CN115803824A - 鉴定与临床反应相关的特征的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开文本涉及用于鉴定与在用治疗性细胞组合物结合细胞疗法治疗后受试者例如患者的临床反应相关的特征的方法，所述特征如受试者、治疗性细胞组合物和用于产生治疗性细胞组合物的输入组合物的属性。所述治疗性细胞组合物的细胞表达重组受体或其他转基因受体，所述重组受体如嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，所述其他转基因受体如T细胞受体(TCR)。所述方法提供用于鉴定与临床反应相关的特征。在一些实施方案中，所述方法可用于确定(例如，预测)受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的反应。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月13日提交的名称为“鉴定与临床反应相关的特征的方法及其用途(METHODS OF IDENTIFYING FEATURES ASSOCIATED WITH CLINICAL RESPONSE ANDUSES THEREOF)”的美国临时申请号63/024,494以及2020年6月10日提交的名称为“鉴定与临床反应相关的特征的方法及其用途(METHODS OF IDENTIFYING FEATURES ASSOCIATEDWITH CLINICAL RESPONSE AND USES THEREOF)”的美国临时申请号63/037,592的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。
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技术领域
本公开文本涉及用于鉴定与在用治疗性细胞组合物结合细胞疗法治疗后受试者例如患者的临床反应相关的特征的方法，所述特征如受试者、治疗性细胞组合物和用于产生治疗性细胞组合物的输入组合物的属性。所述治疗性细胞组合物的细胞表达重组受体或其他转基因受体，所述重组受体如嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，所述其他转基因受体如T细胞受体(TCR)。所述方法提供用于鉴定与临床反应相关的特征。在一些实施方案中，所述方法可用于确定(例如，预测)受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的反应。
背景技术
多种免疫疗法和/或细胞疗法可用于治疗疾病和病症。例如，过继细胞疗法(包括涉及施用表达对目的疾病或障碍具有特异性的嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))和/或其他重组抗原受体的细胞的那些过继细胞疗法，以及其他过继免疫细胞和过继T细胞疗法)在癌症或者其他疾病或障碍的治疗中可以是有益的。需要改进的方法来确定治疗是否会导致有益的临床反应。本文提供了解决此类需要的方法。
发明内容
本文提供了鉴定与临床反应相关的特征的方法，所述方法包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有CAR的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种所述受试者特征、一种或多种所述输入组合物特征和一种或多种所述治疗性细胞组合物特征；(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和所获得的临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机森林模型；以及(e)从经训练的随机森林模型鉴定与所述临床反应相关的信息特征。
本文提供了鉴定与临床反应相关的特征的方法，所述方法包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种所述受试者特征、一种或多种所述输入组合物特征和一种或多种所述治疗性细胞组合物特征；(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型；以及(e)从经训练的随机存活森林模型鉴定与所述临床反应相关的信息特征。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，鉴定与所述临床反应相关的信息特征包括确定每种所述信息特征的重要性量度。在一些实施方案中，所述重要性量度包括置换重要性量度、平均最小深度和/或来自随机森林例如经训练的随机森林模型的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。在一些实施方案中，所述重要性量度包括置换重要性量度、平均最小深度和/或来自随机存活森林例如经训练的随机存活森林模型的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。在一些实施方案中，所述重要性量度是置换重要性量度。在一些实施方案中，所述重要性量度是平均最小深度。在一些实施方案中，所述重要性量度是来自随机森林例如经训练的随机森林模型的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。在一些实施方案中，所述重要性量度是来自随机存活森林例如经训练的随机存活森林模型的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。在一些实施方案中，与所述临床反应相关的信息特征是通过每种所述信息特征的重要性量度的等级排序(例如等级排序值)鉴定的前10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种信息特征，其中所述重要性量度对于每种信息特征是相同的。在一些实施方案中，与所述临床反应相关的信息特征是通过每种所述信息特征的重要性量度的等级排序值鉴定的前5种信息特征，其中所述重要性量度对于每种信息特征是相同的。在一些实施方案中，与所述临床反应相关的信息特征是通过每种所述信息特征的重要性量度的等级排序值鉴定的首个信息特征，其中所述重要性量度对于每种信息特征是相同的。
本文提供了确定例如预测临床反应的方法，所述方法包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及(b)将所述特征作为输入应用于随机森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定例如预测所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机森林模型的信息特征相同。
本文提供了确定例如预测临床反应的方法，所述方法包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及(b)将所述特征作为输入应用于随机存活森林模型，所述随机存活森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定例如预测所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机存活森林模型的信息特征相同。
本文提供了治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)从来自受试者的样品选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；(b)确定包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及(c)将所述特征作为输入应用于随机森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定例如预测所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机森林模型的信息特征相同；以及向所述受试者施用治疗，其中：(1)如果确定例如预测所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、总体反应率(ORR)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述毒性是2级或更低分级的CRS或2级或更低分级的神经毒性)；或者(2)如果确定例如预测所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
本文提供了治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)从来自受试者的样品选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；(b)确定包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及(c)将所述特征作为输入应用于随机存活森林模型，所述随机存活森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定例如预测有待用所述治疗性细胞组合物治疗的受试者中的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机存活森林模型的信息特征相同；以及向所述受试者施用治疗，其中：(1)如果确定例如预测所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、总体反应率(ORR)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述毒性是2级或更低分级的CRS或2级或更低分级的神经毒性)；或者(2)如果确定例如预测所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
在任何实施方案的一些中，所述方法还包括产生治疗性细胞组合物。
在一些实施方案中本文提供了治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)从来自受试者的样品选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；(b)产生治疗性细胞组合物，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物(i)用于治疗所述疾病或病症，(ii)由所述输入组合物产生，以及(iii)将被施用于所述受试者；(c)确定包括以下的特征：(i)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前从所述受试者确定的受试者特征；(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征；以及(iii)从所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征；(c)将所述特征作为输入应用于随机森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定有待用所述治疗性细胞组合物治疗的受试者中的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机森林模型的信息特征相同；以及(d)向所述受试者施用治疗，其中：(1)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述轻度毒性反应是2级或更低分级的细胞因子释放综合征(CRS)或2级或更低分级的神经毒性)；或者(2)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征(CRS)或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
在一些实施方案中本文提供了治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)从来自受试者的样品选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；(b)产生治疗性细胞组合物，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物(i)用于治疗所述疾病或病症，(ii)由所述输入组合物产生，以及(iii)将被施用于所述受试者；(c)确定包括以下的特征：(i)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前从所述受试者确定的受试者特征；(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征；以及(iii)从所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征；(c)将所述特征作为输入应用于随机存活森林模型，所述随机存活森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定有待用所述治疗性细胞组合物治疗的受试者中的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机存活森林模型的信息特征相同；以及(d)向所述受试者施用治疗，其中：(1)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述轻度毒性反应是2级或更低分级的细胞因子释放综合征(CRS)或2级或更低分级的神经毒性)；或者(2)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征(CRS)或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
在一些实施方案中，对随机森林模型进行训练以确定受试者是否将具有完全反应(CR)。在一些实施方案中，(1)如果确定所述受试者具有完全反应(CR)，则向所述受试者施用预定治疗方案，或(2)如果确定所述受试者具有疾病进展(PD)，则向所述受试者施用改变的治疗方案。
在一些实施方案中，对随机森林模型进行训练以确定受试者是否将具有部分反应(PR)。在一些实施方案中，(1)如果确定所述受试者具有部分反应(PR)，则向所述受试者施用预定治疗方案，或(2)如果确定所述受试者具有疾病进展(PD)，则向所述受试者施用改变的治疗方案。
在一些实施方案中，对随机森林模型进行训练以确定受试者是否将具有大于3个月的持久反应。在一些实施方案中，对随机森林存活模型进行训练以确定受试者是否将具有大于3个月的持久反应。在一些实施方案中，(1)如果确定所述受试者具有大于三个月的持久反应，则向所述受试者施用预定治疗方案；或(2)如果确定所述受试者具有小于三个月的持久反应，则向所述受试者施用改变的治疗方案。
在一些实施方案中，对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有超过3个月的无进展存活期(PFS)。在一些实施方案中，对所述随机存活森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有超过3个月的无进展存活期(PFS)。在一些实施方案中，(1)如果确定所述受试者具有大于三个月的无进展存活期(PFS)，则向所述受试者施用预定治疗方案，或(2)如果确定所述受试者具有小于三个月的无进展存活期(PFS)，则向所述受试者施用改变的治疗方案。
在一些实施方案中，对随机森林模型进行训练以确定受试者是否将具有客观反应(OR)。在一些实施方案中，(1)如果确定所述受试者具有客观反应(OR)，则向所述受试者施用预定治疗方案，或(2)如果确定所述受试者具有疾病进展(PD)，则向所述受试者施用改变的治疗方案。
在一些实施方案中，对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者的药代动力学反应。在一些实施方案中，(1)如果确定所述受试者具有为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应，则向所述受试者施用预定治疗方案；或(2)如果确定所述受试者具有与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应，则向所述受试者施用改变的治疗方案。
在一些实施方案中，对随机森林模型进行训练以确定受试者是否将具有毒性反应。在一些实施方案中，(1)如果确定所述受试者没有毒性反应或具有轻度毒性反应，则向所述受试者施用预定治疗方案，或(2)如果确定所述受试者具有毒性反应，则向所述受试者施用改变的治疗方案。在一些实施方案中，毒性反应是重度CRS。在一些实施方案中，毒性反应是重度神经毒性。
在一些实施方案中，使用监督训练对随机森林模型进行训练，所述监督训练包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；(d)应用来自多名受试者的信息特征和获得的临床反应作为输入，以训练随机森林模型。
在一些实施方案中，使用监督训练对随机存活森林模型进行训练，所述监督训练包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；(d)应用来自所述多名受试者的信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型。
本文提供了开发随机森林模型的方法，所述方法包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；(d)应用来自多名受试者的信息特征和获得的临床反应作为输入，以训练随机森林模型。
本文提供了开发随机存活森林模型的方法，所述方法包括：(a)接收包括以下的特征：(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；(d)应用来自所述多名受试者的信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型。
在一些实施方案中，向所述多名受试者中的每一名施用所述多种治疗性细胞组合物中的一种，其中向所述受试者施用的所述一种治疗性细胞组合物是从来自所述受试者的样品的输入组合物产生的治疗性细胞组合物。
在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括以下中的一个或多个：a)去除数据缺失大于、大于约或50％的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；b)去除具有零方差或大于、大于约或95％的等于单个值的数据值和/或小于0.1n个独特值(其中n＝样本数量)的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；c)通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据；d)鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有大于、约或等于0.5的相关系数的受试者特征、输入组合物特征、治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括或是去除数据缺失大于、约或50％的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括或是去除具有零方差或大于、约或95％的等于单个值的数据值且小于0.1n个独特值(其中n＝样本数量)的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括或是通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括或是鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有大于、约或等于0.5的相关系数的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
在一些实施方案中，使用交叉验证来评价随机森林模型。在一些实施方案中，使用交叉验证来评价随机存活森林模型。在一些实施方案中，交叉验证是或是至少10折交叉验证。在一些实施方案中，交叉验证是嵌套交叉验证。
在一些实施方案中，所述多名受试者是或是约500、400、300、200、150、100、50、25、15或10名受试者，或者是任何前述值之间的任何数量。在一些实施方案中，所述多名受试者是、是约或是大于10名受试者且小于250名受试者。在一些实施方案中，所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者且小于200名受试者。在一些实施方案中，所述多名受试者是、是约或是大于20名且小于150名受试者。在一些实施方案中，所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者且小于150名受试者。在一些实施方案中，所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者且小于100名受试者。在一些实施方案中，所述多名受试者参与临床试验。
在一些实施方案中，所述受试者特征包括受试者属性和临床属性中的一种或多种。在一些实施方案中，所述受试者属性包括年龄、重量、身高、种族、人种、性别和体重指数中的一种或多种。在一些实施方案中，所述临床属性包括生物标记、疾病诊断、疾病负荷、疾病持续时间、疾病分级和治疗史中的一种或多种。在一些实施方案中，所述输入组合物特征包括细胞表型。在一些实施方案中，所述治疗性细胞组合物特征包括细胞表型、重组受体依赖性活性和剂量中的一种或多种。在一些实施方案中，所述临床反应包括以下中的一种或多种：完全反应(CR)、部分反应(PR)、持久反应、无进展存活期(PFS)、总体反应率(ORR)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应、无或轻度毒性反应、毒性反应、与目标反应相比降低的药代动力学反应，或缺乏CR、PR、持久反应、ORR、OR或PFS。
在一些实施方案中，所述临床反应是或包括完全反应(CR)、部分反应(PR)、持久反应、无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应、无或轻度毒性反应、毒性反应、与目标反应相比降低的药代动力学反应，或缺乏CR、PR、持久反应或客观反应(OR)。
在一些实施方案中，临床反应是完全反应(CR)。在一些实施方案中，临床反应是缺乏完全反应(CR)。在一些实施方案中，临床反应是部分反应(PR)。在一些实施方案中，临床反应是缺乏部分反应(PR)。在一些实施方案中，临床反应是客观反应(OR)。在一些实施方案中，临床反应是缺乏客观反应(OR)。在一些实施方案中，临床反应是毒性反应。在一些实施方案中，临床反应是缺乏毒性反应。在一些实施方案中，毒性反应是轻度毒性反应。在一些实施方案中，毒性反应是重度毒性反应。在一些实施方案中，毒性反应是重度CRS。在一些实施方案中，毒性反应是重度神经毒性。在一些实施方案中，临床反应是持久反应。在一些实施方案中，临床反应是缺乏持久反应。在一些实施方案中，临床反应是反应持续时间(DOR)。在一些实施方案中，临床反应是至少或至少约三个月的反应持续时间(DOR)。在一些实施方案中，临床反应是无进展存活期(PFS)。在一些实施方案中，临床反应是至少或至少约三个月的无进展存活期(PFS)。在一些实施方案中，临床反应是为或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应。在一些实施方案中，药代动力学反应是在用治疗性细胞组合物治疗受试者之后，所述治疗性细胞组合物的CAR T细胞的扩增的量度。在一些实施方案中，药代动力学反应是在用治疗性细胞组合物治疗受试者之后，所述受试者中的最大CAR T细胞浓度的量度。在一些实施方案中，药代动力学反应是在用治疗性细胞组合物治疗受试者之后，所述受试者中CAR T细胞浓度最大的时间点的量度。在一些实施方案中，药代动力学反应是在用治疗性细胞组合物治疗受试者之后，所述受试者向所述治疗性细胞组合物的CAR T细胞的暴露的量度。
在一些实施方案中，所述样品包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，所述样品是单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，所述单采术产物或白细胞单采术产物先前已经进行冷冻保存。在一些实施方案中，所述T细胞包括从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括CD3+、CD4+和/或CD8+。
在一些实施方案中，所述输入组合物包含CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞，并且所述治疗性细胞组合物包含表达重组受体的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞并且由所述输入组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞的治疗性细胞组合物特征。
在一些实施方案中，所述输入组合物包括CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物，并且所述治疗性细胞组合物包括表达重组受体的CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物并且由所述输入组合物的相应CD4+或CD8+ T细胞组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的CD4+和CD8+ T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的各单独组合物的CD4+和CD8+ T细胞的治疗性细胞组合物特征。
在一些实施方案中，所述输入组合物包括CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物，并且所述治疗性细胞组合物包括表达重组受体的CD4+和CD8+ T细胞的混合组合物并且由所述输入组合物的单独CD4+和CD8+ T细胞组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的单独CD4+和CD8+ T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的CD4+和CD8+细胞的混合组合物的治疗性细胞组合物特征。
在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述预定治疗方案包括或是包括施用以下的单一治疗：a)向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞；b)向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞；或c)向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，改变预定治疗方案，例如改变的治疗方案，包括或是包括施用以下的单一治疗：当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞；当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞；或当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，改变预定治疗方案，例如改变的治疗方案，包括或是包括施用以下的单一治疗：当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞；当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞；或当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，其中改变预定治疗方案，例如改变的治疗方案，包括将所述治疗性细胞组合物与第二治疗剂组合施用。
附图说明
图1A和图1B示出了包含在随机森林模型中的示例性决策树。
图2A示出了使用随机森林和存活森林鉴定为因与用治疗性细胞组合物治疗之后的log10AUC(AUC0-28，在输注后28天的浓度-时间曲线下面积)相关而重要的示例性显著特征簇。箭头表示相关性的方向性。图2B示出了log10AUC与患者年龄之间的相关性。图2C示出了独立于所有其他特征，患者年龄对log10AUC的累积局部效应。图2D示出了log10AUC与患者接受的先前治疗的总数量之间的相关性。图2E示出了独立于所有其他特征，患者接受的先前治疗的数量对log10AUC的累积局部效应。图2F示出了log10AUC与治疗性细胞组合物的CD8+T细胞的效应细胞因子分泌之间的相关性。图2G示出了独立于所有其他特征，治疗性细胞组合物的CD8+ T细胞的效应细胞因子分泌对log10AUC的累积局部效应。
图3A示出了使用随机森林和存活森林鉴定为因与用治疗性细胞组合物治疗之后的无进展存活期(PFS)相关而重要的示例性显著特征簇。箭头表示相关性的方向性。图3B示出了独立于所有其他特征，治疗性细胞组合物中的CD4+ T细胞的抗原特异性细胞因子产生对PFS的累积局部效应。图3C示出了在用淋巴细胞清除化学疗法治疗之前(LDC前)，独立于所有其他特征，乳酸脱氢酶(LDH)水平对PFS的累积局部效应。
图4A示出了使用随机森林和存活森林鉴定为因与用治疗性细胞组合物治疗之后的完全反应(CR)相关而重要的示例性显著特征簇。箭头表示相关性的方向性。图4B示出了独立于所有其他特征，治疗性细胞组合物中的CD4+ T细胞的抗原特异性细胞因子产生对CR的累积局部效应。图4C示出了独立于所有其他特征，治疗性细胞组合物中的CD8+ T细胞的抗原特异性细胞因子产生对CR的累积局部效应。图4D示出了在用淋巴细胞清除化学疗法治疗之前(LDC前)，独立于所有其他特征，通过直径乘积之和(SPD)测量的肿瘤负荷对CR的累积局部效应。图4E示出了在用淋巴细胞清除化学疗法治疗之前(LDC前)，独立于所有其他特征，通过LDH测量的肿瘤负荷对CR的累积局部效应。
图5A示出了使用随机森林和存活森林鉴定为因与用治疗性细胞组合物治疗之后的神经学事件(NE)相关而重要的示例性显著特征簇。箭头表示相关性的方向性。图5B示出了被鉴定为因与用治疗性细胞组合物治疗之后的细胞因子释放综合征(CRS)相关而重要的显著特征簇。箭头表示相关性的方向性。图5C示出了在用淋巴细胞清除化学疗法治疗之前(LDC前)，独立于所有其他特征，通过LDH测量的肿瘤负荷对神经学事件(NE)的累积局部效应。图5D示出了在用淋巴细胞清除化学疗法治疗之前(LDC前)，独立于所有其他特征，通过LDH测量的肿瘤负荷对CRS的累积局部效应。图5E示出了独立于所有其他特征，桥接疗法对CRS的累积局部效应。
具体实施方式
本文提供了用于鉴定与采用用于治疗疾病和病症(包括各种癌症)的细胞疗法如工程化T细胞疗法(例如治疗性细胞组合物)治疗之后受试者的临床反应相关的特征的方法。在一些实施方案中，所述方法确定例如预测在治疗受试者之前受试者对用细胞疗法(例如，治疗性细胞组合物)治疗的临床反应。本文提供的方法的方面，包括其实施方案，涉及确定细胞疗法(例如治疗性细胞组合物)的有效剂量和施用。
许多受试者(患者)属性、用于产生药物产品的起始材料的属性(例如，输入组合物特征)和药物产品(例如，治疗性细胞组合物)属性已在细胞疗法试验中展现出与临床终点(例如，反应)名义上显著的单变量关系。然而，对细胞疗法的临床反应可取决于许多因素，包括但不限于受试者的特征、治疗性细胞组合物的特征以及产生治疗性细胞组合物的输入组合物的特征。量化受试者特征、起始材料(例如，输入组合物)特征和药物产品(例如，治疗性细胞组合物)特征对功效、安全性和药代动力学(PK)反应的多因素贡献是细胞疗法领域的挑战。
本文提供的方法通过使用监督机器学习来解决多变量特征评估的挑战。例如，本文提供的机器学习模型能够评估多个不同特征如何贡献于(例如，确定或预测)临床反应。可以查询或询问模型以鉴定与临床反应相关的特征，例如特征组。在一些情况下，根据本文的方法，还可以对一组特征中的每种特征在确定临床反应中的重要性进行排名。在一些情况下，此信息可用于跨异质患者群体优化临床经验。在一些情况下，此信息可用于优化药物产品生产和制造。
本文提供的方法包括机器学习模型，所述机器学习模型被训练为基于特征如受试者的属性(例如受试者特征)、治疗性细胞组合物的属性(例如治疗性细胞组合物特征)、和用于产生治疗性细胞组合物的输入组合物的属性(例如输入组合物特征)，确定(例如预测)受试者对细胞疗法(例如治疗性组合物)的临床反应，如完全反应(CR)、部分反应(PR)、持久反应(例如反应持久性，DOR)、毒性反应和/或药代动力学反应。在一些实施方案中，受试者特征包括受试者属性，如年龄和重量；和临床属性，如生物标记和生物标记的组合的表达、疾病负荷(例如，肿瘤负荷的量度)、治疗史及其组合。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括但不限于细胞表型如细胞健康(例如，活细胞计数、死细胞数量)、表面标记的存在和/或表达、表面标记的不存在或缺乏表达、细胞因子的存在和/或表达、细胞因子的不存在或缺乏表达、重组受体表达(例如，CAR+)、重组受体依赖性活性(例如，细胞溶解活性、细胞因子产生)及其组合。在一些实施方案中，输入组合物特征包括但不限于细胞表型如细胞健康(例如，活细胞浓度、死细胞数量)、表面标记的存在和/或表达、表面标记的不存在或缺乏表达、及其组合。
在一些方面，本文提供的方法包括机器学习模型，所述机器学习模型被训练为基于受试者的属性(例如，受试者特征)、治疗性细胞组合物的属性(例如，治疗性细胞组合物特征)以及用于产生治疗性细胞组合物的输入组合物的属性(例如，输入组合物特征)，确定(例如预测)受试者对细胞疗法(例如，治疗性组合物)的临床反应。在一些方面中，使用输入组合物作为起始材料产生治疗性细胞组合物。在一些方面，使用受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征训练机器学习模型提供了超过仅使用这些特征集的子集的训练的某些优势。这些优势包括能够更准确地预测受试者的临床反应或更好地鉴定与临床反应相关的信息特征。在一些方面，所提供的方法基于以下认识：即使当输入组合物用作产生治疗性细胞组合物的起始材料时，所述输入组合物在制造之前的特征可以含有与对所述治疗性细胞组合物的临床反应相关的信息，所述信息不包括在所述治疗性细胞组合物在制造之后的特征中或由所述治疗性细胞组合物在制造之后的特征解释。因此，在一些方面，相对于单独用受试者特征和/或治疗性细胞组合物特征训练时所实现的，在模型训练中包括输入组合物特征可以改进模型性能或信息特征的鉴定。
在一些方面，设想为根据本文提供的方法使用的机器学习模型是透明机器学习模型。使用透明机器学习模型是特别有利的，因为它允许鉴定与受试者的临床反应相关的特征。在一些实施方案中，在用细胞疗法治疗受试者之前，可以在受试者中评估被鉴定为与临床反应相关的特征，以确定例如预测受试者是否将对治疗具有期望的或有利的临床反应。
在一些情况下，模型，包括传统的“黑匣子”模型，如果它们可以被查询或询问，从而可以了解对模型如何得出特定决策的理解，则可以认为模型是透明的。在一些实施方案中，对模型如何得出特定决策的理解是或包括鉴定有助于决策的特征或特征组(例如，一种或多种变量)。例如，鉴于本文提供的方法，在一些实施方案中，如果模型可以被询问或查询以鉴定与临床反应相关的特征(例如，确定临床反应的特征重要性)，则认为模型是透明的。在一些实施方案中，每种特征对得到特定决策的贡献被量化。在一些情况下，特征的鉴定和/或量化是通过例如系统地或在受控的和已知的条件下操纵模型并评估模型的准确性(例如，预测准确性)及其在操纵中的变化来确定的。
在一些实施方案中，机器学习模型是随机森林模型。在一些实施方案中，机器学习模型是随机存活森林模型。如上所述，使用随机森林和随机存活森林的优势在于它们的透明性。例如，可以询问随机森林和随机存活森林模型，使得可以鉴定用于预测受试者对细胞疗法的临床反应(例如，治疗性细胞组合物)的特征。在一些实施方案中，用于确定例如预测临床反应的特征被认为与临床反应相关。在一些实施方案中，鉴定用于确定例如预测受试者的临床反应的特征包括评估特征重要性，例如如本文所述(参见，第I.B.1a节和第I.B.2a节)。
在一些实施方案中，询问本文提供的随机森林模型以鉴定与临床反应相关的特征。在一些实施方案中，本文提供的随机森林模型用于确定(例如，分类或预测)尚未用细胞疗法(例如，治疗性细胞组合物)治疗的受试者将具有哪些临床反应。在一些实施方案中，确定例如预测受试者在治疗之前将具有哪些临床反应可导致根据预定治疗方案或根据与所述预定治疗方案不同(例如，改变)的治疗方案来治疗受试者。在一些实施方案中，鉴于所确定的例如预测的临床反应而改变所述预定治疗方案可导致改善的或有利的临床反应，或增加所述受试者具有改善的或有利的临床反应的概率或可能性。
随机存活森林模型能够处理右删失的存活数据，并规避限制性假定，如比例风险或参数假定。在一些实施方案中，随机存活森林模型能够处理多个变量之间的非线性效应和相互作用。这些特征对于建立风险预测模型(例如，临床反应的风险预测模型)是有利的。在一些实施方案中，询问本文提供的随机存活森林模型以鉴定与临床反应相关的特征。例如，可以鉴定与在给定时间量内具有临床反应的概率相关的特征。在一些实施方案中，本文提供的随机存活森林模型用于在治疗受试者之前确定在用细胞疗法(例如治疗性细胞组合物)治疗后受试者具有临床反应的概率。在一些实施方案中，本文提供的随机存活森林模型用于确定受试者的临床反应函数和累积风险函数。在一些实施方案中，所述随机存活森林模型可以估计受试者具有临床反应的风险。在一些实施方案中，所述随机存活森林模型可以估计受试者不具有临床反应的风险。在一些实施方案中，在治疗之前确定(例如估计或预测)在治疗后受试者具有或不具有临床反应可导致根据预定治疗方案或根据与所述预定治疗方案不同(例如，改变)的治疗方案治疗受试者。在一些实施方案中，改变所述预定治疗方案可导致改善的或有利的临床反应，或增加所述受试者具有改善的或有利的临床反应的概率或可能性。
对本文提供的机器学习模型(例如，随机森林和随机存活森林)进行训练，以基于与待治疗的受试者(例如，患者)、待施用于受试者的治疗性细胞组合物、和用于产生治疗性细胞组合物的输入组合物(例如，源自受试者的起始材料)相关的各种特征来预测临床反应。在一些实施方案中，使用与待治疗的受试者相关的特征(例如，在治疗之前的受试者特征)、与待施用于受试者的治疗性细胞组合物相关的特征(例如治疗性细胞组合物特征)、和与用于产生治疗性细胞组合物的输入组合物(例如，源自受试者的起始材料)相关的特征(例如输入组合物特征)对本文提供的机器学习模型进行训练。
在一些实施方案中，所述训练是监督学习。在使用监督学习来训练模型的情况下，确定、获得或以其他方式接收来自已经用治疗性细胞组合物治疗的受试者的临床反应，并且对此已经获得了特征(例如，受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征)。如上所述，在一些实施方案中，临床反应包括但不限于功效结局，如总体反应；完全反应(CR)；部分反应(PR)；持久反应(例如，反应持久性，DOR)，这种反应持续至少3个月、6个月或更长时间；安全结局，如毒性例如神经毒性或CRS的发展；和药代动力学反应，如细胞的最大血清浓度(Cmax)和暴露(例如，曲线下面积(AUC))。
通过确定、获得或接收特征，例如除了用治疗性细胞组合物治疗之后的临床反应之外还有治疗之前的受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征，可以使用标记的数据训练模型。可以使用测试数据对模型进行测试，以确定经训练模型的预测准确性。应理解，对于随机存活森林模型的训练，时间和删失组分(例如，事件发生的时间)将伴随临床反应。
在一些实施方案中，对受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征进行预处理。在一些方面，数据预处理避免了创建产生误导性或不准确结果的模型。在一些实施方案中，预处理防止超出范围的值、缺失值、不可能的数据组合、高度相关的特征以及其他混杂特征被并入模型中(例如被模型学习)。在所提供的实施方案中，发现所提供的预处理步骤对于训练来自小数据队列的数据特别有利，所述来自小数据队列的数据如可能从与治疗药物的临床试验相关的数据(包括涉及T细胞疗法(例如，CAR T细胞)的数据)呈现。
在一些情况下，例如在治疗药物的临床试验期间，可以使用不同剂量水平来治疗不同数量的受试者。例如，100名受试者的队列可接受特定剂量，而50名受试者的不同队列可接受明显不同的剂量。在一些情况下，这可导致数据集不平衡。在一些情况下，样本量的差异也可给训练模型带来问题。在一些方面，通过包括剂量作为训练模型的特征来纠正不平衡。
在一些情况下，预处理导致信息特征的鉴定。例如，预处理可以用于去除具有很少或没有方差的特征、高度相关的特征或具有缺失值的特征，或者用于替换缺失值，使得其余的特征是信息性的、可区分的和独立的(例如，信息特征)。在一些实施方案中，将机器学习模型(例如，随机森林和随机存活森林)在通过预处理鉴定的信息特征上训练。在一些实施方案中，使用监督学习将机器学习模型(例如，随机森林和随机存活森林)在通过预处理鉴定的信息特征上训练。在一些实施方案中，用作模型的输入以确定临床反应的特征(例如，受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入特征)是与用于训练模型的信息特征相同的信息特征。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。I.鉴定与临床结局相关的特征并确定临床结局的方法
本文提供的方法允许鉴定与用治疗性细胞组合物治疗之后受试者中的临床反应相关的特征，如受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征。在一些实施方案中，所述方法允许在用治疗性细胞组合物治疗之前基于特征(例如，受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征)确定有待用治疗性细胞组合物治疗的受试者的临床反应。在早期阶段(例如，在治疗之前)拥有此类型信息允许在治疗受试者之前开发治疗策略(例如，组合治疗、给药)，从而增加受试者具有阳性或有利反应(例如，持久反应、无进展存活期)的概率。
本文提供的方法包括生成包括工程化CD3+、CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+细胞的治疗性细胞组合物(例如治疗性T细胞组合物)，其中治疗性细胞组合物是从包括CD3+、CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞的输入组合物产生的。在一些实施方案中，输入组合物包括两种单独的组合物，例如，CD4+组合物和CD8+组合物。在一些实施方案中，输入组合物含有包括CD4+和CD8+细胞的单一组合物。在一些实施方案中，本文提供的用于生成治疗性细胞组合物的方法包括生成用于治疗性细胞组合物的CD4+和CD8+工程化细胞。在一些实施方案中，CD4+和CD8+细胞被单独工程化，例如以产生单独的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，所述CD4+和CD8+细胞被单独工程化以从单独的CD4+和CD8+输入组合物产生单独的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，所述治疗性细胞组合物含有混合的CD4+和CD8+工程化细胞。在一些实施方案中，将单独治疗性细胞组合物的单独CD4+和CD8+工程化细胞组合以产生混合的CD4+和CD8+工程化细胞治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，混合的CD4+和CD8+工程化细胞治疗性细胞组合物由含有混合的CD4+和CD8+的单一输入组合物产生。输入组合物和治疗性细胞组合物的特征可以从混合或单独的组合物确定、接收或获得。
A.特征和临床反应
设想受试者对用治疗性细胞组合物治疗的临床反应取决于许多因素，包括但不限于受试者的特征、治疗性细胞组合物的特征以及产生治疗性细胞组合物的输入组合物的特征。因此，本文提供的方法涉及使用机器学习模型评估在与用治疗性细胞组合物治疗的受试者相关的特征、与治疗性细胞组合物相关的特征、和产生治疗性细胞组合物的输入组合物的特征与在用治疗性细胞组合物治疗之后受试者的临床反应之间的关系。
在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的与受试者相关的特征包括受试者属性(如年龄和重量)、临床属性(如生物标记和生物标记的组合的表达、疾病负荷(例如，肿瘤负荷的测量)、治疗史、及其组合)。
在一些实施方案中，与治疗性细胞组合物和输入组合物相关的特征包括细胞表型。在一些实施方案中，通过以下方式确定细胞表型：评估一种或多种特定分子的存在或不存在，所述一种或多种特定分子包括可以由输入组合物或治疗性细胞组合物内的细胞或细胞亚群积累或产生的表面分子和/或分子。在一些实施方案中，细胞表型可以包括细胞活性，如响应于刺激物而产生因子(例如，细胞因子)。在一些实施方案中，因子(例如，细胞因子)的产生响应于重组受体依赖性激活。在一些实施方案中，通过以下方式确定治疗性细胞组合物的细胞的重组受体依赖性活性：评估可以由治疗性细胞组合物内的细胞或细胞亚群积累或产生的一种或多种特定分子(例如，细胞因子)。在一些实施方案中，通过确定治疗性细胞组合物的细胞的细胞溶解活性来评估重组受体依赖性活性。
在一些实施方案中，输入组合物和/或治疗性细胞组合物的特征包括细胞组合物(例如，表面分子、细胞因子、重组受体)的表型的测定、检测、定量或其他评估。在特定实施方案中，所述组合物(例如，输入组合物、治疗性细胞组合物)的特征包括特定分子(例如，表面分子、细胞因子、重组受体)的存在、不存在、表达程度或水平的测定、检测、定量或其他评估。在一些实施方案中，确定具有某一属性的细胞的百分比、数量、比率和/或比例。在一些实施方案中，具有属性的细胞的百分比、数量、比率和/或比例是治疗性细胞组合物特征或输入组合物特征，其可用作本文提供的机器学习算法的输入。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征或输入组合物特征是表型，例如细胞表型。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征或输入组合物特征是指示细胞活力的表型。在一些实施方案中，表型指示凋亡的不存在、凋亡的早期阶段的不存在或凋亡的晚期阶段的不存在。在一些实施方案中，表型是指示凋亡、早期凋亡或凋亡的晚期阶段不存在的因子的不存在。在一些实施方案中，表型是治疗性细胞组合物中T细胞的亚群或子集(如重组受体表达T细胞(例如CAR+ T细胞)、CD8+ T细胞、或CD4+ T细胞)的表型。在一些实施方案中，表型是未被激活、和/或缺乏一种或多种激活标记的表达或一种或多种激活标记的表达被减少或较低的细胞的表型。在一些实施方案中，表型是未被耗竭和/或缺乏一种或多种耗竭标记的表达或一种或多种耗竭标记的表达被减少或较低的细胞的表型。
在一些实施方案中，表型是一种或多种细胞因子的产生。在一些实施方案中，例如当由治疗性细胞组合物的工程化细胞响应于由细胞表达的重组受体与其抗原的接合而产生和/或分泌细胞因子时，这种活性称为重组受体依赖性活动。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征是重组受体依赖性活性。
在一些实施方案中，通过细胞内细胞因子染色来测量、检测和/或定量一种或多种细胞因子的产生。在特定实施方案中，表型是缺乏细胞因子的产生。在特定实施方案中，表型是对于细胞因子的产生呈阳性或者是高水平的细胞因子产生。通过流式细胞术进行的细胞内细胞因子染色(ICS)是非常适合于在单细胞水平上研究细胞因子产生的一种技术。它检测在细胞刺激后在内质网内的细胞因子的产生和积累，从而允许鉴定对于特定细胞因子的产生呈阳性或阴性的细胞群或基于阈值将高产和低产细胞分离。ICS还可以与其他流式细胞术方案结合用于使用细胞表面标记或用MHC多聚体进行免疫表型分析，以获得特定细胞亚群中的细胞因子产生，使ICS成为极其灵活和通用的方法。用于测量或检测细胞因子产生的其他单细胞技术包括但不限于ELISPOT、有限稀释和T细胞克隆。
在特定实施方案中，例如在治疗性细胞组合物中，特征包括重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，活性是重组受体(例如CAR)依赖性活性，所述重组受体(例如CAR)依赖性活性是或包括可溶性因子的产生和/或分泌。在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子或趋化因子。
用于测量可溶性因子的产生或分泌的合适技术在本领域中是已知的。可溶性因子的产生和/或分泌可以通过确定因子的细胞外量的浓度或量，或确定编码因子的基因的转录活性的量来测量。合适的技术包括但不限于以下测定：如免疫测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、mRNA表达水平测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、alphalisa测定、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧向流动免疫测定、抑制测定或亲合力测定、蛋白质微阵列、高效液相色谱(HPLC)、中尺度发现(Meso Scale Discovery，MSD)电化学发光和基于珠的多重免疫测定(MIA)。在一些实施方案中，合适的技术可以使用特异性地结合可溶性因子的可检测结合试剂。
在一些实施方案中，表型通过一种或多种特定分子在细胞中的存在、不存在或表达水平来指示，所述一种或多种特定分子是例如指示表型的某些表面标记(例如表面蛋白)、指示表型的细胞内标记、或指示表型的核酸、或指示表型的其他分子或因子。在一些实施方案中，表型是或包含所述一种或多种特定分子的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，特定分子包括但不限于表面标记(例如，膜糖蛋白或受体)；与凋亡或活力相关的标记；或指示免疫细胞状态的特定分子(例如，与激活、耗竭或成熟或幼稚表型相关的标记)。在一些实施方案中，用于基于特定分子评估或测量、计数和/或定量细胞的任何已知方法都可以用于确定组合物(例如，输入组合物、治疗性细胞组合物)中具有所述表型的细胞的数量。
在一些实施方案中，表型是或包括在细胞中一种或多种特定分子的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，阳性表达由细胞中特定分子的可检测量指示。在某些实施方案中，可检测量是在细胞中特定分子的任何检测量。在特定实施方案中，可检测量是在细胞中大于背景(例如背景染色、信号等)的量。在某些实施方案中，阳性表达是大于阈值(例如预定的阈值)的特定分子的量。同样地，在特定实施方案中，具有特定分子的阴性表达的细胞可以是未确定具有阳性表达的任何细胞，或者是缺乏可检测量的特定分子或高于背景的可检测量的特定分子的细胞。在一些实施方案中，如果特定分子的量低于阈值，则细胞具有特定分子的阴性表达。作为常规技能，本领域技术人员将理解如何定义阈值来定义特定分子的阳性和/或阴性表达，并且所述阈值可以根据特定参数(例如但不限于检测的测定或方法、特定分子的身份、用于检测的试剂和仪器)来定义。
可以用于检测特定分子和/或分析细胞表型的方法的例子包括但不限于生化分析；免疫化学分析；图像分析；细胞形态学分析；分子分析如PCR、测序、高通量测序、DNA甲基化的确定；蛋白质组学分析，如蛋白质糖基化和/或磷酸化模式的确定；基因组学分析；表观基因组学分析(例如ChIP-seq或ATAC-seq)；转录组学分析(例如RNA-seq)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述方法可以包括评估免疫受体库，例如T细胞受体(TCR)的库。在一些方面，可以在高通量方法、自动化方法中和/或通过基于单细胞的方法来评估任何表型的确定。在一些方面，大规模或全基因组方法可用于鉴定一种或多种分子特征。在一些方面，可以确定细胞中的一种或多种分子特征，例如特定RNA或蛋白质的表达。在一些实施方案中，通过图像分析、PCR(包括标准PCR和PCR的所有变化形式)、微阵列(包括但不限于DNA微阵列、用于微小RNA的MMchips、蛋白质微阵列、细胞微阵列、抗体微阵列和碳水化合物阵列)、测序、生物标记检测或用于确定DNA甲基化或蛋白质糖基化模式的方法来分析表型的分子特征。在特定实施方案中，特定分子是多肽，即蛋白质。在一些实施方案中，特定分子是多核苷酸。
在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来确定特定分子的阳性或阴性表达，所述一种或多种抗体或其他结合剂分别与在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。在特定实施方案中，阳性或阴性表达通过流式细胞术、免疫组织化学或用于检测特定标记的任何其他合适的方法来确定。
在特定实施方案中，用流式细胞术来评估特定分子的表达。流式细胞术是基于激光或基于阻抗的生物物理学技术，用于细胞计数、细胞分选、生物标记检测和蛋白质工程，通过将细胞悬浮在流体流中并使其流经电子检测仪器来进行。它允许每秒对高达数千个颗粒的物理和化学特征同时进行多参数分析。
可以将由流式细胞仪产生的数据在单一维度上绘制以产生直方图，或者在二维点图中或甚至在三维中绘制。可以基于荧光强度，通过创建一系列子集提取依序分离这些图上的区域，称之为“门”。存在用于诊断和临床目的(尤其是与免疫学有关的)的特定门控方案。通常以对数标度制作图。因为不同的荧光染料的发射光谱重叠，所以必须以电子方式以及计算方式对检测器的信号进行补偿。使用流式细胞仪累积的数据可以使用软件进行分析，所述软件是例如JMP(统计软件)、WinMDI、Flowing Software和基于网络的Cytobank)、Cellcion、FCS Express、FlowJo、FACSDiva、CytoPaint(也称为Paint-A-Gate)、VenturiOne、CellQuest Pro、Infinicyt或Cytospec。
流式细胞术是本领域的标准技术，并且技术人员将容易地理解如何设计或调整方案来检测一种或多种特定分子并分析数据以确定一种或多种特定分子在细胞群中的表达。用于流式细胞术的标准方案和技术发现于以下文献中：Loyd“Flow Cytometry inMicrobiology”；Practical Flow Cytometry，Howard M.Shapiro；Flow Cytometry forBiotechnology，Larry A.Sklar；Handbook of Flow Cytometry Methods，J.PaulRobinson等人；Current Protocols in Cytometry,Wiley-Liss Pub,Flow Cytometry inClinical Diagnosis,v4,(Carey、McCoy、和Keren编),ASCP Press,2007；Ormerod,M.G.(编辑)(2000)Flow Cytometry-A practical approach.第3版.Oxford University Press,牛津,英国；Ormerod,M.G.(1999)Flow Cytometry.第2版.BIOS Scientific Publishers,牛津；以及Flow Cytometry-A basic introduction.Michael G.Ormerod,2008。
在一些实施方案中，将细胞通过表型分选以进行进一步分析。在一些实施方案中，通过荧光激活的细胞分选(FACS)对在同一细胞组合物内的不同表型的细胞进行分选。FACS是专门类型的流式细胞术，其允许基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，将细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器中，每次一个细胞。它是有用的科学仪器，因为它提供对来自单独细胞的荧光信号的快速、客观和定量的记录以及对特别感兴趣的细胞的物理分离。
在一些实施方案中，输入组合物特征或治疗性组合物特征可以包括细胞组合物的特征中的任何一种或多种，例如分别与输入细胞组合物或治疗性T细胞组合物(例如，CAR-T细胞)相关的参数或活性，如已公开的国际申请WO 2019/032929、WO 2018/223101、WO2019/089848、WO 2020/113194、WO 2019/090003、WO 2020/092848、WO 2019/113559和WO2018/157171中所述，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，受试者特征可以包括受试者的或与受试者相关的特征或特性中的任何一种或多种(例如，在涉及施用治疗性T细胞组合物的临床试验中，受试者的属性或与受试者相关的临床属性)，如在已公开的国际申请WO 2019/032929、WO 2018/223101、WO 2019/089848、WO 2020/113194、WO2019/090003、WO 2020/092848、WO 2019/113559和WO 2018/157171中所述，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，对治疗性细胞组合物(例如，CAR-T细胞)的临床反应可以包括在公开的国际申请WO 2019/032929、WO 2018/223101、WO 2019/089848、WO2020/113194、WO 2019/090003、WO 2020/092848、WO 2019/113559和WO 2018/157171中描述的对治疗性细胞组合物(例如，CAR-T细胞)的任何一种或多种临床反应，将这些文献通过引用以其整体并入本文。任何一种或多种此类特征可以用作数据以根据所提供的方法确定(例如，预测)任何一种或多种临床反应。
在以下小节中描述了在所提供的确定(例如，预测)一种或多种非限制性临床反应的方法中用作数据的受试者特征、输入组合物特征、治疗性细胞组合物特征的非限制性例子。
1.受试者特征
根据本文提供的方法，例如，机器学习方法，设想了与用治疗性细胞组合物治疗的受试者相关的各种特征。有待用治疗性细胞组合物治疗的受试者在本文中也可称为患者。
在一些实施方案中，受试者特征包括受试者属性，如年龄和重量。在一些实施方案中，受试者特征是受试者重量，例如体重。在一些实施方案中，受试者重量是在施用治疗性细胞组合物时的受试者的重量。在某些实施方案中，重量以lbs.或kg为单位测量。在一些实施方案中，受试者特征是年龄，例如在开始施用治疗性细胞组合物时的受试者年龄。其他示例性受试者特征包括身高、种族、人种、性别(sex)、性别(gender)和体重指数。
在一些实施方案中，与受试者相关的特征是临床属性。示例性临床属性包括但不限于生物标记和生物标记的组合、疾病诊断、疾病负荷、疾病持续时间、疾病严重程度(例如，疾病分级)和治疗史。
在一些实施方案中，与受试者相关的临床属性(例如，受试者特征)包括先前疗法(例如，在开始施用治疗性T细胞组合物之前的一种或多种疗法)的量。在一些实施方案中，已经施用所述先前疗法以治疗与治疗性细胞组合物所治疗的相同的疾病和/或病症。
在某些实施方案中，临床属性是血小板计数。
在一些实施方案中，临床属性是疾病诊断的近期度。在一些实施方案中，临床属性是受试者所接受的诊断。
在特定实施方案中，临床属性是患有白血病。在一些实施方案中，受试者特征患有B细胞白血病。在某些实施方案中，所述白血病是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或急性髓性白血病(AML)。在某些实施方案中，临床特征是患有急性淋巴细胞白血病(ALL)。在一些实施方案中，临床属性是患有淋巴瘤。在一些实施方案中，临床属性是患有特定分级的淋巴瘤。在一些实施方案中，临床属性患有DLBCL。在一些实施方案中，临床属性是患有滤泡性淋巴瘤。在一些实施方案中，临床属性是患有从滤泡性淋巴瘤转化的DLBCL。在一些实施方案中，临床属性是DLBCL的起源细胞。例如，在一些实施方案中，所述起源细胞是激活的B细胞、非生发中心B细胞或生发中心B细胞样细胞。在一些实施方案中，临床属性是疾病是从头开始还是其他。例如，在一些实施方案中，临床属性是从头DLBCL或不是从头的DLBCL。
在一些实施方案中，临床属性是基因表型，如鉴定到已知与疾病或病症相关或相关联的基因中的突变。在一些实施方案中，临床属性是基因(例如，与疾病或病症相关或相关联的基因)是否具有一个或多个突变，例如，缺失、插入、取代、重排、易位。在一些实施方案中，临床属性是突变的基因(例如，打击)的数量。在一些实施方案中，临床属性是基因双打击。例如，在淋巴瘤的一些情况下，两种基因，例如MYC和BCL2，可能是突变的。在一些实施方案中，临床属性是基因三打击。例如，在淋巴瘤的一些情况下，三种基因，例如MYC、BCL6和BCL2，可能是突变的。在一些实施方案中，临床属性是基因双或三打击。在一些实施方案中，临床属性是基因双表达子。例如，在淋巴瘤的一些情况下，双重表达子或双表达子是指MYC和BCL2过表达的免疫组织化学检测。在一些实施方案中，双表达子是指例如相对于基线过表达的基因。
在一些方面，临床属性是受试者是否患有复发或难治性疾病。在一些方面，临床属性是受试者是否对一种或多种先前疗法已经复发或是难治的。在一些实施方案中，临床属性是在化学疗法治疗之后受试者是否已经复发或是难治的。
设想到有待用所述治疗性细胞组合物治疗的受试者可能已经接受了先前的治疗以尝试治疗所述疾病或病症。因此，在一些实施方案中，临床属性是在用治疗性细胞组合物治疗之前受试者接受的先前疗法线的数量。在一些实施方案中，临床属性是在用治疗性细胞组合物治疗之前受试者接受的先前系统疗法线的数量。在一些实施方案中，临床属性是在用治疗性细胞组合物治疗之前受试者是否接受过同种异体造血干细胞移植。在一些实施方案中，临床属性是在用治疗性细胞组合物治疗之前受试者是否接受过自体造血干细胞移植。在一些实施方案中，临床属性是对先前治疗的最佳总体反应。
在一些实施方案中，临床属性是疾病阶段。
在一些实施方案中，临床属性是疾病负荷。在特定实施方案中，临床属性是高疾病负荷，例如在开始施用治疗性T细胞组合物之前的高疾病负荷。在某些实施方案中，临床属性是就在开始施用治疗性T细胞组合物之前、或在开始施用治疗性细胞组合物之前的1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或大于六个月内的高疾病负荷。在一些实施方案中，疾病负荷由病变计数确定。在一些实施方案中，高疾病负荷是根据骨髓原始细胞的百分比确定的。在某些实施方案中，受试者特征是高疾病负荷，如直径乘积之和(SPD)或乳酸脱氢酶(LDH)水平。
在一些实施方案中，临床属性是病变计数。在一些实施方案中，临床属性是SPD。在一些实施方案中，临床属性是LDH水平。在一些实施方案中，临床属性是SPD的倍数变化。在一些实施方案中，临床属性是LDH水平的倍数变化。在一些实施方案中，确定在初始筛选的时间与在施用治疗性细胞组合物之前递送淋巴细胞清除疗法的时间之间的倍数变化。在一些实施方案中，确定在初始筛选的时间与施用治疗性细胞组合物的时间之间的倍数变化。在一些实施方案中，临床属性SPD、LDH、病变计数和其倍数变化、差异或其他定量用于评估疾病负荷。
在一些实施方案中，临床属性是疾病负荷，例如如由肿瘤负荷所描述的。在一些实施方案中，临床属性是高肿瘤负荷，例如在开始施用治疗性细胞组合物之前的高疾病负荷。在一些实施方案中，肿瘤负荷由一个或多个肿瘤的体积量度确定。在一些实施方案中，所述体积量度是一个或多个病灶的量度，例如肿瘤大小、肿瘤直径、肿瘤体积、肿瘤质量、肿瘤负担或体积、肿瘤相关水肿、肿瘤相关坏死和/或转移的数量或范围。另外，“巨大肿块(bulkydisease)”可以用于描述胸腔中的大型肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤的体积量度是二维量度。例如，在一些实施方案中，将一个或多个病灶的面积计算为所有可测量肿瘤的最长直径与最长垂直直径的乘积。在一些情况下，肿瘤的体积量度是一维量度。在一些情况下，将可测量病灶的大小评估为最长直径。在一些实施方案中，将肿瘤大小以最长直径评估。在一些实施方案中，将肿瘤大小以垂直直径评估。在一些实施方案中，测量直径乘积之和(SPD)、最长肿瘤直径(LD)、最长肿瘤直径之和(SLD)、坏死、肿瘤体积、坏死体积、坏死-肿瘤比率(NTR)、瘤周水肿(PTE)和水肿-肿瘤比率(ETR)。用于测量和评估肿瘤负荷的示例性方法包括描述于例如以下文献中的那些：Carceller等人,Pediatr Blood Cancer.(2016)63(8):1400-1406和Eisenhauer等人,Eur JCancer.(2009)45(2):228-247。在一些实施方案中，体积量度是通过确定所有可测量肿瘤的最大垂直直径的乘积之和来测量的直径乘积之和(SPD)。在一些方面，在一个维度上用最长直径(LD)和/或通过确定所有可测量病灶的最长肿瘤直径之和(SLD)来测量肿瘤或病灶。在一些实施方案中，肿瘤的体积量度是肿瘤坏死的体积定量，例如坏死体积和/或坏死-肿瘤比(NTR)，参见Monsky等人，Anticancer Res.(2012)32(11):4951-4961。在一些方面，肿瘤的体积量度是肿瘤相关水肿的体积定量，如瘤周水肿(PTE)和/或水肿-肿瘤比(ETR)。在一些实施方案中，测量可以使用受试者的成像技术来进行，所述成像技术如计算断层成像(CT)、正电子发射断层成像(PET)和/或磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，肿瘤的体积量度是在筛选期间(如常规评估或抽血)确定，以证实和/或鉴定受试者的病症或疾病。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除化学疗法(LDC)之前测量肿瘤负荷的量度，如体积量度(例如，SPD)。例如，在一些实施方案中，在LDC之前的一个月、两周或一周内，如在LDC之前的7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天内，测量或评估肿瘤负荷的量度，如体积量度(例如，SPD)。在特定实施方案中，在将T细胞疗法输注到荷瘤受试者之前测量肿瘤负荷的量度，如体积量度(例如，SPD)。
在一些实施方案中，受试者特征是肿瘤负荷的量度(例如，体积量度)是高于还是低于阈值水平的类别划分。例如，特征是肿瘤负荷的量度(例如，体积量度)的类别划分，如在输注T细胞疗法之前，例如在LDC之前测量的，其中所述特征是受试者具有处于或低于阈值水平还是大于阈值水平的肿瘤负荷量度。在特定实施方案中，肿瘤负荷量度是SPD，并且SPD的阈值水平是为或为约30cm2、40cm2、50cm2、60cm2、70cm2、80cm2或90cm2。例如，特征是SPD的类别划分，如在输注T细胞疗法之前，例如在LDC之前测量的，其中所述特征是受试者具有为或低于50cm2还是大于50cm2的SPD。
在一些实施方案中，在两个时间点评估指示肿瘤负荷的因素，并且确定指示疾病负荷的因素在两个时间点之间的倍数变化。在一些实施方案中，两个时间点包括第一时间点和第二时间点，并且其中所述倍数变化是指示所述第一时间点处的疾病负荷的因素与指示所述第二时间点处的疾病负荷的因素的比率。在一些实施方案中，在施用疗法(例如，细胞疗法)之前的两个时间点确定肿瘤的体积量度。在一些实施方案中，肿瘤的体积量度是在筛选期间(如常规评估或抽血)确定，以证实和/或鉴定受试者的病症或疾病。在特定实施方案中，在已经是、将是或是有待施用T细胞疗法的候选者的受试者中确定或测量一个或多个肿瘤的体积测量值。在特定实施方案中，在治疗或施用疗法(例如，细胞疗法)之前确定所述测量。在一些实施方案中，所述两个时间点都是在接受细胞疗法之前不超过一个月或两个月。在一些实施方案中，所述两个时间点间隔不少于一周、两周、三周、四周或五周。在一些实施方案中，所述两个时间点间隔不少于三周。在一些实施方案中，所述两个时间点间隔不超过四周、五周或六周。在一些实施方案中，所述第二时间点是在施用细胞疗法之前超过1、2、3、4、5、6或7天。
在一些实施方案中，所述临床属性是通过结节外疾病分类确定的疾病负荷。例如，临床属性可以是疾病(例如淋巴瘤)是否已扩散到淋巴系统外的器官。在一些实施方案中，临床属性是受累及的结节外部位的数量。
在一些实施方案中，临床属性是在施用治疗性细胞组合物时受试者是否患有中枢神经系统(CNS)疾病。在一些实施方案中，在施用治疗性细胞组合物时受试者未患有CNS疾病。在一些实施方案中，CNS疾病是原发性CNS淋巴瘤(PCNSL)。在一些实施方案中，PCNSL涉及不具有系统性淋巴瘤存在的中枢神经系统(CNS)。在一些实施方案中，PCNSL限于脑、脊柱、脑脊液(CSF)和眼。在一些实施方案中，PCNSL是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，PCNSL是伯基特、低分级或T细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，PCNSL包括神经病学体征。在一些实施方案中，神经病学体征包括局灶性神经功能缺损、精神状态和行为变化、颅内压增加的症状和/或癫痫发作。在一些实施方案中，与疾病或病症相关的示例性特征包括Grommes等人(J.Clin Oncol2017；35(21):2410-18)中所述的那些。
在一些实施方案中，CNS疾病是继发性中枢神经系统淋巴瘤(SCNSL)。在一些实施方案中，SCNSL位于患有系统性淋巴瘤的患者中。在一些实施方案中，SCNSL被称为转移性淋巴瘤。在一些实施方案中，SCNSL是DLBCL。在一些实施方案中，SCNSL是侵袭性淋巴瘤，其可涉及脑、脑膜、脊髓和眼。在一些实施方案中，SCNSL包括柔脑膜扩散。在一些实施方案中，SCNSL包括脑实质疾病。在一些实施方案中，与疾病或病症相关的示例性特征包括Malikova等人(Neurophychiatric Disease and Treatment 2018；14:733-40.)中所述的那些。在一些实施方案中，继发性CNS淋巴瘤涉及脑实质和/或柔脑膜。
在一些实施方案中，临床属性是合并症。例如，在一些情况下，合并症是在施用治疗性细胞组合物之前在受试者接受淋巴细胞清除化学疗法之前的肌酐清除率(CrCl)。在一些实施方案中，合并症是左心室射血分数(LVEF)。
在一些实施方案中，临床属性是东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)。在一些实施方案中，受试者的ECOG状态被定义为：0级-完全活跃，能够不受限制地继续所有疾病前的表现；1级-身体剧烈活动受限，但能走动并能够进行轻度或久坐的工作；2级-能走动并能够进行所有自我护理，但不能进行任何工作活动；超过50％的清醒时间起床走动；3级-只能进行受限的自我护理；超过50％的清醒时间被限制在床上或椅子上；4级-完全失能；不能进行任何自我护理；完全被限制在床上或椅子上；或5级-死亡。
在一些实施方案中，临床属性是国际预后指数得分(IPI)，例如淋巴瘤IPI得分。在一些实施方案中，受试者的IPI得分被定义为：低风险(0-1分)-73％的5年存活率；低-中风险(2分)-51％的5年存活率；高-中风险(3分)-43％的5年存活率；或高风险(4-5分)-26％的5年存活率。
在一些实施方案中，临床属性是受试者的温度。在一些实施方案中，临床属性是血液氧合水平。在一些实施方案中，临床属性是白蛋白水平。在一些实施方案中，临床属性是碱性磷酸酶水平。在一些实施方案中，临床属性是嗜碱性粒细胞计数。在一些实施方案中，临床属性是绝对嗜碱性粒细胞计数。在一些实施方案中，临床属性是直接胆红素。在一些实施方案中，临床属性是总胆红素。在一些实施方案中，临床属性是淋巴细胞计数或绝对计数。在一些实施方案中，淋巴细胞计数是在对受试者进行白细胞单采术以获得用于生成治疗性细胞组合物的细胞之前的计数。在一些实施方案中，临床属性是血尿素氮水平。在一些实施方案中，临床属性是钙水平。在一些实施方案中，临床属性是二氧化碳水平。在一些实施方案中，临床属性是氯化物水平。在一些实施方案中，临床属性是肌酐水平。在一些实施方案中，临床属性是嗜酸性粒细胞计数或绝对计数。在一些实施方案中，临床属性是葡萄糖水平。在一些实施方案中，临床属性是血细胞比容水平。在一些实施方案中，临床属性是血红蛋白水平。在一些实施方案中，临床属性是镁水平。在一些实施方案中，临床属性是单核细胞计数或绝对计数。在一些实施方案中，临床属性是嗜中性粒细胞计数或绝对计数。在一些实施方案中，临床属性是血小板计数。在一些实施方案中，临床属性是钾水平。在一些实施方案中，临床属性是总蛋白质水平。在一些实施方案中，临床属性是红细胞计数。在一些实施方案中，临床属性是白细胞计数。在一些实施方案中，临床属性是尿酸水平。在一些实施方案中，临床属性是钠水平。在一些实施方案中，临床属性是甘油三酯水平。在一些实施方案中，临床属性是天冬氨酸转氨酶水平。在一些情况下，天冬氨酸转氨酶水平可以通过血清谷氨酸-草酰乙酸转氨酶测试来确定。在一些实施方案中，临床属性是丙氨酸转氨酶水平。在一些情况下，天冬氨酸转氨酶水平可以通过血清谷氨酸-丙酮酸转氨酶测试来确定。设想用于检测如所描述的水平或计数的任何合适的方法。
在一些实施方案中，临床属性是炎症标记的水平、量和/或浓度。在一些实施方案中，炎症标记是或包括检测和评估的C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、白蛋白、铁蛋白、β2微球蛋白(β2-M)或乳酸脱氢酶(LDH)的水平或存在。在一些实施方案中，使用免疫测定评估炎症标记。例如，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、表面等离子体共振(SPR)、蛋白质印迹、侧向流测定、免疫组织化学、蛋白质阵列或免疫PCR(iPCR)来检测炎症标记。在一些实施方案中，炎症标记的存在、水平、量和/或浓度指示肿瘤负荷，例如高肿瘤负荷。在一些情况下，使用流式细胞术测定或评估炎症标记。在一些情况下，试剂是结合炎症标记的可溶性蛋白质。在一些例子中，所述试剂是结合C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、白蛋白、铁蛋白、β2微球蛋白(β2-M)或乳酸脱氢酶(LDH)的蛋白质。
在一些实施方案中，临床属性是生物标记。在一些实施方案中，生物标记是炎症标记，如C反应蛋白(CRP)。在一些实施方案中，使用体外酶联免疫吸附测定来评估CRP，以从样品(如血清、血浆或血液)获得人CRP的定量测量值。在一些例子中，使用人酶联免疫吸附测定(ELISA)检测CRP。在一些实施方案中，生物标记是炎症标记，如红细胞沉降率(ESR)。在一些实施方案中，通过测量红细胞在竖直移液管或导管中从血浆分离后已经下降的距离(以毫米/小时计)来评估ESR。在一些实施方案中，生物标记是或包括白蛋白。在一些方面，使用比色测试或体外酶联免疫吸附测定来评估白蛋白。在一些例子中，使用人酶联免疫吸附测定(ELISA)检测白蛋白。在一些实施方案中，生物标记是炎症标记，如铁蛋白或β2微球蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白或β2微球蛋白是使用免疫测定来评估，或使用ELISA来检测。在一些方面，生物标记是炎症标记，如乳酸脱氢酶(LDH)，并且LDH是使用比色测试或体外酶联免疫吸附测定来评估。在一些实施方案中，临床属性是LDH的水平、浓度和/或量。
在一些实施方案中，LDH的水平、浓度和/或数量是例如肿瘤或癌症的疾病负荷的替代物。
在一些实施方案中，临床属性是在开始施用治疗性T细胞组合物之前接受桥接化学疗法。在一些实施方案中，桥接化学疗法是系统治疗。在一些实施方案中，临床属性是在开始施用治疗性T细胞组合物之前接受桥接化学疗法和放射疗法。在制造所提供的组合物或细胞期间，治疗医师可以决定例如为了疾病控制是否有必要进行桥接疗法。
在特定实施方案中，临床属性是例如在开始施用治疗性T细胞组合物之前用淋巴细胞清除疗法进行预调理。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法是或包括施用化学疗法。在特定实施方案中，受试者特征是在开始施用治疗性细胞组合物之前用氟达拉滨和/或环磷酰胺进行预调理。在某些实施方案中，受试者特征是在开始施用治疗性T细胞组合物之前用环磷酰胺进行预调理。在一些实施方案中，受试者特征是在开始施用治疗性细胞组合物之前用氟达拉滨和环磷酰胺进行预调理。
在一些实施方案中，临床属性是在开始施用治疗性T细胞组合物之前在血液、血清或血浆样品中细胞因子的水平、量或浓度。在一些实施方案中，细胞因子是白介素，例如白介素-15(IL-15)。
在一些实施方案中，受试者特征是治疗受试者的研究的给药组。在一些情况下，该特征可能特别有用，例如在使用不同给药水平以在根据本文提供的方法评估临床反应时解释给药的差异的一些临床研究中。
在一些实施方案中，受试者特征包括本文所述的任何一种或多种受试者特征，包括临床属性和受试者属性。
在一些实施方案中，所述受试者特征是以下中的一种或多种或全部：给药组、桥接化学疗法、桥接化学疗法和放射疗法、桥接化学疗法系统治疗、细胞起源(例如ABC(激活的B细胞样，或非GCB)或GCB(生发中心B细胞样))、化学疗法后复发或难治、诊断类型、疾病队列(例如DLBCL)、疾病负荷、复发或难治性疾病、疾病起源(例如从头DLBCL或其他DLBCL)、性别、治疗性细胞组合物施用途径(例如输注)、LDH的倍数变化、身高、病变计数、氧饱和度、温度(℃)、用治疗性细胞组合物治疗前的最长肿瘤直径、SPD的倍数变化、淋巴细胞清除化学疗法前的SPD值(例如对于组具有分类阈值：SPD<＝50cm^2或>50cm^2)、BMI、重量、性别、种族、人种、年龄、IPI得分、ECOG得分、疾病分期、基于淋巴细胞清除化学疗法前LDH的疾病负荷、基于淋巴细胞清除化学疗法前SPD的疾病负荷、治疗时患有活动性CNS疾病的受试者、基于结节外疾病分类的疾病负荷、结节外部位的数量、基于巨大肿块分类的疾病负荷、疾病组织学、先前疗法线的数量、先前系统疗法线的数量、先前同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)、先前自体造血干细胞移植(auto-HSCT)、化疗难治性或化疗敏感性疾病类型、用于疾病控制的桥接抗癌疗法、从白细胞单采术日期到首次输注的天数、从诊断到用治疗性细胞组合物治疗的月数、合并症(例如在淋巴细胞清除之前的肌酐清除率(CrCl)，筛选时的左心室射血分数(LVEF))、基线C反应蛋白(CRP)、白细胞单采术前的淋巴细胞计数(10^9/L)、基因双表达子、基因双打击、基因三打击、基因双打击或三打击、基因双打击或三打击或双表达子、白蛋白水平、碱性磷酸酶水平、嗜碱性粒细胞计数、绝对嗜碱性粒细胞计数、直接胆红素、总胆红素、血尿素氮水平、钙水平、二氧化碳水平、氯化物水平、肌酐水平、嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞绝对计数、葡萄糖水平、血细胞比容水平、血红蛋白水平、LDH水平、病变计数、淋巴细胞计数、淋巴细胞绝对计数、镁水平、单核细胞绝对计数、单核细胞计数、嗜中性粒细胞绝对计数、嗜中性粒细胞计数、磷酸盐水平、血小板计数、钾水平、总蛋白、红细胞计数、天冬氨酸转氨酶水平、丙氨酸转氨酶水平、钠水平、直径乘积之和、甘油三酯、最长肿瘤直径、垂直肿瘤直径、尿酸水平和白细胞计数。
在一些实施方案中，受试者特征包括下文表E4中所示的受试者特征中的任何一种或多种。
在一些实施方案中，在初始筛选时确定受试者特征。例如，在白细胞单采术以生成用于产生治疗性细胞组合物的输入组合物之前进行筛选。在一些实施方案中，在施用治疗性细胞组合物之前，在施用淋巴细胞清除疗法之前确定受试者特征。在一些实施方案中，在施用治疗性细胞组合物时确定受试者特征。在一些情况下，例如，当受试者特征是或包括受试者特征的变化时，可以在两个或更多个时间点，例如在初始筛选时、在施用淋巴细胞清除疗法之前、在施用治疗性细胞组合物之前确定受试者特征，以确定受试者特征的差异或变化，例如变化百分比、倍数变化。
2.输入组合物特征
在一些实施方案中，输入组合物含有从样品(例如，生物样品)分离的细胞，所述样品如获自或源自受试者的那些，所述受试者如需要细胞疗法或者将被施用细胞疗法的受试者。从样品(例如，生物样品)中分离细胞的方法描述于例如第II-A节。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中分离、处理和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有CD4+或CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，输入组合物特征包括细胞表型。在一些实施方案中，表型是总T细胞的数量。在一些实施方案中，表型是总CD3+ T细胞的数量。在一些实施方案中，表型是或包括T细胞亚型的身份。T细胞的不同的群体或亚型包括但不限于效应T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、幼稚T细胞、CD4+细胞、和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞亚型可以通过检测特定分子的存在或不存在来鉴定。在某些实施方案中，特定分子是可以用于鉴定T细胞亚型的表面标记。
