TWI701042B - 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供與CD3和腫瘤抗原結合之雙專一性抗體及其使用方法。根據特定的實施例，本發明之雙專一性抗體具有降低的效應子功能及具有對Fcγ受體之獨特的結合性質。此雙專一性抗體係經工程化以有效地引發T細胞-媒介殺死腫瘤細胞。根據特定的實施例，本發明係提供雙專一性抗原結合分子，其係包括專一結合人類CD3之第一抗原結合區、專一結合人類CD20之第二抗原結合區及以專一結合的模式結合Fcγ受體之Fc區。在特定的實施例中，本發明之雙專一性抗原結合分子能抑制B-細胞生長或表現CD20之黑色素瘤腫瘤。本發明之雙專一性抗體可用於治療各種癌症以及其他的CD20-相關疾病和病症。

Description

用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
本發明係關於雙專一性抗體、靶向CD20和CD3抗原及殺死腫瘤之方法。本發明亦關於降低及/或控制可由與腫瘤治療之抗體療法有關之Fc結合所產生的效應子功能。
雙靶向抗體策略已應用於其中多因素調節係瞄準改善治療效用的複合疾病。CD20為一表現在成熟B細胞之細胞膜上的非糖基化磷蛋白。CD20被視為B-細胞腫瘤相關抗原，因為有超過95%的B-細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和其他B-細胞惡性腫瘤表現CD20，但其在B-細胞前體、樹突細胞和漿細胞中則無。以CD20為標靶之治療癌症的方法已為本項技術所知。例如，嵌合的抗-CD20單株抗體利妥昔單抗(rituximab)已用於或建議用於治療癌症，例如NHL、慢性淋巴性白血病(CLL)和小淋巴性淋巴瘤(SLL)。咸信抗-CD20抗體係藉由補體依賴的細胞毒性(CDC)、抗體依賴的細胞媒介細胞毒性(ADCC)及/或引發細胞凋亡和對化學治療的敏感性，殺死CD20-表現的腫瘤細胞，雖然某些病患已顯示對抗-CD20治療發生阻抗性或出現不完全反應(例如，對利妥昔單抗具抗性)。
CD3為一表現在與T細胞受體複合物(TCR)有關之T細胞上的同源二聚性或異源二聚性抗原，且為T細胞活化所需。功能性CD3係由四條不同鏈中的二條鏈二聚結合所形成：ε、ζ、δ和γ。能與CD3和 目標抗原，例如CD20結合之雙專一性抗體己被提出作為涉及針對組織和表現目標抗原細胞之T細胞免疫反應的治療用途。
具有CD20-及結合臂和CD3-結合臂之雙專一性抗體可提供增大抗腫瘤活性之必須的相互干擾(crosstalk)。在此雙專一性抗體中的第三形式為Fc區。修改Fc結合性質可進一步增大治療性抗體的抗腫瘤效力。
免疫球蛋白Fc區與其受體的結合產生了各種訊號傳遞及免疫反應。這些各種的「效應子功能」，例如CDC和ADCC，為G類(IgGs)免疫球蛋白在IgG的Fab區和目標抗原之間形成一複合物之結果，然而IgG的Fc區係在效應子細胞上與Fc受體結合。某些IgG的效應子功能係與抗原結合無關並包括例如循環血清量和轉移Ig跨過屏障之能力的功能其他的效應子功能被視為用於免疫球蛋白治療，例如癌症治療所必須。特別是ADCC機制被視為市面上治療性抗體，例如曲妥珠單抗(rastuzumab)(轉移性乳癌)和利妥昔單抗(非何杰金氏淋巴瘤)之主要的抗腫瘤機制之一。
目前的治療策略典型地係建議，降低效應子功能(或降低Fcγ受體結合)對於其目標為中和或抑制抗原之生物活性(例如抗體阻斷劑或拮抗劑)，或活化或觸發下游細胞訊號傳遞(例如抗體促效劑)的抗體可能為有用的。然而，具有降低的效應子功能之腫瘤靶向抗體的設計為違反直覺的，因為預料中降低標靶細胞的細胞毒性對於治療疾病，亦即破壞腫瘤細胞或抑制腫瘤生長將不會有功效。
文中所描述的一策略係利用分化的Fc受體結合與雙專一性抗原專一性結合標靶腫瘤標記組合，以及觸發腫瘤-專一性T細胞致死。抗體的Fc區係設計用以小心控制Fc受體結合，以消除或降低細胞，如帶 有Fc受體之T細胞、中性殺手細胞和巨噬細胞之不欲的死亡。有關包括FcγRII受體結合相互作用，但缺乏FcγRI或FcγRIII相互作用之Fc受體相互作用的獨特結合模式以描述於本項技術中供腫瘤-靶向的Ig治療。
因此，具有降低與Fc受體結合之雙專一性B細胞和T細胞靶向抗體的組合產生意想不到的有利治療性質。與CD3和CD20二者結合之雙專一性抗體特別可用於其中控制以專一性CD20為標靶及有效細胞毒性為所希望之臨床狀況。
在第一方面，本發明係提供結合人類CD3和CD20之具有改變的Fc結合區的雙專一性抗體。根據本發明此方面之抗體可用於，其中包括，以表現CD3之T細胞為標靶，及用於刺激T細胞活化，例如於其中T細胞媒介的毒殺就針對特定細胞類型，例如抗-CD20腫瘤細胞之CD3-媒介T細胞活化的部分雙專一性抗體為有利或所欲的之情況。此等抗體係進一步經工程化，以具有在免疫系統的天然庫中未發現之特定效應子功能。
本發明之例示性抗-CD3/CD20抗體係列於文中的表1至表8中。表1係列出例示的雙專一性抗體之重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)，以及重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2和LCDR3)之胺基酸序列識別碼。表2係列出編碼例示的雙專一性抗體之HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸分子之序列識別碼組合。表3係列出包括HCVR、重鏈恆定區(CH)和LCVR組合之例示雙專一性抗體的胺基酸序列識別碼。表4係列出編碼例示雙專一性抗體之HCVR、重鏈恆定區(CH)和LCVR組合的核酸分子之核酸序列辨識碼組合。
表5係描述本發明之重鏈實例的胺基酸序列辨識碼，其中此雙專一性抗體係包括一HCVR，而該HCVR係包含與本發明CH配對之表5的HCDR1、HCDR2和HCDR3。表6個別地係描述本發明之輕鏈實例的胺基酸序列辨識碼，其中此雙專一性抗體係包括一包含表6之LCDR1、LCDR2和LCDR3的LCVR。
本發明係提供包括一HCVR之抗體或其抗原結合片段，而該HCVR係包括一由表1所列的HCVR胺基酸序列中選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序列相同度之實質上其類似序列。
本發明亦提供包括一LCVR之抗體或其抗原結合片段，而該LCVR係包括一由表1所列的LCVR胺基酸序列中選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序列相同度之實質上其類似序列。
本發明亦提供包括一HCVR和LCVR胺基酸序列對(HCVR/LCVR)之抗體或其抗原結合片段，而該HCVR和LCVR胺基酸序列對係包括一包含在表1所列的例示抗-CD3/CD20抗體中之胺基酸序列對。在特定的實施例，此HCVR/LCVR胺基酸序列對係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：2/18和10/18(例如，抗體1和抗體2)。
本發明亦提供包括一重鏈CDR1(HCDR1)之抗體或其抗原結合片段，而該重鏈CDR1係包括一由表1所列的HCDR1胺基酸序列中選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供包括一重鏈CDR2(HCDR2)之抗體或其抗原結合片段，而該重鏈CDR2係包括一由表1所列的HCDR2胺基酸序列中 選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供包括一重鏈CDR3(HCDR3)之抗體或其抗原結合片段，而該重鏈CDR3係包括一由表1所列的HCDR3胺基酸序列中選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR1(LCDR1)之抗體或其抗原結合片段，而該輕鏈CDR1係包括一由表1所列的LCDR1胺基酸序列中選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR2(LCDR2)之抗體或其抗原結合片段，而該輕鏈CDR2係包括一由表1所列的LCDR2胺基酸序列中選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供包括一輕鏈CDR3(LCDR3)之抗體或其抗原結合片段，而該輕鏈CDR3係包括一由表1所列的LCDR3胺基酸序列中選出之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供包括一HCDR3和LCDR3胺基酸序列對(HCDR3/LCDR3)之抗體或其抗原結合片段，而該HCDR3和LCDR3胺基酸序列對係包括表1所列的HCDR3胺基酸序列與表1所列的任何LCDR3胺基酸序列配對，例如，由SEQ ID NO：8/16(例如，抗體1或抗體2)組成之群中選出的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。
本發明亦提供包括一組六個包含在表1中之CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗體或其抗原結合片段。在特定的實施例中，此HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組為SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24；或12-14-16-20-22-24(例如，抗體1或抗體2)。
在一相關的實施例中，本發明係提供包括一組六個包含在如表1所列的例示性抗體所定義的HCVR/LCVR胺基酸序列對中之CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗體或其抗原結合片段。例如，本發明係包括含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組之抗體或其抗原結合片段，而該胺基酸序列組係包含在由SEQ ID NO：2/18(例如，抗體1或抗體2)組成之群中選出的HCVR/LCVR胺基酸序列對中。用於辨識HCVR和LCVR胺基酸序列中之CDR的方法和技術已為本項技術所熟知並可用於鑑別文中所揭示的特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可用於鑑別CDR界限之例示性習用法包括，例如Kabat定義、Chothia定義和AbM定義。一般而言，Kabat定義係以序列變異性為基準，Chothia定義係以結構環區域之位置為基準，而AbM定義為介於Kabat和Chothia法之折衷。參見，例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。亦可取得公開的資料庫用以鑑別抗體內的CDR序列。
本發明亦提供編碼抗體或其部分之核酸分子。例如，本發明係提供編碼表1中所列的HCVR或LCVR胺基酸序列之核酸分子；在 特定的實施例中，此核酸分子係包括由表2所列的HCVR/LCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的HCDR1或HCDR2或HCDR3胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中，此核酸分子係包括由表2所列的HCDR1或HCDR2或HCDR3核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列的LCDR1或LCDR2或LCDR3胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中，此核酸分子係包括由表2所列的LCDR1或LCDR2或LCDR3核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供編碼HCVR之核酸分子，其中該HCVR係包括一組三個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中該HCDR1-HCDR2-HCDR3胺基酸序列組係如表1所列的例示性抗-CD3抗體所定義。
本發明亦提供編碼LCVR之核酸分子，其中該LCVR係包括一組三個CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中該LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組係如表1所列的例示性抗-CD3抗體所定義。
本發明亦提供編碼HCVR和LCVR二者之核酸分子，其中此HCVR係包括一表1中所列的HCVR胺基酸序列之胺基酸序列，及其中此LCVR係包括一表1中所列的LCVR胺基酸序列之胺基酸序列。 在特定的實施例中，此核酸分子係包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序列相同度之實質上其類似的序列，及由表2所列的LCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其序列相同度之實質上其類似的序列。在根據本發明此方面之特定的實施例中，此核酸分子係編碼HCVR和LCVR，其中該HCVR和LCVR二者係衍生自表1中所列的相同抗-CD3抗體。
本發明亦提供包括重鏈恆定區(CH)之抗體或其抗原結合片段，而該重鏈恆定區(CH)係包括一選自表2所列的CH胺基酸序列之胺基酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供包括一重鏈恆定區(CH)之抗體或其抗原結合片段，而該重鏈恆定區(CH)係由選自表2所列的CH核酸序列之核酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列所編碼。
本發明亦提供能表現包括抗-CD3抗體之重鏈或輕鏈可變區及抗-CD20抗體之重鏈或輕鏈可變區之多肽的重組表現載體。例如，本發明係包括重組的表現載體，該載體係包括任何上文所提之核酸分子，亦即編碼表1和表2中所列的任何HCVR、LCVR及/或CDR序列，及/或CH序列之核酸分子。本發明之範圍亦包括已導入此等載體之宿主細胞，以及藉由在得以產生抗體和抗體片段之條件下培養宿主細胞，並回收所產生的抗體和抗體片段來製造抗體或其部分之方法。
在另一方面，本發明係提供一治療上有效量之專一與CD3和CD20結合的重組人類抗體或其片段，其中該抗體係包括一嵌合的Fc 區及一醫藥上可接受載劑。在一相關的方面，本發明之特徵為組合抗-CD3/CD20抗體和第二治療劑之組成物。在一實施例中，此第二治療劑為任何有利地與抗-CD3/CD20抗體組合之試劑。可有利地與抗-CD3/CD20抗體組合之例示性試劑包括(不限於)結合及/或活化CD3訊號之其他試劑(包括其他抗體或其抗原結合片段等)，及/或不直接與CD3結合然而卻活化或刺激免疫細胞活化作用，或增進腫瘤死亡之試劑。涉及本發明抗-CD3抗體之另外的組合治療及共調配物係揭示於文中的他處。
根據另外的方面，本發明係提供與CD3和一目標抗原結合之雙專一性抗原-結合分子，其中該分子係包括一如文中所述的嵌合Fc區。根據特定的例示性實施例，此雙專一性抗原-結合分子係與CD3和CD20結合；此等雙專一性抗原-結合分子在文中亦稱為「抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子」。抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子之抗-CD20部分係用於以表現CD20之腫瘤細胞(例如B-細胞腫瘤)為標靶，而雙專一性分子之抗-CD3部分係用於活化T-細胞。同時結合腫瘤細胞上的CD20和T-細胞上的CD3，藉由活化的T-細胞和結合嵌合Fc區之效應子細胞的幫助，媒介了定向性殺死標靶的腫瘤細胞(細胞裂解)。本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子因此可用於，其中包括，治療與CD20-表現腫瘤或由其造成的疾病和病症(例如淋巴瘤和黑色素瘤腫瘤)。
本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子進一步係提供消退CD20-陽性腫瘤之方法。本發明因此係於一患者中提供治療B細胞癌症之方法，此方法係包括投予一治療上有效量之本發明抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中該量係足以在患者中降低腫瘤負荷，產生腫瘤消退或降低腫瘤發展。
本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子進一步係提供抑制或消退CD20-陽性(亦即CD20-表現)黑色素瘤之方法。本發明因此係於一患者中提供治療CD20-陽性黑色素瘤之方法，此方法係包括投予一治療上有效量之本發明抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中該量係足以在患者中抑制腫瘤生長，降低腫瘤負荷或降低腫瘤發展。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中治療或改善癌症之用途，其中該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區，而此治療或改善癌症係包括：(a)於患者中抑制腫瘤生長，(b)於患者中媒介B-係胞裂解，(c)於患者中治療B-細胞癌症，(d)於患者中治療CD20表現為陽性的癌症，或(e)於患者中治療CD20-表現的黑色瘤癌症。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中抑制腫瘤生長之用途，其中該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區。在某些案例中，抑制腫瘤生長係包括：(a)於患者中抑制腫瘤生長，(b)於患者中降低腫瘤大小，或(c)於患者中降低腫瘤數目。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中媒介B-細胞裂解之用途，其中該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區。在某些案例中，此B-細胞為前-B淋巴細胞、成熟的B-淋巴細胞，或B-細胞非何杰金氏淋巴癌細胞。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中治療B-細胞癌症之用途，其中該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一 抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區。在某些情況下，此B-細胞癌症係由下列組成之群中選出：濾泡型淋巴癌、B-細胞慢性淋巴性白血病、B-細胞淋巴母細胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、瀰漫型大B細胞淋巴癌、邊緣區淋巴癌、被套細胞淋巴癌、髮樣細胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，該患者係患有對(a)單獨的抗-CD20單專一性治療，或(b)利妥昔單抗單一治療具抗性或不完全反應之腫瘤。在某些案例中，該患者在投予雙專一性抗體之前，係接受一抗-CD20單專一性抗體治療至少1天至1年。在某些案例中，此抗-CD20單專一性治療係包括或由抗-CD20單專一性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單專一性抗體為利妥昔單抗(rituximab)。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中治療B-細胞癌症之用途，其係包括：(a)選擇患有對單獨的抗-CD20單專一性治療具抗性或不完全反應之癌症的患者；及(b)投予該患者一治療量的雙專一性抗體，而該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區。
在某些案例中，此患者係以具有對抗-CD20單專一性治療具阻抗性、難以治療或不完全反應之腫瘤為基準作選擇。在某些案例中，此抗-CD20單專一性治療係包括或由一抗-CD20單專一性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單專一性抗體為利妥昔單抗。在某些案例中，此B-細胞癌為淋巴癌。在某些案例中，此淋巴癌為非何杰金氏淋巴癌(NHL)。在某些案例中，此B-細胞癌為慢性淋巴性白血病(CLL)。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中治療B-細胞癌症之用途，其中該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區，且其中該雙專一性抗體係以足以於患者中降低腫瘤負荷，產生腫瘤消退、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發展之量來給藥。
在某些案例中，此B-細胞癌症係由下列組成之群中選出：濾泡型淋巴癌、B-細胞慢性淋巴性白血病、B-細胞淋巴母細胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、瀰漫型大B細胞淋巴癌、邊緣區淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、髮樣細胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，該患者係患有對單獨的抗-CD20單專一性治療具阻抗性或不完全反應之腫瘤。在某些案例中，該患者係患有對利妥昔單抗單一治療具阻抗性或不完全反應之腫瘤。在某些案例中，該患者在投予雙專一性抗體之前，已接受一抗-CD20單專一性抗體治療至少1天至1年。在某些案例中，此抗-CD20單專一性治療係包括或由一抗-CD20單專一性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單專一性抗體為利妥昔單抗。在某些案例中，足以於患者中降低腫瘤負荷、產生腫瘤消退、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發展之量係介於約0.001mg/kg至約1mg/kg。在某些案例中，足以於患者中降低腫瘤負荷、產生腫瘤消退或降低腫瘤發展之量為約0.4mg/kg。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中治療CD20表現為陽性之癌症的用途，其係包括：(a)選擇患有癌症及/或腫瘤之患者；及(b)從患者中收集一或多個生物樣本；(c)鑑定一或多個樣本中CD20-表現癌症或腫瘤；及(d)投予該患者一治療量之雙專一性抗體，而該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區。
在某些案例中，此患者係以具有對抗-CD20治療具阻抗性、難以治療或不完全反應之癌症或腫瘤為基準作選擇。在某些案例中，此患者係以具有殘存癌症為基準作選擇。在某些案例中，此抗-CD20單專一性治療係包括或由一抗-CD20單專一性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單專一性抗體為利妥昔單抗。在某些案例中，此癌症為淋巴癌或白血病。在某些案例中，此淋巴癌係由下列組成之群中選出：濾泡型淋巴癌、B-細胞淋巴母細胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、瀰漫型大B細胞淋巴癌、邊緣區淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、髮樣細胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，此白血病為B-細胞慢性淋巴性白血病(CLL)。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體用於患者中治療CD20-表現黑色素癌之用途，其係包括投予一治療量之雙專一性抗體，而該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區，其中此量係以足以於患者中降低腫瘤負荷、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發展。
根據本發明之雙專一性抗原結合分子係包括一專一結合人類CD3之第一抗原結合區，一專一結合CD20之第二抗原結合區，以及一嵌合的Fc區。本發明係包括抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子(例如，雙專一性抗體)其中各抗原結合區係包括一重鏈可變區(HCVR)與輕鏈可變區(LCVR)配對。在本發明特定的例示性實施例中，抗-CD3抗原結合區和抗-CD20抗原結合區各包括不同、有區別、與共同LCVR配對之HCVR。例如，如文中實例2所示，建構雙專一性抗體係包括專一結合CD3之第一抗原結合區，其中該第一抗原結合區係包括衍生自抗-CD3抗體之HCVR/LCVR對；及專一結合CD20之第二抗原結合區，其中該第二抗原結合區係包括衍生自抗-CD20抗體之HCVR與衍生自抗-CD3抗體之 LCVR配對(例如，包括在抗-CD3抗原結合區內的相同LCVR)。換言之，在文中所揭示的例示性分子中，來自抗-CD20抗體之HCVR與來自抗-CD3抗體之LCVR的配對，產生專一結合CD20之抗原結合區(但不與CD3結合)。在此等實施例中，第一和第二抗原結合區係包括不同的抗-CD3和抗-CD20 HCVR，但享有共同的抗-CD3 LCVR。
本發明係提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中專一結合CD3之第一抗原結合區係包括表1或表2中所列的任何HCVR胺基酸序列。專一結合CD3之第一抗原結合區亦包括表1或表2中所列的任何LCVR胺基酸序列。根據特定的實施例，專一結合CD3之第一抗原結合區係包括表1或表2中所列的任何HCVR/LCVR胺基酸序列對。本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中專一結合CD3之第一抗原結合區係包括如表1或表2中所列的任何重鏈CDR1-CDR2-CDR3胺基酸序列，及/或如表1或表2中所列的任何輕鏈CDR1-CDR2-CDR3胺基酸序列。
根據特定的實施例，本發明係提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中該專一結合CD3之第一抗原結合區係包括一重鏈可變區(HCVR)，其具有一包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中專一結合CD3之第一抗原結合區係包括一輕鏈可變區(LCVR)，其具有一包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中專一結合CD3之第一抗原結合區係包括一由SEQ ID NO：10/18組成之群中選出的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)胺基酸序列對。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中專一結合CD3之第一抗原結合區係包括一重鏈CDR3(HCDR3)區，其具有一包括SEQ ID NO：16之胺基序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；及一輕鏈CDR3(LCDR3)區，其具有一包括SEQ ID NO：24之胺基序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
