CN106279404A - 一种可溶且稳定的异质二聚tcr - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在其α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键的异质二聚TCR，本发明的TCR可溶且稳定，能够被很好地复性、重折叠、纯化同时能够与其原配体特异性结合，而且本发明的T细胞受体具有较高的Tm值。本发明还公开了所述TCR的制备方法及用途。

Description

一种可溶且稳定的异质二聚TCR
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种可溶性T细胞受体及其制法、和应用。
背景技术
仅仅有两种类型的分子能够以特异性的方式识别抗原。其中一种是免疫球蛋白或抗体；另一种是T细胞受体(TCR)，它是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”，即TCRα链可变域(Vα)和TCRα链恒定域(Cα)，TCRβ链可变域(Vβ)和TCRβ链恒定域(Cβ)。
TCR是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，这种外源肽或内源肽可能会是细胞出现异常的唯一迹象。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因此，TCR对免疫系统的细胞免疫功能是至关重要的。
如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样，TCR也可以被开发应用于诊断和治疗。可溶性TCR有很广泛的用途，它不仅可用于研究TCR-pMHC的相互作用，也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地，可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞，或者用来抑制T细胞(如那些与自身免疫性肽抗原进行反应的T细胞)。另外，可溶性TCR还可与其他分子(如，抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的细胞,起到杀伤作用。
天然存在的TCR是一种膜蛋白，通过其跨膜区得以稳定，对于获得可溶性TCR蛋白而言，当TCR与膜分离开时，获得保持与其原配体(即pMHC)结合能力的可溶且稳定的TCR是一件非常困难的事情(Shin,et al.,(1993)science259:1901)。其不稳定性和蛋白产量低成为用TCR或其片段来开发治疗剂或诊断试剂的主要障碍。有些文献描述了截短形式的TCR，它仅仅包含胞外区或者仅仅包含胞外和胞质区，尽管这样的TCR可以被TCR特异性的抗体识别，但是产率很低，并且低浓度时不能识别主组织相容性复合体-肽复合物，说明其很容易变性，不够稳定。本领域技术人员致力于开发出可溶的、稳定性T细胞受体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溶且稳定的异质二聚TCR及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种αβ异质二聚TCR，所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。
在另一优选例中，所述TCR的人工链间二硫键位于α链可变区的FR2及β链的恒定区之间。
在另一优选例中，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了位于TRAV的第46位或第47位氨基酸残基。
在另一优选例中，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位或第61位氨基酸残基。
在另一优选例中，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。
在另一优选例中，所述TCR是可溶的。
在另一优选例中，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
在另一优选例中，β链恒定域中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基被替换为另一氨基酸，优选地，被替换为丙氨酸或丝氨酸。
在另一优选例中，在所述TCRβ链恒定域的C末端截短以去除形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。
在另一优选例中，所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域。
在另一优选例中，所述TCRα与β链恒定域之间不存在天然链间二硫键。
在另一优选例中，在所述TCRα链和/或β链恒定区的C末端截短以去除形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。
在另一优选例中，所述TCRα链和/或β链恒定区中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基被替换为另一残基。
在另一优选例中，所述TCR的α链恒定区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。
在另一优选例中，在TCRα链恒定区与β链恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：
TRAC*01外显子1的48T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的57S；
TRAC*01外显子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的77S；
TRAC*01外显子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的17S；
TRAC*01外显子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的59D；
TRAC*01外显子1的15S和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的15E；
TRAC*01外显子1的53R和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的54S；
TRAC*01外显子1的89P和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的19A；或
TRAC*01外显子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的20E。
在另一优选例中，所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。
在另一优选例中，与所述TCR结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或其组合。
在另一优选例中，与所述TCR结合的治疗剂为连接于所述TCR的α或β链的C-或N-末端的抗-CD3抗体。
在另一优选例中，所述TCR的Tm值≥45℃，优选地≥50℃，更优选地≥52℃，最优选的≥55℃。
本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的TCR的α链和/或β链的核酸序列或其互补序列。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞或遗传改造的工程细胞，所述的细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明的第五方面，提供了一种分离的细胞，其表达本发明第一方面所述的TCR。
本发明的第六方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的T细胞受体的方法，包括步骤：
(i)培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的T细胞受体的α链和/或β链；
(ii)分离或纯化出所述的α链和/或β链；
(iii)重折叠所述的α链和/或β链，获得所述T细胞受体。
本发明的第七方面，提供了一种T细胞受体复合物，所述的复合物含有一个或多个本发明第一方面所述的TCR。
本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的TCR的用途，用于制备治疗肿瘤、病毒感染或自身免疫疾病的药物或用于制备检测MHC-肽复合体的试剂。
本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体以及安全有效量的本发明第一方面所述的TCR、本发明第五方面所述的细胞或本发明第七方面所述的T细胞受体复合物。
本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用本发明第一方面所述的TCR、本发明第五方面所述的细胞、本发明第七方面所述的T细胞受体复合物或本发明第九方面所述的药物组合物；
较佳地，所述的疾病包括：肿瘤、自身免疫疾病和病毒感染性疾病。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1a和图1b分别是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域1G4TCR分子的α链可变域氨基酸序列及β链氨基酸序列。
