His에 침지하면서 클론을 포획하였다. 두 번째 시행의 경우, 첫 번째 시행에서 확인된 인간 및 사이노 PD-1 둘 다에 양성인 클론을 AMC 바이오센서에 포획하고, 500 nM의 1가의 인간 PD-1-His 및 사이노 PD-1-His에 침지시켰다.

2. 클론 1C11의 규명

실시예 1에서 확인된 하나의 하이브리도마 클론은 클론 1C11이었다. 하이브리도마 클론 1C11의 VH 및 VL을 암호화하는 DNA를 유전자 합성에 의해 생성하였고, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 인간 IgG1 불변 영역을 함유하는 발현 벡터 pTT5에로 서브클로닝하여 XENP21575를 생성하였고, 이의 서열은 도 9에 도시된다.

3. 클론 1C11에 의한 PD-L1 차단

관문 수용체/리간드 상호작용의 차단은 T 세포 활성화에 필요하다. XENP21575의 결합 능력은 세포 결합 검정에서 대조군으로서의 XENP16432(니볼루맙의 가변 영역을 갖는 항-PD-1 mAb), XENP21461(펨브롤리주맙의 가변 영역을 갖는 항-PD-1 mAb) 및 XENP15074(모타비주맙의 가변 영역을 갖는 항-RSV Mab)에 의해 조사되었다. PD-1을 발현하도록 형질주입된 HEK293T 세포를 XENP21575 및 대조군 항체와 항온처리하였다. 항온처리 이후에, PD-L1의 쥣과 Fc 융합체를 첨가하고 항온처리하였다. HEK293T 세포에 대한 PD-L1-mFc의 결합을 항-쥣과 IgG 2차 항체로 검출하였으며, 이의 데이터는 도 10에 도시된다. 데이터는 XENP21575에 의한 PD-L1 차단이 XENP16432 및 XENP21461에 의한 차단과 유사하다는 것을 보여준다.

4. 클론 1C11의 T 세포 표면 결합

T 세포에 대한 항-PD-1 클론 1C11의 결합을 SEB 자극된 PBMC 검정에서 측정하였다. 스태필로코커스 엔테로톡신 B(SEB)는 PD-1과 같은 관문 수용체의 발현을 포함하여 T 세포 수용체(TCR)를 통한 활성화에 의해 달성되는 것과 유사한 방식으로 T 세포 활성화 및 증식을 일으키는 슈퍼항원이다. 인간 PBMC를 3일 동안 100 ng/mL로 자극하였다. 자극 이후에, PBMC를 표시된 농도의 표시된 시험 물품과 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. PBMC를 항-CD3-FITC(UCHT1) 및 인간 면역글로불린 κ 경쇄에 대한 APC 표지된 항체로 염색하였다. FITC+ 세포에서의 APC MFI에 의해 표시된 바와 같은 T 세포에 대한 시험 물품의 결합은 도 11에 도시된다.

5. 클론 1C11에 의한 T 세포 활성화

사이토카인 분비에 의해 표시된 바와 같은 클론 1C11에 의한 T 세포 활성화는 SEB 자극된 PBMC 검정에서 조사되었다. 인간 PBMC를 2일 동안 500 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이후, 세포를 배양 배지에서 2회 세척하고, 표시된 양의 표시된 시험 물품과 함께 24시간 동안 500 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이후, 상청액을 세포에 의한 IL-2 및 IFNγ에 대해 평가하였고, 이의 데이터는 도 12에 도시된다.

6. 클론 1C11의 인간화

클론 1C11을 스트링 함량 최적화를 사용하여 인간화하였다(예를 들어, 2010년 2월 2일에 허여된 미국 특허 7,657,380호 참조). 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되고, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 발현 벡터 pTT5에로 서브클로닝되었다. 2가 항체 형식의 클론 1C11의 예시적인 인간화된 변이체에 대한 서열은 도 13에 도시된다.

XENP22553의 친화도는 일반적으로 실시예에 기재된 바와 같이 Octet를 사용하여 결정되었다. 특히, 항-인간 Fc(AHC) 바이오센서를 사용하여 다수의 농도의 히스티딘 태그화된 PD-1에 침지하면서 시험 물품을 포획하였다. 친화도 결과 및 상응하는 센서그램은 도 14에 도시된다.

7. scFv 형식의 클론 1C11의 인간화된 변이체의 안정성 최적화

(XENP22553에서처럼) 항-PD-1 클론 1C11 인간화된 변이체 H3L3의 가변 영역은 예를 들어 이중특이적 항체에 사용하기 위해 scFv의 맥락에서 (친화도를 유지시키면서) 개선된 안정성에 대해 조작되었다. XENP22553의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 갖는 scFv를 암호화하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되고, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 발현 벡터 pTT5에로 서브클로닝되었다. ScFv의 C 말단은 정제를 위해 폴리히스티딘 태그를 포함하였다. 이후, scFv 변이체의 라이브러리를 표준 돌연변이유발에 의해 작제하고, 이에 대한 예시적인 서열은 (폴리히스티딘 태그가 제거되었지만) 도 15에 도시된다.

scFv-His의 안정성은 시차 주사 형광측정법 (DSF)을 사용하여 평가되었다. DSF 실험은 Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR Detection System을 사용하여 수행되었다. 단백질을 SYPRO 오렌지 형광 염료와 혼합하고, PBS에서 0.2 mg/mL로 희석하였다. SYPRO 오렌지의 최종 농도는 10X이었다. 25℃의 초기 10분 항온처리 기간 이후에, 단백질을 1℃/분의 가열 속도를 사용하여 25℃부터 95℃까지 가열하였다. 30초마다 형광 측정을 했다. 융점(T_m)은 기기 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 안정성 결과는 도 17에 도시된다. 데이터는 융점(T_m)이 최대 19℃만큼 증가한다는 것을 보여준다.

변이체의 친화도를 결정하기 위해, scFv로부터의 가변 영역은 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 2가 IgG1에서 Fab로서 형식화된다. 예시적인 서열은 도 16에 도시된다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되고, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 IgG1 불변 영역을 함유하는 pTT5 발현 벡터에로 서브클로닝되고, HEK293E 세포에 일시적으로 형질주입되었다. 상청액의 친화도 스크린은 Octet를 사용하여 수행되었다. 항-인간 Fc(AHC) 바이오센서를 사용하여 2.0 nm의 밀도로 각각의 상청액의 1:2 희석액을 포획하고, K_D 결정을 위해 PD-1-His에 침지시켰다. 친화도 결과는 도 17에 도시된다.