在特定的實施例中，此專一結合CD3之第一抗原結合區係包括一包含SEQ ID NO：16/24之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，其中該專一結合CD3之第一抗原結合區係包括一重鏈CDR1(HCDR1)區，其具有一包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；一重鏈CDR2(HCDR2)區，其具有一包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；一輕鏈CDR1(LCDR1)區，其具有一包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；及一輕鏈CDR2(LCDR2)區，其具有一包括SEQ ID NO：22之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明之特定非限定、例示性抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子係包括專一結合CD3之含有 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區的第一抗原結合區，其分別具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：12-14-16-20-22-24。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中該專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一重鏈可變區(HCVR)，其具有SEQ ID NO：2之胺基序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中該專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一輕鏈可變區(LCVR)，其具有SEQ ID NO：18之胺基序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中該專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一輕鏈可變區(LCVR)，其具有SEQ ID NO：75之胺基序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一包含SEQ ID NO：2/18或SEQ ID NO：2/75之HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)胺基酸序列對。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性分子，其中該專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一重鏈CDR3(HCDR3)區，其具有一SEQ ID NO：8之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；一輕鏈CDR3(LCDR3)區，其具有一包括SEQ ID NO：24之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
在特定的實施例中，專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一包含SEQ ID NO：8/24之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，其中該專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一重鏈CDR1(HCDR1)區，其具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；一重鏈CDR2(HCDR2)區，其具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；一輕鏈CDR1(LCDR1)區，其具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列；及一輕鏈CDR2(LCDR2)區，其具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同度之實質上其類似的序列。
本發明之特定非限定、例示性抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子係包括專一結合CD20之含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區的第二抗原結合區，其分別具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24(例如，抗體1或抗體2)。
在一實施例中，本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子係包括一專一結合人類CD3並包括三個重鏈互補決定區(A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3)和三個輕鏈互補決定區(A1-LCDR1、A1-LCDR2、A1-LCDR3)之第一抗原結合區(A1)，以及一專一結合人類CD20並包括三個重鏈互補決定區(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)和三個輕鏈互補決定區(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)之第二抗 原結合區(A2)；其中：(a)A1-HCDR1係包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列；(b)A1-HCDR2係包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(c)A1-HCDR3係包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(d)A1-LCDR1係包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(e)A1-LCDR2係包括SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(f)A1-LCDR3係包括SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(g)A2-HCDR1係包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(h)A2-HCDR2係包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列；(i)A2-HCDR3係包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(j)A2-LCDR1係包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(k)A2-LCDR2係包括SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及(l)A2-LCDR3係包括SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
在一相關的實施例中，本發明係包括抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，其中專一結合CD20之第二抗原結合區係包括一重鏈和輕鏈CDR區，其係包含在SEQ ID NO：2/18之重鏈和輕鏈可變區(HCVR/LCVR)序列內。
在另外方面，本發明係提供編碼文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子之任何HCVR、LCVR或CDR序列的核酸分子，其係包括：包含文中表2、7和8中所列之多核苷酸序列的核酸分子，以及包括二或多個如表2、7和8中所列之多核苷酸序列以其任何功能性組合或排列的核酸分子。攜帶本發明核酸分子之重組的表現載體，和已導入此等載體之宿主細胞亦涵蓋在本發明中，以及藉由在得以產生抗體的條件下培養此等宿主細胞，並回收所產生的抗體來製造抗體之方法，亦涵蓋在本發明中。
本發明係包括抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，其中任何專一結合CD3之前述抗原結合區係與任何專一結合CD20之前 述抗原結合區組合、相連或另外結合，形成一結合CD3和CD20之雙專一性抗原結合分子。
在另外方面，本發明係提供一雙專一性抗體，其係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區，以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區。在一相關方面，此雙專一性抗體能專一與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結合。本發明係提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，其係專一與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結合並顯現對人類FcγRI或人類FcγRIII極小或無結合親和力。在一方面，此雙專一性抗體，如活體外分析所測，能以高於結合人類FcγRIIB、人類FcγRI及/或人類FcγRIII之親和力與專一人類FcγRIIA結合。本發明之雙專一性抗體，如活體外分析所測，能以高於此抗體與人類FcγRI或人類FcγRIII結合之親和力專一與人類FcγRIIA或人類FcγRIIB結合。在某些實施例中，其中與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB二者專一結合之抗體，如活體外分析所測，對各人類FcγRI和人類FcγRIII具有低於1μM KD之結合親和力。
在其他方面，本發明係提供雙專一性抗體，其包括各自包含嵌合Fc區之第一和第二重鏈多肽，其中該第一重鏈多肽係包括一結合人類CD3之抗原結合區，及其中該第二重鏈多肽係包括一結合人類CD20之第二抗原結合區。
在其他的實施例中，如活體外分析所測，此抗體，相對於其結合人類FcγRIIB，係對於人類FcγRIIA具有較高，亦即較強的結合親和力。又在其他的實施例中，此抗體係與人類FcγRIIA結合且如活體外分析所測，相對於其與人類FcγRIIB之結合，係具有較低的KD值。在某些實施例中，此抗體係與FcγRIIA結合，如活體外分析所測，在25℃具有 介於10至30μM之KD值。在某些實施例中，此抗體係與FcγRIIB結合，如活體外分析所測，在25℃具有介於100至250μM之KD值。
在另外的實施例中，此抗體對於人類FcγRI，如活體外分析所測，具有極小或無可偵測的結合親和力。在某些實施例中，此抗體對於人類FcγRIII，如活體外分析所測，具有極小或無可偵測的結合親和力。
在某些實施例中，此活體外分析為表面電漿共振分析。
在某些實施例中，相較於包括野生型Fc區之抗體，此抗體如活體外細胞毒性分析所測，具有降低的抗體-依賴-細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，此抗體具有極輕微或無可偵測的抗體-依賴-細胞毒性(ADCC)。
在某些實施例中，相較於包括野生型Fc區之抗體，此抗體如活體外細胞毒性分析所測，具有降低的補體依賴細胞毒性(CDC)。
在某些實施例中，如於活體外分析藉由測量細胞裂解測得，此抗體具有低於50%細胞毒性。
在某些實施例中，此抗體具有極輕微或無可偵測的補體依賴細胞毒性(CDC)。
在某些實施例中，相較於包括野生型Fc區之抗體，此抗體引發降低的T細胞媒介之殺死帶有Fc受體細胞，例如NK細胞或巨噬細胞。
在特定的實施例中，相較於包括野生型Fc區之抗體，此抗體引發降低的由帶有Fc受體細胞，例如NK細胞或巨噬細胞所媒介之殺死T細胞。
在某些實施例中，如於活體外分析由測量KD所測定，此抗體展現對人類FcγRIIA之結合親和力比其對人類FcγRIIB的結合親和力 更強，該對人類FcγRIIB的結合親和力比該抗體對人類FcγRI的結合親和力更強，該對人類FcγRI的結合親和力比該抗體對人類FcγRIII的結合親和力更強或相當。在其他的實施例中，如活體外分析所測，此抗體具有對人類FcγRIIA>人類FcγRIIB>人類FcγRI>=人類FcγRIII之結合親和力。
在某些實施例中，如於活體外分析由測量KD所測定，此抗體展現對人類FcγRIIA之結合親和力比其對人類FcγRIIB的結合親和力更強，該對人類FcγRIIB的結合親和比此抗體對人類FcγRIII的結合親和力更強，該對人類FcγRIII的結合親和力比此抗體對人類FcγRI的結合親和力更強或相當。在其他的實施例中，如活體外分析所測，此抗體具有對人類FcγRIIA>人類FcγRIIB>人類FcγRIII>=人類FcγRI之結合親和力。
在某些實施例中，此人類FcγRIII為人類FcγRIIIA或人類FcγRIIIB。
在某些實施例中，此嵌合的Fc區係包括一嵌合的絞鏈。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體，其包括一第一抗原結合區、一第二抗原結合區及一嵌合的重鏈恆定(CH)區，其中(a)第一抗原結合區係與CD3結合，(b)第二抗原結合區係與CD20結合。在本發明特定方面，相較於包括野生型CH區之抗體，如活體外分析所測，此嵌合的CH區係以較高，亦即較強的親和力與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結合。又在另外方面，相較於包括野生型CH區之抗體，如活體外分析所測，此嵌合的CH係以較低，亦即較弱或無親和力與人類FcγRI和人類FcγRIII結合。
本發明係提供包括一嵌合絞鏈區之雙專一性抗體。在某些方面，此嵌合絞鏈區係包括來自位置216至236之胺基酸序列殘基(EU編號)。建構本發明之雙專一性抗體，其中該嵌合的絞鏈區係包括來自位置 228至236(EU編號)之人類IgG2下絞鏈胺基酸序列PCPAPPVA(SEQ ID NO：52)。在特定的實施例中，本發明之雙專一性抗體係包括一嵌合的絞鏈及此嵌合絞鏈之上絞鏈部分係包括來自IgG1上絞鏈之位置216至227(EU編號)的胺基酸殘基。在其他的實施例中，本發明之雙專一性抗體係包括一嵌合的絞鏈及此嵌合絞鏈之上絞鏈部分係包括來自IgG4上絞鏈之位置216至227(EU編號)的胺基酸殘基。
在一實施例中，此雙專一性抗體係包括一嵌合的絞鏈胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：53)。在另外的實施例中，此雙專一性抗體係包括一嵌合的絞鏈胺基酸序列ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO：54)。在特定的實施例中，此雙專一性抗體係包括來自位置237至340(EU編號)之人類IgG4 CH2區胺基酸序列。在其他的實施例中，此雙專一性抗體係包括一衍生自人類IgG1 CH3區或人類IgG4 CH3區之CH3區。又在其他的實施例中，此雙專一性抗體係包括一人類IgG1 CH1區及一人類IgG1 CH3區。在更多的實施例中，此雙專一性抗體係包括一人類IgG4 CH1區及一人類IgG4 CH3區。
本發明一方面係提供製造包括一嵌合恆定重鏈區之雙專一性抗體的方法，該方法係包括：(a)以編碼能結合CD3抗原之第一輕鏈的核酸分子轉染宿主細胞，該核酸分子係包括一編碼第一VL區之核苷酸序列和編碼Ig之恆定CL區的核苷酸序列，其中該編碼所選的抗原專一性抗體之VL區的核苷酸序列和該編碼Ig之CL區的核苷酸序列係經操作上連接一起；(b)以編碼能結合CD3抗原之抗體的第一重鏈之核酸分子轉染步驟(a)的宿主細胞，該核酸分子係包括一編碼VH區的核苷酸序列和一編碼人類Ig之嵌合恆定CH區的核苷酸序列，其中該編碼VH區的核苷酸序列和編碼該Ig之CH區的核苷酸序列係經操作上連接一起；其中CH區係 編碼一或多個CH3區內的一或多個胺基酸修飾，其降低或消除了第二CH3區與蛋白A之結合；(c)以編碼能結合CD20抗原之抗體的第二重鏈之核酸分子轉染步驟(a)的宿主細胞，該核酸分子係包括一編碼VH區的核苷酸序列和一編碼人類Ig之嵌合CH區的核苷酸序列，其中該編碼VH區的核苷酸序列和編碼該Ig之CH區的核苷酸序列係經操作上連接一起；及(d)藉由在該宿主細胞中共表現(a)和(b)之核酸分子，製造該抗體。
在一實施例中，本發明係提供一製造雙專一性抗體的方法，其係藉由：(a)以(i)一編碼抗體輕鏈之核酸分子轉染一宿主細胞，其中該核酸分子係包括一編碼包括SEQ ID NO：18之LCVR的核苷酸序列及一編碼Ig之恆定CL區的核苷酸序列，其中該編碼抗體之LCVR區的核苷酸序列係以操作上連接編碼Ig之CL區的核苷酸序列；(b)以(i)一編碼該抗體第一重鏈之核酸分子轉染步驟(a)之宿主細胞，該核酸分子係包括一編碼包括SEQ ID NO：10之HCVR的核苷酸序列及一編碼IgG之嵌合CH區的核苷酸序列，其中該編碼CH區的核苷酸序列係包括編碼SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32之核苷酸序列，其中該編碼HCVR的核苷酸序列係以操作上連接編碼CH區的核苷酸序列；及以(ii)一編碼該抗體第二重鏈之核酸分子轉染步驟(a)之宿主細胞，該核酸分子係包括一編碼包括SEQ ID NO：2之HCVR的核苷酸序列及一編碼IgG之嵌合CH區的核苷酸序列，其中編碼CH區的核苷酸序列係包括編碼SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32之核苷酸序列，其中該編碼HCVR的核苷酸序列係以操作上連接編碼CH區的核苷酸序列；及(c)藉由在該宿主細胞中共表現(a)和(b)之核酸分子，製造此抗體。在某些案例中，此方法進一步係包括培養步驟(b)宿主細胞之步驟，其中此抗體係分泌至細胞培養基中；並從細胞培養基中分離此抗體。
在某些方面，製造雙專一性抗體之方法視需要係包括以編碼能結合CD20抗原之第二輕鏈的核酸分子轉染步驟(a)的宿主細胞，且該核酸分子係包括一編碼第二輕鏈之VL區的核苷酸序列和一編碼Ig之恆定CL區的核苷酸序列，其中該編碼第二輕鏈之VL區的核苷酸序列和該編碼Ig之CL區的核苷酸序列係經操作上連接一起。
在某些實施例中，第一重鏈係包括一包含H95R修飾(IMGT外顯子編號；EU編號為H435R)的CH3區。在另外的實施例中，此第一重鏈區係包括一另外包含一Y96F修飾(IMGT；EU編號為Y436F)之CH3區。在更多的實施例中，此方法係包括使用蛋白分離此抗體。
本發明之另一方面係提供一雙專一性抗體，其包括：(a)一第一重鏈，其包含能辨識和結合第一目標抗原之抗原結合區，(b)一第二重鏈，其包含能辨識和結合第二目標抗原之抗原結合區，及(c)能辨識和結合第一或第二目標抗原之共用的輕鏈抗原結合區，其中(a)或(b)之重鏈或(a)和(b)二者係包括重鏈恆定區(CH)，而該重鏈恆定區(CH)係包括一含有SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54之胺基酸序列的嵌合絞鏈區。
在特定的實施例中，此重鏈恆定區(CH)係包括SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32之胺基酸序列。在某些實施例中，編碼嵌合的CH之核苷酸序列係包括SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33。在其他的實施例中，此嵌合的CH核苷酸序列係編碼SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、or SEQ ID NO：32之胺基酸序列。又在其他的實施例中，CH區之核苷酸序列係包括SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33之編碼胺基酸序列的核苷酸序列。
在特定的方面，此雙專一性抗體係包括一編碼包含SEQ ID NO：35胺基酸序列之輕鏈的核酸分子。在其他方面，此雙專一性抗體係包括一包含SEQ ID NO：34核苷酸序列之輕鏈編碼核酸分子。
在特定的方面，此雙專一性抗體係包括一編碼包含SEQ ID NO：37胺基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙專一性抗體係包括一包含SEQ ID NO：36核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。
在特定的方面，此雙專一性抗體係包括一編碼包含SEQ ID NO：40胺基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙專一性抗體係包括一包含SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。
在特定的方面，此雙專一性抗體係包括一編碼包含SEQ ID NO：42胺基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙專一性抗體係包括一包含SEQ ID NO：41核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。
在特定的方面，此雙專一性抗體係包括一編碼包含SEQ ID NO：44胺基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙專一性抗體係包括一包含SEQ ID NO：43核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。
在另外方面，本發明係提供一治療上有效量之如文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子。在一相關的方面，本發明之特徵為組合抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子和第二治療劑之組成物。在一實施例中，此第二治療劑為任何有利地與抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子組合之試劑。可有利地與抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子組合之例示性藥劑係詳細論述於文中的他處。
又在另一方面，本發明係提供使用本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子用於靶向/殺死表現CD20之腫瘤細胞的治 療方法，其中該治療方法係包括將一治療上有效量之包括本發明抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子的醫藥組成物投予有此需要之患者。在某些案例中，此雙專一性抗原結合分子(例如，抗體)係與表現CD20的人類細胞結合或與人類B-細胞結合。
在另外方面，本發明係提供雙專一性抗體，其中該抗體：係與表現人類CD3之人類細胞和表現獼猴CD3之獼猴細胞結合；係與人類T-細胞或獼猴T-細胞結合；係以介於1x10-12M至1x10-6M之EC50值與CD3-表現的人類T-細胞結合；係以介於1x10-9M至1x10-8M之EC50值與CD3-表現的人類T-細胞結合；係以介於1x10-12M至1x10-6M之EC50值與CD20-表現的人類B-細胞結合；係以介於1x10-9M至1x10-8M之EC50值與CD20-表現的人類B-細胞結合；或促進T-細胞媒介的人類B-細胞毒性，其中該B-細胞對於抗-CD20-媒介的細胞毒性係具阻抗性或難以用抗-CD20-媒介的細胞毒性治療。
在本發明各種方法和用途中，以至少約0.01mg/kg的劑量單一投予雙專一性抗體給病患，在雙專一性抗體投予患者後約2天，造成患者中B-細胞數目降至可偵測量以下。在某些案例中，在以至少約0.01mg/kg雙專一性抗體之單一劑量投予患者後至少直到約7天，B-細胞數目係維持在可偵測量以下。
本發明係包括本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子用於靶向/殺死表現CD20之腫瘤細胞的用途以及於製造醫藥品供治療與CD20表現相關或由其所造成的疾病或病症之用途。在某些案例中，本發明之雙專一性抗體係用於製造醫藥品供於患者中治療或改善癌症，其中該雙專一性抗體係包括一結合人類CD3之第一抗原結合區，一結合人類CD20之第二抗原結合區以及一拴住各第一和第二抗原區之嵌合Fc區， 而此治療或改善癌症係包括：(a)於患者中抑制腫瘤生長，(b)於患者中媒介B-細胞裂解，(c)於患者中治療B-細胞癌症，(d)於患者中治療CD20表現為陽性的癌症，或(e)於患者中治療CD20-表現的黑色瘤癌症。
本發明亦包括一雙專一性抗體，其係包括一第一抗原結合區、一第二抗原結合區及一嵌合的重鏈恆定(CH)區，其中：第一抗原結合區係與CD3結合，第二抗原結合區係與CD20結合，而此嵌合的CH區，相較於包括野生型CH區之抗體，係以較高，亦即較強的親和力與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結合，此雙專一性抗體供用於製造醫藥品。本發明係提供一雙專一性抗體，其包括一結合CD3之第一抗原結合區，一結合CD20之第二抗原結合區，以及一嵌合的CH區，而該嵌合的CH區與人類FcγRIIA結合親和力係高於，亦即強於其與人類FcγRIIB結合，供用於製造醫藥品。
從確認詳細說明之論述中其他的實施例將變得顯而易見。
圖1係說明用於嵌合絞鏈區之結構中的絞鏈胺基酸以及對應的胺基酸編號規則。
圖2係代表人類IgG1重鏈恆定區，包括CH1、絞鏈、CH2和CH3區之胺基酸序列，如UniProtKB中之IGHG1/Swiss-Prot登錄號P01857(SEQ ID NO：45)所述。
圖3係代表人類IgG2重鏈恆定區，包括CH1、絞鏈、CH2和CH3區之胺基酸序列，如UniProtKB中之IGHG2/Swiss-Prot登錄號P01859(SEQ ID NO：46)所述。
圖4係代表人類IgG4重鏈恆定區，包括CH1、絞鏈、CH2和CH3區之胺基酸序列，如UniProtKB中之IGHG4/Swiss-Prot登錄號P01861(SEQ ID NO：47)所述。
圖5A和5B：描述有關Daudi(圖5A)和Raji(圖5B)細胞在具有野生型或嵌合絞鏈區CH之抗體的存在下，缺乏CDC活性之劑量-反應曲線。(「對照」抗體4=含野生型IgG1 CH之雙專一性Ab；抗體1；抗體2；IgG1同型對照組=含野生型IgG1 CH之非專一性Ab)。
圖6A和6B：描述有關Daudi(圖6A)和Raji(圖6B)細胞在具有野生型或嵌合絞鏈區CH之抗體的存在下，缺乏ADDC活性之劑量-反應曲線。(「對照」抗體4=含野生型IgG1 CH之雙專一性Ab；抗體1；抗體2；IgG1同型對照組=含野生型IgG1 CH之非專一性Ab)。
圖7A-7F係顯示以皮下植入Raji腫瘤細胞和PBMC(或無PBMC對照-圖7D)混合物之NSG小鼠，及在腫瘤植入後，投予本發明之CD3xCD20雙專一性抗體(Ab1)或媒劑或對照抗體並在腫瘤植入同一天開始(第0天)治療，及於研究期間所測量之隨時間變化的腫瘤體積(以mm3表示)。圖7A：以媒劑治療並無任何小鼠顯現腫瘤生長抑制；圖7B：以0.4mg/kg對照Ab5(抗-FelD1 Ab)治療，5隻小鼠中有1隻(1/5)顯現腫瘤生長抑制；圖7C：以0.4mg/kg抗體1(Ab1)治療，5/5小鼠顯現腫瘤生長抑制；圖7D：當無PBMC植入及以0.4mg/kg Ab1治療時，0/5小鼠顯現腫瘤生長抑制；圖7E：以0.04mg/kg Ab1治療，5/5小鼠顯現腫瘤生長抑制；及圖7F：以0.004mg/kg Ab1治療，5/5小鼠顯現腫瘤生長抑制。
圖8A和8B係顯示以皮下植入Raji腫瘤細胞和PBMC混合物，並以Ab1(CD3xCD20-嵌合Fc)治療的NSG小鼠，相較於媒劑、有或無IgG添加(圖8A)，或以Ab4(CD3xCD20-wtFc)治療，相較於媒劑、有 或無IgG添加(圖8B)之隨時間變化的腫瘤體積(以mm3表示)。在此模型中添加IgG之二種CD3xCD20雙專一性抗體顯示顯著的腫瘤生長抑制。如圖8A中所見，在此實驗中，有或無添加IgG之CD3xCD20-嵌合Fc雙專一性抗體(Ab1)在試驗的期間顯現完全的腫瘤生長抑制。
圖9係說明在以CD3xCD20雙專一性抗體治療的NSG小鼠中，已建立的腫瘤在第14天消退(~200-400mm3)。NSG小鼠係在治療前15天，以皮係植入Raji腫瘤細胞和PBMC，讓腫瘤建立。隨後以0.4mg/kg抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc抗體)，或0.4mg/kg對照Ab5(抗-FelD1 Ab)或媒劑對照組每週一次(第7天，第14天，第21天)治療小鼠。
圖10係說明在CD3xCD20雙專一性抗體治療的NSG小鼠中，已建立的腫瘤在第21天消退(~500-900mm3)。NSG小鼠係在治療前15天，以皮係植入Raji腫瘤細胞和PBMC，讓腫瘤建立。以0.4mg/kg抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc抗體)或0.4mg/kg對照Ab5(抗-FelD1 Ab)每週一次(第7天，第14天，第21天)治療小鼠。
圖11A和11B係藉由在研究第7天測量獼猴週邊血液中CD20+B-細胞量或CD3+T-細胞量之變化，與單專一性抗體給藥(利妥昔單抗)相比，描繪抗體1和抗體4 CD3xCD20雙專一性抗體給藥之活體內效力。在第0天投予抗體或安慰劑。圖11A：在所有樣本中(安慰劑除外)週邊血液中B-細胞量在第2天顯著衰竭；圖11B：於經雙專一性抗體治療的動物週邊血液中在第2天觀察到T-細胞過渡性喪失並在第4天恢復到基線量。在安慰劑或利妥昔單抗(Rituxan)組中並無觀察到T-細胞喪失(基線以下)。
圖12A和12B係藉由在一長期的研究(3個月)中測量獼猴週邊血液中CD20+B-細胞量或CD3+T-細胞量之變化，描繪抗體1和抗體 4 CD3xCD20雙專一性抗體給藥之活體內效力。在第0天投予1.0mg/kg安慰劑(媒劑)或雙專一性抗體。圖12A：在所有樣本中(安慰劑除外)週邊血液中B-細胞量在第2天顯著衰竭且在研究期間量持續衰竭；圖12B：就經雙專一性抗體治療的動物在第2天觀察到T-細胞過渡性喪失，然後T-細胞在第4天恢復到基線量並維持在大約基線值，如在整個研究期間(>80天)所測。在以安慰劑治療的動物中並無觀察到T-細胞過渡性喪失。