图2a和图2b分别是图1a和图1b中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图3为图1a和图1b中所示TCRα链可变域与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图4为图1a和图1b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图5为图1a和图1b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图6为图1a和图1b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的1G4TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图7a和图7b分别是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域JM22TCR分子的α链可变域氨基酸序列及β链氨基酸序列。
图8a和图8b分别是图7a和图7b中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图9为图7a和图7b中所示TCRα链可变域与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图10为图7a和图7b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图11为图7a和图7b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图12为图7a和图7b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的JM22TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图13a和图13b分别是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域LC13TCR分子的α链可变域氨基酸序列及β链氨基酸序列。
图14a和图14b分别是图13a和图13b中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图15为图13a和图13b中所示TCRα链可变域与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图16为图13a和图13b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图17为图13a和图13b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图18为图13a和图13b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的LC13TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图19是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域1G4分子的α链氨基酸序列。
图20是图19中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图21为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域1G4TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图22为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域1G4TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图23为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域1G4TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图24为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的1G4TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图25是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域JM22分子的α链氨基酸序列。
图26是图25中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图27为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域JM22TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图28为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域JM22TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图29为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域JM22TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图30为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的JM22TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图31是在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域LC13分子的α链氨基酸序列。
图32是图31中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图33为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域LC13TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图34为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域LC13TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图35a和图35b分别为IMGT中列出的TRBC1*01和TRBC2*01的氨基酸序列。
图36为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的LC13TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图37a和图37b分别是在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的三结构域1G4TCR分子的α链可变域氨基酸序列及β链氨基酸序列。
图38a和图38b分别是图37a和图37b中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图39为图37a和图37b中所示TCRα链可变域与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图40为图37a和图37b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图41为图37a和图37b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图42为图37a和图37b中所示TCRα链可变域与β链经重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图43是在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域1G4TCR分子的α链氨基酸序列。
图44是图43中氨基酸所对应的核苷酸序列。
图45为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图46为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图47为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图48为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图49为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图50为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图51为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图52为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图53为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图54为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图55为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图56为在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图57为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图58为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图59为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图60为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图61为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠后经凝胶过滤层析柱的洗脱曲线。
