ES2239246T3 - Receptor soluble de celulas t. - Google Patents
Receptor soluble de celulas t.Info
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Abstract
Un receptor soluble de células T (sTCR), que comprende (i) toda o parte de una cadena á de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, y (ii) toda o parte de una cadena â, excepto el dominio transmembrana de la misma, en el que cada (i) y (ii) comprende un dominio variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR, caracterizado porque (i) y (ii) están unidos mediante un enlace disulfuro entre residuos de cisteína sustituidos por: Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.
Description
Receptor soluble de células T.
La presente invención se refiere a receptores
solubles de células T (TCRs).
Como se describe en el documento WO 99/60120, los
TCR median el reconocimiento de complejo principal de complejos
histocompatibilidad (MHC)-péptido por células T y,
como tales, son esenciales para el funcionamiento del brazo celular
del sistema inmune.
Los anticuerpos y los TCR son solamente dos tipos
de moléculas que reconocen antígenos de una manera específica, y de
este modo el TCR es el único receptor de los antígenos peptídicos
particulares en MHC, el péptido foráneo a menudo siendo el único
signo de anormalidad dentro de una célula. El reconocimiento de las
células T se produce cuando una célula T y una célula presentadora
de antígeno (APC) están en contacto físico directo, y se inicia
mediante ligación de los TCR específicos de antígeno con complejos
pMHC.
El TCR es una proteína de superficie celular
heterodimérica de la superfamilia de las inmunoglobulinas que está
asociada a las proteínas invariantes del complejo CD3 implicado en
la mediación de la trasducción de la señal. Los TCR existen en las
formas \alpha\beta y \gamma\delta, que son estructuralmente
similares pero las células T que las expresan tienen localizaciones
anatómicas y probablemente funciones completamente distintas. La
porción extracelular del receptor consta de dos dominios constantes
proximales de membrana, y dos dominios variables distales de
membrana que llevan bucles polimórficos análogos a las regiones
determinantes complementarias (CDR) de anticuerpos. Son estos bucles
los que forman el sitio de unión de la molécula de TCR y determinan
la especificidad peptídica. La clase I de MHC y ligandos de la
clase II son también las proteínas de la superfamilia de las
inmunoglobulinas pero se especializan para la presentación de
antígenos, con un sitio de unión peptídico polimórfico que les
permite presentar una serie diversa de fragmentos peptídicos cortos
y la superficie celular de la APC.
Los TCR solubles son útiles, no solamente para el
propósito de investigación de interacciones específicas
TCR-pMHC, sino también potencialmente como una
herramienta de diagnóstico para detectar infección, o para detectar
marcadores de enfermedades. Los TCR también tienen aplicaciones en
tinción, por ejemplo, para teñir células para determinar la
presencia de un antígeno peptídico particular presentado en el
contexto del MHC. De manera similar, los TCR solubles se pueden usar
para distribuir un agente terapéutico, por ejemplo un compuesto
citotóxico o un compuesto inmunoestimulante, a las células que
presentan un antígeno particular. Los TCR solubles también se pueden
usar para inhibir las células T, por ejemplo, las que reaccionan con
un antígeno peptídico auto-inmune.
Las proteínas que están hechas de más de una
subunidad polipeptídica y que tienen un dominio transmembrana pueden
ser difíciles de producir en forma soluble debido a que, en muchos
casos, la proteína se estabiliza mediante su región transmembrana.
Éste es el caso del TCR, y se refleja en la bibliografía científica
que describe formas truncadas de TCR, conteniendo bien solamente
dominios extracelulares o dominios extracelulares y citoplásmicos,
que se pueden reconocer por anticuerpos específicos de TCR
(indicando que la parte del TCR recombinante reconocida por el
anticuerpo se ha plegado correctamente), pero que no se puede
producir con un buen rendimiento, que no son estables a bajas
concentraciones y/o que no pueden reconocer los complejos
MHC-péptido. Esta bibliografía se revisa en el
documento WO99/60120.
Numerosas publicaciones describen la producción
de heterodímeros de TCR que incluyen el puente disulfuro nativo que
conecta las subunidades respectivas (Garboczi, y col., (1996),
Nature 384 (6605): 134-41; Garboczi,
y col., (1996), J. Inmunol 157 (12):
5403-10; Chang y col., (1994), PNAS USA
91: 11408-11412; Davodeau y col., (1993),
J. Biol. Chem. 268 (21): 15455-15460;
Golden y col., (1997), J. Imm. Meth. 206:
163-169; patente de Estados Unidos Nº 6080840). Sin
embargo, aunque tales TCR se pueden reconocer por anticuerpos
específicos de TCR, no se mostraron ninguno que reconocieran su
ligando nativo a cualquier otra concentración relativamente alta y/o
no eran estables.
En el documento WO 99/60120, un TCR soluble se
describe que está correctamente plegado de manera que es capaz de
reconocer su ligando nativo, es estable durante un período de
tiempo, y se puede producir en cantidades razonables. Este TCR
comprende una dominio extracelular de cadena \alpha o \gamma de
TCR dimerizado a un dominio extracelular de la cadena \beta o
\delta de TCR respectivamente, mediante un par de péptidos de
dimerización C-terminales, tales como cremalleras de
leucina. Esta estrategia de producción de los TCR es aplicable
generalmente a todos los
TCR.
TCR.
Reiter y col., Immunity, 1995, 2:
281-287, detalla la construcción de una molécula
soluble que comprende dominios variables \alpha y \beta de TCR
estabilizados por disulfuro, uno de los cuales se une a una forma
truncada de exotoxina de Peudomonas (PE38). Una de las
razones establecidas para producir esta molécula era vencer la
inestabilidad inherente de los TCR de cadena sencilla. La posición
del enlace disulfuro novedoso en los dominios variables de TCR se
identificó mediante homología con los dominios variables de
anticuerpos, en los que éstos se habían introducido previamente (por
ejemplo véase Brinkmann, y col., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90: 7538-7542, y Reiter, y col.,
(1994) Biochemistry 33: 5451-5459).
Sin embargo, como no hay tal homología entre anticuerpo y los
dominios constantes de TCR, tal técnica no se puede emplear para
identificar sitios apropiados para nuevos enlaces disulfuro
intercadena entre los dominios constantes de TCR.
Dada la importancia de los TCR solubles, sería
deseable proporcionar una forma alternativa de producir tales
moléculas.
Según un primer aspecto, la presente invención
proporciona un receptor de células T solubles (sTCR), que comprende
(i) toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio
transmembrana del mismo, y (ii) toda o parte de la cadena \beta de
TCR, excepto el dominio transmembrana del mismo, en el que (i) y
(ii) cada uno de ellos comprende un dominio variable funcional y al
menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR,
caracterizado porque (i) y (ii) están unidos mediante un enlace
disulfuro entre residuos cisteína por:
Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01; o
Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un receptor de células t de la forma \alpha\beta soluble (sTCR),
en el que un enlace disulfuro covalente se une a residuos
sustituidos por:
Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01; o
Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un
receptor de las células T soluble (sTCR), que comprende (i) toda o
parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio
transmembrana del mismo, y (ii) toda o parte de la cadena \beta de
TCR, excepto el dominio transmembrana del mismo, en el que (i) y
(ii) cada uno comprende un dominio variable funcional y al menos una
parte del dominio constante de la cadena de TCR, y están unidos
mediante un enlace disulfuro entre los dominios de residuos cisteína
que no está presente en TCR nativo y en el que un enlace disulfuro
intercadena en TCR nativo no está presente.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un
receptor soluble de las células T (sTCR) de forma \alpha\beta,
en el que un enlace disulfuro covalente se une a un residuo de la
región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena
\alpha a un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio
constante de la cadena \beta, en el que un enlace disulfuro
intercadena en TCR nativo no está presente.
Los sTCR de la presente invención tienen la
ventaja de que no contienen polipéptidos heterólogos que pueden ser
inmunogénicos, o que pueden dar como resultado los sTCR que se
eliminan rápidamente del cuerpo. Además, los TRC de la presente
invención tienen una estructura tridimensional que es altamente
similar a los TCR nativos de los que se derivan y, debido e esta
similitud estructural, no son probablemente inmunogénicos. Los sTCR
de acuerdo con la invención pueden ser para reconocer los complejos
de la clase I de MHC-péptido o los complejos de la
clase II de MHC-péptido.
Los TCR de la presente invención son solubles. En
el contexto de esta solicitud, solubilidad se define como la
capacidad del TCR de purificarse como un heterodímero monodisperso
en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (KCl 2,7 mM,
KH_{2}PO_{4}1,5 mM, NaCl 137 mM y Na_{2}PO_{4} 8 mM, pH
7,1-7,5. Life Technologies, Gibco BRL) a una
concentración de 1 mg/ml y para > 90% de dicho TCR que queda como
un heterodímero mono disperso después de la incubación a 25ºC
durante 1 hora. Con el fin de determinar la solubilidad del TCR,
primero se purifica como se describe en el ejemplo 2. Después de
esta purificación, 100 \mug del TCR se analizan mediante
cromatografía de exclusión por tamaño, por ejemplo usando una
columna Superdex 75 HR de Pharmacia equilibrada en PBS. 100 \mug
adicionales del TCR se incuban a 25ºC durante 1 hora y después de
analizan mediante cromatografía por exclusión de tamaño como antes.
Las pequeñas cantidades por exclusión de tamaño se analizan después
mediante integración y las áreas bajo los picos que corresponden al
heterodímero mono disperso se comparan. Los picos relevantes se
pueden identificar mediante comparación con la posición de elución
de los patrones de proteínas de peso molecular conocidos. El TCR
soluble heterodimérico mono disperso tiene un peso molecular de
aproximadamente 50 kDa. Como se ha indicado anteriormente, los TCR
de la presente invención son solubles. Sin embargo, como se explica
en más detalle más adelante, los TCR se pueden acoplara un resto de
manera que el complejo resultante sea insoluble, o se pueden
presentar en la superficie de un soporte sólido insoluble.
La numeración de los aminoácidos de TCR usados en
esta memoria descriptiva sigue el sistema IMGT descrito en The T
Receptor Factsbook, 2001, LeFranc y LeFranc, Academis Press. En este
sistema, el dominio constante de la cadena \alpha tiene la
siguiente notación: TRAC*01, en el que "TR" indica gen receptor
de las células T; "A" indica gen de la cadena \alpha; C
indica región constante; y "01" indica alelo 1. El dominio
constante de la cadena \beta tiene la siguiente notación: TRBC201.
En este caso, existen dos posibles genes de la región constante
"C1" y "C2". El dominio traducido codificado por cada
alelo puede estar hecho a partir del código genético de varios
exones; por lo tanto también están especificados. Los aminoácidos
están numerados según el exón del dominio particular en los que
están presentes.
La porción extracelular del TCR nativo consta de
dos polipéptidos (\alpha\beta y \gamma\delta) cada uno de
los cuales tiene un dominio constante proximal de membrana, y un
dominio variable distal de membrana (véase la figura 1). Cada uno de
los dominios constante y variable, incluye un enlace disulfuro
intracadena. Los dominios variables contienen bucles altamente
polimórficos análogos a las regiones determinantes de
complementariedad (CDR) de anticuerpos. CDR3 del TCR interactúa como
el péptido presentado por MHC, y las CDR 1 y 2 interactúan con el
péptido y el MHC. La diversidad de las secuencias de TCR se genera
mediante transposición somática de genes variables (V), de
diversidad (D), de unión (J), y constantes. Los polipéptidos
funcionales de la cadena \alpha se forman mediante las regiones V
- J - C transpuestas, mientras que las cadenas \beta constan de
las regiones V - D - J - C. El dominio constante extracelular tiene
una región proximal de membrana y una región de inmunoglobulina. La
región proximal de membrana esta constituida por los aminoácidos
entre el dominio transmembrana y el residuo cisteína proximal de
membrana. El dominio de inmunoglobulina constante está constituido
por el resto de los residuos de aminoácidos del dominio constante,
que se extienden desde la cisteína proximal de membrana hasta el
comienzo de la región de la unión, y se caracteriza por la presencia
de un pliegue de tipo de inmunoglobulina. Existe un dominio
constante de la cadena \alpha individual, conocido como C\alpha1
o TRAC*01, y dos dominios constante \beta diferentes, conocidos
como C\beta1 o TRNC1*01 y C\beta2 o TRNC2*01. La diferencia
entre estos dominios constantes \beta diferentes es con respecto a
los residuos 4, 5 y 37 del exón 1. De este modo, TRBC1*01 tiene 4N,
5K y 37 en el exón 1 del mismo, y TRBC2*01 tiene 4K, 5N y 37Y en el
exón 1 del mismo. La extensión de cada uno de los dominios
extracelulares es algo variable.
En la presente invención, el enlace disulfuro se
introduce entre los residuos localizados en los dominios constantes
(o partes de los mismos) de las respectivas cadenas. Las cadenas
respectivas del TCR comprenden suficientes dominios variables de los
dominios variables de los mismos que son capaces de interactuar con
su complejo pMHC. Tal interacción se puede medir usando un
instrumento BIAcore 3000™ o BIAcore 2000™ como se describe en el
ejemplo 3 en esta memoria descriptiva o en el documento WO 99/6120
respectivamente.
En una realización, las cadenas respectivas de
los sTCR de la invención también comprende los enlaces disulfuro de
la cadena intracadena de los mismos. El TCR de la presente invención
puede comprender toda la región Ig constante extracelular de las
cadenas de TCR respectivas, y preferiblemente todo el dominio
extracelular de las respectivas cadenas, es decir incluyendo la
región proximal de membrana. En el TCR nativo, existe un enlace
disulfuro que une las regiones proximales de membrana conservadas de
las cadenas respectivas. En una realización de los primero y segundo
aspectos de la presente invención y en un tercer y cuarto aspectos
de la invención, este enlace disulfuro no está presente. Esto se
puede lograr mediante mutación de los residuos cisteína apropiados
(el aminoácido 4, exón 2 del gen TRAC*01 y el aminoácido 2 de tanto
los genes TRBC*01 como TRBC2*01 respectivamente) a otro aminoácido,
tal como serina o alanina, o truncando las cadenas respectivas de
manera que los residuos cisteína no están incluidos. Un TCR soluble
preferido según la invención comprende las cadenas \alpha y
\beta de TCR nativo truncadas en el extremo C de manera que los
residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo
están excluidos, es decir truncados en el residuo 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9 ó 10 N-terminal a los residuos cisteína. Sin
embargo hay que tener en cuenta que el enlace disulfuro intercadena
nativo puede estar presente en los TCR de la presente invención, y
que, en ciertas realizaciones, solamente las cadenas del TCR tienen
el residuo cisteína nativo que forma en enlace disulfuro intercadena
nativo. Esta cisteína se puede usar para unir restos al TCR.
Sin embargo, las cadenas de TCR respectivas
pueden ser más cortas. Debido a que los dominios constantes no están
implicados directamente en contactos con los ligandos
péptido-MHC, el punto de truncamiento
C-terminal se puede alterar sustancialmente sin
pérdida de funcionalidad.
Como alternativa, se prefiere en esta memoria
descriptiva que pueda estar presente un fragmento mayor de los
dominios constantes, es decir los dominios constantes necesitan no
estar truncados justo antes de las cisteínas formando el enlace
disulfuro de intercadena. Por ejemplo, el dominio constante entero
excepto el dominio transmembrana (es decir, los dominios
extracelular y citoplasmático) pueden estar incluidos. Puede ser
ventajoso en este caso mutar uno o más de los residuos cisteína que
forman el enlace disulfuro intercadena en el TCR celular a otro
residuo de aminoácido que no está implicado en la formación del
enlace disulfuro, o suprimir uno o más de estos residuos.
El péptido señal se puede omitir si el TCR
soluble se expresa en células procarióticas, por ejemplo E.
coli, ya que no sirve cualquier propósito en el TCR maduro para
su capacidad de unión a ligando, y puede en algunas circunstancias
prevenir la formación de un TCR soluble funcional. En la mayoría de
los casos, el sitio de escisión en el que el péptido señal se
elimina de las cadenas de TCR maduras se predice pero no se
determina experimentalmente. Modificando genéticamente las cadenas
del TCR expresado de manera que sean unos pocos, es decir, hasta
aproximadamente 10 por ejemplo, los aminoácidos más largos o más
cortos en el extremo N-terminal pueden no tener
significación para la funcionalidad (es decir, la capacidad de
reconocer pMHP) del TCR soluble. Se pueden añadir ciertas adiciones
que no están presentes en la secuencia proteica original. Por
ejemplo, se puede añadir una secuencia marca corta que puede ayudar
en la purificación de las cadenas de TCR, con tal que no interfiera
con la estructura correcta y plegamiento del sitio de unión a
antígeno del TCR.
Para la expresión en E. coli, un residuo
de metionina se puede modificar por ingeniería genética en el punto
de partida N-terminal de la secuencia proteica
madura predicha con el fin de permitir el inició de traducción.
Todos los residuos lejos de los dominios
variables de las cadenas de TRC son esenciales para la especificidad
y funcionalidad antigénica. De este modo, un número significativo de
mutaciones se puede introducir en este dominio sin afectar a la
especificidad y funcionalidad antigénica. Todos los residuos lejos
en los dominios constantes de las cadenas de TCR son esenciales para
la especificidad y funcionalidad antigénica. De este modo, un número
significativo de mutaciones se puede introducir en este dominio sin
afectar a la especificidad y funcionalidad antigénica.
La cadena \beta del TCR contiene un residuo de
cisteína que no está apareado en el TCR celular o nativo. Se
prefiere si este residuo de cisteína se elimina o se muta a otro
residuo para evitar el apareamiento intracadena o intercadena
incorrecto. Las sustituciones de este residuo de cisteína por otro
residuo, por ejemplo serina o alanina, puede tener un efecto
significativo positivo sobre las eficacias de replegamiento in
vitro.
En el tercero y cuatro aspectos, se puede formar
el enlace disulfuro intercadena mutando los residuos no cisteína en
las cadenas respectivas a cisteína, y que hacen que el enlace se
forme entre los residuos mutados. Los residuos cuyos respectivos
carbono \beta están aproximadamente 6 \ring{A} (0,6 nm) o menos,
y preferiblemente en el intervalo entre 3,5 \ring{A} (0,35 nm) y
5,9 \ring{A} (5,9 nm) separados en el TCR nativo, de manera que se
pueda formar un enlace disulfuro entre residuos de cisteína
introducidos en lugar de los residuos nativos. Se prefiere que si el
enlace disulfuro esté entre residuos en la región inumoglobulina
constante, aunque puede estar entre residuos de la región proximal
de membrana. Los sitios preferidos donde se pueden introducir
cisteínas para formar el enlace disulfuro son los siguientes
residuos en el exón 1 de TRAC*01 para la cadena \alpha de TCR y
TRBC1*01 o TRBC2*01 para la cadena \beta de
TCR:
TCR:
Cadena \alpha de TCR | Cadena \beta de TCR | Separación de carbonos \beta nativos (nm) |
Thr 48 | Ser 57 | 0,473 |
Thr 45 | Ser 77 | 0,533 |
Tyr 10 | Ser 17 | 0,359 |
Thr 45 | Asp 59 | 0,560 |
Ser 15 | Glu 15 | 0.59 |
Un sTCR de la presente invención se deriva del
TCR A6 Tax (Garboczi y col, Nature, 1996, 384 (6605);
134-141). En una realización, el sTCR comprende el
total de la cadena \alpha de TCR, que es
N-terminal del exón 2, residuo 4 de TRAC*01
(residuos de aminoácidos 1-182 de la cadena \alpha
según la numeración usada en Garboczi y col) y el total de la cadena
\beta de TCR que es N-terminal del exón 2,
residuo 2 de tanto TRBC*01 como TRCB2*01 (residuos aminoácidos
1-210 de la cadena \beta según la numeración usada
en Garboczi y col.,). Con el fin de formar el enlace disulfuro, la
treonina 48 del exón 1 en TRAC*01 (treonina 158 de la cadena
\alpha según la numeración usada en Garboczi y col.,) y la serina
57 del exón 1 en tanto TRBC1*01 como TRBC2*01 (la serina 172 de la
cadena \beta según la numeración usada en Garboczi y col.,) puede
cada una estar mutada a cisteína. Estos aminoácidos se localizan en
la hebra D \beta del dominio constante de las cadenas \alpha y
\beta del TCR respectivamente.