圖13A和13B係藉由在一長期的研究(2個月)中測量獼猴週邊血液中CD20+B-細胞量或CD3+T-細胞量之變化，描繪抗體1和抗體4 CD3xCD20雙專一性抗體低劑量給藥之活體內效力。在第0天投予0.01mg/kg或0.001mg/kg(1μg/kg)的雙專一性抗體。圖13A：週邊血液中B-細胞量在第2天顯著衰竭且在研究期間量持續衰竭，與在經高劑量CD3xCD20雙專一性抗體治療的動物中所觀察到的相類似(亦參見圖11A或12A)；圖13B：以非常低劑量(1μg/kg)雙專一性抗體治療的動物經歷了相同的T-細胞過渡性喪失和恢復，如同在以較高劑量CD3xCD20雙專一性抗體治療的動物中所見到的(亦參見圖11B或12B)。
圖14係顯示經CD3xCD20-嵌合Fc抗體1治療的動物週邊血液中B細胞喪失與抗體消失的相關性。當動物的血液循環中抗體暴露(開符號)隨著時間衰退時，B-細胞群族(實心符號)開始恢復(例如在動物編號I06881第81天所觀察到的(實心符號))。
圖15係顯示經CD3xCD20-嵌合Fc抗體2治療的動物週邊血液中B細胞喪失與抗體消失的相關性。當動物的血液循環中抗體暴露(開符號)隨著時間衰退時，B-細胞群族(實心符號)開始恢復(例如在動物編號I06876第66天所觀察到的(實心三角形)，及動物編號I06877第68天所觀察到的(實心正方形))。
圖16係顯示經CD3xCD20-野生型Fc(Ab 4)雙專一性抗體治療的動物週邊血液中B細胞喪失與抗體消失的相關性。當動物的血液循環中抗體暴露(開符號)隨著時間衰退時，B-細胞群族(實心符號)開始恢復(例如在動物編號I06870第91天所觀察到的(實心符號)，及動物編號I06872第64天所觀察到的(實心正方形))。
圖17A和17B係描述獼猴之脾臟(圖17A)或腸系膜淋巴結(圖17B)中，以更低劑量(0.01至1.0mg/kg劑量)投予雙專一性組投予CD3xCD20雙專一性抗體，與抗-CD20單專一性抗體相比較，所造成的組織B-細胞的衰退。此衰減在安慰劑對照動物組的二種組織中並未見到。二種CD3xCD20雙專一性抗體(Ab1和Ab 4)在淋巴器官中造成劑量依賴的B-細胞衰減，且在劑量等於或大於0.1mg/kg時，此雙專一性抗體比利妥昔單抗更有效地衰減B-細胞。
圖18A和18B係說明在一活體外生物分析中CD3xCD20雙專一性抗體引發人類PBMC(圖18A)或獼猴PBMC(圖18B)之增生，而對照的抗體5(-▲-；不特定於CD3xCD20)並未顯現活性。
圖19A和19B係說明在一細胞毒性分析中CD3xCD20-媒介的Raji標靶致死。抗體1分別以25.0ρM和9.10ρM之人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細胞的代表性EC50值媒介了標靶細胞致死。抗體4分別以15.7ρM和1.73ρM之人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細胞的代表性EC50值媒介了標靶細胞致死。並未觀察到對照組(-▲-)之活性。
圖20A和208B係說明CD3xCD20雙專一性抗體藉由天然的T-細胞，媒介了細胞死亡。圖20A係顯示在抗體4最高試驗濃度時之代表性FACS散佈圖。B16F10.9野生型細胞係以CFDA-SE標定，而B16F10.9/CD20細胞係以Violet Cell Tracker標定。效應子細胞未標定。圖 20A的第二個圖係顯示藉由以抗-CD3xCD20治療消除CD20-表現細胞(四象限的右下)。圖20B係顯示在CD20xCD3抗體，亦即抗體4(野生型Fc)、抗體1(嵌合Fc)或對照Ab 5和PBMC的存在下48小時之後，存活的B16F10.9/CD20細胞比例。存活百分比係藉由將活的細胞群族中B16F10.9/CD20細胞與CD20陰性B16F10.9細胞之百分率作比較所測定。Ab4和Ab1在混合的細胞群族中係專一地僅引導人類T細胞殺死表現CD20的標靶細胞(圖20B)。標靶細胞致死僅在雙專一性抗體的存在下觀察到，其中抗體4(EC50 12.8ρM)和抗體1(EC50 19.5ρM)(圖20B)係以劑量-依賴的方式衰減B16F10.9/CD20細胞。在最高試驗劑量時(10μg/mL)僅有低於5%的CD20-表現細胞存活。
圖21係顯示在以B16F10.9/CD20細胞為標靶的48-小時細胞毒性分析中，來自總CD2+效應子細胞中活化的(CD69+)細胞百分比，此活性作用係由任一CD20xCD3抗體，亦即抗體4(野生型Fc)或抗體1(嵌合Fc)所引發。
圖22A和22B係說明CD3xCD20雙專一性抗體經由其雙專一性結合臂引發T-細胞與標靶細胞(CD20+細胞)之群集。效應子細胞係以CFSE染色而CD20+細胞係以Violet Cell Tracker染色，並以個別的象限控制。在以不相關的對照抗體(對照抗體5)培養後，在細胞混合物中並未出現群集(雙重-染色)(圖22A)。在以CD3xCD20雙專一性抗體(Ab 4)培養後，細胞群集出現，因為其染上CFSE和Violet(參見圖22B散佈圖上左上象限，如以粗黑方框所標出)。
圖23係顯示在以皮下植入Raji腫瘤細胞和PBMC混合物的NSG小鼠中之腫瘤體積(以mm3表示)研究，其中係將0.4mg/kg,2X/週(i.p)之本發明CD3xCD20雙專一性抗體(Ab 1)，0.4mg/kg,2X/週(i.p)之不 相關抗體對照Ab 6，或媒劑與8mg/kg,5X/週(i.p)之抗-CD20抗體利妥昔單抗、5X/週(i.v)之CD19xCD3 BiTE作比較(就CD19xCD3 BiTE，參見Nagorsen D，等人Pharmacol Ther.2012 Dec；136(3)：334一42,2012.)。給予帶有已建立腫瘤(~100-500mm3)的小鼠治療。數據係以平均值(SEM)來表示並用於ANOVA分析。在此活體內模型中，每週i.p.給劑2x之Ab1與5x/週i.v.給劑之CD19xCD3 BiTE效力相當。
圖24係顯示在以皮下植入Raji/PBMC混合物的NSG小鼠中之腫瘤體積(以mm3表示)研究，類似於圖23，然而提供Ab1、對照Ab6、利妥昔單抗和媒劑對照組之ANOVA分析。在抑制已建立的Raji腫瘤上，每週給劑2x之Ab1優於利妥昔單抗治療(以8mg/kg；5x/週i.p.給劑)。
圖25A和25B係說明當治療係與hCD20/B16F10.9腫瘤轉植同時開始或跟隨其後時，在以CD3xCD20雙專一性抗體治療的人源化小鼠中之延遲腫瘤生長。圖25A：將hCD3小鼠以皮下植入hCD20-轉導的B16F10.9黑色素瘤細胞並同時以0.004mg/kg或0.4mg/kg抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc抗體)或4mg/kg對照Ab5(抗-FelD1 Ab)，或媒劑對照組(i.p.每週2次)治療。圖25B：將hCD3小鼠以皮下植入hCD20/B16F10.9黑色素瘤細胞並在第10天治療已建立的腫瘤及之後以抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc抗體)或對照組治療。小鼠係以i.p.每週二次之0.4mg/kg或4mg/kg Ab1，或0.4mg/kg對照Ab5(抗-FelD1 Ab)或媒劑對照組治療。
在描述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。如文中所用，術語「大約」當用於有關特定引述的數值時，係指該值可從該引述值做不大於1%的變化。例如，如文中所用，「約100」一詞包括99和101及所有介於之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在施行或試驗本發明時可使用任何該等與文中所述的方法和物質類似或相當者，但較佳的方法和物質為目前所述。
定義
「CD3」一詞，如文中所用，係指表現在T細胞上作為多分子T細胞受體(TCR)之部分的抗原，且其係由下列四條受體鏈中的二條鏈所形成的同源二聚體或異源二聚體所組成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ及CD3-γ。除非明確地指出係來自非人類物種，否則所有關於文中之蛋白、多肽和蛋白片段希望係指人類版本的各蛋白、多肽和蛋白片段。因此，除非明確地指出係來非人類物種，例如「小鼠CD3」、「猴子CD3」等，否則「CD3」一詞係指人類CD3。
如文中所用，「結合CD3之抗體」或「抗-CD3抗體」包括專一性辨識單一CD3亞單元(例如ε、δ、γ或ζ)之抗體及其抗原結合片段，以及專一性辨識二個CD3亞單元之二聚複合物(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚體)的抗體及其抗原結合片段。本發明之抗體及抗原結合片段可與可溶性CD3及/或細胞表面表現的CD3結合。可溶性CD3包括天然的CD3蛋白以及重組的CD3蛋白變體，例如，缺乏跨膜區或另外不與細胞膜結合之單聚和二聚CD3結構。
如文中所用，「細胞表面-表現的CD3」一詞，係指一或多個CD3蛋白，其在活體內或活體外係表現在細胞表面，使得至少一部 分的CD3蛋白係暴露於細胞膜的胞外側且易接近抗體的抗原結合部分。「細胞表面表現的CD3」包括包含在細胞膜中之功能性T細胞受體環境內的CD3蛋白。「細胞表面表現的CD3」一詞包括表現作為細胞表面上的同源二聚體或異源二聚體(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζ CD3二聚體)之部分的CD3蛋白。「細胞表面表現的CD3」一詞亦包括自我表現，在細胞表面上無其他CD3鏈類型之CD3鏈(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)。「細胞表面表現的CD3」可包括或由表現於正常表現CD3蛋白之細胞表面的CD3蛋白所組成。另外，「細胞表面表現的CD3」可包括或由表現於正常不會表現CD3蛋白在其表面上但經人工工程化表現CD3在其表面上之細胞表面的CD3蛋白所組成。
如文中所用，「抗-CD3抗體」一詞，包括帶有單一專一性之單價抗體，以及包括結合CD3之第一臂及結合第二(目標)抗原之第二臂的雙專一性抗體，其中抗-CD3臂係包括任何如文中表1或表2中所列的HCVR/LCVR或CDR序列。抗-CD3雙專一性抗體之實例係描述於文中之他處。術語「抗原-結合分子」包括抗體和抗體之抗原結合片段，其包括，例如雙專一性抗體。抗-CD3雙專一性抗體之實例亦描述於US 2007/0280945A1中；及2013年9月19日申請的PCT國際申請案號PCT/US13/60511中，其係以全文引用的方式併入本文中。
除非有說明係來非人類物種(例如「小鼠CD20」，「猴子CD20」等)，否則術語「CD20」，如文中所用，係指人類CD20蛋白。人類CD20蛋白具有如NCBI參考序列NP_690605.1之胺基酸序列。
如文中所用，「抗-CD20抗體」一詞包括具有單一專一性之單價抗體，例如Rituxan(利妥昔單抗)，如US 7,879,984所述。例示性抗 -CD20抗體亦描述於US 7,879,984和2013年9月19日申請的PCT國際專利申請案號PCT/US13/60511中，其各自係以引用的方式併入本文中。
術語「抗體」如文中所用，係指包括至少一個與特定抗原(例如CD3)專一結合或相互作用之互補決定區(CDR)的任何抗原結合分子或分子複合物。術語「抗體」係包括：包含藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈，二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈之免疫球蛋白分子(亦即「全抗體分子」)以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)及一重鏈恆定區。此重鏈恆定區係包括三個區，CH1、CH2和CH3。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係包括一個區(CL1)。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為架構區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明不同的實施例中，抗-CD3抗體(或其抗原結合部分)之FR可與人類生殖系序列相同，或經自然或人工修飾。胺基酸共有序列可以二或多個CDR之並排(side-by-side)分析為基準來定義。
術語「抗體」，如文中所用，亦包括全抗體分子之抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原專一性結合形成一複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變區和(視需要)恆定區之DNA操作和表現的重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可容易地從例如市面來源、DNA資料庫(包括，例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可經合成。此DNA可用化學或 藉由使用分子生物技術來定序和操作，例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的組態，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基、修飾、增添或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如區域專一性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區，亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地將包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般應包括與一或多個架構序列相鄰或在其架構內之CDR。在具有VL區與VH區結合之抗原結合片段中，VH和VL區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。另外，抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL區。
在特定的實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個可變區與至少一個恆定片段(Fc)區共價連接或另外與一Fc區拴在一起。術語「拴在一起」係指經由共價鍵、連接子多肽序列直接連接，將二種組份相結合，例如可變區與一恆定區拴在一起。因此，在特定的實例中，包括第一和第二抗原結合區之可變區，例如該等結合CD3和CD20形成一雙專一性抗體者，係經由共價鍵或連接子胺基酸序列各自直接連接(或拴住)，例如(由N-端至C-端)全長或部分CH1、嵌合絞鏈、CH2和CH3區。在本發 明之抗體的抗原結合片段內可發現的可變區和恆定區之非限定、例示性組態包括：(i)VH-CH1-絞鏈-CH2-CH3；(ii)VH-絞鏈-CH2-CH3；(iii)VH-CL；(iv)VL-CH1-CH2-CH3；(v)VL-CH2-CH3；及(vi)VL-CL。在任何可變區和恆定區之組態中，包括上列任何的例示性組態，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由本發明之完整或部分的嵌合絞鏈，或藉由完整或部分的CH1和嵌合絞鏈相連(拴住)。在某些案例中，多肽連接子(例如2至10個胺基酸)可連接(拴住)可變區和Fc區或可包括一帶有完整或部分嵌合絞鏈及/或CH1之另外的連接鏈。絞鏈區可由至少上絞鏈和下絞鏈胺基酸所組成，使其在單一多肽分子中於相鄰的可變及/或恆定區之間產生柔性和半柔性連結。再者，在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單體VH或VL區相連結(例如以雙硫鍵)之任何上列的可變區和恆定區組態之同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。
本發明之多專一性抗體模式，包括文中所揭示的例示性雙專一性抗體，典型地係包括至少二個不同的可變區，其中各可變區能專一與個別的抗原結合。多專一性抗體模式，可使用本項技術中可取得的習用技術來改造，使其適用於本發明抗體之抗原結合片段狀況。
本發明之抗體係經修飾以具有降低或無補體-依賴的細胞毒性(CDC)或抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒性(ADCC)，如活體外所測。「補體-依賴的細胞毒性(CDC)」係指在補體的存在下藉由本發明之抗體裂解抗原-表現細胞。「抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒性(ADCC)」係指細胞媒介的反應，其中表現Fc受體(FcR)之非專一性細胞毒性細胞(例如天然的殺手(NK)細胞、嗜中性細胞和巨噬細胞)辨識出目標細胞上的結合抗體並據此導致目標細胞的裂解。CDC和ADCC可使用本項技術所熟知及可取得的分析來測量。(參見，例如美國專利第5,500,362號和第5,821,337號， 及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗體的恆定區(CH)對於抗體固定補體和媒介細胞-依賴的細胞毒性之能力很重要。因此，抗體之CH可依其是否為抗體媒介細胞毒性所需為基準加以選擇。
在本發明特定的實施例中，本發明之雙專一性抗體為人類抗體。術語「人類抗體」，如文中所用，希望係包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位點專一性突變所導入之突變或活體內體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人類架構序列上之抗體。
本發明之抗體，在某些實施例中可為重組的人類抗體。術語「重組的人類抗體」，如文中所用，希望包括由重組方法，例如使用重組的表現載體轉染至宿主細胞(進一步詳述於下)所製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，由重組的組合人類抗體庫(進一步詳述於下)分離出之抗體，由經轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)分離出的抗體(參見，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列與DNA序列剪接之方法所製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區。然而，在特定的實施例中，此等重組的人類抗體係在活體外經誘發突變(或當使用以人類Ig序列基因轉殖之動物時，為活體內體細胞誘發突變)，且因此重組抗體之VH和VL區的胺基酸序列(當衍生自人類生殖系VH和VL序列或與其有關時)其可能並非天然存在於活體內人類抗體生殖系庫中之序列。
人類抗體可以二種與絞鏈異質性有關之形式存在。第一種形式，包括約150-160kDa之安定的四鏈結構之免疫球蛋白分子，其中此二聚體係藉由鏈間重鏈雙硫鍵聚集一起。第二種形式，二聚體並非經由雙硫鍵相連接且此約75-80kDa之分子係由共價偶合的輕鏈和重鏈(半抗體)所組成。這些形式極難分離，即使在親和純化後。
在各種完整的IgG同型中，第二種形式出現的頻率係因(但不限於)與抗體之絞鏈區同型有關之結構差異所致。在人類IgG4絞鏈之絞鏈區中的單一胺基酸取代可顯著地降低第二種形式出現(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)至典型地使用人類IgG1絞鏈所觀察到的程度。本發明係涵蓋在絞鏈區中具有一或多個突變之抗體，該突變例如在製造上可能為所希望的，用以改善所欲的抗體形式之產率。
本發明之抗體可為分離的抗體。「分離的抗體」，如文中所用，係指經鑑定並從至少一種其天然環境之組成份分離及/或回收之抗體。例如，從至少一種生物體，或從組織或細胞之組成份分離或移出之抗體，其中就本發明之目的，該存在自然界或為自然產生的抗體為一「分離的抗體」。分離的抗體亦包括重組細胞內原位抗體。分離的抗體為歷經至少一純化或分離步驟之抗體。根據特定的實施例，分離的抗體可能實質上無其他細胞物質及/或化學物。
相較於可從其衍生抗體之對應的生殖系序列，文中所揭示的抗-CD3或抗-CD20可變區可在重鏈和輕鏈可變區之架構及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之胺基酸序列與得自，例如公開的抗體序列資料庫之生殖系序列相比較，而容易地確定。本發明包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段，其中在一或多個架構及/或CDR區中的一或多個 胺基酸係突變成衍生抗體之生殖系序列的對應殘基，或另一種人類生殖系序列之對應殘基，或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此等序列之改變在文中共同稱為「生殖系突變」)。本項技術之一般技術者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，V H 及/或V L 區內的所有架構及/或CDR殘基係突變回到衍生此抗體之原始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中發現突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現突變的殘基。在其他的實施例中，一或多個架構及/或CDR殘基係突變成不同生殖系序列之對應殘基(亦即與最初衍生抗體之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發明之抗體在架構及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖系突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖系序列之對應殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦得到後，含有一或多個生殖系突變之抗體和抗原結合片段可容易地檢測其一或多種所欲的性質，例如改善結合專一性、增加結合親和力、改善或增進拮抗或促效性生物性質(視情況而定)、降低致免疫力等。以此通用方法所得到的抗體和抗原結合片段係涵蓋在本發明中。
本發明亦包括抗-CD3或抗-CD20可變區，其係包含任何具有一或多個保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列之變體。例如，本發明包括抗-CD3抗體，其相對於文中表1所述之任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，係具有含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。
術語「表位」係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原上的不同區域結合並可具有不同的生物效應。表位可為構型或線性。構型表位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並列的胺基酸所產生。線性表位係由多肽鏈相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下，表位可包括抗原上的醣類基團、磷醯基或磺醯基。
術語「實質上一致」或「實質上相同」當係指核酸或其片段時，係表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最佳化對齊時，以任何熟知的序列相同度演算法，例如下文所論述的FASTA、BLAST或Gap來測量，有至少約95%，及更佳地至少約96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基具核苷酸序列相同度。與參照核酸分子具有實質上鑲同度的核酸分子，在特定情況下，可編碼一多肽，其與參照核酸分子所編碼的多肽具有相同或實質上類似胺基酸序列。
如應用於多肽，術語「實質上類似」係指二個胜肽序列，當以GAP或BESTFIT程式使用內建缺位權重最佳化對齊時，享有至少95%序列相同度，甚佳地至少98%或99%序列相同度。較佳地，不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白質的功能特性。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中，可調高序列相同度之百分比或類似程度以修正此保守性取代作用之性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2) 脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另外，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250對數概似矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數概似矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列類似性，其亦指序列相同度，典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如，GCG軟體含有例如Gap和Bestfit程式，其可使用內定參數，測定密切相關的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間之序列同源性或序列相同度。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內定或建議參數，一種GCG Version 6.1內的程式，作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。當本發明序列與含有較大量來自不同生物體的序列資料庫作比較時，另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
雙專一性抗原-結合分子
本發明之抗體可為雙專一性或多專一性。多專一性抗體可對一目標多肽之不同的表位具專一性或可含有對一個以上的目標多肽具專一性之抗原結合區。參見，例如Tutt等人，1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人，2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明之抗-CD3xCD2抗體可與另外的功能分子，例如另外的胜肽或蛋白相連結或共表現。例如，抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體，例如另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他)，產生帶有另外的結合專一性之雙專一性或多專一性抗體。
因此，本發明係包括雙專一性抗體，其中免疫球蛋白之一臂係與人類CD3結合，而免疫球蛋白之另一臂係對一目標抗原具專一性。與CD3雙專一性抗體之另一臂結合的目標抗原可為任何表現在細胞、組織、器官、微生物或病毒上或在其鄰近地區之抗原，而對抗此抗原的標靶免疫反應為所欲的。CD3-結合臂可包括如文中表1所列之任何HCVR/LCVR或CDR胺基酸序列。
在其中抗體的一臂係與CD3結合而另一臂係與目標抗原結合之本發明雙專一性抗體的情況下，此目標抗原可為一腫瘤相關的抗原。專一性腫瘤-相關抗原之非限定實例包括，例如AFP、ALK、BAGE蛋白、BIRC5(survivin)、BIRC7、β-連環蛋白(β-catenin)、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、cyclin-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如，GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例 如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、間皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Thompson-nouvelle抗原(Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶及uroplakin-3。