在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阳性或高水平表达，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD4、CD8、CD45RA、和/或CD45RO。在某些实施方案中，表型是T细胞的或T细胞的亚群或子集的表面标记，如基于一种或多种表面标记的阳性表面标记表达，例如，CD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和/或CD45RO+。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阳性或高水平表达，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如7型C-C趋化因子受体(CCR7)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、和分化簇45RA(CD45RA)。在某些实施方案中，表型标记包括CCR7、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD62L、和L-选择素。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阴性表达或表达的不存在，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD4、CD8、CD45RA、和/或CD45RO。在某些实施方案中，表型是T细胞的或T细胞的亚群或子集的表面标记，如基于一种或多种表面标记(例如，CD3-、CD4-、CD8-、CD28-、CD62L-、CCR7-、CD27-、CD127-、CD4-、CD8-、CD45RA-、和/或CD45RO-)的表面标记表达的不存在。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阴性表达或表达的不存在，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如7型C-C趋化因子受体(CCR7)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、和分化簇45RA(CD45RA)。在某些实施方案中，表型标记包括CCR7、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD62L、和L-选择素。
在某些实施方案中，表型是或包括CD27、CCR7和/或CD45RA的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是CCR7+。在一些实施方案中，表型是CD27+。在一些实施方案中，表型是CCR7-。在一些实施方案中，表型是CD27-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD27+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27-。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD27-。在一些实施方案中，表型是CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CD45RA+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CD27+/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是CD27-/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是CD27-/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA+。
在一些实施方案中，表型是活力。在某些实施方案中，表型是标记的阳性表达，所述标记指示细胞经历正常功能性细胞过程和/或尚未经历坏死或程序性细胞死亡或并非处于经历坏死或程序性细胞死亡的过程中。在一些实施方案中，可以通过细胞的氧化还原电位、细胞膜的完整性或线粒体的活性或功能来评估活力。在一些实施方案中，活力是在测定中不存在与细胞死亡相关的特定分子，或不存在细胞死亡的指征。
在一些实施方案中，表型是或包含细胞活力。在某些实施方案中，可以通过在本领域中的许多常规手段来检测、测量和/或评估细胞的活力。此类活力测定的非限制性例子包括但不限于染料摄取测定(例如，钙黄绿素AM测定)、XTT细胞活力测定、和染料排除测定(例如，台盼蓝、伊红或丙啶染料排除测定)。活力测定可用于确定细胞剂量、细胞组合物和/或细胞样品中的活细胞的数量或百分比(例如，频率)。在特定实施方案中，表型包括细胞活力以及其他特征，例如表面标记、分子。
在某些实施方案中，表型是或包括细胞活力、活CD3+、活CD4+、活CD8+、活CD4+/CCR7+、活CD8+/CD27+、活CD4+/CD27+、活CD8+/CCR7+/CD27+、活CD4+/CCR7+/CD27+、活CD8+/CCR7+/CD45RA-或活CD4+/CCR7+/CD45RA-或其组合。
在特定实施方案中，所述表型是或包括凋亡的不存在和/或细胞正在经历凋亡过程的指征。凋亡是程序性细胞死亡的过程，所述过程包括导致特征性细胞变化和死亡的一系列定型的形态学和生物化学事件。这些变化包括出泡、细胞皱缩、核碎裂、染色质凝聚、染色体DNA断裂、和全面mRNA降解。凋亡是一种充分表征的过程，并且与各个阶段相关的特定分子是本领域中熟知的。
在一些实施方案中，表型是凋亡的早期阶段的不存在、和/或与凋亡的早期阶段相关的指示物和/或特定分子的不存在。在凋亡的早期阶段，细胞和线粒体膜的变化变得明显。在细胞的细胞质和细胞核中生物化学变化也很明显。例如，凋亡的早期阶段可以通过某些半胱天冬酶(例如，2、8、9和10)的激活来指示。在特定实施方案中，表型是凋亡的晚期阶段的不存在、和/或与凋亡的晚期阶段相关的指示物和/或特定分子的不存在。凋亡的中期至晚期阶段的特征在于膜完整性的进一步丧失、染色质凝聚和DNA断裂，并且包括生物化学事件如半胱天冬酶3、6和7的激活。
在某些实施方案中，表型是与凋亡相关的一种或多种因子的阴性表达，所述一种或多种因子包括已知启动凋亡的促凋亡因子，例如死亡受体途径的成员、线粒体(内在)途径的激活成员，如Bcl-2家族成员(例如Bax、Bad和Bid)以及半胱天冬酶。在一些实施方案中，表型是阴性或低量的凋亡标记。在某些实施方案中，表型是凋亡标记的阴性表达。在某些实施方案中，表型是不存在指示物，例如膜联蛋白V分子，所述指示物当与细胞组合物一起孵育或接触细胞组合物时优先结合正在经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，表型是或包括指示细胞中的凋亡状态的一种或多种标记的表达。
在一些实施方案中，表型是作为凋亡标记的特定分子的阴性(或低)表达。各种凋亡标记对本领域普通技术人员而言是已知的，并且包括但不限于一种或多种半胱天冬酶(即激活的半胱天冬酶(例如活性半胱天冬酶，CAS))的活性的增加、PARP切割的增加、Bcl-2家族蛋白(细胞死亡途径的成员(例如Fas和FADD))的激活和/或易位、核皱缩的存在(例如，通过显微镜监测)和染色体DNA断裂的存在(例如，染色体DNA梯状条带的存在)或使用包括TUNEL染色和膜联蛋白V染色的凋亡测定。
半胱天冬酶是在天冬氨酸残基之后切割蛋白质的酶，所述术语源自“半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶”。半胱天冬酶参与凋亡，因此半胱天冬酶(如半胱天冬酶-3)的激活指示凋亡的增加或再次发生。在一些实施方案中，激活的半胱天冬酶-3在本文中称为3CAS。在某些实施方案中，可以通过普通技术人员已知的方法来检测半胱天冬酶激活。在一些实施方案中，与激活的半胱天冬酶特异性结合(即，与切割过的多肽特异性结合)的抗体可以用于检测半胱天冬酶激活。在另一个例子中，半胱天冬酶活性的荧光色素抑制剂(FLICA)测定可以用于通过检测半胱天冬酶-3对乙酰基Asp-Glu-Val-Asp 7-酰胺基-4-甲基香豆素(Ac-DEVD-AMC)的水解(即检测发荧光的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的释放)来检测半胱天冬酶-3激活。FLICA测定可以用于通过检测通过多种半胱天冬酶处理的底物的产物来确定半胱天冬酶激活(例如，FAM-VAD-FMK FLICA)。其他技术包括使用激活发光的半胱天冬酶-8四肽底物(Z-LETD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-9四肽底物(Z-LEHD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-3/7底物(Z-DEVD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-6底物(Z-VEID-氨基萤光素)或半胱天冬酶-2底物(Z-VDVAD-氨基萤光素)的
半胱天冬酶测定(PROMEGA)。
在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶-1、激活的半胱天冬酶-2、激活的半胱天冬酶-3、激活的半胱天冬酶-7、激活的半胱天冬酶-8、激活的半胱天冬酶-9、激活的半胱天冬酶-10和/或激活的半胱天冬酶-13在细胞中的阴性表达。在特定实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-。在一些实施方案中，半胱天冬酶的前体形式(酶原切割形式)(如上述任何形式)也是指示凋亡存在的标记。在一些实施方案中，表型是或包括半胱天冬酶的前体形式(如半胱天冬酶-3的前体形式)的不存在或阴性表达。
在一些实施方案中，凋亡标记是切割的聚ADP-核糖聚合酶1(PARP)。PARP在凋亡的早期阶段期间被半胱天冬酶切割。因此，切割的PARP肽的检测是凋亡的标记。在特定实施方案中，表型是或包括切割的PARP的阳性或阴性表达。
在一些实施方案中，凋亡标记是检测细胞中与凋亡相关的特征的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是膜联蛋白V分子。在凋亡的早期阶段期间，脂质磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内部小叶易位到外部小叶。PS通常受限于健康和/或非凋亡细胞中的内膜。膜联蛋白V是一种以高亲和力优先结合磷脂酰丝氨酸(PS)的蛋白质。当与荧光标签或其他报告物缀合时，膜联蛋白V可以用于快速检测凋亡的这种早期细胞表面指示物。在一些实施方案中，PS在外膜上的存在将持续到凋亡的晚期阶段。因此，在一些实施方案中，膜联蛋白V染色是凋亡的早期和晚期阶段二者的指征。在某些实施方案中，将膜联蛋白(例如膜联蛋白V)用可检测的标记进行标记，并且与在细胞组合物中的细胞一起孵育、暴露于在细胞组合物中的细胞和/或与在细胞组合物中的细胞接触，以例如通过流式细胞术检测正在经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，将荧光标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V)用于将细胞染色以供流式细胞术分析(例如使用膜联蛋白-V/7-AAD测定)。适合于用膜联蛋白进行凋亡检测的替代性方案包括利用放射性标记的膜联蛋白V的技术和测定。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白的阴性染色，例如膜联蛋白V-。在特定实施方案中，表型是或包括外质膜上PS的不存在。在某些实施方案中，表型是或包括不被膜联蛋白(例如膜联蛋白V)结合的细胞。在某些实施方案中，在外膜上缺乏可检测的PS的细胞是膜联蛋白V-的。在特定实施方案中，在与标记的膜联蛋白V一起孵育之后在测定(例如流式细胞术)中未被膜联蛋白V-结合的细胞是膜联蛋白V-的。
在特定实施方案中，所述表型是膜联蛋白V-、膜联蛋白V-CD3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、膜联蛋白V-CD3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+、膜联蛋白V-/CD8+/CD27+、膜联蛋白V-/CD4+/CD27+、膜联蛋白V-/CD8+/CCR7+/CD27+、膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CD27+、膜联蛋白V-/CD8+/CCR7+/CD45RA-或膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CCR7+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CCR7+/CD45RA-或激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CD45RA-、或其组合。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD27-。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD27+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD27-。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD27+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28-/CD27-。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28-/CD27+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28+/CD27-。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28+/CD27+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD45RA+。在一些实施方案中，表型进一步是CD4+。在一些实施方案中，表型进一步是CD8+。
特定实施方案设想到，对凋亡标记的表达呈阳性的细胞正在经历程序性细胞死亡，显示降低的免疫功能或没有免疫功能，并且具有减弱的经历激活、扩增能力(如果存在)，和/或结合抗原以启动、进行或促进免疫应答或活性。在特定实施方案中，表型被定义为激活的半胱天冬酶的阴性表达和/或膜联蛋白V的阴性染色。
在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3(半胱天冬酶3，3CAS)和/或膜联蛋白V。
表型包括通常与T细胞的一种或多种亚型或亚群或其表型相关的一种或多种标记的表达或表面表达。T细胞亚型和亚群可以包括CD4+和/或CD8+ T细胞及其亚型，所述CD4+和/或CD8+ T细胞及其亚型可以包括幼稚T(TN)细胞、幼稚样细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、TEMRA细胞或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，输入组合物特征是输入组合物的细胞的克隆性。在一些实施方案中，评估T细胞群的克隆性是对T细胞群的克隆多样性的评估。在一些实施方案中，T细胞是多克隆的(polyclonal或multiclonal)。所述T细胞输入组合物的克隆性(如多克隆性)是群体对给定抗原的反应宽度的量度。在一些方面，可以通过测量抗原特异性细胞识别的不同表位的数量来评估输入组合物。这可以使用用于在体外产生和克隆抗原特异性T细胞的标准技术来进行。在一些实施方案中，T细胞是多克隆的(polyclonal或multiclonal)，其中在幼稚样T细胞群中没有单一的克隆型群体占优势。
在一些方面，在T细胞群的(如输入组合物的)情境下，多克隆性的标识是指具有多种广泛的抗原特异性的T细胞群。在一些实施方案中，多克隆性涉及在TCR库中展现出高度多样性的T细胞群。在一些情况下，TCR库的多样性是由于V(D)J重组事件，其在一些方面是由对自身和外来抗原的选择事件触发的。在一些实施方案中，多样化或多克隆的T细胞群是这样的T细胞群，其中分析指示群体中存在多种变化的或不同的TCR转录物或产物。在一些实施方案中，展现出高或相对高克隆性的T细胞群是TCR库的多样性较少的T细胞群。在一些实施方案中，如果分析指示在T细胞群中存在几种(如两种或三种)TCR转录物或产物，则T细胞是寡克隆的。在一些实施方案中，单克隆性是指T细胞群具有低多样性。在一些实施方案中，如果分析指示在T细胞群中存在单一TCR转录物或产物，则T细胞是单克隆的。
在一些例子中，输入组合物中的细胞(如T细胞)的克隆性是通过克隆测序(如下一代测序)或者谱型分析来确定的。在一些方面，可以采用下一代测序方法，使用来自T细胞的基因组DNA或cDNA评估TCR库，包括编码互补决定区3(CDR3)的序列。在一些实施方案中，可以采用通过RNA-seq进行的全转录组测序。在一些实施方案中，可以使用单细胞测序方法。
在一些实施方案中，可以通过谱型分析(TCR Vβ、Vα、Vγ或Vδ链高变区库的量度)来评估或确定克隆性(如多克隆性)。谱型分析辨别具有特定大小而不是序列的重排可变基因。因此，应理解，单个峰可以代表表达有限数量的重排TCR可变基因(Vβ、Vα、Vγ或Vδ)中的任何一个的T细胞群，所述重排TCR可变基因在连接区包含4种潜在的核苷酸(腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t))中的任何一种或这4种核苷酸的组合。当给定TCR Vβ、Vα、Vγ或Vδ家族的Vβ谱型谱具有多个峰(通常为5个或更多个主峰)并且在大多数情况下呈高斯分布时，则认为T细胞群是多克隆的。多克隆性还可以通过针对目标抗原的抗原特异性克隆的产生和表征来定义。在如输入组合物的T细胞的群体的情境下，单克隆性是指T细胞群具有如通过谱型分析(TCR Vβ、Vα、Vγ或Vδ链高变区库的量度)所定义的单一特异性。当给定TCR Vβ、Vα、Vγ和/或Vδ家族的Vβ、Vα、Vγ和/或Vδ谱型谱具有单个主峰时，则认为T细胞群是单克隆的(或单特异性的)。
在一些实施方案中，用于评估克隆性的方法可以包括如国际公开号WO2012/048341、WO 2014/144495、WO 2017/053902、WO 2016044227、WO 2016176322和WO2012048340中描述的方法的各种特征，将每一个通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，此类方法可以用于获得有关细胞内目标靶多核苷酸(如TCR)的序列信息。靶基因可以从来自细胞样品或细胞群的细胞的基因组DNA或mRNA获得。细胞样品或细胞群可以包括免疫细胞。例如，对于靶TCR分子，可以从免疫细胞或T细胞的基因组DNA或mRNA获得编码TCR链的基因。在一些实施方案中，起始材料是来自T细胞的RNA，其由编码TCR链的基因构成。
在一些实施方案中，将香农指数应用于克隆性以作为过滤克隆的阈值(“香农调整的克隆性”)，参见Chaara等人(2018)Front Immunol 9:1038。在一些实施方案中，输入组合物特征是输入组合物的CD4+细胞的克隆性。在一些实施方案中，输入组合物特征是输入组合物的CD8+细胞的克隆性。
在一些方面，表型包括与分化程度较低的细胞子集或分化程度较高的子集相关的表达或标记或功能，例如，抗原特异性功能(如细胞因子分泌)。在一些实施方案中，表型是与分化程度较低的子集相关的那些表型，如CCR7+、CD27+和白介素2(IL-2)产生中的一种或多种。在一些方面，分化程度较低的细胞(例如，中枢记忆细胞)不再存活，并且耗竭较慢，从而增加持久性和耐久性。在一些实施方案中，表型是与分化程度较高的子集相关的那些表型，如干扰素-γ(IFN-γ)或IL-13产生中的一种或多种。在一些方面，分化程度较高的子集也可能与衰老和效应子功能有关。
在一些实施方案中，表型是或包括暴露于其同源抗原的记忆T细胞或记忆T细胞子集的表型。在一些实施方案中，表型是或包括记忆T细胞，如TCM细胞、TEM细胞或TEMRA细胞、TSCM细胞、或其组合的表型(或与其相关的一种或多种标记)。在特定实施方案中，表型是或包括一种或多种特定分子的表达，所述一种或多种特定分子是记忆和/或记忆T细胞或其亚型的标记。在一些方面，与TCM细胞相关的示例性表型可以包括CD45RA-、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+和CD95+中的一种或多种。在一些方面，与TEM细胞相关的示例性表型可以包括CD45RA-、CD62L-、CCR7-、CD27-、CD28-和CD95+中的一种或多种。
在特定实施方案中，表型是或包括作为幼稚T细胞的标记的一种或多种特定分子的表达。
在一些实施方案中，表型是或包括记忆T细胞或幼稚T细胞。在某些实施方案中，表型是作为记忆标记的一种或多种特定分子的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，记忆标记是可以用于定义记忆T细胞群的特定分子。
在一些实施方案中，表型是或包括非记忆T细胞或其亚型的表型或与非记忆T细胞或其亚型相关一种或多种标记；在一些方面，表型是或包括与幼稚细胞相关的表型或一种或多种标记。在一些方面，与幼稚T细胞相关的示例性表型可以包括CCR7+、CD45RA+、CD27+和CD28+中的一种或多种。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+。在某些实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+。在一些实施方案中，表型是或包括中枢记忆T细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+。在某些实施方案中，表型是或包括TEMRA细胞或TSCM细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括CD45RA+。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+、CD27-/CD28+、CD27+/CD28-、或CD27-/CD28-中的一种。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CD27-/CD28-。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27+/CD45RA-。在某些实施方案中，表型是或包括CD45RA+。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27-/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-；CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-；CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；CD27+/CD28+；CD27-/CD28+；CD27+/CD28-；或CD27-/CD28-。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD45RA-；CCR7-/CD27+/CD45RA-；CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；CD27+；CD27-；CD27+/CD28-；或CD27-/CD28-。
在一些实施方案中，表型是或包括与幼稚样T细胞相关的表型或一种或多种标记。在一些实施方案中，幼稚样T细胞可以包括处于各种分化状态的细胞，并且特征可以在于某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CCR7、CD45RA、CD28和/或CD27的阳性或高表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD25、CD45RO、CD56、CD62L和/或KLRG1的阴性表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD95的低表达。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA+，其中所述细胞是CD27+或CD27-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD27+/CCR7+，其中所述细胞是CD45RA+或CD45RA-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD62L-CCR7+。
在某些实施方案中，表型是或包括对凋亡标记呈阴性的T细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括对凋亡标记呈阴性的幼稚细胞。在一些实施方案中，凋亡标记是激活的半胱天冬酶3(3CAS)。在一些实施方案中，凋亡标记是通过膜联蛋白V的阳性染色。在特定实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+、CD27-/CD28+、CD27+/CD28-、CD27-/CD28-、或其组合。
在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CD27+/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CD27-/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CD27+/CD28-、激活的半胱天冬酶3-/CD27-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CD27+/CD28+、膜联蛋白V-/CD27-/CD28+、膜联蛋白V-/CD27+/CD28-、膜联蛋白V-/CD27-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括CD27+、CD27-、CD27+、CD27-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CD27+、CD27-、CD27+、CD27-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CD27-、激活的半胱天冬酶3-/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CD27-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CD27+、膜联蛋白V-/CD27-、膜联蛋白V-/CD27+、膜联蛋白V-/CD27-、或其组合。
在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD28+、CCR7-/CD28+、CCR7+/CD28-、CCR7-/CD28-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD28+、CCR7-/CD28+、CCR7+/CD28-、CCR7-/CD28-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD28-、激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CCR7+/CD28+、膜联蛋白V-/CCR7-/CD28+、膜联蛋白V-/CCR7+/CD28-、膜联蛋白V-/CCR7-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+、CCR7-、CCR7+、CCR7-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7+、CCR7-、CCR7+、CCR7-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CCR7+、激活的半胱天冬酶3-/CCR7-、激活的半胱天冬酶3-/CCR7+、激活的半胱天冬酶3-/CCR7-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CCR7+、膜联蛋白V-/CCR7-、膜联蛋白V-/CCR7+、膜联蛋白V-/CCR7-、或其组合。
在一些实施方案中，输入组合物特征包括本文所述的任何一种或多种或所有输入组合物特征，包括表型。在一些实施方案中，输入组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-、CAS3-/CCR7-/CD27+、CAS3-/CCR7+、CAS3-/CCR7+/CD27-、CAS3-/CCR7+/CD27+、CAS3-/CD27+、CAS3-/CD28-/CD27-、CAS3-/CD28-/CD27+、CAS3-/CD28+、CAS3-/CD28+/CD27-、CAS3-/CD28+/CD27+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-、CAS3-/CCR7-、CD45RA+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-、CAS3-/CCR7+/CD45RA+、CAS+、CAS+/CD3+和克隆性。在一些实施方案中，输入组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+、CAS3-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28-/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD4+、CD45RA+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+、CAS+/CD4+、CAS+/CD3+/CD4+和CD4+克隆性。在一些实施方案中，输入组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+、CAS3-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28-/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD85RA-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD8+、CD85RA+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD85RA-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD85RA+/CD8+、CAS+/CD8+、CAS+/CD3+/CD8+和CD8+克隆性。在一些实施方案中，输入组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+、CAS3-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28-/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD4+、CD45RA+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+、CAS+/CD4+、CAS+/CD3+/CD4+、CD4+克隆性、CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+、CAS3-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28-/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD85RA-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD8+、CD85RA+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD85RA-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD85RA+/CD8+、CAS+/CD8+、CAS+/CD3+/CD8+和CD8+克隆性。
在一些实施方案中，输入组合物特征包括下文表E4中所示的输入组合物特征中的任何一种或多种。在任何上述实施方案的一些中，确定、测量、获得、检测、观察和/或鉴定具有上述表型的细胞的百分比、数量和/或比例。在一些实施方案中，具有所述表型的细胞的数量是输入组合物中具有所述表型的细胞的总量。在一些实施方案中，具有所述表型的细胞的数量可以表示为在输入组合物中存在的具有所述表型的细胞的频率、比率和/或百分比。在一些实施方案中，输入组合物特征是具有本文所述表型的细胞的频率、比率和/或百分比。
3.治疗性细胞组合物特征
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物是从例如如上文所述的输入组合物生成的(例如如本文所述)。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物是治疗性T细胞组合物。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物含有工程化CD4+ T细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物含有工程化CD8+ T细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物含有工程化CD4+和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的工程化T细胞，例如CD4+和/或CD8+工程化T细胞，表达重组受体，如重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组受体(例如，TCR或CAR)结合与疾病或病症相关的抗原。例如，与疾病或病症相关的抗原可以是在疾病或病症的细胞或组织上表达的抗原。在一些实施方案中，所述重组受体特异性地结合至与所述疾病或病症相关的抗原或者在与所述疾病或病症相关的病灶环境中的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因的抗原例如导致、加剧这种疾病、病症或障碍或以其他方式参与其中。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或者例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物，例如治疗性T细胞组合物用于治疗疾病或病症。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括细胞表型。在一些实施方案中，表型是总T细胞的数量。在一些实施方案中，表型是总CD3+ T细胞的数量。在特定实施方案中，表型包括表达重组受体或CAR的细胞。在一些实施方案中，重组或CAR结合与疾病或病症相关的抗原。在一些实施方案中，表型包括一种或多种不同的T细胞亚型。在一些实施方案中，所述一种或多种不同的亚型还表达重组受体或CAR。在一些实施方案中，表型是或包括T细胞亚型的身份。T细胞的不同群体或亚型包括但不限于效应T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、效应记忆T细胞、调节性T细胞、幼稚T细胞、幼稚样T细胞、CD4+细胞和CD8+ T细胞。在某些实施方案中，T细胞亚型可以通过检测特定分子的存在或不存在来鉴定。在某些实施方案中，特定分子是可以用于鉴定T细胞亚型的表面标记。
在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阳性或高水平表达，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD4、CD8、CD45RA、和/或CD45RO。在某些实施方案中，表型是T细胞的或T细胞的亚群或子集的表面标记，如基于一种或多种表面标记的阳性表面标记表达，例如，CD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和/或CD45RO+。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阳性或高水平表达，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如7型C-C趋化因子受体(CCR7)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、和分化簇45RA(CD45RA)。在某些实施方案中，表型标记包括CCR7、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD62L、和L-选择素。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阴性表达或表达的不存在，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD45RA、和/或CD45RO。在某些实施方案中，表型是T细胞的或T细胞的亚群或子集的表面标记，如基于一种或多种表面标记(例如，CD3-、CD4-、CD8-、CD28-、CD62L-、CCR7-、CD27-、CD127-、CD4-、CD8-、CD45RA-、和/或CD45RO-)的表面标记表达的不存在。在一些实施方案中，表型是一种或多种特定分子的阴性表达或表达的不存在，所述一种或多种特定分子是表面标记，例如7型C-C趋化因子受体(CCR7)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、和分化簇45RA(CD45RA)。在某些实施方案中，表型标记包括CCR7、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD62L、和L-选择素。
在某些实施方案中，表型是或包括CD27、CCR7和/或CD45RA的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是CCR7+。在一些实施方案中，表型是CD27+。在一些实施方案中，表型是CCR7-。在一些实施方案中，表型是CD27-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD27+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27-。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD27-。在一些实施方案中，表型是CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CD45RA+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CD27+/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是CD27-/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是CD27-/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA+。
在某些实施方案中，表面标记指示重组受体(例如CAR)的表达。在特定实施方案中，表面标记是重组受体(例如CAR)的表达，其在一些方面可以使用抗体(如抗独特型抗体)来确定。在一些实施方案中，指示重组受体的表达的表面标记是替代标记。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记是由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A(例如SEQ ID NO:1和4)、P2A(例如SEQID NO:5和6)、E2A(例如SEQ ID NO:7)或F2A(例如SEQ ID NO:8))的核酸分开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括截短的细胞表面多肽，例如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(EGFRt，SEQ ID NO:2或3所示的示例性EGFRt序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其经修饰形式。EGFRt可含有由抗体西妥昔单抗
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已经用EGFRt构建体和重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，所述标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如截短形式的)CD34、NGFR、或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸可操作地连接至编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO 2014031687。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR、EGFRt)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR、EGFRt)的示例性多肽包含SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:2或3至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，表型是EGFRt+。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP)、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在某些实施方案中，表型包括表面标记CD3、CD4、CD8中的一种或多种、和/或重组受体(例如CAR)或其指示重组受体(例如CAR)的表达或与重组受体(例如CAR)的表达相关的替代标记的表达(例如表面表达)。在一些实施方案中，替代标记是EGFRt。
在特定实施方案中，通过作为表面标记的一种或多种特定分子的表达来鉴定表型。在某些实施方案中，表型是或包括CD3、CD4、CD8和/或重组受体(例如CAR)的阳性或阴性表达。在某些实施方案中，所述重组受体是CAR。在特定实施方案中，表型包括CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、和/或CD8+/CAR+。
在某些实施方案中，表型是或包括CD27、CCR7和/或CD45RA和/或重组受体(例如CAR)的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD27+/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD28-/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD28-/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD28+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD28+/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CD28+/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7-/CD45RA+/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD45RA+/CAR+。在一些实施方案中，表型进一步是CD4+。在一些实施方案中，表型进一步是CD8+。
在一些实施方案中，表型是活力。在某些实施方案中，表型是标记的阳性表达，所述标记指示细胞经历正常功能性细胞过程和/或尚未经历坏死或程序性细胞死亡或并非处于经历坏死或程序性细胞死亡的过程中。在一些实施方案中，可以通过细胞的氧化还原电位、细胞膜的完整性或线粒体的活性或功能来评估活力。在一些实施方案中，活力是在测定中不存在与细胞死亡相关的特定分子，或不存在细胞死亡的指征。在一些实施方案中，表型是活细胞浓度。
在一些实施方案中，表型是或包含细胞活力。在某些实施方案中，可以通过在本领域中的许多常规手段来检测、测量和/或评估细胞的活力。此类活力测定的非限制性例子包括但不限于染料摄取测定(例如，钙黄绿素AM测定)、XTT细胞活力测定、和染料排除测定(例如，台盼蓝、伊红或丙啶染料排除测定)。活力测定可用于确定细胞剂量、细胞组合物和/或细胞样品中的活细胞的数量或百分比(例如，频率)。在特定实施方案中，表型包括细胞活力以及其他特征(例如，重组受体表达)。在一些实施方案中，表型是或包括可溶性CD137(sCD137、4-IBB)。在一些实施方案中，sCD137指示激活诱导的细胞死亡。在一些实施方案中，在上清液中检测到sCD137。
在某些实施方案中，表型是或包括细胞活力、活CD3+、活CD4+、活CD8+、活CD3+/CAR+、活CD4+/CAR+、活CD8+/CAR+、活CD4+/CCR7+/CAR+、活CD8+/CD27+/CAR+、活CD4+/CD27+/CAR+、活CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+、活CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+、活CD8+/CCR7+/CD45RA-/CAR+或活CD4+/CCR7+/CD45RA-或其组合。
在特定实施方案中，所述表型是或包括凋亡的不存在和/或细胞正在经历凋亡过程的指征。凋亡是程序性细胞死亡的过程，所述过程包括导致特征性细胞变化和死亡的一系列定型的形态学和生物化学事件。这些变化包括出泡、细胞皱缩、核碎裂、染色质凝聚、染色体DNA断裂、和全面mRNA降解。凋亡是一种充分表征的过程，并且与各个阶段相关的特定分子是本领域中熟知的。
在一些实施方案中，表型是凋亡的早期阶段的不存在、和/或与凋亡的早期阶段相关的指示物和/或特定分子的不存在。在凋亡的早期阶段，细胞和线粒体膜的变化变得明显。在细胞的细胞质和细胞核中生物化学变化也很明显。例如，凋亡的早期阶段可以通过某些半胱天冬酶(例如，2、8、9和10)的激活来指示。在特定实施方案中，表型是凋亡的晚期阶段的不存在、和/或与凋亡的晚期阶段相关的指示物和/或特定分子的不存在。凋亡的中期至晚期阶段的特征在于膜完整性的进一步丧失、染色质凝聚和DNA断裂，并且包括生物化学事件如半胱天冬酶3、6和7的激活。
在某些实施方案中，表型是与凋亡相关的一种或多种因子的阴性表达，所述一种或多种因子包括已知启动凋亡的促凋亡因子，例如死亡受体途径的成员、线粒体(内在)途径的激活成员，如Bcl-2家族成员(例如Bax、Bad和Bid)以及半胱天冬酶。在一些实施方案中，表型是阴性或低量的凋亡标记。在某些实施方案中，表型是凋亡标记的阴性表达。在某些实施方案中，表型是不存在指示物，例如膜联蛋白V分子，所述指示物当与细胞组合物一起孵育或接触细胞组合物时优先结合正在经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，表型是或包括指示细胞中的凋亡状态的一种或多种标记的表达。
在一些实施方案中，表型是作为凋亡标记的特定分子的阴性(或低)表达。各种凋亡标记对本领域普通技术人员而言是已知的，并且包括但不限于一种或多种半胱天冬酶(即激活的半胱天冬酶(例如活性半胱天冬酶))的活性的增加、PARP切割的增加、Bcl-2家族蛋白(细胞死亡途径的成员(例如Fas和FADD))的激活和/或易位、核皱缩的存在(例如，通过显微镜监测)和染色体DNA断裂的存在(例如，染色体DNA梯状条带的存在)或使用包括TUNEL染色和膜联蛋白V染色的凋亡测定。
半胱天冬酶是在天冬氨酸残基之后切割蛋白质的酶，所述术语源自“半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶”。半胱天冬酶参与凋亡，因此半胱天冬酶(如半胱天冬酶-3)的激活指示凋亡的增加或再次发生。在某些实施方案中，可以通过普通技术人员已知的方法来检测半胱天冬酶激活。在一些实施方案中，与激活的半胱天冬酶特异性结合(即，与切割过的多肽特异性结合)的抗体可以用于检测半胱天冬酶激活。在另一个例子中，半胱天冬酶活性的荧光色素抑制剂(FLICA)测定可以用于通过检测半胱天冬酶-3对乙酰基Asp-Glu-Val-Asp 7-酰胺基-4-甲基香豆素(Ac-DEVD-AMC)的水解(即检测发荧光的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的释放)来检测半胱天冬酶-3激活。FLICA测定可以用于通过检测通过多种半胱天冬酶处理的底物的产物来确定半胱天冬酶激活(例如，FAM-VAD-FMK FLICA)。其他技术包括使用激活发光的半胱天冬酶-8四肽底物(Z-LETD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-9四肽底物(Z-LEHD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-3/7底物(Z-DEVD-氨基萤光素)、半胱天冬酶-6底物(Z-VEID-氨基萤光素)或半胱天冬酶-2底物(Z-VDVAD-氨基萤光素)的
半胱天冬酶测定(PROMEGA)。
在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶-1、激活的半胱天冬酶-2、激活的半胱天冬酶-3、激活的半胱天冬酶-7、激活的半胱天冬酶-8、激活的半胱天冬酶-9、激活的半胱天冬酶-10和/或激活的半胱天冬酶-13在细胞中的阴性表达。在特定实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-。在一些实施方案中，半胱天冬酶的前体形式(酶原切割形式)(如上述任何形式)也是指示凋亡存在的标记。在一些实施方案中，表型是或包括半胱天冬酶的前体形式(如半胱天冬酶-3的前体形式)的不存在或阴性表达。
在一些实施方案中，凋亡标记是切割的聚ADP-核糖聚合酶1(PARP)。PARP在凋亡的早期阶段期间被半胱天冬酶切割。因此，切割的PARP肽的检测是凋亡的标记。在特定实施方案中，表型是或包括切割的PARP的阳性或阴性表达。
在一些实施方案中，凋亡标记是检测细胞中与凋亡相关的特征的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是膜联蛋白V分子。在凋亡的早期阶段期间，脂质磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内部小叶易位到外部小叶。PS通常受限于健康和/或非凋亡细胞中的内膜。膜联蛋白V是一种以高亲和力优先结合磷脂酰丝氨酸(PS)的蛋白质。当与荧光标签或其他报告物缀合时，膜联蛋白V可以用于快速检测凋亡的这种早期细胞表面指示物。在一些实施方案中，PS在外膜上的存在将持续到凋亡的晚期阶段。因此，在一些实施方案中，膜联蛋白V染色是凋亡的早期和晚期阶段二者的指征。在某些实施方案中，将膜联蛋白(例如膜联蛋白V)用可检测的标记进行标记，并且与在细胞组合物中的细胞一起孵育、暴露于在细胞组合物中的细胞和/或与在细胞组合物中的细胞接触，以例如通过流式细胞术检测正在经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，将荧光标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V)用于将细胞染色以供流式细胞术分析(例如使用膜联蛋白-V/7-AAD测定)。适合于用膜联蛋白进行凋亡检测的替代性方案包括利用放射性标记的膜联蛋白V的技术和测定。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白的阴性染色，例如膜联蛋白V-。在特定实施方案中，表型是或包括外质膜上PS的不存在。在某些实施方案中，表型是或包括不被膜联蛋白(例如膜联蛋白V)结合的细胞。在某些实施方案中，在外膜上缺乏可检测的PS的细胞是膜联蛋白V-的。在特定实施方案中，在与标记的膜联蛋白V一起孵育之后在测定(例如流式细胞术)中未被膜联蛋白V-结合的细胞是膜联蛋白V-的。
在特定实施方案中，表型是膜联蛋白V-、膜联蛋白V-CD3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、膜联蛋白V-CD3+/CAR+、膜联蛋白V-CD4+/CAR+、膜联蛋白V-CD8+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CAR+、膜联蛋白V-/CD8+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD4+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+、膜联蛋白V-/CD8+/CCR7+/CD45RA–/CAR+或膜联蛋白V-/CD4+/CCR7+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CCR7+/CD45RA-/CAR+或激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CCR7+/CD45RA-或其组合。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28-/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28-/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28+/CD27-/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CD28+/CD27+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7-/CD45RA+/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD45RA-/CAR+。在一些实施方案中，表型是3CAS-/CCR7+/CD45RA+/CAR+。在一些实施方案中，表型进一步是CD4+。在一些实施方案中，表型进一步是CD8+。
特定实施方案设想到，对凋亡标记的表达呈阳性的细胞正在经历程序性细胞死亡，显示降低的免疫功能或没有免疫功能，并且具有减弱的经历激活、扩增能力(如果存在)，和/或结合抗原以启动、进行或促进免疫应答或活性。在特定实施方案中，表型被定义为激活的半胱天冬酶的阴性表达和/或膜联蛋白V的阴性染色。
在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-(3CAS-，半胱天冬酶3-)和/或膜联蛋白V-。
表型包括通常与T细胞的一种或多种亚型或亚群或其表型相关的一种或多种标记的表达或表面表达。T细胞亚型和亚群可以包括CD4+和/或CD8+ T细胞及其亚型，所述CD4+和/或CD8+ T细胞及其亚型可以包括幼稚T(TN)细胞、幼稚样T细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、TEMRA细胞或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些方面，表型包括与分化程度较低的细胞子集或分化程度较高的子集相关的表达或标记或功能，例如，抗原特异性功能(如细胞因子分泌)。在一些实施方案中，表型是与分化程度较低的子集相关的那些表型，如CCR7+、CD27+和白介素2(IL-2)产生中的一种或多种。在一些方面，分化程度较低的子集也可能与治疗功效、自我更新、存活功能或移植物抗宿主病有关。在一些实施方案中，表型是与分化程度较高的子集相关的那些表型，如干扰素-γ(IFN-γ)或IL-13产生中的一种或多种。在一些方面，分化程度较高的子集也可能与衰老和效应子功能有关。
在一些实施方案中，表型是或包括暴露于其同源抗原的记忆T细胞或记忆T细胞子集的表型。在一些实施方案中，表型是或包括记忆T细胞，如TCM细胞、TEM细胞或TEMRA细胞、TSCM细胞、或其组合的表型(或与其相关的一种或多种标记)。在特定实施方案中，表型是或包括一种或多种特定分子的表达，所述一种或多种特定分子是记忆和/或记忆T细胞或其亚型的标记。在一些方面，与TCM细胞相关的示例性表型可以包括CD45RA-、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+和CD95+中的一种或多种。在一些方面，与TEM细胞相关的示例性表型可以包括CD45RA-、CD62L-、CCR7-、CD27-、CD28-和CD95+中的一种或多种。
在特定实施方案中，表型是或包括作为幼稚T细胞的标记的一种或多种特定分子的表达。
在一些实施方案中，表型是或包括记忆T细胞或幼稚T细胞。在某些实施方案中，表型是作为记忆标记的一种或多种特定分子的阳性或阴性表达。在一些实施方案中，记忆标记是可以用于定义记忆T细胞群的特定分子。
在一些实施方案中，表型是或包括与幼稚样T细胞相关的表型或一种或多种标记。在某些实施方案中，幼稚样T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CCR7、CD45RA、CD28和/或CD27的阳性或高表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD25、CD45RO、CD56、CD62L和/或KLRG1的阴性表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD95的低表达。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA+，其中所述细胞是CD27+或CD27-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD27+CCR7+，其中所述细胞是CD45RA+或CD45RA-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD62L-CCR7+。
在一些实施方案中，表型是或包括非记忆T细胞或其亚型的表型或与非记忆T细胞或其亚型相关一种或多种标记；在一些方面，表型是或包括与幼稚细胞相关的表型或一种或多种标记。在一些方面，与幼稚T细胞相关的示例性表型可以包括CCR7+、CD45RA+、CD27+和CD28+中的一种或多种。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+。在某些实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+。在一些实施方案中，表型是或包括中枢记忆T细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+。在某些实施方案中，表型是或包括TEMRA细胞或TSCM细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括CD45RA+。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+。在一些实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+、CD27-/CD28+、CD27+/CD28-、或CD27-/CD28-中的一种。在一些实施方案中，表型是CCR7+/CD27+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD45RA+。在某些实施方案中，表型是或包括CD27-/CD28-。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD27+/CD45RA-。在一些实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27+/CD45RA-。在某些实施方案中，表型是或包括CD45RA+。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7-/CD27-/CD45RA+。
在一些实施方案中，表型是或包括任何前述表型特性，并且进一步包括重组受体的表达，如与记忆T细胞或记忆亚型相关并表达CAR的表型，或与表达CAR的幼稚细胞相关的表型。在某些实施方案中，表型是或包括表达CAR的中枢记忆T细胞或中枢记忆干T细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的效应记忆细胞的表型。在一些实施方案中，表型是或包括表达CAR的TEMRA细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；CAR+/CD27+/CD28+；CAR+/CD27-/CD28+；CAR+/CD27+/CD28-；或CAR+/CD27-/CD28-。在特定实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-；CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；CAR+/CD27+；CAR+/CD27-；CAR+/CD27+/CD28-；或CAR+/CD27-/CD28-。
在某些实施方案中，表型是或包括对凋亡标记呈阴性的T细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括对凋亡标记呈阴性的幼稚细胞。在一些实施方案中，凋亡标记是激活的半胱天冬酶3(3CAS)。在一些实施方案中，凋亡标记是通过膜联蛋白V的阳性染色。
在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的记忆T细胞或其亚型的表型。在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的记忆T细胞或特定亚型的表型。在某些实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的幼稚细胞。在某些实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的中枢记忆T细胞或TSCM细胞或幼稚细胞的表型。在特定实施方案中，表型是或包括表达CAR的对凋亡标记呈阴性的效应记忆细胞的表型。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28-；或膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28-。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28-；或激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28-。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-；膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD45RA+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28+；膜联蛋白V-/CAR+/CD27+；或膜联蛋白V-/CAR+/CD27-。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD45RA+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28+；激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+；或激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-。
在特定实施方案中，表型是或包括CD27+/CD28+、CD27-/CD28+、CD27+/CD28-、CD27-/CD28-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CD27+/CD28+、CAR+/CD27-/CD28+、CAR+/CD27+/CD28-、CAR+/CD27-/CD28-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+/CD28-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27+/CD28-、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括CD27+、CD27-、CD27+、CD27-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CD27+、CAR+/CD27-、CAR+/CD27+、CAR+/CD27-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CD27-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CD27+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-、膜联蛋白V-/CAR+/CD27+、膜联蛋白V-/CAR+/CD27-、或其组合。
在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+/CD28+、CCR7-/CD28+、CCR7+/CD28-、CCR7-/CD28-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+/CD28+、CAR+/CCR7-/CD28+、CAR+/CCR7+/CD28-、CAR+/CCR7-/CD28-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD28+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+/CD28-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD28+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+/CD28-、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-/CD28-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括CCR7+、CCR7-、CCR7+、CCR7-、或其组合。在一些实施方案中，表型是或包括CAR+/CCR7+、CAR+/CCR7-、CAR+/CCR7+、CAR+/CCR7-、或其组合。在某些实施方案中，表型是或包括激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7+、激活的半胱天冬酶3-/CAR+/CCR7-、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7+、膜联蛋白V-/CAR+/CCR7-、或其组合。
在一些实施方案中，通过对刺激物(例如触发、诱导、刺激或延长免疫细胞功能的刺激物)的反应来评估表型。在某些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育细胞，表型是或包括对刺激的反应。在特定实施方案中，表型是或包括响应于一种或多种刺激而产生或分泌可溶性因子。在一些实施方案中，表型是或包括响应于一种或多种刺激而缺乏或产生或分泌可溶性因子。在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子是TNFa。在一些实施方案中，细胞因子是IL-17。在一些实施方案中，细胞因子是IL-10。在一些实施方案中，细胞因子是IFNG。在一些实施方案中，细胞因子是IL-13。在一些实施方案中，细胞因子是IL-5。在一些实施方案中，细胞因子是GMSCF。在一些实施方案中，细胞不产生细胞因子(cyto-)。在一些实施方案中，细胞表型是细胞因子阴性(Cyto-)。
用于刺激细胞的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子、和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。在一些实施方案中，刺激细胞并且通过是否产生或分泌可溶性因子(例如细胞因子或趋化因子)来确定表型。在一些实施方案中，刺激是非特异性的，即不是抗原特异性刺激。在一些实施方案中，刺激包括PMA和离子霉素。在一些实施方案中，将细胞在刺激条件或刺激剂的存在下孵育约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约24小时、约48小时，或孵育在1小时与4小时之间、在1小时与12小时之间、在12小时与24小时之间的持续时间，或孵育超过24小时。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括重组受体依赖性活性。例如，在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物的细胞用药剂刺激，所述药剂是对重组受体特异的抗原或其表位或者是结合和/或识别重组受体的抗体或其片段，或其组合。特定实施方案设想到，重组受体依赖性活性(例如CAR依赖性活性)是在表达重组受体的细胞中发生的、不在和/或不能在不表达重组受体的细胞中发生的活性。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是依赖于重组受体的活性或存在的活性。重组受体依赖性活性可以是直接或间接受重组受体的表达和/或存在影响或者受重组受体的活性的变化(如受体刺激)的影响的任何细胞过程。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性可以包括但不限于细胞过程如细胞分裂、DNA复制、转录、蛋白质合成、膜转运、蛋白质转位和/或分泌，或者它可以是免疫细胞功能，例如细胞溶解活性。在某些实施方案中，重组受体依赖性活性可以通过CAR受体的确认、细胞内信号传导分子的磷酸化、蛋白质的降解、蛋白质的转录、翻译、转位、和/或因子(如蛋白质、或生长因子、细胞因子)的产生和分泌的变化来测量。
在一些实施方案中，所述重组受体是CAR，并且所述药剂是对所述CAR具有特异性的抗原或其表位，或者是结合和/或识别所述CAR的抗体或其片段，或其组合。在特定实施方案中，通过在靶细胞的存在下孵育细胞来刺激细胞，所述靶细胞具有由所述CAR识别的抗原的表面表达。在某些实施方案中，所述重组受体是CAR，并且所述药剂是结合所述CAR的抗体或其活性片段、变体或部分。在某些实施方案中，与所述CAR结合的所述抗体或其活性片段、变体或部分是抗独特型(抗ID)抗体。在某些实施方案中，重组受体特异性药剂是在其表面上表达抗原的细胞，例如靶细胞。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性通过由重组受体结合和/或识别(例如，接合)的抗原或其表位来刺激。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂，例如配体。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支持物(如珠)的抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂是PMA和离子霉素。
在某些实施方案中，重组受体依赖性活性(例如CAR依赖性活性)是在刺激细胞组合物后的因子的测量值，例如量或浓度、或者量或浓度的变化。在某些实施方案中，因子可以是蛋白质、磷酸化蛋白质、经切割的蛋白质、转位的蛋白质、活性确认中的蛋白质、多核苷酸、RNA多核苷酸、mRNA和/或shRNA。在某些实施方案中，测量可以包括但不限于激酶活性、蛋白酶活性、磷酸酶活性的增加或减少、cAMP产生、ATP代谢、转位(例如蛋白质的核定位)、转录活性的增加、翻译活性的增加、可溶性因子的产生和/或分泌、细胞摄取、泛素化和/或蛋白质降解。在特定实施方案中，因子是被分泌的可溶性因子，如激素、生长因子、趋化因子和/或细胞因子。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性(例如CAR依赖性活性)是对刺激的反应。在某些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育细胞，并且活性是或包括对刺激的反应的至少一个方面。反应可以包括但不限于细胞内信号传导事件(如受体分子活性增加、一种或多种激酶的激酶活性增加、一种或多种基因的转录增加、一种或多种蛋白质的蛋白质合成增加)、和/或细胞内信号传导分子(例如，蛋白质的激酶活性增加)。在一些实施方案中，反应或活性与免疫活性相关，并且可以包括但不限于可溶性因子(例如细胞因子)产生和/或分泌、抗体产生增加、和/或细胞溶解活性增加。
在特定实施方案中，细胞组合物对刺激的反应是通过测量、检测或定量对刺激物的反应(即由刺激物启动、触发、支持、延长和/或引起的至少一种活性)来评估的。在某些实施方案中，细胞被刺激并且对刺激的反应是对表达重组受体的细胞特异的活性。在某些实施方案中，活性是重组受体特异性活性，并且活性发生在表达重组受体的细胞中，但不发生在不表达受体的细胞中或仅在不表达受体的细胞中发生最少。在特定实施方案中，所述重组受体是CAR。在一些实施方案中，活性是CAR依赖性活性。
用于刺激细胞(例如免疫细胞或T细胞)的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。在一些实施方案中，刺激细胞并且通过是否产生或分泌可溶性因子(例如细胞因子或趋化因子)来确定活性。
在一些实施方案中，活性对表达重组受体的细胞是特异的。在一些实施方案中，对表达重组受体的细胞特异的活性不会发生在缺乏重组受体表达的细胞中。在某些实施方案中，重组受体是CAR，并且活性是CAR依赖性活性。在特定实施方案中，在活性存在于表达重组受体的细胞中的相同条件下，所述活性不存在于缺乏重组受体表达的细胞中。在某些实施方案中，在相同条件下，CAR依赖性活性比在CAR-细胞中的CAR依赖性活性少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％、或约99％。
在一些实施方案中，活性对表达重组受体(例如CAR)的细胞是特异的，并且通过用对表达重组受体的细胞特异的药剂或在对表达重组受体的细胞特异的刺激条件下刺激产生所述活性。在一些实施方案中，重组受体是CAR，并且CAR特异性刺激刺激、触发、启动和/或延长在CAR+细胞中的活性，但不刺激、触发、启动和/或延长在CAR-细胞中的活性。在一些实施方案中，在通过CAR特异性刺激物刺激后，CAR依赖性活性在CAR-细胞中比在CAR+细胞中少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％、或约99％。
在一些实施方案中，在含有表达重组受体(例如CAR)的细胞的细胞组合物中测量活性，并且将测量值与一个或多个对照进行比较。在某些实施方案中，对照是未受刺激的相似或相同的细胞组合物。例如，在一些实施方案中，在与药剂一起孵育之后或期间在细胞组合物中测量活性，并且将所得的测量值与来自未与药剂一起孵育的相似或相同细胞组合物的活性的对照测量值进行比较。在一些实施方案中，活性是重组受体依赖性活性，并且所述细胞组合物和对照细胞组合物都含有表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，活性是重组受体依赖性活性，并且对照是从不含有表达重组受体的细胞(例如CAR+细胞)的类似细胞组合物取得。因此，在一些实施方案中，将含有重组受体表达细胞的细胞组合物和不含有重组受体表达细胞的对照细胞组合物与表达重组受体的特定药剂接触。在某些实施方案中，对照是来自任何刺激之前取得的表达重组受体的相同细胞组合物的测量值。在某些实施方案中，获得对照测量值以确定背景信号，并且从活性的测量值中减去对照测量值。在一些实施方案中，将在细胞组合物中的活性的测量值除以对照测量值，以获得活性与对照水平的比的值。
在特定实施方案中，活性是或包括可溶性因子的产生和/或分泌。在一些实施方案中，活性是重组受体(例如CAR)依赖性活性，所述重组受体(例如CAR)依赖性活性是或包括可溶性因子的产生和/或分泌。在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子或趋化因子。
在特定实施方案中，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)来测量可溶性因子的测量值。ELISA是设计用于检测和定量物质如肽、细胞因子、抗体和激素的一种基于板的测定技术。在ELISA中，必须将可溶性因子固定在固体表面上，并然后与跟酶连接的抗体复合。经由与底物一起孵育以产生可检测的信号评估缀合的酶活性来完成检测。在一些实施方案中，用ELISA测定来测量CAR依赖性活性。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是可溶性因子的分泌或产生。在某些实施方案中，通过重组受体特异性药剂(例如CAR+特异性药剂)在含有重组受体表达细胞(例如CAR表达细胞)的细胞组合物中刺激产生或分泌。在一些实施方案中，重组受体特异性药剂是对重组受体特异的抗原或其表位；表达抗原的细胞，例如靶细胞；或结合和/或识别重组受体的抗体或其部分或变体；或其组合。在某些实施方案中，重组受体特异性药剂是重组蛋白，所述重组蛋白包含由重组受体结合或识别的抗原或其表位。
在某些实施方案中，通过将含有表达重组受体(例如CAR)的细胞的细胞组合物与重组受体特异性药剂(例如CAR+特异性药剂)一起孵育来测量重组受体依赖性可溶性因子产生和/或分泌。在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，含有重组受体表达细胞的在细胞组合物中的细胞在重组受体特异性药剂的存在下孵育一定的时间量，并且在孵育期间在一个或多个时间点处测量可溶性因子的产生和/或分泌。在一些实施方案中，将细胞与CAR特异性药剂一起孵育长达或约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约48小时，或孵育在1小时与4小时之间、在1小时与12小时之间、在12小时与24小时之间(每个都包含端值)的持续时间，或孵育超过24小时，并且检测可溶性因子(例如细胞因子)的量。
在一些实施方案中，重组受体特异性药剂是表达由重组受体识别的抗原的靶细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAR，并且将细胞组合物的细胞与靶细胞一起以约10:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、或约1:10、或任何前述之间的范围的细胞组合物的总细胞、CAR+细胞、CAR+/CD8+细胞或膜联蛋白-/CAR+/CD8+细胞与靶细胞的比率孵育，如以在10:1与1:1之间、在3:1与1:3之间、或在1:1与1:10之间(每个都包含端值)的比率孵育。
在某些实施方案中，重组受体依赖性活性(例如CAR+特异性活性)的测量值是在孵育期间或结束时的时间点的T细胞组合物中可溶性因子的量或浓度、或相对量或浓度。在特定实施方案中，将测量值减去或归一化至对照测量值。在一些实施方案中，对照测量值是在孵育之前取得的来自相同细胞组合物的测量值。在特定实施方案中，对照测量值是从未与重组受体特异性刺激剂一起孵育的相同对照细胞组合物取得的测量值。在某些实施方案中，对照是在与重组受体特异性药剂孵育期间的相同时间点从不含有重组受体阳性细胞的细胞组合物取得的测量值。
