KR20230024283A - 임상 반응과 관련된 특징을 식별하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 세포 요법과 관련하여 치료용 세포 조성물로 치료 후에 대상체(예를 들어, 환자)의 임상 반응과 연관된, 대상체의 속성과 같은 특징을 식별하는 방법, 치료용 세포 조성물 및 치료용 세포 조성물을 생성하기 위해 사용되는 투입 조성물에 관한 것이다. 치료용 세포 조성물의 세포는 키메라 수용체 와 같은 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 다른 형질전환 수용체를 발현한다. 본 방법은 임상 반응과 연관된 특성의 식별을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 대상체의 반응을 알아내는(예를 들어, 예측하는) 데 사용될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 제63/024,494호(제목 “임상 반응과 연관된 특성을 식별하는 방법 및 이의 용도”)와 2020년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 제63/037,592호(제목 “임상 반응과 연관된 특성을 식별하는 방법 및 이의 용도”)의 우선권을 주장하고, 이의 내용들은 그 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2021년 5월 8일에 생성된 735042023740SeqList.TXT라는 제목의 파일로 제공되며 이의 크기는 51,373 바이트이다. 서열 목록 내 전자 형식의 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 세포 요법과 관련하여 치료용 세포 조성물로 치료 후에 대상체(예를 들어, 환자)의 임상 반응과 연관된, 대상체의 속성과 같은 특성을 식별하는 방법, 치료용 세포 조성물 및 치료용 세포 조성물을 생성하기 위해 사용되는 투입 조성물에 관한 것이다. 치료용 세포 조성물의 세포는 키메라 수용체와 같은 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)와 같은 다른 형질전환 수용체를 발현한다. 본 방법은 임상 반응과 연관된 특성의 식별을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 대상체의 반응을 알아내는(예를 들어, 예측하는) 데 사용될 수 있다.
질병 및 병태를 치료하기 위한 다양한 면역 요법 및/또는 세포 요법 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 입양 세포 요법(다른 입양 면역 세포 및 입양 T 세포 요법뿐만 아니라 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 다른 재조합 항원 수용체와 같은 관심 질병 또는 장애에 특이적인 키메라 수용체를 발현하는 세포의 투여를 수반하는 것을 포함)은 암 또는 기타 질병 또는 장애의 치료에 유리할 수 있다. 치료가 유익한 임상 반응을 초래할 것인지 여부를 알아내기 위한 개선된 접근법이 필요하다. 상기 필요를 해결하는 방법이 본원에 제공된다.
임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 CAR을 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; (b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 상기 대상체 특성들 중 하나 이상, 상기 투입 조성물 특성들 중 하나 이상, 및 상기 치료용 세포 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―; (c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계; (d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 상기 획득된 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계; 및 (e) 상기 훈련된 랜덤 포레스트 모델로부터 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계를 포함한다.
임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; (b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 상기 대상체 특성들 중 하나 이상, 상기 투입 조성물 특성들 중 하나 이상, 및 상기 치료용 세포 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―; (c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계; (d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계; 및 (e) 상기 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델로부터 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계는 상기 정보 특성들 중 각각에 대하여 중요도 정도를 알아내는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 중요도 정도는 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및/또는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 포레스트(예를 들어, 상기 훈련된 랜덤 포레스트 모델)의 트리의 총 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 중요도 정도는 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및/또는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 생존 포레스트(예를 들어, 상기 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델)의 트리의 총 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 중요도 정도는 순열 중요도 정도다. 일부 구현예에서, 상기 중요도 정도는 평균 최소 깊이이다. 일부 구현예에서, 상기 중요도 정도는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 포레스트(예를 들어, 상기 훈련된 랜덤 포레스트 모델)의 트리의 총 수이다. 일부 구현예에서, 상기 중요도 정도는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 생존 포레스트(예를 들어, 상기 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델)의 트리의 총 수이다. 일부 구현예에서, 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들은 상기 정보 특성들 중 각각에 대한 상기 중요도 정도의 순위 순서(예를 들어, 순위 순서 값들)에 의해 식별된 첫 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1의 정보 특성이고, 상기 중요도 정도는 각 정보 특성에 대해 동일한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들은 상기 정보 특성들 중 각각에 대한 상기 중요도 정도의 순위 순서 값들에 의해 식별된 첫 5개 정보 특성이고, 상기 중요도 정도는 각 정보 특성에 대해 동일한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들은 상기 정보 특성들 중 각각에 대한 상기 중요도 정도의 순위 순서 값들에 의해 식별된 첫 번째 정보 특성이고, 상기 중요도 정도는 각 정보 특성에 대해 동일한 것이다.
임상 반응을 알아내는(예를 들어, 예측하는) 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; 및 (b) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응들을 알아내도록(예를 들어, 예측하도록) 훈련된 랜덤 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성임―를 포함한다.
임상 반응을 알아내는(예를 들어, 예측하는) 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; 및 (b) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응들을 알아내도록(예를 들어, 예측하도록) 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성임―를 포함한다.
대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계; (b) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 알아내는 단계; (c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응들을 알아내도록(예를 들어, 예측하도록) 훈련된 랜덤 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및 (d) 상기 대상체에 치료법을 적용하는 단계―(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 전체 반응률(ORR), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 독성은 2급 이하의 CRS 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면(예를 들어, 예측되면), 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는 (2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군 또는 중증 신경 독성임), 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면(예를 들어, 예측되면), 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―를 포함한다.
대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계; (b) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 알아내는 단계; (c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용해 치료될 상기 대상체에서 임상 반응들을 알아내도록(예를 들어, 예측하도록) 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및 (d) 상기 대상체에 치료법을 적용하는 단계―(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 전체 반응률(ORR), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 독성은 2급 이하의 CRS 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면(예를 들어, 예측되면), 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는 (2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군 또는 중증 신경 독성임), 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면(예를 들어, 예측되면), 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 상기 치료용 세포 조성물을 생성하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계; (b) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물을 생성하는 단계―상기 치료용 세포 조성물은 (i) 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것이고, (ii) 상기 투입 조성물로부터 생산되며, (iii) 상기 대상체에 투여될 것임―; (c) (i) 상기 대상체가 상기 치료용 세포 조성물로 치료받기 전에 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들; (ii) 상기 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들; 및 (iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 특성들을 알아내는 단계; (c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물로 치료될 상기 대상체에서 임상 반응들을 알아내도록 훈련된 랜덤 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및 (d) 상기 대상체에 치료법을 적용하는 단계―(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 경미한 독성 반응은 2급 이하의 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는 (2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 중증 신경 독성임), 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―를 포함한다.
일부 구현예에서 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계; (b) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물을 생성하는 단계―상기 치료용 세포 조성물은 (i) 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것이고, (ii) 상기 투입 조성물로부터 생산되며, (iii) 상기 대상체에 투여될 것임―; (c) (i) 상기 대상체가 상기 치료용 세포 조성물로 치료받기 전에 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들; (ii) 상기 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들; 및 (iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 특성들을 알아내는 단계; (c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물로 치료될 상기 대상체에서 임상 반응들을 알아내도록 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및 (d) 상기 대상체에 치료법을 적용하는 단계―(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 경미한 독성 반응은 2급 이하의 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는 (2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 중증 신경 독성임), 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 완전 반응(CR)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, (1) 상기 대상체가 완전 반응(CR)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 미리 알아낸 치료 계획을 적용하거나; 또는 (2) 상기 대상체가 진행성 질병(PD)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 변경된 치료 계획을 적용한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 부분 반응(PR)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, (1) 상기 대상체가 부분 반응(PR)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 미리 알아낸 치료 계획을 적용하거나; 또는 (2) 상기 대상체가 진행성 질병(PD)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 변경된 치료 계획을 적용한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 초과의 지속적인 반응을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, 상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 초과의 지속적인 반응을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, (1) 상기 대상체가 3개월 초과의 지속적인 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 미리 알아낸 치료 계획을 적용하거나; 또는 (2) 상기 대상체가 3개월 미만의 지속적인 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 변경된 치료 계획을 적용한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 넘는 무진행 생존(PFS)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, 상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 넘는 무진행 생존(PFS)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, (1) 상기 대상체가 3개월 넘는 무진행 생존(PFS)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 미리 알아낸 치료 계획을 적용하거나, 또는 (2) 상기 대상체가 3개월 미만의 무진행 생존(PFS)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 변경된 치료 계획을 적용한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 객관적 반응(OR)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, (1) 상기 대상체가 객관적 반응(OR)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 미리 알아낸 치료 계획을 적용하거나; 또는 (2) 상기 대상체가 진행성 질병(PD)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 변경된 치료 계획을 적용한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체의 약동학적 반응을 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, (1) 상기 대상체가 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 미리 알아낸 치료 계획을 적용하거나; 또는 (2) 상기 대상체가 상기 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 변경된 치료 계획을 적용한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 독성 반응을 가질 것인지를 알아내도록 훈련된다. 일부 구현예에서, (1) 상기 대상체가 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 미리 알아낸 치료 계획을 적용하거나; 또는 (2) 상기 대상체가 독성 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체에 상기 변경된 치료 계획을 적용한다. 일부 구현예에서, 상기 독성 반응은 중증 CRS이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 중증 신경 독성 이다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 지도 훈련을 사용하여 훈련되고, 상기 지도 훈련은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; (b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성들, 하나 이상의 투입 조성물 특성들, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―; (c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계; 및 (d) 복수의 대상체 및 상기 획득된 임상 반응들로부터 상기 정보 특성들을 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 지도 훈련을 사용하여 훈련되고, 상기 지도 훈련은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; (b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성들, 하나 이상의 투입 조성물 특성들, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―; (c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계; 및 (d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함한다.
랜덤 포레스트 모델을 개발하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; (b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성들, 하나 이상의 투입 조성물 특성들, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―; (c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계; 및 (d) 복수의 대상체 및 상기 획득된 임상 반응들로부터 상기 정보 특성들을 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함한다.
랜덤 생존 포레스트 모델을 개발하는 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은: (a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로, 대상체가 치료받기 전에 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―; (ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및 (iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; (b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성들, 하나 이상의 투입 조성물 특성들, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―; (c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계; 및 (d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체 중 각각에 상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 하나가 투여되고, 상기 대상체에 투여되는 상기 하나의 치료용 세포 조성물은 상기 대상체 유래 샘플의 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는: a) (약) 50% 이상의 결측 데이터가 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계; b) 제로 분산, 또는 단일 값과 (약) 95% 이상 동일한 데이터 값들 및/또는 0.1n 미만의 고유 값들(여기서, n = 샘플 수)을 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계; c) 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치에 의해 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들에 대한 결측 데이터를 대치하는 단계; 및 d) 공변량 클러스터들을 식별하는 단계―상기 공변량 클러스터들은 (약) 0.5 이상의 상관관계 계수를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 상기 공변량 클러스터로부터 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 반복적으로 선택하는 단계―상기 선택된 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들은 모든 남아 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―; 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 (약) 50% 이상의 결측 데이터가 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 제로 분산을 갖거나 또는 (약) 95% 이상의 데이터 값들이 단일 값과 동일하고 0.1n 고유 값들 미만인(, n = 샘플 수) 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치에 의해 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들에 대한 결측 데이터를 대치하는 단계이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 공변량 클러스터들을 식별하는 단계―상기 공변량 클러스터들은 (약) 0.5 이상의 상관관계 계수를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 상기 공변량 클러스터로부터 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 반복적으로 선택하는 단계―상기 선택된 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들은 모든 남아 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―;이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 상기 교차 검증은 10겹 교차 검증이거나 적어도 그 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 교차 검증은 중첩 교차 검증이다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 (약) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 25, 15, 또는 10개 대상체이거나 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 (약) 10개 대상체 이상 및 250개 대상체 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 200개 대상체 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 이상 및 150개 대상체 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 150개 대상체 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 100개 대상체 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 임상 시험에 참여하고 있다.
일부 구현예에서, 상기 대상체 특성들은 대상체 속성들 및 임상 속성들 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체 속성들은 연령, 중량, 키, 민족, 인종, 성별(sex), 및 체질량 지수 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 임상 속성들은 생체표지자들, 질병 진단, 질병 부담, 질병 지속 기간, 질병 등급, 및 치료 이력 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 투입 조성물 특성들은 세포 표현형들을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 세포 표현형, 재조합 수용체-의존성 활성, 및 용량 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 임상 반응들은 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 지속적인 반응, 무진행 생존(PFS), 전체 반응률(ORR), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상인 약동학적 반응, 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응, 독성 반응, 표적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 또는 CR, PR, 지속적인 반응, ORR, OR, 또는 PFS의 결여 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 임상 반응은 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 지속적인 반응, 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상인 약동학적 반응, 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응, 독성 반응, 표적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 또는 CR, PR, 지속적인 반응, 또는 객관적 반응(OR)의 결여이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 완전 반응(CR)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 완전 반응(CR)의 결여이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 부분 반응(PR)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 부분 반응(PR)의 결여이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 객관적 반응(OR)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 객관적 반응(OR)의 결여이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 독성 반응이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 독성 반응의 결여이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 경미한(mild) 독성 반응이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 중증 독성 반응이다. 일부 구현예에서, 상기 독성 반응은 중증 CRS이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 중증 신경 독성 이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 지속적인 반응이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 지속적인 반응의 결여이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 반응 지속 기간(DOR)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 적어도 또는 적어도 약 3개월의 반응 지속 기간(DOR)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 무진행 생존(PFS)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 적어도 또는 적어도 약 3개월의 무진행 생존(PFS)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 목표 약동학적 반응 이상인 약동학적 반응이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 치료용 세포 조성물의 CAR T 세포의 증폭의 정도다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 대상체에서 최대 CAR T 세포 농도의 정도다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 대상체에서 CAR T 세포 농도가 최대인 시점의 정도다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 치료용 세포 조성물의 CAR T 세포에 상기 대상체의 노출의 정도다.
일부 구현예에서, 상기 샘플은 전혈 샘플, 연막(buffy coat) 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물이다. 일부 구현예에서, 상기 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물은 이전에 냉동 보존된 것이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 상기 대상체로부터 수득된 1차 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투입 조성물은 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 상기 치료용 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 상기 투입 조성물로부터 생산되며, 여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물을 포함하고 상기 치료용 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물을 포함하고 상기 투입 조성물의 각각의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 조성물로부터 생산되며, 여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 상기 개별 조성물들 중 각각의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물을 포함하고 상기 치료용 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합 조성물을 포함하고 상기 투입 조성물의 개별 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물로부터 생산되며, 여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 개별 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 상기 CD4+ 및 CD8+ 세포의 혼합 조성물의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
일부 구현예에서, 상기 미리 알아낸 치료 계획은: a) 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; b) 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 또는 c) 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것(예를 들어, 상기 변경된 치료 계획)은: 상기 미리 알아낸 치료 계획이 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 상기 미리 알아낸 치료 계획이 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 또는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것;을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것(예를 들어, 상기 변경된 치료 계획)은: 상기 미리 알아낸 치료 계획이 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 상기 미리 알아낸 치료 계획이 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 또는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것;을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것(예를 들어, 상기 변경된 치료 계획)은 상기 치료용 세포 조성물을 제2 치료제와 병용하여 투여하는 것을 포함한다.
도 1a 및 1b는 랜덤 포레스트 모델에 포함된 예시적인 결정 트리를 도시한다.
도 2a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 log10AUC(AUC0 -28, 주입 후 28일에 걸친 농도-시간 곡선 하 면적)와의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 2b는 log10AUC와 환자 연령 사이의 상관관계를 도시한다. 도 2c는 모든 다른 특성과 무관하게, log10AUC에 대한 환자 연령의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 2d는 log10AUC와 환자가 받은 선행 치료의 총 수 사이의 상관관계를 도시한다. 도 2e는 모든 다른 특성과 무관하게, log10AUC에 대한 환자가 받은 선행 치료의 수의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 2f는 log10AUC와 치료용 세포 조성물의 CD8+ T 세포의 효과기 사이토카인 분비 사이의 상관관계를 도시한다. 도 2g는 모든 다른 특성과 무관하게, log10AUC에 대한 치료용 세포 조성물의 CD8+ T 세포의 효과기 사이토카인 분비의 누적 국소 효과를 도시한다.
도 3a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 무진행 생존(PFS)과의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 3b는 모든 다른 특성과 무관하게, PFS에 대한 치료용 세포 조성물 중 CD4+ T 세포의 항원 특이적 사이토카인 생산의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 3c는 모든 다른 특성과 무관하게, PFS에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) 락트산 탈수소효소(LDH) 수준의 누적 국소 효과를 도시한다.
도 4a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 완전 반응(CR)과의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 4b는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 치료용 세포 조성물의 CD4+ T 세포의 항원 특이적 사이토카인 생산의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 4c는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 치료용 세포 조성물의 CD8+ T 세포의 항원 특이적 사이토카인 생산의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 4d는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) 직경별 산물의 합(SPD)으로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 4e는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) LDH로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다.
도 5a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 신경증 반응(NE)과의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 5b는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 사이토카인 방출 증후군(CRS)과의 상관관계에 중요한 것으로서 식별된 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 5c는 모든 다른 특성과 무관하게, 신경증 반응(NE)에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) LDH로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 5d는 모든 다른 특성과 무관하게, CRS에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) LDH로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 5e는 모든 다른 특성과 무관하게, CRS에 대한 가교 요법의 누적 국소 효과를 도시한다.
도 2a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 log10AUC(AUC0 -28, 주입 후 28일에 걸친 농도-시간 곡선 하 면적)와의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 2b는 log10AUC와 환자 연령 사이의 상관관계를 도시한다. 도 2c는 모든 다른 특성과 무관하게, log10AUC에 대한 환자 연령의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 2d는 log10AUC와 환자가 받은 선행 치료의 총 수 사이의 상관관계를 도시한다. 도 2e는 모든 다른 특성과 무관하게, log10AUC에 대한 환자가 받은 선행 치료의 수의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 2f는 log10AUC와 치료용 세포 조성물의 CD8+ T 세포의 효과기 사이토카인 분비 사이의 상관관계를 도시한다. 도 2g는 모든 다른 특성과 무관하게, log10AUC에 대한 치료용 세포 조성물의 CD8+ T 세포의 효과기 사이토카인 분비의 누적 국소 효과를 도시한다.
도 3a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 무진행 생존(PFS)과의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 3b는 모든 다른 특성과 무관하게, PFS에 대한 치료용 세포 조성물 중 CD4+ T 세포의 항원 특이적 사이토카인 생산의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 3c는 모든 다른 특성과 무관하게, PFS에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) 락트산 탈수소효소(LDH) 수준의 누적 국소 효과를 도시한다.
도 4a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 완전 반응(CR)과의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 4b는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 치료용 세포 조성물의 CD4+ T 세포의 항원 특이적 사이토카인 생산의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 4c는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 치료용 세포 조성물의 CD8+ T 세포의 항원 특이적 사이토카인 생산의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 4d는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) 직경별 산물의 합(SPD)으로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 4e는 모든 다른 특성과 무관하게, CR에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) LDH로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다.
도 5a는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 신경증 반응(NE)과의 상관관계에 중요한 것으로서 랜덤 포레스트 및 생존 포레스트를 사용하여 식별된 예시적인 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 5b는 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 사이토카인 방출 증후군(CRS)과의 상관관계에 중요한 것으로서 식별된 유의한 특성 클러스터를 도시한다. 화살표는 상관관계의 방향성을 나타낸다. 도 5c는 모든 다른 특성과 무관하게, 신경증 반응(NE)에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) LDH로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 5d는 모든 다른 특성과 무관하게, CRS에 대한 림프구 고갈 화학 요법에 의한 치료 전(LDC 전) LDH로 측정된 종양 부담의 누적 국소 효과를 도시한다. 도 5e는 모든 다른 특성과 무관하게, CRS에 대한 가교 요법의 누적 국소 효과를 도시한다.
다양한 암을 포함한 질병 및 병태의 치료를 위해 조작된 T 세포 요법 등의 세포 요법(예를 들어, 치료용 세포 조성물)로 치료 후 대상체에서 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하기 위한 방법들이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 대상체가 치료받기 전에 세포 요법(예를 들어, 치료용 세포 조성물)에 의한 치료에 대한 대상체의 임상 반응을 알아낸다(예를 들어, 예측한다). 그 구현예를 포함한 본원에 제공된 방법의 양태는 세포 요법(예를 들어, 치료용 세포 조성물)의 효과적인 투약 및 투여를 알아내는 것에 관한 것이다.
수많은 대상체(환자) 속성들, 의약품을 생산하기 위한 출발 물질의 속성들(예를 들어, 투입 조성물 특성), 및 의약품(예를 들어, 치료용 세포 조성물) 속성들은 세포 요법 시험에서 임상 종점들, 예를 들어, 반응들과의 명목상 유의한 단변량 관계를 입증하였다. 그러나, 세포 요법에 대한 임상 반응은 대상체의 특성, 치료용 세포 조성물의 특성, 및 치료용 세포 조성물이 생산되는 투입 조성물의 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 인자에 의존할 수 있다. 효능, 안전성, 및 약동학적 (PK) 반응에 대한 대상체 특성, 출발 물질(예를 들어, 투입 조성물) 특성, 및 의약품(예를 들어, 치료용 세포 조성물) 특성의 다인자성 기여를 정량화하는 것은 세포 요법 분야에서 도전 과제이다.
본원에 제공된 방법은 지도(supervised) 기계 학습의 사용을 통한 다변량 특성 평가의 과제를 다룬다. 예를 들면, 본원에 제공된 기계 학습 모델은 복수의 다양한 특성이 임상 반응에 어떻게 기여할 수 있는지(예를 들어, 임상 반응을 어떻게 알아내거나 예측할 수 있는지)를 평가할 수 있다. 상기 모델은 임상 반응과 상관관계가 있는 특성들, 예를 들어 특성들의 그룹을 식별하기 위해 질의되거나 심문될 수 있다. 일부 경우에, 본원의 방법에 따르면, 임상 반응을 알아냄에 있어서 특성들의 세트의 각각의 특성의 중요도를 순위화하는 것이 또한 가능하다. 일부 경우에, 이 정보는 이질적인 환자 집단 전체에서 임상 경험을 최적화하는 데 유용하다. 일부 경우에, 이 정보는 의약품 생산과 제조를 최적화하는 데 유용하다.
본원에 제공된 방법은 세포 요법(예를 들어, 치료용 조성물)에 대한 대상체의 임상 반응, 예컨대 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 지속적인 반응(예를 들어, 반응의 내구성, DOR), 독성 반응, 및/또는 약동학적 반응을 특성들, 예컨대 대상체(예를 들어, 대상체 특성), 치료용 세포 조성물(예를 들어, 치료용 세포 조성물 특성), 및 치료용 세포 조성물을 생산하는 데 사용되는 투입 조성물(예를 들어, 투입 조성물 특성)의 속성들에 기초하여 알아내도록(예를 들어, 예측하도록) 훈련된 기계 학습 모델을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체 특성은 대상체 속성, 예컨대 연령 및 체중, 및 임상 속성, 예컨대 생체표지자들의 발현 및 생체표지자들의 조합, 질병 부담(예를 들어, 종양 부담의 측정), 치료 이력, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물의 특성은 세포 건강(예를 들어, 생존 세포 수, 죽은 세포 수), 표면 표지자의 존재 및/또는 발현, 표면 표지자의 발현의 부재 또는 결여, 사이토카인의 존재 및/또는 발현, 사이토카인의 발현의 부재 또는 결여, 재조합 수용체 발현(예를 들어, CAR+), 재조합 수용체-의존성 활성(예를 들어, 세포 용해 활성, 사이토카인 생산), 및 이들의 조합 등과 같은 세포 표현형들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 세포 건강(예를 들어, 생존 세포 농도, 죽은 세포 수), 표면 표지자의 존재 및/또는 발현, 표면 표지자의 발현의 부재 또는 결여, 및 이들의 조합 등과 같은 세포 표현형들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 방법은 세포 요법(예를 들어, 치료용 조성물)에 대한 대상체의 임상 반응을 대상체(예를 들어, 대상체 특성), 치료용 세포 조성물(예를 들어, 치료용 세포 조성물 특성), 및 치료용 세포 조성물을 생산하는데 사용되는 투입 조성물(예를 들어, 투입 조성물 특성)의 속성들에 기초하여 알아내도록(예를 들어, 예측하도록) 훈련된 기계 학습 모델을 포함한다. 일부 측면에서, 치료용 세포 조성물은 출발 물질로서 투입 조성물을 사용하여 생성된다. 일부 측면에서, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성을 사용하여 기계 학습 모델을 훈련시키는 것은 이들 특성 세트들의 서브세트만을 사용한 훈련에 비해 특정 이점을 제공한다. 이 이점들은 대상체의 임상 반응을 보다 정확하게 예측하거나 임상 반응과 연관된 정보 특성을 보다 잘 식별하는 능력을 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 투입 조성물이 치료용 세포 조성물의 생산을 위한 출발 물질로서 사용되는 경우에도, 제조 전에 투입 조성물의 특성은 그의 제조 후에 치료용 세포 조성물의 특성에 포함되지 않거나 그에 의해 설명되지 않는 치료용 세포 조성물에 대한 임상 반응과 연관된 정보를 포함할 수 있다는 이해에 기초한다. 따라서, 일부 측면에서, 모델 훈련에 투입 조성물 특성을 포함하면 대상체 특성 및/또는 치료용 세포 조성물 특성 단독으로 훈련할 때 달성되는 것에 비해, 모델 성능 또는 정보 특성의 식별을 향상할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 방법에 따라 사용하기 위해 고려되는 기계 학습 모델은 투명한 기계 학습 모델이다. 투명한 기계 학습 모델의 사용은 이것이 대상체에서 임상 반응과 연관된 특성이 식별될 수 있게 하기 때문에 특히 이점이 있다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 것으로 식별된 특성은 대상체를 세포 요법으로 치료하기 전에 대상체에서 평가되어 대상체가 치료에 대한 바람직한 또는 유리한 임상 반응을 가질지 여부를 알아낼(예를 들어 예측할) 수 있다.
일부 경우에, 종래의 “블랙 박스” 모델들을 포함하는 모델들은, 모델이 특정 결정에 어떻게 도달했는지에 대한 이해가 인식될 수 있는 방식으로 질의되거나 심문될 수 있는 경우에는 투명한 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 모델이 특정 결정에 어떻게 도달했는지에 대한 이해는 특성 또는 특성들의 그룹, 예를 들어, 결정에 기여하는 변수(들)를 식별하는 것 또는 이를 포함한다. 예를 들면, 본원에 제공된 방법의 관점에서, 일부 구현예에서, 모델이 임상 반응과 연관된 특성을 식별하기 위해(예를 들어, 임상 반응에 대한 특성 중요도를 결정하기 위해) 질의되거나 심문될 수 있는 경우 그 모델은 투명한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 특정 결정에 도달한 것에 대한 각 특성의 기여가 정량화된다. 일부 경우에, 특성의 식별 및/또는 정량화는, 예를 들어, 체계적으로 또는 제어되고 알려진 조건 하에서 모델을 조작하고, 조작에 걸쳐 모델의 정확도(예를 들어, 예측 정확도) 및 그의 변화를 평가함으로써 알아낸이다.
일부 구현예에서, 기계 학습 모델은 랜덤 포레스트(random forest) 모델이다. 일부 구현예에서, 기계 학습 모델은 랜덤 생존 포레스트(random survival forest) 모델이다. 위에 기술된 바와 같이, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트를 사용하는 이점은 이들의 투명성이다. 예를 들면, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트 모델은 세포 요법(예를 들어, 치료용 세포 조성물)에 대한 대상체의 임상 반응을 예측하는 데 사용되는 특성들이 식별될 수 있도록 심문될 수 있다. 일부 구현예에서, 임상 반응을 알아내는(예를 들어, 예측하는) 데 사용되는 특성들은 임상 반응과 연관된 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 대상체의 임상 반응을 알아내는(예를 들어, 예측하는) 데 사용되는 특성들을 식별하는 것은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이(섹션 I.B.1a 및 I.B.2a 참조) 특성 중요도를 평가하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 랜덤 포레스트 모델은 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하기 위해 심문된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 랜덤 포레스트 모델은 세포 요법(예를 들어, 치료용 세포 조성물)로 아직 치료받지 않은 대상체가 어떤 임상 반응을 보일지를 알아내는(예를 들어, 분류하는 또는 예측하는) 데 사용된다. 일부 구현예에서, 치료 전에 대상체가 어떤 임상 반응을 보일지를 알아내는 것(예를 들어, 예측하는 것)은 대상체가 미리 알아낸 치료 계획에 따라 또는 미리 알아낸 치료 계획과 다른(예를 들어, 변경된) 치료 계획에 따라 치료받는 것으로 귀결될 수 있다. 일부 구현예에서, 알아낸(예를 들어, 예측된) 임상 반응의 관점에서 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것은 개선된 또는 유리한 임상 반응으로 귀결되거나, 대상체가 개선된 또는 유리한 임상 반응을 보일 확률 또는 가능성을 높일 수 있다.
랜덤 생존 포레스트 모델은 우측-중도절단된 생존 데이터를 다룰 수 있고, 비례 위험 또는 매개변수적 가정과 같은 제한적 가정을 회피할 수 있다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 다수의 변수 간의 비선형 효과 및 상호작용을 다룰 수 있다. 이러한 특성들은 위험 예측 모델, 예를 들어, 임상 반응의 위험 예측 모델을 구축하는 데 유리하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 랜덤 생존 포레스트 모델은 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하기 위해 심문된다. 예를 들면, 주어진 시간량 내에서 임상 반응을 보일 확률과 연관된 특성들이 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 랜덤 생존 포레스트 모델은 대상체가 치료받기 전에 세포 요법(예를 들어, 치료용 세포 조성물)에 의한 치료 후 대상체가 임상 반응을 보일 확률을 알아내는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 랜덤 생존 포레스트 모델은 대상체에 대한 임상 반응 함수 및 누적 위험 함수를 알아내는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 임상 반응을 보이는 대상체의 위험을 추정할 수 있다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 임상 반응을 보이지 않는 대상체의 위험을 추정할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 전에 대상체가 치료 후 임상 반응을 보일지 보이지 않을지에 대한 결정(예를 들어, 추정 또는 예측)은 대상체가 미리 알아낸 치료 계획에 따라 또는 미리 알아낸 치료 계획과 다른(예를 들어, 변경된) 치료 계획에 따라 치료받는 것으로 귀결될 수 있다. 일부 구현예에서, 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것은 개선된 또는 유리한 임상 반응으로 귀결되거나, 대상체가 개선된 또는 유리한 임상 반응을 보일 확률 또는 가능성을 높일 수 있다.
본원에 제공된 기계 학습 모델(예를 들어, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트)은 치료될 대상체(예를 들어, 환자), 대상체에 투여될 치료용 세포 조성물, 및 치료용 세포 조성물의 생산을 위한 투입 조성물(예를 들어, 대상체로부터 유래된 출발 물질)과 연관된 다양한 특성에 기초하여 임상 반응을 예측하도록 훈련된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 기계 학습 모델은 치료될 대상체(예를 들어, 치료 전 대상체 특성), 대상체에 투여될 치료용 세포 조성물(예를 들어, 치료용 세포 조성물 특성), 및 치료용 세포 조성물의 생산을 위한 투입 조성물(예를 들어, 대상체로부터 유래된 출발 물질)(투입 조성물 특성)과 연관된 특성들을 사용하여 훈련된다.
일부 구현예에서, 훈련은 지도 학습이다. 모델이 지도 학습을 사용하여 훈련되는 경우에, 치료용 세포 조성물로 치료받은 대상체의 임상 반응들, 및 이를 위해 특성들, 예를 들어, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성이 획득된 임상 반응들이 파악되거나, 획득되거나 또는 그렇지 않으면 수신된다. 위에 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, 상기 임상 반응은 효능 결과, 예컨대 전체 반응; 완전 반응(CR); 부분 반응 (PR); 지속적인 반응(예를 들어, 반응의 내구성, DOR), 예컨대 적어도 3개월, 6개월 또는 그 이상 동안 지속되는 반응; 안전성 결과, 예컨대 독성, 예를 들어, 신경 독성 또는 CRS의 발생; 및 약동학적 반응, 예컨대 세포의 최대 혈청 농도(Cmax) 및 노출(예를 들어, 곡선 하 면적(AUC))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 임상 반응에 더하여, 특성들, 예를 들어 치료 전의 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성을 결정, 획득, 또는 수용함으로써, 모델은 라벨링된 데이터를 사용하여 훈련될 수 있다. 상기 모델들은 훈련된 모델의 예측 정확도를 결정하기 위해 시험 데이터를 사용하여 테스트될 수 있다. 랜덤 생존 포레스트 모델의 훈련을 위해 시간 및 중도절단 성분(예를 들어, 시간 대 이벤트)이 임상 반응에 수반된다는 점을 인식해야 한다.
일부 구현예에서, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성은 사전처리된다. 일부 측면에서, 데이터 사전처리는 잘못된 또는 부정확한 결과들을 생성하는 모델을 생성하는 것을 방지한다. 일부 구현예에서, 사전처리는 범위를 벗어난 값, 결측 값(missing value), 불가능한 데이터 조합, 상관관계가 높은 특성, 및 기타 교란된 특성이 모델에 편입되는 것(예를 들어, 모델에 의해 학습되는 것)을 방지한다. 제공된 구현예들에서, 제공된 사전처리 단계들은 T 세포 요법(예를 들어, CAR T 세포)을 수반하는 것을 비롯한, 치료용 약물의 임상 시험과 연관된 데이터로부터 존재할 수 있는 바와 같이, 작은 데이터 코호트의 훈련 데이터에 특히 유리한 것으로 밝혀졌다.
일부 경우에, 예를 들어 치료용 약물의 임상 시험 중, 상이한 수의 대상체를 치료하기 위해 상이한 용량 수준이 사용될 수 있다. 예를 들면, 100명의 대상체의 코호트는 특정 용량을 받을 수 있는 반면, 50명의 대상체의 다른 코호트는 현저하게 다른 용량을 받을 수 있다. 일부 경우에, 이는 불균형 데이터세트가 발생할 수 있다. 일부 경우에, 샘플 크기의 차이는 또한 모델을 훈련시키는 데 문제가 될 수 있다. 일부 측면에서, 이 불균형은 모델이 훈련되는 특성으로서 용량을 포함시킴으로써 해결된다.
일부 경우에, 사전처리는 정보 특성의 식별로 이어진다. 예를 들면, 사전처리는 남아 있는 특성들이 정보를 제공하고, 구별되고, 독립적이 되도록(예를 들어, 정보 특성) 분산이 거의 없거나 전혀 없는 특성들, 상관관계가 높은 특성들, 또는 결측 값을 갖는 특성들을 제거하는 데, 또는 결측 값을 대체하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 기계 학습 모델(예를 들어, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트)은 사전처리에 의해 식별된, 정보 특성에 대해 훈련된다. 일부 구현예에서, 기계 학습 모델(예를 들어, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트)은 사전처리에 의해 식별된, 정보 특성에 대해 지도 학습을 사용하여 훈련된다. 일부 구현예에서, 임상 반응을 알아내기 위해 모델에 투입으로서 사용되는 특성들, 예를 들어, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 입력 특성은 모델을 훈련하는 데 사용되는 정보 특성과 동일한 정보 특성이다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 간행물은 각각의 개별 간행물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 부합하지 않는 경우, 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 구성을 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Ⅰ. 임상 결과와 연관된 특성을 식별하고 임상 결과를 알아내는 방법
본원에 제공되는 방법은 치료용 세포 조성물로 치료한 후 대상체에서 임상 반응과 연관된 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성 및 투입 조성물 특성과 같은 특성의 식별을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 특성, 예를 들어, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성 및 투입 조성물 특성에 기초하여 치료용 세포 조성물로 치료하기 전 치료용 세포 조성물로 치료할 대상체에서 임상 반응을 알아내는 것을 가능하게 한다. 초기 단계(예를 들어, 치료 전)에 이러한 유형의 정보를 확보하는 것은 대상체를 치료하기 전에 치료 전략(예를 들어, 병용 치료, 투약)의 개발을 가능하게 하여, 대상체가 양성 또는 유리한 임상 반응(예를 들어, 지속적인 반응, 무진행 생존)을 보일 확률을 높일 수 있다.
본원에 제공된 방법은 조작된 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물(예를 들어, 치료용 T 세포 조성물)을 생성하는 것을 포함하고, 여기서 상기 치료용 세포 조성물은 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 두 개의 개별 조성물, 예를 들어, CD4+ 조성물 및 CD8+ 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한 단일 조성물을 함유한다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물을 생성하는 본원에 제공된 방법은 치료용 세포 조성물을 위해 CD4+ 및 CD8+ 조작된 세포 둘 모두를 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ 세포는 예를 들어 개별 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 개별적으로 조작된다. 일부 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ 세포는 개별 CD4+ 및 CD8+ 투입 조성물로부터 개별 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 개별적으로 조작된다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물은 혼합된 CD4+ 및 CD8+ 조작된 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 개별 치료용 세포 조성물의 개별 CD4+ 및 CD8+ 조작된 세포는 결합되어 혼합된 CD4+ 및 CD8+ 조작된 세포 치료용 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 혼합된 CD4+ 및 CD8+ 조작된 세포 치료용 세포 조성물은 혼합된 CD4+ 및 CD8+를 함유한 단일 투입 조성물로부터 생산된다. 투입 조성물 및 치료용 세포 조성물의 특성들은 혼합된 또는 개별 조성물들로부터 결정되거나, 수신되거나, 획득될 수 있다.
A. 특성 및 임상 반응
치료용 세포 조성물로 치료할 대상체의 임상 반응은 대상체의 특성, 치료용 세포 조성물의 특성, 및 치료용 세포 조성물이 생산되는 투입 조성물의 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 인자에 의존하는 것이 고려된다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 치료용 세포 조성물로 치료받을 대상체와 연관된 특성들, 치료용 세포 조성물과 연관된 특성들, 및 치료용 세포 조성물이 생산되는 투입 조성물과 치료용 세포 조성물로 치료 후 대상체에서 임상 반응의 특성들 사이의 관계를 기계 학습 모델을 사용하여 평가하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용되는 대상체와 연관된 특성들은 대상체 속성, 예컨대 연령 및 체중, 임상 속성, 예컨대 생체표지자들의 발현 및 생체표지자들의 조합, 질병 부담(예를 들어, 종양 부담의 측정), 치료 이력, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 및 투입 조성물과 연관된 특성들은 세포 표현형을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표현형은 투입 조성물 또는 치료용 세포 조성물 내의 세포 또는 세포의 하위 집단에 의해 축적되거나 생성될 수 있는 표면 분자 및/또는 분자를 포함하는 하나 이상의 특정 분자의 존재 또는 부재를 평가함으로써 알아낸이다. 일부 구현예에서, 세포 표현형은 자극에 대한 반응으로 인자(예를 들어, 사이토카인)의 생산과 같은 세포 활성을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인자(예를 들어, 사이토카인)의 생산은 재조합 수용체-의존성 활성화에 대한 반응으로 인한 것이다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물의 세포의 재조합 수용체-의존성 활성은 치료용 세포 조성물 내의 세포 또는 세포의 하위 집단에 의해 축적 또는 생성될 수 있는 하나 이상의 특정 분자(예를 들어, 사이토카인)를 평가함으로써 알아낸이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 치료용 세포 조성물의 세포의 세포 용해 활성을 결정함으로써 평가된다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 및/또는 치료용 세포 조성물의 특성들은 세포 조성물의 표현형(예를 들어, 표면 분자, 사이토카인, 재조합 수용체)의 결정, 검출, 정량화, 또는 다른 평가를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 조성물(예를 들어, 투입 조성물, 치료용 세포 조성물)특성들은 특정 분자(예를 들어, 표면 분자, 사이토카인, 재조합 수용체)의 존재, 부재, 발현의 정도 또는 수준의 결정, 검출 정량화, 또는 다른 평가를 포함한다. 일부 구현예에서, 어떤 속성을 가진 세포의 백분율, 수, 비, 및/또는 비율이 알아낸이다. 일부 구현예에서, 어떤 속성을 가진 세포의 백분율, 수, 비 및/또는 비율은 본원에 제공된 기계 학습 알고리즘에 입력으로 사용될 수 있는 치료용 세포 조성물 특성 또는 투입 조성물 특성이다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성 또는 투입 조성물 특성은 표현형(예를 들어, 세포 표현형)이다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성 또는 투입 조성물 특성은 세포의 생존력을 나타내는 표현형이다. 일부 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 부재, 세포자멸사의 초기 단계의 부재 또는 세포자멸사의 말기 단계의 부재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표현형은 세포자멸사, 초기 세포자멸사 또는 세포자멸사의 말기 단계의 부재를 나타내는 인자의 부재이다. 일부 구현예에서, 표현형은 치료용 세포 조성물에서 재조합 수용체-발현 T 세포(예를 들어, CAR+ T 세포), CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포 등의 T 세포의 하위 집단 또는 서브세트의 표현형이다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화되지 않은/않거나 하나 이상의 활성화 표지자의 발현이 결여된 또는 감소한 또는 낮은 세포의 표현형이다. 일부 구현예에서, 표현형은 탈진하지 않은/않거나 하나 이상의 탈진 표지자의 발현이 결여된 또는 감소한 또는 낮은 세포의 표현형이다.
일부 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 사이토카인의 생산이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 사이토카인이 치료용 세포 조성물의 조작된 세포에 의해 발현된 재조합 수용체와 그 항원의 결합에 반응하여 상기 세포에 의해 생산되고/거나 분비될 때, 이 활성은 재조합 수용체-의존성 활성이라고 한다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 재조합 수용체-의존성 활성이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 생산은 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정, 검출 및/또는 정량화된다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 사이토카인의 생산의 결여이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 사이토카인의 생산에 대해 양성이거나 고수준의 사이토카인의 생산이다. 유세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 염색(ICS)은 단일 세포 수준에서 사이토카인 생산을 연구하는 데 적합한 기술이다. 이 기술은 세포 자극 후에 소포체 내 사이토카인의 생산 및 축적을 검출하여, 특정 사이토카인의 생산에 대해 양성 또는 음성인 세포 집단의 식별을 가능하게 하거나 임계값을 기준으로 고 생산 및 저 생산 세포의 분리를 가능하게 한다. ICS는 또한 세포 표면 표지자를 사용하는 면역 표현형 검사를 위해 다른 유세포 분석 프로토콜과 함께 사용하거나 특정 세포 하위 그룹에서 사이토카인 생산에 접근하기 위해 MHC 다량체와 함께 사용할 수 있어, 매우 유연한 다용도의 방법이다. 사이토카인 생산을 측정 또는 검출하기 위한 다른 단일 세포 기술에는 ELISPOT, 한계 희석, 및 T 세포 클로닝이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
구체적인 구현예에서, 예를 들어 치료용 세포 조성물에서, 특성은 재조합 수용체-의존성 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 용해성 인자(soluble factor)의 생산 및/또는 분비이거나 이를 포함하는 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 의존성 활성이다. 특정 구현예에서, 용해성 인자는 사이토카인 또는 케모카인이다.
용해성 인자의 생산 또는 분비의 측정을 위한 적합한 기술은 본 기술 분야에서 알려져 있다. 용해성 인자의 생산 및/또는 분비는 상기 인자의 세포외 양의 농도 또는 양을 측정하거나, 상기 인자를 암호화하는 유전자의 전사 활성의 양을 측정하여 측정될 수 있다. 적합한 기술에는 면역분석, 앱타머 기반 분석, 조직학적 또는 세포학적 분석, mRNA 발현 수준 분석, 효소결합면역흡착분석(ELISA), 알파리사(AlphaLISA) 분석, 면역블로팅, 면역침강, 방사면역분석(RIA), 면역 염색법, 유세포 분석, 표면 플라스몬 공명(SPR), 화학발광 분석, 측면 유동 면역분석, 억제 분석 또는 산염기도 분석, 단백질 마이크로어레이, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 중규모 디스커버리(MSD) 전기화학발광 및 비드 기반 다중 면역분석(MIA)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 적합한 기술은 용해성 인자에 특이적으로 결합하는 검출 가능 결합 시약을 채용할 수 있다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포에서 표현형을 나타내는 특정 표면 표지자들(예를 들어, 표면 단백질들); 표현형을 나타내는 세포내 표지자들; 또는 표현형을 나타내는 핵산들 또는 표현형을 나타내는 다른 분자들 또는 인자들 등의 하나 이상의 특정 분자의 발현의 존재, 부재 또는 수준으로 표시된다. 일부 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 특정 분자에는 표면 표지자, 예를 들어 막 당단백질 또는 수용체; 세포자멸사 또는 생존력과 연관된 표지자; 또는 면역 세포의 상태를 표시하는 특정 분자, 예를 들어 활성화, 탈진, 성숙 또는 나이브 표현형과 연관된 표지자가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물(예를 들어, 투입 조성물, 치료용 세포 조성물)에서 표현형의 세포 수를 결정하기 위해 특정 분자에 기초하여 세포를 평가 또는 측정, 카운트, 및/또는 정량화하는 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포에서 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 양성 발현은 세포에서 특정 분자의 검출 가능한 양으로 표시된다. 특정 구현예에서, 검출 가능한 양은 세포에서 특정 분자의 임의의 검출된 양이다. 구체적인 구현예에서, 검출 가능한 양은 세포에서 백그라운드, 예를 들어, 백그라운드 염색, 신호 등보다 많은 양이다. 특정 구현예에서, 양성 발현은 임계값, 예를 들어 미리 정해진 임계값보다 큰 특정 분자의 양이다. 마찬가지로, 구체적인 구현예에서, 특정 분자의 음성 발현을 가진 세포는 양성 발현을 가지지 않은 것으로 판정된 임의의 세포일 수 있거나, 특정 분자의 검출 가능한 양 또는 백그라운드를 넘는 특정 분자의 검출 가능한 양을 결여한 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 특정 분자의 양이 임계값 아래일 경우 특정 분자의 음성 발현을 갖는다. 본 기술분야의 기술자는 일상적인 기술의 문제로서 특정 분자에 대한 양성 및/또는 음성 발현을 정의하기 위해 임계값을 정의하는 방법을 이해할 것이며, 임계값은 예를 들어, 검출 분석 또는 방법, 특정 분자의 정체성, 검출에 사용되는 시약, 및 기기(그러나 이들에 한정되지 않음)의 특정 매개변수들에 따라 정의될 수 있음을 이해할 것이다.
특정 분자를 검출하고/거나 세포의 표현형을 분석하는 데 사용될 수 있는 방법의 예는 생화학적 분석; 면역화학 분석; 이미지 분석; 세포형태학적 분석; PCR, 염기서열분석, 고처리량 염기서열분석, DNA의 메틸화 판정 등의 분자 분석; 단백질 글리코실화 및/또는 인산화 패턴의 판정 등의 단백질체학 분석; 유전체학 분석; 후성유전학 분석(예를 들어, ChIP-서열분석 또는 ATAC-서열분석); 전사체학 분석(예를 들어, RNA-서열분석); 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역 수용체 레퍼토리(예를 들어, T 세포 수용체(TCR)의 레퍼토리)의 평가를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 표현형의 결정은 고처리량, 자동화 및/또는 단일 세포 기반 방법으로 평가할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 분자적 시그니처를 식별하기 위해 대규모 또는 게놈-전체 방법이 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 분자적 시그니처, 예를 들어 세포에서 특정 RNA 또는 단백질의 발현이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형의 분자적 특징이 이미지 분석, PCR(PCR의 표준 및 모든 이형 포함), 마이크로어레이(DNA 마이크로어레이, 마이크로 RNA용 MM칩, 단백질 마이크로어레이, 세포 마이크로어레이, 항체 마이크로어레이, 및 탄수화물 어레이를 포함하나 이에 한정되지 않음), 염기서열분석, 생체표지자 검출, 또는 DNA 메틸화 또는 단백질 글리코실화 패턴을 알아내는 방법에 의해 분석된다. 구체적인 구현예에서, 특정 분자는 폴리펩타이드, 즉 단백질이다. 일부 구현예에서, 특정 분자는 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 특정 분자의 양성 또는 음성 발현은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 발현(표지자+)되거나 상대적으로 보다 높은 수준으로 발현(표지자high)된 하나 이상의 표면 표지자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션함으로써 알아낸이다. 구체적인 구현예에서, 상기 양성 또는 음성 발현은 유세포 분석, 면역조직화학 또는 특정 표지자를 검출하기에 적합한 다른 방법에 의해 알아낸이다.
구체적인 구현예에서, 특정 분자의 발현은 유세포 분석으로 평가된다. 유세포 분석은 세포를 유체 흐름에 현탁시키고 전자 검출 장치에 통과시켜 세포 계수, 세포 분류, 생체표지자 검출 및 단백질 공학에 사용되는 레이저 또는 임피던스 기반 생물물리학 기술이다. 이 기술은 초당 최대 수천 개의 입자의 물리적 및 화학적 특성에 대한 동시 다중 매개변수 분석이 가능하다.
유세포 분석기에 의해 생성된 데이터는 히스토그램을 생성하기 위해 1차원으로 도표화하거나, 또는 2차원 점 도표 또는 3차원으로 도표화할 수 있다. 이 도표들의 영역들은 “게이트”라고 하는 일련의 서브세트 추출들을 생성하여 형광 강도를 기준으로 순차적으로 분리할 수 있다. 특히 면역학과 관련하여 진단 및 임상 목적을 위한 특정 게이팅 프로토콜이 존재한다. 도표들은 종종 로그 스케일로 작성된다. 상이한 형광 염료의 방출 스펙트럼이 겹치기 때문에, 검출기의 신호는 계산적으로 뿐만 아니라 전자적으로도 보상되어야 한다. 유세포 분석기를 사용하여 축적된 데이터는 소프트웨어, 예를 들어, JMP(통계 소프트웨어), WinMDI, Flowing Software, 웹 기반 Cytobank, Cellcion, FCS Express, FlowJo, FACSDiva, CytoPaint(일명 Paint-A-Gate), VenturiOne, CellQuest Pro, Infinicyt 또는 Cytospec을 사용하여 분석할 수 있다.
유세포 분석은 당업계의 표준 기술이며 당업자는 하나 이상의 특정 분자를 검출하고 데이터를 분석하여 세포 집단에서 하나 이상의 특정 분자의 발현을 결정하기 위한 프로토콜을 설계하거나 맞춤화하는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 유세포 분석을 위한 표준 프로토콜 및 기술은 문헌[Loyd “Flow Cytometry in Microbiology; Practical Flow Cytometry by Howard M. Shapiro; Flow Cytometry for Biotechnology by Larry A. Sklar, Handbook of Flow Cytometry Methods by J. Paul Robinson, 등, Current Protocols in Cytometry, Wiley-Liss Pub, Flow Cytometry in Clinical Diagnosis, v4, (Carey, McCoy, and Keren, eds), ASCP Press, 2007, Ormerod, M.G. (ed.) (2000) Flow Cytometry -A practical approach. 3rd edition. Oxford University Press, Oxford, UK, Ormerod, M.G. (1999) Flow Cytometry. 2nd edition. BIOS Scientific Publishers, Oxford., and Flow Cytometry-A basic introduction. Michael G. Ormerod, 2008]에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 추가 분석을 위해 표현형별로 분류된다. 일부 구현예에서, 동일한 세포 조성물 내에서 상이한 표현형의 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분류된다. FACS는 각 세포의 특정 광산란 및 형광 특성을 기반으로 이질적인 세포 혼합물을 한 번에 한 세포씩 2개 이상의 용기에 분류할 수 있는 특수 유형의 유세포 분석이다. 이것은 개별 세포의 형광 신호를 빠르고 객관적이며 정량적으로 기록할 뿐만 아니라 특정 관심 세포를 물리적으로 분리할 수 있는 유용한 과학 도구이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 특성 또는 치료용 조성물 특성은 세포 조성물의 특성들, 예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[국제 출원 공개 번호 WO 2019/032929, WO 2018/223101, WO 2019/089848, WO 2020/113194, WO 2019/090003, WO 2020/092848, WO 2019/113559, 및 WO 2018/157171]에 각각 기술된 투입 세포 조성물 또는 치료용 T 세포 조성물(예를 들어, CAR-T 세포)과 연관된 매개변수들 또는 활성들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체 특성은 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[국제 출원 공개 번호 WO 2019/032929, WO 2018/223101, WO 2019/089848, WO 2020/113194, WO 2019/090003, WO 2020/092848, WO 2019/113559, 및 WO 2018/157171]에 기술된 대상체의 또는 대상체와 연관된 특성들 또는 특성들(예를 들어, 대상체의 속성들 또는 치료용 T 세포 조성물의 투여를 수반하는 임상 시험에서 대상체와 연관된 임상 속성들) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물(예를 들어, CAR-T 세포)에 대한 임상 반응은 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[국제 출원 공개 번호 WO 2019/032929, WO 2018/223101, WO 2019/089848, WO 2020/113194, WO 2019/090003, WO 2020/092848, WO 2019/113559, 및 WO 2018/157171]에 기술된 치료용 세포 조성물(예를 들어, CAR-T 세포)에 대한 하나 이상의 임상 반응을 포함할 수 있다. 상기 특성들 중 하나 이상은 제공된 방법에 따른 하나 이상의 임상 반응을 알아내기(예를 들어, 예측하기) 위한 데이터로 사용될 수 있다.
하나 이상의 비제한적인 임상 반응을 알아내기(예를 들어, 예측하기) 위해 제공된 방법에 데이터로 사용되는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 치료용 세포 조성물 특성의 비제한적인 예는 다음 하위 섹션들에 기술된다.
1.
대상체
특성
치료용 세포 조성물로 치료될 대상체와 연관된 다양한 특성은 본원에 제공된 방법, 예를 들어 기계 학습 방법에 따라 사용하기 위해 고려된다. 치료용 세포 조성물로 치료될 대상체는 또한 본원에서 환자로도 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체 특성은 연령 및 중량과 같은 대상체 속성을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체 특성은 대상체 중량, 예를 들어, 체중이다. 일부 구현예에서, 대상체 중량은 치료용 세포 조성물이 투여되는 시점의 대상체의 중량이다. 특정 구현예에서, 중량은 lbs. 또는 kg으로 측정된다. 일부 구현예에서, 대상체 특성은 연령, 예를 들어, 치료용 세포 조성물의 투여 시작시의 대상체 연령이다. 다른 예시적인 대상체 특성에는 키, 민족, 인종, 성, 성별, 및 체질량 지수가 포함된다.
일부 구현예에서, 대상체와 연관된 특성은 임상 속성이다. 예시적인 임상 속성에는 생체표지자 및 생체표지자들의 조합, 질병 진단, 질병 부담, 질병 지속 기간, 질병 중증도(예를 들어, 질병 등급), 및 치료 이력이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 대상체와 연관된 임상 속성(예를 들어, 대상체 특성)은 선행 요법의 양, 예를 들어, 치료용 T 세포 조성물의 투여 시작 전 하나 이상의 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 선행 요법들은 치료용 세포 조성물과 동일한 질병 및/또는 병태를 치료하기 위해 투여되었다.
특정 구현예에서, 임상 속성은 혈소판 수이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 질병 진단의 최근성이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체가 받은 질병 진단이다.
구체적인 구현예에서, 임상 속성은 백혈병이 있는 것이다. 일부 구현예에서, 대상체 특성은 B 세포 백혈병이 있는 것이다. 특정 구현예에서, 백혈병은 급성 림프모구 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종(NHL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 또는 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 특정 구현예에서, 임상 특성은 급성 림프구성 백혈병(ALL)이 있는 것이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 림프종이 있는 것이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 특정 등급의 림프종이 있는 것이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 DLBCL이 있는 것이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 여포성 림프종이 있는 것이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 여포성 림프종으로부터 형질전환된 DLBCL이 있는 것이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 DLBCL의 기원 세포이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 기원 세포는 활성화된 B 세포, 비-배중심 B 세포, 또는 배중심 B-세포-유사 세포이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 질병이 드노보인지 다른 것인지이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 임상 속성은 드노보 DLBCL 또는 드노보가 아닌 DLBCL이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 질병 또는 병태와 상관관계가 있거나 연관되는 것으로 알려진 유전자의 돌연변이 식별과 같은 유전자 표현형이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 유전자, 예를 들어, 질병 또는 병태와 상관관계가 있거나 연관된 유전자가 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 결실, 삽입, 치환, 재배열, 전좌를 갖고 있는지이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 돌연변이된 유전자(예를 들어, 유전자 이상)의 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 이중 유전자 이상이다. 예를 들면, 일부 경우에 림프종에서, 두 개의 유전자, 예를 들어 MYC와 BCL2가 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 삼중 유전자 이상이다. 예를 들면, 일부 경우에 림프종에서, 세 개의 유전자, 예를 들어 MYC, BCL6 및 BCL2가 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 이중 또는 삼중 유전자 이상이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 유전자 이중 발현자이다. 예를 들면, 일부 경우에 림프종에서, 이중 발현자(dual-expressor 또는 double-expressor)는 MYC 및 BCL2 과발현의 면역조직화학적 검출을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이중 발현자는 예를 들어 기준선에 비해 과발현되는 유전자를 지칭한다.
일부 측면에서, 임상 속성은 대상체가 재발성 또는 불응성 질병을 가지고 있는지 여부이다. 일부 측면에서, 임상 속성은 대상체가 하나 이상의 선행 요법에 대해 재발했거나 불응성이었는지 여부이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체가 화학 요법 치료 이후 재발성 또는 불응성인지 여부이다.