8. Fab 형식의 클론 1C11의 인간화된 변이체의 친화도 최적화

(XENP22553에서처럼) 항-PD-1 클론 1C11 인간화된 변이체 H3L3의 가변 영역은 Fab 형식으로 생성되고, 예를 들어 가의 단일특이적 항체로서 사용하기 위해 또는 이중특이적 항체에서 사용하기 위해 최적화된 친화도에 대해 조작되었다.

제1 라이브러리에서, 친화도가 증가된 것으로 발견된 실시예 4D에서 생성된 scFv로부터의 가변 중쇄 및 경쇄 영역은 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 2가 IgG1 형식을 생성하도록 조합되고, 이 치환에 대한 예시적인 서열은 도 20에 도시된다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되고, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 IgG1 불변 영역을 함유하는 pTT5 발현 벡터에로 서브클로닝되고, HEK293E 세포에 일시적으로 형질주입되었다. 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, 친화도 스크린을 Octet를 사용하여 수행하였다. AHC 바이오센서를 사용하여 항체를 포획하고, K_D 결정을 위해 다중 농도의 PD-1-His에 침지시켰다. 친화도 결과는 도 19에 도시된다.

제2 라이브러리에서, 추가 변이체는 XENP22553의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나를 암호화하는 발현 벡터에서 표준 돌연변이유발에 의해 작제되었다. 추가 중쇄 및 경쇄 변이체에 대한 예시적인 서열은 도 20 및 도 21에 도시된다. 추가 중쇄 변이체를 암호화하는 DNA 및 XENP22553의 경쇄를 암호화하는 DNA, 또는 XENP22553의 중쇄를 암호화하는 DNA 및 추가 경쇄 변이체를 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 HEK293E 세포에 일시적으로 형질주입하였다. 상청액의 친화도 스크린은 Octet를 사용하여 수행되었다. 항-인간 Fc(AHC) 바이오센서를 사용하여 2.0 nm의 밀도로 각각의 상청액의 1:2 희석액을 포획하고, K_D 결정을 위해 PD-1-His에 침지시켰다. 친화도 결과는 도 22에 도시된다. 추적관찰 스크린에서, 선택된 항체를 암호화하는 DNA를 HEK293E 세포에 형질주입하고, 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, Octet를 사용하여 친화도에 대해 스크리닝하였다. 항-인간 Fc(AHC) 바이오센서를 사용하여 항체를 포획하고, K_D 결정을 위해 다중 농도의 PD-1-His에 침지시키고, 이에 대한 결과는 도 23에 도시된다.

다른 라이브러리는 일반적으로 상기 기재된 바대로 생성되었다. 생성된 항체에 대한 예시적인 서열은 도 24에 도시된다. 선택된 항체를 암호화하는 DNA를 HEK293E 세포에 형질주입하고, 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, Octet를 사용하여 친화도에 대해 스크리닝하였다. 항-인간 Fc(AHC) 바이오센서를 사용하여 항체를 포획하고, KD 결정을 위해 다중 농도의 PD-1-His에 침지시키고, 이에 대한 결과는 도 25에 도시된다.

9. Biacore에 의해 결정된 바와 같은 친화도 최적화된 1C11 변이체의 친화도 스크린

상기 기재된 바대로 생성된 1C11 변이체 및 니볼루맙(XENP16432) 및 펨브롤리주맙(XENP21461)에 기초한 대조군 mAb의 친화도는 표면 플라스몬 공명(SPR) 기반 기법인 Biacore를 사용하여 결정되었다. Biacore에 대한 실험 단계는 시험 물품의 친화도를 결정하기 위해 일반적으로 하기를 포함하였다: 고정화(센서 칩에 리간드를 포획하는 것); 결합(센서 칩 위로 다양한 농도의 분석물질을 흐르게 하는 것); 및 해리(센서 칩 위로 완충액을 흐르게 하는 것). 완충액만을 갖는 기준 유동이 또한 데이터 처리 동안 배경 보정을 위해 이 방법에 포함되었다. 1:1 결합 모델을 사용하여 처리된 데이터를 사용하여 결합 친화도 및 동역학 속도 상수를 얻었다. 특히, 항-PD-1 mAb는 Protein A 센서 칩에 포획되고, 이후 다중 농도의 히스티딘 태그화된 인간 PD-1 또는 히스티딘 태그화된 사이노 PD-1이 센서 칩 위로 흘렀다. 생성된 해리 상수(K_D)는 도 26에 도시된다.

10. 친화도 최적화된 1C11 변이체의 T 세포 표면 결합

T 세포에 대한 친화도 최적화된 1C11 변이체의 결합은 SEB 자극된 PBMC 검정에서 측정되었다. 인간 PBMC를 3일 동안 500 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 자극 이후에, PBMC를 표시된 농도의 표시된 시험 물품과 함께 30분 동안 항온처리하였다. PBMC를 항-CD3-FITC(UCHT1) 및 인간 Fc에 대한 A647 표지된 항체로 염색하였다. FITC+ 세포에서의 A647 MFI에 의해 표시된 바와 같은 T 세포에 대한 시험 물품의 결합은 도 27에 도시된다.

11. 친화도 최적화된 1C11 변이체에 의한 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2 결합의 차단

PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2 결합을 차단하는 친화도 최적화된 1C11 변이체의 능력은 Octet HTX 기기를 사용하여 탠덤 에피토프 비닝 검정에서 조사되었다. Octet용 실험 단계는 일반적으로 실시예에 기재된 바와 같다. 특히, 인간 PD-1의 쥣과 Fc 융합체를 AMC(항-마우스 Fc 포획) 바이오센서로 로딩한 후, 100 nM의 제1 시험 물품(도 28에 도시된 표의 좌측에 표시됨) 및 이후 100 nM의 제2 시험 물품(도 28에 도시된 표의 상부에 표시됨)에 침지시켰다. 시험 물품은 인간화된 클론 1C11 및 PD-L1과 PD-L2의 Fc 융합체의 친화도 최적화된 변이체(RnD Systems(미네소타주 미니애폴리스))를 포함하였다. 바이오센서를 HBS-EP 완충액에 침지시키고 이후 시험 물품에 침지시켜 얻은 반응에 대해 각각의 시험 물품 쌍의 BLI 반응을 정규화하였다. 각각의 시험 물품 쌍의 정규화된 BLI 반응이 도시된다. 제2 시험 물품이 0.4 미만의 정규화된 BLI 반응을 제공하면, PD-1에 대한 제2 시험 물품의 결합은 제1 시험 물품에 의해 차단되는 것으로 간주한다. 제2 시험 물품이 0.4 내지 0.6의 정규화된 BLI 반응을 제공하면, 차단은 경계인 것으로 간주한다. 제2 시험 물품이 0.6 초과의 정규화된 BLI 반응을 제공하면, PD-1에 대한 제2 시험 물품의 결합은 제1 시험 물품에 의해 차단되지 않는 것으로 간주한다. 데이터는 각각의 항-PD-1 1C11 변이체가 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2 결합을 차단한다는 것을 보여준다.