图62为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后的SEC图谱。
图63为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后测得的DSC热谱图。
图64为在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCRα链与β链重折叠及蛋白纯化后所得不同浓度的TCR分子与其相应抗原的结合曲线。
图65为在1G4TCR分子α链可变区与β链恒定区之间不同位置含有人工链间二硫键的三结构域可溶蛋白的胶图。
图66为在不同TCR分子α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键的三结构域可溶蛋白的胶图。
图67为在1G4TCR分子α链可变区与β链恒定区之间不同位置含有人工链间二硫键的四结构域可溶蛋白的胶图。
图68为在不同TCR分子α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键的四结构域可溶蛋白的胶图。
图69为本发明三结构域TCR的结构示意图。
图70为本发明四结构域TCR的结构示意图。
具体实施方式
本发明通过广泛而深入的研究，意外地获得了一种可溶且稳定的T细胞受体。具体地，本发明TCR为αβ异质二聚体，并且本发明TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有共价的人工链间二硫键。更具体地，本发明TCR的人工链间二硫键位于α链的FR2及β链的恒定区之间。本发明还提供了所述TCR的用途，及其制备方法。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
术语
T细胞受体
天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异质二聚TCR的两个亚单位。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”，即TCRα链可变域(Vα)和TCRα链恒定域(Cα)，TCRβ链可变域(Vβ)和TCRβ链恒定域(Cβ)。在天然TCR的近膜区Cα与Cβ链间存在一组二硫键，本发明中称为“天然链间二硫键”。在本发明中，将人工引入的，位置与天然链间二硫键的位置不同的链间共价二硫键称为“人工链间二硫键”。在本发明中，术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用，都指在α链可变区与β链恒定区之间含有本发明人工链间二硫键的异质二聚TCR。
广义上讲，TCRα和β链各包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成，恒定域还包含跨膜区和胞质区，胞质区很短。
本发明TCR的命名方式采用国际免疫遗传学信息系统(IMGT)中对TCR的命名方式。即，在该系统中，“TRAC*01”表示TCR的α链恒定区，其中“TR”表示T细胞受体基因，“A”表示α链基因，C表示恒定区，“01”表示等位基因1。同样地，“TRBC1*01”或“TRBC2*01”表示β链恒定结构域。在β链中存在两个可能的恒定区基因“C1”和“C2”。
本领域的技术人员广为知晓并可得到IMGT中给出的TRAC*01与TRBC1*01或TRBC2*01的序列，例如可在IMGT的公开数据库中找到(http://www.imgt.org/)。
“TRAV”表示TCR的α链可变区，其中“TR”表示T细胞受体基因，“A”表示α链基因，V表示可变区。同样地，“TRBV”表示TCR的β链可变区。各可变区包含3个骨架结构(framework regions，FR)以及嵌合在骨架结构中的3个CDR(complementary determining region，互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区，尤其是CDR3决定了TCR的多样性以及TCR与pMHC复合物的结合。3个骨架结构分别为FR1，其在IMGT中的位置编号为1-26；FR2，其在IMGT中的位置编号为39-55；FR3，其在IMGT中的位置编号为66-104。不同TCR分子的骨架结构是十分相似的(K.Christopher Garcia,et al.,Annu.Rev.Immunol.1999.17:369-397)，本领域的技术人员广为知晓并可得到IMGT中给出的TCR可变区骨架结构及其在IMGT中的位置编号，例如可在IMGT的公开数据库中找到(http://www.imgt.org/)。
为方便描述，本发明中TRAC*01与TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置编号按从N端到C端依次的顺序进行位置编号，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按从N端到C端依次的顺序第60个氨基酸为P(脯氨酸)，则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的60P，也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按从N端到C端依次的顺序第61个氨基酸为Q(谷氨酰胺)，则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61Q，也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸，其他以此类推。TRBC1*01和TRBC2*01从N端到C端的氨基酸序列分别如图35a和35b所示。本发明中，可变区TRAV与TRBV的氨基酸序列的位置编号，按照IMGT中列出的位置编号。如TRAV中的某个氨基酸，IMGT中列出的位置编号为46，则本发明中将其描述为TRAV第46位氨基酸，其他以此类推。综上，本发明中提及的TRAV中氨基酸的位置是按照IMGT中列出的氨基酸序列的位置编号，TRBC1*01或TRBC2*01中氨基酸的位置则是按其从N端到C端依次的顺序进行的位置编号。应注意，IMGT中列出的氨基酸序列的位置编号与将氨基酸的序列按从N端到C端依次的顺序进行的位置编号并不完全相同。
TCR的α链具有唯一的恒定区TRAC*01，β链的两种恒定区仅有微小差别，TRBC1*01在其外显子1中具有4N、5K和37F，而TRBC2*01在其外显子1中具有4K、5N和37Y。因此，TCR分子β链的恒定区为TRBC1*01或为TRBC2*01基本没有区别。本发明实施例中选用的β链的恒定区为TRBC2*01。
稳定性
术语“稳定性”指蛋白质稳定性的任何方面。包括复性能力、表达能力、蛋白复性收率、热稳定性、抗聚集及抗解折叠等方面；更佳地，是指蛋白复性收率及热稳定性方面。
三结构域TCR
术语“三结构域TCR”指所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，α链可变域与β链形成异质二聚体，人工链间二硫键连接所述TCR的α链可变区与β链恒定区。本发明三结构域TCR的结构示意图如图69所示。应注意，该示意图仅用于说明本发明，并不能限制本发明的范围。
四结构域TCR
术语“四结构域TCR”指所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域，α链与β链形成异质二聚体，人工链间二硫键连接所述TCR的α链可变区与β链恒定区。本发明四结构域TCR的结构示意图如图70所示。应注意，该示意图仅用于说明本发明，并不能限制本发明的范围。
发明详述
本发明通过在TCR的α链可变区与β链恒定区之间引入共价人工链间二硫键，获得了一种可溶且稳定的异质二聚T细胞受体。具体地，本发明TCR的人工链间二硫键位于α链可变区(TRAV)的FR2及β链的恒定区之间。更具体地，形成人工链间二硫键的位点可在TRAV的第46位或第47位氨基酸残基与β链恒定区适宜的位点之间。同样地，形成人工链间二硫键的位点也可在TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位或第61位氨基酸残基与α链可变区适宜的位点之间。
在本发明的优选例中，形成本发明TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。
优选地，TRAV的第46位氨基酸可以是D、A、P、T、S、C、L、H、Y或K；TRAV的第47位氨基酸可以是G、N、S、R、W、A或K。
在本发明的一个较佳实施方式中，本发明的TCR为三结构域TCR，即所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，α链可变域与β链形成异质二聚体，人工链间二硫键连接所述TCR的α链可变区与β链恒定区。
优选地，本发明的三结构域TCR的β链包含除跨膜结构域以外的全部恒定结构域(即包含胞外和胞质结构域)。在这种情况下，β链中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基优选突变为不参与二硫键形成的其他氨基酸残基，优选地，丙氨酸或丝氨酸。
更优选地，本发明的三结构域TCR的β链包含除跨膜结构域以外的部分恒定结构域，在这种情况下，β链中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基优选突变为不参与二硫键形成的其他氨基酸残基，优选地，丙氨酸或丝氨酸。或者，也可以在所述TCRβ链恒定域的C末端截短以去除形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。优选地，可在距形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸处截短，以去掉形成天然链间二硫键的半胱氨酸。
