KR20210120031A

KR20210120031A - 신규한 이중특이적 cd3/cd20 폴리펩티드 복합체

Info

Publication number: KR20210120031A
Application number: KR1020217026760A
Authority: KR
Inventors: 윈잉 첸; 친 메이; 지안칭 쉬; 쭈오츠 왕; 징 리
Original assignee: 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-10-06
Also published as: WO2020156405A1; EP3917969A4; JP2022518530A; US20220162312A1; EP3917969A1; JP7261307B2; TWI754211B; TW202030206A

Abstract

본 개시 내용은 폴리펩티드 복합체의 제1 항원-바인딩 모이어티 및 제2 항원-바인딩 모이어티를 함유하는 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체, 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체의 제조 방법, 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체를 사용하는 질환 또는 장애의 치료 방법, 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

신규한 이중특이적 CD3/CD20 폴리펩티드 복합체

본 출원은 2019년 1월 28일자로 출원된 PCT/CN2019/073418에 우선권을 주장하며, 이는 참조에 의해 본 개시내용 전체에 통합된다.

본 출원은 전자 형태의 서열 목록으로 제출된다. 서열 목록의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

본 출원은 일반적으로 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다.

이중특이적 항체는 치료용 항체의 새로운 범주로 성장하고 있다. 그들은 두 개의 다른 표적 또는 표적에 두 개의 다른 에피토프를 바인딩하여 개별 항체의 효과보다 우수한 부가적 또는 상승적 효과를 생성할 수 있다. DVD-Ig, 크로스맵 (CrossMab), BiTE 등과 같은 새로운 이중특이적 형식을 설계하기 위해 많은 항체 공학적인 노력을 하였다(Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp.95-106 (2015)). 그러나 이러한 형식은 잠재적으로 안정성, 용해도, 짧은 반감기 및 면역원성에 다양한 제한이 있을 수 있다.

이들 이중특이적 항체 형식 중에서, IgG-유사 이중특이적 항체는 일반적인 형식이다: 한 팔은 표적 A에 바인딩하고 다른 팔은 표적 B에 바인딩한다. 구조적으로 항체 A의 절반과 항체 B의 절반으로 구성되어 있으며 천연 IgG와 크기와 모양이 비슷하다. 다운스트림 개발 (downstream development)을 용이하게 하기 위해, 이러한 이중특이적 분자는 단일 숙주 세포 (a single host cell)로부터 높은 발현 수준 및 올바르게 조립된 형태로 정상 IgG처럼 쉽게 생성될 것이 요구된다. 불행히도, 동종의 경중쇄 (light-heavy chains) 페어링과 두 개의 서로 다른 반쪽 항체의 조립은 자동으로 제어할 수 없다. 무작위 방식으로 모든 종류의 미스페어링은 심각한 제품 이질성을 초래할 수 있다.

“놉-인투-홀” (knobs-into-holes, Ridgway et al., Protein Engineering, 9(7), pp.617-21(1996); Merchant et al., Nature Biotechnology, 16(7), pp.677-681(1998)), 정전기 (Gunasekaran et al., Journal of Biological Chemistry, 285(25), pp.19637-19646(2010)) 또는 음의 상태 설계 (Von Kreudenstein et al. al., mAbs, 5(5), pp.646-654(2013); Leaver-Fay et al., Structure, 24(4), pp.641-651(2016))와 같은 Fc 영역에 돌연변이를 도입함으로써, 두 개의 다른 중쇄가 완성되었다. 그러나, 각 개별 항체 경중쇄의 선택적인 페어링은 여전히 어려운 일이다. 경중쇄 사이의 경계면에는 가변 도메인 (VH-VL)과 불변 도메인 (CH1-CL)이 포함된다. 동종의 페어링을 용이하게 하기 위한 직교 인터페이스를 설계하는데 여러 전략이 적용되었다. Roche는 CH1과 CL의 도메인을 교환하고 크로스맵 플랫폼을 만들었고 (Schaefer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of America, 108(27), pp.11187-11192 (2011)), MedImmune은 대안적으로 이황화 결합을 도입했고 (Mazor et al., mAbs, 7(2), pp.377-389(2015)), Amgen은 CH1-CL 영역에서 정전기를 추가로 만들었으며 (Liu et al., Journal of Biological Chemistry, 290(12), pp.7535-7562 (2015)), 그리고 Lilly (Lewis et al., Nature Biotechnology, 32(2), pp.191-198(2014)) 및 Genentech (Dillon et al., mAbs, 9(2), pp.213-230 (2017))은 가변 및 불변 도메인 모두에 돌연변이를 도입했다.

CD20은 B-림프구의 표면에서 발현되는 활성화된 글리코실화된 인단백질이다. 1997년 FDA에 의해 승인된 키메라 항-CD20 모노클로날 항체(이하 "mAb"라고도 함)인 리툭시맙 (Rituximab)을 사용한 항체 요법은 지난 30년 동안 림프증식성 장애 치료에서 가장 중요한 진전 중 하나이다. 특히, 다양한 화학 요법 / 방사선 요법과의 조합에서 리툭시맙은 B 세포 림프종 및 만성 림프종 (CLL) 환자의 생존 통계의 모든 측면을 유의하게 개선했다 (Chu TW, Zhang R, Yang J, et al. A Two-Step Pretargeted Nanotherapy for CD20 Crosslinking May Achieve Superior Anti-Lymphoma Efficacy to Rituximab. Theranostics. 2015 Apr 26; 5(8): 834-46).

지난 30년 동안 사람들은 CD20의 단백질 구조 및 분자 기능에 대한 이해에 상당한 진전을 이루었고, 따라서 차세대 항-CD20 치료 항체가 생성되어 임상 사용을 위해 승인되었다. 오파투무맙 (Ofatumumab)은 완전한 인간 항-CD20 치료 항체로, 리툭시맙보다 세포 표면에 더 근접한 다른 CD20 에피토프를 표적으로 하여 리툭시맙보다 더 느린 오프 레이트와 더 안정적인 바인딩을 나타낸다 (Laurenti L, Innocenti I, Autore F, et al. New developments in the management of chronic lymphocytic leukemia: role of ofatumumab. Onco Targets Ther. 2016 Jan 20; 9: 421-9). 그럼에도 불구하고, 차세대 항-CD20 모노클로날 항체는 효능과 안전성에서 리툭시맙보다 훨씬 더 우수한 것으로 입증되지 않았다. 항-CD20 mAb 치료의 경우, 질병 재발 또는 재기는 소포성 림프종 및 CLL이 있는 모든 환자와 공격성 B 세포 림프종 (예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종) 환자의 약 절반에서 여전히 발생한다 (Lim SH, Beers SA, French RR, et al. Anti-CD20 monoclonal antibodies: historical and future perspectives. Haematologica. 2010 Jan;95(1):135-43). 따라서 이중특이적 항체 및 키메라 항원 수용체 (CARs)-T 세포 치료와 같은 독특한 작용 기전(MOA)을 가진 B 세포 표적 치료제의 새로운 전략을 개발하기 위한 충족되지 않은 의학적 요구가 남아 있다.

CD3 T-세포 공수용체는 4개의 별개의 사슬, 즉 CD3감마 사슬, CD3델타 사슬 및 2개의 CD3엡실론 사슬로 구성된 단백질 복합체이다. 4개의 사슬은 T 세포 수용체(TCR)로 알려진 분자 및 제타 사슬과 결합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. T 세포 TCR, 제타 사슬 및 CD3 분자는 TCR 복합체를 구성하는데, 여기서 서브유닛인 TCR은 항원을 인식하여 결합하고, 서브유닛인 CD3은 항원 자극을 신호전달 경로로 전송하고 전달하여, 궁극적으로 T 세포 활성을 조절한다. CD3 단백질은 거의 모든 T 세포에 존재한다. CD3-TCR 복합체는 세포 및 체액성 면역 기능뿐만 아니라 선천 및 입양 면역 반응 모두에서 T 세포 기능을 조절한다. 여기에는 병원성 유기체를 제거하고 광범위한 세포독성 효과를 통해 종양 성장을 제어하는 것이 포함된다. OKT3 (Kung et al., Science, 206: 347-9 (1979))와 같은 인간 CD3에 특이적인 마우스 모노클로날 항체는 치료를 위해 개발된 1세대 CD3 항체였다. OKT3는 강력한 면역억제 효능을 가지고 있지만, 면역원성 및 유사분열 가능성과 관련된 심각한 부작용으로 인해 임상 사용이 제한되었다(Chatenoud, Nature Reviews, 3:123-132 (2003)). OKT3는 항글로불린 반응을 유도하여 자체적인 빠른 제거 및 중화를 촉진한다(Chatenoud et al., Eur. J. Immunol., 137:830-8 (1982)). 또한, OKT3는 시험관내에서 T-세포 증식 및 사이토카인 생성을 유도하였고, 생체내에서 사이토카인의 대규모 방출을 유도하였다(Hirsch et al., J. Immunol, 142: 737-43 (1989)). 이러한 심각한 부작용은 이식에서 OKT3의 광범위한 사용은 물론 자가면역과 같은 다른 임상 분야로의 사용 확장을 제한했다.

CD3 및 CD20을 표적으로 하는 이중특이적 항체는 T 세포 및 B 세포에 동시에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체가 CD3 양성 T 세포와 CD20 양성 B 세포에 결합하면 세포용해 시냅스가 형성된다. 세포독성 T 세포의 과립에서 퍼포린 (perforin)과 그랜자임 (granzymes)이 방출되어 세포독성이 유도되고, 그 후 악성 B 세포의 세포자멸사 및 용해를 유도한다.

CD3 및 CD20 모두에 대한 이중특이적 분자를 설계할 필요성은 매우 크다. 이러한 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체는 암을 비롯한 CD20-관련 질환을 치료하는데 유용하다.

일 양태에서, 본 개시 내용은 제2 항원-바인딩 모이어티와 연관된 제1 항원-바인딩 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공하며, 상기:

다음을 포함하는 제1 항원-바인딩 모이어티:

제1 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역(C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인(VH)을 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 제1 폴리펩티드, 및

제2 TCR 불변 영역(C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 제2 폴리펩티드,

상기:

C1 및 C2는 C1 및 C2 사이에 적어도 하나의 비-천연 사슬간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 사슬간 결합은 이량체를 안정화할 수 있고

및

다음을 포함하는 제2 항원-바인딩 모이어티:

항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 중쇄 가변 도메인(VH2), 및

항체 경쇄 불변(CL) 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 경쇄 가변 도메인(VL2),

상기:

제1 및 제2 항원-바인딩 모이어티 중 하나는 항-CD3 바인딩 모이어티이고, 다른 하나는 항-CD20 바인딩 모이어티이고,

항-CD3 바인딩 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래된다:

a) 서열번호 1, 13, 25, 37 및 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,

b) 서열번호 2, 14, 26, 38 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,

c) 서열번호 3, 15, 27, 39 및 51로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,

d) 서열번호 4, 16, 28, 40 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR1,

e) 서열번호 5, 17, 29, 41 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR2, 및

f) 서열번호 6, 18, 30, 42 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR3,

항-CD20 바인딩 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD20 항체로부터 유래된다:

a) 서열번호 7, 19, 31, 43 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,

b) 서열번호 8, 20, 32, 44 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,

c) 서열번호 9, 21, 33, 45 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,

d) 서열번호 10, 22, 34, 46 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR1,

e) 서열번호 11, 23, 35, 47 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR2, 및

f) 서열번호 12, 24, 36, 48 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR3.

특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 항-CD3 바인딩 모이어티는 서열번호 61, 63, 65, 67 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 62, 64, 66, 68 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래된다.

특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 항-CD20 바인딩 모이어티는 서열번호 71, 73,75, 77 및 79를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 72, 74, 76, 78 및 80을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-CD20 항체로부터 유래된다.

특정 실시예에서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 및 서열번호 84.

특정 실시예에서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 및 서열번호 88.

특정 실시예에서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92.

특정 실시예에서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 및 서열번호 96.

특정 실시예에서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 및 서열번호 100.

특정 실시예에서, 서열번호 92의 폴리펩티드 서열에서 위치 182, 193, 203, 206 및 207에 있는 천연 글리코실화 부위로부터의 하나 이상의 아미노산이 변형된다. 바람직하게는, 변형은 서열번호 92의 폴리펩티드 서열에서 위치 193의 아미노산에 대하여 이루어진다. 특정 실시예에서, 이러한 변형은 S182X, S193X, S203X, S206X 또는 S207X의 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 상기 X는 Ser 및 Thr 이외의 어느 아미노산을 나타낸다. 특정 바람직한 실시예에서, 상기 변형은 S193X이고, 상기 X는 Ala, Gly, Pro 또는 Val로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 변형(들)은 O-글리코실화 부위를 제거하고, O-글리코실화의 유형은 Core1 배열의 O-사카라이드이고 NeuAc-Gal-GalNAc 또는 NeuAc-Gal-(NeuAc) GalNAc의 구조식을 갖는다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공한다:

(a) 적당한 친화력으로 동시에 인간 CD3 및 CD20 단백질에 특이적으로 바인딩;

(b) 인간 CD3 및/또는 개(cyno) CD3 단백질에 특이적으로 바인딩;

(c) 인간 CD20 및/또는 개 CD20 단백질에 특이적으로 바인딩;

(d) 일부 시험관내 세포 기능학적 실험에서, CD3 및 CD20을 표적으로 하는 다른 이중특이적 항체와 비교하여, 더 강력한 T 세포 활성화를 유도할 수 있고, CD20 양성 종양 세포를 더 효과적 및 특이적으로 죽이고, 더 적은 수의 사이토카인을 방출;

(e) 우수한 열 안정성을 갖고 개 또는 인간 혈청에서 안정함;

(f) CD3 및 CD20을 표적으로 하는 다른 이중특이적 항체와 비교하여 우수한 생체내 항-종양 효과를 제공;

(g) 사이노몰구스 원숭이에서 사이토카인 폭풍(cytokine storm)과 같은 부작용 없이 B 세포를 효과적으로 고갈시키는 효과 및 충분한 혈청 반감기(T_1/2)를 나타냄. 일 실시예에서, 본 개시 내용은 모이어티에 접합된 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 접합체를 본원에 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 벡터를 본원에 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에서 제공되는 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에서 제공되는 분리된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 본원에 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건 하에 본원에서 제공되는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법을 본원에 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 본원에 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 CD20-관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 본원에 제공한다. 특정 실시예에서, 상기 질환 또는 상태는 제1 항원 및 제2 항원 모두가 조절될 때 완화, 제거, 치료 또는 예방될 수 있다.

특정 실시예에서, 제1 항원-바인딩 모이어티는 제1 이량체화 도메인에 연결되고, 제2 항원-바인딩 모이어티는 제2 이량체화 도메인에 연결되며, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 연관된다. 특정 실시예에서, 연관은 커넥터, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기 상호작용, 염 다리, 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통해 이루어진다.

특정 실시예에서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다.

특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-바인딩 모이어티의 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된다.

특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하고 동종이량체화를 억제하고 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연관한다.

특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀, 소수성 상호작용, 정전기 상호작용, 친수성 상호작용, 또는 증가된 유연성을 통해 이종이량체로 연관될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 질환 또는 상태의 검출, 진단, 예후 또는 치료를 위해 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 대상체에서 CD20-관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 제조에서 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 용도를 제공한다.

일 실시예에서, 상기 CD20-관련 질환 또는 상태는 암이고, 바람직하게는, 상기 암은 림프종, 폐암, 간암, 자궁경부암, 결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 교모세포종, 전립선암, 식도암 또는 위암으로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 CD20-관련 질환 또는 상태는 B 세포 림프종, 선택적으로 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 비-호지킨 림프종은 다음을 포함한다: 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 소포성 림프종, 변연부 B-세포 림프종(MZL), 점막-연관 림프 조직 림프종(MALT), 소 림프구 림프종(만성 림프구 백혈병, CLL) 또는 외투 세포 림프종(MCL), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM).

본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부 도면을 참조하여 진행되는 여러 실시예의 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

본 발명의 다음 설명은 본 발명의 다양한 실시예를 예시하기 위한 것에 불과하다.

정의

관사 "a," "an," 및 "the"는 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, "a 폴리펩티드 복합체"는 하나의 폴리펩티드 복합체 또는 하나 이상의 폴리펩티드 복합체를 의미한다.

본 명세서상 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 레벨, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 만큼 변하는 양, 레벨, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 양, 무게 또는 길이를 지칭한다. 특정 실시예에서, 수치 앞에 쓰인 "약" 또는 "대략"은 15%, 10%, 5% 또는 1%의 범위를 더하거나 뺀 값을 나타낸다.

명세서 전반에 걸쳐, 달리 정의되지 않는 한, "포함하다" 및 "포함하는" 단어는 명시된 단계, 요소, 또는 단계 또는 요소 그룹의 포함을 의미하지만 다른 단계, 요소, 또는 단계 또는 요소 그룹의 배제를 의미하는 것으로 이해되지 않는다. "~로 구성된"은 "~로 구성된" 뒤에 오는 모든 것을 포함하고 이에 국한되는 것을 의미한다. 따라서 "~로 구성된"은 나열된 요소가 필수적 또는 의무적이거나 다른 요소가 없을 수 있음을 나타낸다. "본질적으로 구성되는"은 뒤에 나열된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하며, 나열된 요소에 대한 개시 내용에 명시된 활동 또는 작용을 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서 "본질적으로 구성되는"이라는 문구는 나열된 요소가 필수적 또는 의무적이지만, 다른 요소는 선택 사항이며 나열된 요소의 활동 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 없을 수도 있음을 나타낸다.

본 명세서 전체에 걸쳐 "실시예", "일 실시예", "특정 실시예", "관련 실시예", "어떤 실시예", "추가 실시예", "그 이상의 실시예" 또는 이들의 조합은 실시예와 관련하여 설명된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본 명세서의 적어도 하나의 실시예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 전술한 문구가 반드시 모두 동일한 실시예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체, 또는 아미노산 잔기의 다중 중합체의 어셈블리 (assembly)를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전 암호에 의해 암호화된 아미노산과 나중에 변형되는 아미노산이며, 예를 들어, 히드록시프롤린 (hydroxyproline), 감마-카르복시글루타메이트 (gamma-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린 (O-phosphoserine)이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 알파-탄소이며, 예를 들어, 호모세린 (homoserine), 노르류신 (norleucine), 메티오닌 설폭사이드 (methionine sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포늄 (methionine methyl sulfonium)이다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 알파-탄소는 카르보닐과 같은 작용기에 부착되는 첫 번째 탄소 원자를 나타낸다. 베타-탄소는 알파-탄소에 연결된 두 번째 탄소 원자를 의미하며, 시스템은 계속해서 그리스 문자 알파벳 순서로 탄소를 명명한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 다르지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 말한다. "단백질"이라는 용어는 일반적으로 큰 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드 서열은 일반적으로 폴리펩티드 서열의 왼쪽 말단이 아미노 말단(N-말단)이고; 폴리펩티드 서열의 오른쪽 말단은 카르복실 말단(C-말단)이다. 본 명세서에 사용된 "폴리펩티드 복합체"는 특정 기능을 수행하기 위해 회합된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 지칭한다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드는 면역-관련된다.