Hay que indicar que, en las figuras 3 a y 3b,
residuo 1 (según la numeración usada en Garboczi y col.,) es K y N
respectivamente. El residuo metionina N-terminal no
está presente en el TCR A6 Tax, como se ha mencionado anteriormente,
está algunas veces presente cuando las cadenas respectivas se
producen en sistemas de expresión bacterianos.
Ahora que los residuos en los TCR humanos que se
pueden mutar a residuos cisteínas para formar un nuevo enlace
disulfuro intercadena se han identificado, los expertos en al
técnica serán capaces de mutar cualquier TCR de la misma manera que
para producir una forma soluble del TCR que tiene un nuevo enlace
disulfuro intercadena. En los seres humanos, los expertos en la
técnica necesitan buscar los siguientes motivos en las respectivas
cadenas de TCR para identificar el residuo a mutar (el residuo
sombreado es el residuo para mutación a cisteína).
En otras especies, las cadenas de TRC pueden no
tener una región que tiene 100% de identidad a los motivos
anteriores. Sin embargo, los expertos en la técnica serán capaces de
tener de usar motivos para identificar la parte equivalente de la
cadena \alpha o \beta del TCR y por lo tanto el residuo a mutar
a cisteína. Las técnicas de alineación se pueden usar en este
respecto. Por ejemplo, ClustalW, disponible de la página web del
Instituto de Bioinformática Europeo
(http://www.ebi.ac.uk/index.html) se puede usar para compra
los motivos anteriores a una secuencia de la cadena de TCR
particular con el fin de localizar la parte relevante de la
secuencia de TCR para mutación.
La presente invención incluye dentro de su
alcance los TCR \alpha\beta unidos por disulfuro humanos, así
como los TCR \alpha\beta unidos por disulfuro de otros
mamíferos, incluyendo pero sin limitación, ratón, rata, cerdo, cabra
y oveja. Como se ha mencionado anteriormente los expertos en la
técnica serán capaces de determinar sitios equivalentes a los sitios
humanos descritos anteriormente en los que los residuos cisteína se
pueden introducir para formar un enlace disulfuro intercadena. Por
ejemplo, lo siguiente muestra las secuencias de aminoácidos de los
dominios solubles C\alpha y C \beta de ratón, junto con los
motivos que muestran los residuos murinos equivalentes a los
residuos humanos mencionados anteriormente que se pueden mutar a
cisteínas para formar un enlace disulfuro intercadena de TCR (donde
los residuos relevantes están sombreados):
Dominio soluble C\alpha de ratón:
Dominio soluble C\beta de ratón:
En una realización preferida de la presente
invención, (i) y (ii) del TCR cada uno comprende el dominio variable
funcional del primer TCR condensado a todo o parte del dominio
constante de un segundo TCR, el primer y segundo TCR siendo de la
misma especie y el enlace disulfuro intercadena estando entre los
residuos en dicho todo o parte del dominio constante respectivo no
presente en TCR nativo. En una realización, el primer y segundo TCR
son humanos. En otras palabras, los dominios constantes unidos por
enlace disulfuro actúan como un marco conservado sobre el que los
dominios variables se pueden condensar. El TCR resultante será
sustancialmente idéntico al TCR nativo a partir del cual se obtiene
el primer TCR. Tal sistema permite la fácil expresión de cualquier
dominio variable funcional sobre un marco conservado del dominio
constante estable.
Los dominios constantes del sTCR A6 Tax, o de
hecho los dominios constantes de cualquiera de los TCR
\alpha\beta que tienen un nuevo enlace disulfuro intercadena
descrito anteriormente, se puede usar como marco conservado en el
que los dominios variables heterólogos se pueden condensar. Se
prefiere si la proteína de fusión conserva tanto de la conformación
de los dominios variables heterólogos como sea posible. Por lo
tanto, se prefiere que los dominios variables heterólogos estén
unidos a los dominios constantes en cualquier punto entre los
residuos cisteína introducidos y el extremo N del dominio constante.
Para el TCR A6 Tax, los residuos cisteína introducidos sobre las
cadenas \alpha y \beta se localizan preferiblemente en la
treonina 48 del exón 1 en TRAC*01 (treonina 158 de la cadena
\alpha según la numeración usada en Garboczi y col) y la serina 57
del exón 1 tanto en TBRC1*01 como en TRBC2*01 (serina 172 de la
cadena \beta según la numeración usada en Garboczi y col.,)
respectivamente. Por lo tanto se prefiere si los puntos de unión de
los dominios variables de las cadenas \alpha y \beta heterólogos
están entre los residuos 48 (159 según la numeración usada en
Garboczi y col.,) o 58 (173 según la numeración usada en Garboczi y
col.,) y el extremo N de los dominios constantes \alpha y \beta
respectivamente.
Los residuos en los dominios constantes de las
cadenas \alpha y \beta heterólogos a los puntos de alineación
en el TCR A6 Tax se pueden identificar por homología de secuencia.
La proteína de fusión se construye preferiblemente para que incluya
toda la secuencia heteróloga N-terminal al punto de
unión.
Como se describe en más detalle más adelante, el
sTCR de la presente invención se puede derivatizar con, o
condensarse a, un resto como su extremo C o N. Se prefiere el
extremo C ya que es distal del dominio de unión. En una realización,
una o ambas de las cadenas de TCR tienen un residuo cisteína en su
extremo C y/o N al que tal resto se puede condensar.
Un TCR soluble (que es preferiblemente humano) de
la presente invención se puede proporcionar en forma sustancialmente
pura, o como una preparación purificada o aislada. Por ejemplo, se
puede proporcionar en una forma que esté sustancialmente libre de
otras proteínas.
Se puede proporcionar una pluralidad de TCR
solubles de la presente invención en un complejo multivalente. De
este modo, la presente invención proporciona, en un aspecto, un
complejo de los receptores de las células T (TCR) multivalente, que
comprende una pluralidad de los receptores de las células T solubles
como se describe en esta memoria descriptiva. Cada uno de la
pluralidad de los TCR soluble es preferiblemente idéntico.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento APRA detectar complejos MHC-péptido
dicho procedimiento comprende:
- (i)
- proporcionar un receptor de las células T soluble o un complejo de los receptores de las células T multivalente como se describe esta memoria descriptiva;
- (ii)
- poner en contacto el receptor de las células T soluble o complejo de los TCR multivalente con los complejos MHC-péptido; y
- (iii)
- detectar la unión del receptor de las células T soluble o un complejo de los TCR multivalente a los complejos MHC-péptido.
En el complejo multivalente de la presente
invención, los TCR pueden estar en la forma de multímeros, y/o puede
estar presente en o asociado con una bicapa lipídica, por ejemplo,
un liposoma.
En su forma más simple, un complejo de TCR
multivalente según la invención comprende un multímero de dos o
tres o cuatro o más moléculas del receptor T asociado (por ejemplo,
covalentemente o de otra manera unido) con otro, preferiblemente
mediante una molécula de engarce. Las moléculas de engarce adecuadas
incluyen, pero sin limitación, moléculas de unión multivalente tales
como avidina, estreptavidina, neutravidina y extravidina, cada una
de las cuales tiene cuatro sitios de unión para biotina. De este
modo, las moléculas de TCR biotiniladas se pueden formar en los
multímeros de los receptores de las células T que tienen una
pluralidad de sitios de unión. El número de moléculas de TCR en el
multímero dependerá de la cantidad de TCR en relación a la cantidad
de la molécula engarce usada para preparar los multímeros, y también
en la presencia o ausencia de cualquier otra molécula biotinilada.
Los multímeros preferidos son complejos diméricos, triméricos o
tetraméricos de TCR.
Las estructuras que son mucho más grandes que los
tetrámeros de TRC se pueden usar en el rastreo o dirección de
células que expresan el complejo específico
MHC-péptido. Preferiblemente las estructuras están
en el intervalo entre 10 nm y 10 \mum de diámetro. Cada estructura
puede mostrar múltiples moléculas de TCR a una suficiente distancia
separadas que permiten que dos moléculas de TCR en la estructura se
unan simultáneamente a dos o más complejos
MHC-péptido en una célula y de este modo incrementen
la avidez del resto de unión multimérico por la célula.
Las estructuras adecuadas para uso en la
invención incluyen estructura de membrana tales como liposomas y
estructura sólidas que son preferiblemente partículas tales como
perlas, por ejemplo, perlas de látex. Otras estructuras que se
pueden revestir externamente con moléculas de los receptores de las
células T son también adecuadas. Preferiblemente, las estructuras se
revisten con multímeros de los receptores de las células T mejor que
moléculas de los receptores de las células T.
En el caso de liposomas, las moléculas de los
receptores de las células T o los multímeros de las mismas se pueden
unir a o por lo demás asociarse con la membrana. Las técnicas para
esto las conocen bien los expertos en al técnica.
Un marcador o cualquier otro resto, tal como un
resto tóxico o terapéutico, se puede incluir en un complejo de TCR
multimérico de la presente invención. Por ejemplo, el marcador u
otro resto se pueden incluir en un multímero de la molécula
mezclado. Un ejemplo de tal molécula multimérica es un tetrámero que
contiene tres moléculas de TCR y una molécula de peroxidasa. Esto se
puede lograr mezclando el TCR y la enzima a una relación molar de
3:1 para generar complejos tetraméricos, y aislando el complejo
deseado a partir de cualquier complejo que no contenga la relación
correcta de moléculas. Estas moléculas mezcladas pueden contener
cualquier combinación de moléculas, con tal que el impedimento
estérico no comprometa o no comprometa significativamente la función
deseada de las moléculas. El posicionamiento de los sitios de unión
sobre la molécula de estreptavidina es adecuado para tetrámeros
mezclados ya que el impedimento estérico no es probable que se
produzca.
Pueden ser posibles medios alternativos de
biotinilación del TCR. Por ejemplo, se puede usar la biotinilación
química. Como alternativa se pueden usar marcas de biotinilación,
aunque ciertos aminoácidos en la secuencia de marca de biotina son
esenciales (Schatz, (1993). Biotechnology NY 11:
(10): 1138-43). La mezcla usada para biotinilación
también se puede variar. La enzima requiere Mg-ATP y
baja resistencia iónica, aunque ambas de estas condiciones se pueden
variar por ejemplo, puede ser posible usar una resistencia iónica
mayor y un mayor tiempo de reacción. Puede ser posible usar una
molécula distinta de avidina o estreptavidina para formar multímeros
del TCR. Cualquier molécula que se una a biotina de una manera
multivalente sería adecuada. Como alternativa, un enlace enteramente
diferente se podría proyectar (tal como una marca de
poli-histidina a un ion de níquel quelado (Quiagen
Product Guide, 1999, capítulo 3 "Protein Expresión, Purification,
Detection and Assay" p. 35-37). Preferiblemente,
la marca se localiza hacia el extremo C de la proteína de manera que
minimiza la cantidad de impedimento estérico en la interacción con
complejos péptido-MHC.
Una o ambas de las cadenas del TRC se pueden
marcar con un marcador detectable, por ejemplo un marcador que sea
adecuado para propósitos de diagnóstico. De este modo, la invención
proporciona un procedimiento para detectar complejos
MHC-péptido dicho procedimiento comprende poner en
contacto los complejos MHC-péptido con un TCR o
complejo de TCR multimérico de acuerdo con la invención que es
específico para el complejo MHC - péptido; y detectar la unión del
TCR multimérico o complejo de TCR multimérico al complejo
MHC-péptido. En el TCR tetramérico formado usando
heterodímeros biotinilados, se puede usar estreptavidina
fluorescente (comercialmente disponible) para proporcionar un
marcador detectable. Un tetrámero marcado fluorescentemente es
adecuado para uso en análisis de FACS, por ejemplo para detectar
células presentadoras de antígeno que llevan el péptido para el que
TCR es específico.
Otra manera en la que los TCR solubles de la
presente invención se pueden detectar es mediante el uso de
anticuerpos específicos de TCR, en particular anticuerpos
monoclonales. Existen muchos anticuerpos anti-TCR
comercialmente disponibles, tales como \alphaF1 y \betaF1, que
reconocen las regiones constantes de la cadena \alpha y \beta
respectivamente.
El TCR (o complejo multivalente del mismo) de la
presente invención puede alternativamente o adicionalmente estar
asociado con (por ejemplo, covalentemente o de otra manera unido a)
una gente terapéutico que puede ser por ejemplo, un resto tóxico
para usar en la muerte de células, o un agente inmunoestimulante tal
como una interleucina o una citocina. Un complejo de TCR
multivalente de la presente invención puede tener potenciada la
capacidad de unión para un pMCH comparado con un heterodímero
receptor de las células T no multimérico. De este modo, los
complejos de TCR multivalentes según la invención son
particularmente útiles para rastrear o dirigir células que presentan
antígenos particulares in vitro o in vivo, y son
también útiles como intermedios para la producción de complejos de
TCR multivalentes adicionales que tienen tales usos. El TCR o
complejo de TCR multivalente se puede por lo tanto proporcionar en
una formulación farmacéuticamente aceptable para uso in
vivo.
La invención también proporciona un procedimiento
para distribuir una agente terapéutico a una célula diana, dicho
procedimiento comprende poner en contacto células diana potenciales
con un TCR o complejo de TCR multivalente de acuerdo con la
invención en condiciones que permiten la unión del TCR o complejo de
TCR multivalente a la célula diana, dicho TCR o complejo de TCR
multivalente siendo específico para los complejos
MHC-péptido y teniendo el agente terapéutico
asociado a ellos.
En particular, el TCR o complejo de TCR
multivalente se puede usar para distribuir agentes terapéuticos al
lugar de células que presentan un antígeno particular. Esto sería
útil en muchas situaciones y, en particular, contra tumores. Un
agente terapéutico se puede distribuir de manera que ejerza su
efecto localmente pero no solamente sobre la célula a la que se une.
De este modo, una estrategia particular contempla moléculas
antitumorales unidas a receptores de células T o complejos de TCR
multivalentes específicos para antígenos de tumores.
Muchos agentes terapéuticos se pueden usar para
este uso, por ejemplo compuestos radiactivos, enzimas, perforina por
ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (cis-platina
por ejemplo). Para asegurar que los efectos tóxicos se ejercen en el
lugar deseado la toxina puede estar en el interior de un liposoma
ligado a estreptavidina de manera que el compuesto se libere
lentamente. Esto evitará los efectos perjudiciales durante el
transporte en el cuerpo y asegurará que la toxina tiene máximo
efecto después de la unión del TCR a las células presentadoras de
antígeno relevantes.
Otros agentes terapéuticos adecuados
incluyen:
- \bullet
- agentes citotóxicos de pequeña molécula, es decir compuestos con la capacidad de destruir células de mamífero que tiene un peso molecular menor de 700 daltons. Tales compuestos podrían también contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, se debe entender que estos agentes citotóxicos de pequeñas moléculas también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Los ejemplos de tales agentes incluyen cis-platina, derivados de maitansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecan, melfalan, mitoxantrona, sorfimer sodiofotofrina II, temozolmida, topotecan, trimetreato glucuronato, auristatina E vincristina y doxorubicina;
- \bullet
- citotoxinas petídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con la capacidad de destruir células de mamíferos. Los ejemplos incluyen ricina, toxina de difteria exotoxina A bacteriana de pseudomonas, ADNasa y ARNasa;
- \bullet
- radio-nuclidos, es decir isótopos inestables de elementos que se descomponen con la emisión simultánea de una o más partículas \alpha o \beta, o rayos \gamma. Los ejemplos incluyen yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213;
- \bullet
- profármacos, tales como profármacos de enzimas dirigidos a anticuerpos;
- \bullet
- inmuno-estimulantes, es decir, restos con respuesta inmune estimulada. Los ejemplos incluyen citocinas tales como IL-2, quimiocinas tales como IL-8, factor 8 de plaquetas, proteína estimuladora del crecimiento de melanomas, etc, anticuerpos o fragmentos de los mismos, activadores de complemento, dominios proteicos xenogénicos, dominios proteicos alogénicos, dominios proteicos virales bacterianos y péptidos virales/bacterianos.
Los TCR solubles o complejos de TCR multivalentes
de la invención se pueden unir a una enzima capaz de convertir un
profármaco en un fármaco. Estro permite que el profármaco se
convierta en el fármaco solamente en el sitio donde se requiere (es
decir, dirigido por el sTCR).
Los ejemplos de dianas
MHC-péptido para el TCR según la invención incluyen,
pero sin limitación a, epítopes virales tales como epítopes de
HTLV-1 (por ejemplo, el péptido Tax restringido por
HLA-A2; HTLV-1 se asocia con
lecucemia), epítopes de VIH, epítopes de VBE, epítopes de VCM;
epítopes de melanoma (por ejemplo, epítope restringido de
HLA-A1 MAGE-1) y otros epítopes
específicos de cáncer (por ejemplo, el carcinoma de células renales
asociado a antígeno G250 restringido por HLA-A2); y
epítopes asociados con trastornos autoinmunes, tales como artritis
reumatoide. Además se identifican las dianas de pMHC asociadas a
enfermedad, adecuados para uso en la presente invención, se enumeran
en el HLA Factbook (Barclay (Ed) Academic Press), y muchos
otros.
Una multitud de tratamientos patológicos se
pueden potencialmente mejorar localizando el fármaco a través de la
especificidad de TCR solubles.
Las enfermedades virales para las que el fármaco
existe, por ejemplo, VIH, VIS, VBE, VCM, se beneficiarían del
fármaco que se libera o activa en la proximidad cercana de las
células infectadas. Para cáncer, la localización en la proximidad de
tumores o metástasis potenciaría el efecto de las toxinas o
inmunoestimulantes. En las enfermedades autoinmunes, los fármacos
inmunosupresores se pueden liberar lentamente, teniendo más efecto
local durante un período de tiempo extendido mientras que afecta
mínimamente afectando a la capacidad inmune global del sujeto. En la
prevención del rechazo de injertos, el efecto de fármacos
inmunosupresores se puede optimizar de la misma manera. Para la
distribución de vacunas, el antígeno de vacunas se puede localizar
en la proximidad de las células presentadoras de antígeno, de este
modo potenciando la eficacia del antígeno. El procedimiento también
se puede aplicar para propósitos de formación de imágenes.
Los TCR solubles de la presente invención se
pueden usar para modular la activación de células T mediante la
unión a pMHC específicos y por lo tanto inhibiendo la activación de
células T. Las enfermedades autoinmunes que implican inflamación
mediada por células T y/o lesión en el tejido serían responsables de
este planteamiento, por ejemplo, diabetes de tipo I. El conocimiento
del epítope peptídico específico presentado por el pMHC relevante se
requiere para este uso.
Los medicamentos de acuerdo con la invención se
suministrarán como parte de una composición estéril, farmacéutica
que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Esta composición farmacéutica puede ser de cualquier forma adecuada,
(dependiendo del procedimiento deseado de administración a un
paciente). Se puede proporcionar en forma de dosificación unitaria,
se proporcionará generalmente en un recipiente sellado y se puede
proporcionar como parte de un kit. Tal kit incluirá normalmente
(aunque no necesariamente) instrucciones para uso. Puede incluir una
pluralidad de dichas formas de dosificación unitaria.
La composición farmacéutica se puede adaptar para
administración mediante una vía apropiada, por ejemplo, mediante la
vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica
(incluyendo bucal, sublingual o trandérmica), vaginal o parenteral
(incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica).
Tales composiciones se pueden preparar mediante cualquier
procedimiento conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo,
mediante la mezcla del ingrediente activo con el (los) vehículo (s)
o excipiente (s) en condiciones estériles.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración oral se pueden presentar en forma de unidades
discretas tales como cápsulas o comprimidos; en forma de polvos o
gránulos; en forma de soluciones, jarabes o suspensiones (en
líquidos acuosos o no acuosos; o en forma de espumas o batidos
comestibles; o en forma de emulsiones). Los excipientes adecuados
para comprimidos o cápsulas de gelatina duras incluyen lactosa,
almidón de maíz o derivados de los mismos, ácido esteárico, o las
sales de los mismos. Los excipientes adecuados para uso con cápsulas
de gelatina blanda incluyen por ejemplo aceites vegetales, ceras,
grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc.