在一些实施方案中，测量值是如与对照相比的量或浓度的归一化比率。在特定实施方案中，测量值是每时间量(例如，每分钟或每小时)的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每个细胞或每设定或参考数量的细胞(例如，每100个细胞、每103个细胞、每104个细胞、每105个细胞、每106个细胞等)的可溶性因子的量或浓度。在某些实施方案中，测量值是每时间量、每个细胞或每参考数量的细胞的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是细胞组合物中每个表达重组受体的细胞、CAR+细胞、CAR+/CD8+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD8+细胞、3CAS-/CAR+/CD8+细胞、CAR+/CD4+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD4+细胞、或3CAS-/CAR+/CD4+细胞的可溶性因子的量或浓度。在某些实施方案中，测量值是细胞组合物中每个表达重组受体的细胞、CAR+细胞、CAR+/CD8+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD8+细胞、3CAS-/CAR+/CD8+细胞、CAR+/CD4+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD4+细胞、或3CAS-/CAR+/CD4+细胞每时间量(例如每分钟或每小时)的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每时间量每重组受体或CAR+特异性药剂的量或浓度的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每个细胞或每设定或参考数量的细胞每CAR+特异性药剂的量或浓度的可溶性因子的量或浓度。在某些实施方案中，测量值是每时间量、每重组受体或CAR+特异性药剂的量或浓度、每个细胞或每参考数量的细胞的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是细胞组合物中每个表达重组受体的细胞、CAR+细胞、CAR+/CD8+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD8+细胞、3CAS-/CAR+/CD8+细胞、CAR+/CD4+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD4+细胞、或3CAS-/CAR+/CD4+细胞每重组受体或CAR+特异性药剂的量或浓度的可溶性因子的量或浓度。在某些实施方案中，测量值是细胞组合物中每CAR+细胞、CAR+/CD8+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD8+细胞、3CAS-/CAR+/CD8+细胞、CAR+/CD4+细胞、膜联蛋白-/CAR+/CD4+细胞、或3CAS-/CAR+/CD4+细胞的量的、每重组受体或CAR+特异性药剂的量或浓度的、每时间量的可溶性因子的量或浓度。
在特定实施方案中，重组受体或CAR依赖性活性是两种或更多种可溶性因子的产生或分泌。在某些实施方案中，重组受体或CAR依赖性活性是两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种可溶性因子的产生或分泌。在一些实施方案中，将两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种可溶性因子的测量值合并成算术平均值或几何平均值。在某些测量中，重组受体活性的测量值是两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种可溶性因子的复合物的分泌。
在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子。在特定实施方案中，重组受体依赖性活性是或包括响应于一种或多种刺激而产生或分泌细胞因子。细胞因子是在细胞通讯中广泛发挥作用的一大组小的信号传导分子。细胞因子最常与各种免疫调节分子(包括白介素、趋化因子和干扰素)相关。可替代地，细胞因子可以通过它们的结构来表征，其被分类为四个家族：包括IL-2亚家族和IFN亚家族的四α螺旋家族；IL-1家族、IL-17家族、IL-10家族、和包括转化生长因子β家族成员的半胱氨酸结细胞因子。细胞因子的产生和/或分泌有助于免疫应答，并涉及不同的过程，包括抗病毒蛋白的诱导和T细胞增殖的诱导。细胞因子不是预先形成的因子，而是响应于细胞激活而快速产生和分泌。可以通过本领域已知的任何合适的技术测量、检测和/或定量细胞因子的产生或分泌。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是包括白介素、干扰素和趋化因子的一种或多种可溶性因子的产生或分泌。在特定实施方案中，重组受体依赖性活性是IL-2家族成员、IFN亚家族成员、IL-1家族成员、IL-10成员、IL-17家族成员、半胱氨酸结细胞因子和/或转化生长因子β家族的成员中的一种或多种的产生或分泌。
在某些实施方案中，表型是一种或多种细胞因子的产生。在一些实施方案中，从相同细胞产生两种或更多种细胞因子可以指示此类细胞的多功能特征。在特定实施方案中，通过细胞内细胞因子染色来测量、检测和/或定量一种或多种细胞因子的产生。通过流式细胞术进行的细胞内细胞因子染色(ICS)是非常适合于在单细胞水平上研究细胞因子产生的一种技术。它检测在细胞刺激后在内质网内的细胞因子的产生和积累，从而允许鉴定对于特定细胞因子的产生呈阳性或阴性的细胞群或基于阈值将高产和低产细胞分离。在一些实施方案中，如上所述，可以使用非特异性刺激(例如不是抗原特异性刺激)来进行刺激。例如，PMA/离子霉素可用于非特异性细胞刺激。在一些实施方案中，刺激可以通过如下药剂进行，所述药剂是对重组受体(例如CAR)具有特异性的抗原或其表位，或者是结合和/或识别重组受体的抗体或其片段，或其组合。ICS还可以与其他流式细胞术方案结合用于使用细胞表面标记或用MHC多聚体进行免疫表型分析，以获得特定细胞亚群中的细胞因子产生，使ICS成为极其灵活和通用的方法。用于测量或检测细胞因子产生的其他单细胞技术包括但不限于ELISPOT、有限稀释和T细胞克隆。
在一些实施方案中，表型是如在用对重组受体具有特异性和/或由重组受体识别的抗原刺激重组受体后，细胞因子的产生。在特定实施方案中，表型是如在用对重组受体具有特异性和/或由重组受体识别的抗原刺激重组受体后，细胞因子的产生的缺乏。在特定实施方案中，表型是对于细胞因子的产生呈阳性或者是高水平的细胞因子产生。在某些实施方案中，表型是对于细胞因子的产生呈阴性或者是低水平的细胞因子产生。细胞因子可以包括但不限于白介素-1(IL-1)、IL-1β、IL-2、sIL-2Ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL 27、IL-33、IL-35、TNF、肿瘤坏死因子α(TNFA)、CXCL2、CCL2、CCL3、CCL5、CCL17、CCL24、PGD2、LTB4、干扰素γ(IFNG)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、巨噬细胞炎症蛋白MIP1α、MIP1β、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，表型包括细胞因子的产生，所述细胞因子例如与特定细胞类型相关的细胞因子，如与Th1、Th2、Th17和/或Treg亚型相关的细胞因子。在一些实施方案中，示例性Th1相关细胞因子包括IL-2、IFN-γ和转化生长因子β(TGF-β)，并且在一些情况下参与细胞免疫应答。在一些实施方案中，示例性Th2相关细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，并且在一些情况下与体液免疫和抗炎特性相关。在一些实施方案中，示例性Th17相关细胞因子包括IL-17A和IL-17F，并且在一些情况下例如在炎症反应期间参与募集嗜中性粒细胞和巨噬细胞。
在特定实施方案中，重组受体依赖性活性是IL-1、IL-1β、IL-2、sIL-2Ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL 27、IL-33、IL-35、TNF、TNFα、CXCL2、CCL2、CCL3、CCL5、CCL17、CCL24、PGD2、LTB4、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1a、MIP-1b、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5中的一种或多种的产生和/或分泌。在某些实施方案中，重组受体依赖性活性是Th17细胞因子的产生或分泌。在一些实施方案中，Th17细胞因子是GMCSF。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性包括Th2细胞因子的产生或分泌，其中所述Th2细胞因子是IL-4、IL-5、IL-10或IL-13。
在某些实施方案中，重组受体依赖性活性是促炎细胞因子的产生或分泌。促炎性细胞因子在启动炎性反应中起作用并且调节针对介导先天免疫应答的病原体的宿主防御。促炎性细胞因子包括但不限于白介素(IL)、白介素-l-β(IL-1)、白介素-3(IL-3)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-13(IL-13)、肿瘤坏死因子(TNF)、CXC-趋化因子配体2(CXCL2)、CC-趋化因子配体2(CCL2)、CC-趋化因子配体3(CCL3)、CC-趋化因子配体5(CCL5)、CC-趋化因子配体17(CCL17)、CC-趋化因子配体24(CCL24)、前列腺素D2(PGD2)和白三烯B4(LTB4)以及IL-33。在一些实施方案中，CAR依赖性活性是白介素和/或TNF家族成员的产生和/或分泌。在特定实施方案中，CAR依赖性活性是IL-1、IL-6、IL-8、和IL-18、TNF-α或其组合的产生和/或分泌。
在特定实施方案中，重组受体依赖性活性是IL-2、IFN-γ、TNF-α或其组合的分泌。
在一些实施方案中，表型(例如重组受体依赖性活性)是或包括细胞因子的产生。在某些实施方案中，表型是或包括多于一种细胞因子的产生(例如多功能的)。在某些实施方案中，重组受体依赖性活性是或包括缺乏一种或多种细胞因子的产生。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFNG或TNFA中的一种或多种的产生或缺乏所述产生。在某些实施方案中，重组受体依赖性活性是或包括IL-2、IL-13、IFNG或TNFA中的一种或多种的产生或缺乏所述产生。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是存在细胞因子的产生、和/或存在细胞因子的高水平产生。在一些实施方案中，表型是细胞因子的低的、减少的或不存在的产生。
在一些实施方案中，表型是或包括细胞因子的内部(细胞内)产生，例如，如在刺激剂的存在下或在刺激条件下在分泌被阻止或抑制时评估的。在一些实施方案中，刺激剂是非特异性刺激剂，例如不与例如重组受体(例如CAR)上的抗原结合结构域结合的刺激剂。在一些实施方案中，刺激剂是PMA/离子霉素，其可以充当非特异性刺激剂。在一些实施方案中，刺激剂是特异性刺激剂，例如是如下刺激剂：是对重组受体(例如CAR)具有特异性的抗原或其表位，或者是结合和/或识别重组受体的抗体或其片段，或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括细胞因子的内部产生的缺乏或不存在。在某些实施方案中，当用ICS测定评估超过一种细胞因子的产生时，表型是或包括一种或多种细胞因子的内部量。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-5、IL-13、IFNG或TNFA中的一种或多种的内部量，如通过ICS测定评估的。在一些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的低内部量或缺乏可检测量，如用ICS测定评估的。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-5、IL-13、IFNG或TNFA的低内部量或缺乏可检测量，如用ICS测定评估的。在一些实施方案中，表型包括例如通过多重测定或评估多功能性的测定对多种细胞因子的评估(参见例如，Xue等人,(2017)Journal for ImmunoTherapy of Cancer 5:85)。在一些实施方案中，细胞因子表达的缺乏与细胞的活性和/或功能和/或反应和无进展存活期的持久性相反地相关联或相关。在一些实施方案中，在细胞组合物(例如，输出组合物、治疗性细胞组合物)中减少根据任何已知方法或本文所述的方法所评估具有减少的、极少的或没有细胞因子产生的细胞。
特定实施方案设想到，表型可以包括细胞因子的产生、或细胞因子产生的缺乏或低量。这可能取决于若干种因素，所述因素包括但不限于细胞因子的身份、为了检测细胞因子而进行的测定、以及与所述测定一起使用的刺激剂或刺激条件。例如，在一些实施方案中，设想到了表型是或包括如通过ICS指示的IL-13产生的缺乏或低水平，而在一些实施方案中，表型是或包括如通过ICS指示的IFN-γ的产生。
在一些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的产生以及CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、膜联蛋白V-、膜联蛋白V-CD3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、膜联蛋白V-CD3+/CAR+、膜联蛋白V-CD4+/CAR+、膜联蛋白V-CD8+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、或激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、或其组合。在特定实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+中一种或多种细胞因子的产生。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是IL-2、IFN-γ和/TNF-α。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中IL-2的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在CD8+/CAR+细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生。在一些实施方案中，表型是或包括在膜联蛋白V-/CD8+/CAR+细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。在一些实施方案中，此段落中描述的表型与持久反应和无进展存活期呈正相关。因此，在一些实施方案中，在细胞组合物(例如，输出组合物、治疗性细胞组合物)中最大化或增加包括这些表型的细胞。
在一些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的产生的缺乏。在某些实施方案中，表型是或包括一种或多种细胞因子的产生的缺乏和CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、膜联蛋白V-、膜联蛋白V-CD3+、膜联蛋白V-CD4+、膜联蛋白V-CD8+、膜联蛋白V-CD3+/CAR+、膜联蛋白V-CD4+/CAR+、膜联蛋白V-CD8+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-、激活的半胱天冬酶3-/CD3+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+、激活的半胱天冬酶3-/CD8+、激活的半胱天冬酶3-/CD3+/CAR+、激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+、或激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+、或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是IL-2、IFN-γ和/TNF-α。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD4+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，表型是或包括在激活的半胱天冬酶3-/CD8+/CAR+细胞中INF-γ和TNF-α的产生的缺乏。在一些实施方案中，此段落中描述的表型与持久反应和无进展存活期负相关。
在特定实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-13、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种的内部量的存在或不存在(如用ICS测定评估的)，和特定细胞类型的细胞子集或细胞的一种或多种特定标记。在一些实施方案中，表型是或包括IL-2、IL-13、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种的产生或其缺乏以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括IL-2的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IL-2的缺乏或低产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IL-13的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IL-13的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括IL-13的缺乏或低产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括IFN-γ的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括TNF-α的产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括TNF-α的缺乏或低产生以及CD4+/CAR+和/或CD8+/CAR+。
可以根据所提供的方法评估或确定单独的或组合的任何一种或多种表型。在一些实施方案中，表型是CD3+、CD3+/CAR+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、或其组合。
在某些实施方案中，表型是或包括CD3+。在某些实施方案中，表型是或包括CD3+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括CD4+/CAR+。
在特定实施方案中，表型是或包括膜联蛋白-/CD3+/CAR+。在一些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白-/CD4+/CAR+。在特定实施方案中，表型是膜联蛋白-/CD8+/CAR。
在特定实施方案中，表型是或包括细胞内IL-2的缺乏或低量和CD4+/CAR+。在特定实施方案中，表型是细胞内IL-13的缺乏或低量和CD4+/CAR+。在一些实施方案中，表型是IL-13的细胞内表达的缺乏或低量和CD8+/CAR+细胞。在特定实施方案中，表型是细胞内TNF-α的缺乏或低量和CD4+/CAR+。
在某些实施方案中，表型是或包括CD8+/CAR+。在某些实施方案中，表型是或包括膜联蛋白-/CD8+/CAR+。
在一些实施方案中，表型包含产生细胞因子的一种或组合的指示物，其任选地对抗原或重组受体是非特异性的和/或是多克隆产生的，其中所述一种或多种细胞因子是IL-2、IL-13、IL-17、IFN-γ或TNF-α。在一些实施方案中，在测定(任选地细胞内细胞因子染色测定)中测量产生的指示物，所述测定包括将T细胞组合物的样品与多克隆药剂、抗原特异性药剂或结合重组受体(任选地CAR)的药剂一起孵育。在一些实施方案中，所述药剂是或包含PMA和离子霉素，或者是或包含T细胞受体或T细胞受体复合物激动剂。在一些实施方案中，表型包括幼稚表型或记忆表型，任选地其中所述记忆表型包括T效应记忆表型、T中枢记忆表型或表达CD45RA的T效应记忆表型(Temra)。
在一些实施方案中，重组受体依赖性(例如CAR)活性是促炎性细胞因子(任选地，TNF-α、IFN-γ、和IL-2中的一种或组合)的产生或积累的量度。在一些实施方案中，重组受体依赖性(例如，CAR)活性是TNF-α、IFN-γ、和IL-2、和IL-17的组合的产生或积累的量度。在一些实施方案中，重组受体依赖性(例如，CAR)活性是IFN-γ和IL-2的产生或积累的量度。在一些实施方案中，重组受体依赖性(例如，CAR)活性是IFN-γ、TNFA和IL-2的产生或积累的量度。在一些实施方案中，重组受体依赖性(例如，CAR)活性是IFN-γ和TNFA的产生或积累的量度。
在一些实施方案中，重组受体活性是重组受体特异性杀伤(例如，细胞溶解行为)。在一些实施方案中，评估(例如，定量)工程化CD8+细胞的细胞溶解活性。在一些实施方案中，通过将表达重组受体的细胞或含有表达重组受体的细胞的细胞组合物暴露于表达由重组受体结合和/或识别的抗原或表位的靶细胞、与表达由重组受体结合和/或识别的抗原或表位的靶细胞一起孵育和/或与表达由重组受体结合和/或识别的抗原或表位的靶细胞接触来评估重组受体依赖性细胞溶解活性。可以通过直接或间接测量随时间的靶细胞数量来测量细胞溶解活性。例如，可以在与重组受体表达细胞孵育之前将靶细胞与可检测标记(可检测的然后靶细胞被裂解的这样的标记、或在存活靶细胞中是可检测的可检测标记)一起孵育。这些读数提供直接或间接的靶细胞数量和/或靶细胞死亡，并且可以在测定期间的不同时间点进行测量。靶细胞数量的减少和/或靶细胞死亡的增加指示细胞的细胞溶解活性。用于进行细胞溶解测定的合适的方法在本领域中是已知的，并且包括但不限于铬-51释放测定、非放射性铬测定、使用荧光染料(如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、PKH-2和PKH-26)的流式细胞术测定。在一些情况下，细胞溶解活性在本文中也称为细胞裂解。
在某些实施方案中，重组受体(例如CAR)依赖性细胞溶解活性是通过将含有表达重组受体的细胞的细胞组合物与表达由重组受体结合或识别的抗原或其表位的靶细胞一起孵育来测量的。在某些实施方案中，所述重组受体是CAR。
在一些实施方案中，将活性的测量值与对照进行比较。在某些实施方案中，对照是未与细胞组合物一起孵育的靶细胞的培养物。在一些实施方案中，对照是来自以相同比率与靶细胞一起孵育的不含有CAR+细胞的对照细胞组合物的测量值。
在某些实施方案中，细胞溶解活性测定的测量值是在孵育期间或结束时的时间点存活的靶细胞的数量。在某些实施方案中，测量值是在孵育期间释放的靶细胞死亡标记(例如铬-51)的量。在一些实施方案中，测量值是通过从单独孵育的对照的靶细胞的量减去在给定时间点在共孵育中的靶细胞的量确定的靶细胞死亡的量。在一些实施方案中，测量值是与靶细胞的起始量相比在一定时间点保持的靶细胞的百分比。在特定实施方案中，测量值是在一定时间量内被杀伤的细胞的量。在某些实施方案中，测量值是每个在细胞组合物中的细胞的被杀伤的细胞的量。在一些实施方案中，测量值是每个细胞的被杀伤的细胞的量，或每设定或参考数量的细胞的被杀伤的细胞的量，例如但不限于组合物的每100个细胞、每103个细胞、每104个细胞、每105个细胞、每106个细胞、每107个细胞、每108个细胞、每109个细胞、或每1010个细胞的被杀伤的靶细胞的量。在特定实施方案中，测量值是细胞组合物中每个CAR+细胞、CAR+/CD8+细胞或膜联蛋白-/CAR+/CD8+细胞或其参考或设定数量的被杀伤的细胞的量。在某些实施方案中，测量值是在一定时间量内每个在细胞组合物中的细胞的被杀伤的细胞的量。在特定实施方案中，测量值是在一定时间量内每个在细胞组合物中的CAR+细胞、CAR+/CD8+细胞或膜联蛋白-/CAR+/CD8+细胞的被杀伤的细胞的量。
在一些实施方案中，细胞表型包括评估转基因序列(如编码重组受体例如CAR的转基因序列)的基因组整合。在一些实施方案中，细胞表型是整合的拷贝数，例如载体拷贝数，其是整合至细胞的染色体DNA或基因组DNA中的转基因序列的拷贝数。在一些实施方案中，载体拷贝数可以表示为平均或均值拷贝数。在一些方面，特定整合转基因的载体拷贝数包括每个细胞中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些实施方案中，特定整合转基因的载体拷贝数包括每个二倍体基因组中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些方面，转基因序列的载体拷贝数表示为每个细胞中的整合转基因序列的数量。在一些方面，转基因序列的载体拷贝数表示为每个二倍体基因组中的整合转基因序列的数量。在一些实施方案中，所述拷贝数是所述细胞群中的每个二倍体基因组或每个细胞中的平均或均值拷贝数。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征是治疗性细胞组合物的细胞的克隆性。在一些实施方案中，评估T细胞群的克隆性是对T细胞群的克隆多样性的评估。在一些实施方案中，T细胞是多克隆的(polyclonal或multiclonal)。T细胞的所述治疗性细胞组合物的克隆性(如多克隆性)是群体对给定抗原的反应宽度的量度。在一些方面，可以通过测量抗原特异性细胞识别的不同表位的数量来评估治疗性细胞组合物。这可以使用用于在体外产生和克隆抗原特异性T细胞的标准技术来进行。在一些实施方案中，T细胞是多克隆的(polyclonal或multiclonal)，其中在幼稚样T细胞群中没有单一的克隆型群体占优势。
在一些方面，在T细胞群的(如治疗性细胞组合物的)情境下，多克隆性的标识是指T细胞群具有多重且广泛的抗原特异性。在一些实施方案中，多克隆性涉及在TCR库中展现出高度多样性的T细胞群。在一些情况下，TCR库的多样性是由于V(D)J重组事件，其在一些方面是由对自身和外来抗原的选择事件触发的。在一些实施方案中，多样化或多克隆的T细胞群是这样的T细胞群，其中分析指示群体中存在多种变化的或不同的TCR转录物或产物。在一些实施方案中，展现出高或相对高克隆性的T细胞群是TCR库的多样性较少的T细胞群。在一些实施方案中，如果分析指示在T细胞群中存在几种(如两种或三种)TCR转录物或产物，则T细胞是寡克隆的。在一些实施方案中，单克隆性是指T细胞群具有低多样性。在一些实施方案中，如果分析指示在T细胞群中存在单一TCR转录物或产物，则T细胞是单克隆的。
在一些例子中，治疗性细胞组合物中的细胞(如T细胞)的克隆性是通过克隆测序(如下一代测序)或者谱型分析来确定的。在一些方面，可以采用下一代测序方法，使用来自T细胞的基因组DNA或cDNA评估TCR库，包括编码互补决定区3(CDR3)的序列。在一些实施方案中，可以采用通过RNA-seq进行的全转录组测序。在一些实施方案中，可以使用单细胞测序方法。
在一些实施方案中，可以通过谱型分析(TCR Vβ、Vα、Vγ或Vδ链高变区库的量度)来评估或确定克隆性(如多克隆性)。谱型分析辨别具有特定大小而不是序列的重排可变基因。因此，应理解，单个峰可以代表表达有限数量的重排TCR可变基因(Vβ、Vα、Vγ或Vδ)中的任何一个的T细胞群，所述重排TCR可变基因在连接区包含4种潜在的核苷酸(腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t))中的任何一种或这4种核苷酸的组合。当给定TCR Vβ、Vα、Vγ或Vδ家族的Vβ谱型谱具有多个峰(通常为5个或更多个主峰)并且在大多数情况下呈高斯分布时，则认为T细胞群是多克隆的。多克隆性还可以通过针对目标抗原的抗原特异性克隆的产生和表征来定义。在如治疗性细胞组合物的T细胞的群体的情境下，单克隆性是指T细胞群具有如通过谱型分析(TCR Vβ、Vα、Vγ或Vδ链高变区库的量度)所定义的单一特异性。当给定TCR Vβ、Vα、Vγ和/或Vδ家族的Vβ、Vα、Vγ和/或Vδ谱型谱具有单个主峰时，则认为T细胞群是单克隆的(或单特异性的)。
在一些实施方案中，用于评估克隆性的方法可以包括如国际公开号WO 2012/048341、WO 2014/144495、WO 2017/053902、WO 2016044227、WO 2016176322和WO2012048340中描述的方法的各种特征，将每一个通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，此类方法可以用于获得有关细胞内目标靶多核苷酸(如TCR)的序列信息。靶基因可以从来自细胞样品或细胞群的细胞的基因组DNA或mRNA获得。细胞样品或细胞群可以包括免疫细胞。例如，对于靶TCR分子，可以从免疫细胞或T细胞的基因组DNA或mRNA获得编码TCR链的基因。在一些实施方案中，起始材料是来自T细胞的RNA，其由编码TCR链的基因构成。
在一些实施方案中，将香农指数应用于克隆性以作为过滤克隆的阈值(“香农调整的克隆性”)，参见Chaara等人(2018)Front Immunol 9:1038。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征是治疗性细胞组合物的CD4+细胞的克隆性。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征是治疗性细胞组合物的CD8+细胞的克隆性。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征是剂量。在一些实施方案中，所述剂量是CD4+和CD8+工程化细胞的单一剂量。在一些实施方案中，所述单一剂量包括单独向受试者施用CD4+工程化细胞和CD8+工程化细胞。在一些实施方案中，单一剂量包括单独向受试者施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，单一剂量包括单独向受试者施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，单一剂量包括单独向受试者施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括本文所述的任何一种或多种或所有治疗性细胞组合物特征，包括表型和重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-、CAS3-/CCR7-/CD27+、CAS3-/CCR7+、CAS3-/CCR7+/CD27-、CAS3-/CCR7+/CD27+、CAS3-/CD27+、CAS3-/CD28+、CAS3-/CD28+/CD27-、CAS3-/CD28+/CD27+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-、CAS3-/CCR7-/CD45RA+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-、CAS3-/CCR7+/CD45RA+、CAS+/CD3+/CAR+、CD3+/CAR+、CD3+、CAR+、克隆性、EGFRt+、细胞因子-、IFNG+、IFNg+/IL2、IFNg+/IL17+/TNFa+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+、IFNg+/IL2+/TNFa+、CAR+/IFNg+、IFNg+/TNFa+、CAR+/IL2+、IL2+/TNFa+、细胞裂解、CAR+/TNFa+、活细胞浓度、载体拷贝数(VCN)、EGFRt+载体拷贝数、活力、GMCSF+/CD19+、IFNG+/CD19+、IL10+/CD19+、IL13+/CD19+、IL2+/CD19+、IL4+/CD19+、IL5+/CD19+、IL6+/CD19+、MIP1A+/CD19+、MIP1B+/CD19+、sCD137+/CD19+、TNFa+/CD19+、剂量、剂量水平、给予的活细胞百分比、给予的总非活细胞、给予的总活细胞、总剂量。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+、CAS3-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+、CAS+/CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CD4+、CAR+/CD4+、CD4+细胞的克隆性、EGFRt+/CD4+、细胞因子-/CD4+、IFNG+/CD4+、IFNg+/IL2/CD4+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+、CAR+/IFNg+/CD4+、IFNg+/TNFa+/CD4+、CAR+/IL2+/CD4+、IL2+/TNFa+/CD4+、通过CD4+得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD4+、CD4+细胞的活细胞浓度、CD4+的载体拷贝数、CD4+细胞的EGFRt+载体拷贝数、CD4+细胞的活力、GMCSF+/CD19+/CD4+、IFNG+/CD19+/CD4+、IL10+/CD19+/CD4+、IL13+/CD19+/CD4+、IL2+/CD19+/CD4+、IL4+/CD19+/CD4+、IL5+/CD19+/CD4+、IL6+/CD19+/CD4+、MIP1A+/CD19+/CD4+、MIP1B+/CD19+/CD4+、sCD137+/CD19+/CD4+、TNFa+/CD19+/CD4+、CD4+细胞的剂量、CD4+细胞的剂量水平、给予的CD4+细胞的活细胞百分比、给予的CD4+细胞的总非活细胞、给予的CD4+细胞的总活细胞、CD4+细胞的总剂量。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+、CAS3-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+、CAS+/CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CD8+、CAR+/CD8+、CD8+的克隆性、EGFRt+/CD8+、细胞因子-/CD8+、IFNG+/CD8+、IFNg+/IL2/CD8+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+、CAR+/IFNg+/CD8+、IFNg+/TNFa+/CD8+、CAR+/IL2+/CD8+、IL2+/TNFa+/CD8+、通过CD8+细胞得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD8+、CD8+细胞的活细胞浓度、CD8+细胞的载体拷贝数、CD8+细胞的EGFRt+载体拷贝数、CD8+细胞的活力、GMCSF+/CD19+/CD8+、IFNG+/CD19+/CD8+、IL10+/CD19+/CD8+、IL13+/CD19+/CD8+、IL2+/CD19+/CD8+、IL4+/CD19+/CD8+、IL5+/CD19+/CD8+、IL6+/CD19+/CD8+、MIP1A+/CD19+/CD8+、MIP1B+/CD19+/CD8+、sCD137+/CD19+/CD8+、TNFa+/CD19+/CD8+、CD8+细胞的剂量、CD8+的剂量水平、给予的CD8+细胞的活细胞百分比、给予的CD8+细胞的总非活细胞、给予的CD8+细胞的总活细胞、CD8+细胞的总剂量。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-、CAS3-/CCR7-/CD27+、CAS3-/CCR7+、CAS3-/CCR7+/CD27-、CAS3-/CCR7+/CD27+、CAS3-/CD27+、CAS3-/CD28+、CAS3-/CD28+/CD27-、CAS3-/CD28+/CD27+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-、CAS3-/CCR7-/CD45RA+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-、CAS3-/CCR7+/CD45RA+、CAS+/CD3+/CAR+、CD3+/CAR+、CD3+、CAR+、克隆性、EGFRt+、细胞因子-、IFNG+、IFNg+/IL2、IFNg+/IL17+/TNFa+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+、IFNg+/IL2+/TNFa+、CAR+/IFNg+、IFNg+/TNFa+、CAR+/IL2+、IL2+/TNFa+、细胞裂解、CAR+/TNFa+、活细胞浓度、载体拷贝数、EGFRt+载体拷贝数、活力、GMCSF+/、IFNG+/、IL10+/、IL13+/、IL2+/、IL4+/、IL5+/、IL6+/、MIP1A+/、MIP1B+/、sCD137+/、TNFa+/、剂量、剂量水平、给予的活细胞百分比、给予的总非活细胞、给予的总活细胞、总剂量。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+、CAS3-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+、CAS+/CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CD4+、CAR+/CD4+、CD4+细胞的克隆性、EGFRt+/CD4+、细胞因子-/CD4+、IFNG+/CD4+、IFNg+/IL2/CD4+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+、CAR+/IFNg+/CD4+、IFNg+/TNFa+/CD4+、CAR+/IL2+/CD4+、IL2+/TNFa+/CD4+、通过CD4+得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD4+、CD4+细胞的活细胞浓度、CD4+细胞的载体拷贝数、CD4+的EGFRt+载体拷贝数、CD4+的活力、GMCSF+/CD4+、IFNG+/CD4+、IL10+/CD4+、IL13+/CD4+、IL2+/CD4+、IL4+/CD4+、IL5+/CD4+、IL6+/CD4+、MIP1A+/CD4+、MIP1B+/CD4+、sCD137+/CD4+、TNFa+/CD4+、CD4+细胞的剂量、CD4+细胞的剂量水平、给予的CD4+细胞的活细胞百分比、给予的CD4+细胞的总非活细胞、给予的CD4+细胞的总活细胞、和CD4+细胞的总剂量。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+、CAS3-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+、CAS+/CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CD8+、CAR+/CD8+、CD8+细胞的克隆性、EGFRt+/CD8+、细胞因子-/CD8+、IFNG+/CD8+、IFNg+/IL2/CD8+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+、CAR+/IFNg+/CD8+、IFNg+/TNFa+/CD8+、CAR+/IL2+/CD8+、IL2+/TNFa+/CD8+、通过CD8+得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD8+、CD8+细胞的活细胞浓度、CD8+细胞的载体拷贝数、CD8+的EGFRt+载体拷贝数、CD8+的活力、GMCSF+/CD8+、IFNG+/CD8+、IL10+/CD8+、IL13+/CD8+、IL2+/CD8+、IL4+/CD8+、IL5+/CD8+、IL6+/CD8+、MIP1A+/CD8+、MIP1B+/CD8+、sCD137+/CD8+、TNFa+/CD8+、CD8+细胞的剂量、CD8+细胞的剂量水平、给予的CD8+细胞的活细胞百分比、给予的CD8+细胞的总非活细胞、给予的CD8+细胞的总活细胞、和CD8+细胞的总剂量。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+、CAS3-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+、CAS+/CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CD8+、CAR+/CD8+、CD8+细胞的克隆性、EGFRt+/CD8+、细胞因子-/CD8+、IFNG+/CD8+、IFNg+/IL2/CD8+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+、CAR+/IFNg+/CD8+、IFNg+/TNFa+/CD8+、CAR+/IL2+/CD8+、IL2+/TNFa+/CD8+、通过CD8+得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD8+、CD8+细胞的活细胞浓度、CD8+细胞的载体拷贝数、CD8+的EGFRt+载体拷贝数、CD8+的活力、GMCSF+/CD8+、IFNG+/CD8+、IL10+/CD8+、IL13+/CD8+、IL2+/CD8+、IL4+/CD8+、IL5+/CD8+、IL6+/CD8+、MIP1A+/CD8+、MIP1B+/CD8+、sCD137+/CD8+、TNFa+/CD8+、CD8+细胞的剂量、CD8+细胞的剂量水平、给予的CD8+细胞的活细胞百分比、给予的CD8+细胞的总非活细胞、给予的CD8+细胞的总活细胞、CD8+细胞的总剂量、CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+、CAS3-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+、CAS+/CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CD4+、CAR+/CD4+、CD4+细胞的克隆性、EGFRt+/CD4+、细胞因子-/CD4+、IFNG+/CD4+、IFNg+/IL2/CD4+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+、CAR+/IFNg+/CD4+、IFNg+/TNFa+/CD4+、CAR+/IL2+/CD4+、IL2+/TNFa+/CD4+、通过CD4+得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD4+、CD4+细胞的活细胞浓度、CD4+细胞的载体拷贝数、CD4+的EGFRt+载体拷贝数、CD4+的活力、GMCSF+/CD4+、IFNG+/CD4+、IL10+/CD4+、IL13+/CD4+、IL2+/CD4+、IL4+/CD4+、IL5+/CD4+、IL6+/CD4+、MIP1A+/CD4+、MIP1B+/CD4+、sCD137+/CD4+、TNFa+/CD4+、CD4+细胞的剂量、CD4+细胞的剂量水平、给予的CD4+细胞的活细胞百分比、给予的CD4+细胞的总非活细胞、给予的CD4+细胞的总活细胞、和CD4+细胞的总剂量。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征包括下文表E4中所示的治疗性细胞组合物特征中的任何一种或多种。在任何上述实施方案的一些中，确定、测量、获得、检测、观察和/或鉴定具有上述表型的细胞的百分比、数量和/或比例。在某些实施方案中，具有所述表型的细胞的数量是细胞组合物中具有所述表型的细胞的总量。在一些实施方案中，具有所述表型的细胞的数量可以表示为在治疗性细胞组合物中存在的具有所述表型的细胞的频率、比率和/或百分比。.在一些实施方案中，治疗性细胞组合物特征是具有本文所述的表型或重组受体依赖性活性的细胞的频率、比率和/或百分比。
4.临床反应
本文提供的方法可用于确定与用治疗性细胞组合物治疗之后受试者中的临床反应相关的特征，如本文所述的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。本文考虑了各种类型的临床反应，包括但不限于完全反应(CR)、部分反应(PR)、总体反应率(ORR)、客观反应(OR)、无进展存活期(PFS)、持久反应(例如，反应的持久性DOR)、毒性反应和/或药代动力学反应。
在一些实施方案中，临床反应是完全反应(CR)。如本文所用，CR是指响应于对疾病或病症的治疗，受试者中的疾病或病症的所有病征消失。因此，在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出CR。
在一些实施方案中，临床反应是如使用卢加诺标准描述的完全反应(CR)，其涉及在不同可测量部位的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残余肿块。
在一些实施方案中，临床反应是部分反应(PR)。如本文所用，PR是指响应于对疾病或病症的治疗，受试者中的疾病或病症的程度降低。因此，在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出PR。
在一些方面，临床反应是使用卢加诺标准描述的部分反应(PR；在一些情况下也称为部分缓解)，并且涉及在不同可测量部位的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残余肿块。
在一些实施方案中，临床反应是无进展存活期(PFS)。如本文所用，PFS是指在治疗疾病或病症期间和之后患者伴随疾病而生活但疾病或病症不会恶化的时间长度。因此，在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后的PFS。在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出一定持续时间的PFS。在一些实施方案中，所述特定持续时间是、是约、大于或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月。在一些实施方案中，所述特定持续时间大于3个月。
在一些实施方案中，临床反应是客观反应(OR)。在一些实施方案中，OR是通过部分反应率和完全反应率二值化的最佳客观反应。因此，在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出OR。
在一些实施方案中，临床反应是无进展存活期(PFS)，其被描述为治疗疾病(如癌症)期间和之后受试者伴随疾病存活但疾病不恶化的时间长度。在一些实施方案中，临床反应是客观反应(OR)。在一些实施方案中，OR是通过部分反应率和完全反应率二值化的最佳客观反应。在一些实施方案中，临床反应是客观反应率(ORR；在一些情况下也称为总体反应率)，其被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，临床反应是总存活期(OS)，其被描述为从诊断日期或疾病(如癌症)治疗开始日期起，被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活的时间长度。在一些实施方案中，临床反应是无事件存活期(EFS)，其被描述为在癌症治疗结束后，受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括癌症的复发或某些症状的发作，如已经扩散到骨骼的癌症引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，临床反应是反应持续时间(DOR)的量度。如本文所用，DOR是指从记录对治疗的反应到疾病进展的时间量。因此，在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后的DOR。在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出持久反应。在一些实施方案中，所述持久反应是、是约、大于或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的DOR。在一些实施方案中，持久反应是大于3个月的DOR。
在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出一定持续时间的DOR。在一些实施方案中，所述特定持续时间是、是约、大于或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月。在一些实施方案中，所述特定持续时间大于3个月。
在一些实施方案中，临床反应是反应持续时间(DOR)的量度，其包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，临床反应可以包括持久反应，例如，在从开始疗法起的一个时间段之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在开始疗法后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应可持续大于3个月或大于6个月。
在一些方面，临床反应基于RECIST标准，所述标准用于确定客观肿瘤反应；在一些方面，在实体瘤中确定。(Eisenhauer等人,European Journal of Cancer 45(2009)228-247。)在一些实施方案中，使用RECIST标准确定对于靶病灶的客观肿瘤反应。在一些方面，使用RECIST标准确定的完全反应被描述为所有靶病灶的消失，并且任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)必须在短轴上减少至<10mm。在其他方面，使用RECIST标准确定的部分反应被描述为以基线总和直径为参考，靶病灶的直径总和减少至少30％。在其他方面，疾病进展(PD)被描述为以研究中的最小总和(如果基线总和在研究中最小，则这个最小总和包括基线总和)作为参考，靶病灶直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加外，所述总和还必须显示至少5mm的绝对增加(在一些方面，出现一个或多个新病灶也被视为进展)。在其他方面，疾病稳定(SD)被描述为以研究时的最小总直径作为参考，既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。
在一些实施方案中，临床反应包括所施用细胞的药代动力学。例如，确定过继转移细胞的药代动力学以评估所施用细胞的利用度，例如生物利用度。用于确定过继转移细胞的药代动力学的方法可以包括从已经被施用工程化细胞的受试者中抽取外周血，并确定所述外周血中所述工程化细胞的数量或比率。用于选择和/或分离细胞的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)，直接引入CAR中的特定位点中的表位标签如Strep-标签序列，借此使用Strep-标签的结合试剂直接评估CAR(Liu等人(2016)Nature Biotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO2015095895)以及与CAR多肽特异性地结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO2014190273)。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞疗法结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下也促进细胞自杀。在一些情况下，截短的表皮生长因子受体(EGFRt)可以与所转导细胞中目的转基因(CAR或TCR)共表达(参见例如，美国专利号8,802,374)。EGFRt可以含有抗体西妥昔单抗
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已用EGFRt构建体和另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。
在一些实施方案中，临床反应是药代动力学反应。在一些实施方案中，药代动力学反应是在施用细胞疗法之后一段时间确定的从受试者获得的样品(例如血液)中的CAR+ T细胞的数量。在一些实施方案中，临床反应是在从先前用治疗性细胞组合物治疗的受试者获得的样品(例如血液)中鉴定出的CAR+ T细胞的最大浓度。在一些实施方案中，药代动力学反应是通过从先前用治疗性细胞组合物治疗的受试者获得的样品(例如血液样品)中鉴定出的CAR+ T细胞的曲线下面积(AUC)确定的暴露。在一些实施方案中，药代动力学反应是CAR+ T细胞扩增。在一些实施方案中，药代动力学反应是CAR+ T细胞持久性。在一些实施方案中，药代动力学反应是CAR+ T细胞耗竭。在一些实施方案中，药代动力学反应是目标药代动力学反应。例如，目标药代动力学反应可以是在施用细胞疗法之后一段时间从受试者获得的血液样品中最大CAR+ T细胞(Cmax)的目标量度，通过AUC确定的暴露的目标量度，和/或达到CAR+ T细胞峰浓度的目标时间(Tmax)。在一些实施方案中，测定在从施用治疗性细胞组合物的时间起0至28天的时间段内的AUC(例如，AUC0-28)。在一些实施方案中，本文提供的方法可确定用本文提供的治疗性细胞组合物治疗的受试者是否将实现目标药代动力学反应。
在一些实施方案中，临床反应是毒性反应。在一些实施方案中，临床反应是细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)。CRS，例如sCRS。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者施用其他生物制品后可发生CRS或sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509-1518(2013)；和Kochenderfer等人,Blood 119,2709-2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。
通常，CRS由例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的过度的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症应答和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。重度的危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他重度的危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。在一些方面，发热、特别是高热(≥38.5℃或≥101.3°F)与CRS或其风险相关。在一些情况下，CRS的特征或症状类似于感染。在一些实施方案中，在呈现CRS症状的受试者中也考虑感染，并且可以施用通过培养的监测和经验性抗生素疗法。与CRS相关的其他症状可以包括心功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、肾和/或肝衰竭、凝血障碍、弥散性血管内凝血和毛细血管渗漏综合征。
在一些实施方案中，临床反应是CRS的分级。在一些实施方案中，临床反应是重度CRS。在一些实施方案中，临床反应是重度CRS的不存在(例如中度或轻度CRS)。下文的表1和表2示出了反映CRS分级的标准。
在一些实施方案中，临床反应是神经毒性或与神经毒性相关。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识错乱、谵妄、失语、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫发作(任选地如通过脑电图(EEG)证实)、升高的β淀粉样蛋白(Aβ)水平、升高的谷氨酸水平和升高的氧自由基水平。在一些实施方案中，例如使用1-5级量表基于严重程度对神经毒性进行分级(参见例如，Guido Cavaletti&Paola Marmiroli Nature Reviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。
在一些实施方案中，临床反应是轻度或中度神经毒性，例如，如下文表3所示的1级或2级。在一些实施方案中，临床反应是重度神经毒性，其包括3级或更高分级神经毒性，如表3所示。
因此，在一些实施方案中，所提供的方法可用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出毒性反应。在一些实施方案中，毒性反应是CRS(例如，1级或更高分级的CRS)。在一些实施方案中，毒性反应是轻度CRS(例如，2级或更低分级的CRS)。在一些实施方案中，毒性反应是重度CRS(例如，3级或更高分级的CRS)。
在一些实施方案中，毒性反应是神经毒性(例如，1级或更高分级的神经毒性)。在一些实施方案中，毒性反应是轻度神经毒性(例如，2级或更低分级的神经毒性)。在一些实施方案中，毒性反应是重度神经毒性(例如，3级或更高分级的神经毒性)。
在一些实施方案中，临床反应是以下中的一种或多种或全部：log10CD3+细胞的AUC，log10CD3+细胞的最大浓度(Cmax)，CD3+细胞的峰浓度时间(Tmax)，log10CD4+细胞的AUC，log10CD4+细胞的最大浓度(Cmax)，CD4+细胞的峰浓度时间(Tmax)，log10CD8+细胞的AUC，log10CD8+细胞的最大浓度(Cmax)，CD8+细胞的峰浓度时间(Tmax)，总体log10AUC，总体log10最大浓度(Cmax)，总体细胞峰浓度的时间(Tmax)，客观反应，完全反应，无进展存活期，反应持久性，3级或更高分级的神经毒性，任何神经毒性反应，3级或更高分级的细胞因子释放综合征，以及任何细胞因子释放综合征。在一些实施方案中，通过流式细胞术和/或聚合酶链式反应确定Cmax、Tmax和AUC。在一些实施方案中，从施用治疗性细胞组合物起0-28天确定AUC。在一些情况下，例如当根据随机存活森林模型确定时，无进展存活期和反应持久性包括时间量度，例如，到事件的时间(PFS或DOR)。
B.监督机器学习方法
设想到，在一些情况下，受试者对用治疗性细胞组合物(例如，工程化T细胞组合物)治疗的临床反应可以取决于许多因素，包括但不限于待治疗的受试者的特征、施用于受试者的治疗性细胞组合物的特征、以及产生治疗性细胞组合物的输入组合物的特征(参见例如第I.A节)。因此，在一些实施方案中，为了鉴定与受试者临床反应相关的特征，所述特征可以用作能够鉴定用于确定临床反应的重要性特征的机器学习模型的输入。
关于鉴定与临床反应相关的特征，在一些实施方案中，机器学习模型可用于在治疗受试者之前确定受试者在用治疗性细胞组合物治疗之后的临床反应，其中临床结局的确定基于受试者特征、治疗性细胞特征、和输入组合物特征。如下文第I.B.4节中所述，在施用细胞组合物之前确定受试者对用治疗性细胞组合物治疗的临床反应可以告知治疗受试者的策略。例如，如果确定(例如，预测)受试者具有阴性临床反应(例如，毒性反应)，则可以改变治疗方案(例如，预定治疗方案)，以导致阳性临床反应(例如，完全反应、持久反应、不存在毒性反应)。
设想用于根据本文所述的方法使用的机器学习模型包括透明模型。例如，可以询问或查询机器学习模型以确定模型如何做出特定的确定(例如，预测)。在一些实施方案中，机器学习模型是随机森林模型。在一些实施方案中，机器学习模型是随机存活森林模型。使用随机森林和随机存活森林模型的优势包括能够询问或查询模型以鉴定模型如何用于(例如模型使用哪些特征)确定受试者对细胞疗法(例如，治疗性细胞组合物)的临床反应。在一些实施方案中，用于确定临床反应的特征被认为是与临床反应相关的特征。在一些实施方案中，鉴定用于确定受试者的临床反应的特征包括评估特征重要性，例如如本文所述。
1.随机森林
在一些实施方案中，用于鉴定与临床反应相关的特征的机器学习模型是随机森林模型。在一些实施方案中，随机森林模型还用于确定用治疗性细胞组合物治疗的受试者的临床反应。随机森林是集成学习方法的一个例子。随机森林可以包括多个决策树，对所述多个决策树应用一个或多个输入，例如特征，如受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征，以生成一个或多个相应的输出，例如分类，例如临床反应。在一些实施方案中，随机森林是分类器。在一些实施方案中，随机森林执行回归。
在一些实施方案中，随机森林模型中的决策树接受受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征作为输入，并且生成临床反应的分类作为输出。(优选地，单独的决策树是充分不相关的，使得应用到所述多个决策树的共同输入将导致输出的多样性。)在一些实施方案中，受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征被应用于所述多个单独决策树，并且对应的输出被调和以生成随机森林模型的输出。例如，在一些实施方案中，随机森林的输出可以对应于大多数单独决策树所得到的分类输出。
训练随机森林的各种方法对于本领域技术人员来说是熟知的并且在本公开文本的范围内。例如，在一些实施方案中，可以通过将随机采样的输入数据(例如，受试者特征、治疗性细胞组合物特征、和输入组合物特征)应用到随机森林的单独决策树来在数据集上训练随机森林模型，所述数据集包括受试者特征、治疗性细胞组合物特征、和输入组合物特征。这种训练方法促进了单独决策树之间的多样性，从而可以提高随机森林的准确性。本领域技术人员将理解，可以酌情使用许多合适的随机森林配置；本公开文本不限于任何类型或配置的随机森林、其组成决策树、任何训练决策树的方法或任何训练上述任一项的方法。
在一些实施方案中，使用监督学习来训练随机森林模型，以基于受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征来确定(例如，分类或预测)临床反应。在一些情况下，可以在包括受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征和相应临床反应的数据集合上训练随机森林模型，并且在未用于训练模型的不同数据集合上测试模型的准确性，所述不同数据集合包括其中临床反应是已知的情况下的受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征。
在一些实施方案中，例如，当用于训练和测试模型的数据集在大小上受到限制时，例如如下所述，可以使用自举聚合来训练模型。在一些实施方案中，例如，当用于训练和测试模型的数据集在大小上受到限制时，例如如下所述，可以使用交叉验证来评价模型。在一些实施方案中，使用交叉验证来评价随机森林模型。在一些实施方案中，使用k折交叉验证来评价随机森林模型。在一些实施方案中，使用10折交叉验证来评价随机森林模型。在一些实施方案中，使用嵌套交叉验证来评价随机森林模型。
在一些实施方案中，用于训练随机森林模型的数据集包括从或从约500、400、300、200、150、100、50、25、15或10名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机森林模型的数据集包括从或从约100至500、100至400、100至300、100至200或100至150名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机森林模型的数据集包括从、从约或从少于500、400、300、200、150、100名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机森林模型的数据集包括从、从约或从少于300、200、150、100名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机森林模型的数据集包括从、从约或从少于200名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机森林模型的数据集包括从、从约或从少于150名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机森林模型的数据集包括从、从约或从少于100名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于评价模型的数据集是从、从约或从少于本段中描述的任何数量的受试者获得的。在一些实施方案中，受试者是参与临床试验的受试者。
a.特征重要性
在一些实施方案中，可以查询本文所述的随机森林模型(例如，经训练、测试、评价的随机森林模型)以鉴定与临床反应相关的特征。在一些实施方案中，鉴定与临床反应相关的特征包括确定用于模型中的特征中的每一种的重要性量度。可以使用各种技术来评估重要性量度，所述技术包括但不限于：置换重要性量度，其中对单独特征(例如，一次一种特征)的值进行置换并计算预测准确性的降低；通过在单独特征上分裂来确定节点杂质的基尼系数的平均减少；确定平均最小深度(例如，特征用于分割时的平均深度)；确定在特征上的分裂发生时的树的总数量；确定使用特征进行分裂的节点的总数量；确定其中使用特征使根节点分裂时的树的总数量；以及确定单侧二项式检验的p值。在一些实施方案中，重要性量度是或包括前述重要性量度中的任一种。在一些实施方案中，重要性量度是置换重要性量度。在一些实施方案中，重要性量度是平均最小深度。在一些实施方案中，重要性量度是其中特征使根节点分裂时的树的总数量。
在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度的幅值鉴定的特征。在一些实施方案中，特征可以通过重要性量度值(例如，幅值)进行等级排序。例如，在一些情况下，特征可以按从最大到最小重要性量度值进行等级排序，其中评估的重要性量度对于每种特征是相同的(例如，置换重要性量度、平均最小深度、特征使根节点分裂时的树的数量)。在一些实施方案中，通过按重要性量度值对特征进行等级排序来鉴定与临床反应相关的特征，其中评估的重要性量度对于每种特征是相同的(例如，置换重要性量度、平均最小深度、特征使根节点分裂时的树的数量)。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过等级排序所鉴定的前10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种特征。在一些实施方案中，通过等级排序所鉴定的前10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种特征包括具有最大重要性量度的特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度的等级排序所鉴定的前10种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的前5种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的前3种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的前2种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的首个特征。
在一些实施方案中，可以使用超过一种重要性量度或重要性量度的组合来鉴定与临床结局相关的特征。在一些实施方案中，重要性量度的组合是或包括置换重要性量度、平均最小深度、特征使根节点分裂时的树的数量以及p值或其任何组合。在一些实施方案中，重要性量度的组合是或包括置换重要性量度、平均最小深度、以及特征使根节点分裂时的树的数量。
b.预测临床结局
本文所述的随机森林模型还可用于在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前确定受试者对用治疗性细胞组合物治疗的临床反应。在一些实施方案中，评估所确定的受试者的临床反应可用于告知受试者的治疗。例如，如果确定(例如，预测)受试者具有阴性临床反应，例如毒性、与目标反应相比差的或降低的药代动力学、缺乏CR、PR或DOR，则可以对预定治疗方案进行改变，例如如下文第I.B.4节所述。在另一方面，如果确定(例如，预测)受试者具有阳性临床反应，例如CR、PR、DOR、反映或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应、无毒性或轻度毒性，则可以施用预定治疗方案。
在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出CR。
在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出PR。
在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出OR。
在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后的DOR。在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出持久反应，例如大于三个月的DOR。
在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后的PFS。在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出一定持续时间的PFS，例如大于三个月的PFS。
在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后的药代动力学反应。在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出超过目标药代动力学反应的药代动力学反应。在一些实施方案中，药代动力学反应是在施用治疗方案之后一段时间从受试者获得的血液样品中的最大CAR+ T细胞浓度(Cmax)的量度。在一些实施方案中，药代动力学反应是向CAR+ T细胞的暴露的量度，例如在施用治疗方案之后经或经约28天的暴露和/或如通过在施用治疗方案之后的CAR+ T细胞浓度-时间曲线的AUC所确定的。在一些实施方案中，药代动力学反应是达到CAR+ T细胞的峰浓度的时间(Tmax)。
在一些实施方案中，经训练的随机森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出毒性反应。在一些实施方案中，毒性反应是CRS。在一些实施方案中，毒性反应是重度CRS，例如3级或更高分级的CRS。在一些实施方案中是神经毒性。在一些实施方案中，毒性反应是重度神经毒性，例如3级或更高分级的神经毒性。
2.随机存活森林
在一些实施方案中，用于鉴定与临床反应相关的特征并确定用治疗性细胞组合物治疗的受试者的临床反应的机器学习模型是随机存活森林模型。随机存活森林是可用于分析右删失存活数据的集成学习方法的例子。与上述随机森林一样，随机存活森林可以包括多个决策树，将每个决策树应用到一个或多个输入(例如特征)以生成一个或多个相应输出(例如分类)。随机存活森林模型的生成通常遵循随机森林的生成，然而，随机存活森林模型包括时间和删失指示符，其中删失指示符表示在给定时间点t事件的存在(例如，1)或不存在(例如，0)。因此，用于使随机存活森林的树生长的分裂规则解释了删失特征。本文提供的随机存活森林模型是基于临床反应随时间的发生而生成的。
在一些实施方案中，基于受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征，使用监督学习以估计临床反应函数和累积危险函数(例如，对于给定的临床反应)来训练随机存活森林模型。在一些情况下，可以在包括受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征和相应临床反应的数据集合上训练随机存活森林模型，并且在未用于训练模型的不同数据集合上测试模型的准确性，所述不同数据集合包括其中临床反应是已知的情况下的受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征。
在一些实施方案中，例如，当用于训练和测试模型的数据集在大小上受到限制时，例如如下所述，可以使用交叉验证来评价模型。在一些实施方案中，使用交叉验证来评价随机存活森林模型。在一些实施方案中，使用k折交叉验证来评价随机存活森林模型。在一些实施方案中，使用10折交叉验证来评价随机存活森林模型。在一些实施方案中，使用嵌套交叉验证来评价随机存活森林模型。
在一些实施方案中，用于训练随机存活森林模型的数据集包括从或从约500、400、300、200、150、100、50、25、15或10名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机存活森林模型的数据集包括从或从约100至500、100至400、100至300、100至200或100至150名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机存活森林模型的数据集包括从、从约或从少于500、400、300、200、150、100名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机存活森林模型的数据集包括从、从约或从少于300、200、150、100名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机存活森林模型的数据集包括从、从约或从少于200名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机存活森林模型的数据集包括从、从约或从少于150名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于训练随机存活森林模型的数据集包括从、从约或从少于100名受试者获得的特征(受试者特征、治疗性细胞组合物特征、输入组合物特征)。在一些实施方案中，用于评价模型的数据集是从、从约或从少于本段中描述的任何数量的受试者获得的。在一些实施方案中，受试者是参与临床试验的受试者。
a.特征重要性
在一些实施方案中，可以查询本文所述的随机存活森林模型(例如，经训练、测试、评价的随机存活森林模型)以鉴定与临床反应相关的特征。在一些实施方案中，鉴定与临床反应(例如，临床反应和累积危险函数)相关的特征包括确定用于模型中的特征中的每一种的重要性量度。与随机森林类似，可以使用各种技术来评估重要性量度，所述技术包括但不限于：置换重要性量度，其中对单独特征(例如，一次一种特征)的值进行置换并计算预测准确性的降低；通过在单独特征上分裂来确定节点杂质的基尼系数的平均减少；确定平均最小深度(例如，特征用于分割时的平均深度)；确定在特征上的分裂发生时的树的总数量；确定使用特征进行分裂的节点的总数量；确定其中使用特征使根节点分裂时的树的总数量；以及确定单侧二项式检验的p值。在一些实施方案中，例如当使用置换时，预测准确度的降低是关于一致性指数的。在一些实施方案中，重要性量度是或包括前述重要性量度中的任一种。在一些实施方案中，重要性量度是置换重要性量度。在一些实施方案中，重要性量度是平均最小深度。在一些实施方案中，重要性量度是其中特征使根节点分裂时的树的总数量。
在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度的幅值鉴定的特征。在一些实施方案中，特征可以通过重要性量度值(例如，幅值)进行等级排序。例如，在一些情况下，特征可以按从最大到最小重要性量度值进行等级排序，其中评估的重要性量度对于每种特征是相同的(例如，置换重要性量度、平均最小深度、特征使根节点分裂时的树的数量)。在一些实施方案中，通过按重要性量度值对特征进行等级排序来鉴定与临床反应相关的特征，其中评估的重要性量度对于每种特征是相同的(例如，置换重要性量度、平均最小深度、特征使根节点分裂时的树的数量)。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过等级排序所鉴定的前10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种特征。在一些实施方案中，通过等级排序所鉴定的前10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种特征包括具有最大重要性量度的特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度的等级排序所鉴定的前10种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的前5种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的前3种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的前2种特征。在一些实施方案中，与临床反应相关的特征是通过重要性量度值的等级排序所鉴定的首个特征。
在一些实施方案中，可以使用超过一种重要性量度或重要性量度的组合来鉴定与临床结局相关的特征。在一些实施方案中，重要性量度的组合是或包括置换重要性量度、平均最小深度、特征使根节点分裂时的树的数量以及p值或其任何组合。在一些实施方案中，重要性量度的组合是或包括置换重要性量度、平均最小深度、以及特征使根节点分裂时的树的数量。
b.预测临床结局
本文所述的随机存活森林模型还可用于在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前确定例如估计受试者对用治疗性细胞组合物治疗的临床反应。在一些实施方案中，评估所确定的受试者的临床反应可用于告知受试者的治疗。例如，如果确定(例如，预测)受试者具有阴性临床反应，例如毒性、与目标反应相比差的或降低的药代动力学、缺乏CR、PR或DOR，则可以对预定治疗方案进行改变，例如如下文第I.B.4节所述。在另一方面，如果确定(例如，预测)受试者具有阳性临床反应，例如CR、PR、DOR、反映或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应、无毒性或轻度毒性，则可以施用预定治疗方案。
在一些实施方案中，经训练的随机存活森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后的DOR。在一些实施方案中，经训练的随机存活森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出持久反应，例如大于三个月的DOR。
在一些实施方案中，经训练的随机存活森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后的PFS。在一些实施方案中，经训练的随机存活森林模型用于在治疗之前确定或预测有待用治疗方案(例如，包括治疗性细胞组合物(包括由包含从受试者选择的T细胞的输入组合物产生的治疗性细胞组合物)的预定治疗方案)治疗的受试者在用所述治疗方案治疗后是否将展现出一定持续时间的PFS，例如大于三个月的PFS。
3.预处理
在一些实施方案中，对受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征进行预处理。数据预处理是模型创建中的重要步骤，以避免创建产生误导性或不准确结果的模型。在一些实施方案中，预处理防止超出范围的值、缺失值、不可能的数据组合、高度相关的变量等被并入模型中。在一些情况下，预处理导致信息特征的鉴定。例如，预处理可以用于去除具有很少或没有方差的特征、具有低动态范围(例如，在分布上<5％)的特征、高度相关的特征或具有缺失值的特征，或者替代缺失值，使得其余的特征是信息性的、可区分的和独立的(例如，信息特征)。在一些实施方案中，去除具有很少或没有科学相关性的特征。例如，可以去除与制造治疗性细胞组合物相关但具有低科学相关性的某些特征。在一些实施方案中，通过预处理鉴定的特征是信息特征。
在一些实施方案中，将机器学习模型(例如，随机森林、随机存活森林)在通过预处理鉴定的信息特征上训练。在一些实施方案中，使用监督学习将机器学习模型(例如，随机森林、随机存活森林)在通过预处理鉴定的信息特征上训练。分别在第I.B.1a-b节和第I.B.2a-b节中描述的随机森林模型和随机存活森林模型的生成、训练、测试和验证可以使用通过预处理鉴定的信息特征进行。此外，当随机森林或随机存活森林用于在治疗受试者之前确定(例如，预测、估计)有待用治疗性细胞组合物治疗的受试者的临床反应时，用作模型输入的特征是预处理鉴定的信息特征。在一些实施方案中，用于训练模型的信息特征和用于在用治疗性细胞组合物治疗之前确定受试者的临床反应的信息特征是相同的信息特征。