在本发明的另一较佳实施方式中，本发明的TCR为四结构域TCR，即所述TCR包含(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域，α链与β链形成异质二聚体，人工链间二硫键连接所述TCR的α链可变区与β链恒定区。
优选地，本发明的四结构域TCR中不包含天然链间二硫键。一方面，本发明的四结构域TCR的α和/或β链可以包含除跨膜结构域以外的全部恒定结构域(即包含胞外和胞质结构域)。在这种情况下，各链中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基优选突变为不参与二硫键形成的其他氨基酸残基，优选地，丙氨酸或丝氨酸。另一方面，本发明的四结构域TCR的α和/或β链可以包含除跨膜结构域以外的部分恒定结构域，在这种情况下，各链中形成天然TCR链间二硫键的半胱氨酸残基优选突变为不参与二硫键形成的其他氨基酸残基，优选地，丙氨酸或丝氨酸。更优选地，在所述TCRα和/或β链恒定域的C末端截短以去除形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。优选地，可在距形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸处截短，以去掉形成天然链间二硫键的半胱氨酸。但应当指出，本发明的TCR中也可包含天然的链间二硫键。
本发明的四结构域TCR的α和β链恒定域间也可以包含人工链间二硫键，形成上述人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：
TRAC*01外显子1的48T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的57S；
TRAC*01外显子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的77S；
TRAC*01外显子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的17S；
TRAC*01外显子1的45T和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的59D；
TRAC*01外显子1的15S和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的15E；
TRAC*01外显子1的53R和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的54S；
TRAC*01外显子1的89P和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的19A；或
TRAC*01外显子1的10Y和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的20E。
应注意，在某些情况下，仅一条TCR链具有形成天然链间二硫键的半胱氨酸，该半胱氨酸用于连接具有本发明人工链间二硫键的TCR分子与另外的分子。在TCR的β链中含有一个游离的未配对半胱氨酸残基，在本发明中优选将该半胱氨酸突变为另一氨基酸，如突变为丝氨酸或丙氨酸。
应理解，TCR的恒定结构域并不直接参与TCR与pMHC的结合，在恒定域的C末端截短一定数量的氨基酸残基基本不会对TCR的功能产生影响，因此本发明TCR的各条链还可以更短。可通过任何合适的方法测定本发明TCR与其相应抗原的结合亲和力(与解离平衡常数KD成反比)。在本发明的优选例中，TCR与其相应pMHC的结合通过forteBIO Oke进行测定，如在本发明实施例4中所述。
可在本发明TCR链中引入适量的突变而不影响其功能性。突变形式包括(但不限于)：1-6个(通常为1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。
在TCR的α链可变区与β链恒定区之间引入人工链间二硫键可以获得可溶且稳定的本发明T细胞受体。进一步，本发明还鉴定出了α链可变区与β链恒定区中能够突变为半胱氨酸以形成人工链间二硫键的合适位点。本发明的TCR不仅包含人类的TCR，本领域技术人员可根据本发明提供的信息，获得其他物种的可溶且稳定的TCR。
虽然其他物种的TCR的α链可变区和/或β链恒定区可能与人类TCR链的相应部分不具有100％相同性，但本领域技术人员能够鉴定出相应TCR的等同部分而得到待突变的半胱氨酸残基。比如，可利用欧洲生物信息学学院网站获得的ClustalW来将其他物种的TCR链与人类TCR链的相应部分进行比对，来得到相应的位点。
本发明包含人工链间二硫键连接的人类的可溶且稳定的αβ异质二聚TCR，以及其他哺乳动物的人工链间二硫键连接的αβTCR，所述哺乳动物包括但不限于山羊、绵羊、猪、小鼠和大鼠。
应理解，本文中氨基酸名称用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
本发明还包括本发明多肽的活性片段、衍生物和类似物。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明TCR与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指具有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
发明还提供本发明TCR的类似物。这些类似物与本发明原TCR多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
本发明的多肽可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个与另一分子相连的T细胞受体分子。
本发明还涉及编码本发明TCR的多核苷酸。本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
编码序列
本发明还涉及编码本发明TCR的多核苷酸，包括编码本发明所述的T细胞受体的α链和/或β链的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、14、16、18、21、22、24所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、15、17、19、20、23所示氨基酸序列的蛋白质，但与上述相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
制备方法
形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基的引入可采用任何合适的方法，包括但不限于依据聚合酶链式反应(PCR)的那些、依据限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(LIC)方法。许多标准分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(PCR)诱变和依据限制性酶的克隆的更多细节可参见Sambrook和Russell,(2001)分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可见(Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6)。
本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：
(1)用编码本发明TCR多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化出本发明TCR多肽。
优选地，可通过在细菌如大肠杆菌中以包涵体形式表达并进行体外重折叠来获得本发明的可溶且稳定的TCR。
药物组合物和施用方法
本发明的TCR和本发明TCR转染的T细胞可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的TCR、多价TCR复合物和细胞通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。
本发明的TCR可以单独使用，也可与偶联物结合，优选地以共价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒素(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(CancerImmunology and Immunotherapy)51，565)；3.细胞因子(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(CancerImmunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(CancerResearch)63，3202)；4.抗体Fc片段(Mosquera等，2005，免疫学杂志(The JournalOf Immunology)174，4381)；5.抗体scFv片段(Zhu等，1995，癌症国际期刊(International Journal of Cancer)62,319)；6.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；8.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；9.纳米磁粒；10.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；11.化疗剂(例如，顺铂)等。