본 명세서상 용어 "항체"는 특정 항원에 결합하는 임의의 면역글로불린, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 또는 이중특이적 (2가) 항체를 포함한다. 천연 온전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각 중쇄는 가변 영역("HCVR") 및 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성되는 반면, 각 경쇄는 가변 영역("LCVR") 및 불변 영역("CL")으로 구성된다. 포유류 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로 분류되고 포유류 경쇄는 λ또는 κ로 분류된다. 항체는 이황화 결합을 통해 함께 결합된 두 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역으로 구성된 Y의 줄기가 있는 "Y" 모양이다. Y의 각 팔은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 바인딩을 담당한다. 두 사슬의 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 3개의 고도로 가변적인 루프를 포함한다 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경(L) 사슬 CDR, 및 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중(H) 사슬 CDR). 항체에 대한 CDR 경계는 Kabat, Chothia 또는 Al-Lazikani의 규칙에 의해 정의되거나 식별될 수 있다. (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, AM, J. Mol. Biol., 273(4), 927(1997), Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63(1985), Chothia, C. 및 Lesk, AM, J.Mol. Biol., 196,901(1987), Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28, 342(6252):877-83(1989), Kabat EA et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). 3개의 CDR는 프레임워크 영역 (FR)으로 알려진 측면 스트레치 사이에 삽입되며, 이는 CDR보다 더 많이 보존되고 초가변 루프를 지원하는 스캐폴드 (scaffold)를 형성한다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 4개의 FR를 포함하고, CDR 및 FR은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 바인딩에 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열을 기반으로 클래스에 할당된다. 항체의 5가지 주요 클래스 또는 이소타입 (isotypes)은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 하는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이다. 주요 항체 클래스 중 일부는 IgG1 (γ중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ중쇄), IgG4 (γ중쇄), IgA1 (α1 중쇄) 또는 IgA2 (α2 중쇄)와 같은 하위 클래스로 나뉜다.

본 명세서상 용어 "가변 도메인"은 하나 이상의 CDR를 포함하는 항체 가변 영역 또는 그의 단편을 지칭한다. 가변 도메인은 온전한 가변 영역(예를 들어, HCVR 또는 LCVR)을 포함할 수 있지만, 온전한 가변 영역 미만을 포함하면서도 여전히 항원에 결합하거나 항원-바인딩 부위를 형성하는 능력을 보유하는 것도 가능하다.

본 명세서상 용어 용어 "항원-바인딩 모이어티"는 하나 이상의 CDR를 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 항체 단편, 또는 항원에 결합하지만 온전한 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-바인딩 모이어티의 예에는 가변 도메인, 가변 영역, 디아바디 (diabody), Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)₂, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화 디아바디 (ds diabody), 다중특이적 항체, 낙타화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 2가 도메인 항체가 포함되지만, 이에 국한되지 않는다. 항원 결합 모이어티는 모 항체가 바인딩하는 동일한 항원에 바인딩할 수 있다. 특정 실시예에서, 항원-바인딩 모이어티는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 이식된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 항원 결합 부분의 보다 자세한 형식은 Spiess et al., 2015 (Supra) 및 Brinkman et al., mAbs, 9(2), pp.182-212(2017)에 설명되어 있다.

항체에 관한 "Fab"는 이황화 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역에 회합하는 단일 경쇄 (가변 및 불변 영역 모두)로 이루어진 항체의 부분을 지칭한다. 특정 실시예에서, 경쇄 및 중쇄 모두의 불변 영역은 TCR 불변 영역으로 대체된다.

"Fab'"는 힌지 (hinge) 영역의 일부를 포함하는 Fab 단편을 의미한다.

"F(ab')₂"는 Fab'의 이량체를 의미한다.

항체와 관련하여 "난해한 단 (Fd)"은 경쇄와 결합하여 Fab를 형성할 수 있는 중쇄 단편의 아미노-말단 절반을 지칭한다.

항체에 관한 "Fc"는 제2 중쇄의 제2 불변 영역 및 제3 불변 영역에 이황화 결합으로 결합된 제1 중쇄의 제2 불변 영역 (CH2) 및 제3 불변 영역 (CH3)으로 이루어진 항체의 부분을 지칭한다. 항체의 Fc 부분은 ADCC 및 CDC와 같은 다양한 효과기 기능을 담당하지만 항원 바인딩에서는 기능하지 않는다.

항체의 관점에서 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 영역은 약 25개의 아미노산 잔기를 포함하고 유연하며 2개의 N-말단 항원 바인딩 영역이 독립적으로 이동할 수 있다.

본 명세서상 용어 "CH2 도메인"은 연장되는 중쇄 분자의 부분, 예를 들어, 통상적인 번호 매기기 방식을 사용하여 IgG 항체의 약 아미노산 244에서 아미노산 360까지를 포함하는 것을 지칭한다 (amino acids 244 to 360, Kabat numbering system; and amino acids 231-340, EU numbering system; see Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)).

"CH3 도메인"은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 대략 108개의 아미노산을 포함한다. 특정 면역글로불린 (immunoglobulin) 부류, 예를 들어 IgM은 CH4 영역을 추가로 포함한다.

항체에 관한 "Fv"는 완전한 항원 바인딩 부위를 보유하는 항체의 가장 작은 단편을 지칭한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 도메인에 결합된 단일 경쇄의 가변 도메인으로 구성된다. 도입된 이황화 결합에 의해 두 도메인 간의 연관성이 강화된 dsFv를 포함하여 다수의 Fv 디자인이 제공되고; scFv는 2개의 도메인을 단일 폴리펩티드로 함께 결합하기 위해 펩타이드 링커를 사용하여 형성될 수 있다. 상응하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변 및 불변 도메인과 관련된 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린의 가변 도메인을 포함하는 Fvs 작제물 (constructs)도 생산되었다. Fv는 또한 다중화되어 디아바디 (diabodies) 및 트리아바디 (triabodies)를 형성한다 Maynard et al., Annu Rev Biomed Eng 2 339-376 (2000)).

"ScFab"은 단일 사슬 Fab 단편 (scFab)의 형성을 초래하는 폴리펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 Fd를 갖는 융합 폴리펩티드를 지칭한다.

"TriFabs"는 Fab-기능성을 갖는 3개의 단위로 구성된 3가, 이중특이적 융합 단백질을 지칭한다. TriFab에는 비대칭 Fab 유사 모이어티에 융합된 2개의 일반 Fab가 있다.

"Fab-Fab"은 제1 Fab 팔의 Fd 사슬을 제2 Fab 팔의 Fd 사슬의 N-말단에 융합시켜 형성된 융합 단백질을 지칭한다.

"Fab-Fv"는 Fd 사슬의 C-말단에 HCVR을 융합하고 경쇄의 C-말단에 LCVR을 융합하여 형성된 융합 단백질을 의미한다.

"Fab-dsFv" 분자는 HCVR 도메인과 LCVR 도메인 사이에 도메인간 이황화 결합을 도입함으로써 형성될 수 있다.

"MAb-Fv" 또는 "IgG-Fv"는 하나의 Fc 사슬의 C-말단에 HCVR 도메인의 융합에 의해 형성된 융합 단백질을 지칭하고, 개별적으로 발현되거나 다른 것의 C-말단에 융합된 LCVR 도메인은 도메인간 이황화 결합에 의해 안정화된 Fv와 함께 이중특이적, 3가 IgG-Fv (mAb-Fv) 융합 단백질을 생성했다.

"ScFab-Fc-scFv2" 및 "ScFab-Fc-scFv"는 단일 사슬 Fab와 Fc 및 이황화 안정화된 Fv 도메인의 융합에 의해 형성된 융합 단백질을 의미한다.

"추가된 IgG (appended IgG)"는 이중특이적 (Fab)₂-Fc의 형식을 형성하기 위해 IgG에 융합된 Fab 팔을 갖는 융합 단백질을 지칭한다. 이것은 커넥터가 있거나 또는 없는 IgG 분자의 C-말단 또는 N-말단에 융합된 Fab와 함께 "IgG-Fab" 또는 "Fab-IgG"를 형성할 수 있다. 특정 실시예에서, 추가된 IgG는 IgG-Fab₄의 형식으로 추가로 변형될 수 있다 (참조, Brinkman et al., 2017, Supra).

"DVD-Ig"는 추가의 HCVR 도메인 및 IgG 중쇄 및 경쇄에 대한 제2 특이성의 LCVR 도메인의 융합에 의해 형성되는 이중 가변 도메인 항체를 지칭한다. "CODV-Ig"는 2개의 HCVR 및 2개의 LCVR 도메인이 가변 HCVR-LCVR 도메인의 교차 페어링을 허용하는 방식으로 연결되어 있는 관련 형식을 나타내며, (N-에서 C-말단까지) HCVRA-HCVRB 및 LCVRB-LCVRA, 또는 HCVRB-HCVRA 및 LCVRA-LCVRB 순서로 정렬된다.

"크로스맵 (crossMab)"은 비변형 중쇄와 상응하는 비변형 경쇄의 페어링 및 변형된 중쇄와 상응하는 변형된 경쇄의 페어링 기술을 말하며, 그 결과 경쇄에서 잘못된 페어링이 감소된 항체를 생성한다.

"BiTE"는 HCVR-LCVR 배향에서 제2 특이성을 갖는 제2 scFv에 연결된 LCVR-HCVR 배향에서 제1 항원 특이성을 갖는 제1 scFv를 포함하는 이중특이적 T-세포 인게이저 (engager) 분자이다.

"WuXiBody"는 항체의 가변 도메인 및 TCR의 불변 도메인을 갖는 가용성 키메라 단백질 (chimeric protein)을 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 TCR 불변 도메인의 서브유닛(예: 알파 및 베타 도메인)은 조작된 이황화 결합에 의해 연결된다.

아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 "백분율 (%) 서열 동일성"은 아미노산 (또는 핵산) 서열을 정렬한 후 참조 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 필요한 경우 간격 (gap)을 도입하여 동일한 아미노산 (또는 핵산)의 최대 수를 달성한다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로 고려되거나 또는 고려되지 않을 수 있다. 백분율 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLASTN, BLASTp (미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 웹사이트에서 이용 가능, Altschul SF et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids 참조 Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (European Bioinformatics Institute의 웹사이트에서 이용 가능, Higgins DG et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin MA et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21) 참조): 2947-8(2007)), 및 ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 사용 가능한 도구를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 도구에 의해 제공되는 디폴트 매개변수를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어 적절한 알고리즘을 선택하는 것과 같이, 정렬에 적절하게 매개변수를 맞출 수 있다.

본 명세서에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 세포 배양물 또는 동물에서 항체의 생성 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 물질을 지칭하며, 이는 (하이브리도마와 같은) 세포 배양물에 첨가되거나 동물에 주사되거나 흡수되는 조성물 (암-특이적 단백질을 포함하는 것과 같은 것)을 포함한다. 항원은 이종 항원에 의해 유도된 것을 포함하여 특정 체액성 또는 세포성 면역의 산물 (예를 들어, 항체)과 반응한다.

"에피토프" 또는 "항원 결정기"는 결합제 (예를 들어, 항체)가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산 (선형 또는 순차 에피토프라고도 함) 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 비인접 아미노산 (배위 또는 형태 에피토프라고도 함)으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 단백질의 1차 아미노산 잔기를 따라 선형으로 배열되며 인접 아미노산의 작은 부분은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 바인딩하는 항원으로부터 분해되거나 변성 용매에 노출될 때 유지될 수 있으며, 반면에 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리하면 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 구조에서 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개, 약 7개, 또는 약 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.

본 명세서상 용어 "특이적 바인딩" 또는 "특이적으로 바인딩하는"은, 예를 들어 항체와 항원 사이와 같이, 2개의 분자 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 특정 실시예에서, 본 출원에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 ≤ 10^-6 M (예를 들어, ≤ 5x10^-7 M, ≤ 2x10^-7 M, ≤ 10^-7 M, ≤ 5x10^-8 M, ≤ 2x10^-8 M, ≤ 10^-8 M, ≤ 5x10^-9 M, ≤ 2x10^-9 M, ≤ 10^-9 M, 또는 ≤ 10^-10 M)의 결합 친화도(K_D)로 항원에 특이적으로 결합한다. 본 출원에 사용된 K_D는 결합 속도에 대한 해리 속도의 비율(k_off/k_on)을 나타내며, 예를 들어 Biacore와 같은 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 방법 (plasmon resonance methods)을 사용하여 측정할 수 있다.

본 명세서상 용어 "작동 가능하게 연결하는" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 스페이서 또는 링커가 있거나 또는 없이, 이들이 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 방식으로 둘 이상의 관심 생물학적 서열의 병치를 지칭한다. 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 폴리펩티드 서열이 연결된 생성물이 의도된 생물학적 기능을 갖도록 하는 방식으로 연결됨을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 항체 가변 영역은 항원-바인딩 활성을 갖는 안정한 생성물을 제공하기 위해 불변 영역에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이 용어는 또한 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동 가능하게 연결된 경우, 이는 폴리뉴클레오티드 서열이 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩티드의 조절된 발현을 허용하는 방식으로 연결됨을 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서상 용어 " 융합" 또는 "융합된"이 아미노산 서열 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질)과 관련하여 사용되는 경우, 예를 들어 화학적 결합 또는 재조합 수단에 의해, 자연적으로 존재하지 않는 단일 아미노산 서열로 2개 이상의 아미노산 서열의 조합을 지칭한다.

본 명세서상 용어 "스페이서 (spacer)"는 펩티드 결합에 의해 연결되고 하나 이상의 폴리펩티드를 연결하는 데 사용되는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기, 또는 5 내지 15, 20, 30, 50개 이상의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 인공 아미노산 서열을 지칭한다. 스페이서는 2차 구조를 가질 수도 있고 또는 갖지 않을 수도 있다. 스페이서 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2:1121-1123 (1994)이다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 스페이서가 사용될 수 있다.

용어 "항원 특이성"은 항원 결합 분자에 의해 선택적으로 인식되는 특정 항원 또는 그의 에피토프를 지칭한다.

본 출원에 사용된 아미노산 잔기와 관련한 용어 "치환"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 하나 이상의 아미노산을 다른 것으로 자연 발생 또는 유도된 대체를 지칭한다. 폴리펩티드로의 치환은 폴리펩티드 기능의 감소, 향상 또는 제거를 초래할 수 있다.

치환은 또한 아미노산 서열과 관련하여 "보존적 치환"일 수 있고, 이는 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하거나 폴리펩티드의 활성에 중요하지 않은 아미노산의 치환을 지칭한다. 예를 들어, 비극성 측쇄 (예를 들어, Met, Ala, Val, Leu 및 Ile, Pro, Phe, Trp), 비하전 극성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Cys, Ser, Thr, Asn, Gly 및 Gln), 산성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Asp, Glu), 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, His, Lys, Arg), 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, Thr, Val 및 Ile), 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, Cys 및 Met), 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Trp, Tyr, His 및 Phe) 사이에 보존적 치환이 이루어질 수 있다. 특정 실시예에서, 치환, 결실 또는 추가는 또한 "보존적 치환"으로 간주될 수 있다. 삽입 또는 결실된 아미노산의 수는 약 1 내지 5의 범위일 수 있다. 보존적 치환은 일반적으로 단백질 형태 구조에 큰 변화를 일으키지 않으므로 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 아미노산 잔기와 관련하여 "돌연변이" 또는 "돌연변이된"이라는 용어는 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 추가를 지칭한다.

본 출원에 사용된 "T 세포"는 세포 매개 면역에서 중요한 역할을 하는 림프구의 유형을 나타내며, 여기에는 헬퍼 T 세포 (예를 들어, CD4⁺ T 세포, T 헬퍼 1형 T 세포, T 헬퍼 2형 T 세포, T 헬퍼 3형 T 세포, T 헬퍼 17형 T 세포), 세포독성 T 세포 (예를 들어, CD8⁺ T 세포), 기억 T 세포 (예를 들어, 중심 기억 T 세포(TCM 세포), 효과기 기억 T 세포(TEM 세포 및 TEMRA 세포) 및 CD8⁺ 또는 CD4⁺인 상주 기억 T 세포(TRM)), 자연 살해 T(NKT) 세포 및 억제 T 세포가 포함된다.

천연 "T 세포 수용체" 또는 천연 "TCR"은 불변 CD3 사슬과 연관되어 신호 전달을 매개할 수 있는 복합체를 형성하는 이종이량체 T 세포 표면 단백질이다. TCR은 면역글로불린 슈퍼패밀리 (immunoglobulin superfamily)에 속하며 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 갖는 반쪽 항체와 유사하다. 천연 TCR에는 세포외 부분, 막횡단 부분 및 세포내 부분이 있다. TCR의 세포외 도메인은 막-근위 불변 영역과 막-원위 가변 영역을 갖는다.

본 명세서상 용어 "대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자"는 질병 또는 장애의 진단, 예후, 개선, 예방 및/또는 치료가 필요한 인간 또는 포유동물 또는 영장류를 비롯한 인간이 아닌 동물을 지칭한다. 포유동물의 대상은 인간, 가축, 농장 동물, 동물원, 스포츠, 또는 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 쥐, 생쥐, 말, 돼지, 소, 곰 등과 같은 애완동물을 포함한다.

이중특이적 폴리펩티드 복합체

일 양태에서, 본 개시 내용은 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 본원에 제공한다. 본원에 사용된 용어 "이중특이적"은 2개의 항원-바인딩 모이어티가 있음을 의미하고, 이들 각각은 동일한 항원 상의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 특이적으로 바인딩할 수 있다. 본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 제2 항원-바인딩 모이어티와 연관된 제1 항원-바인딩 모이어티를 포함하고, 이들 중 하나는 CD3에 특이적으로 바인딩하고, 다른 하나는 CD20에 특이적으로 바인딩한다. 즉, 제1 항원-바인딩 모이어티는 CD3에 특이적으로 바인딩하고, 제2 항원-바인딩 모이어티는 CD20에 특이적으로 바인딩할 수 있다. 대안적으로, 제1 항원-바인딩 모이어티는 CD20에 특이적으로 바인딩할 수 있고 제2 항원-바인딩 모이어티는 CD3에 특이적으로 바인딩할 수 있다. 본 개시 내용에서, 용어 "이중특이성 항-CD3 × CD20 폴리펩티드 복합체", "CD3 및 CD20을 표적으로 하는 폴리펩티드 복합체" 또는 "항-CD3 및 CD20 폴리펩티드 복합체"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

다음을 포함하는 제1 항원-바인딩 모이어티:

상기:

및

다음을 포함하는 제2 항원-바인딩 모이어티:

상기:

특정 실시예에서, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 TCR 불변 영역으로부터 유래된 서열을 함유하는 제1 항원-바인딩 모이어티를 포함하나 제2 항원-바인딩 모이어티는 TCR 불변 영역으로부터 유래된 서열을 함유하지 않는다.

본원에서 제공되는 이중특이성 폴리펩티드 복합체는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 미스페어링을 이루는 경향이 유의하게 적다. 어떤 이론에 구속되지 않고, 제1 항원-바인딩 모이어티의 안정화된 TCR 불변 영역은 서로 특이적으로 연관할 수 있고 따라서 의도된 항원-바인딩 부위를 제공하지 않는 다른 가변 영역과 VH1 또는 VL1의 원치 않는 미스페어링을 억제하는 동안 의도된 VH1 및 VL1의 고도로 특이적인 페어링에 기여할 수 있다고 믿어진다.

특정 실시예에서, 제2 항원-바인딩 모이어티는 VH2에 작동 가능하게 연결된 항체 불변 CH1 도메인, 및 VL2에 작동 가능하게 연결된 항체 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 따라서, 제2 항원-바인딩 모이어티는 Fab를 포함한다.