Para la preparación de suspensiones y jarabes los
excipientes que se pueden usar incluye por ejemplo, agua, polioles y
azúcares. Para la preparaciones de suspensiones se pueden usar
aceites (por ejemplo, aceites vegetales) para proporcionar
suspensiones aceite en agua o agua en aceite. Las composiciones
farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica se pueden
presentar en forma de parches discretos destinados a permanecer en
contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un tiempo
prolongado de tiempo. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede
distribuir a partir del parche mediante iontoforesis como se
describe generalmente en Pharmacia Research, 3 (6):
318 (1986). Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración tópica se pueden formular en forma de pomadas,
cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles,
pulverizaciones, aerosoles o aceites. Para las infecciones del ojo u
otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, las composiciones
se aplican preferiblemente en forma de pomada o crema tópica. Cuando
se formula en una pomada, el ingrediente activo se puede emplear con
bien una base parafínica o de pomada miscible en agua. Como
alternativa, el ingrediente activo se puede formular en una crema
con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en
aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la
administración tópica al ojo incluyen gotas de ojos en las que el
ingrediente activo se disuelve o se suspende en un vehículo
adecuado, especialmente un disolvente acuoso. Las composiciones
farmacéuticas adaptadas para administración tópica en la boca
incluyen grageas, pastillas y composiciones de enjuague bucal.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración rectal se pueden presentar en forma de supositorios o
enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para
administración nasal en las que el vehículo es un sólido incluyen un
polvo grueso que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el
intervalo entre 20 y 500 micrómetros que se administra de la manera
en la que se esnifa, es decir, mediante inhalación rápida a través
del paso nasal desde un recipiente en el que se mantiene el polvo
cerrado hasta la nariz. Las composiciones adecuadas en las que el
vehículo es un líquido, para la administración en forma de una
pulverización nasal o en forma de gotas nasales, incluyen soluciones
acuosas u oleosas del ingrediente activo. Las composiciones
farmacéuticas adaptadas para administración mediante inhalación
incluyen polvos en partículas finas o nieblas que se pueden que se
pueden generar por medio de diversos tipos de aerosoles,
nebulizadores o insufladores presurizados de dosis medida. Las
composiciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal se
pueden presentar en forma de formulaciones de pesarios, tampones,
cremas, geles, pastas, espumas o pulverizaciones. Las composiciones
farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen
solución acuosa y no acuosa estéril que pueden contener
antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la
formulación sustancialmente isotónica con la sangre del receptor
propuesto; y las suspensiones acusas y no acuosas estériles que
pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los
excipientes que se pueden usar para soluciones inyectables incluyen,
por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites
vegetales. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de
dosis unitaria o multi-dosis, por ejemplo, ampollas
y viales cerradas, y se pueden almacenar en una condición secada por
congelación (liofilizada) que requiere solamente la adición del
líquido estéril llevado, por ejemplo, agua para inyecciones,
inmediatamente antes de usar. Las soluciones y suspensiones para
inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos,
gránulos y comprimidos estériles.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener
agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes
estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes,
colorantes, perfumes, sales (sustancias de la presente invención se
pueden proporcionar ellas mismas en la forma de una sal
farmacéuticamente aceptable), tampones, agentes de revestimiento o
antioxidantes. También pueden contener agentes terapéuticamente
activos además de la sustancia de la presente invención.
Las dosificaciones de las sustancias de la
presente invención pueden variar entre limites amplios, dependiendo
de la enfermedad o trastorno a tratar, y la edad y condición del
individuo a tratar, etc, y un médico determinará por último las
dosificaciones apropiadas a usar. La dosificación se puede repetir
tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos
secundarios la cantidad y/o frecuencia de la dosificación se puede
reducir, de acuerdo con la práctica clínica normal.
Se pueden usar técnicas de clonación de genes
para proporcionar un sTCR de la invención, preferiblemente en forma
sustancialmente pura. Estas técnicas, se describen, por ejemplo, en
J. Sambrook y col Molecular Cloning edición 2ª, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989). De este modo, en un aspecto
adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia que codifica una cadena del TCR
soluble de la presente invención, o una secuencia complementaria a
ella. Tales secuencias de ácido nucleico se pueden obtener aislando
ácido nucleico que codifica TCR a partir de clones de las células T
y realizando mutaciones apropiadas (mediante inserción, supresión o
sustitución).
La molécula de ácido nucleico puede estar en
forma aislada o recombinante. Se puede incorporar en un vector y el
vector se puede incorporar en una célula hospedadora. Tales vectores
y hospedadores adecuados forman todavía aspectos adicionales de la
presente invención.
La invención también proporciona un procedimiento
para obtener una cadena de TCR y después purificar el
polipéptido.
Los TCR solubles de la presente invenciones
pueden obtener mediante la expresión de una bacteria tal como E.
coli como cuerpos de inclusión, y posterior replegamiento in
vitro.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un procedimiento para obtener un receptor de células T
solubles (sTCR), dicho procedimiento comprende:
incubar una célula hospedadora que comprende un
vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica (i)
todo toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el dominio
transmembrana de la misma, y una célula hospedadora que comprende un
vector que comprende un ácido nucleico que codifica (ii) toda o
parte de una cadena \beta de TCR, excepto el dominio transmembrana
de la misma en condiciones que producen expresión de (i) y (ii), en
el que (i) y (ii) cada uno comprenden un dominio variable funcional
y al menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR;
purificar (i) y (ii); y
mezclar (i) y (ii) en condiciones de
replegamiento de manera que se unen mediante un enlace disulfuro
entre residuos de dominios constantes que no está presente en el TCR
nativo.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona un procedimiento para obtener un receptor de
las células T \alpha\beta soluble (sTCR), dicho procedimiento
comprende:
incubar una célula hospedadora que comprende un
vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una
cadena \alpha de TCR en condiciones que producen la expresión de
las cadenas de TCR respectivas;
purificar las cadenas respectivas de TCR; y
mezclar las cadenas respectivas de TCR en
condiciones de replegamiento de manera que un enlace disulfuro
covalente se une a un residuo de la región inmunológica del dominio
constante de la cadena \beta.
El replegamiento de las cadenas de TCR puede
tener lugar in vitro en condiciones adecuadas de
replegamiento. En una realización particular, un TCR con la correcta
conformación se logra mediante replegamiento de las cadenas de TCR
solubilizadas en un tampón de replegamiento que comprende un agente
solubilizante, por ejemplo urea. De manera ventajosa, la urea puede
estar presente a una concentración de al menos 0,1 M o al menos 1 M
o al menos 2,5 M, o aproximadamente 5 M. Un agente solubilizante
alternativo que se puede usar es guanidina, a una concentración
entre 0,1 M y 8 M, preferiblemente al menos 1 M o al menos 2,5 M.
Antes del replegamiento, se emplea un agente reductor para asegurar
la completa reducción de residuos de cisteína. Se pueden usar, según
se necesiten, agentes desnaturalizantes adicionales tales como DTT y
guanidina. Se pueden usar agentes desnaturalizantes y reductores
diferentes antes de la etapa de replegamiento (por ejemplo, urea,
\beta-mercaptoetanol). Como alternativa se pueden
usar parejas redox durante el replegamiento, tal como una pareja
redox cistamina/cistamina, DDT o
\beta-mercaptoetanol/oxígeno atmosférico, y
cisteína en formas reducidas y oxidadas.
La eficacia de plegamiento también se puede
aumentar mediante la adición de otros ciertos componentes proteicos,
por ejemplo proteínas de chaperona, a la mezcla de replegamiento. El
replegamiento mejorado se ha logrado pasando la proteína a través de
columnas con mini-chaperonas proteína (Altamirano,
y col., (1999). Nature Biotechnology 17:
187-191; Altamirano, y col., (1997). Proc. Natl.
Acad Sci USA 94 (8): 3576-8).
Como alternativa, el TCR de la presente invención
se puede obtener mediante la expresión en un sistema celular
eucariótico, tal como células de insecto.
La purificación del TCR se puede lograr por
muchos medios diferentes. Se pueden emplear modos alternativos de
intercambio iónico o purificación de proteínas tales como
cromatografía por filtración en gel o cromatografía de afinidad.
Los TCR solubles y complejos de TCR multivalentes
de la presente invención también encuentran uso en la selección de
agentes, tales como compuestos químicos pequeños, que tienen la
capacidad de inhibir la unión del TCR a su complejo de pMHC. De este
modo, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un
procedimiento para seleccionar un agente que inhiba la unión de un
receptor de células T a un complejo péptido-MHC, que
comprende el control de la unión de un receptor de células T soluble
de la invención con un complejo péptido-MHC en
presencia de un agente; y agentes de selección que inhiben tal
unión.
Las técnicas adecuadas para tal procedimiento de
selección incluyen el procedimiento basado en resonancia de plasmón
superficial descrita en el documento WO 01/22084. Otras técnicas
bien conocidas que podrían formar la base de este procedimiento de
selección son análisis de centelleo por proximidad (SPA) y ensayo
por proximidad luminiscente amplificado.
Los agentes seleccionados mediante procedimientos
de selección de la invención se pueden usar como fármacos, o como la
base de un programa de desarrollo de fármacos, estando modificado o
de otra manera mejorado para que tenga características que les hace
más adecuados para administración como medicamento. Tales
medicamentos se pueden usar para el tratamiento de afecciones que
incluyen un componente de respuestas de células T no deseado. Tales
afecciones incluyen cáncer (por ejemplo, renal, de ovarios, de
cabeza y cuello, testicular, de pulmón, cervical, de próstata o
melanoma), enfermedad autoinmune, rechazo de injertos y enfermedad
de hospedador frente a injerto.
Las características preferidas de cada aspecto de
la invención son para cada uno de los otros aspectos mutatis
mutandi. Los documentos de la técnica anterior mencionados en
esta memoria descriptiva se incorporan en el máximo grado permitido
por la ley.
La invención se describe adicionalmente en los
siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención de
ninguna manera.
En lo siguiente se hace referencia a los dibujos
acompañantes en los que:
La figura 1 es un diagrama esquemático de un TCR
soluble con un enlace disulfuro intercadena introducido de acuerdo
con la invención:
Las figuras 2 a y 2 b muestran respectivamente
las secuencias de ácido nucleico de las cadenas \alpha y \beta
de un TCR A6 soluble, mutado de manera que introduce un codón de
cisteína. El sombreado indica el codón de cisteína introducido;
La figura 3a muestra la secuencia de aminoácidos
extracelular de la cadena \alpha del TCR A6, incluyendo la
mutación T48 \rightarrow C (subrayada) usada para producir el
enlace intercadena disulfuro novedoso, y la figura 3b muestra la
secuencia de aminoácidos extracelular de la cadena \beta del TCR
A6, incluyendo la mutación S57 \rightarrow C (subrayada) usada
para producir el enlace intercadena disulfuro novedoso;
La figura 4 es una pequeña cantidad obtenida
después de la cromatografía de intercambio aniónico del TCR A6
soluble, que muestra la elución de proteína a partir de una columna
POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl 0-500 mM,
como se indica por la línea de puntos;
Figura 5-A.
SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de las
fracciones del desarrollo de la columna en la figura 4, como se
indica. B. SDS-PAGE no reductor (teñido por
Coomassie) o fracciones de la columna desarrollada en la figura 4,
como se indica. El pico 1 claramente contiene principalmente cadena
\beta unida por puente no disulfuro, el pico 2 contiene
heterodímero de TCR que está unido por disulfuro intercadena, y el
hombro se debe a contaminantes de E. coli, en mezcla con el
sTCR unido con disulfuro intercadena, que es escasamente visible
tras esta reproducción;
La figura 6 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía de tamaño por exclusión de fracciones
reunidas del pico 1 en la figura 5. La proteína eluye en forma de un
único pico principal, correspondiente al heterodímero;
La figura 7 es una curva de respuesta BIAcore de
la unión específica del TCR soluble A6 unido por disulfuro al
complejo HLA-A2 tax. La inserción muestra la
respuesta de unión comparada con el control para una sola inyección
de TCR soluble A6 unido por disulfuro;
La figura 8a muestra la secuencia de la cadena
\alpha del TCR A6 que incluye el residuo de cisteína novedoso
mutado para incorporar un sitio de restricción BamH1. El sombreado
indica las mutaciones introducidas para formar el sitio de
restricción BamH1. Las figuras 8b y 8c muestran la secuencia de ADN
de la cadena \alpha y \beta del TCR JM22 mutado para incluir
residuos de cisteína adicionales para formar un enlace disulfuro no
nativo;
Las figuras 9a y 9b muestran respectivamente las
secuencias de aminoácidos extracelulares de las cadenas \alpha y
\beta del TCR JM22 producidas a partir de lasa secuencias de ADN
de las figuras 8a y 8b;
La figura 10 es una pequeña cantidad obtenida
después de la cromatografía de intercambio aniónico del TCR JM22
unido por disulfuro soluble que muestra elución de proteína a partir
de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl
0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;
La figura 11a muestra un SDS-PAGE
reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones de la columna
desarrollada en la figura 10, como se indica y la figura 11b muestra
un SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de
las fracciones de la columna desarrollada en la figura 10, como
indica. El pico 1 claramente contiene el heterodímero TCR que está
unido por disulfuro intercadena.
La figura 12 es una pequeña cantidad obtenida de
la cromatografía de exclusión por tamaño de las fracciones del pico
1 en la figura 10. La proteína eluye como un solo pico principal al
heterodímero. El rendimiento es 80%;
Figura 13-A. Curva respuesta
BIAcore de la unión específica del TCR soluble JM22 unido por
disulfuro al complejo HLA-Flu. B. Respuesta de unión
comparada con el control para una sola inyección de TCR soluble JM22
unido por disulfuro;
Las figuras 14a y 14b muestran la secuencia de
ADN de la cadena \alpha y \beta del NY-ESO
mutado que incluye residuos cisteína adicionales para formar un
enlace disulfuro no nativo;
Las figuras 15a y 15b muestran respectivamente
las secuencias de aminoácidos de las cadenas \alpha y \beta del
TCR NY-ESO producidas a partir de las secuencias de
ADN de las figuras 14a y 14b;
La figura 16 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de una cromatografía de intercambio aniónico del TCR unido
por disulfuro NY-ESO soluble que muestra la elución
de proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente
de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de
puntos;
Figura 17-A.
SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de las
fracciones de la columna desarrollada en la figura 16, como se
indica B. SDS-PAGE no reductor (teñido por
Coomassie) de las fracciones de la columna desarrollada en la figura
16, como indica. El pico 1 y 2 claramente contienen el heterodímero
TCR que está unido por disulfuro intercadena.
Figura 18. Cromatografía de tamaño por exclusión
de las fracciones reunidas del pico 1 (A) y el pico (B) en al
figura 17. La proteína eluye como un solo pico principal,
correspondiente al heterodímero;
La figura 19 muestra una curva de respuesta
BIAcore de la unión específica de TCR soluble NY-ESO
unido por disulfuro al complejo HLA-NYESO. A. Pico
1, B. pico 2;
Las figuras 20a y 29b muestran respectivamente
las secuencias de ADN de las cadenas \alpha y \beta de un TCR
NY-ESO soluble, mutado de manera que introduce un
codón de cisteína novedoso (indicado por sombreado). Las secuencias
incluyen la cisteína implicada en el enlace intercadena disulfuro
nativo (indicado por el codón en letra negrita);
Las figuras 21a y 21b muestran respectivamente
las secuencias de aminoácidos extracelulares de las cadenas \alpha
y \beta del TCR NY-ESO producidas a partir de las
secuencias de ADN de las figuras 20a y 21b;
La figura 22 muestra una pequeña cantidad
obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del
TCR\alpha^{cys} \beta^{cys} NY-ESO que
muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ
usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica
por la línea de puntos;
La figura 23 muestra una pequeña cantidad
obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del
TCR\alpha^{cys} NY-ESO que muestra la elución de
proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de
NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de
puntos;
La figura 24 muestra una pequeña cantidad
obtenida a partir de una cromatografía de intercambio aniónico del
TCR \beta^{cys} NY-ESO que muestra la elución de
proteína a partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de
NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de
puntos;
La figura 25 muestra un SDS-PAGE
reductor (teñido por Coomassie) de las fracciones
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y
TCR\beta^{cys} NY-ESO a partir de los
desarrollos de la columna de intercambio aniónico en las figuras
22-24 respectivamente. Las bandas 1 y 7 son
marcadores de peso molecular, la banda 2 es el pico NYESOdsTCR1g4
\alpha-cys \beta (EB/084/033); la banda 3 es el
pico pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta
(EB/084/033), la banda 4 es NYESOdsTCR1g4 \alpha
\beta-cys (EB/084/034); la banda 5 es el pico
pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys
\beta-cys (EB/084/035), y la banda 6 es el pico
NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys
\beta-cys (EB/084/035);
La figura 26 muestra un SDS-PAGE
no-reductor (teñido por Coomassie) de
NY-ESO de las fracciones
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y
TCR\beta^{cys} NY-ESO a partir de los
desarrollos de la columna de intercambio aniónico en las figuras
22-24 respectivamente. Las bandas 1 y 7 son
marcadores de peso molecular, la banda 2 es el pico NYESOdsTCR1g4
\alpha-cys \beta (EB/084/033); la banda 3 es el
pico pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys \beta
(EB/084/033), la banda 4 es NYESOdsTCR1g4 \alpha
\beta-cys (EB/084/034); la banda 5 es el pico
pequeño NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys
\beta-cys (EB/084/035), y la banda 6 es el pico
NYESOdsTCR1g4 \alpha-cys
\beta-cys (EB/084/035);
La figura 27 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de una cromatografía de intercambio aniónico del
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys} NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína de la figura 22. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys} NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína de la figura 22. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;
La figura 28 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de una cromatografía de intercambio aniónico del
TCR\alpha^{cys}
NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína a partir de la figura 22. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;
NY-ESO soluble que muestra la elución de proteína a partir de la figura 22. La proteína eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;
La figura 29 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de una cromatografía de intercambio aniónico del
TCR\beta^{cys} NY-ESO soluble que muestra la
elución de proteína de la figura 22. La proteína eluye en forma de
un solo pico principal, correspondiente al heterodímero;
La figura 30 es una curva respuesta de la unión
específica del TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}
NY-ESO al complejo
HLA-NY-ESO;
La figura 31 es una curva respuesta de la unión
específica del TCR\alpha^{cys}NY-ESO al complejo
HLA-NY-ESO;
La figura 32 es una curva respuesta de la unión
específica del TCR\beta^{cys}NY-ESO al complejo
HLA-NY-ESO;
Las figuras 33a y 33b muestran respectivamente
las secuencias de ADN de las cadenas \alpha y \beta del TCR
AH-1.23, mutado de manera que introduzca un codón de
cisteína novedoso (indicado por el sombreado). Las secuencias
incluyen la cisteína implicada en el enlace intercadena disulfuro
nativo (indicado por el codón en letra negrita)
La figura 34a y 34b muestra respectivamente las
secuencias de aminoácidos de las cadenas \alpha y \beta del TCR
AH-1.23 producido a partir de las secuencias de ADN
de las figuras 33a y 33b;
La figura 35 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía de intercambio aniónico del TCR
AH-1.23 soluble, que muestra la elución de proteína
a partir de una columna POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl
0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;
La figura 36 es un SDS-PAGE
reductor (Bis-Tris gel al 10%, teñido por Coomassie)
de las fracciones AH-1.23 a partir del desarrollo de
una columna de intercambio aniónico en la figura 35. Las proteínas
examinadas son las fracciones de intercambio aniónico de TCR 1.23
S-S de replegado 3. La banda 1 es marcadores de peso
molecular, la banda 2 es B4, la banda 3 es C2, la banda 4 es C3, la
banda 5 es C4, la banda 6 es C5, la banda 7 es C6, la banda 8 es C7,
la banda 9 es C8, y la banda 10 es C9.
La figura 37 es un SDS-PAGE
no-reductor (Bis-Tris gel al 10%,
teñido por Coomassie) de las fracciones AH-1.23 a
partir del desarrollo de una columna de intercambio aniónico en la
figura 35. Las proteínas examinadas son las fracciones de
intercambio aniónico de TCR 1.23 S-S de replegado 3.
La banda 1 es marcadores de peso molecular, la banda 2 es B4, la
banda 3 es C2, la banda 4 es C3, la banda 5 es C4, la banda 6 es C5,
la banda 7 es C6, la banda 8 es C7, la banda 9 es C8, y la banda 10
es C9.