与本发明TCR结合(优选地,共价结合)的抗体或其片段包括抗-T细胞或NK-细胞决定抗体，如抗-CD3或抗-CD28或抗-CD16抗体，优选地抗-CD3抗体，上述抗体或其片段与TCR的结合能够对效应细胞进行定向更好地靶向靶细胞。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991))中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有针剂、口服剂等。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明多肽可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明多肽或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。
本发明TCR的用途
本发明的TCR可用作药物或诊断试剂。可通过修饰或其他改进以使其获得更适于作为药物或诊断试剂使用的特征。该药物或诊断试剂可用于治疗或诊断多种不同的疾病，所述疾病包括但不限于：癌症(例如肾癌、卵巢癌、头和颈癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌或黑素瘤等)、自身免疫病、病毒感染性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病。
通过本发明TCR的特异性可实现药物定位或靶向给药，从而提高多种疾病的治疗或诊断效果。
对于癌症，定位于肿瘤或转移癌的附近可提高毒素或免疫刺激物的效果。在自身免疫病中，可特异性地抑制对正常细胞或组织的免疫反应,或缓慢释放免疫抑制药，使其在更长的时间范围内产生更多的局部效果,从而对受试者的整体免疫能力的影响减至最小。在防止移植排斥中，可以同样的方式优化免疫抑制的作用。对于已存在药物的病毒性疾病，例如HIV、SIV、EBV、CMV、HCV、HBV，药物在感染细胞区域附近释放或发挥激活功能也是有益的。
本发明的TCR可用于调节T细胞激活，本发明的TCR通过结合特异的pMHC并由此抑制T细胞活化。涉及T细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫病可适于此方法，例如Ⅰ型糖尿病。
本发明的TCR也可用于将细胞毒性剂递送至癌细胞的目的，或可用于转染T细胞，从而使得它们能够破坏呈递HLA复合物的肿瘤细胞，以便在称为过继免疫治疗的治疗过程中给予患者。
本发明的TCR也可用作诊断试剂。用可检测标记物对本发明的TCR进行标记，如用适用于诊断目的的标记物标记，来检测MHC-肽与MHC-肽特异性的本发明TCR之间的结合。荧光标记的TCR多聚体适用于FACS分析，可用来检测携带TCR特异性的肽的抗原呈递细胞。
另外，可溶性的本发明TCR还可与其他分子，优选地抗-CD3抗体，结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的靶细胞并进行杀伤。
工业应用性
本发明可溶且稳定的T细胞受体，可用于研究TCR与pMHC(肽-主组织相容性复合体)之间的相互作用及用于疾病的诊断和治疗等目的。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明获得了可溶且稳定的T细胞受体，本发明的TCR能够被很好地复性、重折叠、纯化同时能够与其原配体特异性结合。
(2)本发明的T细胞受体具有较高的Tm值。
(3)本发明的T细胞受体的蛋白复性收率高，易于大规模制备，并有利于降低生产成本。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook和Russel l等人，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
实施例1 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域1G4分子的引物设计和PCR突变
将TCR分子1G4(针对抗原短肽HLA-A2/SLLMWITQC(SEQ ID NO:25)，NY-ESO-1肿瘤特异性抗原)TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。
上述TCR的TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
GTGGTTTCGTCAAGATTGCGGTAAAGGTCTGACC(SEQ ID NO:26)
GGTCAGACCTTTACCGCAATCTTGACGAAACCAC(SEQ ID NO:27)
上述TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC(SEQ ID NO:28)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC(SEQ ID NO:29)
进行PCR的步骤如下：
含1G4TCRα可变域和β链基因的表达质粒pET28a+(Novagene)分别用上述α链可变域和β链引物进行如下突变。每个PCR点突变反应中，将10-30ng的质粒DNA与5μL 10×KOD plus缓冲液、5μL 2.5mM dNTP Mix、3μL 2mM MgSO4、1单位的KOD plus聚合酶(东洋纺上海生物科技有限公司)，10μM的上、下游引物各1μL，最终以H2O补充至50μL。混匀后，至于Bio-Rad PCR仪中反应。94℃2min初始变性之后，进行18个循环的扩增(94℃15sec变性、55℃30sec退火和68℃6min延伸)。然后用10单位的DpnⅠ限制酶(New England Biolabs)37℃消化1小时。将10μL消化产物转化到感受态E.col i DH5α细菌中并在37℃下生长16小时。挑取单克隆在5mL LB+卡纳青霉素中过夜培养。根据生产商的使用说明书应用Zyppy质粒小提试剂盒(ZYMO RESEARCH)纯化质粒DNA，并送至Invitrogen公司测序验证，正确突变后用于下游表达。
含有本发明人工链间二硫键的三结构域TCR分子1G4的α链可变域与β链胞外氨基酸序列分别如图1a和1b所示，其对应的核苷酸序列分别如图2a和2b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线的字母表示。
通过《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的标准方法将上述TCRα和β链的目的基因序列经合成后分别插入到表达载体pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位点分别是NcoI和NotI。插入片段经过测序确认无误。
实施例2 TCR的表达、重折叠和纯化及其结果测定
TCR蛋白的表达
将含有TCRα链可变域与β链的表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，涂布LB平板(卡那霉素50μg/ml)置于37℃培养过夜。次日，挑克隆接种至10ml LB液体培养基(卡那霉素50μg/ml)培养2-3h，按体积比1:100接种至1LLB培养基(卡那霉素50μg/ml)中，继续培养至OD600为0.5-0.8，然后使用终浓度为1mM的IPTG诱导目的蛋白的表达。诱导4小时以后，以6000rpm离心10min收获细胞。PBS缓冲液洗涤菌体一次，并且分装菌体，取相当于200ml的细菌培养物的菌体用5ml BugBuster Master Mix(Novagen)裂解细菌，以6000g离心15min收集包涵体。然后进行4次洗涤剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。然后，用缓冲液如PBS洗涤包涵体以除去洗涤剂和盐。最终，将包涵体用含6M盐酸胍缓冲溶液溶解，并测定包涵体浓度，将其分装后置于-80℃冷冻保存。
TCR蛋白的重折叠
从-80℃超低温冰箱中取出包涵体解冻，加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为10mM，在37℃中温育30min到1小时以确保二硫键完全打开。然后将包涵体样品溶液(9.2mgα链和10mgβ链)先后滴入200ml 4℃预冷重折叠缓冲液(100mM Tris pH 8.1，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素，6.5mM盐酸半胱胺和1.87mM二盐酸胱胺)，4℃缓慢搅拌约30分钟。复性溶液用8倍体积预冷的H2O透析16-20小时。再用8倍体积的20mM Tris pH 8.0透析两次，4℃继续透析约8小时，透析后样品过滤后进行以下纯化。
TCR蛋白的第一步纯化
经过透析的重折叠物(20mM Tri s pH 8.0中)使用GE Hitrap Q阴离子交换层析预装柱(GE Healthcare)，在AKTA纯化仪(GE Healthcare)用0-600mM NaCl进行梯度洗脱。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析各个组分，然后合并。
TCR蛋白的第二步纯化
将第一步纯化合并的样品溶液浓缩以供此步纯化，利用在PBS缓冲液中预平衡的Superdex 100 160/300 GL凝胶过滤层析预装柱(GE Healthcare)纯化蛋白，在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位引入本发明的人工链间二硫键后得到的三结构域TCR分子的洗脱曲线如图3所示。考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析出峰的组分，其还原和非还原胶图如图65的泳道1和泳道6所示。根据洗脱峰及胶图可知，洗脱单峰为人工链间二硫键连接的可溶性TCR分子，该分子在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链可变域和β链。