제1, 제2, 제3 및 제4 가변 도메인(예: VH1, VH2, VL1 및 VL2)이 하나의 세포에서 발현되는 경우, VH1이 VL1과 특이적으로 페어링을 이루고 VH2가 VL2와 특이적으로 페어링을 이루는 것이 매우 바람직하며, 생성된 이중특이적 단백질 산물이 정확한 항원-바인딩 특이성을 갖도록 한다. 그러나, 하이브리드-하이브리도마(또는 쿼드로마)와 같은 기존 기술에서는, VH1, VH2, VL1 및 VL2의 무작위 페어링이 발생하여 결과적으로 최대 10개의 서로 다른 종의 생성이 발생하며, 그 중 하나는 기능적인 이중특이적 항원-바인딩 분자이다. 이는 생산 수율을 감소시킬 뿐만 아니라 표적 산물의 정제를 복잡하게 한다.

본원에 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 가변 도메인이 제1 및 제2 항원-바인딩 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우에 그렇지 않은 경우보다 미스페어링을 이루는 경향이 적다는 점에서 예외적이다. 예시적인 실시예에서, 제1 항원-바인딩 도메인은 VL1-C2와 페어링을 이루는 VH1-C1을 포함하고, 제2 항원-바인딩 도메인은 VL2-CL과 페어링을 이루는 VH2-CH1을 포함한다. 놀랍게도 C1 및 C2는 서로 우선적으로 연관하고, CL 또는 CH1과 연관하는 경향이 적어서 C1-CH, C1-CL, C2-CH 및 C2-CL과 같은 원치 않는 페어링의 형성이 억제되고 유의하게 감소한다는 것이 발견되었다. C1-C2의 특이적인 연관의 결과로, VH1은 VL1과 특이적으로 페어링을 이루고, 제1 항원 바인딩 부위를 제공하고, CH1은 CL과 특이적으로 페어링을 이루어, 제2 항원 바인딩 부위를 제공하는 VH2-VL2의 특이적인 페어링을 가능하게 한다. 따라서, 제1 항원 바인딩 모이어티 및 제2 항원 바인딩 모이어티는 미스페어링을 이루는 경향이 적고, 예를 들어 VH1-VL2, VH2-VL1, VH1-VH2, VL1-VL2 사이의 미스페어링은, VH1-CH1, VL1-CL, VH2-CH1 및 VL2-CL의 형태로 제1 및 제2 항원-바인딩 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우에 그렇지 않은 경우보다 유의하게 감소된다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는, 세포로부터 발현될 때, 비교 조건 하에 발현된 참조 분자보다 잘못된 짝의 산물이 유의하게 더 적고(예를 들어, 잘못된 짝의 산물이 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상 적음) 및/또는 유의하게 더 높은 생산 수율을 가지고(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상의 수율), 상기 참조 분자는 C1 대신 천연 CH1을 갖고 C2 대신 천연 CL을 갖는 것을 제외하고는 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 달리 동일하다.

조작된 CAlpha 및 CBeta를 포함하는 항원-바인딩 모이어티

본원에 제공되는 제1 항원-바인딩 모이어티는 제1 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 항체 중쇄 가변 도메인, 및 제2 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 제1 TCR 불변 영역 및 제2 TCR 불변 영역은 적어도 하나의 비-천연 사슬간 이황화 결합을 통해 연관된다. 제1 항원-바인딩 모이어티는 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이들 각각은 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 TCR로부터 유래된 불변 영역을 포함한다. 따라서, 제1 항원-바인딩 모이어티는 각각 한 페어링의 TCR 불변 영역에 작동가능하게 연결된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 항원-바인딩 모이어티 내의 TCR 불변 영역 페어링은 alpha/beta TCR 불변 영역이다. 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체의 TCR 불변 영역은 적어도 하나의 비-천연 이황화 결합을 통해 이량체를 형성하도록 서로 연관할 수 있다.

놀랍게도, 적어도 하나의 비-천연 이황화 결합이 있는 본원에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티가 재조합적으로 발현되고 원하는 형태로 조립될 수 있으며, 이는 항체 가변 영역의 우수한 항원-바인딩 활성을 제공하면서 TCR 불변 영역 이량체를 안정화시키는 것이 발견되었다. 더욱이, 제1 항원-바인딩 모이어티는 예를 들어 글리코실화 부위의 변형 및 일부 천연 서열의 제거와 같은 일상적인 항체 조작을 잘 견디는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본원에서 제공되는 폴리펩티드 복합체는 제1 항원-바인딩 모이어티에 TCR 불변 영역의 존재로 인한 항원-바인딩 서열의 최소 또는 실질적으로 미스페어링 없이 쉽게 발현되고 조립될 수 있는 이중특이적 형식으로 혼입될 수 있다. 본원에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티 및 컨스트럭트의 부가적인 이점은 하기 개시 내용에서 더욱 명백해질 것이다.

요약하면, 본원에서 제공되는 제1 항원-바인딩 모이어티는 제1 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역(C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인(VH)을 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 제2 TCR 불변 영역(C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 C1 및 C2는 이량체를 형성할 수 있고, C1 및 C2 사이의 비-천연 사슬간 이황화 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있다.

TCR 불변 영역

본원에서 제공되는 제1 항원-결합 모이어티는 TCR로부터 유래된 알파 또는 베타 불변 영역을 포함한다.

인간 TCR 알파 사슬 불변 영역은 NCBI 등록 번호가 P01848인 TRAC로 알려져 있다.

인간 TCR 베타 사슬 불변 영역은 TRBC1 및 TRBC2(IMGT 명명법)로 알려진 2개의 상이한 변이체를 갖는다(Toyonaga B, et al., PNAs, Vol. 82, pp.8624-8628, Immunology (1985) 참조).

본 개시 내용에서, 본원에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티의 제1 및 제2 TCR 불변 영역은 이량체를 안정화할 수 있는 적어도 하나의 비-천연 사슬간 이황화 결합을 TCR 불변 영역 사이에 포함하는 이량체를 형성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "이량체"는 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 2개의 분자에 의해 형성된 연관 구조를 지칭한다. 동종이량체 또는 동종이량체화는 2개의 동일한 분자에 의해 형성되고, 이종이량체 또는 이종이량체화는 2개의 상이한 분자에 의해 형성된다. 제1 및 제2 TCR 불변 영역에 의해 형성된 이량체는 이종이량체이다.

"돌연변이된" 아미노산 잔기는 치환, 삽입 또는 첨가되고 상응하는 천연 TCR 불변 영역에서 그의 천연 대응 잔기와 상이한 것을 지칭한다. 예를 들어, 야생형 TCR 불변 영역의 특정 위치에 있는 아미노산 잔기를 "천연" 잔기라고 하는 경우, 돌연변이된 대응물은 천연 잔기와 다르지만 TCR 불변 영역에서 동일한 위치에 존재하는 어느 잔기이다. 돌연변이된 잔기는 동일한 위치에서 천연 잔기를 치환하거나 천연 잔기 앞에 삽입되어 원래 위치를 차지하는 상이한 잔기일 수 있다.

본원에서 제공되는 폴리펩티드 복합체에서, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역은 비-천연 사슬간 이황화 결합 형성을 담당하는 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하도록 조작되었다. 이러한 돌연변이 잔기를 TCR 불변 영역에 도입하기 위해, TCR 영역의 코딩 서열을 조작하여, 예를 들어 네이티브 잔기의 코돈 앞에 돌연변이 잔기를 코딩하는 코돈을 천연 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환하거나 돌연변이 잔기를 코딩하는 코돈을 삽입할 수 있다.

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역은 하나 이상의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하도록 조작되어 시스테인 잔기로의 대체 후 비-천연 사슬간 이황화 결합이 두 TCR 불변 영역 사이에 형성될 수 있다.

비-천연 사슬간 이황화 결합은 제1 항원-바인딩 모이어티를 안정화할 수 있다. 이러한 안정화 효과는 다양하게 구현될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 아미노산 잔기 또는 비-천연 사슬간 이황화 결합의 존재는 폴리펩티드 복합체가 안정적으로 발현되고 및/또는 높은 수준으로 발현되도록 하고 및/또는 원하는 생물학적 활성(예: 항원 바인딩 활성), 및/또는 원하는 생물학적 활성을 갖는 높은 수준의 원하는 안정한 복합체로 발현 및 조립된다. 제1 및 제2 TCR 불변 영역을 안정화시키는 사슬간 이황화 결합의 능력은 SDS-PAGE에 표시된 분자량, 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 측정된 열안정성, 또는 시차 주사 형광 측정법(DSF)과 같은 당업계에 공지된 적절한 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 생성물이 제1 및 제2 폴리펩티드의 합한 분자량에 필적하는 분자량을 나타내는 경우, 본원에 제공된 안정한 제1 항원-바인딩 모이어티의 형성은 SDS-PAGE에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에서 제공되는 제1 항원-바인딩 모이어티는 이의 열 안정성이 천연 Fab의 열 안정성의 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상이라는 점에서 안정하다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 제1 항원-결합 모이어티는 그의 열 안정성이 천연 Fab의 열 안정성에 필적한다는 점에서 안정하다.

어느 이론에 구속되지 않고, 제1 항원-바인딩 모이어티에서 제1 및 제2 TCR 불변 영역 사이에 형성된 비-천연 사슬간 이황화 결합은 TCR 불변 영역의 이종이량체를 안정화할 수 있고, 이에 의해 정확한 폴딩 수준, 구조적 안정성 및/또는 이종이량체 및 제1 항원-바인딩 모이어티의 발현 수준을 향상시킨다. T 세포 표면의 막에 고정된 천연 TCR과 달리, 천연 TCR 세포외 도메인의 이종이량체는 3D 구조에서 항체 Fab와 유사함에도 불구하고 훨씬 덜 안정적인 것으로 밝혀졌다. 사실, 용해성 조건에서 천연 TCR의 불안정성은 그 결정 구조의 규명을 방해하는 중요한 장애물이다(Wang, Protein Cell, 5(9), pp.649-652 (2014) 참조). TCR 불변영역에 한 페어링의 시스테인(Cys) 돌연변이를 도입하여 사슬간 비-천연 이황화 결합을 형성함으로써, 제1 항원-바인딩 모이어티를 안정적으로 발현시키는 동시에 항체 가변영역의 항원-바인딩 능력이 유지된다.

돌연변이된 잔기를 포함하는 TCR 불변 영역은 또한 본원에서 "조작된" TCR 불변 영역으로 지칭된다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 복합체의 제1 TCR 불변 영역(C1)은 조작된 TCR 알파 사슬(CALpha)를 포함하고, 제2 TCR 불변 영역(C2)은 조작된 TCR 베타 사슬(CBeta)을 포함한다. 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAAlpha를 포함한다.

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 조작된 TCR 불변 영역은 제1 및/또는 제2 조작된 TCR 불변 영역의 접촉 계면 내에 하나 이상의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "접촉 계면"은 폴리펩티드가 서로 상호작용/연관하는 폴리펩티드 상의 특정 영역(들)을 지칭한다. 접촉 계면은 상호작용이 일어날 때 접촉 또는 연관하게 되는 상응하는 아미노산 잔기(들)와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 접촉 계면의 아미노산 잔기는 연속적인 서열일 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들어, 계면이 3차원인 경우, 계면 내의 아미노산 잔기는 선형 서열의 상이한 위치에서 분리될 수 있다.

특정 실시예에서, 조작된 CAlpha와 조작된 CBeta 사이에 하나 이상의 이황화 결합이 형성될 수 있다. 특정 실시예에서, 한 페어링의 시스테인 잔기는 비-천연 사슬간 이황화 결합을 형성할 수 있다.

본원 명세서 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, TCR 불변 영역에 대한 "XnY"는 TCR 불변 영역 상의 n번째 아미노산 잔기 X가 아미노산 잔기 Y로 대체됨을 의미하는 것으로 의도되며, 상기 X 및 Y는 각각 특정 아미노산 잔기의 한 글자 약어이다.

본원에서 제공되는 폴리펩티드 복합체에서, 조작된 CBeta는 서열번호 121을 포함하거나 서열번호 121이고, 조작된 CAlpha는 서열번호 122를 포함하거나 서열번호 122이다.

서열번호 121 및 서열번호 122로 표시되는 서열은 하기에 제공된다:

서열번호 121

LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA

서열번호 122

PDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 천연 TCR 불변 영역에 존재하는 하나 이상의 천연 글리코실화 부위는 본 개시내용에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티에서 변형(예를 들어, 제거)되었다. 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "글리코실화 부위"는 탄수화물 모이어티(예를 들어, 올리고당 구조)가 부착될 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체와 같은 폴리펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-연결체 또는 O-연결체이다. N-연결체는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티가 부착됨을 의미하고, 예를 들어, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌과 같은 트리펩티드 서열의 아스파라긴 잔기이고, 상기 X는 프롤린을 제외한 어느 아미노산이다. O-연결체 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로오스 중 하나가 하이드록시아미노산에, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 의미한다. 천연 글리코실화 부위의 제거는 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열(N-연결체 글리코실화 부위의 경우) 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기(O-연결체 글리코실화 부위의 경우)가 치환되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.

본원에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티에서, 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위는 조작된 TCR 불변 영역, 예를 들어, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역에 존재하지 않는다. 어떤 이론에 구속되기를 원하지 않으나, CAlpha(즉, N34, N68 및 N79) 및 CBeta(즉, N69)와 같은 TCR 불변 영역에 N-연결체 글리코실화 부위의 존재가 단백질 발현 및 안정성에 필요(Wu et al., Mabs, 7:2, 364-376, 2015 참조)하다는 기존의 가르침과는 대조적으로, 본원에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티는 단백질 발현 및 안정성에 영향을 미치지 않으면서 글리코실화 부위의 전체 또는 일부의 제거를 견딜 수 있다고 믿어진다.

본원에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티에서, TCR로부터 유래된 불변 영역은 항체로부터 유래된 가변 영역에 작동 가능하게 연결된다.

특정 실시예에서, 제1 항체 가변 도메인(VH)은 제1 접합 도메인에서 제1 TCR 불변 영역(C1)에 융합되고, 제1 항체 가변 도메인(VL)은 제2 접합 도메인에서 제2 TCR 불변 영역(C2)에 융합된다.

본원에 사용된 "접합 도메인"은 2개의 아미노산 서열이 융합되거나 조합되는 경계 또는 경계 영역을 지칭한다. 특정 실시예에서, 제1 접합 도메인은 항체 V/C 접합의 C 말단 단편의 적어도 일부를 포함하고, 제2 접합 도메인은 TCR V/C 접합의 N-말단 단편의 적어도 일부를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "항체 V/C 접합"은 항체 가변 도메인 및 불변 도메인의 경계, 예를 들어, 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인 사이, 또는 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 도메인 사이의 경계를 지칭한다. 유사하게, 용어 "TCR V/C 접합"은 TCR 가변 도메인 및 불변 도메인의 경계, 예를 들어, TCR 알파 가변 도메인 및 불변 도메인 사이, 또는 TCRBeta 가변 도메인 및 불변 도메인 사이의 경계를 지칭한다.

특정 실시예에서, 제1 폴리펩티드는 화학식 (I): VH-HCJ-C1 에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하는 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 화학식 (II): VL-LCJ-C2 에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하는 서열을 포함하고, 상기:

VH는 항체의 중쇄 가변 도메인이고;

HCJ는 상기 정의된 제1 접합 도메인이고;

C1은 상기 정의된 제1 TCR 불변 도메인이고;

VL은 항체의 경쇄 가변 도메인이고;

LCJ는 상기 정의된 제2 접합 도메인이고;

C2는 상기 정의된 제2 TCR 불변 도메인이다.

항체 가변 영역

본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 제2 항원-바인딩 모이어티와 연관된 제1 항원-바인딩 모이어티를 포함하고, 이 중 하나는 CD3에 특이적으로 바인딩하는 반면, 다른 하나는 CD20에 특이적으로 바인딩한다. 본원에서 제공되는 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-바인딩 모이어티는 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인(VH1) 및 제1 경쇄 가변 도메인(VL1)을 포함하고, 제2 항원-바인딩 모이어티는 제2 항체의 제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하고, 상기 제1 항체 및 제2 항체는 상이하고 항-CD3 항체 및 항-CD20 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 제1 항체는 항-CD3 항체이고, 제2 항체는 항-CD20 항체이다. 다른 특정 실시예에서, 제1 항체는 항-CD20 항체이고, 제2 항체는 항-CD3 항체이다.

통상적인 천연 항체에서, 가변 영역은 플랭킹 프레임워크(FR) 영역에 의해 개재된 3개의 CDR 영역을 포함하고, 예를 들어, 하기 화학식에 제시된 바와 같다: N-말단에서 C-말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

a) 항-CD3 바인딩 모이어티

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-바인딩 모이어티 또는 제2 항원-바인딩 모이어티는 항-CD3 바인딩 모이어티이다.

특정 실시예에서, 항-CD3 바인딩 모이어티는 하기 표 1에 제시된 항체 W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP		서열번호 1	서열번호 2	서열번호 3
	VH	GYSFTTYYIH	WIFPGNDNIKYSEKFKG	DSVSIYYFDY
		서열번호 4	서열번호 5	서열번호 6
	VK	KSSQSLLNSRTRKNYLA	WASTRKS	TQSFILRT

W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 61):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTVSS

VH - 핵산 서열(서열번호 101):

caggtgcaactcgtgcagtctggagctgaagtgaagaagcctgggtcttcagtcaaggtcagttgcaaggccagtgggtattccttcactacctactacatccactgggtgcggcaggcaccaggacaggggcttgagtggatgggctggatctttcccggcaacgataatattaagtacagcgagaagttcaaagggagggtcaccattaccgccgacaaatccacttccacagcctacatggagttgagcagcctgagatccgaggatacagccgtgtactactgtgccattgacagcgtgtccatctactactttgactactggggccagggcacactggtcacagtgagcagc

VK - 아미노산 서열(서열번호 62):

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKVEIK

VK - 핵산 서열(서열번호 102):

gacatcgtcatgacccagtccccagactctttggcagtgtctctcggggaaagagctaccatcaactgcaagagcagccagtcccttctgaacagcaggaccaggaagaattacctcgcctggtaccaacagaagcccggacagcctcctaagctcctgatctactgggcctcaacccggaagagtggagtgcccgatcgctttagcgggagcggctccgggacagatttcacactgacaatttcctccctgcaggccgaggacgtcgccgtgtattactgtactcagagcttcattctgcggacatttggcggcgggactaaagtggagattaag

특정 실시예에서, 항-CD3 바인딩 모이어티는 하기 표 2에 제시된 항체 W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP		서열번호 13	서열번호 14	서열번호 15
	VH	GFAFTDYYIH	WISPGNVNTKYNENFKG	DGYSLYYFDY
		서열번호 16	서열번호 17	서열번호 18
	VK	KSSQSLLNSRTRKNYLA	WASTRQS	TQSHTLRT

W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 63):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS

VH - 핵산 서열(서열번호 103):

caggtgcagcttgtgcagtctggggcagaagtgaagaagcctgggtctagtgtcaaggtgtcatgcaaggctagcgggttcgcctttactgactactacatccactgggtgcggcaggctcccggacaagggttggagtggatgggatggatctccccaggcaatgtcaacacaaagtacaacgagaacttcaaaggccgcgtcaccattaccgccgacaagagcacctccacagcctacatggagctgtccagcctcagaagcgaggacactgccgtctactactgtgccagggatgggtactccctgtattactttgattactggggccagggcacactggtgacagtgagctcc

VK - 아미노산 서열(서열번호 64):

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK

VK - 핵산 서열(서열번호 104):

gatatcgtgatgacccagagcccagactcccttgctgtctccctcggcgaaagagcaaccatcaactgcaagagctcccaaagcctgctgaactccaggaccaggaagaattacctggcctggtatcagcagaagcccggccagcctcctaagctgctcatctactgggcctccacccggcagtctggggtgcccgatcggtttagtggatctgggagcgggacagacttcacattgacaattagctcactgcaggccgaggacgtggccgtctactactgtactcagagccacactctccgcacattcggcggagggactaaagtggagattaag

특정 실시예에서, 항-CD3 바인딩 모이어티는 하기 표 3에 제시된 항체 W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP		서열번호 25	서열번호 26	서열번호 27
	VH	GFAFTDYYIH	WISPGNVNTKYNENFKG	DGYSLYYFDY
		서열번호 28	서열번호 29	서열번호 30
	VK	KSSQSLLNSRTRKNYLA	WASTRQS	TQSHTLRT

W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 65):

VH - 핵산 서열(서열번호 105):

VK - 아미노산 서열(서열번호 66):

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSTGDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK

VK - 핵산 서열(서열번호 106):

특정 실시예에서, 항-CD3 바인딩 모이어티는 하기 표 4에 제시된 항체 W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP		서열번호 37	서열번호 38	서열번호 39
	VH	GYSFTTYYIH	WIFPGNDNIKYSEKFKG	DSVSIYYFDY
		서열번호 40	서열번호 41	서열번호 42
	VK	KSSQSLLNSRTRKNYLA	WASTRKS	TQSFILRT

W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 67):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWWIPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTVSS

VH - 핵산 서열(서열번호 107):

VK - 아미노산 서열(서열번호 68):

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSSGVPDRFSGSGSTGDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKVEIK

VK - 핵산 서열(서열번호 108):

특정 실시예에서, 항-CD3 바인딩 모이어티는 하기 표 5에 제시된 항체 W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP		서열번호 49	서열번호 50	서열번호 51
	VH	GFAFTDYYIH	WISPGNVNTKYNENFKG	DGYSLYYFDY
		서열번호 52	서열번호 53	서열번호 54
	VK	KSSQSLLNSRTRKNYLA	WASTRQS	TQSHTLRT

W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD3 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 69):

VH - 핵산 서열(서열번호 109):

VK - 아미노산 서열(서열번호 70):

VK - 핵산 서열(서열번호 110):

본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 항-CD3 결합 모이어티가 CD3에 특이적으로 바인딩할 수 있는 한 적합한 프레임워크 영역(FR) 서열을 추가로 포함한다.