La figura 38 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía de intercambio por exclusión de tamaño
del TCR AH-1.23 soluble, que muestra la elución de
proteína de las fracciones reunidas de la figura 35. La proteína
eluye en forma de un solo pico principal, correspondiente al
heterodímero;
Las figuras 39a y 39b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 48 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 40a y 40b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 45 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 41a y 41b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 61 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 42a y 42b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 50 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 43a y 43b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 10 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 44a y 44b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 15 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 45a y 45b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 12 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 46a y 46b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 22 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 47a y 47b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 52 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 48a y 48b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 43 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 49a y 49b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \alpha de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 57 en el exón 1 de TRAC*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 50a y 50b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 77 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 51a y 51b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 77 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 52a y 52b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 13 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 53a y 53b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 59 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 54a y 54b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 79 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 55a y 55b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 14 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 56a y 56b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 55 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 57a y 57b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 63 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 58a y 58b muestra respectivamente las
secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena \beta de un TCR A6
soluble, mutado de manera que se introduce una cisteína nueva en el
residuo 15 en el exón 1 de TRBC2*01. Los nucleótidos sombreados
indican el codón de cisteína nuevo introducido y el aminoácido
subrayado indica la cisteína introducida;
Las figuras 59-64 son pequeñas
cantidades obtenidas a partir de la cromatografía de intercambio
aniónico del TCR A6 soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro novedoso entre: los residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57
del exón 1 de TRBC2*01; residuos 45 del exón 1 del TRAC*01 y 77 del
exón 1 de TRBC2*01; residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17 del exón
1 de TRBC2*01; residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y exón 59 de
TRBC2*01; residuos 52 del exón 1 del TRAC*01 y 55 del exón 1 de
TRBC2*01; residuos 15 del exón 1 de TRAC*01 y 15 del exón 1 de
TRBC2*01, respectivamente, que muestra la elución de proteína a
partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl
0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;
Las figuras 65a y 65b son, respectivamente,
SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por
Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro novedoso entre los residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57
del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron
del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura
59;
Las figuras 66a y 66b son, respectivamente,
SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por
Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro novedosos entre los residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 77
del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron
del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura
60;
Las figuras 67a y 67b son, respectivamente,
SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por
Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro novedosos entre los residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17
del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron
del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura
61;
Las figuras 68a y 68b son, respectivamente,
SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por
Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro novedosos entre los residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 59
del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron
del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura
62;
Las figuras 69a y 69b son, respectivamente,
SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por
Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro novedosos entre los residuos 52 del exón 1 de TRAC*01 y 55
del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron
del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura
63;
Las figuras 70a y 70b son, respectivamente,
SDS-PAGE reductor y no reductor (teñidos por
Coomassie) de TRC A6 soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro novedosos entre los residuos 15 del exón 1 de TRAC*01 y 15
del exón 1 de TRBC2*01, las fracciones desarrolladas se recogieron
del desarrollo de la columna de intercambio aniónico en la figura
64;
La figura 71 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble
que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre los
residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57 del exón 1 de TRBC2*01, que
muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel
Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir
de una columna de intercambio aniónico en la figura 59;
La figura 72 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble
que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los
residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 77 del exón 1 de TRBC2*01, que
muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel
Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir
de una columna de intercambio aniónico en la figura 60;
La figura 73 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble
que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los
residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17 del exón 1 de TRBC2*01, que
muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel
Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir
de una columna de intercambio aniónico en la figura 61;
La figura 74 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble
que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los
residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y 59 del exón 1 de TRBC2*01, que
muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel
Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir
de una columna de intercambio aniónico en la figura 62;
La figura 75 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble
que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los
residuos 52 del exón 1 de TRAC*01 y 55 del exón 1 de TRBC2*01, que
muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel
Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir
de una columna de intercambio aniónico en la figura 63;
La figura 76 es una pequeña cantidad obtenida a
partir de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRC A6 soluble
que contiene un enlace intercadena disulfuro novedosos entre los
residuos 15 del exón 1 de TRAC*01 y 15 del exón 1 de TRBC2*01, que
muestra la elución de proteína de una columna de filtración en gel
Superdex 200 HL. Las fracciones desarrolladas se recogieron a partir
de una columna de intercambio aniónico en la figura 64; y
Las figuras 77-80 son curvas
respuesta BIAcore que muestran, respectivamente, la unión de TCR A6
soluble que contiene un enlace intercadena disulfuro novedoso entre:
los residuos 48 del exón 1 de TRAC*01 y 57 del exón 1 de TRBC2*01;
residuos 45 del exón 1 del TRAC*01 y 77 del exón 1 de TRBC2*01;
residuos 10 del exón 1 de TRAC*01 y 17 del exón 1 de TRBC2*01; y
residuos 45 del exón 1 de TRAC*01 y exón 59 de TRBC2*01 a
HLA-A2-tax pMHC.
La figura 81 en una pequeña cantidad de BIAcore
que muestra la unión no específica de TCR A6 soluble que contiene un
enlace intercadena disulfuro novedoso entre los residuos 52 del exón
1 de TRAC*01 y 55 del exón 1 de TRBC2*01 a
HLA-A2-tax y a
HLA-A2-NY-ESO
pMHC;
La figura 82 en una curva respuesta de BIAcore
que muestra la unión de TCR A6 soluble que contiene un enlace
intercadena disulfuro novedoso entre los residuos 15 del exón 1 de
TRAC*01 y 15 del exón 1 de TRBC2*01 a
HLA-A2-tax pMHC;
La figura 83a es un mapa de densidad electrónica
alrededor del modelo con secuencia 1BD2 (cadena A Thr 164, cadena B
Ser 174). El mapa trazado en 1,0, 2,0 y 3,0 \sigma. La figura 83 b
es un mapa de densidad electrónica después de refinamiento con Cys
en las dos posiciones A164 y B174. El mapa está trazado en los
mismos niveles de \sigma que en la figura 83a;
La figura 84 compara las estructuras del TCR 1BD2
con un TCR NY-ESO de la presente invención mediante
solapamiento de dichas estructuras en las representaciones de banda
y espiral;
Las figuras 85a y 85b muestran las secuencias de
aminoácidos y ADN respectivamente de la cadena \beta del TCR
NY-ESO que incorpora un sitio de reconocimiento de
biotina. El sitio de reconocimiento de biotina está subrayado;
Las figuras 86a y 86b muestran las secuencias de
aminoácidos y ADN respectivamente de la cadena \beta del TCR
NY-ESO que incorpora la diana
hexa-histidina. La diana
hexa-histidina está subrayada;
La figura 87 ilustra la elución de TCR
NY-ESO soluble que contiene un enlace disulfuro
novedoso y una secuencia de reconocimiento de biotina a partir de
una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ que usa un gradiente
de NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de
puntos;
La figura 88 ilustra la elución de TCR
NY-ESO soluble que contiene un enlace disulfuro
novedoso y una marca hexa-histidina a partir de una
columna de intercambio aniónico POROS 50HQ que usa un gradiente de
NaCl 0-500 mM, como se indica por la línea de
puntos;
La figura 89 es un perfil de elución de proteína
a partir de una cromatografía de filtración en gel de fracciones
reunidas a partir del desarrollo de la columna de intercambio
aniónico de NY-ESO-biotina marcado
ilustrado en la figura 87;
La figura 90 es un perfil de elución de proteína
a partir de una cromatografía de filtración en gel de fracciones
reunidas a partir del desarrollo de la en columna de intercambio
aniónico de
NY-ESO-hexa-histidina
marcado ilustrado en la figura 88;
Las figuras 91a-h son histogramas
FACS que ilustran la intensidad de tinción producida a partir de
25.000 casos para la línea celular B transformada por EBV positivo
HLA-A2 (PP LCL) incubada con las siguientes
concentraciones de tetrámeros de TCR NY-ESO péptido
y NY-ESO fluorescente respectivamente: TCR 0 NYESO 5
\mug, TCR 10^{-4} M NYESO 5 \mug, TCR 10^{-5} M NYESO 5
\mug, TCR 10^{-6} M NYESO 5 \mug, TCR 0 NYESO 10 \mug, TCR
10^{-4} M NYESO 10 \mug, TCR 10^{-5} M NYESO 10 \mug, TCR
10^{-6} M NYESO 10 \mug;
La figura 92 es la secuencia de ADN de la cadena
beta de TCR A6 que incorpora la región constante TRBC*01;
La figura 93 es una pequeña cantidad de
cromatografía de intercambio aniónico de TCR A6 que incorpora la
región constante TRBC1*01 que muestra la elución de proteína de una
columna POROS 50HQ que usa un gradiente de NaCl
0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;
Figura 94-A.
SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de
fracciones de la columna desarrollada en la figura 93. B.
SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de las
fracciones de la columna desarrollada en la figura 93, como se
indica;
Figura 95-cromatografía por
exclusión de tamaño de las fracciones reunidas del pico 2 en la
figura 93. El pico 1 contiene el heterodímero TCR que está unido por
disulfuro intercadena;
Figura 96-A. Análisis BIAcore de
la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a complejo
HLA-Flu. B. Respuesta de unión comparada con el
control para una sola inyección de TCR soluble A6 unido por
disulfuro;
La figura 97 muestra la secuencia de ácido
nucleico de la cadena beta mutada del TCR A6 que incorpora la
cisteína "libre";
Figura 98 - cromatografía de intercambio aniónico
del TCR A6 soluble que incorpora la cisteína "libre" que
muestra la elución de proteína a partir de una columna POROS 50HQ
usando un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica
por la línea de puntos;
Figura 99-A.
SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de
fracciones de la columna desarrollada en al figura 98, como se
indica. B. SDS-PAGE no reductor (teñido por
Coomassie) de fracciones de la columna desarrollada en al figura 98,
como se indica.
Figura 100 - cromatografía por exclusión de
tamaño de las fracciones reunidas del pico 2 en la figura 98. El
pico 1 contiene el heterodímero TCR que es que está unido por
disulfuro intercadena;
Figura 101-A. Análisis BIAcore de
la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro que
incorpora la cisteína "libre" a complejo
HLA-Flu. B. Respuesta de unión comparada con el
control para una sola inyección de TCR soluble A6 unido por
disulfuro;
La figura 102 muestra al secuencia de ácido
nucleico de la cadena beta mutada del TCR A6 que incorpora un
residuo serina mutado para la cisteína "libre";
Figura 103 - cromatografía de intercambio
aniónico de TCR A6 soluble que incorpora un residuo serina mutado en
la cisteína "libre" que muestra la elución de proteína a partir
de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl
0-500 mM, como se indica por la línea de puntos;
Figura 104-A.
SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) de
fracciones de la columna desarrollada en al figura 103, como se
indica. B. SDS-PAGE no reductor (teñido por
Coomassie) de fracciones de la columna desarrollada en al figura
103, como se indica. El pico 2 claramente contiene el heterodímero
TCR que está unido por disulfuro intercadena.
Figura 105 - cromatografía por exclusión de
tamaño de las fracciones reunidas del pico 2 en la figura 103. El
pico 1 contiene el heterodímero TCR que es que está unido por
disulfuro intercadena;
Figura 106-A. Análisis BIAcore de
la unión específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro que
incorpora un residuo serina mutado por la cisteína "libre" a
complejo HLA-Flu. B. Respuesta de unión comparada
con el control para una sola inyección de TCR soluble A6 unido por
disulfuro;
La figura 107 muestra la secuencia de nucleótidos
de pYX112;
La figura 108 muestra la secuencia de nucleótidos
de pYX122;
La figura 109 muestra la secuencias de ADN y
proteína del factor alfa de pre - pro apareamiento condensado a la
cadena \alpha de TCR;
La figura 110 muestra la secuencias de ADN y
proteína del factor alfa de pre - pro apareamiento condensado a la
cadena \beta de TCR;
La figura 111 muestra una transferencia de
Western de TCR soluble en la cepa SEY62510 de S. cerevisiae.
La banda C contiene 60 ng de TCR NY-ESO soluble
purificado como control. Las bandas 1 y 2 contienen las proteínas
recogidas de los dos cultivos de levaduras transformados de TCR
separados;
La figura 112 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos del KpnI a la inserción EcoRI del plásmido pEX172. El
resto del plásmido es pBluescript II KS-;
La figura 113 es un diagrama esquemático de las
cadenas de TCR para clonación en baculovirus;
La figura 114 muestra la secuencia de ácido
nucleico de la construcción de TCR \alpha A6 disulfuro como una
inserción BamHI para la inserción en el plásmido de expresión
pAcAB3;
La figura 115 muestra la construcción de TCR
\beta A6 como una inserción en el plásmido de expresión pAcAB3;
y
La figura 116 muestra un gel teñido por Coomassie
y transferencia de Western contra el TCR A6 disulfuro producido
bacterianamente y el TCR A6 disulfuro de insecto.
En todos los siguientes exactos, salvo que se
establezca de otra manera, las cadenas de TCR producidos están
truncados inmediatamente C-terminal a los residuos
cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo.
Para mutar la treonina 48 de Tax A6 del exón 1 en
TRAC*01 a cisteína, se diseñaron los siguientes cebadores (mutación
mostrada en el caso más abajo)
5'-C ACA GAC AAA
tgT GTG CTA GAC
AT
5'-AT GTC TAG CAG
Aca TTT GTC TGT
G
Para mutar la serina 57 de Tax A6 del exón 1 en
tanto TRBC1*01 como TRBC2*01 a cisteína, se diseñaron los siguientes
cebadores (mutación mostrada en el caso más abajo)
5'-C AGT GGG GTC
tGC ACA GAC
GC
5'-GG GTC TGT GCa
GAC CCC ACT
G
La expresión de los plásmidos que contienen los
genes para la cadena \alpha y \beta del TCR A6 Tax se mutaron
usando los cebadores de la cadena \alpha o los cebadores de la
cadena \beta respectivamente, como sigue. 100 ng del plásmido se
mezclaron con 5 \mu de dNTP 10 mM, 25 \mul de tampón 10xPfu
(Stratagene), 10 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene) y el
volumen final se ajustó hasta 240 \mul con H_{2}O. 48 \mul de
esta mezcla se suplementó con cebadores diluidos para proporcionar
una concentración final de 0,2 \muM en 50 \mul de volumen de
reacción final. Después de una etapa de desnaturalización inicial de
30 segundos a 95ºC, la mezcla de reacción se sometió a 15 rondas de
desnaturalización (95ºC, 30 segundos), hibridación (55ºC, 60
segundos), y elongación (73ºC, 8 minutos) en una máquina de PCR
exprés Hybaid PCR. Después el producto se digirió durante 5 horas a
37ºC con 10 unidades de enzima de restricción Dpnl (New England
Biolabs). 10 \mul de la reacción digerida se transformó en
bacteria XL1-Blue competente y se hizo crecer
durante 18 horas a 37ºC. Se cogió una colonia individual y se hizo
crecer durante toda una noche en 5 ml de YTP + ampicilina (16 g/l de
Bacto-Tristona, 16 g/l de extracto de levadura, 5
g/l de Na ClNa, 2,5 de K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El
ADN de plásmido se purificó en una columna de Qiagen
mini-prep según las instrucciones del fabricante y
la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en las
instalaciones de secuenciación del departamento de bioquímica de la
Universidad de Oxford. Las secuencias respectivas de aminoácidos y
ADN se muestran en las figuras 2a y 3a para la cadena \alpha y las
figuras 2b y 3b para la cadena \beta.
Los plásmidos de expresión que contienen la
cadena \alpha y la cadena \beta respectivamente se transformaron
separadamente en la cepa de E. coli BL2pLysS, y las colonias
individuales resistentes a ampicilina se hicieron crecer a 37ºC en
medio TYP (100 \mug/ml de ampicilina) hasta una DO_{600} de 0,4
antes de inducir la expresión de proteína con IPGT 0,5 mM. Las
células se recogieron tres horas después de la inducción mediante
centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman
J-6B. Los sedimentos celulares se volvieron a
suspender en un tampón que contenía Tris 50 mM - HCl, sacarosa al
25% (p/v), Na EDTA 1 mM, NaAzida al 0,1% (p/v), DTT 10 mM, pH 8,0.
Después de toda una noche de etapa de
congelación-descongelación las células se sonicaron
en impulsos de 1 minuto durante un total de aproximadamente 10
minutos en un sonicador Milsonix XL2020 usando una sonda de 12 mm de
diámetro convencional. Los sedimentos de los cuerpos de inclusión se
recuperaron mediante centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm
en una centrífuga Beckman J2-21. Se llevaron a cabo
tres lavados de detergente para retirar los desechos celulares y
componentes de membrana. Cada momento el sedimento de los cuerpos de
inclusión se homogenizó en un tampón Triton (Tris 50 mM - HCl,
Triton-X100 al 0,5%, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM,
NaAzida al 0,1% (p/v), DTT 2 mM, pH 8,0) antes de sedimentarse
mediante centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en un Beckman
J2-21. Después se retiró la sal y detergente
mediante un lavado similar en el siguiente tampón: Tris 50 mM - HCl,
NaEDTA 1 mM, NaAzida al 0,1% (p/v), DTT 2 mM, pH 8,0. Finalmente,
los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se
congelaron a -70ºC. La proteína de los cuerpos de inclusión
producida se cuantificó solubilizando con guanidina 6 M - HCl y la
medición con un ensayo de unión a tinte Bradford (PerBio).
Aproximadamente 30 mg (es decir, 1 \mumol) de
cada cadena de cuerpos de inclusión solubilizada se descongeló de
las existencias congeladas, después se mezclaron muestras y la
mezcla se diluyó en 15 ml de una solución de guanidina (guanidina 6
M - clorhidrato, acetato sódico 10 mM, EDTA 10 mM), para asegurar la
desnaturalización de la cadena completa. La solución de guanidina
que contiene las cadenas de TCR reducidas y desnaturalizadas
completamente se inyectaron después en 1 litro del siguiente tampón
de replegamiento: Tris 100 mM pH 8,5, L-Arginina 400
mM, EDTA 2 mM, glutatión 5 mM reducido, glutatión oxidado 0,5 mM,
urea 5 M, PMSF 0,2 mM. La solución se dejó durante 24 horas. Después
el replegamiento se dializó dos veces, primeramente contra 10 litros
de urea 100 mM, en segundo lugar contra 10 litros de urea 100 mM,
tris 10 mM pH 8,0: Tanto la etapa de replegamiento como la de
diálisis se llevaron a cabo a 6-8ºC.
sTCR se separó de los productos de degradación e
impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de
intercambio aniónico POROS 50 HQ y eluyendo la proteína unida con un
gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de
columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura 4.
Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se analizaron
mediante SDS-PAGE teñido por Coomassie (figura 5)
antes de reunirse y concentrarse. Finalmente el sTCR se purificó y
caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR
(figura 6) preequilibrada en tampón HBS-EP (HEPES 10
mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 al 0,05%). El pico
que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se
reunió y se concentró antes de caracterización por análisis de
resonancia de plasmón superficial BIAcore.
Se uso un biosensor de resonancia de plasmón
superficial (BIAcore 3000™) para analizar la unión de un sTCR a su
ligando péptido-MHC. Esto se facilitó por la
producción de complejos individuales pMHC (descritos más adelante)
que se inmovilizaron a una superficie de unión revestida por
estreptavidina de una manera semiorientada, que permite el análisis
eficaz de la unión de un receptor de células T soluble hasta a
cuatro pMHC diferentes (células de flujo inmovilizadas o separadas)
simultáneamente. La inyección manual de complejo de HlA permite el
nivel preciso de moléculas de la clase I inmovilizada que se va a
manipular fácilmente.
Tales complejos inmovilizados son capaces de
unirse a tanto los receptores de las células T como el correceptor
CD8\alpha\alpha, los cuales se pueden inyectar en la fase
soluble. La unión específica de TCR se obtiene incluso a bajas
concentraciones (al menos 40 \mug/ml), que implica que el TCR es
relativamente estable. Las propiedades de unión de pMHC del sTCR se
observan que son cualitativamente y cuantitativamente similares si
se usa sTCR bien en la fase soluble o en la inmovilizada. Esto es un
control importante para la actividad parcial de especies solubles y
también sugiere que los complejos pMHC biotinilados son
biológicamente tan activos como los complejos no biotinilados.