HPLC法测定TCR蛋白的纯度
TCR蛋白在经过两步纯化合并后，将洗脱组分用HPLC测试其纯度。条件为：Agilent 1260,色谱柱Bio SEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流动相为150mM磷酸盐缓冲液，流速0.5mL/min，柱温25℃，紫外检测波长214nm。TCR分子的SEC(空间排阻色谱)谱图如图4所示。含有本发明人工链间二硫键的三结构域TCR分子的HPLC洗脱峰单一且对称，说明该蛋白结构稳定，并没有聚集或解折叠等现象的发生，纯度非常高。
TCR蛋白复性收率的计算
本发明中TCR蛋白复性收率的计算方式如下：
蛋白复性收率(％)＝100*纯化完成后所得蛋白量(mg)/复性所用包涵体的量(mg)。根据上述计算方式，在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位之间形成人工链间二硫键的1G4TCR分子的蛋白复性收率为49％。收率很高，说明在TCR的α链可变区与β链恒定区具有本发明人工链间二硫键三结构域TCR分子可溶且稳定。
实施例3 TCR的α链可变区与β链恒定区含有人工链间二硫键的TCR的稳定性测试
将实施例2中获得的1G4TCR蛋白(浓度0.5mg/ml)1ml透析至PBS中，利用美国TA(waters)公司的差示扫描量热仪(Nano DSC)对TCR蛋白进行热稳定性测定。检测的温度范围为10-90℃，升温速率为1℃/min。用透析外液PBS作为对照，测定基线3次，待基线稳定之后，再检测蛋白样品。采集数据之后，用分析软件TA_DSC_NanoAnalyze测定TCR的Tm值，并得到其DSC热谱图。本发明的α链可变区与β链恒定区含有人工链间二硫键的TCR的DSC热谱图如图5所示，其Tm值可以达到53℃。该热谱图能够反映在室温下，甚至温度达到43-44℃，含有本发明人工链间二硫键的TCR分子都能维持正确折叠，并保持应有的活性，说明其稳定性很高。
实施例4 结合表征及特异性检测
使用forteBIO Oke实时分析系统检测TCR蛋白与其对应抗原pMHC复合物的结合活性。
在SA传感器表面固定了约2nm的生物素化的pMHC复合物，再将0.05mM的生物素以10μL/min的流速流过芯片120s，封闭链霉亲和素剩余的结合位点。采用动力学分析方法测定其亲和力，使用PBST缓冲液(PBS+0.005％吐温20，pH 7.4)将TCR蛋白稀释成几个不同的浓度(一般为64、32、16、8、4、0uM)，测定与其相对应的pMHC的亲和力。使用Evaluation软件以1:1结合的模型拟合计算动力学参数。
上述pMHC复合物的制备过程如下：
a.纯化
收集100ml诱导表达重链或轻链的E.col i菌液，于4℃8000g离心10min后用10ml PBS洗涤菌体一次，之后用5ml BugBuster Master Mix ExtractionReagents(Merck)剧烈震荡重悬菌体，并于室温旋转孵育20min，之后于4℃，6000g离心15min，弃去上清，收集包涵体。
将上述包涵体重悬于5ml BugBuster Master Mix中，室温旋转孵育5min；加30ml稀释10倍的BugBuster，混匀，4℃6000g离心15min；弃去上清，加30ml稀释10倍的BugBuster重悬包涵体，混匀，4℃6000g离心15min，重复两次，加30ml 20mM Tris-HCl pH 8.0重悬包涵体，混匀，4℃6000g离心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵体，SDS-PAGE检测包涵体纯度，BCA试剂盒测浓度。
b.复性
合成所需的短肽(北京赛百盛基因技术有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的浓度。轻链和重链的包涵体用8M尿素、20mM Tris pH 8.0、10mM DTT来溶解，复性前加入3M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA进一步变性。将短肽以25mg/L(终浓度)加入复性缓冲液(0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM还原型谷胱甘肽、0.2mM PMSF，冷却至4℃)，然后依次加入20mg/L的轻链和90mg/L的重链(终浓度，重链分三次加入，8h/次)，复性在4℃进行至少3天至完成，SDS-PAGE检测能否复性成功。
c.复性后纯化
用10体积的20mM Tri s pH 8.0作透析来更换复性缓冲液，至少更换缓冲液两次来充分降低溶液的离子强度。透析后用0.45μm醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，然后加载到HiTrap Q HP(GE通用电气公司)阴离子交换柱上(5ml床体积)。利用Akta纯化仪(GE通用电气公司)，20mM Tris pH 8.0配制的0-400mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白，pMHC约在250mM NaCl处洗脱，收集诸峰组分，SDS-PAGE检测纯度。
d.生物素化
用Millipore超滤管将纯化的pMHC分子浓缩，同时将缓冲液置换为20mM TrispH 8.0，然后加入生物素化试剂0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室温孵育混合物过夜，SDS-PAGE检测生物素化是否完全。
e.纯化生物素化后的复合物
用Millipore超滤管将生物素化标记后的pMHC分子浓缩至1ml，采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pMHC，利用Akta纯化仪(GE通用电气公司)，用过滤过的PBS预平衡HiPrepTM 16/60S200HR柱(GE通用电气公司)，加载1ml浓缩过的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脱。生物素化的pMHC分子在约55ml时作为单峰洗脱出现。合并含有蛋白质的组分，用Millipore超滤管浓缩，BCA法(Thermo)测定蛋白质浓度，加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)将生物素化的pMHC分子分装保存在-80℃。
不同浓度的含有本发明人工链间二硫键的1G4 TCR分子与其相应抗原的结合曲线如图6所示。从该结合曲线中可以看出，浓度的降低并没有影响本发明TCR分子与其相应抗原的结合，低浓度的TCR分子表现出与高浓度TCR分子相同的结合时间，也能够从侧面说明具有本发明人工链间二硫键的可溶性三结构域TCR分子是较稳定的。
TCR蛋白的特异性检测
应用forteBIO Oke实时分析系统检测TCR蛋白对其相应抗原pMHC复合物的特异性。含有本发明人工链间二硫键的TCR蛋白的特异性检测方式如下：将TCR的相应抗原pMHC复合物(已生物素化)及选定的几种其他无关抗原pMHC复合物(已生物素化)分别加载到SA传感器的表面，然后，与各个待测的TCR蛋白相互作用；最后，分析其互作所产生的信号。
按上述测定方法，含本发明人工链间二硫键的1G4 TCR蛋白只与其相应抗原有结合，与其他无关抗原均无相互作用。
实施例5 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域TCR分子
本实施例进一步验证了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的三结构域TCR分子。
将TCR分子JM22(针对抗原短肽HLA-A2/GILGFVFTL(SEQ ID NO:30)，源自流感病毒基质蛋白)和LC13(针对抗原短肽HLA-B4405：EEYLKAWTF(SEQ ID NO:31))TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。
上述JM22TCR的TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
GTGGTATCGTCAAGAATGCGGTGAAGGTCCGGTC(SEQ ID NO:32)
GACCGGACCTTCACCGCATTCTTGACGATACCAC(SEQ ID NO:33)
上述JM22 TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC(SEQ ID NO:34)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC(SEQ ID NO:35)
上述LC13TCR的TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
CATTGGTACCGTCAGCTGTGCAGCCAAGGTCCGG(SEQ ID NO:36)
CCGGACCTTGGCTGCACAGCTGACGGTACCAATG(SEQ ID NO:37)
上述LC13TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC(SEQ ID NO:38)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC(SEQ ID NO:39)
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。
含有人工链间二硫键的本发明三结构域TCR分子JM22的α链可变域与β链胞外氨基酸序列分别如图7a和7b所示，其对应的核苷酸序列分别如图8a和8b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线字母表示。其洗脱曲线和胶图分别如图9和图66的泳道2(还原胶)和泳道5(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图10所示。蛋白复性收率达到了25％。其Tm值为54℃，对应的DSC谱图如图11所示。JM22分子与其相应抗原的结合曲线如图12所示。