在其中抗體的一臂係與CD3結合而另一臂係與目標抗原結合之本發明雙專一性抗體的情況下，此目標抗原可為一感染性疾病-相關的抗原。感染性疾病-相關的抗原之非限定實例包括，例如表現在病毒顆粒表面上，或優先表現在經病毒感染的細胞上之抗原，其中該病毒係由下列組成之群中選出：HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、埃-巴病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、伊科病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒疹、冠狀病毒、呼吸道融合瘤病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、微小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革熱病毒、乳突病毒、軟疣病毒、小兒麻痺病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。另一種選擇，目標抗原可為表現在細菌表面，或優先表現在經細菌感染的細胞上之抗原，其中該細菌係由下列組成之群中選出：衣原體(chlamydia)、立克次體(rickettsia)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎雙球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)、淋病球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、退伍軍人菌(legionella)、白喉菌(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂菌(cholera)、破傷 風菌(tetanus)、肉毒桿菌(botulism)、炭疽病菌(anthrax)、瘟疫菌(plague)、鉤端螺旋體(leptospira)及萊姆病菌(Lyme disease bacteria)。在特定的實施例中，此目標抗原可為表現在真菌表面，或優先表現在經真菌感染的細胞上之抗原，其中該真菌係由下列組成之群中選出：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Crytococcus neoformans)、麹菌(Aspergillus)(煙麴黴菌(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴目(毛黴屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizopus)等)、申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。在特定的實施例中，此目標抗原可為表現在寄生蟲表面，或優先表現在經寄生蟲感染的細胞上之抗原，其中該寄生蟲係由下列組成之群中選出：痢疾阿米巴原蟲(Entamoeba histolytica)、結腸小袋絛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格裡變形蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴原蟲(Acanthamoeba sp.)、梨型鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium sp.)、陰道毛滴蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、果氏巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、枯西氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓漿蟲(Toxoplasma gondii)、巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)、狐絛蟲(Taenia crassiceps)及馬來血絲蟲(Brugia malayi)。特異性病原-相關抗原之非限定實例包括，例如HIV gp120、HIV CD4、B型肝炎糖蛋白L、B型肝炎糖蛋白M、B型肝炎糖蛋白S、C型肝炎E1、C型肝炎E2、肝細胞特異性蛋白、單純疱疹病毒gB、巨細胞病毒gB及HTLV胞膜蛋白。
根據特定例示性實施例，本發明包括專一與CD3和CD20結合之雙專一性抗原結合分子。此等分子在文中可稱為，例如「抗-CD3/抗-CD20」或「抗-CD3/CD20」，或「抗-CD3xCD20」或「CD3xCD20」雙專一性分子，或其他類似術語。
如文中所用，「抗原結合分子」一詞係指與特定抗原專一結合之包括或包含至少一個互補決定區(CDR)單獨或與一或多個另外的CDR及/或架構區(FR)組合之蛋白、多肽或分子複合物。在特定的實施例中，抗原結合分子為一抗體或抗體之片段，如該等術語於文中他處所定義。
如文中所用，「雙專一性抗原結合分子」一詞係指包括至少一第一抗原結合區和一第二抗原結合區之蛋白、多肽或分子複合物。與特定抗原專一結合之雙專一性抗原結合分子內的各抗原結合區係包括至少單獨一個CDR或與一或多個另外的CDR及/或FR組合。在本發明內文中，第一抗原結合區係與第一抗原(例如CD3)專一結合，而第二抗原結合區係與第二，不同的抗原(例如CD20)專一結合。
在本發明特定的例示性實施例中，此雙專一性抗原結合分子為一雙專一性抗體。雙專一性抗體之各抗原結合區係包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)。就包括第一和第二抗原結合區之雙專一性抗原結合分子(例如雙專一性抗體)之情況，第一抗原結合區的CDR可以字首「A1」來定名，而第二抗原結合區之CDR可以字首「A2」來定名。因此，第一抗原結合區之CDR在文中可稱為A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3；而第二抗原結合區之CDR在文中可稱為A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3。
第一抗原結合區和第二抗原結合區可直接或間接彼此相連形成本發明之雙專一性抗原結合分子(亦即雙專一性ScFv)，進一步與Fc區結合。另一種選擇，第一抗原結合區和第二抗原結合區可各自與個別的Fc區連接。本發明之雙專一性抗原結合分子典型地將包括二個Fc區，其為個別抗體重鏈之各個別部份。除了在CH3區具有一突變用來幫助或使異源二聚體(亦即雙專一性)分子容易純化外，第一和第二Fc區可為相同的序列。
本發明包括包含第一CH3區及第二Ig CH3區之雙專一性抗原結合分子，其中第一和第二Ig CH3區至少有一胺基酸互不相同，且相較於無此胺基差異之雙專一性抗體，其中至少一胺基酸之差異降低了雙專一性抗體與蛋白A之結合。在一實施例中，第一Ig CH3區結合蛋白A而第二Ig CH3區含有降低或消除蛋白A結合之突變，例如H435R修飾(EU編號；IMGT外顯子編號為H95R)。第二CH3可進一步包括Y436F修飾(EU編號；IMGT為Y96F)。在第二CH3中可發現的另外修飾作用，就IgG1 CH3區之情況而言係包括：EU編號D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I(IMGT為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I)；及就IgG4 CH3區之情況為EU編號Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I(IMGT為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I)。
其他雙專一性抗體格式或技術可用來製造本發明之雙專一性抗原結合分子。例如具有第一抗原結合專一性之抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體，例如具有第二抗原結合專一性之另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他)，產生一專一性抗原結合分子。可用於本發明內文中之特定例示性雙專一性模 式包括(不限於)，例如scFv-為基礎或雙抗體雙專一性模式、IgG-scFv融合、雙可變區(DVD)-Ig、細胞雜交瘤(Quadroma)、knobs-into-holes、共同輕鏈(例如帶有knobs-into-holes之共同輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉鏈、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG和Mab2雙專一模式(參見，例如Klein等人2012,mAbs 4：6,1-11及文中所引述的參考文獻，作為前述模式之審視)。
在本發明之雙專一性抗原結合分子的情況下，相較於無改變所欲功能之特定嵌合版本的Fc區，此Fc區可包括一或多個胺基酸變化(例如插入、刪除或取代)。例如，本發明係包括在Fc區中包含一或多個修飾，造成經修飾的Fc區在Fc和FcRn之間具有修飾的結合交互作用(例如促進或減少)之雙專一性抗原結合分子。在一實施例中，此雙專一性抗原結合分子係包括CH2或CH3區中之修飾，其中該修飾增加了酸性環境中Fc區對FcRn之親和力(例如在其中pH範圍從約5.5至約6.0的核內體中)。此等Fc修飾之非限定實例包括，例如位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)之修飾；或位置428及/或433(例如L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)之修飾；或位置250及/或428之修飾；或位置307或308(例如308F、V308F)和434之修飾。在一實施例中，此修飾包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾(例如T250Q和M428L)；及307及/或308修飾(例如308F或308P)。
序列變體
相較於可從其衍生個別的抗原結合區之對應的生殖系序列，本發明之抗體和雙專一性抗原結合分子可在重鏈和輕鏈可變區之架構及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之胺基酸序列與得自，例如公開的抗體序列資料庫之生殖系序列相比較，加以容易地確定。本發明之抗原結合分子可包括由任何文中所揭示的例示胺基酸序列所衍生之抗原結合區，其中在一或多個架構及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成從其衍生抗體之生殖系序列的對應殘基，或另一種人類生殖系序列之對應殘基，或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此等序列之改變在文中共同稱為「生殖系突變」)。本項技術之一般技術者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，V H 及/或V L 區內的所有架構及/或CDR殘基係突變回到從其衍生此抗原結合區之原始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中發現突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現突變的殘基。在其他的實施例中，一或多個架構及/或CDR殘基係突變成不同生殖系序列之對應殘基(亦即與最初從其衍生抗原結合區之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發明之抗原結合區在架構及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖系突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖系序列之對應殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦得到後，含有一或多個生殖系突變之抗原結合區可容易地檢測其一或多種所欲的性質，例如改善結合專一性、增加結合親和力、改善或增進拮抗或促效性生物性質(視情況而定)、降低致免疫力等。以此通用方法所得 到之包括一或多個抗原結合區的雙專一性抗原結合分子係涵蓋在本發明內。
本發明亦包括抗原結合分子，其中一或二個抗原結合區係包含任何具有一或多個保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明係包括包含抗原結合區之抗原結合分子，其具有相對於文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，係帶有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上並不會改變蛋白質的功能特性。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另外，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250對數概似矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數概似矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列類似性，其亦稱為序列相同度，可使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似性度量值配出類似的序列。例如，GCG軟 體含有例如Gap和Bestfit程式，其可以內定參數用於測定密切相關的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或介於野生型和其突變蛋白之序列同源性或序列相同度。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內定或建議參數，GCG Version 6.1內的程式來作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。當本發明序列與含有較大量來自不同物種的序列資料庫作比較時，另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402)。
pH-依賴結合
本發明包括具有pH-依賴結合特性之抗-CD3/抗-CD20抗體雙專一性抗原結合分子。例如，本發明之抗-CD3抗體在酸性pH時，相較於中性pH，可能出現與CD3結合降低。另外，本發明之抗-CD3抗體在酸性pH時，相較於中性pH，可能出現與CD3結合增加。「酸性pH」一詞係包括低於約6.2之pH值，例如約6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低。如文中所用，「中性pH」一詞係指約7.0至約7.4之pH。「中性pH」一詞係包括約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4之pH值。
在特定的情況下，「相較於中性pH，在酸性pH時.....結合降低」係藉由在酸性pH時抗體與其抗原結合之KD值和在中性pH時抗體與其抗原結合之KD值的比率(或反之亦然)來表示。例如，抗體或其抗原結合片段在酸性pH時，相較於中性pH，就本發明之目的，若抗體或其 抗原結合片段出現約3或更大之酸性/中性KD比率，可能被視為出現與CD3結合降低。在特定的例示性實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段的酸性/中性KD比率可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
具有pH-依賴結合特性之抗體可，例如藉由在酸性pH時，相較於中性pH，針對與特定抗原之結合降低(或提高)，篩選一抗體群組來取得。另外，胺基酸層級之抗原結合區的修飾作用可能產生具有pH-依賴結合特性之抗體。例如，藉由將一或多個抗原結合區的胺基酸(例如在CDR內)以組胺酸殘基取代，可得到相對於中性pH，在酸性pH時具有抗原結合降低之抗體。
Fc受體結合
係提供包括一嵌合的Fc區之本發明抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子及抗體，該嵌合的Fc區，例如係衍生自不同IgG同型及具有有關Fc受體結合和活化之獨特性質的Ig重鏈之絞鏈-CH2-CH3恆定區。本發明之特定的Fc區係經工程化以包括一嵌合的絞鏈。
術語「嵌合的」如文中所用，係指由不同來源之部份所組成。「嵌合蛋白」一詞包括第一胺基酸蛋白連接第二胺基酸蛋白，其並非天然正常地連接。胺基酸序列一般可以個別的蛋白存在或以不同的排列存在相同的蛋白上，並以新的排列共同聚集於一融合多肽中。嵌合蛋白可藉由各種本項技術已知的方法來製造，例如藉由化學合成或藉由製造一編碼此嵌合蛋白(以所欲的排列)之胺基酸的多核苷酸。例示的嵌合蛋白包括連 接IgG之重鏈區的嵌合絞鏈序列，以及經工程化用以製造本發明之人類抗體和抗原結合蛋白的融合蛋白。
文中所揭示的嵌合蛋白係設計用來最小化接合點中致免疫表位的產生，例如相較於野生型IgG Fc區。本發明之工程化蛋白因此具有降低的致免疫性，並對Fc受體展現降低的結合，以及不會降低對效應子功能。
術語「絞鏈」如文中所用，希望係包括連接免疫球蛋白之CH1區C端與CH2區N-端之連續的胺基酸殘基區。由CH2外顯子所編碼之CH2區N-端的數個胺基酸，亦視為「下絞鏈」之部份。不受限於理論，IgG1、IgG2和IgG4之絞鏈區的胺基酸經定性為包括由不同絞鏈外顯子所編碼之12-15個連續胺基酸，及數個CH2區之N端胺基酸(由CH2外顯子所編碼)(Brekke,O.H.，等人Immunology Today 16(2)：85-90(1995))。在另一方面，IgG3係包括由四個部份所組成之絞鏈區：1個與IgG1之絞鏈區相似的上絞鏈部份及3個IgG3特有的相同胺基酸重複之部份。
術語「嵌合絞鏈」如文中所用，希望係包括一包含衍生自一Ig分子之絞鏈區的第一胺基酸序列和衍生自不同種類或亞類Ig分子之絞鏈區的第二胺基酸序列。本發明之例示性嵌合絞鏈包括一衍生自人類IgG1絞鏈區或人類IgG4絞鏈區之第一胺基酸序列或「上絞鏈」，及一衍生自人類IgG2絞鏈區之第二胺基酸序列或「下絞鏈」。在特定的實施例中，第一或「上絞鏈」序列係包括來自EU編號之位置216至227的胺基酸殘基。在某些實施例中，此第二或「下絞鏈」序列係包括來自EU編號之位置228至236的胺基酸殘基。
就本揭示文之目的，「上絞鏈」區希望係包括EU編號之位置216至227的胺基酸殘基(Kabat編號為位置226至240之胺基酸殘 基)(參見圖1)。「下絞鏈」區希望係包括EU編號之位置228至236的胺基酸殘基(Kabat編號為位置241至2499之胺基酸殘基)(參見圖1)。
為了本發明施行者之方便，在本揭示文中，人類IgG1、IgG2和IgG4之絞鏈區的胺基酸在本文中已藉由Kabat之EU編號系統標出(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版.US Department of Health and Human Services,NIH publication No.91-3242(1991))，亦稱為「EU編號」或「EU索引」，如根據IMGT® Scientific Chart,IMGT®,the international ImMunoGeneTics information system®,http：//www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html最近更新，創立：200年5月17日，最近更新2013年1月10日。
就人類IgG1、IgG2和IgG4絞鏈胺基酸之EU編號和IMGT獨特區域編號，IMGT外顯子編號，以及Kabat編號慣例(亦參見Kabat,E.A.等人，1991，前文)之間的對應性係描述於下表A至F中：
Figure 104108403-A0202-12-0055-1
Figure 104108403-A0202-12-0056-2
Figure 104108403-A0202-12-0056-3
Figure 104108403-A0202-12-0056-4
Figure 104108403-A0202-12-0056-5
Figure 104108403-A0202-12-0056-6
Figure 104108403-A0202-12-0057-7
Figure 104108403-A0202-12-0057-8
 由外顯子剪接所形成的胺基酸係如括弧中所示。-係指無對應的編號提出--係指在此位置為對應的胺基酸a根據最近更新的IMGT Scientific Chart編號b根據如Kabat,EA，等人1991中所提出的EU索引編號亦參見，例如Lefranc,M.-P.等人，Devel Comp Immunol,29,185-203(2005)；及Edelman,G.M.等人PNAS USA,63：78-85(1969)。
術語「結合」就抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白與例如預先確定的抗原或與FcγR結合之情況，典型地係指最少二個實體或分 子結構之間的相互作用或結合，例如抗體-抗原相互作用或含Fc-蛋白對FcγR。
例如，結合親和力，當例如以表面電漿共振(SPR)技術於BIAcore 3000儀器中使用抗原或作為配體及以抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白作為分析物(或抗配體)來測定時，典型地係相當於約10-7M或更低，例如約10-8M或更低，例如約10-9M或更低之KD值。因此，抗體或其他結合蛋白與預先決定的抗原或受體係以相當於比其與非專一性抗原(例如BSA、酪蛋白)結合之親和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少100,000倍之KD值結合。
術語「KD」(M)，如文中所用，係指特定的抗體-抗原相互作用之裂解平衡常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白與FcγR之裂解平衡常數。KD和結合親和力之間具有逆相關性，因此較小的KD值，較高的，亦即較強的親和力。因此，術語「較高的親和力」或「較強的親和力」係關於較高形成相互作用的能力且因此為較小的KD值，而反之，術語「較低的親和力」或「較弱的親和力」係關於較低形成相互作用的能力且因此為較大的KD值。在某些情況下，特定分子(例如抗體)與其相互作用的夥伴分子(例如受體X)之較高的結合親和力(或KD)，相較於此分子(例如抗體)與另外的夥伴分子(例如受體Y)之結合親和力，可以較大KD值(較低或較弱親和力)除以較小KD(較高或較強親和力)所測定的結合比率來表示，或例如以大於5-倍或10-倍的結合親和力來表示，視情況而定。
術語「Kd」(sec-1或1/s)，如文中所用，係指特定的抗體-抗原交互作用之裂解速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白與FcγR之裂解速率常數。
術語「Ka」(M-1 x sec-1或1/M)，如文中所用，係指特定的抗體-抗原交互作用之結合速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白與FcγR之結合速率常數。
術語「KA」(M-1或1/M)，如文中所用，係指特定的抗體-抗原交互作用之結合平衡常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白與FcγR之結合平衡常數。結合平衡常數係由ka除以kd所得來。
術語「EC50」或「EC50」，如文中所用，係指半數最大有效濃度，其包括引發基線至一特定暴露時間後最大量間之半數反應的抗體濃度。EC50基本上係代表其中觀察到50%之其最大效用的抗體濃度。因此，隨著EC50或半數最大有效濃度值增加，會觀察到結合降低。
在一實施例中，結合降低可定義為：能與半數最大量之目標細胞結合的EC50抗體濃度增加。
在某些實施例中，細胞毒性活性，例如ADCC或CDC降低，可定義為能裂解半數最大量目標細胞之EC50抗體濃度增加。細胞毒性測定為細胞毒性百分比，或裂解百分比其為在一鈣黃綠素(calcein)釋放分析中觀察到裂解的總細胞群族之分量。細胞毒性百分比可如實例6中所述來測量。
在其他的實施例中，增生降低可定義為使半數最大量目標細胞增生之EC50抗體濃度增加。
「效應子功能」一詞，如文中所用，希望係包括由含Fc-蛋白因與FcγR結合所賦予的功能性能力。不受限於理論，Fc/FcγR複合物之形成招募了各種效應子細胞至結合抗原的位置，典型地在細胞內產生種種的訊號傳遞事件及重要的後續免疫反應。
本發明之含嵌合Fc抗原結合蛋白及抗體，相較於對應的含野生型Fc抗原結合蛋白或抗體，展現改變或降低的效應子功能，參見，例如2014年8月7日公開的PCT公開案號WO 2014/121087，其係以全文引用的方式併入。
在某些實施例中，降低或改變的效應子功能為一細胞毒性效應子功能，例如細胞毒性、補體-依賴細胞毒性(CDC)或抗體-依賴細胞毒性(ADCC)。在一實施例中，此降低或改變的效應子功能為補體-依賴細胞毒性(CDC)。在另外的實施例中，此降低或改變的效應子功能為抗體-依賴細胞毒性。在其他的實施例中，此降低或改變的效應子功能為目標細胞之細胞增生。
數種抗體效應子功能至少部份係由在特定免疫球蛋白的恆定區中(特別是CH2和CH3區)與抗體的Fc區結合之Fc受體(FcRs)所媒介。有許多對不同種類的免疫球蛋白，亦即IgG、IgE、IgA、IgM和IgD具專一性之Fc受體。人類IgG Fc受體家族係分成三組：FcγRI(CD64)，其能以高親和力與IgG結合，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)二者為低親和力受體。各FcγR亞類係由二或三個基因所編碼，及替代的RNA剪接導致多重轉錄，因此有廣泛多樣性FcγR同型存在(例如FcγRIA(CD64；FCGR1A)，FcγRIB(CD64；FCRG1B)，FcγRIIA(CD32A；FCGR2A)，FcγRIIB(CD32B；FCGR2B)，FcγRIIC(CD32C；FCGR2C)，FcγRIIIA(CD16a；FCGR3A)和FcγRIIIB(CD16b；FCGR3B))。另外，FcRn或新生兒Fc受體(亦稱為Fc受體轉運子，α或FCGRT)能經由胎盤將IgG抗體從母體轉移到胎兒。再者，Fc受體係表現在各種細胞，包括，例如B細胞、單核細胞、樹突細胞、嗜中性細胞及特定的淋巴細胞。例如，U937細胞，一種人類單核細胞株係表現FcγRI和FcγRIIA二者(參見，例如Jones，等人J Immunol 135(5)：3348-53(1985)；及Brooks，等人J Exp Med 170：1369-85(1989年10月))。文中所指的各受體，包括任何已知功能形式的受體，其包括轉錄變體、同型和多形物。
Ig Fc與其受體結合將這些效應子細胞帶到結合抗原的位置，最後產生各種訊號傳遞和免疫反應，包括B細胞活化、發炎反應、細胞毒性反應和吞噬細胞反應。如此一來，Ig Fc與其受體之降低或改變的結合可能造成效應子功能降低。
「抗體-依賴的細胞吞噬作用」或「ADCP」一詞係關於藉由吞噬目標細胞而非引發細胞毒性來消除(或殺死)目標細胞之效應子功能。ADCP可能為活體內殺死腫瘤標之一重要的機制。ADCP可藉由雙色螢光流式細胞儀方法來測量，例如利用，例如PKH2(綠色螢光染劑)及藻紅素-接合的(紅色)單株抗體對抗不同的細胞表面表面蛋白，用以分化受檢測細胞之方法，從而測定吞噬細胞活性及吞噬作用的速率。ADCP測量已為本項技術所熟知。相對於FcγRIIB選擇性FcγRIIA活化之治療策略可能增進巨噬細胞吞噬活性(Richards,JO，等人2008 Mol Cancer Ther 7(8)：2517-27)。本發明之含嵌合的Fc區抗原結合蛋白和抗體係結合及活化人類FcγRIIA。在特定的情況下，本發明之抗原結合蛋白和抗體係以高於此抗體結合FcγRIIB之親和力與人類FcγRIIA結合。在某些實施例中，此抗體展現對人類FcγRIIA之親和力係比此抗體與人類FcγRIIB之結合親和力強約5-倍，此親和力值係以KD表示。在其他的實施例中，此抗體展現對人類FcγRIIA之親和力係比此抗體與人類FcγRIIB之結合親和力強約6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-或20-倍。
抗體和雙專一性抗原結合分子之生物特性
本發明係包括與人類CD3和CD20結合之抗體及其抗原結合片段。例如，本發明包括以低於約60nM之EC50值與Jurkat細胞(CD3+)和Raji細胞(CD20+)結合之抗-CD3xCD20抗體，如藉由活體外結合分析，例如使用文中實例3所定義的分析模式(例如評估抗-CD3xCD20抗體與Jurkat細胞或Raji細胞之結合)或實質上類似的分析所測量。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如藉由活體外結合分析，例如使用文中實例4所定義的分析模式或實質上類似的分析所測量，係以低於約75nM，低於約70nM，低於約65nM，低於約60nM，低於約50nM，低於約40nM，低於約30nM，或低於約25nM之EC50值與細胞(例如Jurkat細胞及/或Raji細胞)表面的CD3或CD20結合。