F. 실시예 6: 친화도 최적화된 1C11 변이체의 추가의 조작

본 발명자들은 상기 언급된 접근법을 사용할 뿐만 아니라 친화도를 가장 잘 조절하는 것으로 보이는 치환을 혼합하고 매칭함으로써 PD-1 친화도를 조절하도록 추가의 1C11 변이체를 조작하였다. 또한, 본 발명자들은 변이체 1C11 가변 중쇄를 변이체 1C11 가변 경쇄와 조합하여 양호한 친화도 조절을 입증하였다. 생성된 항체에 대한 예시적인 서열은 도 40에 도시된다.

1. 추가의 친화도 조작된 1C11 변이체의 친화도 스크린

추가의 친화도 조작된 1C11 변이체의 친화도는 일반적으로 상기 기재된 바대로 Octet를 사용하여 결정되었다. 특히, AHC 바이오센서를 사용하여 1C11 변이체를 포획하고, 다중 농도의 His 태그화된 인간 PD-1(및 도 41에 도시된 데이터에 대해 His 태그화된 사이노몰거스 PD-1)에 침지시켰다. 생성된 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)는 도 41 내지 도 45에 도시되어 있고, 여기서 각각의 도면은 별개의 실험 세트를 도시한다.

2. SEB 자극된 PBMC 검정에서 1C11 변이체에 의한 사이토카인 분비의 유도

실험 사이에 기술적 변동이 있고, Octet 또는 Biacore로부터 얻은 데이터 사이에 기술적 변동이 있지만, (Octet에 의해 결정된 바와 같은) 1C11_H3L3의 친화도는 일반적으로 15 내지 19 nM의 범위였다(6개 중 4개 실험). 다양한 횟수의 조작으로부터, 본 발명자들은 인간 PD-1에 대해 훨씬 더 강한 친화도를 갖는 1C11 변이체(예를 들어, Octet에 의해 결정된 바대로 0.51 내지 0.74 nM의 범위의 친화도를 갖는 XENP26940; 및 0.77 nM의 친화도를 갖는 XENP28652), 및 훨씬 더 약한 친화도를 갖는 변이체(예를 들어, Octet에 의해 결정된 바대로 333 nM의 친화도를 갖는 XENP26928)를 얻었다. 따라서, 본 발명자들은 SEB 자극된 PBMC 검정에서 사이토카인 분비에 의해 표시된 바대로 친화도가 다른 변이체에 의해 T 세포 활성화를 조사하였다. 18개의 고유한 도너로부터의 PBMC를 2일 동안 100 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이후, 세포를 세척하고, SEB 및 20 μg/mL의 시험 물품으로 재자극하였다. IFNγ 및 IL-2 분비를 도시하는 데이터는 각각 도 46 및 도 47에 도시된다. XENP26928의 더 약한 결합 친화도 및 상응하는 더 약한 사이토카인 분비 유도로 표시된 바와 같이, 데이터는 1C11 변이체의 활성과 이의 친화도 사이의 상관관계를 제안하였다.

요약하면, 본 발명자들은 1C11_H3L3(XENP22533)으로 인간화될 때 니볼루맙에 기초한 항-PD-1 mAb XENP16432와 비교하여 유사한 친화도를 갖는 신규의 항-PD-1 mAb 1C11을 확인하였다(Biacore에 의해 결정될 때 각각 8.6 nM 및 4.5 nM; Octet에 의해 결정될 때 각각 약 18 nM 및 10 nM). 유사한 친화도에도 불구하고, XENP22533은 도 11에 도시된 바대로 XENP16432보다 더 강하게 T 세포에 결합한다. 본 발명자들은 XENP22533을 조작하여, Octet로 측정한 경우 PD-1에 대해 2차수 초과의 조절된 친화도를 갖는 변이체를 생성했다. 이 "친화도 래더(ladder)"는 PD-1 수용체 리사이클링의 복잡한 물리적 거동, 항체:항원 복합체 수명, 및 항체 혈청 반감기를 가장 잘 네비게이트할 수 있는 PD-1에 대한 최적 친화도를 특정하는 데 유용할 것이다. 이들 인자는 향후 생체내 마우스 종양 모델에서 탐구될 것이다.

G. 실시예 7: XmAb22841 및 αPD-1에 의한 삼중 관문 차단은 SEB 자극된 세포로부터의 사이토카인 분비를 향상시킨다

인간 PBMC를 2일 동안 100 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 세포를 2회 세척하고, 24시간 동안 100 ng/mL의 SEB 및 20 μg/mL의 표시된 시험 물품으로 재자극하였다. 세포 상청액을 수집하고, 도 29 및 도 30에 도시된 바대로 IFNγ 및 IL-2 분비에 대해 평가하였다. 데이터는 XmAb22841과 XENP16432의 조합(니볼루맙에 기초한 절제된 효과기 기능을 갖는 2가 αPD-1 mAb)에 의해 가능한 삼중 관문 차단이 XENP16432 또는 XmAb22841 이상으로 사이토카인 분비를 향상시킨다는 것을 보여준다. 특히, XmAb22841과 XENP16432의 조합은 XENP16432, XENP16433(이필리무맙에 기초한 절제된 효과기 기능을 갖는 2가 αCTLA-4 mAb) 및 XENP16436(25F7에 기초한 절제된 효과기 기능을 갖는 2가 αLAG-3 mAb)의 조합에 의한 삼중 관문 차단과 유사한 수준으로 사이토카인 분비를 향상시켰다.