含有人工链间二硫键的本发明三结构域TCR分子LC13的α链可变域与β链胞外氨基酸序列分别如图13a和13b所示，其对应的核苷酸序列分别如图14a和14b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线字母表示。其洗脱曲线和胶图分别如图15和图66的泳道1(还原胶)和泳道4(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图16所示。蛋白复性收率也相当高，达到了21％。其Tm值可以达到60℃，对应的DSC谱图如图17所示。LC13分子与其相应抗原的结合曲线如图18所示。
由以上几种分子的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链可变域和β链。蛋白复性收率也都较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值也都很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入人工链间二硫键的本发明TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明三结构域TCR蛋白。
实施例6 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCR分子
本实施例验证了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的四结构域TCR分子。
分别将TCR分子1G4(针对抗原短肽HLA-A2/SLLMWITQC，NY-ESO-1肿瘤特异性抗原)、JM22(针对抗原短肽HLA-A2/GILGFVFTL，源自流感病毒基质蛋白)和LC13(针对抗原短肽HLA-B4405：EEYLKAWTF)TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。突变所用引物及步骤参照上述实施例。
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。稍有不同之处在于，实施例2中TCR重折叠步骤中，所用TCRα链与β链的包涵体的量分别为15mg及10mg。
含有人工链间二硫键的本发明四结构域TCR分子1G4的α链与β链胞外氨基酸序列分别如图19和1b所示，其对应的核苷酸序列分别如图20和2b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线字母表示。其洗脱曲线和胶图分别如图21和图67的泳道1(还原胶)和泳道6(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图22所示。蛋白复性收率达到了35％。其Tm值为56℃，对应的DSC谱图如图23所示。1G4分子与其相应抗原的结合曲线如图24所示。
含有人工链间二硫键的本发明四结构域TCR分子JM22的α链与β链胞外氨基酸序列分别如图25和7b所示，其对应的核苷酸序列分别如图26和8b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线字母表示。其洗脱曲线和胶图分别如图27和图68的泳道2(还原胶)和泳道5(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图28所示。蛋白复性收率达到了20％。其Tm值为53℃，对应的DSC谱图如图29所示。JM22分子与其相应抗原的结合曲线如图30所示。
含有人工链间二硫键的本发明四结构域TCR分子LC13的α链可变域与β链胞外氨基酸序列分别如图31和13b所示，其对应的核苷酸序列分别如图32和14b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线字母表示。其洗脱曲线和胶图分别如图33和图68的泳道1(还原胶)和泳道4(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图34所示。蛋白复性收率也相当高，达到了22％。其Tm值可以达到60℃。LC13分子与其相应抗原的结合曲线如图36所示。
由以上几种分子的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性四结构域TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链和β链。蛋白复性收率也都较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值也都很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入本发明人工链间二硫键的TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明四结构域TCR蛋白。
实施例7 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的三结构域TCR分子
本实施例验证了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的本发明三结构域TCR分子。
将1G4TCR分子TRAV的第47位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。
上述TCR的TRAV的第47位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
GTTTCGTCAAGATCCGTGCAAAGGTCTGACCAGC(SEQ ID NO：40)
GCTGGTCAGACCTTTGCACGGATCTTGACGAAAC(SEQ ID NO：41)
上述TCR的TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸突变为半胱氨酸时，所设计的引物如下：
5’-3’
GTTTCTACCGATCCGtgcCCGCTGAAAGAACAG(SEQ ID NO：42)
CTGTTCTTTCAGCGGgcaCGGATCGGTAGAAAC(SEQ ID NO：43)
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。
含有人工链间二硫键的本发明三结构域TCR分子的α链可变域与β链胞外氨基酸序列分别如图37a和37b所示，其对应的核苷酸序列分别如图38a和38b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线字母表示。其洗脱曲线和胶图分别如图39和图65的泳道4(还原胶)和泳道9(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图40所示。蛋白复性收率达到了36％。其Tm值为52℃，对应的DSC谱图如图41所示。TCR分子与其相应抗原的结合曲线如图42所示。
由以上的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性三结构域TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链可变域和β链。蛋白复性收率也较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入本发明人工链间二硫键的TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明三结构域TCR蛋白。
实施例8 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCR分子
本实施例验证了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的本发明四结构域TCR分子。
将TCR分子TRAV的第47位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。突变所用引物及步骤参照上述实施例。
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。稍有不同之处在于，实施例2中TCR重折叠步骤中，所用TCRα链与β链的包涵体的量分别为15mg及10mg。
含有人工链间二硫键的本发明四结构域TCR分子α链与β链胞外氨基酸序列分别如图43和37b所示，其对应的核苷酸序列分别如图44和38b所示，引入的半胱氨酸残基以加粗并带下划线字母表示。其洗脱曲线和胶图分别如图45和图67的泳道4(还原胶)和泳道9(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图46所示。蛋白复性收率达到了43％。其Tm值为56℃，对应的DSC谱图如图47所示。TCR分子与其相应抗原的结合曲线如图48所示。
由以上的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性四结构域TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链和β链。蛋白复性收率也较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入本发明人工链间二硫键的TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明四结构域TCR蛋白。
实施例9 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的三结构域TCR分子
本实施例验证了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的本发明三结构域TCR分子。