在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括以下中的一个或多个或全部：去除具有零方差或接近零方差的特征，例如受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；去除值缺失大于70％的特征；去除来自数据集的高度相关特征(例如|ρ|>0.7)；以及输入值缺失小于70％的特征的值，其中将缺失值用均值或众数替代。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除具有零方差或接近零方差的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失大于70％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除高度相关(|ρ|>0.7)的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括输入值缺失小于70％的特征的值，其中将缺失值用均值或众数替代。在一些实施方案中，本文所述的一个或多个预处理步骤产生包括信息特征的数据集。
在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括以下中的一个或多个或全部：去除数据缺失大于、大于约或50％的特征，例如受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；去除具有零方差或大于、大于约或95％的等于单个值的数据值和小于0.1n个独特值(其中n＝样本数量)的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据；鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有大于、约或等于0.5(例如|ρ|≥0.5)的相关系数的受试者特征、输入组合物特征、治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括以下中的一个或多个或全部：去除数据缺失大于、大于约或60％的特征，例如受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；去除具有零方差或大于、大于约或95％的等于单个值的数据值和小于0.1n个独特值(其中n＝样本数量)的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据；鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有大于、约或等于0.5(例如|ρ|≥0.5)的相关系数的受试者特征、输入组合物特征、治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
在一些实施方案中，鉴定协变量簇包括计算异质相关矩阵，所述异质相关矩阵包括数值特征之间的皮尔逊积差相关、数值特征与序数特征之间的多系列相关、以及序数特征之间的多分格相关。对于每对特征之间的相关性使用对这些特征的所有完整成对观察结果来计算。协变量簇被定义为相关系数>0.5的特征集合，并且代表性特征被迭代地选择为每个簇中与数据集中的所有其他剩余特征展现出最低平均绝对相关性的那些特征。在任何实施方案的一些中，相关系数是ρ的绝对值(例如，|ρ|)。
在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括去除数据缺失大于、大于约或50％的特征，例如受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括去除数据缺失大于、大于约或60％的特征，例如受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括去除具有零方差或大于、大于约或95％的等于单个值的数据值且小于0.1n个独特值(其中n＝样本数量)的特征，例如受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征包括鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有大于、约或等于0.5的相关系数(例如，|ρ|≥0.5)的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失大于40％、50％、60％、70％或80％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失为或为约40％至80％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失为或为约40％至70％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失为或为约40％至60％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失为或为约40％至50％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失大于40％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失大于50％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失大于60％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失大于70％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除值缺失大于80％的特征。在一些实施方案中，预处理以鉴定信息特征是或包括去除高度相关的特征。在一些实施方案中，高度相关的特征是具有大于或等于或约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的ρ绝对值的特征。在一些实施方案中，高度相关的特征是具有大于或等于或约0.4的ρ绝对值的特征。在一些实施方案中，高度相关的特征是具有大于或等于或约0.5的ρ绝对值的特征。在一些实施方案中，高度相关的特征是具有大于或等于或约0.6的ρ绝对值的特征。在一些实施方案中，高度相关的特征是具有大于或等于或约0.7的ρ绝对值的特征。在一些实施方案中，高度相关的特征是具有大于或等于或约0.8的ρ绝对值的特征。在一些实施方案中，高度相关的特征是具有大于或等于或约0.9的ρ绝对值的特征。
在一些实施方案中，本文(例如，第I.B.3节)所述的预处理步骤中的一个或多个(例如，任何组合)用于鉴定信息特征。在一些实施方案中，本文所述的一个或多个预处理步骤产生包括信息特征的数据集。在一些实施方案中，信息特征包括一个或多个受试者特征、一个或多个治疗性细胞组合物特征和一个或多个输入组合物特征。在一些实施方案中，信息特征包括一个或多个受试者特征、一个或多个治疗性细胞组合物特征或一个或多个输入组合物特征。
4.治疗方法
在一些实施方案中，理解特征(例如，受试者特征、治疗性细胞组合物特征和输入组合物特征)与受试者的临床反应之间的关系(例如，相关性)，以及在治疗之前确定或预测受试者对用治疗性细胞组合物治疗的临床反应的能力可以告知治疗策略。例如，可以根据预期的临床反应来改变或维持治疗方案，例如预定治疗方案。在一些实施方案中，维持所述预定治疗方案或改变所述治疗方案可用于产生阳性临床反应，例如CR、PR、DOR、无毒性。
a.组合治疗
在一些实施方案中，如果确定(例如，预测)待治疗的受试者具有不包括一定持续时间的CR、PR、DOR、一定持续时间的无进展存活期或目标药代动力学在内的临床反应，则可考虑包括其他治疗的治疗策略。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物(例如CD4+、CD8+治疗性T细胞组合物)作为组合治疗的一部分进行施用，例如同时或以任何顺序依序与另一治疗性干预(如抗体或者工程化细胞或受体或药剂，如细胞毒性剂或治疗剂)一起施用。在一些实施方案中，将所述细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预联合施用(同时或以任何顺序依序施用)。在一些情境下，将治疗性细胞组合物(例如CD4+、CD8+治疗性T细胞组合物)与另一疗法在时间上足够接近地共同施用，使得治疗性细胞组合物群体增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之前，施用治疗性细胞组合物(例如CD4+、CD8+治疗性T细胞组合物)。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之后施用所述细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂包括细胞因子如IL-2，以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括施用化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述施用之前施用化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)，例如以减小肿瘤负荷。
在一些实施方案中，组合疗法包括施用激酶抑制剂，如BTK抑制剂(例如依鲁替尼或阿卡替尼(acalibrutinib))；色氨酸代谢和/或犬尿氨酸途径的抑制剂，如吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)的抑制剂(例如艾卡哚司他(epacadostat))；免疫调节剂，如免疫调节性酰亚胺药物(IMiD)，包括沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺、泊马度胺(pomalidomide)、或波那度胺(pomnalidomide))；或检查点抑制剂，如抗PD-L1抗体(例如度伐鲁木单抗(durvalumumab))。
示例性组合疗法和方法描述于公开的国际申请WO 2018/085731、WO 2018/102785、WO 2019/213184、WO 2018/071873、WO 2018/102786、WO 2018/204427、WO 2019/152743中，将它们通过引用以其整体并入。
b.确定给药和施用
在一些实施方案中，如果确定(例如，预测)待治疗的受试者具有不包括一定持续时间的CR、PR、DOR、一定持续时间的无进展存活期或目标药代动力学在内的临床反应，则可考虑优化剂量的治疗策略。在一些实施方案中，治疗性组合物或其剂量以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。在一些实施方案中，组合物以有效减少疾病或病症负荷的量包括细胞。在一些实施方案中，组合物以在被施用所述组合物的一组受试者之间提供更一致的结局(例如反应和/或安全性结局)和/或更一致的药代动力学参数的量包括细胞。在一些实施方案中，组合物包括有效促进持久反应和/或无进展存活期的量的细胞。在一些方面，所提供的方法涉及针对细胞表型评估含有T细胞的治疗性组合物，并且基于此类结局确定剂量。
在一些实施方案中，确定剂量以在一种或多种特定组合物中包含相对一致的数量、比例、比率和/或百分比的具有特定表型的工程化细胞。在一些方面，所述一致性与相对一致的活性、功能、药代动力学参数、毒性结局和/或反应结局相关或有关。在一些方面，在多名受试者、多种组合物和/或多个剂量中，所述数量、比例、比率和/或百分比是相对一致的，例如，在组合物或单位剂量中具有特定表型(例如表达CCR7(CCR7+)或产生细胞因子(例如产生IL-2、TNF-α或IFN-γ))的细胞的数量或比率变化不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％或不超过5％。在一些方面，在组合物或单位剂量中具有特定表型(例如表达CCR7(CCR7+))的细胞的数量或比率与在通过所述过程产生的多种T细胞组合物中所述数量或比率的平均值相比变化不超过20％或不超过10％或不超过5％，和/或与这个平均值相比变化不超过一个标准差，或者在所确定的多种T细胞组合物或剂量中变化不超过20％或不超过10％或不超过5％。在一些实施方案中，多名受试者包括至少10名受试者，如至少15名、至少20名、至少25名、至少30名、至少40名、至少50名、至少60名、至少70名、至少80名、至少90名、至少100名或更多名受试者。
在一些方面，所述剂量，例如一个或多个单位剂量是基于工程化T细胞的特定子集，例如具有特定表型(如特定表面标记表型)的细胞的数量、百分比、比率、频率和/或比例来确定。在一些方面，细胞表型是基于特定细胞标记(例如表面标记)的表达和/或表达的不存在来确定。在一些方面，细胞标记包括指示细胞的活力和/或凋亡状态的标记。在一些方面，示例性标记包括CD3、CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。在一些方面，示例性标记是CCR7。在一些方面，示例性标记是CD27。在一些方面，示例性标记包括CCR7和/或CD27。在一些方面，示例性标记包括CCR7、CD27和/或CD45RA。
在一些实施方案中，提供了涉及向受试者施用一个或多个单位剂量的治疗性T细胞组合物(如本文所述的任一种和/或通过本文提供的方法确定的任何单位剂量)的方法。
在一些实施方案中，提供了如下方法，所述方法涉及向患有疾病或病症的受试者施用单位剂量的T细胞组合物，所述T细胞组合物包含含有特异性地结合至与所述疾病或病症相关的抗原的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的细胞，其中施用限定数量的治疗性组合物的总重组受体表达细胞(受体+)、总CD8+重组受体表达细胞(受体+/CD8+)，和/或施用此类细胞的单位剂量，其中所述单位剂量含有限定数量、百分比、比率、频率和/或比例的具有某一表型的细胞，所述表型例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7-/CD4+、CCR7-/CD8+、CD27-/CD4+、CD27-/CD8+、CD45RA-/CD4+、CD45RA-/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA-/CD4+、CCR7+/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD45RA-/CD4+、CCR7-/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD27-/CD4+、CCR7-/CD27-/CD8+。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达7型C-C趋化因子受体(CCR7)的重组受体表达CD8+ T细胞(受体+/CD8+/CCR7+细胞)和/或限定数量的表达CCR7的重组受体表达CD4+ T细胞(受体+/CD4+/CCR7+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+细胞。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD27和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达分化簇27(CD27)的重组受体表达CD8+ T细胞(受体+/CD8+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CD27的重组受体表达CD4+ T细胞(受体+/CD4+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CCR7和/或CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD8+ T细胞(受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定数量的表达CCR7和CD27的重组受体表达CD4+ T细胞(受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞)和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞和/或限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞与所述组合物中的另一种细胞子集。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD8+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定数量的CD4+/CCR7+/CD27+细胞。在一些实施方案中，所述限定数量或比率是进一步基于CD45RA在所述细胞上的表达或表达的不存在。
在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是期望以一定剂量施用至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如表达或不表达选自CD3 CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA、膜联蛋白V、或激活的半胱天冬酶3的一种或多种标记的细胞)的数量、百分比、比率、频率和/或比例。在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如CCR7+、CD27+、CD45RA+、CD45RA-、CD4+、CD8+、CD3+、凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V-或半胱天冬酶3–)细胞，或对任何前述项中的一种或多种呈阳性或阴性的细胞)的数量、百分比、比率、频率和/或比例。
在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是期望以一定剂量施用至特定受试者(如已经衍生出细胞的受试者)的细胞的数量或重组受体表达细胞或CAR表达细胞的数量、或某一表型的此类细胞(例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7-/CD4+、CCR7-/CD8+、CD27-/CD4+、CD27-/CD8+、CD45RA-/CD4+、CD45RA-/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA-/CD4+、CCR7+/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD45RA-/CD4+、CCR7-/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD27-/CD4+、CCR7-/CD27-/CD8+；和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V-或半胱天冬酶3-)细胞)的数量、百分比、比率和/或比例。在一些实施方案中，单位剂量含有限定数量的细胞或限定数量的重组受体表达细胞或CAR表达细胞、或限定数量、百分比、比率和/或比例的某一表型的此类细胞(例如CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7-/CD4+、CCR7-/CD8+、CD27-/CD4+、CD27-/CD8+、CD45RA-/CD4+、CD45RA-/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA-/CD4+、CCR7+/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD45RA-/CD4+、CCR7-/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD27-/CD4+、CCR7-/CD27-/CD8+；和凋亡标记阴性(例如膜联蛋白V–或半胱天冬酶3–)细胞、和/或其任何子集)。
在一些实施方案中，单位剂量是基于以下来确定：细胞组合物中的细胞或一种或多种细胞类型的数量和/或细胞或细胞类型的频率、比率和/或百分比，所述细胞或细胞类型例如单独群体、表型或亚型，如具有以下表型的那些：膜联蛋白V–/CCR7+/CAR+；膜联蛋白V-/CCR7+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V-/CCR7+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V-/CD27+/CAR+；膜联蛋白V-/CD27+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V-/CD27+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V-/CCR7+/CD27+/CAR+；膜联蛋白V-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+；膜联蛋白V-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+；膜联蛋白V-/CCR7+/CD45RA-/CAR+；膜联蛋白V-/CCR7+/CD45RA-/CAR+/CD4+；膜联蛋白V-/CCR7+/CD45RA-/CAR+/CD8+；膜联蛋白V-/CCR7-/CD45RA-/CAR+；膜联蛋白V-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD4+；膜联蛋白V-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD8+；膜联蛋白V-/CCR7-/CD27-/CAR+、膜联蛋白V-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD4+；膜联蛋白V-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CAR+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3-/CD27+/CAR+；激活的半胱天冬酶3-/CD27+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3-/CD27+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD27+/CAR+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD45RA-/CAR+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD45RA–/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7+/CD45RA-/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD45RA-/CAR+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD4+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD8+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD27-/CAR+；激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD4+；和/或激活的半胱天冬酶3-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD8+；或其组合。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约1x105个与为或约1x108个之间、在为或约5x105个与为或约1x107个之间、或在为或约1x106个与为或约1x107个之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过约1x108、不超过约5x107、不超过约1x107、不超过约5x106、不超过约1x106、或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约5x105个与为或约5x107个之间、在为或约1x106个与为或约1x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞或受体+/CD4+/CCR7+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约5x107、1x107、5x106、1x106、或至少约5x105个总受体+/CD8+/CCR7+细胞或受体+/CD4+/CCR7+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约5x105个与为或约5x107个之间、在为或约1x106个与为或约1x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD8+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约5x107、1x107、5x106、1x106、或至少约5x105个总受体+/CD8+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+细胞和/或至少或至少约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约3x106个与为或约2.5x107个之间、在为或约4x106个与为或约2x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD8+/CCR7+细胞，和/或在为或约3x106个与为或约2.5x107个之间、在为或约4x106个与为或约2x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD4+/CCR7+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CD27+细胞和/或至少或至少约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约3x106个与为或约2.5x107个之间、在为或约4x106个与为或约2x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD8+/CD27+细胞，和/或在为或约3x106个与为或约2.5x107个之间、在为或约4x106个与为或约2x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约5x105个与为或约5x107个之间、在为或约1x106个与为或约1x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少或至少约5x107、1x107、5x106、1x106、或至少或至少约5x105个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含至少或至少约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞和/或至少或至少约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、或1x107个总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约3x106个与为或约2.5x107个之间、在为或约4x106个与为或约2x107个、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞，和/或在为或约3x106个与为或约2.5x107个之间、在为或约4x106个与为或约2x107个之间、或在为或约5x106个与为或约1x107个之间的总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约1x105个与为或约1x108个之间、在为或约5x105个与为或约1x107个之间、或在为或约1x106个与为或约1x107个之间的表达重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约1x108、不超过或不超过约5x107、不超过或不超过约1x107、不超过或不超过约5x106、不超过或不超过约1x106、或不超过或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约1x105个与为或约5x108个之间、在为或约1x105个与为或约1x108个之间、在为或约5x105个与为或约1x107个之间、或在为或约1x106个与为或约1x107个之间的表达重组受体的总CD3+细胞(受体+/CD3+细胞)或总CD3+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约5x108、不超过或不超过约1x108、不超过或不超过约5x107、不超过或不超过约1x107、不超过或不超过约5x106、不超过或不超过约1x106、或不超过或不超过约5x105个总受体+/CD3+细胞或总CD3+细胞。
在一些实施方案中，CD3+细胞的总数、受体+/CD3+细胞的总数、受体+/CD8+细胞的总数、受体+/CD4+细胞的总数、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数是活的或有活力的此类细胞的总数。在一些实施方案中，CD3+细胞的总数、受体+/CD3+细胞的总数、受体+/CD8+细胞的总数、受体+/CD4+细胞的总数、受体+/CD8+/CCR7+细胞的总数、受体+/CD4+/CCR7+细胞的总数、受体+/CD8+/CD27+细胞的总数、受体+/CD4+/CD27+细胞的总数、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞的总数、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞的总数、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–细胞和/或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–细胞的总数是不表达凋亡标记的此类细胞的总数和/或是凋亡标记阴性(–)的此类细胞的总数，其中所述凋亡标记为膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物中T细胞的总数的(或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数的)至少或至少约、或为或约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％对CCR7和/或CD27呈表面阳性。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物中T细胞的总数的(或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数的)至少或至少约、或为或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％能够产生选自白介素2(IL-2)和/或TNF-α的细胞因子。在一些实施方案中，能够产生IL-2和/或TNF-α的T细胞是CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少或至少约、或为或约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的15％或约15％至90％或约90％、20％或约20％至80％或约80％、30％或约30％至70％或约70％、或40％或约40％至60％或约60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+。在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少或至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的15％或约15％至90％或约90％、20％或约20％至80％或约80％、30％或约30％至70％或约70％、或40％或约40％至60％或约60％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+。在一些实施方案中，所述单位剂量中所述总受体+细胞的至少或至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或所述单位剂量中所述总受体+细胞的15％或约15％至90％或约90％、20％或约20％至80％或约80％、30％或约30％至70％或约70％、或40％或约40％至60％或约60％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。
在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD8+细胞的至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％，或所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD8+细胞的50％或约50％至90％或约90％、60％或约60％至90％或约90％、70％或约70％至80％或约80％(每个都包含端值)是受体+/CD8+/CCR7+或受体+/CD8+/CD27+或受体+/CD8+/CCR7+/CD27+。在一些实施方案中，在本文提供的包含表达重组受体的T细胞的任何组合物中，所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD4+细胞的至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％，或所述组合物或所述单位剂量中所述总受体+/CD4+细胞的50％或约50％至90％或约90％、60％或约60％至90％或约90％、70％或约70％至80％或约80％(每个都包含端值)是受体+/CD4+/CCR7+或受体+/CD4+/CD27+、或受体+/CD4+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD27+、受体+/CD8+/CCR7+/CD45RA–、受体+/CD4+/CCR7+/CD27+或受体+/CD4+/CCR7+/CD45RA–。在一些实施方案中，所述组合物中所述总受体+/CD8+细胞的至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％是受体+/CD8+/CCR7+/CD27+；或者所述组合物中所述总受体+/CD4+细胞的至少或至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％是受体+/CD4+/CCR7+/CD27+。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约1x105个与为或约1x108个之间、在为或约5x105个与为或约1x107个之间、或在为或约1x106个与为或约1x107个之间的表达所述重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达所述重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约1x108、不超过或不超过约5x107、不超过或不超过约1x107、不超过或不超过约5x106、不超过或不超过约1x106、或不超过或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+细胞、总受体+/CD4+/CCR7+细胞、总受体+/CD8+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+细胞与受体+/CD4+/CCR7+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所述单位剂量包含在为或约1x105个与为或约1x108个之间、在为或约5x105个与为或约1x107个之间、或在为或约1x106个与为或约1x107个之间的表达重组受体的总CD8+细胞(受体+/CD8+细胞)或表达重组受体的总CD4+细胞(受体+/CD4+细胞)、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述单位剂量包含不超过或不超过约1x108、不超过或不超过约5x107、不超过或不超过约1x107、不超过或不超过约5x106、不超过或不超过约1x106、或不超过或不超过约5x105个总受体+/CD8+细胞或总受体+/CD4+细胞、总受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞、或总受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述单位剂量包含限定比率的受体+/CD8+/CCR7+/CD27+细胞与受体+/CD4+/CCR7+/CD27+细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或在大约1:3与大约3:1之间。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及施用含有限定数量的细胞的剂量。在一些实施方案中，所述剂量，如细胞的所述限定数量，如为CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7-/CD4+、CCR7-/CD8+、CD27-/CD4+、CD27-/CD8+、CD45RA-/CD4+、CD45RA–/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA-/CD4+、CCR7+/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD45RA-/CD4+、CCR7-/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD27-/CD4+、或CCR7-/CD27-/CD8+的CAR+细胞的限定数量在或在约5.0x106与2.25x107之间、5.0x106与2.0x107之间、5.0x106与1.5x107之间、5.0x106与1.0x107之间、5.0x106与7.5x106之间、7.5x106与2.25x107之间、7.5x106与2.0x107之间、7.5x106与1.5x107之间、7.5x106与1.0x107之间、1.0x107与2.25x107之间、1.0x107与2.0x107之间、1.0x107与1.5x107之间、1.5x107与2.25x107之间、1.5x107与2.0x107之间、2.0x107与2.25x107之间。在一些实施方案中，这种剂量(如细胞的这种限定数量)是指在所施用的组合物中的总重组受体表达细胞。在一些方面，所施用的限定数量的重组受体表达细胞是呈凋亡标记阴性(-)的细胞，并且任选地其中所述凋亡标记是膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，所述单位剂量的细胞的剂量含有一定数量的细胞，如限定数量的细胞，在至少或至少约5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、10x106与约15x106之间的重组受体表达细胞，如为CCR7+/CD4+、CCR7+/CD8+、CD27+/CD4+、CD27+/CD8+、CD45RA+/CD4+、CD45RA+/CD8+、CCR7-/CD4+、CCR7-/CD8+、CD27-/CD4+、CD27-/CD8+、CD45RA-/CD4+、CD45RA-/CD8+、CCR7+/CD27+/CD4+、CCR7+/CD27+/CD8+、CCR7+/CD45RA-/CD4+、CCR7+/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD45RA-/CD4+、CCR7-/CD45RA-/CD8+、CCR7-/CD27-/CD4+、或CCR7-/CD27-/CD8+，和/或呈凋亡标记阴性(-)且CD8+的重组受体表达细胞，任选地其中所述凋亡标记是膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3。
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞施用于受试者。在一些实施方案中，剂量的大小或时间安排根据受试者的特定疾病或病症确定。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。
在一些实施方案中，细胞剂量包含在为或约2x105个细胞/kg与为或约2x106个细胞/kg之间，如在为或约4x105个细胞/kg与为或约1x106个细胞/kg之间或在为或约6x105个细胞/kg与为或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的剂量包含不超过2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg、或者不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的剂量包含至少或至少约或为或约2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x106个细胞/kg、或至少或至少约或为或约2x106个细胞/kg。
在某些实施方案中，向受试者施用为或约10万至为或约1000亿个细胞和/或每公斤受试者体重的该细胞量的范围的细胞或细胞亚型的单独群体，例如像为或约10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或由前述任何两个值限定的范围)，并且在一些情况下，为或约1亿个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约1.2亿个细胞、为或约2.5亿个细胞、为或约3.5亿个细胞、为或约4.5亿个细胞、为或约6.5亿个细胞、为或约8亿个细胞、为或约9亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，细胞剂量是细胞的平剂量或细胞的固定剂量，使得细胞剂量不依赖于或基于受试者的体表面积或体重。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含少于约5x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如，在为或约1x106至为或约5x108个此类细胞的范围内，如为或约2x106、5x106、1x107、5x107、1x108、1.5x108或5x108个总此类细胞，或者在任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包含多于或多于约1x106个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)并且少于或少于约2x109个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如在为或约2.5x107至为或约1.2x109个此类细胞的范围内，如为或约2.5x107、5x107、1x108、1.5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x105至为或约5x108个总CAR表达(CAR表达)T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞.在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约2.5x107至为或约1.5x108个总CAR表达T细胞，如从或从约5x107至或至约1x108个总CAR表达T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约1.5x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，从或从约5x105至或至约1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)或者从或从约1x106至或至约1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量的细胞，所述剂量包含以下细胞数量：至少或至少约1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106、至少或至少约1x107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如，CAR+)CD3+或CD8+细胞的总数。在一些实施方案中，所述数量是关于CD4+和CD8+的总数，在一些情况下是关于重组受体表达(例如，CAR+)CD4+和CD8+细胞的总数。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x105至或至约1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或从或从约1x106至或至约1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个CD4+和CD8+总T细胞或CD4+和CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x105至或至约1x107个CD4+和CD8+总T细胞或CD4+和CD8+重组受体表达细胞、或从或从约1x106至或至约1x107个CD4+和CD8+总T细胞或CD4+和CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5x105至或至约1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞或者从或从约1x106至或至约1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个总CD4+/CAR+和CD8+/CAR+细胞、从或从约5x105至或至约1x107个总CD4+/CAR+和CD8+/CAR+细胞或者从或从约1x106至或至约1x107个总CD4+/CAR+和CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包含CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，CD8+ T细胞的剂量(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)包括在为或约1x106个与为或约5x108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD8+细胞，例如，在以下范围内：从为或约5x106至为或约1x108个此类细胞，如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或从约1x107至或至约0.75x108个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x107至或至约5x107个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x107至或至约0.25x108个总重组受体表达CD8+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108、2.5x108、或5x108个总重组受体表达CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，CD4+ T细胞的剂量(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)包括在为或约1x106个与为或约5x108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD4+细胞，例如，在以下范围内：从为或约5x106至为或约1x108个此类细胞，如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或约1x107至或至约0.75x108个总重组受体表达CD4+ T细胞、从或约1x107至或至约5x107个总重组受体表达CD4+ T细胞、从或从约1x107至或至约0.25x108个总重组受体表达CD4+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108、2.5x108、或5x108个总重组受体表达CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的剂量作为单一剂量施用于受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。
在过继细胞疗法的情况下，施用给定“剂量”涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情境下，剂量是指定数量的细胞的单次或连续施用，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情境下，剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式施用，例如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指这样分割的剂量，使其在超过一天的时间内施用。这种类型的给药包括在本方法中并且被认为是单一剂量。
因此，所述细胞剂量可以作为分割剂量施用，例如随时间施用的分割剂量。例如，在一些实施方案中，剂量可以在2天或3天内施用受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用33％的剂量，并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过施用多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来施用，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地施用各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多个组合物。例如，细胞的群体或亚型可以分别包括CD8+和CD4+ T细胞，和/或分别富含CD8+和富含CD4+的群体，例如，各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞的CD4+和/或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的施用包括施用第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+ T细胞或一定剂量的CD4+ T细胞，以及施用第二组合物，所述第二组合物包含所述剂量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的另一种。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的施用(例如，所述多种细胞组合物的施用)涉及分开施用所述细胞组合物。在一些方面，分开施用同时或按任何顺序依序进行。在一些实施方案中，所述剂量包括第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和第二组合物的施用相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第一组合物的施用的开始和第二组合物的施用的开始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，第一组合物的施用的开始和/或完成和第二组合物的施用的完成和/或开始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。
在一些实施方案中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前施用。在一些实施方案中，第二组合物(例如，所述剂量的第二组合物)包含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，第二组合物(例如，所述剂量的第二组合物)包含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量或组合物包括限定或目标比率的表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或限定或目标比率的CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有不同细胞群的目标或所需比率(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如，1:1)的组合物或剂量的施用涉及施用含有所述群体中的一种的细胞组合物，然后施用包含所述群体中的另一种的单独细胞组合物，其中所述施用是以或大约以所述目标或所需比率来进行。在一些方面，定义比率的细胞的剂量或组合物的施用导致改善T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天施用。在一些实施方案中，在第一剂量后施用多个连续剂量，使得在施用所述连续剂量后施用另外一个或多个剂量。在一些方面，在另外的剂量中施用于受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，所述第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如所述受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、所述受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或所述受试者发生毒性结局(例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的施用与连续剂量的施用之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，施用所述连续剂量是在施用所述第一剂量后大于约14天且在施用所述第一剂量后小于约28天的某个时间点进行。在一些方面，所述第一剂量与所述连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在施用先前剂量后至少约14天且小于约28天施用另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)施用所述另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不施用剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不施用剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双剂量)，包含第一剂量的T细胞和连续剂量的T细胞，其中第一剂量和第二剂量中之一或两者包括施用分割剂量的T细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量通常足够大以有效减少疾病负荷。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，细胞的所述剂量在一些实施方案中是基于总细胞数(或每kg体重的数量)以及单独群体或亚型的所需比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量基于所需的单独群体中的细胞或单独细胞类型的总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，剂量基于这种特征的组合，如所需的总细胞数量、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如所需剂量的T细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内施用细胞的群体或亚型如CD8+和CD4+ T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小细胞数量。在一些方面，在以所需剂量施用的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，所述细胞是以细胞的一种或多种单独群体或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)来施用，或在所述所需剂量的容忍差异内施用。在一些方面，所需剂量是亚型或群体的细胞的所需数量或被施用所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞的所需数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小的群体或亚型的细胞数量或每单位体重的最小的群体或亚型的细胞数量。
因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比例，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如各自)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+细胞的比率，和/或基于所需的CD4+和/或CD8+细胞的固定或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞是以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率来施用，或在所述所需输出比率的容忍范围内施用。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。在一些实施方案中，剂量的大小是基于预测的输出细胞组合物属性确定的。在任何上述实施方案的一些中，剂量可以是预定剂量和/或预定方案。在一些实施方案中，可以修改剂量的大小、剂量的浓度和/或施用剂量的频率以实现正临床结局(例如，反应)。在一些实施方案中，改变剂量大小、浓度和/或施用的频率导致改变预定的剂量和/或治疗方案。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量不同，例如，更高，如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低，如例如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的施用：受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
II.用于生成工程化T细胞的方法
在一些实施方案中，将鉴定与对治疗性细胞组合物的临床反应相关的特征的方法或者在治疗之前确定对用治疗性细胞组合物治疗的反应的方法与生成表达重组蛋白例如重组受体(如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))的工程化细胞(如工程化CD4+ T细胞和/或工程化CD8+ T细胞)的治疗性组合物(例如，输出组合物)结合使用。在一些实施方案中，本文提供的方法与制造、生成或产生细胞疗法结合使用，并且可以与另外的处理步骤，如分离(isolation)、分开(separation)、选择、激活或刺激、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞的步骤结合使用。在一些实施方案中，生成或产生工程化细胞，例如工程化CD4+ T细胞和/或工程化CD8+ T细胞的方法包括以下中的一项或多项：从受试者分离细胞、制备细胞、处理细胞、在刺激条件下孵育细胞和/或工程化(例如转导)细胞。在一些实施方案中，所述方法包括以如下顺序进行的处理步骤：首先从生物样品中分离，如选择或分开输入细胞，例如原代细胞；在刺激条件下，孵育输入细胞，用载体颗粒，例如病毒载体颗粒对所述输入细胞进行工程化，以例如通过转导或转染将重组多核苷酸引入所述细胞中；培育所述工程化细胞(例如转导的细胞)，如以扩增所述细胞；以及收集、收获所述细胞的全部或一部分，和/或用其填充容器，以将所述细胞配制为输出组合物。在一些实施方案中，CD4+和CD8+ T细胞被彼此独立地制造于例如单独的输入组合物中，但制造过程包括相同的处理步骤。在一些实施方案中，CD4+和CD8+ T细胞被一起制造于例如同一输入组合物中。在一些实施方案中，确定所选择的细胞(例如，输入组合物)的特征并将所述特征用作机器学习模型(例如，本文提供的随机森林模型、随机存活森林模型)的输入。
在一些实施方案中，在冷冻保存之前或之后将所生成的输出组合物(例如，治疗性细胞组合物)的细胞重新引入同一受试者体内。在一些实施方案中，确定治疗性细胞组合物的工程化细胞的特征并将所述特征用作机器学习模型(例如，本文提供的随机森林模型、随机存活森林模型)的输入。在一些实施方案中，工程化细胞的输出组合物(例如治疗性细胞组合物)适合在疗法(例如自体细胞疗法)中使用。)。示例性制造方法描述于公开的国际专利申请公开号WO 2019/089855中，其内容通过引用以其整体并入本文。
A.样品和细胞制备
在特定实施方案中，所提供的方法与从生物样品中分离、选择和/或富集细胞以生成富集细胞(例如T细胞)的一种或多种输入组合物结合使用。在一些实施方案中，所提供的方法包括从生物样品中分离细胞或其组合物，所述生物样品例如是获得自或源自受试者的那些生物样品，所述受试者例如是患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，确定或获得待治疗的受试者的特征，例如如在第I-A节和第I-A.1节中描述的，并将所述特征用作本文提供的机器学习模型的输入。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中分离、处理和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些方面，样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、选择和/或富集、和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后，和/或在培育和/或收获工程化细胞之后，冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。在一些实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或冷冻保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或冷冻保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以等于或约1°/分钟的速率冷冻至等于或约-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所述细胞或群体的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记进行分离的方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性结合至细胞上的标记的分子(例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，所述方法是使用颗粒如珠(例如磁珠)进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，使用在国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行分离或分开。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其时间安排，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少腔室中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如，珠试剂)的浓度，从而增加溶液的化学势，而不影响腔室中的细胞总数。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分是在离心室中进行，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合，所述量远少于根据制造商的说明书在管或容器中进行类似选择以用于选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常采用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记的分子，例如抗体，其任选地偶联到支架(例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL，诸如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至所述细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将所述选择缓冲液和选择试剂单独添加至所述细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间是从5分钟至6小时或从约5分钟至约6小时，如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，如在旋转的存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF是从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这种过程是在与所述室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如预先洗涤步骤洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，使所孵育的细胞经受分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与所述选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与所述选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到系统中用于基于免疫亲和力来分离细胞。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。
在一些实施方案中，过程步骤进一步包括如使用可以进行基于亲和力的选择的系统或设备对孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择。在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过以下方式完成阳性或阴性选择：将细胞与特异性结合至一种或多种表面标记的一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育，所述一种或多种表面标记分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高的水平表达(标记高)。可以进行多轮相同的选择步骤(例如阳性或阴性选择步骤)。在某些实施方案中，使阳性或阴性选择的级分经受选择过程，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，将选择重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或多于九次。在某些实施方案中，相同的选择进行多至五次。在某些实施方案中，相同的选择步骤进行三次。
所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。在某些实施方案中，一个或多个分离步骤重复和/或进行多于一次。在一些实施方案中，使从分离步骤得到的阳性或阴性选择的级分经受相同的分离步骤，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，单个分离步骤重复和/或进行多于一次，例如以增加阳性选择细胞的产率，以增加阴性选择细胞的纯度，和/或以进一步从阴性选择的级分去除阳性选择的细胞。在某些实施方案中，一个或多个分离步骤进行和/或重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或多于十次。在某些实施方案中，所述一个或多个选择步骤进行和/或重复一次与十次之间、一次与五次之间或三次与五次之间。在某些实施方案中，一个或多个选择步骤重复三次。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术来分离T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或表达高水平的所述表面标记的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞。在一些实施方案中，通过与特异性结合此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体可以与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)缀合(如直接或间接地)以实现选择。例如，CD3+、CD28+ T细胞可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，
M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器和/或
珠)进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可以通过针对在一种或多种幼稚T细胞、记忆T细胞和/或效应T细胞亚群上表达或表达至相对较高程度的标记进行阳性或阴性选择来进一步分选为亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，使CD8+ T细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+ T细胞与CD4+ T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分经受基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择以及基于CD62L的阳性选择。
在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依序进行。在一些方面，用于制备CD8+ T细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+ T细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分二者被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+ T细胞群的选择和对CD8+ T细胞群的选择同时进行。在一些实施方案中，以任一顺序依序进行CD4+ T细胞群和CD8+ T细胞群的选择。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括公开的美国申请号US20170037369中所述的那些。在一些实施方案中，可以在选择之后将经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+ T细胞群合并。在一些方面，可以将经选择CD4+T细胞群和经选择CD8+ T细胞群合并在如本文所述的生物反应器袋中。在一些实施方案中，如根据所提供的方法，分别处理经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+ T细胞群，由此使经选择CD4+ T细胞群富集CD4+ T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育；并且使经选择CD8+ T细胞群富集CD8+ T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)(如与来自同一供体的用于工程化CD4+ T细胞的相同的重组蛋白)的病毒载体转导，并且在扩增T细胞的条件下培育。
在特定实施方案中，使生物样品(例如PBMC或其他白细胞的样品)经受CD4+T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD8+ T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经受CD8+ T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+ T细胞选自阴性级分。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分二者。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+ T辅助细胞分选为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+ T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、或CD4+ T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+ T细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+ T细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+ T细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:MetastasisResearch Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将待分离的所孵育的细胞样品或组合物与含有小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如Dynabeads或
珠粒))的选择试剂一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。用于磁分离方法中的许多熟知的磁响应材料是已知的，例如Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些方面，在其中将样品置于磁场中的程序中实现分离，并且具有附着至其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经受另外的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotech，加利福尼亚州奥本)进行的。磁激活细胞分选(MACS)(例如，CliniMACS系统)能够对其上附着有磁化颗粒的细胞进行高纯度选择。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于施用于患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，所述分离和/或选择产生经富集T细胞，例如CD3+ T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+ T细胞的一种或多种输入组合物。在一些实施方案中，从单一生物样品中分离、选择、富集或获得两种或更多种单独的输入组合物。在一些实施方案中，从单独的生物样品中分离、选择、富集和/或获得单独的输入组合物，所述单独的生物样品从同一受试者收集、获取和/或获得。
在一些实施方案中，评估所述一种或多种输入组合物的特征，例如如第I-A节和第I-A-2节所述。在一些实施方案中，所述特征是细胞表型。在一些实施方案中，定量了细胞表型，以提供输入组合物中具有某一属性的细胞的数量、百分比、比例和/或比率。在一些实施方案中，将所述特征用作本文提供的机器学习模型的输入。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD3+ T细胞。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的输入组合物基本上由CD3+ T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集CD4+ T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述CD4+ T细胞的输入组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD4+ T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种组合物是或包括CD8+ T细胞的组合物，所述组合物是或包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述CD8+ T细胞的组合物含有少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD8+ T细胞组成。
在一些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后将所述经富集T细胞的一种或多种输入组合物冷冻，例如冷冻保存和/或低温冷冻。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制所述细胞的组合物的任何步骤之前冷冻，例如冷冻保存和/或低温冷冻所述一种或多种输入组合物。在特定实施方案中，将所述一种或多种低温冷冻的输入组合物例如在或在约-80℃下储存12小时至7天、24小时至120小时或2天至5天。在特定实施方案中，将所述一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天、3天、2天或1天的时间量。在一些实施方案中，将一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存或储存约1天、2天、3天、4天、5天或6天。
B.细胞的激活和刺激
在一些实施方案中，将所提供的方法与在刺激条件下孵育细胞结合使用。在一些实施方案中，刺激条件包括激活或刺激和/或能够激活或刺激细胞(例如，CD4+ T细胞或CD8+ T细胞)中的信号(如从TCR和/或共受体生成的信号)的条件。在一些实施方案中，刺激条件包括用刺激试剂(例如，激活或刺激和/或能够激活或刺激细胞中的信号的试剂)和/或在刺激试剂的存在下培养、培育、孵育、激活、繁殖细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，刺激试剂刺激和/或激活TCR和/或共受体。在特定实施方案中，刺激试剂是在第II-B-1节中所述的试剂。