본 개시 내용의 항-CD3 항체는 CD3-발현 세포(예를 들어, CD4 T 세포)에 대한 특이적 바인딩 친화도를 가지며 인간 T 세포를 활성화하고 TNFalpha 및 IFNgamma의 사이토카인 방출을 촉발할 수 있다.

본원에서 제공되는 항-CD3 바인딩 모이어티의 바인딩 친화도는 항원 및 항원-바인딩 분자 사이의 바인딩이 평형에 도달할 때 해리 속도 대 연관 속도의 비(k_off/k_on)를 나타내는 K_D 값으로 나타낼 수 있다. 항원-바인딩 친화도(예를 들어, K_D)는 예를 들어 유세포 분석법을 포함하는 당업계에 공지된 적합한 방법을 사용하여 적절하게 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 상이한 농도에서 항원에 대한 항체의 바인딩은 유세포 분석에 의해 결정될 수 있고, 결정된 평균 형광 강도(MFI)는 먼저 항체 농도에 대해 플롯팅될 수 있고, 그런 다음 K_D 값은 특이적인 바인딩 형광 강도(Y) 및 항체 농도(X)의 의존성을 하나의 부위 포화 방정식에 맞추어 계산될 수 있다: Prism 버전 5(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하는 Y=B_max*X/(KD + X), 상기 B_max는 항원에 대한 시험된 항체의 최대 특이적 바인딩을 나타낸다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 세포 표면 상에 발현된 인간 CD3, 또는 재조합 인간 CD3에 특이적으로 바인딩할 수 있다. CD3는 세포에 발현되는 수용체이다. 재조합 CD3은 재조합으로 발현되고 세포막과 연관되지 않는 가용성 CD3이다. 재조합 CD3은 다양한 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 일 예에서, 인간 CD3(NP_000724.1)(Met1-Asp126)의 세포외 도메인을 코딩하는 CD3 DNA 서열은 발현 벡터의 C-말단에서 폴리히스티딘 태그와 융합된 다음, 293E 세포에서 형질감염 및 발현되어 Ni-친화도 크로마토그래피로 정제될 수 있다.

일부 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 유세포 분석에 의해 측정 시 5x10^-9 M 이하, 4x10^-9 M 이하, 3x10^-9 M 이하, 2x10^-9 M 이하, 10^-9 M 이하, 5x10^-10 M 이하, 4x10^-10 M 이하, 3x10^-10 M 이하, 2x10^-10 M 이하, 10^-10 M 이하, 5x10^-11 M 이하, 또는 4x10^-11 M 이하, 3x10^-11 M 이하, 또는 2x10^-11 M 이하, 또는 10^-11 M 이하의 바인딩 친화도(K_D)로 세포의 표면 상에 발현된 인간 CD3에 특이적으로 바인딩할 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 사이노몰구스 원숭이 CD3, 예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 사이노몰구스 원숭이 CD3, 또는 가용성 재조합 사이노몰구스 원숭이 CD3과 교차-반응한다.

세포 표면 상에서 발현된 재조합 CD3 또는 CD3에 대한 항-CD3 바인딩 모이어티의 바인딩은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석, 및 기타 바인딩 분석과 같은 샌드위치 분석에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 0.01 nM 이하, 0.02 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.04 nM, 0.05 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.07 nM 이하 또는 0.08 nM 이하의 EC₅₀(즉, 50% 바인딩 농도)에서 ELISA에 의해 재조합 인간 CD3에 특이적으로 바인딩한다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 0.5 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.9nM 이하, 1nM 이하, 2nM 이하, 3nM 이하, 4nM 이하, 5nM 이하, 6nM 이하, 7nM 이하, 8 nM 이하, 9 nM 이하 또는 10 nM 이하의 EC₅₀에서 유세포 분석법에 의해 세포 표면 상에 발현된 인간 CD3에 특이적으로 바인딩한다.

특정 실시예에서, 항-CD3 바인딩 모이어티는 인간 CD3과 유사한 바인딩 친화도로 사이노몰구스 원숭이 CD3에 바인딩한다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 0.001 nM 이하, 0.005 nM 이하, 0.01 nM 이하, 0.02 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.04 nM 이하, 또는 0.05 nM 이하의 EC₅₀으로 ELISA에 의해 재조합 사이노몰구스 원숭이 CD3에 특이적으로 바인딩한다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 바인딩 모이어티는 진단 및/또는 치료 용도를 제공하기에 충분한 인간 CD3에 대한 특이적 바인딩 친화도를 갖는다. 다수의 치료 전략은 특히 임상적으로 사용되는 항-인간 CD3 모노클로날 항체에 의한 TCR 신호전달을 표적화함으로써 T 세포 면역을 조절합니다.

b) 항-CD20 항체

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-바인딩 모이어티 또는 제2 항원-바인딩 모이어티는 항-CD20 바인딩 모이어티이다.

특정 실시예에서, 항-CD20 바인딩 모이어티는 하기 표 6에 제시된 항체 W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP		서열번호 7	서열번호 8	서열번호 9
	VH	GFTFNDYAMH	TISWNSGSIGYADSVKG	DIQYGNYYYGMDV
		서열번호 10	서열번호 11	서열번호 12
	VK	RASQSVSSYLA	DASNRAT	QQRSNWPIT

W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 71):

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS

VH - 핵산 서열(서열번호 111):

gaggtgcaattggtggagagcggaggagggctcgtgcagcctggaagatctcttaggctgagttgcgctgcatctgggttcacattcaacgactacgccatgcactgggtgaggcaggctcccggcaaagggctggaatgggtgtcaactatctcctggaactccggcagcatcggctacgccgatagcgtcaagggccggtttacaatttcccgcgataacgccaagaagtccctgtacctgcagatgaacagcctgcgggccgaggatactgccctctactactgtgccaaggacattcagtacgggaattactattacgggatggacgtctggggccaggggaccaccgtgacagtcagctcc

VK - 아미노산 서열(서열번호 72):

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSTGDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK

VK - 핵산 서열(서열번호 112):

gaaatcgtgctgacccagtccccagcaaccctctccctttctcctggagagagagctaccctcagctgtagggcctcacagtctgtctccagttacctggcttggtaccagcagaaacccgggcaggcccctaggttgctgatctacgacgccagcaatagggccactggcatcccagcccggttttccggaagcggcagcgggacagatttcacactcactattagcagcctggagcccgaggacttcgccgtgtactattgccagcagcggtccaactggcccattacatttggccaagggacacgcctggagattaag

특정 실시예에서, 항-CD20 바인딩 모이어티는 하기 표 7에 제시된 항체 W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP		서열번호 19	서열번호 20	서열번호 21
	VH	GYTFTSYNMH	AIYPGNGDTSYNQKFKG	STYYGGDWYFNV
		서열번호 22	서열번호 23	서열번호 24
	VK	RASSSVSYIH	ATSNLAS	QQWTSNPPT

W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 73):

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA

VH - 핵산 서열(서열번호 113):

caggtccagctgcagcagcccggagccgaactggtcaaacccggggctagcgtgaaaatgtcttgcaaagcaagtggttacacattcacttcctataacatgcactgggtgaagcagacacctgggcgaggtctggaatggatcggcgccatctacccaggcaacggagacactagctataatcagaagtttaaaggaaaggccaccctgacagctgataagtccagctctaccgcttacatgcagctgagttcactgacaagtgaggactcagcagtgtactattgcgcccgttctacctactatggcggagattggtatttcaatgtgtggggcgccggtaccacagtcaccgtgtccgcc

VK - 아미노산 서열(서열번호 74):

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK

VK - 핵산 서열(서열번호 114):

cagattgtcctgagccagagccctgccatcctgtctgctagtcccggcgagaaggtgaccatgacatgcagggcatccagctctgtctcctacatccactggttccagcagaagcccgggagttcacctaaaccatggatctacgctacatccaacctggcaagcggtgtgcctgtcaggttttcaggttccggcagcggaacatcttacagtctgactatttctcgggtggaggccgaagacgccgctacctactattgccagcagtggacctccaatccccctacattcggcggagggactaagctggagatcaaa

특정 실시예에서, 항-CD20 바인딩 모이어티는 하기 표 8에 제시된 항체 W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP		서열목록 31	서열목록 32	서열목록 33
	VH	GYTFTSYNMH	AIYPGNGDTSYNQKFKG	STYYGGDWYFNV
		서열목록 34	서열목록 35	서열목록 36
	VK	RASSSVSYIH	ATSNLAS	QQWTSNPPT

W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 75):

VH - 핵산 서열(서열번호 115):

VK - 아미노산 서열(서열번호 76):

VK - 핵산 서열(서열번호 116):

특정 실시예에서, 항-CD20 바인딩 모이어티는 하기 표 9에 제시된 항체 W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP		서열번호 43	서열번호 44	서열번호 45
	VH	GFTFNDYAMH	TISWNSGSIGYADSVKG	DIQYGNYYYGMDV
		서열번호 46	서열번호 47	서열번호 48
	VK	RASQSVSSYLA	DASNRAT	QQRSNWPIT

W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 77):

VH - 핵산 서열(서열번호 117):

VK - 아미노산 서열(서열번호 78):

VK - 핵산 서열(서열번호 118):

특정 실시예에서, 항-CD20 바인딩 모이어티는 하기 표 10에 제시된 항체 W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP로부터 유래된다. W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 CDR 서열은 하기에 제공된다.

항체 ID:		CDR1	CDR2	CDR3
W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP		서열번호 55	서열번호 56	서열번호 57
	VH	GYTFTSYNMH	AIYPGNGDTSYNQKFKG	STYYGGDWYFNV
		서열번호 58	서열번호 59	서열번호 60
	VK	RASSSVSYIH	ATSNLAS	QQWTSNPPT

W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP 항체의 항-CD20 바인딩 모이어티의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.

VH - 아미노산 서열(서열번호 79):

VH - 핵산 서열(서열번호 119):

VK - 아미노산 서열(서열번호 80):

VK - 핵산 서열(서열번호 120):

본원에 제공된 항-CD20 바인딩 모이어티는 항-CD20 바인딩 모이어티가 CD20에 특이적으로 바인딩할 수 있는 한 적합한 프레임워크 영역(FR) 서열을 추가로 포함한다.

일부 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD20 바인딩 모이어티는 유세포 분석 검정에 의해 측정 시 5x10^-9 M 이하, 1x10^-9 M, 9x10^-10 M 이하, 8x10^-10 M 이하, 7x10^-10 M 이하, 6x10^-10 M 이하, 5x10^-10 M 이하, 4x10^-10 M 이하, 3x10^-10 M 이하, 2x10^-10 M 이하, 또는 1x10^-10 M 이하의 바인딩 친화도(K_D)로 세포의 표면 상에 발현된 인간 CD20에 특이적으로 바인딩할 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD20 바인딩 모이어티는 사이노몰구스 원숭이 CD20, 예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 사이노몰구스 원숭이 CD20, 또는 가용성 재조합 사이노몰구스 원숭이 CD20과 교차-반응한다.

세포 상에서 발현된 CD20에 대한 항-CD20 바인딩 모이어티의 바인딩은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석 및 기타 결합 분석과 같은 샌드위치 분석에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD20 바인딩 모이어티는 유세포 분석에 의하여 0.01 nM 이하, 0.02 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.04 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.7 nM 이하, 이하 0.8 nM, 0.9 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 EC₅₀으로 세포 상에서 발현된 인간 CD20에 특이적으로 바인딩한다.

특정 실시예에서, 항-CD20 바인딩 모이어티는 인간 CD20과 유사한 바인딩 친화도로 사이노몰구스 원숭이 CD20에 바인딩한다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD20 바인딩 모이어티는 유세포 분석에 의하여 0.2 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.8 nM 이하, 1 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 3 nM 이하의 EC₅₀으로 세포 상에서 발현된 사이노몰구스 원숭이 CD20에 특이적으로 바인딩한다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD20 바인딩 모이어티는 Fab-Zap 검정에 의해 1 pM 이하, 2 pM 이하, 3 pM 이하, 4 pM 이하, 5 pM 이하, 6 pM 이하, 7 pM 이하, 8 pM 이하, 9 pM 이하, 10 pM 이하, 11 pM 이하, 12 pM 이하, 13 pM 이하, 14 pM 이하, 15 pM 이하, 16 pM 이하, 17 pM 이하, 18 pM 이하, 19 pM 이하, 20 pM 이하, 21 pM 이하, 22 pM 이하, 23 pM 이하, 24 pM 이하, 25 pM 이하, 30 pM 이하, 35 pM 이하, 40 pM 이하, 45 pM 이하, 50 pM 이하의 EC₅₀으로 CD20-발현 세포에 의해 내재화된다.

이중특이적 폴리펩티드 복합체

특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 항원 바인딩 모이어티는 2가, 3가, 4가와 같은 다가이다. 본원에 사용된 용어 "가"는 주어진 분자에서 특정 수의 항원 바인딩 부위의 존재를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항원-바인딩 분자 내에 각각 2개의 바인딩 부위, 4개의 바인딩 부위 및 6개의 바인딩 부위가 존재하는 것을 의미한다. 2가 분자는 2개의 바인딩 부위가 모두 동일한 항원 또는 동일한 에피토프의 특이적 바인딩에 대한 것이라면 단일특이적일 수 있다. 유사하게, 3가 분자는, 예를 들어, 2개의 바인딩 부위가 제1 항원(또는 에피토프)에 대해 단일특이적이고 제3 바인딩 부위가 제2 항원(또는 에피토프)에 대해 단일특이적인 경우, 이중특이적일 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 내의 제1 및/또는 제2 항원-바인딩 모이어티는 동일한 항원 또는 에피토프에 대해 특이적인 적어도 2개의 바인딩 부위를 갖는 2가, 3가 또는 4가일 수 있다. 이는 특정 실시예에서 1가 대응물보다 항원 또는 에피토프에 대한 더 강한 바인딩을 제공한다. 특정 실시예에서, 2가 항원-바인딩 모이어티에서, 제1 가의 바인딩 부위 및 제2 가의 바인딩 부위는 구조적으로 동일하거나(즉, 동일한 서열을 가짐), 또는 구조적으로 상이하다(즉, 동일한 특이성을 갖지만 상이한 서열을 가짐).

특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 항원 바인딩 모이어티는 다가이고 스페이서의 존재 또는 부재하에 함께 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 항원 바인딩 부위를 포함한다.

특정 실시예에서, 제2 항원 바인딩 모이어티는 제2 항체의 2개 이상의 Fab를 포함한다. 2개의 Fab는 서로 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 예를 들어 제1 Fab는 사이에 스페이서의 존재 또는 부재하에 중쇄를 통해 제2 Fab에 공유적으로 부착될 수 있다.

특정 실시예에서, 제1 항원-바인딩 모이어티는 제1 이량체화 도메인에 연결되고, 제2 항원-바인딩 모이어티는 제2 이량체화 도메인에 연결된다. 본원에 사용된 용어 "이량체화 도메인"은 서로 연관하여 이량체를 형성할 수 있고, 또는 일부 예에서, 2개의 펩티드의 자발적 이량체화를 가능하게 할 수 있는 펩티드 도메인을 지칭한다.

특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제2 이량체화 도메인과 연관될 수 있다. 연관은 어느 적합한 상호작용 또는 연결 또는 결합을 통해, 예를 들어, 커넥터, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기 상호작용, 염 다리, 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통해 이루어질 수 있다. 예시적인 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역, 항체 CH2 도메인, 항체 CH3 도메인, 및 서로 이량체화 및 회합할 수 있는 다른 적합한 단백질 단량체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인은 IgG1, IgG2 및 IgG4와 같은 항체 이소타입에서 유래될 수 있다.

"이황화 결합"은 R-S-S-R' 구조를 갖는 공유 결합을 의미한다. 아미노산 시스테인은 예를 들어 다른 시스테인 잔기로부터의 제2 티올기와 이황화 결합을 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 이황화 결합은 2개의 폴리펩티드 사슬에 각각 존재하는 2개의 시스테인 잔기의 티올기 사이에 형성되어, 사슬간 브릿지 또는 사슬간 결합을 형성할 수 있다.

수소 원자가 질소, 산소 또는 불소와 같은 전기음성도가 높은 원자에 공유적으로 바인딩될 때 두 극성 그룹 사이의 정전기적 인력에 의해 수소 결합이 형성된다. Asn의 질소 그룹과 His의 산소 그룹, Asn의 산소 그룹과 Lys의 질소 그룹과 같이 각각 두 잔기의 백본 산소(예를 들어, 칼코겐 그룹)와 아미드 수소(질소 그룹) 사이의 폴리펩티드에서 수소 결합이 형성될 수 있다. 수소 결합은 반데르발스 상호작용보다 강하지만, 공유 또는 이온 결합보다는 약하고, 2차 구조와 3차 구조를 유지하는 데 중요하다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 간격이 i와 i+4 사이에 규칙적으로 발생할 때 알파 나선이 형성되고, 베타 시트는 적어도 2개 또는 3개의 백본 수소 결합 펩티드로 연결된 2개의 펩티드가 꼬인 주름진 시트를 형성할 때 형성되는 3-10개 아미노산 길이의 펩티드 사슬의 스트레치이다.

정전기 상호작용은 비-공유 상호작용이며 이온 상호작용, 수소 결합 및 할로겐 결합을 포함하는 단백질 폴딩, 안정성, 유연성 및 기능에 중요하다. 정전기적 상호작용은 폴리펩티드에서, 예를 들어, Lys와 Asp 사이, Lys와 Glu 사이, Glu와 Arg 사이, 또는 제1 사슬의 Glu, Trp 및 제2 사슬의 Arg, Val 또는 Thr 사이에서 형성될 수 있다.