Los complejos
HLA-A2-péptido de la clase I
biotinilada se replegaron in vitro a partir de cuerpos de
inclusión expresados bacterianamente que contienen las proteínas de
las susbunidades constituyentes y péptido sintético, seguido de la
purificación y biotinilación enzimática in vitro (O'Callaghan
y col., (1999) Anal Biochem. 266:
9-15). La cadena pesada de HLA se expresó con una
marca de biotinilación C-terminal que reemplaza los
dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína en una
construcción apropiada. Se obtuvieron niveles de expresión de los
cuerpos de inclusión de aproximadamente 75 mg/litro de cultivo
bacteriano. También se expresó la cadena ligera de HLA o la
microglobulina \beta2 como cuerpos de inclusión en E. coli
a partir de una construcción apropiada, a un nivel de
aproximadamente 500 mg/litro de cultivo bacteriano.
Se lisaron células de E. coli y los
cuerpos de inclusión se purificaron hasta aproximadamente 80% de
pureza. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnaturalizaron
en guanidina 6 M, - HCl, Tris 50 mM pH 8,0,NaCl 100 mM, DTT 10 mM,
EDTA 10 mM, y se replegó a una concentración de 30 mg/litro de
cadena pesada, 30 mg/litro de \beta2 en L-arginina
0,4 M - HCl, Tris 100 mM pH 8,1, cistamina 3,7 mM, cistamina 0M, 4
mg/ml de péptido (por ejemplo, tax 11-19), mediante
la adición de un solo pulso de proteína desnaturalizada en tampón de
replegado a < 5ºC. El replegamiento se dejó que alcanzara la
terminación a 4ºC durante al menos 1 hora.
El tampón se intercambió mediante diálisis en 10
volúmenes de Tris 10 mM pH 8,1. Fueron necesarios dos cambios de
tampón para reducir la resistencia iónica de la solución de manera
suficiente. La solución de proteína se filtró después a través de
filtro de acetato de celulosa de 1,5 \mum y se cargó en una
columna de intercambio aniónico POROS 50HQ (8 ml de volumen de
lecho). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl
0-500 mM. El complejo
HLA-A2-péptido eluyó a
aproximadamente NaCl 250 mM, y se recogieron las fracciones pico, se
añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem) y las
fracciones se enfriaron en hielo.
Los complejos de HLA marcados por bionialción se
intercambiaron en tampón en Tris 10 mM pH 8,1, NaCl 5 mM usando una
columna desaladora ultra-rápida de Pharmacia
equilibrada en el mismo tampón. Inmediatamente después de la
elución, las fracciones que contienen proteínas se enfriaron sobre
hielo y se añadió el cóctel de inhibidores de proteasas
(Calbiochem). Después se añadieron reactivos de biotinilación:
biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado hasta pH 8), MgCl_{2} 7,5 mM y 5
\mug/ml de enzima BirA (purificada según O'Callaghan y col.,
(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15).
Después la mezcla se dejo que se incubara a temperatura ambiente
durante toda una noche.
Los complejos de HLA biotinilados se purificaron
usando cromatografía de filtración sobre gel. Una columna Superdex
75 HR 10/30 de Pharmacia se preequilibró con PBS filtrado y se cargó
1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación y la columna se
desarrolló con PBS a 0,5 ml/min. Los complejos de HLA biotinilados
eluidos en forma de un solo pico a aproximadamente 15 ml. Las
fracciones que contenían proteína se reunieron, se enfriaron en
hielo, y se añadió el cóctel de inhibidores de proteasas. La
concentración de proteína se determinó usando un ensayo de unión de
Coomassie (PerBio) y se almacenaron congelados complejos de HLA
biotinilados a -20ºC. Se inmovilizó estreptavidina mediante
procedimientos de acoplamiento de amina normalizados.
Las interacciones entre sTCR A6 Tax que contenía
un enlace intercadena novedoso y su complejo ligando/MHC o una
combinación HLA-péptido irrelevante, la producción
de los cuales se ha descrito anteriormente, se analizaron en un
biosensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) BIAcore 3000™.
SPR mide los cambios en los índices de refracción expresados en
unidades de respuesta (RU) cerca de una superficie sensora dentro
de una célula de flujo pequeño, un principio que se puede usar para
detectar interacciones de receptor de ligando y analizar su afinidad
y parámetros cinéticos. Las células de flujo de sonda se prepararon
inmovilizando los complejos individuales HLA-péptido
en células de flujo separadas mediante la unión entre la biotina
entrecruzada en \beta2m y estreptavidina que se había entrecruzado
químicamente a la superficie activa de las células de flujo. Después
el ensayo se realizó mediante pase de sTCR en las superficies de las
diferentes células de flujo a un caudal constante, midiendo la
respuesta de SPR haciendo esto. Inicialmente, la especificidad de la
interacción se verificó pasando sTCR a un flujo constante de 5
\mul/min sobre dos superficies diferentes; uno revestido con
aproximadamente 5000 RU de complejo péptido-HLA
específico, el segundo revestido con aproximadamente 5000 RU de
complejo-péptido HLA no específico (inserción en la
figura 7): Las inyecciones de sTCR soluble a un caudal constante y
diferentes concentraciones sobre el complejo
péptido-HLA se usaron para definir la resonancia de
fondo. Los valores de estas mediciones de control se sustrajeron de
los valores obtenidos con complejo péptido-HLA
específico y se usaron para calcular las afinidades de unión
expresadas como la constante de disociación, Kd (Price y Dwek,
Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemist
(edición 2ª) 1979, Clarendon Press, Oxford), como en la figura
7.
El valor de Kd obtenido (1,8 \muM) está cerca
del reseñado para la interacción entre el sTCR A6 Tax sin el enlace
disulfuro novedoso y pMHC (0,91 \muM - Ding y col., 1999,
Immunity 11: 45-56).
La cadena \beta del TCR A6 soluble preparada en
el ejemplo 1 contiene en la secuencia un sitio de restricción BgIII
(AAGCTT) adecuado para uso como sitio de ligación.
La mutagénesis por PCR se llevó a cabo como se
detalla más adelante para introducir un sitio de restricción BamH1
(GGATCC) en la cadena \alpha del TCR A6 soluble, 5' del codón de
cisteína novedosos. La secuencia descrita en al figura 2a se usó
como molde para esta mutagénesis. Se usaron los siguientes
cebadores:
Se mezclaron 100 ng del plásmido con 5 \mul de
dNTP 10 mM, 25 \mul de tampón 10xPfu (Stratagene), 10 unidades de
Pfu polimerada (Stratagene) y el volumen final se ajustó hasta 240
\mul con H_{2}O. Se suplementaron 48 \mul de esta mezcla con
cebadores diluidos para proporcionar una concentración final de 0,2
\muM en 50 \mul de volumen de reacción final. Después de una
etapa de desnaturalización inicial de 30 segundos a 95ºC, la mezcla
de reacción se sometió a 15 rondas de desnaturalización (95ºC, 30
segundos), hibridación (55ºC, 60 segundos), y elongación (73ºC, 8
minutos) en una máquina de PCR exprés Hybaid PCR. Después el
producto se digirió durante 5 horas a 37ºC con 10 unidades de enzima
de restricción Dpnl (New England Biolabs). 10 \mul de la reacción
digerida se transformó en bacteria XL1-Blue
competente y se hizo crecer durante 18 horas a 37ºC. Se cogió una
colonia individual y se hizo crecer durante toda una noche en 5 ml
de YTP + ampicilina (16 g/l de Bacto-Tristona, 16
g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 2,5 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El ADN de plásmido se
purificó en una columna de Qiagen mini-prep según
las instrucciones del fabricante y la secuencia se verificó mediante
secuenciación automática en las instalaciones de secuenciación del
departamento de bioquímica de la Universidad de Oxford. Las
mutaciones introducidas en la cadena \alpha se "silenciaron",
por lo tanto las secuencias de aminoácidos de esta cadena
permanecían sin cambiar a partir de lo detallado en la figura 3a. La
secuencia de ADN para la cadena \alpha mutada se muestra en la
figura 8a.
Con el fin de producir un TCR Jm22 soluble que
incorpora un enlace disulfuro novedoso, los plásmidos de TCR A6 que
contienen los sitios de restricción de la cadena \alpha BamH1 y
BgIII de la cadena \beta.se usaron como moldes. Se usaron los
siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Las construcciones TCR JM22 de las cadenas
\alpha y \beta se obtuvieron mediante clonación por PCR como
sigue. Las reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como
se ha mostrado anteriormente, y moldes que contienen las cadenas del
TCR JM22. Los productos de PCR se digirieron por restricción con las
enzimas de restricción relevantes, y se clonaron en pGMT7 para
obtener plásmidos de expresión. La secuencia de las inserciones del
plásmido se confirmó mediante secuenciación automática de ADN. Las
figuras 8b y 8c muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha
y \beta mutadas de TCR JM22 respectivamente, y las figuras 9a y
9b muestran las secuencias de aminoácidos resultantes.
Las cadenas de TCR respectivas se expresaron, se
co-replegaron y se purificaron como se describe en
los ejemplos 1 y 2. La figura 10 ilustra la elución de la elución de
proteína de TCR JM22 soluble unido por disulfuro a partir de una
columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl 0-500
mM, como se indica por la línea de puntos. La figura 11 muestra los
resultados de geles tanto SDS-ELISA reductor (teñido
por Coomassie) como SDS-ELISA no reductor (teñido
por Coomassie) de las fracciones a partir del desarrollo de la
columna ilustrada en la figura 10. El pico 1 contiene claramente el
heterodímero de TCR que está unido por disulfuro intercadena. La
figura 12 muestra elución de proteína a partir de una columna de
tamaño por exclusión de las fracciones reunidas del pico 1 en la
figura 10.
El análisis de BIAcore se la unión del TRC JM22 a
pMHC se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. La figura
13a muestra análisis BIAcore de la unión específica del TCR JM22
soluble unido por disulfuro a complejo HLA-Flu. La
figura 13b muestra la respuesta de unión comparada con el control
para una sola inyección del TCR JM22 soluble unido por disulfuro
para el complejo HLA-flu se determinó que era 7,9
\pm 0,51 \muM.
El ADNc que codifica el TCR
NY-ESO se aisló a partir de las células T
suministradas por Enzo Cerundolo (Instituto de medicina molecular,
Universidad de Oxford) según técnicas conocidas. El ADNc que
codifica el TCR NY-ESO se produjo mediante
tratamiento del ARNm con transcriptasa inversa.
Con el fin de producir un TCR
NY-ESO que incorpora un enlace disulfuro novedoso,
los plásmidos de TCR A6 que contienen sitios de restricción de la
cadena \alpha BamH1 y BgIII de la cadena \beta se usaron como
moldes como se ha descrito en el ejemplo 4. Se usaron los siguientes
cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Las construcciones de las cadenas \alpha y
\beta del TCR NY-ESO se obtuvieron mediante
clonación por PCR. La reacciones de PCR se realizaron usando los
cebadores como se ha mostrado anteriormente, y los moldes que
contenían las cadenas de TCR NY-ESO. Los productos
de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción
relevantes, y se clonaron en pGMT7 para obtener plásmidos de
expresión. La secuencia de las inserciones de plásmido se
confirmaron mediante secuenciación de ADN automática. Las figuras
14a y 14b muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y
\beta del TCR NY-ESO respectivamente, y las
figuras 15a y 15b muestran las secuencias de aminoácidos
resultantes.
Las respectivas cadenas de TCR se expresaron, se
co-replegaron y se purificaron como se ha descrito
en los ejemplos 1 y 2, excepto para las siguientes alteraciones en
el protocolo.
Desnaturalización de los TCR solubles: 30
mg del cuerpo de inclusión de la cadena \beta de TCR solubilizado
y 60 mg del cuerpo de inclusión de la cadena \alpha de TCR
solubilizado se descongelaron de las existencias congeladas. Los
cuerpos de inclusión se diluyeron hasta una concentración final de 5
mg/ml en solución de guanidina 6 M, y DTT (solución madre 2 M) se
añadió hasta una concentración final de 10 mM. La mezcla se incubó a
37ºC durante 30 minutos.
Replegamiento de los TCR solubles: Se
agitó vigorosamente 1 l de tampón de replegamiento a 5ºC \pm 3ºC.
La pareja redox (2-mercaptoetilamina y cistamina)
(hasta una concentración final de 6,6 mM y 3,7 mM, respectivamente)
se añadieron aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las
cadenas de TCR desnaturalizadas. Después se dejó que la proteína se
replegara durante aproximadamente 5ºC \pm 3ºC.
Diálisis de los TCR solubles replegados:
El TCR replegado se dializó en una membrana Spectrapor 1 (Spectrum;
producto nº 132670) contra 10 l de Tris 10 mM pH 8,1 a 5ºC \pm 3ºC
durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el
tampón de diálisis se cambió a Tris 10 mM reciente pH 8,1 (10 l) y
se continuó la diálisis a 5ºC \pm 3ºC durante otras
20-22 horas.
La figura 16 ilustra la elución de la elución de
proteína de TCR unido por disulfuro NY-ESO soluble a
partir de una columna POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl
0-500 mM, como se indica por la línea de puntos. La
figura 17 muestra los resultados de geles de tanto
SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) como
SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de
fracciones a partir la columna desarrollada ilustrada por la figura
16. Los picos 1 y 2 claramente contienen heterodímero de TCR que
está unido por disulfuro intercadena. La figura 18 muestra una
cromatografía por exclusión de tamaño de fracciones reunidas del
pico 1 (A) y el pico 2 (B) en la figura 17. La proteína eluye como
un pico individual principal, correspondiente al heterodímero.
El análisis de BIAcore de la unión del TCR
NY-ESO unido por disulfuro a pMHC se llevó a cabo
como se ha descrito en el ejemplo 3. La figura 19 muestra el
análisis de BIAcore de la unión específica de TCR soluble
NY-ESO unido por disulfuro al complejo
HLA-NYESO. A pico 1, B. pico 2.
La Kd de este TCR unido por disulfuro para el
complejo HLA-NY-ESO se determinó que
era 9,4 \pm 0,84 \muM.
Con el fin de producir un TCR
NY-ESO soluble que incorpora un enlace disulfuro
novedoso y al menos uno de los residuos cisteína implicados en el
enlace intercadena disulfuro nativo, plásmidos que contienen los
sitios de restricción BamH1 de la cadena \alpha y BgIII de la
cadena \beta, se usaron como moldes como un marco conservado como
se describe en el ejemplo 4. Se usaron los siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Las construcciones de las cadenas \alpha y
\beta del TCR NY-ESO se obtuvieron mediante
clonación por PCR. La reacciones de PCR se realizaron usando los
cebadores como se ha mostrado anteriormente, y los moldes que
contenían las cadenas de TCR NY-ESO. Los productos
de PCR se digirieron por restricción con las enzimas de restricción
relevantes, y se clonaron en pGMT7 para obtener plásmidos de
expresión. La secuencia de las inserciones de plásmido se
confirmaron mediante secuenciación de ADN automática. Las figuras
20a y 20b muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y
\beta del TCR NY-ESO respectivamente, y las
figuras 21a y 21b muestran las secuencias de aminoácidos
resultantes.
Para producir un TCR NY-ESO
soluble que contiene tanto un enlace intercadena disulfuro no nativo
como el enlace intercadena disulfuro nativo, se usó ADN aislado
usando ambos cebadores anteriores. Para producir los TCR NY - ESO
solubles con un enlace intercadena disulfuro no nativo y solamente
uno de los residuos cisteína implicado en el enlace intercadena
disulfuro nativo, se usó ADN aislado usando uno de los cebadores
anteriores junto con el cebador apropiado del ejemplo 5.
Las respectivas cadenas de TCR se expresaron, se
co-replegaron como se ha descrito en el ejemplo.
Las figuras 22-24 ilustran la
elución de TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}NY-ESO
soluble (es decir con cisteínas no nativas y nativas en ambas
cadenas), TCR\alpha^{cys} (es decir con cisteínas no nativas en
ambas cadenas pero la cisteína nativa en la cadena \alpha
solamente), y TCR\beta^{cys} (es decir con cisteínas no nativas
en ambas cadenas pero la cisteína nativa en la cadena \beta
solamente) la elución de proteína a partir de columnas de
intercambio aniónico POROS 50 HQ usando un gradiente de NaCl
0-500 mM, como se indica por la línea de puntos. Las
figuras 25 y 26 respectivamente muestran los resultados de geles de
SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) y
SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie) de los
desarrollos de las fracciones de los desarrollos de las columnas
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y
TCR\beta^{cys} ilustrados en las figuras 22-24.
Éstas claramente indican que se han formado los heterodímeros de TCR
que están unidos por disulfuro intercadena. Las figuras
27-29 son perfiles de elución de proteínas a partir
de cromatografía de filtración en gel de fracciones reunidas a
partir de desarrollos de la columna de intercambio aniónico de
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys}, TCR\alpha^{cys}, y
TCR\beta^{cys} ilustrados en las figuras 22-24
respectivamente. La proteína eluye en forma de un solo pico
principal, correspondiente al heterodímero de TCR.
Se llevó a cabo un análisis de BIAcore de unión
de sTCR a pMHC como se ha descrito en el ejemplo 3. Las figuras
30-32 muestran análisis de BIAcore de la unión
específica de TCR\alpha^{cys}\beta^{cys},
TCR\alpha^{cys}, y TCR\beta^{cys} NY-ESO
respectivamente a complejo HLA-NYESO.
TCR\alpha^{cys}\beta^{cys} tenía una
K_{d} de 18,08 \pm 2,075, TCR\alpha^{cys} tenía una K_{d}
de 19,24 \pm 2,01 \muM, y y TCR\beta^{cys} tenía una
K_{d} de 22,5 \pm 4,0692 \muM.
El ADNc que codifica AH-1.23 se
aisló a partir de las células T suministradas por Hill Gaston
(Medical School, Addenbrooke's Hospital, Cambridge) según técnicas
conocidas. El ADNc que codifica el TCR NY-ESO se
produjo mediante tratamiento del ARNm con transcriptasa inversa.
Con el fin de producir un TCR
AH-1.23 que incorpora un enlace disulfuro novedoso,
los plásmidos de TCR que contienen sitios de restricción de la
cadena \alpha BamH1 y BgIII de la cadena \beta se usaron como
un marco conservado como se ha descrito en el ejemplo 4. Se usaron
los siguientes cebadores:
Las construcciones de las cadenas \alpha y
\beta se obtuvieron mediante clonación de PCR como sigue. Las
reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como se ha
mostrado anteriormente, y los moldes que contienen las cadenas de
TCR AH-1.23. Los productos de PCR se digirieron por
restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron
en pGMT7 para obtener plásmidos de expresión. La secuencia de las
inserciones de plásmido se confirmaron mediante secuenciación de ADN
automática. Las figuras 33a y 33b muestran la secuencia de ADN de
las cadenas \alpha y \beta del TCR AH-1.23
respectivamente, y las figuras 34a y 34b muestran las secuencias de
aminoácidos resultantes.
Las respectivas cadenas de TCR se expresaron, se
co-replegaron y se purificaron como se ha descrito
en el ejemplo 5.
La figura 35 ilustra la elución de la elución de
proteína de TCR unido por disulfuro AH-1.23 soluble
a partir de una columna de intercambio aniónico POROS 50 HQ usando
un gradiente de NaCl 0-500 mM, como se indica por la
línea de puntos. Las figuras 36 y 37 muestran los resultados de los
geles de SDS - PAGE reductor (teñido por Coomassie) y
SDS-PAGE no reductor (teñido por Coomassie)
respectivamente del desarrollo de las fracciones de la columna
ilustrada en al figura 35. Estos geles claramente indican la
presencia de un heterodímero de TRC que está unido por disulfuro
intercadena. La figura 38 es el perfil de elución del desarrollo de
una columna de filtración de gel Superdex 75 HR del desarrollo de
las fracciones reunidas de la columna de intercambio aniónico
ilustrado en la figura 35. La proteína eluye en forma de un solo
pico principal, correspondiente al heterodímero.
Se llevaron a cabo los siguientes experimentos
con el fin de investigar si era posible formar los TCR solubles
funcionales que incluyen un enlace disulfuro novedoso en la región
de inmunoglobulina de TCR en una posición distinta de entre treonina
48 del exón 1 en TRAC*01 y serina 57 del exón en ambos TRBC*01 /
TRBC2*01.