在某些实施方案中，在对细胞进行基因工程化，例如通过第II-C节中提供的技术转染和/或转导细胞之前，在刺激条件下孵育经富集T细胞的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在已从生物样品中分离、选择、富集或获得经富集T细胞的一种或多种组合物之后，在刺激条件下孵育所述一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是输入组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种输入组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，所述经富集T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的输入组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在孵育之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+ T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成孵育之后将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独经刺激组合物合并为单一组合物。在一些实施方案中，如根据所提供的方法，在已经进行和/或完成孵育之后分别处理经刺激CD4+ T和经刺激CD8+ T细胞的单独经刺激组合物，由此将经刺激CD4+ T细胞群(例如与刺激性抗CD3/抗CD28磁珠刺激试剂一起孵育)用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育，并且将经刺激CD8+ T细胞群(例如与刺激性抗CD3/抗CD28磁珠刺激试剂一起孵育)用编码重组蛋白(例如CAR)(如与来自同一供体的用于工程化CD4+T细胞的相同的重组蛋白)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育可以包括培养、培育、刺激、激活、繁殖，包括通过在刺激条件的存在下孵育，所述刺激条件例如设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的条件。在特定实施方案中，刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和设计为激活细胞的任何其他药剂))。
在一些方面，根据多种技术进行刺激和/或在刺激条件下的孵育，所述技术如以下中所述的那些：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77，Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72–82，和/或Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方法扩增细胞(例如T细胞)、细胞组合物和/或细胞群，如CD4+和CD8+ T细胞或其组合物、群体或亚群：向培养起始组合物中添加饲养细胞如非分裂外周血单个核细胞(PBMC)(例如，使得所得细胞群对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。在一些实施方案中，在培养期间实现温度转变，如从37摄氏度至35摄氏度。任选地，孵育还可以包括加入非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，可以通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性的CD4+和CD8+的群体。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。也可以使用幼稚T细胞。
在特定实施方案中，刺激条件包括将细胞与刺激试剂一起孵育、培养和/或培育。在特定实施方案中，刺激试剂是在第I-B-1节中所述的试剂。在某些实施方案中，刺激试剂含有或包括珠。示例性刺激试剂是或包括抗CD3/抗CD28磁珠。在某些实施方案中，当将细胞与刺激试剂发生接触和/或与刺激试剂一起孵育时，发生在刺激条件下孵育、培养和/或培育细胞的开始和/或起始。在特定实施方案中，在基因工程化细胞(例如，如通过转染或转导将重组多核苷酸引入细胞中)之前、期间和/或之后，孵育细胞。
在一些实施方案中，以为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1或0.2:1的刺激试剂和/或珠(例如抗CD3/抗CD28磁珠)与细胞的比率孵育所述经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，刺激试剂和/或珠与细胞的比率在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1:1。
在特定实施方案中，以小于3:1或每细胞少于3个刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)的比率(如1:1的比率)孵育所述细胞降低了孵育期间发生的细胞死亡(例如，如因激活诱导的细胞死亡所致)的量。在一些实施方案中，将所述细胞与所述刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3(或3:1或每细胞少于3个珠)的珠与细胞的比率一起孵育。在特定实施方案中，以小于3:1或每细胞少于3个珠的比率(如1:1的比率)孵育所述细胞降低了孵育期间发生的细胞死亡(例如，如因激活诱导的死亡所致)的量。
在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3:1的刺激试剂和/或珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且在完成孵育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的T细胞存活，例如是有活力的并且/或未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂以小于3:1的刺激试剂和/或珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且在孵育期间少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞经历激活诱导的细胞死亡。
在某些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3:1的珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且与经历示例性和/或替代性过程(其中将经富集T细胞的组合物与刺激试剂以3:1或更大的比率一起孵育)的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在一些实施方案中，与所述刺激试剂一起孵育的所述经富集T细胞的组合物包含从1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL或从约1.0x105个细胞/mL至约1.0x108个细胞/mL，如至少或约至少或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。在一些实施方案中，与所述刺激试剂一起孵育的所述经富集T细胞的组合物包含约0.5x106个细胞/mL、1x106个细胞/mL、1.5x106个细胞/mL、2x106个细胞/mL、2.5x106个细胞/mL、3x106个细胞/mL、3.5x106个细胞/mL、4x106个细胞/mL、4.5x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、5.5x106个细胞/mL、6x106个细胞/mL、6.5x106个细胞/mL、7x106个细胞/mL、7.5x106个细胞/mL、8x106个细胞/mL、8.5x106个细胞/mL、9x106个细胞/mL、9.5x106个细胞/mL或10x106个细胞/mL，如约2.4x106个细胞/mL。
在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃，例如为或为约37℃±2℃的温度下一起孵育。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂在从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或为约5％±0.5％的CO2水平下一起孵育。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂在为或为约37℃的温度下和/或在为或为约5％的CO2水平下一起孵育。
在特定实施方案中，所述刺激条件包括用一种或多种细胞因子和/或在一种或多种细胞因子存在下孵育、培养和/或培育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-2。在一些实施方案中，所述刺激条件包括在如所述的刺激试剂(抗CD3/抗CD28磁珠)的存在下和在一种或多种重组细胞因子存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞或经富集CD8+ T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，将经富集CD4+ T细胞的组合物与IL-2，例如重组IL-2一起孵育。在不希望受理论束缚的情况下，特定实施方案设想到，从一些受试者获得的CD4+T细胞不产生或不足够地产生如下量的IL-2，所述量允许在用于产生输出细胞(例如适合于在细胞疗法中使用的工程化细胞)的组合物的整个过程中的生长、分裂和扩增。在一些实施方案中，在重组IL-2的存在下在刺激条件下孵育经富集CD4+ T细胞的组合物增加了所述组合物的CD4+ T细胞在孵育步骤期间和整个所述过程中将继续存活、生长、扩增和/或激活的概率或可能性。在一些实施方案中，与未在重组IL-2的存在下孵育所述经富集CD4+ T细胞的组合物的替代性和/或示例性方法相比，在重组IL-2的存在下孵育所述经富集CD4+ T细胞的组合物将从所述经富集CD4+ T细胞的组合物产生经富集CD4+ T细胞(例如适合于细胞疗法的工程化CD4+ T细胞)的输出组合物的概率和/或可能性增加至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子的量或浓度是用国际单位(IU)测量和/或定量的。国际单位可以用于定量维生素、激素、细胞因子、疫苗、血液制品和类似的生物活性物质。在一些实施方案中，IU是或包括通过与具有特定重量和强度的国际参考标准(例如，针对IL-2的WHO第一国际标准(WHO 1st International Standard for Human IL-2)，86/504)相比的生物制剂效力的量度单位。国际单位是报告生物活性单位的唯一公认且标准化的方法，所述生物活性单位公开和源自国际合作研究工作。在特定实施方案中，可以通过与类似的WHO标准产品的产品比较测试获得细胞因子的组合物、样品或来源的IU。例如，在一些实施方案中，将人重组IL-2、IL-7或IL-15的组合物、样品或来源的IU/mg分别与WHO标准IL-2产品(NIBSC代码：86/500)、WHO标准IL-17产品(NIBSC代码：90/530)和WHO标准IL-15产品(NIBSC代码：95/554)进行比较。
在一些实施方案中，以IU/mg计的生物活性等同于(以ng/ml计的ED50)-1x106。在特定实施方案中，重组人IL-2或IL-15的ED50等同于使用CTLL-2细胞的细胞增殖的半最大刺激(XTT切割)所需的浓度。在某些实施方案中，重组人IL-7的ED50等同于PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的半最大刺激所需的浓度。与IL-2的IU的测定和计算相关的细节论述于Wadhwa等人,Journal of Immunological Methods(2013),379(1-2):1-7；和Gearing和Thorpe,Journal of Immunological Methods(1988),114(1-2):3-9中；与IL-15的IU的测定和计算相关的细节论述于Soman等人Journal of Immunological Methods(2009)348(1-2):83-94中；所述文献通过引用以其整体特此并入。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15的存在下在刺激条件下孵育经富集CD8+T细胞的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下在刺激条件下孵育经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些方面，所述经富集T细胞组合物的孵育还包括刺激试剂，例如抗CD3/抗CD28磁珠的存在。
在一些实施方案中，将所述细胞与细胞因子，例如重组人细胞因子一起孵育，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与1,000IU/ml之间、在10IU/ml与50IU/ml之间、在50IU/ml与100IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与1,000IU/ml之间。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与IL-2，例如人重组IL-2一起孵育，所述IL-2的浓度在1IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与150IU/ml之间、在80IU/ml与120IU/ml之间、在60IU/ml与90IU/ml之间或在70IU/ml与90IU/ml之间。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与重组IL-2一起孵育，所述重组IL-2的浓度为或为约50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml、75IU/ml、80IU/ml、85IU/ml、90IU/ml、95IU/ml、100IU/ml、110IU/ml、120IU/ml、130IU/ml、140IU/ml或150IU/ml。在一些实施方案中，在为或为约85IU/ml的重组IL-2的存在下孵育所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，将与重组IL-2一起孵育的所述组合物针对T细胞(例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，所述T细胞群是CD4+ T细胞群。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+ T细胞进行富集，其中CD4+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+ T细胞进行富集，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在一些实施方案中，与重组IL-2一起孵育的经富集CD4+ T细胞组合物也可以与重组IL-7和/或重组IL-15如以所述量一起孵育。在一些实施方案中，与重组IL-2一起孵育的经富集CD8+ T细胞组合物也可以与重组IL-15如以所述量一起孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-7，例如人重组IL-7一起孵育，所述重组IL-7的浓度在100IU/ml与2,000IU/ml之间、在500IU/ml与1,000IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在500IU/ml与750IU/ml之间、在750IU/ml与1,000IU/ml之间或在550IU/ml与650IU/ml之间。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与重组IL-7一起孵育，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/ml、100IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml、450IU/ml、500IU/ml、550IU/ml、600IU/ml、650IU/ml、700IU/ml、750IU/ml、800IU/ml、750IU/ml、750IU/ml、750IU/ml或1,000IU/ml。在特定实施方案中，在为或为约600IU/ml的重组IL-7的存在下孵育所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，将与重组IL-7一起孵育的组合物针对T细胞(例如CD4+ T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，与重组IL-7一起孵育的经富集CD4+ T细胞组合物也可以与重组IL-2和/或重组IL-15如以所述量一起孵育。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+ T细胞进行富集，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在一些实施方案中，不将经富集CD8+ T细胞组合物与重组IL-7一起孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-15，例如人重组IL-15一起孵育，所述重组IL-15的浓度在0.1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间或在10IU/ml与100IU/ml之间。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与重组IL-15一起孵育，所述重组IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml或50IU/ml。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml重组IL-15中孵育。在一些实施方案中，将与重组IL-15一起孵育的所述组合物针对T细胞(例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，所述T细胞群是CD4+ T细胞群。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+T细胞进行富集，其中CD4+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+ T细胞进行富集，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在一些实施方案中，与重组IL-15一起孵育的经富集CD4+T细胞组合物也可以与重组IL-7和/或重组IL-2如以所述量一起孵育。在一些实施方案中，与重组IL-15一起孵育的经富集CD8+ T细胞组合物也可以与重组IL-2如以所述量一起孵育。
在特定实施方案中，将所述细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)在一种或多种抗氧化剂的存在下与所述刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于，一种或多种抗氧化剂包括生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-二甲酸)、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、类黄酮、异黄酮、番茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素(luetin)、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、柠檬酸、L-肉碱、BHT、硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽(gluthatione)、胱胺和胱硫醚(cysstathionine)和/或甘氨酸-甘氨酸-组氨酸。在一些方面，所述经富集T细胞组合物(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+T细胞)与抗氧化剂一起孵育还包括刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)和一种或多种重组细胞因子(如所述的)的存在。
在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫氧化剂。在某些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括含硫醇抗氧化剂和/或例如在环结构内展现出一个或多个硫部分的抗氧化剂。在一些实施方案中，所述含硫抗氧化剂可以包括例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和2,3-二巯基丙醇(DMP)、L-2-氧代-4-噻唑烷甲酸酯(OTC)和硫辛酸。在特定实施方案中，所述含硫抗氧化剂是谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽前体是可以在细胞内的一个或多个步骤中被修饰成衍生的谷胱甘肽的分子。在特定实施方案中，谷胱甘肽前体可以包括但不限于N-乙酰半胱氨酸(NAC)、L-2-氧代噻唑烷-4-甲酸(丙半胱氨酸(Procysteine))、硫辛酸、S-烯丙基半胱氨酸或甲基甲硫氨酸锍氯化物。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育所述细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)包括在一种或多种抗氧化剂的存在下孵育所述细胞。在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下用所述刺激试剂刺激所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1 500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的所述一种或多种抗氧化剂的存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的所述一种或多种抗氧化剂的存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫抗氧化剂。在特定实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括谷胱甘肽前体。
在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，在刺激条件下孵育所述细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)包括在NAC的存在下孵育所述细胞。在特定实施方案中，在NAC的存在下用所述刺激试剂刺激所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1-500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的NAC的存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的NAC的存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，用或用约0.8mg/ml孵育所述细胞。
在特定实施方案中，如与在不存在抗氧化剂的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物减少了细胞中的激活。在某些实施方案中，所述降低的激活通过细胞中一种或多种激活标记的表达来测量。在某些实施方案中，激活标记包括但不限于增加的细胞内复杂性(例如，如通过测量侧向散射(SSC)确定的)、增加的细胞大小(例如，如通过测量细胞直径和/或前向散射(FSC)确定的)、增加的CD27表达和/或减少的CD25表达。在一些实施方案中，当在孵育、工程化、转导、转染、扩增或配制期间或之后，或在孵育后进行的所述过程的任何阶段期间或之后进行检查时，所述组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。在一些实施方案中，在所述过程完成后，所述组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。
在一些实施方案中，将流式细胞术用于确定细胞的相对大小。在特定实施方案中，将FSC和SSC参数用于分析细胞以及基于大小和内部复杂性将细胞彼此区分。在特定实施方案中，可以测量已知大小的颗粒或珠作为确定细胞实际大小的标准。在一些实施方案中，将流式细胞术与染色剂例如标记的抗体组合使用，以测量或定量表面蛋白(如激活标记，例如CD25或CD27)的表达。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，细胞直径减少至少0.25μm、0.5μm、0.75μm、1.0μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm或超过5μm。在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，如通过FSC测量的细胞大小减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，如通过SSC测量的细胞内复杂性减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，例如如通过流式细胞术测量的CD27表达降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在某些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，例如如通过流式细胞术测量的CD25表达增加至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物增加了例如在如第I-D节中所述的孵育或培育步骤或阶段期间的扩增。在一些实施方案中，经富集细胞的组合物在开始培育的14天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天内或3天内实现了2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、或大于10倍的扩增。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下孵育所述经富集T细胞的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的经培育细胞相比，所述组合物的细胞在培育期间经历快至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍的扩增速率。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物减少了细胞死亡(例如因细胞凋亡所致)的量。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞的组合物，并且在完成孵育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的细胞存活，例如未经历细胞凋亡。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述组合物，并且与经历其中未将细胞在一种或多种抗氧化剂的存在下孵育的示例性和/或替代性过程的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，半胱天冬酶表达，例如半胱天冬酶3表达降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施方案中，在如所述的刺激条件或刺激试剂的存在下孵育所述组合物或细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)。此类条件包括设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。示例性刺激试剂(如抗CD3/抗CD28磁珠)在下文描述。与刺激试剂一起孵育还可以在一种或多种刺激细胞因子的存在下，如在重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15中的一种或多种的存在下，和/或在至少一种抗氧化剂如NAC存在下进行，如上文所述。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞的组合物在刺激条件下与刺激剂(即重组IL-2、重组IL-7、重组IL-15)和NAC如以如所述量一起孵育。在一些实施方案中，将经富集CD8+T细胞的组合物在刺激条件下与刺激剂(即重组IL-2、重组IL-15)和NAC如以如所述量一起孵育。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下中的一种或多种：特定介质、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计用于激活细胞的药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂存在下进行的孵育的至少一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。
在一些实施方案中，将所述刺激剂以一定的量添加至室空腔中的细胞，所述一定的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，对相同细胞数量或相同细胞体积实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现孵育例如约10mL至约200mL或约20mL至约125mL(如至少或至少约或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、105mL、110mL、115mL、120mL、125mL、130mL、135mL、140mL、145mL、150mL、160mL、170mL、180mL、190mL、或200mL)试剂的目标体积。在一些实施方案中，在添加细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将所述孵育缓冲液和刺激剂单独添加至所述细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，所述孵育通常在混合条件下进行，如在旋转的存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF是从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间、18小时与30小时之间、或12小时与24小时之间，如为至少或为至少约或为约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行如下时间：在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间并包含端值。
在一些实施方案中，在用于例如通过转导和/或转染将多核苷酸例如编码重组受体的多核苷酸引入细胞中的步骤(如通过第I-C节所述)之前和/或期间，在刺激条件下培养、培育和/或孵育所述细胞。在某些实施方案中，在基因工程化之前将所述细胞在刺激条件下培养、培育和/或孵育如下时间量：在30分钟与2小时之间、在1小时与8小时之间、在1小时与6小时之间、在6小时与12小时之间、在12小时与18小时之间、在16小时与24小时之间、在12小时与36小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时之间和在1天与7天之间、在3天与8天之间、在1天与3天之间、在4天与6天之间或在4天与5天之间。在一些实施方案中，在工程化之前将所述细胞孵育2天或约2天。
在某些实施方案中，在基因工程化细胞之前和/或期间将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育。在某些实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育如下时间量：在12小时与36小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时之间和在2天与7天之间、在3天与8天之间、在1天与8天之间、在4天与6天之间或在4天与5天之间。在特定实施方案中，在基因工程化细胞之前和/或期间将所述细胞在刺激条件下培养、培育和/或孵育如下时间量：少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天，或如下时间量：少于168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时。在特定实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育4天、5天、6天或7天或约4天、5天、6天或7天。在一些实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育4天或约4天。在特定实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育5天或约5天。在某些实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育少于7天。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育细胞包括将细胞与在第II-B-1节中所述的刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，刺激试剂含有或包括珠，如顺磁珠，并且将细胞与刺激试剂以小于3:1(珠:细胞)的比率，如1:1的比率一起孵育。在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子和/或一种或多种抗氧化剂的存在下将所述细胞与所述刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，在重组IL-2、IL-7、IL-15和NAC的存在下将经富集CD4+ T细胞的组合物与所述刺激试剂以1:1(珠:细胞)的比率一起孵育。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-15和NAC的存在下将经富集CD8+ T细胞的组合物与所述刺激试剂以1:1(珠:细胞)的比率一起孵育。在一些实施方案中，在从开始或起始孵育起，例如从将刺激试剂添加至细胞或与细胞接触的时间起的6天、5天或4天时、6天、5天或4天内或约6天、5天或4天内，将所述刺激试剂从所述细胞去除和/或分离。
1.刺激试剂
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育经富集细胞的组合物是或包括使经富集细胞的组合物与能够激活和/或扩增T细胞的刺激试剂孵育和/或接触。在一些实施方案中，刺激试剂能够刺激和/或激活细胞中的一个或多个信号。在一些实施方案中，所述一个或多个信号由受体介导。在特定实施方案中，所述一个或多个信号是信号转导和/或第二信使(例如，cAMP和/或细胞内钙)的水平或量的变化，一种或多种细胞蛋白的量、细胞定位、构象、磷酸化、泛素化和/或截短的变化，和/或细胞活性(例如转录、翻译、蛋白降解、细胞形态、激活状态和/或细胞分裂)的变化，或与所述变化相关。在特定实施方案中，刺激试剂激活和/或能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，刺激试剂含有与能够激活和/或扩增细胞(例如，T细胞)的一种或多种药剂(例如，生物分子)缀合或连接的颗粒(例如，珠)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂结合至珠。在一些实施方案中，珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，珠对培养的细胞(例如培养的T细胞)是无毒的。在一些实施方案中，珠可以是能够以允许药剂与细胞之间相互作用的方式附着药剂的任何颗粒。
在一些实施方案中，刺激试剂含有能够激活和/或扩增细胞(例如T细胞)的一种或多种药剂，所述一种或多种药剂结合至或以其他方式附着至珠，例如结合至或附着于珠的表面。在某些实施方案中，珠是非细胞颗粒。在特定实施方案中，珠可以包括胶体颗粒、微球体、纳米颗粒、磁珠等。在一些实施方案中，珠是琼脂糖珠。在某些实施方案中，珠是琼脂糖凝胶珠。
在特定实施方案中，刺激试剂含有单分散的珠。在某些实施方案中，是单分散的珠包含彼此的直径标准偏差小于5％的尺寸分散体。
在一些实施方案中，珠含有一种或多种药剂，如与珠的表面偶联、缀合或连接(直接或间接)的药剂。在一些实施方案中，如本文设想的药剂可以包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(例如，酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质凝集素或对所希望的靶标具有亲和力的任何其他生物分子。在一些实施方案中，所希望的靶标是T细胞受体和/或T细胞受体的组分。在某些实施方案中，所需靶标是CD3。在某些实施方案中，所需靶标是T细胞共刺激分子，例如CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。所述一种或多种药剂可以通过在本领域中已知和可用的各种方法直接或间接附着至珠上。所述附着可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种附着手段(包括例如化学手段、机械手段或酶促手段)来实现。在一些实施方案中，生物分子(例如，生物素化的抗CD3抗体)可以经由直接附着至珠的另一种生物分子(例如，抗生物素抗体)间接附着至珠上。
在一些实施方案中，刺激试剂含有珠和直接与细胞表面上的大分子相互作用的一种或多种药剂。在某些实施方案中，所述珠(例如顺磁珠)经由对细胞上的一种或多种大分子(例如一种或多种细胞表面蛋白)具有特异性的一种或多种药剂(例如抗体)与细胞相互作用。在某些实施方案中，将珠(例如顺磁珠)用本文所述的第一药剂(例如一抗(例如抗生物素抗体)或其他生物分子)标记，然后添加第二药剂(例如二抗(例如，生物素化的抗CD3抗体)或其他第二生物分子(例如，链霉亲和素)，由此所述二抗或其他第二生物分子与颗粒上的此类一抗或其他生物分子特异性结合。
在一些实施方案中，所述刺激试剂含有一种或多种药剂(例如抗体)，所述一种或多种药剂附着至珠(例如顺磁珠)并且与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性结合：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(例如，δ样1/4、Jagged 1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3或其片段，包括这些大分子的相应配体或其片段。在一些实施方案中，附着至珠的药剂(例如抗体)与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性结合：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。
在一些实施方案中，附着至珠的一种或多种药剂是抗体。所述抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。在一些实施方案中，所述刺激试剂是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。应当理解，任何同种型的恒定区都可以用于本文设想的抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可以从任何人或动物物种(例如，鼠物种)获得。在一些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别T细胞受体的一种或多种组分的抗体。在特定实施方案中，所述药剂是抗CD3抗体。在某些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别共受体的抗体。在一些实施方案中，所述刺激试剂包括抗CD28抗体。在一些实施方案中，珠具有大于约0.001μm、大于约0.01μm、大于约0.1μm、大于约1.0μm、大于约10μm、大于约50μm、大于约100μm、或大于约1000μm且不超过约1500μm的直径。在一些实施方案中，珠具有约1.0μm至约500μm、约1.0μm至约150μm、约1.0μm至约30μm、约1.0μm至约10μm、约1.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约5.0μm的直径。在一些实施方案中，珠具有约3μm至约5μm的直径。在一些实施方案中，珠具有至少或至少约或约0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、或20μm的直径。在某些实施方案中，珠具有为或约4.5μm的直径。在某些实施方案中，珠具有为或约2.8μm的直径。
在一些实施方案中，珠的密度大于0.001g/cm3、大于0.01g/cm3、大于0.05g/cm3、大于0.1g/cm3、大于0.5g/cm3、大于0.6g/cm3、大于0.7g/cm3、大于0.8g/cm3、大于0.9g/cm3、大于1g/cm3、大于1.1g/cm3、大于1.2g/cm3、大于1.3g/cm3、大于1.4g/cm3、大于1.5g/cm3、大于2g/cm3、大于3g/cm3、大于4g/cm3、或大于5g/cm3。在一些实施方案中，珠的密度在约0.001g/cm3与约100g/cm3之间、约0.01g/cm3与约50g/cm3之间、约0.1g/cm3与约10g/cm3之间、约0.1g/cm3与约.5g/cm3之间、约0.5g/cm3与约1g/cm3之间、约0.5g/cm3与约1.5g/cm3之间、约1g/cm3与约1.5g/cm3之间、约1g/cm3与约2g/cm3之间、或约1g/cm3与约5g/cm3之间。在一些实施方案中，珠的密度为约0.5g/cm3、约0.5g/cm3、约0.6g/cm3、约0.7g/cm3、约0.8g/cm3、约0.9g/cm3、约1.0g/cm3、约1.1g/cm3、约1.2g/cm3、约1.3g/cm3、约1.4g/cm3、约1.5g/cm3、约1.6g/cm3、约1.7g/cm3、约1.8g/cm3、约1.9g/cm3、或约2.0g/cm3。在某些实施方案中，珠的密度为约1.6g/cm3。在特定实施方案中，珠或颗粒的密度为约1.5g/cm3。在某些实施方案中，颗粒的密度为约1.3g/cm3。
在某些实施方案中，多个珠具有均匀的密度。在某些实施方案中，均匀的密度包含平均珠密度的小于10％、小于5％或小于1％的密度标准差。
在一些实施方案中，珠的表面积在约0.001m2/克颗粒(m2/g)至约1,000m2/g、约.010m2/g至约100m2/g、约0.1m2/g至约10m2/g、约0.1m2/g至约1m2/g、约1m2/g至约10m2/g、约10m2/g至约100m2/g、约0.5m2/g至约20m2/g、约0.5m2/g至约5m2/g或约1m2/g至约4m2/g之间。在一些实施方案中，颗粒或珠的表面积为约1m2/g至约4m2/g。
在一些实施方案中，珠在珠的表面处或附近含有可以与药剂偶联、连接或缀合的至少一种材料。在一些实施方案中，珠是表面官能化的，即包含能够与结合分子(例如，多核苷酸或多肽)形成共价键的官能团。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的羧基、氨基、羟基、甲苯磺酰基、环氧基和/或氯甲基。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的琼脂糖和/或琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，珠表面包含附着的刺激试剂，所述刺激试剂可以结合或附着结合分子。在特定实施方案中，生物分子是多肽。在一些实施方案中，珠包含表面暴露的蛋白质A、蛋白质G或生物素。
在一些实施方案中，珠在磁场中反应。在一些实施方案中，珠是磁珠。在一些实施方案中，磁珠是顺磁性的。在特定实施方案中，磁珠是超顺磁性的。在某些实施方案中，珠不显示任何磁性特性，除非它们暴露于磁场。
在特定实施方案中，珠包含磁核、顺磁核或超顺磁核。在一些实施方案中，磁核含有金属。在一些实施方案中，所述金属可以是但不限于铁、镍、铜、钴、钆、锰、钽、锌、锆或其任何组合。在某些实施方案中，磁核包含金属氧化物(例如，氧化铁)、铁氧体(例如，锰铁氧体、钴铁氧体、镍铁氧体等)、赤铁矿和金属合金(例如，CoTaZn)。在一些实施方案中，磁核包含铁氧体、金属、金属合金、氧化铁或二氧化铬中的一种或多种。在一些实施方案中，磁核包含元素铁或其化合物。在一些实施方案中，磁核包含磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3)或硫复铁矿(Fe3S4)中的一种或多种。在一些实施方案中，内核包含氧化铁(例如，Fe3O4)。
在某些实施方案中，珠含有被表面官能化涂层(coat或coating)覆盖的磁核、顺磁核和/或超顺磁核。在一些实施方案中，涂层可以含有如下材料：其可以包括但不限于聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳、琼脂糖、琼脂糖凝胶或其组合。在一些实施方案中，聚合物可以是聚乙二醇、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯或聚乙烯醇。在某些实施方案中，外包衣(coat或coating)包含聚苯乙烯。在特定实施方案中，外包衣是表面官能化的。
在一些实施方案中，刺激试剂包含珠，其含有金属氧化物核(例如，氧化铁核)和涂层，其中所述金属氧化物核包含至少一种多糖(例如，葡聚糖)，并且其中所述涂层包含至少一种多糖(例如，氨基葡聚糖)、至少一种聚合物(例如，聚氨酯)和二氧化硅。在一些实施方案中，金属氧化物核是胶体氧化铁核。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗生物素抗体。在一些实施方案中，珠具有约3μm至约10μm的直径。在一些实施方案中，珠具有约3μm至约5μm的直径。在某些实施方案中，珠的直径为约3.5μm。
在一些实施方案中，刺激试剂包含附着至珠的一种或多种药剂，所述珠包含金属氧化物核(例如，氧化铁内核)和涂层(例如，保护涂层)，其中所述涂层包含聚苯乙烯。在某些实施方案中，珠是单分散的顺磁(例如超顺磁)珠，其包含顺磁(例如超顺磁)铁核(例如，包含磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(γFe2O3)的核)和聚苯乙烯涂层(coat或coating)。在一些实施方案中，珠是无孔的。在一些实施方案中，珠含有所述一种或多种药剂附着的官能化表面。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂与珠在表面上共价结合。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，刺激试剂是或包括抗CD3/抗CD28磁珠。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和/或抗CD28抗体，以及能够与标记的抗体(例如，生物素化的抗体，如标记的抗CD3或抗CD28抗体)结合的抗体或其抗原片段。在某些实施方案中，珠具有约1.5g/cm3的密度和约1m2/g至约4m2/g的表面积。在特定实施方案中；珠是单分散的超顺磁珠，其具有约4.5μm的直径和约1.5g/cm3的密度。在一些实施方案中，珠是具有约2.8μm的平均直径和约1.3g/cm3的密度的单分散的超顺磁珠。
在一些实施方案中，以为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1或0.2:1的珠与细胞的比率将经富集T细胞的组合物与刺激试剂一起孵育。在特定实施方案中，珠与细胞的比率为在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1:1。
2.从细胞中去除刺激试剂
在某些实施方案中，将刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)从细胞中去除和/或分离。在不希望受理论束缚的情况下，特定实施方案设想到，在一些情况下，在孵育期间，刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合可能随着时间而减少。在某些实施方案中，可以添加一种或多种药剂以减少刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合。在特定实施方案中，细胞培养条件(例如培养基温度或pH)的改变可以减少刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合。因此，在一些实施方案中，可以将刺激试剂与细胞分开地从孵育、细胞培养系统和/或溶液中去除，例如不会将细胞也从孵育、细胞培养系统和/或溶液中去除。
从细胞中去除刺激试剂(例如，为或含有颗粒如珠颗粒或可磁化颗粒的刺激试剂)的方法是已知的。在一些实施方案中，可以使用竞争性抗体(如未标记的抗体)的使用，其例如与刺激试剂的一抗结合，并改变所述一抗对细胞上其抗原的亲和力，从而允许温和脱附。在一些情况下，在脱附之后，竞争性抗体可以保持与颗粒(例如，珠颗粒)缔合，而未反应的抗体被洗掉或可以被洗掉，并且细胞不含分离、选择、富集和/或激活抗体。这种试剂的例子是DETACaBEAD(Friedl等人1995；Entschladen等人1997)。在一些实施方案中，可以在可切割接头(例如，DNA接头)的存在下除去颗粒(例如，珠颗粒)，由此使颗粒结合的抗体缀合至接头(例如，CELLection、Dynal)。在一些情况下，接头区提供了可切割位点，以在分离之后例如通过添加DNase或其他释放缓冲液从细胞中除去颗粒(例如，珠颗粒)。在一些实施方案中，还可以采用其他酶促方法从细胞中释放颗粒(例如，珠颗粒)。在一些实施方案中，颗粒(例如，珠颗粒或可磁化颗粒)是可生物降解的。
在一些实施方案中，所述刺激试剂是磁性的、顺磁性的和/或超顺磁性的，和/或含有磁珠、顺磁珠和/或超顺磁珠，并且可以通过将细胞暴露于磁场来将刺激试剂从细胞中去除。含有用于产生磁场的磁体的合适设备的例子包括DynaMag CTS(Thermo Fisher)、磁分离器(Takara)和EasySep磁体(Stem Cell Technologies)。
在特定实施方案中，在完成所提供的方法之前，例如在收获、收集和/或配制通过本文提供的方法产生的工程化细胞之前，将刺激试剂从细胞中去除或分离。在一些实施方案中，在工程化(例如转导或转染)细胞之前，将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在特定实施方案中，在工程化细胞的步骤之后，将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在培育细胞之前，例如，在促进增殖和/或扩增的条件下培育经工程化，例如经转染或转导的细胞之前，将刺激试剂去除。
在某些实施方案中，在一定时间量后将刺激试剂从细胞分离和/或去除。在特定实施方案中，所述时间量是从在刺激条件下开始和/或起始孵育起的时间量。在特定实施方案中，孵育的开始被认为是在或约在细胞与刺激试剂和/或含有刺激试剂的培养基或溶液接触的时候。在特定实施方案中，在开始或起始孵育后10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内或者约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内将刺激试剂从细胞中去除或分离。在特定实施方案中，在开始或起始孵育后9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天或者约9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在开始或起始孵育后168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时或者约168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在特定实施方案中，在开始和/或起始孵育后5天或约5天时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在一些实施方案中，在开始和/或起始孵育后4天或约4天时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。
C.工程化细胞
在一些实施方案中，所提供的方法涉及向患有疾病或病症的受试者施用表达重组抗原受体的细胞。用于引入基因工程化组分例如重组受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。
表达受体并通过所提供的方法施用的细胞包括工程化细胞。基因工程通常涉及将编码重组或工程化组分的核酸引入含有细胞的组合物中，如通过逆转录病毒转导、转染或转化。
在一些实施方案中，本文所提供的方法与工程化经富集T细胞的一种或多种组合物结合使用。在某些实施方案中，工程化是或包括引入多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸。在特定实施方案中，重组蛋白是重组受体，如第III节中描述的任何受体。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。在一些实施方案中，工程化产生经富集T细胞的一种或多种工程化组合物。
在某些实施方案中，在如通过第II-D节中提供的方法例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞之前，将经富集T细胞的一种或多种组合物工程化，例如转导或转染。在特定实施方案中，在所述一种或多种组合物已经在刺激条件(如在第II-B节中提供的方法中所述)下被刺激、激活和/或孵育之后，将经富集T细胞的一种或多种组合物工程化。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是经刺激组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种经刺激组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在工程化之前解冻。
在某些实施方案中，所述经刺激T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独的经刺激组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，已从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别工程化。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的两种单独组合物如在如上所述的刺激条件下孵育之后分别基因工程化。在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物基因工程化。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在工程化之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD4+ T细胞(如经刺激CD4+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD4+ T细胞(如经刺激CD4+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD8+ T细胞(如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD8+ T细胞(如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且进行基因工程化，例如转导或转染。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成基因工程化之后将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独工程化组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独组合物(如经刺激CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)分别工程化，并且在已经进行和/或完成基因工程化之后分别处理以进行T细胞的培育和/或扩增。
在一些实施方案中，多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸的引入通过使经富集CD4+或CD8+ T细胞(如经刺激CD4+或CD8+ T细胞)与含有所述多核苷酸的病毒颗粒接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(spinoculation)(例如离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从100g至3200g或从约100g至约3200g(例如，为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)，如为或为约693g的力(例如，相对离心力)来进行，所述力如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。在一些实施方案中，所述细胞(例如来自经富集CD4+ T细胞或经富集CD8+ T细胞的经刺激组合物的细胞)与病毒进行的接触、孵育和/或工程化的至少一部分在约100g与3200g、1000g与2000g、1000g与3200g、500g与1000g、400g与1200g、600g与800g、600g与700g或500g与700g之间的旋转下进行。在一些实施方案中，旋转在600g与700g之间，例如在或在约693g下进行。
在某些实施方案中，所述工程化、转导和/或转染的至少一部分在旋转，例如旋转接种和/或离心下进行。在一些实施方案中，将旋转进行、进行约、或进行至少或至少约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、1形式、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、2天、3天、4天、5天、6天，或进行至少7天。在一些实施方案中，将旋转进行或进行约60分钟。在某些实施方案中，将旋转进行约30分钟。在一些实施方案中，将旋转在600g至700g之间，例如在或在约693g下进行约30分钟。
在某些实施方案中，待工程化、转导和/或转染的活细胞的数量的范围为从约5x106个细胞至约100x107个细胞，如从约10x106个细胞至约100x106个细胞、从约100x106个细胞至约200x106个细胞、从约200x106个细胞至约300x106个细胞、从约300x106个细胞至约400x106个细胞、从约400x106个细胞至约500x106个细胞或从约500x106个细胞至约100x107个细胞。在特定例子中，待工程化、转导和/或转染的活细胞的数量为约或少于约300x106个细胞。
在某些实施例中，所述工程化、转导和/或转染的至少一部分在如下体积(例如，旋转接种体积)下进行，所述体积从约5mL至约100mL，如从约10mL至约50mL、从约15mL至约45mL、从约20mL至约40mL、从约25mL至约35mL，或为或为约30mL。在某些实施方案中，旋转接种后的细胞团粒体积的范围为从约1mL至约25mL，如从约5mL至约20mL、从约5mL至约15mL、从约5mL至约10mL，或为或为约10mL。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。在某些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先将细胞在刺激条件下孵育，如通过第II-B节中所述的方法中的任一种。
在一些实施方案中，用于基因工程化的方法通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(例如，离心接种)来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
和
2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统以及处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中所述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，所述容器(如袋子)包括一个或多个容器(例如袋子)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋子或单独袋子)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统进一步包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他处理步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，在将组合物提供至空腔之前，可以将含有细胞的组合物和含有病毒载体颗粒的组合物以及任选的空气合并或混合。在一些实施方案中，将含有细胞的组合物和含有病毒载体颗粒的组合物以及任选的空气分别提供在空腔中并且在其中合并和混合。在一些实施方案中，可以以任何顺序将含有细胞的组合物、含有病毒载体颗粒的组合物和任选的空气提供至内部空腔。在此类一些实施方案中的任一种中，含有细胞和病毒载体颗粒的组合物是曾经合并或混合在一起的输入组合物，不论所述输入组合物是在离心室内部还是外部合并和/或混合，和/或不论细胞和病毒载体颗粒是一起还是分别(如同时还是依序)提供至离心室。
在一些实施方案中，在转导方法中，在孵育细胞和病毒载体颗粒(如旋转)之前进行一定体积的气体(如空气)的摄入。在一些实施方案中，在转导方法中在细胞和病毒载体颗粒的孵育(如旋转)期间进行一定体积的气体(如空气)的摄入。
在一些实施方案中，构成转导组合物的细胞或病毒载体颗粒的液体体积、以及任选地空气的体积可以是预定体积。所述体积可以是被编程到系统中和/或由与所述系统相关联的电路控制的体积。
在一些实施方案中，手动、半自动和/或自动地控制转导组合物和任选地气体(如空气)的摄入，直到已经将所需或预定的体积摄入室的内部空腔中为止。在一些实施方案中，与系统相关的传感器可以例如经由其颜色、流速和/或密度来检测流入和流出离心室的液体和/或气体，并且可以与相关电路通信以按照需要停止或继续摄入，直到已经实现这种所需或预定体积的摄入为止。在一些方面，可以使被编程或仅能够检测系统中的液体而非气体(例如空气)的传感器能够在不停止摄入的情况下允许气体(如空气)通过进入系统中。在一些此类实施方案中，当需要气体(如空气)摄入时，可以将一条不透明的管道放置在传感器附近的线中。在一些实施方案中，可以手动地控制气体(如空气)的摄入。
在所提供的方法的方面，使离心室的内部空腔经历高速旋转。在一些实施方案中，在液体输入组合物和任选地空气的摄入之前、同时、之后或间歇地实现旋转。在一些实施方案中，在液体输入组合物和任选地空气的摄入之后实现旋转。在一些实施方案中，旋转是通过在内部空腔的侧壁的内表面和/或在细胞的表面层处的为或约或至少或至少约800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3500g或4000g的相对离心力对离心室的离心进行。在一些实施方案中，旋转是通过大于或约1100g，例如通过大于或约1200g、大于或约1400g、大于或约1600g、大于或约1800g、大于或约2000g、大于或约2400g、大于或约2800g、大于或约3000g或大于或约3200g的力的离心进行。在一些实施方案中，旋转是通过为或为约1600g的力的离心进行。
在一些实施方案中，转导方法包括在离心室中将转导组合物和任选地空气旋转或离心，持续大于或约5分钟，例如大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟。在一些实施方案中，将转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心，持续大于5分钟，但持续不超过60分钟、不超过45分钟、不超过30分钟或不超过15分钟。在特定实施方案中，转导包括旋转或离心持续或持续约60分钟。
在一些实施方案中，所述转导方法包括使转导组合物和任选的空气在离心室中旋转或离心以下时间：在或在约10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值，并且所述旋转或离心是以至少或大于或约1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200g或3600g的内部空腔侧壁内表面处和/或细胞表层处的力来进行的。在特定实施方案中，所述转导方法包括使转导组合物(例如，细胞和病毒载体颗粒)以1600g或约1600g旋转或离心60分钟或约60分钟。
在一些实施方案中，将室的空腔中的气体(如空气)从室中排出。在一些实施方案中，将气体(如空气)排出到容器，所述容器作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接。在一些实施方案中，容器是自由或空的容器。在一些实施方案中，室的空腔中的空气(如气体)通过过滤器排出，所述过滤器经由无菌管组线与室的内部空腔可操作地连接。在一些实施方案中，使用手动、半自动或自动过程排出空气。在一些实施方案中，在从室的空腔中输送(express)含有孵育的细胞和病毒载体颗粒(例如已经开始转导的细胞或已经用病毒载体转导的细胞)的输出组合物之前、同时、间歇或随后将空气从空腔排出。
在一些实施方案中，转导和/或其他孵育作为连续或半连续过程或作为所述连续或半连续过程的一部分进行。在一些实施方案中，连续过程涉及连续摄入细胞和病毒载体颗粒，例如转导组合物(作为单一预先存在的组合物，或者通过连续抽入同一容器(例如空腔)中，从而混合其部分)，和/或在孵育的至少一部分期间(例如，在离心的同时)，从容器中连续输送或排出液体，以及任选地排出气体(例如空气)。在一些实施方案中，至少部分同时进行连续摄入和连续输送。在一些实施方案中，连续摄入发生在部分孵育期间，例如在部分离心期间，并且连续输送发生在孵育的单独部分期间。两者可以交替进行。因此，在进行孵育的同时，连续摄入和输送可以允许处理(例如转导)总体积更大的样品。
在一些实施方案中，孵育是连续过程的一部分，所述方法包括在孵育的至少一部分期间，实现在室旋转期间以及在孵育的一部分期间将所述转导组合物连续摄入空腔中，实现在室的旋转期间通过所述至少一个开口自空腔连续输送液体并任选地排出气体(例如空气)。
在一些实施方案中，通过在以下步骤之间交替来进行半连续孵育：实现将组合物摄入空腔中，孵育，自空腔输送液体和任选地自空腔排出气体(例如空气)，如到输出容器，然后摄入含有更多细胞和用于处理的其他试剂(例如，病毒载体颗粒)的随后的(例如第二、第三等)组合物，并重复所述过程。例如，在一些实施方案中，孵育是半连续过程的一部分，所述方法包括在孵育之前，实现将转导组合物通过至少一个开口摄入空腔中，及在孵育之后，实现自空腔输送流体；实现将包含细胞和病毒载体颗粒的另一转导组合物摄入内部空腔中；以及在所述内部空腔中在一定条件下孵育另一转导组合物，由此使所述另一转导组合物中的细胞被所述载体转导。所述过程能以迭代的方式继续进行许多另外的回合。在此方面，半连续或连续方法可以允许产生甚至更大体积和/或数量的细胞。
在一些实施方案中，转导孵育的一部分在离心室中进行，其在包括旋转或离心的条件下进行。
在一些实施方案中，所述方法包括孵育，其中细胞和病毒载体颗粒的孵育的另一部分在无旋转或离心的情况下进行，所述另一部分一般在孵育的包括室的旋转或离心的所述至少一部分之后进行。在某些实施方案中，细胞和病毒载体颗粒的孵育在无旋转或离心的情况下进行至少1小时、6小时、12小时、24小时、32小时、48小时、60小时、72小时、90小时、96小时、3天、4天、5天或大于5天。在某些实施方案中，将孵育72小时或约72小时。
在一些此类实施方案中，进一步孵育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。评估或确定孵育是否已经导致病毒载体颗粒整合到宿主基因组中，并且因此凭经验确定进一步孵育的条件是在技术人员的水平内。在一些实施方案中，可以通过测量在孵育后由病毒载体颗粒基因组中含有的核酸编码的重组蛋白(如异源蛋白)的表达水平来评估病毒载体在宿主基因组中的整合。可以使用多种熟知方法来评价重组分子的表达水平，例如在细胞表面蛋白的情况下，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测，例如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记和/或报告物构建体来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其表达和/或增强的标记。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、载体(例如病毒颗粒)和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从100g至3200g或从约100g至约3200g(例如为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，所述力如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在一些实施方案中，在基因工程的至少一部分(例如转导)期间，和/或在基因工程之后，将细胞转移到生物反应器袋组件中，用于培养经基因工程化的细胞，例如用于培育或扩增细胞，如上所述。
在某些实施方案中，在转导佐剂的存在下工程化，例如转导或转染经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下工程化经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种转导佐剂的存在下转导，例如与病毒载体颗粒一起孵育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，在一种或多种转导佐剂的存在下转染，例如与非病毒载体一起孵育经富集T细胞的组合物。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在诸如通过增加组合物中工程化(例如，转导或转染)的细胞的量、部分和/或百分比来增加基因递送的效率。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在增加了转染的效率。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在增加了转导的效率。在特定实施方案中，在聚阳离子的存在下工程化的细胞的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％含有或表达重组多核苷酸。在一些实施方案中，与在不存在转导佐剂的情况下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在聚阳离子的存在下，组合物中多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的细胞被工程化为含有或表达重组转导佐剂。
在一些实施方案中，在小于100μg/ml、小于90μg/ml、小于80μg/ml、小于75μg/ml、小于70μg/ml、小于60μg/ml、小于50μg/ml、小于40μg/ml、小于30μg/ml、小于25μg/ml、小于20μg/ml或小于μg/ml、小于10μg/ml的转导佐剂的存在下工程化经富集细胞的组合物。在某些实施方案中，适用于所提供的方法的转导佐剂包括但不限于聚阳离子、纤连蛋白或源自纤连蛋白的片段或变体、RetroNectin及其组合。
在一些实施方案中，在细胞因子，例如重组人细胞因子的存在下工程化所述细胞，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与1,000IU/ml之间、在10IU/ml与50IU/ml之间、在50IU/ml与100IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与1,000IU/ml之间。
在一些实施方案中，在IL-2，例如人重组IL-2的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述IL-2的浓度在1IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与150IU/ml之间、在80IU/ml与120IU/ml之间、在60IU/ml与90IU/ml之间或在70IU/ml与90IU/ml之间。在特定实施方案中，在重组IL-2的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-2的浓度为或为约50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml、75IU/ml、80IU/ml、85IU/ml、90IU/ml、95IU/ml、100IU/ml、110IU/ml、120IU/ml、130IU/ml、140IU/ml或150IU/ml。在一些实施方案中，在或在约85IU/ml的存在下工程化所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述T细胞群是CD4+ T细胞群。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+ T细胞进行富集，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+ T细胞进行富集，其中CD4+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，在重组IL-7，例如人重组IL-7的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-7的浓度在100IU/ml与2,000IU/ml之间、在500IU/ml与1,000IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在500IU/ml与750IU/ml之间、在750IU/ml与1,000IU/ml之间或在550IU/ml与650IU/ml之间。在特定实施方案中，在IL-7的存在下工程化所述经富集T细胞的组合物，所述IL-7的浓度为或为约50IU/ml、100IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml、450IU/ml、500IU/ml、550IU/ml、600IU/ml、650IU/ml、700IU/ml、750IU/ml、800IU/ml、750IU/ml、750IU/ml、750IU/ml或1,000IU/ml。在特定实施方案中，在或在约600IU/ml的IL-7的存在下工程化所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，将在重组IL-7的存在下工程化的组合物针对T细胞(例如CD4+ T细胞)的群体进行富集。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+ T细胞进行富集，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，在重组IL-15，例如人重组IL-15的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-15的浓度在0.1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间、或在10IU/ml与100IU/ml之间。在特定实施方案中，在IL-15的存在下工程化所述经富集T细胞的组合物，所述IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml或50IU/ml。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml IL-15中工程化。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml重组IL-15中孵育。在一些实施方案中，将在重组IL-15的存在下工程化的组合物针对T细胞(例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+ T细胞进行富集，其中CD4+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+ T细胞进行富集，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15的存在下工程化经富集CD8+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下工程化经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于，一种或多种抗氧化剂包括生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-二甲酸)、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、类黄酮、异黄酮、番茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、柠檬酸、L-肉碱、BHT、硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱胺和胱硫醚和/或甘氨酸-甘氨酸-组氨酸。
在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫氧化剂。在某些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括含硫醇抗氧化剂和/或例如在环结构内展现出一个或多个硫部分的抗氧化剂。在一些实施方案中，所述含硫抗氧化剂可以包括例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和2,3-二巯基丙醇(DMP)、L-2-氧代-4-噻唑烷甲酸酯(OTC)和硫辛酸。在特定实施方案中，所述含硫抗氧化剂是谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽前体是可以在细胞内的一个或多个步骤中被修饰成衍生的谷胱甘肽的分子。在特定实施方案中，谷胱甘肽前体可以包括但不限于N-乙酰半胱氨酸(NAC)、L-2-氧代噻唑烷-4-甲酸(丙半胱氨酸(Procysteine))、硫辛酸、S-烯丙基半胱氨酸或甲基甲硫氨酸锍氯化物。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1 500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的所述一种或多种抗氧化剂的存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的所述一种或多种抗氧化剂的存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫抗氧化剂。在特定实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括谷胱甘肽前体。
在一些实施方案中，在NAC的存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1,500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的NAC的存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的NAC的存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，用或用约0.8mg/ml工程化所述细胞。