H. 실시예 8: XmAb22841의 결합능은 MLR로부터의 사이토카인 방출에 관여한다

2개의 고유한 도너로부터의 PBMC(400,000개의 세포/도너)를 혼합하고, 5일 동안 20 μg/mL의 표시된 시험 물품과 항온처리하였다. 항온처리 이후에, 세포를 도 31에 도시된 바대로 IFNγ에 대해 평가하였다. 유사한 실험에서, 혼합된 PBMC를 다양한 농도의 표시된 시험 물품과 5일 동안 항온처리하고, PBS에 대한 IFNγ의 배수 유도는 도 32에 도시된다. 데이터는 XmAb22841이 IFNγ 분비를 XENP24895(XmAb22841의 항-LAG-3 아암에 기초한 1-아암 1가 mAb) 및 XENP24893(XmAb22841의 항-CTLA-4 아암에 기초한 1-아암 1가 mAb)의 조합 이상으로 향상시킨다는 것을 보여주어, 2가 결합에 의해 가능한 결합능이 사이토카인 방출을 향상시키는 데 필요하다는 것을 입증한다.

I. 실시예 9: XmAb22841 및 αPD-1에 의한 삼중 관문 차단은 NSG 마우스에서 GVHD를 향상시킨다

NOD SCID 감마(NSG) 마우스(그룹 당 10마리)에 0일에 10 x 106개의 인간 PBMC로 IV-OSP를 통해 생착시켰다. 1일에, 마우스에 4주(총 4회 용량) 동안 XENP26842(절제된 효과기 기능 및 M428L/N434S Xtend 돌연변이를 갖는 니볼루맙에 기초한 2가 αPD-1 mAb; 도 33에 도시된 서열), XmAb22841, XmAb22841과 XENP16432의 조합, 또는 PBS로 투여하였다. (14일 동안) 도 34에 도시된 바대로 다양한 림프구 집단 및 (7일 동안) 도 35에 도시된 바대로 IFNγ의 혈청 농도를 계수하도록 7일, 14일 및 21일에 채혈하였다.

J. 실시예 10: XmAb22841 및 αPD-1에 의한 삼중 관문 차단은 마우스에서 항종양 반응을 향상시킨다

NOD SCID 감마(NSG) 마우스(그룹 당 10마리)에 -14일에 뒤옆구리에서 진피내로 3 x 106개의 pp65를 발현하는 MCF-7 세포로 생착하였다. 0일에, 마우스에 HLA 일치된 CMV+ 도너로부터의 5 x 10⁶개의 인간 PBMC로 복강내로 생착하고, 이것을 T 세포 pp65 반응성(또는 대조군 마우스에 대해 PBS)에 대해 양성 스크리닝하였다. 마우스를 4주(총 4회 용량) 동안 XENP16432, XmAb22841, XmAb22841과 XENP16432의 조합, 또는 (대조군 마우스에 대해) PBS로 매주 치료하였다. 종양 용적을 캘리퍼 측정에 의해 모니터링하고, 이에 대한 데이터(제1 용량 후 일자)가 도 36a 내지 도 36b에 도시된다. 7일, 12일, 19일 및 26일에 채혈하고, 도 37a 내지 도 37d에 도시된 바대로 혈액을 유세포 분석법에 의해 분석하여 다양한 림프구 집단을 계수하였다. 데이터는 림프구 계수치(특히 CD8+ T 세포)가 다양한 관문 억제제를 갖거나 갖지 않으면서 유사하다는 것을 보여준다. 그러나, 다양한 시험 물품에 의한 처리는 특히 종양 용적을 감소시켜 관문 차단에 의한 T 세포 활성의 억제해제로부터 향상된 항종양 반응을 나타낸다. 게다가, 데이터는 (CTLA-4 및 LAG-3을 표적화하는) XmAb22841 및 (PD-1을 표적화하는) XENP16432에 의한 조합 치료에 의해 가능한 삼중 관문 차단이 XmAb22841 또는 XENP16432 단독 중 어느 하나에 의한 치료에 비해 항종양 반응을 상승적으로(synergistically) 증대시킨다는 것을 보여준다.

K. 실시예 11: 항-PD-1 mAb 1C11은 PBMC 생착된 NSG-마우스에서 GVHD를 향상시킨다

GVHD 연구에서, 본 발명자들은 인간화된 항-PD-1 mAb 1C11_H3L3(XENP22553)의 효과를 조사하였다. NSG 마우스를 0일에 10 x 106개의 인간 PBMC로 i.v. 생착한 후 1일, 8일, 15일 및 21일에 하기 시험 물품에 의해 치료하였다: PBS 대조군, XENP16432(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 갖는 니볼루맙에 기초한 항-PD-1 항체) 및 XENP22553. 도 38은 (초기 체중의 백분율로서) 시간에 따른 마우스의 체중 변화를 도시하고, 도 39는 시간에 따른 마우스 혈액에서의 인간 CD45+ 세포 계수치, CD4+ T 세포 계수치 및 CD8+ T 세포 계수치를 도시한다.

L. 실시예 12: Xtend Fc 도메인은 hFcRn 형질전환 마우스에서 항-PD-1 x 항-CTLA-4 이중특이적 항체의 반감기를 연장한다

Tg276 형질전환 hFcRn 마우스(hFcRn에 대해 반접합성; n = 5)를 0일에 2 mg/kg의 XmAb20717 또는 XENP20053(XmAb20717의 비-Xtend 유사체)으로 치료하였다. 전혈 샘플을 치료 전 1시간에 수집하고, 2일, 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일, 16일, 29일, 33일 및 35일에 수집하였다. 인간 PD-1 및 인간 CTLA-4 항원을 사용하여 시험 물품 농도를 검출하였다. 시간에 따른 유리 약물 혈청 농도의 비구획 분석을 위해 PK 매개변수로 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(버전 6.4.0.768)를 사용하여 PK 해석 분석을 수행하였다. XmAb20717 및 XENP20053의 약동학적 프로파일은 도 76에 도시되어 있고; 반감기는 도 77에 도시되어 있고; C_max는 도 78에 도시된다. 추가 PK 매개변수는 도 79에 요약되어 있다.