Para la mutación de la cadena \alpha de TCT A6,
se usaron los siguientes cebadores (los números en los nombres de
los cebadores se refieren a la posición del residuo de de
aminoácidos a mutar en el exón 1 de TRAC*01, los residuos mutados se
muestran en el caso a continuación):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para mutar la cadena \beta de TCR A6, se
diseñaron los siguientes cebadores (los números en los nombres de
los cebadores se refieren a la posición del residuo de de
aminoácidos a mutar en el exón 1 de TRBC*01. Los residuos mutados se
muestran en el caso a continuación):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis de PCR, amplificación de la
construcción de TCR \alpha y \beta, ligación y purificación de
plásmido se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 1 usando
la combinación apropiada de los cebadores anteriores con el fin de
producir los TCR solubles incluyendo enlaces intercadena disulfuro
novedosos entre los pares siguientes de aminoácidos:
Cadena \alpha de TCR | Cadena \beta de TCR | Cebador \alpha usado | Cebador \beta usado |
Thr 48 | Ser 57 | T48 \rightarrow C | S 57 \rightarrow C |
Tfr 45 | Ser 77 | T45 \rightarrow C | S 77 \rightarrow C |
Ser 61 | Ser 57 | S 61 \rightarrow C | S 57 \rightarrow C |
Leu 50 | Ser 57 | L 50 \rightarrow C | S 57 \rightarrow C |
Tyr 10 | Ser 17 | Y 10 \rightarrow C | S 17 \rightarrow C |
Ser 15 | Val 13 | S 15 \rightarrow C | V 13 \rightarrow C |
Thr 45 | Asp 59 | T 45 \rightarrow C | D 59 \rightarrow C |
Leu 12 | Ser 17 | L 12 \rightarrow C | S 17 \rightarrow C |
Ser 61 | Arg 79 | S 61 \rightarrow C | R 79 \rightarrow C |
Leu 12 | Phe 14 | L 12 \rightarrow C | F 14 \rightarrow C |
Val 22 | Phe 14 | V 22 \rightarrow C | F 14 \rightarrow C |
Met 52 | Gly 55 | M 52 \rightarrow C | G 55 \rightarrow C |
Tyr 43 | Leu 63 | Y 43 \rightarrow C | L 63 \rightarrow C |
Ser 15 | Glu 15 | S 15 \rightarrow C | E 15 \rightarrow C |
Las figuras 39 a 58 muestran las secuencia de ADN
y aminoácidos de las cadenas de TCR A6 mutadas amplificadas por los
cebadores anteriores. Los codones que codifican las cisteínas
mutadas están subrayados.
Las cadenas de TCR respectivas se expresaron, se
co-replegaron y se purificaron como se describe en
el ejemplo 5. Después de al purificación en una columna de
intercambio aniónico POROS 50 HQ, las proteínas resultantes se
desarrollaron en geles SDS-PAGE con el fin de
valorar si se habían formado cualquier TCR replegado correctamente.
Estos geles se valoraron también para averiguar la presencia o
ausencia de cualquier proteína unida por disulfuro del peso
molecular correcto en el material purificado. Los TCR en
investigación que contienen los siguientes enlaces intercadena
disulfuro novedosos no producían proteína unida por disulfuro del
peso molecular usando este sistema de expresión bacteriano y éstos
no se valoraron adicionalmente. Sin embargo, están disponibles
sistema de expresión procarióticos o eucarióticos.
\newpage
Cadena \alpha de TCR | Cadena \beta de TCR |
Ser 61 | Ser 57 |
Leu 50 | Ser 57 |
Ser 15 | Val 13 |
Leu 12 | Ser 17 |
Ser 61 | Arg 79 |
Leu 12 | Phe 14 |
Val 22 | Phe 14 |
Tyr 43 | Leu 63 |
Las figuras 59 a 64 ilustran respectivamente la
elución de los TCR solubles que contienen enlaces intercadena
disulfuro novedosos entre los siguientes residuos: Thr
48-Ser 57, Thr 45-Ser 77, Tyr
10-Ser 17, THr 45- Asp 59, Met
52-Gly 55 y Ser 15-Glu 15 a partir
de una columna de intercambio aniónico POROS 200 HQ usando un
gradiente de NaCl 0-500 mN, como se indica por la
línea de puntos. Las figuras 65 a 70 muestran los resultados de
geles SDS-PAGE reductor (teñido por Coomassie) y no
reductor (teñido por Coomassie) respectivamente de fracciones de los
desarrollos de la columna ilustrados en las figuras 59 a 64. Estos
geles indican claramente la presencia de heterodímeros de TCR que
están unidos por disulfuro intercadena.
Las figuras 71 a 76 son perfiles de elución de
una columna de filtración sobre gel Superdex 200 HR de las
fracciones reunidas a partir de los desarrollos de la columna de
intercambio aniónico ilustrados en las figuras 59 a 64.
El análisis de BIAcore de la unión de los TCR a
pMHC se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. Las
figuras 77-82 son pequeñas cantidades de BIAcore que
demuestran la capacidad de los TCR solubles purificados para unirse
a los complejos HLA-A2 tax pMHC.
Thr 48-Ser 57 tenía una K_{d}
de 7,8 \muM, Thr 45-Ser 77 tenía una K_{d} de
12,7 \muM, Tyr 10-Ser 17 tenía una K_{d} de 34
\muM, Thr 45-Asp 59 tenía una K_{d} de 14,9
\muM, y Ser 15-Glu 15 tenía una K_{d} de 6,3
\muM. Met 52-Gly 55 era capaz de unirse a su
"diana" nativa, el complejo HLA-A2 tax, aunque
también unido de una manera similar a una diana "irrelevante",
el complejo
HLA-A2-NY-ESO (véase
la figura 81).
El dsTCR NY-ESO se clonó como se
ha descrito en el ejemplo 5, y se expresó como sigue.
Los plásmidos de expresión que contenían la
cadena \alpha y cadena \beta mutadas respectivamente se
transformaron separadamente en la cepa de E. coli BL21 pLysS,
y las colinas resistentes a ampicilina individuales se hicieron
crecer a 37ºC en medio TYP (ampicilina 100 \mug/ml) hasta
DO_{600} de 0,7 antes de inducir la expresión de proteína con IPTG
0,5 mM. Las células se recogieron 18 horas después de la inducción
mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un Beckman
J-6B. Los sedimentos celulares se resuspendieron en
tampón de lisis que contiene Tris 10 mM - HCl pH 8,1, MgCl_{2} 10
mM, NaCl 150 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10%. Para cada 1 l de cultivo
de bacterias se añadieron 100 \mul de lisozima (20 mg/ml) y 100
\mul de ADNasa I (20 \mug/ml). Después de la incubación sobre
hielo durante 30 minutos, la suspensión bacteriana se sonicó en
pulsos de 1 minuto para un total de 10 minutos usando un sonicador
Milsonix XL2020 con una sonda de 12 mm de diámetro convencional. Los
sedimentos de los cuerpos de inclusión se recuperaron mediante
centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga
Beckman J2-21 (4ºC). Después se llevaron a cabo tres
lavados en tampón de lavado Triton (Tris 50 mM - HCl, pH 8,1,
Triton-X100 al 0,5%, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM, 0,1%
(p/v), DTT 2 mM) para retirar los desechos celulares y componentes
de membrana. Cada vez, el sedimento de cuerpos de inclusión se
homogenizó en tampón de lavado Tritón antes de centrifugarse por
centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en un
J2-21 Beckman. Después se retiró la sal y detergente
mediante un lavado similar en tampón de resuspensión (Tris 50 mM -
HCl, pH 8,1 NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM, DTT 2 mM. Finalmente, los
cuerpos de inclusión se solubilizaron en tampón guanidina 6 M
(guanidina 6 M - clorhidrato, Tris 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA
10 mM, DTT 10 mM) se dividieron en alícuotas de 120 mg y se
congelaron a -70ºC. Los cuerpos de inclusión se cuantificaron
solubilizando con guanidina 6 M - HCl y la medición con un ensayo de
unión a tinte Bradford (PerBio).
Aproximadamente 60 mg (es decir, 2,4 \mumoles)
de cada cadena de la cadena alfa solubilizada se mezcló con 30 mg
(es decir 1,2 \mumoles) de la cadena beta solubilizada congelada.
La mezcla de TCR se diluyó hasta un volumen final de 18 ml con
tampón guanidina 6 M y se calentó hasta 37ºC durante 30 minutos para
asegurar la desnaturalización de la cadena completa. La solución de
guanidina que contiene las cadenas de TCR reducidas y
desnaturalizadas completamente se mezclaron después en 1 litro del
tampón de replegamiento (Tris 100 mM pH 8,1,
L-Arginina 400 mM - HCl, EDTA 2 mM,
2-mercaptoetilamina 6,6 mM, cistamina 3,7 mM, urea 5
M) con agitación. La solución se dejó durante 5 horas en la
habitación enfriada (5ºC \pm 3ºC) para dejar que tuviera lugar el
replegamiento. Después el replegamiento se dializó contra 12 litros
de agua durante 18-20 horas, seguido de 12 litros
de Tris 10 mM pH 8,1 durante 18-20 horas (5ºC \pm
3ºC). Spectrapor 1 (Spectrum Laboratories, producto nº 132670)
membrana de diálisis que tiene un corte de peso molecular de
6-8000 kDa se usó para el procedimiento de diálisis.
La proteína dializada se filtró a través de filtros de tamaño de
poro de 0,45 \mum (Schleicher y Schuell, número de referencia, 10
404012) ajustada a una unidad de filtración Nalgene.
El TCR NY-ESO replegado se separó
de los productos de degradación e impurezas cargando el
replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS
50 HQ (Applied Biosystems) usando un purificador ÄKTA (Amersham
Biotech). Una columna POROS 50 HQ se preequilibró con 10 volúmenes
de columna de tampón A (Tris 10 mM pH 8,1) antes de cargar con
proteína. La proteína unida se eluyó con un gradiente de NaCl
0-500 mM. Las fracciones de los picos (1 ml) se
analizaron sobre SDS-PAGE de desnaturalización
usando tampón de muestra reductor y no reductor. Las fracciones de
los picos que contenían el complejo heterodimérico
alfa-beta se purificaron adicionalmente usando una
columna de filtración en gel Superdex 75 HR preequilibrada en MES 25
mM pH 6,5. El pico de proteína que eluye a un peso molecular
relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió, se concentró hasta 42
mg/ml en concentradores de centrífuga Ultrafree (Millipore, número
de parte UFV2BGC40) y se almacenó a -80ºC.
La cristalización del TCR NY-ESO
se realizó mediante la técnica de gota colgante a 18ºC usando 1
\mul de solución de proteína (8,4 mg/ml) en Mes 5 mM pH 6,5
mezclado con un volumen equivalente de tampón de cristalización. Los
cristales aparecieron en varias condiciones diferentes usando
tampones de selección de cristal (Hapton Research). Se desarrollaron
cristales cúbicos individuales (< 100 \mum) en PEG 4000 al 30%,
citrato de socio 0,1 M pH 5,6, tampón de acetato amónico 0,2 M y se
usó para determinación de la estructura.
Los cristales del TCR NY-ESO se
ultra-congelaron y se ensayaron para difracción en
el haz de rayos X del sincrotron de Daresbury. Los cristales
difractados a 0,25 nm (2,5 \ring{A}) de resolución. Un conjunto de
datos de recogió y se procesó para proporcionar un 98,6% de conjunto
completo de amplitudes que eran razonables a alrededor de 0,27 nm
(2,7 \ring{A}), pero utilizable hasta 0,25 nm (2,5 \ring{A}). El
factor R emergente, es decir el acuerdo entre las mediciones de
reflexiones cristalográficamente equivalentes, era 10,8% para todos
los datos. Esto es marginal en el caparazón de resolución más alto.
El grupo espacial era P2_{1}, con dimensiones celulares a = 4,25
nm (42,5 \ring{A}), b = 5,95 nm (59,5 \ring{A}), c = 8,17 nm
(81,7 \ring{A}), \beta = 91,5º. Las dimensiones celulares y
significado de simetría eran dos copias en la célula. La unidad
asimétrica, ua o el volumen mínimo que necesita estudiarse, tiene
solamente 1 molécula, y la otra molécula en la célula se genera
mediante la operación de simetría 2_{1}. El posicionamiento de la
molécula en la ua es arbitraria en la dirección y. Siempre que esté
en la posición correcta en el plano x-z, se puede
traducir a voluntad en la dirección y. Esto se refiere a como un
parámetro libre, en este grupo espacial "polar".
La base de datos PDB tiene solamente una entrada
que contiene un TCR heterodimérico A/B, 1BD2. Esta entrada también
tiene coordenadas del péptido HLA-afín en el
complejo con el TCR. La cadena B del TCR era la misma en
NY-ESO, pero la cadena A tenía pequeñas diferencias
en el dominio C y diferencias significativas en el dominio N. Usando
el modelo 1BD2 A/B para el reemplazo molecular, RM, proporcionó una
solución incorrecta, como se muestra por solapamiento por extensión
con moléculas equivalentes simétricas. El uso de la cadena B sola
proporcionó una solución mejor que no tuvo conflictos significativos
con los vecinos. El coeficiente de correlación era 49%, el 50% del
factor R cristalográfico, y el planteamiento más cercano (centro de
gravedad a c-o-g) era 0,49 nm (49
\ring{A}). La operación de rotación y traslación necesaria para
transformar el modelo de la cadena B de partida al equivalente RM,
se aplicó a la cadena A. La solución de RM híbrida así generada, se
empaquetó bien en la célula, con conflictos mínimos.
Los mapas de densidad electrónica generalmente
estaban de acuerdo con el modelo, y permitió su ajuste para
emparejar la secuencia del TCR NY-ESO. Pero el
modelo de partida tenía muchos huecos, específicamente perdiendo
cadenas laterales, que son características de porciones escasamente
ordenadas del modelo. Muchos de los bucles de alfiler del pelo entre
las hebras tenían muy poca densidad, y eran difíciles para el
modelo. El factor R de cristalización del modelo es 30%. El factor R
es un residuo, es decir, es la diferencia entre las amplitudes
calculadas y observadas.
Como demuestran las figuras 83a y 83b, la
secuencia de entrada de IBD2 no coincidía con la densidad muy bien.
El cambio del modelo por Cys en las posiciones 164 en la cadena A, y
174 en la cadena B, seguido de refinamiento adicional, mostró
claramente que esta asignación de secuencia se ajusta mucho mejor a
la densidad. Pero las diferencias en términos de tamaño de la cadena
lateral son mínimas, de este modo había poca perturbación en el
modelo. La densidad electrónica en esa región está poco
cambiada.
El aspecto más importante en este trabajo es que
el nuevo TCR es muy similar en estructura al modelo publicado
(1BD2). La comparación podría incluir todo el TCR, los dominios
constantes, o la parte pequeña próxima al punto de mutación.
Los valores de desviación r. c. m. se enumeran en
la tabla más adelante. La comparación de las estructuras se muestra
en la figura 84.
\newpage
Cadena A | Cadena B | Cadena A | Cadena B | Alargamiento | |
completa | completa | constante | constante | corto | |
Desplazamiento r. c. m. | 2,831 | 1,285 | 1,658 | 1,098 | 0,613 |
Desplazamiento medio | 2,178 | 1,001 | 1,235 | 0,833 | 0,546 |
Desplazamiento máximo | 9,885 | 6,209 | 6,830 | 4,490 | 1,330 |
(Todas las unidades en \ring{A}) |
El alargamiento corto se refiere a la hebra
sencilla de la cadena A (A157 a A 159) y la hebra sencilla de la
cadena B (B170 a B183) que ahora se unen por el puente disulfuro.
Las desviaciones se calcularon para solamente los átomos de la
cadena principal.
Estos resultados muestran que la introducción del
enlace disulfuro tiene efecto mínimo sobre la estructura local del
TCR alrededor del enlace. Se observan grandes efectos cuando se
compara la TCR con la estructura publicada (1BD2) del TCR A6, pero
el incremento en el desplazamiento RMS se debe en gran medida a las
diferencias en conformaciones de bucle (véase la figura 84). Estos
bucles no forman parte de la estructura central del TCR, que se
forma por una serie de hojas \beta que forman un pliegue de Ig
característico. La desviación de RCS para el conjunto de la cadena
\alpha es particularmente grande debido a la diferencia en la
secuencia de los dominios variables entre los TCR A6 (1BD2) y el
NY-ESO. Sin embargo, los TCR A6 y
NY-ESO tienen el mismo dominio \beta variable y
las desviaciones RCS para la cadena \beta total muestra que la
estructura de este dominio variable también se mantiene en el TCR
con el nuevo enlace disulfuro. Por lo tanto estos datos indican que
la estructura central del TCR se mantiene en la estructura
cristalina del TCR con el nuevo enlace disulfuro.
Con el fin de producir un TCR
NY-ESO soluble que incorpora un enlace disulfuro
novedoso, los plásmidos TCR A6 que contienen los sitios de
restricción BamHI de la cadena \alpha y BgIII de la cadena \beta
se usaron como marcos conservados como se describe en el ejemplo
4.
Las construcciones de la cadena \beta de TCR
NY-ESO se obtuvieron por clonación de PCR como
sigue. Las reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores como
se muestra más adelante, y los moldes que contienen las cadenas de
TCR NY-ESO.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de PCR se digirieron por
restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron
en pGMT7 que contiene la secuencia de reconocimiento de biotina para
obtener la expresión de plásmidos. La secuencia de las inserciones
de plásmido se confirmó por secuenciación automática. La figura 85a
muestra la secuencia de ADN de la cadena \beta del TCR
NY-ESO que incorpora el sitio de reconocimiento de
biotina, y la figura 85b muestra la secuencia de aminoácidos
resultante.
La construcción de la cadena \alpha se produjo
como se describe en el ejemplo 5. Las cadenas de TCR respectivas se
expresaron, se co-replegaron y se purificaron como
se ha descrito en el ejemplo 5.
Con el fin de producir un TCR
NY-ESO soluble que contiene un enlace intercadena
disulfuro no nativo y una marca de hexa-histidina
sobre el extremo C de la cadena \beta, se usaron como se ha
indicado anteriormente los mismos cebadores y molde
NY-ESO. Los productos de PCR se digirieron por
restricción con las enzimas de restricción relevantes, y se clonaron
en pGMT7 que contiene la secuencia de hexa-histidina
para obtener plásmidos de expresión. La figura 86a muestra la
secuencia de ADN de la cadena \beta del TCR NY-ESO
que incorpora la marca hexa-histidina, y la figura
86b muestra la secuencia de aminoácidos resultante.
La figura 87 ilustra la elución del TCR
NY-ESO soluble que contiene un enlace disulfuro
novedoso y la secuencia de reconocimiento de biotina a partir de la
columna de intercambio aniónico POROS 50HQ usando un gradiente de
NaCl 0-500, como se indica por la línea de puntos.
La figura 88 ilustra la elución del TCR soluble
NY-ESO que contiene un enlace disulfuro novedoso y
la marca hexa-histidina a partir de una columna de
intercambio aniónico POROS 50HQ usando un gradiente de NaCl
0-500, como se indica por la línea de puntos.
Las figuras 89 y 90 son perfiles de elución de
proteína de la cromatografía de filtración de fracciones reunidas a
partir de los desarrollos de la columna de intercambio aniónico
marcada con biotina NY-ESO y con
hexa-histidina NY-ESO ilustrados por
las figuras 87 y 88 respectivamente. La proteína eluye en forma de
un pico principal individual, que corresponde al heterodímero de
TCR.
Un análisis BIAcore de sTCR que se une a pMHC se
llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 3. El TCR
NY-ESO marcado con biotina tenía una Kd de 7,5
\muM. El TCR marcado con hexa-histidina
NY-ESO tenía una Kd de 9,6 \muM.