치료용 세포 조성물로 치료될 대상체는 질병 또는 병태를 치료하기 위한 시도로 선행 치료를 받았을 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체가 치료용 세포 조성물로 치료 전에 받은 선행 요법 차수의 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체가 치료용 세포 조성물로 치료 전에 받은 선행 전신 요법 차수의 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체가 치료용 세포 조성물로 치료 전에 동종이계 조혈 줄기세포 이식을 받았는지 여부이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체가 치료용 세포 조성물로 치료 전에 자가 조혈 줄기세포 이식을 받았는지 여부이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 선행 치료에 대한 최상 전체 반응이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 질병 단계이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 질병 부담이다. 구체적인 구현예에서, 임상 속성은 높은 질병 부담, 예를 들어, 치료용 T 세포 조성물의 투여 시작 전 높은 질병 부담이다. 특정 구현예에서, 임상 속성은 치료용 세포 조성물의 투여 시작 직전의 또는 1주 이내, 2주 이내, 3주 이내, 4주 이내, 5주 이내, 6주 이내, 7주 이내, 8주 이내, 9주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 5개월 이내, 6개월 이내 또는 6개월 이상 전의 높은 질병 부담이다. 일부 구현예에서, 질병 부담은 병변 수에 의해 알아낸이다. 일부 구현예에서, 높은 질병 부담은 골수 아세포의 백분율을 기준으로 알아낸이다. 특정 구현예에서, 대상체 특성은 높은 질병 부담, 예컨대 직경의 곱의 합(SPD) 또는 락트산 탈수소효소(LDH)의 수준이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 병변 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 SPD이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 LDH 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 SPD의 배수 변화이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 LDH 수분의 배수 변화이다. 일부 구현예에서, 배수 변화는 초기 스크리닝의 시기와 치료용 세포 조성물의 투여 전 림프구 고갈 요법이 전달되는 시점 사이에서 알아낸이다. 일부 구현예에서, 배수 변화는 초기 스크리닝의 시기와 치료용 세포 조성물이 투여되는 시점 사이에서 알아낸이다. 일부 구현예에서, 임상 속성들인 SPD, LDH, 병변 수, 및 배수 변화, 차이들 또는 이의 다른 정량화들이 질병 부담을 평가하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 예를 들어 종양 부담에 의해 설명되는 바와 같은 질병 부담이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 높은 종양 부담, 예를 들어, 치료용 세포 조성물의 투여 시작 전 높은 질병 부담이다. 일부 구현예에서, 종양 부담은 종양(들)의 부피 척도에 의해 알아낸이다. 일부 구현예에서, 부피 척도는 종양 크기, 종양 직경, 종양 부피, 종양 질량, 종양 부하 또는 벌크, 종양-관련 부종, 종양-관련 괴사, 및/또는 전이의 수 또는 정도와 같은 병변(들)의 척도이다. 또한, “부피가 큰 질병(bulky disease)”은 흉부 내의 큰 종양을 기술하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양의 부피 척도는 2차원 척도이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 병변(들)의 면적은 모든 측정 가능한 종양의 가장 긴 직경과 가장 긴 수직 직경의 곱으로 계산된다. 일부 경우에, 종양의 부피 척도는 1차원 척도이다. 일부 경우에, 측정 가능한 병들의 크기는 가장 긴 직경으로 평가된다. 일부 구현예에서, 종양 크기는 가장 긴 직경으로 평가된다. 일부 구현예에서, 종양 크기는 수직 직경으로 평가된다. 일부 구현예에서, 직경들의 곱의 합(SPD), 가장 긴 종양 직경들(LD), 가장 긴 종양 직경들의 합(SLD), 괴사, 종양 부피, 괴사 부피, 괴사-종양 비(NTR), 종양 부근 부종(PTE), 및 부종-종양 비(ETR)가 측정된다. 종양 부담을 측정 및 평가하는 예시적인 방법은 예를 들어 문헌[Carceller 등, Pediatr Blood Cancer. (2016) 63(8):1400-1406 및 Eisenhauer 등, Eur J Cancer. (2009) 45(2):228-247]에 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 부피 척도는 모든 측정 가능한 종양의 가장 큰 수직 직경들의 곱의 합을 측정함으로써 측정된 직경들의 곱의 합(SPD)이다. 일부 측면에서, 종양 또는 병변은 가장 긴 직경(LD)으로 및/또는 모든 측정 가능한 병변의 가장 긴 종양 직경들의 합(SLD)을 측정함으로써 1차원으로 측정된다. 일부 구현예에서, 종양의 부피 척도는 괴사 부피 및/또는 괴사-종양 비(NTR)와 같은 종양의 부피 정량화이며, 문헌[Monsky 등, Anticancer Res. (2012) 32(11): 4951-4961]을 참조한다. 일부 측면에서, 종양의 부피 척도는 종양 부근 부종(PTE) 및/또는 부종-종양 비(ETR)와 같은 종양 관련 부종의 부피 정량화이다. 일부 구현예에서, 측정은 대상체의 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방사 단층 촬영(PET), 및/또는 자기 공명 영상(MRI)과 같은 이미지화 기술을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 종양의 부피 척도는 대상체에서 병태 또는 질병을 확인하고/거나 식별하기 위한 일상적인 평가 또는 채혈과 같은 스크리닝 시간에 알아낸이다. 일부 구현예에서, 부피 척도(예를 들어, SPD)와 같은 종양 부담의 척도는 림프구 고갈 화학 요법(LDC) 전에 측정된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 부피 척도(예를 들어, SPD)와 같은 종양 부담의 척도는 LDC 전 일개월, 이주일, 또는 일주일 이내에 예컨대 LDC 전 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 이내에 측정 또는 평가된다. 구체적인 구현예에서, 부피 척도(예를 들어, SPD)와 같은 종양 부담의 척도는 종양 보유 대상체에 T 세포 요법의 주입 전에 측정된다.
일부 구현예에서, 대상체 특성은 종양 부담의 척도(예를 들어, 부피 척도)가 임계 수준 위인지 또는 아래인지의 범주형 컷이다. 예를 들면, 상기 특성은 T 세포 요법의 주입 전에, 예를 들어, LDC 전에 측정되는 바와 같은 종양 부담의 척도(예를 들어, 부피 척도)의 범주형 컷이며, 여기서 상기 특성은 대상체가 임계 수준 이하이거나 임계 수준보다 큰 종양 부담의 척도를 가졌는지이다. 구체적인 구현예에서, 종양 부담의 척도는 SPD이고 SPD의 임계 수준은 (약) 30cm2, 40cm2, 50cm2, 60cm2, 70cm2, 80cm2 또는 90cm2이다. 예를 들면, 상기 특성은 T 세포 요법의 주입 전에, 예를 들어, LDC 전에 측정되는 바와 같은 SPD의 범주형 컷이며, 여기서 상기 특성은 대상체가 50cm2 이하이거나 50cm2보다 큰 SPD를 가졌는지이다.
일부 구현예에서, 종양 부담을 나타내는 인자는 두 시점에 평가되고, 두 시점 사이에 질병 부담을 나타내는 인자의 배수 변화가 측정된다. 일부 구현예에서, 상기 두 시점은 제1 시점 및 제2 시점을 포함하고, 상기 배수 변화는 제1 시점에 질병 부담을 나타내는 인자와 제2 시점에 질병 부담을 나타내는 인자의 비(ratio)이다. 일부 구현예에서, 종양의 부피 척도는 요법(예를 들어, 세포 요법)의 투여 전 두 시점에 알아낸이다. 일부 구현예에서, 종양의 부피 척도는 대상체에서 병태 또는 질병을 확인하고/거나 식별하기 위한 일상적인 평가 또는 채혈과 같은 스크리닝 시간에 알아낸이다. 구체적인 구현예에서, 종양(들)의 부피 측정은 T 세포 요법을 투여받은, 투여받을 또는 투여받을 후보 대상체에서 결정 또는 측정된다. 구체적인 구현예에서, 상기 측정은 요법(예를 들어, 세포 요법)에 의한 치료 또는 투여 전에 알아낸이다. 일부 구현예에서, 상기 두 시점은 세포 요법을 받기 전 한 달 또는 두 달 이내이다. 일부 구현예에서, 상기 두 시점은 일주일, 이주일, 삼주일, 사주일, 또는 오주일 이상 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 상기 두 시점은 삼주일 이상 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 상기 두 시점은 사주일, 오주일, 또는 육주일 이하 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 제2 시점은 세포 요법의 투여 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 초과 전이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 림프절외 질병 분류에 의해 결정되는 질병 부담이다. 예를 들면, 임상 속성은 질병(예를 들어, 림프종)이 림프계 외부의 기관으로 확산되었는지 여부일 수 있다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 영향을 받은 림프절 외 부위의 수이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체가 치료용 세포 조성물을 투여하는 시점에 중추신경계(CNS) 질병을 가지고 있는지 여부이다. 일부 구현예에서, 대상체는 치료용 세포 조성물을 투여하는 시점에 CNS 질병을 가지고 있지 않다. 일부 구현예에서, CNS 질병은 원발성 CNS 림프종(PCNSL)이다. 일부 구현예에서, PCNSL은 전신성 림프종이 없는 중추신경계(CNS)를 포함한다. 일부 구현예에서, PCNSL은 뇌, 척추, 뇌척수액(CSF), 및 눈에 국한된다. 일부 구현예에서, PCNSL은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 일부 구현예에서, PCNSL은 버킷, 저등급 또는 T 세포 림프종이다. 일부 구현예에서, PCNSL은 신경학적 징후를 포함한다. 일부 구현예에서, 신경학적 징후에는 초점 신경 결핍, 정신 상태 및 행동 변화, 두개내압 증가 증상, 및/또는 발작이 포함된다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태와 연관된 예시적인 특성에는 문헌[Grommes 등 (J. Clin Oncol 2017; 35(21):2410-18)]에 기술된 것이 포함된다.
일부 구현예에서, CNS 질병은 속발성 중추신경계 림프종(SCNSL)이다. 일부 구현예에서, SCNSL은 전신성 림프종이 있는 환자에 있다. 일부 구현예에서, SCNSL은 전이성 림프종으로 지칭된다. 일부 구현예에서, SCNSL은 DLBCL이다. 일부 구현예에서, SCNSL은 뇌, 수막, 척수, 및 눈을 포함할 수 있는 공격성 림프종이다. 일부 구현예에서, SCNSL은 연수막 전이를 포함한다. 일부 구현예에서, SCNSL은 뇌실질 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태와 연관된 예시적인 특성에는 문헌[Malikova 등 (Neurophychiatric Disease and Treatment 2018; 14:733-40)]에 기술된 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 속발성 CNS 림프종은 뇌실질 및/또는 연수막을 포함한다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 동반질병이다. 예를 들면, 일부 경우에, 동반질병은 치료용 세포 조성물의 투여 전에 대상체가 림프구 고갈 화학 요법을 받기 전 크레아티닌 청소율(CrCl)이다. 일부 구현예에서, 동반질병은 좌심실 박출률(LVEF)이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 수행도이다. 일부 구현예에서, 대상체의 ECOG 상태는 다음과 같이 정의된다: 0등급 - 제한없이 모든 질병 전 수행력을 발휘할 수 있는, 완전히 활동적임; 1급 - 육체적으로 격렬한 활동이 제한되나 걸을 수 있고 가볍거나 앉아서 하는 성질의 일을 수행할 수 있음; 2급 - 깨어있는 시간의 50 % 이상에서 걸을 수 있고 모든 자기 관리가 가능하나 어떠한 작업 활동도 수행할 수 없음; 3급 - 제한된 자기 돌봄만 가능하며; 깨어 있는 시간의 50% 이상 침대나 의자에서 지냄; 4급 - 완전히 지체 부자유함; 어떠한 자기 돌봄도 수행할 수 없음; 전적으로 침대나 의자에서 지냄; 또는 5급 - 사망.
일부 구현예에서, 임상 속성은 국제 예후 지표(IPI) 점수, 예를 들어, 림프종 IPI 점수이다. 일부 구현예에서, 대상체의 IPI 점수는 다음과 같이 정의된다: 낮은 위험(0-1점) - 5년 생존율 73%; 낮은 중간 위험(2점) - 5년 생존율 51%; 높은 중간 위험(3점) - 5년 생존율 43%; 또는 높은 위험(4-5점) - 5년 생존율 26%.
일부 구현예에서, 임상 속성은 대상체의 온도이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 혈액 산화 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 알부민 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 알칼리 포스파타아제 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 호염기구 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 절대 호염기구 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 직접 빌리루빈이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 총 빌리루빈이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 림프구 수 또는 절대 수이다. 일부 구현예에서, 림프구 수는 치료용 세포 조성물을 생성하기 위한 세포를 수득하기 위해 대상체에 백혈구 성분채집술을 수행하기 전의 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 혈액 요소 질소 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 칼슘 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 이산화탄소 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 염화물 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 크레아티닌 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 호산구 수 또는 절대 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 글루코스 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 적혈구용적률 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 헤모글로빈 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 마그네슘 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 단핵구 수 또는 절대 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 호중구 수 또는 절대 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 혈소판 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 칼륨 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 총 단백질 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 적혈구 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 백혈구 수이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 요산 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 나트륨 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 트리글리세리드 수준이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 아스파르트산 아미노기 전달효소 수준이다. 일부 경우에, 아스파르트산 아미노기 전달효소 수준은 혈청 글루타민산-옥살아세트산 아미노기 전이효소 시험에 의해 알아낸이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 알라닌 아미노기 전달효소 수준이다. 일부 경우에, 아스파르트산 아미노기 전달효소 수준은 혈청 글루타민산-피루빈산 아미노기 전이효소 시험에 의해 알아낸이다. 기술된 바와 같은 수준 또는 수를 검출하는 적합한 임의의 방법이 고려된다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 염증 표지자의 수준, 양, 및/또는 농도이다. 일부 구현예에서, 염증 표지자는 검출 또는 평가되는 C 반응성 단백질(CRP), 적혈구 침강 속도(ESR), 알부민, 페리틴, β2 마이크로글로불린(β2-M), 또는 락트산 탈수소효소(LDH)의 수준 또는 존재이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 염증 표지자는 면역 분석을 사용하여 평가된다. 예를 들면, 효소결합면역흡착분석(ELISA), 효소 면역분석(EIA), 방사면역분석(RIA), 표면 플라스몬 공명(SPR), 웨스턴 블롯, 간염성 질병 분석, 면역조직화학, 단백질 어레이 또는 면역-PCR(iPCR)을 사용하여 염증 표지자를 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 염증 표지자의 존재, 수준, 양, 및/또는 농도는 종양 부담(예를 들어, 높은 종양 부담)을 나타낸다. 일부 경우에, 염증 표지자의 분석 또는 평가는 유세포 분석을 사용한다. 일부 경우에, 시약은 염증 표지자에 결합하는 용해성 단백질이다. 일부 예에서, 시약은 C 반응성 단백질(CRP), 적혈구 침강 속도(ESR), 알부민, 페리틴, β2 마이크로글로불린(β2-M), 또는 락트산 탈수소효소(LDH)에 결합하는 단백질이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 생체표지자이다. 일부 구현예에서, 생체표지자는 C 반응성 단백질(CRP)과 같은 염증 표지자이다. 일부 구현예에서, 혈청, 혈장, 또는 혈액과 같은 샘플로부터 인간 CRP의 정량적 측정을 획득하기 위해 시험관내 효소결합면역흡착분석을 사용하여 CRP을 평가한다. 일부 예에서, 인간 효소결합면역흡착분석(ELISA)을 사용하여 CRP를 검출한다. 일부 구현예에서, 생체표지자는 적혈구 침강 속도(ESR)와 같은 염증 표지자이다. 일부 구현예에서, ESR은 수직 피펫 또는 튜브에서 혈장으로부터 분리된 후 적혈구가 떨어지는 거리(시간당 밀리미터)를 측정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 생체표지자는 알부민이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 알부민은 비색 시험(colorimetric test) 또는 시험관내 효소결합면역흡착분석을 사용하여 평가된다. 일부 예에서, 인간 효소결합면역흡착분석(ELISA)을 사용하여 알부민을 검출한다. 일부 구현예에서, 생체표지자는 페리틴 또는 β2 마이크로글로불린과 같은 염증 표지자이다. 일부 구현예에서, 페리틴 또는 β2 마이크로글로불린은 면역분석을 사용하여 평가되거나 ELISA를 사용하여 검출된다. 일부 측면에서, 생체표지자는 락트산 탈수소효소(LDH)와 같은 염증 표지자이고, LDH는 비색 시험 또는 시험관내 효소결합면역흡착분석을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 LDH의 수준, 농도, 및/또는 양이다.
일부 구현예에서, LDH의 수준, 농도, 및/또는 수는 질병 부담에 대한, 예를 들어, 종양 또는 암에 대한 대용물이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 치료용 T 세포 조성물의 투여 시작 전 가교 화학 요법을 받는 것이다. 일부 구현예에서, 가교 화학 요법은 전신 치료이다. 일부 구현예에서, 임상 속성은 치료용 T 세포 조성물의 투여 시작 전 가교 화학 요법 및 방사선요법을 받는 것이다. 치료 의사는 제공된 조성물 또는 세포의 제조 동안, 예를 들어 질병 통제를 위해 가교 요법이 필요한지를 알아낼 수 있다.
구체적인 구현예에서, 임상 속성은, 예를 들어 치료용 T 세포 조성물의 투여 시작 전에, 림프구 고갈 요법으로 사전 조절하는 것이다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈 요법은 화학 요법의 투여이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 대상체 특성은 치료용 세포 조성물의 투여 시작 전에 플루다라빈 및/또는 시클로포스파미드로 사전 조절하는 것이다. 특정 구현예에서, 대상체 특성은 치료용 T 세포 조성물의 투여 시작 전에 시클로포스파미드로 사전 조절하는 것이다. 일부 구현예에서, 대상체 특성은 치료용 세포 조성물의 투여 시작 전에 플루다라빈 및 시클로포스파미드로 사전 조절하는 것이다.
일부 구현예에서, 임상 속성은 치료용 T 세포 조성물의 투여 시작 전 혈액, 혈청, 또는 혈장 샘플 내 사이토카인의 수준, 양 또는 농도이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터루킨, 예를 들어, 인터루킨-15(IL-15)이다.
일부 구현예에서, 대상체 특성은 대상체가 치료되는 연구의 투약 암(dosing arm)이다. 일부 경우에, 이러한 특성은, 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라 임상 반응을 평가할 때 투약의 차이를 설명하기 위해, 상이한 투약 수준이 사용되는 일부 임상 연구에서 특히 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체 특성들은 본원에 기술된 임상 속성들 및 대상체 속성들을 포함한, 하나 이상의 대상체 특성을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체 특성은 투약 암(dosing arm), 가교 화학 요법, 가교 화학 요법 및 방사선요법, 가교 화학 요법 전신 치료, 세포 기원(예를 들어, ABC(활성화된 B-세포-유사, 또는 비-GCB) 또는 GCB(배중심 B-세포-유사)), 화학 요법 후 재발 또는 불응성, 진단 유형, 질병 코호트(예를 들어, DLBCL), 질병 부담, 재발성 또는 불응성 질병, 질병 기원(예를 들어, 드노보 DLBCL 또는 다른 DLBCL), 성별(gender), 치료용 세포 조성물 투여 경로(예를 들어, 주입), LDH의 배수 변화, 신장, 병변 수, 산소 포화도, 온도(℃), 치료용 세포 조성물에 의한 가장 긴 종양 직경 사전처리, SPD의 배수 변화, SPD 값 림프구 고갈 화학 요법-전(예를 들어, SPD <= 50cm^2 또는 > 50cm^2를 갖는 그룹에 대한 범주형 임계치를 가짐), BMI, 체중, 성별(sex), 민족, 인종, 연령, IPI 점수, ECOG 점수, 질병 병기, 림프구 고갈 화학 요법-전 LDH에 기초한 질병 부담, 림프구 고갈 화학 요법-전 SPD에 기초한 질병 부담, 치료 시 활성 CNS 질병을 갖는 대상체, 림프절외 질병 분류에 기초한 질병 부담, 림프절외 부위의 수, 부피가 큰 질병 분류에 기초한 질병 부담, 질병 조직학, 선행 요법 차수의 수, 선행 전신 요법 차수의 수, 선행 동종이계 조혈 줄기세포 이식(allo-HSCT), 선행 자가 조혈 줄기세포 이식(auto-HSCT), 화학적불응성 또는 화학적민감성 질병 유형, 질병 통제를 위한 가교 항암 요법, 백혈구 성분채집술 날짜로부터 첫 번째 주입까지의 일 수, 진단으로부터 치료용 세포 조성물에 의한 치료까지의 개월 수, 동반질병(예를 들어, 림프고갈 전 크레아티닌 청소율(CrCl), 스크리닝시 좌심실 박출률(LVEF)), 기준선 C 반응성 단백질(CRP), 백혈구 성분채집술-전 림프구 수(10^9/L), 유전자 이중 발현자, 이중 유전자 이상, 삼중 유전자 이상, 이중 또는 삼중 유전자 이상, 이중 또는 삼중 유전자 이상 또는 유전자 이중 발현자, 알부민 수준, 알칼리 포스파타아제 수준, 호염기구 수, 절대 호염기구 수, 직접 빌리루빈, 총 빌리루빈, 혈액 요소 질소 수준, 칼슘 수준, 이산화탄소 수준, 염화물 수준, 크레아티닌 수준, 호산구 수, 호산구 절대 수, 글루코스 수준, 적혈구용적률 수준, 헤모글로빈 수준, LDH 수준, 병변 수, 림프구 수, 림프구 절대 수, 마그네슘 수준, 단핵구 절대 수, 단핵구 수, 호중구 절대 수, 호중구 수, 인산염 수준, 혈소판 수, 칼륨 수준, 총 단백질, 적혈구 수, 아스파르트산 아미노기 전달효소 수준, 알라닌 아미노기 전달효소 수준, 나트륨 수준, 직경들의 곱의 합, 트리글리세리드, 가장 긴 종양 직경, 수직 종양 직경, 요산 수준, 및 백혈구 수 중 하나 이상 또는 모두이다.
일부 구현예에서, 대상체 특성들은 아래 표 E4에 제시된 대상체 특성들 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체 특성들은 초기 스크리닝에서 알아낸이다. 예를 들어, 치료용 세포 조성물을 생산하기 위한 투입 조성물을 생성하기 위한 백혈구 성분채집술 전에 스크리닝이 이루어진다. 일부 구현예에서, 대상체 특성들은 치료용 세포 조성물을 투여하기 전 림프구 고갈 요법의 투여 전에 알아낸이다. 일부 구현예에서, 대상체 특성들은 치료용 세포 조성물이 투여되는 시점에 알아낸이다. 일부 경우에, 예를 들어 대상체 특성이 대상체 특성의 변화이거나 이를 포함할 때, 대상체 특성은 대상체 특성의 차이 또는 변화, 예를 들어 백분율 변화, 배수 변화를 결정하기 위해, 치료용 세포 조성물 투여 전에, 림프구 고갈 요법 투여 전에, 2개 이상의 시점에, 예를 들어 초기 스크리닝에 결정될 수 있다.
2. 투입 조성물 특성
일부 구현예에서, 투입 조성물은 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체와 같은 대상체로부터 수득되거나 유래된 것과 같은 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플)로부터 단리된 세포를 함유한다. 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플)에서 세포를 단리하는 방법은 예를 들어 섹션 II-A에 기술되어 있다. 일부 측면에서, 대상체는 입양 세포 요법(이를 위해 세포가 단리, 가공 및/또는 조작됨)과 같은 특정한 치료적 개입이 필요한 환자인 대상체와 같은 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 세포 표현형을 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 총 T 세포의 수이다. 일부 구현예에서, 표현형은 총 CD3+ T 세포의 수이다. 일부 구현예에서, 표현형은 T 세포 아형의 정체성이거나 이를 포함한다. T 세포의 상이한 집단 또는 아형은 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 나이브 T 세포, CD4+ 세포, 및 CD8+ T 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 아형은 특정 분자의 존재 또는 부재를 검출함으로써 식별할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 특정 분자는 T 세포 아형을 식별하는 데 사용될 수 있는 표면 표지자이다.
일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO인 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 고수준 발현이다. 특정 구현예에서, 표현형은 예컨대 하나 이상의 표면 표지자, 예를 들어 CD3+, CD4+, CD8+, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+의 양성 표면 표지자 발현을 기반으로 하여 T 세포 또는 T 세포의 하위 집단 또는 서브세트의 표면 표지자이다. 일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 C-C 케모카인 수용체 유형 7(CCR7), 분화 클러스터 27(CD27), 분화 클러스터 28(CD28), 및 분화 클러스터 45 RA(CD45RA)인 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 고수준 발현이다. 특정 구현예에서, 표현형 표지자에는 CCR7, CD27, CD28, CD44, CD45RA, CD62L, 및 L-셀렉틴이 포함된다. 일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO인 하나 이상의 특정 분자의 음성 발현 또는 발현의 부재이다. 특정 구현예에서, 표현형은 예컨대 하나 이상의 표면 표지자, 예를 들어 CD3-, CD4-, CD8-, CD28-, CD62L-, CCR7-, CD27-, CD127-, CD4-, CD8-, CD45RA-, 및/또는 CD45RO-의 표면 표지자 발현의 부재를 기반으로 하여 T 세포 또는 T 세포의 하위 집단 또는 서브세트의 표면 표지자이다. 일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 C-C 케모카인 수용체 유형 7(CCR7), 분화 클러스터 27(CD27), 분화 클러스터 28(CD28), 및 분화 클러스터 45 RA(CD45RA)인 하나 이상의 특정 분자의 음성 발현 또는 발현의 부재이다. 특정 구현예에서, 표현형 표지자에는 CCR7, CD27, CD28, CD44, CD45RA, CD62L, 및 L-셀렉틴이 포함된다.
특정 구현예에서, 표현형은 CD27, CCR7 및/또는 CD45RA의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27-/CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27-/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA+이다.
일부 구현예에서, 표현형은 생존력이다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포가 정상적인 기능적 세포 과정을 겪고/거나 괴사 또는 세포예정사를 겪는 과정을 겪지 않았거나 겪는 중이 아님을 나타내는 표지자의 양성 발현이다. 일부 구현예에서, 생존력은 세포의 산화 환원 전위, 세포막의 완전성, 또는 미토콘드리아의 활성 또는 기능에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 생존력은 세포 사멸과 연관된 특정 분자의 부재 또는 분석에서 세포 사멸 징후의 부재이다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포 생존력이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포의 생존력은 당업계에서 통상적인 다수의 수단에 의해 검출, 측정 및/또는 평가될 수 있다. 이와 같은 생존력 분석법의 비제한적인 예에는 염료 흡착 분석(예를 들어, 칼세인 AM 분석), XTT 세포 생존력 분석 및 염료 배제 분석(예를 들어, 트립판 블루, 에오신 또는 프로피디움 염료 배제 분석)이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 생존력 분석은 세포 용량, 세포 조성물, 및/또는 세포 샘플에서 생존 세포의 수 또는 백분율(예를 들어, 빈도)을 알아내는 데 유용하다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 다른 특성들, 예를 들어 표면 표지자, 분자와 함께 세포 생존력을 포함한다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포 생존력, 생존 CD3+, 생존 CD4+, 생존 CD8+, 생존 CD4+/CCR7+, 생존 CD8+/CD27+, 생존 CD4+/CD27+, 생존 CD8+/CCR7+/CD27+, 생존 CD4+/CCR7+/CD27+, 생존 CD8+/CCR7+/CD45RA- 또는 생존 CD4+/CCR7+/CD45RA- 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 부재 및/또는 세포가 세포자멸사 과정을 겪고 있다는 표시이거나 이를 포함한다. 세포자멸사는 특징적인 세포 변화와 사멸로 이어지는 일련의 정형화된 형태적 및 생화학적 사건들을 포함하는 세포예정사의 과정이다. 이러한 변화에는 수포 형성, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 축합, 염색체 DNA 단편화 및 전체 mRNA 붕괴가 포함된다. 세포자멸사는 잘 특성화된 과정이며 다양한 단계와 관련된 특정 분자는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 초기 단계의 부재, 및/또는 세포자멸사의 초기 단계와 연관된 지표 및/또는 특정 분자의 부재이다. 세포자멸사의 초기 단계에서, 세포 막 및 미토콘드리아 막의 변화가 분명해진다. 세포질과 세포 핵에서 생화학적 변화도 분명해진다. 예를 들어, 세포자멸사의 초기 단계는 특정 카스파제, 예를 들어 2, 8, 9 및 10의 활성화로 표시될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 말기 단계의 부재, 및/또는 세포자멸사의 말기 단계와 연관된 지표 및/또는 특정 분자의 부재이다. 세포자멸사의 중간 내지 말기 단계는 막 완전성의 추가 손실, 염색질 축합 및 DNA 단편화를 특징으로 하며, 카스파제 3, 6 및 7의 활성화와 같은 생화학적 사건을 포함한다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사를 개시하는 것으로 알려진 전-세포자멸사 인자, 예를 들어 사멸 수용체 경로의 멤버, 미토콘드리아(내인성) 경로의 활성화된 멤버, 예컨대 Bax, Bad 및 Bid와 같은 Bcl-2 계열 멤버 및 카스파제를 포함한 세포자멸사와 연관된 하나 이상의 인자의 음성 발현이다. 일부 구현예에서, 표현형은 음성 또는 소량의 세포자멸사 표지자이다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자의 음성 발현이다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포 조성물과 함께 인큐베이션되거나 세포 조성물과 접촉할 때 세포자멸사를 겪는 세포에 우선적으로 결합하는 지표, 예를 들어 아넥신 V 분자의 부재이다. 일부 구현예에서, 표현형은 세포에서 세포자멸사 상태를 나타내는 하나 이상의 표지자의 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자인 특정 분자의 음성 (또는 낮은) 발현이다. 다양한 세포자멸사 표지자는 당업자에게 알려져 있으며, 하나 이상의 카스파제 즉 활성화된 카스파제(예를 들어, 활성 카스파제, CAS)의 활성 증가, PARP 절단의 증가, 세포 사멸 경로의 멤버들인 Bcl-2 계열 단백질들 예를 들어 Fas 및 FADD의 활성화 및/또는 전좌, 핵 수축(예를 들어, 현미경에 의해 모니터링됨)의 존재 및 염색체 DNA 단편화의 존재(예를 들어, 염색체 DNA 사다리의 존재) 또는 TUNEL 염색 및 아넥신 V 염색을 포함한 세포자멸사 분석이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
카스파제(caspase)는 아스파르트산 잔기 뒤에 단백질을 절단하는 효소이며, 이 용어는 “시스테인-아스파르트산 프로테아제(cysteine-aspartic acid protease)”에서 파생된 것이다. 카스파제는 세포자멸사에 관여하므로, 카스파제-3 등의 카스파제의 활성화는 세포자멸사의 증가 또는 부흥을 나타낸다. 일부 구현예에서, 활성화된 카스파제-3은 본원에서 3CAS로 지칭된다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성화는 당업자에게 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화된 카스파제에 특이적으로 결합하는 (즉, 절단된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는) 항체가 카스파제 활성화를 검출하는 데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 카스파제 활성의 형광색소 억제제(FLICA) 분석을 이용하여 카스파제-3에 의한 아세틸 Asp-Glu-Val-Asp 7-아미도-4-메틸쿠마린(Ac-DEVD-AMC)의 가수 분해를 검출함으로써(즉, 형광 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)의 방출을 검출함으로써) 카스파제-3 활성화를 검출할 수 있다. FLICA 분석은 다중 카스파제(예를 들어, FAM-VAD-FMK FLICA)에 의해 처리된 기질의 생성물을 검출하여 카스파제 활성화를 판정하는 데 사용될 수 있다. 다른 기술들에는 발광성(luminogenic) 카스파제-8 테트라펩타이드 기질(Z-LETD-아미노루시페린), 카스파제-9 테트라펩타이드 기질(Z-LEHD-아미노루시페린), 카스파제-3/7 기질(Z-DEVD-아미노루시페린), 카스파제-6 기질(Z-VEID-아미노루시페린) 또는 카스파제-2 기질(Z-VDVAD-아미노루시페린)을 사용하는 CASPASE-GLO® 카스파제 분석(PROMEGA)이 포함된다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포에서 활성화된 카스파제-1, 활성화된 카스파제-2, 활성화된 카스파제-3, 활성화된 카스파제-7, 활성화된 카스파제-8, 활성화된 카스파제-9, 활성화된 카스파제-10 및/또는 활성화된 카스파제-13의 음성 발현이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기와 같은 카스파제의 프로폼(proform, 또는 ‘사전-형’) (치모겐이 절단된) 형태 또한 세포자멸사의 존재를 나타내는 표지자이다. 일부 구현예에서, 표현형은 카스파제-3의 프로폼(proform)과 같은 카스파제의 프로폼의 부재 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포자멸사의 표지자는 절단된 폴리 ADP-리보스 중합효소 1(PARP)이다. PARP는 세포자멸사의 초기 단계 중에 카스파제에 의해 절단된다. 따라서, 절단된 PARP 펩타이드의 검출은 세포자멸사에 대한 표지자이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 절단된 PARP의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자멸사의 표지자는 세포자멸사와 연관된 세포 내 특징을 검출하는 시약이다. 특정 구현예에서, 상기 시약은 아넥신 V 분자이다. 세포자멸사의 초기 단계 중에 지질 포스파티딜세린(PS)이 원형질막의 내부 소엽에서 외부 소엽으로 전좌한다. PS는 일반적으로 건강한 세포 및/또는 비-세포자멸성 세포의 내부 막으로 제한된다. 아넥신 V는 포스파티딜세린(PS)에 높은 친화도로 우선적으로 결합하는 단백질이다. 형광 태그 또는 다른 리포터에 접합될 때, 아넥신 V는 세포자멸사의 이 초기 세포 표면 지표를 빠르게 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 외막 상에 PS의 존재는 세포자멸사의 말기 단계까지 지속될 것이다. 따라서 일부 구현예에서, 아넥신 V 염색은 세포자멸사의 초기 및 말기 단계 둘 모두의 징후이다. 특정 구현예에서, 아넥신(예를 들어, 아넥신 V)이 검출 가능한 표지로 표지되고 세포 조성물의 세포들과 인큐베이션되고/거나, 세포들에 노출되고/거나 세포들과 접촉하여 세포자멸사를 겪고 있는 세포들을 예를 들어 유세포 분석에 의해 검출한다. 일부 구현예에서, 형광 태그된 아넥신(예를 들어, 아넥신 V)을 사용하여 예를 들어 아넥신-V/7-AAD 분석으로 유세포 분석을 위한 세포를 염색한다. 아넥신을 사용한 세포자멸사 검출에 적합한 대체 프로토콜에는 방사선 표지된 아넥신 V를 활용하는 기술 및 분석이 포함된다. 특정 구현예에서, 표현형은 아넥신, 예를 들어 아넥신 V-에 의한 음성 염색이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 외부 원형질막 상에 PS의 부재이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 아넥신, 예를 들어 아넥신 V에 의해 결합되지 않는 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 외막 상에 검출 가능한 PS가 결여된 세포는 아넥신 V-이다. 구체적인 구현예에서, 표지된 아넥신 V와의 인큐베이션 후 분석, 예를 들어 유세포 분석에서 아넥신 V-에 의해 결합되지 않는 세포는 아넥신 V-이다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-, 아넥신 V- CD3+, 아넥신 V-CD4+, 아넥신 V- CD8+, 아넥신 V- CD3+, 아넥신 V- CD4+, 아넥신 V- CD8+, 활성화된 카스파제 3-, 활성화된 카스파제 3-/CD3+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+, 활성화된 카스파제 3- /CD8+, 활성화된 카스파제 3-/CD3+, 활성화된 카스파제 3-/ CD4+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+, 아넥신 V-/CD4+/CCR7+, 아넥신 V-/CD8+/CD27+, 아넥신 V-/CD4+/CD27+, 아넥신 V-/CD8+/CCR7+/CD27+, 아넥신 V-/CD4+/CCR7+/CD27+, 아넥신 V-/CD8+/CCR7+/CD45RA- 또는 아넥신 V-/CD4+/CCR7+/CD45RA-; 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CCR7+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CCR7+/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CCR7+/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CCR7+/CD45RA- 또는 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CCR7+/CD45RA- 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28-/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28-/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28+/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28+/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 추가로 CD4+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 추가로 CD8+이다.
구체적인 구현예들은 세포자멸사에 대한 표지자의 발현에 양성인 세포는, 활성화, 증폭을 겪고/거나 항원에 결합하여 면역 반응 또는 활성을 개시, 수행 또는 그에 기여하는 경우, 세포예정사를 겪고 있고, 면역 기능이 감소되거나 전혀 나타나지 않고, 능력이 감소된 것으로 생각한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제에 대한 음성 발현 및/또는 아넥신 V를 이용한 음성 염색으로 정의된다.
특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3(카스파제 3, 3CAS) 및/또는 아넥신 V이거나 이를 포함한다.
표현형들 중에는 T 세포의 하나 이상의 아형 또는 하위 집단 또는 이의 표현형과 일반적으로 연관된 하나 이상의 표지자의 발현 또는 표면 발현이 있다. T 세포 아형 및 하위 집단에는 나이브 T(TN) 세포, 나이브-유사 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이들의 아형, 예컨대 줄기세포 기억 T(TSCM), 중심 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM), TEMRA 세포 또는 말단 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양 침윤성 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막 연관 불변 T(MAIT) 세포, 천연 발생 및 적응성 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포를 포함할 수 있는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 및 이들의 아형이 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 투입 조성물의 세포의 클론성이다. 일부 구현예에서, T 세포들의 집단의 클론성을 평가하는 것은 T 세포들의 집단의 클론 다양성의 평가이다. 일부 구현예에서, T 세포는 다클론성 또는 다중클론성이다. 상기 T 세포들의 투입 조성물의 다클론성과 같은 클론성은 주어진 항원에 대한 상기 집단의 반응의 폭의 척도이다. 일부 측면에서, 투입 조성물은 항원 특이적 세포에 의해 인식되는 상이한 에피토프의 수를 측정함으로써 평가할 수 있다. 이는 시험관내에서 항원 특이적 T 세포를 생성 및 클로닝하기 위한 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 나이브-유사 T 세포들의 집단에서 우세한 단일 클론형 집단이 없는 다클론(또는 다중클론)이다.
T 세포들의 집단의 예컨대 투입 조성물의 맥락에서, 일부 측면에서, 다클론성의 시그니처는 다중 및 광범위한 항원 특이성을 갖는 T 세포들의 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 다클론성은 TCR 레퍼토리에서 높은 다양성을 나타내는 T 세포들의 집단에 관한 것이다. 일부 경우에, TCR 레퍼토리의 다양성은, 일부 측면에서, 자가 및 외래 항원에 대한 선택 사건에 의해 촉발되는 V(D)J 재조합 사건으로 인한 것이다. 일부 구현예에서, 다양하거나 다클론성인 T 세포들의 집단은 분석이 집단에 복수의 다양한 또는 상이한 TCR 전사물 또는 산물의 존재를 나타내는 T 세포들의 집단이다. 일부 구현예에서, 높은 또는 상대적으로 높은 클론성을 나타내는 T 세포들의 집단은 TCR 레퍼토리가 덜 다양한 T 세포들의 집단이다. 일부 구현예에서, 분석이 T 세포들의 집단에 여러 예컨대 둘 또는 셋의 TCR 전사물 또는 산물의 존재를 나타내면 T 세포들은 올리고클론성이다. 일부 구현예에서, 단클론성은 다양성이 낮은 T 세포들의 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 분석이 T 세포들의 집단에 단일 TCR 전사물 또는 산물의 존재를 나타내면 T 세포들은 단클론성이다.
T 세포와 같은 투입 조성물 내 세포의 클론성은 일부 예에서 차세대 염기서열분석과 같은 클론 염기서열분석, 또는 분광 형태 분석에 의해 알아낸이다. 일부 측면에서, 차세대 염기서열분석 방법은 T 세포로부터의 게놈 DNA 또는 cDNA를 사용하여 상보성-결정 영역 3(CDR3)을 암호화하는 서열을 포함한 TCR 레퍼토리를 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-seq에 의한 전체 전사체 염기서열분석이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일-세포 염기서열분석 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다클론성과 같은 클론성은 분광 형태 분석(TCR Vβ, Vα, Vγ, 또는 Vδ 사슬 초가변 영역 레퍼토리의 척도)에 의해 평가 또는 결정될 수 있다. 분광 형태 분석은 서열이 아닌 특정 크기의 재배열된 가변 유전자를 구별한다. 따라서, 단일 피크는 4개의 잠재적 뉴클레오타이드(아데닌(a), 구아닌(g), 시토신(c), 또는 티민(t)) 중 어느 하나 또는 접합 영역에서 4개의 뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 제한된 수의 재배열된 TCR 가변 유전자(Vβ, Vα, Vγ, 또는 Vδ) 중 어느 하나를 발현하는 T 세포들의 집단을 나타낼 수 있는 것으로 이해된다. T 세포들의 집단은 주어진 TCR Vβ, Vα, Vγ 또는 Vδ 패밀리에 대한 Vβ 분광 형태 프로파일이 다수의 피크, 전형적으로 5개 이상의 우세한 피크 및 대부분의 경우 가우시안 분포를 갖는 경우 다클론성으로 간주된다. 다클론성은 또한 관심 항원에 대한 항원 특이적 클론의 생성 및 특성화에 의해 정의될 수 있다. T 세포들의 집단의 예컨대 투입 조성물의 맥락에서, 단클론성은 분광 형태 분석(TCR Vβ, Vα, Vγ, 또는 Vδ 사슬 초가변 영역 레퍼토리의 척도)에 의해 정의할 때 단일 특이성을 갖는 T 세포들의 집단을 지칭한다. T 세포들의 집단은 주어진 TCR Vβ, Vα, Vγ, 및/또는 Vδ 패밀리에 대한 Vβ, Vα, Vγ, 및/또는 Vδ 분광 형태 프로파일이 단일 우세 피크를 가질 때 단클론성(또는 단일-특이성)으로 간주된다.
일부 구현예에서, 클론성을 평가하는 방법은 각자 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[국제 공개 번호 WO2012/048341, WO2014/144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 및 WO2012048340]에 기술된 바와 같은 방법들의 다양한 특성들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법들은 세포 예컨대 TCR 내의 관심 표적 폴리뉴클레오타이드에 관한 서열 정보를 획득하는 데 사용될 수 있다. 표적 유전자는 샘플 또는 세포들의 집단의 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 획득할 수 있다. 상기 샘플 또는 세포들의 집단은 면역 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표적 TCR 분자의 경우, TCR의 사슬을 암호화하는 유전자는 면역 세포 또는 T 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 획득할 수 있다. 일부 구현예에서, 출발 물질은 TCR의 사슬을 암호화하는 유전자들로 구성된 T 세포들 유래의 RNA이다.
일부 구현예에서, 샤논 지수는 클론을 필터링하기 위한 임계치로서 클론성에 적용되며(“샤논-조절된 클론성”), 문헌[Chaara 등 (2018) Front Immunol 9:1038]을 참조한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 투입 조성물의 CD4+ 세포의 클론성이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 투입 조성물의 CD8+ 세포의 클론성이다.
일부 측면에서, 표현형 중에는 덜 분화된 세포 서브세트 또는 더 분화된 서브세트와 연관된, 발현 또는 표지자 또는 기능 예를 들어 사이토카인 분비와 같은 항원 특이적 기능이 포함된다. 일부 구현예에서, 표현형들은 CCR7+, CD27+ 및 인터루킨-2(IL-2) 생산 중 하나 이상과 같은 덜 분화된 서브세트와 연관된 것들이다. 일부 측면에서, 덜 분화된 세포, 예를 들어 중심 기억 세포는 수명이 더 길고 덜 빨리 탈진되어 지속성과 내구성이 증가한다. 일부 구현예에서, 표현형들은 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 IL-13 생산 중 하나 이상과 같은 더 분화된 서브세트와 연관된 것들이다. 일부 측면에서, 더 분화된 서브세트는 또한 노화 및 효과기 기능과 관련될 수 있다.
일부 구현예에서, 표현형은 그의 동족 항원에 노출된 기억 T 세포 또는 기억 T 세포 서브세트의 표현형이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 기억 T 세포(또는 그와 연관된 하나 이상의 표지자), 예컨대 TCM 세포, TEM 세포, 또는 TEMRA 세포, TSCM 세포, 또는 이들의 조합의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 기억 및/또는 기억 T 세포 또는 이의 아형에 대한 표지자인, 하나 이상의 특정 분자의 발현이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, TCM 세포와 연관된 예시적인 표현형에는 CD45RA-, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+ 및 CD95+ 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 일부 측면에서, TEM 세포와 연관된 예시적인 표현형에는 CD45RA-, CD62L-, CCR7-, CD27-, CD28-, 및 CD95+ 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 나이브 T 세포에 대한 표지자인, 하나 이상의 특정 분자의 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은 기억 T 세포 또는 나이브 T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 기억(memory)에 대한 표지자인, 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 음성 발현이다. 일부 구현예에서, 상기 기억 표지자는 기억 T 세포 집단을 정의하는 데 사용될 수 있는 특정 분자이다.
일부 구현예에서, 표현형은 비-기억 T 세포 또는 이의 아형과 연관된 하나 이상의 표지자의 표현형이거나 이를 포함하고; 일부 측면에서, 그것은 나이브 세포와 연관된 표현형 또는 표지자(들)이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 나이브 T 세포와 연관된 예시적인 표현형에는 CCR7+, CD45RA+, CD27+, 및 CD28+ 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA+이다. 특정 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 중심 기억 T 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 TEMRA 세포 또는 TSCM 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD45RA+이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+, CD27-/CD28+, CD27+/CD28-, 또는 CD27-/CD28- 중 하나이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA+이다. 특정 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD45RA+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27-/CD45RA+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-; CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-; CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+; CD27+/CD28+; CD27-/CD28+; CD27+/CD28-; 또는 CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA-; CCR7-/CD27+/CD45RA-; CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+; CD27+; CD27-; CD27+/CD28-; 또는 CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은 나이브-유사 T 세포와 연관된 하나 이상의 표지자의 표현형이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 다양한 분화 상태의 세포를 포함할 수 있고 특정 세포 표지자의 양성 또는 고 발현(예를 들어, 표면 발현 또는 세포내 발현) 및/또는 다른 세포 표지자의 음성 또는 저 발현(예를 들어, 표면 발현 또는 세포내 발현)을 특징으로 할 수 있다. 일부 측면에서, 나이브-유사 T 세포는 CCR7, CD45RA, CD28, 및/또는 CD27의 양성 또는 고 발현을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 나이브-유사 T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, CD62L, 및/또는 KLRG1의 음성 발현을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 나이브-유사 T 세포는 CD95의 저 발현을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현되는 표지자에 대해 표면 양성인 T 세포는 CCR7+CD45RA+이고, 여기서 상기 세포들은 CD27+ 또는 CD27-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현되는 표지자에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD27+/CCR7+이고, 여기서 상기 세포들은 CD45RA+ 또는 CD45RA-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현되는 표지자에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD62L-CCR7+이다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 T 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 나이브 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포자멸사의 표지자는 활성화된 카스파제 3(3CAS)이다. 일부 구현예에서, 상기 세포자멸사의 표지자는 아넥신 V에 의한 양성 염색이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+, CD27-/CD28+, CD27+/CD28-, CD27-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD27+/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CD27-/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CD27+/CD28-, 활성화된 카스파제 3-/CD27-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CD27+/CD28+, 아넥신 V-/CD27-/CD28+, 아넥신 V-/CD27+/CD28-, 아넥신 V-/CD27-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CD27+, CD27-, CD27+, CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+, CD27-, CD27+, CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CD27-, 활성화된 카스파제 3-/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CD27+, 아넥신 V-/CD27-, 아넥신 V-/CD27+, 아넥신 V-/CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD28+, CCR7-/CD28+, CCR7+/CD28-, CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD28+, CCR7-/CD28+, CCR7+/CD28-, CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD28-, 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CCR7+/CD28+, 아넥신 V-/CCR7-/CD28+, 아넥신 V-/CCR7+/CD28-, 아넥신 V-/CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+, CCR7-, CCR7+, CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+, CCR7-, CCR7+, CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CCR7+, 활성화된 카스파제 3-/CCR7-, 활성화된 카스파제 3-/CCR7+, 활성화된 카스파제 3-/CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CCR7+, 아넥신 V-/CCR7-, 아넥신 V-/CCR7+, 아넥신 V-/CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 본원에 기술된 표현형을 포함하여 하나 이상 또는 모든 투입 조성물 특성을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-, CAS3-/CCR7-/CD27+, CAS3-/CCR7+, CAS3-/CCR7+/CD27-, CAS3-/CCR7+/CD27+, CAS3-/CD27+, CAS3-/CD28-/CD27-, CAS3-/CD28-/CD27+, CAS3-/CD28+, CAS3-/CD28+/CD27-, CAS3-/CD28+/CD27+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-, CAS3-/CCR7-, CD45RA+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-, CAS3-/CCR7+/CD45RA+, CAS+, CAS+/CD3+, 및 클론성 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+, CAS3-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28-/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD4+, CD45RA+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+, CAS+/CD4+, CAS+/CD3+/CD4+, 및 CD4+ 클론성 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+, CAS3-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28-/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD85RA-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD8+, CD85RA+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD85RA-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD85RA+/CD8+, CAS+/CD8+, CAS+/CD3+/CD8+, 및 CD8+ 클론성 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+, CAS3-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28-/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD4+, CD45RA+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+, CAS+/CD4+, CAS+/CD3+/CD4+, CD4+ 클론성, CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+, CAS3-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28-/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD85RA-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD8+, CD85RA+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD85RA-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD85RA+/CD8+, CAS+/CD8+, CAS+/CD3+/CD8+, 및 CD8+ 클론성 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 특성들은 아래 표 E4에 제시된 투입 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함한다. 상기 임의의 구현예의 일부에서, 상기 전술한 바와 같은 표현형을 가진 세포의 백분율, 수, 및/또는 비율이 결정, 측정, 획득, 검출, 관측, 및/또는 식별된다. 일부 구현예에서, 상기 표현형의 세포의 수는 투입 조성물의 표현형의 세포의 총량이다. 일부 구현예에서, 상기 표현형의 세포의 수는 투입 조성물에 존재하는 표현형의 세포의 빈도, 비, 및/또는 백분율로서 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 특성은 본원에 기술된 표현형을 가진 세포의 빈도, 비, 및/또는 백분율이다.
3. 치료용 세포 조성물 특성
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물, 예를 들어, 치료용 T 세포 조성물은 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 세포 표현형을 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 총 T 세포의 수이다. 일부 구현예에서, 표현형은 총 CD3+ T 세포의 수이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 재조합 수용체 또는 CAR을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 또는 CAR은 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 표현형은 T 세포들의 하나 이상의 상이한 아형을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 상이한 아형은 재조합 수용체 또는 CAR을 더 발현한다. 일부 구현예에서, 표현형은 T 세포 아형의 정체성이거나 이를 포함한다. T 세포의 상이한 집단 또는 아형은 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포, 조절 T 세포, 나이브 T 세포, 나이브-유사 T 세포, CD4+ 세포, 및 CD8+ T 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, T 세포 아형은 특정 분자의 존재 또는 부재를 검출함으로써 식별할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 특정 분자는 T 세포 아형을 식별하는 데 사용될 수 있는 표면 표지자이다.
일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO인 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 고수준 발현이다. 특정 구현예에서, 표현형은 예컨대 하나 이상의 표면 표지자, 예를 들어 CD3+, CD4+, CD8+, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+의 양성 표면 표지자 발현을 기반으로 하여 T 세포 또는 T 세포의 하위 집단 또는 서브세트의 표면 표지자이다. 일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 C-C 케모카인 수용체 유형 7(CCR7), 분화 클러스터 27(CD27), 분화 클러스터 28(CD28), 및 분화 클러스터 45 RA(CD45RA)인 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 고수준 발현이다. 특정 구현예에서, 표현형 표지자에는 CCR7, CD27, CD28, CD44, CD45RA, CD62L, 및 L-셀렉틴이 포함된다. 일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD45RA, 및/또는 CD45RO인 하나 이상의 특정 분자의 음성 발현 또는 발현의 부재이다. 특정 구현예에서, 표현형은 예컨대 하나 이상의 표면 표지자, 예를 들어 CD3-, CD4-, CD8-, CD28-, CD62L-, CCR7-, CD27-, CD127-, CD4-, CD8-, CD45RA-, 및/또는 CD45RO-의 표면 표지자 발현의 부재를 기반으로 하여 T 세포 또는 T 세포의 하위 집단 또는 서브세트의 표면 표지자이다. 일부 구현예에서, 표현형은 표면 표지자, 예를 들어 C-C 케모카인 수용체 유형 7(CCR7), 분화 클러스터 27(CD27), 분화 클러스터 28(CD28), 및 분화 클러스터 45 RA(CD45RA)인 하나 이상의 특정 분자의 음성 발현 또는 발현의 부재이다. 특정 구현예에서, 표현형 표지자에는 CCR7, CD27, CD28, CD44, CD45RA, CD62L, 및 L-셀렉틴이 포함된다.
특정 구현예에서, 표현형은 CD27, CCR7 및/또는 CD45RA의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27-/CD45RA+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27-/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA+이다.
특정 구현예에서, 상기 표면 표지자는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 발현을 나타낸다. 구체적인 구현예에서, 상기 표면 표지자는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 발현이고, 이는 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체와 같은 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 발현을 나타내는 표면 표지자는 대리 표지자이다. 구체적인 구현예에서, 상기와 같은 대리 표지자는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 특정 구현예에서, 대리 표지자는 재조합 수용체를 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 암호화된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은, 선택적으로 내부 리보솜 유입점(IRES)에 의해 분리되는, 표지자를 암호화하는 핵산 서열에 또는 자가 절단 펩타이드 또는 T2A(예를 들어, 서열 번호: 1과 4), P2A(예를 들어, 서열 번호: 5와 6), E2A(예를 들어, 서열 번호: 7) 또는 F2A(예를 들어, 서열 번호: 8)와 같은 2A 서열과 같은 리보솜 스키핑을 일으키는 펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 외인성 표지 유전자는 일부 경우에 세포의 검출 또는 선택을 가능하게 하도록, 일부 경우에 또한 세포 자살을 촉진하도록, 조작된 세포와 관련하여 사용될 수 있다.
예시적인 대리 표지자는 절단형 인간 표피 성장 인자 수용체 2(tHER2), 절단형 표피 성장 인자 수용체(EGFRt, 서열 번호: 2 또는 3에 제시된 예시적인 EGFRt 서열) 또는 전립선-특이적 막 항원(PSMA) 또는 이의 변형 형태와 같은 절단형 세포 표면 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. EGFRt는 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 EGFRt 구조체 및 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작된 세포를 식별 또는 선택하기 위해 및/또는 상기 수용체를 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu 등, Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]을 참조한다. 일부 측면에서, 표지자(예를 들어, 대리 표지자)에는 CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태)가 포함된다. 일부 구현예에서, 표지자를 암호화하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열(예를 들어, T2A)과 같은 링커 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 표지자 및 선택적으로 링커 서열은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687]에 개시된 바와 같은 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 표지자는 선택적으로 링커 서열, 예컨대 T2A 절단 가능한 링커 서열에 연결된 절단형 EGFR(tEGFR, EGFRt)일 수 있다. 절단형 EGFR(예를 들어, , tEGFR, EGFRt)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호: 2 또는 3에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호: 2 또는 3에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 EGFRt+이다.
일부 구현예에서, 표지자는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청록 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 청색 형광 단백질(EBFP) 및 노랑 형광 단백질(YFP) 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 및 코돈 최적화된 및/또는 강화된 변이체를 포함한 상기들의 변이체와 같은 형광 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지자는 루시퍼라아제, 대장균(E. Coli )의 lacZ 유전자, 알칼리 포스파타아제, 분비 배아 알칼리 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)와 같은 효소이거나 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자에는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 이들의 변이체가 포함된다.
특정 구현예에서, 표현형은 표면 표지자들 CD3, CD4, CD8, 및/또는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 하나 이상의 발현 예를 들어 표면 발현 또는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 발현을 나타내거와 그와 상관관계가 있는 대리 표지자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대리 표지자는 EGFRt이다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 표면 표지자인, 하나 이상의 특정 분자의 발현에 의해 식별된다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD3, CD4, CD8, 및/또는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CD3+/CAR+, CD4+/CAR+, 및/또는 CD8+/CAR+을 포함한다.
특정 구현예에서, 표현형은 CD27, CCR7 및/또는 CD45RA, 및/또는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD28-/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD28-/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD28+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD28+/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD28+/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD45RA+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 추가로 CD4+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 추가로 CD8+이다.
일부 구현예에서, 표현형은 생존력이다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포가 정상적인 기능적 세포 과정을 겪고/거나 괴사 또는 세포예정사를 겪는 과정을 겪지 않았거나 겪는 중이 아님을 나타내는 표지자의 양성 발현이다. 일부 구현예에서, 생존력은 세포의 산화 환원 전위, 세포막의 완전성, 또는 미토콘드리아의 활성 또는 기능에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 생존력은 세포 사멸과 연관된 특정 분자의 부재 또는 분석에서 세포 사멸 징후의 부재이다. 일부 구현예에서, 표현형은 생존 세포 농도이다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포 생존력이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포의 생존력은 당업계에서 통상적인 다수의 수단에 의해 검출, 측정 및/또는 평가될 수 있다. 이와 같은 생존력 분석법의 비제한적인 예에는 염료 흡착 분석(예를 들어, 칼세인 AM 분석), XTT 세포 생존력 분석 및 염료 배제 분석(예를 들어, 트립판 블루, 에오신 또는 프로피디움 염료 배제 분석)이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 생존력 분석은 세포 용량, 세포 조성물, 및/또는 세포 샘플에서 생존 세포의 수 또는 백분율(예를 들어, 빈도)을 알아내는 데 유용하다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 다른 특성들, 예를 들어 재조합 수용체 발현과 함께 세포 생존력을 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 용해성 CD137(sCD137, 4-IBB)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, sCD137은 활성화 유도된 세포 사멸을 나타낸다. 일부 구현예에서, sCD137은 상청액에서 검출된다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포 생존력, 생존 CD3+, 생존 CD4+, 생존 CD8+, 생존 CD3+/CAR+, 생존 CD4+/CAR+, 생존 CD8+/CAR+, 생존 CD4+/CCR7+/CAR+, 생존 CD8+/CD27+/CAR+, 생존 CD4+/CD27+/CAR+, 생존 CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+, 생존 CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+, 생존 CD8+/CCR7+/CD45RA-/CAR+ 또는 생존 CD4+/CCR7+/CD45RA- 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 부재 및/또는 세포가 세포자멸사 과정을 겪고 있다는 표시이거나 이를 포함한다. 세포자멸사는 특징적인 세포 변화와 사멸로 이어지는 일련의 정형화된 형태적 및 생화학적 사건들을 포함하는 세포예정사의 과정이다. 이러한 변화에는 수포 형성, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 축합, 염색체 DNA 단편화 및 전체 mRNA 붕괴가 포함된다. 세포자멸사는 잘 특성화된 과정이며 다양한 단계와 연관된 특정 분자는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 초기 단계의 부재, 및/또는 세포자멸사의 초기 단계와 연관된 지표 및/또는 특정 분자의 부재이다. 세포자멸사의 초기 단계에서, 세포 막 및 미토콘드리아 막의 변화가 분명해진다. 세포질과 세포 핵에서 생화학적 변화도 분명해진다. 예를 들어, 세포자멸사의 초기 단계는 특정 카스파제, 예를 들어 2, 8, 9 및 10의 활성화로 표시될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 말기 단계의 부재, 및/또는 세포자멸사의 말기 단계와 연관된 지표 및/또는 특정 분자의 부재이다. 세포자멸사의 중간 내지 말기 단계는 막 완전성의 추가 손실, 염색질 축합 및 DNA 단편화를 특징으로 하며, 카스파제 3, 6 및 7의 활성화와 같은 생화학적 사건을 포함한다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사를 개시하는 것으로 알려진 전-세포자멸사 인자, 예를 들어 사멸 수용체 경로의 멤버, 미토콘드리아(내인성) 경로의 활성화된 멤버, 예컨대 Bax, Bad 및 Bid와 같은 Bcl-2 계열 멤버 및 카스파제를 포함한 세포자멸사와 연관된 하나 이상의 인자의 음성 발현이다. 일부 구현예에서, 표현형은 음성 또는 소량의 세포자멸사 표지자이다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자의 음성 발현이다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포 조성물과 함께 인큐베이션되거나 세포 조성물과 접촉할 때 세포자멸사를 겪는 세포에 우선적으로 결합하는 지표, 예를 들어 아넥신 V 분자의 부재이다. 일부 구현예에서, 표현형은 세포에서 세포자멸사 상태를 나타내는 하나 이상의 표지자의 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자인 특정 분자의 음성 (또는 낮은) 발현이다. 다양한 세포자멸사 표지자는 당업자에게 알려져 있으며, 하나 이상의 카스파제 즉 활성화된 카스파제(예를 들어, 활성 카스파제)의 활성 증가, PARP 절단의 증가, 세포 사멸 경로의 멤버들인 Bcl-2 계열 단백질들 예를 들어 Fas 및 FADD의 활성화 및/또는 전좌, 핵 수축(예를 들어, 현미경에 의해 모니터링됨)의 존재 및 염색체 DNA 단편화의 존재(예를 들어, 염색체 DNA 사다리의 존재) 또는 TUNEL 염색 및 아넥신 V 염색을 포함한 세포자멸사 분석이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
카스파제(caspase)는 아스파르트산 잔기 뒤에 단백질을 절단하는 효소이며, 이 용어는 “시스테인-아스파르트산 프로테아제(cysteine-aspartic acid protease)”에서 파생된 것이다. 카스파제는 세포자멸사에 관여하므로, 카스파제-3 등의 카스파제의 활성화는 세포자멸사의 증가 또는 부흥을 나타낸다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성화는 당업자에게 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화된 카스파제에 특이적으로 결합하는 (즉, 절단된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는) 항체가 카스파제 활성화를 검출하는 데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 카스파제 활성의 형광색소 억제제(FLICA) 분석을 이용하여 카스파제-3에 의한 아세틸 Asp-Glu-Val-Asp 7-아미도-4-메틸쿠마린(Ac-DEVD-AMC)의 가수 분해를 검출함으로써(즉, 형광 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC)의 방출을 검출함으로써) 카스파제-3 활성화를 검출할 수 있다. FLICA 분석은 다중 카스파제(예를 들어, FAM-VAD-FMK FLICA)에 의해 처리된 기질의 생성물을 검출하여 카스파제 활성화를 판정하는 데 사용될 수 있다. 다른 기술들에는 발광성(luminogenic) 카스파제-8 테트라펩타이드 기질(Z-LETD-아미노루시페린), 카스파제-9 테트라펩타이드 기질(Z-LEHD-아미노루시페린), 카스파제-3/7 기질(Z-DEVD-아미노루시페린), 카스파제-6 기질(Z-VEID-아미노루시페린) 또는 카스파제-2 기질(Z-VDVAD-아미노루시페린)을 사용하는 CASPASE-GLO® 카스파제 분석(PROMEGA)이 포함된다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포에서 활성화된 카스파제-1, 활성화된 카스파제-2, 활성화된 카스파제-3, 활성화된 카스파제-7, 활성화된 카스파제-8, 활성화된 카스파제-9, 활성화된 카스파제-10 및/또는 활성화된 카스파제-13의 음성 발현이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기와 같은 카스파제의 프로폼(proform, 또는 ‘사전-형’) (치모겐이 절단된) 형태 또한 세포자멸사의 존재를 나타내는 표지자이다. 일부 구현예에서, 표현형은 카스파제-3의 프로폼(proform)과 같은 카스파제의 프로폼의 부재 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포자멸사의 표지자는 절단된 폴리 ADP-리보스 중합효소 1(PARP)이다. PARP는 세포자멸사의 초기 단계 중에 카스파제에 의해 절단된다. 따라서, 절단된 PARP 펩타이드의 검출은 세포자멸사에 대한 표지자이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 절단된 PARP의 양성 또는 음성 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포자멸사의 표지자는 세포자멸사와 연관된 세포 내 특징을 검출하는 시약이다. 특정 구현예에서, 상기 시약은 아넥신 V 분자이다. 세포자멸사의 초기 단계 중에 지질 포스파티딜세린(PS)이 원형질막의 내부 소엽에서 외부 소엽으로 전좌한다. PS는 일반적으로 건강한 세포 및/또는 비-세포자멸성 세포의 내부 막으로 제한된다. 아넥신 V는 포스파티딜세린(PS)에 높은 친화도로 우선적으로 결합하는 단백질이다. 형광 태그 또는 다른 리포터에 접합될 때, 아넥신 V는 세포자멸사의 이 초기 세포 표면 지표를 빠르게 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 외막 상에 PS의 존재는 세포자멸사의 말기 단계까지 지속될 것이다. 따라서 일부 구현예에서, 아넥신 V 염색은 세포자멸사의 초기 및 말기 단계 둘 모두의 징후이다. 특정 구현예에서, 아넥신(예를 들어, 아넥신 V)이 검출 가능한 표지로 표지되고 세포 조성물의 세포들과 인큐베이션되고/거나, 세포들에 노출되고/거나 세포들과 접촉하여 세포자멸사를 겪고 있는 세포들을 예를 들어 유세포 분석에 의해 검출한다. 일부 구현예에서, 형광 태그된 아넥신(예를 들어, 아넥신 V)을 사용하여 예를 들어 아넥신-V/7-AAD 분석으로 유세포 분석을 위한 세포를 염색한다. 아넥신을 사용한 세포자멸사 검출에 적합한 대체 프로토콜에는 방사선 표지된 아넥신 V를 활용하는 기술 및 분석이 포함된다. 특정 구현예에서, 표현형은 아넥신, 예를 들어 아넥신 V-에 의한 음성 염색이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 외부 원형질막 상에 PS의 부재이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 아넥신, 예를 들어 아넥신 V에 의해 결합되지 않는 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 외막 상에 검출 가능한 PS가 결여된 세포는 아넥신 V-이다. 구체적인 구현예에서, 표지된 아넥신 V와의 인큐베이션 후 분석, 예를 들어 유세포 분석에서 아넥신 V-에 의해 결합되지 않는 세포는 아넥신 V-이다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-, 아넥신 V- CD3+, 아넥신 V-CD4+, 아넥신 V- CD8+, 아넥신 V- CD3+/CAR+, 아넥신 V- CD4+/CAR+, 아넥신 V- CD8+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-, 활성화된 카스파제 3-/CD3+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+, 활성화된 카스파제 3- /CD8+, 활성화된 카스파제 3-/CD3+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/ CD4+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CAR+, 아넥신 V-/CD4+/CCR7+/CAR+, 아넥신 V-/CD8+/CD27+/CAR+, 아넥신 V-/CD4+/CD27+/CAR+, 아넥신 V-/CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+, 아넥신 V-/CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+, 아넥신 V-/CD8+/CCR7+/CD45RA-/CAR+ 또는 아넥신 V-/CD4+/CCR7+/CD45RA-; 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CCR7+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CD27+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CD27+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CCR7+/CD27+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CCR7+/CD27+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CCR7+/CD45RA-/CAR+ 또는 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CCR7+/CD45RA- 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28-/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28-/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28+/CD27-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CD28+/CD27+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7-/CD45RA+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD45RA-/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 3CAS-/CCR7+/CD45RA+/CAR+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 추가로 CD4+이다. 일부 구현예에서, 표현형은 추가로 CD8+이다.