在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下工程化经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下转导，例如与病毒载体颗粒一起孵育经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下用非病毒载体转染(例如与非病毒载体一起孵育)经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在诸如通过增加组合物中工程化(例如，转导或转染)的细胞的量、部分和/或百分比来增加基因递送的效率。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在增加了转染的效率。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在增加了转导的效率。在特定实施方案中，在聚阳离子的存在下工程化的细胞的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％含有或表达重组多核苷酸。在一些实施方案中，与在不存在转导佐剂的情况下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在聚阳离子的存在下，组合物中多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的细胞被工程化为含有或表达重组多核苷酸。
在某些实施方案中，例如，相对于在聚阴离子的存在下工程化细胞的示例性和/或替代性方法，在低浓度或量的聚阳离子的存在下工程化所述经富集细胞的组合物，例如经富集CD4+ T细胞或经富集CD8+ T细胞(如其经刺激T细胞)的组合物。在某些实施方案中，在小于90％、小于80％、小于75％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％的用于工程化细胞的示例性和/或替代性方法的聚阳离子的量或浓度的存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，在小于100μg/ml、小于90μg/ml、小于80μg/ml、小于75μg/ml、小于70μg/ml、小于60μg/ml、小于50μg/ml、小于40μg/ml、小于30μg/ml、小于25μg/ml、小于20μg/ml或小于μg/ml、小于10μg/ml的所述聚阳离子的存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在为或为约1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml或50μg/ml的所述聚阳离子的存在下工程化所述经富集细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，在聚阳离子的存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物减少了细胞死亡(例如因坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡所致)的量。在一些实施方案中，在低量聚阳离子(例如小于100μg/ml、50μg/ml或10μg/ml)的存在下工程化所述经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物，并且在完成工程化步骤后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的细胞存活，例如未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在一些实施方案中，与在较高量或浓度的聚阳离子(例如，超过50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml或1,000μg/ml)的存在下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在低浓度或量的聚阳离子的存在下工程化所述组合物，并且与经历所述示例性和/或替代性过程的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在一些实施方案中，所述聚阳离子带正电荷。在某些实施方案中，所述聚阳离子降低细胞与载体(例如病毒或非病毒载体)之间的斥力，并且介导载体与细胞表面的接触和/或结合。在一些实施方案中，所述聚阳离子是聚凝胺、DEAE-葡聚糖、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸或阳离子脂质体。
在特定实施方案中，所述聚阳离子是硫酸鱼精蛋白。在一些实施方案中，在小于或约500μg/ml、小于或约400μg/ml、小于或约300μg/ml、小于或约200μg/ml、小于或约150μg/ml、小于或约100μg/ml、小于或约90μg/ml、小于或约80μg/ml、小于或约75μg/ml、小于或约70μg/ml、小于或约60μg/ml、小于或约50μg/ml、小于或约40μg/ml、小于或约30μg/ml、小于或约25μg/ml、小于或约20μg/ml或小于或约15μg/ml或小于或约10μg/ml的硫酸鱼精蛋白的存在下工程化所述经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在为或为约1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml或150μg/ml的硫酸鱼精蛋白的存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。
在一些实施方案中，所述经富集CD4+ T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞)的工程化组合物包含至少40％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的所述经富集CD4+ T细胞，如经刺激T细胞(如经刺激CD4+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，经工程化的所述经富集CD8+ T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的所述经富集CD8+ T细胞，如经刺激T细胞(如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将细胞工程化包括与载体(例如病毒载体或非病毒载体)一起培养、接触或一起孵育。在某些实施方案中，所述工程化包括将细胞与载体一起培养、接触和/或孵育，进行、进行约或进行至少4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或超过7天。在特定实施方案中，所述工程化包括将细胞与载体一起培养、接触和/或孵育，持续或持续约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或84小时，或持续或持续约2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，将所述工程化步骤进行或进行约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或84小时。在某些实施方案中，将所述工程化进行约60小时或约84小时，进行或进行约72小时，或进行或进行约2天。
在一些实施方案中，所述工程化是在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃、从约36℃至约38℃，或为或为约37℃±2℃的温度下进行。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或为约5％±0.5％的CO2水平下工程化。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在为或为约37℃的温度下和/或在为或为约5％的CO2水平下工程化。
在一些实施方案中，在进行用于基因工程化例如转导或转染细胞(例如CD4+和/或CD8+ T细胞)以含有编码重组受体的多核苷酸的一个或多个步骤之后，培育所述细胞。在一些实施方案中，培育可以包括培养、孵育、刺激、激活、扩增和/或繁殖。在一些此类实施方案中，进一步培育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。
在一些实施方案中，进一步孵育是在高于室温的温度下进行，所述温度为例如高于或高于约25℃，例如通常高于或高于约32℃、35℃或37℃。在一些实施方案中，进一步孵育是在为或为约37℃±2℃的温度下，例如在为或为约37℃的温度下实现。
在一些实施方案中，进一步孵育是在用于刺激和/或激活细胞的条件下进行，所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如刺激性和/或辅助性药剂)，例如配体。在一些方面，所述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联，例如是适于递送初级信号以例如启动ITAM诱导的信号(例如对TCR组分具有特异性的那些)的激活的药剂，和/或促进共刺激信号(例如对T细胞共刺激受体具有特异性的共刺激信号)的药剂，例如抗CD3、抗CD28或抗41-BB(例如，其任选地结合至固体支持物如珠)和/或一种或多种细胞因子。所述刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如，
M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器和/或
珠)。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂，例如配体。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支持物(如珠)的抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和旨在激活细胞的任何其他药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，进一步孵育是在进行接触的相同容器或设备中进行。在一些实施方案中，进一步孵育是在没有旋转或离心的情况下进行，这通常是在旋转下(例如与离心或旋转接种结合)进行的孵育的所述至少一部分之后进行。在一些实施方案中，进一步孵育是在固定相之外进行，例如在色谱基质之外、例如在溶液中进行。
在一些实施方案中，进一步孵育是在与进行接触的容器或设备不同的容器或设备中进行，例如通过将细胞组合物在与病毒颗粒和试剂接触之后转移(例如自动转移)至不同的容器或设备中。
在一些实施方案中，进一步培养或孵育例如以促进离体扩增进行大于或大于约24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，进一步培养或孵育进行不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天或不超过24小时。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，如至少或约至少或约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行如下时间：在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间并包含端值。
在一些实施方案中，本文所提供的方法不包括进一步培养或孵育，例如，不包括离体扩增步骤，或者包括显著更短的离体扩增步骤。
在一些实施方案中，在工程化之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在特定实施方案中，在工程化之后将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在工程化之后并且在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，所述刺激试剂是在第II-B-1节中所述的刺激试剂。在特定实施方案中，如第II-B-2节中所述将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。
1.载体和方法
还提供了编码重组受体的一种或多种多核苷酸(例如，核酸分子)、用于根据所提供的用于产生所述工程化细胞的方法将细胞基因工程化以表达此类受体的载体。在一些实施方案中，载体含有编码重组受体的核酸。在特定实施方案中，载体是病毒载体、非病毒载体。在一些情况下，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:10中所示并且由SEQID NO:9中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽、SEQ ID NO:11中所示的CD8α信号肽或SEQ ID NO:12中所示的CD33信号肽。
在一些实施方案中，所述载体包括病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子，例如睡美人转座子系统；源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，源自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体或非病毒DNA含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，所述异源重组分子是或包括重组受体(例如抗原受体)、SB转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如用于基因组重组)或报告基因(例如荧光蛋白，如GFP)或萤光素酶。
a.病毒载体颗粒
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(如抗原受体，如CAR)的异源核酸被包含在和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可以用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将此缺失转移到原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被拷贝到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在经转导细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录之后产生的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系中回收的病毒的滴度。还可以包括增强子序列。可以使用增加病毒RNA基因组在包装细胞系中的表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合型载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如使一个或两个附接位点突变或缺失来防止整合，或者通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径；这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些方法并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述方法。例如，整合酶和附接位点两者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体还可以含有这样的基因，其表达赋予可检测或可选择标记，如抗药性。
所述病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因递送系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分之一或两者时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或Tat(HIV的主要反式激活因子))。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了所述一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并且在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用含有产生颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目标序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性、多嗜性或双嗜性包膜，如辛德比斯病毒包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有重组慢病毒载体，可以回收并滴定所述重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
在一些实施方案中，组合物中待转导的细胞的浓度为从1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL或从约1.0x105个细胞/mL至约1.0x108个细胞/mL，如止水或约至少或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。
在一些实施方案中，病毒颗粒是以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU)与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒在接触期间是以为或约或至少为或至少约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x106IU/mL与1x108IU/mL之间，如在或在约5x106IU/mL与5x107IU/mL之间，如至少6x106IU/mL、7x106IU/mL、8x106IU/mL、9x106IU/mL、1x107IU/mL、2x107IU/mL、3x107IU/mL、4x107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100(如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小)的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或孵育。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少或约30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以如下体积接触：从0.5mL至500mL或从约0.5mL至约500mL，如从或从约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在某些实施方案中，用包含结合分子的颗粒对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，将细胞与病毒载体颗粒一起孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
b.非病毒载体
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，将重组核酸经由转座子转移到T细胞中。转座子(转座元件)是可以从基因组内的一个基因座移动到另一个基因座的DNA可移动区段。这些元件经由保守的“剪切粘贴”机制移动：转座酶催化转座子从其原始位置切除，并促进其在基因组中的其他位置的重新整合。如果转座酶是由另一个转座酶基因提供，则可以动员缺乏转座酶的元件。因此，可以将转座子用于将外来DNA掺入宿主基因组中而无需使用病毒转导系统。适合于与哺乳动物细胞(例如人原代白细胞)一起使用的转座子的例子包括但不限于睡美人(Sleeping Beauty)和PiggyBacs。
基于转座子的转染是由转座酶和转座子组成的两组分系统。在一些实施方案中，所述系统包含转座子，所述转座子被工程化以包含外来DNA(本文也称为货物DNA)(例如编码重组受体的基因)，其侧翼为由伴随的转座酶识别的反向重复/同向重复(IR/DR)序列。在一些实施方案中，非病毒质粒编码在启动子的控制下的转座酶。将质粒转染到宿主细胞中导致转座酶的瞬时表达，由此在转染后的最初时期中，转座酶以足够水平表达以将转座子整合到基因组DNA中。在一些实施方案中，转座酶本身不整合到基因组DNA中，并且因此转座酶的表达随时间推移降低。在一些实施方案中，转座酶表达由宿主细胞以足以使对应转座子整合持续以下时间的水平表达：少于约4小时、少于约8小时、少于约12小时、少于约24小时、少于约2天、少于约3天、少于约4天、少于约5天、少于约6天、少于约7天、少于约2周、少于约3周、少于约4周、少于约周、或少于约8周。在一些实施方案中，引入宿主基因组中的货物DNA随后不会从宿主基因组中被去除，至少是因为宿主不表达能够切除货物DNA的内源转座酶。
睡美人(SB)是转座子的Tc/1-水手超家族的合成成员，是由鲑科鱼基因组中具有的休眠元件重新构建的。基于SB转座子的转染是一个由转座酶和转座子组成的两组分系统，所述转座子含有导致精确整合到TA二核苷酸中的反向重复/同向重复(IR/DR)序列。将转座子设计成具有侧翼为IR/DR的目的表达盒。SB转座酶结合位于睡美人转座子IR上的特异性结合位点。SB转座酶介导转座子的整合，所述转座子是编码货物序列的可移动元件，在所述货物序列的两侧都侧接具有催化性酶(SB)结合位点的反向末端重复序列。当SB通过剪切粘贴机制将基因序列在TA靶二核苷酸处插入脊椎动物染色体中时，获得稳定的表达。已将此系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代外周血白细胞。在一些实施方案中，将细胞与SB转座子接触、与SB转座子一起孵育和/或用SB转座子处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码重组受体或CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含SB转座子的质粒接触、与包含SB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含SB转座子的质粒处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含编码侧翼没有SBIR序列的SB转座酶的基因。
PiggyBac(PB)是可以用于将货物DNA整合到宿主(例如人)的基因组DNA中的另一种转座子系统。PB转座酶识别位于转座子两个末端的PB转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且高效地将内容物从原始位点移出并将所述内容物高效地整合到TTAA染色体位点中。PB转座子系统使得能够将PB载体中两个ITR之间的目的基因动员到靶基因组中。已将PB系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代细胞。在一些实施方案中，将待转染的细胞与PB转座子接触、与PB转座子一起孵育、和/或用PB转座子处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含PB转座子的质粒接触、与包含PB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含PB转座子的质粒处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含编码侧翼没有PB IR序列的SB转座酶的基因。
在一些实施方案中，可以通过限制酶切割、连接和分子克隆的标准方法来产生用于主题方法中的转座子/转座酶的各种元件，例如一种或多种SB或PB载体。用于构建主题载体的一种方案包括以下步骤。首先，用限制性核酸内切酶从初始来源(例如包含转座酶基因的载体)切割经纯化的核酸片段，所述核酸片段含有所需组分核苷酸序列以及外来序列。然后使用常规分离方法(例如通过琼脂糖凝胶电泳)将含有所需核苷酸序列的片段与不同大小的不需要片段分离。将所需片段从凝胶上切下，并以适当的配置连接在一起，从而产生含有所需序列(例如如上所述的与主题载体的各种元件对应的序列)的环状核酸或质粒。然后，在需要的情况下，在原核宿主(例如大肠杆菌)中扩增如此构建的环状分子。这些步骤中涉及的切割、质粒构建、细胞转化和质粒产生的程序对本领域技术人员而言是熟知的，并且限制性酶切和连接所需的酶可商购获得。(参见，例如R.Wu,编,Methods in Enzymology,第68卷,Academic Press,纽约(1979)；T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,纽约(1982)；目录号1982-83,New England Biolabs,Inc.；目录号1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc。如何构建主题方法中采用的载体的例子提供于下文的实验章节中。在WO 98/40510和WO 99/25817中也披露了代表性睡美人转座子系统的制备)。
在一些实施方案中，用包含转座酶基因的质粒和包含转座子的质粒进行用转座子的转导，所述转座子含有侧翼为由转座酶识别的反向重复/同向重复(IR/DR)序列的货物DNA序列。在某些实施方案中，货物DNA序列编码异源蛋白，例如重组T细胞受体或CAR。在一些实施方案中，质粒包含转座酶和转座子。在一些实施方案中，转座酶在遍在启动子或适合于驱动转座酶在靶细胞中表达的任何启动子的控制下。遍在启动子包括但不限于EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、人β-肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIa和U6。在一些实施方案中，货物DNA包含选择盒，所述选择盒允许选择将货物DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。合适的选择盒包括但不限于编码以下的选择盒：卡那霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、红霉素抗性基因和多粘菌素B抗性基因。
在一些实施方案中，将用于用转座子转导的组分(例如包含SB转座酶和SB转座子的质粒)引入靶细胞中。可以采用任何方便的方案，其中取决于靶细胞的位置，所述方案可以将系统组分体外或体内引入靶细胞中。例如，在靶细胞是分离的细胞的情况下，可以例如通过使用标准转化技术，在容许靶细胞活力的细胞培养条件下将所述系统直接引入所述细胞中。此类技术包括但不必限于：病毒感染、转化、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送等。方法的选择通常取决于待转化的细胞的类型和发生转化的环境(即体外、离体或体内)。这些方法的一般性讨论可以在Ausubel,等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995中找到。
在一些实施方案中，在足以从携带转座子的载体上切下反向重复侧翼核酸并且随后将切下的核酸整合到靶细胞的基因组中的条件下，将SB转座子和SB转座酶来源引入多细胞生物体(例如哺乳动物或人)的靶细胞中。一些实施方案还包括确保必需的转座酶活性连同引入的转座子一起存在于靶细胞中的步骤。取决于转座子载体本身的结构，即载体是否包括编码具有转座酶活性的产物的区域，所述方法还可以包括将编码必需转座酶活性的第二载体引入靶细胞中。
在一些实施方案中，引入细胞中的包含转座子的载体核酸的量和编码转座酶的载体核酸的量足以提供所需的将转座子核酸切下并插入靶细胞基因组中。这样，引入的载体核酸的量应提供足够量的转座酶活性和足够拷贝数的期望插入靶细胞中的核酸。引入靶细胞中的载体核酸的量取决于所采用的特定引入方案(例如所采用的特定离体施用方案)的效率而变化。
一旦载体DNA与必需的转座酶组合进入了靶细胞，就经由所提供的转座酶从载体上切下侧翼为反向重复序列的载体核酸区域(即位于睡美人转座酶识别的反向重复序列之间的载体核酸)并将其插入靶细胞的基因组中。这样，在将载体DNA引入靶细胞中之后，随后进行转座酶介导的对载体携带的外源核酸的切除并将其插入靶细胞的基因组中。在特定实施方案中，载体整合到至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％至少7％至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、或至少20％的用SB转座子和/或SB转座酶转染的细胞的基因组中。在一些实施方案中，核酸整合到靶细胞基因组中是稳定的，即，载体核酸保持存在于靶细胞基因组中持续超过瞬时时间段，并且一部分染色体遗传物质传递到靶细胞的后代。
在某些实施方案中，转座子用于将各种大小的核酸(即多核苷酸)整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约0.1kb至200kb、从约0.5kb至100kb、从约1.0kb至约8.0kb、从约1.0至约200kb、从约1.0至约10kb、从约10kb至约50kb、从约50kb至约100kb、或从约100kb至约200kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约200kb。在特定实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。
D.细胞的培育和/或扩增
在一些实施方案中，所提供的方法包括用于培育细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。在一些实施方案中，所述培育产生富集T细胞的一种或多种培育组合物。
在某些实施方案中，在配制细胞之前，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞(包括经刺激和经转导T细胞)的一种或多种组合物(如此类CD4+和CD8+T细胞的单独组合物)。在一些方面，所述培育方法(如用于促进增殖和/或扩增)包括本文如在第II-D节中提供的方法。在特定实施方案中，在已对一种或多种经富集T细胞的组合物进行工程化(例如转导或转染)之后，培育所述一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是工程化组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种工程化组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在培育之前解冻。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物。在特定实施方案中，将引入有重组受体(例如CAR)的经富集T细胞的两种单独组合物在促进细胞的增殖和/或扩增的条件下分别培育，所述单独组合物是例如从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物。在一些实施方案中，所述条件是刺激条件。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞(如引入有编码重组受体的核酸和/或表达重组受体的工程化CD4+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+ T细胞(如引入有编码重组受体的核酸和/或表达重组受体的工程化CD8+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞)的两种单独组合物例如在促进增殖和/或扩增的条件下分别培育。在一些实施方案中，培育经富集T细胞的单一组合物。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在培育之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用编码重组受体的重组多核苷酸转导或转染的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经培育的经富集CD4+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+t细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用编码重组受体的重组多核苷酸转导或转染的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化CD4+和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)合并为单一组合物并且例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成培育之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独培育的组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化CD4+和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)例如在促进增殖和/或扩增的条件下分别培育。
在一些实施方案中，在为、为约、或为至少100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL、或2,400mL的体积的培养基中培育细胞(例如工程化细胞)。在一些实施方案中，以初始体积培育细胞，所述初始体积稍后被调节至不同的体积。在特定实施方案中，所述体积稍后在培育期间被调节。在特定实施方案中，所述体积从培育期间的初始体积增加。在某些实施方案中，当细胞在培育期间实现密度时，将所述体积进行增加。在某些实施方案中，初始体积为或为约500mL。
在特定实施方案中，当细胞在培育期间实现密度或浓度时，所述体积从初始体积增加。在特定实施方案中，当细胞实现如下密度和/或浓度时将所述体积进行增加：为、为约、或为至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml、或10x106个细胞/ml。在一些实施方案中，当细胞实现为、至少或约0.6x106个细胞/mL的密度和/或浓度时，所述体积从初始体积增加。在一些实施方案中，密度和/或浓度是培养物中活细胞的。在特定实施方案中，当细胞实现如下密度和/或浓度时将所述体积进行增加：为、为约、或为至少0.1x106个活细胞/ml、0.2x106个活细胞/ml、0.4x106个活细胞/ml、0.6x106个活细胞/ml、0.8x106个活细胞/ml、1x106个活细胞/ml、1.2x106个活细胞/ml、1.4x106个活细胞/ml、1.6x106个活细胞/ml、1.8x106个活细胞/ml、2.0x106个活细胞/ml、2.5x106个活细胞/ml、3.0x106个活细胞/ml、3.5x106个活细胞/ml、4.0x106个活细胞/ml、4.5x106个活细胞/ml、5.0x106个活细胞/ml、6x106个活细胞/ml、8x106个活细胞/ml、或10x106个活细胞/ml。在一些实施方案中，当活细胞实现为、为至少或为约0.6x106个活细胞/ml的密度和/或浓度时，从所述初始体积增加体积。在一些实施方案中，可以在培育期间确定或监测细胞或活细胞的密度和/或浓度，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，所述细胞实现一定密度和/或浓度，并且体积增加、增加约或增加至少100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL或2,400mL。在一些实施方案中，体积增加500mL。在特定实施方案中，体积增加到如下体积：为、为约或至少500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL或2,400mL。在某些实施方案中，体积增加到1,000mL的体积。在某些实施方案中，体积以如下速率增加：为、为至少或为约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟5mL、10mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、75mL、80mL、90mL或100mL。在某些实施方案中，所述速率为或为约每8分钟50mL。
在一些实施方案中，在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物。在一些实施方案中，此类条件可以经设计以诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计成促进细胞的生长、分裂和/或扩增的药剂))。
在一些实施方案中，培育是在如下条件下进行，所述条件通常包括适合于原代免疫细胞(如人T淋巴细胞)生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在25℃至38℃，如30℃至37℃，例如为或约37℃±2℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所需或阈值密度、浓度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所需或阈值密度、浓度、数量或剂量的活细胞。在一些实施方案中，所述孵育是大于或大于约或持续约或24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。在一些实施方案中，可以在培育期间确定或监测细胞的密度、浓度和/或数量或剂量，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在培育之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在工程化之后并且在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在一些实施方案中，所述刺激试剂是本文例如在第II-B-1节中所述的刺激试剂。在特定实施方案中，如本文(例如在第II-B-2节中)所述，从细胞中去除和/或分离刺激试剂。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下培育经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物(例如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。
在特定实施方案中，将经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物用重组IL-2培育。在一些实施方案中，在重组IL-2的存在下培育经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物增加了所述组合物的CD4+ T细胞在培育步骤期间和整个所述过程中将继续存活、生长、扩增和/或激活的概率或可能性。在一些实施方案中，与未在重组IL-2的存在下培育所述经富集CD4+ T细胞的组合物的替代性和/或示例性方法相比，在重组IL-2的存在下培育所述经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物使得将从所述经富集CD4+ T细胞的组合物产生经富集CD4+ T细胞(例如适合于细胞疗法的工程化CD4+ T细胞)的输出组合物的概率和/或可能性增加至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％或至少200％CD4+。
在一些实施方案中，用细胞因子，例如重组人细胞因子培育所述细胞(如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与2,000IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与500IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在500IU/ml与1400IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与2,500IU/ml之间。
在一些实施方案中，用重组IL-2，例如人重组IL-2培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)，所述重组IL-2的浓度在2IU/ml与500IU/ml之间、在10IU/ml与250IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml或在100IU/ml与400IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-2培育所述经富集T细胞的组合物，所述IL-2的浓度为或为约50IU/ml、75IU/ml、100IU/ml、125IU/ml、150IU/ml、175IU/ml、200IU/ml、225IU/ml、250IU/ml、300IU/ml或400IU/ml。在一些实施方案中，用浓度为200IU/ml的重组IL-2培育所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物，如工程化CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物，如工程化CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，用IL-7，例如人重组IL-7培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物)，所述IL-7的浓度在10IU/ml与5,000IU/ml之间、在500IU/ml与2,000IU/ml之间、在600IU/ml与1,500IU/ml之间、在500IU/ml与2,500IU/ml之间、在750IU/ml与1,500IU/ml之间或在1,000IU/ml与2,000IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-7培育所述经富集T细胞的组合物，所述IL-7的浓度为或为约100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml、400IU/ml、500IU/ml、600IU/ml、700IU/ml、800IU/ml、900IU/ml、1,000IU/ml、1,200IU/ml、1,400IU/ml或1,600IU/ml。在一些实施方案中，在浓度为或为约1,200IU/ml的重组IL-7的存在下培育所述细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物。
在一些实施方案中，用IL-15，例如人重组IL-15培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物)，所述IL-15的浓度在0.1IU/ml与200IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间、或在10IU/ml与00IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-15培育所述经富集T细胞的组合物，所述IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml、50IU/ml、100IU/ml或200IU/ml。在特定实施方案中，用浓度为20IU/ml的重组IL-15培育经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+ T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15(如以如所述量)的存在下培育经富集CD8+T细胞(如工程化CD8+ T细胞)的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15(如以如所述量)的存在下培育经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。
在特定实施方案中，在封闭系统中进行培育。在某些实施方案中，在无菌条件下在封闭系统中进行培育。在特定实施方案中，在与所提供系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行培育。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物从封闭系统中去除并且置于用于培育的生物反应器中和/或与其连接。合适的用于培育的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，生物反应器用于在培育步骤的至少一部分期间灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，在密闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞在培育期间比没有生物反应器的情况下培育的细胞(例如在静态条件下(例如在没有混合、摇摆、运动和/或灌注的情况下)培育的细胞)经历更快的扩增。在一些实施方案中，在封闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞在14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时内达到或实现阈值扩增、细胞计数和/或密度。在一些实施方案中，与未在封闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育细胞的示例性和/或替代性过程中培育的细胞相比，在封闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞达到或实现至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍的阈值扩增、细胞计数和/或密度。
在一些实施方案中，混合是或包括摇摆和/或运动。在一些情况下，生物反应器可以经受运动或摇摆，其在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调节摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间并包含端值。
在一些实施方案中，使生物反应器保持等于或接近37℃的温度和等于或接近5％的CO2水平，且具有如下稳定空气流量：为、为约或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min或2.0L/min或大于2.0L/min。在某些实施方案中，在灌注的情况下，如以290ml/天、580ml/天和/或1160ml/天的速率(例如，这取决于与培育起始相关的时间安排和/或经培育细胞的密度)进行培育的至少一部分。在一些实施方案中，在摇摆运动(如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(如在5RPM与15RPM之间(如6RPM或10RPM)的速度))的情况下进行细胞培养物扩增的至少一部分。
在一些实施方案中，在恒定灌注(例如，慢稳定速率的灌注)下进行培育步骤的所述至少一部分。在一些实施方案中，灌注是或包括液体(例如，用过的培养基)的流出和新鲜培养基的流入。在某些实施方案中，灌注用新鲜培养基更换用过的培养基。在一些实施方案中，培育的至少一部分在灌注下进行，所述灌注具有如下稳定速率：为或为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。
在特定实施方案中，在没有灌注的条件下开始培育，并且在设定和/或预定的时间量(如在培育开始或起始后为或约或至少12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、或72小时或超过72小时)之后开始灌注。在特定实施方案中，当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当经培育细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。在特定实施方案中，当活细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个活细胞/ml、0.2x106个活细胞/ml、0.4x106个活细胞/ml、0.6x106个活细胞/ml、0.8x106个活细胞/ml、1x106个活细胞/ml、1.2x106个活细胞/ml、1.4x106个活细胞/ml、1.6x106个活细胞/ml、1.8x106个活细胞/ml、2.0x106个活细胞/ml、2.5x106个活细胞/ml、3.0x106个活细胞/ml、3.5x106个活细胞/ml、4.0x106个活细胞/ml、4.5x106个活细胞/ml、5.0x106个活细胞/ml、6x106个活细胞/ml、8x106个活细胞/ml或10x106个活细胞/ml。
在特定实施方案中，在培育期间以不同的速度进行灌注。例如，在一些实施方案中，灌注的速率取决于经培育细胞的密度和/或浓度。在某些实施方案中，当细胞达到设定或预定的密度或浓度时，增加灌注的速率。在培育期间灌注速率可以改变，例如从一种稳定灌注速率变为增加的稳定灌注速率，改变一次、两次、三次、四次、五次、超过五次、超过十次、超过15次、超过20次、超过25次、超过50次或超过100次。在一些实施方案中，当细胞达到如下设定或预定的细胞密度或浓度时增加稳定灌注速率：为、为约或至少0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。在一些实施方案中，当细胞达到如下设定或预定的活细胞密度或浓度时增加稳定灌注速率：为、为约或至少0.6x106个活细胞/ml、0.8x106个活细胞/ml、1x106个活细胞/ml、1.2x106个活细胞/ml、1.4x106个活细胞/ml、1.6x106个活细胞/ml、1.8x106个活细胞/ml、2.0x106个活细胞/ml、2.5x106个活细胞/ml、3.0x106个活细胞/ml、3.5x106个活细胞/ml、4.0x106个活细胞/ml、4.5x106个活细胞/ml、5.0x106个活细胞/ml、6x106个活细胞/ml、8x106个活细胞/ml或10x106个活细胞/ml。在一些实施方案中，可以确定或监测在培育期间(如在灌注下)细胞或活细胞的密度和/或浓度，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在没有灌注的条件下开始培育，并且当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时，以如下速率开始灌注：为、为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。在一些实施方案中，当经培育细胞或经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。
在某些实施方案中，培育的至少一部分在某一速率的灌注下进行，并且当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时，将灌注速率增加到如下速率：为、为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。在一些实施方案中，当经培育细胞或经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。在一些实施方案中，当以如下体积培育细胞时进行灌注：为、为约或至少300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。在一些实施方案中，所述体积是1000mL。
在某些实施方案中，在没有灌注或以某一速率灌注的条件下开始培育，并且当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.61x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少290ml/天。在某些实施方案中，当以为、为约或至少1000mL的体积培育细胞时，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.61x106个细胞/ml的浓度时，以为、为约或至少290ml/天的速率灌注细胞。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.81x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少580ml/天。在某些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少1.01x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少1160ml/天。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少1.2x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少1160ml/天。
在所提供的实施方案的方面，通过在培育期间评估细胞的密度和/或浓度或评估活细胞的密度和/或浓度来确定灌注速率，包括如本文及上文所述的开始或增加灌注时的时间安排。在一些实施方案中，可以使用如所述的方法确定细胞的密度和/或浓度，所述方法包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在表面活性剂的存在下培育经富集细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，培育所述组合物的细胞减少了在培育期间例如由于混合、摇摆、运动和/或灌注而可能发生的剪切应力的量。在特定实施方案中，用表面活性剂培育所述经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物，并且在完成培育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的T细胞存活，例如是有活力的并且/或者未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，在表面活性剂的存在下培育所述经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物，并且少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞未经历如由于剪切或剪切诱导的应力而引起的细胞死亡，例如程序性细胞死亡、细胞凋亡和/或坏死。
在特定实施方案中，在如下量的表面活性剂的存在下培育经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂的存在下培育所述经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或为约2μl/ml的表面活性剂的存在下培育所述经富集T细胞的组合物。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括降低液体和/或固体的表面张力的药剂。例如，表面活性剂包括脂肪醇(例如，甾醇)、聚氧乙二醇辛基酚醚(例如Triton X-100)或聚氧乙二醇失水山梨糖醇烷基酯(例如聚山梨醇酯20、40、60)。在某些实施方案中，表面活性剂选自聚山梨醇酯80(PS80)、聚山梨醇酯20(PS20)、泊洛沙姆188(P188)。在示例性实施方案中，化学确定的进料培养基中的表面活性剂的浓度为约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS80；约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS20；或约0.1％至约5.0％(w/v)的P188。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括添加到其中的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、月桂酸钾、硬脂酸三乙醇胺、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、海藻酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠)。
在一些实施方案中，合适的非离子表面活性剂包括：甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨酯)、聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡基硬脂醇、硬脂醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖(包括淀粉和淀粉衍生物，如羟乙基淀粉(HES))、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，并且优选是丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。此类聚合物以商标名泊洛沙姆出售，有时也被称为
F68或
P188。聚氧乙烯脂肪酸酯包括具有短烷基链的那些。这种表面活性剂的一个例子是
HS 15，即聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯。
在一些实施方案中，合适的阳离子表面活性剂可以包括但不限于天然磷脂、合成磷脂、季铵化合物、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、壳聚糖、月桂基二甲基苄基氯化铵、酰基肉碱盐酸、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、双十四酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二酰基甘油-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶鎓卤化物或长链烷基胺(例如正辛胺和油酰胺)。
两性离子表面活性剂是电中性的，但在同一分子内具有局部正电荷和负电荷。合适的两性离子表面活性剂包括但不限于两性离子磷脂。合适的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油-磷酸乙醇胺(如双十四酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)和二油酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE))。在本发明中可以使用磷脂(包括阴离子磷脂和两性离子磷脂)的混合物。此类混合物包括但不限于溶血磷脂、卵磷脂或大豆磷脂或其任何组合。磷脂(无论是阴离子的磷脂、两性离子磷脂还是磷脂的混合物)可以被盐化或脱盐、氢化或部分氢化或者是天然半合成的或合成的。
在某些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆，例如，泊洛沙姆188。在一些实施方案中，在如下量的泊洛沙姆的存在下培育经富集T细胞的组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂的存在下培育所述经富集T细胞的组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或为约2μl/ml的泊洛沙姆的存在下培育所述经富集T细胞的组合物。
在特定实施方案中，当细胞实现阈值量、浓度和/或扩增时，如通过收获细胞结束培育。在特定实施方案中，当例如关于和/或相对于培育开始或起始时细胞密度的量，细胞实现或实现约或至少1.5倍扩增、2倍扩增、2.5倍扩增、3倍扩增、3.5倍扩增、4倍扩增、4.5倍扩增、5倍扩增、6倍扩增、7倍扩增、8倍扩增、9倍扩增、10倍扩增或大于10倍扩增时，培育结束。在一些实施方案中，阈值扩增为例如关于和/或相对于开始或起始培育时细胞的量或密度的4倍扩增。
在一些实施方案中，当细胞实现细胞的阈值总量，例如阈值细胞计数时，如通过收获细胞结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值总有核细胞(TNC)计数时，结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值活细胞量(例如阈值活细胞计数)时，培育结束。在一些实施方案中，阈值细胞计数为或为约或为至少50x106个细胞、100x106个细胞、200x106个细胞、300x106个细胞、400x106个细胞、600x106个细胞、800x106个细胞、1000x106个细胞、1200x106个细胞、1400x106个细胞、1600x106个细胞、1800x106个细胞、2000x106个细胞、2500x106个细胞、3000x106个细胞、4000x106个细胞、5000x106个细胞、10,000x106个细胞、12,000x106个细胞、15,000x106个细胞或20,000x106个细胞，或前述活细胞阈值中的任一项。在特定实施方案中，当细胞实现阈值细胞计数时，结束培育。在一些实施方案中，在实现阈值细胞计数后的以下时间、在约以下时间或在以下时间内，培育结束：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现阈值细胞计数后1天或约1天时结束培育。在某些实施方案中，阈值密度为、为约或为至少0.1x106个细胞/ml、0.5x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.5x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml、或10x106个细胞/ml，或前述活细胞阈值中的任一项。在特定实施方案中，当细胞实现阈值密度时，培育结束。在一些实施方案中，在实现阈值密度后的以下时间、在约以下时间或在以下时间内，培育结束：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现阈值密度后1天或约1天，培育结束。
在一些实施方案中，将培育步骤进行对于细胞实现阈值量、密度和/或扩增所需的时间量。在一些实施方案中，将培育进行如下时间量：为或为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。在特定实施方案中，对于从不同生物样品中分离、富集和/或选择的经富集T细胞的多种单独组合物的细胞实现阈值密度所需的平均时间量为、为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。在某些实施方案中，对于从不同生物样品中分离、富集和/或选择的经富集T细胞的多种单独组合物的细胞实现阈值密度所需的平均时间量为、为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。
在某些实施方案中，将培育步骤进行最少4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天或10天，和/或直到细胞实现如下阈值细胞计数(或数量)或阈值活细胞计数(或数量)后的12小时、24小时、36小时、1天、2天或3天：为或为约1000x106个细胞、1200x106个细胞、1400x106个细胞、1600x106个细胞、1800x106个细胞、2000x106个细胞、2500x106个细胞、3000x106个细胞、4000x106个细胞或5000x106个细胞。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或为约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少10天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或为约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少9天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或为约1000x106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少8天后1天，和/或直到细胞实现为或为约4000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在某些实施方案中，培育是扩增步骤并且将其进行最少4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天或10天，和/或直到细胞实现如下阈值细胞计数(或数量)或阈值活细胞计数(或数量)后的12小时、24小时、36小时、1天、2天或3天：为或为约1000x106个细胞、1200x106个细胞、1400x106个细胞、1600x106个细胞、1800x106个细胞、2000x106个细胞、2500x106个细胞、3000x106个细胞、4000x106个细胞或5000x106个细胞。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少10天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少9天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1000x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少8天后1天，和/或直到细胞实现为或为约4000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1400x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少5天后1天，和/或直到细胞实现为或为约4000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。
在一些实施方案中，将培育进行至少最少时间量。在一些实施方案中，即使在最少时间量之前实现阈值，也将培育进行至少14天、至少12天、至少10天、至少7天、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天、至少36小时、至少24小时、至少12小时或至少6小时。在一些实施方案中，在一些情况下，增加进行培育的最少时间量可以在经培育细胞、经配制细胞和/或输出组合物的细胞中减少激活和/或降低一种或多种激活标记的水平。在一些实施方案中，最少培育时间从示例性过程的确定点(例如选择步骤；解冻步骤；和/或激活步骤)开始计数到收获细胞的那一天。
在所提供的实施方案的方面，在培育期间监测细胞或活细胞的密度和/或浓度或在培育期间进行，如直到实现如所述的阈值量、密度和/或扩增。在一些实施方案中，此类方法包括如所述的那些，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在某些实施方案中，培育的细胞是输出细胞。在一些实施方案中，已经进行培育的经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物是经富集T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，已经进行培育的CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞是输出CD4+和/或CD8+ T细胞。在特定实施方案中，已经进行培育的经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物是经富集CD4+ T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，已经进行培育的经富集CD8+T细胞(如工程化CD8+T细胞)的组合物是经富集CD8+ T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下在促进增殖和/或扩增的条件下培育所述细胞。在特定实施方案中，所述培育的至少一部分是在恒定的混合和/或灌注(如通过生物反应器控制的混合或灌注)的情况下进行。在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下并且用表面活性剂(例如泊洛沙姆，如泊洛沙姆188)培育细胞，以减少来自恒定混合和/或灌注的剪切和/或剪切应力。在一些实施方案中，在重组IL-2、IL-7、IL-15和泊洛沙姆的存在下培育经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物，其中所述培育的至少一部分是在恒定混合和/或灌注的情况下进行。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-15和泊洛沙姆的存在下培育经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+ T细胞)的组合物，其中所述培育的至少一部分是在恒定混合和/或灌注的情况下进行。在一些实施方案中，进行培育直到细胞达到例如与开始培育时相比至少4倍的阈值扩增。
1.在培育期间监测细胞
在一些实施方案中，在培育步骤期间监测细胞。可以进行监测，例如以确定(例如，测量、定量)细胞形态、细胞活力、细胞死亡和/或细胞浓度(例如，活细胞浓度)。在一些实施方案中，监测是手动进行，如由人类操作者进行。在一些实施方案中，监测通过自动化系统进行。自动化系统可能需要最少的人工输入或不需要人工输入来监测培育的细胞。在一些实施方案中，监测是手动和通过自动化系统进行的。
在某些实施方案中，通过无需人工输入的自动化系统来监测细胞。在一些实施方案中，自动化系统与生物反应器(例如本文所述的生物反应器)兼容，使得可以将经历培育的细胞从生物反应器中移取出、监测并随后返回至生物反应器。在一些实施方案中，监测和培育以闭环配置发生。在一些方面，在闭环配置中，自动化系统和生物反应器保持无菌。在实施方案中，自动化系统是无菌的。在一些实施方案中，自动化系统是在线系统。
在一些实施方案中，自动化系统包括使用光学技术(例如显微镜检查)检测细胞形态、细胞活力、细胞死亡和/或细胞浓度(例如活细胞浓度)。本文设想到了适合于确定例如细胞特征、活力和浓度的任何光学技术。有用的光学技术的非限制性例子包括亮视野显微术、荧光显微术、微分干涉差(DIC)显微术、相差显微术、数字全息显微术(DHM)、差分数字全息显微术(DDHM)或其组合。差分数字全息显微术、DDHM和差分DHM可以在本文中互换使用。在某些实施方案中，自动化系统包括差分数字全息显微镜。在某些实施方案中，自动化系统包括差分数字全息显微镜，包括照明装置(例如，激光、led)。DDHM方法和使用的描述可以发现于例如以下文献中：US 7,362,449；EP1,631,788；US 9,904,248；和US 9,684,281，所述申请通过引用以其整体并入本文。
DDHM允许对细胞进行无标记的无损成像，从而产生高对比度的全息图像。可以对图像进行对象分割和进一步分析，以获得定量地描述所成像的对象(例如，培育的细胞、细胞碎片)的多个形态特征。这样，可以使用例如图像采集、图像处理、图像分割和特征提取的步骤，直接从DDHM评估或计算各种特征(例如，细胞形态、细胞活力、细胞浓度)。在一些实施方案中，自动化系统包括数字记录装置以记录全息图像。在一些实施方案中，自动化系统包括计算机，所述计算机包括用于分析全息图像的算法。在一些实施方案中，自动化系统包括用于显示全息图像分析结果的监测器和/或计算机。在一些实施方案中，分析是自动化的(即，能够在没有用户输入的情况下进行)。用于在培育步骤期间监测细胞的合适的自动化系统的例子包括但不限于Ovizio iLine F(Ovizio Imaging Systems NV/SA，比利时布鲁塞尔)。
在某些实施方案中，在培育步骤期间连续进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间实时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间的离散时间点进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每15分钟进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每30分钟进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每45分钟进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每2小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每4小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每6小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每8小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每10小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每12小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每14小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每16小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每18小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每20小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每22小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内每天至少进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每两天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每三天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每四天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每五天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每六天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每七天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每八天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每九天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每十天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间至少进行一次监测。
在一些实施方案中，可以通过监测(包括使用光学技术，如DHM或DDHM)确定的细胞特征包括细胞活力、细胞浓度、细胞数量和/或细胞密度。在一些实施方案中，表征或确定细胞活力。在一些实施方案中，表征或确定细胞浓度、密度和/或数量。在一些实施方案中，表征或确定活细胞浓度、活细胞数量和/或活细胞密度。在一些实施方案中，通过自动化系统监测经培育的细胞，直到达到如上所述的扩增的阈值。在一些实施方案中，一旦达到扩增的阈值，就例如通过自动化或手动方法例如由人类操作者收获培育的细胞。扩增的阈值可能取决于由自动化系统确定的培养细胞的总浓度、密度和/或数量。可替代地，扩增的阈值可能取决于活细胞浓度、密度和/或数量。
在一些实施方案中，如所述配制收获的细胞，如在药学上可接受的载体的存在下配制。在一些实施方案中，在冷冻保护剂的存在下配制收获的细胞。
E.配制细胞
在一些实施方案中，所提供的用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的方法可以包括在孵育、工程化和培育和/或如所述的一个或多个其他处理步骤之前或之后配制细胞，例如配制由所提供的处理步骤产生的基因工程化细胞。在一些实施方案中，所提供的与细胞的配制相关的方法包括在封闭系统中处理转导的细胞，如使用上述处理步骤转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，提供包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品。此类组合物可以根据所提供的方法使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法中。
在一些情况下，在用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行的)中处理细胞，可以包括在培养(例如培育和扩增)和/或如所述的一个或多个其他处理步骤之前或之后配制细胞，例如配制由所提供的转导处理步骤产生的基因工程化细胞。在一些情况下，可以以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量配制细胞。在一些实施方案中，所提供的与细胞的配制相关的方法包括在封闭系统中处理转导的细胞，如使用上述处理步骤转导和/或扩增的细胞。
在某些实施方案中，配制经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种组合物、治疗性细胞组合物。在特定实施方案中，在已经工程化和/或培育所述一种或多种组合物之后配制经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种组合物、治疗性细胞组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是输入组合物。在一些实施方案中，先前已经将一种或多种输入组合物低温冷冻并储存，并在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，所述经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种治疗性组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的工程化和/或经培育组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独治疗性组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的、单独工程化和单独培育的经富集CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的两种单独组合物分别配制。在某些实施方案中，所述两种单独治疗性细胞组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独治疗性细胞组合物包括经富集CD8+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独治疗性组合物(如工程化和经培育CD4+ T细胞和工程化和经培育CD8+ T细胞的单独组合物)分别配制。在一些实施方案中，对经富集T细胞的单一治疗性组合物进行配制。在某些实施方案中，所述单一治疗性组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一治疗性组合物是在配制之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独治疗性组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)合并为单一治疗性组合物并配制。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成配制之后将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独经配制治疗性组合物合并为单一治疗性组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独治疗性组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)分别配制为单独组合物。