M. 실시예 13: XmAb20717은 미경험 T 세포 P에서 사이토카인 방출을 유도하지 않는다

BMC를 밤새 해동하고, 20 μg/mL의 표시된 가용성 시험 물품 또는 플레이트 결합된 시험 물품으로 24시간 동안 치료하였다. 항-CD3 항체는 클론 OKT3이었다. 이후, 세포 상청액을 수집하고, V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit(Meso Scale(메릴랜드주 록빌))로 평가하였다. 각각의 점은 기술적 단일항에서 시험된 고유한 인간 도너를 나타낸다. 대응 t 검정은 통계 유의도를 결정하도록 사용되었다(n.s.는 p-값 > 0.05를 의미한다). 도 80에 도시된 데이터는 XmAb20717이 미경험 T 세포에서 사이토카인 방출(a: IFNγ; b: IL-1β; c: IL-2; d: IL-4; e: IL-8; f: IL-6; g: IL-10; h: IL-12p70; i: IL-13; j: TNFα)을 유도하지 않는다는 것을 보여준다.

N. 실시예 14: XmAb20717에 의한 결합의 추가의 규명

1. A: XmAb20717은 인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 및 PD-1에 결합한다

인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 및 PD-1에 대한 XmAb20717의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. 전반적으로 1:1 결합 모델을 사용하여 처리된 데이터를 분석하여 결합 친화도를 얻었다. Octet 센서그램은 도 81 및 도 82에 도시된다. 생성된 평형 해리 상수(K_D), 결합 속도 상수(k_a) 및 해리 상수(k_d)는 도 83에 제시된다. 인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 둘 다에 대한 친화도는 각각 대략 4.1 nM 및 23 nM에서 측정되었다. 인간 및 사이노 PD-1에 대한 결합 친화도는 각각 1.4 nM 및 5.5 nM이었다.

2. B: XmAb20717은 CTLA-4 및 PD-1의 리간드와의 결합에 대해 경쟁한다

XmAb20717과 함께 및 이것 없이 CTLA-4에 대한 CD80 및 CD86의 결합 및 XmAb20717과 함께 및 이것 없이 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. Octet 센서그램은 도 84 및 도 85에 도시된다. 모든 경우에, 100 nM CTLA-4 및 100 nM PD-1은 이들의 리간드(각각 CD80/CD86 및 PDL1/PDL2)에 의한 결합 신호를 보여준다. 실험 전에 실온에서 1시간 동안 CTLA-4 또는 PD-1과 예비항온처리된 과량의 XmAb20717의 존재 하에, 각각 리간드 CD80/CD86과 PD-L1/PD-L2에 대해 CTLA-4와 PD-1 및 XmAb20717의 경쟁으로 인해 임의의 리간드에서 관찰된 결합 신호가 없다.

3. C: XmAb20717은 FcγR에 결합하지 않는다

인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcγR에 대한 XmAb20717의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. 비교자 항체도 유사한 방법을 사용하여 시험되었다: 네이티브 IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체. Octet 센서그램은 도 86 내지 도 88에 도시된다. 네이티브 인간 IgG1 항체에 대한 예상된 결합 패턴이 비교자 항체에 대해 관찰되지만, XmAb20717에 대해서는 FcγR에 대한 어떤 결합도 검출되지 않았다.

4. D: XmAb20717은 pH 6.0에서 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn에 결합한다

pH 6.0에서의 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn에 대한 XmAb20717의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. 비교자 항체도 유사한 방법을 사용하여 시험되었다: XmAb20717과 동일한 가변 영역 및 조작된 불변 영역을 함유하지만 아미노산 치환 XmAb20717이 결여된 항-PD1 × 항-CTLA4 이중특이적 항체인 XENP20053이 FcRn 결합 향상을 위해 함유된다. 전반적으로 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 처리된 데이터를 분석하여 결합 친화도를 얻었다. Octet 센서그램은 도 90에 도시된다. 생성된 평형 해리 상수(K_D)는 도 89에 제시된다. XmAb20717에 대해 측정된 친화도는 비교자에 대해 측정된 것보다 강하고, 이는 XmAb20717에 함유된 Fc 치환이 엔도솜 이동에 대해 생리학적으로 적절한 pH인 pH 6.0에서 FcRn에 대한 친화도를 개선한다는 것을 나타낸다.

5. E: XmAb20717은 PD-1 및 CTLA-4에 동시에 결합한다

PD1 및 CTLA4 항원 둘 다에 대한 XmAb20717의 결합은 Octet HTX 기기에서 BLI 기술을 사용하여 탠덤식 침지 접근법을 사용하여 시험되었다. 처음에, 바이오센서를 PD-1로 로딩하고, 이후 XmAb20717 또는 대조군으로서 완충액에 침지시키고, 마지막으로 CTLA-4에 침지시켰다. 도 91은 XmAb20717이 동시에 항원 둘 다에 결합할 수 있다는 것을 나타내는 결합 센서그램을 보여준다. XmAb20717 센서그램은 최종 CTLA4 항원 침지 동안에 신호 증가에 기여하지만, XmAb20717이 로딩되지 않은 대조군 센서그램은 편평하다.

O. 실시예 15: XmAb20717의 추가의 시험관내 규명

1. A: XmAb20717은 항-PD-1 항체와 비교하여 SEB 자극된 PBMC로부터 IL-2 분비를 더 크게 촉진한다

22개의 고유한 도너로부터의 PBMC를 48시간 동안 500 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이후, 세포를 배양 배지에서 2회 세척하고, 18시간 동안 500 ng/mL의 SEB와 20 μg/mL의 표시된 시험 물품으로 재자극하였다. 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 IL-2 농도에 대해 평가하였고, 이에 대한 데이터는 도 92에 도시된다.

2. B: XmAb20717은 항-PD-1 항체와 비교하여 비자극된 인간 PBMC로부터 IL-2 분비를 억제한다

22개의 고유한 도너로부터의 비자극된 PBMC를 72시간 동안 20 μg/mL의 표시된 시험 물품으로 치료하였다. 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 IL-2 농도에 대해 평가하였고, 이에 대한 데이터는 도 93에 도시된다.

3. C: XmAb20717은 XmAb20717을 포함하는 성분 아암의 혼합물과 비교하여 인간 림프구로부터의 IL-2 분비를 더 크게 촉진한다

22개의 고유한 도너로부터의 PBMC를 48시간 동안 500 ng/mL의 SEB로 자극하였다(도 92로부터 되풀이된 XENP15074 및 XENP20717로부터의 데이터). 이후, 세포를 배양 배지에서 2회 세척하고, 18시간 동안 500 ng/mL의 SEB 및 20 μg/mL의 표시된 시험 물품으로 재자극하였다. 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 IL-2 풍부도에 대해 평가하였고, 이에 대한 데이터는 도 94에 도시된다.