将1G4TCR分子TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。突变所用引物及步骤参照上述实施例。
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。
含有人工链间二硫键的本发明三结构域TCR分子的其洗脱曲线和胶图分别如图49和图65的泳道2(还原胶)和泳道7(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图50所示。蛋白复性收率达到了37％。其Tm值为48℃，对应的DSC谱图如图51所示。TCR分子与其相应抗原的结合曲线如图52所示。
由以上的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性三结构域TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链可变域和β链。蛋白复性收率也较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入本发明人工链间二硫键的TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明三结构域TCR蛋白。
实施例10 在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键的四结构域TCR分子
本实施例验证了在TCR分子TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的本发明四结构域TCR分子。
将1G4TCR分子TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。突变所用引物及步骤参照上述实施例。
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。稍有不同之处在于，实施例2中TCR重折叠步骤中，所用TCRα链与β链的包涵体的量分别为15mg及10mg。
含有人工链间二硫键的本发明四结构域TCR分子的其洗脱曲线和胶图分别如图53和图67的泳道2(还原胶)和泳道7(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图54所示。蛋白复性收率达到了38％。其Tm值为50℃，对应的DSC谱图如图55所示。TCR分子与其相应抗原的结合曲线如图56所示。
由以上的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性四结构域TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链和β链。蛋白复性收率也较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入本发明人工链间二硫键的TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第46位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明四结构域TCR蛋白。
实施例11 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的三结构域TCR分子
本实施例验证了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的本发明三结构域TCR分子。
将1G4 TCR分子TRAV的第47位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。突变所用引物及步骤参照上述实施例。
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。
含有人工链间二硫键的本发明三结构域TCR分子的其洗脱曲线和胶图分别如图57和图65的泳道3(还原胶)和泳道8(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图58所示。蛋白复性收率达到了22％。其Tm值为48℃，对应的DSC谱图如图59所示。TCR分子与其相应抗原的结合曲线如图60所示。
由以上的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性三结构域TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链可变域和β链。蛋白复性收率也较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入本发明人工链间二硫键的TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明三结构域TCR蛋白。
实施例12 在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键的四结构域TCR分子
本实施例验证了在TCR分子TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位形成人工链间二硫键后，能够获得可溶且稳定的本发明四结构域TCR分子。
将1G4 TCR分子TRAV的第46位氨基酸突变为半胱氨酸，并将其TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸突变为半胱氨酸，以形成人工链间二硫键。突变所用引物及步骤参照上述实施例。
采用实施例1至实施例4中所述方式对TCR进行PCR、复性及性能测试。稍有不同之处在于，实施例2中TCR重折叠步骤中，所用TCRα链与β链的包涵体的量分别为15mg及10mg。
含有人工链间二硫键的本发明四结构域TCR分子的其洗脱曲线和胶图分别如图61和图67的泳道3(还原胶)和泳道8(非还原胶)所示。HPLC洗脱峰单一且对称如图62所示。蛋白复性收率达到了31％。其Tm值为52℃，对应的DSC谱图如图63所示。TCR分子与其相应抗原的结合曲线如图64所示。
由以上的洗脱曲线和SDS胶图可知，洗脱峰组份为本发明人工链间二硫键连接的可溶性四结构域TCR分子，在SDS凝胶中形成单一条带并稳定存在，经还原后形成分开的α链和β链。蛋白复性收率也较高。另外，由本发明人工链间二硫键连接的TCR分子的Tm值很高，说明在较高的温度下它们都能维持正确折叠，并保持应有的活性，显示其稳定性很高。同时，TCR分子与其原配体的结合曲线显示，TCR浓度的降低并没有影响与其配体的结合，也能够从侧面说明具有本发明链间二硫键的TCR分子是稳定的。在特异性测试中，这些引入本发明人工链间二硫键的TCR分子只与其相应抗原结合，与其他几种无关抗原并无相互作用，展示了很好的特异性。因此，上述实验数据证明了在TRAV的第47位和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位引入人工链间二硫键，可以获得可溶且稳定的本发明四结构域TCR蛋白。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种αβ异质二聚TCR，其特征在于，所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键；
优选地，所述TCR的人工链间二硫键位于α链可变区的FR2及β链的恒定区之间；
更优选地，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了位于TRAV的第46位或第47位氨基酸残基；和/或
形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位或第61位氨基酸残基；
最优选地，形成所述TCR的人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。
2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR是可溶的。
优选地，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码以上权利要求中任一所述的TCR的α链和/或β链的核酸序列或其互补序列。
4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞或遗传改造的工程细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要4所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求3所述的核酸分子。
6.一种分离的细胞，其特征在于，其表达权利要求1-2中任一所述的TCR。
7.一种制备权利要求1-2中任一所述的T细胞受体的方法，包括步骤：
(i)培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达权利要求1-2中任一所述的T细胞受体的α链和/或β链；
(ii)分离或纯化出所述的α链和/或β链；
(iii)重折叠所述的α链和/或β链，获得所述T细胞受体。
8.一种T细胞受体复合物，其特征在于，所述的复合物含有一个或多个权利要求1-2中任一所述的TCR。
9.权利要求1-2中任一所述的TCR的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤、病毒感染或自身免疫疾病的药物或用于制备检测MHC-肽复合体的试剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，含有药学上可接受的载体以及安全有效量的权利要求1-2中任一所述的TCR、权利要求5或权利要求6所述的细胞或权利要求8所述的T细胞受体复合物。
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