在一些实施方案中，经配制的经富集CD4+ T细胞(如工程化和经培育CD4+ T细胞，例如输出CD4+ T细胞)的治疗性组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经配制的经富集CD4+ T细胞(如工程化和经培育CD4+ T细胞，例如输出CD4+ T细胞)的治疗性组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，经配制的经富集CD8+ T细胞(如工程化和经培育CD8+ T细胞，例如输出CD8+ T细胞)的治疗性组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述治疗性组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞(如工程化和经培育CD8+ T细胞，例如输出CD8+ T细胞)的治疗性组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，在配制之前，评估所述一种或多种治疗性组合物的特征，例如如第I-A节和第I-A-3节所述。在一些实施方案中，所述特征是细胞表型和重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，细胞表型和重组受体依赖性活性被定量为提供在治疗性细胞组合物中具有某一属性的细胞的数量、百分比、比例和/或比率。在一些实施方案中，所述特征被用作本文提供的机器学习过程的输入。
在某些实施方案中，经配制细胞是输出细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的经配制治疗性组合物(如工程化和经培育T细胞的经配制组合物)是经富集T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，经配制CD4+ T细胞和/或经配制CD8+ T细胞是输出CD4+和/或CD8+ T细胞。在特定实施方案中，经富集CD4+ T细胞的经配制组合物是经富集CD4+ T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，经富集CD8+ T细胞的经配制组合物是经富集CD8+ T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器如袋子或小瓶中。在一些实施方案中，在细胞后在培育期间已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后0天与10天之间、0与5天之间、2天与7天之间、0.5天与4天之间或1天与3天之间，配制细胞。在某些实施方案中，在培育期间已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后为或为或约12小时、18小时、24小时、1天、2天或3天或在12小时、18小时、24小时、1天、2天或3天内，配制细胞。在一些实施方案中，在培育期间已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后为或约1天内，配制细胞。
特定实施方案设想到，细胞在培育期间的早期阶段比在培育期间的晚期阶段处于激活程度更高的状态。此外，在一些实施方案中，可能期望配制处于比在培育期间发生或可能发生的峰值激活更低激活状态的细胞。在某些实施方案中，将细胞培育最少持续时间或时间量，例如使得与在培育期间的较早时间点时配制所述细胞的情况相比，以收获处于更低激活状态的细胞，而不管阈值何时实现。在一些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后在1天与3天之间培育细胞。在某些实施方案中，细胞在配制之前实现阈值细胞计数、密度和/或扩增，并且保持培育最少时间或持续时间。在一些实施方案中，不对已实现阈值的细胞进行配制，直到已经将它们培育最少持续时间和/或时间量，如在1天与14天之间、在2天与7天之间或在3天与6天之间的最少时间或持续时间，或为或为约2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天的最少培育时间或持续时间。在一些实施方案中，最少的培育时间或持续时间在3天与6天之间。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，处理包括将介质交换成药学上可接受的或施用于受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。包括药学上可接受的载体或赋形剂的此类药物形式的例子可以是下文与将细胞和组合物施用于受试者可接受的形式结合描述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应证、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可以含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强所述组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，配制缓冲液含有冷冻保存剂。在一些实施方案中，用冷冻保存剂溶液配制细胞，所述冷冻保存剂溶液含有1.0％至30％的DMSO溶液，如5％至20％的DMSO溶液或5％至10％的DMSO溶液。在一些实施方案中，冷冻保存剂溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS、或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，冷冻保存剂溶液是或含有例如至少或约7.5％DMSO。在一些实施方案中，加工步骤可以涉及洗涤经转导的和/或扩增的细胞以交换在冷冻保存剂溶液中的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或冷冻保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或冷冻保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA。
在特定实施方案中，对所述经富集T细胞(例如，已经刺激、工程化和/或培育的T细胞)的治疗性组合物进行配制，低温冷冻，然后储存一定时间量。在某些实施方案中，所配制的低温冷冻的细胞被储存直到将细胞释放用于输注。在特定实施方案中，所配制的低温冷冻的细胞储存持续1天与6个月之间、在1个月与3个月之间、在1天与14天之间、在1天与7天之间、在3天与6天之间、在6个月与12个月之间、或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞低温冷冻并储存持续、持续约、或持续少于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存之后，将细胞解冻并施用至受试者。在某些实施方案中，将细胞储存持续或持续约5天。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞，如培养或扩增的细胞。在一些实施方案中，处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分用的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，处理步骤可以包括减小体积，从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，处理步骤可以包括增加体积，从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，处理包括向转导的和/或扩增的细胞添加一定体积的配制缓冲液。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积为从10mL至1000mL或从约10mL至约1000mL，如至少或至少约或约50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类处理步骤在封闭系统中进行。此类处理步骤的例子可以使用与跟细胞处理系统相关的一个或多个系统或套件结合的离心室(例如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括用于与
或Sepax
细胞处理系统一起使用的那些)来进行。在国际公开号WO 2016/073602中描述了示例性系统和过程。在一些实施方案中，所述方法包括实现自离心室的内部空腔输送经配制组合物，所述经配制组合物是在如所述的任何以上实施方案中，在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方案中，将经配制组合物输送至作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的容器(如本文所述的生物医学材料器皿的小瓶)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合至和或可操作连接至并且/或者被整合至或可操作地连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至系统。在一些情况下，所述封闭系统在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
和
2系统。
在一些实施方案中，如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供经配制组合物输送。在一些方面，所需数量或多个小瓶可以无菌连接至多端口输出中的一个或多个，通常两个或更多个，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个端口。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至所述端口或少于全部的所述端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物输送至生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，可以将细胞以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量输送至多个输出容器(例如，生物医学材料器皿的小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，生物医学材料器皿的小瓶可以各自含有以给定剂量或其部分施用的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于施用的单一单位剂量，或者可以含有所需剂量的一部分，使得多个小瓶中的多于一个，如两个小瓶或3个小瓶一起构成用于施用的剂量。
因此，本文所述的小瓶通常含有待施用的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是要施用于受试者的细胞的量或数量，或者是要施用的细胞的数量的两倍(或更多数量)。它可以是要施用于受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x106、2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的经配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，如至少或约至少或约20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，容器(例如袋或小瓶)中的细胞可以是冷冻保存的。在一些实施方案中，容器(例如小瓶)可以储存在液氮中，直到进一步使用。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物施用至受试者以治疗疾病或病症。
III.用于基因工程化的重组受体
在一些实施方案中，所述治疗性细胞组合物的细胞例如CD4+细胞、CD8+细胞是编码重组蛋白的工程化细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的工程化细胞含有或表达重组蛋白，如重组受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，所述的制造或工程化方法产生和/或能够产生细胞或者含有和/或富含细胞的群体或组合物，所述细胞被工程化为表达或含有重组蛋白(如重组受体)。
在一些方面，所编码的重组受体是嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)。重组受体包括嵌合受体、抗原受体和含有嵌合受体或抗原受体的一种或多种组分的受体。重组受体可以包括含有配体结合结构域或其结合片段和细胞内信号传导结构域或区域的那些。在一些实施方案中，由所述工程化细胞编码的重组受体包括功能性非TCR抗原受体、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)、重组T细胞受体(TCR)和前述任一种的区域、结构域或组分，包括多链重组受体的一个或多个多肽链。所述重组受体(如CAR)通常包括(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。在一些实施方案中，由工程化细胞表达的示例性重组受体包括含有两种或更多种受体多肽的多链受体，所述两种或更多种受体多肽在一些情况下含有不同的组分、结构域或区域。在一些方面，重组受体含有两种或更多种多肽，所述两种或更多种多肽共同构成功能性重组受体。在一些方面，多链受体是双链受体，其包含共同构成功能性重组受体的两种多肽。在一些实施方案中，重组受体是包含两种不同受体多肽(例如，TCR alpha(TCRα)和TCR beta(TCRβ)链；或TCR gamma(TCRγ)和TCR delta(TCRδ)链)的TCR。在一些实施方案中，重组受体是多链受体，其中所述多肽中的一种或多种调控、修饰或控制另一种受体多肽的表达、活性或功能。在一些方面，多链受体允许对受体的特异性、活性、抗原(或配体)结合、功能和/或表达进行空间或时间调控或控制。
A.嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，所编码的重组受体是对特定抗原(或标记或配体)(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶标细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或病原细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包括胞质信号传导结构域或区域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域或区域)，如能够在T细胞中诱导初级激活信号的胞质(细胞内)区域，例如，T细胞受体(TCR)组分的胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的胞质信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)；和/或所述细胞内信号传导区包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
在一些实施方案中，嵌合受体进一步含有与配体(例如，抗原)抗原特异性结合的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有特异性地结合至抗原的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类抗原受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci TranslMed.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原例如为在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如癌症标记)和/或旨在诱导衰减应答的抗原(例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一个或多个细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或类似通过天然抗原受体(如TCR)的信号，并且任选地模拟或类似通过这种受体与共刺激受体的组合的信号。
在一些实施方案中，重组受体(如嵌合受体(例如，CAR))包括与抗原(或配体)结合(如特异性结合)的配体结合结构域。嵌合受体靶向的抗原包括在经由过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的背景下表达的那些。疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌症、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，CAR含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，CAR是对BCMA(例如人BCMA)具有特异性的抗BCMA CAR。先前已经描述了含有抗BCMA抗体(包括小鼠抗人BCMA抗体和人抗人抗体)的嵌合抗原受体以及表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060，WO 2016/090320，WO 2016090327，WO 2010104949A2和WO 2017173256。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR含有抗原结合结构域(如scFv)，所述抗原结合结构域含有源自WO 2016/090320或WO 2016090327中所述的抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:13中所示的VH和SEQ ID NO:14中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:15中所示的VH和SEQ IDNO:16中所示的VL。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:17所示的VH和SEQ ID NO:18所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQID NO:19中所示的VH和SEQ ID NO:20中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:21所示的VH和SEQ ID NO:22所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:23中所示的VH和SEQ ID NO:24中所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:25中所示的VH和SEQ ID NO:26中所示的VL。在一些实施方案中，VH或VL具有与任何前述VH或VL序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且保留与BCMA结合的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH区位于VL区的氨基末端。在一些实施方案中，VH区位于VL区的羧基末端。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性地识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自与CD19特异性结合的抗体或抗原结合片段或者是其变体。在一些实施方案中，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。
在一些实施方案中，CAR是对CD19(例如人CD19)具有特异性的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，scFv和/或VH结构域源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987)。Leucocytetyping III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含分别在SEQ ID NO:30和31所示的CDR-H1和CDR-H2，和SEQ ID NO:32或33所示的CDR-H3；以及SEQ ID NO:27所示的CDR-L1和SEQ ID NO:28或34所示的CDR-L2和SEQ ID NO:29或35所示的CDR-L3序列。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:27的CDR-L1序列、SEQ ID NO:28的CDR-L2序列和SEQ ID NO:29的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:30的CDR-H1序列、SEQ ID NO:31的CDR-H2序列和SEQ ID NO:32的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:36中所示的可变重链区和SEQ ID NO:37中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ IDNO:38所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列或展现出与SEQID NO:39至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:40至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987)。Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别如SEQ ID NO:41-43所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列，以及分别如SEQ ID NO:44-46所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，scFv包含含有SEQID NO:44的CDR-L1序列、SEQ ID NO:45的CDR-L2序列和SEQ ID NO:46的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:41的CDR-H1序列、SEQ ID NO:42的CDR-H2序列和SEQ ID NO:43的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:47中所示的可变重链区和SEQ ID NO:48中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:49所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:50至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述CAR是对CD20具有特异性的抗CD20 CAR。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD20的抗体或抗体片段是如下抗体，所述抗体是利妥昔单抗或源自利妥昔单抗，如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，所述CAR是对CD22具有特异性的抗CD22 CAR。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD22的抗体或抗体片段是抗体，所述抗体是m971或源自m971，如是m971scFv。
在一些实施方案中，所述CAR是对GPRC5D具有特异性的抗GPRC5D CAR。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO2016/090312所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗体是包括一个或多个接头的抗原结合片段(如scFv)，所述一个或多个接头连接两个抗体结构域或区域(如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区)。所述接头通常是肽接头，例如，柔性和/或可溶性肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下苏氨酸的那些接头。在一些实施方案中，接头还包括带电荷的残基(如赖氨酸和/或谷氨酸)，其可以改善溶解性。在一些实施方案中，接头还包括一个或多个脯氨酸。在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。示例性接头包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:51)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:52)的重复的接头，例如在这样的序列的2个、3个、4个和5个重复之间。示例性接头包括具有SEQ ID NO:53(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:54(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或SEQ ID NO:55(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)所示的序列或由其组成的那些。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，如特异性识别作为MHC-肽复合物于细胞表面上呈递的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是具有跨膜α链(在一些情况下具有三个α结构域)和非共价缔合的β2微球蛋白的异二聚体。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β构成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(如通常是CD8+ T细胞，但是在一些情况下是CD4+ T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中肽通常被CD4+ T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，它们在小鼠中统称为H-2，并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，如用于由抗原受体识别。通常，肽源自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，肽通常具有约8至约24个氨基酸的长度。在一些实施方案中，对于MHC II类复合物中的识别，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC I类复合物中的识别，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)背景下的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，诱导T细胞反应，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞反应或其他反应。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如，美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际PCT公开号WO03/068201)。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原是例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主施用有效量的免疫原以用于引发免疫反应，其中免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫反应的时间。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如，美国公开申请号US 20020150914、US 2014/0294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括抗原结合的片段(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在一些情况下是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是已知的，在一些情况下是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A and Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMolBiol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。
下表4列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
表4.根据各种编号方案的CDR边界。
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情形中，指定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，所述抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
包括在所提供的CAR中的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗原结合结构域是或包括含有可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的抗体片段。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基都衍生自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述重组受体(如CAR，如其抗体部分)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。
在一些例子中，间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125-135或国际专利申请公开号WO 2014031687、美国专利号8,822,647或US2014/0271635。在一些实施方案中，间隔子包括免疫球蛋白铰链区、CH2区和CH3区的序列。在一些实施方案中，铰链、CH2和CH3中的一个或多个全部或部分源自IgG4或IgG2。在一些情况下，所述铰链、CH2和CH3源自IgG4。在一些方面，所述铰链、CH2和CH3中的一个或多个是嵌合的并且含有源自IgG4和IgG2的序列。在一些例子中，间隔子含有IgG4/2嵌合铰链、IgG2/4CH2区、和IgG4 CH3区。
在一些实施方案中，间隔子可以全部或部分地源自IgG4和/或IgG2。在一些实施方案中，所述间隔子可以是含有源自IgG4、IgG2和/或IgG2和IgG4的铰链、CH2和/或CH3序列中的一种或多种的嵌合多肽。在一些实施方案中，间隔子可以含有突变，如在一个或多个结构域中的一个或多个单氨基酸突变。在一些例子中，氨基酸修饰是在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在一些实施方案中，氨基酸修饰是天冬酰胺(N)被谷氨酰胺(Q)取代以降低糖基化异质性，如在对应于SEQ ID NO:70所示的IgG4重链恒定区序列的CH2区中的位置177的位置(Uniprot登录号P01861；对应于依据EU编号的位置297和SEQ ID NO:56所示的铰链-CH2-CH3间隔子序列的位置79的位置)处的N至Q取代，或在对应于SEQ ID NO:57所示的IgG2重链恒定区序列的CH2区中的位置176的位置(Uniprot登录号P01859；对应于依据EU编号的位置297的位置)处的N至Q取代。
在一些方面，所述间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ IDNO:58所示的仅铰链间隔子，且由SEQ ID NO:60所示的序列编码。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:59所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:56所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:61中所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有与SEQ ID NO:56-61中的任何一个展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
所述抗原识别结构域通常连接至一种或多种细胞内信号传导组分，如模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)进行刺激或激活和/或经由另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导区连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用与受体(例如，CAR)中的一个结构域天然地缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下(即包含其至少一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。
细胞内信号传导区包括模拟或类似以下的那些：通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体的组合的信号、和/或仅通过共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
所述受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，所述受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述ROR1结合抗体与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)进一步包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接所述CAR后，所述CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区激活免疫细胞(例如，工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能,如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区的截短部分(例如如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区(例如包含一个或多个细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情境下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，所述CAR中的胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，所述CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导区和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR包括信号传导区和共刺激组分两者。
在一些实施方案中，所述信号传导区包括于一种CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。
在某些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，所述CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区之间的跨膜结构域。
在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文描述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及细胞内信号传导结构域(含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体)。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及细胞内信号传导结构域(含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体)。在一些此类实施方案中，所述受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:62至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区和/或结构域可以包含SEQ ID NO:64或65所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:64或65展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，例如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的胞质结构域或其功能变体或部分，例如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:66至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含SEQ ID NO:67、68或69所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:67、68或69展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:58所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:59所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:56所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
B.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，所编码的重组受体是识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且其能够特异性结合至与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，所述TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，所述TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区的用于所述肽-MHC复合物的加工肽部分的抗原识别和/或用于与其相互作用的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与所述MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，β链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4:33页,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可在每条α和β链中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，所述TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，所述TCR链含有胞质尾。在一些情况下，结构允许TCR与其他分子(如CD3和其亚基)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将所述蛋白质锚定在细胞膜中并与所述CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα,β链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是易于获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，所述TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对所述TCR序列的知识以合成方式产生。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，TCR文库可以从CD4+或CD8+细胞产生。在一些实施方案中，所述TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T细胞)中进行RT-PCR。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增的产物被克隆或组装以通过接头分开。取决于受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。在一些方面，使TCR经历例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，所述TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细胞，如通过筛选以评估针对所述肽的CTL活性。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过对抗原的结合活性(例如，特定亲和力或亲合力)来选择。
在一些实施方案中，基因工程化抗原受体包括重组T细胞受体(TCR)和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定、分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)NatBiotechnol.23:349-354。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性如具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和力的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法实现定向进化，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad SciU S A,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于在产生或生成目的TCR中使用的靶多肽的肽是已知的或可以由熟练技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目标靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的蛋白酶体和免疫蛋白酶体的HLA-A0201结合基序和切割位点是已知的。用于预测MHC I类结合位点的此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI Database forSearching and T-Cell Epitope Prediction.,Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409卷(1):75-93 2007)。
在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式(其中一种或多种特性(如结合特征)已经被改变)。在一些实施方案中，TCR可以来源于各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，所述TCR呈在细胞的表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，所述TCR是全长TCR。在一些实施方案中，所述TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，所述TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，所述TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述TCR在细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。在一些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链(含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序)和TCRβ链(包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法产生scTCR，参见例如Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如国际公开PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段、由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段(融合至对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端)和将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接所述第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中所述氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，所述第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少所述scTCR与所述靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从或从约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:23)
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。
在含有引入的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，用形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸取代另一残基，如取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际PCT号WO 2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现出亲和力，所述平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方法扩增，并且克隆到一种或多种合适的表达载体中。所述表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备所述重组表达载体。在一些实施方案中，所述载体可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其可操作地连接至编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想其他已知的启动子。
在一些实施方案中，在获得T细胞克隆之后，将TCRα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，TCRα和β基因经由小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，TCR的遗传转移是通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子完成(参见例如，Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal of theAmerican Society of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人(2010)MolecularTherapy:The Journal of the American Society of Gene Therapy.18:1748-1757；和Hackett等人(2010)Molecular Therapy:The Journal of the American Society ofGene Therapy.18:674-683。
在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目标TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
IV.施用方法
在一些方面，包含工程化细胞(例如，工程化CD4+和CD8+细胞)的治疗性细胞组合物可以与治疗方法结合使用，所述治疗方法例如包括施用已经使用本文提供的方法评估的任何工程化细胞或含有工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，表达重组受体的工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物可用于多种治疗性、诊断性和预防性适应证。例如，所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物(例如，治疗性细胞组合物)可用于治疗受试者的多种疾病和障碍。方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及将工程化细胞或含有工程化细胞的组合物施用于患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者。在一些实施方案中，将使用本文提供的实施方案评估或评价的工程化细胞或组合物以有效量施用以实现所述疾病或障碍的治疗。用途包括工程化细胞或组合物在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，通过向患有或怀疑患有所述疾病或病症的受试者施用所评估或评价的工程化细胞或包含其的组合物来进行所述方法(例如，治疗性方法)。在一些实施方案中，这些方法从而治疗所述受试者的所述疾病或病症或障碍。
在一些方面，可以将所述工程化细胞或工程化细胞组合物施用于受试者，如患有疾病或障碍的受试者。用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞疗法方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)NatRev Clin Oncol.8(10):577-85。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或者例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。示例性抗原(其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原)描述于上文中。在特定实施方案中，嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合至与疾病或病症相关的抗原。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B))。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与所述疾病或障碍相关的抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原，如病毒抗原(例如，来自HIV、HCV、HBV的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性地识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自与CD19特异性结合的抗体或抗原结合片段或者是其变体。在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受细胞疗法的受试者或从源自这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将细胞施用于同一受试者。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。在一些方面，所述疾病或病症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些情况下，所述疾病或病症是NHL(例如或包括作为侵袭性NHL的NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性结合至与疾病或病症相关的抗原或在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30、或其组合。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性结合至与疾病或病症相关的抗原或在与多发性骨髓瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原。在一些方面，在多发性骨髓瘤上表达抗原，例如第二或另外抗原，如疾病特有抗原和/或相关抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917--27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，抗原包括存在于淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下中描述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US 20120189622或US 20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO 2009080829或WO 2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，疾病或障碍与G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的表达和/或B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关。
在一些实施方案中，疾病或障碍是B细胞相关障碍。在所提供方法的任何所提供实施方案的一些实施方案中，与BCMA相关的疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。在所提供方法的任何所提供实施方案的一些实施方案中，自身免疫性疾病或障碍是系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、ANCA相关性血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、查加斯病(Chagas'disease)、格雷夫斯病(Grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、寻常型天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、血管炎、糖尿病、雷诺综合征(Reynaud's syndrome)、抗磷脂综合征、古德帕斯丘病(Goodpasture'sdisease)、川崎病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性肾小球肾炎。
在一些实施方案中，疾病或障碍是癌症。在一些实施方案中，癌症是表达GPRC5D的癌症。在一些实施方案中，癌症是浆细胞恶性肿瘤，并且浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者与所述第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
可以将所述细胞通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过例如在不超过3天的时间段内细胞的多次推注施用，或通过细胞的连续输注施用来施用。在一些实施方案中，细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的施用是经由门诊递送进行的。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、是针对预防目的还是针对治疗目的而施用细胞、先前治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，适合将组合物和细胞一次或在一系列治疗中施用于受试者。
在一些实施方案中，将所述细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任何顺序依序施用。在一些实施方案中，将所述细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预联合施用(同时或以任何顺序依序施用)。在一些情境下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之前施用所述细胞。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之后施用所述细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂包括细胞因子如IL-2，以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括施用化学治疗剂。
在一些实施方案中，在所述施用之前向所述受试者施用化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)例如以减小肿瘤负荷。
在一些方面，用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，在开始所述细胞疗法之前将预调理剂施用于所述受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在开始所述细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向所述受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在开始所述细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向所述受试者施用预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，将环磷酰胺每日施用一次，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，按如下剂量向受试者施用环磷酰胺：在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或者250mg/m2与350mg/m2之间，包含端值。在一些情形中，向受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每日施用环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始细胞疗法之前每日向受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，当淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨时，向受试者施用剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2之间、如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间或24mg/m2与35mg/m2之间的氟达拉滨(包含端值)。在一些情形中，向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每日施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始细胞疗法之前每日向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可包括任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时间表)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者施用60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5次剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物学活性。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在一些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
在某些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，使得其治疗或预防功效增加。例如，可以将群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践在本领域是已知的。参见例如Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，将所述细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任何顺序依序施用。在一些实施方案中，将所述细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预联合施用(同时或以任何顺序依序施用)。在一些情境下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之前施用所述细胞。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之后施用所述细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)例如以增强持久性。
A.给药
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞施用于受试者。在一些实施方案中，剂量的大小或时间安排根据受试者的特定疾病或病症确定。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。
在一些实施方案中，细胞剂量包含在为或约2x105个细胞/kg与为或约2x106个细胞/kg之间，如在为或约4x105个细胞/kg与为或约1x106个细胞/kg之间或在为或约6x105个细胞/kg与为或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的剂量包含不超过2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg、或者不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的剂量包含至少或至少约或为或约2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x106个细胞/kg、或至少或至少约或为或约2x106个细胞/kg。
在某些实施方案中，向受试者施用为或约10万至为或约1000亿个细胞和/或每公斤受试者体重的该细胞量的范围的细胞或细胞亚型的单独群体，例如像为或约10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或由前述任何两个值限定的范围)，并且在一些情况下，为或约1亿个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约1.2亿个细胞、为或约2.5亿个细胞、为或约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、为或约6.5亿个细胞、为或约8亿个细胞、为或约9亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，细胞剂量是细胞的平剂量或细胞的固定剂量，使得细胞剂量不依赖于或基于受试者的体表面积或体重。在一些实施方案中，这些值是指表达重组受体的细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指施用的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包括少于约5x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如，在约1x106至5x108个此类细胞的范围内，如2x106、5x106、1x107、5x107、1x108或5x108，为或约1x106至为或约5x108个此类细胞，如为或约2x106、5x106、1x107、5x107、1x108、1.5x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包括多于或多于约1x106个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)并且少于或少于约2x109个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如在为或约2.5x107至为或约1.2x109个此类细胞的范围内，如为或约2.5x107、5x107、1x108、1.5x108、8x108或1.2x109个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x105至为或约5x108个总CAR表达(CAR+)T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约2.5x107至为或约1.5x108个总CAR表达T细胞，如从或从约5x107至或至约1x108个总CAR表达T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约1.5x108个CAR表达细胞、至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞、或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，从或从约5x105至或至约1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)或者从或从约1x106至或至约1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量的细胞，所述剂量包含以下细胞数量：至少或至少约1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单个核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106、至少或至少约1x107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3表达细胞或CD8表达细胞的总数，在一些情况下也是关于重组受体表达(例如CAR表达)细胞的总数。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个表达CD3或表达CD8的总T细胞或表达CD3或表达CD8的重组受体表达细胞、从或从约5x105至或至约1x107个表达CD3或表达CD8的总T细胞或表达CD3或表达CD8的重组受体表达细胞、或从或从约1x106至或至约1x107个表达CD3或表达CD8的总T细胞或表达CD3或表达CD8的重组受体表达细胞(每个都包含端值)。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下数量的细胞：从或从约1x105至或至约5x108个总CD3表达/CAR表达或CD8表达/CAR表达细胞、从或从约5x105至或至约1x107个总CD3表达/CAR表达或CD8表达/CAR表达细胞、或从或从约1x106至或至约1x107个总CD3表达/CAR表达或CD8表达/CAR表达细胞(每个都包含端值)。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包含CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，则所述剂量的CD8+ T细胞(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)包括在为或约1x106与为或约5x108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达CD8+细胞，例如在以下范围内：从为或约5x106至为或约1x108个此类细胞，如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或从约1x107至或至约0.75x108个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x107至或至约5x107个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x107至或至约0.25x108个总重组受体表达CD8+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108、2.5x108、或5x108个总重组受体表达CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的剂量作为单一剂量施用于受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。
在过继细胞疗法的情况下，施用给定“剂量”涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情境下，剂量是指定数量的细胞的单次或连续施用，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情境下，剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式施用，例如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指这样分割的剂量，使其在超过一天的时间内施用。这种类型的给药包括在本方法中并且被认为是单一剂量。
因此，所述细胞剂量可以作为分割剂量施用，例如随时间施用的分割剂量。例如，在一些实施方案中，剂量可以在2天或3天内施用受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用33％的剂量，并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过施用多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来施用，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地施用各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多个组合物。例如，细胞的群体或亚型可以分别包括CD8+和CD4+ T细胞，和/或分别富含CD8+和富含CD4+的群体，例如，各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞的CD4+和/或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的施用包括施用第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+ T细胞或一定剂量的CD4+ T细胞，以及施用第二组合物，所述第二组合物包含所述剂量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的另一种。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的施用(例如，所述多种细胞组合物的施用)涉及分开施用所述细胞组合物。在一些方面，分开施用同时或按任何顺序依序进行。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且将第一组合物和第二组合物相隔从为或约0至为或约12小时、相隔从为或约0至为或约6小时或相隔从为或约0至为或约2小时施用。在一些实施方案中，开始施用第一组合物和开始施用第二组合物是相隔不超过或不超过约2小时、不超过或不超过约1小时或不超过或不超过约30分钟，相隔不超过或不超过约15分钟、不超过或不超过约10分钟或不超过或不超过约5分钟进行的。在一些实施方案中，开始和/或完成施用第一组合物和完成和/或开始施用第二组合物是相隔不超过或不超过约2小时、不超过或不超过约1小时或不超过或不超过约30分钟，相隔不超过或不超过约15分钟、不超过或不超过约10分钟或不超过或不超过约5分钟进行的。
在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前施用。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量或组合物包括限定或目标比率的表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或限定或目标比率的CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有不同细胞群的目标或所需比率(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如，1:1)的组合物或剂量的施用涉及施用含有所述群体中的一种的细胞组合物，然后施用包含所述群体中的另一种的单独细胞组合物，其中所述施用是以或大约以所述目标或所需比率来进行。在一些方面，定义比率的细胞的剂量或组合物的施用导致改善T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天施用。在一些实施方案中，在第一剂量后施用多个连续剂量，使得在施用所述连续剂量后施用另外一个或多个剂量。在一些方面，在另外的剂量中施用于受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，所述第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如所述受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、所述受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或所述受试者发生毒性结局(例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的施用与连续剂量的施用之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，施用所述连续剂量是在施用所述第一剂量后大于约14天且在施用所述第一剂量后小于约28天的某个时间点进行。在一些方面，所述第一剂量与所述连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在施用先前剂量后至少约14天且小于约28天施用另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)施用所述另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不施用剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不施用剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双剂量)，包含第一剂量的T细胞和连续剂量的T细胞，其中第一剂量和第二剂量中之一或两者包括施用分割剂量的T细胞。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量通常足够大以有效减少疾病负荷。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，细胞的所述剂量在一些实施方案中是基于总细胞数(或每kg体重的数量)以及单独群体或亚型的所需比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量基于所需的单独群体中的细胞或单独细胞类型的总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，剂量基于这种特征的组合，如所需的总细胞数量、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如所需剂量的T细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内施用细胞的群体或亚型如CD8+和CD4+ T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小细胞数量。在一些方面，在以所需剂量施用的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，所述细胞是以细胞的一种或多种单独群体或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)来施用，或在所述所需剂量的容忍差异内施用。在一些方面，所需剂量是亚型或群体的细胞的所需数量或被施用所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞的所需数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小的群体或亚型的细胞数量或每单位体重的最小的群体或亚型的细胞数量。