P. 실시예 16: 쥣과 모델에서의 생체내 연구의 추가의 분석

본 발명자들은 이전의 실시예에 기재된 GVHD 연구로부터의 데이터를 추가로 분석하였다. 도 95는 (초기 체중의 백분율로서) 시간에 따른 마우스의 평균 체중 변화를 도시한다. 도 96은 시간에 따른 마우스의 생존율을 도시한다. 도 97은 시간에 따른 마우스에서의 평균 IFNγ 수준을 도시한다. 도 98은 시간에 따른 마우스 혈액에서의 인간 CD45⁺ 세포 계수치, CD4⁺ T 세포 계수치 및 CD8⁺ T 세포 계수치를 도시한다.

Q. 실시예 17: XmAb20717은 GVHD 모델에서 PD-L1 차단과 조합된다

다른 GVHD 연구에서, 본 발명자들은 XmAb20717과 PD-L1 차단의 조합을 조사하였다(항-PD-L1 mAb). NSG 마우스를 0일에 10 x 10⁶개의 인간 PBMC로 i.v. 생착한 후 1일, 8일, 15일 및 21일에 하기 시험 물품에 의해 치료하였다: PBS 대조군, XmAb20717, XENP16434(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 갖는 아테졸리주맙에 기초한 항-PD-L1 항체; 도 99에 도시된 서열), 및 XENP16434와 조합된 XmAb20717. 도 100은 (초기 체중의 백분율로서) 시간에 따른 마우스의 체중 변화를 도시하고, 도 101은 시간에 따른 마우스의 생존율을 도시하고, 도 102는 14일에 마우스 혈액에서의 인간 CD45⁺ 세포 계수치, CD4⁺ T 세포 계수치 및 CD8⁺ T 세포 계수치를 도시한다.

R. 실시예 18: XmAb20717과 비교자 항-PD-1 항체의 상호작용

펨브롤리주맙 또는 니볼루맙이 XmAb20717의 결합 활성을 방해할 수 있는지를 결정하기 위해, PD-1-GFP 및 CTLA-4를 안정하게 발현하는 293T 세포를 4℃에서 30분 동안 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙(100 μg/mL에서 시작하여 16점 2배 연속 희석)으로 처리하였다. 세포를 200 μL의 빙냉 FACS 완충액(PBS 중 3% FBS)으로 2회 세척하고, 30분 동안 얼음 상에서 Alexa647에 접합된 XmAb20717(200 μg/mL에서 시작하여 16점 3배 연속 희석)로 염색하였다. 이후, 세포를 XmAb20717에 의한 결합에 대해 FACS에 의해 분석하고, 이에 대한 데이터는 도 103 및 도 104에 도시된다. 도 103에 도시된 데이터는 니볼루맙이 PD-1⁺CTLA-4⁺ 세포에 대한 XmAb20717의 결합을 상당히 방해하지 않는다는 것을 나타낸다. 도 104에 도시된 데이터는 펨브롤리주맙이 PD-1⁺CTLA-4⁺ 세포에 대한 XmAb20717의 결합을 방해하지만, 도 105에 도시된 데이터는 펨브롤리주맙에 의한 방해가 높은 농도의 XmAb20717에 의해 극복될 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 XmAb20717이 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙의 치료와 조합되어 또는 이에 후속하여 대상체에 투여될 수 있음을 제안한다.

S. 실시예 19: XmAb22841은 미경험 T 세포에서 사이토카인 방출을 유도하지 않고 과작동성(superagonistic)이 아니다

PBMC를 밤새 해동하고, 20 μg/mL의 표시된 가용성 시험 물품은 플레이트 결합된 시험 물품으로 24시간 동안 치료하였다. 항-CD3 항체는 클론 OKT3이었다. 이후, 세포 상청액을 수집하고, V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit(Meso Scale(메릴랜드주 록빌))로 평가하였다. 각각의 점은 기술적 단일항에서 시험된 고유한 인간 도너를 나타낸다. 대응 t 검정은 통계 유의도를 결정하도록 사용되었다(n.s.는 p-값 > 0.05를 의미한다). 도 106에 도시된 데이터는 XmAb22841이 미경험 T 세포에서 사이토카인 방출을 유도하지 않는다는 것을 보여준다(a: IFNγ; b: IL-1β; c: IL-2; d: IL-4; e: IL-8; f: IL-6; g: IL-10; h: IL-12p70; i: IL-13; j: TNFα).

XmAb22841의 과작동성 특성이 Stebbings 프로토콜마다 공기 건조에 의해 또한 평가되었다(Stebbings R. et al. 2007). 시험 물품의 공기 건조는 실온에서 2시간 동안 SpeedVac^TM에서 건조에 의해 달성되었다. 인간 PBMC를 10 μg의 공기 건조된 XmAb22841로 24시간 동안 처리하고, 활성을 10 μg의 공기 건조된 XENP15074(항-RSV 네가티브 아이소타입 대조군) 또는 과작동제 TGN1412(XENP29154; 이에 대한 서열은 도 107에 도시됨)와 비교하였다. TGN1412는 수성 흡착 방법을 사용하여 검정 플레이트에 결합될 때 어떠한 활성을 보유하지 않지만, 공기 건조된 TGN1412는 비자극된 인간 PBMC로부터 IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 TNF 사이토카인 분비를 촉진하였다. 비교하면, 공기 건조된 XmAb22841로 치료된 PBMC에서의 사이토카인 수준은 공기 건조된 XENP15074의 음성 대조군과 유사하다(도 108에 도시된 데이터).

T. 실시예 20: XmAb22841에 의한 결합의 추가의 규명

1. A: XmAb22841은 인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 및 LAG-3에 결합한다

인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 및 LAG-3에 대한 XmAb22841의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. 전반적으로 1:1 결합 모델을 사용하여 처리된 데이터를 분석하여 결합 친화도를 얻었다. Octet 센서그램은 도 109 및 도 110에 도시된다. 생성된 평형 해리 상수(K_D), 결합 속도 상수(k_a) 및 해리 상수(k_d)는 도 111에 제시되어 있다. 인간 및 사이노몰거스 CTLA-4 둘 다에 대한 친화도는 각각 대략 4.6 nM 및 17.6 nM에서 측정되었다. 인간 및 사이노 LAG-3에 대한 결합 친화도는 각각 1.4 nM 및 1.3 nM이었다.