本發明包括能同時結合人類CD3和人類CD20之雙專一性抗原結合分子(例如，雙專一性抗體)。根據特定的實施例，本發明之雙專一性抗原結合分子係專一與表現CD3及/或CD20之細胞相互作用。雙專一性抗原結合分子與表現CD3及/或CD20之細胞結合的程度可藉由螢光活化的細胞分類(FACS)，如文中實例中所示來評估。例如，本發明係包括專一結合表現CD3之人類T-細胞株(例如Jurkat)、表現CD20之人類B細胞株(例如Raji)及靈長類T細胞(例如獼猴週邊血液單核細胞[PBMC])之雙專一性抗原結合分子。本發明係包括，如使用實例4中所述的FACS分析或實質上類似的分析所測量，以從約8.74 x10-6至約5.99 x10-8或更低之EC50值與任何前述細胞及細胞株結合之雙專一性抗原結合分子。
本發明亦包括與人類CD3結合及引發T-細胞媒介的殺死腫瘤細胞之抗體及其抗原結合片段。例如，本發明係包括抗-CD3xCD20抗體，其如活體外T-細胞媒介的殺死腫瘤細胞分析，例如使用文中實例5中所定義的分析模式(例如在抗-CD3抗體的存在下評估Raji腫瘤細胞被人 類PBMC殺死之程度)或實質上類似的分析所測量，係以低於約60pM之EC50值引發T-細胞媒介的殺死腫瘤細胞。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如活體外T-細胞媒介的殺死腫瘤細胞分析，例如使用文中實例5中所定義的分析模式或實質上類似的分析所測量，係以低於約56pM，低於約50pM，低於約45pM，低於約40pM，低於約35pM，低於約30pM，低於約25pM，低於約20pM，低於約15pM，低於約10pM，低於約5pM，或低於約1pM之EC50值引發T-細胞媒介的殺死腫瘤細胞(例如PBMC-媒介的殺死Raji細胞)。
本發明亦包括與人類CD3/CD20結合及引發補體-依賴的細胞毒性(CDC)之抗體及其抗原結合片段，雖然比具有野生型IgG Fc區之抗體在程度上效低。例如，本發明包括，如活體外T-細胞媒介的腫瘤細胞致死分析，例如使用文中實例6中所定義的分析模式(例如，在補體及抗-CD3xCD20抗體的存在下，評估殺死目標細胞(Raji或Daudi)的程度)或實質上類似的分析所測量，以低於約50%之細胞毒性百分比(%細胞毒性或%係胞裂解)引發CDC殺死Raji或Daudi(CD20-表現)細胞之抗-CD3xCD20抗體。在特定的實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段，如活體外補體-媒介的細胞致死分析，例如使用文中實例6中所定義的分析模式或實質上類似的分析所測量，係以低於約45%，低於約40%，低於約35%，低於約30%，低於約25%，低於約20%，低於約15%，低於約10%，低於約5%，低於約1%之細胞毒性百分比，低於背景細胞毒性或無可偵測的細胞毒性，引發CDC細胞致死(例如補體-媒介的殺死Raji或Daudi細胞)。
本發明亦包括與人類CD3/CD20結合，而相較於具有野生型IgG Fc區的抗體，不會顯著引發抗體-依賴的細胞媒介細胞毒性(ADCC)之抗體及其抗原結合片段。例如，本發明係包括，如活體外NK細胞媒介 的細胞致死分析，例如使用文中實例7中所定義的分析模式(例如，在NK細胞及抗-CD3xCD20抗體的存在下，評估目標細胞致死(Raji或Daudi)的程度)或實質上類似的分析所測量，帶有低於約20%的細胞毒性百分比(%細胞毒性或%係胞裂解)不具有可感知殺死Raji或Daudi(CD20-表現)細胞的抗-CD3xCD20抗體。實質上類似的分析可包括NK細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、嗜酸性細胞或其他FcγRIII-表現細胞，包括表現變體FcγRIII之細胞的存在。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如活體外FcγRIII-媒介的腫瘤細胞致死分析，例如使用文中實例7中所定義的分析模式或實質上類似的分析所測量，不具有可偵測的ADCC活性(例如，NK細胞或FcγRIII-媒介的殺死Raji或Daudi細胞)，帶有低於約30%，低於約25%，低於約20%，低於約15%，低於約10%，低於約5%，低於約1%之細胞毒性百分比，低於背景細胞毒性或無可偵測的細胞毒性。
根據特定的實施例，本發明係包括，如表面電漿子共振，例如使用文中實例8所定義的分析模式所測量，以低於約23.5μM之KD值與人類FcγRIIA(例如在25℃)結合之抗體及抗體之抗原結合片段。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如以表面電漿子共振，例如使用文中實例8所定義的分析模式(例如，mAb-捕捉或抗原捕捉模式)或實質上類似的分析所測量，係以低於約20.5μM，低於約20μM，低於約19.3μM，低於約18μM，低於約17μM，低於約16μM，低於約15μM，低於約10μM，低於約9μM，低於約8μM，低於約7μM，低於約6μM，低於約5μM，低於約4μM，低於約3μM，低於約2μM，低於約1μM，低於約900nM，低於約800nM，或低於約700nM之KD值與FcγRIIA結合。
根據特定的實施例，本發明係包括，如表面電漿子共振，例如使用文中實例8所定義的分析模式所測量，以低於約233μM之KD與人類FcγRIIB結合(例如於25℃)之抗體及抗體的抗原結合片段。在特定的實施例中，在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如表面電漿子共振，例如使用文中實例8所定義的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或實質上類似的分析所測量，係以低於約200μM，低於約190μM，低於約180μM，低於約170μM，低於約160μM，低於約150μM，低於約140μM，低於約130μM，低於約125μM，低於約123μM，低於約120μM，低於約110μM，低於約100μM，低於約90μM，低於約80μM，低於約70μM，低於約60μM，低於約50μM，或低於約40μM之KD值與FcγRIIB結合。
本發明亦包括，如表面電漿子共振於25℃或37℃，例如使用文中實例9所定義的分析模式或實質上類似的分析所測量，係以大於約8天的裂解半衰期(t½)與CD3xCD20結合之抗體及其抗原結合片段。在特定的實施例中，此抗體，如表面電漿子共振於25℃或37℃，例如使用文中實例9所定義的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或實質上類似的分析所測量，係具有大於約5天，大於約6天，大於約7天，大於約8天，大於約9天，大於約10天，大於約11天，大於約12天，大於約13天，大於約14天，大於約15天，或大於約20天之t½。
本發明亦包括，在一或多個由下列組成之群中選出的分析中不具有實質活性之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子：(a)活體外引發PBMC增生；(b)CDC細胞毒性(參見，例如文中實例6)；(d)ADCC(參見，例如文中實例7)。
本發明亦包括，在一或多個由下列組成之群中選出的分析中具有實質活性之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子：(a)在獼猴中去除B-細胞(例如，CD45+/CD20+B-細胞)(參見，例如文中實例10和11)；(b)在免疫缺陷小鼠模型中降低B-細胞腫瘤體積(例如Raji腫瘤體積)(參見，例如實例12A)；及(c)在帶有已建立腫瘤的小鼠模型中消退腫瘤(參見，例如實例12B)。
本發明包括能於一患者中去除B細胞之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子(參見，例如實例10)。例如，根據特定的實施例，係提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，其中係將雙專一性抗原結合分子單一投予一患者(例如以約1mg/kg，約0.9mg/kg，約0.8mg/kg，約0.7mg/kg，約0.6mg/kg，約0.5mg/kg，約0.4mg/kg，約0.3mg/kg，約0.2mg/kg，約0.1mg/kg，約0.08mg/kg，約0.06mg/kg，約0.04mg/kg，約0.03mg/kg，約0.02mg/kg，約0.01mg/kg或更低的劑量)，使此患者之B細胞數目下降(例如由此患者所採集的血液樣本中)至可偵測量以下。在特定的實施例中，單一投予約0.1mg/kg劑量之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，係在將雙專一性抗原結合分子投予此患者後約第7天、約第6天、約第5天、約第4天、約第3天、約第2天、約第1天，使此患者之B係胞數目下降至可偵測量以下。根據特定的實施例，單一投予約0.01mg/kg劑量之本發明抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，在投予後，直到至少約7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天或更多天，使此B係胞數目仍在可偵測量以下。如文中所用，「可偵測量以下」一詞係指從患者抽取的血液樣本中，使用標準的B細胞偵測分析，例如文中實例10中所述之B細胞標記的FACS分析，無直接或間接偵測到B細胞。
本發明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，當投予一患者，其造成不超過一次過渡性T細胞降低。例如，提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，當以約0.01mg/kg，或約0.1mg/kg，或約1mg/kg之劑量投予一患者時，在投予後第1天造成T細胞數目下降，但其中每微升血液之T細胞數目在之後的時間點即回復(例如在投予後約第2天、第4天、第7天、第14天、第28天或之後)。例如，本發明係提供抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子，其中在投予約0.01mg/kg，或約0.1mg/kg，或約1mg/k劑量之抗原結合分子至一患者後約第4天至約第7天，如使用標準的T-細胞偵測分析，例如文中實例10中所述，用於T-細胞標記之FACS分析所測，從該患者抽出的每微升血液之T細胞，係等於或大於投予雙專一性抗原結合分子之前由該患者抽出的每微升血液之T細胞數目。
表位定位及相關技術
與本發明抗原結合分子結合之CD3上或CD20上的表位可由3或多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多)CD3蛋白之胺基酸的單一連續序列所組成。另外，表位可由多數個CD3或CD20之非連續胺基酸(或胺基酸序列)所組成。本發明之抗體可與包含在單一CD3鏈(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)內的胺基酸相互作用，或可與二或多條不同CD3鏈上的胺基酸相互作用。術語「表位」，如文中所用，係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原的不同區域結合並可具有不同的生物效應。表位可為構型或線性。構型表位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並 列的胺基酸所產生。線性表位係由多肽鏈相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下，表位可包括抗原上的醣類基團、磷醯基基團或磺醯基基團。
本項技術之一般技術者已知的各種技術皆可用於測定抗體之抗原結合區是否與多肽或蛋白內的「一或多個胺基酸交互作用」。例示的技術包括，例如習用的交叉阻斷分析，例如描述於Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中，丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke(2004),Methods Mol Biol 248：443-463)及胜肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學修飾等方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)。可用於辨識多肽內與抗體之抗原結合區相互作用之胺基酸的另外方法係以質譜偵測氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法係包括以氘標定所指的蛋白，接著讓抗體與氘標定的蛋白結合。接著，將蛋白/抗體複合物轉置於水中，讓除了受抗體保護的殘基(其仍為氘標定)以外的所有殘基發生氫-氘交換。裂解抗體後，將目標蛋白以蛋白酶裂解並以質譜分析，藉此找出氘標定殘基，其係相當於與抗體交互作用之特定胺基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。抗原/抗體複合物之X-光晶體學亦可用於表位定位之目的。
本發明進一步係包括與任何文中所述之特定例示性抗體相同之表位結合的抗-CD3抗體(例如，包括如文中表1所述之任何胺基序的抗體)。同樣的，本發明亦包括與任何文中所述之特定例示性抗體(例如，包括如文中表1所述之任何胺基序的抗體)競爭與CD3結合之抗-CD3抗體。
本發明亦包括雙專一性抗原結合分子，其係包含專一與人類CD3結合之第一抗原結合區，及專一與人類CD20結合之第二抗原結合區，其中第一抗原結合區係與任何文中所述之特定例示性CD3-專一抗原結合區相同之CD3上的表位結合，及/或其中第二抗原結合區係與任何文中所述之特定例示性CD20-專一抗原結合區相同之CD20上的表位結合。
同樣地，本發明亦包括雙專一性抗原結合分子，其包含專一與人類CD3結合之第一抗原結合區，及專一與人類CD20結合之第二抗原結合區，其中第一抗原結合區係與任何文中所述之特定例示性CD3-專一抗原結合區競爭與CD3之結合，及/或其中第二抗原結合區係與任何文中所述之特定例示性CD20-專一抗原結合區競爭與CD20之結合。
在一方面，本發明係包括其中第一抗原結合區係與參照的抗原結合區競爭與人類CD3結合之雙專一性抗體，其係包括三個重鏈互補決定區(A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3)及三個輕鏈互補決定區(A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3)，其中(i)A1-HCDR1係包括SEQ ID NO：12之胺基酸列；(ii)A1-HCDR2係包括SEQ ID NO：14之胺基酸列；(iii)A1-HCDR3係包括SEQ ID NO：16之胺基酸列；(iv)A1-LCDR1係包括SEQ ID NO：20之胺基酸列；(v)A1-LCDR2係包括SEQ ID NO：22之胺基酸列；及(vi)A1-LCDR3係包括SEQ ID NO：24之胺基酸列。在某些案例中，雙專一性抗體係包括與參照抗原結合區競爭和人類CD3結合之第一抗原結合區，其係包括(i)SEQ ID NO：10之重鏈可變區(HCVR)胺基酸序列，及(ii)SEQ ID NO：18之輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列。
在另外方面，本發明係包括其中第二抗原結合區係與參照的抗原結合區競爭與人類CD20結合之雙專一性抗體，其係包括三個重鏈 互補決定區(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)及三個輕鏈互補決定區(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)，其中(i)A2-HCDR1係包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(ii)A2-HCDR2係包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列；(iii)A2-HCDR3係包括SEQ ID NO：8；(iv)A2-LCDR1係包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)A2-LCDR2係包括SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及(vi)A2-LCDR3係包括SEQ ID NO：24之胺基酸序列。在某些案例中，雙專一性抗體係包括與參照抗原結合區競爭和人類CD20結合之第二抗原結合區，其係包括(i)包含SEQ ID NO：2胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)，及(ii)包含SEQ ID NO：18胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)。
在另外方面，本發明係包括一具有與參照的抗原結合蛋白競爭與人類CD3結合之第一抗原結合區的雙專一性抗體，該第一抗原結合區係包括(i)一包含SEQ ID NO：10胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)，及(ii)一包含SEQ ID NO：18胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)；並具有與參照的抗原結合蛋白競爭與人類CD20結合之第二抗原結合區，其係包括(iii)一包含SEQ ID NO：2胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)，及一包含SEQ ID NO：18胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)。
藉由使用本項技術中已知的習用方法，可容易地測定特定的抗原結合分子(例如抗體)或其抗原結合區是否與本發明之參照抗原結合分子相同的表位結合或是與其競爭結合。例如，測定試驗抗體是否與如同本發明參照的雙專一性抗原結合分子之CD3(或CD20)上的相同表位結合，首先係讓參照的雙專一性分子與CD3蛋白(或CD20蛋白)結合。接著，評估試驗抗體與CD3(或CD20)分子結合之能力。若試驗抗體在與參照的雙專一性抗原結合分子飽和結合後，能與CD3(或CD20)結合，則其可結論出，該試驗抗體係與不同於參照的雙專一性抗原結合分子的CD3(或CD20) 表位結合。另一方面，若試驗抗體在與參照的雙專一性抗原結合分子飽和結合後，不能與CD3(或CD20)分子結合，則試驗抗體可能與和本發明之參照的雙專一性抗原結合分子結合的表位相同之CD3(或CD20)表位結合。然後可進行另外例行的實驗(例如胜肽突變和結合分析)，以確定所觀察到無試驗抗體結合事實上是否係由於與和參照的雙專一性抗原結合分子相同的表位結合所致，或是否係因立體阻斷(或另外的現象)造成無觀察到結合。此類實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或本項技術中可取得的任何其他量性或質性抗體-結合分析來進行。依照本發明特定的實施例，如於競爭性結合分析中所測，若例如一1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗原結合蛋白抑制另一抗體之結合至少50%，但較佳地75%、90%或甚至99%，則二種抗原結合蛋白係與相同(或重疊)的表位結合(參見，例如Junghans等人，Cancer Res.1990 50：1495-1502)。另外，若基本上降低或消除一抗原結合蛋白之結合的抗原中所有的胺基酸突變，係降低或消除另一種抗原結合蛋白之結合，則二種抗原結合蛋白被認為係與相同的表位結合。若僅一亞群的胺基酸突變降低或消除一抗原結合蛋白之結合或消除另一種抗原結合蛋白之結合，則二種抗原結合蛋白被認為具有「重疊的表位」。
為了測定一抗體或其抗原結合區是否與參照的抗原結合分子競爭結合，係以二個方向進行上述結合方法：第一個方向：讓參照的抗原結合分子在飽和的條件下與CD3蛋白(或CD20蛋白)結合，接著評估試驗抗體與CD3(或CD20)分子之結合。第二個方向：讓試驗抗體在飽和的條件下與CD3(或CD20)分子結合，接著評估參照的抗原結合分子與CD3(或CD20)分子之結合。若在二個方向中，僅有第一(飽和)抗原結合分子能與CD3(或CD20)分子結合，則結論出試驗抗體和參照的抗原結合分 子係競爭與CD3(或CD20)結合。本項技術之一般技術者應了解，與參照的抗原結合分子競爭結合之抗體可能不一定係與參照抗體相同之表位結合，但可能藉由與重疊或相鄰的表位結合，在立體上阻斷參照抗體之結合。
製備抗原結合區及建構雙專一性分子
對特定抗原具專一性之抗原結合區可藉由任何本項技術中已知的抗體生產技術來製備。一旦獲得後，對二種不同抗原(例如CD3和CD20)具專一性之二種不同的抗原結合區可以相對彼此適合的排列使用習用方法，產生本發明之雙專一性抗原結合分子。(可用於建構本發明雙專一性抗原結合分子之例示的雙專一性抗體模式之論述係提供於文中他處)。在特定的實施例中，本發明之多專一性抗原結合分子的一或多個個別組份(例如重鏈和輕鏈)係衍生自嵌合、人源化或全人類抗體。製造此等抗體之方法已為本項技術所熟知。例如，可使用VELOCIMMUNETM技術製備一或多條本發明雙專一性抗原結合分子之重鏈及/或輕鏈。使用VELOCIMMUNETM技術(或任何其他人類抗體生產技術)，起初先分離對特定抗原(例如CD3或CD20)具高親和力之具有人類可變區和小鼠恆定區的嵌合抗體。將抗體定性並就所欲的性質來選擇，包括親和力、選擇性、表位等。以所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區產生本發明全人類抗體，及/或輕鏈其可併入本發明之雙專一性抗原結合分子中。
基因工程動物可用於製造人類雙專一性抗原結合分子。例如，可使用不能重排和表現內生性小鼠免疫球蛋白輕鏈可變序列之基因改造小鼠，其中小鼠僅表現一或二個由人類免疫球蛋白序列操作上在內生性小鼠κ基因座連接小鼠κ輕鏈恆定基因所編碼的人類輕鏈可變區。此基因改造小鼠可用於製造包括連結相同輕鏈之二種不同重鏈的全人類雙專一 性抗原結合分子，該輕鏈係包括衍生自二種不同人類輕鏈可變區基因片段其中一種之可變區。(參見，例如US 2011/0195454就此工程化小鼠詳細論述及將其用於製造雙專一性抗原結合分子)。
生物等效性
本發明係涵蓋具有與文中所揭示的例示分子不同但保留與CD3及/或CD20結合能力之胺基酸序列的抗原結合分子。此等變體分子，當與親代序列相比較時，可包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的雙專一性抗原結合分子實質上相當之生物活性。
本發明係包括與文中所述的任何例示性抗原結合分子為生物等效之抗原結合分子。二種抗原結合蛋白或抗體，若例如其為醫藥同等物或醫藥替代品，當於類似的實驗條件下以單一劑量或多劑量之相同的莫耳劑量投予時，其吸收速率和程度並無顯示顯著的差異，則係視為生物等效的。某些抗原結合蛋白若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等效物或醫藥替代品，且仍可視為生物等效，因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標示上，對於達到例如長期使用之有效體藥濃度並非必要的，且就特定藥物產品的研究上被視為無醫療上的顯著性。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。
在一實施例中，若相較於無此變更之持續治療，病患可在參照產品和生物產品間作一或多次變更而無預期的有害效應之風險增加(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)，則二種抗原結合蛋白為生物等效的。
在一實施例中，若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀，而達到此等機制已知的程度，則二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內和活體外方法來驗證。生物等效性測量包括，例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量血液、血漿、血清或其他生物體液中隨時間變化之抗體或其代謝物濃度；(b)與人類活體內生物可利用性數據有相互關係及可合理預測此數據之活體外試驗；(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量隨時間變化之抗體(或其目標)的適當急性藥理效用；及(d)已建立抗原結合蛋白之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好對照的臨床試驗。
文中所述之例示性雙專一性抗原結合分子的生物等效變體可藉由，例如製造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如，生物活性不需要的半胱胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換，以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內雙硫橋。在其他內容中，生物等效的抗原結合蛋白可包括文中所述之例示性雙專一性抗原結合分子的變體，其係包含修飾分子之糖基化特性的胺基酸改變，例如消除或移除糖基化之突變。
物種選擇性和物種交叉反應
根據本發明特定的實施例，係提供與人類CD3結合但不與其他物種CD3結合之抗原結合分子。亦提供與人類CD20結合但不與其他物種CD20結合之抗原結合分子。本發明亦包括與人類CD3及來自一或多種非人類物種之CD3結合的抗原結合分子；及/或與人類CD20及來自一或多種非人類物種之CD20結合的抗原結合分子。
根據本發明特定的例示性實施例，係提供與人類CD3及/或人類CD20結合，以及可或不可與(視情況而定)一或多種小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、絨猴、恆河猴或黑猩猩CD3及/或CD20結合之抗原結合分子。例如，在本發明特定的例示性實施例中，係提供包括與人類CD3和獼猴CD3結合之第一抗原結合區及專一與人類CD20結合之第二抗原結合區的雙專一性抗原結合分子。
免疫接合物
本發明涵蓋與療效成份，例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合之抗原結合分子(免疫接合物)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害之試劑。用於形成免疫接合物之適合的細胞毒性劑及化療劑實例已為本項技術所知(參見，例如WO 05/103081)。
治療調配物及給藥
如文中所用，術語「有效量」和「治療上有效量」係指活性治療劑之量，在無過份的有害副作用，例如毒性、刺激性或過敏反應下，足以產生所欲的治療反應。特定的「有效量」明顯地將依此等因子，例如所欲治療之特定症狀、病患的生理狀況和所欲治療的動物種類、治療持續時間、同時治療(若有)之性質和所用的特定調配物以及化合物結構或其衍生物而不同。在此情況下，若其造成下列一或多項(但不限)，則此量應視為治療上有效的：(a)抑制腫瘤生長(例如，B-細胞癌症)；及(b)反轉或安定B-細胞癌症。
投予病患之抗原結合分子的劑量可依照病患的年齡和體型大小、標的疾病、症狀、給藥路徑及其類似因素而不同。較佳的劑量典型地係根據體重或體表面積來計算。當本發明之雙專一性抗原結合分子係 用於成人病患之治療目的時，有利的一般可以靜脈給予約0.01至約20毫克/kg體重，更佳地約0.02至約7，約0.03至約5，或約0.05至約3毫克/kg體重之單一劑量的本發明雙專一性抗原結合分子。依照症狀之嚴重度，治療之頻率和治療持續時間可調整。給予雙專一性抗原結合分子之有效劑量和時程可依經驗來決定；例如可以定期評估來監看病患進步，並據此調整劑量。再者，物種間劑量之衡量可使用本項技術熟知的方法來進行(例如Mordenti等人，1991,Pharmaceut.Res.8：1351)。
各種的遞送系統已為所知並可用於投予本發明之醫藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現突變病毒之重組細胞、受體媒介的內吞作用(參見，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。導入方法包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服路徑。組成物可以任何方便的路徑，例如以輸注或團注、以經由上皮或黏膜層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收來給藥，並可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部的。.