因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比例，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如各自)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+细胞的比率，和/或基于所需的CD4+和/或CD8+细胞的固定或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞是以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率来施用，或在所述所需输出比率的容忍范围内施用。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)是在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)、或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的施用：受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。在一些实施方案中，基于根据本文提供的方法确定的临床反应来确定一个或多个另外的剂量的施用。
V.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解，在所述范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(如序列表所示)是指，在使用标准比对算法(例如，GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导，鉴定相应的残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见例如，Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,纽约,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，例如逆转录病毒(例如γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择，具有相同功能或生物活性的突变体后代。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括为了在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
氨基酸取代可以包括用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。所述取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入感兴趣的结合分子(例如抗体)、和针对所希望的活性(例如保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
VI.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种鉴定与临床反应相关的特征的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有CAR的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种所述受试者特征、一种或多种所述输入组合物特征和一种或多种所述治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和所获得的临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机森林模型；以及
(e)从经训练的随机森林模型鉴定与所述临床反应相关的信息特征。
2.一种鉴定与临床反应相关的特征的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种所述受试者特征、一种或多种所述输入组合物特征和一种或多种所述治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型；以及
(e)从经训练的随机存活森林模型鉴定与所述临床反应相关的信息特征。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中鉴定与所述临床反应相关的信息特征包括确定每种所述信息特征的重要性量度。
4.根据实施方案3所述的方法，其中所述重要性量度包括置换重要性量度、平均最小深度和/或来自所述随机森林的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。
5.根据实施方案3所述的方法，其中所述重要性量度包括置换重要性量度、平均最小深度和/或来自所述随机存活森林的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。
6.根据实施方案3-5中任一项所述的方法，其中所述重要性量度是所述置换重要性量度。
7.根据实施方案3-5中任一项所述的方法，其中所述重要性量度是所述平均最小深度。
8.根据实施方案3或实施方案4所述的方法，其中所述重要性量度是来自所述随机森林的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。
9.根据实施方案3或实施方案5所述的方法，其中所述重要性量度是来自所述随机存活森林的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。
10.根据实施方案3-10中任一项所述的方法，其中与所述临床反应相关的信息特征是通过每种所述信息特征的重要性量度的等级排序鉴定的前10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种信息特征，其中所述重要性量度对于每种信息特征是相同的。
11.根据实施方案3-10中任一项所述的方法，其中与所述临床反应相关的信息特征是通过每种所述信息特征的重要性量度的等级排序值鉴定的前5种信息特征，其中所述重要性量度对于每种信息特征是相同的。
12.根据实施方案3-11中任一项所述的方法，其中与所述临床反应相关的信息特征是通过每种所述信息特征的重要性量度的等级排序值鉴定的首个信息特征，其中所述重要性量度对于每种信息特征是相同的。
13.一种确定临床反应的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及
(b)将所述特征作为输入应用于随机森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机森林模型的特征相同。
14.一种确定临床反应的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及
(b)将所述特征作为输入应用于随机存活森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机存活森林模型的特征相同。
15.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
(a)从来自受试者的样品中选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；
(b)确定包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及
(c)将所述特征作为输入应用于随机森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机森林模型的特征相同；以及
将治疗施用于所述受试者，其中：
(1)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述毒性是2级或更低分级的CRS或2级或更低分级的神经毒性)；或者
(2)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
16.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
(a)从来自受试者的样品中选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；
(b)确定包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及
(c)将所述特征作为输入应用于随机存活森林模型，所述随机森林模型被训练为以在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定有待用所述治疗性细胞组合物治疗的所述受试者的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机存活森林模型的特征相同；以及
将治疗施用于所述受试者，其中：
(1)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述毒性是2级或更低分级的CRS或2级或更低分级的神经毒性)；或者
(2)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
17.根据实施方案13或实施方案15所述的方法，其中使用监督训练对所述随机森林模型进行训练，所述监督训练包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的信息特征和获得的临床反应作为输入来训练随机森林模型。
18.根据实施方案14或实施方案16所述的方法，其中使用监督训练对所述随机存活森林模型进行训练，所述监督训练包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型。
19.一种开发随机森林模型的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的信息特征和获得的临床反应作为输入来训练随机森林模型。
20.一种开发随机存活森林模型的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型。
21.根据实施方案1-12和17-20中任一项所述的方法，其中向所述多名受试者中的每一名施用所述多种治疗性细胞组合物中的一种，其中向所述受试者施用的所述一种治疗性细胞组合物是从来自所述受试者的样品的输入组合物产生的治疗性细胞组合物。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括以下中的一个或多个：
a)去除数据缺失大于、大于约或50％的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；
b)去除具有零方差，或大于、大于约或95％的等于单个值的数据值，和/或小于0.1n个独特值的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征，其中n＝样本数量；
c)通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据；
d)鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有大于、约或等于0.5的相关系数的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是去除数据缺失大于、约或50％的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是去除具有零方差或大于、约或95％的等于单个值的数据值且小于0.1n个独特值(其中n＝样本数量)的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有大于、约或等于0.5的相关系数的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
27.根据实施方案1、3、4、6-8、10-13、15、17、19和21-26中任一项所述的方法，其中使用交叉验证来评价所述随机森林模型。
28.根据实施方案2、3、5-7、9-12、14、16、18和20-26中任一项所述的方法，其中使用交叉验证来评价所述随机存活森林模型。
29.根据实施方案27或实施方案28所述的方法，其中所述交叉验证是或是至少10折交叉验证。
30.根据实施方案27或28中任一项所述的方法，其中所述交叉验证是嵌套交叉验证。
31.根据实施方案1-12和17-30中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是或是约500、400、300、200、150、100、50、25、15或10名受试者，或者是任何前述值之间的任何数量。
32.根据实施方案1-12和17-31中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于10名受试者且小于250名受试者。
33.根据实施方案1-12和17-33中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者且小于200名受试者。
34.根据实施方案1-12和17-33中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于20名且小于150名受试者。
35.根据实施方案1-12和17-34中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者且小于150名受试者。
36.根据实施方案1-12和17-35中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者小于100名受试者。
37.根据实施方案1-12和17-36中任一项所述的方法，其中所述多名受试者正参与临床试验。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中所述受试者特征包括受试者属性和临床属性中的一种或多种。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述受试者属性包括年龄、重量、身高、种族、人种、性别和体重指数中的一种或多种。
40.根据实施方案38或实施方案39所述的方法，其中所述临床属性包括生物标记、疾病诊断、疾病负荷、疾病持续时间、疾病分级和治疗史中的一种或多种。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述输入组合物特征包括细胞表型。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物特征包括细胞表型、重组受体依赖性活性和剂量中的一种或多种。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述临床反应包括以下中的一种或多种：完全反应(CR)、部分反应(PR)、持久反应、无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应、无或轻度毒性反应、毒性反应、与目标反应相比降低的药代动力学反应，或缺乏CR、PR、持久反应、OR或PFS。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述样品包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述样品是单采术产物或白细胞单采术产物。
46.根据实施方案45所述的方法，其中所述单采术产物或白细胞单采术产物先前已经进行冷冻保存。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述T细胞包含从所述受试者获得的原代细胞。
48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中所述T细胞包含CD3+、CD4+和/或CD8+。
49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞，并且所述治疗性细胞组合物包含表达重组受体的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞并且由所述输入组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+ T细胞的治疗性细胞组合物特征。
50.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包括CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物，并且所述治疗性细胞组合物包括表达重组受体的CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物并且由所述输入组合物的相应CD4+或CD8+ T细胞组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的CD4+和CD8+ T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的各单独组合物的CD4+和CD8+T细胞的治疗性细胞组合物特征。
51.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包括CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物，并且所述治疗性细胞组合物包括表达重组受体的CD4+和CD8+ T细胞的混合组合物并且由所述输入组合物的单独CD4+和CD8+ T细胞组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的单独CD4+和CD8+ T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的CD4+和CD8+细胞的混合组合物的治疗性细胞组合物特征。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
53.根据实施方案15-18和21-52中任一项所述的方法，其中所述预定治疗方案包括或是包括施用以下的单一治疗：
a)向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞；
b)向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞；或
c)向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞。
54.根据实施方案15-18和21-52中任一项所述的方法，其中改变所述预定治疗方案包括或是包括施用以下的单一治疗：
当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞；
当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞；或
当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+ T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞。
55.根据实施方案15-18和21-52中任一项所述的方法，其中改变所述预定治疗方案包括或是包括施用以下的单一治疗：
当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+ T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞；
当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用50x106个CD8+CAR+T细胞和50x106个CD4+CAR+ T细胞；或
当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用75x106个CD8+CAR+ T细胞和75x106个CD4+CAR+ T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用25x106个CD8+CAR+T细胞和25x106个CD4+CAR+ T细胞。
56.根据实施方案15-18和21-52中任一项所述的方法，其中改变所述预定治疗方案包括将所述治疗性细胞组合物与第二治疗剂组合施用。
VII.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：用于评估对用治疗性细胞组合物治疗的临床反应的随机森林和随机存
活森林
对随机森林和随机存活森林进行了训练，以预测复发性或难治性大B细胞淋巴瘤受试者对用含有用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的治疗性细胞组合物治疗的临床反应。这些模型用于鉴定与临床反应相关的特征，包括受试者属性、治疗性细胞组合物属性以及用于产生治疗性细胞组合物的起始材料的属性。
A.受试者和治疗
向患有复发性或难治性大B细胞淋巴瘤(LBCL)的受试者(n＝172)施用工程化CD4+T细胞和工程化CD8+ T细胞的治疗性细胞组合物，所述细胞各自表达相同的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)。
为产生治疗性细胞组合物，从已通过白细胞单采术获得的人外周血单个核细胞(PBMC)中通过基于免疫亲和力的选择单独选择CD4+和CD8+细胞，从而生成单独的经富集CD4+和经富集CD8+细胞组合物(例如，输入组合物)，然后将其冷冻保存。随后将CD4+和CD8+组合物解冻，并分别经历刺激、转导和扩增的步骤。
将解冻的CD4+和CD8+细胞分别在与抗CD3和抗CD28抗体偶联的聚苯乙烯包被的顺磁珠的存在下进行刺激，珠与细胞的比率为1:1。在含有人重组IL-2、人重组IL-15和N-乙酰半胱氨酸(NAC)的培养基中进行刺激。所述CD4+细胞培养基还包含人重组IL-7。
引入所述珠之后，用编码相同抗CD19 CAR的慢病毒载体分别转导CD4+和CD8+细胞。CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv、免疫球蛋白间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。所述载体还编码截短的EGFR(EGFRt)，其用作CAR表达的替代标记，通过T2A序列连接至CAR构建体。在10μg/ml硫酸鱼精蛋白的存在下转导细胞。
转导后，通过暴露于磁场将所述珠从所述细胞组合物中去除。然后通过生物反应器(Xuri W25生物反应器)，在连续混合和氧气转移的情况下，分别培育CD4+和CD8+细胞组合物以进行扩增。将泊洛沙姆添加到培养基中。在IL-2和IL-15的存在下培育两种细胞组合物。CD4+细胞培养基还包含IL-7。在收获之前，将CD4+和CD8+细胞各自培育至4倍扩增。达到阈值后一天，分别收获、配制和冷冻保存来自每种组合物的细胞。示例性过程汇总于表E1中。
*大约
在用治疗性细胞组合物治疗之前，受试者接受了淋巴细胞清除化学疗法。在一些情况下，在白细胞单采术之后且在淋巴细胞清除化学疗法之前，向受试者施用桥接疗法以控制疾病。
在静脉内施用之前，将冷冻保存的治疗性细胞组合物解冻。将治疗性细胞组合物以大约1:1的目标比率的限定量的所配制的CD4+CAR+细胞和所配制的CD8+CAR+细胞施用。向受试者施用CAR表达T细胞的单一剂量(每个单一剂量通过分别单独输注CD4+CAR表达T细胞和CD8+CAR表达T细胞来施用)，如下：剂量水平1(DL1)的单一剂量含有50x106个总CAR表达T细胞(n＝5名受试者)，剂量水平2(DL2)的单一剂量含有100x106个总CAR表达T细胞(n＝126名受试者)，或者剂量水平3(DL3)的单一剂量含有150x106个总CAR表达T细胞(n＝41名受试者)。施用的目标剂量水平和T细胞子集数量列于表E2中。
B.特征评估和预处理
在用如上所述的治疗性细胞组合物治疗的172名个体中评估321种特征(包括患者属性、输入组合物属性和治疗性细胞组合物属性)的多变量分析。
对321种特征进行预处理，以鉴定用于对随机森林和随机存活森林进行监督训练的特征。从数据集中去除接近零方差的特征、值缺失大于70％的特征以及高度相关(|ρ|>0.7)的特征。对于值缺失少于70％的特征，将缺失值用均值或众数替代。
训练数据包括预处理的特征(例如，预测因子)和20种反应(例如，因变量)。反应包括无进展存活期(PFS)；总体反应率(ORR)；客观反应(OR)；完全反应(CR)；安全性：神经学事件(NE)分级≥1和分级≥3，以及细胞因子释放综合征(CRS)分级≥1和分级≥3；和药代动力学终点：log10曲线下面积(AUC)、log10最大浓度(Cmax)和达到峰浓度的时间(Tmax)。
C.多变量监督学习
使用十折交叉验证对随机森林和随机存活森林进行训练和测试。特征重要性和相关的基于置换的p值用于评估特征影响的显著性。使用Wilcoxon秩和检验、斯皮尔曼相关(Spearman correlation)和Cox比例风险模型支持单变量分析。
发现包括受试者属性和治疗性细胞组合物属性在内的多种特征与所检查的临床反应(例如，因变量)相关。患者肿瘤负荷和全身性炎症与CAR T细胞扩增、功效和安全性相关。通常，更高的肿瘤负荷与更高的体内CAR T细胞扩增相关，但与更低的功效和更高的不良事件风险相关。基线时更高的全身性炎症与更高的不良事件风险相关。在药物产品中，抗原特异性细胞因子水平的增加与扩增和功效呈正相关，并且分化程度较低的中枢记忆CART细胞的更高频率与更高的扩增和功效相关。表E3汇总了特征相关性的子集。
1随机(存活)森林中变量重要性的基于置换的p值(Altmann等人2010)。DLBCL，弥漫性大B细胞淋巴瘤；LDH，乳酸脱氢酶；NOS，非特指型。
这些数据支持使用随机森林和随机存活森林来鉴定与在对用治疗性细胞组合物治疗的反应方面的患者临床结局相关的特征。
实施例2：预处理方法
预处理在用如实施例1中所述的治疗性细胞组合物治疗的172名个体中评估的321种特征(包括患者属性、输入组合物属性和治疗性细胞组合物属性)，以鉴定用于随机森林和随机存活森林的监督训练的特征。预处理由四(4)个顺序步骤组成：
1.去除缺失数据>50％的特征；
2.去除具有零方差或近零方差的特征，其中近零方差由具有>95％由单一值支配的数据且具有小于0.1n个独特值(n＝样本数量)的特征定义；
3.通过链式方程(小鼠)使用多变量插补来输入缺失数据；以及
4.鉴定协变量簇并选择代表性特征。
通过首先计算异质相关矩阵来进行预处理的步骤4，所述异质相关矩阵由以下组成：数值特征之间的皮尔逊积差相关、数值特征与序数特征之间的多系列相关、以及序数特征之间的多分格相关。对于每对变量之间的相关性使用对这些变量的所有完整成对观察结果来计算。协变量簇被定义为相关系数>0.5(例如，|ρ|>0.5)的变量集合，并且代表性特征被迭代地选择为每个簇中与数据集中的所有其他剩余特征展现出最低平均绝对相关性的那些特征。
预处理鉴定了用于训练随机森林和随机存活森林的信息特征。
训练数据包括经鉴定的信息特征(例如，预测因子)和20种临床反应(例如，因变量)。反应包括无进展存活期(PFS)；客观反应(OR)；完全反应(CR)；安全性：神经学事件(NE)分级≥1和分级≥3，以及细胞因子释放综合征(CRS)分级≥1和分级≥3；和药代动力学终点：log10曲线下面积(AUC)、log10最大浓度(Cmax)和达到峰浓度的时间(Tmax)。
特征重要性和相关的基于置换的p值用于评估特征与临床反应的相关性。
实施例3：多变量监督学习，以鉴定与治疗性细胞组合物在大B细胞淋巴瘤中的临
床反应相关的特征
进行多变量监督学习以鉴定共同影响患有复发性或难治性大B细胞淋巴瘤的、用含有用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的治疗性细胞组合物治疗的受试者的临床结局的特征，如上文实施例1中所述。随机森林分类、回归和随机存活森林用于鉴定与临床反应相关的特征，包括受试者属性、治疗性细胞组合物属性以及用于产生治疗性细胞组合物的起始材料(例如，输入组合物)的属性。
A.特征评估和预处理
在用治疗性细胞组合物治疗的172名个体中评估了总共321种特征，包括受试者属性、治疗性细胞组合物属性和用于产生治疗性细胞组合物的起始材料(例如，输入组合物)的属性，如实施例1中所述。
数据的初始筛选去除了具有低科学相关性的特征，例如制造所特有的特征以及具有低动态范围(例如，其中整个分布低于5％)的特征。初始筛选鉴定了238种特征，包括与治疗性细胞组合物属性和用于产生治疗性细胞组合物的起始材料的属性相关的136种特征以及与受试者属性相关的102种特征。表E4示出了示例性特征。
对238种特征进行预处理，以鉴定用于对随机森林和随机存活森林模型进行监督训练的特征。预处理由四(4)个步骤组成：
1.去除具有零方差或近零方差的特征，其中近零方差由具有>95％由单一值支配的数据且具有小于0.1n个独特值(n＝样本数量)的特征定义；
2.去除值缺失(例如，不可用)>60％的特征；
3.鉴定高度相关(|ρ|>0.5)的特征，并选择一种代表性特征；以及
4.通过链式方程使用多变量插补来输入缺失值(小鼠；vanBuuren等人,Journalof Statistical Software.2011；45(3))。
通过首先计算异质相关矩阵来进行预处理的步骤3，所述异质相关矩阵由以下组成：数值特征之间的皮尔逊积差相关、数值特征与序数特征之间的多系列相关、以及序数特征之间的多分格相关。对于每对变量之间的相关性使用对这些变量的所有完整成对观察结果来计算。协变量簇被定义为相关系数>0.5的变量集合，并且代表性特征被迭代地选择为每个簇中与数据集中的所有其他剩余特征展现出最低平均绝对相关性的那些特征。
预处理鉴定了有待共同考虑的76种代表性独立特征。76种特征中，33种特征与治疗性细胞组合物属性和用于产生治疗性细胞组合物的起始材料的属性相关，以及47种特征与受试者属性相关。
模型的训练数据包括预处理的特征(例如，预测因子)和20种反应(例如，因变量)。反应包括：药代动力学结局，其包括AUC和Cmax；功效终点，如无进展存活期(PFS)、反应持续时间(DOR)、完全反应(CR)和客观反应(OR)；和安全性终点，其包括任何分级的和重度细胞因子释放综合征(CRS)和神经学事件(NE)。表E5提供了所考虑的示例性结局的列表。
aOR是通过部分反应率和完全反应率二值化的最佳客观反应。PFS、CR和OR由独立审查委员会评估。bCRS根据Lee标准进行分级(Lee DW,等人Blood.2014；124:188-195)。c NE基于研究者评估，并根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准v4.03进行分级。AUC0-28，至输注后28天的浓度-时间曲线下面积；Cmax，最大血清浓度；CRS，细胞因子释放综合征；NE，神经学事件；qPCR，定量聚合酶链式反应。
B.多变量监督学习
使用10折交叉验证对随机森林和随机存活森林进行了训练，以评估每种特征在其对临床反应的贡献中的重要性。
随机森林由决策树构成。使用患者子集和特征子集训练每棵树以防止过度拟合(图1A-图1B)。构建了数百棵决策树：选择具有特征间隔的子集以最好地分离感兴趣的反应，最小化分类的基尼不纯度、回归的均方根误差或存活的一致性指数。
对模型进行评估，以鉴定对确定临床反应重要的特征。通过置换测试来评估特征重要性的显著性P值(Altmann A,等人Bioinformatics.2010；26(10):1340-1347)。
1.药代动力学反应
五个示例性显著特征簇被鉴定为对于与在用治疗性细胞组合物治疗后的log10AUC0-28相关是重要的。示例性特征包括年龄、治疗性细胞组合物中CD8+ T细胞的效应细胞因子分泌、筛选期间的嗜碱性粒细胞、疾病组织学(PBMCL：原发性纵隔大B细胞淋巴瘤)和患者接受的先前治疗的数量(图2A)。
用治疗性细胞组合物治疗的较年轻患者倾向于经历更高的CAR T细胞扩增。通过定量聚合酶链式反应测量CAR T扩增，并通过流式细胞术验证。单变量的情况下，这也是正确的(图2B)，并且使用称为累积局部效应估计的技术考虑到多因素模型中的所有其他因素量化年龄的贡献。该技术可以独立于所有其他受试者、输入组合物和治疗性细胞组合物特征量化例如年龄的每1岁增加与log10AUC0-28的相关性如何。图2C示出了患者年龄对log10AUC0-28的累积局部效应。
还发现Log10AUC0-28与在用治疗性细胞组合物治疗之前患者接受的治疗数量相关。更少的先前疗法与更高的CAR T细胞扩增相关(图2D-图2E)。
治疗性细胞组合物的CD8+细胞的更低效应细胞因子分泌(其反映了更幼稚的表型)也与通过AUC0-28测量的细胞扩增增加相关(图2F-图2G)。
2.功效：PFS和CR
图3A-图3C示出了与PFS相关的示例性特征。更长的PFS与治疗性细胞组合物中CD4+细胞的更高功能性细胞因子产生相关(图3A-图3B)。
具有降低的肿瘤负荷(由在淋巴细胞清除化学疗法之前更低的LDH水平反映)的患者和患有从滤泡性淋巴瘤(tFL)或原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)转化的LBCL的患者也实现了更长的PFS(图3A和图3C)。可见胆红素与PFS之间的相关性弱；然而，这种作用显现是由胆红素水平低于正常水平的受试者驱动的。
图4A-图4E示出了与完全反应(CR)相关的示例性特征。治疗性细胞组合物的更高功能性细胞因子产生与更高的实现完全反应(CR；图4A-图4C)的概率相关。具有降低的肿瘤负荷的患者也更可能实现完全反应(图4A和图4D-图4E)。
3.安全性：NE和CRS
图5A-图5E示出了与安全性反应相关的示例性特征。具有更大肿瘤负荷(如通过在接受淋巴细胞清除化学疗法之前的LDH水平所测量的)的患者在接受治疗性细胞组合物之后更有可能经历任何分级的神经学事件(NE)或细胞因子释放综合征(CRS)(图5A-图5D)。
需要在单采术与输注治疗性细胞组合物之间进行桥接疗法的患者还具有更高的经历CRS的风险，这可能是由于其病症的严重程度而使得需要桥接疗法(图5A、图5B和图5E)。
表E6汇总了与临床反应相关的示例性特征。
肿瘤负荷和治疗性细胞组合物的细胞的抗原特异性功能是与对用治疗性细胞组合物治疗的PK(细胞扩增；AUC0-28)、功效(PFS，CR)和安全性(CRS，NE)反应相关的最重要特征。
更高的肿瘤负荷与增加的CAR T细胞扩增(AUC0-28)、CRS和神经学事件的风险以及降低的功效相关。独立于肿瘤负荷，增加的抗原特异性细胞因子水平表达和治疗性细胞组合物中分化程度较低的CAR T细胞与增加的扩增和功效相关。
这些结果表明，基于受试者和制造数据(例如，输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征)通往细胞疗法的监督学习途径提供了对患者临床结局的多因素影响的见解。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> 鉴定与临床反应相关的特征的方法及其用途
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Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
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<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
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<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 22
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
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<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 23
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 27
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 28
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 29
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 30
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 31
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 32
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 33
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 34
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 35
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 36
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 38
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 39
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 39
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 40
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 41
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 42
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 43
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 47
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 48
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 50
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 54
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 55
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 56
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3 间隔子
<400> 56
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 57
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 58
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH3 间隔子
<400> 59
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 60
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 61
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 61
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 62
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸153-179)
<400> 62
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 63
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179)
<400> 63
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 64
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)
<400> 64
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 65
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (LL变为GG)
<400> 65
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 66
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)
<400> 66
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 67
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 68
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 69
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Claims (72)
1.一种确定临床反应的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，
所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及
(b)将所述特征作为输入应用于随机森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机森林模型的特征相同。
2.一种确定临床反应的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，
所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；以及
(b)将所述特征作为输入应用于随机存活森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机存活森林模型的特征相同。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述临床反应是或包括完全反应(CR)、部分反应(PR)、持久反应、无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应、无或轻度毒性反应、毒性反应、与目标反应相比降低的药代动力学反应，或缺乏CR、PR、持久反应或客观反应(OR)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述临床反应是完全反应(CR)或缺乏完全反应(CR)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述临床反应是部分反应(PR)或缺乏部分反应(PR)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述临床反应是客观反应(OR)或缺乏客观反应(OR)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述临床反应是毒性反应或缺乏毒性反应。
8.根据权利要求3或权利要求7所述的方法，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征(CRS)或重度神经毒性。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述临床反应是持久反应或缺乏持久反应。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述临床反应是反应持续时间(DOR)。
11.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述临床反应是至少或至少约三个月的反应持续时间(DOR)。
12.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述临床反应是无进展存活期(PFS)。
13.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述临床反应是至少或至少约三个月的无进展存活期(PFS)。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述临床反应是为或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应。
15.根据权利要求3或权利要求14所述的方法，其中所述药代动力学反应是对以下的测量：
(i)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述治疗性细胞组合物的CAR T细胞的扩增；
(ii)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述受试者中的最大CAR T细胞浓度；
(iii)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述受试者中CAR T细胞浓度最大的时间点；或者
(iv)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述受试者向所述治疗性细胞组合物的CAR T细胞的暴露。
16.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
(a)从来自受试者的样品中选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；
(b)确定包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；
(c)将所述特征作为输入应用于随机森林模型，所述随机森林模型被训练为在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定所述受试者对用所述治疗性细胞组合物治疗的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机森林模型的特征相同；以及
(d)将治疗施用于所述受试者，其中：
(1)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述轻度毒性反应是2级或更低分级的细胞因子释放综合征(CRS)或2级或更低分级的神经毒性)；或者
(2)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征(CRS)或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
17.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
(a)从来自受试者的样品中选择T细胞以产生包含T细胞的输入组合物；
(b)确定包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前从所述受试者确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从所述输入组合物确定的输入组合物特征，其中所述输入组合物包含从来自所述受试者的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)由所述治疗性细胞组合物确定的治疗性细胞组合物特征，其中所述治疗性细胞组合物由所述输入组合物产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述受试者；
(c)将所述特征作为输入应用于随机存活森林模型，所述随机森林模型被训练为以在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之前，基于通过预处理鉴定的信息特征确定有待用所述治疗性细胞组合物治疗的所述受试者的临床反应，其中所述被作为输入应用的特征与用于训练所述随机存活森林模型的特征相同；以及
(d)将治疗施用于所述受试者，其中：
(1)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则施用包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案：完全反应(CR)、部分反应(PR)、大于3个月的持久反应、超过3个月的无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应、以及没有或轻度毒性反应(任选地，其中所述轻度毒性反应是2级或更低分级的细胞因子释放综合征(CRS)或2级或更低分级的神经毒性)；或者
(2)如果确定所述受试者具有选自以下的临床反应，则向所述受试者施用与包含所述治疗性细胞组合物的预定治疗方案相比发生改变的包含所述治疗性细胞组合物的治疗方案：毒性反应(任选地，其中所述毒性反应是重度细胞因子释放综合征(CRS)或重度神经毒性)、与目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应、疾病进展(PD)、小于3个月的持久反应和小于3个月的PFS。
18.根据权利要求16所述的方法，其中对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有完全反应(CR)，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有完全反应(CR)，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有疾病进展(PD)，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
19.根据权利要求16所述的方法，其中对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有部分反应(PR)，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有部分反应(PR)，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有疾病进展(PD)，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
20.根据权利要求16所述的方法，其中对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有大于3个月的持久反应，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有大于三个月的持久反应，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有小于三个月的持久反应，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
21.根据权利要求17所述的方法，其中对所述随机存活森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有大于3个月的持久反应，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有大于三个月的持久反应，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有小于三个月的持久反应，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
22.根据权利要求16所述的方法，其中对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有超过3个月的无进展存活期(PFS)，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有超过三个月的无进展存活期(PFS)，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有小于三个月的无进展存活期(PFS)，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
23.根据权利要求17所述的方法，其中对所述随机存活森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有超过3个月的无进展存活期(PFS)，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有超过三个月的无进展存活期(PFS)，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有小于三个月的无进展存活期(PFS)，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
24.根据权利要求16所述的方法，其中对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有客观反应(OR)，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有客观反应(OR)，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有疾病进展(PD)，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
25.根据权利要求16所述的方法，其中对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者的药代动力学反应，并且其中：
(1)如果确定所述受试者具有为或超过目标药代动力学反应的期望药代动力学反应，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有与所述目标药代动力学反应相比降低的药代动力学反应，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述药代动力学反应是对以下的测量：
(i)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述治疗性细胞组合物的CAR T细胞的扩增；
(ii)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述受试者中的最大CAR T细胞浓度；
(iii)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述受试者中CAR T细胞浓度最大的时间点；或者
(iv)在用所述治疗性细胞组合物治疗所述受试者之后，所述受试者向所述治疗性细胞组合物的CAR T细胞的暴露。
27.根据权利要求16所述的方法，其中对所述随机森林模型进行训练以确定所述受试者是否将具有毒性反应，并且其中：
(1)如果确定所述受试者不具有毒性反应或具有轻度毒性反应，则向所述受试者施用所述预定治疗方案；或者
(2)如果确定所述受试者具有毒性反应，则向所述受试者施用所述改变的治疗方案。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述毒性反应是重度CRS或重度神经毒性。
29.根据权利要求16-28中任一项所述的方法，所述方法进一步包括产生所述治疗性细胞组合物。
30.根据权利要求1、3-16、18-20、22和24-29中任一项所述的方法，其中使用监督训练对所述随机森林模型进行训练，所述监督训练包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中
所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；以及
(d)应用来自所述多名受试者的信息特征和获得的临床反应作为输入来训练随机森林模型。
31.根据权利要求2、3、8-13、15、17、21、23和29中任一项所述的方法，其中使用监督训练对所述随机存活森林模型进行训练，所述监督训练包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与所述疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中
所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；以及
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型。
32.一种开发随机森林模型的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中
所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；以及
(d)应用来自所述多名受试者的信息特征和获得的临床反应作为输入来训练随机森林模型。
33.一种开发随机存活森林模型的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中
所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种受试者特征、一种或多种输入组合物特征和一种或多种治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；以及
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型。
34.一种鉴定与临床反应相关的特征的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述CAR的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中
所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种所述受试者特征、一种或多种所述输入组合物特征和一种或多种所述治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和所获得的临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机森林模型；以及
(e)从经训练的随机森林模型鉴定与所述临床反应相关的信息特征。
35.一种鉴定与临床反应相关的特征的方法，所述方法包括：
(a)接收包括以下的特征：
(i)在用治疗性细胞组合物治疗多名受试者之前从所述多名受试者中的每一名确定的受试者特征，所述治疗性细胞组合物包含含有与疾病或病症相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，其中所述治疗性细胞组合物用于治疗所述疾病或病症；
(ii)从多种输入组合物中的每一种确定的输入组合物特征，其中所述多种输入组合物中的每一种包含从来自所述多名受试者中的每一名的样品选择的T细胞，其中所述T细胞用于产生包含含有所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的所述治疗性细胞组合物；以及
(iii)从多种治疗性细胞组合物中的每一种确定的治疗性细胞组合物特征，其中
所述多种治疗性细胞组合物中的每一种由所述多种输入组合物中的一种产生并表达所述CAR，其中所述治疗性组合物将被施用于所述多名受试者中的一名；
(b)预处理所述特征以鉴定信息特征，所述信息特征包括所述特征的子集，所述子集包括一种或多种所述受试者特征、一种或多种所述输入组合物特征和一种或多种所述治疗性细胞组合物特征；
(c)在用所述多种治疗性组合物中的一种治疗后，从所述多名受试者中的每一名获得随时间的临床反应；
(d)应用来自所述多名受试者的所述信息特征和临床反应作为输入，以使用监督学习来训练随机存活森林模型；以及
(e)从经训练的随机存活森林模型鉴定与所述临床反应相关的信息特征。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述临床反应是或包括完全反应(CR)、部分反应(PR)、持久反应、无进展存活期(PFS)、客观反应(OR)、为或超过目标药代动力学反应的药代动力学反应、无或轻度毒性反应、毒性反应、与目标反应相比降低的药代动力学反应，或缺乏CR、PR、持久反应或客观反应(OR)。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中鉴定与所述临床反应相关的信息特征包括确定每种所述信息特征的重要性量度。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述重要性量度包括置换重要性量度、平均最小深度和/或来自经训练的随机森林模型的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述重要性量度包括置换重要性量度、平均最小深度和/或来自经训练的随机存活森林模型的树的总数量，其中所述信息特征使根节点分裂。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中与所述临床反应相关的信息特征是通过每种所述信息特征的重要性量度的等级排序值鉴定的前10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种信息特征，其中所述重要性量度对于每种信息特征是相同的。
41.根据权利要求30-40中任一项所述的方法，其中向所述多名受试者中的每一名施用所述多种治疗性细胞组合物中的一种，其中向所述受试者施用的所述一种治疗性细胞组合物是从来自所述受试者的样品的输入组合物产生的治疗性细胞组合物。
42.根据权利要求30-41中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括以下中的一个或多个：
a)去除数据缺失大于、大于约或50％的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征；
b)去除具有(i)零方差，(ii)大于、大于约或等于95％的等于单个值的数据值，(iii)和/或小于0.1n个独特值的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征，其中n＝样本数量；
c)通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据；以及
d)鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有绝对值大于、约或等于0.5的相关系数的受试者特征、输入组合物特征、治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
43.根据权利要求30-42中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是去除数据缺失大于、约或50％的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。
44.根据权利要求30-43中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是去除数据缺失大于、约或60％的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征。
45.根据权利要求30-44中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是去除具有(i)零方差或(ii)大于、约或95％的等于单个值的数据值且小于0.1n个独特值的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征，其中n＝样本数量。
46.根据权利要求30-45中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是通过链式方程经多变量插补输入受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征的缺失数据。
47.根据权利要求30-46中任一项所述的方法，其中所述预处理以鉴定信息特征包括或是鉴定协变量簇，所述协变量簇包括具有绝对值大于、约或等于0.5的相关系数的受试者特征、输入组合物特征、治疗性细胞组合物特征及其组合的集合，并且从所述协变量簇迭代地选择受试者特征、输入组合物特征、和治疗性细胞组合物特征，其中所选择的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征与所有剩余的受试者特征、输入组合物特征和治疗性细胞组合物特征具有最低平均绝对相关性。
48.根据权利要求30-47中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是或是约500、400、300、200、150、100、50、25、15或10名受试者，或者是任何前述值之间的任何数量。
49.根据权利要求30-48中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于10名受试者且小于250名受试者。
50.根据权利要求30-49中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者且小于200名受试者。
51.根据权利要求30-50中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于20名且小于150名受试者。
52.根据权利要求30-51中任一项所述的方法，其中所述多名受试者是、是约或是大于20名受试者且小于100名受试者。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述受试者特征包括受试者属性和临床属性中的一种或多种。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者属性包括年龄、重量、身高、种族、人种、性别和体重指数中的一种或多种。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述临床属性包括生物标记、疾病诊断、疾病负荷、疾病持续时间、疾病分级和治疗史中的一种或多种。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述受试者特征包括以下中的一种或多种：给药组、桥接化学疗法、桥接化学疗法和放射疗法、桥接化学疗法系统治疗、细胞起源、化学疗法后复发或难治、诊断类型、疾病队列、疾病负荷、复发或难治性疾病、疾病起源、性别、治疗性细胞组合物施用途径、LDH的倍数变化、身高、病变计数、氧饱和度、温度(℃)、用治疗性细胞组合物治疗前的最长肿瘤直径、SPD的倍数变化、淋巴细胞清除化学疗法前的SPD值、BMI、重量、性别、种族、人种、年龄、IPI得分、ECOG得分、疾病分期、基于淋巴细胞清除化学疗法前LDH的疾病负荷、基于淋巴细胞清除化学疗法前SPD的疾病负荷、治疗时患有活动性CNS疾病的受试者、基于结节外疾病分类的疾病负荷、结节外部位的数量、基于巨大肿块分类的疾病负荷、疾病组织学、先前疗法线的数量、先前系统疗法线的数量、先前同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)、先前自体造血干细胞移植(auto-HSCT)、化疗难治性或化疗敏感性疾病类型、用于疾病控制的桥接抗癌疗法、从白细胞单采术日期到首次输注的天数、从诊断到用治疗性细胞组合物治疗的月数、基线C反应蛋白(CRP)、白细胞单采术前的淋巴细胞计数(10^9/L)、基因双表达子、基因双打击、基因三打击、基因双打击或三打击、基因双打击或三打击或双表达子、白蛋白水平、碱性磷酸酶水平、嗜碱性粒细胞计数、绝对嗜碱性粒细胞计数、直接胆红素、总胆红素、血尿素氮水平、钙水平、二氧化碳水平、氯化物水平、肌酐水平、嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞绝对计数、葡萄糖水平、血细胞比容水平、血红蛋白水平、LDH水平、病变计数、淋巴细胞计数、淋巴细胞绝对计数、镁水平、单核细胞绝对计数、单核细胞计数、嗜中性粒细胞绝对计数、嗜中性粒细胞计数、磷酸盐水平、血小板计数、钾水平、总蛋白、红细胞计数、天冬氨酸转氨酶水平、丙氨酸转氨酶水平、钠水平、直径乘积之和、甘油三酯、最长肿瘤直径、垂直肿瘤直径、尿酸水平和白细胞计数。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述输入组合物特征包括细胞表型。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述输入组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+、CAS3-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28-/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD4+、CD45RA+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+、CAS+/CD4+、CAS+/CD3+/CD4+、CD4+克隆性、CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+、CAS3-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28-/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD85RA-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD8+、CD85RA+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD85RA-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD85RA+/CD8+、CAS+/CD8+、CAS+/CD3+/CD8+、和CD8+克隆性。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物特征包括细胞表型、重组受体依赖性活性和剂量中的一种或多种。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物特征包括以下中的一种或多种：CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+、CAS3-/CD27+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+、CAS+/CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CAR+/CD8+、CD3+/CD8+、CAR+/CD8+、CD8+细胞的克隆性、EGFRt+/CD8+、细胞因子-/CD8+、IFNG+/CD8+、IFNg+/IL2/CD8+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+、CAR+/IFNg+/CD8+、IFNg+/TNFa+/CD8+、CAR+/IL2+/CD8+、IL2+/TNFa+/CD8+、通过CD8+得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD8+、CD8+细胞的活细胞浓度、CD8+细胞的载体拷贝数、CD8+的EGFRt+载体拷贝数、CD8+的活力、GMCSF+/CD8+、IFNG+/CD8+、IL10+/CD8+、IL13+/CD8+、IL2+/CD8+、IL4+/CD8+、IL5+/CD8+、IL6+/CD8+、MIP1A+/CD8+、MIP1B+/CD8+、sCD137+/CD8+、TNFa+/CD8+、CD8+细胞的剂量、CD8+细胞的剂量水平、给予的CD8+细胞的活细胞百分比、给予的CD8+细胞的总非活细胞、给予的CD8+细胞的总活细胞、CD8+细胞的总剂量、CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+、CAS3-/CD27+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+、CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+、CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+、CAS+/CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CAR+/CD4+、CD3+/CD4+、CAR+/CD4+、CD4+细胞的克隆性、EGFRt+/CD4+、细胞因子-/CD4+、IFNG+/CD4+、IFNg+/IL2/CD4+、IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+、IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+、CAR+/IFNg+/CD4+、IFNg+/TNFa+/CD4+、CAR+/IL2+/CD4+、IL2+/TNFa+/CD4+、通过CD4+得出的细胞裂解、CAR+/TNFa+/CD4+、CD4+细胞的活细胞浓度、CD4+细胞的载体拷贝数、CD4+的EGFRt+载体拷贝数、CD4+的活力、GMCSF+/CD4+、IFNG+/CD4+、IL10+/CD4+、IL13+/CD4+、IL2+/CD4+、IL4+/CD4+、IL5+/CD4+、IL6+/CD4+、MIP1A+/CD4+、MIP1B+/CD4+、sCD137+/CD4+、TNFa+/CD4+、CD4+细胞的剂量、CD4+细胞的剂量水平、给予的CD4+细胞的活细胞百分比、给予的CD4+细胞的总非活细胞、给予的CD4+细胞的总活细胞、和CD4+细胞的总剂量。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述样品包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述样品是单采术产物或白细胞单采术产物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述单采术产物或白细胞单采术产物先前已经进行冷冻保存。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括从所述受试者获得的原代细胞。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+T细胞，并且所述治疗性细胞组合物包含表达所述CAR的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+T细胞并且由所述输入组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的CD4+、CD8+、或CD4+和CD8+T细胞的治疗性细胞组合物特征。
67.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包括CD4+和CD8+T细胞的单独组合物，并且所述治疗性细胞组合物包括表达所述CAR的CD4+和CD8+T细胞的单独组合物并且由所述输入组合物的相应CD4+或CD8+T细胞组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的CD4+和CD8+T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的各单独组合物的CD4+和CD8+T细胞的治疗性细胞组合物特征。
68.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包括CD4+和CD8+T细胞的单独组合物，并且所述治疗性细胞组合物包括表达所述CAR的CD4+和CD8+T细胞的混合组合物并且由所述输入组合物的单独CD4+和CD8+T细胞组合物产生，其中所述输入组合物特征包括来自所述输入组合物的单独CD4+和CD8+T细胞组合物的输入组合物特征，并且所述治疗性细胞组合物特征包括来自所述治疗性组合物的CD4+和CD8+细胞的混合组合物的治疗性细胞组合物特征。
69.根据权利要求16-31和41-68中任一项所述的方法，其中所述预定治疗方案包括或是包括施用以下的单一治疗：
a)向所述受试者单独施用25x 106个CD8+CAR+T细胞和25x 106个CD4+CAR+T细胞；
b)向所述受试者单独施用50x 106个CD8+CAR+T细胞和50x 106个CD4+CAR+T细胞；或
c)向所述受试者单独施用75x 106个CD8+CAR+T细胞和75x 106个CD4+CAR+T细胞。
70.根据权利要求16-31和41-68中任一项所述的方法，其中所述改变的治疗方案包括或是包括施用以下的单一治疗：
a)当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用25x 106个CD8+CAR+T细胞和25x 106个CD4+CAR+T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用50x 106个CD8+CAR+T细胞和50x 106个CD4+CAR+T细胞；
b)当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用50x 106个CD8+CAR+T细胞和50x 106个CD4+CAR+T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用75x 106个CD8+CAR+T细胞和75x 106个CD4+CAR+T细胞；或
c)当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用25x 106个CD8+CAR+T细胞和25x 106个CD4+CAR+T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用75x 106个CD8+CAR+T细胞和75x 106个CD4+CAR+T细胞。
71.根据权利要求16-31和41-68中任一项所述的方法，其中所述改变的治疗方案包括或是包括施用以下的单一治疗：
a)当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用50x 106个CD8+CAR+T细胞和50x 106个CD4+CAR+T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用25x 106个CD8+CAR+T细胞和25x 106个CD4+CAR+T细胞；
b)当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用75x 106个CD8+CAR+T细胞和75x 106个CD4+CAR+T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用50x 106个CD8+CAR+T细胞和50x 106个CD4+CAR+T细胞；或
c)当所述预定治疗方案包括或是包括向所述受试者单独施用75x 106个CD8+CAR+T细胞和75x 106个CD4+CAR+T细胞的单一治疗时，向所述受试者单独施用25x 106个CD8+CAR+T细胞和25x 106个CD4+CAR+T细胞。
72.根据权利要求16-31和41-68中任一项所述的方法，其中所述改变的治疗方案包括将所述治疗性细胞组合物与第二治疗剂组合施用。
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