2. B: XmAb22841은 CTLA-4 및 LAG-3의 리간드와의 결합에 대해 경쟁한다

XmAb22841과 함께 및 이것 없이 CTLA-4에 대한 CD80 및 CD86의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. Octet 센서그램은 도 112에 도시된다. 두 경우 모두, 100 nM CTLA-4는 이의 리간드(CD80/CD86)와의 결합 신호를 보여준다. 실험 전에 1시간 동안 실온에서 CTLA-4와 예비항온처리된 과량의 XmAb22841의 존재 하에, 리간드 CD80/CD86에 대한 CTLA-4와의 XmAb22841의 경쟁으로 인해 임의의 리간드에 관찰된 결합 신호가 없었다.

가용성 LAG-3은 암 세포주의 표면에서 발현된 MHC 클래스 II에 결합한다. 따라서, 본 발명은 XmAb22841이 XmAb22841에 복합체화될 때 MHCII⁺ Ramos 세포에 대한 가용성 LAG-3 결합을 차단할 수 있는지를 결정하였다. 도 113에 도시된 바대로, XmAb22841은 Ramos 세포에 대한 가용성 LAG-3 항원의 결합을 용량 의존적으로 차단하였다.

3. C: XmAb22841은 FcγR에 결합하지 않는다

인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcγR에 대한 XmAb22841의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. 비교자 항체도 유사한 방법을 사용하여 시험되었다: 네이티브 IgG1 불변 영역을 갖는 항-CD19 항체. Octet 센서그램은 도 114 내지 도 116에 도시된다. 네이티브 인간 IgG1 항체에 대한 예상된 결합 패턴이 비교자 항체에 대해 관찰되지만, XmAb22841에 대해서는 FcγR에 대한 어떤 결합도 검출되지 않았다.

4. D: XmAb22841는 pH 6.0에서 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn에 결합한다

pH 6.0에서의 인간, 사이노몰거스 및 마우스 FcRn에 대한 XmAb22841의 결합은 BioLayer Interferometry(BLI) 기반 방법인 Octet를 사용하여 규명되었다. 비교자 항체도 유사한 방법을 사용하여 시험되었다: XmAb22841과 동일한 가변 영역 및 조작된 불변 영역을 함유하지만 아미노산 치환 XmAb22841이 결여된 항-CTLA-4 x 항-LAG-3 이중특이적 항체인 XENP22602가 FcRn 결합 향상을 위해 함유된다. 전반적으로 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 처리된 데이터를 분석하여 결합 친화도를 얻었다. Octet 센서그램은 도 118에 도시된다. 생성된 평형 해리 상수(K_D)는 도 117에 제시되어 있다. XmAb22841에 의해 측정된 친화도는 비교자에 대해 측정된 것보다 강하고, 이는 XmAb22841에 함유된 Fc 치환이 엔도솜 이동에 대해 생리학적으로 적절한 pH인 pH 6.0에서 FcRn에 대한 친화도를 개선한다는 것을 나타낸다.

5. E: XmAb22841은 동시에 CTLA-4 및 LAG-3에 결합한다

Octet HTX 기기에서 BLI 기술을 사용한 접근법. 첫째로, 바이오센서에 LAG3을 로딩하고, 이후 XmAb22841 또는 대조군으로서 완충액 중 어느 하나에 침지시키고, 마지막으로 CTLA4에 침지시켰다. 도 119는 XmAb22841이 동시에 항원 둘 다에 결합할 수 있다는 것을 나타내는 결합 센서그램을 보여준다. XmAb22841 센서그램은 최종 CTLA4 항원 침지 동안 신호의 증가에 기여하지만, XmAb22841이 로딩되지 않은 대조군 센서그램은 편평하다.

U. 실시예 21: XmAb22841 및 PD-1 차단에 의한 GVHD의 추가 분석

본 발명자들은 이전의 실시예에 기재된 XmAb22841에 의한 삼중 관문 차단 및 PD-1 차단을 조사하는 GVHD 연구로부터의 데이터를 추가로 분석하였다. 도 120은 (초기 체중의 백분율로서) 시간에 따른 마우스의 평균 체중 변화를 도시한다. 도 121은 시간에 따른 마우스의 생존율을 도시한다. 도 122는 7일 및 14일에서의 IFNγ 및 IL-10 농도를 도시한다.

Claims (35)