염 다리는 Asp 또는 Glu의 음이온성 카르복실레이트 및 Lys 또는 Arg의 구아니디늄으로부터의 양이온성 암모늄으로부터 주로 발생하는 근-거리 정전기 상호작용이며, 이는 천연 단백질 구조에서 반대 전하를 띤 잔기의 공간적인 근위 페어링이다. 대부분 소수성 계면에서 전하를 띠고 극성인 잔기는 바인딩을 위한 핫 스팟으로 작용할 수 있다. 그 중에서도, His, Tyr 및 Ser과 같은 이온화 가능한 측쇄를 가진 잔기 또한 염 다리 형성에 참여할 수 있다.

소수성 상호작용은 제1 사슬 상의 하나 이상의 Val, Tyr 및 Ala와 제2 사슬 상의 하나 이상의 Val, Leu, 및 Trp, 또는 제1 사슬 상의 His 및 Ala 및 제2 사슬 상의 Thr 및 Phe 사이에 형성될 수 있다(Brinkmann, et al, 2017, Supra 참조).

특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 CH2 도메인, 및/또는 항체 CH3 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 힌지-Fc 영역, 즉 힌지-CH2-CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제1 TCR 불변 영역의 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-바인딩 모이어티의 항체 CH1 불변 영역의 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 이량체화 도메인은 조작된 TCR 불변 영역의 C-말단에 작동 가능하게 연결되고, 함께 키메라 불변 영역을 형성한다. 다시 말해서, 키메라 불변 영역은 조작된 TCR 불변 영역과 작동 가능하게 연결된 제1 이량체화 도메인을 포함한다.

특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 제1 힌지-Fc 영역에 부착된 조작된 CBeta를 포함한다.

특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 제1 항체 CH2 도메인, 및/또는 제1 항체 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 키메라 불변 영역은 제3 접합 도메인의 C-말단에 부착된 제1 항체 CH2-CH3 도메인을 추가로 포함한다.

키메라 불변 영역 및 제2 TCR 불변 도메인의 이러한 페어링은 원하는 항체 가변 영역에 융합되도록 조작되어 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 제공할 수 있다는 점에서 유용하다. 예를 들어, 항체 중쇄 가변 영역은 키메라 불변 영역(C1 포함)에 융합되어 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제1 폴리펩티드 사슬을 제공할 수 있고; 유사하게, 항체 경쇄 가변 영역은 제2 TCR 불변 도메인(C2 포함)에 융합되어 본원에서 제공되는 폴리펩티드 복합체의 제2 폴리펩티드 사슬을 제공할 수 있다.

특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4와 같은 항체로부터 유래될 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 선택적으로 예를 들면 힌지-Fc 영역과 같은 항체 CH2 도메인, 및/또는 항체 CH3 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 힌지 영역은 제2 항원 바인딩 부위(예를 들어 Fab)의 항체 중쇄에 부착될 수 있다.

이중특이적 폴리펩티드 복합체에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이량체로 연관될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하고 동종이량체화를 방해하고 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연관한다. 예를 들어, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이들이 동일하지 않고 그 자체 내에서 서로 간에 동종이량체를 형성하기보다는 이종이량체를 형성하도록 우선적으로 선택될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀의 형성, 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 친수성 상호작용, 또는 증가된 유연성을 통해 이종이량체로 연관될 수 있다.

특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀을 형성할 수 있도록 각각 돌연변이된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 첫 번째 CH2/CH3 폴리펩티드에서 작은 아미노산 잔기를 더 큰 아미노산 잔기로 교체하여 노브를 얻을 수 있고, 큰 잔기를 작은 잔기로 교체하여 구멍을 얻을 수 있다. 놉-인투-홀에 대한 돌연변이 부위의 세부사항은 Ridgway et al., 1996, supra, Spiess et al., 2015, supra and Brinkmann et al., 2017, supra에 개시된다.

이중특이적 형식

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-바인딩 부분 및 제2 바인딩 부분은 Ig-유사 구조로 연관된다. Ig-유사 구조는 항원-바인딩을 위한 2개의 팔과 연관 및 안정화를 위한 1개의 줄기가 있는 Y형 구조를 갖는 천연 항체와 같다. 천연 항체와의 유사성은 우수한 생체내 약동학, 원하는 면역학적 반응 및 안정성 등과 같은 다양한 이점을 제공할 수 있다. 본원에 제공된 제2 항원-바인딩 모이어티와 연관된 본원에 제공된 제1 항원-바인딩 모이어티를 포함하는 Ig-유사 구조는 Ig(예를 들어, IgG)의 열 안정성에 필적하는 열 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 Ig-유사 구조는 천연 IgG의 것의 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%이다.

본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다: i) VH1-C1-힌지-CH2-CH3; ii) VL1-C2; iii) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3, 및 iv) VL2-CL, 상기 C1 및 C2는 적어도 하나의 비-천연 사슬간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 및 2개의 힌지 영역 및/또는 2개의 CH3 도메인은 이량체화를 촉진할 수 있는 하나 이상의 사슬간 결합을 형성할 수 있다.

본원에 개시된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 생체내 반감기가 더 길고 다른 형식의 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 비교할 때 상대적으로 제조하기가 더 쉽다.

이중특이적 복합체 서열

일부 실시예에서, 이중특이적 복합체의 제1 항원-바인딩 모이어티는 CD3에 특이적으로 바인딩할 수 있고, 제2 항원-바인딩 모이어티는 CD20에 특이적으로 바인딩할 수 있다. 다른 실시예에서, 이중특이적 복합체의 제1 항원-바인딩 모이어티는 CD20에 특이적으로 바인딩할 수 있고, 제2 항원-바인딩 모이어티는 CD3에 특이적으로 바인딩할 수 있다.

특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 실시예 2에 나타낸 바와 같은 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 및 서열번호 84(W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP 항체). 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 실시예 2에 나타낸 바와 같은 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 및 서열번호 88(W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP 항체). 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 실시예 2에 나타낸 바와 같은 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92. 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 5개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다: a) 서열번호 89에 제시된 서열을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬; b) 서열번호 90에 제시된 서열을 갖는 제2 폴리펩티드 사슬; c) 서열번호 91에 제시된 서열을 갖는 제3 폴리펩티드 사슬; d) 서열번호 91에 제시된 서열을 갖는 제4 폴리펩티드 사슬; 및 e) 서열번호 92에 기재된 서열을 갖는 제5 폴리펩티드 사슬. 예를 들어, 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 2개의 항-CD20 바인딩 모이어티를 포함하는 W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP 항체이며, 이 중 하나의 중쇄 VH-CH1 도메인은 실시예 2에 나타낸 바와 같은 항-CD3 바인딩 모이어티의 중쇄 VH 도메인이다. 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 실시예 2에 나타낸 바와 같은 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95 및 서열번호 96(W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP 항체). 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 실시예 2에 나타낸 바와 같은 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 및 서열번호 100(W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP 항체). 이러한 실시예에서, 제1 항원 바인딩 모이어티는 CD3에 바인딩하고, 제2 항원 바인딩 모이어티는 CD20에 결합한다.

특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 다음을 포함하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다: i) 제1 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH1; ii) 제2 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VL1; iii) 통상적인 항체 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH2, 및 iv) 통상적인 항체 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VL2. 특정 실시예에서, 제1 키메라 불변 영역은 각각 상기 정의된 바와 같은 C1-힌지-CH2-CH3를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 키메라 불변 영역은 상기 정의된 바와 같은 C2를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 통상적인 항체 중쇄 불변 영역은 각각 상기 정의된 바와 같은 CH1-힌지-CH2-CH3을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 통상적인 항체 경쇄 불변 영역은 상기 정의된 바와 같이 CL을 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, 서열번호 92의 폴리펩티드 서열에서 위치 182, 193, 203, 206 및 207에 있는 천연 글리코실화 부위로부터의 하나 이상의 아미노산이 변형된다. 바람직하게는, 변형은 서열번호 92의 위치 193에 있는 아미노산에 대해 이루어진다. 특정 실시예에서, 이러한 변형은 S182X, S193X, S203X, S206X 또는 S207X의 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 상기 X는 Ser 및 Thr 이외의 어느 아미노산을 나타낸다. 특정 바람직한 실시예에서, 상기 변형은 S193X이고, 상기 X는 Ala, Gly, Pro 또는 Val로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 돌연변이(들)는 O-글리코실화 부위를 제거하고, O-글리코실화의 유형은 Core1 배열의 O-당류이고 NeuAc-Gal-GalNAc 또는 NeuAc-Gal-(NeuAc) GalNAc의 구조식을 갖는다.

상기 기재된 바와 같이, 변형이 없는 이중특이적 항체와 비교하여, 본원에 기재된 이중특이적 항체의 상응하는 폴리펩티드 서열에서 천연 글리코실화 부위를 변형시켜 생성된 돌연변이 이중특이적 항체는 천연 항체와 더 유사하고, 유의하게 감소된 면역원성, 개선된 반감기 및 개선된 약물가능성을 갖는다.

제조 방법

본 개시 내용은 폴리펩티드 복합체, 및 본원에 제공된 이중특이적 항-CD3 x CD20 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 분리된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본원에 사용된 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중- 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 바인딩 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 이종상동체, SNP, 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) 참조).

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 이를 위해, 모 항체(CDR 또는 가변 영역과 같은)의 항원-바인딩 모이어티를 코딩하는 DNA는 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄 영역을 코딩하는 유전자에 특이적으로 바인딩할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 통상적인 절차를 사용하여 분리되고 서열 결정될 수 있다. 마찬가지로, TCR 불변 영역을 코딩하는 DNA도 얻을 수 있다. 예로서, 가변 도메인(VH)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 제1 TCR 불변 영역(C1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 수득되고 작동 가능하게 연결되어 숙주 세포에서 전사 및 발현되어 제1 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 유사하게, VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 C1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되어, 숙주 세포에서 제2 폴리펩티드의 발현을 허용한다. 필요한 경우, 하나 이상의 스페이서에 대한 코딩 폴리뉴클레오티드 서열 또한 원하는 산물의 발현을 허용하기 위해 다른 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다.

코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 선택적으로 발현 벡터에서 하나 이상의 조절 서열에 추가로 작동 가능하게 연결되어, 제1 및 제2 폴리펩티드의 발현 또는 생산이 실현가능하고 적절한 제어 하에 있을 수 있다.

코딩 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 다른 실시예에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 당업계에 공지된 상동 재조합에 의해 생산될 수 있다. 많은 벡터가 사용 가능하다. 벡터 구성요소는 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터(예를 들어, SV40, CMV, EF-1α), 및 전사 종결 서열.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 삽입되어 그 단백질의 발현을 야기할 수 있는 비히클을 지칭한다. 전형적으로, 작제물은 또한 적절한 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자는 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 부위-지향적 변형 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'-플랭킹 영역에 위치한 조절 서열을 포함할 수 있으며, 가능한 방식으로 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 원하는 전사체/유전자를 숙주 세포에서 발현시키는 것. 벡터는 숙주 세포 내에서 운반하는 유전 요소의 발현을 야기하기 위해 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 벡터의 예에는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체, 람다 파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지, 동물 바이러스가 포함된다. 벡터로 사용되는 동물 바이러스의 범주에는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 유두종바이러스 및 파포바바이러스(예를 들어, SV40)가 포함된다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택가능한 요소, 및 리포터 유전자를 포함하는 발현 조절을 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 부가적으로, 벡터는 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 코팅을 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포 내로의 진입을 돕는 물질을 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 벡터 시스템은 포유동물, 박테리아, 효모 시스템 등을 포함하고, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 등, 및 기타 실험실적 및 상업적으로 이용가능한 벡터를 포함한다. 적합한 벡터는 플라스미드, 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함할 수 있다.

본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본원에서의 용어 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.

본원의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진균, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 대장균과 같은 장내세균과, 예를 들어 E. coli, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들어, 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예를 들어, Serratia marcescans, 및 시겔라, 뿐만 아니라 B. subtilis 및 B. licheniformis와 같은 바실리, P. aeruginosa 및 Streptomyces와 같은 슈도모나스를 포함한다.

원핵생물에 부가적으로, 사상균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물은 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지에, 또는 일반적인 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 쉬조사카로마이세스 폼; 예를 들어 K. lactis, K. fragilis(ATCC 12,424), K. bulgaricus(ATCC 16,045), K. wickeramii(ATCC 24,178), K. waltii(ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, 및 K. marxianus와 같은 클루이베로마이세스 숙주; 야로위아(EP 402,226); 피치아 파스토리스 (EP 183,070); 칸디다균; 트리코더마 레시아(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사; 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스와 같은 슈반니오마이세스; 및 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움과 같은 사상균, 및 A. nidulans 및 A. niger와 같은 아스퍼질러스 숙주와 같은 사상 진균과 같은 다수의 다른 속, 종 및 균주가 본원에서 일반적으로 이용가능하고 유용하다.

본원에 제공된 글리코실화된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루기페르다 (애벌레), 아이데스 이집트 (모기), 아이데스 알보픽투스 (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (초파리) 및 봄빅스 모리와 같은 숙주의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 해당 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 예를 들어 오토그라파 캘리포니아 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주와 같이 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주가 공개적으로 이용 가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따른 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로 사용할 수 있다.

그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 높았고, 배양(조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식이 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977))로, 예컨대 Expi293; 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 계통(Hep G2)이다.

숙주 세포는 전술한 발현으로 형질전환되거나 클로닝 벡터는 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 클로닝 벡터 증폭에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.

본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 생산을 위해, 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 숙주 세포의 배양에는 Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium(MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Sigma)와 같은 상용 배지가 적합하다. 부가적으로, Ham et al., Meth. 엔즈. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 U.S. Pat. Re. 30,985에 개시된 배지는 숙주 세포의 배양 배지로 사용될 수 있다. 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 버퍼(예컨대 HEPES), 뉴클레오티드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 GENTAMYCINTM 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 포도당 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 어느 다른 필요한 보충물이 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은, 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사전에 사용된 조건이며, 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

일 양태에서, 본 개시 내용은 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건 하에 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법을 제공한다.

특정 실시예에서, 본 개시 내용은 다음을 포함하는 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 생산하는 방법을 제공하고, a) 숙주 세포에 도입하는 단계: N-말단에서 C-말단까지 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 항원-바인딩 모이어티를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 제1 TCR 불변 영역(C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인(VH), N-말단에서 C-말단까지 제2 TCR 불변 영역(C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 제2 항원-바인딩 모이어티를 코딩하는 하나 이상의 부가적인 폴리뉴클레오티드, 상기 C1 및 C2는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 사슬간 이황화 결합은 C1 및 C2의 이량체를 안정화할 수 있고, 제1 항원-바인딩 모이어티 및 제2 항원-바인딩 모이어티는 제1 항원-바인딩 모이어티와 제2 항원-바인딩 모이어티가 모두 천연 Fab 대응물이고, 제1 항체가 제1 항원 특이성을 갖고 제2 항체가 제2 항원 특이성을 갖고, b) 숙주 세포가 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하도록 하는 단계.

특정 실시예에서, 상기 방법은 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.

재조합 기술을 사용할 때, 본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 세포 내, 주변세포질 공간에서 생성되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 산물이 세포 내에서 생산되는 경우, 첫 번째 단계로, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편을, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과를 통해 제거한다. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)은 E. coli의 주변 세포질 공간으로 분비되는 항체를 분리하는 절차를 설명합니다. 간단히 말해서, 세포 페이스트를 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동한다. 세포 파편은 원심분리로 제거할 수 있다. 생성물이 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템의 상청액은 일반적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위해 상기 어느 단계에 포함될 수 있고 항생제는 외래성 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 염석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 선호되는 정제 기술은 친화성 크로마토그래피이다.

본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 경우, 단백질 A는 폴리펩티드 복합체에 존재하는 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 친화성 리간드로서 사용될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기초한 폴리펩티드 복합체의 정제에 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입과 인간 γ에 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 사용 가능하다. 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 허용한다.

본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제에 유용하다. 이온-교환 컬럼의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼)에 대한 헤파린 SEPHAROSE^TM 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 ammonium sulfate 침전과 같은 단백질 정제를 위한 기타 기술 또한 회수할 항체에 따라 가능하다.

어느 예비 정제 단계(들) 이후, 관심 폴리펩티드 복합체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 바람직하게는 낮은 염 농도에서 수행되는 약 2.5-4.5의 pH에서 용리 버퍼를 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다. (예를 들어, 약 0-0.25M 염).

특정 실시예에서, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 통상적인 방법을 사용하여 고수율로 용이하게 정제될 수 있다. 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 장점 중 하나는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열 간의 미스페어링이 현저히 감소된다는 것이다. 이는 원치 않는 부산물의 생산을 줄이고 비교적 간단한 정제 공정을 사용하여 고순도 산물을 고수율로 얻을 수 있도록 한다.

유도체

특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 원하는 접합체와의 접합 염기로서 사용될 수 있다.

다양한 접합체가 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 연결될 수 있는 것으로 고려된다(예를 들어, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, JM Cruse and RE Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989)). 이들 접합체는 다른 방법 중에서 공유 결합, 친화성 결합, 삽입, 배위 결합, 복합체화, 연관, 블렌딩, 또는 첨가에 의해 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 연결될 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 하나 이상의 접합체에 대한 결합에 사용될 수 있는 에피토프 바인딩 부분 외부의 특정 부위를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는 접합체에 대한 공유 연결을 용이하게 하기 위해 예를 들어 시스테인 또는 히스티딘 잔기와 같은 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 접합체에 직접적으로, 또는 간접적으로, 예를 들어 다른 접합체를 통해 또는 링커를 통해 연결될 수 있다.

예를 들어, 시스테인과 같은 반응성 잔기를 갖는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 반응성 그룹이 예를 들어 말레이미드, 요오도아세트아미드, 피리딜 이황화물, 또는 기타 티올-반응성 접합 파트너인 티올-반응제에 연결될 수 있다. (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671).

또 다른 예를 들어, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 비오틴에 접합된 다음, 아비딘에 접합된 제2 접합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 또 다른 예를 들면, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 접합체에 추가로 연결되는 링커에 연결될 수 있다. 링커의 예에는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이관능성 유도체와 같은 이관능성 커플링제가 포함되고, 이관능성 유도체는 이미도에스테르(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대 디숙신이미딜 수헤레이트), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 his-활성 불소 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)에서 유래된다. 특히 바람직한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPP)를 포함하고 이황화 연결을 제공한다.

접합체는 검출가능한 표지, 약동학적 변형 모이어티, 정제 모이어티, 또는 세포독성 모이어티일 수 있다. 검출 가능한 표지의 예에는 형광 표지(예를 들어 플루오레세인, 로다민, 단실, 피코에리트린 또는 텍사스 레드), 효소-기질 표지(예를 들어 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈, 알칼리 포스파테이즈, 루세리페레이즈, 글루코아밀레이즈, 리소자임, 사카라이드 산화효소 또는 β-D-갈락토시데이즈), 방사성 동위원소(예를 들어 ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ³H, ¹¹¹In, ¹¹²In, ¹⁴C, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, 및 ³²P, 다른 란타나이드, 발광 표지), 발색단 모이어티, 디곡시제닌, 비오틴/아비딘, 검출용 DNA 분자 또는 금이 포함될 수 있다. 특정 실시예에서, 접합체는 항체의 반감기를 증가시키는 데 도움이 되는 PEG와 같은 약동학적 변형 모이어티일 수 있다. 다른 적합한 중합체는 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체와 같은 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 접합체는 자성 비드와 같은 정제 모이어티일 수 있다. "세포독성 모이어티"는 세포에 유해하거나 세포를 손상시키거나 또는 죽일 수 있는 어느 제제일 수 있다. 세포독성 모이어티의 예에는, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라톡신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신 및 이의 유사체, 항대사물질(예를 들어 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 암티오에실, 클로르에타민) 안트라사이클린(예를 들어 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항-유사분열제(예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

항체, 면역글로불린 또는 이의 단편과 같은 단백질에 대한 접합체의 접합 방법은, 예를 들어, U.S. Pat. No. 5,208,020; U.S. Pat. No. 6,441,163; WO2005037992; WO2005081711; 및 WO2006/034488에 기재되어 있으며, 이는 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.