本發明之醫藥組成物可以標準針或注射器由皮下或靜脈內來遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為重複使用型或拋棄型。可重複使用的筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換補充匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後而補充匣變空，此空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之補充匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的補充匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一但醫藥組成物的儲槽變空，整個裝置便可丟棄。
許多可重複使用的筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不限於)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置之實例包括(但不限於)SOLOSTARTM筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅提出一些。
在特定的情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦(參見Langer，前文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另外的實施例中，可使用聚合物質；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。又在另外的實施例中，控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處，因此僅需要全身劑量之一部分(參見，例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release，前文，第2冊，pp.115-138)。其他的控制釋放系統係論述於Langer,1990,Science 249：1527-1533之評論中。
可注射的製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可由公開已知的方法來製備。例如，可注射製備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖之等張溶液和其他佐劑等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑，可使用芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。由此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中。
有利地，上述之口服或非經腸用途之醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑量之劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般每單位劑量之劑型為約5至約500毫克；特別是注射形式，較佳的前述抗體係含有約5至約100毫而其他劑型為約10至約250毫克。
抗原結合分子之治療用途
本發明係包括：包含於一有此需要之患者中投予包括專一與CD3和目標抗原(例如CD20)結合之抗-CD3抗體或雙專一性抗原結合分子的治療組成物之方法。此治療組成物可包括任何文中所揭示之抗體或雙專一性抗原結合分子以及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。如文中所用，「有此需要之患者」一詞係指具有一或多種癌症之症候或適應症之人類或非人類動物(例如表現腫瘤或患有任何下文所指的癌症之患者)，或另外可從抑制或降低CD20活性或去除CD20+B細胞或消退CD20+B細胞腫瘤而得利者。
本發明之抗體及雙專一性抗原結合分子(及包括彼等之治療組成物)可用於，其中包括，治療其中刺激、活化及/或以免疫反應為目標應為有利的疾病或病症。特言之，本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子可用於治療、預防及/或改善任何與CD20表現或活性或CD20+B細胞增生有關或由其所媒介之疾病或病症。達成本發明治療方法之作用機制係包括在效應子細胞的存在下殺死表現CD20之細胞，例如，藉由細胞凋亡、吞噬作用或藉由二或多種這些機制的組合或類似的細胞毒性機制。可使用本發明之雙專一性抗原結合分子抑制或殺死之CD20表現細胞包括，例如致腫瘤B細胞。
降低腫瘤負荷或腫瘤消退包括在患者中一或多個腫瘤之部分或完全消失。請了解，腫瘤消退代表趨向較低的腫瘤負荷或較低的疾病嚴重狀態之傾向。如此一來，消退為逐漸減弱性消除體內可測量的惡性腫瘤。降低腫瘤發展包括部分或完全抑制或壓抑另外或新的腫瘤生長。
本發明之抗原結合分子可用於瞄準及治療，例如發生於腦及腦膜、口咽、肺及支氣管樹、胃腸道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮膚和附屬件、結締組織、脾、免疫系統、造血細胞和骨髓、肝及泌尿道和特定的感官器官例如眼睛之原生及/或轉移腫瘤。在特定的實施例中，本發明之雙專一性抗原結合分子可用於治療一或多種下列癌症：腎細胞癌、胰臟癌、乳癌、頭和頸癌、前列腺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌(例如帶有MET增幅之胃癌)、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑液肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。根據特定的例示性實施例，本發明之雙專一性抗原結合分子可用於治療B細胞癌(例如何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤[NHL]、前軀B細胞淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、成熟B細胞腫瘤、B細胞慢性淋巴性白血病/小淋巴性 淋巴瘤、B細胞前淋巴性白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、皮膚濾泡中心淋巴瘤、週邊區域B細胞淋巴瘤、毛狀細胞白血病、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、漿細胞瘤、漿細胞骨髓瘤、移植後淋巴增生病症、華氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症及間變性大細胞淋巴瘤)。
本發明之抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子係以足以在患者中降低腫瘤負荷，產生腫瘤消退、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發展之量來給藥。在本發明某些例示的實施例中，投予的量係介於約0.001mg/kg至約1mg/kg之間。在其他的實施例中，投予的量為約0.4mg/kg。在其他的實施例中，投予的量為約0.04mg/kg。又在其他的實施例中，投予的量為約0.004mg/kg。
根據本發明特定的實施例，此抗原結合分子可用於治療患有B-細胞淋巴瘤(例如NHL)，對單獨的抗-CD20治療具阻抗性或不完全反應(例如，對利妥昔單抗具抗性)之病患。根據本發明之其他相關的實施例，係提供包括將如文中所述的抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子投予患有以抗-CD20治療難以治療之B-細胞淋巴瘤(例如NHL)的病患(例如，患有利妥昔單抗難以治療之腫瘤或復發性或難治的B-細胞淋巴瘤之病患)之方法。本項技術中已知的分析/診斷方法，例如腫瘤掃描等，可用於確認病患是否隱藏有對單獨的抗-CD20治療具阻抗性或不完全反應或難以治療之腫瘤。
本發明亦包括於一患者中治療殘餘癌之方法。如文中所用，術語「殘餘癌」係指以抗癌療法治療後，在一患者中存在或持續留有一或多個癌細胞。
根據特定方面，本發明係提供治療與CD20表現有關的疾病或病症(例如B細胞淋巴瘤)之方法，其包括在一患者已接受抗-CD20單一治療後，將一或多種文中他處所述的雙專一性抗原結合分子投予該患者(例如，在投予包括抗-CD20抗體如利妥昔單抗之醫藥組成物之後)。例如，本發明係包括治療B細胞淋巴瘤之方法，其包括在一病患已接受抗-CD20單一治療(例如，利妥昔單抗治療或其同等性治療)後1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週或4週、2個月、4個月、6個月、8個月、1年或更久，將抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子投予該患者。
組合治療及調配物
本發明係提供包括將包含文中所述之任何例示性抗體和雙專一性抗原結合分子之醫藥組成物與一或多種另外的治療劑組合給藥之方法。可與本發明之抗原結合分子組合或組合給藥之例示性另外的治療劑包括，例如EGFR拮抗劑(例如抗-EGFR抗體[例如，西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab)]或EGFR之小分子抑制劑[例如，吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])，另外的EGFR家族成員之拮抗劑，例如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4(例如抗-ErbB2、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗體或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性之小分子抑制劑)，EGFRvIII之拮抗劑(例如專一與EGFRvIII結合之抗體)，cMET拮抗劑(例如抗-cMET抗體)，IGF1R拮抗劑(例如抗-IGF1R抗體)，B-raf抑制劑(例如威羅菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)，PDGFR-α抑制劑(例如抗-PDGFR-α抗體)，PDGFR-β抑制劑(例如抗-PDGFR-β抗體)，VEGF拮抗劑(例如VEGF-Trap，參見例如US 7,087,411(文中亦稱為「VEGF-抑制融合蛋白」)、抗-VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab))、VEGF受體之小分子激酶抑制劑(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼 (sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗劑(例如揭示於US 2009/0142354中之抗-DLL4抗體)、Ang2拮抗劑(例如揭示於US 2011/0027286中之抗-Ang2抗體，例如H1H685P)、FOLH1拮抗劑(例如抗-FOLH1抗體)、PRLR拮抗劑(例如抗-PRLR抗體)、STEAP1或STEAP2拮抗劑(例如抗-STEAP1抗體或抗-STEAP2抗體)、TMPRSS2拮抗劑(例如抗-TMPRSS2抗體)、MSLN拮抗劑(例如抗-MSLN抗體)、CA9拮抗劑(例如抗-CA9抗體)、尿溶蛋白(uroplakin)拮抗劑(例如抗-尿溶蛋白抗體)、抗-CTLA4抗體(例如，伊匹單抗(ipilimumab)(MDX-010))、單價CD20拮抗劑(例如單價抗-CD20抗體，如利妥昔單抗)等。
可有利地與本發明之抗原結合分子組合之其他試劑包括免疫活化劑或抑制劑。特定的免疫活化劑或抑制劑為細胞激素活化劑或抑制劑，包括小分子化合物以及與細胞激素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其個別受體結合之抗體。本發明之醫藥組成物(例如包括如文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20雙專一性抗原結合分子之醫藥組成物)亦可作為包括一或多個治療組合之療法的部份來給藥，而該治療組合係選自「ICE」：異磷醯胺(ifosfamide)(例如，Ifex®)、卡鉑(carboplatin)(例如，Paraplatin®)、依托泊苷(etoposide)(例如，Etopophos®、Toposar®、VePesid®、VP-16)；「DHAP」：地塞米松(dexamethasone)(例如，Decadron®)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如，Cytosar-U®、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、ara-C)、順鉑(cisplatin)(例如，Platinol®-AQ)；及「ESHAP」：依託泊苷(例如，Etopophos®、Toposar®、VePesid®、VP-16)、甲潑尼龍(methylprednisolone)(例如，Medrol®)、高劑量阿糖胞苷、順鉑(例如，Platinol®-AQ)。
本發明亦包括包含文中所提及之任何抗原結合分子與一或多種下列抑制劑之治療組合：VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、uroplakin或任何前述的細胞激素，其中該抑制劑為一適配體、反義分子、核糖酵素、siRNA、肽體、奈米抗體或抗體片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程化分子，例如二抗體、三抗體、四抗體、微小抗體和最小識別單元)。本發明之抗原結合分子亦可與抗病毒劑、抗生素、鎮痛劑、皮質類固醇及/或NSAID組合給藥及/或共調配。本發明之抗原結合分子亦可作為同時包括放射線治療及/或習用化療之治療療法的部分來給藥。
另外的治療活性組份可在投予本發明抗原結合分子之前、同時或之後不久給藥(就本揭示文之目的，此等給藥療法係被視為本發明之抗原結合分子與另外的治療活性組份「組合」給藥)。
本發明係包括其中本發明之抗原結合分子係與一或多種如文中他處所述之另外的治療活性組份共調配之醫藥組成物。
給藥療法
根據本發明特定的實施例，可於一定義的時程將多劑量的抗原結合分子(例如抗-CD3抗體或專一與CD20和CD3結合之雙專一性抗原結合分子)投予一患者。根據本發明此方面之方法係包括先後將多劑量之本發明抗原結合分子投予一患者。如文中所用，「先後給藥」係指各劑量之抗原結合分子係於不同的時間點投予該患者，例如以預計的間隔隔開之不同日(例如小時、日、週或月)。本發明係包括，包含將一單一起始劑 量之抗原結合分子先後投予病患，接著一或多個第二劑量之抗原結合分子及視需要接著一或多個第三劑量之抗原結合分子之方法。
術語「起始劑量」、「第二劑量」和「第三劑量」係指投予本發明抗原結合分子之暫時順序。因此，「起始劑量」為治療療法開始時所投予之劑量(亦稱為「基線」劑量)；「第二劑量」為在起始劑量之後所投予之劑量；而「第三劑量」為在第二劑量之後所投予之劑量。起始、第二和第三劑量皆可含有相同量之抗原結合分子，但就給藥的頻率而言，一般可彼此不同。在特定的實施例中，然而，包含在起始、第二及/或第三劑量中之抗原結合分子之量，在治療期間可互不相同(例如，若適當，經上調或下調)。在特定的實施例中，係在治療療法開始時投予二或多個(例如2、3、4或5個)劑量作為「承載劑量」，接著以較低頻率為基礎，投予後續劑量(例如「維持劑量」)。
在本發明一例示性的實施例中，各第二及/或第三劑量係緊接前面劑量之後的1至26週(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更久)給藥。「緊接前面劑量」一詞，如文中所用，係指在一多重給藥之順序中，抗原結合分子之劑量，在每個相鄰接的劑量給藥之前係以無插入劑量之順序給藥。
根據本發明此方面之方法可包括將任何數目之第二及/或第三劑量之抗原結合分子(例如抗-CD3抗體或專一與CD20和CD3結合之雙專一性抗原結合分子)，投予一病患。例如，在特定的實施例中，僅將一單一第二劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、 4、5、6、7、8或更多)第二劑量投予該病患。同樣地，在特定的實施例中，僅將一單一第三劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量投予該病患。
在涉及多重第二劑量之實施例中，各第二劑量可與其他第二劑量相同的頻率來給藥。例如，各第二劑量可在緊接前面劑量後1至2週，投予該病患。同樣地，在涉及多重第三劑量之實施例中，各第三劑量可與其他第三劑量相同的頻率來給藥。例如，各第三劑量可在緊接前面劑量後2至4週，投予該病患。另外，投予病患之第二及/或第三劑量的頻率，在治療療法期間可不同。在治療期間，給藥頻率亦可依照個別病患之需求在臨床檢查後由醫師做調整。
抗體之診斷用途
本發明之抗-CD3xCD20抗體亦可用於偵測及/或測量樣本中之CD3或CD3-表現細胞，例如供作診斷目的。例如抗-CD3xCD20抗體或其片段可用於診斷特徵為CD3異常表現(例如過度表現，表現不足，無表現等)之症狀或疾病。CD3之例示性診斷分析可包括，例如將得自病患的樣本與本發明之抗-CD3xCD20抗體接觸，其中該抗體係以可偵測的標記或受體分子標定。另外，未標定的抗-CD3xCD20抗體可與本身經可偵測標記標定之第二抗體組合用於診斷用途。可偵測標記或報導子分子可為放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學螢光基團，例如螢光素異硫氰酸酯或羅丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶(luciferase)。可用於偵測或測量樣本之CD3的特定例示分析包括酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及螢光活化細胞分類(FACS)。
本發明之抗-CD3xCD20抗體可用於偵測及/或測量樣本中之CD20或CD20-表現細胞，或診斷特徵為CD20異常表現(例如，過度表現、低度表現或缺乏表現等)之症狀或疾病，以此類推。
根據本發明可用於CD3或CD20診斷分析之樣本係包括含有可偵測量之CD3及/或CD20蛋白或其片段，其係在正常或病理條件下由病患所得來之任何組織或液體樣本。一般而言，起初係測量得自健康病患(例如未患有與異常CD3或CD20量或活性有關的疾病或症狀之病患)之特定樣本中CD3或CD20的量，建立一基線或標準的CD3或CD20量。然後可將此CD3或CD20之基線量分別與得自疑似患有CD3-或CD20-相關疾病或症狀之個體的樣本中所測量之CD3或CD20量作比較。
實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明方法和組合物之完整揭示和說明，但不希望限制發明者所認為之發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字(例如量、溫度等)之正確性，但仍應考量某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數係為重量之份數，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度數表示，而壓力係為或接近大氣壓。
實例1.產生抗-CD3和抗-CD20抗體
已知有數種分離抗-CD3或抗-CD20抗體之方法。用於下列實例之全人類抗-CD3抗體，係如US 2007/0280945A1中所述，直接由未與骨髓瘤細胞融合之抗原-陽性的B細胞分離。
另外的抗-CD3抗體之實例可用於此方法中，且此等抗體之說明和此等抗-CD3抗體之生物特性係描述於2013年9月19日申請的PCT國際申請案號PCT/US13/60511中，其係以全文引用的方式併入本文 中。例示的抗-CD20抗體和此等抗-CD20抗體之生物性質係描述於US 7,879,984和2013年9月19日申請的PCT國際申請案號PCT/US13/60511中，其各自係以引用的方式併入本文中。
抗-CD20抗體及製造用於建構本實例之雙專一性抗體的方法係描述於US 7,879,984中。
用於建構雙專一性抗體之抗-CD3抗原結合臂和抗-CD20結合臂的重鏈和輕鏈可變區及CDR之胺基酸序列識別碼係列於表1中。對應的核酸序列識別碼係列於表2中。
Figure 104108403-A0202-12-0087-9
Figure 104108403-A0202-12-0087-10
實例2.產生結合CD3和CD20的雙專一性抗體
以上述序列使用標準方法建構包括抗-CD3-專一結合區和抗-CD20-專一結合區之雙專一性抗體，其中係將來自抗-CD3抗體之重鏈和同源輕鏈與來自抗-CD20抗體的重鏈組合。
就此，依照本實例所製造的雙專一性抗體係包括二個個別的抗原結合區(亦即結合臂)。第一抗原結合區係包括衍生自抗-CD20抗體("CD20-VH")之重鏈可變區，與衍生自抗-CD3抗體的輕鏈可變區("CD3-VL")配對。CD20-VH/CD3-VL配對製造出一個專一辨識CD20之抗原結合區。第二抗原結合區係包括衍生自抗-CD3抗體(「CD3-VH」)之重鏈可變區，與衍生自抗-CD3抗體的輕鏈可變區(「CD3-VL」)配對。此CD3-VH/CD3-VL配對製造出一個專一辨識CD3之抗原結合區。在此實例中所製造的所有雙專一性抗體係使用相同的CD20-VH並命名為「CD20-VH-A」。
各重鏈之野生型重鏈恆定區(CH)係藉由重組技術以一嵌合的CH置換。一結合臂(例如抗-CD3結合臂)之CH係在CH的CH3區含有一突變，其促進分離此雙專一性分子。
依照此實例所製造的各種雙專一性抗體的組份部分彙整係列於表3和表4中。
Figure 104108403-A0202-12-0088-11
Figure 104108403-A0202-12-0088-12
Figure 104108403-A0202-12-0089-13
表5和6係列出帶有此實例雙專一性抗體之其對應CDR的各種重鏈可變區(表5)和輕鏈可變區(表6)之胺基酸序列識別碼。
Figure 104108403-A0202-12-0089-14
Figure 104108403-A0202-12-0089-15
另外，表7和8係列出編碼帶有此實例雙專一性抗體之其對應CDR的各種重鏈可變區(表7)、重鏈恆定區和輕鏈可變區(表8)之核苷酸序列識別碼。
Figure 104108403-A0202-12-0089-16
Figure 104108403-A0202-12-0089-17
除了上述的雙專一性抗體外，在下列實例中所列的特定實驗亦使用下列對照抗體：
對照抗體1：如中所US 4,361,549述，抗人類T-細胞表面抗原之單株抗體「OKT-3」並可得自雜交瘤CRL-8001(American Type Culture Collection,Manassas,VA).