1. 항-PD-1 단일클론 항체로서,
   a) N 말단에서 C 말단으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄; 및
   b) N 말단에서 C 말단으로 VL-CL을 포함하는 경쇄를 포함하고;
   VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3은 도 24에서의 XENP26940으로부터의 CDR 및 도 40에서의 XNE28652로부터의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 VH 및 VL은 XENP26940으로부터의 VH 및 VL 및 XENP28652로부터의 VH 및 VL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 힌지-CH2-CH3은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터의 Fc 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 도메인인, 항체.
4. 제3항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 변이체 인간 IgG1 도메인인, 항체.
5. 제4항에 있어서, 상기 변이체 인간 IgG1 도메인은 아미노산 치환 427L/434S를 포함하는, 항체.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 변이체 인간 IgG1 도메인은 도 5에 도시된 것으로부터 선택된 절제(ablation) 변이체를 포함하는, 항체.
7. 제3항에 있어서, Fc 도메인은 S228P 아미노산 치환을 포함하는 변이체 인간 IgG4 도메인인, 항체.
8. 제1항에 있어서, XNE26940 및 XENP28652로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체.
9. 핵산 조성물로서,
   a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 상기 중쇄를 암호화하는 제1 핵산; 및
   b) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 상기 경쇄를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
10. 발현 벡터 조성물로서,
    a) 제9항의 상기 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터; 및
    b) 제9항의 상기 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물.
11. 제9항의 상기 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하는 발현 벡터.
12. 제10항의 발현 벡터 조성물 또는 제11항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
13. 항-PD-1 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 항체가 발현되는 조건 하에 제12항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
14. 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
15. 이종이합체성 이중특이적 항체로서,
    a) 제1 단량체로서,
    i) 인간 PD-1에 결합하는 단쇄 Fv 도메인(scFv)이되, 상기 scFv 도메인은
    1) 제1 가변 중쇄 도메인(VH1);
    2) scFv 링커; 및
    3) 제1 가변 경쇄 도메인(VL1)을 포함하는, scFv; 및
    ii) 제1 변이체 Fc 도메인을 포함하는, 제1 단량체;
    b) 제2 단량체로서,
    i) 제2 가변 중쇄 도메인 (VH2)-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 중쇄를 포함하는, 제2 단량체; 및
    c) 제2 가변 경쇄 도메인(VL2) 및 불변 경쇄 도메인(CL)을 포함하는 경쇄를 포함하고;
    상기 제1 가변 중쇄 도메인 및 상기 제1 가변 경쇄 도메인은 도 15에서의 XENP25806으로부터의 1C11[PD-1]_H3.234_L3.144, 도 15에서의 XENP25812로부터의 1C11[PD-1]_H3.240_L3.148, 도 15에서의 XENP25813으로부터의 1C11[PD-1]_H3.241_L3.148 및 도 15에서의 XENP25819로부터의 1C11[PD-1]_H3.241_L3.92로 이루어진 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는 제1 항원 결합 도메인(ABD1)을 형성하고, 상기 제2 가변 중쇄 도메인 및 상기 제2 가변 경쇄 도메인은 인간 CTLA-4, 인간 LAG-3, 인간 TIM-3, 인간 TIGIT, 인간 BTLA 및 인간 ICOS로부터 선택된 항원에 결합하는 제2 ABD(ABD2)를 형성하는, 이종이합체성 이중특이적 항체.
16. 제15항에 있어서, 상기 제1 단량체는 N 말단에서 C 말단으로 VH1-scFv 링커-VL1-힌지-변이체 Fc 도메인을 포함하는, 이종이합체성 이중특이적 항체.
17. 제16항에 있어서, 상기 제1 단량체는 N 말단에서 C 말단으로 VL1-scFv 링커-VH1-힌지-변이체 Fc 도메인을 포함하는, 이종이합체성 이중특이적 항체.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD2는 인간 CTLA-4에 결합하는, 이종이합체성 항체.
19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD2는 인간 LAG-3에 결합하는, 이종이합체성 항체.
20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD2는 인간 TIM-3에 결합하는, 이종이합체성 항체.
21. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD2는 인간 TIGIT에 결합하는, 이종이합체성 항체.
22. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD2는 인간 ICOS에 결합하는, 이종이합체성 항체.
23. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD2는 인간 BTLA에 결합하는, 이종이합체성 항체.
24. 제18항에 있어서, 상기 항-CTLA-4 ABD2는 서열 목록의 서열 번호 38134번과 38138번, 36739번과 36743번, 36747번과 36751번, 36755번과 36759번, 36763번과 36767번, 36771번과 36775번, 36779번과 36783번, 36787번과 36791번, 36795번과 36799번, 36803번과 36807번, 및 36811번과 36815번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는, 이종이합체성 항체.
25. 제19항에 있어서, 상기 항-LAG-3 ABD2는 서열 번호 32755번과 32760번, 36819번과 36823번, 36827번과 36831번, 36835번과 36839번, 36843번과 36847번, 36851번과 36855번, 36859번과 36863번, 36867번과 36871번, 36875번과 36879번, 36883번과 36887번, 36891번과 36895번, 36899번과 36903번, 36907번과 36911번, 36915번과 36919번, 36923번과 36927번, 36931번과 36935번, 36939번과 36943번, 36947번과 36951번, 및 36955번과 36959번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는, 이종이합체성 항체.
26. 제20항에 있어서, 상기 항-TIM-3 ABD2는 서열 번호 36508번과 36513번, 35757번과 37591번, 37959번과 37599번, 37603번과 37607번, 37611번과 37615번, 37619번과 37623번, 37627번과 37631번, 37635번과 37639번, 37643번과 37647번, 37651번과 37655번, 37659번과 37663번, 37667번과 37671번, 37675번과 37679번, 37683번과 37687번, 및 37691번과 37695번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는, 이종이합체성 항체.
27. 제21항에 있어서, 상기 항-TIGIT ABD2는 서열 번호 37435번과 37439번, 37443번과 37447번, 37451번과 37455번, 37459번과 37463번, 37467번과 37471번, 37475번과 37479번, 37483번과 37487번, 37491번과 37495번, 37499번과 37503번, 37507번과 37511번, 37515번과 37519번, 37523번과 37527번, 37531번과 37535번, 37539번과 37543번, 37547번과 37551번, 37555번과 37559번, 37563번과 37567번, 37571번과 37575번, 및 37579번과 37583번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는, 이종이합체성 항체.
28. 제22항에 있어서, 상기 항-ICOS ABD2는
    a) 미국 특허출원공개 US2018/0127501호로부터의 서열 목록으로부터의 서열 번호 26323번과 26328번, 27477번과 27452번 및 26353번과 26358번의 쌍;
    b) 도 49에서의 XENCS500의 VH 서열 및 VL 서열;
    c) 도 49에서의 XENCS501의 VH 서열 및 VL 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 이종이합체성 항체.
29. 제23항에 있어서, 상기 항-BTLA ABD2는 서열 번호 20936번과 20941번, 36707번과 36711번, 36715번과 36719번, 36723번과 36727번 및 36761번과 36735번의 쌍으로부터 선택된 서열을 갖는, 이종이합체성 항체.
30. 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함하고, 상기 제1 변이체 Fc 도메인 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 치환 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고; 상기 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 S364K/E357Q를 포함하고, 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 L368D/K370S를 포함하고, 여기서 넘버링은 카밧(Kabat)에서처럼 EU 인덱스에 따르는, 이종이합체성 항체.
31. 핵산 조성물로서,
    a) 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항의 상기 제1 단량체를 암호화하는 제1 핵산;
    b) 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항의 상기 제2 단량체를 암호화하는 제2 핵산; 및
    c) 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항의 상기 경쇄를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물.
32. 발현 벡터 조성물로서,
    a) 제31항의 상기 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
    b) 제31항의 상기 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
    c) 제31항의 상기 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물.
33. 제32항의 발현 벡터 조성물을 포함하는, 숙주 세포.
34. 이종이합체성 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 항체가 발현되는 조건 하에 제33항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
35. 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

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