구체적인 구현예들은 세포자멸사에 대한 표지자의 발현에 양성인 세포는, 활성화, 증폭을 겪고/거나 항원에 결합하여 면역 반응 또는 활성을 개시, 수행 또는 그에 기여하는 경우, 세포예정사를 겪고 있고, 면역 기능이 감소되거나 전혀 나타나지 않고, 능력이 감소된 것으로 생각한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제에 대한 음성 발현 및/또는 아넥신 V를 이용한 음성 염색으로 정의된다.
특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-(3CAS-, 카스파제 3-) 및/또는 아넥신 V-이거나 이를 포함한다.
표현형들 중에는 T 세포의 하나 이상의 아형 또는 하위 집단 또는 이의 표현형과 일반적으로 연관된 하나 이상의 표지자의 발현 또는 표면 발현이 있다. T 세포 아형 및 하위 집단에는 나이브 T(TN) 세포, 나이브-유사 T 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이들의 아형, 예컨대 줄기세포 기억 T(TSCM), 중심 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM), TEMRA 세포 또는 말단 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양 침윤성 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막 연관 불변 T(MAIT) 세포, 천연 발생 및 적응성 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포를 포함할 수 있는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 및 이들의 아형이 포함될 수 있다.
일부 측면에서, 표현형 중에는 덜 분화된 세포 서브세트 또는 더 분화된 서브세트와 연관된, 발현 또는 표지자 또는 기능 예를 들어 사이토카인 분비와 같은 항원 특이적 기능이 포함된다. 일부 구현예에서, 표현형들은 CCR7+, CD27+ 및 인터루킨-2(IL-2) 생산 중 하나 이상과 같은 덜 분화된 서브세트와 연관된 것들이다. 일부 측면에서, 덜 분화된 서브세트는 또한 치료 효능, 자가 재생, 생존 기능 또는 이식편 대 숙주병과 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형들은 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 IL-13 생산 중 하나 이상과 같은 더 분화된 서브세트와 연관된 것들이다. 일부 측면에서, 더 분화된 서브세트는 또한 노화 및 효과기 기능과 관련될 수 있다.
일부 구현예에서, 표현형은 그의 동족 항원에 노출된 기억 T 세포 또는 기억 T 세포 서브세트의 표현형이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 기억 T 세포(또는 그와 연관된 하나 이상의 표지자), 예컨대 TCM 세포, TEM 세포, 또는 TEMRA 세포, TSCM 세포, 또는 이들의 조합의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 기억 및/또는 기억 T 세포 또는 이의 아형에 대한 표지자인, 하나 이상의 특정 분자의 발현이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, TCM 세포와 연관된 예시적인 표현형에는 CD45RA-, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, 및 CD95+ 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 일부 측면에서, TEM 세포와 연관된 예시적인 표현형에는 CD45RA-, CD62L-, CCR7-, CD27-, CD28-, 및 CD95+ 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 나이브 T 세포에 대한 표지자인, 하나 이상의 특정 분자의 발현이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은 기억 T 세포 또는 나이브 T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 기억(memory)에 대한 표지자인, 하나 이상의 특정 분자의 양성 또는 음성 발현이다. 일부 구현예에서, 상기 기억 표지자는 기억 T 세포 집단을 정의하는 데 사용될 수 있는 특정 분자이다.
일부 구현예에서, 표현형은 나이브-유사 T 세포와 연관된 하나 이상의 표지자의 표현형이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 다양한 분화 상태의 세포를 포함할 수 있고 특정 세포 표지자의 양성 또는 고 발현(예를 들어, 표면 발현 또는 세포내 발현) 및/또는 다른 세포 표지자의 음성 또는 저 발현(예를 들어, 표면 발현 또는 세포내 발현)을 특징으로 할 수 있다. 일부 측면에서, 나이브-유사 T 세포는 CCR7, CD45RA, CD28, 및/또는 CD27의 양성 또는 고 발현을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 나이브-유사 T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, CD62L, 및/또는 KLRG1의 음성 발현을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 나이브-유사 T 세포는 CD95의 저 발현을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현되는 표지자에 대해 표면 양성인 T 세포는 CCR7+CD45RA+이고, 여기서 상기 세포들은 CD27+ 또는 CD27-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현되는 표지자에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD27+CCR7+이고, 여기서 상기 세포들은 CD45RA+ 또는 CD45RA-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현되는 표지자에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD62L-CCR7+이다.
일부 구현예에서, 표현형은 비-기억 T 세포 또는 이의 아형과 연관된 하나 이상의 표지자의 표현형이거나 이를 포함하고; 일부 측면에서, 그것은 나이브 세포와 연관된 표현형 또는 표지자(들)이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 나이브 T 세포와 연관된 예시적인 표현형에는 CCR7+, CD45RA+, CD27+, 및 CD28+ 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA+이다. 특정 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 중심 기억 T 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 TEMRA 세포 또는 TSCM 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD45RA+이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+, CD27-/CD28+, CD27+/CD28-, 또는 CD27-/CD28- 중 하나이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA+이다. 특정 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD45RA+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD27+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27+/CD45RA-이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD45RA+이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7-/CD27-/CD45RA+이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은 전술한 표현형 특성들 중 임의의 것이거나 이를 포함하고 CAR을 발현하는 기억 T 세포 또는 기억 아형과 연관된 표현형 또는 CAR을 발현하는 나이브 세포와 연관된 표현형 등 재조합 수용체의 발현을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 중심 기억 T 세포 또는 줄기 중심 기억 T 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 효과기 기억 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 TEMRA 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-; CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-; CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+; CAR+/CD27+/CD28+; CAR+/CD27-/CD28+; CAR+/CD27+/CD28-; 또는 CAR+/CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-; CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-; CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+; CAR+/CD27+; CAR+/CD27-; CAR+/CD27+/CD28-; 또는 CAR+/CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 T 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 나이브 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포자멸사의 표지자는 활성화된 카스파제 3(3CAS)이다. 일부 구현예에서, 상기 세포자멸사의 표지자는 아넥신 V에 의한 양성 염색이다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 기억 T 세포 또는 이의 아형의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 기억 T 세포 또는 특정 아형의 표현형이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 나이브 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 중심 기억 T 세포 또는 TSCM 세포 또는 나이브 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CAR을 발현하는 세포자멸사의 표지자에 대해 음성인 효과기 기억 세포의 표현형이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-; 아넥신 V-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-; 아넥신 V-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+; 아넥신 V-/CAR+/CD27+/CD28+; 아넥신 V-/CAR+/CD27-/CD28+; 아넥신 V-/CAR+/CD27+/CD28-; 또는 아넥신 V-/CAR+/CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD28+/CD45RA-; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD28+/CD45RA-; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD28-/CD45RA+; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+/CD28+; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-/CD28+; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+/CD28-; 또는 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-/CD28-이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-; 아넥신 V-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-; 아넥신 V-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD45RA+; 아넥신 V-/CAR+/CD27+/CD28+; 아넥신 V-/CAR+/CD27-/CD28+; 아넥신 V-/CAR+/CD27+; 또는 아넥신 V-/CAR+/CD27-이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7+/CD27+/CD45RA-; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-/CD27+/CD45RA-; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-/CD27-/CD45RA+; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+/CD28+; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-/CD28+; 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+; 또는 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 CD27+/CD28+, CD27-/CD28+, CD27+/CD28-, CD27-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CAR+/CD27+/CD28+, CAR+/CD27-/CD28+, CAR+/CD27+/CD28-, CAR+/CD27-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+/CD28-, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CAR+/CD27+/CD28+, 아넥신 V-/CAR+/CD27-/CD28+, 아넥신 V-/CAR+/CD27+/CD28-, 아넥신 V-/CAR+/CD27-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CD27+, CD27-, CD27+, CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CAR+/CD27+, CAR+/CD27-, CAR+/CD27+, CAR+/CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CAR+/CD27+, 아넥신 V-/CAR+/CD27-, 아넥신 V-/CAR+/CD27+, 아넥신 V-/CAR+/CD27-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+/CD28+, CCR7-/CD28+, CCR7+/CD28-, CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CAR+/CCR7+/CD28+, CAR+/CCR7-/CD28+, CAR+/CCR7+/CD28-, CAR+/CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7+/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-/CD28+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7+/CD28-, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CAR+/CCR7+/CD28+, 아넥신 V-/CAR+/CCR7-/CD28+, 아넥신 V-/CAR+/CCR7+/CD28-, 아넥신 V-/CAR+/CCR7-/CD28-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CCR7+, CCR7-, CCR7+, CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CAR+/CCR7+, CAR+/CCR7-, CAR+/CCR7+, CAR+/CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7+, 활성화된 카스파제 3-/CAR+/CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CAR+/CCR7+, 아넥신 V-/CAR+/CCR7-, 아넥신 V-/CAR+/CCR7+, 아넥신 V-/CAR+/CCR7-, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은 자극, 예를 들어 면역 세포 기능을 촉발, 유도, 자극 또는 연장하는 자극에 대한 반응으로 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션되고, 표현형은 자극에 대한 반응이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 자극에 대한 반응으로 용해성 인자의 생산 또는 분비이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 자극에 대한 반응으로 용해성 인자의 결여 또는 생산 또는 분비이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 용해성 인자는 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 TNFa이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-17이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFNG이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-13이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-5이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 GMSCF이다. 일부 구현예에서, 세포는 사이토카인을 생산하지 않는다(cyto-). 일부 구현예에서, 세포 표현형은 사이토카인 음성(Cyto-)이다.
세포를 자극하기 위해 사용되는 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 자극되고 표현형은 용해성 인자, 예를 들어 사이토카인 또는 케모카인이 생산 또는 분비되는지 아닌지로 알아낸이다. 일부 구현예에서, 자극은 비특이적이다, 즉, 항원 특이적 자극이 아니다. 일부 구현예에서, 자극은 PMA 및 이오노마이신을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포가 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 48시간 동안, 또는 1시간 내지 4시간, 1시간 내지 12시간, 12시간 내지 24시간 사이의 시간 동안, 또는 24시간 넘는 시간 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 재조합 수용체-의존성 활성을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물의 세포가 재조합 수용체에 특이적인 항원 또는 이의 에피토프이거나, 또는 재조합 수용체에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 단편이거나, 또는 이들의 조합인 제제로 자극된다. 구체적인 구현예는 재조합 수용체-의존성 활성, 예를 들어 CAR 의존성 활성이 재조합 수용체를 발현하는 세포에서 일어나는 활성이고 이는 재조합 수용체를 발현하지 않는 세포에서 일어나지 않고/거나 일어날 수 없다는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 재조합 수용체의 활성 또는 존재에 의존하는 활성이다. 재조합 수용체-의존성 활성은 재조합 수용체의 발현 및/또는 존재에 의해 또는 재조합 수용체의 활성 예컨대 수용체 자극의 변화에 의해 직접 또는 간접적으로 영향을 받는 임의의 세포 과정일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 세포 분열, DNA 복제, 전사, 단백질 합성, 막 수송, 단백질 전좌 및/또는 분비 등의 세포 과정을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 또는 면역 세포 기능, 예를 들어 세포 용해 활성일 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 CAR 수용체의 확인, 세포내 신호전달 분자의 인산화, 단백질의 분해, 단백질의 전사, 번역, 전좌 및/또는 단백질, 또는 성장 인자, 사이토카인 등의 인자의 생산 및 분비의 변화에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이고, 제제는 상기 CAR에 특이적인 항원 또는 이의 에피토프이거나, 또는 상기 CAR에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 단편이거나, 또는 이들의 조합이다. 구체적인 구현예에서, 세포는 상기 CAR에 의해 인식되는 항원의 표면 발현과 함께 표적 세포의 존재 하에 세포를 인큐베이션함으로써 자극된다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이고, 제제는 상기 CAR에 결합하는 항체 또는 이의 활성 단편, 변이체 또는 일부이다. 특정 구현예에서, 상기 CAR에 결합하는 항체 또는 이의 활성 단편, 변이체 또는 일부는 항-이디오타입(항-ID) 항체이다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체 특이적 제제는 표면에 상기 항원을 발현하는 세포 예를 들어 표적 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 의존성 활성은 재조합 수용체에 의해 결합되고/되거나 이에 의해 인식되는 (예를 들어, 결합하는) 항원 또는 이의 에피토프에 의해 자극된다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 자극 또는 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리간드)를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 계단식 다단계 반응을 작동시키거나 개시한다. 상기 제제는 TCR 성분 및/또는 공자극 수용체에 특이적인 항체와 같은 항체, 예를 들어, 비드와 같은 고체 지지체에 결합된 항-CD3, 항-CD28 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 PMA 및 이오노마이신이다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성, 예를 들어 CAR 의존성 활성은 인자, 예를 들어 세포 조성물의 자극 이후 양 또는 농도 또는 양 또는 농도의 변화의 측정치이다. 특정 구현예에서, 상기 인자는 단백질, 인산화된 단백질, 절단된 단백질, 전좌된 단백질, 활성 확인 단백질, 폴리뉴클레오타이드, RNA 폴리뉴클레오타이드, mRNA, 및/또는 shRNA일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 측정치는 키나아제 활성, 프로테아제 활성, 포스파타아제 활성, cAMP 생산, ATP 대사, 전좌의 증가 또는 감소, 예를 들어 단백질의 핵 국소화, 전사 활성 증가, 번역 활성 증가, 용해성 인자의 생산 및/또는 분비, 세포 섭취, 유비퀴틴화, 및/또는 단백질 분해를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 상기 인자는 호르몬 등과 같은 분비되는 용해성 인자, 성장 인자, 케모카인 및/또는 사이토카인이다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성, 예를 들어, CAR 의존성 활성은 자극에 대한 반응이다. 특정 구현예에서, 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션되고, 상기 활성은 자극에 대한 반응의 적어도 한 측면이거나 이를 포함한다. 반응은 세포내 신호전달 이벤트, 예컨대 수용체 분자의 활성 증가, 하나 이상의 키나아제의 키나아제 활성 증가, 하나 이상의 유전자의 전사 증가, 하나 이상의 단백질의 단백질 합성 증가, 및/또는 세포내 신호전달 분자, 예를 들어 단백질의 키나아제 활성 증가를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 반응 또는 활성은 면역 활성과 연관되고, 용해성 인자, 예를 들어 사이토카인의 생산 및/또는 분비, 항체 생산의 증가, 및/또는 세포 용해 활성의 증가를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
구체적인 구현예에서, 세포 조성물의 자극에 대한 반응은 자극에 대한 반응, 즉 상기 자극에 의해 개시, 촉발, 지원, 연장 및/또는 유발되는 적어도 하나의 활성을 측정, 검출, 또는 정량화하여 평가된다. 특정 구현예에서, 세포가 자극되고 이 자극에 대한 반응은 재조합 수용체를 발현하는 세포에 특이적인 활성이다. 특정 구현예에서, 상기 활성은 재조합 수용체 특이적 활성이고 상기 활성은 재조합 수용체를 발현하는 세포에서 발행하지만, 상기 수용체를 발현하지 않는 세포에서는 발생하지 않거나 최소한으로만 발생한다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 CAR 의존성 활성이다.
세포(예를 들어, 면역 세포 또는 T 세포)를 자극하기 위해 사용되는 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 자극되고 활성은 용해성 인자, 예를 들어 사이토카인 또는 케모카인이 생산 또는 분비되는지 아닌지로 알아낸이다.
일부 구현예에서, 상기 활성은 재조합 수용체를 발현하는 세포에 특이적이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포에 특이적인 활성은 재조합 수용체의 발현이 결여된 세포에서 발생하지 않는다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이고, 활성은 CAR 의존성 활성이다. 구체적인 구현예에서, 상기 활성은 재조합 수용체를 발현하는 세포에 상기 활성이 존재하는 동일한 조건에서 재조합 수용체의 발현이 결여된 세포에는 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 CAR 의존성 활성은 동일한 조건에서 CAR- 세포에 있는 CAR 의존성 활성보다 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60% 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 약 99% 미만이다.
일부 구현예에서, 상기 활성은 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포에 특이적이고, 상기 활성은 제제를 통한 자극에 의해 또는 재조합 수용체를 발현하는 세포에 특이적인 자극 조건에서 생산된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이고, CAR 특이적 자극은 CAR+ 세포에서 활성을 자극, 촉발, 개시 및/또는 연장하지만, CAR- 세포에서 상기 활성을 자극, 촉발, 개시 및/또는 연장하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 CAR 의존성 활성은 CAR 특이적 자극에 의한 자극 이후 CAR+ 세포에서보다 CAR- 세포에서 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60% 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 약 99% 미만이다.
일부 구현예에서, 상기 활성은 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포를 함유한 세포 조성물에서 측정되고, 측정치는 하나 이상의 대조군과 비교된다. 특정 구현예에서, 대조군은 자극된 세포의 조성물과 유사하거나 동일한 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 활성은 제제와의 인큐베이션 이후 또는 도중에 세포 조성물에서 측정되고, 그 결과로 얻은 측정치는 상기 제제와 인큐베이션되지 않은 유사한 또는 동일한 세포 조성물의 대조군 활성 측정치와 비교된다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 재조합 수용체-의존성 활성이고, 세포 조성물과 대조군 세포 조성물 모두 재조합 수용체를 발현하는 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 재조합 수용체-의존성 활성이고, 대조군은 재조합 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, CAR+ 세포)를 함유하지 않은 유사한 세포 조성물에서 취한다. 따라서 일부 구현예에서, 재조합 수용체 발현 세포를 함유한 세포 조성물과 재조합 수용체 발현 세포를 함유하지 않은 대조군 세포 조성물을 재조합 수용체 발현 특이적 제제와 접촉시킨다. 특정 구현예에서, 대조군은 재조합 수용체를 발현하는 동일한 세포 조성물에서 자극 전에 취한 측정치이다. 특정 구현예에서, 백그라운드 신호를 결정하기 위해 대조군 측정치를 획득하고, 상기 활성의 측정치에서 대조군 측정치를 뺀다. 일부 구현예에서, 세포 조성물에서 활성의 측정치를 대조군 측정치로 나누어 대조군 수준에 대한 활성의 비인 값을 얻는다.
구체적인 구현예에서, 상기 활성은 용해성 인자의 생산 및/또는 분비이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 용해성 인자(soluble factor)의 생산 및/또는 분비이거나 이를 포함하는 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 의존성 활성이다. 특정 구현예에서, 용해성 인자는 사이토카인 또는 케모카인이다.
구체적인 구현예에서, 용해성 인자의 측정치는 ELISA(효소결합면역흡착분석)에 의해 측정된다. ELISA는 펩타이드, 사이토카인, 항체 및 호르몬과 같은 물질을 검출하고 정량화하기 위해 설계된 플레이트 기반 분석 기술이다. ELISA에서, 용해성 인자는 고체 표면에 고정된 다음 효소에 연결된 항체와 복합체를 형성해야 한다. 검출은 검출 가능한 신호를 생성하기 위해 기질과의 인큐베이션을 통해 접합된 효소 활성을 평가함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, CAR 의존성 활성은 ELISA 분석으로 측정된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 용해성 인자의 분비 또는 생산이다. 특정 구현예에서, 생산 또는 분비는 재조합 수용체 발현 세포(예를 들어, CAR 발현 세포)를 함유한 세포 조성물에서 재조합 수용체 특이적 제제(예를 들어, CAR+ 특이적 제제)에 의해 자극된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 특이적 제제는 재조합 수용체에 특이적인 항원 또는 이의 에피토프; 상기 항원을 발현하는 세포(예를 들어, 표적 세포); 또는 재조합 수용체에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 부분 또는 변이체; 또는 이들의 조합이다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체 특이적 제제는 재조합 수용체에 의해 결합되거나 인식되는 항원 또는 이의 에피토프를 포함하는 재조합 단백질이다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체 의존성 용해성 인자 생산 및/또는 분비는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포를 함유한 세포 조성물을 재조합 수용체 특이적 제제(예를 들어, CAR+ 특이적 제제)와 함께 인큐베이션하여 측정한다. 특정 구현예에서, 용해성 인자는 사이토카인 또는 케모카인이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 발현 세포를 함유한 세포 조성물의 세포는 일정 시간량 동안 재조합 수용체 특이적 제제의 존재 하에 인큐베이션되고, 인큐베이션 동안 하나 이상의 시점에서 용해성 인자의 생산 및/또는 분비가 측정된다. 일부 구현예에서, 세포가 CAR 특이적 제제와 함께 최대 또는 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 48시간 동안, 또는 1시간 내지 4시간, 1시간 내지 12시간, 12시간 내지 24시간 사이의 시간 동안(각 수치 포함), 또는 24시간 넘는 시간 동안 인큐베이션되고, 용해성 인자(예를 들어, 사이토카인)의 양이 검출된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 특이적 제제는 재조합 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 표적 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이고, 세포 조성물의 세포는 표적 세포와 함께 세포 조성물의 총 세포, CAR+ 세포, CAR+/CD8+ 세포, 또는 아넥신-/CAR+/CD8+ 세포 대 표적 세포의 비가 약 10:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 또는 약 1:10에서, 또는 전술한 임의 수치 사이의 범위에서, 예컨대 10:1 내지 1:1, 3:1 내지 1:3, 또는 1:1 내지 1:10(각 수치 포함) 사이에서, 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성(예를 들어, CAR+ 특이적 활성)의 측정치는 인큐베이션 도중의 한 시점 또는 종료 시의 T 세포 조성물 내 용해성 인자의 양 또는 농도, 또는 상대적 양 또는 농도이다. 구체적인 구현예에서, 상기 측정치에서 대조군 측정치를 빼거나 상기 측정치를 대조군 측정치로 정규화한다. 일부 구현예에서, 대조군 측정치는 동일한 세포 조성물에서 인큐베이션 전에 취한 측정치이다. 구체적인 구현예에서, 대조군 측정치는 재조합 수용체 특이적 자극 제제와 인큐베이션되지 않은 동일한 대조군 세포 조성물에서 취한 측정치이다. 특정 구현예에서, 대조군은 재조합 수용체 양성 세포를 함유하지 않은 세포 조성물에서 재조합 수용체 특이적 제제와의 인큐베이션 중에 동일한 시점에 취한 측정치이다.
일부 구현예에서, 측정치는 대조군과 비교하여 양 또는 농도의 정규화된 비(ratio)이다. 구체적인 구현예에서, 측정치는 시간량당, 예를 들어 분당 또는 시간당 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 일부 구현예에서, 측정치는 세포당 또는 세포의 세트 또는 기준 수당, 예를 들어, 100개 세포당, 103개 세포당, 104개 세포당, 105개 세포당, 106 세포당, 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 특정 구현예에서, 측정치는 시간량당, 세포당 또는 세포의 기준 수당 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 일부 구현예에서, 측정치는 세포 조성물의 재조합 수용체, CAR+ 세포, CAR+/CD8+ 세포, 아넥신-/CAR+/CD8+ 세포, 3CAS-/CAR+/CD8+ 세포, CAR+/CD4+ 세포, 아넥신-/CAR+/CD4+ 세포, 또는 3CAS-/CAR+/CD4+ 세포를 발현하는, 세포당 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 특정 구현예에서, 측정치는 세포 조성물의 재조합 수용체, CAR+ 세포, CAR+/CD8+ 세포, 아넥신-/CAR+/CD8+ 세포, 3CAS-/CAR+/CD8+ 세포, CAR+/CD4+ cell, 아넥신-/CAR+/CD4+ 세포, 또는 3CAS-/CAR+/CD4+ 세포를 발현하는 세포당 시간량당(예를 들어, 분당 또는 시간당) 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 일부 구현예에서, 측정치는 재조합 수용체 또는 CAR+ 특이적 제제의 양 또는 농도당 시간량당 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 일부 구현예에서, 측정치는 CAR+ 특이적 제제의 양 또는 농도당 세포당 또는 세포의 세트 또는 기준 수당 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 특정 구현예에서, 측정치는 시간량당, 재조합 수용체 또는 CAR+ 특이적 제제의 양 또는 농도당, 세포당 또는 세포의 기준 수당 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 일부 구현예에서, 측정치는 세포 조성물의 재조합 수용체, CAR+ 세포, CAR+/CD8+ 세포, 아넥신-/CAR+/CD8+ 세포, 3CAS-/CAR+/CD8+ 세포, CAR+/CD4+ cell, 아넥신-/CAR+/CD4+ 세포, 또는 3CAS-/CAR+/CD4+ 세포를 발현하는 세포당, 재조합 수용체 또는 CAR+ 특이적 제제의 양 또는 농도당 용해성 인자의 양 또는 농도이다. 특정 구현예에서, 측정치는 시간량당, 재조합 수용체 또는 CAR+ 특이적 제제의 양 또는 농도당, 세포 조성물의 CAR+ 세포, CAR+/CD8+ 세포, 아넥신-/CAR+/CD8+ 세포, 3CAS-/CAR+/CD8+ 세포, CAR+/CD4+ 세포, 아넥신-/CAR+/CD4+ 세포, 또는 3CAS-/CAR+/CD4+ 세포의 양당 용해성 인자의 양 또는 농도이다.
구체적인 구현예에서, 재조합 수용체 또는 CAR 의존성 활성은 둘 이상의 용해성 인자의 생산 또는 분비이다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체 또는 CAR 의존성 활성은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 이상의 용해성 인자의 생산 또는 분비이다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 이상의 용해성 인자의 측정치는 산술 평균 또는 기하 평균으로 결합된다. 특정 측정치에서, 재조합 수용체 활성의 측정치는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 이상의 용해성 인자의 합성물의 분비이다.
특정 구현예에서, 용해성 인자는 사이토카인이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 하나 이상의 자극에 대한 반응으로 사이토카인의 생산 또는 분비이거나 이를 포함한다. 사이토카인은 세포 의사소통에서 광범위하게 기능하는 작은 신호전달 분자의 큰 그룹이다. 사이토카인은 인터루킨, 케모카인 및 인터페론을 포함하는 다양한 면역 조절 분자와 가장 자주 연관된다. 또는 사이토카인은 4개의 패밀리, 즉, IL-2 서브패밀리, 및 IFN 서브패밀리; IL-1 패밀리, IL-17 패밀리, IL-10 패밀리, 및 형질전환 성장 인자 베타 패밀리의 멤버들을 포함하는 시스테인 매듭 사이토카인을 포함하는 4개의 알파 나선 패밀리로 분류되는 그 구조를 특징으로 할 수 있다. 사이토카인의 생산 및/또는 분비는 면역 반응에 기여하고, 항바이러스 단백질의 유도 및 T 세포 증식의 유도를 포함한 상이한 과정들에 관여한다. 사이토카인은 미리 형성된 인자가 아니지만 세포 활성화에 반응하여 빠르게 생산되고 분비된다. 사이토카인의 생산 또는 분비는 당업계에 알려진 임의의 적합한 기술에 의해 측정, 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 인터루킨, 인터페론, 및 케모카인을 포함한 하나 이상의 용해성 인자의 생산 또는 분비이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 IL-2 패밀리 멤버, IFN 서브패밀리 멤버, IL-1 패밀리 멤버; IL-10 멤버, IL-17 패밀리 멤버, 시스테인-매듭 사이토카인, 및/또는 형질전환 성장 인자 베타 패밀리의 멤버 중 하나 이상의 생산 또는 분비이다.
특정 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 사이토카인의 생산이다. 일부 구현예에서, 동일한 세포로부터 둘 이상의 사이토카인의 생산은 그러한 세포의 다기능적 특징을 나타낼 수 있다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 생산은 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정, 검출 및/또는 정량화된다. 유세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 염색(ICS)은 단일 세포 수준에서 사이토카인 생산을 연구하는 데 적합한 기술이다. 이 기술은 세포 자극 후에 소포체 내 사이토카인의 생산 및 축적을 검출하여, 특정 사이토카인의 생산에 대해 양성 또는 음성인 세포 집단의 식별을 가능하게 하거나 임계값을 기준으로 고 생산 및 저 생산 세포의 분리를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 전술한 바와 같이, 자극은 비특이적 자극을 이용하여 수행될 수 있고, 예를 들어 항원 특이적 자극이 아니다. 예를 들어, PMA/이오노마이신이 비특이적 세포 자극에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 자극은 재조합 수용체(예를 들어, CAR)에 특이적인 항원 또는 이의 에피토프이거나, 또는 재조합 수용체에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 단편이거나, 또는 이들의 조합인 제제에 의해 수행될 수 있다. ICS는 또한 세포 표면 표지자를 사용하는 면역 표현형 검사를 위해 다른 유세포 분석 프로토콜과 함께 사용하거나 특정 세포 하위 그룹에서 사이토카인 생산에 접근하기 위해 MHC 다량체와 함께 사용할 수 있어, 매우 유연한 다용도의 방법이다. 사이토카인 생산을 측정 또는 검출하기 위한 다른 단일 세포 기술에는 ELISPOT, 한계 희석, 및 T 세포 클로닝이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 표현형은 예컨대 재조합 수용체에 특이적인 및/또는 이에 의해 인식되는 항원으로 재조합 수용체의 자극 이후, 사이토카인의 생산이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 예컨대 재조합 수용체에 특이적인 및/또는 이에 의해 인식되는 항원으로 재조합 수용체의 자극 이후, 사이토카인의 생산의 결여이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 사이토카인의 생산에 대해 양성이거나 고수준의 사이토카인의 생산이다. 특정 구현예에서, 표현형은 사이토카인에 대해 음성이거나 저수준의 사이토카인의 생산이다. 사이토카인은 인터루킨-1(IL-1), IL-1β, IL-2, sIL-2Ra, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-27, IL-33, IL-35, TNF, 종양 괴사 인자 알파(TNFA), CXCL2, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL24, PGD2, LTB4, 인터페론 감마(IFNG), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GMCSF), 대식세포 염증성 단백질 MIP1α, MIP1β, Flt-3L, 프렉탈카인, 및/또는 IL-5를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 표현형은 사이토카인, 예를 들어 특정 세포 유형과 연관된 사이토카인, 예컨대 Th1, Th2, Th17 및/또는 Treg 아형과 연관된 사이토카인의 생산을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 Th1-관련 사이토카인은 IL-2, IFN-γ, 및 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)를 포함하고, 일부 경우에 세포 면역 반응에 관여한다. 일부 구현예에서, 예시적인 Th2-관련 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 포함하고, 일부 경우에 체액 면역 및 항염증 특성들과 연관된다. 일부 구현예에서, 예시적인 Th17-관련 사이토카인은 IL-17A 및 IL-17F를 포함하고, 일부 경우에 예를 들어 염증성 반응 동안 호중구와 대식세포를 보급하는 데 관여한다.
구체적인 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 IL-1, IL-1β, IL-2, sIL-2Ra, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-27, IL-33, IL-35, TNF, TNF 알파, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL24, PGD2, LTB4, 인터페론 감마(IFN-γ), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 염증성 단백질(MIP)-1a, MIP-1b, Flt-3L, 프렉탈카인, 및/또는 IL-5 중 하나 이상의 생산 및/또는 분비이다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 Th17 사이토카인의 생산 또는 분비이다. 일부 구현예에서, Th17 사이토카인은 GMCSF이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 Th2 사이토카인의 생산 또는 분비를 포함하고, 여기서 Th2 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-10, 또는 IL-13이다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 전염증성 사이토카인의 생산 또는 분비이다. 전염증성 사이토카인은 염증 반응을 개시하는 데 역할을 하고 선천성 면역 반응을 매개하는 병원체에 대한 숙주 방어를 조절하는 역할을 한다. 전염증성 사이토카인은 인터루킨(IL), 인터루킨-1-베타(IL-1), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-13(IL-13) ), 종양 괴사 인자(TNF), CXC-케모카인 리간드 2(CXCL2), CC-케모카인 리간드 2(CCL2), CC-케모카인 리간드 3(CCL3), CC-케모카인 리간드 5(CCL5), CC-케모카인 리간드 17(CCL17), CC-케모카인 리간드 24(CCL24), 프로스타글란딘 D2(PGD2) 및 류코트리엔 B4(LTB4) 및 IL-33을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, CAR 의존성 활성은 인터루킨 및/또는 TNF 패밀리 멤버의 생산 및/또는 분비이다. 구체적인 구현예에서, CAR 의존성 활성은 IL-1, IL-6, IL-8, 및 IL-18, TNF-알파 또는 이들의 조합의 생산 및/또는 분비이다.
구체적인 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 IL-2, IFN-감마, TNF-알파 또는 이들의 조합의 분비이다.
일부 구현예에서, 표현형(예를 들어, 재조합 수용체-의존성 활성)은 사이토카인의 생산이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 둘 이상의 사이토카인(예를 들어, 다기능성)의 생산이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 하나 이상의 사이토카인의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 IL-2, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, IFNG, 또는 TNFA 중 하나 이상의 생산 또는 이의 결여이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 IL-2, IL-13, IFNG, 또는 TNFA 중 하나 이상의 생산 또는 이의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 활성은 사이토카인의 생산의 존재 및/또는 고수준 생산의 존재이다. 일부 구현예에서, 표현형은 사이토카인의 낮은 생산, 생산 감소 또는 생산 부재이다.
일부 구현예에서, 표현형은 예를 들어 분비가 방지되거나 억제될 때 자극제의 존재 하에 또는 자극 조건에서 평가할 때, 사이토카인의 내부(세포내) 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극제는 비특이적 자극제, 예를 들어 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 상에서 항원 결합 도메인에 결합하지 않는 자극제이다. 일부 구현예에서, 자극제는 PMA/이오노마이신이고, 이는 비특이적 자극제로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 특이적 자극제, 예를 들어, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)에 특이적인 항원 또는 이의 에피토프이거나, 또는 재조합 수용체에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 단편이거나, 또는 이들의 조합인 자극제이다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 사이토카인의 내부 생산의 결여 또는 부재이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 ICS 분석으로 평가할 때 둘 이상의 사이토카인의 생산 시 하나 이상의 사이토카인의 내부 양이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 ICS 분석으로 평가할 때 IL-2, IL-5, IL-13, IFNG, 또는 TNFA 중 하나 이상의 내부 양이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 ICS 분석으로 평가할 때 하나 이상의 사이토카인의 낮은 내부 양 또는 검출 가능한 양의 결여이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 ICS 분석으로 평가할 때 IL-2, IL-5, IL-13, IFNG, 또는 TNFA의 낮은 내부 양 또는 검출 가능한 양의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 예를 들어 다중 분석 또는 다기능성을 평가하기 위한 분석에 의한, 다중 사이토카인의 평가를 포함한다(예를 들어, 문헌[Xue et 등, (2017) Journal for ImmunoTherapy of Cancer 5:85] 참조). 일부 구현예에서, 사이토카인 발현의 결여는 세포의 활성 및/또는 기능 및/또는 반응의 지속성 및 무진행 생존과 역의 상관관계 또는 역의 관계가 있다. 일부 구현예에서, 임의의 알려진 방법 또는 본원에 기술된 방법에 따라 평가된, 사이토카인 생산이 감소한, 최소인 또는 없는 세포는 세포 조성물(예를 들어, 산출 조성물, 치료용 세포 조성물)에서 감소한다.
구체적인 구현예는 표현형이 사이토카인의 생산 또는 사이토카인의 생산의 결여 또는 낮은 양의 생산을 포함할 수 있음을 고려한다. 이것은 사이토카인의 정체성, 사이토카인을 검출하기 위해 수행되는 분석, 및 분석에 사용되는 자극제 또는 조건을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 몇 가지 인자에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표현형은 ICS에 의해 표현될 때 IL-13 생산의 결여 또는 낮은 수준이거나 이를 포함하고 한편 일부 구현예에서, 표현형은 ICS에 의해 표현될 때 IFN-감마의 생산이거나 이를 포함한다는 것이 고려된다.
일부 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 사이토카인의 생산 및 CD3+, CD4+, CD8+, CD3+/CAR+, CD4+/CAR+, CD8+/CAR+, 아넥신 V-, 아넥신 V- CD3+, 아넥신 V-CD4+, 아넥신 V- CD8+, 아넥신 V-CD3+/CAR+, 아넥신 V- CD4+/CAR+, 아넥신 V- CD8+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-, 활성화된 카스파제 3-/CD3+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+, 활성화된 카스파제 3-/CD3+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+, 또는 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CAR+ 또는 이들의 조합의 생산이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+에서 하나 이상의 사이토카인의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IFN-감마, 및/또는 TNF-알파이다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD4+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 IFN-감마의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD8+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD8+/CAR+ 세포에서 IFN-감마 및 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 IFN-감마의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CAR+ 세포에서 IFN-감마 및 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CD4+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 IFN-감마의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CD8+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 아넥신 V-/CD8+/CAR+ 세포에서 IFN-감마 및 TNF-알파의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 단락에 기술된 표현형들은 지속적인 반응 및 무진행 생존과 양의 상관관계가 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이러한 표현형들을 포함한 세포는 세포 조성물(예를 들어, 산출 조성물, 치료용 세포 조성물)에서 최대화되거나 증가된다.
일부 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 사이토카인의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 하나 이상의 사이토카인의 생산의 결여 및 CD3+, CD4+, CD8+, CD3+/CAR+, CD4+/CAR+, CD8+/CAR+, 아넥신 V-, 아넥신 V- CD3+, 아넥신 V-CD4+, 아넥신 V- CD8+, 아넥신 V-CD3+/CAR+, 아넥신 V- CD4+/CAR+, 아넥신 V- CD8+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-, 활성화된 카스파제 3-/CD3+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+, 활성화된 카스파제 3-/CD8+, 활성화된 카스파제 3-/CD3+/CAR+, 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+, 또는 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CAR+ 또는 이들의 조합의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IFN-감마, 및/또는 TNF-알파이다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 TNF-알파의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD4+/CAR+ 세포에서 IL-2 및 IFN-감마의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CAR+ 세포에서 TNF-알파의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 활성화된 카스파제 3-/CD8+/CAR+ 세포에서 INF-감마 및 TNF-알파의 생산의 결여이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 단락에 기술된 표현형들은 지속적인 반응 및 무진행 생존과 음의 상관관계가 있다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 ICS 분석으로 평가할 때 IL-2, IL-13, IFN-감마, 또는 TNF-알파 중 하나 이상, 및 특정 세포 유형의 세포 또는 세포의 서브세트에 대한 하나 이상의 특정 표지자의 존재 또는 부재이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 IL-2, IL-13, IFN-감마, 또는 TNF-알파 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+ 중 하나 이상의 생산 또는 이의 결여이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 IL-2 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 IL-2 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산의 결여 또는 낮은 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 IL-13 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 IL-13 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 IL-13 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산의 결여 또는 낮은 생산이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 IFN-감마 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 TNF-알파 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 TNF-알파 및 CD4+/CAR+ 및/또는 CD8+/CAR+의 생산의 결여 또는 낮은 생산이거나 이를 포함한다.
상기 표현형들 중 하나 이상은 단독으로 또는 조합하여 제공된 방법에 따라 평가 또는 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD3+, CD3+/CAR+, CD4+/CAR+, CD8+/CAR+, 또는 이들의 조합이다.
특정 구현예에서, 표현형은 CD3+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD3+/CAR+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 CD8+/CAR+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 CD4+/CAR+이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신-/CD3+/CAR+이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 아넥신-/CD4+/CAR+이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 아넥신-/CD8+/CAR이다.
구체적인 구현예에서, 표현형은 세포내 IL-2 및 CD4+/CAR+의 결여 또는 낮은 양이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 세포내 IL-13 및 CD4+/CAR+의 결여 또는 낮은 양이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 IL-13 및 CD8+/CAR+의 세포내 발현의 결여 또는 낮은 양이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 표현형은 세포내 TNF-알파 및 CD4+/CAR+의 결여 또는 낮은 양이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 표현형은 CD8+/CAR+이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 표현형은 아넥신-/CD8+/CAR+이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표현형은, 선택적으로 항원 또는 재조합 수용체에 비특이적이고/거나 다클론성으로 생산되는, 하나의 사이토카인 또는 사이토카인들의 조합의 생산의 지표를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IL-13, IL-17, IFN-감마 또는 TNF-알파이다. 일부 구현예에서, 생산의 지표는 T 세포 조성물의 샘플을 다클론 제제, 항원 특이적 제제 또는 재조합 수용체(선택적으로 CAR)에 결합하는 제제와 인큐베이션하는 것을 포함하는 분석에서, 선택적으로 세포내 사이토카인 염색 분석에서 측정된다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 PMA 및 이오노마이신이거나 이를 포함하거나 또는 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체 복합체 작용제이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 나이브 표현형 또는 기억 표현형을 포함하고, 선택적으로 여기서 기억 표현형은 T 효과기 기억 표현형, T 중심 기억 표현형, 또는 CD45RA 발현 T 효과기 기억 표현형(Temra)을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성(예를 들어, CAR) 활성은 전염증성 사이토카인, 선택적으로 TNF-알파, IFN-감마, 및 IL-2 중 하나 또는 이들의 조합의 생산 또는 축적의 척도이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성(예를 들어, CAR) 활성은 TNF-알파, IFN-감마, 및 IL-2, 및 IL-17의 조합의 생산 또는 축적의 척도이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성(예를 들어, CAR) 활성은 IFN-감마, 및 IL-2의 생산 또는 축적의 척도이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성(예를 들어, CAR) 활성은 IFN-감마, TNFA, 및 IL-2의 생산 또는 축적의 척도이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성(예를 들어, CAR) 활성은 IFN-감마 및 TNFA의 생산 또는 축적의 척도이다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 활성은 재조합 수용체-특이적 사멸(예를 들어, 세포 용해 거동)이다. 일부 구현예에서, 조작된 CD8+ 세포의 세포 용해 활성이 평가된다(예를 들어, 정량화된다). 일부 구현예에서, 재조합 수용체-의존성 세포 용해 활성이 재조합 수용체를 발현하는 세포, 또는 재조합 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 세포 조성물을 재조합 수용체에 의해 결합되고/거나 인식되는 항원 및/또는 에피토프를 발현하는 표적 세포와 노출, 인큐베이션 및/또는 접촉하여 평가된다. 세포 용해 활성은 시간 경과에 따른 표적 세포 수를 직접 또는 간접적으로 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 재조합 수용체 발현 세포와 인큐베이션하기 전에 검출 가능한 표지자, 예컨대 검출 가능하고 표적 세포가 용해되는 표지자와, 또는 생존 표적 세포에서 검출 가능한 검출 가능 표지자와 인큐베이션될 수 있다. 이러한 판독값들은 표적 세포 수 및/또는 표적 세포 사멸의 직간접적인 정보를 제공하며 분석 중 상이한 시점들에 측정할 수 있다. 표적 세포 수의 감소 및/또는 표적 세포 사멸의 증가는 세포의 세포 용해 활성을 나타낸다. 세포 용해 분석을 수행하기 위한 적합한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 크롬-51 방출 분석, 비방사성 크롬 분석, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE), PKH-2 및 PKH-26과 같은 형광 염료를 사용하는 유세포 분석을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일부 경우에, 세포 용해 활성은 본원에서 또한 세포 용해로도 지칭된다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 함유한 세포 조성물을 재조합 수용체에 의해 결합되거나 인식되는 항원 또는 이의 에피토프를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션하여 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 의존성 세포 용해 활성이 측정된다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다.
일부 구현예에서, 상기 활성의 측정치가 대조군과 비교된다. 특정 구현예에서, 상기 대조군은 세포 조성물과 인큐베이션되지 않은 표적 세포의 배양물이다. 일부 구현예에서, 상기 대조군은 동일한 비로 표적 세포와 인큐베이션된 CAR+ 세포를 함유하지 않은 대조군 세포 조성물의 측정치이다.
특정 구현예에서, 세포 용해 활성 분석의 측정치는 인큐베이션 동안 한 시점에 또는 종료 시에 생존한 표적 세포의 수이다. 특정 구현예에서, 상기 측정치는 인큐베이션 동안 방출되는 표적 세포 사멸 표지자(예를 들어, 크롬 51)의 양이다. 일부 구현예에서, 상기 측정치는 단독으로 인큐베이션된 대조군의 표적 세포의 양에서 주어진 시점에 공동 인큐베이션에서 표적 세포의 양을 빼서 알아낸 표적 세포 사멸의 양이다. 일부 구현예에서, 상기 측정치는 표적 세포의 시작 양과 비교하여 한 시점에 남아 있는 표적 세포의 백분율이다. 구체적인 구현예에서, 상기 측정치는 일정 시간량 동안 사멸된 세포의 양이다. 특정 구현예에서, 상기 측정치는 세포 조성물의 각 세포당 사멸된 세포의 양이다. 일부 구현예에서, 상기 측정치는 세포당 사멸된 세포의 양, 또는 설정된 수 또는 기준 세포당 사멸된 세포의 양이고, 예를 들어 (그러나 이에 한정되지 않음) 조성물의 100개 세포당, 103개 세포당, 104개 세포당, 105개 세포당, 106개 세포당, 107개 세포당, 108개 세포당, 109개 세포당, 또는 1010개 세포당 사멸된 표적 세포의 양이다. 구체적인 구현예에서, 상기 측정치는 세포 조성물의 각 CAR+ 세포, CAR+/CD8+ 세포, 또는 아넥신-/CAR+/CD8+ 세포당, 또는 이의 기준 또는 설정된 수당 사멸된 세포의 양이다. 특정 구현예에서, 상기 측정치는 세포 조성물의 세포당 일정 시간량 동안 사멸된 세포의 양이다. 구체적인 구현예에서, 상기 측정치는 세포 조성물의 CAR+ 세포, CAR+/CD8+ 세포, 또는 아넥신-/CAR+/CD8+ 세포당 일정 시간량 동안 사멸된 세포의 양이다.
일부 구현예에서, 세포 표현형은 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 암호화하는 전이유전자 서열과 같은 전이유전자 서열의 게놈 통합을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표현형은 세포의 염색체 DNA 또는 게놈 DNA에 통합된 전이유전자 서열의 복제수인 통합 복제수(예를 들어, 벡터 복제수)이다. 일부 구현예에서, 벡터 복제수는 평균 복제수로 표현될 수 있다. 일부 측면에서, 특정 통합된 전이유전자의 벡터 복제수는 세포당 (전이유전자 서열을 함유하는) 구성 부분의 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 특정 통합된 전이유전자의 벡터 복제수는 2배체 게놈당 (전이유전자 서열을 함유하는) 구성 부분의 수를 포함한다. 일부 측면에서, 전이유전자 서열의 벡터 복제수는 세포당 통합된 전이유전자 서열의 수로 표현된다. 일부 측면에서, 전이유전자 서열의 벡터 복제수는 2배체 게놈당 통합된 전이유전자 서열의 수로 표현된다. 일부 구현예에서, 복제수는 세포의 집단 중에서 2배체 게놈당 또는 세포당 평균 복제수이다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 치료용 세포 조성물의 세포의 클론성이다. 일부 구현예에서, T 세포들의 집단의 클론성을 평가하는 것은 T 세포들의 집단의 클론 다양성의 평가이다. 일부 구현예에서, T 세포는 다클론성 또는 다중클론성이다. 상기 T 세포들의 치료용 세포 조성물의 다클론성과 같은 클론성은 주어진 항원에 대한 상기 집단의 반응의 폭의 척도이다. 일부 측면에서, 치료용 세포 조성물은 항원 특이적 세포에 의해 인식되는 상이한 에피토프의 수를 측정함으로써 평가할 수 있다. 이는 시험관내에서 항원 특이적 T 세포를 생성 및 클로닝하기 위한 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 나이브-유사 T 세포들의 집단에서 우세한 단일 클론형 집단이 없는 다클론(또는 다중클론)이다.
T 세포들의 집단의 예컨대 치료용 세포 조성물의 맥락에서, 일부 측면에서, 다클론성의 시그니처는 다중 및 광범위한 항원 특이성을 갖는 T 세포들의 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 다클론성은 TCR 레퍼토리에서 높은 다양성을 나타내는 T 세포들의 집단에 관한 것이다. 일부 경우에, TCR 레퍼토리의 다양성은, 일부 측면에서, 자가 및 외래 항원에 대한 선택 사건에 의해 촉발되는 V(D)J 재조합 사건으로 인한 것이다. 일부 구현예에서, 다양하거나 다클론성인 T 세포들의 집단은 분석이 집단에 복수의 다양한 또는 상이한 TCR 전사물 또는 산물의 존재를 나타내는 T 세포들의 집단이다. 일부 구현예에서, 높은 또는 상대적으로 높은 클론성을 나타내는 T 세포들의 집단은 TCR 레퍼토리가 덜 다양한 T 세포들의 집단이다. 일부 구현예에서, 분석이 T 세포들의 집단에 여러 예컨대 둘 또는 셋의 TCR 전사물 또는 산물의 존재를 나타내면 T 세포들은 올리고클론성이다. 일부 구현예에서, 단클론성은 다양성이 낮은 T 세포들의 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 분석이 T 세포들의 집단에 단일 TCR 전사물 또는 산물의 존재를 나타내면 T 세포들은 단클론성이다.
T 세포와 같은 치료용 세포 조성물 내 세포의 클론성은 일부 예에서 차세대 염기서열분석과 같은 클론 염기서열분석, 또는 분광 형태 분석에 의해 알아낸이다. 일부 측면에서, 차세대 염기서열분석 방법은 T 세포로부터의 게놈 DNA 또는 cDNA를 사용하여 상보성-결정 영역 3(CDR3)을 암호화하는 서열을 포함한 TCR 레퍼토리를 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-seq에 의한 전체 전사체 염기서열분석이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일-세포 염기서열분석 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다클론성과 같은 클론성은 분광 형태 분석(TCR Vβ, Vα, Vγ, 또는 Vδ 사슬 초가변 영역 레퍼토리의 척도)에 의해 평가 또는 결정될 수 있다. 분광 형태 분석은 서열이 아닌 특정 크기의 재배열된 가변 유전자를 구별한다. 따라서, 단일 피크는 4개의 잠재적 뉴클레오타이드(아데닌(a), 구아닌(g), 시토신(c), 또는 티민(t)) 중 어느 하나 또는 접합 영역에서 4개의 뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 제한된 수의 재배열된 TCR 가변 유전자(Vβ, Vα, Vγ, 또는 Vδ) 중 어느 하나를 발현하는 T 세포들의 집단을 나타낼 수 있는 것으로 이해된다. T 세포들의 집단은 주어진 TCR Vβ, Vα, Vγ 또는 Vδ 패밀리에 대한 Vβ 분광 형태 프로파일이 다수의 피크, 전형적으로 5개 이상의 우세한 피크 및 대부분의 경우 가우시안 분포를 갖는 경우 다클론성으로 간주된다. 다클론성은 또한 관심 항원에 대한 항원 특이적 클론의 생성 및 특성화에 의해 정의될 수 있다. T 세포들의 집단의 예컨대 치료용 세포 조성물의 맥락에서, 단클론성은 분광 형태 분석(TCR Vβ, Vα, Vγ, 또는 Vδ 사슬 초가변 영역 레퍼토리의 척도)에 의해 정의할 때 단일 특이성을 갖는 T 세포들의 집단을 지칭한다. T 세포들의 집단은 주어진 TCR Vβ, Vα, Vγ, 및/또는 Vδ 패밀리에 대한 Vβ, Vα, Vγ, 및/또는 Vδ 분광 형태 프로파일이 단일 우세 피크를 가질 때 단클론성(또는 단일-특이성)으로 간주된다.
일부 구현예에서, 클론성을 평가하는 방법은 각자 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[국제 공개 번호 WO2012/048341, WO2014/144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 및 WO2012048340]에 기술된 바와 같은 방법들의 다양한 특성들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법들은 세포 예컨대 TCR 내의 관심 표적 폴리뉴클레오타이드에 관한 서열 정보를 획득하는 데 사용될 수 있다. 표적 유전자는 샘플 또는 세포들의 집단의 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 획득할 수 있다. 상기 샘플 또는 세포들의 집단은 면역 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표적 TCR 분자의 경우, TCR의 사슬을 암호화하는 유전자는 면역 세포 또는 T 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 획득할 수 있다. 일부 구현예에서, 출발 물질은 TCR의 사슬을 암호화하는 유전자들로 구성된 T 세포들 유래의 RNA이다.