Los TCR solubles NY-ESO que
contienen un enlace disulfuro novedoso y una secuencia de
reconocimiento de biotina prepara como en el ejemplo 10 se
utilizaron para formar los tetrámeros de TCR solubles que usan lo
requerido para la tinción celular. 2,5 ml de solución de TCR soluble
purificado (aproximadamente 0,2 mg/ml) se intercambió usando tampón
en tampón de reacción de biotinilación (Tris 50 mM pH 8,0,
MgCl_{2} 10 mM) usando una columna PD-10
(pharmacia). El eluato (3,5) se concentró hasta 1 ml usando un
concentrador centricon (Amicon) con un corte de peso molecular de 10
kDa. Esto se completó hasta 10 mM con ATP añadido de solución madre
(0,1 g/ml ajustada hasta pH 7,0). Después se añadió un volumen de un
cóctel de inhibidores de proteasa (cóctel de inhibidores de proteasa
Conjunto 1, Calbiochem Biochemicals), suficiente para proporcionar
una concentración de cóctel de proteasa final de 1/100 de la
solución madre como se suministró, seguido de biotina 1 mM (añadida
a partir de la solución madre 0,2 M) y 20 \mug/ml de enzima ( a
partir de 0,5 mg/ml de solución madre). Después la mezcla se incubó
durante toda una noche a temperatura ambiente. Se retiró el exceso
de biotina de la solución por cromatografía por exclusión de tamaño
en una columna S75 HR. El nivel de biotinilación presente en el TCR
NY-ESO se determinó mediante un procedimiento basado
en HPLC por exclusión de tamaño como sigue. Una alícuota de 50 ul
del TCR NY-ESO biotinilado (2 mg/ml) se incubó con
50 ul de perlas de agarosa recubiertas con estreptavidina (Sigma)
durante 1 hora. Después las perlas se centrifugaron, y 50 \mul de
la muestra no unida se desarrollaron en una columna TSK 2000 SW
(Tosoohaas) usando un caudal de 0,5 ml/minuto (Tampón fosfato 200 mM
pH 7,0) durante 30 minutos. La presencia de del TCR
NY-ESO biotinilado se detectó mediante un
espectrómetro de UV a tanto 214 nm como 280 nm. El
NY-ESO biotinilado se desarrolló contra un control
de TCR NY-ESO no biotinilado. El porcentaje de
biotinilación se calculó sustrayendo el área del pico de la proteína
biotinilada de la de la proteína no biotinilada.
La tetramerización del TCR soluble biotinilado se
logró usando conjugado neutravidina-ficoeritrina
(Cambridge Biosciences, Reino Unido). La concentración de TCR
soluble biotinilado se midió usando un ensayo de proteína Coomassie
(Pierce), y una relación de TCR soluble 0,8 mg/mg de conjugado
neutravidina-ficoeritrina se calculó para lograr la
saturación de la neutravidina-PE por TCR biotinilado
a una relación de 1:4. 19,5 \mul de una solución de 6,15 mg/ml de
TCR soluble NY-ESO biotinilado en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) se añadió lentamente a 150 \mul de 1
mg/ml de neutravidina-PE soluble sobre hielo con
agitación suave. 1 Después se añadieron 100,5 \mul de PBS a esta
solución para proporcionar una concentración de tetrámero de TCR
NY-ESO de 1 mg/ml.
Se incubaron cuatro alícuotas de 0,3 x 10^{6}
de línea celular B transformada por EBV positivo
HLA-A2 (PP LCL) en 0,5 ml de PBS con concentraciones
variables (0, 10^{-4}, 10^{-5} y 10^{-6} M) de péptido
HLA-A2 NYESO (SLLMWITQC) durante 2 horas a 37ºC.
Después estas células de PP LCL se lavaron dos veces en solución
salina tamponada de Hanks (HBSS) (Gibco, Reino Unido).
Cada una de las cuatro alícuotas se dividieron
igualmente y se tiñeron con TCR unido por disulfuro
NY-ESO biotinilado tetramerizado recientemente con
neutravidina-ficoeritrina. Las células se incubaron
con bien 5 ó 10 \mug de complejos de dsTCR tetraméricos marcados
con ficoeritrina sobre hielo durante 30 minutos y se lavaron con
HBSS. Las células se lavaron otra vez, se volvieron a suspender en
HBSS y se analizaron por FACSVantage. Se recogieron 25.000 casos y
los datos de analizaron usando el software WinMIDI.
Las figuras 91a-h ilustran en
forma de histogramas los datos FACSVantage generados para cada una
de las muestras preparadas como se ha descrito anteriormente. La
tabla siguiente enumera el porcentaje de células teñidas
positivamente observadas para cada una de las muestras:
\newpage
Muestra | Células teñidas positivas (%) |
Péptido NY-ESO 0 0, 5 \mu | 0,75 |
Péptido NY-ESO 10^{-4} M, 5 \mu de TCR | 84,39 |
Péptido NY-ESO 10^{-5} M, 5 \mu de TCR | 35,29 |
Péptido NY-ESO 10^{-6} M, 5 \mu de TCR | 7,98 |
Péptido NY-ESO 0, 10 \mu de TCR | 0,94 |
Péptido NY-ESO 10^{-4} M, 10 \mu de TCR | 88,51 |
Péptido NY-ESO 10^{-5} M, 10 \mu de TCR | 8,25 |
Péptido NY-ESO 10^{-6} M, 10 \mu de TCR | 3,45 |
Estos datos indican claramente que la proporción
de las células marcadas por los tetrámeros de NY-ESO
se incrementa de una manera correlacionada con la concentración del
péptido (SLLMWITQC) en el que se habían incubado. Por lo tanto,
estos tetrámeros de TCR NY-ESO son restos adecuados
parta el marcaje celular específico basándose en la expresión del
complejo HLA-A2 NY-ESO.
En el presente ejemplo, se había usado un
tetrámero de TCR NY-ESO conjugado fluorescente. Sin
embargo, se esperarían niveles similares de unión celular si este
marcador se reemplazara por un resto terapéutico adecua-
do.
do.
Todos los ejemplos anteriores describen la
producción de los TCR solubles con un enlace disulfuro novedoso que
incorpora la región constante C\beta2. El presente ejemplo
demuestra que los TCR solubles que incorporan la región constante
C\beta1 se pueden producir con éxito.
Para la construcción de PCR del dominio V de la
cadena \beta del TCR A6, se diseñaron los siguientes
cebadores:
5'-GGAGATATACATATGAACGCTGGTGTCACT-3'
5'-CCTTGTTCAGGTCCTCTGTGACCGTGAG-3'
Para la construcción de PCR de C\beta1 del TCR
A6, se diseñaron los siguientes cebadores:
5'-CTCACGGTCACAGAGGACCTGAACAAGG-3'
5'-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3'
La construcción VTCR beta y la construcción
C\beta1 se amplificaron separadamente usando la tecnología de PCR
convencional. Se conectaron entre sí usando una sutura de PCR. El
ADN de plásmido se purificó en una columna
mini-prep. de Qiagen según las instrucciones del
fabricante y la secuencia se verificó mediante secuenciación
automática en las instalaciones de secuenciación del departamento de
biología, Universidad de Oxford. La secuencia para A6 + C\beta1 se
muestra en la figura 92.
Por consiguiente, la cadena A6 + C\beta1 se
apareó al TCR alfa A6 mediante enlace disulfuro intercadena después
de introducir cisteína en el dominio C de ambas cadenas.
El TCR soluble se expresó y se replegó como se ha
descrito en el ejemplo 2.
El sTCR se separó de los productos de degradación
e impurezas cargando el repliegue dializado en una columna de
intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un
gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de
columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura 93.
Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se analizaron por
SDS-PAGE teñido por Coomassie (figura 94) antes de
reunirse y concentrarse. Finalmente, el sTCR se purificó y se
caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR
(figura 95) preequilibrada en tampón HBS-EP (HEPES
10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 al 0,05%). El
pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50
kDa se reunió y se concentró antes de la caracterización mediante
análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.
\newpage
Un análisis de BIAcore de la unión del TCR A6
unido por disulfuro se llevó a cabo como se ha descrito en el
ejemplo 3. La figura 96 muestra el análisis de BIAcore de la unión
específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a sus pMHC
afín.
El TCR A6 soluble con un enlace disulfuro
novedoso que incorpora la región constante C\beta1 tenía una
K_{d} de 2,42 \pm 0,55 \muM para su pMHC afín. Este valor es
muy similar a la K_{d} de 1,8 \muM determinada para el TCR A6
soluble con un enlace disulfuro novedoso que incorpora la región
constante C\beta2 como se ha determinado en el ejemplo
3.
3.
Las regiones constantes de la cadena \beta de
los TCR incluyen un residuo cisteína (residuo 75 en el exón 1 de
TBRC1*01 y TRBC2*01) que no está implicado en la formación de enlace
disulfuro bien intercadena o intracadena. Todos los ejemplos previos
describen la producción de los TCR solubles con un enlace disulfuro
novedoso en el que esta cisteína "libre" se ha mutado a alanina
con el fin de evitar la posible formación de cualquier enlace
disulfuro "inapropiado" que podría dar como resultado un
rendimiento reducido de TCR funcional. El ejemplo presente demuestra
que se puede producir los TCR solubles que incorporan esta cisteína
"libre".
La formulación de la alanina de la cadena \beta
del TCR (residuo 75 en el exón 1 de TRBC1*01 y TRBC2*01) a cisteína,
se diseñaron los siguientes cebadores (mutación mostrada en el caso
más adelante):
5'-TGAC TCC AGA TAC
tgT CTG AGC AGC
CG
5'-CG GCT GCT CAG
Aca GTA TCT GGA GTC
A
La mutagénesis de PCR, expresión y repliegue del
TCR soluble se llevó a cabo como se ha descrito en el ejemplo 2.
El sTCR se separó de los productos de degradación
e impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de
intercambio aniónico POROS 50 HQ y eluyendo la proteína unida con un
gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de
columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura 98.
Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se analizaron
mediante SDS-PAGE teñido por Coomassie (figura 99)
antes de reunirse y concentrarse. Finalmente el sTCR se purificó y
caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR
(figura 100) preequilibrada en tampón HBS-EP (HEPES
10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, nonidet p40 al 0,05%). El
pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50
kDa se reunió y se concentró antes de caracterización por análisis
de resonancia de plasmón superficial BIAcore.
Se llevó a cabo un análisis de BIAcore de la
unión del TCR A6 unido por disulfuro como se ha descrito en el
ejemplo 3. La figura 101 muestra el análisis de BIAcore de la unión
específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a sus pMHC
afín.
El TCR A6 soluble con un enlace disulfuro
novedoso que incorpora la cisteína "libre" en al cadena \beta
tenía una K_{d} de 21,39 \pm 3,55 \muM para su pMHC afín.
El presente ejemplo demuestra que los TCR
solubles con un enlace disulfuro novedoso en el que la cisteína
"libre" en la cadena \beta (residuo 75 en el exón 1 de
TRBC1*01 y TRBC2*01) se muta a serina se puede producir con
éxito.
Para mutar la alanina de la cadena \beta de TCR
que se había sustituido previamente por la cisteína nativa (residuo
75 en el exón 1 de TRBC1*01 y TRBC2*01) a serina, se diseñaron los
siguientes cebadores (mutación mostrada en el caso más
adelante):
5'-T GAC TCC AGA
TAC tCT CTG AGC AGC
CG
5'-CG GCT GCT CAG
AGa GTA TCT GGA GTC
A
La mutagénesis por PCR (que da como resultado una
cadena beta mutada como se muestra e la figura 102), la expresión y
replegamiento del TCR soluble se llevó a cabo como se ha descrito
en el ejemplo 2.
El sTCR se separó de los productos de degradación
e impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de
intercambio aniónico POROS 50 HQ y eluyendo la proteína unida con un
gradiente de NaCl 0-500 mM en 50 volúmenes de
columna usando un purificador Akta (Pharmacia) como en la figura
103. Las fracciones de los picos se almacenaron a 4ºC y se
analizaron mediante SDS-PAGE teñido por Coomassie
(figura 104) antes de reunirse y concentrarse. Finalmente el sTCR se
purificó y caracterizó usando una columna de filtración en gel
Superdex 200HR (figura 105) preequilibrada en tampón
HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5
mM, nonidet p40 al 0,05%). El pico que eluye a un peso molecular
relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió y se concentró antes de
caracterización por análisis de resonancia de plasmón superficial
BIAcore.
Se llevó a cabo un análisis de BIAcore de la
unión del TCR A6 unido por disulfuro como se ha descrito en el
ejemplo 3. La figura 106 muestra el análisis de BIAcore de la unión
específica de TCR soluble A6 unido por disulfuro a sus pMHC
afín.
El TCR A6 soluble con un enlace disulfuro
novedoso en el que la cisteína "libre" en al cadena \beta se
mutó a serina tenía una K_{d} de 2,98 \pm 0,27 \muM para su
pMHC afín.
Este valor es muy similar a la K_{d} de 1,8
\muM determinada para el TCR A6 soluble con un enlace disulfuro
novedosos en el que la cisteína "libre" en la cadena \beta se
mutó a alanina como se determina en el ejemplo 3.
Las cadenas \alpha y \beta del TCR
NY-ESO se condensaron al extremo C de la secuencia
del factor alfa de pre - pro apareamiento de Saccharomyces
cerevisiae y se clonaron en los vectores de expresión pYX122 y
pYX112 respectivamente (véanse las figuras 107 y 108).
Se diseñaron los siguientes cebadores para
amplificar por PCR la secuencia alfa del factor de pre - pro
apareamiento a partir de la cepa de S. cerevisiae SEY6210
(Robinson y col., (1991), Mol Cell Biol, 11 (12):
5813-24) para condensarse a la cadena \alpha del
TCR.
5'-TCT GAA TTC ATG
AGA TTT CCT TCA ATT TTT
AC-3'
5'-TCA CCT CCT GGG
CTT CAG CCT CTC TTT TAT
C-3'
Se diseñaron los siguientes cebadores para
amplificar por PCR la secuencia del factor alfa de pre - pro
apareamiento a partir de la cepa de S. cerevisiae SEY6210
para condensarse a la cadena \beta del TCR.
5'-TCT GAA TTC ATG
AGA TTT CCT TCA ATT TTT
AC-3'
5'-GTG TCT CGA GTT
AGT CTG CTC TAC CCC AGG
C-3'
Se preparó ADN de levadura resuspendiendo una
colonia de la cepa de S. cerevisiae SEY6210 en 30 \mul de
SDS al 0,25% en agua y calentando durante 3 minutos a 90ºC. Las
secuencias del factor alfa de pre - pro apareamiento para
condensarse a las cadenas \alpha y \beta del TCR se generaron
amplificando por PCR 0,25 \mul de ADN de levadura con los pares de
cebadores respectivos mencionados anteriormente usando las
siguientes condiciones de PCR. 12,5 pmoles de cada cebador se
mezclaron con dNTP 200 \muM, 5 \mul de tampón 10x Pfu y 1,25
unidades de Pfu polimerasa (Stratagene) en un volumen final de 50
\mul. Después de una etapa desnaturalización inicial de 30
segundos a 92ºC, la mezcla de reacción se sometió a 30 rondas de
desnaturalización (92ºC, 30 segundos), hibridación (46,9ºC, 60
segundos), y elongación (72ºC, 2 minutos) en una máquina de PCR
exprés Hybaid PCR.
Se diseñaron los siguientes cebadores para
amplificar por PCR la cadena \alpha de TCR a condensarse a la
secuencia del factor alfa de pre - pro apareamiento mencionada
anteriormente.
5'-GGC TGA AGC CCA
GGA GGT GAC ACA GAT
TCC-3'
5'-CTC CTC TCG AGT
TAG GAA CTT TCT GGG CTG
GG-3'
Se diseñaron los siguientes cebadores para
amplificar por PCR la cadena \beta de TCR a condensarse a la
secuencia del factor alfa de pre - pro apareamiento mencionada
anteriormente.
5'-GGC TGA AGC CGG
CGT CAC TCA GAC CCC AAA
AT-3'
5'-GTG TCT CGA GTT
AGT CTG CTC TAC CCC AGG
C-3'
Las condiciones de PCR para amplificar las
cadenas \alpha y \beta del TCR eran las mismas que se han
mencionado anteriormente excepto para los siguientes cambios: el
molde de ADN usado para amplificar las cadenas \alpha y \beta
eran las cadenas \alpha y \beta del TCR NY-ESO
respectivamente (como se prepara en el ejemplo 5); y la temperatura
de hibridación usada era 60,1ºC.
Después los productos de PCR se usaron en una
reacción de sutura de PCR utilizando las secuencias de solapamiento
complementarias introducidas en los productos de PCR iniciales para
crear un gen quimérico de longitud completa. Los productos de PCR
resultantes se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y
XhoI y se clonaron en bien pXY122 o pYX112 digeridos con las mismas
enzimas. Los plásmidos resultantes se purificaron en una columna
mini-prep. Qiagen™ según las instrucciones del
fabricante, y las secuencias verificadas mediante secuenciación
automática en las instalaciones de secuenciación de Genetics Ltd,
Queensway, New Milton, Hampshire, Reino Unido. Las figuras 109 y 110
muestran las secuencias de ADn y proteína de los productos
quiméricos clonados.
Los plásmidos de expresión de levadura que
contienen las cadenas \alpha y \beta de TCR respectivamente
producidos como se ha descrito en el ejemplo 15 se
co-transformaron en la cepa de S. cerevisiae
SEY6210 usando el protocolo de Agatep y col., (1998) (Técnica Tips
Online (http://tto.trends.com) 1: 51: P01525). Una colonia
individual que crece en un agar mínimo sintético (SD) que contenía
Histidina y Uracilo (Qbiogene, Ilqlich, Francia) se cultivó durante
toda una noche a 30ºC en 10 ml de medio SD que contiene Histidina y
Uracilo. El cultivo durante toda una noche se
sub-cultivó 1:10 en el medio reciente de SD que
contiene Histidina y Uracilo y se hizo crecer durante 4 horas a
30ºC. El cultivo se centrifugó durante 5 minutos a 3800 rpm en
Heraeus Megafuge 2.0R (Kendro Laboratory Prodicts Ltd, Bishop's
Stortford, Hertfordshire, Reino Unido) y se recogió el sobrenadante.
Se mezclaron 5 \mul de resina StartClean (Stratagene) con el
sobrenadante y se mantuvo en rotación en una "blood wheele" a
4ºC durante toda la noche. La resina StrataClean se centrífugo a
3800 rpm en una Heraeus Megafuge 2.0R y se desecho el medio. Se
añadieron 25 \mul de tampón de muestra reductor (950 \mul de
tampón de muestra Laemmli (Biorad) que contenía 50 \mul de DTT 2
M) a la resina y las muestras se calentaron a 95ºC durante 5 minutos
y después de enfriaron en un baño de hielo antes de que 20 \mul de
la mezcla se cargara en un gel SDS-PAGE a 0,8 mA
constante/cm^{2} de superficie del gel durante 1 hora. Las
proteínas en el gel se transformaron a membranas
Inmuno-Blot PVDF (Bio-Rad) y se
exploraron con anticuerpo anti cadena \alpha de TCR como se ha
descrito en el ejemplo 17 más adelante excepto para los cambios
siguientes. El anticuerpo primarios (anti cadena \alpha de TCR) y
los anticuerpos secundarios se usaron a 1 y 200 y 1 y 1000
diluciones respectivamente. La figura 111 muestra una imagen de la
membrana desarrollada. El resultado muestra que existe un nivel bajo
de secreción de TCR mediante el cultivo de levadura en el medio.
Las cadenas \alpha y \beta del TCR A6 Tax
disulfuro se clonaron a partir de pGMT7 en un vector basado en
pBluescript KS2 llamado el pEX172. Este vector se diseñó para
clonación diferentes cadenas \beta de la clase II de MHC, para a
expresión de células de insecto, usando la secuencia guía a partir
de DBR1*0101, un sitio AgeI para la inserción de diferentes
secuencias codificadoras de péptidos, una región de engarce, y
después los sitios MluI y SalI para clonar las cadenas DR\beta en
frente se la secuencia cremallera Jun Leucina. La secuencia donde
pEX 172 difiere de pBluescript II KS-, localizada entre los sitios
KpnI y EcoRI de pBluescript II KS-, se muestra en al figura 112.