약제학적 조성물

본 개시 내용은 또한 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

용어 "약제학적으로 허용되는"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들) 및/또는 염이 제제를 구성하는 다른 성분과 일반적으로 화학적으로 및/또는 물리적으로 양립가능하고, 이의 수용자와 생리학적으로 양립할 수 있음을 나타낸다.

"약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의 약제학적 제형의 성분을 지칭하며, 이는 대상체에 대해 생물활성이 허용되고 무독성이다. 본원에 개시된 약제학적 조성물에 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 버퍼, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 격리 또는 킬레이트제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 비-독성 보조 물질, 당업계에 공지된 기타 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 포함한다.

적합한 성분은 예를 들어 항산화제, 충전제, 바인딩제, 붕해제, 버퍼, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 당 및 시클로덱스트린과 같은 안정제를 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈레이즈, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화 히드록사니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물에 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제의 포함은 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 산화를 감소시킨다. 이러한 산화 감소는 바인딩 친화력의 손실을 방지하거나 감소시켜, 단백질 안정성을 개선하고 저장 수명을 최대화한다. 따라서, 특정 실시예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하는 조성물이 제공된다.

추가로 예시하기 위해, 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 또는 덱스트로스 및 락테이트 링거 주사, 식물성 고정유와 같은 비수성 비히클, 면실유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩유, 정균 또는 진균 농도의 항균제, 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장제, 인산염 또는 시트르산 완충제와 같은 완충제, 중황산나트륨과 같은 항산화제, 염산프로카인과 같은 국소 마취제, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 현탁 및 분산제, 폴리소르베이트 80(TWEEN-80)과 같은 유화제, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산)와 같은 격리 또는 킬레이트제, 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 포함할 수 있다. 담체로 사용되는 항균제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 다중 용량 용기의 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 비-독성 보조 물질은 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 향상제, 또는 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 또는 시클로덱스트린과 같은 제제를 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 환제, 캡슐, 정제, 지속 방출 제형 또는 분말일 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, 약제학적 조성물은 주사가능한 조성물로 제제화된다. 주사가능한 약제학적 조성물은 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 또는 에멀젼을 생성하기에 적합한 액체 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 고체 형태와 같은 어느 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 주사용 제제는 주사용 멸균 및/또는 비-발열성 용액, 사용 직전에 용매와 결합할 수 있는 동결건조 분말과 같은 멸균 건조 가용성 산물, 피하 정제, 주사용 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 결합할 준비가 된 멸균 건조 불용성 산물, 및 멸균 및/또는 비-발열성 에멀젼을 포함할 수 있다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.

특정 실시예에서, 단위-용량 장관외 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장된다. 장관외 투여를 위한 모든 제제는 당업계에 공지된 바와 같이 무균 및 비 발열이어야 한다.

특정 실시예에서, 멸균, 동결건조 분말은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 분말 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 안정성 또는 기타 약리학적 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 물, 덱스트로스, 소르비탈, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 포도당, 수크로스 또는 기타 적합한 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용매는 버퍼, 예컨대 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨 또는 일 실시예에서 대략 중성 pH에서 당업자에게 공지된 기타 버퍼를 함유할 수 있다. 용액의 후속 멸균 여과 후 당업자에게 공지된 표준 조건 하에 동결건조가 바람직한 제제를 제공한다. 일 실시예에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알에 분배될 것이다. 각각의 바이알은 폴리펩티드 복합체, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 또는 이들의 조합의 단일 투여량 또는 다중 투여량을 함유할 수 있다. 정확한 샘플 회수 및 정확한 투여를 용이하게 하기 위해 용량 또는 용량 세트(예를 들어 약 10%)에 필요한 것보다 적은 양으로 바이알을 과도하게 채우는 것이 허용된다. 동결건조된 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건에서 보관될 수 있다.

주사용수로 동결건조된 분말의 재구성은 장관외 투여에 사용하기 위한 제형을 제공한다. 일 실시예에서, 재구성을 위해 멸균 및/또는 비-발열수 또는 기타 적합한 액체 담체가 동결건조된 분말에 첨가된다. 정확한 양은 선택한 요법에 따라 다르며 경험적으로 결정할 수 있다.

치료 방법

다음을 포함하는 치료 방법이 또한 제공된다: 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 상태 또는 장애를 치료 또는 예방하는 것. 특정 실시예에서, 대상체는 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 상태를 갖는 것으로 확인되었다.

본원에 사용된 상태의 "치료하다" 또는 "치료"는 상태의 예방 또는 완화, 상태 발병의 발생 또는 속도의 둔화, 상태의 발병 위험 감소, 관련된 증상의 발병 예방 또는 지연, 상태와 관련된 증상의 감소 또는 종료, 상태의 완전한 또는 부분적 퇴행 생성, 상태의 치유, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.

본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량은 예를 들어 대상체의 체중, 연령, 과거 병력, 현재 약물, 건강 상태 및 교차-반응, 알레르기, 과민성 및 불리한 부작용뿐만 아니라 투여 경로 및 질병 발병 정도와 같은 당업계에 공지된 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량은 이들 및 다른 상황 또는 요건에 의해 지시된 바와 같이 당업자(예를 들어 의사 또는 수의사)에 의해 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg(예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg)의 치료적 투여량으로 투여될 수 있다. 이들 중 특정 실시예에서, 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고, 이들 중 특정 실시예에서 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 실시예에서, 투여 용량은 치료 과정에 걸쳐 변경될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시예에서 초기 투여 용량은 후속 투여 용량보다 높을 수 있다. 특정 실시예에서, 투여 용량은 대상체의 반응에 따라 치료 과정에 걸쳐 변할 수 있다.

최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 투여량 요법을 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 또는 시간이 지남에 따라 여러 분할 용량이 투여될 수 있다.

본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 예를 들어 장관외(예를 들어, 정맥내 주입, 근육내 또는 피내 주사를 포함하는 피하, 복강내, 정맥내) 또는 비-장관외(예를 들어, 경구, 비강내, 안내, 설하, 직장 또는 국소) 경로와 같은 당업계에 알려진 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 의해 치료되는 상태 또는 장애는 암 또는 암성 상태, 자가면역 질환, 감염성 및 기생충성 질환, 심혈관 질환, 신경병증, 신경정신병 상태, 상해, 염증, 또는 응고 장애이다.

본원에 사용된 "암" 또는 "암성 상태"는 신생물 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이에 의해 매개되는 임의의 의학적 상태를 지칭하고, 고형암 및 백혈병과 같은 비-고형암 모두를 포함한다. 본원에 사용된 "종양"은 신생물 및/또는 악성 세포의 고형 덩어리를 지칭한다.

암과 관련하여, "치료하는" 또는 "치료"는 신생물 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이를 억제하거나 둔화시키는 것, 또는 신생물 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이의 발달을 예방하거나 지연시키는 것, 또는 이들의 일부 조합을 지칭할 수 있다. 종양과 관련하여, "치료하는" 또는 "치료"는 종양의 전부 또는 일부를 근절하는 것, 종양 성장 및 전이를 억제하거나 둔화시키는 것, 종양의 발달을 예방하거나 지연시키는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.

예를 들어, 암을 치료하기 위한 본원에 개시된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 용도와 관련하여, 치료 유효량은 종양의 전부 또는 일부를 근절하고, 종양 성장을 억제하거나 둔화시키며, 암성 상태를 매개하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하고, 종양 세포 전이를 억제하며, 종양 또는 암성 상태와 연관된 임의의 증상 또는 마커를 개선하고, 종양 또는 암성 상태의 발병을 예방 또는 지연시키며, 또는 이들의 일부 조합을 수행할 수 있는 폴리펩티드 복합체의 투여량 또는 농도이다.

특정 실시예에서, 상태 및 장애는 종양 및 암, 예를 들어, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 신장 세포암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위 암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈세포암, 및 기타 혈액암, 예컨대 전형적 호지킨 림프종(CHL), 원발성 가슴세로칸 큰 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종, EBV-양성 및 -음성 PTLD, 및 EBV-연관 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 형질 모세포 림프종, 림프절외 NK/T-세포 림프종, 비인두 암종, 및 HHV8-연관 원발성 삼출 림프종, 호지킨 림프종, 원발성 CNS 림프종, 척추 종양, 뇌간 교종과 같은 중추신경계(CNS) 신생물을 포함한다.

특정 실시예에서, 상태 및 장애는 CD20-관련 상태, 예컨대 B 세포 림프종, 선택적으로 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종을 포함하고, 상기 비-호지킨 림프종은 다음을 포함한다: 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 소포성 림프종, 변연부 B-세포 림프종(MZL), 점막-연관 림프 조직 림프종(MALT), 소 림프구 림프종(만성 림프구 백혈병, CLL), 또는 외투 세포 림프종(MCL), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM).

이중특이적 폴리펩티드 복합체는 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 치료 수단 또는 제제와 조합하여 투여될 수 있다.

특정 실시예에서, 암 또는 종양 또는 증식성 질환의 치료에 사용되는 경우, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 화학요법, 방사선 요법, 암 치료를 위한 수술(예를 들어, 종양 절제술), 화학 요법으로 인해 발생하는 합병증에 대한 하나 이상의 항구토제 또는 기타 치료제, 또는 암 또는 이와 관련된 모든 의학적 장애의 치료에 사용하기 위한 기타 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "조합으로 투여되는"은 동일한 약제학적 조성물의 일부로서 동시에, 별개의 조성물로서 동시에, 또는 별개의 조성물로서 상이한 시점에 투여되는 것을 포함한다. 다른 제제 이전 또는 이후에 투여된 조성물은, 조성물 및 제2 제제가 상이한 경로를 통해 투여되더라도, 본원에서 사용된 문구와 같이 그 제제와 "조합하여" 투여되는 것으로 간주된다. 가능한 경우, 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 조합하여 투여되는 부가적인 치료제는 부가적인 치료제의 제품 정보 시트에 나열된 일정, 또는 Physicians' Desk Reference (Physicians' Desk Reference, 70th Ed (2016)), 또는 당업계에 잘 알려진 프로토콜에 따라 투여된다.

특정 실시예에서, 치료제는 암에 대한 면역 반응을 유도하거나 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 종양 백신을 사용하여 특정 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 사이토카인 요법은 또한 면역계에 대한 종양 항원 제시를 향상시키는 데 사용될 수 있다. 사이토카인 요법의 예에는 인터페론-α, -β및 -γ와 같은 인터페론, 대식세포-CSF, 과립구 대식세포 CSF, 및 과립구-CSF, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 및 IL-12와 같은 인터루킨, TNF-α 및 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자와 같은 집락 자극 인자가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 면역억제 표적을 불활성화시키는 제제, 예를 들어, TGF-베타 억제제, IL-10 억제제, 및 Fas 리간드 억제제가 또한 사용될 수 있다. 다른 그룹의 제제는 종양 또는 암세포에 대한 면역 반응성을 활성화하는 작용제, 예를 들어, T 세포 활성화를 향상시키는 제제(예를 들어, CTLA-4, ICOS 및 OX-40과 같은 T 세포 공동자극 분자의 작용제) 및 수지상 세포 기능 및 항원 제시를 향상시키는 제제를 포함한다.

키트

본 개시 내용은 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 관심 표적의 존재 또는 수준을 검출하거나 또는 포획 또는 농축하는데 유용하다. 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 키트는 검출가능한 표지와 접합된 본원에서 제공되는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 특정 다른 실시예에서, 상기 키트는 본원에서 제공되는 표지되지 않은 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하고, 본원에서 제공되는 표지되지 않은 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 바인딩할 수 있는 2차 표지된 항체를 추가로 포함한다. 상기 키트는 사용 설명서, 및 키트의 각 구성 요소를 분리하는 패키지를 추가로 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 기질 또는 장치와 연관되어 있다. 유용한 기질 또는 장치는, 예를 들어, 자기 비드, 마이크로타이터 플레이트, 또는 테스트 스트립일 수 있다. 이는 바인딩 분석(ELISA와 같은), 면역학적 분석, 생물학적 샘플에서 표적 분자의 포획 또는 농축에 유용할 수 있다.

도 1은 연구된 항체 형식의 개략도를 나타내고, 여기서 "E17R-1", "F16-1" 및 "F17R-1"은 다음 이중특이적 항체의 형식을 개략적으로 나타낸다: W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP, W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP 및 W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP 각각. 그리고 "F18R-1"은 W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP 및 W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP의 형식을 개략적으로 나타낸다. 본 발명의 일 예에서, 이중특이적 항체의 명칭 "U"는 항-CD20 항체 또는 항-CD20 바인딩 부분을 지칭하고, 이중특이적 항체의 명칭 "T"는 항-CD3 항체 또는 항-CD3 바인딩 부분을 지칭한다. "T"의 불변 영역(CL 및 CH1)을 TCR의 불변 도메인으로 대체하여 일반 항체와 직교하는 독특한 경중쇄 경계면을 설계했다. Fc 도메인에서 “놉-인투-홀” (knobs-into-holes) 돌연변이와 함께 TCR-변형된 "T" 및 천연 "U"를 사용하여 이중특이적 항체 형식 "E17R-1", "F16-1", "F17R-1" 및 "F18R-1."을 설계했다.
도 2는 FACS에 의한 표적 바인딩을 나타낸다: (A) 주르캇 (Jurkat) 세포에 대한 WBP3278 BsAbs 결합 시험, 및 (B) 라지 (Raji) 세포에 대한 WBP3278 BsAbs 결합 시험.
도 3은 FACS에 의한 동시 이중 표적 바인딩을 나타낸다.
도 4는 T 세포 사멸을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 각각 CD25 발현 및 CD69 발현에 의해 표시되는 T 세포 활성화를 나타낸다.
도 6은 CD4⁺ T 세포에 의한 IL-2(A) 및 TNF-α(B) 방출을 나타낸다.
도 7은 혈청 안정성의 결과를 나타낸다.
도 8은 생체내 치료적 치료 모델에서 본 발명의 BsAb의 용량 의존적 항종양 활성을 나타낸다.
도 9는 WBP3278 리드 Ab (즉, W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4)가 투여된 나이브 수컷 사이노몰구스 원숭이의 말초혈액 순환 B 세포의 고갈을 나타낸다.
도 10a, 10b 및 10c는 WBP3278 리드 Ab 처리 후 말초 혈액에서 순환하는 T 세포의 수준 변화를 보여준다.
도 11은 WBP3278 리드 Ab 처리 후 순환하는 사이토카인 수준 변화를 보여준다.
도 12는 시간 경과에 따른 WBP3278 리드 Ab의 혈청 농도 변화를 보여준다.

다음 실시예는 청구된 발명을 더 잘 설명하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 하기에 기술된 모든 특이적 조성물, 재료, 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 특이적인 조성물, 재료, 및 방법은 본 발명을 제한하려는 것이 아니라, 단지 본 발명의 범위 내에 속하는 특정 실시예를 예시하기 위한 것이다. 당업자는 본 발명의 능력을 행사하거나 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 동등한 조성물, 재료, 및 방법을 개발할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 여전히 유지하면서 본 명세서에 기재된 절차에서 많은 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 그러한 변형이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이 본 발명자의 의도이다.

실시예 1

재료 및 벤치마크 항체의 준비

1. 재료 준비

실시예에 사용된 상업적으로 입수 가능한 재료에 대한 정보가 표 11에 제공되어 있다.

상용 재료

재료	공급업체	카탈로그 번호
CD4⁺ T 세포 분리 키트 (인간) (CD4⁺ T cell Isolation Kit (Human))	Stemcell	19052
CD8⁺ T 세포 분리 키트 (인간)(CD8⁺ T cell Isolation Kit (Human))	Stemcell	19053

칼세인-AM(Calcein-AM)	Invitrogen	C3099
CellTracker 파레드(CellTrackerTM FarRed)	Invitrogen	C34572
프로피듐 요오드화물 (PI)(Propidium Iodide (PI))	Invitrogen	P3566

알렉사 플루어647 접합 염소 항-인간 IgG Fc(Alexa Fluor647 conjugated Goat anti-human IgG Fc)	Jackson	109-605-098
FITC 표지된 항-인간 CD4(FITC labeled anti-human CD4)	BD Pharmingen	550628
PerCP-Cy5.5 표지된 항-인간 CD8(PerCP-Cy5.5 labeled anti-human CD8)	BD Pharmingen	565310
PE 표지된 항-인간 CD69(PE labeled anti-human CD69)	BD Pharmingen	555531
APC 표지된 항-인간 CD25(APC labeled anti-human CD25)	BD Pharmingen	555434

포획항체 정제 항-인간 TNF(Capture Antibody Purified Anti-Human TNF)	BD Pharmingen	555212 (51-26371E)
검출 항체 비오틴화 항-인간 TNF 단일클론항체(Detection Antibody Biotinylated Anti-Human TNF monoclonal antibody)	BD Pharmingen	555212 (51-26372E)
효소 시약 스트렙타비딘-HRP(Enzyme Reagent Streptavidin-HRP)	BD Pharmingen	555212 (51-9002813)
재조합 인간 TNF 표준(Recombinant Human TNF Standard)	BD Pharmingen	555212 (51-26376E)
인간/영장류 IL-2 항체 mAb 마우스 IgG2A(Human/Primate IL-2 Antibody mAb Mouse IgG2A)	R&D	MAB602
인간/영장류 IL-2 비오틴화된 항체(Human/Primate IL-2 Biotinylated Antibody)	R&D	BAF202
재조합 인간 IL-2(Recombinant human IL-2)	R&D	202-IL

주르캇(Jurkat)	ATCC	TIB-152
라지(Raji)	ATCC	CCL-86
나말와(NAMALWA)	ATCC	CRL-1432
라모스(Ramos)	ATCC	CRL-1596
SU-DHL-1	ATCC	CRL-2955

2. 벤치마크 항체의 생성

2개의 벤치마크 항체 W327-BMK1 및 W327-BMK4를 참조 항체로서 실시예에 적용하였다.

항-인간 CD20 벤치마크 항체 BMK1 (리툭시맙)은 미국 특허 출원 US 20140004037 A1로부터의 클론 C2B8의 서열에 기초하여 생성되었다. 항-CD3xCD20 참조 이중특이적 항체 BMK4 (REGN1979) 유전자를 미국 특허 출원 US 20150266966 A1의 서열에 따라 합성하였다. BMK 항체는 Expi293 세포에서 발현된 다음 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다.

실시예 2

본 출원의 이중특이적 항체의 제조

1. 항체 및 TCR 키메라 단백질의 디자인 및 설계

TCR 서열

TCR은 2개의 사슬로 구성된 이종이량체 단백질이다. 약 95%의 인간 T 세포에는 알파 및 베타 사슬로 구성된 TCR이 있다. 더 많은 결정 구조가 베타 사슬 TRBC1에 이용 가능하다는 점을 고려하면, TRBC1 서열이 본원에 개시된 폴리펩티드 복합체("WuXiBody")를 설계하기 위한 주요 골격으로 선택되었다. TRBC1의 전형적인 아미노산 서열은 PDB (Protein Data Bgank) 구조 4L4T에서 찾을 수 있다.