일부 구현예에서, 샤논 지수는 클론을 필터링하기 위한 임계치로서 클론성에 적용되며(“샤논-조절된 클론성”), 문헌[Chaara 등 (2018) Front Immunol 9:1038]을 참조한다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 치료용 세포 조성물의 CD4+ 세포의 클론성이다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 치료용 세포 조성물의 CD8+ 세포의 클론성이다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 용량이다. 일부 구현예에서, 용량은 CD4+ 및 CD8+ 조작된 세포의 단일 용량이다. 일부 구현예에서, 단일 용량은 CD4+ 조작된 세포 및 CD8+ 조작된 세포를 대상체에 개별적으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 용량은 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 대상체에 개별적으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 용량은 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 대상체에 개별적으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 용량은 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 대상체에 개별적으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 본원에 기술된 표현형 및 재조합 수용체-의존성 활성을 포함하여 하나 이상 또는 모든 치료용 세포 조성물 특성을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-, CAS3-/CCR7-/CD27+, CAS3-/CCR7+, CAS3-/CCR7+/CD27-,CAS3-/CCR7+/CD27+, CAS3-/CD27+, CAS3-/CD28+, CAS3-/CD28+/CD27-, CAS3-/CD28+/CD27+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-, CAS3-/CCR7-/CD45RA+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-, CAS3-/CCR7+/CD45RA+, CAS+/CD3+/CAR+, CD3+/CAR+, CD3+, CAR+, 클론성, EGFRt+, 사이토카인-, IFNG+, IFNg+/IL2, IFNg+/IL17+/TNFa+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+, IFNg+/IL2+/TNFa+, CAR+/IFNg+, IFNg+/TNFa+, CAR+/IL2+, IL2+/TNFa+, 세포 용해, CAR+/TNFa+, 생존 세포 농도, 벡터 복제수(VCN), EGFRt+ 벡터 복제수, 생존력, GMCSF+/CD19+, IFNG+/CD19+, IL10+/CD19+, IL13+/CD19+, IL2+/CD19+, IL4+/CD19+, IL5+/CD19+, IL6+/CD19+, MIP1A+/CD19+, MIP1B+/CD19+, sCD137+/CD19+, TNFa+/CD19+, 용량, 용량 수준, 투여된 생존 세포 백분율, 투여된 총 비생존 세포, 투여된 총 생존 세포, 총 용량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+, CAS3-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+, CAS+/CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CD4+, CAR+/CD4+, CD4+ 세포의 클론성, EGFRt+/CD4+, 사이토카인-/CD4+, IFNG+/CD4+, IFNg+/IL2/CD4+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+, CAR+/IFNg+/CD4+, IFNg+/TNFa+/CD4+, CAR+/IL2+/CD4+, IL2+/TNFa+/CD4+, CD4+에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD4+, CD4+ 세포의 생존 세포 농도, CD4+의 벡터 복제수, CD4+ 세포의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD4+ 세포의 생존력, GMCSF+/CD19+/CD4+, IFNG+/CD19+/CD4+, IL10+/CD19+/CD4+, IL13+/CD19+/CD4+, IL2+/CD19+/CD4+, IL4+/CD19+/CD4+, IL5+/CD19+/CD4+, IL6+/CD19+/CD4+, MIP1A+/CD19+/CD4+, MIP1B+/CD19+/CD4+, sCD137+/CD19+/CD4+, TNFa+/CD19+/CD4+, CD4+ 세포의 용량, CD4+ 세포의 용량 수준, CD4+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD4+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD4+ 세포의 투여된 총 생존 세포, CD4+ 세포의 총 용량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+, CAS3-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+, CAS+/CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CD8+, CAR+/CD8+, CD8+의 클론성, EGFRt+/CD8+, 사이토카인-/CD8+, IFNG+/CD8+, IFNg+/IL2/CD8+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+, CAR+/IFNg+/CD8+, IFNg+/TNFa+/CD8+, CAR+/IL2+/CD8+, IL2+/TNFa+/CD8+, CD8+ 세포에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD8+, CD8+ 세포의 생존 세포 농도, CD8+ 세포의 벡터 복제수, CD8+ 세포의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD8+ 세포의 생존력, GMCSF+/CD19+/CD8+, IFNG+/CD19+/CD8+, IL10+/CD19+/CD8+, IL13+/CD19+/CD8+, IL2+/CD19+/CD8+, IL4+/CD19+/CD8+, IL5+/CD19+/CD8+, IL6+/CD19+/CD8+, MIP1A+/CD19+/CD8+, MIP1B+/CD19+/CD8+, sCD137+/CD19+/CD8+, TNFa+/CD19+/CD8+, CD8+ 세포의 용량, CD8+의 용량 수준, CD8+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD8+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD8+ 세포의 투여된 총 생존 세포, CD8+ 세포의 총 용량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-, CAS3-/CCR7-/CD27+, CAS3-/CCR7+, CAS3-/CCR7+/CD27-,CAS3-/CCR7+/CD27+, CAS3-/CD27+, CAS3-/CD28+, CAS3-/CD28+/CD27-, CAS3-/CD28+/CD27+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-, CAS3-/CCR7-/CD45RA+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-, CAS3-/CCR7+/CD45RA+, CAS+/CD3+/CAR+, CD3+/CAR+, CD3+, CAR+, 클론성, EGFRt+, 사이토카인-, IFNG+, IFNg+/IL2, IFNg+/IL17+/TNFa+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+, IFNg+/IL2+/TNFa+, CAR+/IFNg+, IFNg+/TNFa+, CAR+/IL2+, IL2+/TNFa+, 세포 용해, CAR+/TNFa+, 생존 세포 농도, 벡터 복제수, EGFRt+ 벡터 복제수, 생존력, GMCSF+/, IFNG+/, IL10+/, IL13+/, IL2+/, IL4+/, IL5+/, IL6+/, MIP1A+/, MIP1B+/, sCD137+/, TNFa+/, 용량, 용량 수준, 투여된 생존 세포 백분율, 투여된 총 비생존 세포, 투여된 총 생존 세포, 총 용량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+, CAS3-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+, CAS+/CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CD4+, CAR+/CD4+, CD4+ 세포의 클론성, EGFRt+/CD4+, 사이토카인-/CD4+, IFNG+/CD4+, IFNg+/IL2/CD4+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+, CAR+/IFNg+/CD4+, IFNg+/TNFa+/CD4+, CAR+/IL2+/CD4+, IL2+/TNFa+/CD4+, CD4+에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD4+, CD4+ 세포의 생존 세포 농도, CD4+ 세포의 벡터 복제수, CD4+의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD4+의 생존력, GMCSF+/CD4+, IFNG+/CD4+, IL10+/CD4+, IL13+/CD4+, IL2+/CD4+, IL4+/CD4+, IL5+/CD4+, IL6+/CD4+, MIP1A+/CD4+, MIP1B+/CD4+, sCD137+/CD4+, TNFa+/CD4+, CD4+ 세포의 용량, CD4+ 세포의 용량 수준, CD4+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD4+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD4+ 세포의 투여된 총 생존 세포, 및 CD4+ 세포의 총 용량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+, CAS3-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+, CAS+/CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CD8+, CAR+/CD8+, CD8+ 세포의 클론성, EGFRt+/CD8+, 사이토카인-/CD8+, IFNG+/CD8+, IFNg+/IL2/CD8+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+, CAR+/IFNg+/CD8+, IFNg+/TNFa+/CD8+, CAR+/IL2+/CD8+, IL2+/TNFa+/CD8+, CD8+에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD8+, CD8+ 세포의 생존 세포 농도, CD8+ 세포의 벡터 복제수, CD8+의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD8+의 생존력, GMCSF+/CD8+, IFNG+/CD8+, IL10+/CD8+, IL13+/CD8+, IL2+/CD8+, IL4+/CD8+, IL5+/CD8+, IL6+/CD8+, MIP1A+/CD8+, MIP1B+/CD8+, sCD137+/CD8+, TNFa+/CD8+, CD8+ 세포의 용량, CD8+ 세포의 용량 수준, CD8+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD8+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD8+ 세포의 투여된 총 생존 세포, 및 CD8+ 세포의 총 용량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+, CAS3-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+, CAS+/CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CD8+, CAR+/CD8+, CD8+ 세포의 클론성, EGFRt+/CD8+, 사이토카인-/CD8+, IFNG+/CD8+, IFNg+/IL2/CD8+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+, CAR+/IFNg+/CD8+, IFNg+/TNFa+/CD8+, CAR+/IL2+/CD8+, IL2+/TNFa+/CD8+, CD8+에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD8+, CD8+ 세포의 생존 세포 농도, CD8+ 세포의 벡터 복제수, CD8+의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD8+의 생존력, GMCSF+/CD8+, IFNG+/CD8+, IL10+/CD8+, IL13+/CD8+, IL2+/CD8+, IL4+/CD8+, IL5+/CD8+, IL6+/CD8+, MIP1A+/CD8+, MIP1B+/CD8+, sCD137+/CD8+, TNFa+/CD8+, CD8+ 세포의 용량, CD8+ 세포의 용량 수준, CD8+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD8+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD8+ 세포의 투여된 총 생존 세포, CD8+ 세포의 총 용량, CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+, CAS3-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+, CAS+/CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CD4+, CAR+/CD4+, CD4+ 세포의 클론성, EGFRt+/CD4+, 사이토카인-/CD4+, IFNG+/CD4+, IFNg+/IL2/CD4+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+, CAR+/IFNg+/CD4+, IFNg+/TNFa+/CD4+, CAR+/IL2+/CD4+, IL2+/TNFa+/CD4+, CD4+에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD4+, CD4+ 세포의 생존 세포 농도, CD4+ 세포의 벡터 복제수, CD4+의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD4+의 생존력, GMCSF+/CD4+, IFNG+/CD4+, IL10+/CD4+, IL13+/CD4+, IL2+/CD4+, IL4+/CD4+, IL5+/CD4+, IL6+/CD4+, MIP1A+/CD4+, MIP1B+/CD4+, sCD137+/CD4+, TNFa+/CD4+, CD4+ 세포의 용량, CD4+ 세포의 용량 수준, CD4+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD4+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD4+ 세포의 투여된 총 생존 세포, 및 CD4+ 세포의 총 용량 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성들은 아래 표 E4에 제시된 투입 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함한다.
상기 임의의 구현예의 일부에서, 상기 전술한 바와 같은 표현형을 가진 세포의 백분율, 수, 및/또는 비율이 결정, 측정, 획득, 검출, 관측, 및/또는 식별된다. 특정 구현예에서, 상기 표현형의 세포의 수는 세포 조성물의 표현형의 세포의 총량이다. 일부 구현예에서, 상기 표현형의 세포의 수는 치료용 세포 조성물에 존재하는 표현형의 세포의 빈도, 비, 및/또는 백분율로서 표현될 수 있다. . 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물 특성은 본원에 기술된 표현형 또는 재조합 수용체-의존성 활성을 가진 세포의 빈도, 비, 및/또는 백분율이다.
4. 임상 반응
본원에 제공되는 방법은 치료용 세포 조성물로 치료한 후 대상체에서 임상 반응과 연관된, 본원에 기술된 바와 같은 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성과 같은 특징을 알아내는 데 유용하다. 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 전체 반응률(ORR), 객관적 반응(OR), 무진행 생존(PFS), 지속적인 반응(예를 들어, 반응의 내구성 DOR), 독성 반응, 및/또는 약동학적 반응을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 유형의 임상 반응이 본원에서 고려된다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 완전 반응(CR)이다. 본원에 사용될 때, CR은 질병 또는 병태에 대한 치료에 대한 반응으로 대상체에서 질병 또는 병태의 모든 징후의 소실을 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 CR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 루가노 기준을 사용하여 기술된 바와 같은 완전 반응(CR)이며, 다양한 측정 가능한 부위들에서의 완전 대사 반응 및 완전 방사선 반응을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 부위들은 림프절 및 림프 외 부위를 포함하며, 여기서 CR은 PET-CT가 사용될 경우 5점 척도에서 잔류 질량을 갖거나 갖지 않는 1, 2 또는 3의 점수로 설명된다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 부분 반응(PR)이다. 본원에 사용될 때, PR은 질병 또는 병태에 대한 치료에 대한 반응으로 대상체에서 질병 또는 병태의 정도의 감소를 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 PR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 임상 반응은 루가노 기준을 사용하여 기술된 바와 같은 부분 반응(PR; 일부 경우에 부분 관해로도 알려짐)이고 다양한 측정 가능한 부위에서의 부분 대사 반응 및/또는 방사선 반응을 포함한다. 일부 측면에서, 이 부위들은 림프절 및 림프 외 부위를 포함하며, 여기서 PR은 PET-CT가 사용될 경우 기준선 및 잔류 덩어리(들)의 임의의 크기와 비교하여 섭취가 감소된 4 또는 5의 점수로 설명된다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 무진행 생존(PFS)이다. 본원에 사용될 때, PFS는 환자가 질병을 앓으면서 살아가지만 질병이나 병태가 악화되지 않는 질병 또는 병태의 치료 중 및 치료 후 시간의 길이를 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 치료 계획으로 치료 후, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체의 PFS를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 특정 기간의 PFS를 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 특정 기간은 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 또는 24개월이거나 그보다 길다. 일부 구현예에서, 상기 특정 기간은 3개월 보다 길다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 객관적 반응(OR)이다. 일부 구현예에서, OR은 부분 및 완전 반응률로 이진화된 최상 객관적 반응이다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 OR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 무진행 생존(PFS)이며, 이는 대상체가 질병을 갖고 살지만 악화되지 않는 암과 같은 질병의 치료 중 및 치료 후의 시간의 길이로 설명된다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 객관적 반응(OR)이다. 일부 구현예에서, OR은 부분 및 완전 반응률로 이진화된 최상 객관적 반응이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 객관적 반응률(ORR; 일부 경우에 전체 반응률로도 알려짐)이며, 이는 CR 또는 PR을 달성한 환자의 비율로 설명된다. 일부 측면에서, 임상 반응은 질병으로 진단된 대상체가 여전히 살아 있는, 암과 같은 질병에 대한 진단일 또는 치료 시작 중 하나로부터의 시간의 길이로 기술되는 전체 생존율(OS)이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 암에 대한 치료가 끝난 후, 치료가 예방 또는 지연하도록 의도한 특정 합병증 또는 사건이 없는 채로 대상체가 존속하는 시간의 길이로 기술되는, 무사건 생존(EFS)이다. 상기 사건은 암이 뼈에 전파되어 일으키는 뼈 통증과 같은 특정 증상의 개시 또는 암의 재발 또는 죽음을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 반응 지속 기간(DOR)의 척도이다. 본원에 사용될 때, DOR은 치료에 대한 반응의 문서화에서 질병 진행까지의 시간량을 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 치료 계획으로 치료 후, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체의 DOR를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 지속적인 반응(durable response)을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 지속적인 반응은 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 또는 24개월의 또는 그보다 긴 DOR이다. 일부 구현예에서, 지속적인 반응은 3개월 보다 긴 DOR이다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 특정 기간의 DOR를 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 특정 기간은 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 또는 24개월이거나 그보다 길다. 일부 구현예에서, 상기 특정 기간은 3개월 보다 길다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 반응 지속 기간(DOR)의 척도이며, 이는 종양 반응의 문서화에서 질병 진행까지의 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 지속적인 반응, 예를 들어, 요법 시작으로부터 일정 기간 후에 지속되는 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 지속적인 반응은 요법 시작 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 또는 24개월에서의 반응률로 표시된다. 일부 구현예에서, 반응은 3개월 또는 6개월보다 더 오랫동안 지속된다.
일부 측면에서, 임상 반응은 객관적 종양 반응을 결정하기 위해 이용되고; 일부 측면에서, 고형 종양에서 사용되는 RECIST 기준에 기초한다. (Eisenhauer 등, European Journal of Cancer 45 (2009) 228-247.) 일부 구현예에서, RECIST 기준은 표적 병변에 대한 객관적 종양 반응을 결정하기 위해 이용된다. 일부 측면에서, RECIST 기준을 사용하여 알아낸 바와 같은 완전 반응은 모든 표적 병변의 소멸로 설명되고, 임의의 병리적 림프절(표적이건 비표적이건)이 단축(short axis)에서 <10mm까지 축소되어야 한다. 다른 측면에서, RECIST 기준을 사용하여 알아낸 바와 같은 부분 반응은 기준선 합계 직경을 기준으로 하여, 표적 병변의 직경의 합계에서 적어도 30% 이상의 감소로 설명된다. 다른 측면에서, 진행성 질병(PD)은 연구 중 가장 작은 합계를 기준으로 하여(이는 기준선 합계가 연구 중 가장 작은 경우 기준선 합계를 포함함) 표적 병변의 직경의 합계에서 적어도 20% 이상의 증가로 설명된다. 20%의 상대적 증가 외에, 합계는 적어도 5mm 이상의 절대적인 증가를 또한 입증해야 한다(일부 측면에서, 하나 이상의 새로운 병변의 출현도 진행으로 간주된다). 다른 측면에서, 안정 병변(stable disease, SD)은 연구 중인 가장 작은 합계 직경을 기준으로 하여, PR에 적격인 충분한 수축도 없고, PD에 적격인 충분한 증가도 없는 것으로 설명된다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 투여된 세포의 약동학적 특성을 포함한다. 예를 들면, 입양으로 전달된 세포의 약동학적 특성을 측정하여 투여된 세포의 이용률, 예를 들어, 생체이용률을 평가한다. 입양으로 전달된 세포의 약동학적 특성을 측정하는 방법은 조작된 세포를 투여받은 대상체로부터 말초 혈액을 채혈하는 것과 말초 혈액에서 조작된 세포의 수 또는 비(ratio)를 측정하는 것을 포함한다. 세포를 선택 및/또는 단리하는 접근법은 키메라 항원 수용체(CAR)-특이성 항체의 사용(예를 들어, Brentjens 등, Sci. Transl. Med. 2013 Mar; 5(177): (177ra38) Protein L (Zheng 등, J. Transl. Med. 2012 Feb; 10:29)), 에피토프 태그, 예컨대 CAR 내 특이적 부위로 직접 도입되는 Strep-Tag 서열의 사용을 포함하며, 이로써 Strep-Tag를 위한 결합 시약이 사용되어 CAR을 직접 평가하고(Liu 등 (2016) Nature Biotechnology, 34:430; 국제 특허 출원 공개 번호 WO2015095895) 그리고 CAR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 직접 평가한다(국제 특허 출원 공개 번호 WO2014190273 참조). 외인성 표지 유전자는 일부 경우에 세포의 검출 또는 선택을 가능하게 하도록, 일부 경우에 또한 세포 자살을 촉진하도록, 조작된 세포 요법과 관련하여 사용될 수 있다. 일부 경우에 절단형 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFRt)는 형질도입된 세포에서 관심 전이유전자(CAR 또는 TCR)와 함께 공발현될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 8,802,374 참조). EGFRt는 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 EGFRt 구조체 및 다른 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작된 세포를 식별 또는 선택하기 위해 및/또는 상기 수용체를 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu 등, Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]을 참조한다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 약동학적 반응이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 세포 요법의 투여 후 일정 기간에 측정한, 대상체로부터 수득된 샘플(예를 들어, 혈액) 내 CAR+ T 세포의 수이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 치료용 세포 조성물로 이전에 치료한 대상체로부터 수득된, 샘플(예를 들어, 혈액)에서 식별된 CAR+ T 세포의 최대 농도이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 치료용 세포 조성물로 이전에 치료한 대상체로부터 수득된, 샘플들(예를 들어, 생물학적 샘플들)에서 식별된 CAR+ T 세포의 곡선 하 면적(AUC)에 의해 결정되는, 노출이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 CAR+ T 세포 증폭이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 CAR+ T 세포 지속성이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 CAR+ T 세포 탈진이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 목표 약동학적 반응이다. 예를 들면, 목표 약동학적 반응은 세포 요법의 투여 후에 일정 기간에 대상체로부터 수득한 혈액 샘플에서 최대 CAR+ T 세포(Cmax)의 표적 정도, AUC에 의해 결정되는 노출의 표적 정도, 및/또는 CAR+ T 세포의 피크 농도까지의 표적 시간(Tmax)일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물의 투여 시로부터 0 내지 28일까지의 기간에 대한 AUC, 예를 들어, AUC0 -28가 알아낸이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 제공된 치료용 세포 조성물로 치료된 대상체가 목표 약동학적 반응을 달성할 것인지를 알아낼 수 있다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 독성 반응이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 중증 CRS(sCRS)이다. CRS, 예를 들어, sCRS. 일부 경우에 입양 T 세포 요법 및 대상체에 다른 생물학적 생성물의 투여 이후에 CRS 또는 sCRS가 일어날 수 있다. 문헌[Davila 등, Sci Transl Med 6, 224ra25 (2014); Brentjens 등, Sci. Transl. Med. 5, 177ra38 (2013); Grupp 등, N. Engl. J. Med. 368, 1509-1518 (2013); 및 Kochenderfer 등, Blood 119, 2709-2720 (2012); Xu 등, Cancer Letters 343 (2014) 172-78]을 참조한다.
통상적으로, CRS는 예를 들어 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 및/또는 대식세포에 의해 매개되는 과도한 전신 면역 반응에 의해 일어난다. 상기 세포들은 사이토카인 및 케모카인과 같은 많은 양의 염증성 매개인자를 방출할 수 있다. 사이토카인은 급성 염증 반응을 촉발할 수 있고/거나 내피 기관 손상을 유도할 수 있으며, 이는 미세 혈관 누출, 심부전, 또는 사망을 초래할 수 있다. 중증의 생명을 위협하는 CRS는 폐침윤 및 폐손상, 신부전, 또는 파종성 혈관내 응고로 이어질 수 있다. 다른 중증의 생명을 위협하는 독성에는 심장 독성, 호흡곤란, 신경학상 독성 및/또는 간부전이 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 발열, 특히 높은 발열 (≥ 38.5°C 또는 ≥ 101.3°F)은 CRS 또는 이의 위험과 연관된다. 일부 경우에, CRS의 특징 또는 증상은 감염을 모방한다. 일부 구현예에서, 감염은 또한 CRS 증상을 나타내는 대상체에서 고려되고, 배양에 의한 모니터링과 경험적 항생제 요법이 시행될 수 있다. CRS와 연관된 다른 증상은 심장 기능장애, 성인 호흡곤란 증후군, 신부전 및/또는 간부전, 응고장애, 파종성 혈관내 응고, 및 모세 혈관 누출 증후군을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 CRS의 등급이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 중증 CRS이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 중증 CRS의 부재(예를 들어, 보통 또는 경미한 CRS)이다. 아래 표 1과 2는 CRS 등급을 반영하는 기준을 보여준다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 신경 독성이거나 이와 연관된다. 일부 구현예에서, 신경 독성의 임상적 위험과 연관된 증상에는 착란상태, 섬망, 실어증, 표현실어증, 둔감, 간대성 근경련, 무기력, 정신 상태 변화, 경련, 발작 유사 활성, 발작(선택적으로 뇌전도(EEG)에 의해 확인된 바와 같음), 베타 아밀로이드(Aβ)의 수준 상승, 글루타메이트의 수준 상승, 및 산소 라디칼의 수준 상승이 포함된다. 일부 구현예에서, 신경 독성은 예를 들어, 1~5급 척도를 사용하는 중증도에 기초하여 등급이 매겨진다(예를 들어, 문헌[Guido Cavaletti & Paola Marmiroli Nature Reviews Neurology 6, 657-666 (December 2010); National Cancer Institute―Common Toxicity Criteria version 4.03 (NCI-CTCAE v4.03)] 참조).
일부 구현예에서, 임상 반응은 경미한 또는 보통 신경 독성, 예를 들어, 아래 표 3에 제시된 바에 따른 1급 또는 2급이다. 일부 구현예에서, 임상 반응은 중증 신경 독성이고, 이는 표 3에 제시된 바와 같은 3급 이상의 신경 독성을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 독성 반응을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 CRS(예를 들어, 1급 이상의 CRS)이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 경미한 CRS(예를 들어, 2급 이하의 CRS)이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 중증 CRS(예를 들어, 3급 이상의 CRS)이다.
일부 구현예에서, 독성 반응은 신경 독성(예를 들어, 1급 이상의 신경 독성)이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 경미한 신경 독성(예를 들어, 2급 이하의 신경 독성)이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 중증 신경 독성(예를 들어, 3급 이상의 신경 독성)이다.
일부 구현예에서, 임상 반응은 CD3+ 세포에 대한 log10AUC, CD3+ 세포에 대한 log10 최대 농도(Cmax), CD3+ 세포의 피크 농도의 시간(Tmax), CD4+ 세포에 대한 log10AUC, CD4+ 세포에 대한 log10 최대 농도(Cmax), CD4+ 세포의 피크 농도의 시간(Tmax), CD8+ 세포에 대한 log10AUC, CD8+ 세포에 대한 log10 최대 농도(Cmax), CD8+ 세포의 피크 농도의 시간(Tmax), 전체 log10AUC, 전체 log10 최대 농도(Cmax), 전체 세포의 피크 농도의 시간(Tmax), 객관적 반응, 완전 반응, 무진행 생존, 반응의 내구성, 3급 이상 신경 독성, 임의의 신경 독성 반응, 3급 이상 사이토카인 방출 증후군, 및 임의의 사이토카인 방출 증후군 중 하나 이상 또는 모두이다. 일부 구현예에서, Cmax, Tmax, 및 AUC는 유세포 분석 및/또는 중합효소연쇄반응에 의해 알아낸이다. 일부 구현예에서, AUC는 치료용 세포 조성물의 투여로부터 0 내지 28일로부터 알아낸이다. 일부 경우에, 예를 들어 랜덤 생존 포레스트 모델에 따라 결정될 때, 무진행 생존 및 반응의 내구성은 시간 척도, 예를 들어, 시간 대 이벤트(PFS 또는 DOR)를 포함한다.
B. 지도 기계 학습 방법
치료용 세포 조성물(예를 들어, 조작된 T 세포 조성물)로 치료할 대상체의 임상 반응은 일부 경우에 치료될 대상체의 특성, 대상체에 투여되는 치료용 세포 조성물의 특성, 및 치료용 세포 조성물이 생산되는 투입 조성물의 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 인자에 의존할 수 있다는 것이 고려된다(예를 들어, 섹션 I.A 참조). 따라서, 일부 구현예에서, 대상체 임상 반응과 연관된 특징을 식별하기 위해, 특징들을 임상 반응을 알아내기 위해 중요한 특성들을 식별할 수 있는 기계 학습 모델에 투입으로 사용할 수 있다.
추가로 대상체 임상 반응과 연관된 특징을 식별하기 위해, 일부 구현예에서, 기계 학습 모델은 대상체를 치료하기 전에 치료용 세포 조성물로 치료 후 대상체의 임상 반응을 알아내는 데 사용될 수 있으며, 여기서 임상 결과는 대상체 특성, 치료용 세포 특징, 및 투입 조성물 특성에 기초한다. 아래 섹션 I.B.4에 기술된 바와 같이, 치료용 세포 조성물을 투여하기 전에 치료용 세포 조성물로 치료할 대상체의 임상 반응을 알아내는 것은 대상체 치료 전략에 대한 정보를 줄 수 있다. 예를 들면, 대상체가 음성의 임상 반응(예를 들어, 독성 반응)을 가질 것으로 판단되면(예를 들어, 예측되면), 치료 계획(예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획)은 양성의 임상 반응(예를 들어, 완전 반응, 지속적인 반응, 독성 반응 부재)을 초래하도록 변경될 수 있다.
본원에 제공된 방법에 따라 사용하기 위해 고려되는 기계 학습 모델은 투명 모델을 포함한다. 예를 들면, 기계 학습 모델은 모델이 특정 결정(예를 들어, 예측)을 내린 방법을 확인하기 위해 심문되거나 질의될 수 있다. 일부 구현예에서, 기계 학습 모델은 랜덤 포레스트 모델(random forests model)이다. 일부 구현예에서, 기계 학습 모델은 랜덤 생존 포레스트 모델(random survival forests model)이다. 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트 모델을 사용하는 이점은 세포 요법, 예를 들어 치료용 세포 조성물에 대한 대상체의 임상 반응을 알아내기 위해 사용된 모델, 예를 들어 어느 특징이 어떻게 사용되는지를 식별하기 위해 모델을 심문하거나 질의하는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 임상 반응을 알아내는 데 사용되는 특징들은 임상 반응과 연관된 특징들로 간주된다. 일부 구현예에서, 대상체의 임상 반응을 알아내는 데 사용되는 특성들을 식별하는 것은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 특성 중요도를 평가하는 것을 포함한다.
1. 랜덤 포레스트
일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징을 식별하는 데 사용되는 기계 학습 모델은 랜덤 포레스트 모델이다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 또한 치료용 세포 조성물로 치료받는 대상체의 임상 반응을 알아내는 데 사용된다. 랜덤 포레스트는 앙상블 학습 방법의 예이다. 랜덤 포레스트는 하나 이상의 상응하는 산출, 예를 들어 분류, 예를 들어 임상 반응을 생성하기 위해 하나 이상의 투입, 예를 들어 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성과 같은 특징이 적용되는 복수의 결정 트리를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트는 분류기(classifier)이다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트는 회귀를 수행한다.
일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델의 결정 트리는 투입으로 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성을 수용하고 산출로 임상 반응의 분류를 생성한다. (바람직하게는, 개별 결정 트리는 복수의 결정 트리에 적용되는 공통 투입들이 산출들의 다양성을 초래할 정도로 충분히 상관관계가 없다.) 일부 구현예에서, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성은 복수의 개별 결정 트리에 적용되고, 대응하는 산출들이 조정되어 랜덤 포레스트 모델의 산출을 생성한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트의 산출은 대다수의 개별 결정 트리에 의한 분류 산출에 해당할 수 있다.
랜덤 포레스트를 훈련시키는 다양한 방법은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익숙하며 본 개시내용의 범위 내에 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 랜덤으로 샘플링된 투입 데이터(예를 들어, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성)를 랜덤 포레스트의 개별 결정 트리에 적용함으로써 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성을 포함하는 데이터세트에 대해 훈련될 수 있다. 이 훈련 방법은 개별 결정 트리 간의 다양성을 촉진하여 랜덤 포레스트의 정확도를 향상시킬 수 있다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 랜덤 포레스트의 많은 적절한 구성이 적절하게 활용될 수 있고, 본 개시내용은 랜덤 포레스트의 임의의 유형 또는 구성, 그 구성 결정 트리, 결정 트리를 훈련하는 임의의 방법, 또는 상기 임의의 것을 훈련하는 임의의 방법에 한정되지 않는다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성에 기초하여 임상 반응을 알아내기(예를 들어, 분류 또는 예측하기) 위해 지도 학습을 사용하여 훈련된다. 일부 경우에, 랜덤 포레스트 모델은 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성, 및 상응하는 임상 반응을 포함하는 데이터세트, 및 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성을 포함하는 모델을 훈련하는데 사용되지 않은 상이한 데이터의 세트에 대해 시험된 모델의 정확도에 대해 훈련될 수 있으며, 여기서 임상 반응은 알려져 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 모델을 훈련 및 시험하기 위한 데이터세트들이 예를 들어 아래 기술된 바와 같이 크기가 제한되는 경우, 그 모델은 부스트트랩 집계를 사용하여 훈련될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 모델을 훈련 및 시험하기 위한 데이터세트들이 예를 들어 아래 기술된 바와 같이 크기가 제한되는 경우, 그 모델은 교차 검증을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 k-겹 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 10겹 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델은 중첩 교차 검증을 사용하여 평가된다.
일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 25, 15, 또는 10개 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 200, 또는 100 내지 150개 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약), 500, 400, 300, 200, 150, 100개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약), 300, 200, 150, 100개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 200개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 150개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 100개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 모델을 평가하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 이 단락에 기술된 임의의 수 또는 그 미만 대상체로부터 획득된다. 일부 구현예에서, 대상체는 임상 시험에 참여하는 대상체이다.
a. 특성 중요도
일부 구현예에서, 본원에 기술된 랜덤 포레스트 모델(예를 들어, 훈련된, 시험된, 평가된 랜덤 포레스트 모델)은 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하기 위해 질의될 수 있다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 것은 모델에서 사용되는 특징들 각각에 대하여 중요도 정도를 알아내는 것을 포함한다. 중요도 정도들은 개별 특징들의 값들(예를 들어, 한번에 하나의 특징)이 순열되고 예측 정확도의 감소가 계산되는 순열 중요도 정도, 개별 특징에 대한 분할들에 의한 노드 불순도의 지니 지수의 평균 감소를 알아내는 것, 평균 최소 깊이(예를 들어, 특징이 분할을 위해 사용되는 평균 깊이)를 알아내는 것, 특징에 대한 분할이 발생하는 트리들의 총 수를 알아내는 것, 분할을 위해 특징을 사용하는 노드들의 총 수를 알아내는 것, 특징이 루트 노드를 분할하기 위해 사용되는 트리들의 총 수를 알아내는 것, 및 단측 이항 검정(one-sided binomial test)에 대한 p-값을 알아내는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술들을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 전술한 중요도 정도들 중 임의의 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 순열 중요도 정도(permutation importance measure)이다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 평균 최소 깊이(mean minimal depth)이다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 특성이 루트 노드를 분할하는 트리의 총 수이다.
일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 중요도 정도의 크기에 의해 식별된 특성들이다. 일부 구현예에서, 특성들은 중요도 정도 값(예를 들어, 크기)에 의해 정렬된 순위일 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 특성들은 가장 큰 것부터 가장 작은 것까지 중요도 정도 값들로 정렬된 순위일 수 있으며, 여기서 평가되는 중요도 정도는 각각의 특성(예를 들어, 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 특성들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수)에 대해 동일하다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 중요도 정도 값에 의해 특성들을 순위 순서로 하여 식별되며, 여기서 평가되는 중요도 정도는 각각의 특성(예를 들어, 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 특성들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수)에 대해 동일하다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 순위 순서에 의해 식별된 처음 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 특성이다. 일부 구현예에서, 순위 순서에 의해 식별된 처음 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 특성은 가장 큰 중요도 정도를 가진 특성들을 포함한다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 중요도 정도의 순위 순서에 의해 식별된 첫 10개 특성이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 5개 특성이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 3개 특성이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 2개 특성이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 번째 특성이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 중요도 정도 또는 조합을 사용하여 임상 결과와 연관된 특성들을 식별할 수 있다. 일부 구현예에서, 중요도 정도의 조합은 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 특성들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수, 및 p-값, 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 중요도 정도의 조합은 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및 특성들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수이거나 이를 포함한다.
b. 임상 결과 예측
본원에 기술된 랜덤 포레스트 모델은 또한 대상체를 치료용 세포 조성물로 치료하기 전에, 치료용 세포 조성물로 치료할 대상체의 임상 반응을 알아내는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체의 알아낸 임상 반응을 평가하는 것은 대상체의 치료에 정보를 제공하는 것에 사용될 수 있다. 예를 들면, 대상체가 음성 임상 반응, 예를 들어 독성, 표적 반응에 비해 불량하거나 감소된 약동학, CR, PR 또는 DOR의 결여를 갖는 것으로 판단(예를 들어, 예측)되는 경우, 예를 들어 아래 섹션 I.B.4에 기술된 바와 같은 미리 알아낸 치료 계획에 대한 변경이 이루어질 수 있다. 반면, 대상체가 양성 임상 반응, 예를 들어 CR, PR, DOR, 목표 약동학적 반응을 반영하거나 그보다 큰 약동학적 반응, 독성이 없거나 경미한 독성을 갖는 것으로 판단(예를 들어, 예측)되는 경우, 미리 알아낸 치료 계획은 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 CR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 PR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 OR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 치료 계획으로 치료 후, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체의 DOR을 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 지속적인 반응, 예를 들어, 3개월 넘는 DOR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 치료 계획으로 치료 후, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체의 PFS을 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 특정 기간의 PFS, 예를 들어, 3개월 넘는 PFS를 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 치료 계획으로 치료 후, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체의 약동학적 반응을 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 목표 약동학적 반응보다 큰 약동학적 반응을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 치료 계획의 투여 후 일정 기간에 대상체로부터 획득한 혈액 샘플에서 최대 CAR+ T 세포 농도(Cmax)의 정도이다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 치료 계획의 투여 후 CAR+ T 세포에 대한 노출, 예를 들어 (약) 28일 동안 노출의 정도 및/또는 치료 계획의 투여 후 CAR+ T 세포 농도-시간 곡선의 AUC에 의해 결정되는 바와 같은 정도다. 일부 구현예에서, 약동학적 반응은 CAR+ T 세포의 피크 농도까지의 시간(Tmax)이다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 독성 반응을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 CRS이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 중증 CRS, 예를 들어, 3급 이상 CRS이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 신경 독성이다. 일부 구현예에서, 독성 반응은 중증 신경 독성, 예를 들어, 3급 이상 신경 독성이다.
2. 랜덤 생존 포레스트
일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하고 치료용 세포 조성물로 치료되는 대상체의 임상 반응을 알아내는 데 사용되는 기계 학습 모델은 랜덤 생존 포레스트 모델이다. 랜덤 생존 포레스트는 우측-중도절단된 생존 데이터를 분석하는 데 유용한 앙상블 학습 방법의 예이다. 위에 기술된 랜덤 포레스트와 마찬가지로, 랜덤 생존 포레스트는 복수의 결정 트리를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 하나 이상의 투입, 예를 들어, 특성에 적용되어 하나 이상의 대응하는 산출, 예를 들어, 분류를 생성한다. 랜덤 생존 포레스트 모델의 생성은 일반적으로 랜덤 포레스트의 것을 따르지만, 랜덤 생존 포레스트 모델은 시간과 중도절단 지표(censor indicator)를 포함하며, 여기서 중도절단 지표는 주어진 시점 t에서 이벤트의 존재(예를 들어, 1) 또는 부재(예를 들어, 0)를 나타낸다. 따라서, 랜덤 생존 포레스트의 트리를 성장시키기 위한 분할 규칙은 중도절단 특징을 설명한다. 본원에 제공된 랜덤 생존 포레스트 모델은 시간 경과에 따른 임상 반응의 발생을 기반으로 생성된다.
일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성에 기초하여 예를 들어 주어진 임상 반응에 대해 임상 반응 함수 및 누적 위험 함수를 추정하기 위해 지도 학습을 사용하여 훈련된다. 일부 경우에, 랜덤 생존 포레스트 모델은 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성, 및 상응하는 임상 반응을 포함하는 데이터세트, 및 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성을 포함하는 모델을 훈련하는데 사용되지 않은 상이한 데이터의 세트에 대해 시험된 모델의 정확도에 대해 훈련될 수 있으며, 여기서 임상 반응은 알려져 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 모델을 훈련 및 시험하기 위한 데이터세트들이 예를 들어 아래 기술된 바와 같이 크기가 제한되는 경우, 그 모델은 교차 검증을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 k-겹 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 10겹 교차 검증을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델은 중첩 교차 검증을 사용하여 평가된다.
일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 25, 15, 또는 10개 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 200, 또는 100 내지 150개 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약), 500, 400, 300, 200, 150, 100개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약), 300, 200, 150, 100개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 200개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 150개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 100개 또는 미만 대상체로부터 획득된 특징들(대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 투입 조성물 특성)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 모델을 평가하는 데 사용되는 데이터세트는 (약) 이 단락에 기술된 임의의 수 또는 그 미만 대상체로부터 획득된다. 일부 구현예에서, 대상체는 임상 시험에 참여하는 대상체이다.
a. 특성 중요도
일부 구현예에서, 본원에 기술된 랜덤 생존 포레스트 모델(예를 들어, 훈련된, 시험된, 평가된 랜덤 생존 포레스트 모델)은 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하기 위해 질의될 수 있다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들(예를 들어, 임상 반응 및 누적 위험 함수)을 식별하는 것은 모델에서 사용되는 특징들 각각에 대하여 중요도 정도를 알아내는 것을 포함한다. 랜덤 포레스트와 유사하게, 중요도 정도들은 개별 특징들의 값들(예를 들어, 한번에 하나의 특징)이 순열되고 예측 정확도의 감소가 계산되는 순열 중요도 정도, 개별 특징에 대한 분할들에 의한 노드 불순도의 지니 지수의 평균 감소를 알아내는 것, 평균 최소 깊이(예를 들어, 특징이 분할을 위해 사용되는 평균 깊이)를 알아내는 것, 특징에 대한 분할이 발생하는 트리들의 총 수를 알아내는 것, 분할을 위해 특징을 사용하는 노드들의 총 수를 알아내는 것, 특징이 루트 노드를 분할하기 위해 사용되는 트리들의 총 수를 알아내는 것, 및 단측 이항 검정(one-sided binomial test)에 대한 p-값을 알아내는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술들을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 순열을 사용할 때, 예측 정확도의 감소는 일치성 지수(concordance index)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 전술한 중요도 정도들 중 임의의 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 순열 중요도 정도(permutation importance measure)이다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 평균 최소 깊이(mean minimal depth)이다. 일부 구현예에서, 중요도 정도는 특징이 루트 노드를 분할하는 트리의 총 수이다.
일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 중요도 정도의 크기에 의해 식별된 특징들이다. 일부 구현예에서, 특징들은 중요도 정도 값(예를 들어, 크기)에 의해 정렬된 순위일 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 특징들은 가장 큰 것부터 가장 작은 것까지 중요도 정도 값들로 정렬된 순위일 수 있으며, 여기서 평가되는 중요도 정도는 각각의 특징(예를 들어, 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 특징들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수)에 대해 동일하다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 중요도 정도 값에 의해 특성들을 순위 순서로 하여 식별되며, 여기서 평가되는 중요도 정도는 각각의 특징(예를 들어, 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 특징들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수)에 대해 동일하다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 순위 순서에 의해 식별된 처음 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 특징이다. 일부 구현예에서, 순위 순서에 의해 식별된 처음 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 특징은 가장 큰 중요도 정도를 가진 특징들을 포함한다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 중요도 정도의 순위 순서에 의해 식별된 첫 10개 특징이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 5개 특징이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 3개 특징이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 2개 특징이다. 일부 구현예에서, 임상 반응과 연관된 특징들은 중요도 정도 값을 순위 지정하여 식별된 첫 번째 특징이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 중요도 정도 또는 조합을 사용하여 임상 결과와 연관된 특성들을 식별할 수 있다. 일부 구현예에서, 중요도 정도의 조합은 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 특징들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수, 및 p-값, 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 중요도 정도의 조합은 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및 특징들이 루트 노드를 분할하는 트리의 수이거나 이를 포함한다.
b. 임상 결과 예측
본원에 기술된 랜덤 생존 포레스트 모델은 또한 대상체를 치료용 세포 조성물로 치료하기 전에, 치료용 세포 조성물로 치료할 대상체의 임상 반응을 알아내는 데(예를 들어, 추정하는 데) 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체의 알아낸 임상 반응을 평가하는 것은 대상체의 치료에 정보를 제공하는 것에 사용될 수 있다. 예를 들면, 대상체가 음성 임상 반응, 예를 들어 독성, 표적 반응에 비해 불량하거나 감소된 약동학, CR, PR 또는 DOR의 결여를 갖는 것으로 판단(예를 들어, 예측)되는 경우, 예를 들어 아래 섹션 I.B.4에 기술된 바와 같은 미리 알아낸 치료 계획에 대한 변경이 이루어질 수 있다. 반면, 대상체가 양성 임상 반응, 예를 들어 CR, PR, DOR, 목표 약동학적 반응을 반영하거나 그보다 큰 약동학적 반응, 독성이 없거나 경미한 독성을 갖는 것으로 판단(예를 들어, 예측)되는 경우, 미리 알아낸 치료 계획은 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델은, 치료 전에, 치료 계획으로 치료 후, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체의 DOR을 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 지속적인 반응, 예를 들어, 3개월 넘는 DOR을 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델은, 치료 전에, 치료 계획으로 치료 후, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체의 PFS을 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델은, 치료 전에, 대상체로부터 선택된 T 세포를 포함하는 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물을 포함한, 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획, 예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획으로 치료될 대상체가 치료 계획으로 치료 후 특정 기간의 PFS, 예를 들어, 3개월 넘는 PFS를 나타낼 것인지를 알아내는 데 또는 예측하는 데 사용된다.
3. 사전처리
일부 구현예에서, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성은 사전처리된다. 데이터 사전처리는 모델 생성 시 잘못된 또는 부정확한 결과들을 생성하는 모델을 생성하는 것을 방지하기 위한 중요한 단계이다. 일부 구현예에서, 사전처리는 범위를 벗어난 값, 결측 값(missing value), 불가능한 데이터 조합, 상관관계가 높은 변수 등이 모델에 편입되는 것을 방지한다. 일부 경우에, 사전처리는 정보 특성의 식별로 이어진다. 예를 들면, 사전처리는 남아 있는 특징들이 정보를 제공하고, 구별되고, 독립적이 되도록(예를 들어, 정보 특성) 분산이 거의 없거나 전혀 없는 특징들, 동적 범위가 낮은 특징들(예를 들어, 분포에 대해 < 5%), 상관관계가 높은 특징들, 또는 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 데, 또는 결측 값을 대체하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 과학적 관련성이 거의 또는 전혀 없는 특징은 제거된다. 예를 들면, 치료용 세포 조성물을 제조하는 것과 연관되지만 과학적 관련성이 낮은 특정 특징들은 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 사전처리에 의해 식별된 특징들은 정보 특성이다.
일부 구현예에서, 기계 학습 모델(예를 들어, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트)은 사전처리에 의해 식별된, 정보 특성에 대해 훈련된다. 일부 구현예에서, 기계 학습 모델(예를 들어, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트)은 사전처리에 의해 식별된, 정보 특성에 대해 지도 학습을 사용하여 훈련된다. 섹션 I.B.1a-b 및 I.B.2a-b 각각에 기술된 랜덤 포레스트 모델 및 랜덤 생존 포레스트 모델의 생성, 훈련, 시험, 및 검증은 사전처리에 의해 식별된, 정보 특성들을 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 대상체를 치료하기 전에, 치료용 세포 조성물로 치료될 대상체의 임상 반응을 알아내기(예를 들어, 예측하기, 추정하기) 위해 랜덤 포레스트 또는 랜덤 생존 포레스트가 사용될 때, 이 모델들에 투입으로 사용되는 특징들은 사전처리에서 식별된, 정보 특성들이다. 일부 구현예에서, 모델들을 훈련시키는 데 사용되는 정보 특성들과 치료용 세포 조성물로 치료하기 전에 대상체에서 임상 반응을 알아내기 위한 정보 특성들은 동일한, 정보 특성들이다.
일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 데이터세트로부터 0 또는 거의 제로 분산을 갖는 특징들(예를 들어, 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성)을 제거하는 것, 70% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것, 높은 상관관계가 있는 특징들(예를 들어, |ρ| > 0.7)을 제거하는 것, 및 70% 미만의 결측 값을 갖는 특징들에 대한 값들을 대치하는 것 중 하나 이상 또는 모두를 포함하며, 여기서 결측 값들은 평균 또는 최빈값으로 대체된다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 0 또는 거의 제로 분산을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 70% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 높은 상관관계가 있는 특징들(|ρ| > 0.7)을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 70% 미만의 결측 값을 갖는 특징들에 대한 값들을 대치하는 것이거나 이를 포함하며, 여기서 결측 값들은 평균 또는 최빈값으로 대체된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 사전처리 단계는 정보 특성들을 포함하는 데이터세트를 생성한다.
일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 50% 이상의 결측 데이터가 있는 특징들(예를 들어, 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성)을 제거하는 것; 제로 분산을 갖거나 또는 (약) 95% 이상의 데이터 값들이 단일 값과 동일하고 0.1n 고유 값들 미만인(여기서, n = 샘플 수) 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 것; 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성에 대한 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치에 의해 결측 데이터를 대치하는 것; 공변량 클러스터를 식별하는 것―공변량 클러스터는 (약) 0.5 이상의 상관관계 계수(예를 들어, |ρ| ≥ 0.5)를 갖는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 공변량 클러스터로부터 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성을 반복적으로 선택하는 것―선택된 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성은 모든 남아 있는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―; 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 60% 이상의 결측 데이터가 있는 특징들(예를 들어, 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성)을 제거하는 것; 제로 분산을 갖거나 또는 (약) 95% 이상의 데이터 값들이 단일 값과 동일하고 0.1n 고유 값들 미만인(여기서, n = 샘플 수) 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 것; 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성에 대한 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치에 의해 결측 데이터를 대치하는 것; 공변량 클러스터를 식별하는 것―공변량 클러스터는 (약) 0.5 이상의 상관관계 계수(예를 들어, |ρ| ≥ 0.5)를 갖는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 공변량 클러스터로부터 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성을 반복적으로 선택하는 것―선택된 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성은 모든 남아 있는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―; 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 공변량 클러스터를 식별하는 것은 숫자 특징들 사이의 피어슨 적률 상관관계, 숫자 및 서수 특징들 사이의 폴리시리얼 상관관계, 및 서수 특징들 사이의 폴리코릭 상관관계를 포함하는 이질적 상관관계 매트릭스를 계산하는 것을 포함한다. 상관관계는 이 특징들에 대한 모든 완전한 관찰 쌍을 사용하여 각각의 특징들의 쌍 사이에서 계산된다. 공변량 클러스터는 상관 계수 > 0.5인 특징들의 세트로서 정의되고, 대표적인 특징들은 데이터세트 내의 모든 다른 나머지 특징과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 나타내는 각각의 클러스터 내의 특징들로서 반복적으로 선택된다. 임의의 구현예의 일부에서, 상관관계 계수는 rho의 절대값(예를 들어, |ρ|)이다.
일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 50% 이상의 결측 데이터가 있는 특징들(예를 들어, 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성)을 제거하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 60% 이상의 결측 데이터가 있는 특징들(예를 들어, 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성)을 제거하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 제로 분산을 갖거나 또는 (약) 95% 이상의 데이터 값들이 단일 값과 동일하고 0.1n 고유 값들 미만인(여기서, n = 샘플 수) 특징들(예를 들어, 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성)을 제거하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성에 대한 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치에 의해 결측 데이터를 대치하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 공변량 클러스터를 식별하는 것―공변량 클러스터는 (약) 0.5 이상의 상관관계 계수(예를 들어, |ρ| ≥ 0.5)를 갖는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 공변량 클러스터로부터 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성을 반복적으로 선택하는 것―선택된 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성은 모든 남아 있는 대상체 특성, 투입 조성물 특성, 및 치료용 세포 조성물 특성과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―;을 포함한다.
일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 40, 50, 60, 70, 또는 80% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 40 내지 80% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 40 내지 70% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 40 내지 60% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 (약) 40 내지 50% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 40% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 50% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 60% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 70% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 80% 초과의 결측 값을 갖는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 정보 특성들을 식별하기 위한 사전처리는 높은 상관관계가 있는 특징들을 제거하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 높은 상관관계가 있는 특징들은 (약) 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9 이상의 rho의 절대값을 갖는 특징들이다. 일부 구현예에서, 높은 상관관계가 있는 특징들은 (약) 0.4 이상의 rho의 절대값을 갖는 특징들이다. 일부 구현예에서, 높은 상관관계가 있는 특징들은 (약) 0.5 이상의 rho의 절대값을 갖는 특징들이다. 일부 구현예에서, 높은 상관관계가 있는 특징들은 (약) 0.6 이상의 rho의 절대값을 갖는 특징들이다. 일부 구현예에서, 높은 상관관계가 있는 특징들은 (약) 0.7 이상의 rho의 절대값을 갖는 특징들이다. 일부 구현예에서, 높은 상관관계가 있는 특징들은 (약) 0.8 이상의 rho의 절대값을 갖는 특징들이다. 일부 구현예에서, 높은 상관관계가 있는 특징들은 (약) 0.9 이상의 rho의 절대값을 갖는 특징들이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 사전처리 단계들(예를 들어, 섹션 I.B.3)의 하나 이상(예를 들어, 임의의 조합)은 정보 특성들을 식별하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 사전처리 단계는 정보 특성들을 포함하는 데이터세트를 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성, 및 하나 이상의 투입 조성물 특성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성, 또는 하나 이상의 투입 조성물 특성을 포함한다.
4. 치료 방법
일부 구현예에서, 대상체에서 임상 반응들을 갖는 특징들(예를 들어, 대상체 특성, 치료용 세포 조성물 특성, 및 투입 조성물 특성) 사이의 관계(예를 들어, 연관성)를 이해하는 것 및 치료 전에 치료용 세포 조성물로 치료할 대상체에서 임상 반응을 알아내거나 예측하는 능력은 치료 전략에 정보를 제공할 수 있다. 예를 들면, 치료 계획(예를 들어, 미리 알아낸 치료 계획)은 예상된 임상 반응에 따라 변경되거나 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 미리 알아낸 치료 계획을 유지하거나 치료 계획을 변경하는 것은 양성 임상 반응, 예를 들어, CR, PR, DOR, 독성 없음을 생성하는 데 유용할 수 있다.
a. 병용 치료
일부 구현예에서, 치료될 대상체가 CR, PR, 특정 길이의 DOR, 특정 길이의 무진행 생존, 또는 표적 약동학적 특성을 포함하지 않는 임상 반응을 가질 것으로 판단(예를 들어, 예측)되면, 추가 치료를 포함하는 치료 전략을 고려할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물(예를 들어, CD4+, CD8+ 치료용 T 세포 조성물)은 병용 치료의 일부로서 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 치료용 세포 조성물(예를 들어, CD4+, CD8+ 치료용 T 세포 조성물)은 치료용 세포 조성물 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 하는 데 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포 조성물(예를 들어, CD4+, CD8+ 치료용 T 세포 조성물)은 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 화학 요법제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은, 예를 들어 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위한, 화학 요법제, 예를 들어, 조절 화학 요법제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 병용 요법은 BTK 억제제(예를 들어, 이브루티닙 또는 아칼라브루티닙)와 같은 키나아제 억제제; 트립토판 대사 및/또는 키누레닌 경로의 억제제, 예컨대 인돌아민 2,3-이산소화효소-1(IDO1) 억제제(예를 들어, 에파카도스타트); 탈리도마이드 또는 탈리도마이드 유도체(예를 들어, 레날리도마이드 또는 포말리도마이드)를 포함하는 면역조절 이미드 의약물(IMiD)과 같은 면역 조절제; 또는 항-PD-L1 항체(예를 들어, 두르발루무마브(durvalumumab))와 같은 관문 억제제(check point inhibitor)의 투여를 포함한다.
예시적인 병용 요법 및 방법이 문헌[국제 공개 출원 번호 WO 2018/085731, WO 2018/102785, WO 2019/213184, WO 2018/071873, WO 2018/102786, WO 2018/204427, WO 2019/152743]에 기술되어 있으며, 이의 내용들은 그 전체가 참조로 포함된다.
b. 투약 및 투여 결정
일부 구현예에서, 치료될 대상체가 CR, PR, 특정 길이의 DOR, 특정 길이의 무진행 생존, 또는 표적 약동학적 특성을 포함하지 않는 임상 반응을 가질 것으로 판단(예를 들어, 예측)되면, 용량을 최적화하는 치료 전략을 고려할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 조성물 또는 이의 용량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 질병 또는 병태의 부담을 감소시키기에 효과적인 양으로 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 상기 조성물을 투여받은 대상체 군에서 좀 더 일관된 결과(예를 들어, 반응) 및/또는 안전성 결과, 및/또는 더 일관된 약동학적 매개변수를 제공하는 양으로 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 지속적인 반응 및/또는 무진행 생존을 증진하기에 효과적인 양으로 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 T 세포를 함유하는 치료용 조성물을 세포 표현형에 대해 평가하는 단계, 및 그러한 결과에 기초하여 용량을 알아내는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 용량은 하나 이상의 특정 조성물에서 특정 표현형을 갖는 조작된 세포의 상대적으로 일관된 수, 비율, 비 및/또는 백분율을 포함하도록 알아낸이다. 일부 측면에서, 일관성은 상대적으로 일관된 활성, 기능, 약동학적 매개변수, 독성 결과 및/또는 반응 결과와 연관되거나 관련된다. 일부 측면에서, 복수의 대상체, 조성물 및/또는 용량에서, 수, 비율, 비 및/또는 백분율은 상대적으로 일관되고, 예를 들어, 조성물 또는 단위 용량에서, 특정 표현형을 가진 예를 들어 CCR7(CCR7+)을 발현하는 또는 사이토카인을 생산하는 예를 들어 IL-2, TNF-알파, 또는 IFN-감마를 생산하는 세포의 수 또는 비는 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하만큼 다르다. 일부 측면에서, 조성물 또는 단위 용량에서 특정 표현형을 갖는, 예를 들어 CCR7(CCR7+)을 발현하는 세포의 수 또는 비는 공정에 의해 생산된 복수의 T 세포 조성물에서 상기 수 또는 비의 평균으로부터 20% 이하 또는 10% 이하 또는 5% 이하만큼 다르고/거나 이러한 평균으로부터 1 표준 편차 이하만큼 다르거나 알아낸 복수의 T 세포 조성물 또는 용량 중에서 20% 이하 또는 10% 이하 또는 5% 이하만큼 다르다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 대상체는 적어도 10 대상체, 예컨대 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100 또는 그 이상의 대상체를 포함한다.
일부 측면에서, 용량, 예를 들어 하나 이상의 단위 용량(들)은 특정 서브세트의 조작된 T 세포, 예를 들어 특정 표면 표지자 표현형과 같은 특정 표현형을 갖는 세포의 수, 백분율, 비, 빈도 및/또는 비율에 기초하여 알아낸이다. 일부 측면에서, 세포 표현형은 특정 세포 표지자(예를 들어, 표면 표지자)의 발현 및/또는 발현의 부재에 기초하여 알아낸이다. 일부 측면에서, 세포 표지자는 세포의 생존력 및/또는 세포자멸 상태를 나타내는 표지자를 포함한다. 일부 측면에서, 예시적인 표지자는 CD3, CD4, CD8, CCR7, CD27, CD45RA, 아넥신 V, 또는 활성화된 카스파제 3을 포함한다. 일부 측면에서, 예시적인 표지자는 CCR7이다. 일부 측면에서, 예시적인 표지자는 CD27이다. 일부 측면에서, 예시적인 표지자는 CCR7 및/또는 CD27을 포함한다. 일부 측면에서, 예시적인 표지자는 CCR7, CD27 및/또는 CD45RA를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에 치료용 T 세포 조성물, 예컨대 본원에 기술된 임의의 조성물의 하나 이상의 단위 용량 및/또는 본원에 제공된 방법에 의해 알아낸 임의의 단위 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태를 가진 대상체에 그 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체(예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR))를 포함하는 세포를 포함하는 T 세포 조성물의 단위 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 정의된 수의 치료용 조성물의 총 재조합 수용체-발현 세포(수용체+), 총 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포(수용체+/CD8+)가 투여되고/거나 그러한 세포의 단위 용량이 투여되고, 상기 단위 용량은 특정 표현형, 예를 들어, CCR7+/CD4+, CCR7+/CD8+, CD27+/CD4+, CD27+/CD8+, CD45RA+/CD4+, CD45RA+/CD8+, CCR7-/CD4+, CCR7-/CD8+, CD27-/CD4+, CD27-/CD8+, CD45RA-/CD4+, CD45RA-/CD8+, CCR7+/CD27+/CD4+, CCR7+/CD27+/CD8+, CCR7+/CD45RA-/CD4+, CCR7+/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD45RA-/CD4+, CCR7-/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD27-/CD4+, 또는 CCR7-/CD27-/CD8+을 가진 세포의 정의된 수, 백분율, 비, 빈도 및/또는 비율을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은, 조성물에서, C-C 케모카인 수용체 유형 7(CCR7)을 발현하는, 정의된 수의 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포(수용체+/CD8+/CCR7+ 세포) 및/또는 CCR7을 발현하는, 정의된 수의 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포(수용체+/CD4+/CCR7+ 세포) 및/또는 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 대 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포의 정의된 비 및/또는 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 및/또는 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포 대 다른 서브세트의 세포의 비를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 정의된 수의 CD8+/CCR7+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 정의된 수의 CD4+/CCR7+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 정의된 수 또는 비는 추가로 세포상에서 CD27 및/또는 CD45RA의 발현 또는 발현의 부재에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은, 조성물에서, 분화 클러스터 27(CD27)을 발현하는, 정의된 수의 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포(수용체+/CD8+/CD27+ 세포) 및/또는 CD27을 발현하는, 정의된 수의 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포(수용체+/CD4+/CD27+ 세포) 및/또는 수용체+/CD8+/CD27+ 세포 대 수용체+/CD4+/CD27+ 세포의 정의된 비 및/또는 수용체+/CD8+/CD27+ 세포 및/또는 수용체+/CD4+/CD27+ 세포 대 다른 서브세트의 세포의 비를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 정의된 수의 CD8+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 정의된 수의 CD4+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 정의된 수 또는 비는 추가로 세포상에서 CCR7 및/또는 CD45RA의 발현 또는 발현의 부재에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은, 조성물에서, CCR7 및 CD27을 발현하는, 정의된 수의 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포(수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포) 및/또는 CCR7 및 CD27을 발현하는, 정의된 수의 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포(수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포) 및/또는 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 대 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포의 정의된 비 및/또는 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 및/또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포 대 다른 서브세트의 세포의 비를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 정의된 수의 CD8+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 정의된 수의 CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 정의된 수 또는 비는 추가로 세포상에서 CD45RA의 발현 또는 발현의 부재에 기초한다.
일부 구현예에서, 단위 용량에서 세포의 수는, 용량에서 특정 대상체, 예컨대 세포가 유래된 대상체에 투여하기에 바람직한, 세포의 수 또는 재조합 수용체-발현 또는 CAR-발현 세포의 수, 또는 특정 표현형의 상기 세포, 예를 들어, CD3 CD4, CD8, CCR7, CD27, CD45RA, 아넥신 V, 또는 활성화된 카스파제 3에서 선택된 하나 이상의 표지자를 발현하거나 발현하지 않는 세포의 수, 백분율, 비, 빈도 및/또는 비율이다. 일부 구현예에서, 단위 용량에서 세포의 수는 세포의 수 또는 재조합 수용체-발현 또는 CAR-발현 세포의 수, 또는 특정 표현형의 상기 세포, 예를 들어, CCR7+, CD27+, CD45RA+, CD45RA-, CD4+, CD8+, CD3+, 세포자멸사 표지자 음성(예를 들어, 아넥신 V- 또는 카스파제 3-) 세포, 또는 전술한 것 중 하나 이상에 대해 양성 또는 음성인 세포의 수, 백분율, 비, 빈도 및/또는 비율이다.