Para los propósitos de clonación las cadenas de TCR en células de
insecto, este pEX172 se cortó con AgeI y SalI para retirar la región
engarce y el sitio MluI, y las cadenas de TCR entran donde
comenzaría la secuencia de péptidos. Las secuencias de TCR se
clonaron a partir de pGMT7 con el sitio BspEI en el extremo 5' (esto
tenía los extremos adherentes compatibles AgeI) y un sitio SalI en
el extremo 3'. Con el fin de proporcionar el sitio de escisión para
la separación de la secuencia guía DR\beta, los tres primeros
residuos de la cadena DR\beta (GDT) se preservaron. Con el fin de
prevenir la secuencia cremallera Jun Leucina que se transcribe, era
necesario insertar un codón de parada antes del sitio SalI. Para un
esquema de esta construcción, véase la figura 113. Una vez que las
cadenas de TCR están en este plásmido, el fragmento BamHI se
cortaron y se subclonaron en el vector pAcAB3, que tenía sitios de
recombinación de homología para Baculovirus. El vector pAcAB3 tiene
dos promotores divergentes, uno con un sitio BamHI y uno con un
sitio de clonación BgIII. Existe un sitio BgIII en la cadena \beta
de TCR A6, se manera que la cadena \alpha del TCR A6 se insertó en
el sitio BgIII, y la cadena \beta se subclonó en el sitio
BamHI.
De acuerdo con la estrategia de clonación
anterior, se diseñaron los siguientes cebadores (homología a los
vectores en el caso anterior):
Los plásmidos de expresión que contienen los
genes para la cadena \alpha o \beta del TCR A6 Tax se usaron
como moldes en las siguientes reacciones de PCR. Se mezclaron 100 ng
de plásmido \alpha con 1 \mul de dNTP 10 mM, 5 \mul de tampón
de tampón 10xPfu (Stratagene), 1,25 unidades de Pfu polimerasa
(Stratagene), 50 pmol de los cebadores A6\alpha anteriores, y el
volumen final se ajustó hasta 50 \mul con H_{2}O. Se estableció
una mezcla de reacción similar para la cadena \beta, usando el
plásmido \beta y el par de cebadores \beta. Las mezclas de
reacción se sometieron a 35 rondas de desnaturalización (95ºC, 60
segundos), hibridación (50ºC, 60 segundos), y elongación (72ºC, 8
minutos) en una máquina de PCR exprés Hybaid PCR. Después el
producto se digirió durante 2 horas a 37ºC con 10 unidades de enzima
de restricción BspEI después durante 2 horas adicionales con 10
unidades de SalI (New England Biolabs). Estas reacciones digeridas
se ligaron en pEX172 que se habían digerido con AgeI y SalI, y éstas
se transformaron en bacterias XL1-Blue competentes y
se hicieron crecer durante 18 horas a 37ºC. Se cogió una colonia
individual de cada una de las preparaciones \alpha o \beta y se
hicieron crecer durante toda una noche en YTP + ampicilina (16 g/l
de Bacto-Tristona, 16 g/l de extracto de levadura, 5
g/l de Na ClNa, 2,5 de K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El
ADN de plásmido se purificó en una columna de Qiagen
mini-prep según las instrucciones del fabricante y
la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en las
instalaciones de secuenciación de Genetix. Las secuencias de
aminoácidos de las inserciones BamII se muestran en las figuras 114
y 115 para la cadena \alpha y la cadena \beta,
respectivamente.
Estas construcciones del TCR A6 Tax disulfuro
\alpha o \beta en pEX172 se digirieron durante 2 horas a 37ºC
con la enzima de restricción BamHI (New England Biolabs). La
inserción BamHI de la cadena \alpha se ligó en el vector pAcAB3
(Pharmingen-BD Biosciences: 212 6P) que se había
digerido con la enzima BgIII. Esto se transformó en bacterias
HL1-Blue competentes y se hicieron crecer durante 18
horas a 37ºC. Se cogió una colonia individual de esta placa y se
hizo crecer durante toda una noche en 5 ml de YTP + ampicilina y se
purificó el ADN del plásmido como antes. Después este plásmido se
digirió con BamHI y la inserción BamHI de la cadena \alpha se
ligó, se transformó en bacterias XL1-Blue, se
hicieron crecer durante toda una noche, se recogieron
TYP-ampicilina, y se hicieron crecer antes de la
minipreapración como antes usando una columna Qiagen
mini-prep. La correcta orientación de ambas cadenas
\alpha y \beta se confirmó mediante secuenciación usando los
siguientes cebadores de secuenciación:
El plásmido de expresión que contenía la cadena
\alpha y la cadena \beta se transfectaron en células sf9
(Pharmingen-BD Biosciences: 21300C) crecidas en el
medio exento de suero (Pharmingen-BD Biosciences:
551411), usando el kit de transfección Baculo gold
(Pharmingen-BD Biosciences: 21100K) según las
instrucciones del fabricante. Después de 5 días a 27ºC, 200 \mul
del medio de estas células transfectadas que se había crecido se
añadieron a 100 ml de High Five cells a 1 x 10^{6} células/ml en
medio exento de suero. Después de 6 días adicionales a 27ºC, 1 ml de
este medio se retiró y se centrifugó a 13.000 rpm en Hereus
microfuge durante 5 minutos para sedimentar los desechos
celulares.
10 \mul de este sobrenadante de TCR unido por
disulfuro A6 de insectos se desarrolló junto a controles positivos
de 5 \mug y 10 \mug de TCR unido por disulfuro A6 bacteriano
sobre un gel Tris al 4-20%/glicina
pre-moldeado (Invitrogen: EC60252). Se prepararon
muestras reducidas añadiendo 10 \mul de tampón de muestra reductor
(950 \mul de tampón de muestra Laemmli (Bio-Rad:
161-0737) 50 \mul de DTT 2 M) y calentando a 95ºC
durante 5 minutos, enfriando a temperatura ambiente durante 10
minutos y después cargando 20 \mul. Las muestras no reducidas se
prepararon añadiendo 10 \mul de tampón de muestras Laemmli, y
cargando 20 \mul.
El gel se desarrolló a 150 voltios durante 1 hora
en un tanque de gel Novex - Xcell después de lo cual el gel se tiñó
en 50 ml de tinte gel de Coomassie durante 1 hora con agitación
suave (a 1,1 g de polvo de Coomassie en 500 ml de metanol con
agitación durante 1 hora se añaden 100 ml de ácido acético y se
completa hasta 1 litro con H_{2}O, se agita durante 1 hora,
después de filtra a través de un filtro de 0,45 \mum). El gel se
destiñó tres veces durante 30 minutos con agitación suave en 50 ml
de distinción (como el tinte de gel de Coomassie pero omitiendo el
polvo de Coomassie).
Se realizaron transferencias de Western
desarrollando geles SDS-PAGE como antes pero las
proteínas se transfirieron a membranas Inmuno-Blot
PVDF (Bio-Rad: 162-0174) en lugar la
tinción de los geles con Coomassie. Se cortaron seis papeles de
filtro al tamaño del gel y se sumergieron en tampón de transferencia
(2,39 g de glicina, 5,81 g de Tris Base, 0,77 g de DTT disueltos en
500 ml de H_{2}O, 200 ml de metanol se añadieron y se completó
hasta 1000 con H_{2}O.) La membrana de PVDF se preparó sumergiendo
en metanol durante 1 hora y después en tampón de transferencia
durante 2 minutos. Se colocaron tres papeles de filtro en la parte
superior seguido del gel y después finalmente tres papeles de filtro
más sobre el lado del cátodo. La inmunotransferencia se desarrolló
durante 1 hora a 0,8 mA constante/cm^{2}.
Después de la transferencia, la membrana se
bloqueó en 7,5 ml de tampón de bloqueo (4 comprimidos de solución
salina tamponada con Tris (Sigma: T5030), 3 g de leche deshidratada
no grasa (Sigma: M7409), 30 \mul de Tween 20 completado hasta 30
ml con H_{2}O) durante 60 minutos con agitación suave. La membrana
se lavó tres veces durante 5 minutos con tampón de lavado TBS
(comprimidos 20 TBS, 150 \mul de Tween 20 completado hasta 300 ml
con H_{2}O). Después la membrana se incubó en anticuerpo primario,
dilución 1 en 50 del clon de la cadena \alpha 3A8 (Serotec:
MCA987) o clon de la cadena \beta anti TCR 8A3 (Serotec: MCA988)
en 7,5 ml de tampón de bloqueo durante 1 hora con agitación suave.
La membrana se lavó como antes en tampón de lavado TBS. A
continuación, una incubación de anticuerpo secundario de anticuerpo
abti-ratón de cabra marcado con HPR (Santa Cruz
Biotech: Sc-2005) dilución 1 en 1000 en 7,5 ml de
tampón de bloqueo se llevó a cabo durante 30 minutos con agitación
suave. La membrana se lavó como antes y después de lavó en 30 ml de
H_{2}O con 2 comprimidos de TBS.
La unión de anticuerpo se detectó mediante
detección colorimétrica Opti-4CN (Biorad:
170-8235) 1,4 ml de diluyente
Opt-4CN, 16 ml de H_{2}O, 0,28 ml de sustrato de
Opti-4CN). Las membranas se colorearon durante 30
minutos y después se lavaron en H_{2}O durante 15 minutos. Las
membranas se secaron a temperatura ambiente, y las imágenes barridas
se alinearon con una imagen del gel teñido por coomassie (figura
116).
Puede observarse en la figura 116 que ambos TCR
disulfuro se forman como un heterodímero que es estable en el gel de
SADS. Ambos se descompusieron en las cadenas \alpha o \beta tras
reducción. El heterodímero de TCR disulfuro de insecto tiene un peso
molecular ligeramente más alto que la versión producida
bacterianamente, presumiblemente debido a la glicosilación de las
células de insecto. Puede observarse que en este caso las células de
insecto producen la cadena \alpha en exceso, y la cadena \alpha
libre se puede ver en la banda no reducida de la transferencia
western anti \alpha.
Estos datos claramente demuestran que el sistema
de expresión de baculovirus descritos anteriormente proporciona una
alternativa viable a la expresión procariótica de los TCR solubles
que contienen enlaces disulfuro novedosos.
Claims (63)
1. Un receptor soluble de células T (sTCR), que
comprende (i) toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el
dominio transmembrana de la misma, y (ii) toda o parte de una cadena
\beta, excepto el dominio transmembrana de la misma, en el que
cada (i) y (ii) comprende un dominio variable funcional y al menos
una parte del dominio constante de la cadena de TCR,
caracterizado porque (i) y (ii) están unidos mediante un
enlace disulfuro entre residuos de cisteína sustituidos por:
Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01; o
Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01.
2. Un sTCR según la reivindicación 1, en el que
uno o ambos de (i) y (ii) comprenden todo el dominio extracelular de
la cadena TCR.
3. Un sTCR según la reivindicación 1 ó 2, en el
que uno o ambos de (i) y (ii) comprenden todo el dominio
extracelular de la cadena TCR.
4. Un receptor de las células T de la forma
\alpha\beta soluble (sTCR), en el que un enlace disulfuro
covalente se une a residuos de cisteína sustituidos por:
Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01;
Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01; o
Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1
de TRBC1*01 o TRBC2*01.
5. Un receptor soluble de células T (sTCR), que
comprende (i) toda o parte de una cadena \alpha de TCR, excepto el
dominio transmembrana de la misma, y (ii) toda o parte de una cadena
\beta de TCR, excepto el dominio transmembrana de la misma, en el
que (i) y (ii) cada uno comprende un dominio variable funcional y al
menos una parte del dominio constante de la cadena de TCR, y están
unidos por un enlace disulfuro entre los residuos de dominios
constantes que no está presente en el TCR nativo y en el que no está
presente un enlace disulfuro intercadena en el TCR nati-
vo.
vo.
6. Un sTCR según la reivindicación 5, en el que
uno o ambos de (i) y (ii) comprenden todo el dominio Ig constante
extracelular de la cadena TCR.
7. Un sTCR según la reivindicación 5 o
reivindicación 6, en el que uno o ambos de (i) y (ii) comprenden
todo el dominio extracelular de la cadena TCR.
8. Un receptor soluble (sTCR) de células T de la
forma \alpha\beta, en el que un enlace covalente disulfuro se
une a un residuo de la región de inmunoglobulina del domino
constante de la cadena \alpha a un residuo de la región
inmunoglobulina del dominio constante de la cadena \beta, en el
que no está presente un enlace disulfuro intercadena en TCR
nati-
vo.
vo.
9. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por los residuos cuyos átomos de carbono \beta están a menos de
0,6 nm de distancia en la estructura de TCR nativo.
10. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
11. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
12. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
13. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
14. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
15. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que un enlace disulfuro intercadena
TCR nativo no está presente.
16. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 15, en el que las cadenas de TCR \alpha y
\beta nativas están truncadas en el extremo C de manera que los
residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena nativo
están excluidos.
17. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 15, en el que los residuos cisteína que forman
el enlace disulfuro intercadena están sustituidos por otro
residuo.
18. Un sTCR según la reivindicación 17, en el
que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro intercadena
nativo están sustituidos por serina o alanina.
19. Un sTCR según cualquier reivindicación
precedente, en el que un residuo cisteína no apareado presente en la
cadena \beta de TCR nativo no está presente.
20. Un sTCR según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 5, 6 y 9 a 19, en el que (i) y (ii) cada uno
comprende el dominio variable funcional de un primer TCR condensado
a parte o todo el dominio constante de un segundo TCR, el primer y
segundo TCR siendo de la misma especie.
21. Un sTCR según la reivindicación 20, en el
que los dominios constantes del segundo TCR son
N-terminal truncados a los residuos que forman el
enlace disulfuro intercadena no nativo.
22. Un sTCR según cualquiera reivindicación
anterior, en el que una o ambas cadenas se derivatizan con, o se
condensan a, un resto en su extremo C o N.
23. Un sTCR según cualquiera reivindicación
anterior, en el que una o ambas cadenas tienen un residuo cisteína
en su extremo C y/o N al que se puede condensar un resto.
24. Un sTCR según cualquiera reivindicación
anterior, que comprende además un marcador detectable.
25. Un sTCR según cualquiera reivindicación
anterior asociado a un agente terapéutico.
26. Un complejo receptor de las células T (TCR)
multivalente que comprende una pluralidad de sTCR según cualquier
reivindicación precedente.
27. Un complejo según la reivindicación 26, que
comprende un multímero de sTCR.
28. Un complejo según la reivindicación 27, que
comprende dos, tres, cuatro o más moléculas receptoras de las
células T asociadas entre sí, preferiblemente mediante una molécula
engarce.
29. Un complejo según la reivindicación 26, 27 ó
28, en el que los sTCR o multímeros de sTCR están presentes en una
bicapa lipídica o están unidos a una partícula.
30. Un procedimiento para detectar complejos
MHC-péptido, que comprende:
- (i)
- proporcionar un TCR soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 o un complejo de receptores de células T multivalente según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29;
- (ii)
- poner en contacto el TCR soluble o complejo de TCR multivalente con los complejos MHC-péptido; y
- (iii)
- detectar la unión del TCR soluble o complejo de TCR multivalente a los complejos MHC-péptido.
31. Una formulación farmacéutica que comprende
un sTCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, y/o un
complejo de TCR multivalente según una cualquiera de las
reivindicaciones 26 a 29, junto con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
32. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia que codifica (i) o (ii) de un sTCR según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, o una secuencia
complementaria a la misma.
33. Un vector que comprende una molécula de
ácido nucleico según la reivindicación 32.
34. Una célula hospedadora que comprende un
vector según la reivindicación 33.
35. Un procedimiento para obtener (i) o (ii)
como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
25, dicho procedimiento comprende incubar una célula hospedadora
según la reivindicación 34 en condiciones que producen la expresión
del péptido y después purificar el polipéptido.
36. Un procedimiento según la reivindicación 35,
que comprende además mezclar (i) y (ii) en condiciones de
replegamiento adecuadas.
37. Un procedimiento para obtener un receptor de
las células T soluble (sTCR), dicho procedimiento compren-
de:
de:
incubar una célula hospedadora que comprende un
vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica (i)
toda o parte de la cadena \alpha de TCR, excepto el dominio
transmembrana de la misma, y una célula hospedadora que comprende un
vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica
(ii) toda o parte de la cadena \beta de TCR, excepto el dominio
transmembrana de la misma en condiciones que producen la expresión
de (i) y (ii), en el que (i) y (ii) cada uno comprende un dominio
variable funcional y al menos una parte del dominio constante de la
cadena de TCR;
purificar (i) y (ii); y
mezclar (i) y (ii) en condiciones de
replegamiento de manera que se unen mediante un enlace disulfuro
entre los residuos del dominio constante que no está presente en el
TCR nativo.
38. Un procedimiento según la reivindicación 37,
en el que uno o ambos (i) y (ii) comprenden todo el dominio Ig
constante extracelular de la cadena TCR.
39. Un procedimiento según la reivindicación 37
ó reivindicación 38, en el que uno o ambos (i) y (ii) comprenden
todo el dominio extracelular de la cadena TCR.
40. Un procedimiento para obtener un receptor de
las células T soluble (sTCR) de la forma \alpha\beta, dicho
procedimiento comprende:
incubar una célula hospedadora que comprende un
vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una
cadena \alpha de TCR y una célula hospedadora que comprende un
vector que comprende un vector que comprende una molécula de ácido
nucleico que codifica una cadena \beta de TCR en condiciones que
producen la expresión las cadenas de TCR respectivas;
purificar las cadenas respectivas de TCR; y
mezclar las cadenas respectivas de TCR en
condiciones de replegamiento de manera que un enlace disulfuro
covalente se une a un residuo de la región inmunoglobulina del
dominio constante de la cadena \alpha a un residuo de la región
inmunoglobulina del dominio constante de la cadena \beta.
41. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 40, en el que un enlace disulfuro intercadena
en el TCR nativo no está presente.
42. Un procedimiento según la reivindicación 41,
en el que las cadenas \alpha y \beta de TCR nativo se truncan en
el extremo C de manera que los residuos cisteína que forman el
enlace disulfuro intercadena nativo están excluidos.
43. Un procedimiento según la reivindicación 41,
en el que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro
intercadena nativo están sustituidos por otro residuo.
44. Un procedimiento según la reivindicación 43,
en el que los residuos cisteína que forman el enlace disulfuro
intercadena nativo están sustituidos por serina o alanina.
45. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 44, en el que el residuo cisteína no apareado
presente en la cadena \beta de TCR nativo no está presente.
46. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 45, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por los residuos cuyos átomos de carbono \beta están a menos de
0,6 nm de distancia en la estructura de TCR nativo.
47. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
48. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
49. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
50. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
51. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 46, en el que el enlace disulfuro que no está
presente en TCR nativo está entre los residuos cisteína sustituidos
por Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o
TRBC02*01.
52. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37, 38 y 41 a 51, en el que (i) y (ii) cada uno
comprende el dominio variable funcional del primer TCR condensado a
todo o parte del dominio constante de un segundo TCR, el primer y
segundo TCR siendo de la misma especie.
53. Un procedimiento según la reivindicación 52,
en el que los dominios constantes del segundo TCR son
N-terminal truncados a los residuos que forman el
enlace disulfuro intercadena no nativo.
54. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 53, en el que una o ambas cadenas se
derivatizan con, o se condensan a, un resto en su extremo C o N.
55. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 54, en el que una o ambas cadenas tienen un
residuo cisteína en su extremo C y/o N al que se puede condensar un
resto.
56. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 55, en el que el sTCR comprende además un
marcador detectable.
57. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 57, en el que el TCR está asociado a un agente
terapéutico.
58. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, que comprende además combinar una
pluralidad de sTCR para formar un complejo receptor de las células
T (TCR) multivalente.
59. Un procedimiento según la reivindicación 58,
en el que los TCR se combinan para formar un multímero de sTCR.
60. Un procedimiento según la reivindicación 59,
en el que dos, tres, cuatro o más moléculas receptoras de las
células T se asocian entre sí, preferiblemente mediante una molécula
engarce.
61. Un procedimiento según la reivindicación 58,
59 ó 60, en el que los sTCR o multímeros de sTCR se combinan en una
bicapa lipídica o están unidas a una partícula.
62. Un procedimiento para detectar complejos
MHC-péptido, que comprende:
- (i)
- proporcionar un TCR soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 57 o un complejo de receptores de células T multivalente producido mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 58 a 61;
- (ii)
- poner en contacto el TCR soluble o complejo de TCR multivalente con los complejos MHC-péptido; y
- (iii)
- detectar la unión del TCR soluble o complejo de TCR multivalente a los complejos MHC-péptido.
63. Una formulación farmacéutica que comprende
un sTCR producido mediante el procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 57, y/o un complejo de TCR multivalente
producido mediante el procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 58 a 61, junto con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
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