TCR의 사슬간 이황화 결합

TCR 결정 구조는 WuXiBody 디자인을 안내하는 데 사용되었다. T 세포 표면의 막에 고정된 천연 TCR과 달리 가용성 TCR 분자는 3D 구조가 항체 Fab와 매우 유사하지만 덜 안정적이다. 사실, TCR의 가용성 상태의 불안정성은 그 결정 구조의 해명을 가로막는 큰 걸림돌이었다 (Wang, Protein Cell, 5(9), pp.649-652(2014) 참조). 우리는 TCR 불변 영역에 한 쌍의 Cys 돌연변이를 도입하는 전략을 채택했으며 이것이 사슬 조립을 크게 개선하고 발현을 향상시킬 수 있음을 발견했다.

항체 가변 및 TCR 불변 도메인에 접속하는 접합, 이들의 상대적 융합 방향, 및 Fc-접속 접합은 모두 조심스럽게 미세 조정되었다. TCR 구조가 항체 Fab와 매우 유사하기 때문에, TCR 가변 영역 (PDB 4L4T)에 항체 Fv 상동성 모델을 중첩했다. 중첩된 구조는 항체 Fv가 TCR 불변 도메인과 구조적으로 양립할 수 있음을 나타낸다. 이 구조적 정렬 및 해당 시퀀스를 기반으로 모든 관련 설계 매개변수가 디자인되었다.

2. 본 출원의 이중특이적 항체의 제조

W3278 BsAb는 노브-인투-홀 형식의 인간 IgG4로 생성되었다 (S. Atwell, J. B. Ridgway, J. A. Wells, P. Carter, Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J. Mol. Biol. 270, 26-35 (1997); C. Spiess, M. Merchant, A. Huang, et al. D. G. Yansura, J. M. Scheer, Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nat. Biotechnol. 31, 753-758 (2013)). 인간 IgG4 Fc 영역 서열은 S228P 돌연변이로 디자인되었다. 항-CD3 모노클로날 항체는 사내 프로그램의 하이브리도마 기술에 의해 인간 CD3ε및 CD3δ ECD 단백질로 마우스의 면역화를 통해 생성되었다. 항-CD20 팔 가변 영역 서열은 오파투무맙 (Ofatumumab, PCT 공개 번호 WO 2010083365A1의 클론 2F2) 또는 리툭시맙 (Rituximab, 미국 특허 출원 US 20140004037 A1의 클론 C2B8)의 서열을 기반으로 하였다. W3278 BsAb 후보의 서열은 표 2에 나열되었으며, 그 DNA 서열은 제네위즈 (Genewiz, Shanghai)에서 합성되어 변형된 pcDNA3.3 발현 벡터에 클로닝되었다. 항-CD20 팔 및 항-CD3 팔의 발현 벡터를 ExpiFectamine293 형질감염 키트 (Invitrogen-A14524)를 사용하여 Expi293 (Invitrogen-A14527)에 공동 형질감염시켰다. 세포는 8% CO₂의 습한 환경을 포함하는 37℃ 인큐베이터에서 135rpm으로 회전하는 오비탈 쉐이커 플랫폼의 Expi293 발현 배지(Invitrogen-A1435101)에서 배양되었다. 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare, 17543802)을 사용하여 단백질 정제를 위해 배양 상청액을 수확하였다. 단백질 농도는 UV-Vis 분광광도계 (NanoDrop 2000, Thermo Scientific)로 측정하였다. 단백질 순도는 SDS-PAGE 및 분석용 HPLC-SEC에 의해 추정되었다. W3278-BsAb 후보의 개략도는 도 1에 설명되어 있다.

각 BsAb에서 중쇄 및/또는 경쇄의 서열

클론 ID		서열번호	아미노산 서열
W3278-T2U3.E17R-1.uIgG4.SP	H1	81	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
	H2	82	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTV LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
	L1	83	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
	L2	84	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK PDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
W3278-T3U2.F16-1.uIgG4.SP	H1	85	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTV LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
	H2	86	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
	L1	87	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK PDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
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W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP	H1	89	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTV LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
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W3278-U3T2.F18R-1.uIgG4.SP	H1	93	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFPGNDNIKYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIDSVSIYYFDYWGQGTLVTV LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
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W3278-T3U2.F17R-1.uIgG4.SP	H1	97	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTV LEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
	H2	98	QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
	L1	99	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK PDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
	L2	100	QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

참고: TCR 시퀀스는 기울임꼴 스크립트로 표시됨.

추가로, 이중특이적 항체 W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP의 경우, 서열번호 92의 폴리펩티드 서열에서 위치 182, 193, 203, 206 및 207에 있는 천연 글리코실화 부위로부터의 하나 이상의 아미노산이 변형되었다. 바람직하게는, 서열번호 92의 193번 위치의 아미노산에 변형이 이루어졌다. 특정 실시예에서, 이러한 변형은 S182X, S193X, S203X, S206X 또는 S207X의 하나 이상의 돌연변이를 포함하였고, 여기서 X는 Ser 및 Thr 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 특정 바람직한 실시예에서, 상기 변형은 S193X이고, 여기서 X는 Ala, Gly, Pro 또는 Val로부터 선택되었다. 상기 돌연변이(들)는 O-글리코실화 부위를 제거하였고, O-글리코실화의 유형은 코어1 (Core1) 배열의 O-사카라이드이고 NeuAc-Gal-GalNAc 또는 NeuAc-Gal-(NeuAc) GalNAc의 구조식을 가졌다.

상기 기재된 바와 같이, 변형되지 않은 이중특이적 항체와 비교하여, 본원에 기재된 이중특이적 항체의 상응하는 폴리펩티드 서열에서 천연 글리코실화 부위를 변형함으로써 생성된 돌연변이 이중특이적 항체는 천연 항체와 더 유사하고, 면역원성을 상당히 감소시키고, 반감기를 개선하고, 약물 투여성을 개선하였다.

실시예 3

시험관내 특성화

1. 세포주 및 1차 세포 분리

완전 배지 (10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640)에서 배양된 다음 세포주를 사용했다: 주르캇 (CD3+/CD20_- 세포); 라지, 라모스 및 나말와 (CD20+/CD3_- 세포), SU-DHL-1 (CD20_-/CD3_- 세포).

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 건강한 정상 공여자로부터의 헤파린 처리된 정맥혈로부터 피콜-파케 플러스 (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare-17-1440-03) 밀도 원심분리에 의해 새로 단리되었다. 1차 인간 CD8⁺ T 세포는 이지샙 (EasySep) 키트 (Stemcell-19053)에 의해 신선한 인간 PBMC로부터 분리되었고, 정제된 CD4⁺ T 세포는 이지샙 (Stemcell-19052) 컬럼에 의해 분리되었다.

2. 표적 세포에 대한 W3278 BsAb의 결합

표적 세포에 대한 W3278 BsAb의 결합은 유세포 분석 (low cytometry)에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, 표적 세포 (CD3+/CD20_- 세포 또는 CD20+/CD3_- 세포)의 1 x 10⁵/웰을 W3278 BsAb 또는 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체의 연속 희석액과 함께 4℃에서 60분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 차가운 1% BSA/1xPBS로 2회 세척하고 알렉사 플루어647 접합 염소 항-인간 IgG Fc (Jackson-109-605-098)를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 2회 세척 후 FACS Canto II 세포측정기 (BD Biosciences)를 이용하여 염색된 세포의 기하평균형광 (MFI)을 측정하였다. 항체가 없는 웰 또는 형광 2차 항체만 포함하는 웰을 사용하여 배경 형광을 확립했다. 세포 결합의 EC50 값은 4-매개변수 비선형 회귀 분석을 사용하여 계산된 값과 함께 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어 (GraphPad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 결정되었다. 표적 세포에 대한 W3278 BsAb의 FACS 결합은 도 2에 제시되어 있고, 결합 EC50은 하기 표 13에 제시되어 있다.

W3278 BsAb의 FACS 바인딩 EC50 및 세포 표면 표적에 대한 모 항체

Abs	Jurkat 2B8		Raji
Abs	EC50 (nM)	TOP MFI	EC50 (nM)	TOP MFI
W3278-T2U3.E17R-1.ulgG4.SP	128.7	3876	13.2	68500
W3278-T3U2.F16-1.ulgG4.SP	58.9	6753	>1000	55200
W3278-U2T3.F18R-1.ulgG4.SP	41.7	4077	2.5	66700
W3278-U3T2.F18R-1.ulgG4.SP	26.6	536	1.3	55400
W3278-T3U2.F17R-1.ulgG4.SP	17.3	7355	85.3	64900
Anti-CD3 Fab (T2)	33.0	3214
Anti-CD3 Fab	43.7	3803
Anti-CD20.lgG4 (U2)			11.4	53500
Anti-CD20.lgG4 (U3)			0.9	33300

CD3 및 CD20 발현 세포에 대한 W3278 BsAb의 동시 바인딩을 테스트하기 위해, 1x10⁶/ml 라지 세포 및 1x10⁶/ml 주르캇 세포를 각각 50nM 칼세인-AM (Invitrogen-C3099) 및 20nM 파레드 (Invitrogen-C34572)로 표지하였다. 차가운 1% BSA/1XPBS로 세척한 후, 표지된 라지 및 주르캇 세포를 재현탁하고 1:1의 비율로 1 x 10⁶/ml의 최종 농도로 혼합하였다. 1x10⁵/웰의 혼합 세포를 플레이팅하고 W3278 BsAb의 연속 희석액을 첨가했다. 4℃에서 60분간 배양한 후 FACS로 칼세인-AM과 파레드 이중양성 세포의 비율을 분석하였다.

도 3의 결과는 W3278 리드 BsAb가 BMK4보다 더 강력한 용량-의존적 동시 이중 표적 바인딩을 보여줌을 나타낸다.

3. 시험관내 세포독성 분석

CD8⁺ T 림프구에 의한 종양 세포 용해를 매개하는 BsAb의 효능은 FACS 기반 세포독성 검정에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, 새롭게 단리된 인간 CD8⁺ T 세포는 50 IU/ml 재조합 인간 IL-2 및 10ng/ml OKT-3을 포함하는 완전 배지에서 3 내지 5일 동안 배양되었다. 다음 날, 표적 세포인 라지, 라모스, 나말와 및 SU-DHL-1 (1×10⁶ 세포/ml)을 37℃에서 30분 동안 DPBS에서 20 nM 파레드 (Invitrogen-C34572)로 표지하고, 그 후 분석 완충액 (페놀 레드가 없는 RPMI 1640 배양 배지 + 10% FBS)으로 두 번 세척했다. 파레드 표지된 표적 세포 (2x10⁴/웰)를 이펙터 CD8⁺ T 세포 (이펙터/표적 세포 비율 5:1) 및 BsAbs 또는 hIgG4 이소타입 대조군의 연속 희석액을 포함하는 110μl/웰 완전 배지에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양했다. 마지막으로, 프로피듐 요오드화물 (PI, Invitrogen-P3566)을 첨가하고 유동 세포 계측법으로 분석하기 전 실온에서 15분 동안 배양했다. 백분율 세포독성은 방정식을 사용하여 계산되었다: 세포독성 %= 100*파레드⁺PI⁺/(파레드⁺PI⁺ + 파레드⁺PI^-)*100%. 시험관내 세포독성의 EC₅₀ 값은 프리즘 4-파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하여 결정되었다.

도 4의 결과는 W3278 리드 Ab "W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4"가 CD20 음성 SU-DHL-1 세포의 세포 사멸을 매개하지 않는다는 것을 보여준다. W3278 리드 Ab "W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4"는 BMK4보다 더 강력하게 CD20 양성 세포의 세포 사멸을 매개하고, 사멸 EC50은 세포 표면 CD20 발현 수준에 비례하여 증가한다. BsAb 매개 세포독성 EC50 및 최대 세포독성 (Max Cyto)%는 표 14에 개시된다.

W3278 리드 BsAb 및 BMK4 BsAb에 의한 상이한 B 세포주의 세포독성 EC50 및 최대 세포독성%.

Abs	Raji		Ramos		NAMALWA		SU-DHL-1
Abs	EC50 (pM)	Max Cyto %	EC50 (pM)	Max Cyto %	EC50 (pM)	Max Cyto %	EC50 (pM)	Max Cyto %
WBP327-BMK4.ulgG4	21.49	36.4	119.2	24.6	411.7	40.3	53.59	6.1
W3278-U2T3.F18R-1.ulgG4	0.52	41.7	1.25	17.1	46.8	33.0	NA	1.6

4. 세포 활성화 및 사이토카인 방출 분석

BsAb에 의해 매개되는 T 세포 활성화는 CD69 또는 CD25 발현 효과기 세포의 백분율을 측정하는 유세포 분석에 의해 결정되었다. 새로 분리된 정제된 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포를 각각 효과기 세포로 조사하였다. 간단히 말해서, 5x10⁴ CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포를 37℃에서 24시간 동안 1x10⁴ 라지 또는 SU-DHL-1 세포/웰의 존재하에 BsAbs 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체의 연속 희석을 포함하는 110㎕/웰 완전 배지에 플레이팅하였다. 배양 후, 세포를 1% BSA/1XDPBS로 2회 세척하고 항-인간 Ab 패널 (FITC 표지된 항-인간 CD4 (BD Pharmingen-550628); PerCP-Cy5.5 표지된 항-인간 CD8 (BD Pharmingen-565310); PE 표지된 항-인간 CD69 (BD Pharmingen-555531) 및 APC 표지된 항-인간 CD25 (BD Pharmingen-555434))로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. CD69 또는 CD25 발현에 의해 평가된 T 세포 활성화를 FACS에 의해 분석하였다. T 세포 활성화의 EC50은 프리즘 4-파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하여 결정되었다.

표적 세포가 없는 경우, W3278 리드 Ab는 T 세포 활성화를 유도하지 않는다. 표적 세포의 존재 하에서만 W3278 리드 Ab는 CD25 발현 (도 5a) 및 CD69 발현 (도 5b)에 의해 나타난 바와 같이 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 활성화를 유도하며, 이는 BMK4보다 더 강력하다. 활성화 EC50은 표 15 및 16에 개시된다.

라지 세포의 존재 하에 W3278 BsAb 및 BMK4 BsAb에 의해 매개되는 T 세포 CD25 발현 EC50.

Abs	Raji		Ramos
Abs	EC50 (pM)	Max %	EC50 (pM)	Max %
W3278-U2T3.F18R-1.ulgG4	0.6	34.0	0.8	39.3
WBP327-BMK4.ulgG4	6.5	37.1	8.2	46.5

라지 세포의 존재 하에 W3278 BsAb 및 BMK4 BsAb에 의해 매개되는 T 세포 CD69 발현 EC50.

Abs	CD4+ / 라지		CD8+ / 라지
Abs	EC50 (pM)	최대 %	EC50 (pM)	최대 %
W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP	0.2	61.8	0.4	83.8
WBP327-BMK4.uIgG4	3.5	64.2	7.3	86.0

사이토카인 방출 (TNF-α 및 IL-2) 분석을 위해 새로 분리된 5x10⁴ CD4⁺ T 세포를 37℃에서 24시간 동안 1x10⁴ 라지 또는 SU-DHL-1 세포/웰의 존재하에 BsAbs 또는 hIgG4 이소타입 대조군 항체의 연속 희석을 포함하는 110μl/웰 완전 배지에 플레이팅했다. 24시간 배양 후, 플레이트를 원심분리하고 ELISA에 의한 사이토카인 농도 측정을 위해 -80℃에서 상층액을 수확하여 보관하였다.

ELISA에 의한 TNF-α 검출을 위해, 96-웰 ELISA 플레이트 (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)를 4℃에서 밤새 탄산수소염 완충액 (20mM Na₂CO₃, 180mM NaHCO₃, pH 9.2)에서 정제된 항-인간 TNF (BD Pharmingen-51-26371E) 포획 항체 50㎕로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 세척 완충액 (1X PBST 완충액, 0.05% 트윈-20)으로 세척한 다음 200μl 분석 희석제(PBS + 10% FBS)로 차단했다. 차단 후, 50㎕의 테스트 샘플 및 재조합 인간 TNF 표준(BD Pharmingen-51-26376E)을 첨가하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트에 대한 TNF-α의 결합은 검출 항체 비오틴화 항-인간 TNF (BD Pharmingen-51-26372E)에 의해 검출되었다. 발색 반응에는 스트렙타비딘-HRP 시약 (BD Pharmingen-51-9002813)과 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질(Sigma-860336-5G)을 사용했다. 세척 완충액으로 세척하는 단계를 단계 사이에 적용했다. 발색 반응은 2M HCl에 의해 대략 30분 후에 중단되었다. 멀티웰 플레이트 판독기 (SpectraMax®M5e)를 사용하여 450 nm에서 웰의 흡광도를 측정했다. 유사하게, 배양 상청액의 IL-2 농도를 ELISA로 측정하였다. 항-인간 IL-2 항체 mAb (R&D-MAB602)를 포획 항체로 사용하고 비오틴화된 항-인간 IL-2 항체 (R&D-BAF202)를 검출 항체로 사용했다.

도 6에 나타낸 바와 같이, CD20 음성 SU-DHL-1 세포의 존재 하에, W3278 리드 Ab는 T 세포 사이토카인 방출을 유도하지 않는다. 표적 라지 세포가 있는 경우에만 W3278 리드 Ab는 BMK4에 의한 것과 비교하여 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 유도할 수 있다. 그리고 사이토카인 방출과 세포 사멸 사이의 EC50 비율로 표시되는 EC50 창은 BMK4보다 W3278 Ab에 의해 더 크다 (표 17).

BsAb 매개 CD4 ⁺ T 세포 사이토카인 방출 EC50 및 최대 레벨, 라지 세포 사멸에 대한 사이토카인 방출의 EC50 비율

Ab	TNF-a		IL-2		EC50 비율 TNFa 방출/ Raji 세포 사멸	EC50 비율 IL-2 방출/ Raji 세포 사멸
Ab	EC50 (pM)	최대 레벨 (ng/ml)	EC50 (pM)	최대 레벨 (ng/ml)	EC50 비율 TNFa 방출/ Raji 세포 사멸	EC50 비율 IL-2 방출/ Raji 세포 사멸
WBP327-BMK4.uIgG4	131.4	1.3	113.6	11.8	6 (131.4pM / 21.49pM)	5 (113.6pM / 21.49pM)
W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP	13.5	0.9	11.4	7.7	26 (13.5pM / 0.52pM)	22 (11.4pM / 0.52pM)

5. 혈청 안정성 시험

항체를 새로 수집된 인간 혈청과 부드럽게 혼합하고 혼합 샘플에서 혈청 비율의 95% 이상을 확보했다. 혼합된 샘플 분취량을 37℃에서 0 내지 14일 동안 배양하였다. 도 7과 같이 각 시점에서 시료를 액체질소에서 급속 냉동하여 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 라지 또는 주르캇 세포에 대한 각 샘플의 바인딩은 FACS에 의해 분석되었다.

도 7에 도시된 바와 같이, 주르캇 (도 7a) 및 라지 (도 7b) 세포 둘 모두에 대한 인간 혈청 처리된 W3278 Ab의 결합은 신선하게 해동된 Ab (0일)의 결합과 유사하였다. 이러한 결과는 W3278 Ab가 적어도 14일 동안 인간 혈청에서 안정함을 시사하였다 (도 7).