일부 구현예에서, 단위 용량에서 세포의 수는, 용량에서 특정 대상체, 예컨대 세포가 유래된 대상체에 투여하기에 바람직한, 세포의 수 또는 재조합 수용체-발현 또는 CAR-발현 세포의 수, 또는 특정 표현형의 상기 세포, 예를 들어, CCR7+/CD4+, CCR7+/CD8+, CD27+/CD4+, CD27+/CD8+, CD45RA+/CD4+, CD45RA+/CD8+, CCR7-/CD4+, CCR7-/CD8+, CD27-/CD4+, CD27-/CD8+, CD45RA-/CD4+, CD45RA-/CD8+, CCR7+/CD27+/CD4+, CCR7+/CD27+/CD8+, CCR7+/CD45RA-/CD4+, CCR7+/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD45RA-/CD4+, CCR7-/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD27-/CD4+, CCR7-/CD27-/CD8+, 및 세포자멸사 표지자 음성(예를 들어, 아넥신 V- 또는 카스파제 3-) 세포의 수, 백분율, 비 및/또는 비율이다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 정의된 세포의 수 또는 재조합 수용체-발현 또는 CAR-발현 세포의 수, 또는 특정 표현형의 상기 세포, 예를 들어, CCR7+/CD4+, CCR7+/CD8+, CD27+/CD4+, CD27+/CD8+, CD45RA+/CD4+, CD45RA+/CD8+, CCR7-/CD4+, CCR7-/CD8+, CD27-/CD4+, CD27-/CD8+, CD45RA-/CD4+, CD45RA-/CD8+, CCR7+/CD27+/CD4+, CCR7+/CD27+/CD8+, CCR7+/CD45RA-/CD4+, CCR7+/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD45RA-/CD4+, CCR7-/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD27-/CD4+, CCR7-/CD27-/CD8+, 및 세포자멸사 표지자 음성(예를 들어, 아넥신 V- 또는 카스파제 3-) 세포, 및/또는 이들의 임의 서브세트의 수, 백분율, 비 및/또는 비율을 함유한다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 세포 조성물에서 세포 또는 세포 유형(들)의 수 및/또는 세포 또는 세포 유형, 예를 들어 개별 집단, 표현형 또는 아형, 예컨대 아넥신 V-/CCR7+/CAR+; 아넥신 V-/CCR7+/CAR+/CD4+; 아넥신 V-/CCR7+/CAR+/CD8+; 아넥신 V-/CD27+/CAR+; 아넥신 V-/CD27+/CAR+/CD4+; 아넥신 V-/CD27+/CAR+/CD8+; 아넥신 V-/CCR7+/CD27+/CAR+; 아넥신 V-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+; 아넥신 V-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+; 아넥신 V-/CCR7+/CD45RA-/CAR+; 아넥신 V-/CCR7+/CD45RA-/CAR+/CD4+; 아넥신 V-/CCR7+/CD45RA-/CAR+/CD8+; 아넥신 V-/CCR7-/CD45RA-/CAR+; 아넥신 V-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD4+; 아넥신 V-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD8+; 아넥신 V-/CCR7-/CD27-/CAR+, 아넥신 V-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD4+; 아넥신 V-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD8+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CAR+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CAR+/CD4+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CAR+/CD8+; 활성화된 카스파제 3-/CD27+/CAR+; 활성화된 카스파제 3-/CD27+/CAR+/CD4+; 활성화된 카스파제 3-/CD27+/CAR+/CD8+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD27+/CAR+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD4+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD27+/CAR+/CD8+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD45RA-/CAR+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD45RA-/CAR+/CD4+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7+/CD45RA-/CAR+/CD8+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD45RA-/CAR+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD4+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD45RA-/CAR+/CD8+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD27-/CAR+; 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD4+; 및/또는 활성화된 카스파제 3-/CCR7-/CD27-/CAR+/CD8+; 또는 이들의 조합의 표현형을 가진 것의 빈도, 비, 및/또는 백분율에 기초하여 알아낸이다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함), 재조합 수용체를 발현하는 총 CD8+ 세포(수용체+/CD8+ 세포) 또는 재조합 수용체를 발현하는 총 CD4+ 세포(수용체+/CD4+ 세포), 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 약 1 x 108개 이하, 약 5 x 107개 이하, 약 1 x 107개 이하, 약 5 x 106개 이하, 약 1 x 106개 이하, 또는 약 5 x 105개 이하의 총 수용체+/CD8+ 세포 또는 총 수용체+/CD4+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 5 x 105 내지 (약) 5 x 107, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 또는 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 적어도 (약) 5 x 107, 1 x 107, 5 x 106, 1 x 106, 또는 적어도 약 5 x 105개의 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 또는 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 5 x 105 내지 (약) 5 x 107, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포 또는 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 적어도 (약) 5 x 107, 1 x 107, 5 x 106, 1 x 106, 또는 적어도 약 5 x 105개의 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포 또는 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 적어도 (약) 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 또는 1 x 107개의 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 및/또는 적어도 (약) 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 또는 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 3 x 106 내지 (약) 2.5 x 107, (약) 4 x 106 내지 (약) 2 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 및/또는 (약) 3 x 106 내지 (약) 2.5 x 107, (약) 4 x 106 내지 (약) 2 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 적어도 (약) 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 또는 1 x 107개의 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포 및/또는 적어도 (약) 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 또는 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 3 x 106 내지 (약) 2.5 x 107, (약) 4 x 106 내지 (약) 2 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포 및/또는 (약) 3 x 106 내지 (약) 2.5 x 107, (약) 4 x 106 내지 (약) 2 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 5 x 105 내지 (약) 5 x 107, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 적어도 (약) 5 x 107, 1 x 107, 5 x 106, 1 x 106, 또는 적어도 (약) 5 x 105개의 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 적어도 (약) 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 또는 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 및/또는 적어도 (약) 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 또는 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 3 x 106 내지 (약) 2.5 x 107, (약) 4 x 106 내지 (약) 2 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 및/또는 (약) 3 x 106 내지 (약) 2.5 x 107, (약) 4 x 106 내지 (약) 2 x 107, 또는 (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 대 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포의 정의된 비를 포함하고, 이 비는 선택적으로 (대략) 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이이다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 수용체+/CD8+/CD27+ 세포 대 수용체+/CD4+/CD27+ 세포의 정의된 비를 포함하고, 이 비는 선택적으로 (대략) 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이이다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함), 재조합 수용체를 발현하는 총 CD8+ 세포(수용체+/CD8+ 세포) 또는 재조합 수용체를 발현하는 총 CD4+ 세포(수용체+/CD4+ 세포), 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 108개 이하, (약) 5 x 107개 이하, (약) 1 x 107개 이하, (약) 5 x 106개 이하, (약) 1 x 106개 이하, 또는 (약) 5 x 105개 이하의 총 수용체+/CD8+ 세포 또는 총 수용체+/CD4+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 대 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포의 정의된 비를 포함하고, 이 비는 선택적으로 (대략) 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이이다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 재조합 수용체를 발현하는 총 CD3+ 세포(수용체+/CD3+ 세포) 또는 총 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 5 x 108개 이하, (약) 1 x 108개 이하, (약) 5 x 107개 이하, (약) 1 x 107개 이하, (약) 5 x 106개 이하, (약) 1 x 106개 이하 또는 (약) 5 x 105개 이하의 총 수용체+/CD3+ 세포 또는 총 CD3+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, CD3+ 세포의 총 수, 수용체+/CD3+ 세포의 총수, 수용체+/CD8+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CCR7+/CD45RA- 세포 및/또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD45RA- 세포의 총 수는 살아 있거나 생존 가능한 상기 세포의 총 수이다. 일부 구현예에서, CD3+ 세포의 총 수, 수용체+/CD3+ 세포의 총수, 수용체+/CD8+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포의 총 수, 수용체+/CD8+/CCR7+/CD45RA- 세포 및/또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD45RA- 세포의 총 수는 세포자멸 표지자를 발현하지 않는 상기 세포의 총 수 및/또는 세포자멸 표지자 음성(-)인 상기 세포의 총 수이고, 여기서 세포자멸 표지자는 아넥신 V 또는 활성화된 카스파제 3이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 임의의 조성물에서, 조성물에서 T 세포의 총수(또는 재조합 수용체를 발현하는 조성물에서 T 세포의 총 수)의 적어도 (약) 또는 (약) 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 CCR7 및/또는 CD27에 대해 표면 양성이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 임의의 조성물에서, 조성물에서 T 세포의 총수(또는 재조합 수용체를 발현하는 조성물에서 T 세포의 총 수)의 적어도 (약) 또는 (약) 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 인터루킨 2(IL-2) 및/또는 TNF-알파로부터 선택된 사이토카인을 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 및/또는 TNF-알파를 생산할 수 있는 T 세포는 CD4+ T 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 임의의 조성물에서, 단위 용량에서 총 수용체+ 세포의 적어도 (약) 또는 (약) 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 또는 단위 용량에서 총 수용체+ 세포의 (약) 15% 내지 (약) 90%, (약) 20% 내지 (약) 80%, (약) 30% % 내지 (약) 70%, 또는 (약) 40% % 내지 (약) 60%(각 수치 포함)는 수용체+/CD8+/CCR7+ 또는 수용체+/CD8+/CD27+이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 임의의 조성물에서, 단위 용량에서 총 수용체+ 세포의 적어도 (약) 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 또는 단위 용량에서 총 수용체+ 세포의 (약) 15% 내지 (약) 90%, (약) 20% 내지 (약) 80%, (약) 30% % 내지 (약) 70%, 또는 (약) 40% % 내지 (약) 60%(각 수치 포함)는 수용체+/CD4+/CCR7+ 또는 수용체+/CD4+/CD27+이다. 일부 구현예에서, 단위 용량에서 총 수용체+ 세포의 적어도 (약) 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 또는 단위 용량에서 총 수용체+ 세포의 (약) 15% 내지 (약) 90%, (약) 20% 내지 (약) 80%, (약) 30% 내지 (약) 70%, 또는 (약) 40% 내지 (약) 60%(각 수치 포함)는 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+, 수용체+/CD8+/CCR7+/CD45RA-, 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD45RA-이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 임의의 조성물에서, 조성물 또는 단위 용량에서 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 (약) 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 또는 조성물 또는 단위 용량에서 총 수용체+/CD8+ 세포의 (약) 50% 내지 (약) 90%, (약) 60% 내지 (약) 90%, 또는 (약) 70% 내지 (약) 80%(각 수치 포함)는 수용체+/CD8+/CCR7+ 또는 수용체+/CD8+/CD27+, 또는 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 임의의 조성물에서, 조성물 또는 단위 용량에서 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 (약) 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 또는 조성물 또는 단위 용량에서 총 수용체+/CD4+ 세포의 (약) 50% 내지 (약) 90%, (약) 60% 내지 (약) 90%, (약) 70% 내지 (약) 80%(각 수치 포함)는 수용체+/CD4+/CCR7+ 또는 수용체+/CD4+/CD27+, 또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+, 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+, 수용체+/CD8+/CCR7+/CD45RA-, 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 또는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 조성물에서 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 (약) 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+이거나; 또는 조성물에서 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 (약) 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+이다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함), 재조합 수용체를 발현하는 총 CD8+ 세포(수용체+/CD8+ 세포) 또는 재조합 수용체를 발현하는 총 CD4+ 세포(수용체+/CD4+ 세포), 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 108개 이하, (약) 5 x 107개 이하, (약) 1 x 107개 이하, (약) 5 x 106개 이하, (약) 1 x 106개 이하, 또는 (약) 5 x 105개 이하의 총 수용체+/CD8+ 세포 또는 총 수용체+/CD4+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 수용체+/CD8+/CCR7+ 세포 대 수용체+/CD4+/CCR7+ 세포의 정의된 비를 포함하고, 이 비는 선택적으로 (대략) 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이이다.
일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107, 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함), 재조합 수용체를 발현하는 총 CD8+ 세포(수용체+/CD8+ 세포) 또는 재조합 수용체를 발현하는 총 CD4+ 세포(수용체+/CD4+ 세포), 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 1 x 108개 이하, (약) 5 x 107개 이하, (약) 1 x 107개 이하, (약) 5 x 106개 이하, (약) 1 x 106개 이하, 또는 (약) 5 x 105개 이하의 총 수용체+/CD8+ 세포 또는 총 수용체+/CD4+ 세포, 총 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포, 또는 총 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 수용체+/CD8+/CCR7+/CD27+ 세포 대 수용체+/CD4+/CCR7+/CD27+ 세포의 정의된 비를 포함하고, 이 비는 선택적으로 (대략) 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이이다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 정의된 수의 세포를 함유한 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용량, 예컨대 상기 정의된 수의 세포, 예컨대 CCR7+/CD4+, CCR7+/CD8+, CD27+/CD4+, CD27+/CD8+, CD45RA+/CD4+, CD45RA+/CD8+, CCR7-/CD4+, CCR7-/CD8+, CD27-/CD4+, CD27-/CD8+, CD45RA-/CD4+, CD45RA-/CD8+, CCR7+/CD27+/CD4+, CCR7+/CD27+/CD8+, CCR7+/CD45RA-/CD4+, CCR7+/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD45RA-/CD4+, CCR7-/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD27-/CD4+, 또는 CCR7-/CD27-/CD8+인 정의된 수의 CAR+ 세포는 (약) 5.0 x 106 내지 2.25 x 107, 5.0 x 106 내지 2.0 x 107, 5.0 x 106 내지 1.5 x 107, 5.0 x 106 내지 1.0 x 107, 5.0 x 106 내지 7.5 x 106, 7.5 x 106 내지 2.25 x 107, 7.5 x 106 내지 2.0 x 107, 7.5 x 106 내지 1.5 x 107, 7.5 x 106 내지 1.0 x 107, 1.0 x 107 내지 2.25 x 107, 1.0 x 107 내지 2.0 x 107, 1.0 x 107 내지 1.5 x 107, 1.5 x 107 내지 2.25 x 107, 1.5 x 107 내지 2.0 x 107, 또는 2.0 x 107 내지 2.25 x 107개이다. 일부 구현예에서, 상기 세포의 정의된 수와 같은 상기 용량은 투여된 조성물 내 총 재조합-수용체 발현 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 투여되는 정의된 수의 재조합 수용체-발현 세포는 세포자멸 표지자 음성(-)인 세포이고, 선택적으로 상기 세포자멸 표지자는 아넥신 V 또는 활성화된 카스파제 3이다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 세포의 용량은 적어도 (약) 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 10 x 106 및 약 15 x106개 사이의 재조합 수용체 발현 세포, 예컨대 CCR7+/CD4+, CCR7+/CD8+, CD27+/CD4+, CD27+/CD8+, CD45RA+/CD4+, CD45RA+/CD8+, CCR7-/CD4+, CCR7-/CD8+, CD27-/CD4+, CD27-/CD8+, CD45RA-/CD4+, CD45RA-/CD8+, CCR7+/CD27+/CD4+, CCR7+/CD27+/CD8+, CCR7+/CD45RA-/CD4+, CCR7+/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD45RA-/CD4+, CCR7-/CD45RA-/CD8+, CCR7-/CD27-/CD4+, 또는 CCR7-/CD27-/CD8+인 및/또는 세포자멸 표지자 음성(-)이고 CD8+인 재조합 수용체 발현 세포의 세포 수, 예컨대 정의된 세포 수를 함유하고, 선택적으로 상기 세포자멸 표지자는 아넥신 V 또는 활성화된 카스파제 3이다.
일부 구현예에서, 세포의 일정 용량이 제공된 방법,및/또는 제공된 제조품 또는 조성물에 부합되게 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 크기 또는 투여 시기는 대상체에서 특정 질병 또는 병태에 대한 작용으로서 알아낸이다. 일부 경우에, 제공된 기재의 관점에서 특정 질병에 대한 용량의 크기 또는 투여 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 2 x 105개 세포/kg 내지 (약) 2 x 106개 세포/kg, 예컨대 (약) 4 x 105개 세포/kg 내지 (약) 1 x 106개 세포/kg 또는 (약) 6 x 105개 세포/kg 내지 (약) 8 x 105개 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 대상체 체중 1 킬로그램당 2 x 105개 이내의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 (약) 3 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 4 x 10 5개 이내의 세포/kg, (약) 5 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 6 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 7 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 8 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 9 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 1 x 106개 이내의 세포/kg 또는 (약) 2 x 106개 이내의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 대상체의 체중 1 킬로그램당 적어도 (약) 또는 (약) 2 x 105개의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 적어도 (약) 또는 (약) 3 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 4 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 5 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 6 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 7 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 8 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 9 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 1 x 106개 세포/kg, 또는 적어도 (약) 또는 (약) 2 x 106개 세포/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 또는 세포의 아형의 개별 집단은 (약) 10만 내지 (약) 1000억 세포의 범위로 및/또는 대상체의 체중 1kg당 세포의 양으로, 예컨대, 예를 들어, (약) 10만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), (약) 1백만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), 예컨대 (약) 1천만 내지 (약) 1000억 세포(예를 들어, (약) 2천만 세포, (약) 3천만 세포, (약) 4천만 세포, (약) 6천만 세포, (약) 7천만 세포, (약) 8천만 세포, (약) 9천만 세포, (약) 100억 세포, (약) 250억 세포, (약) 500억 세포, (약) 750억 세포, (약) 900억 세포 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위) 및 일부 경우에 (약) 1억 세포 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 1억2천만 세포, (약) 2억5천만 세포, (약) 3억5천만 세포, (약) 4억 5천만 세포, (약) 6억5천만 세포, (약) 8억 세포, (약) 9억 세포, (약) 30억 세포, (약) 300억 세포, (약) 450억 세포) 또는 상기 범위 사이의 임의의 수치 및/또는 대상체의 체중 1kg당 세포의 양으로 대상체에 투여된다. 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료의 구체적인 속성에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 세포의 용량이 대상체의 체표면적 또는 체중에 결부되거나 그에 기초하지 않도록 하는 세포의 균일한 용량 또는 세포의 고정된 용량이다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우에, 용량은 약 5 x 108개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 상기 세포 수 범위내에서, 예컨대, (약) 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108 또는 5 x 108개의 총 상기 세포 수의 범위내에서, 또는 전술한 수치들 중 임의의 두 개 수치 사이의 범위내에서 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우에, 용량은 (약) 1 x 106개 초과의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 (약) 2 x 109개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.2 x 109개의 상기 세포 수 범위내, 예컨대, (약) 2.5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포의 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, 또는 (약) 2.5 x 108 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포의 용량은 (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.5 x 108개의 총 CAR-발현 세포, 예컨대 (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포의 용량은 적어도 (약) 1 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1.5 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 108개의 CAR-발현 세포, 또는 적어도 (약) 5 x 108개의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 적어도 (약) 1 x 105개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 예컨대 적어도 (약) 1 x 106개, 적어도 (약) 1 x 107개, 적어도 (약) 1 x 108개의 상기 세포의 수를 포함하는 세포의 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+, 일부 경우에 또한 재조합 수용체-발현(예를 들어, CAR+) CD3+ 또는 CD8+ 세포의 총 수를 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD4+ 및 CD8+, 일부 경우에 재조합 수용체-발현(예를 들어, CAR+) CD4+ 및 CD8+ 세포의 총 수를 기준으로 한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107개의(각 수치 포함) CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108개의 CD4+ 및 CD8+ 총 T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107개의 CD4+ 및 CD8+ 총 T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107개의(각 수치 포함) CD4+ 및 CD8+ 총 T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108개의 총 CD4+/CAR+ 및 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107개의 총 CD4+/CAR+ 및 CD8+/CAR+ 세포 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 CD4+/CAR+ 및 CD8+/CAR+ 세포의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 용량에 포함된 용량의 CD8+ T 세포는 (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 CD8+ 세포, 예를 들어, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 상기 세포의 범위내, 예컨대 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량을 투여받고, 각각의 용량 또는 총 용량은 전술한 수치들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1 x 107 내지 (약) 0.75 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 0.25 x 108개의(각 수치 포함) 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 2.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 용량에 포함된 용량의 CD4+ T 세포는 (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 CD4+ 세포, 예를 들어, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 상기 세포의 범위내, 예컨대 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량을 투여받고, 각각의 용량 또는 총 용량은 전술한 수치들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1 x 107 내지 (약) 0.75 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 0.25 x 108개의(각 수치 포함) 총 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 2.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD4+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 T 세포의 용량이 단일 용량으로 대상체에 투여되거나 2주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 이상의 기간 내에 1회만 투여된다.
입양 세포 요법의 맥락에서, 주어진 “용량(dose)”의 투여는 단일 조성물 및/또는 단일 비중단 투여, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입으로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄하며, 또한 다중 개별 조성물 또는 주입제로 제공된 경우 명시된 기간에 걸쳐, 예컨대 3일 이내에 걸쳐 분할된 용량 또는 복수의 조성물로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄한다. 따라서, 일부 맥락에서, 용량은 단일 시점에서 주어진 또는 개시된, 명시된 세포 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 맥락에서, 용량은 3일 동안 또는 2일 동안 하루에 한 번 또는 하루의 기간에 걸쳐 다중 주입에 의한 것과 같이 3일 이내의 기간에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 용량의 세포는 단일 약학 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 세포는 총체적으로 용량의 세포를 함유하는 복수의 조성물로 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 “분할 용량(split dose)”은 1일을 초과하는 기간에 걸쳐 투여되도록 분할된 용량을 지칭한다. 상기 유형의 투약은 본 방법에 포괄되고 단일 용량으로 간주된다.
따라서, 세포의 용량은 분할 용량, 예를 들어, 시간에 걸쳐 투여되는 분할 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용량은 2일 또는 3일에 걸쳐 대상체에 투여될 수 있다. 분할 투약에 대한 예시적인 방법은 첫 날에 용량의 25%를 투여하고 두 번째 날에 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예들에서, 용량의 33%가 첫 날에 투여되고 두 번째 날에 나머지 67%가 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 용량의 10%가 첫 날에 투여되고, 용량의 30%가 두 번째 날에 투여되며, 용량의 60%가 셋째 날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 3일을 초과하는 기간에 걸쳐 나뉘지는 않는다.
일부 구현예에서, 용량의 세포는 복수의 조성물 또는 용액, 예컨대 제1 및 제2, 선택적으로 그 이상의 투여로 투여될 수 있고, 각각은 용량의 세포를 일부 함유한다. 일부 측면에서, 각각이 상이한 세포들의 집단 및/또는 아형을 함유하는 복수의 조성물이 개별적으로 또는 독립적으로, 선택적으로 특정 기간 내에 투여된다. 예를 들어, 세포들의 집단 및/또는 아형은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 각각 CD8+ 및 CD4+-농축된 집단, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있고, 각각은 개별적으로 재조합 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 용량 또는 CD4+ T 세포의 용량을 포함하는 제1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 용량을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 용량의 투여, 예를 들어, 복수의 세포 조성물의 투여는 세포 조성물들의 개별 투여를 수반한다. 일부 측면에서, 개별 투여는 동시에, 또는 순차적으로 임의의 순서로 수행된다. 일부 구현예에서, 용량은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 제1 조성물 및 제2 조성물은 0 내지 12시간 간격, 0 내지 6시간 간격 또는 0 내지 2시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 시작 및 제2 조성물의 투여 시작은 2시간 이내, 1시간 이내 또는 30분 이내의 간격, 15분 이내, 10분 이내 또는 5분 이내의 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 시작 및/또는 완료 및 제2 조성물의 투여 시작 및/또는 완료는 2시간 이내, 1시간 이내 또는 30분 이내의 간격, 15분 이내, 10분 이내 또는 5분 이내의 간격으로 수행된다.
일부 구현예에서, 제1 조성물, 예를 들어, 용량의 제1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조성물, 예를 들어, 용량의 제1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 조성물, 예를 들어, 용량의 제2 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 조성물, 예를 들어, 용량의 제2 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포들의 용량 또는 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포 및/또는 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 정의된 비 또는 표적 비를 포함하고, 상기 비는 선택적으로 대략 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이, 예컨대 대략 1:1이다. 일부 측면에서, 표적 비 또는 원하는 비의 상이한 세포의 집단(예컨대 CD4+:CD8+ 비 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비, 예를 들어, 1:1)을 갖는 조성물 또는 용량의 투여는 집단들 중 하나를 함유하는 세포 조성물의 투여 후 집단들 중 다른 하나를 포함하는 별도의 세포 조성물의 투여를 수반하고, 상기 투여는 표적 비 또는 원하는 비이거나 대략적인 표적 비 또는 원하는 비로 수행된다. 일부 측면에서, 정의된 비로 세포들의 용량 또는 조성물의 투여는 T 세포 요법의 증폭, 지속성 및/또는 항종양 활성의 향상으로 이어진다.
일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 용량, 예를 들어 두 개 이상의 용량 또는 다중 연속 용량을 투여받는다. 일부 구현예에서, 두 개의 용량이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 연속 용량, 예를 들어 제2 용량을 투여받는데, 이는 제1 용량 후 대략 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일에 투여된다. 일부 구현예에서, 다중 연속 용량은 제1 용량 후에 투여되어, 추가 용량 또는 용량들이 연속 용량의 투여 후에 투여되도록 한다. 일부 측면에서, 추가 용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제1 용량 및/또는 연속 용량과 동일하거나 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들은 선행 용량들보다 더 크다.
일부 측면에서, 제1 및/또는 연속 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학 요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 알아낸이다.
일부 측면에서, 제1 용량의 투여와 연속 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35일, 약 14 내지 약 28일 또는 15 내지 27일이다. 일부 구현예에서, 연속 용량의 투여는 제1 용량의 투여 후 약 14일 초과 및 약 28일 미만의 시점에 수행한다. 일부 측면에서, 제1 용량 및 연속 용량 사이 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들, 예를 들어, 연속 용량들이 연속 용량의 투여 후 투여된다. 일부 측면에서, 추가 연속 용량 또는 용량들은 선행 용량의 투여 후 적어도 약 14일 이상 내지 약 28일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 용량은 선행 용량 후 약 14일 미만에, 예를 들어, 선행 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13일에 투여된다. 일부 구현예에서, 선행 용량 후 약 14일 미만에 및/또는 선행 용량 후 약 28일 초과하여 어떤 용량도 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체 발현 세포의 용량은 제1 용량의 T 세포 및 연속 용량의 T 세포를 포함한 제2 용량(예를 들어, 2배 용량)을 포함하며, 여기서 제1 용량 및 제2 용량 중 하나 또는 둘 모두는 T 세포의 분할 용량 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 일반적으로 질병 부담을 감소시키는 데 효과적일 만큼 충분히 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되며, 이는 일부 측면에서 원하는 세포의 용량 수 또는 세포 유형(들) 및/또는 세포 유형의 원하는 비를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 투여량은 세포의 총 수(또는 체중 1kg당 수) 및 개별 집단 또는 아형의 원하는 비, 예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비에 기초한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 개별 집단 내 세포 또는 개별 세포 유형의 원하는 총 수(또는 체중 1kg당 수)에 기초한다. 일부 구현예에서, 투여량은 개별 집단에서 원하는 총 세포의 수, 원하는 비 및 원하는 세포의 총 수와 같은 상기 특징들의 조합에 기초한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 아형의 세포는 원하는 T 세포의 용량과 같이 원하는 총 세포의 용량의 허용된 차이로 또는 허용된 차이 내로 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 원하는 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 세포 수, 예를 들어 세포 수/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 최소 세포 수 또는 체중 단위당 최소 세포 수 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여되는 총 세포 중, 개별 집단 또는 하위 유형은 원하는 산출 비(예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비)로 또는 부근의 비로, 예를 들어 상기 비의 특정 허용된 차이 또는 오차 내로 존재한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 용량과 같은 하나 이상의 개별 세포 집단 또는 아형의 세포의 원하는 용량의 허용된 차이 또는 차이 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 원하는 하위 유형 또는 집단의 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 상기 세포 수, 예를 들어 세포 수/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 아형의 최소 세포 수 또는 체중 단위당 집단 또는 아형의 최소 세포 수 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 용량 및 원하는 비에 기초하고/거나 개별 아형들 또는 하위 집단들 중 하나 이상, 예를 들어 각각의 원하는 고정 용량에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정 또는 최소 용량 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비에 기초하고/거나 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정 또는 최소 용량에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 아형과 같은 다중 세포 집단 또는 아형의 원하는 산출 비의 허용된 범위로 또는 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있거나 비들의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 원하는 비(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비)는 (약) 1:5 내지 (약) 5:1(또는 약 1:5 초과 내지 약 5:1 미만), 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1(또는 약 1:3 초과 내지 약 3:1 미만), 예컨대 (약) 2:1 내지 (약) 1:5(또는 약 1:5 초과 내지 약 2:1 미만), 예컨대 (약) 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용된 차이는 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%(상기 범위들 사이의 임의의 수치 포함) 이내이다.
구체적인 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포의 수를 지칭한다. 다른 구현예들에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여되는 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 지칭한다.
일부 측면에서, 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학 요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 병기(stage) 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 알아낸이다. 일부 구현예에서, 용량의 크기는 예측되는 산출 세포 조성물 속성에 기초하여 알아낸이다. 상기 구현예들 중 일부에서, 용량은 미리 정해진 용량 및/또는 미리 정해진 양생법일 수 있다. 일부 구현예에서, 용량의 크기, 용량의 농도, 및/또는 용량을 투여하는 빈도는 양성 임상 결과(예를 들어, 반응)를 달성하기 위해 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 용량 크기, 농도, 및/또는 투여 빈도를 변경하면 미리 정해진 용량 및/또는 치료 계획이 변경되게 된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포 및/또는 림프구 고갈 요법의 하나 이상의 추가 용량을 투여하는 단계를 포함하고/거나 본 방법의 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 상이하며, 예를 들어, 초기 용량보다 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상만큼 더 높거나, 초기 용량보다, 예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상만큼 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의의 선행 치료에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 병기 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 알아낸이다.
Ⅱ. 조작된 T 세포 생성 방법
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물에 대한 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 방법 또는 치료 전에 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 반응을 알아내는 방법은 재조합 단백질, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 등의 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포(예를 들어, 산출 조성물), 예컨대 조작된 CD4+ T 세포 및/또는 조작된 CD8+ T 세포의 치료용 조성물을 생성하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 세포 요법의 제조, 생성, 또는 생산과 관련하여 사용되며, 추가 가공 단계, 예컨대 세포의 단리, 분리, 선택, 활성화 또는 자극, 형질도입, 세척, 현탁, 희석, 농축 및/또는 제형화를 위한 단계와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어 조작된 CD4+ T 세포 및/또는 조작된 CD8+ T 세포를 생성 또는 생산하는 방법은 대상체로부터 세포를 단리, 세포를 준비, 가공, 자극 조건에서 인큐베이션, 및/또는 조작(예를 들어, 형질도입)하는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 다음과 같은 순서로 수행되는 가공 단계들―투입 세포(예를 들어, 1차 세포)가 생물학적 샘플로부터 우선 단리되고, 예컨대 선택 또는 분리되고; 투입 세포가 자극 조건에서 인큐베이션되고, 벡터 입자(예를 들어, 바이러스 벡터 입자)로 세포 내로 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하도록, 예를 들어 형질도입 또는 형질주입에 의해 조작되고; 조작된 세포(예를 들어, 형질도입된 세포)를 육성하고, 예컨대 세포를 증폭하고; 채집하고, 수확하고 및/또는 산출 조성물로 세포를 제형화하기 위해 용기를 세포의 전부 또는 일부로 채움―을 포함한다. 일부 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 서로 독립적으로, 예를 들어, 개별 투입 조성물에서 제조되지만, 제조를 위한 공정은 동일한 가공 단계들을 포함한다. 일부 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 함께, 예를 들어 동일한 투입 조성물에서 제조된다. 일부 구현예에서, 선택된 세포(예를 들어, 투입 조성물)의 특징들이 결정되고 본원에 제공된 기계 학습 모델, 예를 들어, 랜덤 포레스트 모델, 랜덤 생존 포레스트 모델에 투입으로 사용된다.
일부 구현예에서, 생성된 산출 조성물(예를 들어, 치료용 세포 조성물)의 세포는 냉동 보존 전 또는 후에, 동일한 대상체로 재도입된다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물의 조작된 세포의 특징들이 결정되고 본원에 제공된 기계 학습 모델, 예를 들어, 랜덤 포레스트 모델, 랜덤 생존 포레스트 모델에 투입으로 사용된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 산출 조성물(예를 들어, 치료용 세포 조성물)은 어떤 요법(예를 들어, 자가 세포 요법)에 사용하기에 적합하다. 예시적인 제조 방법은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/089855]에 기술되어 있으며, 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
A. 샘플 및 세포 준비
구체적인 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 세포(예를 들어, T 세포)의 하나 이상의 투입 조성물을 생성하기 위해 생물학적 샘플에서 세포를 단리, 선택, 및/또는 농축하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 특정 질병 또는 병태를 갖거나 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체 등의 대상체로부터 수득되거나 유래된 것과 같은 생물학적 샘플로부터 세포 또는 이의 조성물의 단리를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료될 대상체의 (예를 들어 위의 섹션 I-A 및 I-A.1에 기술된 바와 같은) 특징들이 결정되거나 획득되고 본원에 제공된 기계 학습 모델에 투입으로 사용된다. 일부 측면에서, 대상체는 입양 세포 요법(이를 위해 세포가 단리, 가공 및/또는 조작됨)과 같은 특정한 치료적 개입이 필요한 환자인 대상체와 같은 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플은 대상체에서 직접 채취한 조직, 체액 및 기타 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 기관 샘플(이들로부터 유래된 가공 샘플 포함)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나 또는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 생성물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 창자, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 기타 기관 및/또는 이들로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플에는 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법의 맥락에서 자가 및 동종이계 공급원으로부터 유래된 샘플이 포함된다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액 유래 세포는 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 채집된 혈액 세포는, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척된다. 일부 구현예에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 “플로우-쓰루(flow-through)” 원심 분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)로 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca++/Mg++이 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 이 세포는 배양 배지에서 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 준비 방법은 단리, 선택 및/또는 농축 및/또는 형질도입 및 조작을 위한 인큐베이션 전 또는 후에, 및/또는 조작된 세포의 육성 및/또는 수확 후에 세포를 동결, 예를 들어, 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 이후에 동결 용액에서 현탁된다. 일부 측면에서, 알려진 임의의 다양한 동결 용액 및 매개변수가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 최종 농도가 (약) 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5%, 또는 5.0% DMSO, 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10%, 또는 6% 내지 8% DMSO인 배지 및/또는 용액에서 동결(예를 들어, 극저온 동결 또는 냉동 보존)된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 최종 농도가 (약) 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5%, 또는 0.25% HSA, 또는 0.1% 내지 -5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2% HSA인 배지 및/또는 용액에서 동결(예를 들어, 극저온 동결 또는 냉동 보존)된다. 일 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 이어서, 상기를 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지와 1:1로 희석시킨다. 이어서 세포를 일반적으로 분당 (약) 1°의 속도로 (약) -80℃까지 동결시키고 액체 질소 저장 탱크에 기체상(vapor phase)으로 저장한다.
일부 구현예에서, 세포 또는 집단의 단리는 하나 이상의 준비 단계 및/또는 비친화도 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예에서, 세포는 예를 들어 원치 않는 성분의 제거, 원하는 성분의 농축, 특정 시약에 민감한 세포를 용해하거나 제거하기 위해, 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션된다. 일부 예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감도 및/또는 내성에 기초하여 분리된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해시켜 말초 혈액으로부터 백혈구의 준비 및 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 선택 시약과 함께 세포의 인큐베이션을 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 상이한 세포 유형의 선택을 위한 하나 이상의 선택 시약을 이용하여 수행될 수 있는 선택 방법의 일부로서 선택 시약 또는 시약들과의 인큐베이션은 하나 이상의 특정 분자, 예컨대 표면 표지자, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 표지자 또는 핵산의 세포 내 또는 세포 상 발현 또는 존재에 기초한다. 일부 구현예에서, 상기 표지자에 기초한 분리를 위한 선택 시약 또는 시약들을 사용하는 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약들은 친화도 또는 면역 친화도 기반 분리인 분리를 초래한다. 예를 들어, 일부 측면에서 선택은 하나 이상의 표지자, 통상적으로 세포 표면 표지자의 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 예를 들어 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션 후 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포와 항체 또는 결합 파트너와 결합한 세포의 분리에 의한 세포 및 세포 집단의 분리를 위한 시약 또는 시약들과의 인큐베이션을 포함한다.
이러한 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포를 일정량의 원하는 친화도 기반 선택 시약과 혼합한다. 면역 친화도 기반 선택은 분리되는 세포와, 세포 상의 표지자, 예를 들어 고체 표면, 예를 들어 입자 상의 항체 또는 기타 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 분자 간의 양호하고 활발한 상호작용을 초래하는 임의의 시스템 또는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 세포의 표지자에 특이적인 선택제(예를 들어, 항체)로 코팅된, 비드(예를 들어, 자성 비드)와 같은 입자를 사용하여 수행된다. 입자(예를 들어, 비드)는 일정한 세포 밀도 대 입자(예를 들어, 비드) 비로 진탕하거나 혼합하면서 튜브나 백과 같은 용기에서 세포와 인큐베이션 또는 혼합되어 양호한 상호작용의 활발한 촉진을 도울 수 있다. 다른 경우에, 본 방법은 선택의 전부 또는 일부가 원심분리 챔버의 내부 공동에서 예를 들어, 원심분리 회전 하에서 수행되는 세포의 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 친화도 기반 선택 시약과 같은 선택 시약과 함께 세포의 인큐베이션이 원심분리 챔버에서 수행된다. 특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1]에 기술된 시스템, 디바이스 또는 장치를 이용하여 수행된다. 일 예에서, 시스템은 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 상기 선택 단계 또는 이의 일부(예를 들어, 항체 코팅된 입자, 예를 들어 자성 비드와의 인큐베이션)를 원심분리 챔버의 공동에서 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피, 가공 중 용액의 첨가 및 이의 타이밍과 같은 특정 매개변수를 제어할 수 있으며, 이는 다른 이용 가능한 방법에 비해 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 인큐베이션 중 공동의 액체 부피를 감소시키는 능력은 선택에 사용되는 입자(예를 들어, 비드 시약)의 농도를 증가시킬 수 있어서 공동 내 세포의 총 수에는 영향을 주지 않고 용액의 화학적 전위를 증가시킬 수 있다. 이는 결국 가공되는 세포와 선택에 사용되는 입자 사이의 쌍방향 상호작용을 증진할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 시스템, 회로 및 제어와 연관된 경우, 챔버에서의 인큐베이션 단계 수행은 사용자가 인큐베이션 중에 원하는 시간에 용액의 교반을 실행할 수 있게 하고, 이는 또한 상호작용을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 원심분리 챔버에서 수행되고, 이는 세포와 선택 시약의 인큐베이션을 포함한다. 상기 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포를 제조 업체의 지침에 따라 동일한 수의 세포 및/또는 동일한 부피의 세포의 선택을 위해 튜브 또는 용기에서 유사한 선택을 수행할 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 원하는 친화도 기반 선택 시약과 혼합한다. 일부 구현예에서, 제조사의 지침에 따라 동일한 수의 세포 및/또는 동일한 부피의 세포에 대해 튜브 또는 용기 기반 인큐베이션에서 세포의 선택을 위해 사용되는 동일한 선택 시약(들)의 양의 5% 이내, 10% 이내, 15% 이내, 20% 이내, 25% 이내, 50% 이내, 60% 이내, 70% 이내 또는 80% 이내 양의 선택 시약 또는 시약들의 양이 사용된다.
일부 구현예에서, 세포의 선택, 예를 들어 면역 친화도 기반 선택을 위해, 세포는 챔버의 공동에서 선택 시약, 예컨대 농축 및/또는 고갈을 원하는 세포 상의 표면 표지자에는 특이적으로 결합하나, 항체와 같은 조성물 중의 다른 세포 상의 표면 표지자에는 특이적으로 결합하지 않는 분자(이는 선택적으로 중합체 또는 표면과 같은 스캐폴드, 예를 들어 비드, 예를 들어 자성 비드, 예컨대 CD4 및 CD8에 대해 특이적인 단클론 항체에 결합된 자성 비드에 결합됨)와 함께 선택 완충제를 또한 함유하는 조성물 내에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 기술된 바와 같이, 선택이 진탕되거나 회전하는 튜브에서 수행될 경우 같은 수의 세포 또는 같은 부피의 세포와 대략 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하기 위해 통상적으로 사용되거나 필요한 선택 시약의 양과 비교하여 실질적으로 보다 적은 양(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이내의 양)으로 챔버의 공동에 있는 세포에 선택 시약을 첨가한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 예를 들어 10mL 내지 200mL, 예컨대 적어도 (약) 또는 약 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL의 시약의 인큐베이션 표적 부피를 달성하기 위해 세포에 선택 완충제 및 선택 시약을 첨가하고 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 세포에 첨가되기 전에 미리 혼합된다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 세포에 개별적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 선택 인큐베이션은 주기적으로 부드럽게 혼합하는 조건으로 수행되며, 이는 양호한 상호작용을 활발하게 촉진하는 데 도움이 될 수 있으며, 이로써 높은 선택 효율을 달성하면서 전반적으로 선택 시약을 보다 적게 사용하는 것이 가능할 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 시약을 이용한 인큐베이션의 총 기간은 5분 내지 6시간 또는 약 5분 내지 약 6시간, 예컨대 30분 내지 3시간, 예를 들어 적어도 (약) 30분, 60분, 120분 또는 180분이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 일반적으로 스피닝(spinning)이 존재하는 것과 같은 혼합하는 조건 하에서 수행되며, 일반적으로 이는 상대적으로 낮은 힘 또는 속도, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 600rpm 내지 1700rpm 또는 약 600rpm 내지 약 1700rpm(예를 들어, (약) 또는 적어도 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm)에서, 예컨대 80g 내지 100g 또는 약 80g 내지 약 100g(예를 들어, (약) 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)의 챔버 또는 다른 용기의 벽 또는 샘플에서 RCF로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀은 상기와 같은 낮은 속도의 스핀과 이어지는 휴지 기간(rest period), 예컨대 스핀 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10초 동안의 휴지, 예컨대, 대략 1 또는 2초의 스핀과 이어지는 대략 5, 6, 7 또는 8초 동안의 휴지의 구간을 반복하여 수행된다.
일부 구현예에서, 이러한 공정은 챔버와 일체형인 완전 폐쇄 시스템 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본 공정(및 일부 측면에서 또한 하나 이상의 추가 단계, 예컨대 성분채집술 샘플과 같은 세포를 함유하는 샘플을 세척하는 사전 세척 단계)은 자동화된 방식으로 수행되어, 자동화 프로그램을 이용하여 단일 폐쇄 시스템에서 세척 및 결합 단계를 완료하기 위해 세포, 시약 및 기타 성분이 적절한 시간 및 원심분리 달성 시점에 챔버로 유입되고 챔버 밖으로 밀어내어진다.
일부 구현예에서, 세포 및 선택 시약 및/또는 시약들의 인큐베이션 및/또는 혼합 후, 인큐베이션된 세포는 특정 시약 또는 시약들의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 선택하기 위한 분리를 거친다. 일부 구현예에서, 분리는 선택 시약과 세포의 인큐베이션이 수행된 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 시약과 함께 인큐베이션 후, 선택 시약이 결합된 세포를 포함한 인큐베이션된 세포는 세포의 면역 친화도 기반 분리를 위한 시스템으로 전달된다. 일부 구현예에서, 면역 친화도 기반 분리를 위한 시스템은 자성 분리 컬럼이거나 이를 함유한다.
상기 분리 단계는 시약, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 시약, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않는 세포가 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어서, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 표지자에 기초하여 가장 잘 수행된다.
일부 구현예에서, 공정 단계들은 예컨대 친화도 기반 선택을 수행할 수 있는 시스템 또는 장치를 사용하여 수행되는 인큐베이션된 세포의 음성 및/또는 양성 선택을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축, 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 발현(표지자+)되거나 상대적으로 보다 높은 수준으로 발현(표지자high)된 하나 이상의 표면 표지자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다. 동일한 선택 단계, 예를 들어 양성 또는 음성 선택 단계의 다수 라운드가 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 양성 또는 음성으로 선택된 분획은 예컨대 양성 또는 음성 선택 단계를 반복함으로써, 선택을 위한 공정을 거친다. 일부 구현예에서, 선택은, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 9회를 초과하여 반복된다. 특정 구현예에서, 동일한 선택이 최대 5회까지 수행된다. 특정 구현예에서, 동일한 선택 단계가 3회 수행된다.
분리는 특정 표지자를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거로 귀결될 필요는 없다. 예를 들어, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 상기 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하나, 상기 표지자를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재로 귀결될 필요는 없다. 마찬가지로, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 상기 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하나, 상기 모든 세포의 완전한 제거로 귀결될 필요는 없다.
일부 예에서, 다수 라운드의 분리 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예컨대 각각 음성 선택을 위해 표적화된 표지자에 대해 특이적인 다수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 표지자를 발현하는 세포들을 동시에 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 세포 유형이 동시에 양성 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 분리 단계는 1회를 초과하여 반복 및/또는 수행된다. 일부 구현예에서, 분리 단계의 결과로 양성 또는 음성으로 선택된 분획은 예컨대 양성 또는 음성 선택 단계를 반복함으로써, 동일한 분리 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 단일 분리 단계는 예를 들어 양성으로 선택된 세포의 수율을 증가시키기 위해, 음성으로 선택된 세포의 순도를 증가시키기 위해, 및/또는 음성으로 선택된 분획으로부터 양성으로 선택된 세포를 추가로 제거하기 위해, 1회를 초과하여 반복 및/또는 수행된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 분리 단계는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 또는 10회를 초과하여 수행 및/또는 반복된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 1회 내지 10회, 1회 내지 5회, 또는 3회 내지 5회 사이로 수행 및/또는 반복된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 3회 반복된다.
예를 들어, 일부 측면에서, 예컨대 하나 이상의 표면 표지자를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포와 같은 T 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 선택을 달성하기 위해 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 예컨대 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander, 및/또는 ExpACT® 비드)를 사용하여 양성 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단핵구 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14와 같은 비-T 세포 상에서 발현되는 표지자의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브(naive), 기억 및/또는 효과기(effector) T 세포 하위 집단 상에서 발현되거나 상대적으로 보다 높은 정도로 발현되는 표지자에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 예컨대 각각의 하위 집단과 연관된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중심 기억, 효과기 기억 및/또는 중심 기억 줄기세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포의 농축은 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후의 장기간 생존, 증폭 및/또는 생착을 향상하기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 상기 하위 집단에서 특히 견고하다. 문헌[Terakura et 등, (2012) Blood.1:72-82; Wang 등 (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 더욱 증진한다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해 농축되거나 고갈될 수 있다.
일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 고도의 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중심 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행되며, 이는 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택, 및 CD62L에 기초한 양성 선택을 거친다.
상기 선택은 일부 측면에서 동시에 수행되고 다른 측면에서 순차적으로 어떠한 순서로든 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ T 세포 집단 또는 하위 집단을 준비하는 데 사용된 동일한 CD4 발현 기반 선택 단계가 CD4+ T 세포 집단 또는 하위 집단을 생성하는 데 또한 사용되어, CD4 기반 분리로부터 유래된 양성 및 음성 분획 모두가 유지되고 선택적으로 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계 후에 방법의 후속 단계들에서 사용된다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포 집단에 대한 선택 및 CD8+ T 세포 집단에 대한 선택은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포 집단에 대한 선택 및 CD8+ T 세포 집단에 대한 선택은 어느 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 세포를 선택하는 방법은 문헌[미국 출원 공개 번호 US20170037369]에 기술된 바와 같은 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 CD4+ T 세포 집단 및 선택된 CD8+ T 세포 집단은 선택 단계 후 결합될 수 있다. 일부 측면에서, 선택된 CD4+ T 세포 집단 및 선택된 CD8+ T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같은 생물반응기 백에서 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 CD4+ T 세포 집단 및 선택된 CD8+ T 세포 집단은 개별적으로 가공되고, 그럼으로써 선택된 CD4+ T 세포 집단은 CD4+ T 세포로 농축되어 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)과 인큐베이션되고, 재조합 단백질(예를 들어, CAR)을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입되고 T 세포를 증폭시키기 위한 조건 하에서 육성되며, 선택된 CD8+ T 세포 집단은 CD8+ T 세포로 농축되어 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)과 인큐베이션되고, 동일한 공여체로부터 유래한 CD4+ T 세포를 조작하기 위한 것과 동일한 재조합 단백질 등의 재조합 단백질(예를 들어, CAR)을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입되고 예컨대 제공된 방법에 따라 T 세포를 증폭하기 위한 조건 하에서 육성된다.
구체적인 구현예에서, 생물학적 샘플, 예를 들어 PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은 음성 및 양성 분획 모두가 유지되는 CD4+ T 세포의 선택을 거친다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포가 음성 분획으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 음성 및 양성 분획 모두가 유지되는 CD8+ T 세포의 선택을 거친다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포가 음성 분획으로부터 선택된다.
구체적인 일 예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은 음성 및 양성 분획이 모두 유지되는 CD4+ T 세포의 선택을 거친다. 이어서 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L 또는 CCR7과 같은 중심 기억 T 세포의 표지자 특성에 기초한 양성 선택을 거치고, 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든 수행된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별하여 나이브, 중심 기억 및 효과기 세포로 분류될 수 있다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ 또는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 CD4+ T 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 효과기 CD4+ T 세포는 CD62L- 및 CD45RO- 이다.
일 예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ T 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리가 가능하도록 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(또는 자성친화도) 분리 기법을 사용하여 분리되거나 단리된다(문헌[Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ]에서 검토됨).
일부 측면에서, 분리될 세포의 인큐베이션된 샘플 또는 조성물은 작고, 자화 가능하거나 또는 자성 반응성 재료, 예컨대 자성 반응성 입자 또는 미세입자, 예컨대 상자성 비드(예를 들어, Dynalbeads 또는 MACS® 비드)를 함유하는 선택 시약과 함께 인큐베이션된다. 자성 반응성 재료(예를 들어, 입자)는 일반적으로 분리하기를 원하는, 예를 들어 음성 또는 양성 선택하기를 원하는 세포, 세포들 또는 세포 집단에 존재하는 분자(예를 들어, 표면 표지자)에 특이적으로 결합하는 결합 파트너(예를 들어, 항체)에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특이적인 결합 멤버에 결합되는 자성 반응성 재료를 포함한다. 자성 분리 방법에 사용할 알려진 많은 자성 반응성 재료는 알려져 있으며, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌[Molday, 미국 특허 번호 4,452,773, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B]에 기술된 것들이 있다. 문헌[Owen 미국 특허 번호 4,795,698 및 Liberti 등, 미국 특허 번호 5,200,084]에 기술된 것과 같은 콜로이드 크기의 입자가 사용될 수도 있다.
인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 예컨대 자성 입자 또는 비드에 부착된 상기 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다.
특정 구현예에서, 자성 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 표지자에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적 2차 항체- 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘 코팅된 자성 입자는 비오티닐화 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 측면에서, 분리는 샘플이 자기장에 배치되는 절차로 달성되고, 이에 부착된 자성 반응성 또는 자화 가능 입자를 갖는 상기 세포는 자석에 끌려당겨지고 표지되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택의 경우, 자석에 끌려당겨진 세포가 유지되고; 음성 선택의 경우, 끌려당겨지지 않은 세포(비표지 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합이 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 상기 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가적으로 가공되거나 추가적인 분리 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 친화도 기반 선택은 자성 활성화 세포 분류(magnetic-activated cell sorting, MACS)(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 통한 것이다. 자성 활성화 세포 분류(MACS), 예를 들어, CliniMACS 시스템은 자화된 입자가 부착되어 있는 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 외부 자기장을 가한 후에 비 표적 종 및 표적 종(species)이 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포는 제자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종은 용리된다. 이어서, 이 제1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되어 용리가 방지된 종들은 용리 및 회수될 수 있도록 상당한 방식으로 해제된다. 특정 구현예에서, 비 표적 세포는 표지되고 이종 세포의 집단으로부터 고갈된다.
일부 구현예에서, 자성 반응성 입자는 후속적으로 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착되어 남아있고; 일부 측면에서, 상기 입자는 환자에게 투여하기 위한 세포에 부착되어 남아있는다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자성 반응성 입자는 세포로부터 제거된다. 세포에서 자화 가능 입자를 제거하는 방법은 알려져 있고, 예를 들어 경쟁 비-표지 항체 및 절단 가능한 링커에 접합된 자화 가능 입자 또는 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화 가능 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 단리 및/또는 선택은 농축된 T 세포, 예를 들어, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포의 하나 이상의 투입 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 개별 투입 조성물이 단일 생물학적 샘플로부터 단리, 선택, 농축, 또는 수득된다. 일부 구현예에서, 개별 투입 조성물이 동일한 대상체로부터 채집, 채취, 및/또는 수득된 개별 생물학적 샘플로부터 단리, 선택, 농축, 및/또는 수득된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물의 특성들이 섹션 I-A 및 I-A-2에 기술된 바와 같이 평가된다. 일부 구현예에서, 특징은 세포 표현형이다. 일부 구현예에서, 세포 표현형이 투입 조성물 내 속성을 가진 세포의 수, 백분율, 비율, 및/또는 비를 제공하기 위해 정량화된다. 일부 구현예에서, 특징들은 본원에 제공된 기계 학습 모델에 투입으로 사용된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포의 조성물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포 투입 조성물은 CD3+ T 세포를 필수적으로 포함하여 구성된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ T 세포의 조성물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포 투입 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD4+ T 세포를 필수적으로 포함하여 구성된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포이거나 이를 포함하는 CD8+ T 세포의 조성물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고/거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD8+ T 세포를 필수적으로 포함하여 구성된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 투입 조성물은 단리, 선택 및/또는 농축 후에 동결(예를 들어, 냉동 보존 및/또는 극저온 동결)된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물은 세포 조성물을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질주입, 육성, 증폭, 수확, 및/또는 제형화하는 단계 전에 동결(예를 들어, 냉동 보존 및/또는 극저온 동결)된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 극저온 동결된 투입 조성물은, 예를 들어 (약) -80°C에서, 12시간 내지 7일, 24시간 내지 120시간, 또는 2일 내지 5일 동안 보관된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 극저온 동결된 투입 조성물은 (약) -80°C에서 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 또는 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 미만의 시간량 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 극저온 동결된 투입 조성물은 (약) -80°C에서 (약) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 동안 보관된다.
B. 세포의 활성화 및 자극
일부 구현예에서, 제공된 방법은 자극 조건에서 세포를 인큐베이션하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 세포(예를 들어, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포) 내 신호, 예컨대 TCR 및/또는 공수용체로부터 생성된 신호를 활성화 또는 자극하고/거나 활성화 또는 자극할 수 있는 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 자극 시약, 예를 들어 세포 내 신호를 활성화 또는 자극하고/거나 활성화 또는 자극할 수 있는, 시약과 함께 및/또는 시약의 존재 하에서, 세포를 배양, 육성, 인큐베이션, 활성화, 번식시키는 것 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 TCR 및/또는 공수용체를 자극 및/또는 활성화한다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 섹션 II-B-1에 기술된 시약이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물이, 세포를 유전적으로 조작하기 전에, 예를 들어 세포를, 예컨대 섹션 II-C에 제공된 기술에 의해, 형질주입 및/또는 형질도입하기 전에 자극 조건에서 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 조성물이 생물학적 샘플로부터 단리, 선택, 농축, 또는 수득된 후에 자극 조건에서 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 투입 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물은 이전에 극저온 동결 및 보관되었다가, 인큐베이션 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 T 세포 조성물은 두 개의 농축된 T 세포 개별 조성물(예를 들어, 개별 투입 조성물)이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 두 개의 농축된 T 세포 개별 조성물, 예를 들어 동일한 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 및/또는 농축된 두 개의 농축된 T 세포 개별 조성물이 자극 조건에서 개별적으로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 두 개의 개별 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 두 개의 개별 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 두 개의 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포 개별 조성물이 자극 조건에서 개별적으로 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 단일 조성물이 자극 조건에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물이다. 일부 구현예에서, 단일 조성물은 인큐베이션 전에 개별 조성물들로부터 조합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 자극 조건에서 인큐베이션되는 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건에서 인큐베이션되는 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 자극 조건에서 인큐베이션되는 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건에서 인큐베이션되는 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 개별 조성물이 단일 조성물에 조합되고 자극 조건에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 개별 자극된 조성물들은 인큐베이션이 수행 및/또는 완료된 후에 단일 조성물로 조합된다. 일부 구현예에서, 자극된 CD4+ 및 자극된 CD8+ T 세포의 개별 자극된 조성물은 인큐베이션이 수행 및/또는 완료된 후에 개별적으로 가공되고, 그럼으로써 자극된 CD4+ T 세포 집단(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드 자극 시약과 인큐베이션됨)은 재조합 단백질(예를 들어, CAR)을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입되고 T 세포를 증폭시키기 위한 조건 하에서 육성되며, 자극된 CD8+ T 세포 집단(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드 자극 시약과 인큐베이션됨)은, 동일한 공여체로부터 유래된 CD4+ T 세포를 조작하기 위한 것과 동일한 재조합 단백질과 같은 재조합 단백질(예를 들어, CAR)을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입되고 예컨대 제공된 방법에 따라 T 세포를 증폭하기 위한 조건에서 육성된다.
일부 구현예에서, 자극 조건에서 인큐베이션은 자극 조건, 예를 들어, 집단 내 세포의 증식, 증폭, 활성화, 및/또는 생존을 유도하여 유전자 조작을 위해, 예컨대 재조합 항원 수용체의 도입을 위해 항원 노출을 모방하고/거나 세포를 프라이밍하도록 설계된 조건의 존재 하에서 인큐베이션에 의한 것을 포함하여 배양, 육성, 자극, 활성화, 번식을 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 자극 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 자극 조건에서 자극 및/또는 인큐베이션은 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040,177 Riddell 등, Klebanoff 등 (2012) J Immunother . 35(9): 651-660, Terakura 등 (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang 등 (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포), 세포 조성물, 및/또는 세포 집단, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 조성물, 집단, 또는 이의 하위 집단은 배양-개시 조성물 배양보조 세포, 예컨대 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 첨가하고(예를 들어, 생성된 세포 집단은 증폭될 초기 집단 중 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40개 이상의 PBMC 배양보조 세포를 함유하도록); 상기 배양물을 (예를 들어, T 세포 수를 증폭시키기에 충분한 시간 동안) 인큐베이션하여, 증폭된다. 일부 측면에서, 비분할 배양보조 세포는 감마-조사된(gamma-irradiated) PBMC 배양보조 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC에 약 3000 내지 3600 라드(rad) 범위의 감마선을 조사하여 세포 분열을 방지한다. 일부 측면에서, 배양보조 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃ 이상, 일반적으로 적어도 약 30℃ 이상 및 일반적으로 (약) 37℃를 포함한다. 일부 구현예에서, 온도 변화는 37℃에서 35℃로와 같이 배양 중에 달성된다. 선택적으로, 인큐베이션은 배양보조 세포로서 비분할 EBV 형질전환 림프아구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 라드 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서, LCL 배양보조 세포는 임의의 적합한 양으로 제공되며, 예컨대 LCL 배양보조 세포 대 초기 T 림프구의 비가 적어도 약 10:1 이상으로 제공된다.