對照抗體2：抗體「SP34」反應性抗人類T淋巴細胞上T3複合物之ε鏈，可得自BD Pharmagen，型號55052。
對照抗體3：抗-CD20治療抗體，如US 5,736,137中所揭示，具有Rituxan®(利妥昔單抗)之重鏈和輕鏈序列。
對照抗體4：亦稱為CD3xCD20抗體-野生型Fc(wtFc)，此抗體係類似上述方法所製造，具有一包括SEQ ID NO：2/18之HCVR/LCVR胺基酸序列對的抗-CD20臂(SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列)，及野生型IgG1 CH區(SEQ ID NO：45)；及一包括SEQ ID NO：10/18之HCVR/LCVR胺基酸序列對的抗-CD3臂(SEQ ID NO：12-14-16-20-22-24之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列)，及在CH3區帶有2個胺基酸修飾使其容易分離之野生型IgG1 CH區(SEQ ID NO：48)。CD3xCD20抗體-wtFc(抗體4)可指具有野生型IgG1 Fc區之相配的對照抗體(亦即與本發明CD3xCD20-嵌合Fc抗體之抗原結合區相配)，作為與具有不同Fc區序列或結構之抗體相比較抗體效應子功能，或其他性質之目的。
對照抗體5：抗-FelD1單株抗體係與貓抗原結合，對人類CD20或CD3無交叉反應性。此IgG1非專一性抗體對照係藉由如2013年11月7日申請的PCT公開案號WO2013/166236所述之方法所得來。
對照抗體6：抗-FelD1抗原結合區，如PCT公開案號WO2013/166236中所述，如文中所述經工程化以含有一嵌合的IgG4 Fc區， 類似Ab 1。對照Ab 6對於人類CD20或CD3無交叉反應性，但具有類似Ab 1的效應子功能。
實例3.嵌合的重鏈結構
產生嵌合重鏈，例如嵌合的CH IgG4(SEQ ID NO：26)和嵌合的CH IgG1(SEQ ID NO：30)，係使用標準的選殖技術來進行。首先，經由一2-步驟PCR增幅程序產生嵌合的IgG4 CH。使用含有野生型hIgG4 CH DNA之起始載體結構pR001，使用CH區分別側接P1-P2和P3-P4的引子對，增幅二個PCR片段，片段1和2。參見下表9。引子將所欲的IgG2下絞鏈序列(其編碼SEQ ID NO：52)和側接的限制位置二者導入此等片段。然後使用PCR引子P2和P4連接這二個片段。將所產生的序列經由Xho1-Not1限制位置插入pR001，產生含有嵌合IgG4 CH(其具有一IgG2下絞鏈序列)之載體結構pR002。使用引子P10和P11確認此序列。
此外，經由多步驟PCR增幅產生嵌合的IgG1 CH。使用引子P2和P5(參見下表9)從模板pR85503(其含有一野生型人類IgG1 CH DNA)產生片段1a。以引子P6和P8使用pR002(含有嵌合的IgG4 CH DNA)作為模板，增幅片段2a。使用引子P7和P9從模板pR003(野生型hIgG1 CH DNA；SEQ ID NO：45)製造片段3。使用引子P2和P8連接片段1a和2a，其產生了片段4。使用引子P6和P9連接片段2a和3，產生了片段5。然後使用引子P2和P9將片段4和5融合。將所產生的序列經由Xho1-Not1限制位置插入pR001，產生結構pR004，其具有一帶有IgG2下絞鏈和IgG4 CH2區之IgG1恆定區。使用引子P10和P11確認此序列。
Figure 104108403-A0202-12-0091-18
Figure 104108403-A0202-12-0092-19
實例4.相較於單專一性抗體，CD20 x CD3雙專一性抗體選擇性結合Jurkat、Raji和猴子T-細胞
將CD3xCD20抗體-wtFc(對照抗體4)與單專一性對照抗體，如實例2中所述，經由FACS結合法，比較其結合Jurkat(CD3+、CD20-人類T-細胞株)、Raji(CD3-、CD20+人類B-細胞株)或獼猴PBMC(「mkT細胞」)之能力。
使用下列方法得到FACS數據：將每孔2x105個細胞以連續稀釋的抗體於冰上培養30min。培養後，清洗細胞及加入適當的二級(Jurkat、RAJI細胞)或二級抗體混合液(用於獼猴PBMC)並另再培養30分鐘。培養後，清洗細胞，再懸浮於含1% BSA之冷的PBS中並以流式細胞儀於BD FACS Canto II上分析。將Jurkat和Raji細胞以側散射和前散射閘控，而獼猴T細胞亦閘控CD2+CD4+群族。使用Prism軟體以使用 4-參數非線性迴歸分析所計算的值測定細胞結合滴定之EC50。結果係如表10所示。
Figure 104108403-A0202-12-0093-20
 (+)EC50值未測定，但有觀察到結合；NB無結合；NT未測試
如表10所示，試驗抗體的分格，依照其專一性，在各中細胞株上顯現一範圍的結合親和力。雙專一性對照抗體4顯示與人類和獼猴目標細胞之結合能力。對照抗體4包括與本發明抗體1和抗體2相同的抗-CD3xCD20可變區，然而卻具有野生型IgG1 CH區。抗-CD3對照1(OKT3)、抗-CD3對照2(SP34)和抗-CD20對照3分別與Jurkat、獼猴T細胞和RAJI結合。
實例5.帶有野生型CH之CD20 x CD3雙專一性抗體在活化的T-細胞存在下引發對Raji細胞的細胞毒性
以一活體外細胞毒性分析檢測CD20 x CD3雙專一性抗體重新引導T-細胞媒介殺死CD20-表現的Raji細胞之能力。此外，亦研究雙專一性和親代抗-CD3抗體二者經由Fc/FcR相互作用殺死U937細胞之能力。
鈣黃綠素致死分析係使用下列方法來進行：分別於ficoll-Plaque上或經由Lympholyte哺乳動物細胞分離液分離人類和獼猴PBMC。將分離的PBMC於數天的期間內以含有重組的人類IL-2(30U/ml) 和T-細胞活化的微珠之培養基活化(抗-CD3/CD28用於人類PBMC，抗-CD2/CD3/CD28用於獼猴PBMC)。
將目標細胞(Raji用於CD20媒介的致死而U937用於FcR媒介的致死)以鈣黃綠素標定，並以活化的T細胞在10：1效應子：目標比率使用抗體的3-倍連續稀釋液於37℃培養3小時的時間。培養後，將培養盤離心並將上清液轉置於半透明黑色底部澄清的測定盤中進行螢光分析。使用Prism測定EC50，其係定義為引發50%細胞毒性之雙專一性抗體的莫耳濃度。使用4-參數非線性迴歸分析計算數值。結果係彙整於表10中。
Figure 104108403-A0202-12-0094-21
 (*)數據為3次或更多次獨立分析之平均值。無(*)之數據為1或2次獨立分析之代表值/平均值。NA=無活性
如表11所示，含有人類-專一性和獼猴交叉反應性抗-CD3臂及野生型IgG1 CH區之雙專一性CD20xCD3抗體，在人類活化的T細胞之存在下能專一重新引導對Raji細胞的細胞毒性。在獼猴活化的T細胞之存在下，當其與具有活化獼猴T細胞之抗-CD3臂的對照Ab 4雙專一性抗體培養時，殺死了Raji。雙專一性抗體以及對照Ab1(抗-CD3 mAb)二者在U937 Fc/FcR依賴的致死分析中顯現活性。此活性應可藉由於反應中加入阻斷非專一性人類IgG來加以阻斷(數據未顯示)。
實例6. 包括嵌合的CH區之CD20 x CD3雙專一性抗體在一CDC分析中 顯現降低的效應子功能
將帶有嵌合CH區之CD20xCD3雙專一性抗體(抗體1和抗體2)，如上文實例2中所述，工程化以改變或降低效應子功能。相較於包括同型IgG1之野生型(wt)重鏈恆定區的抗體(對照Ab 4)，CH區的取代可能阻礙Ig Fc與其受體結合之能力。因此，訊號傳遞和免疫反應，例如B細胞活化或吞噬作用，可能改變。檢測CH區中的胺基酸修飾對於補體依賴的細胞毒性(CDC)(在此實例中)及抗體-依賴的細胞媒介細胞毒性(ADCC)效應子功能(參見實例7)之效應。
為了檢測抗體1和抗體2對CDC效應子功能之效應，係在5%人類血清補充劑的存在下將CD20-表現Raji(目標)細胞(5000/孔)或Daudi細胞植入測定盤中。將抗體1、抗體2和對照抗體的連續稀釋液，以100nM開始，於37℃加到細胞中歷經4h。使用CytoTox GloTM套組(Promega)測定目標細胞裂解並計算細胞毒性百分比。
使用下列方程式計算細胞毒性百分比：細胞毒性%=((LS-LSR)/(LMR-LSR))*100%其中LSR為基線發光而LMR為經毛地黃皂苷(digitonin)裂解之細胞所釋放的最大鈣黃綠素。細胞毒性之EC50係使用Prism軟體(GraphPad)來測定。數值係使用4-參數非線性迴歸分析來計算並如表1表12以及圖5A和5B所示。
相較於具有wt重鏈恆定區之對應抗體，抗體1和體2對抗Daudi和Raji細胞之CDC活性顯著地減低。參見表12和圖5A/B。觀察到抗體1對抗Raji細胞之某些CDC活性，然而，整體的結果顯示，嵌合的抗體在提升效應子反應上比wt IgG1 Fc對照抗體更弱。
表12：包括嵌合CH區之CD20xCD3雙專一性抗體在測量效應子功能之CDC分析中展現降低的活性
Figure 104108403-A0202-12-0096-22
 NA：無活性
實例7. 包括嵌合CH區之CD3xCD20雙專一性抗體在ADCC分析中顯現降低的效應子功能
為了檢測抗體1和抗體2與帶有野生型CH區(及相同可變區)之雙專一性抗體對ADCC效應子功能之效應，係將新鮮分離的非刺激CD56-陽性NK細胞或經工程化表現FcγRIIIA之較高親和力V等位基因的NK92細胞在嵌合CH-抗體(抗體1和抗體2)及wt-CH對照抗體(對照抗體4)的存在下，置入含鈣黃綠素-標定的CD20-陽性Raji或Daudi細胞的盤中。監測從目標細胞釋放的鈣黃綠素及測定細胞毒性百分比。如上文CDC分析所述，計算細胞毒性百分比和EC50。結果係如表13及圖6A和6B中所示。
嵌合的CH抗體、抗體1和抗體2並無媒介對抗Raji或Daudi細胞之ADCC活性(表13)。
Figure 104108403-A0202-12-0096-23
 NA：無或性；#：背景細胞毒性~20%
實例8. 嵌合抗體之表面電漿子共振衍生的結合親和力和動力學常數
使用表面電漿共振(SPR)(Biacore)技術分析具有嵌合恆定重鏈區之抗-CD3 x抗-CD20雙專一性抗體，抗體1和抗體2，用以測定其與人類和獼猴Fcγ受體之動力學結合參數。以類似的方式檢測同型對照組，亦即wt-IgG1同型對照組和wt-IgG4 CPPC同型對照組。
簡言之，SPR實驗係於25℃在Biacore T200儀器上運用一塗覆羧甲基葡聚醣(CM-5)晶片來進行。使用標準的胺-偶合化學將小鼠的單株抗-五-組胺酸抗體(GE Healthcare)固定在CM-5感應晶片之表面上。將His-標記的人類或猴子FcγR蛋白之140RU-376RU捕捉至抗-五-組胺酸-偶合CM-5晶片並於捕捉的蛋白上以20μl/min注射抗體儲存液歷時2.5min。監測mAb結合反應，及，就低親和力受體，計算穩態的結合平衡。藉由處理數據及使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體與1：1結合模型擬合，測定動力結合(ka)和裂解(kd)速率常數。從動力學速率常數計算結合裂解平衡常數(KD)和裂解半衰期(t1/2)：KD(M)=kd/ka；及t1/2(min)=(ln2/(60*kd)。
Figure 104108403-A0202-12-0097-25
 NB：無偵測到結合
如表14中的結果所示，相較於具有野生型(wt)hIgG1或hIgG4-CPPC CH區之抗體，在SPR分析中抗體1和抗體2雙專一性抗體 並未顯示與人類FcγRI結合。相較於帶有wt hIgG1或hIgG4-CPPC Fc序列之抗體，本發明之嵌合重鏈雙專一性抗體對數種低親和力人類FcRγ受體亦展現微弱至無結合(例如對人類FcRγIIA、FcRγIIB微弱結合，而對人類FcRγI、FcRγIIIA或FcRγIIIB則未偵測到結合)(下表15)。
Figure 104108403-A0202-12-0098-26
 NB：無偵測到結合
實例9.嵌合抗體的藥物動力學性質
抗體1和抗體2之毒理動力學性質係藉由從接受單一30-分鐘IV輸注的雄性獼猴得到血液樣本(3隻動物/治療組)，接著12週的觀察期來評估。用於血清中總藥物濃度之毒理動力學分析的血液樣本係於給劑前和給劑後5分鐘和5、24、48、72和168小時，以及第14、21、35、49、66和84天所收集。將所得到的樣本以直接的酵素結合免疫吸附分析(ELISA)分析，用以測定Ab 1或Ab 2之總藥物濃度。使用非隔室分析 (Phoenix WinNonLin)評估受試品項之毒理動力學，以測定藥物動力學參數。結果係如表16所示(AUC=濃度與時間曲線下面積；Cmax=實測的血清中最大濃度)。
Figure 104108403-A0202-12-0099-27
在獼猴中1.0mg/kg之Ab1和Ab2的單一靜脈給劑後，觀察到平均高峰濃度(Cmax)分別為33.4和26.0μg/mL，及平均AUC0-168h值分別為100和61.1天*ug/mL。表觀最終半衰期預估係介於這二個分子之8.14-14.0天。數據顯示，在所有的動物中就大多數12週觀察期維持連續暴露於Ab1和Ab2且在各治療組中為相當的。受試的品項並無觀察到表觀的致免疫性。Ab1和Ab2整體藥物動力學樣貌為給劑於獼猴之典型的單株抗體。
實例10. CD3xCD20雙專一性抗體可用比單專一性抗體更低的劑量在獼猴中去除CD20+B-細胞
就測定抗體1和對照抗體4 CD3xCD20雙專一性抗體給藥之活體內效力，係在給予抗-CD3xCD20雙專一性抗體後，經由FACS檢測獼猴週邊血液CD20+B-細胞量的變化，與單專一性抗-CD20抗體(對照Ab 3)相比較。此研究係在編成8個給劑組，每個給劑組3隻動物之雄性獼猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis))中如下進行：第1組為安慰劑組(媒劑 對照給藥)；第2組接受30mg/kg之單專一性抗體(對照Ab 3；rituxan)(猴子中30mg/kg相當於375mg/m2之人類劑量，其被認為是最大臨床劑量)；第3組為0.01mg/kg之雙專一性CD3xCD20對照抗體4；第4組-0.1mg/kg之抗體4；第5組-1mg/kg之抗體4；第6組-0.01mg/kg之抗體1；第7組-0.1mg/kg之抗體1；及第8組-1mg/kg之抗體1。在給劑動物前第-7和-4天抽血。抗體藥物或媒劑(安慰劑)之劑量係經由i.v.輸注來給藥，並於給劑後第2、4和7天抽血。以FACS就B細胞(CD20；表17)和T細胞(CD3，參見下文)標記分析血液樣本並測定這些細胞類型的絕對數。
簡言之，將100μl的血液以1.5ml RBC裂解緩衝液於Eppendorf試管中培養3分鐘。將細胞以0.4xg離心5分鐘，以FACS清洗液(PBS+3%FBS)清洗2x並於室溫以Fc阻斷試劑阻斷10分鐘。然後將細胞於4℃以直接接合hCD45和CD20螢光試劑的抗體培養30分鐘。使用由CD45螢光染劑和側散射特性(SSC)界定(CD45brightSSCdim)所組成之異源性閘控策略先進行B細胞子群(CD20)或T細胞子群(CD3)的定量測定，描繪白血液細胞(WBC)群族。然後經由使用適當螢光標定的抗體(CD20 APC-Cy7)鑑別B細胞群族。染色後，清洗細胞二次，之後以FACSCanto細胞儀獲得FACS，並以FlowJo軟體分析。結果係如表17以及圖11A和11B所示。
Figure 104108403-A0202-12-0100-28
Figure 104108403-A0202-12-0101-29
如表17和圖11A中所示，以第1個測量的時間點(第2天)，給予CD3xCD20雙專一性抗體和抗-CD20單專一性抗體造成循環的B-細胞減少至基線量。此減少在安慰劑對照動物組中並未看到。在雙專一性抗體之1mg/kg給劑後，雙專一性組中B細胞去除維持1週，在0.01和0.10mg/kg劑量的雙專一性組同樣維持B細胞去除。
在此實驗中亦以螢光標定的抗-CD3抗體監測T-細胞(CD3+)量。在雙專一性抗體組(Ab4和Ab1；所有劑量)中於給劑後第2天觀察到過渡性喪失循環的T-細胞。在媒劑(安慰劑)對照和對照Ab3(Rituxan)組中於測量的時間點並未觀察到T細胞喪失。在雙專一性抗體組中在第4天的時間點T-細胞量回到基線量，並維持在基線量直到實驗結束(參見圖11B)。
抗體1和抗體4 CD3xCD20雙專一性抗體之活體內效力係以一長期(3個月)研究於獼猴週邊血液中測量CD20+B-細胞量或CD3+T-細胞量之變化，類似上述研究。在第0天投予1.0mg/kg之安慰劑(媒劑)或雙專一性抗體。於二個雙專一性抗體組中，週邊血液中B-細胞量在第2天顯著減少，且在所有的樣本中(安慰劑除外)，於整個研究期內量維持減少(參見圖12A)。於雙專一性組中，第2天觀察到過渡性T-細胞喪失，然後在第4天回復到基線量，且就經雙專一性抗體治療的動物，如整個研究(>80天)中所測，係維持大約的基線(圖12B)。在以安慰劑治療的動物中並無觀察到過渡性T-細胞喪失。
就進一步測量低劑量給藥之抗體1和抗體4 CD3xCD20雙專一性抗體的活體內效力，係以一長期(2個月)研究於獼猴週邊血液中測量CD20+B-細胞量或CD3+T-細胞量之變化，類似上述實驗。在第0天投予0.01mg/kg或0.001mg/kg(1μg/kg)之雙專一性抗體。就二個CD3xCD20組，週邊血液中B-細胞量在第2天顯著減少，且於整個研究期內量維持減少(參見圖13A)，與高劑量CD3xCD20雙專一性抗體治療的動物中所觀察到的相類似(參見表17和圖11A或12A)。以非常低劑量(1μg/kg)的雙專一性抗體治療的動物，如同以較高劑量CD3xCD20雙專一性抗體治療的動物中所見到的，歷經相同的過渡性T-細胞喪失及恢復(參見圖13B與圖11B或12B相比)。
如在上述研究中所觀察到的B-細胞喪失係與經CD3xCD20-嵌合Fc抗體1治療的動物之週邊血液中循環抗體的喪失相關(參見圖14)。當動物循環中的抗體暴露隨時間減少，B-細胞群族開始恢復(例如在動物編號I06881中第81天所觀察到的)。
B-細胞喪失與週邊血液中循環抗體喪失之相關性亦在經CD3xCD20-嵌合Fc抗體2治療的動物中可看到(參見圖15)，當動物循環中的抗體暴露隨時間減少，則B細胞群族開始恢復，如在動物編號I06876中第66天，及在動物編號I06877中第68天所觀察到的。類似的相關性在經CD3xCD20-wtFc(Ab 4)雙專一性抗體治療的動物中亦可看到(參見圖16)。當動物循環中的抗體暴露隨時間減少，B細胞群族開始恢復(參見圖16，如在動物編號I06870中第91天，及在動物編號I06872中第64天所觀察到)。
實例11. CD3xCD20雙專一性抗體可用比單專一性抗體更低的劑量減少獼猴淋巴樣組織中CD20+B-細胞
投予抗-CD3xCD20雙專一性抗體(抗體1或抗體4)後，經由FACS檢測獼猴淋巴樣組織中CD20+B-細胞量的變化，與單專一性抗-CD20抗體(對照Ab 3-Rituxan)相比較。此研究係在編成8個給劑組，每個給劑組3隻動物之雄性獼猴(Macaca fascicularis)中如下進行，係類似上文實例10之1-8組中所述。抗體藥物或媒劑之劑量係經由i.v.輸注來給藥，及於給劑後第7天將動物安樂死並收集組織。就白血液細胞(CD45+)和特別是B細胞(CD20+)、標記以FACS分析組織樣本，然後測定B細胞的體積%。
經由使用適當螢光標定的抗體(CD20 APC-Cy7)鑑別B細胞群族並類似上述實例10之方法獲得FACS。結果係如表18以及圖17A和17B所示。
Figure 104108403-A0202-12-0103-30
Figure 104108403-A0202-12-0104-31
如表18和圖17A中所示，投予CD3xCD20雙專一性抗體，相較於抗-CD20單專一性抗體，就雙專一性組以低很多的劑量(0.01至1.0mg/kg劑量)造成脾臟中組織B細胞減少。此減少在安慰劑對照動物組中並未看到。
如表18和圖17B中所示，投予CD3xCD20雙專一性抗體，相較於抗-CD20單專一性抗體，就雙專一性組以低很多的劑量(0.01至1.0mg/kg劑量)造成腸系膜淋巴結中組織B細胞減少，其中0.1mg/kg劑量和1mg/kg劑量的雙專一性抗體比單專一性組產生更有效的B細胞減少。此 減少在安慰劑對照動物組中並未看到。在CD20之免疫組織化學染色時(數據未顯示)，在單專一性-治療(Rituxan® 30mg/kg)的淋巴結中偵測到殘餘的B-細胞。從0.1至1.0mg/kg雙專一性抗-CD3xCD20抗體治療組所收集的組織中並未偵測到殘餘的B細胞。這些數據驗證了Ab1和Ab1具有比Ab3更強殺死B細胞之深度。
實例12.以CD3 x CD20雙專一性抗體治療腫瘤 A.以CD20 x CD3雙專一性抗體治療，抑制了NSG小鼠中Raji腫瘤生長
就評估選擇的抗-CD3xCD20雙專一性抗體對降低Raji腫瘤生長的效力，係將購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine,USA)之NSG小鼠(NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull小鼠)以皮下共同植入2x106個Raji腫瘤細胞和5x105個人類PBMC(第0天)。在同一天，以抗體1或對照抗體5(不相關標靶之IgG1抗體)或對照媒劑之0.4、0.04或0.004mg/kg腹膜內劑量治療每隻小鼠(每組治療組N=5隻小鼠)。由第0天開始，以藥物或媒劑之腹膜內劑量每週二次治療小鼠進行至其餘的研究天數。使用游標尺每週測量腫瘤大小2次，且腫瘤體積係計算為體積=(長x寬2)/2。利用GraphPad軟體Prism 5.0(MacIntosh Version)進行統計分析。
藉由雙因子ANOVA以杜凱氏多重比較事後測驗(Tukey’s multiple comparisons post-test)測定統計顯著性。將各讀值之數據於治療組間交叉比較。p<0.05之閥值視為統計上顯著的。
結果係顯示在圖7A-7F中。這些結果顯示抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc)以共同植入人類免疫細胞之小鼠中Raji腫瘤為標靶，造成在受試劑量時完全抑制腫瘤生長(圖7C：0.4mg/kg Ab1；圖7E：0.04mg/kg Ab1；圖7F：0.004mg/kg Ab1)。此實例驗證了，在腫瘤植入時開始以CD3xCD20雙專一性抗體1治療對於抑制腫瘤生長為有效的。相對於 對照組，在給予0.4、0.04或0.004mg/kg劑量的抗體1小鼠中，Raji腫瘤生長直到植入後23天仍完全受到抑制。於研究期間，在抗體1或對照抗體中皆未觀察到對小鼠體重有顯著的影響(數據未顯示)。
以一類似的NSG小鼠模型(如上述)進一步試驗CD3xCD20雙專一性抗體的抗腫瘤效應，然而各NSG小鼠係在第-1天給劑1mg小鼠IgG(mIgG2a Fc)，之後每週一次。結果係如圖8A-8B所示。
此實驗驗證了，在腫瘤植入時開始，在循環IgG的存在下以受試的雙專一性Ab劑量之CD3xCD20雙專一性抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc)或CD3xCD20雙專一性抗體4(CD3xCD20-wtFc)治療對於抑制腫瘤生長為有效的(圖8A-8B)。如圖8A所見，於本實驗中抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc雙專一性抗體)在有或無IgG1補充劑時，於受試的期間內展現完全的腫瘤抑制。
B.以CD3xCD20雙專一性抗體治療在NSG小鼠中縮小了已建立的腫瘤