6. DSF 분석 및 열안정성 시험

실시간 형광 정량적 PCR (QuantStudio 7 Flex, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 DSF 분석을 수행했다. 간단히 말해서, 19 μL의 항체 용액을 1 μL의 62.5 X 시프로 오렌지 용액 (Invitrogen)과 혼합하고 96 웰 플레이트 (Biosystems)에 첨가했다. 플레이트를 2 ℃/분의 속도로 26 ℃에서 95 ℃로 가열하고 생성된 형광 데이터를 수집했다. 상이한 온도에 대한 형광 변화의 음의 도함수를 계산하고, 최대값을 용융 온도 T_h로 정의하였다. 단백질에 다중 전개 전이가 있는 경우, 처음 두 개의 T_h가 보고되었으며 T_m1 및 T_m2로 명명되었다. T_m1은 항상 다른 단백질 간의 비교를 용이하게 하기 위해 형식적 용융 온도 T_m으로 해석된다. 데이터 수집 및 T_h 계산은 운영 소프트웨어 (QuantStudio Real-Time PCR PCR 소프트웨어 v1.3)에 의해 자동으로 수행되었다. 다른 버퍼에서 W3278 Ab의 T_m1 및 T_m2 값은 표 18에 나와 있다. W3278의 T_m은 약 61 ℃로 W3278 Ab의 우수한 열 안정성을 나타낸다.

DSF 시험에 의한 열안정성 (T _m 값은 표에서 T _m1 로 표시)

단백질 이름	pI	버퍼	Tm1 (℃)	Tm2 (℃)
W3278-U2T3.F18R-1.uIgG4.SP	7.42	PBS	61.1	72.6
		20mM 히스티딘 +7% 수크로스 pH 6.5	60.3	73.6
		50 mM NaAC +7% 수크로스 pH 5.6	61.0	74.2

실시예 4

생체 내 항암 효능

항체 생체내 항종양 효능을 NOG 마우스에서 라지 종양을 보유하는 혼합 PBMC 인간화 모델에서 시험하였다. 6 내지 8주령의 암컷 NOG 마우스 (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., LTD)가 연구에 사용되었다. 라지 종양 세포 (ATCC® CCL-86™)는 공기 중 5% CO₂, 37℃ 환경에서 10% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 1640 배지에서 단층 배양으로 시험관 내에서 유지되었다. 종양 세포를 일상적으로 매주 2회 계대 배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다. 제조업체의 지침에 따라 피콜-파케 플러스 (Ficoll-Paque Plus)를 사용하여 단일 건강한 기증자의 헤파린 전혈에서 인간 PBMC를 분리했다.

치료 모델의 경우, 각각의 마우스에 미리 혼합된 라지 종양 세포 (2.0 x 10⁶) 및 PBMC (3.0 x 10⁶)를 오른쪽 상부 옆구리에 피하로 공동 접종하였다. 평균 종양 부피가 대략 60 mm³에 도달했을 때, 동물을 그룹화하기 위해 무작위화하고 첫 번째 항체 주사를 맞았다. 효능 연구를 위해 마우스에 지시된 양의 항체를 3주 동안 매주 2회 정맥내 처리했다. 연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 지침에 따라 WuXi AppTec의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인한 지침에 따라 수행되었다. 모든 종양 연구에서 마우스의 무게를 측정하고 캘리퍼스 (calipers)를 사용하여 일주일에 두 번 종양 성장을 측정했다. 종양 부피는 ½ (길이 × 너비²)로 추정되었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, W3278 리드 Ab 치료는 BMK4에 비해 더 강력한 용량 의존적 항종양 활성을 나타낸다 (도 8a). 마우스 체중은 실험 동안 정상이었다(도 8b).

실시예 5

천연 사이노몰구스 원숭이를 대상으로 한 WBP3278 BSAB의 단일 용량 연구

WBP3278 이중특이적 항체를 사용한 치료가 영장류에서 순환하는 B 세포를 고갈시킬 수 있는지, 그리고 그것이 임의의 예상치 못한 독성을 초래하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 사이노몰구스 원숭이 (Macaca Fascicularis)에서 탐색적 비-GLP 약리학 연구를 수행했다. Guangdong Zhao Qing Chuang Yao Biotechnology Co., Ltd.에서 4마리의 천연 수컷 사이노몰구스 원숭이 (3~4세, 무게 약 4kg)를 공급받았다. 연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 지침에 따라 PharmaLegacy Laboratories의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인한 지침에 따라 수행되었다.

2개의 그룹 (2마리의 동물/그룹)의 4마리의 동물에게 1 mg/kg (그룹 1) 및 10 mg/kg (그룹 2)을 천천히 iv로 1회 각각 60초 이내에 주입했다. 말초 혈액에서 순환하는 B 및 T 세포의 수준은 B 림프구 (CD45+ /CD20+); T 림프구 (CD45+/CD3+); CD4+ T 림프구 (CD4+/CD45+/CD3+) 및 CD8+ T 림프구 (CD8+/CD45+/CD3+)에 대한 FACS에 의해 4주 동안 모니터링되었다. 순환하는 염증성 사이토카인의 수준은 BD™Cytometric Bead Array(CBA) 비인간 영장류 Th1/Th2 사이토카인 키트(BD Bioscience, Cat: 557800)를 사용하여 분석되었다. WBP3278 리드 Ab로 치료하면 순환 B 세포가 즉각적이고 완전히 고갈되어 최소 4주 동안 지속되었다 (도 9). 순환 T 세포의 수준은 또한 WBP3278 리드 Ab 치료 후 처음에 감소되었고, 72시간 후에 기준선 또는 약간 더 높은 수준으로 되돌아갔고 적어도 4주 동안 지속되었다 (도 10a). CD8+ T 세포 (도 10b)의 수준이 증가하였고 CD4+ T 세포 (도 10c)의 수준은 72시간 후에 정상 수준으로 복귀되었고 적어도 4주 동안 지속되었다. WBP3278 리드 Ab로 처리한 후 순환하는 사이토카인 수준의 급격한 상승이 관찰되었으며 모든 사이토카인은 24시간 후에 정상 수준으로 돌아갔다 (도 11).

혈청 내 WBP3278 리드 Ab의 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트를 항-인간 IgG (SouthernBiotech, #2049-01)로 코팅한 다음, 혈청 샘플의 연속 희석액을 첨가했다. 결합 신호는 염소 항-인간 IgG-비오틴 (SouthernBiotech, #2049-08) 및 스트렙타비딘-HRP (Life, #SNN1004)로 검출되었다. 흡광도는 멀티웰 플레이트 판독기 (SpectraMax®M5e)로 (450 내지 540) nm에서 측정되었다. 원숭이에서 WBP3278 리드 Ab의 혈청 농도는 피닉스 WinNonlin 소프트웨어 (버전 8.1, Pharsight, Mountain View, CA)를 사용하여 비구획 약동학 분석을 받았다. 선형/로그 사다리꼴 규칙 (linear/log trapezoidal rule)은 PK 매개변수를 얻기 위해 적용되었다. 개별 BLQ는 평균 농도 계산에서 제외되었다. 공칭 용량 수준 (nominal dose level)과 명목 샘플링 시간 (nominal sampling time)은 모든 약동학적 매개변수의 계산에 사용되었다. PK 매개변수에 대한 요약은 표 19 및 도 12에 도시되어 있다. 결론적으로, C_O의 전신 노출 (systemic exposure)은 19.9μg/mL에서 282μg/mL (약 14배)로 증가했고, AUC_0-last는 용량이 1 mg/kg에서 10 mg/kg으로 증가함에 따라 259μg.h/mL에서 5788μg.h/mL (약 22배)로 증가했다. WBP3278 리드 Ab의 혈청 반감기(T_1/2)는 1 및 10 mg/kg에서 각각 약 43.3시간 및 89.8시간이었다.

WBP3278 리드 Ab의 PK 매개변수 요약

PK 매개변수	1mg/kg (평균)	10mg/kg (평균)
C0 (μg/mL)	19.9	282
T1/2 (h)	43.3	89.8
AUC0-last (μg.h/mL)	259	5788

더욱이, 실험 동안 케이지-사이드 관찰 (cage-side observation)은 고용량 및 저용량 수준 둘 다에서 WBP3278 리드 Ab에 대한 예상치 못한 독성을 나타내지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).

이 실험의 결과는 WBP3278 리드 Ab가 사이토카인 폭풍 (cytokine storm) 등과 같은 부작용 없이 생체 내에서 B 세포를 효과적으로 고갈시킬 수 있고, 사이노몰구스 원숭이에서 충분한 혈청 반감기(T_1/2)를 가짐을 입증했다. 이러한 실험 결과는 WBP3278 리드 Ab의 전임상 개발을 진행하는 데 대한 지지를 제공했다.

당업자는 본 발명이 그 정신 또는 중심 속성을 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 본 발명의 전술한 설명은 단지 예시적인 실시예를 개시한다는 점에서, 다른 변형이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 여기에서 상세히 설명된 특정 실시예에 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 내용을 나타내는 첨부된 청구범위를 참조해야 한다.

<110> WUXI BIOLOGICS IRELAND LIMITED <120> NOVEL BISPECIFIC CD3/CD20 POLYPEPTIDE COMPLEXES <130> PI210022CN <150> PCT/CN2019/073418 <151> 2019-01-28 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 1 Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 2 Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 3 Asp Ser Val Ser Ile Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 6 Thr Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT 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tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300 cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaag 336 <210> 111 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 111 gaggtgcaat tggtggagag cggaggaggg ctcgtgcagc ctggaagatc tcttaggctg 60 agttgcgctg catctgggtt cacattcaac gactacgcca tgcactgggt gaggcaggct 120 cccggcaaag ggctggaatg ggtgtcaact atctcctgga actccggcag catcggctac 180 gccgatagcg tcaagggccg gtttacaatt tcccgcgata acgccaagaa gtccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat actgccctct actactgtgc caaggacatt 300 cagtacggga attactatta cgggatggac gtctggggcc aggggaccac cgtgacagtc 360 agctcc 366 <210> 112 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK <400> 112 gaaatcgtgc tgacccagtc cccagcaacc ctctcccttt ctcctggaga gagagctacc 60 ctcagctgta gggcctcaca gtctgtctcc agttacctgg cttggtacca gcagaaaccc 120 gggcaggccc ctaggttgct gatctacgac gccagcaata gggccactgg catcccagcc 180 cggttttccg gaagcggcag cgggacagat ttcacactca ctattagcag cctggagccc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag cggtccaact ggcccattac atttggccaa 300 gggacacgcc tggagattaa g 321 <210> 113 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 113 caggtccagc tgcagcagcc cggagccgaa ctggtcaaac ccggggctag cgtgaaaatg 60 tcttgcaaag caagtggtta cacattcact tcctataaca tgcactgggt gaagcagaca 120 cctgggcgag gtctggaatg gatcggcgcc atctacccag gcaacggaga cactagctat 180 aatcagaagt ttaaaggaaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcttac 240 atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagcagtgt actattgcgc ccgttctacc 300 tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggcgccg gtaccacagt caccgtgtcc 360 gcc 363 <210> 114 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK <400> 114 cagattgtcc tgagccagag ccctgccatc ctgtctgcta gtcccggcga gaaggtgacc 60 atgacatgca gggcatccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggg 120 agttcaccta aaccatggat ctacgctaca tccaacctgg caagcggtgt gcctgtcagg 180 ttttcaggtt ccggcagcgg aacatcttac agtctgacta tttctcgggt ggaggccgaa 240 gacgccgcta cctactattg ccagcagtgg acctccaatc cccctacatt cggcggaggg 300 actaagctgg agatcaaa 318 <210> 115 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 115 caggtccagc tgcagcagcc cggagccgaa ctggtcaaac ccggggctag cgtgaaaatg 60 tcttgcaaag caagtggtta cacattcact tcctataaca tgcactgggt gaagcagaca 120 cctgggcgag gtctggaatg gatcggcgcc atctacccag gcaacggaga cactagctat 180 aatcagaagt ttaaaggaaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcttac 240 atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagcagtgt actattgcgc ccgttctacc 300 tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggcgccg gtaccacagt caccgtgtcc 360 gcc 363 <210> 116 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK <400> 116 cagattgtcc tgagccagag ccctgccatc ctgtctgcta gtcccggcga gaaggtgacc 60 atgacatgca gggcatccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggg 120 agttcaccta aaccatggat ctacgctaca tccaacctgg caagcggtgt gcctgtcagg 180 ttttcaggtt ccggcagcgg aacatcttac agtctgacta tttctcgggt ggaggccgaa 240 gacgccgcta cctactattg ccagcagtgg acctccaatc cccctacatt cggcggaggg 300 actaagctgg agatcaaa 318 <210> 117 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 117 gaggtgcaat tggtggagag cggaggaggg ctcgtgcagc ctggaagatc tcttaggctg 60 agttgcgctg catctgggtt cacattcaac gactacgcca tgcactgggt gaggcaggct 120 cccggcaaag ggctggaatg ggtgtcaact atctcctgga actccggcag catcggctac 180 gccgatagcg tcaagggccg gtttacaatt tcccgcgata acgccaagaa gtccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat actgccctct actactgtgc caaggacatt 300 cagtacggga attactatta cgggatggac gtctggggcc aggggaccac cgtgacagtc 360 agctcc 366 <210> 118 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK <400> 118 gaaatcgtgc tgacccagtc cccagcaacc ctctcccttt ctcctggaga gagagctacc 60 ctcagctgta gggcctcaca gtctgtctcc agttacctgg cttggtacca gcagaaaccc 120 gggcaggccc ctaggttgct gatctacgac gccagcaata gggccactgg catcccagcc 180 cggttttccg gaagcggcag cgggacagat ttcacactca ctattagcag cctggagccc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag cggtccaact ggcccattac atttggccaa 300 gggacacgcc tggagattaa g 321 <210> 119 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 119 caggtccagc tgcagcagcc cggagccgaa ctggtcaaac ccggggctag cgtgaaaatg 60 tcttgcaaag caagtggtta cacattcact tcctataaca tgcactgggt gaagcagaca 120 cctgggcgag gtctggaatg gatcggcgcc atctacccag gcaacggaga cactagctat 180 aatcagaagt ttaaaggaaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcttac 240 atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagcagtgt actattgcgc ccgttctacc 300 tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggcgccg gtaccacagt caccgtgtcc 360 gcc 363 <210> 120 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK <400> 120 cagattgtcc tgagccagag ccctgccatc ctgtctgcta gtcccggcga gaaggtgacc 60 atgacatgca gggcatccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggg 120 agttcaccta aaccatggat ctacgctaca tccaacctgg caagcggtgt gcctgtcagg 180 ttttcaggtt ccggcagcgg aacatcttac agtctgacta tttctcgggt ggaggccgaa 240 gacgccgcta cctactattg ccagcagtgg acctccaatc cccctacatt cggcggaggg 300 actaagctgg agatcaaa 318 <210> 121 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered TCRBeta <400> 121 Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu 1 5 10 15 Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys 20 25 30 Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val 35 40 45 Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu 50 55 60 Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg 65 70 75 80 Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg 85 90 95 Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln 100 105 110 Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 115 120 125 <210> 122 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered TCRAlpha <400> 122 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 85 90 95

Claims

제2 항원-바인딩 모이어티와 연관된 제1 항원-바인딩 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기:
다음을 포함하는 제1 항원-바인딩 모이어티:
제1 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역(C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인(VH)을 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
제2 TCR 불변 영역(C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인(VL)을 N-말단에서 C-말단까지 포함하는 제2 폴리펩티드,
상기:
C1 및 C2는 C1 및 C2 사이에 적어도 하나의 비-천연 사슬간 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 사슬간 결합은 이량체를 안정화할 수 있고
및
다음을 포함하는 제2 항원-바인딩 모이어티:
항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 중쇄 가변 도메인(VH2), 및
항체 경쇄 불변(CL) 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 경쇄 가변 도메인(VL2),
상기:
제1 및 제2 항원-바인딩 모이어티 중 하나는 항-CD3 바인딩 모이어티이고, 다른 하나는 항-CD20 바인딩 모이어티이고,
항-CD3 바인딩 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래된다:
a) 서열번호 1, 13, 25, 37 및 49로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
b) 서열번호 2, 14, 26, 38 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
c) 서열번호 3, 15, 27, 39 및 51로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
d) 서열번호 4, 16, 28, 40 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR1,
e) 서열번호 5, 17, 29, 41 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR2, 및
f) 서열번호 6, 18, 30, 42 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR3,
항-CD20 바인딩 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD20 항체로부터 유래된다:
a) 서열번호 7, 19, 31, 43 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
b) 서열번호 8, 20, 32, 44 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
c) 서열번호 9, 21, 33, 45 및 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
d) 서열번호 10, 22, 34, 46 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR1,
e) 서열번호 11, 23, 35, 47 및 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR2, 및
f) 서열번호 12, 24, 36, 48 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 CDR3.
제1항에 있어서, 상기 항-CD3 바인딩 모이어티는 서열번호 61, 63, 65, 67 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 62, 64, 66, 68 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD20 바인딩 모이어티는 서열번호 71, 73,75, 77 및 79를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 72, 74, 76, 78 및 80을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-바인딩 모이어티는 제1 이량체화 도메인에 연결되고, 제2 항원-바인딩 모이어티는 제2 이량체화 도메인에 연결되고, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 연관된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제4항에 있어서, 상기 연관은 커넥터, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기 상호작용, 염 다리, 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통해 이루어지는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제5항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제6항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제6항에 있어서, 상기 제1 이량체화 도메인은 제3 접합 도메인에서 제1 TCR 불변 영역(C1)에 작동 가능하게 연결된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제6항에 있어서, 상기 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-바인딩 모이어티의 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하고 동종이량체화를 억제 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연관되는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제10항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀, 소수성 상호작용, 정전기 상호작용, 친수성 상호작용 또는 증가된 유연성을 통해 이종이량체로 연관될 수 있는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 및 서열번호 84.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 및 서열번호 88.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 및 서열번호 92.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 및 서열번호 96.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 및 서열번호 100.
제14항에 있어서, 상기 서열번호 92의 폴리펩티드 서열에서 위치 182, 193, 203, 206 및 207의 하나 이상의 아미노산은 Ser 및 Thr 이외의 어느 아미노산으로 변형되어 글리코실화 부위가 제거되고, 바람직하게는, 서열번호 92의 폴리펩티드 서열에서 위치 193의 아미노산이 변형된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
제17항에 있어서, 상기 서열번호 92의 폴리펩티드 서열에서 위치 193의 아미노산이 Ala, Gly, Pro 또는 Val로 변형된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
모이어티에 접합된, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 접합체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제20항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 벡터.
제20항의 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 제21항의 분리된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제22항의 숙주 세포를 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하는 방법.
다음을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 생산 방법:
a) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및
b) 숙주 세포가 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하도록 허용하는 단계.
제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 CD20-관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 암인 것인, 방법.
제29항에 있어서, 상기 암은 림프종, 폐암, 간암, 자궁경부암, 결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 교모세포종, 전립선암, 식도암 또는 위암인 것인, 방법.
제28항에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 B 세포 림프종, 선택적으로 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 비-호지킨 림프종이 다음을 포함하는 것인, 방법: 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 소포성 림프종, 변연부 B-세포 림프종(MZL), 점막-연관 림프 조직 림프종(MALT), 소 림프구 림프종(만성 림프구 백혈병, CLL), 또는 외투 세포 림프종(MCL), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM).
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트.
제32항에 있어서, 상기 키트는 CD20-관련 질환 또는 상태의 검출, 진단, 예후, 또는 치료에 사용되는 것인, 키트.