구현예들에서, 항원 특이적인 CD4+ 및 CD8+ 집단은 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 단리하고 시험관내에서 상기 세포를 동일한 항원으로 자극함으로써 시토메갈로 바이러스 항원에 대해 생성될 수 있다. 나이브 T 세포 또한 사용될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 자극 조건은 세포를 자극 시약과 함께 인큐베이션, 배양, 및/또는 육성하는 것을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 섹션 I-B-1에 기술된 시약이다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 비드를 함유 또는 포함한다. 예시적인 자극 시약은 항-CD3/항-CD28 자성 비드이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건에서 세포의 인큐베이션, 배양, 및/또는 육성의 시작 및/또는 개시는 세포가 자극 시약과 접촉하고/거나 자극 시약과 인큐베이션될 때 발생한다. 구체적인 구현예에서, 세포는 세포를 유전적으로 조작 전에, 동안, 및/또는 이후에, 예를 들어 재조합 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 예컨대 형질도입 또는 형질주입에 의해 도입 전에, 동안, 및/또는 이후에 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 자극 시약 및/또는 비드(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드) 대 세포의 비를 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1로 하여 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약 및/또는 비드 대 세포의 비는 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비는 약 1:1 또는 1:1이다.
구체적인 구현예에서, 3:1 미만 또는 세포당 3개 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드) 미만의 비로, 예컨대 1:1의 비로 세포를 인큐베이션하면 인큐베이션 중에, 예를 들어 예컨대 활성화-유도 세포 사멸에 의해, 발생하는 세포 사멸의 양이 줄어든다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)와 비드 대 3개 미만의 세포(또는 3:1 또는 세포당 3개 비드 미만)의 비로 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 3:1 미만 또는 세포당 3개 비드 미만의 비로, 예컨대 1:1의 비로 세포를 인큐베이션하면 인큐베이션 중에, 예를 들어 예컨대 활성화-유도 세포 사멸에 의해, 발생하는 세포 사멸의 양이 줄어든다.
구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)과 함께 세포당 3:1 미만의 자극 시약 및/또는 비드의 비로, 예컨대 1:1의 비로 인큐베이션되고, T 세포 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%는 인큐베이션 동안 또는 인큐베이션이 완료된 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 7일 초과 시점에 생존해 있고/있거나(예를 들어, 생존 가능하고/거나) 괴사, 세포예정사(programed cell death), 또는 세포자멸사를 겪지 않는다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 자극 시약과 함께 세포당 3:1 미만의 자극 시약 및/또는 비드의 비로, 예를 들어 1:1의 비로 인큐베이션되고, 세포의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만은 인큐베이션 동안 활성화 유도 세포 사멸을 겪는다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)과 함께 세포당 3:1 미만 비드의 비로, 예를 들어 1:1의 비로, 인큐베이션되고, 조성물의 세포는 농축된 T 세포 조성물이 자극 시약과 함께 3:1 또는 그 이상의 비로 인큐베이션되는 예시적인 및/또는 대체 공정을 겪은 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 생존한다.
일부 구현예에서, 자극 시약과 함께 인큐베이션된 농축된 T 세포 조성물은 1.0 x 105개 세포/mL 내지 1.0 x 108개 세포/mL 또는 약 1.0 x 105개 세포/mL 내지 약 1.0 x 108개 세포/mL, 예컨대 적어도 (약) 또는 약 1.0 x 105개 세포/mL, 5 x 105개 세포/mL, 1 x 106개 세포/mL, 5 x 106개 세포mL, 1 x 107개 세포/mL, 5 x 107개 세포/mL 또는 1 x 108개 세포/mL를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약과 함께 인큐베이션된 농축된 T 세포 조성물은 약 0.5 x 106개 세포/mL, 1 x 106개 세포/mL, 1.5 x 106개 세포/mL, 2 x 106개 세포/mL, 2.5 x 106개 세포/mL, 3 x 106개 세포/mL, 3.5 x 106개 세포/mL, 4 x 106개 세포/mL, 4.5 x 106개 세포/mL, 5 x 106개 세포/mL, 5.5 x 106개 세포/mL, 6 x 106개 세포/mL, 6.5 x 106개 세포/mL, 7 x 106개 세포/mL, 7.5 x 106개 세포/mL, 8 x 106개 세포/mL, 8.5 x 106개 세포/mL, 9 x 106개 세포/mL, 9.5 x 106개 세포/mL, 또는 10 x 106개 세포/mL, 예컨대 약 2.4 x 106개 세포/mL를 포함한다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 약 25 내지 약 38℃, 예컨대 약 30 내지 약 37℃, 예를 들어, (약) 37℃ ± 2℃의 온도에서 자극 시약과 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 약 2.5% 내지 약 7.5%, 예컨대 약 4% 내지 약 6%, 예를 들어, (약) 5% ± 0.5%의 CO2 수준에서 자극 시약과 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 37℃의 온도에서 및/또는 (약) 5%의 CO2 수준에서 자극 시약과 함께 인큐베이션된다.
구체적인 구현예에서, 자극 조건은 하나 이상의 사이토카인과 함께 및/또는 이의 존재 하에서 농축된 T 세포 조성물을 인큐베이션, 배양 및/또는 육성하는 것을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현되고/거나 T 세포에 대해 내인성인 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-나선 번들 패밀리의 멤버이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-나선 번들 패밀리의 멤버는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨15(IL-15), 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 농축된 T 세포, 예컨대 농축된 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD8+ T 세포 조성물을 기술된 바와 같은 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)의 존재 하에서, 그리고 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 IL-2(예를 들어, 재조합 IL-2)와 함께 인큐베이션된다. 이론에 얽매이지 않고, 구체적인 구현예들은 일부 대상체로부터 수득된 CD4+ T 세포는 IL-2를 산출 세포, 예를 들어, 세포 요법에 사용하기 적합한 조작된 세포의 조성물을 생성하기 위한 공정 동안 쭉 성장, 분할, 및 증폭을 가능하게 하는 양으로 생산하지 않거나 충분히 생산하지 않는다는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 재조합 IL-2가 존재하는 자극 조건에서 인큐베이션하면 조성물의 CD4+ T 세포가 인큐베이션 단계 동안 및 공정 내내 계속 생존하고, 성장하고, 증폭되고, 및/또는 활성화될 확률 또는 가능성이 증가한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 재조합 IL-2의 존재 하에서 인큐베이션하면 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어, 세포 요법에 적합한 조작된 CD4+ T 세포) 산출 조성물이, 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 재조합 IL-2의 존재 하에서 인큐베이션하지 않는 대체 및/또는 예시적인 방법과 비교하여, 농축된 CD4+ T 세포 조성물로부터 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 생산될 확률 및/또는 가능성이 증가한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 양 또는 농도는 국제 단위(IU)로 측정 및/또는 정량화된다. 국제 단위는 비타민, 호르몬, 사이토카인, 백신, 혈액 제제, 및 유사한 생물학적 활성 물질을 정량화하는 데 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, IU는 비중량 및 강도의 국제 기준 표준, 예를 들어, WHO 제1 인간 IL-2 국제 표준, 86/504와 비교한 생물학적 제제(biological preparation)의 효능의 측정 단위이거나 이를 포함한다. 국제 단위는 출판되고 국제 공동 연구 노력에서 파생된 생물학적 활성 단위를 보고하는 유일하게 인정되고 표준화된 방법이다. 구체적인 구현예에서, 사이토카인의 조성물, 샘플, 또는 공급원에 대한 IU는 유사한 WHO 표준 제품과의 제품 비교 시험을 통해 획득될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인간 재조합 IL-2, IL-7, 또는 IL-15의 조성물, 샘플, 또는 공급원의 IU/mg가 WHO 표준 IL-2 제품(NIBSC 코드: 86/500), WHO 표준 IL-17 제품(NIBSC 코드: 90/530) 및 WHO 표준 IL-15 제품(NIBSC 코드: 95/554)과 각각 비교된다.
일부 구현예에서, IU/mg 단위의 생물학적 활성은 (ng/ml 단위 ED50)-1 x106과 등가이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15의 ED50은 CTLL-2 세포를 사용한 세포 증식의 반-최대 자극(half-maximal stimulation)(XTT 절단)에 필요한 농도와 등가이다. 특정 구현예에서, 재조합 인간 IL-7의 ED50은 PHA-활성화된 인간 말초 혈액 림프구의 증식을 위한 반-최대 자극에 필요한 농도와 등가이다. IL-2의 IU의 분석 및 계산과 관련한 세부 사항은 문헌[Wadhwa 등, Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7; 및 Gearing and Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9]에서 논의하고; IL-15의 IU의 분석 및 계산과 관련한 세부 사항은 문헌[Soman 등 Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94]에서 논의하며; 이의 내용들은 그 전체가 참조로 포함된다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포 조성물이 IL-2 및/또는 IL-15가 존재하는 자극 조건에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 조성물이 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15가 존재하는 자극 조건에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 재조합형이다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 인간형이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 농축된 T 세포 조성물의 인큐베이션은 또한 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)의 존재를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 1 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 10 IU/ml 내지 50 IU/ml, 50 IU/ml 내지 100 IU/ml, 100 IU/ml 내지 200 IU/ml, 100 IU/ml 내지 500 IU/ml, 250 IU/ml 내지 500 IU/ml, 또는 500 IU/ml 내지 1,000 IU/ml 사이 농도의 사이토카인(예를 들어, 재조합 인간 사이토카인)과 함께 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 1 IU/ml 내지 200 IU/ml, 10 IU/ml 내지 200 IU/ml, 10 IU/ml 내지 100 IU/ml, 50 IU/ml 내지 150 IU/ml, 80 IU/ml 내지 120 IU/ml, 60 IU/ml 내지 90 IU/ml, 또는 70 IU/ml 내지 90 IU/ml 사이 농도의 IL-2(예를 들어, 인간 재조합 IL-2)와 함께 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 50 IU/ml, 55 IU/ml, 60 IU/ml, 65 IU/ml, 70 IU/ml, 75 IU/ml, 80 IU/ml, 85 IU/ml, 90 IU/ml, 95 IU/ml, 100 IU/ml, 110 IU/ml, 120 IU/ml, 130 IU/ml, 140 IU/ml, 또는 150 IU/ml 농도의 재조합 IL-2와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 85 IU/ml 재조합 IL-2의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2와 함께 인큐베이션된 조성물은 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 집단에 대해 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포 집단은 CD4+ T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD8+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD4+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD4+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD4+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD8+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD8+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2와 인큐베이션된 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 또한 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15와 함께, 예컨대 기술된 양으로 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2와 인큐베이션된 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 또한 재조합 IL-15와 함께, 예컨대 기술된 양으로 인큐베이션될 수 있다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 100 IU/ml 내지 2,000 IU/ml, 500 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 100 IU/ml 내지 500 IU/ml, 500 IU/ml 내지 750 IU/ml, 750 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 또는 550 IU/ml 내지 650 IU/ml 사이 농도의 재조합 IL-7(예를 들어, 인간 재조합 IL-7)과 함께 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 50 IU/ml,100 IU/ml, 150 IU/ml, 200 IU/ml, 250 IU/ml, 300 IU/ml, 350 IU/ml, 400 IU/ml, 450 IU/ml, 500 IU/ml, 550 IU/ml, 600 IU/ml, 650 IU/ml, 700 IU/ml, 750 IU/ml, 800 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 또는 1,000 IU/ml 농도의 재조합 IL-7과 함께 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 600 IU/ml의 재조합 IL-7의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-7과 함께 인큐베이션된 조성물은 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포의 집단에 대해 농축된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-7와 인큐베이션된 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 또한 재조합 IL-2 및/또는 재조합 IL-15와 함께, 예컨대 기술된 양으로 인큐베이션될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD4+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD8+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD8+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 재조합 IL-7과 인큐베이션되지 않는다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 0.1 IU/ml 내지 100 IU/ml, 1 IU/ml 내지 100 IU/ml, 1 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 25 IU/ml, 25 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 15 IU/ml, 또는 10 IU/ml 내지 100 IU/ml 사이 농도의 재조합 IL-15(예를 들어, 인간 재조합 IL-15)와 함께 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 1 IU/ml, 2 IU/ml, 3 IU/ml, 4 IU/ml, 5 IU/ml, 6 IU/ml, 7 IU/ml, 8 IU/ml, 9 IU/ml, 10 IU/ml, 11 IU/ml, 12 IU/ml, 13 IU/ml, 14 IU/ml, 15 IU/ml, 20 IU/ml, 25 IU/ml, 30 IU/ml, 40 IU/ml, 또는 50 IU/ml 농도의 재조합 IL-15와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 10 IU/ml의 재조합 IL-15에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-15와 함께 인큐베이션된 조성물은 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 집단에 대해 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포 집단은 CD4+ T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD8+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD4+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD4+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD4+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD8+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD8+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-15와 인큐베이션된 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 또한 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-2와 함께, 예컨대 기술된 양으로 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-15와 인큐베이션된 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 또한 재조합 IL-2와 함께, 예컨대 기술된 양으로 인큐베이션될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 세포는 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 자극 시약과 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 토코페롤, 토코트리에놀, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤, 알파-토코트리에놀, 베타-토코트리에놀, 알파-토코페롤퀴논, Trolox(6-하이드록시-2,5,7 ,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산), 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 플라보노이드, 이소플라본, 리코펜, 베타카로틴, 셀레늄, 유비퀴논, 루에틴, S-아데노실메티오닌, 글루타티온, 타우린, N-아세틸 시스테인(NAC), 시트르산, L-카르니틴, BHT, 모노티오글리세롤, 아스코르브산, 프로필 갈레이트, 메티오닌, 시스테인, 호모시스테인, 글루타티온, 시스타민 및 시스타티오닌, 및/또는 글리신-글리신-히스티딘을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물의 항산화제와의 인큐베이션은 또한 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드), 및 기술된 바와 같은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 함황 산화제(sulfur containing oxidant)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 함황 항산화제는 티올-함유 항산화제 및/또는 예를 들어 고리 구조 내에서 하나 이상의 황 모이어티를 나타내는 항산화제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 함황 항산화제는 예를 들어 N-아세틸시스테인(NAC) 및 2,3-다이머캅토프로판올(DMP), L-2-옥소-4-티아졸리딘카르복실레이트(OTC) 및 리포산을 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 함황 항산화제는 글루타티온 전구체이다. 일부 구현예에서, 글루타티온 전구체는 세포 내에서 하나 이상의 단계로 유래된 글루타티온으로 변형될 수 있는 분자이다. 구체적인 구현예에서, 글루타티온 전구체는 N-아세틸 시스테인(NAC), L-2-옥소티아졸리딘-4-카르복실산(프로시스테인), 리포산, S-알릴 시스테인 또는 염화 메틸메티오닌 설포늄을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 세포를 자극 조건에서 인큐베이션하는 것은 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 상기 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포는 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 자극 시약으로 자극된다. 일부 구현예에서, 세포는 1ng/ml 내지 100ng/ml, 10ng/ml 내지 1μg/ml, 100ng/ml 내지 10μg/ml, 1μg/ml 내지 100μg/ml, 10μg/ml 내지 1mg/ml, 100μg/ml 내지 1mg/ml, 1 500μg/ml 내지 2mg/ml, 500μg/ml 내지 5mg/ml, 1mg/ml 내지 10mg/ml, 또는 1mg/ml 내지 100mg/ml의 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 1μg/ml, 10μg/ml, 100μg/ml, 0.2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.6mg/ml, 0.8mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml, 100mg/ml, 200mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml, 또는 500mg/ml의 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 함황 항산화제(sulfur containing antioxidant)이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 글루타티온 전구체이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 N-아세틸 시스테인(NAC)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 세포를 자극 조건에서 인큐베이션하는 것은 NAC의 존재 하에서 상기 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포는 NAC의 존재 하에서 자극 시약으로 자극된다. 일부 구현예에서, 세포는 1ng/ml 내지 100ng/ml, 10ng/ml 내지 1μg/ml, 100ng/ml 내지 10μg/ml, 1μg/ml 내지 100μg/ml, 10μg/ml 내지 1mg/ml, 100μg/ml 내지 1mg/ml, 1500μg/ml 내지 2mg/ml, 500μg/ml 내지 5mg/ml, 1mg/ml 내지 10mg/ml, 또는 1mg/ml 내지 100mg/ml의 NAC의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 1μg/ml, 10μg/ml, 100μg/ml, 0.2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.6mg/ml, 0.8mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml, 100mg/ml, 200mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml, 또는 500mg/ml의 NAC의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 0.8mg/ml과 함께 인큐베이션된다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물을 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션하면 항산화제가 존재하지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 세포와 비교하여 활성화가 감소한다. 특정 구현예에서, 감소된 활성화는 세포에서 하나 이상의 활성화 표지자의 발현으로 측정된다. 특정 구현예에서, 활성화 표지자는 증가한 세포내 복잡도(예를 들어, 측방 산란(SSC)을 측정하여 결정), 증가한 세포 크기(예를 들어, 세포 직경 및/또는 전방 산란(FSC)을 측정하여 결정), CD27의 증가한 발현, 및/또는 CD25의 감소한 발현을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포는 인큐베이션, 조작, 형질도입, 형질주입, 증폭, 또는 제형화 동안 또는 후에 또는 인큐베이션 이후 발생하는 공정의 임의의 단계 동안 또는 후에 검사 시 활성화 표지자의 음성, 감소된 또는 낮은 발현 및/또는 정도를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포는 공정이 완료된 후에 활성화 표지자의 음성, 감소된 또는 낮은 발현 및/또는 정도를 갖는다. 구체적인 구현예에서, 산출 조성물의 세포는 활성화 표지자의 음성, 감소된 또는 낮은 발현 및/또는 정도를 갖는다.
일부 구현예에서, 세포의 상대 크기를 결정하기 위해 유세포 분석이 사용된다. 구체적인 구현예에서, 세포를 분석하고 크기 및 내부 복잡도에 기초하여 세포를 서로 구별하는 데 FSC 및 SSC 매개변수가 사용된다. 구체적인 구현예에서, 세포의 실제 크기를 결정하기 위해 크기가 알려진 입자 또는 비드를 표준으로 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 유세포 분석을 염색(예를 들어, 표지 항체)과 조합해 사용하여 표면 단백질, 예컨대 활성화 표지자, 예를 들어 CD25 또는 CD27의 발현을 측정 또는 정량화한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, 인큐베이션이 항산화제의 존재 하에서 수행되지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 세포와 비교하여 세포 직경이 적어도 0.25μm, 0.5μm, 0.75μm, 1.0μm, 1.5μm, 2μm, 2.5μm, 3μm, 3.5μm, 4μm, 4.5μm, 5μm, 또는 5μm 넘게 줄어든다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, FSC로 측정한 세포 크기가 인큐베이션이 항산화제의 존재 하에서 수행되지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 세포와 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 줄어든다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, SSC로 측정한 세포내 복잡도가 인큐베이션이 항산화제의 존재 하에서 수행되지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 세포와 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 줄어든다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, 예를 들어 유세포 분석으로 측정한, CD27의 발현이 인큐베이션이 항산화제의 존재 하에서 수행되지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 세포와 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 줄어든다.
특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, 예를 들어 유세포 분석으로 측정한, CD25의 발현이 인큐베이션이 항산화제의 존재 하에서 수행되지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 세포와 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 증가한다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물을 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션하면, 예를 들어 섹션 I-D에 기술된 바와 같이 인큐베이션 또는 육성 단계 동안, 증폭을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 농축된 세포 조성물은 육성 시작 후 14일, 12일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 또는 3일 내에 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 초과의 증폭을 달성한다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 인큐베이션되고 상기 조성물의 세포는 인큐베이션이 항산화제의 존재 하에서 수행되지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 육성된 세포와 비교하여 육성 동안 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 빠른 속도의 증폭을 겪는다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물을 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션하면, 예를 들어 세포자멸사에 의한, 세포 사멸의 양이 줄어든다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%의 세포는 인큐베이션이 완료된 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 7일 이상 동안 생존한다(예를 들어, 세포자멸사를 겪지 않는다). 일부 구현예에서, 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, 조성물의 세포는 세포가 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 인큐베이션되지 않는 예시적인 및/또는 대체 공정을 겪은 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 생존한다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물이 하나 이상의 항산화제(예를 들어, NAC)의 존재 하에서 인큐베이션되고, 카스파제 발현(예를 들어, 카스파제 3 발현)이 항산화제의 존재 하에서 수행되지 않는 대체 및/또는 예시적인 공정에서 인큐베이션된 세포와 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 줄어든다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포 등의 조성물 또는 세포가 기술된 바와 같이 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에서 인큐베이션된다. 상기 조건은 집단에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것을 포함한다. 항-CD3/항-CD28 자성 비드 등 예시적인 자극 시약은 아래 기술되어 있다. 자극 시약과의 인큐베이션은 또한 상기 기술된 바와 같이, 하나 이상의 자극 사이토카인의 존재 하에서, 예컨대 하나 이상의 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15의 존재 하에서 및/또는 적어도 하나의 항산화제(예컨대, NAC)의 존재 하에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 자극 조건에서, 예컨대 기술된 바와 같은 양으로, 자극제, 재조합 IL-2, 재조합 IL-7, 재조합 IL-15 및 NAC와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 자극 조건에서, 예컨대 기술된 바와 같은 양으로, 자극제, 재조합 IL-2, 재조합 IL-15 및 NAC와 함께 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 자극 및/또는 활성화를 위한 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040,177 Riddell 등, Klebanoff 등 (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 등 (2012) Blood.1:72-82 및/또는 Wang 등 (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에서 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 원심분리 회전 하에서, 원심분리 챔버의 내부 공동에서 수행된다. 일부 구현예에서, 원심분리 챔버에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하기 위한 시약 또는 시약들과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택된 세포 등의 세포는 원심분리 챔버에서 자극 조건 또는 자극제와 혼합된다. 상기 공정들의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포를 세포 배양 플레이트 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행할 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 하나 이상의 자극 조건 또는 제제의 양과 혼합한다.
일부 구현예에서, 선택이 원심분리 챔버에서, 예를 들어 주기적으로 진탕하거나 회전하는 튜브나 백에서 혼합되지 않고 수행될 경우 같은 수의 세포 또는 같은 부피의 세포와 대략 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하기 위해 전형적으로 사용되거나 필요한 자극제의 양과 비교하여 실질적으로 보다 적은 양(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이내의 양)으로 자극제를 챔버의 공동에 있는 세포에 첨가한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 예를 들어 약 10mL 내지 약 200mL, 또는 약 20mL 내지 약 125mL, 예컨대 적어도 (약) 또는 약 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 105mL, 110mL, 115mL, 120mL, 125mL, 130mL, 135mL, 140mL, 145mL, 150mL, 160mL, 170mL, 180mL, 190mL, 또는 200mL의 시약의 인큐베이션으로 표적 부피를 달성하기 위해 세포 및 자극제에 인큐베이션 완충제를 참가하여 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극제는 세포에 첨가하기 전에 미리 혼합된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극제는 세포에 개별적으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극 인큐베이션은 주기적으로 부드럽게 혼합하는 조건으로 수행되며, 이는 양호한 상호작용을 활발하게 촉진하는데 도움이 될 수 있으며, 이로써 세포의 자극 및 활성화를 달성하면서 전반적으로 보다 적은 자극제의 사용이 가능할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 일반적으로 스피닝(spinning)이 존재하는 것과 같은 혼합하는 조건 하에서 수행되며, 일반적으로 이는 상대적으로 낮은 힘 또는 속도, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 600rpm 내지 1700rpm 또는 약 600rpm 내지 약 1700rpm(예를 들어, (약) 또는 적어도 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm)에서, 예컨대 80g 내지 100g 또는 약 80g 내지 약 100g(예를 들어, (약) 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)의 챔버 또는 다른 용기의 벽 또는 샘플에서 RCF로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀은 상기와 같은 낮은 속도의 스핀과 이어지는 휴지 기간(rest period), 예컨대 스핀 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10초 동안의 휴지, 예컨대, 대략 1 또는 2초의 스핀과 이어지는 대략 5, 6, 7 또는 8초 동안의 휴지의 구간을 반복하여 수행된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 자극제와의 인큐베이션의 총 지속 시간은 (약) 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간, 18시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간, 예컨대 적어도 (약) 또는 약 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 (약) 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간(수치 포함) 동안이다.
일부 구현예에서, 세포는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 예를 들어 섹션 I-C에 기술된 바와 같이 형질도입 및/또는 형질주입에 의해 도입하기 위한 단계 전에 및/또는 도중에 자극 조건에서 배양, 육성, 및/또는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 유전자 조작 전에 30분 내지 2시간, 1시간 내지 8시간, 1시간 내지 6시간, 6시간 내지 12시간, 12시간 내지 18시간, 16시간 내지 24시간, 12시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 72시간, 42시간 내지 54시간, 60시간 내지 120시간, 96시간 내지 120시간, 90시간 내지, 1일 내지 7일, 3일 내지 8일, 1일 내지 3일, 4일 내지 6일, 또는 4일 내지 5일의 시간량 동안 자극 조건에서 배양, 육성, 및/또는 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 조작 전에 (약) 2일 동안 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 세포는 세포를 유전적으로 조작 전에 및/또는 도중에 자극 시약과 함께 또는 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 12시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 72시간, 42시간 내지 54시간, 60시간 내지 120시간, 96시간 내지 120시간, 90시간 내지, 2일 내지 7일, 3일 내지 8일, 1일 내지 8일, 4일 내지 6일, 또는 4일 내지 5일의 시간량 동안 자극 시약과 함께 및/또는 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 세포를 유전적으로 조작 전에 및/또는 도중에 자극 조건에서 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 또는 5일, 4일 미만의 시간량 동안 또는 168시간, 162시간, 156시간, 144시간, 138시간, 132시간, 120시간, 114시간, 108시간, 102시간, 또는 96시간 미만의 시간량 동안 배양, 육성, 및/또는 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 (약) 4일, 5일, 6일, 또는 7일 동안 자극 시약과 함께 및/또는 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 4일 동안 자극 시약과 함께 및/또는 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 (약) 5일 동안 자극 시약과 함께 및/또는 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 7일 미만 동안 자극 시약과 함께 및/또는 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 자극 조건에서 세포를 인큐베이션하는 것은 섹션 II-B-1에 기술된 자극 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 상자성 비드 등의 비드를 함유하거나 포함하고, 세포는 자극 시약과 함께 3:1(비드:세포) 미만의 비로, 예컨대 1:1의 비로 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 자극 시약과 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 자극 시약과 함께 재조합 IL-2, IL-7, IL-15, 및 NAC의 존재 하에서 1:1(비드:세포)의 비로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 자극 시약과 함께 재조합 IL-2, IL-15, 및 NAC의 존재 하에서 1:1(비드:세포)의 비로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션의 시작 또는 개시로부터, 예를 들어, 자극 시약이 세포에 첨가되거나 세포와 접촉한 때로부터, 6일, 5일, 또는 4일 째에, 또는 (약) 6일, 5일, 또는 4일 내에 세포로부터 제거되고/거나 분리된다.
1. 자극 시약
일부 구현예에서, 농축된 세포 조성물을 자극 조건에서 인큐베이션하는 것은 T 세포를 활성화 및/또는 증폭할 수 있는 자극 시약과 함께 농축된 세포 조성물을 인큐베이션 및/또는 접촉하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 세포에서 하나 이상의 신호를 자극 및/또는 활성화할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 신호는 수용체에 의해 매개된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 신호는 2차 메신저(예를 들어, cAMP 및/또는 세포내 칼슘)의 신호전달 및/또는 수준 또는 양의 변화, 하나 이상의 세포 단백질의 양, 세포 국소화, 확인, 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 절단의 변화, 및/또는 세포 활성, 예를 들어 전사, 번역, 단백질 분해, 세포 형태, 활성화 상태 및/또는 세포 분열의 변화이거나 이와 연관된다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 TCR 복합체 중 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 하나 상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화하고/거나 활성화할 수 있다.
특정 구현예에서, 자극 시약은 세포(예를 들어, T 세포)를 활성화 및/또는 증폭할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 생체분자)에 접합되거나 연결된 입자(예를 들어, 비드)를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 비드는 생체 적합성이 있으며, 즉 생물학적 용도에 적합한 재료로 구성된다. 일부 구현예에서, 비드는 배양된 세포, 예를 들어 배양된 T 세포에 무독성이다. 일부 구현예에서, 비드는 제제와 세포 사이의 상호작용을 허용하는 방식으로 제제를 부착할 수 있는 임의의 입자일 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 비드에 예를 들어 비드의 표면에 결합되거나 다른 방식으로 부착되는 세포(예를 들어, T 세포)를 활성화 및/또는 증폭할 수 있는 하나 이상의 제제를 함유한다. 특정 구현예에서, 비드는 비세포 입자이다. 구체적인 구현예에서, 비드는 콜로이드 입자, 마이크로스피어, 나노입자, 자성 비드 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 아가로스 비드이다. 특정 구현예에서, 비드는 세파로스 비드이다.
구체적인 구현예에서, 자극 시약은 단분산인 비드를 함유한다. 특정 구현예에서, 단분산인 비드는 직경 표준 편차가 서로 5% 미만인 크기 분산(size dispersion)을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 비드의 표면에 (직접 또는 간접적으로) 결합, 접합, 또는 연결된 제제 등과 같은 하나 이상의 제제를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 제제는 RNA, DNA, 단백질(예를 들어, 효소), 항원, 다클론 항체, 단클론 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질, 렉틴, 또는 원하는 표적에 대해 친화도가 있는 다른 생체분자를 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 수용체 및/또는 T 세포 수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 공자극 분자, 예를 들어, CD28, CD137(4-1-BB), OX40, 또는 ICOS이다. 하나 이상의 제제는 본 기술분야에서 알려진 이용 가능한 다양한 방법으로 비드에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 부착은 공유성, 비공유성, 정전기성, 또는 소수성일 수 있으며 예를 들어 화학적 수단, 기계적 수단 또는 효소적 수단을 포함한 다양한 부착 수단으로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체분자(예를 들어, 비오티닐화 항-CD3 항체)는 비드에 직접 부착된 다른 생체분자(예를 들어, 항-비오틴 항체)를 통해 비드에 간접적으로 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 비드, 및 세포 표면 상의 거대분자와 직접 상호작용하는 하나 이상의 제제를 함유한다. 특정 구현예에서, 비드(예를 들어, 상자성 비드)는 세포 상의 하나 이상의 거대분자(예를 들어, 하나 이상의 세포 표면 단백질)에 특이적인 하나 이상의 제제(예를 들어, 항체)를 통해 세포와 상호작용한다. 특정 구현예에서, 비드(예를 들어, 상자성 비드)는 본원에 기술된 제1 제제, 예컨대 1차 항체(예를 들어, 항-비오틴 항체) 또는 다른 생체분자로 표지되고, 이어서 제2 제제, 예컨대 2차 항체(예를 들어, 비오티닐화 항-CD3 항체) 또는 다른 제2 생체분자(예를 들어, 스트렙타비딘)가 첨가되고, 이에 의해 2차 항체 또는 다른 제2 생체분자는 1차 항체 또는 입자 상의 다른 생체분자에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 자극 시약은, 비드(예를 들어, 상자성 비드)에 부착되고 세포(예를 들어, T 세포) 상의 다음 거대분자들: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, CD18/CDl la (LFA-1), CD62L (L-셀렉틴), CD29/CD49d (VLA-4), 노치 리간드(예를 들어, 델타-유사 1/4, JAGGED 1/2 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, 및 CXCR3 또는 이 거대분자들 또는 이의 단편들에 대한 해당 리간드들을 포함한 이들의 단편 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는, 하나 이상의 제제(예를 들어, 항체)를 함유한다. 일부 구현예에서, 비드에 부착된 제제(예를 들어, 항체)는 세포(예를 들어, T 세포) 상의 다음 거대분자들: CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 비드에 부착된 제제들 중 하나 이상은 항체이다. 항체는 다클론 항체, 단클론 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체 포함), 다중 에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 및 단일 사슬 분자, 뿐만 아니라 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항체 단편(항원 결합 단편 포함), 예를 들어, Fab, Fab′-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab′)2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한 임의의 동형(isotype)의 불변 영역이 본원에서 고려되는 항체에 사용될 수 있고, 그러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종(예를 들어, 뮤린 종)으로부터 수득될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 제제는 T 세포 수용체의 하나 이상의 성분에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체이다. 구체적인 구현예에서, 제제는 항-CD3 항체이다. 특정 구현예에서, 제제는 공동 수용체에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체이다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.001μm보다 큰, 약 0.01μm보다 큰, 약 0.1μm보다 큰, 약 1.0μm보다 큰, 약 10μm보다 큰, 약 50μm보다 큰, 약 100μm보다 큰 또는 약 1000μm보다 큰 그리고 약 1500μm 이하의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 1.0μm 내지 약 500μm, 약 1.0μm 내지 약 150μm, 약 1.0μm 내지 약 30μm, 약 1.0μm 내지 약 10μm, 약 1.0μm 내지 약 5.0μm, 약 2.0μm 내지 약 5.0μm, 또는 약 3.0μm 내지 약 5.0μm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3μm 내지 약 5μm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 적어도 또는 적어도 (약) 0.001μm, 0.01μm, 0.1μm, 0.5μm, 1.0μm, 1.5μm, 2.0μm, 2.5μm, 3.0μm, 3.5μm, 4.0μm, 4.5μm, 5.0μm, 5.5μm, 6.0μm, 6.5μm, 7.0μm, 7.5μm, 8.0μm, 8.5μm, 9.0μm, 9.5μm, 10μm, 12μm, 14μm, 16μm, 18μm 또는 20μm의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 (약) 4.5μm의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 (약) 2.8μm의 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 비드는 0.001g/cm3보다 큰, 0.01g/cm3보다 큰, 0.05g/cm3보다 큰, 0.1g/cm3보다 큰, 0.5g/cm3보다 큰, 0.6g/cm3보다 큰, 0.7g/cm3보다 큰, 0.8g/cm3보다 큰, 0.9g/cm3보다 큰, 1g/cm3보다 큰, 1.1g/cm3보다 큰, 1.2g/cm3보다 큰, 1.3g/cm3보다 큰, 1.4g/cm3보다 큰, 1.5g/cm3보다 큰, 2g/cm3보다 큰, 3g/cm3보다 큰, 4g/cm3보다 큰, 또는 5g/cm3보다 큰 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.001g/cm3 내지 약 100g/cm3, 약 0.01g/cm3 내지 약 50g/cm3, 약 0.1g/cm3 내지 약 10g/cm3, 약 0.1g/cm3 내지 약 0.5g/cm3, 약 0.5g/cm3 내지 약 1g/cm3, 약 0.5g/cm3 내지 약 1.5g/cm3, 약 1g/cm3 내지 약 1.5g/cm3, 약 1g/cm3 내지 약 2g/cm3, 또는 약 1g/cm3 내지 약 5g/cm3의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.5g/cm3, 약 0.5g/cm3, 약 0.6g/cm3, 약 0.7g/cm3, 약 0.8g/cm3, 약 0.9g/cm3, 약 1.0g/cm3, 약 1.1g/cm3, 약 1.2g/cm3, 약 1.3g/cm3, 약 1.4g/cm3, 약 1.5g/cm3, 약 1.6g/cm3, 약 1.7g/cm3, 약 1.8g/cm3, 약 1.9g/cm3, 또는 약 2.0g/cm3의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.6g/cm3의 밀도를 갖는다. 구체적인 구현예에서, 비드 또는 입자는 약 1.5g/cm3의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 입자는 약 1.3g/cm3의 밀도를 갖는다.
특정 구현예에서, 복수의 비드가 균일한 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 균일한 밀도는 평균 비드 밀도의 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만의 밀도 표준 편차를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 입자의 각 그램당 약 0.001m2(m2/g) 내지 약 1,000m2/g, 약 0.01m2/g 내지 약 100m2/g, 약 0.1m2/g 내지 약 10m2/g, 약 0.1m2/g 내지 약 1m2/g, 약 1m2/g 내지 약 10m2/g, 약 10m2/g 내지 약 100m2/g, 약 0.5m2/g 내지 약 20m2/g, 약 0.5m2/g 내지 약 5m2/g, 또는 약 1m2/g 내지 약 4m2/g의 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 약 1m2/g 내지 약 4m2/g의 표면적을 갖는다.
일부 구현예에서, 비드는 비드 표면 또는 그 근처에 제제에 결합, 연결 또는 접합될 수 있는 적어도 하나의 재료를 함유한다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 기능화되며, 즉 결합 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 공유결합을 형성할 수 있는 작용기(functional group)를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 비드는 표면-노출된 카르복시기, 아미노기, 하이드록시기, 토실기, 에폭시기, 및/또는 클로로메틸기를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 비드는 표면 노출된 아가로스 및/또는 세파로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드 표면은 결합 분자에 결합하거나 부착할 수 있는 부착된 자극 시약을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 생체분자는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 노출된 단백질 A, 단백질 G, 또는 비오틴을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 자기장에서 반응한다. 일부 구현예에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 구현예에서, 자성 비드는 상자성이다. 구체적인 구현예에서, 자성 비드는 초상자성이다. 특정 구현예에서, 비드는 자기장에 노출되지 않는 한 자성 특성을 나타내지 않는다.
구체적인 구현예에서, 비드는 자성 코어, 상자성 코어, 또는 초상자성 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 금속을 함유한다. 일부 구현예에서, 금속은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄, 망간, 탄탈륨, 아연, 지르코늄 또는 이들의 임의의 조합일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 자성 코어는 금속 산화물(예를 들어, 산화철), 페라이트(예를 들어, 망간 페라이트, 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 등), 적철광 및 금속 합금(예를 들어, CoTaZn)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 페라이트, 금속, 금속 합금, 산화철, 또는 이산화크롬 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 원소 철 또는 이의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 자철광(Fe3O4), 마그헤마이트(γFe2O3), 또는 그레이자이트(Fe3S4) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 코어는 산화철(예를 들어, Fe3O4)을 포함한다.
특정 구현예에서, 비드는 표면 기능화된 피막(coat) 또는 코팅(coating)으로 덮인 자성, 상자성, 및/또는 초상자성 코어를 함유한다. 일부 구현예에서, 피막(coat)은 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 아가로스, 세파로스, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 재료를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 또는 폴리비닐 알코올일 수 있다. 특정 구현예에서, 외부 피막 또는 코팅은 폴리스티렌을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 외부 코팅은 표면 기능화된다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예를 들어, 산화철 코어)와 피막을 함유하는 비드를 포함하고, 여기서 금속 산화물 코어는 적어도 하나의 다당류(예를 들어, 덱스트란)를 포함하고, 피막은 적어도 하나의 다당류(예를 들어, 아미노 덱스트란), 적어도 하나의 중합체(예를 들어, 폴리우레탄) 및 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서, 금속 산화물 코어는 콜로이드 산화철 코어이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 또는 이들의 항원 결합 단편들을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3μm 내지 약 10μm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3μm 내지 약 5μm의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 3.5μm의 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예를 들어, 산화철 내부 코어) 및 피막(예를 들어, 보호 피막)을 포함하는 비드에 부착된 하나 이상의 제제를 포함하되, 피막은 폴리스티렌을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 상자성(예를 들어, 초상자성) 철 코어, 예를 들어, 자철광(Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트(γFe2O3) c를 포함하는 코어 및 폴리스티렌 피막 또는 코팅을 포함하는 단분산 상자성(예를 들어, 초상자성) 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 비다공성이다. 일부 구현예에서, 비드는 하나 이상의 제제가 부착되는 기능화된 표면을 함유한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제는 비드에 표면에서 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3/항-CD28 자성 비드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체, 및 표지된 항-CD3 또는 항-CD28 등의 표지 항체(예를 들어, 비오티닐화 항체)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.5g/cm3의 밀도 및 약 1m2/g 내지 약 4m2/g의 표면적을 갖는다. 구체적인 구현예에서, 비드는 약 4.5μm의 직경 및 약 1.5g/cm3의 밀도를 갖는 단분산 초상자성 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 약 2.8μm의 평균 직경 및 약 1.3g/cm3의 밀도를 갖는 단분산 초상자성 비드이다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 자극 시약과 함께 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 비드 대 세포 비로 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 비드 대 세포의 비는 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비는 약 1:1 또는 1:1이다.
2. 세포로부터 자극 시약의 제거
특정 구현예에서, 자극 시약(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자성 비드)은 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 이론에 얽매이지 않고, 구체적인 구현예들은 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 회합은 일부 환경에서 인큐베이션 동안 시간의 경과에 따라 감소될 수 있다는 것을 고려한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 회합을 감소시키도록 첨가될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 세포 배양 조건(예를 들어, pH의 배지 온도)의 변화는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 회합을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션, 세포 배양 시스템, 및/또는 용액으로부터 세포와 별도로, 예를 들어 인큐베이션, 세포 배양 시스템, 및/또는 용액으로부터 세포를 제거하지 않고도, 제거될 수 있다.
세포로부터 자극 시약(예를 들어, 비드 입자 또는 자화성 입자 등의 입자이거나 이를 함유하는 자극 시약)을 제거하는 방법은 알려져 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 자극 시약의 1차 항체에 결합되어 세포 상의 항원에 대한 친화도를 변경시켜 부드러운 분리가 가능하게 하는, 비표지 항체 등의 경쟁 항체를 사용할 수 있다. 일부 경우에, 분리 후에, 경쟁 항체는 입자(예를 들어, 비드 입자)와 회합된 상태로 남아 있을 수 있는 반면, 미반응 항체는 세척되거나 세척될 수 있고 세포는 항체를 단리, 선택, 농축 및/또는 활성화하지 않는다. 이러한 시약의 예시는 DETACaBEAD이다(Friedl 등 1995; Entschladen 등 1997). 일부 구현예에서, 입자(예를 들어, 비드 입자)는 절단 가능한 링커(예를 들어, DNA 링커)의 존재 하에서 제거될 수 있고, 이에 의해 입자-결합 항체는 링커에 접합된다(예를 들어, CELLection, Dynal). 일부 경우에, 링커 영역은, 예를 들어 DNase 또는 다른 방출 완충제의 첨가에 의한 단리 후에 세포로부터 입자(예를 들어, 비드 입자)를 제거하기 위해 절단 가능한 부위를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포로부터 입자(예를 들어, 비드 입자)의 방출을 위해 다른 효소적 방법을 사용할 수도 있다. 일부 구현예에서, 입자(예를 들어, 비드 입자 또는 자화 가능 입자)는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 자성, 상자성, 및/또는 초상자성이고/거나 자성, 상자성, 및/또는 초상자성인 비드를 함유하고, 자극 시약은 세포를 자기장에 노출함으로써 세포로부터 제거될 수 있다. 자기장을 생성하기 위한 자석을 포함한 적합한 장비의 예는 DynaMag CTS (Thermo Fisher), Magnetic Separator (Takara) 및 EasySep Magnet(Stem Cell Technologies)를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 자극 시약은 제공된 방법이 완료되기 전에, 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 조작된 세포를 수확, 채집, 및/또는 제형화하기 전에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 세포를 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)하기 전에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 세포를 조작하는 단계 후에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 세포의 육성 전에, 예를 들어 조작된(예를 들어, 형질주입된 또는 형질도입된) 세포의 육성 전에 제거된다.
특정 구현예에서, 자극 시약은 일정 시간량 후에 세포로부터 분리 및/또는 제거된다. 구체적인 구현예에서, 일정 시간량은 자극 조건에서 인큐베이션의 시작 및/또는 개시로부터 일정 시간량이다. 구체적인 구현예에서, 인큐베이션의 시작은 세포가 자극 시약 및/또는 자극 시약을 함유한 배지 또는 용액과 접촉하거나 대략 접촉하는 시점으로 간주된다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션의 시작 또는 개시 이후 (약) 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 또는 2일 이내에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션의 시작 또는 개시 이후 (약) 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 또는 2일 시점에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션의 시작 또는 개시 이후 (약) 168시간, 162시간, 156시간, 144시간, 138시간, 132시간, 120시간, 114시간, 108시간, 102시간, 또는 96시간 시점에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션의 시작 또는 개시 이후 (약) 5일 시점에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션의 시작 및/또는 개시 이후 (약) 4일 시점에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다.
C. 세포 조작
일부 구현예에서, 제공된 방법은 질병 또는 병태를 가진 대상체에 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포를 투여하는 것을 포함한다. 유전적으로 조작된 성분, 예를 들어 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 도입하는 다양한 방법이 널리 알려져 있으며 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스성(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스성) 형질도입, 트랜스포손 및 전기천공법을 통한 것을 포함하여 수용체를 암호화하는 핵산의 전이를 위한 방법을 포함한다.
수용체를 발현하고 제공된 방법에 의해 투여되는 세포 중에는 조작된 세포가 있다. 유전자 조작은 일반적으로 재조합 또는 조작된 성분을 암호화하는 핵산을, 예컨대 레트로바이러스 형질도입, 형질주입 또는 형질전환에 의해, 세포를 함유하는 조성물 내로 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물을 조작하는 것과 공동으로 사용된다. 특정 구현예에서, 조작(engineering)은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드)의 도입이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 재조합 단백질은 섹션 III에 기술된 임의의 것과 같은 재조합 수용체이다. 세포에 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 도입은 알려진 다수의 임의의 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 벡터에는 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 포함한 바이러스 및 비-바이러스 시스템뿐만 아니라 PiggyBac 또는 Sleeping Beauty 기반 유전자 전달 시스템과 같은 트랜스포손 기반 시스템이 포함된다. 예시적인 방법은 바이러스성(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스성) 형질도입, 트랜스포손 및 전기천공법을 통한 것을 포함하여 수용체를 암호화하는 핵산의 전이를 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작은 하나 이상의 조작된 농축된 T 세포 조성물을 생산한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물은, 예컨대 섹션 II-D에 제공된 방법에 의해, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서, 세포를 육성하기 전에, 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 조성물이, 예컨대 섹션 II-B에 제공된 방법에 기술된 바와 같이, 자극 조건에서 자극, 활성화, 및/또는 인큐베이션된 후에 조작된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 자극된 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 자극된 조성물은 이전에 극저온 동결 및 보관되었다가, 조작 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 T 세포 조성물은 두 개의 농축된 T 세포 개별 자극된 조성물이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 두 개의 농축된 T 세포 개별 조성물, 예를 들어 동일한 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 및/또는 농축된 두 개의 농축된 T 세포 개별 조성물이 개별적으로 조작된다. 특정 구현예에서, 두 개의 개별 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 두 개의 개별 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 두 개의 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포 개별 조성물은 예컨대 상기 기술된 바와 같은 자극 조건에서 인큐베이션 이후 개별적으로 유전적으로 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 단일 조성물이 유전적으로 조작된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물이다. 일부 구현예에서, 단일 조성물은 조작 전에 개별 조성물들로부터 조합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 자극된 CD4+ T 세포 등의 조작된(예를 들어, 형질도입된 또는 형질주입된) 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극된 CD4+ T 세포 등의 조작된 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 자극된 CD8+ T 세포 등의 조작된(예를 들어, 형질도입된 또는 형질주입된) 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극된 CD8+ T 세포 등의 조작된 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 개별 조성물이 단일 조성물로 조합되고 유전적으로 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 농축된 CD8+ T 세포 개별 조작된 조성물들은 유전자 조작이 수행 및/또는 완료된 후에 단일 조성물로 조합된다. 구체적인 구현예에서, 자극된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 개별 조성물 등의 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 개별 조성물은 유전자 조작이 수행 및/또는 완료된 후에 T 세포의 육성 및/또는 증폭을 위해 개별적으로 조작되고 개별적으로 가공된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드)의 도입은 자극된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 등의 농축된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 폴리뉴클레오타이드를 함유한 바이러스 입자와 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉은 회전 접종(예를 들어, 원심분리 접종)과 같은 원심분리로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물을 일반적으로 상대적으로 작은 힘 또는 저속으로, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 600rpm 내지 1700rpm, 약 600rpm 내지 약 1700rpm(예를 들어 (약) 또는 적어도 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm)으로 회전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 공동의 내벽 또는 외벽에서 측정된 바와 같은, 100g 내지 3200g 또는 약 100g 내지 약 3200g(예를 들어 (약) 또는 적어도 (약) 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3200g), 예컨대 (약) 693g의 힘으로, 예를 들어, 상대 원심력으로 수행된다. 용어 “상대 원심력(relative centrifugal force)” 또는 RCF는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간의 특정 지점에서 지구의 중력에 대해 상대적인 물체 또는 물질(예컨대 세포, 샘플 또는 펠릿 및/또는 회전되는 챔버 또는 다른 용기의 지점)에 부여된 유효힘(effective force)으로 이해된다. 상기 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(회전축과 RCF를 측정하는 물체, 물질 또는 입자로부터의 거리)을 고려하여 잘 알려진 공식을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 예를 들어, 농축된 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD8+ T 세포 자극된 조성물의 세포를 바이러스와 접촉, 인큐베이션 및/또는 조작하는 것 중 적어도 일부는 약 100g 내지 3200g, 1000g 내지 2000g, 1000g 내지 3200g, 500g 내지 1000g, 400g 내지 1200g, 600g 내지 800g, 600g 내지 700g, 또는 500g 내지 700g의 회전으로 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 600g 내지 700g, 예를 들어 (약) 693g이다.
특정 구현예에서, 조작, 형질도입, 및/또는 형질주입 중 적어도 일부는 회전(예를 들어 회전 접종 및/또는 원심분리)으로 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 또는 적어도 (약) 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 90분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 동안 또는 적어도 7일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 60분 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 회전은 약 30분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 약 30분 동안 600g 내지 700g, 예를 들어 (약) 693g으로 수행된다.
특정 구현예에서, 조작, 형질도입, 및/또는 형질주입될 생존 세포의 수는 약 5 x 106개 세포 내지 약 100 x 107개 세포, 예컨대 약 10 x 106개 세포 내지 약 100 x 106개 세포, 약 100 x 106개 세포 내지 약 200 x 106개 세포, 약 200 x 106개 세포 내지 약 300 x 106개 세포, 약 300 x 106개 세포 내지 약 400 x 106개 세포, 약 400 x 106개 세포 내지 약 500 x 106개 세포, 또는 약 500 x 106개 세포 내지 약 100 x 107개 세포의 범위이다. 구체적인 예에서, 조작, 형질도입, 및/또는 형질주입될 생존 세포의 수는 약 300 x 106개 세포 이하이다.
특정 구현예에서, 조작, 형질도입, 및/또는 형질주입 중 적어도 일부는 약 5mL 내지 약 100mL, 예컨대 약 10mL 내지 약 50mL, 약 15mL 내지 약 45mL, 약 20mL 내지 약 40mL, 약 25mL 내지 약35mL, 또는 (약) 30mL의 부피(예를 들어, 회전 접종 부피)로 수행된다. 특정 구현예에서, 회전 접종 후에 세포 펠릿 부피는 약 1mL 내지 약 25mL, 예컨대 5mL 내지 약 20mL, 약 5mL 내지 약 15mL, 약 5mL 내지 약 10mL, 또는 (약) 10mL 범위이다.
일부 구현예에서, 유전자 전달은 먼저 세포를 자극하고, 예컨대 예를 들어 사이토카인 또는 활성화 표지자의 발현에 의해 측정했을 때 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 세포를 조합하고, 뒤이어 활성화된 세포의 형질도입 및 임상 적용에 충분한 수로 배양에서 증폭시켜 달성된다. 특정 구현예에서, 유전자 전달은 우선 자극 조건에서 예컨대 섹션 II-B에 기술된 임의의 방법에 의해 세포를 인큐베이션하여 달성된다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 방법은 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 조성물의 하나 이상의 세포를 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉은 회전 접종(예를 들어, 원심분리 접종)과 같은 원심분리로 달성될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 임의의 것을 포함한다. 예시적인 원심분리 챔버는 Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 챔버를 포함하며, Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 함께 사용하기 위한 챔버를 포함하고, A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버 및 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 가공 기기 및 캐비닛은 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2008/0171951, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/38762]에 기술되어 있고, 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 제품 이름 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2로 BioSafe SA에서 판매되는 일회용 키트를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 시스템은 시스템에서 수행되는 형질도입 단계 및 하나 이상의 다양한 다른 가공 단계, 예를 들어 본원 또는 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 원심분리 챔버 시스템으로 수행되거나 이와 관련하여 수행될 수 있는 하나 이상의 가공 단계의 양태들을 작동, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 기기를 포함하여 다른 기기와 공동으로 포함되고/거나 이와 공동으로 배치된다. 일부 구현예에서 상기 기기는 캐비닛 내에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 기기에는 제어 회로, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 수용한 하우징을 포함한 캐비닛이 포함된다. 예시적인 디바이스가 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 US 2008/0171951]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 일련의 용기, 예를 들어 백, 튜빙, 스톱콕, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 용기는 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 동일한 용기 또는 별도의 용기들에 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 챔버 내로 들어오는 희석제 및/또는 세척 용액 및/또는 방법 중에 성분 및/또는 조성물을 희석, 재현탁 및/또는 세척하기 위한 기타 성분 같은 배지를 함유하는, 백 같은 하나 이상의 용기를 추가로 포함한다. 용기들은 시스템의 하나 이상의 위치에, 예컨대 입력 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 산출 라인에 대응하는 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 챔버는 예컨대 회전축 주위로 챔버를 회전시킬 수 있는 원심분리기와 결합되어 있다. 회전은 세포의 형질도입과 관련하여 및/또는 다른 가공 단계 중 하나 이상에서 인큐베이션 이전, 도중 및/또는 이후에 이루어질 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 다양한 가공 단계는 예를 들어, 특정 힘으로 회전되면서 수행된다. 챔버가 원심분리 중에 수직으로 위치하고 측벽과 축은 수직 또는 일반적으로 수직이며, 말단 벽은 수평 또는 일반적으로 수평이 되도록, 전형적으로 챔버는 수직 또는 일반적으로 수직 회전할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 조성물과 바이러스 벡터 입자를 함유하는 조성물, 및 선택적으로 공기가 조성물들을 공동에 제공하기 전에 조합되거나 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 조성물과 바이러스 벡터 입자를 함유하는 조성물, 및 선택적으로 공기가 개별적으로 제공되고 공동에서 조합 및 혼합된다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 조성물, 바이러스 벡터 입자를 함유하는 조성물, 및 선택적으로 공기가 임의의 순서로 내부 공동에 제공될 수 있다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 조성물은, 이들이 원심분리 챔버 내부 또는 외부에서 조합 또는 혼합되든 및/또는 세포 및 바이러스 벡터 입자가 원심분리 챔버에 함께 또는 개별적으로, 예컨대 동시에 또는 순차적으로 제공되든, 조합 또는 혼합된 투입 조성물이다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법에서 공기와 같은 일정 부피의 기체의 흡입이 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션 전에 예컨대 회전 전에 일어난다. 일부 구현예에서, 형질도입 방법에서 공기와 같은 일정 부피의 기체의 흡입이 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션 동안에 예컨대 회전 동안에 일어난다.
일부 구현예에서, 형질도입 조성물을 구성하는 세포 또는 바이러스 벡터 입자의 액체 부피, 선택적으로 공기 부피는 미리 정해진 부피일 수 있다. 상기 부피는 시스템과 연관된 회로에 프로그램되고/거나 그 회로에 의해 제어되는 부피일 수 있다.
일부 구현예에서, 형질도입 조성물과, 선택적으로 공기 등의 기체의 흡입은 원하는 또는 미리 정해진 부피가 챔버의 내부 공동으로 들어갈 때까지 수동으로, 반자동으로 및/또는 자동으로 제어된다. 일부 구현예에서, 시스템과 연관된 센서는 원심분리 챔버에 흘러 들어가고 그로부터 나오는 액체 및/또는 기체를 예컨대 그 색상, 유속 및/또는 밀도를 통해 감지할 수 있고, 원하는 또는 미리 정해진 부피가 달성될 때까지 필요한 대로 흡입을 멈추거나 계속하도록 연관된 회로와 통신할 수 있다. 일부 측면에서, 시스템에서 기체(예를 들어, 공기)가 아닌 액체만 감지하도록 프로그램되거나 액체만 감지할 수 있는 센서는 시스템 내로 흡입을 멈추지 않고 기체(예컨대 공기)의 통과를 허용할 수 있도록 만들어질 수 있다. 일부 상기 구현예에서, 공기와 같은 기체 흡입이 필요한 동안 불투명 튜빙을 센서 근처의 라인에 배치할 수 있다. 일부 구현예에서, 공기와 같은 기체의 흡입은 수동으로 제어될 수 있다.
제공된 방법의 측면에서, 원심분리 챔버의 내부 공동은 고속 회전을 거친다. 일부 구현예에서, 회전은 액체 투입 조성물과, 선택적으로 공기의 흡입 전에, 그와 동시에, 이후에 또는 간헐적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 액체 투입 조성물과, 선택적으로 공기의 흡입 이후에 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 내부 공동의 측벽의 내부 표면에 및/또는 세포의 표면층에 (약) 또는 적어도 (약) 800g, 1000g, 1100g, 1500g, 1600g, 1800g, 2000g, 2200g, 2500g, 3000g, 3500g 또는 4000g의 상대 원심력으로 원심분리 챔버의 원심분리에 의해 이루어진다. 일부 구현예에서, 회전은 약 1100g 이상, 예컨대 약 1200g 이상, 약 1400g 이상, 약 1600g 이상, 약 1800g이상, 약 2000g이상, 약 2400g이상, 약 2800g이상, 약 3000g이상 또는 약 3200g 이상의 힘으로 원심분리에 의해 이루어진다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 1600g의 힘으로 원심분리에 의해 이루어진다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법은 원심분리 챔버에서 약 5분 이상, 예컨대 약 10분 이상, 약 15분 이상, 약 20분 이상, 약 30분 이상, 약 45분 이상, 약 60분 이상, 약 90분 이상 또는 약 120분 이상 동안 형질도입 조성물과 선택적으로 공기의 회전 또는 원심분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입 조성물과, 선택적으로 공기는 원심분리 챔버에서 5분을 넘는 시간 동안 그러나 60분 이내, 45분 이내, 30분 이내 또는 15분 이내 동안 회전 또는 원심분리된다. 구체적인 구현예에서, 형질도입은 (약) 60분 동안 회전 또는 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법은 원심분리 챔버에서 (약) 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분(각 수치 포함) 동안, 내부 공동의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에 적어도 약 1000g, 1100g, 1200g, 1400g, 1500g, 1600g, 1800g, 2000g, 2200g, 2400g, 2800g, 3200g 또는 3600g의 힘으로, 형질도입 조성물과, 선택적으로 공기의 회전 또는 원심분리를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 형질도입 방법은 (약) 1600g으로 (약) 60분 동안 형질도입 조성물(예를 들어, 세포 및 바이러스 벡터 입자)의 회전 또는 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 챔버의 공동 내의 기체(예컨대 공기)가 챔버로부터 배출된다. 일부 구현예에서, 기체(예컨대 공기)는 원심분리 챔버와 폐쇄 시스템의 일부로서 작동 가능하게 연결된 용기로 배출된다. 일부 구현예에서, 용기는 비어있거나 빈 용기이다. 일부 구현예에서, 챔버의 공동 내의 공기 등의 기체는 멸균 배관 라인을 통해 챔버의 내부 공동에 작동 가능하게 연결된 필터를 통해 배출된다. 일부 구현예에서, 공기는 수동, 반자동 또는 자동 공정을 이용해 배출된다. 일부 구현예에서, 공기는, 형질도입이 개시되었거나 세포가 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 등의 인큐베이션된 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유한 산출 조성물을 챔버의 공동으로부터 발현하기 전에, 그와 동시에, 간헐적으로, 또는 그 이후에 챔버로부터 방출된다.