評估選擇的抗-CD3xCD20雙專一性抗體在NSG小鼠(NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull小鼠)中降低已建立腫瘤之效力。NSG小鼠係購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine,USA)並以皮下共同植入HLA-相合的Raji腫瘤細胞(2x106)和人類PBMC(5x105)(第-15天)。在治療前讓腫瘤於宿主中建立15天。在給藥的前一天(第-1天)，小鼠各給劑5mg mIgG2a Fc之補充劑。隨後將小鼠在實驗期間以每週一次每隻小鼠給劑5mg的mIgG2a Fc(第7天、第14天等)。在給藥前根據腫瘤大小將小鼠分成2個實驗組：第1組：~200-400mm3或第2組：~500-900mm3。
藥物治療後，於第0、3、6、10、14、17、21和28天監測各小鼠腫瘤大小並記錄。每週二次使用游標尺測量腫瘤大小，並計算腫瘤體積為體積=(長x寬2)/2。亦以觸知測定腫瘤的存在。利用GraphPad軟 體Prism 5.0(MacIntosh Version)進行統計分析。將來自各讀出值之數據於治療組中交叉比較。結果係如圖9和10中所示。
a.第1組：~200-400mm3腫瘤。在第0天開始，以所試劑量之藥物或媒劑每週一次(亦即第7天、第14天等)如下治療各4或5隻小鼠的數個小組：
i.對照：單獨的媒劑
ii.對照抗體5，0.4mg/kg
iii.抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc),0.4mg/kg
b.第2組：~500-900mm3腫瘤。在第0天開始，以所試劑量之藥物或媒劑每週一次(亦即第7天、第14天等)如下治療各4隻小鼠的數個小組：
i.對照抗體5，0.4mg/kg
ii.抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc),0.4mg/kg
在投予0.4mg/kg抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc)的小鼠於14天腫瘤完全消退。參見圖9。
在帶有較大已建立腫瘤之模型中(亦即，第2組，~500-900mm3)，抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc)治療(0.4mg/kg)在第21天所觀察的腫瘤完全消除。參見圖10，其驗證了Ab1在治療帶有體積大於0.5cm及高達0.9cm之大淋巴瘤塊(亦即CD20表現陽性之腫瘤)小鼠中的效用。
實例13. CD3xCD20雙專一性抗體在活體外引發PBMC增生
選擇的CD20xCD3雙專一性抗體及對照組結構刺激週邊血液單核細胞(PBMC)及引發增生作用之能力係使用ATP催化的定量分析(CellTiter Glo®)來評估。PBMC之活化造成細胞激素釋放，其驅動細胞增生。
使用下列方法得到增生數據：將人類或獼猴衍生的PBMC(5x105/孔)以3-倍連續稀釋之抗-CD3 xCD20或對照抗體及市售的抗-CD28 抗體(人類：200ng/mL，獼猴：500ng/mL)於37℃培養72h。使用Cell Titer Glo®定量細胞並使用VICTOR X5多標定盤式判讀儀(PerkinElmer)測量作為細胞存活讀數之發光量，用以偵測活細胞。細胞存活(刺激與未刺激細胞之誘發倍率)係藉由將刺激細胞的發光除以未刺激細胞的基線發光並使用Prism軟體作圖來測定。結果係彙整於表19以及圖18A和18B中。
Figure 104108403-A0202-12-0108-32
 數據為3或多個獨立分析之中位數。NA=無活性。
如表19和圖18A-18B中所示，本發明之二種CD20 x CD3雙專一性抗體引發了人類或獼猴PBMC之增生。抗體1以大約相等的效力引發人類和獼猴二者PBMC之增生。對照Ab5不具有活性。
實例14. CD20 x CD3雙專一性在活體外藉由活化的T-細胞媒介細胞致死
分別於ficoll-Plaque上或使用淋巴溶解素哺乳動物細胞分離液(Lympholyte Mammal cell separation media)分離人類或獼猴PBMC。將分離的PBMC(1x106個細胞/mL人類PBMC或5x106個細胞/mL獼猴PBMC)，於含有重組的人類IL-2(30U/mL用於人類PBMC，100U/mL用於獼猴PBMC)及T細胞活化微珠(抗-CD3/CD28用於人類PBMC，抗-CD2/CD3/CD28用於獼猴PBMC)之完全培養基(RPMI補充10% FBS、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、292μg/mL L-麩醯胺酸)分別活化7和21天。將CD20表現的Raji細胞(2x106個細胞/mL)於37℃以8μM鈣黃綠素-AM標定30分鐘並以培養基沖洗3次。將鈣黃綠素-標定的標靶細胞 (10,000-20,000個細胞/孔)於37℃置入200μL含有活化T細胞(效應子/標靶細胞比率10：1)及抗體1、Ab 4或對照Ab 5之連續稀釋液(人類濃渡範圍：2nM至0.00003nM；獼猴濃度範圍：6.6nM至0.002pM)完全培養基中2小時。培養後，將培養盤離心並將上清液轉置於半透明黑色底部澄清的盤中進行螢光分析。使用下列方程式計算細胞毒性百分比：細胞毒性%=((FS-FSR)/(FMR-FSR))*100%，其中FS為從試驗孔槽釋放出的鈣黃綠素，FSR為自發性鈣黃綠素釋放而FMR為經Triton-X裂解的細胞所釋出之最大鈣黃綠素。
使用Prism軟體測定細胞存活的之EC50(ATP催化性定量分析)。細胞裂解(細胞毒性)係藉由鈣黃綠素釋放作為最大釋放的分數所測量。將所觀察的釋放與最大釋放相比，計算細胞毒性百分比並測定EC50值。結果係如表20及圖19A(人類T-細胞)和19B(猴子T-細胞)中所示。
Figure 104108403-A0202-12-0109-34
 NA=無活性；NT=未測試
如表20中所示，抗體1分別以25.0ρM和9.10ρM對人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細胞之帶表性EC50值媒介了目標細胞致死。抗體4分別以15.7pM和1.73pM對人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細胞之代表性EC50值媒介了目標細胞致死。對照組未觀察到活性。
為了以流式細胞儀監測帶有CD20的標靶細胞之專一性致死，係將B16F10.9親代鼠科骨髓瘤細胞(不會表現CD20)及經工程化穩定 表現人類CD20之B16F10.9細胞(B16F10.9/CD20)分別以1μM的螢光追蹤染劑羧基螢光素二乙酸鹽琥珀醯亞胺酯(CFDA-SE)和Violet Cell Tracker標定。標定後，將細胞以1：1比率混合，並於37℃放置隔夜。個別地，將人類PBMC以1x106個細胞/mL置入補充的RPMI培養基並於37℃培養至隔夜，藉由去除黏附的巨噬細胞、樹突細胞和某些單核細胞來豐富淋巴細胞。隔天，將標靶細胞與去除黏附細胞的天然PBMC(效應子/標靶細胞4：1比率)及試驗的CD3xCD20雙專一性抗體或IgG1對照抗體5的連續稀釋液(濃度範圍：66.7nM至0.25ρM)於37℃共培養48小時。使用無酵素細胞裂解緩衝液從細胞培養皿移出細胞，並以FACS分析。就FACS分析，係將細胞以死/活far red cell tracker(Invitrogen)染色。就評估致死之特異性，係將細胞閘控在活的Violet和CFDA-SE標定的族群上。記錄各族群的百分比如下用於計算調整的存活：調整的存活=(R1/R2)*100，其中R1=[(B16F10.9/CD20)/旁觀細胞(B16F10.9)]*100在無抗體之下，及R2=相同的比率但在試驗抗體的存在下。
Figure 104108403-A0202-12-0110-35
 NA=無活性。
CD3xCD20-嵌合Fc(抗體1)和CD3xCD20-wtFc(抗體4)二者在細胞的混合群族中專一性引導人類T細胞僅殺死表現CD20之標靶細胞(圖20A-B)。僅在雙專一性抗體的存在下觀察到標靶細胞致死，其中B16F10.9/CD20細胞係以劑量依賴的方式被抗體1(EC50 19.5ρM)和抗體4 (EC50 12.8ρM)去除(圖20B)。低於5%的CD20-表現細胞在受試的最高劑量(10μg/mL)時仍存活(圖20B)。就對照Ab5，一種IgG1對照抗體，在親代B16F10.9細胞群族或B16F10.9/CD20群組為觀察到死亡證據。
實例15.在20小時FACS的活體外分析中CD3xCD20雙專一性抗體上調了T細胞上之早期活化標記CD69
CD69+為其中一種指出T細胞已被活化之最早可誘發的細胞表面標記。T-細胞活化可藉由檢驗上調的特定細胞表面標記，例如CD69來測定。
CD3xCD20雙專一性抗體上調全血中人類或獼猴T細胞上之早期活化標記CD69的能力係藉由20小時活體外FACS分析來測定。簡言之，藉由將新鮮分離的人類或獼猴全血於平底96孔盤以5-倍(人類)或10-倍(獼猴)的抗體1、抗體4或對照Ab 5之連續稀釋液(濃度範圍50nM至0.0006nM)於RPMI+L-麩醯胺酸中在37℃培養20小時，來評估T細胞活化。培養後，將培養盤以1000rpm旋轉5分鐘並移除血漿。就測量T細胞上CD69上調，係將含直接接合CD2和CD69之抗體，以及CD45、CD4、CD8，和CD19(人類)或CD16(獼猴)之混合液，於4℃直接加到血液中歷時30分鐘。依照製造商的說明以1.5mL PharmLyse緩衝液溶離紅血球。清洗細胞二次，懸浮於200μL冷的PBS+1% FBS中，並以流式細胞儀使用BD FACSCanto細胞計數器分析。以首先閘控在能生存的小CD45+淋巴細胞，然後閘控在CD19-/CD2+/CD4+T細胞(人類)或CD16-/CD2+/CD4+T細胞(獼猴)，鑑別CD4+T細胞。
記錄總CD2+效應子細胞中活化的(CD69+)T細胞百分比。參見表22以及圖21。結果顯示，如早期活化標記CD69所偵測，CD3xCD20雙專一性抗體顯著地活化T細胞。
Figure 104108403-A0202-12-0112-36
 NA=無活性
實例16. CD3xCD20雙專一性抗體引發T細胞與標靶細胞群聚
使用細胞群聚模式測定CD3xCD20雙專一性抗體係經由其雙專一性結合臂橋接T-細胞與標靶細胞(CD20+細胞)。將效應子細胞以CFSE預先染色，及以Violet Cell Tracker將CD20+細胞預先染色24小時，並以不相關的對照抗體(對照抗體5，不相關IgG1同型抗體)培養後閘控分開四象限。參見圖22A，其係描繪對於以不相關抗體治療的細胞混合物中無群聚(雙重-染色)。以CD3xCD20雙專一性抗體培養後，由於染上CFSE和Violet二者，則出現細胞群聚(參見圖22B，在散射圖之左上方象限以粗黑方框標出)。
實例17. CD3+細胞上Tim-3和PD-1標記之抑制表現
T細胞功能障礙或衰竭係發生在帶有腫瘤之宿主中。已鑑別出Tim-3和PD-1受體為慢性疾病狀態中T細胞衰竭的標記。根據研究人員Sakuishi,K.等人(J.Exp.Med.207(10)：2187-2194,2010)，Tim-3和PD-1陽性(Tim-3+PD-1+TIL)之腫瘤浸潤的淋巴細胞(TIL)，如無法增生和產生IL-2、TNF和IFN-γ所定義，具有最嚴重的衰竭表型。
由以皮下共植入HLA-相合Raji腫瘤細胞和人類PBMC之NSG小鼠的血液和腫瘤中萃取CD3-陽性細胞-參見上文實例12B。簡言之，在治療前讓腫瘤在宿主中建立15天-然後將小鼠以腫瘤大小為基礎分成二個治療組(參見實例12B)。從各研究組在第9天由經治療(雙專一性Ab)和 未經治療的小鼠中萃取血液，亦即第1組~200-400mm3或第2組~500-900mm3。在實驗結束時將具有達到1500mm3腫瘤未經治療的小鼠安樂死並將這些腫瘤進行PD1和Tim-3表現之檢測。
就循環的T細胞實驗，係選擇可存活的CD45+CD3+T細胞比率使用Tim-3或PD-1之直接標定抗體(可購自Biolegend)進行標記鑑定。Tim-3+PD-1+細胞在未治療動物血液中循環T細胞佔優勢比率。然而，在經CD20xCD3雙專一性抗體(Ab 1)治療的動物血液中T細胞則展現較低的Tim-3+PD-1+細胞比率。
將來自未治療宿主的腫瘤細胞分離並就存活性染色。就存活的單一細胞進行FACS分析，用以挑選出CD45+CD3+細胞比率，然後檢測其Tim-3或PD-1表現。
吾等已發現，在實例12B所述的實驗期間，抑制的受體Tim-3和PD-1係表現在未經治療小鼠之NSG B細胞淋巴瘤的CD3+TIL上，而Tim-3+PD-1+細胞在T細胞浸潤腫瘤佔優勢比率。
實例18.於帶有已建立Raji腫瘤之NSG小鼠中以CD3xCD20雙專一性抗體治療比抗-CD20+抗體更有效
評估選擇的抗-CD3xCD20雙專一性抗體在降低NSG小鼠中已建立腫瘤之效力。將NSG小鼠(NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull小鼠；Jackson Laboratories)以皮下共植入Raji腫瘤細胞(2x106)和人類PBMC(5x105)(於第-14天)(類似上文中實例12B)。
在抑制已建立Raji腫瘤上，CD20xCD3雙專一性Ab1(以0.4mg/kg；2x/週i.p.給劑)係與CD19xCD3 BiTE(以0.5mg/kg；5x/週i.v.給劑)(圖23)相當但優於利妥昔單抗治療(以8mg/kg；5x/週i.p.給劑)(圖24)， 因此驗證了Ab1在治療患有體積大於0.5cm之大淋巴瘤塊的動物為效的。
實例19.以CD3xCD20雙專一性抗體治療CD20+黑色素瘤
研究人員已測定出，在病患中特定的黑色素癌亞群，例如CD20+黑色素腫瘤細胞，可代表腫瘤起始特癥及較高的疾病再發生風險(Pinc等人Mol Ther.20(5)：1056-1062,2012,epub 2012 Feb 21)。CD20xCD3雙專一性抗體Ab1展現對抗表現CD20之B16F10.9腫瘤細胞的有效活性，因為其在免疫-適當的小鼠中顯著地延緩hCD20-轉導的B16F10.9(B16F10.9/CD20)腫瘤生長。
CD3之人源化小鼠(人源化CD3γε小鼠)係於CD20位置人源化，使得小鼠表現二種人源化蛋白。將人源化CD3/CD20小鼠以皮下植入2x105個經人類CD20轉導的B16F10.9黑色素瘤腫瘤細胞(K.Peters/Charles Lin；Duke University)。在第0天開始(腫瘤移植當天)，將小鼠以每週2次腹膜內之媒劑(PBS；n=5)、0.4mg/kg對照Ab5(抗不相關抗原之抗體；n=5)、0.4mg/kg的Ab1(N=5)或0.004mg/kg Ab1(n=5)治療。所測量的腫瘤體積係如圖25A中所示。當腫瘤達到大於1500mm3體積時，將小鼠安樂死。如圖25A所示，當治療係與腫瘤移植同時開始時，以Ab1治療延緩了腫瘤生長。
在一分開的實驗中，亦檢測Ab1抑制已建立腫瘤之腫瘤生長的能力(圖25B)。將人源化CD3/CD20小鼠以皮下植入2x105個表現人類CD20之B16F10.9黑色素瘤腫瘤細胞。在腫瘤移植後的第10天，將小鼠以腫瘤大小為基礎隨機化並分成下列治療組，每組5隻小鼠：媒劑(PBS)、4mg/kg對照Ab5(抗不相關抗原之對照抗體)、4mg/kg的Ab1或0.4mg/kg Ab1。所有的小鼠係以1週2次i.p.治療。當腫瘤達到大於1500mm3體積 時，將小鼠安樂死。如圖25B所示，以Ab1治療延緩了腫瘤已建立腫瘤的生長，其驗證了Ab1展現對抗表現CD20之B16F10.9黑色素瘤細胞地有效活性。
本發明並不希望被限制於文中所述的特定實施例之範圍中。實際上，由前述說明及伴隨的圖示，各種本發明之修改對於熟習本項技術者將變得顯而易見。此等修改係希望落在所附的申請專利範圍內。
<110> 美商再生元醫藥公司(REGENERON PHARMACEUTICALS,INC.)
<120> 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (18)

  1. 一種雙專一性抗體於製備治療或改善患者之B-細胞癌症的藥物之用途，其中該雙專一性抗體係包括結合人類CD3之第一抗原結合區、結合人類CD20之第二抗原結合區，以及拴住各第一和第二抗原區之重鏈恆定(CH)區，其中：(a)該結合人類CD3之第一抗原結合區(A1)包含三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2、HCDR3)與三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中A1-HCDR1包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；A1-HCDR2包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；A1-HCDR3包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；且A1-LCDR3包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(b)該結合人類CD20之第二抗原結合區(A2)包含三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2、HCDR3)與三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中A2-HCDR1包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；A2-HCDR2包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；A2-HCDR3包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；且A2-LCDR3包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；且(c)該CH區包含： 人類IgG1或人類IgG4 CH1區；包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54之胺基酸序列的絞鏈；人類IgG4 CH2區；與人類IgG1或人類IgG4 CH3區，其中在表面電漿子共振分析測量時，該雙專一性抗體對人類Fc γ RIIA展現相對於人類Fc γ RIIB較高之結合親和力，且對於人類FcγRI與人類FcγRIII展現少許或無可測得之結合親和力。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該B-細胞癌症係由下列組成之群中選出；濾泡型淋巴癌、B-細胞慢性淋巴性白血病、B-細胞淋巴母細胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、瀰漫型大B細胞淋巴癌、邊緣區淋巴癌、被套(Mantle)細胞淋巴癌、髮樣細胞白血病和勃氏淋巴癌。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該B-細胞癌症為濾泡型淋巴癌。
  4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該B-細胞癌症為瀰漫型大B細胞淋巴癌。
  5. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該B-細胞癌症為被套細胞淋巴癌。
  6. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該B-細胞癌症為邊緣區淋巴癌。
  7. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該患者係患有對(a)單獨的抗-CD20單專一性治療，或(b)利妥昔單抗單一治療具抗性或不完全反應之腫瘤。
  8. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該患者在投予雙專一性抗體之前，已接受一抗-CD20單專一性抗體治療至少1天至1年。
  9. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體：(a)結合至人類FcγRIIA，其在表面電漿子共振分析測量時，在25℃下具有介於10與30uM間之KD值；或 (b)結合至人類FcγRIIB，其在表面電漿子共振分析測量時，在25℃下具有介於100與250uM間之KD值。
  10. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體：(a)在活體外細胞毒性分析測量時，相較於包括野生型Fc區之抗體，具有降低的抗體-依賴-細胞毒性(ADCC)；(b)此抗體具有極輕微或無可偵測的ADCC；(c)在活體外細胞毒性分析測量時，相較於包括野生型Fc區之抗體，具有降低的補體依賴細胞毒性(CDC)；(d)在活體外分析藉由測定細胞裂解測量時，具有低於50%細胞毒性；(e)具有極輕微或無可偵測的CDC；(f)相較於包括野生型Fc區之抗體，引發降低的T細胞媒介殺死帶有Fc受體的細胞，或(g)相較於包括野生型Fc區之抗體，引發降低的由帶有Fc受體細胞所媒介之T細胞致死。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之用途，其中該專一性結合人類CD3之第一抗原結合區包含重鏈可變區(HCVR)胺基酸序列，其包含SEQ ID NO：10；以及輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其包含SEQ ID NO：18。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該專一性結合人類CD20之第二抗原結合區包含重鏈可變區(HCVR)胺基酸序列，其包含SEQ ID NO：2；以及輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列，其包含SEQ ID NO：18。
  13. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之用途，其中該雙專一性抗體包含CH區，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列。
  14. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之用途，其中該雙專一性抗體包 含CH區，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之用途，其中該雙專一性抗體包含CH區，其包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之用途，其中該雙專一性抗體包含CH區，其包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該雙專一性抗體包含CH區，其包含拴至(tethered to)第一抗原結合區之SEQ ID NO：28的胺基酸序列以及CH區，其包含拴至第二抗原結合區之SEQ ID NO：26的胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該雙專一性抗體包含CH區，其包含拴至(tethered to)第一抗原結合區之SEQ ID NO：32的胺基酸序列以及CH區，其包含拴至第二抗原結合區之SEQ ID NO：30的胺基酸序列。
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