일부 구현예에서, 형질도입 및/또는 다른 인큐베이션은 연속 또는 반-연속 공정으로서 또는 그 일부로서 수행된다. 일부 구현예에서, 연속 공정은 세포 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어, 형질도입 조성물(단일 기존 조성물로서 또는 동일한 용기 예를 들어 공동으로 연속적으로 끌어 넣음으로서, 그렇게 하여 그 부분을 혼합하여)의 연속 흡입 및/또는 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예를 들어 원심분리하는 동안, 용기로부터 액체의 연속 발현 또는 방출, 및 선택적으로 기체(예를 들어, 공기)의 방출을 포함한다. 일부 구현예에서, 연속 흡입 및 연속 발현은 적어도 부분적으로 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 연속 흡입은 인큐베이션의 일부 동안, 예를 들어 원심분리의 일부 동안 일어나고, 연속 발현은 인큐베이션의 별도 일부 동안 일어난다. 상기 둘은 교대로 될 수 있다. 따라서, 인큐베이션을 수행하는 중에, 연속 흡입 및 발현은 가공(예를 들어, 형질도입)될 샘플의 전체 부피를 더 크게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 연속 공정의 일부이고, 상기 방법은 인큐베이션 중 적어도 일부 동안 상기 형질도입 조성물을 공동 내로 챔버의 회전 동안 연속 흡입되게 하는 것, 및 인큐베이션의 일부 동안, 챔버의 회전 동안 적어도 하나의 개구를 통해 공동으로부터 액체의 연속 발현이 되게 하는 것, 그리고 선택적으로 기체(예를 들어, 공기)를 방출하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 반-연속 인큐베이션은 조성물을 공동 내로 흡입, 인큐베이션, 공동으로부터 예컨대 출력 용기로 액체의 발현, 및 선택적으로 공동으로부터 기체(예를 들어, 공기)의 방출 사이를 번갈아 하고, 그런 후 가공을 위한 추가적인 세포 및 다른 시약, 예를 들어 바이러스 벡터 입자를 함유한 후속(예를 들어, 제2, 제3 등) 조성물의 흡입 및 공정을 반복하여 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인큐베이션은 반-연속 공정의 일부이고, 상기 방법은 인큐베이션 전에 형질도입 조성물을 상기 적어도 하나의 개구를 통해 공동 내로 흡입을 실행하고, 인큐베이션 후에, 공동으로부터 유체의 발현을 실행하는 단계; 세포 및 바이러스 벡터 입자를 포함한 다른 형질도입 조성물을 상기 내부 공동 내로 흡입을 실행하는 단계; 및 상기 다른 형질도입 조성물 내 상기 세포가 상기 벡터로 형질도입되는 조건에서 상기 내부 공동에서 상기 다른 형질도입 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 공정은 다수의 추가 라운드 동안 반복적인 방식으로 계속될 수 있다. 이와 관련하여, 반연속 또는 연속 방법은 훨씬 더 큰 부피 및/또는 수의 세포를 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 형질도입 인큐베이션의 일부는 원심분리 챔버에서 수행되고, 이는 회전 또는 원심분리를 포함하는 조건에서 수행된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션의 추가 일부는 회전 또는 원심분리 없이 수행되고, 이는 일반적으로 챔버의 회전 또는 원심분리를 포함하는 인큐베이션의 적어도 일부에 이어서 수행되는, 인큐베이션을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션은 회전 또는 원심분리 없이 적어도 1시간, 6시간, 12시간, 24시간, 32시간, 48시간, 60시간, 72시간, 90시간, 96시간, 3일, 4일, 5일, 또는 5일 이상 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 72시간 동안 수행된다.
일부 상기 구현예에서, 추가 인큐베이션이 바이러스 벡터가 하나 이상의 세포의 숙주 게놈으로 통합되는 조건에서 수행된다. 인큐베이션으로 인해 바이러스 벡터 입자가 숙주 게놈에 통합되었는지 평가하거나 결정하여 추가 배양을 위한 조건을 경험적으로 알아내는 것은 숙련된 기술자의 수준 내에 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 숙주 게놈으로의 통합은 인큐베이션 후 바이러스 벡터 입자의 게놈에 함유된 핵산에 의해 암호화되는 이종 단백질과 같은 재조합 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 친화도 기반 방법, 예를 들어, 세포 표면 단백질의 맥락에서, 면역 친화도 기반 방법에 의한, 예컨대 유세포 분석에 의한 검출과 같이 재조합 분자의 발현 수준을 평가하기 위한 다수의 잘 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 예에서, 발현은 형질도입 표지자 및/또는 리포터 구조체의 검출에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 절단된 표면 단백질을 암호화하는 핵산이 벡터 내에 포함되고 발현 및/또는 이의 향상의 표지자로서 사용된다.
일부 구현예에서, 세포, 벡터(예를 들어, 바이러스 입자) 및 시약을 함유하는 조성물을 일반적으로 상대적으로 작은 힘 또는 저속으로, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 600rpm 내지 1700rpm, 약 600rpm 내지 약 1700rpm(예를 들어 (약) 또는 적어도 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm)으로 회전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 공동의 내벽 또는 외벽에서 측정했을 때, 100g 내지 3200g 또는 약 100g 내지 약 3200g(예를 들어 (약) 또는 적어도 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3200g)의 힘, 예를 들어, 상대 원심력으로 수행된다. 용어 “상대 원심력(relative centrifugal force)” 또는 RCF는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간의 특정 지점에서 지구의 중력에 대해 상대적인 물체 또는 물질(예컨대 세포, 샘플 또는 펠릿 및/또는 회전되는 챔버 또는 다른 용기의 지점)에 부여된 유효힘(effective force)으로 이해된다. 상기 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(회전축과 RCF를 측정하는 물체, 물질 또는 입자로부터의 거리)을 고려하여 잘 알려진 공식을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 조작(예를 들어, 형질도입)의 적어도 일부 중에 및/또는 유전자 조작 이후에, 세포는 상술한 바와 같이 세포의 육성 또는 증폭과 같은 유전적으로 조작된 세포의 배양을 위해 생물반응기 백 어셈블리로 전달된다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 형질도입 보조제의 존재 하에서 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 다가 양이온의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 형질도입 보조제의 존재 하에서 바이러스 벡터 입자로 형질도입(예를 들어, 인큐베이션)된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 형질도입 보조제의 존재 하에서 비-바이러스 벡터로 형질주입(예를 들어, 인큐베이션)된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 형질도입 보조제의 존재는 예컨대 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)되는 조성물의 세포의 양, 비율, 및/또는 백분율을 증가시켜 유전자 전달의 효율을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 형질도입 보조제의 존재는 형질주입의 효율을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 형질도입 보조제의 존재는 형질도입의 효율을 증가시킨다. 구체적인 구현예에서, 다가 양이온의 존재 하에서 조작되는 세포의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 발현한다. 일부 구현예에서, 조성물의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많은 세포가 형질도입 보조제가 존재하지 않는 대체 및/또는 예시적인 세포 조작 방법과 비교하여 다가 양이온의 존재 하에서 재조합 형질도입 보조제를 함유하거나 발현하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 농축된 세포 조성물은 100μg/ml 미만, 90μg/ml 미만, 80μg/ml 미만, 75μg/ml 미만, 70μg/ml 미만, 60μg/ml 미만, 50μg/ml 미만, 40μg/ml 미만, 30μg/ml 미만, 25μg/ml 미만, 20μg/ml 미만, 또는 10μg/ml 미만의 형질도입 보조제의 존재 하에서 조작된다. 특정 구현예에서, 제공된 방법과 사용하기에 적합한 형질도입 보조제는 다가 양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유래 단편 또는 변이체, 레트로넥틴, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 세포는 1 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 10 IU/ml 내지 50 IU/ml, 50 IU/ml 내지 100 IU/ml, 100 IU/ml 내지 200 IU/ml, 100 IU/ml 내지 500 IU/ml, 250 IU/ml 내지 500 IU/ml, 또는 500 IU/ml 내지 1,000 IU/ml 사이 농도의 사이토카인(예를 들어, 재조합 인간 사이토카인)의 존재 하에서 조작된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 1 IU/ml 내지 200 IU/ml, 10 IU/ml 내지 100 IU/ml, 50 IU/ml 내지 150 IU/ml, 80 IU/ml 내지 120 IU/ml, 60 IU/ml 내지 90 IU/ml, 또는 70 IU/ml 내지 90 IU/ml 사이 농도의 IL-2(예를 들어, 인간 재조합 IL-2)의 존재 하에서 조작된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 50 IU/ml, 55 IU/ml, 60 IU/ml, 65 IU/ml, 70 IU/ml, 75 IU/ml, 80 IU/ml, 85 IU/ml, 90 IU/ml, 95 IU/ml, 100 IU/ml, 110 IU/ml, 120 IU/ml, 130 IU/ml, 140 IU/ml, 또는 150 IU/ml 농도의 재조합 IL-2의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 85 IU/ml의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, T 세포 집단은 CD4+ T 세포 집단이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD4+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD8+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD8+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD8+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD4+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD4+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 100 IU/ml 내지 2,000 IU/ml, 500 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 100 IU/ml 내지 500 IU/ml, 500 IU/ml 내지 750 IU/ml, 750 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 또는 550 IU/ml 내지 650 IU/ml 사이 농도의 재조합 IL-7(예를 들어, 인간 재조합 IL-7)의 존재 하에서 조작된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 50 IU/ml, 100 IU/ml, 150 IU/ml, 200 IU/ml, 250 IU/ml, 300 IU/ml, 350 IU/ml, 400 IU/ml, 450 IU/ml, 500 IU/ml, 550 IU/ml, 600 IU/ml, 650 IU/ml, 700 IU/ml, 750 IU/ml, 800 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 또는 1,000 IU/ml 농도의 IL-7의 존재 하에서 조작된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 600 IU/ml의 IL-7의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-7의 존재 하에서 조작된 조성물은 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포의 집단에 대해 농축된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD4+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD8+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD8+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 0.1 IU/ml 내지 100 IU/ml, 1 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 25 IU/ml, 25 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 15 IU/ml, 또는 10 IU/ml 내지 100 IU/ml 사이 농도의 재조합 IL-15(예를 들어, 인간 재조합 IL-15)의 존재 하에서 조작된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 1 IU/ml, 2 IU/ml, 3 IU/ml, 4 IU/ml, 5 IU/ml, 6 IU/ml, 7 IU/ml, 8 IU/ml, 9 IU/ml, 10 IU/ml, 11 IU/ml, 12 IU/ml, 13 IU/ml, 14 IU/ml, 15 IU/ml, 20 IU/ml, 25 IU/ml, 30 IU/ml, 40 IU/ml, 또는 50 IU/ml 농도의 IL-15의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 10 IU/ml의 IL-15의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 10 IU/ml의 재조합 IL-15에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-15의 존재 하에서 조작된 조성물은 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 집단에 대해 농축된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD8+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD4+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD4+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 CD4+ T 세포에 대해 농축되고, 여기서 CD8+ T 세포는 농축되지 않고/거나 CD8+ T 세포는 조성물로부터 음성 선택되거나 고갈된다.
구체적인 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포 조성물이 IL-2 및/또는 IL-15의 존재 하에서 조작된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 조성물이 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 재조합형이다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 인간형이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 세포는 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 토코페롤, 토코트리에놀, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤, 알파-토코트리에놀, 베타-토코트리에놀, 알파-토코페롤퀴논, Trolox(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산), 부틸 하이드록시아니솔(BHA), 부틸 하이드록시톨루엔(BHT), 플라보노이드, 이소플라본, 리코펜, 베타카로틴, 셀레늄, 유비퀴논, 루에틴, S-아데노실메티오닌, 글루타티온, 타우린, N-아세틸 시스테인(NAC), 시트르산, L-카르니틴, BHT, 모노티오글리세롤, 아스코르브산, 프로필 갈레이트, 메티오닌, 시스테인, 호모시스테인, 글루타티온, 시스타민 및 시스타티오닌, 및/또는 글리신-글리신-히스티딘을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 함황 산화제(sulfur containing oxidant)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 함황 항산화제는 티올-함유 항산화제 및/또는 예를 들어 고리 구조 내에서 하나 이상의 황 모이어티를 나타내는 항산화제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 함황 항산화제는 예를 들어 N-아세틸시스테인(NAC) 및 2,3-다이머캅토프로판올(DMP), L-2-옥소-4-티아졸리딘카르복실레이트(OTC) 및 리포산을 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 함황 항산화제는 글루타티온 전구체이다. 일부 구현예에서, 글루타티온 전구체는 세포 내에서 하나 이상의 단계로 유래된 글루타티온으로 변형될 수 있는 분자이다. 구체적인 구현예에서, 글루타티온 전구체는 N-아세틸 시스테인(NAC), L-2-옥소티아졸리딘-4-카르복실산(프로시스테인), 리포산, S-알릴 시스테인 또는 염화 메틸메티오닌 설포늄을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 1ng/ml 내지 100ng/ml, 10ng/ml 내지 1μg/ml, 100ng/ml 내지 10μg/ml, 1μg/ml 내지 100μg/ml, 10μg/ml 내지 1mg/ml, 100μg/ml 내지 1mg/ml, 1 500μg/ml 내지 2mg/ml, 500μg/ml 내지 5mg/ml, 1mg/ml 내지 10mg/ml, 또는 1mg/ml 내지 100mg/ml의 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 1μg/ml, 10μg/ml, 100μg/ml, 0.2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.6mg/ml, 0.8mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml, 100mg/ml, 200mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml, 또는 500mg/ml의 하나 이상의 항산화제의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 함황 항산화제(sulfur containing antioxidant)이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 항산화제는 글루타티온 전구체이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 NAC의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 1ng/ml 내지 100ng/ml, 10ng/ml 내지 1μg/ml, 100ng/ml 내지 10μg/ml, 1μg/ml 내지 100μg/ml, 10μg/ml 내지 1mg/ml, 100μg/ml 내지 1mg/ml, 1,500μg/ml 내지 2mg/ml, 500μg/ml 내지 5mg/ml, 1mg/ml 내지 10mg/ml, 또는 1mg/ml 내지 100mg/ml의 NAC의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 1μg/ml, 10μg/ml, 100μg/ml, 0.2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.6mg/ml, 0.8mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml, 100mg/ml, 200mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml, 또는 500mg/ml의 NAC의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 0.8mg/ml과 함께 조작된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 하나 이상의 다가 양이온의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 하나 이상의 다가 양이온의 존재 하에서 바이러스 벡터 입자로 형질도입(예를 들어, 인큐베이션)된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 하나 이상의 다가 양이온의 존재 하에서 비-바이러스 벡터로 형질주입(예를 들어, 인큐베이션)된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 다가 양이온의 존재는 예컨대 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)되는 조성물의 세포의 양, 비율, 및/또는 백분율을 증가시켜 유전자 전달의 효율을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 다가 양이온의 존재는 형질주입의 효율을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 다가 양이온의 존재는 형질도입의 효율을 증가시킨다. 구체적인 구현예에서, 다가 양이온의 존재 하에서 조작되는 세포의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 발현한다. 일부 구현예에서, 조성물의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많은 세포가 다가 양이온이 존재하지 않는 대체 및/또는 예시적인 세포 조작 방법과 비교하여 다가 양이온의 존재 하에서 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 발현하도록 조작된다.
특정 구현예에서, 농축된 세포 조성물, 예를 들어 농축된 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD8+ T 세포, 예컨대 이들의 자극된 T 세포 조성물은, 예를 들어 다가 양이온의 존재 하에서 예시적인 및/또는 대체 세포 조작 방법에 대비하여, 낮은 농도 또는 양의 다가 양이온의 존재 하에서 조작된다. 특정 구현예에서, 농축된 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 세포를 조작하기 위한 예시적 및/또는 대체 공정의 다가 양이온의 양 및/또는 농도보다 90% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1%, 또는 0.01% 미만의 존재 하에서 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 100μg/ml 미만, 90μg/ml 미만, 80μg/ml 미만, 75μg/ml 미만, 70μg/ml 미만, 60μg/ml 미만, 50μg/ml 미만, 40μg/ml 미만, 30μg/ml 미만, 25μg/ml 미만, 20μg/ml 미만, 또는 10μg/ml 미만의 다가 양이온의 존재 하에서 조작된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 (약) 1μg/ml, 5μg/ml, 10μg/ml, 15μg/ml, 20μg/ml, 25μg/ml, 30μg/ml, 35μg/ml, 40μg/ml, 45μg/ml, 또는 50μg/ml의 다가 양이온의 존재 하에서 조작된다.
구체적인 구현예에서, 다가 양이온의 존재 하에서 농축된 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물을 조작하면, 예를 들어 괴사, 세포예정사, 또는 세포자멸사에 의한, 세포 사멸의 양이 줄어든다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 낮은 양, 예를 들어 100μg/ml, 50μg/ml, 또는 10μg/ml 미만의 다가 양이온의 존재 하에서 조작되고, 세포 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%는 조작 단계가 완료된 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 7일 초과 시점에 또는 그 동안에 생존한다(예를 들어, 괴사, 세포예정사, 또는 세포자멸사를 겪지 않는다). 일부 구현예에서, 조성물은 더 높은 양 또는 농도, 예를 들어 50μg/ml, 100μg/ml, 500μg/ml, 또는 1,000μg/ml보다 많은 다가 양이온의 존재 하에서 세포를 조작하는 예시적 및/또는 대체 방법과 비교하여 낮은 농도 또는 양의 다가 양이온의 존재 하에서 조작되고, 조성물의 세포는 상기 예시적인 및/또는 대체 공정을 겪은 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 생존한다.
일부 구현예에서, 다가 양이온은 양전하를 띤다. 특정 구현예에서, 다가 양이온은 세포와 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터) 사이의 반발력을 감소시키고, 세포 표면에 대한 벡터의 접촉 및/또는 결합을 매개한다. 일부 구현예에서, 다가 양이온은 폴리브렌, DEAE-덱스트란, 프로타민 황산염, 폴리-L-리신 또는 양이온성 리포솜이다.
구체적인 구현예에서, 다가 양이온은 프로타민 황산염이다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 약 500μg/ml 이하, 약 400μg/ml 이하, 약 300μg/ml 이하, 약 200μg/ml 이하, 약 150μg/ml 이하, 약 100μg/ml 이하, 약 90μg/ml 이하, 약 80μg/ml 이하, 약 75μg/ml 이하, 약 70μg/ml 이하, 약 60μg/ml 이하, 약 50μg/ml 이하, 약 40μg/ml 이하, 약 30μg/ml 이하, 약 25μg/ml 이하, 약 20μg/ml 이하, 또는 약 15μg/ml 이하, 또는 약 10μg/ml 이하의 프로타민 황산염의 존재 하에서 조작된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 세포, 예컨대 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포 또는 자극된 CD8+ T 세포) 조성물은 (약) 1μg/ml, 5μg/ml, 10μg/ml, 15μg/ml, 20μg/ml, 25μg/ml, 30μg/ml, 35μg/ml, 40μg/ml, 45μg/ml, 50μg/ml, 55μg/ml, 60μg/ml, 75μg/ml, 80μg/ml, 85μg/ml, 90μg/ml, 95μg/ml, 100μg/ml, 105μg/ml, 110μg/ml, 115μg/ml, 120μg/ml, 125μg/ml, 130μg/ml, 135μg/ml, 140μg/ml, 145μg/ml, 또는 150μg/ml의 프로타민 황산염의 존재 하에서 조작된다.
일부 구현예에서, 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포) 등의 농축된 CD4+ T 세포의 조작된 조성물은 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD4+ T 세포) 등의 조작된 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD8+ T 세포) 등의 조작된 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극된 T 세포(예를 들어, 자극된 CD8+ T 세포) 등의 조작된 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 세포를 조작하는 것은 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터)와 함께 배양, 접촉 또는 인큐베이션하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작하는 것은 (약) 또는 적어도 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 40시간, 48시간, 54시간, 60시간, 72시간, 84시간, 1일, 2일 , 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일, 또는 7일 이상 동안 세포를 벡터와 함께 배양, 접촉, 및/또는 인큐베이션하는 것을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 조작하는 것은 (약) 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 또는 84시간, 또는 (약) 2일, 3일, 4일 또는 5일 동안 세포를 벡터와 함께 배양, 접촉, 및/또는 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작 단계는 (약) 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 또는 84시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 조작은 약 60시간 동안 또는 약 84시간 동안, (약) 72시간 동안, 또는 (약) 2일 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 조작은 약 25 내지 약 38°C, 예컨대 약 30 내지 약 37°C, 약 36 내지 약 38°C, 또는 (약) 37°C ± 2°C의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 약 2.5% 내지 약 7.5%, 예컨대 약 4% 내지 약 6%, 예를 들어, (약) 5% ± 0.5%의 CO2 수준에서 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 37°C의 온도에서 및/또는 (약) 5%의 CO2 수준에서 조작된다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)는 세포가 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하도록 유전자 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)을 위한 하나 이상의 단계를 수행한 후, 육성된다. 일부 구현예에서, 육성(cultivation)은 배양, 인큐베이션, 자극, 활성화, 증폭, 및/또는 번식을 포함할 수 있다. 일부 상기 구현예에서, 추가 육성이 바이러스 벡터가 하나 이상의 세포의 숙주 게놈으로 통합되는 조건 하에 수행된다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰(well), 컬럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알(vial), 배양 접시, 백(bag) 또는 배양 또는 세포 육성을 위한 다른 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션된다. 상기 조건은 집단에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 추가 인큐베이션이 실온보다 높은, 예컨대 약 25°C 이상, 예컨대 일반적으로 (약) 32°C, 35°C 또는 37°C보다 높은 온도에서 실행된다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션이 (약) 37°C ± 2°C의 온도에서, 예컨대 (약) 37°C의 온도에서 실행된다.
일부 구현예에서, 추가 인큐베이션이 세포의 자극 및/또는 활성화를 위한 조건에서 수행되며, 이 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 자극제 및/또는 부속제)예를 들어, 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 제제는, TCR 성분에 특이적인 것과 같이 예를 들어 ITAM 유도 신호의 활성화를 개시하기 위해 1차 신호를 전달하기에 적합한 제제 및/또는 예를 들어 선택적으로 비드와 같은 고체 지지체에 결합된 T 세포 공자극 수용체, 예를 들어 항-CD3, 항-CD28 또는 항-41-BB에 특이적인 것과 같은 공자극 신호를 촉진하는 제제 및/또는 하나 이상의 사이토카인과 같이, T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 계단식 다단계 반응을 작동시키거나 개시한다. 자극제 중에는 항-CD3/항-CD28 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander 및/또는 ExpACT® 비드)가 있다. 선택적으로, 증폭 방법은 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제(stimulating agent)는 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, 적어도 약 10 유닛/mL의 IL-2 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리간드)를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 계단식 다단계 반응을 작동시키거나 개시한다. 상기 제제는 TCR 성분 및/또는 공자극 수용체에 특이적인 항체와 같은 항체, 예를 들어 비드와 같은 고체 지지체에 결합된 항-CD3, 항-CD28 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 선택적으로, 증폭 방법은 (예를 들어, 적어도 약 0.5ng/ml 이상의 농도의) 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, 적어도 약 10 유닛/mL, 적어도 약 50 유닛/mL, 적어도 약 100 유닛/mL 또는 적어도 약 200 유닛/mL의 IL-2 농도를 포함한다.
상기 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040,177 Riddell 등, Klebanoff 등 (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 등 (2012) Blood.1:72-82 및/또는 Wang 등 (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 접촉이 일어나는 동일한 용기 또는 장치에서 추가 인큐베이션이 실행된다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션이 회전 또는 원심분리 없이 수행되며, 이는 일반적으로 예를 들어 원심분리 또는 회전 접종과 관련하여, 회전 하에 행해진 인큐베이션의 적어도 일부에 이어서 수행된다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션이 예를 들어 용액에서, 크로마토그래피 매트릭스 외부와 같은 정지상 외부에서 수행된다.
일부 구현예에서, 추가 인큐베이션이 접촉이 일어난 것과 다른 용기 또는 장치에서, 예컨대 바이러스 입자 및 시약과 접촉한 이후 다른 용기 또는 장치 내로 세포 조성물의 전달(예를 들어, 자동 전달)에 의해 수행된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 생체외 증폭을 촉진하기 위한, 추가 배양 또는 인큐베이션이 약 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 추가 배양 또는 인큐베이션이 6일 이내, 5일 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일 이내 또는 24시간 이내 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 자극제와의 인큐베이션의 총 지속 시간은 (약) 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간, 예컨대 적어도 (약) 또는 약 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 (약) 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간(수치 포함) 동안이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 추가 배양 또는 인큐베이션을 포함하지 않거나(예를 들어, 생체외 증폭 단계를 포함하지 않거나) 실질적으로 더 짧은 생체외 증폭 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 조작 전에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 조작 후에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 특정 구현예에서, 자극제는 조작 이후에 및 조작된 세포를, 예를 들어, 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 육성하기 전에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 섹션 II-B-1에 기술된 자극 시약이다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 섹션 II-B-2에 기술된 바와 같이 세포로부터 제거 및/또는 분리된다.
1. 벡터 및 방법
또한, 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 분자), 조작된 세포를 생산하기 위해 제공된 방법에 따라 상기와 같은 수용체를 발현하도록 세포를 유전적으로 조작하기 위한 벡터가 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산을 함유한다. 구체적인 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 벡터는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터)와 같은 바이러스 벡터이다.
일부 경우에, 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 신호 펩타이드의 비제한적인 예시적인 예에는 예를 들어, 서열 번호: 9에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고 서열 번호: 10에 제시된 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩타이드, 서열 번호: 11에 제시된 CD8 알파 신호 펩타이드, 또는 서열 번호: 12에 제시된 CD33 신호 펩타이드가 포함된다.
일부 구현예에서, 벡터에는 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스), 비-바이러스 벡터 또는 트랜스포손(예를 들어, Sleeping Beauty 트랜스포손 시스템), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터, 감마-레트로바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식 육종 바이러스(MPSV), 뮤린 배아 줄기세포 바이러스(MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV), 비장 병소 형성 바이러스(SFFV) 또는 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터 등이 포함된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 DNA는 이종 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한다. 일부 구현예에서, 이종 재조합 분자는 재조합 수용체(예를 들어, 항원 수용체), SB-트랜스포손(예를 들어, 유전자 침묵을 위한 캡시드로 둘러싼 트랜스포손), (예를 들어, 게놈 재조합 또는 리포터 유전자를 위한) 상동성 이중 가닥 핵산(예를 들어, GFP 또는 루시퍼라아제와 같은 형광 단백질)이거나 이를 포함한다.
a. 바이러스 벡터 입자
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 문헌[Koste 등 (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조).
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아 줄기세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 병소 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV) 또는 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류(avian) 또는 포유동물 세포 공급원으로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag(객), pol(폴) 및/또는 env(엔브) 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 등 (1991) Virology 180:849-852; Burns 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기술되어 있다.
렌티바이러스 형질도입 방법은 알려져 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어, 문헌[Wang 등 (2012) J. Immunother . 35(9): 689-701; Cooper 등 (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등 (2009) Methods Mol Biol . 506: 97-114; 및 Cavalieri 등 (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 게놈 기반 벡터로부터 유래된 것과 같은 레트로바이러스 게놈 기반 벡터로부터 유래된 게놈을 함유한다. 제공된 바이러스 벡터의 일부 측면에서, CAR과 같은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산은 벡터 게놈의 5′ LTR 및 3′ LTR 서열 사이에 함유되고/거나 위치한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈과 같은 렌티바이러스 게놈이다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 병독성 유전자를 약화시켜 배가시킴으로써 생성되었으며, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpu 및 nef가 결실되어 치료 목적으로 벡터를 더 안전하게 만들 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 알려져 있다. 문헌[Naldini 등, (1996 및 1998); Zufferey 등, (1997); Dull 등, 1998, 미국 특허 번호 6,013,516; 및 5,994,136]을 참조한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 숙주 세포 내로 핵산을 전달하기 위한, 선택을 위한 및 외부 핵산을 통합하기 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 알려진 렌티바이러스는 미국형 배양 컬렉션(“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)과 같은 기탁 기관 또는 컬렉션으로부터 용이하게 수득될 수 있거나 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 알려진 공급원으로부터 단리될 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 비제한적인 예로는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1), HIV-2, 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 T-세포림프친화 바이러스 1(HTLV-1), HTLV-2 또는 말 감염 빈혈 바이러스(EIAV)와 같은 렌티바이러스 유래 벡터가 포함된다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 HIV 병독성 유전자를 약화시켜 배가시킴으로써 생성되었으며, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되어 치료 목적으로 벡터를 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터는 본 기술분야에 알려져 있으며, 문헌[Naldini 등, (1996 및 1998); Zufferey 등, (1997); Dull 등, 1998, 미국 특허 번호 6,013,516; 및 5,994,136]을 참조한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 숙주 세포 내로 핵산을 전달하기 위한, 선택을 위한 및 외부 핵산을 통합하기 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 알려진 렌티바이러스는 미국형 배양 컬렉션(“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)과 같은 기탁 기관 또는 컬렉션으로부터 용이하게 수득될 수 있거나 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 알려진 공급원으로부터 단리될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 게놈 벡터는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스의 5′ 및 3′ LTR 서열을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 게놈 구조체는 렌티바이러스의 5′ 및 3′ LTR로부터의 서열을 함유할 수 있고, 특히 렌티바이러스의 5′ LTR에서 R 및 U5 서열 및 렌티바이러스에서 비활성화된 또는 자가 비활성화 3′ LTR을 함유할 수 있다. LTR 서열은 임의의 종 유래의 렌티바이러스의 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어, 이는 HIV, SIV, FIV 또는 BIV 유래의 LTR 서열일 수 있다. 통상적으로 LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
일부 구현예에서, HIV 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 핵산은 추가 전사 단위가 결여된다. 벡터 게놈은 비활성화된 또는 자가 비활성화 3′ LTR을 함유할 수 있다(Zufferey 등 J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi 등, J Virol 72:8150, 1998). 예를 들어, 바이러스 벡터 RNA를 생산하는 데 사용되는 핵산의 3′ LTR의 U3 영역에서의 결실은 자가 비활성화(self-inactivating, SIN) 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이어서 상기 결실은 역전사 동안 프로바이러스(proviral) DNA의 5′ LTR로 전달될 수 있다. 자가 비활성화 벡터는 일반적으로 벡터 통합 중에 5′ LTR로 복사되는 3′ 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR)로부터 인핸서 및 프로모터 서열의 결실이 있다. 일부 구현예에서, LTR의 전사 활성을 폐기하기 위해 TATA 박스의 제거를 포함하여 충분한 서열이 제거될 수 있다. 이는 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 방지할 수 있다. 일부 측면에서, 3′ LTR의 U3 요소는 인핸서 서열, TATA 박스, Sp1 및 NF-카파 B 부위의 결실을 함유한다. 자가 비활성화 3′ LTR의 결과로, 도입 및 역전사 후에 생성되는 프로바이러스(provirus)는 비활성화된 5′ LTR을 함유한다. 이는 벡터 게놈의 이동 위험 및 근처 세포 프로모터에 대한 LTR의 영향력을 감소시킴으로써 안전성을 개선할 수 있다. 자가 비활성화 3′ LTR은 본 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 구조체화될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 벡터 역가 또는 벡터의 시험관내 또는 생체내 특성에 영향을 미치지 않는다.
선택적으로, 렌티바이러스 5′ LTR로부터의 U3 서열은 바이러스 구조체에서 이종 프로모터 서열과 같은 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 패키징 세포주에서 회수되는 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열도 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합이 사용될 수 있다. 일 예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 사용된다(미국 특허 번호 5,385,839 및 미국 특허 번호 5,168,062).
특정 구현예에서, 삽입 돌연변이 유발의 위험은 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 레트로바이러스 벡터 게놈을 통합 결함이 있는 것으로 구성함으로써 최소화할 수 있다. 비통합 벡터 게놈을 생산하기 위해 다양한 접근법을 추구할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 비활성 인테그라제가 있는 단백질을 암호화하도록 pol 유전자의 인테그라제 효소 성분 내로 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈 자체는 예를 들어 하나 또는 둘 모두의 부착 부위를 돌연변이시키거나 또는 결실시키거나 3′ LTR-근위 폴리퓨린관(PPT)을 결실 또는 변형을 통해 비기능성으로 만들어 통합을 방지하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 비유전적 접근법이 이용 가능하고; 이는 인테그라제의 하나 이상의 기능을 억제하는 약리학 제제를 포함한다. 상기 접근법은 상호 배타적이지 않다; 즉, 이 중 하나 이상을 한 번에 사용할 수 있다. 예를 들어, 인테그라제와 부착 부위 모두 비기능성일 수 있거나, 인테그라제와 PPT 부위가 비기능성일 수 있거나 또는 부착 부위와 PPT 부위가 비기능성일 수 있거나 또는 이들 모두가 비기능성일 수 있다. 상기 방법과 바이러스 벡터 게놈은 알려져 있고 이용 가능하다(문헌[Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman 등 J Virol 69:2729, 1995; Brown 등 J Virol 73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams 등, J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996] 참조).
일부 구현예에서, 벡터는 원핵생물 숙주 세포와 같은 숙주 세포에 번식을 위한 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산은 세균 세포와 같은 원핵 세포에 번식을 위한 하나 이상의 복제 기점을 함유한다. 일부 구현예에서, 원핵 생물 복제 기점을 포함하는 벡터는 또한 유전자의 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 표지자를 부여하는 유전자를 함유할 수 있다.
바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주로 형질주입될 수 있는 플라스미드 형태로 구조체화된다. 게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 함유하는 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 다양한 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개 이상의 성분이 바이러스 기반 유전자 전달 시스템을 만드는 데 관여하는데, 첫째, 바이러스 벡터 입자를 생성하는 데 필요한 효소뿐만 아니라 구조 단백질을 포함하는 패키징 플라스미드이고, 둘째, 바이러스 벡터 자체, 즉, 전달될 유전 물질이다. 생물학적 안전성 보호 장치를 상기 성분들 중 하나 또는 둘 다의 설계에 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는 외피 단백질 이외의 HIV-1과 같은 모든 레트로바이러스 단백질을 함유할 수 있다(Naldini 등, 1998). 다른 구현예들에서, 바이러스 벡터에는 병독성과 연관된 유전자, 예를 들어 vpr, vif, vpu 및 nef 및/또는 Tat, 즉 HIV의 1차 전이 활성 인자(transactivator)와 같은 추가 바이러스 유전자가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV 기반 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터는 모(parental) 바이러스의 3가지 유전자: gag, pol 및 rev만을 포함하며, 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는 데 필요한 모든 성분을 함유하는 패키징 세포주에 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은 하나 이상의 관심 서열, 예를 들어, 재조합 핵산 외에도 바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자는 제거되어 패키징 세포주에 별도로 제공된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주가 입자를 생성하는 데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 LTR, 시스-작용(cis-acting) 패키징 서열 및 관심 서열, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 암호화하는 핵산; 및 바이러스의 효소 성분 및/또는 구조 성분, 예컨대 gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 포함한 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전 성분을 분리하기 위해 다중 벡터가 사용된다. 일부 상기 구현예에서, 패키징 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 가능 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 이벤트의 가능성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위해 슈도타입화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 VSV-G 당단백질로 슈도타입화되며, 이는 형질도입될 수 있는 세포 유형을 확장하는 광범위한 세포 숙주 범위를 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 예컨대 신드비스(Sindbis) 바이러스 외피, GALV 또는 VSV-G와 같은 이종향성(xenotropic), 다방성(polytropic) 또는 암포트로픽(amphotropic) 외피를 포함하는 비천연 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드 또는 폴리뉴클레오타이드로 형질주입된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스 벡터 입자로 패키징하기 위해 트랜스에서 요구되는 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함한 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고 기능성 렌티바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주에는 293(ATCC CCL X), 293T, HeLA(ATCC CCL 2), D17(ATCC CCL 183), MDCK(ATCC CCL 34), BHK(ATCC CCL-10) 및 Cf2Th(ATCC CRL 1430) 세포가 포함된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 안정적으로 바이러스 단백질(들)을 발현한다. 예를 들어, 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 기타 구조 유전자를 함유하나 LTR 및 패키징 성분은 함유하지 않는 패키징 세포주가 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 이종 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 외피 당단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 일시적으로 형질주입될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 및/또는 헬퍼 플라스미드는 패키징 세포주 내로 형질주입 또는 감염을 통해 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 벡터 입자를 생산한다. 형질주입 또는 감염을 위한 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예에는 인산칼슘, DEAE-덱스트란 및 리포펙션(lipofection) 방법, 전기천공법 및 미세주입이 포함된다.
재조합 플라스미드, 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열이 특수 세포주로(예를 들어, 인산칼슘 침전에 의해) 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자로 패키징되도록 허용할 수 있으며, 이어서 이는 배양 배지로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지가 채집되고, 선택적으로 농축되고, 유전자 전달을 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 패키징 플라스미드 및 전달 벡터를 패키징 세포주로 공형질주입(cotransfection) 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되어 당업자들에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 등의 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징 세포주에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 형질주입되고/거나 gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체(예를 들어, CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 선택적으로 및/또는 추가적으로 형질주입되고/거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 VSV-G와 같은 비천연 외피 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 선택적으로 및/또는 추가적으로 형질주입되고/거나 이를 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 세포(예를 들어, HEK 293T 세포)의 형질주입 후 대략 2일 후에, 세포 상청액은 재조합 렌티바이러스 벡터를 함유하고 이는 회수되어 적정될 수 있다.
회수 및/또는 생산된 레트로바이러스 벡터 입자는 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵 내로 유입되어 안정적으로 숙주 게놈에 통합된다. 바이러스 RNA의 통합 후 1일 또는 2일 후, 재조합 단백질(예를 들어, 항원 수용체, 예컨대 CAR)의 발현이 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 복수의 세포를 포함하는 세포 조성물을 바이러스 입자와 접촉함으로써, 예를 들어, 인큐베이션함으로써 세포를 형질도입하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 형질주입 또는 형질도입될 세포는 대상체로부터 농축 및/또는 선택된 세포와 같은 대상체로부터 수득된 1차 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물의 형질도입될 세포의 농도는 1.0 x 105개 세포/mL 내지 1.0 x 108개 세포/mL 또는 약 1.0 x 105개 세포/mL 내지 약 1.0 x 108개 세포/mL, 예컨대 적어도 (약) 또는 약 1.0 x 105개 세포/mL, 5 x 105개 세포/mL, 1 x 106개 세포/mL, 5 x 106개 세포mL, 1 x 107개 세포/mL, 5 x 107개 세포/mL 또는 1 x 108개 세포/mL이다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자는 형질도입될 세포의 총 수당 바이러스 벡터 입자의 특정 비의 카피 수 또는 이의 감염 단위(IU)로 제공된다(IU/세포). 예를 들어, 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 접촉하는 동안 하나의 세포당 (약) 또는 적어도 (약) 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 IU의 바이러스 벡터 입자로 존재한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자의 역가는 (약) 1 x 106 IU/mL 내지 1 x 108 IU/mL, 예컨대 (약) 5 x 106 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL, 예컨대 적어도 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, 또는 5 x 107 IU/mL이다.
일부 구현예에서, 형질도입은 100 미만, 예컨대 일반적으로 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 이하 미만의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)에서 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포를 바이러스 입자와 접촉 또는 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 접촉은 30분 내지 72시간, 예컨대 30분 내지 48시간, 30분 내지 24시간 또는 1시간 내지 24시간, 예컨대 적어도 (약) 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간 또는 그 이상 동안 이루어진다.
일부 구현예에서, 접촉은 용액에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 입자는 0.5mL 내지 500mL 또는 약 0.5mL 내지 약 500mL, 예컨대 (약) 0.5mL 내지 200mL, 0.5mL 내지 100mL, 0.5mL 내지 50mL, 0.5mL 내지 10mL, 0.5mL 내지 5mL, 5mL 내지 500mL, 5mL 내지 200mL, 5mL 내지 100mL, 5mL 내지 50mL, 5mL 내지 10mL, 10mL 내지 500mL, 10mL 내지 200mL, 10mL 내지 100mL, 10mL 내지 50mL, 50mL 내지 500mL, 50mL 내지 200mL, 50mL 내지 100mL, 100mL 내지 500mL, 100mL 내지 200mL 또는 200mL 내지 500mL의 부피에서 접촉된다.
특정 구현예에서, 투입 세포는 바이러스 DNA에 의해 암호화되는 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 결합 분자를 포함하는 입자로 처치, 인큐베이션 또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자와 세포의 인큐베이션은 바이러스 벡터 입자로 형질도입된 세포를 포함하는 산출 조성물을 초래하거나 생산한다.
b. 비-바이러스 벡터
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기천공법을 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌[Chicaybam 등, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo 등 (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위(transposition)를 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌[Manuri 등 (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma 등 (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang 등 (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126] 참조). 면역 세포에 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법에는 인산칼슘 형질주입(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.]에 기술된 바와 같음), 원형질체 융합, 양이온성 리포솜-매개 형질주입; 텅스텐 입자 촉진 마이크로입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산스트론튬 DNA 공동 침전(Brash 등, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))이 포함된다.
재조합 생성물을 암호화하는 핵산 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예를 들어, 문헌[국제 특허 출원 공개 번호: WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190]에 기술된 것이다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산이 트랜스포손을 통해 T 세포 내로 전달된다. 트랜스포손(전이 가능한 인자)은 게놈 내에서 한 유전자 자리에서 다른 유전자 자리로 이동할 수 있는 DNA의 이동 가능 분절이다. 이러한 요소들은 보존적인 “잘라내고 붙이는” 메커니즘을 통해 이동하며: 유전자전위효소(transposase)는 원래 위치에서 트랜스포손의 절단을 촉매하고 게놈의 다른 곳에서 재통합을 촉진한다. 유전자전위효소가 다른 유전자전위효소 유전자에 의해 제공되면 유전자전위효소-결핍 요소는 동원될 수 있다. 따라서, 트랜스포손은 바이러스 형질도입 시스템을 사용하지 않고 외래 DNA를 숙주 게놈에 통합하는 데 사용될 수 있다. 포유동물 세포(예를 들어, 인간 1차 백혈구)와 함께 사용하기에 적합한 트랜스포손의 예에는 Sleeping Beauty 및 PiggyBac이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
트랜스포손 기반 형질주입은 유전자전위효소와 트랜스포손으로 구성된 2성분 시스템이다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 동반하는 유전자전위효소에 의해 인식되는 역반복/직접 반복(IR/DR) 서열이 측면에 배치된 외래 DNA(본원에서는 카고 DNA라고도 함)(예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 유전자)를 포함하도록 조작된 트랜스포손을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 플라스미드는 프로모터의 통제 하에 유전자전위효소를 암호화한다. 플라스미드를 숙주 세포로 형질주입시키면 유전자전위효소의 일시적인 발현이 일어나므로, 형질주입 후 초기 기간 동안 유전자전위효소는 게놈 DNA에 트랜스포손을 통합하기에 충분한 수준으로 발현된다. 일부 구현예에서, 유전자전위효소 자체는 게놈 DNA에 통합되지 않으며, 따라서 유전자전위효소의 발현은 시간이 지남에 따라 감소한다. 일부 구현예에서, 유전자전위효소 발현은 약 4시간 미만, 약 8시간 미만, 약 12시간 미만, 약 24시간 미만, 약 2일 미만, 약 3일 미만, 약 4일 미만, 약 5일 미만, 약 6일 미만, 약 7일 미만, 약 2주 미만, 약 3주 미만, 약 4주 미만, 약 1주 미만, 또는 약 8주 미만 동안 해당 트랜스포손을 통합하기에 충분한 수준으로 숙주 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 숙주의 게놈에 도입된 카고 DNA는 적어도 숙주가 카고 DNA를 절단할 수 있는 내인성 유전자전위효소를 발현하지 않기 때문에 이후에 숙주의 게놈에서 제거되지 않는다.
Sleeping Beauty(SB)는 연어류 어류 게놈에 숨어 있는 휴면 요소로부터 재구성된 트랜스포손의 Tc/1-마리너(mariner) 상과(superfamily)의 합성 멤버이다. SB 트랜스포손 기반 형질주입은 TA 디뉴클레오타이드로의 정확한 통합을 초래하는 역반복/직접 반복(IR/DR) 서열을 함유하는 트랜스포손 및 유전자전위효소로 구성된 2성분 시스템이다. 트랜스포손은 IR/DR들이 측면에 배치된 관심 발현 카세트로 설계된다. SB 유전자전위효소는 Sleeping Beauty 트랜스포손의 IR에 위치한 특이적 결합 부위에 결합한다. SB 유전자전위효소는 촉매 효소(SB)에 대한 결합 부위를 보유하는 역 말단 반복부에 의해 양쪽에 측면에 배치된 카고 서열을 암호화하는 이동성 요소인 트랜스포손의 통합을 매개한다. SB가 잘라내고 붙이는 메커니즘을 통해 TA 표적 디뉴클레오타이드에서 척추동물 염색체에 유전자 서열을 삽입할 때 안정적인 발현이 발생한다. 이 시스템은 1차 인간 말초 혈액 백혈구를 포함하여 다양한 척추동물 세포 유형을 조작하는 데 사용해 왔다. 일부 구현예에서, 세포는 SB IR 서열이 측면에 배치된, 카고 유전자, 예를 들어 재조합 수용체 또는 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 SB 트랜스포손으로 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처치된다. 구체적인 구현예에서, 형질주입될 세포는 SB IR 서열이 측면에 배치된, 카고 유전자, 예를 들어 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 SB 트랜스포손을 포함하는 플라스미드로 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처치된다. 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 SB IR 서열이 측면에 배치되지 않은 SB 유전자전위효소를 암호화하는 유전자를 더 포함한다.
PiggyBac(PB)은 카고 DNA를 숙주의(예를 들어, 인간의) 게놈 DNA 내로 통합하는 데 사용될 수 있는 또 다른 트랜스포손 시스템이다. PB 유전자전위효소는 트랜스포손의 양쪽 끝에 위치한 PB 트랜스포손 특이적 역 말단 반복 서열(ITR)을 인식하고 원래 부위에서 내용물을 효율적으로 이동시키고 이 내용물을 TTAA 염색체 부위에 효율적으로 통합한다. PB 트랜스포손 시스템은 PB 벡터의 두 ITR 사이의 관심 유전자들이 표적 게놈들 내로 동원될 수 있도록 한다. PB 시스템은 1차 인간 세포를 포함하여 다양한 척추동물 세포 유형을 조작하는 데 사용해 왔다. 일부 구현예에서, 형질주입될 세포는 PB IR 서열이 측면에 배치된, 카고 유전자, 예를 들어 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 PB 트랜스포손으로 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처치된다. 구체적인 구현예에서, 형질주입될 세포는 PB IR 서열이 측면에 배치된, 카고 유전자, 예를 들어 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 PB 트랜스포손을 포함하는 플라스미드로 접촉, 인큐베이션, 및/또는 처치된다. 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 PB IR 서열이 측면에 배치되지 않은 SB 유전자전위효소를 암호화하는 유전자를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 대상 방법에 사용된 트랜스포손/유전자전위효소의 다양한 요소들, 예를 들어 SB 또는 PB 벡터(들)는 제한 효소 절단, 결찰 및 분자 클로닝의 표준 방법에 의해 생산될 수 있다. 대상 벡터를 구조체화하기 위한 한 프로토콜에는 다음 단계들이 포함된다. 먼저, 초기 공급원, 예를 들어 유전자전위효소 유전자를 포함하는 벡터로부터 제한 엔도뉴클레아제로 원하는 성분 뉴클레오타이드 서열 및 외부 서열을 함유하는 정제된 핵산 단편을 절단한다. 그런 후, 원하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단편을 통상적인 분리 방법을 사용하여, 예를 들어 아가로스 겔 전기영동에 의해, 상이한 크기의 원치 않는 단편과 분리한다. 원하는 단편을 겔로부터 절제하고 적절한 구성으로 함께 결찰하여 원하는 서열, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 대상 벡터의 다양한 요소들에 해당하는 서열을 함유하는 원형 핵산 또는 플라스미드가 생산되도록 한다. 그런 후, 원하는 경우, 그렇게 구조체화된 원형 분자를 원핵 숙주, 예를 들어 대장균(E. coli )에서 증폭시킨다. 이 단계들에 관련된 절단, 플라스미드 구조체화, 세포 형질전환 및 플라스미드 생산의 절차는 당업자에게 잘 알려져 있고 제한 및 결찰에 필요한 효소는 상업적으로 입수할 수 있다. 예를 들어, 문헌[R. Wu, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Catalog 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catalog 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc.]을 참조한다. 대상 방법에 사용된 벡터를 구조체화하는 방법의 예는 아래의 실험 섹션에 제공된다. 대표적인 Sleeping Beauty 트랜스포손 시스템의 준비는 또한 문헌[WO 98/40510 및 WO 99/25817]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 트랜스포손을 이용한 형질도입이 유전자전위효소 유전자를 포함하는 플라스미드 및 유전자전위효소에 의해 인식되는 역반복/직접 반복(IR/DR) 서열이 측면에 배치된 카고 DNA 서열을 함유하는 트랜스포손을 포함하는 플라스미드로 수행된다. 특정 구현예에서, 카고 DNA 서열은 이종 단백질, 예를 들어 재조합 T 세포 수용체 또는 CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 유전자전위효소 및 트랜스포손을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자전위효소는 유비쿼터스 프로모터, 또는 표적 세포에서 유전자전위효소의 발현을 유도하기에 적합한 임의의 프로모터의 제어를 받는다. 유비쿼터스 프로모터에는 EF1a, CMB, SV40, PGK1, Ubc, 인간 β-액틴, CAG, TRE, UAS, Ac5, CaMKIIa, 및 U6이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 카고 DNA는 카고 DNA를 게놈 DNA에 안정적으로 통합하여 세포의 선택을 가능하게 하는 선택 카세트를 포함한다. 적합한 선택 카세트에는 카나마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카르베니실린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 에리트로마이신 내성 유전자 및 폴리믹신 B 내성 유전자를 암호화하는 선택 카세트들이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 트랜스포손으로 형질도입을 하기 위한 성분들, 예를 들어 SB 유전자전위효소 및 SB 트랜스포손을 포함하는 플라스미드들이 표적 세포 내로 도입된다. 프로토콜이 표적 세포의 위치에 따라 표적 세포 내로 시스템 성분들의 시험관내 또는 생체내 도입을 제공할 수 있는, 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포가 단리된 세포인 경우, 시스템은, 예를 들어 표준 형질전환 기술을 사용하여, 표적 세포의 생존력이 허용되는 세포 배양 조건에서 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 상기와 같은 기술에는 바이러스 감염, 형질전환, 접합, 원형질체 융합, 전기천공, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입, 바이러스 벡터 전달 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 방법의 선택은 일반적으로 형질전환되는 세포의 유형과 형질전환이 일어나는 환경(즉, 시험관내, 생체외, 또는 생체내)에 따라 달라진다. 이러한 방법에 대한 일반적인 논의는 문헌[Ausubel, 등, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995]에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, SB 트랜스포손 및 SB 유전자전위효소 공급원은, 트랜스포손을 운반하는 벡터로부터 역 반복 측면 배치된 핵산의 절제 및 표적 세포의 게놈 내로 절제된 핵산의 후속 통합에 충분한 조건 하에서, 다세포 생물(예를 들어, 포유동물 또는 인간)의 표적 세포 내로 도입된다. 일부 구현예들은 도입된 트랜스포손과 함께 필수 유전자전위효소 활성이 표적 세포에 존재하는지를 확인하는 단계를 더 포함한다. 트랜스포손 벡터 자체의 구조에 따라, 즉 상기 벡터가 유전자전위효소 활성을 가진 생성물을 암호화하는 영역을 포함하는지 여부에 따라, 본 방법은 필수 유전자전위효소 활성을 암호화하는 표적 세포 내로 제2 벡터를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 트랜스포손을 포함하는 벡터 핵산의 양과 세포 내로 도입되는 유전자전위효소를 암호화하는 벡터 핵산의 양은 트랜스포손 핵산의 원하는 절제와 표적 세포 게놈 내로 삽입을 제공하기에 충분하다. 이와 같이, 도입된 벡터 핵산의 양은 충분한 양의 유전자전위효소 활성 및 표적 세포에 삽입되기를 원하는 핵산의 충분한 복제수를 제공해야 한다. 표적 세포 내로 도입되는 벡터 핵산의 양은 사용되는 구체적인 도입 프로토콜, 예를 들어 사용되는 구체적인 생체외 투여 프로토콜의 효율에 따라 다르다.
벡터 DNA가 필수 유전자전위효소와 함께 표적 세포에 들어가면, 역 반복들이 측면에 배치되는 벡터의 핵산 영역, 즉 Sleeping Beauty 유전자전위효소 인식된 역 반복들 사이에 위치한 벡터 핵산이 제공된 유전자전위효소를 통해 벡터로부터 절제되어 표적화된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 이와 같이, 표적 세포 내로 벡터 DNA의 도입에 이어서 후속적인 유전자전위효소 매개 절제 및 벡터에 의해 운반된 외인성 핵산의 표적화된 세포의 게놈 내로 삽입이 이어진다. 구체적인 구현예에서, 벡터는 SB 트랜스포손 및/또는 SB 유전자전위효소로 형질주입된 세포들의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6% 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20%의 게놈들 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 표적 세포 게놈 내로 핵산의 통합은 안정적이다. 즉, 벡터 핵산은 일시적인 기간 이상 동안 표적 세포 게놈에 존재하고 염색체 유전 물질의 일부 상에서 표적 세포의 자손에게 전달된다.
특정 구현예에서, 트랜스포손은 표적 세포 게놈 내로 다양한 크기의 핵산들, 즉 폴리뉴클레오타이드들을 통합하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 대상 방법을 사용하여 표적 세포 게놈 내로 삽입되는 DNA의 크기는 약 0.1kb 내지 200kb, 약 0.5kb 내지 100kb, 약 1.0kb 내지 약 8.0kb, 약 1.0kb 내지 약 200kb, 약 1.0kb 내지 약 10kb, 약 10kb 내지 약 50kb, 약 50kb 내지 약 100kb, 또는 약 100kb 내지 약 200kb의 범위이다. 일부 구현예에서, 대상 방법을 사용하여 표적 세포 게놈 내로 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0kb 내지 약 8.0kb의 범위이다. 일부 구현예에서, 대상 방법을 사용하여 표적 세포 게놈 내로 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0kb 내지 약 200kb의 범위이다. 구체적인 구현예에서, 대상 방법을 사용하여 표적 세포 게놈 내로 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0kb 내지 약 8.0kb의 범위이다.
D. 세포의 육성 및/또는 증폭
일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포를 육성하기 위한, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건 하에서 세포를 육성하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전적으로 조작하는 단계 이후에, 예를 들어 형질도입 또는 형질주입에 의해 재조합 폴리펩타이드를 세포에 도입하는 단계 이후에 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건 하에서 육성된다. 구체적인 구현예에서, 세포가 자극 조건 하에서 인큐베이션되고 재조합 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 형질도입되거나 형질주입된 후, 세포가 육성된다. 일부 구현예에서, 육성(cultivation)은 농축된 T 세포의 하나 이상의 육성된 조성물을 생산한다.
특정 구현예에서, 자극된 및 형질도입된 T 세포를 포함한 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물, 예컨대 상기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물들이 세포를 제형화하기 전에 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 육성된다. 일부 측면에서, 예컨대 증식 및/또는 증폭을 촉진하기 위한, 육성 방법은 본원에 예컨대 섹션 II-D에 제공된 방법을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 조성물이 조작(예를 들어, 형질도입 또는 형질주입)된 후에 육성된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 조작된 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 조작된 조성물은 이전에 극저온 동결 및 보관되었다가, 육성 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 조작된 T 세포 조성물은 두 개의 농축된 T 세포 개별 조성물이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포의 두 개의 개별 조성물, 예를 들어 동일한 생물학적 샘플로부터 선택된, 단리된, 및/또는 농축된, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)로 도입된 농축된 T 세포의 두 개의 개별 조성물은 세포의 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 개별적으로 육성된다. 일부 구현예에서, 조건은 자극 조건이다. 특정 구현예에서, 두 개의 개별 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물, 예컨대 재조합 수용체를 암호화하고/거나 재조합 수용체를 발현하는 핵산으로 도입된 조작된 CD4+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 두 개의 개별 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물, 예컨대 재조합 수용체를 암호화하고/거나 재조합 수용체를 발현하는 핵산으로 도입된 조작된 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포, 예컨대 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포의 두 개의 개별 조성물은 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 개별적으로 육성된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 단일 조성물이 육성된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물이다. 일부 구현예에서, 단일 조성물은 육성 전에 개별 조성물들로부터 조합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서, 육성된 농축된 CD4+ T 세포, 예컨대 조작된 CD4+ T 세포 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 재조합 수용체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입 또는 형질주입되고/거나 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 포함한다. 특정 구현예에서, 육성된 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서, 육성된 농축된 CD8+ T 세포, 예컨대 조작된 CD8+ T 세포 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 조성물은 재조합 수용체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입 또는 형질주입되고/거나 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건에서 인큐베이션되는 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 조작된 CD4+ 및 조작된 CD8+ T 세포의 개별 조성물들과 같은 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물들은 단일 조성물로 결합되고, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서, 육성된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 농축된 CD8+ T 세포 개별 육성된 조성물들은 육성이 수행 및/또는 완료된 후에 단일 조성물로 조합된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 개별 조성물들, 예컨대 조작된 CD4+ 및 조작된 CD8+ T 세포 개별 조성물들은 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 개별적으로 육성된다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 조작된 세포)는 (약) 또는 적어도 100mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL, 600mL, 700mL, 800mL, 900mL, 1,000mL, 1,200mL, 1,400mL, 1,600mL, 1,800mL, 2,000mL, 2,200mL, 또는 2,400mL 부피의 배지에서 육성된다. 일부 구현예에서, 세포는 초기 부피에서 육성되고 나중에 다른 부피로 조정된다. 구체적인 구현예에서, 부피는 나중에 육성 중에 조정된다. 구체적인 구현예에서, 부피는 육성 중에 초기 부피에서 증가한다. 특정 구현예에서, 부피는 세포가 육성 중에 밀도를 달성하면 증가한다. 특정 구현예에서, 초기 부피는 (약) 500mL이다.
구체적인 구현예에서, 부피는 세포가 육성 중에 밀도 또는 농도를 달성하면 초기 부피에서 증가한다. 구체적인 구현예에서, 부피는 세포가 (약) 또는 적어도 0.1 x 106개 세포/ml, 0.2 x 106개 세포/ml, 0.4 x 106개 세포/ml, 0.6 x 106개 세포/ml, 0.8 x 106개 세포/ml, 1 x 106개 세포/ml, 1.2 x 106개 세포/ml, 1.4 x 106개 세포/ml, 1.6 x 106개 세포/ml, 1.8 x 106개 세포/ml, 2.0 x 106개 세포/ml, 2.5 x 106개 세포/ml, 3.0 x106개 세포/ml, 3.5 x106개 세포/ml, 4.0 x 106개 세포/ml, 4.5 x 106개 세포/ml, 5.0 x 106개 세포/ml, 6 x 106개 세포/ml, 8 x 106개 세포/ml, 또는 10 x 106개 세포/ml의 밀도 및/또는 농도를 달성하면 증가한다. 일부 구현예에서, 부피는 세포가 (약) 또는 적어도 0.6 x 106개 세포/ml의 밀도 및/또는 농도를 달성하면 초기 부피에서 증가한다. 일부 구현예에서, 상기 밀도 및/또는 농도는 배양물에서 생존 세포의 것이다. 구체적인 구현예에서, 부피는 세포가 (약) 또는 적어도 0.1 x 106개 생존 세포/ml, 0.2 x 106개 생존 세포/ml, 0.4 x 106개 생존 세포/ml, 0.6 x 106개 생존 세포/ml, 0.8 x 106개 생존 세포/ml, 1 x 106개 생존 세포/ml, 1.2 x 106개 생존 세포/ml, 1.4 x 106개 생존 세포/ml, 1.6 x 106개 생존 세포/ml, 1.8 x 106개 생존 세포/ml, 2.0 x 106개 생존 세포/ml, 2.5 x 106개 생존 세포/ml, 3.0 x 106개 생존 세포/ml, 3.5 x 106개 생존 세포/ml, 4.0 x 106개 생존 세포/ml, 4.5 x 106개 생존 세포/ml, 5.0 x 106개 생존 세포/ml, 6 x 106개 생존 세포/ml, 8 x 106개 생존 세포/ml, 또는 10 x 106개 생존 세포/ml의 밀도 및/또는 농도를 달성하면 증가한다. 일부 구현예에서, 부피는 세포가 (약) 또는 적어도 0.6 x 106개 생존 세포/ml의 밀도 및/또는 농도를 달성하면 초기 부피에서 증가한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 생존 세포의 밀도 및/또는 농도는 육성 중에, 예컨대 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DHM) 또는 차동 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DDHM)를 포함한 광학적 방법들을 포함한, 기술된 바와 같은 방법들을 사용하여, 측정 또는 모니터링될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 밀도 및/또는 농도를 달성하고, 부피는 (약) 또는 적어도 100mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL, 600mL, 700mL, 800mL, 900mL, 1,000mL, 1,200mL, 1,400mL, 1,600mL, 1,800mL, 2,000mL, 2,200mL 또는 2,400mL 증가한다. 일부 구현예에서, 부피는 500mL 증가한다. 구체적인 구현예에서, 부피는 (약) 또는 적어도 500mL, 600mL, 700mL, 800mL, 900mL, 1,000mL, 1,200mL, 1,400mL, 1,600mL, 1,800mL, 2,000mL, 2,200mL 또는 2,400mL의 부피로 증가한다. 특정 구현예에서, 부피는 1,000mL의 부피로 증가한다. 특정 구현예에서, 부피는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10분마다 (약) 또는 적어도 5mL, 10mL, 20mL, 25mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 75mL, 80mL, 90mL, 또는 100mL의 속도로 증가한다. 특정 구현예에서, 속도는 8분마다 (약) 50mL이다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포(예컨대, 조작된 T 세포) 조성물이 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 육성된다. 일부 구현예에서, 상기 조건은 집단 내에서 세포의 증식, 증폭, 활성화, 및/또는 생존을 유도하도록 설계될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 자극 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체, 및 세포의 성장, 분열, 및/또는 증폭을 촉진하도록 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 육성은 일반적으로 인간 T 림프구와 같은 1차 면역 세포의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30℃, 및 일반적으로 (약) 37℃를 포함하는 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 25 내지 38℃, 예컨대 30 내지 37℃, 예를 들어, (약) 37℃ ± 2℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 배양(예를 들어, 육성 또는 증폭)이 세포의 원하는 또는 임계 밀도, 농도, 수 또는 용량으로 귀결될 때까지의 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 배양(예를 들어, 육성 또는 증폭)이 생존 세포의 원하는 또는 임계 밀도, 농도, 수 또는 용량으로 귀결될 때까지의 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 세포의 밀도, 농도 및/또는 수 또는 용량은 육성 중에, 예컨대 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DHM) 또는 차동 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DDHM)를 포함한 광학적 방법들을 포함한, 기술된 바와 같은 방법들을 사용하여, 측정 또는 모니터링될 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 육성 전에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 특정 구현예에서, 자극제는 조작 이후에 및 조작된 세포를, 예를 들어, 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 육성하기 전에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 본원에 예를 들어 섹션 II-B-1에 기술된 자극 시약이다. 구체적인 구현예에서, 자극 시약은 본원에 예를 들어 섹션 II-B-2에 기술된 바와 같이 세포로부터 제거 및/또는 분리된다.
구체적인 구현예에서,조작된 T 세포 등의 농축된 T 세포 조성물, 예를 들어 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포 개별 조성물들은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서 육성된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현되고/거나 T 세포에 대해 내인성인 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-나선 번들 패밀리의 멤버이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-나선 번들 패밀리의 멤버는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨15(IL-15), 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 등의 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 재조합 IL-2와 함께 육성된다. 일부 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 등의 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 재조합 IL-2의 존재 하에서 육성하면 조성물의 CD4+ T 세포가 육성 단계 동안 및 공정 내내 계속 생존하고, 성장하고, 증폭되고, 및/또는 활성화될 확률 또는 가능성이 증가한다. 일부 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 등의 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 재조합 IL-2의 존재 하에서 육성하면 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어, 세포 요법에 적합한 조작된 CD4+ T 세포) 산출 조성물이, 농축된 CD4+ T 세포 조성물을 재조합 IL-2의 존재 하에서 육성하지 않는 대체 및/또는 예시적인 방법과 비교하여, 농축된 CD4+ T 세포 조성물로부터 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 또는 적어도 200% CD4+ 생산될 확률 및/또는 가능성이 증가한다.
일부 구현예에서, 세포(예컨대, 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포 개별 조성물들)는 1 IU/mL 내지 2,000 IU/mL, 10 IU/mL 내지 100 IU/mL, 50 IU/mL 내지 500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 500 IU/mL 내지 1400 IU/mL, 250 IU/mL 내지 500 IU/mL, 또는 500 IU/mL 내지 2,500 IU/mL 사이 농도의 사이토카인(예를 들어, 재조합 인간 사이토카인)과 함께 육성된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물(예컨대, 조작된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 개별 조성물들)은 2 IU/ml 내지 500 IU/ml, 10 IU/ml 내지 250 IU/ml, 100 IU/ml 내지 500 IU/ml, 또는 100 IU/ml 내지 400 IU/ml 농도의 재조합 IL-2(예를 들어, 인간 재조합 IL-2)와 함께 육성된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 50 IU/ml, 75 IU/ml, 100 IU/ml, 125 IU/ml, 150 IU/ml, 175 IU/ml, 200 IU/ml, 225 IU/ml, 250 IU/ml, 300 IU/ml 또는 400 IU/ml 농도의 IL-2와 함께 육성된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 200 IU/ml 농도의 재조합 IL-2와 함께 육성된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 조성물, 예컨대 조작된 CD4+ T 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포 조성물, 예컨대 조작된 CD8+ T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 개별 조성물 등의 농축된 T 세포 조성물은 10 IU/ml 내지 5,000 IU/ml, 500 IU/ml 내지 2,000 IU/ml, 600 IU/ml 내지 1,500 IU/ml, 500 IU/ml 내지 2,500 IU/ml, 750 IU/ml 내지 1,500 IU/ml, 또는 1,000 IU/ml 내지 2,000 IU/ml 사이 농도의 IL-7(예를 들어, 인간 재조합 IL-7)과 함께 육성된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 100 IU/ml, 200 IU/ml, 300 IU/ml, 400 IU/ml, 500 IU/ml, 600 IU/ml, 700 IU/ml, 800 IU/ml, 900 IU/ml, 1,000 IU/ml, 1,200 IU/ml, 1,400 IU/ml 또는 1,600 IU/ml 농도의 IL-7과 함께 육성된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 1,200 IU/ml 농도의 재조합 IL-7의 존재 하에서 육성된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포(예컨대 조작된 CD4+ T 세포) 조성물이다.
일부 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 개별 조성물 등의 농축된 T 세포 조성물은 0.1 IU/ml 내지 200 IU/ml, 1 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 25 IU/ml, 25 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 15 IU/ml, 또는 10 IU/ml 내지 00 IU/ml 사이 농도의 IL-15(예를 들어, 인간 재조합 IL-15)와 함께 육성된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 1 IU/ml, 2 IU/ml, 3 IU/ml, 4 IU/ml, 5 IU/ml, 6 IU/ml, 7 IU/ml, 8 IU/ml, 9 IU/ml, 10 IU/ml, 11 IU/ml, 12 IU/ml, 13 IU/ml, 14 IU/ml, 15 IU/ml, 20 IU/ml, 25 IU/ml, 30 IU/ml, 40 IU/ml, 50 IU/ml, 100 IU/ml, 또는 200 IU/ml 농도의 IL-15와 함께 육성된다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 20 IU/ml 농도의 재조합 IL-15와 함께 육성된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포(예컨대 조작된 CD4+ T 세포) 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포(예컨대 조작된 CD8+ T 세포) 조성물이다.
구체적인 구현예에서, 조작된 CD8+ T 세포 등의 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 기술된 바와 같은 양으로, IL-2 및/또는 IL-15의 존재 하에서 육성된다. 특정 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 등의 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 기술된 바와 같은 양으로, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15의 존재 하에서 육성된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 재조합형이다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 인간형이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 육성은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 육성은 멸균 조건 하 폐쇄 시스템에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 육성은 제공된 시스템의 하나 이상의 단계와 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서 농축된 T 세포 조성물은 폐쇄 시스템에서 제거되어 육성을 위한 생물반응기 내에 배치되고/거나 이에 연결된다. 육성에 적합한 생물반응기의 예에는 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems 및 Pall XRS Bioreactor Systems이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 육성 단계 중 적어도 일부 동안 세포를 관류 및/또는 혼합하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 생물반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 육성된 세포는 생물반응기 없이 육성된 세포, 예를 들어 예컨대 혼합, 흔들림, 움직임 및/또는 관류 없이 정적 조건 하에서 육성된 세포보다 육성 도중 더 빠르게 증폭을 겪는다. 일부 구현예에서, 생물반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 육성된 세포는 14일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간 또는 12시간 내에 임계 증폭, 세포 수 및/또는 밀도에 도달하거나 이를 달성한다. 일부 구현예에서, 생물반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 육성된 세포는 세포가 생물반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 육성되지 않는 예시적인 및/또는 대체 공정에서 육성된 세포보다 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배의 임계 증폭, 세포 수 및/또는 밀도에 도달하거나 이를 달성한다.
일부 구현예에서, 혼합하는 것은 흔들림 및/또는 움직임이거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 생물반응기는 움직임이나 흔들림을 거칠 수 있고, 이는 일부 측면에서, 산소 전달을 증가시킬 수 있다. 생물반응기를 움직이는 것은 수평 축을 따라 회전하는 것, 수직 축을 따라 회전하는 것, 생물반응기의 경사진 또는 기울어진 수평 축을 따라 흔들리는 움직임 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 흔들리면서 수행된다. 흔들리는 속도 및 흔들리는 각도는 원하는 교반을 달성하기 위해 조정될 수 있다. 일부 구현예에서 흔들기 각도는 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° 또는 1°이다. 특정 구현예에서, 흔들기 각도는 6 내지 16°이다. 다른 구현예들에서, 흔들기 각도는 7 내지 16°이다. 다른 구현예들에서, 흔들기 각도는 8 내지 12°이다. 일부 구현예에서, 흔들기 속도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 1 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40rpm이다. 일부 구현예에서, 흔들기 속도는 4 내지 12rpm, 예컨대 4 내지 6rpm(수치 포함) 사이이다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 약 또는 적어도 0.01L/min, 0.05L/min, 0.1L/min, 0.2L/min, 0.3L/min, 0.4L/min, 0.5L/min, 1.0L/min, 1.5L/min 또는 2.0L/min 또는 2.0 L/min 초과의 안정적인 공기 흐름을 가지면서 37°C 또는 그 근접 온도 및 5% 또는 그 근접 CO2 수준을 유지한다. 특정 구현예에서, 육성의 적어도 일부는 예를 들어, 육성된 세포의 육성 시작과 관련한 시기 및/또는 밀도에 따라, 관류로, 예컨대 290ml/day, 580ml/day 및/또는 1160ml/day의 속도로 수행된다. 일부 구현예에서, 세포 배양 증폭의 적어도 일부는 예컨대 5° 내지 10° 사이, 예컨대 6°의 각도에서, 일정한 흔들림 속도, 예컨대 5 내지 15RPM 사이, 예컨대 6RPM 또는 10RPM의 속도로 흔들리는 움직임과 함께 수행된다.
일부 구현예에서, 육성 단계의 적어도 일부는 일정한 관류, 예를 들어, 느린 일정한 속도의 관류 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 관류는 액체(예를 들어, 사용된 배지)의 유출 및 새로운 배지의 유입이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 관류는 사용된 배지를 새로운 배지로 교체한다. 일부 구현예에서, 육성의 적어도 일부는 (약) 또는 적어도 100ml/day, 200ml/day, 250ml/day, 275ml/day, 290ml/day, 300ml/day, 350ml/day, 400ml/day, 450ml/day, 500ml/day, 550ml/day, 575ml/day, 580ml/day, 600ml/day, 650ml/day, 700ml/day, 750ml/day, 800ml/day, 850ml/day, 900ml/day, 950ml/day, 1000ml/day, 1100ml/day, 1160ml/day, 1200ml/day, 1400ml/day, 1600ml/day, 1800ml/day, 2000ml/day, 2200ml/day, 또는 2400ml/day의 일정한 속도로 관류 하에 수행된다.
구체적인 구현예에서, 육성이 무 관류 조건에서 시작되고, 설정된 및/또는 미리 정해진 시간량, 예컨대 육성의 시작 또는 개시 이후 (약) 또는 적어도 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 또는 72시간 초과 후에 관류가 시작된다. 구체적인 구현예에서, 관류는 세포의 밀도 또는 농도가 설정된 또는 미리 정해진 밀도 또는 농도에 도달하면 시작된다. 일부 구현예에서, 관류는 육성된 세포가 (약) 또는 적어도 0.1 x106개 세포/ml, 0.2 x106개 세포/ml, 0.4 x106개 세포/ml, 0.6 x106개 세포/ml, 0.8 x106개 세포/ml, 1 x106개 세포/ml, 1.2 x106개 세포/ml, 1.4 x106개 세포/ml, 1.6 x106개 세포/ml, 1.8 x106개 세포/ml, 2.0 x106개 세포/ml, 2.5 x106개 세포/ml, 3.0 x106개 세포/ml, 3.5 x106개 세포/ml, 4.0 x106개 세포/ml, 4.5 x106개 세포/ml, 5.0 x106개 세포/ml, 6 x106개 세포/ml, 8 x106개 세포/ml, 또는 10 x106개 세포/ml의 밀도 또는 농도에 도달하면 시작된다. 구체적인 구현예에서, 관류는 생존 세포의 밀도 또는 농도가 설정된 또는 미리 정해진 밀도 또는 농도에 도달하면 시작된다. 일부 구현예에서, 관류는 육성된 생존 세포가 (약) 또는 적어도 0.1 x106개 생존 세포/ml, 0.2 x106개 생존 세포/ml, 0.4 x106개 생존 세포/ml, 0.6 x106개 생존 세포/ml, 0.8 x106개 생존 세포/ml, 1 x106개 생존 세포/ml, 1.2 x106개 생존 세포/ml, 1.4 x106개 생존 세포/ml, 1.6 x106개 생존 세포/ml, 1.8 x106개 생존 세포/ml, 2.0 x106개 생존 세포/ml, 2.5 x106개 생존 세포/ml, 3.0 x106개 생존 세포/ml, 3.5 x106개 생존 세포/ml, 4.0 x106개 생존 세포/ml, 4.5 x106개 생존 세포/ml, 5.0 x106개 생존 세포/ml, 6 x106개 생존 세포/ml, 8 x106개 생존 세포/ml, 또는 10 x106개 생존 세포/ml의 밀도 또는 농도에 도달하면 시작된다.
구체적인 구현예에서, 관류는 육성 동안 상이한 속도로 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 관류 속도는 육성된 세포의 밀도 및/또는 농도에 좌우된다. 특정 구현예에서, 관류 속도는 세포가 설정된 또는 미리 정해진 밀도 또는 농도에 도달하면 증가한다. 관류 속도는 변경될 수 있으며, 예를 들어 육성 동안 한 번, 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번, 다섯 번 이상, 열 번 이상, 15번 이상, 20번 이상, 25번 이상, 50번 이상, 또는 100번 이상 하나의 일정한 관류 속도에서 증가된 일정한 관류 속도로 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 일정한 관류 속도는 세포가 (약) 또는 적어도 0.6 x106개 세포/ml, 0.8 x106개 세포/ml, 1 x106개 세포/ml, 1.2 x106개 세포/ml, 1.4 x106개 세포/ml, 1.6 x106개 세포/ml, 1.8 x106개 세포/ml, 2.0 x106개 세포/ml, 2.5 x106개 세포/ml, 3.0 x106개 세포/ml, 3.5 x106개 세포/ml, 4.0 x106개 세포/ml, 4.5 x106개 세포/ml, 5.0 x106개 세포/ml, 6 x106개 세포/ml, 8 x106개 세포/ml, 또는 10 x106개 세포/ml의 설정된 또는 미리 정해진 세포 밀도 또는 농도에 도달하면 증가한다. 일부 구현예에서, 일정한 관류 속도는 세포가 (약) 또는 적어도 0.6 x106개 생존 세포/ml, 0.8 x106개 생존 세포/ml, 1 x106개 생존 세포/ml, 1.2 x106개 생존 세포/ml, 1.4 x106개 생존 세포/ml, 1.6 x106개 생존 세포/ml, 1.8 x106개 생존 세포/ml, 2.0 x106개 생존 세포/ml, 2.5 x106개 생존 세포/ml, 3.0 x106개 생존 세포/ml, 3.5 x106개 생존 세포/ml, 4.0 x106개 생존 세포/ml, 4.5 x106개 생존 세포/ml, 5.0 x106개 생존 세포/ml, 6 x106개 생존 세포/ml, 8 x106개 생존 세포/ml, or 10 x106개 생존 세포/ml의 설정된 또는 미리 정해진 생존 세포 밀도 또는 농도에 도달하면 증가한다. 일부 구현예에서, 예컨대 관류 하에, 육성 중에 세포 또는 생존 세포의 밀도 및/또는 농도는, 예컨대 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DHM) 또는 차동 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DDHM)를 포함한 광학적 방법들을 포함한, 기술된 바와 같은 방법들을 사용하여, 측정 또는 모니터링될 수 있다.
일부 구현예에서, 육성이 무 관류 조건에서 시작되고, 세포의 밀도 또는 농도가 설정된 또는 미리 정해진 밀도 또는 농도에 도달하면 관류가 시작된다. 일부 구현예에서, 관류는 세포의 밀도 또는 농도가 설정된 또는 미리 정해진 밀도 또는 농도에 도달하면 (약) 또는 적어도 100ml/day, 200ml/day, 250ml/day, 275ml/day, 290ml/day, 300ml/day, 350ml/day, 400ml/day, 450ml/day, 500ml/day, 550ml/day, 575ml/day, 580ml/day, 600ml/day, 650ml/day, 700ml/day, 750ml/day, 800ml/day, 850ml/day, 900ml/day, 950ml/day, 1000ml/day, 1100ml/day, 1160ml/day, 1200ml/day, 1400ml/day, 1600ml/day, 1800ml/day, 2000ml/day, 2200ml/day, 또는 2400ml/day의 속도로 시작된다. 일부 구현예에서, 관류는 육성된 세포 또는 육성된 생존 세포가 (약) 또는 적어도 0.1 x106개 세포/ml, 0.2 x106개 세포/ml, 0.4 x106개 세포/ml, 0.6 x106개 세포/ml, 0.8 x106개 세포/ml, 1 x106개 세포/ml, 1.2 x106개 세포/ml, 1.4 x106개 세포/ml, 1.6 x106개 세포/ml, 1.8 x106개 세포/ml, 2.0 x106개 세포/ml, 2.5 x106개 세포/ml, 3.0 x106개 세포/ml, 3.5 x106개 세포/ml, 4.0 x106개 세포/ml, 4.5 x106개 세포/ml, 5.0 x106개 세포/ml, 6 x106개 세포/ml, 8 x106개 세포/ml, 또는 10 x106개 세포/ml의 밀도 또는 농도에 도달하면 시작된다.
특정 구현예에서, 육성의 적어도 일부는 특정 속도의 관류로 수행되고, 관류 속도는 세포의 밀도 또는 농도가 설정된 또는 미리 정해진 밀도 또는 농도에 도달하면 (약) 또는 적어도 100ml/day, 200ml/day, 250ml/day, 275ml/day, 290ml/day, 300ml/day, 350ml/day, 400ml/day, 450ml/day, 500ml/day, 550ml/day, 575ml/day, 580ml/day, 600ml/day, 650ml/day, 700ml/day, 750ml/day, 800ml/day, 850ml/day, 900ml/day, 950ml/day, 1000ml/day, 1100ml/day, 1160ml/day, 1200ml/day, 1400ml/day, 1600ml/day, 1800ml/day, 2000ml/day, 2200ml/day, 또는 2400ml/day로 증가한다. 일부 구현예에서, 관류는 육성된 세포 또는 육성된 생존 세포가 (약) 또는 적어도 0.1 x106개 세포/ml, 0.2 x106개 세포/ml, 0.4 x106개 세포/ml, 0.6 x106개 세포/ml, 0.8 x106개 세포/ml, 1 x106개 세포/ml, 1.2 x106개 세포/ml, 1.4 x106개 세포/ml, 1.6 x106개 세포/ml, 1.8 x106개 세포/ml, 2.0 x106개 세포/ml, 2.5 x106개 세포/ml, 3.0 x106개 세포/ml, 3.5 x106개 세포/ml, 4.0 x106개 세포/ml, 4.5 x106개 세포/ml, 5.0 x106개 세포/ml, 6 x106개 세포/ml, 8 x106개 세포/ml, 또는 10 x106개 세포/ml의 밀도 또는 농도에 도달하면 시작된다. 일부 구현예에서, 관류는 세포가 (약) 또는 적어도 300mL, 400mL, 500mL, 600mL, 700mL, 800mL, 900mL, 또는 1000mL의 부피로 육성되면 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 부피는 1000mL이다.
특정 구현예에서, 육성은 무 관류 또는 특정 속도의 관류 조건에서 시작되고, 세포의 밀도 또는 농도가 (약) 또는 적어도 0.61 x106개 세포/ml의 농도에 도달하면 관류 속도는 (약) 또는 적어도 290ml/day로 증가한다. 특정 구현예에서, 세포가 (약) 또는 적어도 1000mL의 부피에서 육성될 때 세포의 밀도 또는 농도가 (약) 또는 적어도 0.61 x106개 세포/ml에 도달하면 세포는 (약) 또는 적어도 290ml/day의 속도로 관류된다. 일부 구현예에서, 세포의 밀도 또는 농도가 (약) 또는 적어도 0.81 x106개 세포/ml의 농도에 도달하면 관류 속도는 (약) 또는 적어도 580ml/day로 증가한다. 특정 구현예에서, 세포의 밀도 또는 농도가 (약) 또는 적어도 1.01 x106개 세포/ml의 농도에 도달하면 관류 속도는 (약) 또는 적어도 1160ml/day로 증가한다. 일부 구현예에서, 세포의 밀도 또는 농도가 (약) 또는 적어도 1.2 x106개 세포/ml의 농도에 도달하면 관류 속도는 (약) 또는 적어도 1160ml/day로 증가한다.
제공된 구현예들의 측면에서, 관류가 여기와 상기에 기술된 바와 같이 시작되거나 증가되는 시기를 포함하여 관류 속도는 육성 동안 세포의 밀도 및/또는 농도를 평가하거나 생존 세포의 밀도 및/또는 농도를 평가하여 알아낸이다. 일부 구현예에서, 세포의 밀도 및/또는 농도는 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DHM) 또는 차동 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DDHM)를 포함한 광학적 방법들을 포함한, 기술된 바와 같은 방법들을 사용하여 측정된다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포(예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포)와 같은 농축된 세포 조성물은 계면활성제의 존재 하에서 육성된다. 구체적인 구현예에서, 이 조성물의 세포를 육성하면 예를 들어 혼합, 흔들림, 움직임 및/또는 관류로 인해 육성 중에 발생할 수 있는 전단 응력의 양이 감소한다. 구체적인 구현예에서, 조작된 T 세포(예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포) 등의 농축된 T 세포 조성물은 계면활성제와 함께 육성되고 T 세포 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%는 육성이 완료된 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 7일 초과 시점에 또는 그 도중에 생존해 있고/있거나(생존 가능하고/하거나) 괴사, 세포예정사(programed cell death), 또는 세포자멸사(apoptosis)를 겪지 않는다. 구체적인 구현예에서, 조작된 T 세포(예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포) 등의 농축된 T 세포 조성물은 계면활성제의 존재 하에서 육성되고 세포의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만은 예컨대 전단 응력 또는 전단 유도 응력 등으로 인해 세포사, 예를 들어 세포예정사, 세포자멸사, 및/또는 괴사를 겪는다.
구체적인 구현예에서, 조작된 T 세포(예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포) 등의 농축된 T 세포 조성물은 0.1μl/ml 내지 10.0μl/ml, 0.2μl/ml 내지 2.5μl/ml, 0.5μl/ml 내지 5μl/ml, 1μl/ml 내지 3μl/ml, 또는 2μl/ml 내지 4μl/ml의 계면활성제의 존재 하에서 육성된다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포(예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포) 등의 농축된 T 세포 조성물은 (약) 또는 적어도 0.1μl/ml, 0.2μl/ml, 0.4μl/ml, 0.6μl/ml, 0.8μl/ml, 1μl/ml, 1.5μl/ml, 2.0μl/ml, 2.5μl/ml, 5.0μl/ml, 10μl/ml, 25μl/ml, 또는 50μl/ml의 계면활성제의 존재 하에서 육성된다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 2μl/ml의 계면활성제의 존재 하에서 육성된다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 액체 및/또는 고체의 표면 장력을 감소시키는 제제이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 계면활성제는 지방 알코올(예를 들어, 스테릴 알코올), 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르(예를 들어, Triton X-100), 또는 폴리옥시에틸렌 글리콜 솔비탄 알킬 에스테르(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 40, 60)를 포함한다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80(PS80), 폴리소르베이트 20(PS20), 폴록사머 188(P188)로 구성된 군에서 선택된다. 예시적인 구현예에서, 화학적으로 정의된 급이(feed) 배지에서 계면활성제의 농도는 PS80 약 0.0025% 내지 약 0.25%(v/v); PS20 약 0.0025% 내지 약 0.25%(v/v); 또는 P188 약 0.1% 내지 약 5.0%(w/v)이다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 음이온 계면활성제, 양이온 계면활성제, 쌍극성이온 계면활성제, 또는 이에 첨가된 비이온 계면활성제이거나 이를 포함한다. 적합한 음이온 계면활성제는 알킬 설포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬 포스포네이트, 라우르산칼륨, 트리에탄올아민 스테아레이트, 라우릴 황산나트륨, 황산 도데실 나트륨, 알킬 폴리옥시에틸렌 설페이트, 알긴산 나트륨, 디옥틸 소듐 설포석시네이트, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노신, 포스파티딜이노시톨, 디포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티드산 및 그의 염, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 콜산 및 다른 담즙산(예를 들어, 콜산, 디옥시콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 글리코디옥시콜산) 및 이들의 염(예를 들어, 소듐 디옥시콜레이트)이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 적합한 비이온 계면활성제는: 글리세릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르(폴리소르베이트), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 솔비탄 에스테르, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 세틸 알코올, 세토스테아릴 알코올, 스테아릴 알코올, 아릴 알킬 폴리에테르 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(폴록사머), 폴록사민, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 비결정질 셀룰로오스, 히드록시에틸 전분(HES) 등의 전분 및 전분 유도체를 포함하는 다당류, 폴리비닐 알코올, 및 폴리비닐피롤리돈이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 비이온 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌 공중합체이고 바람직하게는 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜의 블록 공중합체이다. 이러한 중합체는 때때로 PLURONIC® F68 또는 Kollipho® P188이라고도 하는 상표명 POLOXAMER로 판매된다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 중에는 짧은 알킬 사슬을 갖는 것이 포함된다. 이러한 계면활성제의 한 예는 SOLUTOL® HS 15, 폴리에틸렌-660-히드록시스테아레이트이다.
일부 구현예에서, 적합한 양이온 계면활성제는 천연 인지질, 합성 인지질, 4차 암모늄 화합물, 염화 벤잘코늄, 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드, 키토산, 라우릴 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 아실 카르니틴 염산염, 디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDAB), 디올레올트리메틸 암모늄 프로판(dioleyoltrimethyl ammonium propane, DOTAP), 디미리스토일 트리메틸 암모늄 프로판(DMTAP), 디메틸 아미노 에탄 카르바모일 콜레스테롤(DC-Chol), 1,2-디아실글리세로-3-(O-알킬) 포스포콜린, O-알킬포스파티딜콜린, 알킬 피리디늄 할라이드, 또는 예를 들어 n-옥틸아민 및 올레일아민 등의 장쇄 알킬 아민이 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
쌍극성이온 계면활성제는 전기적으로 중성이지만 동일한 분자 내에서 국부적인 양전하와 음전하를 가지고 있다. 적합한 쌍극성이온 계면활성제는 쌍극성이온 인지질이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 디아실-글리세로-포스포에탄올아민(예컨대, 디미리스토일-글리세로-포스포에탄올아민(DMPE), 디팔미토일-글리세로-포스포에탄올아민(DPPE), 디스테아로일-글리세로-포스포에탄올아민(DSPE) 및 디올레올릴-글리세로-포스포에탄올아민(DOPE) 등)이 포함된다. 음이온 및 쌍극성이온 인지질을 포함하는 인지질의 혼합물이 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 혼합물은 리소인지질, 계란 또는 대두 인지질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 음이온 인지질이든, 쌍극성이온 인지질이든 또는 인지질의 혼합물이든 간에 인지질은 염 또는 탈염되거나, 수소화 또는 부분 수소화되거나 또는 천연 반합성 또는 합성일 수 있다.
특정 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머, 예를 들어 폴록사머 188이다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 0.1μl/ml 내지 10.0μl/ml, 0.2μl/ml 내지 2.5μl/ml, 0.5μl/ml 내지 5μl/ml, 1μl/ml 내지 3μl/ml, 또는 2μl/ml 내지 4μl/ml의 폴록사머의 존재 하에서 육성된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 또는 적어도 0.1μl/ml, 0.2μl/ml, 0.4μl/ml, 0.6μl/ml, 0.8μl/ml, 1μl/ml, 1.5μl/ml, 2.0μl/ml, 2.5μl/ml, 5.0μl/ml, 10μl/ml, 25μl/ml, 또는 50μl/ml의 계면활성제의 존재 하에서 육성된다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포 조성물은 (약) 2μl/ml의 폴록사머의 존재 하에서 육성된다.
구체적인 구현예에서, 세포가 임계 양, 농도 및/또는 증폭을 달성하면, 예컨대 세포를 수확함으로써 육성이 종료된다. 구체적인 구현예에서, 육성의 시작 또는 개시 시 세포가 예를 들어 세포의 밀도의 양에 대하여 및/또는 세포의 밀도의 양과 관련하여 (약) 또는 적어도 1.5배 증폭, 2배 증폭, 2.5배 증폭, 3배 증폭, 3.5배 증폭, 4배 증폭, 4.5배 증폭, 5배 증폭, 6배 증폭, 7배 증폭, 8배 증폭, 9배 증폭, 10배 증폭, 또는 10배 증폭 이상을 달성하면 육성이 종료된다. 일부 구현예에서, 임계 증폭은 예를 들어 육성의 시작 또는 개시 시 세포의 밀도의 양에 대하여 및/또는 세포의 농도의 양과 관련하여 4배 증폭이다.
일부 구현예에서, 세포가 세포의 임계 총량, 예를 들어 임계 세포 수를 달성하면, 예컨대 세포를 수확함으로써 육성이 종료된다. 일부 구현예에서, 세포가 임계 총 유핵 세포(TNC) 수를 달성하면 육성이 종료된다. 일부 구현예에서, 세포가 세포의 임계 생존량, 예를 들어 임계 생존 세포 수를 달성하면 육성이 종료된다. 일부 구현예에서, 임계 세포 수는 (약) 또는 적어도 50 x106개 세포, 100 x106개 세포, 200 x106개 세포, 300 x106개 세포, 400 x106개 세포, 600 x106개 세포, 800 x106개 세포, 1000 x106개 세포, 1200 x106개 세포, 1400 x106개 세포, 1600 x106개 세포, 1800 x106개 세포, 2000 x106개 세포, 2500 x106개 세포, 3000 x106개 세포, 4000 x106개 세포, 5000 x106개 세포, 10,000 x106개 세포, 12,000 x106개 세포, 15,000 x106개 세포 또는 20,000 x106개 세포, 또는 전술한 생존 세포 임계치 중 어느 하나이다. 구체적인 구현예에서, 세포가 임계 세포 수를 달성하면 육성이 종료된다. 일부 구현예에서, 임계 세포 수가 달성된 후 (약) 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 이상에 또는 그 이내에 육성이 종료된다. 구체적인 구현예에서, 임계 세포 수가 달성된 후 (약) 1일 후에 육성이 종료된다. 특정 구현예에서, 임계 밀도는 (약) 또는 적어도 0.1 x106개 세포/ml, 0.5 x106개 세포/ml, 1 x106개 세포/ml, 1.2 x106개 세포/ml, 1.5 x106개 세포/ml, 1.6 x106개 세포/ml, 1.8 x106개 세포/ml, 2.0 x106개 세포/ml, 2.5 x106개 세포/ml, 3.0 x106개 세포/ml, 3.5 x106개 세포/ml, 4.0 x106개 세포/ml, 4.5 x106개 세포/ml, 5.0 x106개 세포/ml, 6 x106개 세포/ml, 8 x106개 세포/ml, 또는 10 x106개 세포/ml 또는 전술한 생존 세포 임계치 중 어느 하나이다. 구체적인 구현예에서, 세포가 임계 밀도를 달성하면 육성이 종료된다. 일부 구현예에서, 임계 밀도가 달성된 후 (약) 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 이상에 또는 그 이내에 육성이 종료된다. 구체적인 구현예에서, 임계 밀도가 달성된 후 (약) 1일 후에 육성이 종료된다.
일부 구현예에서, 육성 단계는 세포가 임계 양, 밀도, 및/또는 증폭을 달성하기에 필요한 시간량 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 육성은 (약) 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 2일, 3일 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 또는 그 미만 동안 수행된다. 구체적인 구현예에서, 상이한 생물학적 샘플들로부터 단리된, 농축된, 및/또는 선택된 복수의 농축된 T 세포 개별 조성물의 세포가 임계 밀도를 달성하기 위해 필요한 평균 시간량은 (약) 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 2일, 3일 4일, 5일, 6일, 7일,8일, 9일, 10일, 1주, 2주, 3주 또는 4주이거나 또는 그 미만이다. 특정 구현예에서, 상이한 생물학적 샘플들로부터 단리된, 농축된, 및/또는 선택된 복수의 농축된 T 세포 개별 조성물의 세포가 임계 밀도를 달성하기 위해 필요한 평균 시간량은 (약) 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 2일, 3일 4일, 5일, 6일, 7일,8일, 9일, 10일, 1주, 2주, 3주 또는 4주이거나 또는 그 미만이다.
특정 구현예에서, 육성 단계는 최소 4일, 5일, 6일, 7일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 동안 및/또는 세포가 (약) 1000 x106개 세포, 1200 x106개 세포, 1400 x106개 세포, 1600 x106개 세포, 1800 x106개 세포, 2000 x106개 세포, 2500 x106개 세포, 3000 x106개 세포, 4000 x106개 세포, 또는 5000 x106개 세포의 임계 세포 수 또는 임계 생존 세포 수를 달성한 후 12시간, 24시간, 36시간, 1일, 2일 또는 3일까지 수행된다. 일부 구현예에서, 육성 단계는 세포가 (약) 1200 x 106개 세포의 임계 세포 수를 달성하고 최소 10일 동안 배양된 후 1일까지 및/또는 세포가 (약) 5000 x106개 세포의 임계 세포 수를 달성한 후 1일까지 수행된다. 일부 구현예에서, 육성 단계는 세포가 (약) 1200 x 106개 세포의 임계 세포 수를 달성하고 최소 9일 동안 배양된 후 1일까지 및/또는 세포가 (약) 5000 x106개 세포의 임계 세포 수를 달성한 후 1일까지 수행된다. 일부 구현예에서, 육성 단계는 세포가 (약) 1000 x 106개 세포의 임계 세포 수를 달성하고 최소 8일 동안 배양된 후 1일까지 및/또는 세포가 (약) 4000 x106개 세포의 임계 세포 수를 달성한 후 1일까지 수행된다. 특정 구현예에서, 육성 단계는 증폭 단계이고 최소 4일, 5일, 6일, 7일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 동안 및/또는 세포가 (약) 1000 x106개 세포, 1200 x106개 세포, 1400 x106개 세포, 1600 x106개 세포, 1800 x106개 세포, 2000 x106개 세포, 2500 x106개 세포, 3000 x106개 세포, 4000 x106개 세포, 또는 5000 x106개 세포의 임계 세포 수 또는 임계 생존 세포 수를 달성한 후 12시간, 24시간, 36시간, 1일, 2일 또는 3일까지 수행된다. 일부 구현예에서, 증폭 단계는 세포가 (약) 1200 x 106개 세포의 임계 세포 수를 달성하고 최소 10일 동안 증폭된 후 1일까지 및/또는 세포가 (약) 5000 x106개 세포의 임계 세포 수를 달성한 후 1일까지 수행된다. 일부 구현예에서, 증폭 단계는 세포가 (약) 1200 x 106개 세포의 임계 세포 수를 달성하고 최소 9일 동안 증폭된 후 1일까지 및/또는 세포가 (약) 5000 x106개 세포의 임계 세포 수를 달성한 후 1일까지 수행된다. 일부 구현예에서, 증폭 단계는 세포가 (약) 1000 x 106개 세포의 임계 세포 수를 달성하고 최소 8일 동안 증폭된 후 1일까지 및/또는 세포가 (약) 4000 x106개 세포의 임계 세포 수를 달성한 후 1일까지 수행된다. 일부 구현예에서, 증폭 단계는 세포가 (약) 1400 x 106개 세포의 임계 세포 수를 달성하고 최소 5일 동안 증폭된 후 1일까지 및/또는 세포가 (약) 4000 x106개 세포의 임계 세포 수를 달성한 후 1일까지 수행된다.
일부 구현예에서, 육성은 적어도 최소 시간량 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 육성은 임계치가 최소 시간량 전에 달성되더라도 적어도 14일, 적어도 12일, 적어도 10일, 적어도 7일, 적어도 6일, 적어도 5일, 적어도 4일, 적어도 3일, 적어도 2일, 적어도 36시간, 적어도 24시간, 적어도 12시간, 또는 적어도 6시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 육성이 수행되는 최소 시간량을 증가시키면 육성된 세포, 제형화된 세포, 및/또는 산출 조성물의 세포에서 일부 경우에 활성화를 감소시키고/거나 하나 이상의 활성화 표지자의 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 최소 육성 시간은 미리 정해진 시점인 예시적인 공정(예를 들어, 선택 단계; 해동 단계; 및/또는 활성화 단계)부터 세포가 수확된 날까지를 계산한다.
제공된 구현예들의 측면에서, 육성 동안 세포 또는 생존 세포의 밀도 및/또는 농도는 육성 동안 예컨대 임계 양, 밀도, 및/또는 증폭이 기술된 바와 같이 달성될 때까지 모니터링되거나 수행된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DHM) 또는 차동 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DDHM)를 포함한 광학적 방법들을 포함한 기술된 바와 같은 것들을 포함한다.
특정 구현예에서, 육성된 세포는 산출 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포 등의 육성된 농축된 T 세포 조성물은 농축된 T 세포의 산출 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 육성된 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포는 산출 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포이다. 구체적인 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 등의 육성된 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 산출 조성물이다. 일부 구현예에서, 조작된 CD8+ T 세포 등의 육성된 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 산출 조성물이다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건에서 육성된다. 구체적인 구현예에서, 육성의 적어도 일부는 생물반응기에 의해 제어되는 혼합 또는 관류와 같은 일정한 혼합 및/또는 관류와 함께 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서 그리고 일정한 혼합 및/또는 관류로 인한 전단 및/또는 전단 응력을 줄이기 위해 계면활성제, 예를 들어 폴록사머 188 등의 폴록사머와 함께 육성된다. 일부 구현예에서, 조작된 CD4+ T 세포 등의 농축된 CD4+ T 세포 조성물은 재조합 IL-2, IL-7, IL-15, 및 폴록사머의 존재 하에서 육성되고, 육성의 적어도 일부는 일정한 혼합 및/또는 관류와 함께 수행된다. 특정 구현예에서, 조작된 CD8+ T 세포 등의 농축된 CD8+ T 세포 조성물은 재조합 IL-2, IL-15, 및 폴록사머의 존재 하에서 육성되고, 육성의 적어도 일부는 일정한 혼합 및/또는 관류와 함께 수행된다. 일부 구현예에서, 육성은 세포가 예를 들어 육성의 시작과 비교하여, 적어도 4배의 임계 증폭에 도달할 때까지 수행된다.
1. 육성 동안 세포 모니터링
일부 구현예에서, 세포는 육성 단계 동안 모니터링된다. 모니터링은, 예를 들어, 세포 형태, 세포 생존력, 세포 사멸 및/또는 세포 농도(예를 들어, 생존 세포 농도)를 확인(예를 들어, 측정, 정량화)하기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 모니터링은 수동으로, 예컨대 인간 작업자에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 자동화 시스템에 의해 수행된다. 자동화 시스템은 육성된 세포를 모니터링하기 위해 최소한의 수동 입력이 필요하거나 전혀 필요하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 모니터링은 수동 및 자동화 시스템 모두에 의해 수행된다.
특정 구현예에서, 세포는 수동 입력이 필요하지 않은 자동화 시스템에 의해 모니터링된다. 일부 구현예에서, 자동화 시스템은 생물반응기, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 생물반응기와 호환될 수 있으며, 이로써 육성을 겪는 세포가 생물반응기로부터 제거되고, 모니터링되고, 그리고 이어서 생물반응기로 복귀될 수 있다. 일부 구현예에서, 모니터링 및 육성은 폐쇄 루프 구성에서 이루어진다. 일부 측면에서, 폐쇄 루프 구성에서, 자동화 시스템 및 생물반응기는 멸균 상태로 유지된다. 구현예들에서, 자동화 시스템은 멸균 상태이다. 일부 구현예에서, 자동화 시스템은 인라인 시스템(in-line system)이다.
일부 구현예에서, 자동화 시스템은 세포 형태, 세포 생존력, 세포 사멸 및/또는 세포 농도(예를 들어, 생존 세포 농도)를 검출하기 위한 광학 기술(예를 들어, 현미경 검사)의 사용을 포함한다. 예를 들어, 세포 특징, 생존력 및 농도를 결정하기에 적합한 임의의 광학 기술이 본원에서 고려된다. 유용한 광학 기술의 비제한적인 예는 명시야 현미경 검사, 형광 현미경 검사, 차동 간섭 대비(DIC) 현미경 검사, 위상차 현미경 검사, 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DHM), 차동 디지털 홀로그래피 현미경 검사(DDHM), 또는 이들의 조합을 포함한다. 차동 디지털 홀로그래피 현미경 검사, DDHM, 및 차동 DHM은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 자동화 시스템은 차동 디지털 홀로그래피 현미경을 포함한다. 특정 구현예에서, 자동화 시스템은 조명 수단(예를 들어, 레이저, LED)을 포함한 차동 디지털 홀로그래피 현미경을 포함한다. DDHM 방법론 및 용도에 대한 설명은 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[US 7,362,449; EP 1,631,788; US 9,904,248; 및 US 9,684,281]에서 찾을 수 있다.
DDHM은 무표지 비파괴 세포 이미지화를 가능하게 하여 고대비 홀로그래프 이미지를 생성한다. 이미지들은 이미지화된 개체(예를 들어, 육성된 세포, 세포 잔해)를 정량적으로 설명하는 복수의 형태적 특징을 얻기 위해 개체 분할 및 추가 분석을 거칠 수 있다. 이와 같이, 다양한 특성(예를 들어, 세포 형태, 세포 생존력, 세포 농도)은 예를 들어 이미지 획득, 이미지 처리, 이미지 분할 및 특징 추출의 단계를 사용하여 DDHM으로부터 직접 평가하거나 계산할 수 있다. 일부 구현예에서, 자동화 시스템은 홀로그래프 이미지 기록을 위한 디지털 기록 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 자동화 시스템은 홀로그래프 이미지 분석을 위한 알고리즘을 포함한 컴퓨터를 포함한다. 일부 구현예에서, 자동화 시스템은 홀로그래프 이미지 분석의 결과를 표시하기 위한 모니터 및/또는 컴퓨터를 포함한다. 일부 구현예에서, 분석은 자동화된다(즉, 사용자 입력 없이 수행될 수 있다). 육성 단계 동안 세포를 모니터링하기 위한 적합한 자동화 시스템의 예로는 Ovizio iLine F(Ovizio Imaging Systems NV/SA, 벨기에 브뤼셀)가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 동안 연속적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 동안 실시간으로 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 동안 개별 시점들에 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 15분마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 30분마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 45분마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 1시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 2시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 4시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 6시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 8시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 10시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 12시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 14시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 16시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 18시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 20시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 22시간마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 하루에 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 2일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 3일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 4일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 5일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 6일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 7일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 8일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 9일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 기간 동안 적어도 10일마다 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 육성 단계 동안 적어도 1회 이상 수행된다.
일부 구현예에서, DHM 또는 DDHM 등의 광학 기술 사용을 포함하여 모니터링에 의해 결정될 수 있는 세포의 특징들은 세포 생존력, 세포 농도, 세포 수 및/또는 세포 밀도를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 생존력은 특징화되거나 알아낸이다. 일부 구현예에서, 세포 농도, 밀도 및/또는 수는 특징화되거나 알아낸이다. 일부 구현예에서, 생존 세포 농도, 생존 세포 수 및/또는 생존 세포 밀도는 특징화되거나 알아낸이다. 일부 구현예에서, 육성된 세포는 예컨대 상기 기술된 증폭 임계치가 달성될 때까지 자동화 시스템에 의해 모니터링된다. 일부 구현예에서, 증폭 임계치에 도달하면, 육성된 세포는 자동 또는 수동 방법 등에 의해, 예를 들어 인간 작업자에 의해 수확된다. 증폭 임계치는 자동화 시스템에 의해 알아낸 배양된 세포의 총 농도, 밀도 및/또는 수에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 증폭 임계치는 생존 세포 농도, 밀도 및/또는 수에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 수확된 세포는, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 운반체의 존재 하에서, 기술된 바와 같이 제형화된다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 동결보호제의 존재 하에서 제형화된다.
E. 세포
제형화
일부 구현예에서, 세포 요법 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하는 제공된 방법은 기술된 바와 같은 인큐베이션, 조작 및 육성 및/또는 하나 이상의 다른 가공 단계 전 또는 후의 제공된 가공 단계에서 초래된 유전적으로 조작된 세포의 제형화와 같은 세포의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 연관된 제공된 방법은 폐쇄 시스템에서 상기 기술된 가공 단계들을 이용하여 형질도입된 및/또는 증폭된 세포와 같이 형질도입된 세포를 가공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체, 예를 들어, CAR 또는 TCR로 조작된 세포를 포함하는 세포의 용량은 약학 조성물 또는 제형과 같은 조성물 또는 제형으로 제공된다. 이러한 조성물은 질병, 병태 및 장애의 예방 또는 치료 등에 제공된 방법에 따라, 또는 검출, 진단 및 예측 방법에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 세포는 세포 요법 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 단계로 가공(예를 들어 원심분리 챔버 및/또는 폐쇄 시스템에서 수행)되고, 하나 이상의 단계는 기재된 바와 같은 배양, 예를 들어 육성 및 증폭 및/또는 하나 이상의 다른 가공 단계 전 또는 후의 제공된 형질도입 가공 단계에서 생성된 유전적으로 조작된 세포의 제형화와 같은 세포의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 단일 단위 투여량 투여 또는 다중 투여량 투여를 위한 것과 같은 투여량 투여를 위한 양으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 연관된 제공된 방법은 폐쇄 시스템에서 상기 기술된 가공 단계들을 이용하여 형질도입된 및/또는 증폭된 세포와 같이 형질도입된 세포를 가공하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 조작된 및 육성된 T 세포, 예를 들어 산출 T 세포 등의 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물, 치료용 세포 조성물이 제형화된다. 구체적인 구현예에서, 조작된 및 육성된 T 세포, 예를 들어 산출 T 세포 등의 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물, 치료용 세포 조성물은 하나 이상의 조성물이 조작 및/또는 육성된 후에 제형화된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 투입 조성물이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물은 이전에 극저온 동결 및 보관되었다가, 인큐베이션 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 조작된 및 육성된 T 세포, 예를 들어 산출 T 세포 등의 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물은 농축된 T 세포의 두 개의 개별 조성물, 예를 들어 개별의 조작된 및/또는 육성된 조성물이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포의 두 개의 개별 치료용 조성물, 예를 들어 개별적으로 조작된 및 개별적으로 육성된, 동일한 생물학적 샘플로부터 선택된, 단리된 및/또는 농축된, 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 두 개의 개별 조성물은 개별적으로 제형화된다. 특정 구현예에서, 두 개의 개별 치료용 세포 조성물은 조작된 및/또는 육성된 CD4+ T 세포의 조성물과 같은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 두 개의 개별 치료용 세포 조성물은 조작된 및/또는 육성된 CD8+ T 세포의 조성물과 같은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 및 육성된 CD4+ T 세포 및 조작된 및 육성된 CD8+ T 세포의 개별 조성물과 같은 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 두 개의 개별 치료용 조성물은 개별적으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 치료용 조성물이 제형화된다. 특정 구현예에서, 단일 치료용 조성물은 조작된 및/또는 육성된 농축 CD4+ T 세포 조성물과 같은 농축된 CD4+ T 세포 조성물이다. 일부 구현예에서, 단일 치료용 조성물은 제형화 전에 개별 조성물들로부터 조합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 조작된 및 육성된 농축 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물들과 같은 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 치료용 조성물들은 단일 치료용 조성물로 조합되어 제형화된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 농축된 CD8+ T 세포의 개별 제형화된 치료용 조성물들은 제형화가 수행 및/또는 완료된 후에 단일 치료용 조성물로 조합된다. 구체적인 구현예에서, 조작된 및 육성된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물들과 같은 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 치료용 조성물들은 개별 조성물로 개별적으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 조작된 및 육성된 CD4+ T 세포 등의 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어, 산출 CD4+ T 세포)의 제형화된 치료용 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입 또는 형질주입되고/거나 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 및 육성된 CD4+ T 세포 등의 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어, 산출 CD4+ T 세포)의 제형화된 치료용 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 조작된 및 육성된 CD8+ T 세포 등의 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어, 산출 CD8+ T 세포)의 제형화된 치료용 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 치료용 조성물은 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입 또는 형질주입되고/거나 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 및 육성된 CD8+ T 세포 등의 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어, 산출 CD8+ T 세포)의 자극 조건에서 인큐베이션된 치료용 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/거나, CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 치료용 조성물의 특성들이 제형화 전에 예를 들어 섹션 I-A 및 I-A-3에 기술된 바와 같이 평가된다. 일부 구현예에서, 상기 특징들은 세포 표현형 및 재조합 수용체-의존성 활성이다. 일부 구현예에서, 세포 표현형 및 재조합 수용체-의존성 활성이 치료용 세포 조성물 내 속성을 가진 세포의 수, 백분율, 비율, 및/또는 비를 제공하기 위해 정량화된다. 일부 구현예에서, 상기 특징들은 본원에 제공된 기계 학습 프로세스에 투입으로 사용된다.
특정 구현예에서, 제형화된 세포는 산출 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 및 육성된 T 세포의 제형화된 조성물 등의 농축된 T 세포의 제형화된 치료용 조성물은 농축된 T 세포의 산출 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 제형화된 CD4+ T 세포 및/또는 제형화된 CD8+ T 세포는 산출 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포이다. 구체적인 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 제형화된 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 산출 조성물이다. 일부 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포의 제형화된 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 산출 조성물이다.
일부 구현예에서, 세포는 백(bag)이나 바이알 같은 용기 내로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 육성 중에 세포가 임계 세포 수, 밀도 및/또는 증폭이 달성된 후 0 내지 10일, 0 내지 5일, 2 내지 7일, 0.5일 내지 4일, 또는 1일 내지 3일 사이에 제형화된다. 특정 구현예에서, 세포는 육성 중에 임계 세포 수, 밀도 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 12시간, 18시간, 24시간, 1일, 2일, 또는 3일에 또는 그 이내에 제형화된다. 일부 구현예에서, 세포는 육성 중에 임계 세포 수, 밀도 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 1일 이내에 제형화된다.
구체적인 구현예들은 세포가 육성 중 말기 단계보다 육성 중 초기 단계에 더 활성화된 상태에 있는 것으로 고려한다. 또한, 일부 구현예에서, 육성 동안 일어나거나 일어날 수 있는 피크 활성화보다 덜 활성화된 상태에 있는 세포를 제형화하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는, 예를 들어 세포가 언제 임계치가 달성되는지 상관 없이 육성 동안 더 이른 시점에 제형화된 경우보다 덜 활성화된 상태에서 수확되도록, 최소 기간 또는 시간량 동안 육성된다. 일부 구현예에서, 세포는 육성 중에 임계 세포 수, 밀도 및/또는 증폭이 달성된 후 1일 내지 3일 사이에 육성된다. 특정 구현예에서, 세포는 임계 세포 수, 밀도, 및/또는 증폭을 달성하고 제형화 전에 최소 시간 또는 기간 동안 계속 육성된다. 일부 구현예에서, 임계치를 달성한 세포는 최소 기간 및/또는 시간량, 예컨대 1일 내지 14일, 2일 내지 7일, 또는 3일 내지 6일 사이의 최소 시간 또는 기간 동안 육성될 때까지, 또는 (약) 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 7일 이상의 육성의 최소 시간 또는 기간까지 제형화되지 않는다. 일부 구현예에서, 육성의 최소 시간 또는 기간은 3일 내지 6일 사이이다.
일부 구현예에서, 세포는 약학적으로 허용 가능한 완충제로 제형화되며, 이는 일부 측면에서, 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가공은 대상체에 투여하기에 약학적으로 허용 가능하거나 바람직한 배지 또는 제형 완충제로 배지를 교환하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 가공 단계는 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 부형제를 포함할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 완충제에서 세포를 교체하기 위해 형질도입 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 부형제를 포함한 상기 약학적 형태의 예시는 대상체에 세포 및 조성물을 투여하기에 허용 가능한 형태와 함께 아래에 기재된 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예에서 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 세포를 함유한다.
“약학적으로 허용 가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)”는 활성 성분 이외의 약학적 제형 안에 있는 성분을 지칭하고, 이는 대상체에 무독성이다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 운반체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 알아낸이다. 따라서, 적합한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화 벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 운반체는, 예를 들어, 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 사용된 용량 및 농도에서 일반적으로 수용자(recipient)에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 염화 벤잘코늄; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로 헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제에는 예를 들어, 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염이 포함된다. 일부 측면에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 조제 방법은 알려져 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기술되어 있다.
제형에는 수용액이 포함될 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한 세포, 바람직하게는 세포에 상보적인 활성을 가진 것으로 치료될 특정 증상, 질병 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성이 서로 악영향을 미치지 않는다. 상기 활성 성분들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학 요법제, 예를 들어 아스파라기나아제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴 및/또는 빈크리스틴 등과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 더 포함한다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션, 분산액 또는 점성 조성물로 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조성물은 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있는 운반체를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적합한 운반체, 희석제 또는 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 같은 부형제와의 혼화물과 같은 용매에 세포를 통합함으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제제에 따라 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 방부제, 향미제 및/또는 색소와 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 조제품 제조를 위하여 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 포함한, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사용 약학적 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형 완충제는 냉동 보존제를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포는 1.0% 내지 30% DMSO 용액, 예컨대 5% 내지 20% DMSO 용액 또는 5% 내지 10% DMSO 용액을 함유하는 냉동 보존 용액으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 냉동 보존 용액은 예를 들어, 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 냉동 보존 용액은 예를 들어 적어도 또는 약 7.5% DMSO이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 가공 단계는 냉동 보존 용액에서 세포를 대체하기 위해 형질도입된 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 최종 농도가 (약) 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5%, 또는 5.0% DMSO, 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10%, 또는 6% 내지 8% DMSO인 배지 및/또는 용액에서 동결(예를 들어, 극저온 동결 또는 냉동 보존)된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 최종 농도가 (약) 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5%, 또는 0.25% HSA, 또는 0.1% 내지 -5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2% HSA인 배지 및/또는 용액에서 동결(예를 들어, 극저온 동결 또는 냉동 보존)된다.
구체적인 구현예에서, 농축된 T 세포, 예를 들어 자극된, 조작된 및/또는 육성된 T 세포의 치료용 조성물은 제형화되고, 극저온 동결된 후 일정 시간량 동안 저장된다. 특정 구현예에서, 제형화된 극저온 동결 세포는 세포가 주입을 위해 방출될 때가지 저장된다. 구체적인 구현예에서, 제형화된 극저온 동결 세포는 1일 내지 6개월, 1개월 내지 3개월, 1일 내지 14일, 1일 내지 7일, 3일 내지 6일, 6개월 내지 12개월 동안 또는 12개월보다 더 길게 저장된다. 일부 구현예에서, 세포는 극저온 동결되고 (약) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 또는 그 미만 동안 저장된다. 특정 구현예에서, 세포는 저장 후 해동되고 대상체에 투여된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 5일 동안 저장된다.
일부 구현예에서, 제형화는 배양 또는 증폭된 세포와 같은 세포를 세척, 희석 또는 농축시키는 것을 포함하는 하나 이상의 가공 단계를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 가공은 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여를 위한 세포의 수를 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은 원하는 농도 또는 수로 세포의 희석 또는 농축을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가공 단계는 부피 감소를 통해 원하는 대로 세포의 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가공 단계는 부피 추가를 통해 원하는 대로 세포의 농도를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가공은 형질도입된 및/또는 증폭된 세포에 일정 부피의 제형 완충제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 완충제의 부피는 10mL 내지 1000mL, 약 10mL 내지 약 1000mL, 예컨대 적어도 (약) 또는 약 50mL, 100mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL, 600mL, 700mL, 800mL, 900mL 또는 1000mL이다.
일부 구현예에서, 세포 조성물을 제형화하기 위한 상기 가공 단계는 폐쇄 시스템에서 수행된다. 예시적인 상기 가공 단계는 Sepax® 또는 Sepax 2® 세포 처리 시스템과 함께 사용하기 위한 것을 포함하여 Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 원심분리 챔버와 같은 세포 처리 시스템과 연관된 하나 이상의 시스템 또는 키트와 함께 원심분리 챔버를 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 시스템 및 공정이 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 기재된 바와 같이, 상기 구현예 중 어느 하나에서 제형 완충제, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 완충제에서 제형화된 세포의 생성된 조성물인 제형화된 조성물을 원심분리 챔버의 내부 공동으로부터 발현을 달성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형화된 조성물의 발현은 원심분리 챔버를 가진 폐쇄 시스템의 일부로서 작동 가능하게 연결된 본원에 기재된 생물 의학 재료 용기의 바이알과 같은 용기에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 생물 의학 재료 용기는 하나 이상의 가공 단계를 수행하는 폐쇄 시스템 또는 디바이스에 통합 및/또는 작동 가능한 연결을 위해 구성되고/거나 이에 통합되거나 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 생물 의학 재료 용기는 시스템의 출력 라인 또는 출력 위치에 연결된다. 일부 경우에, 폐쇄 시스템은 입구 튜브에서 생물 의학 재료 용기의 바이알에 연결된다. 본원에 기술된 생물 의학 재료 용기와 함께 사용하기 위한 예시적인 폐쇄 시스템은 Sepax® 및 Sepax® 2 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 예컨대 원심분리 챔버 또는 세포 처리 시스템에 결합된, 폐쇄 시스템은, 하나 또는 다수의 용기가 제형화된 조성물의 발현을 위해 연결될 수 있는 포트를 가진 튜브 라인의 각 끝에 결합된 다방향 튜브 매니폴드를 함유하는 다중 포트 출력 키트를 포함한다. 일부 측면에서, 바람직한 수 또는 다수의 바이알은 다중 포트 출력 중 하나 이상, 일반적으로 둘 이상, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 포트에 멸균적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기, 예를 들어, 생물 의학 재료 용기는 포트들에 또는 모든 수 미만의 포트에 부착될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 시스템은 생물 의학 재료 용기의 다수의 바이알 내로 산출 조성물의 발현을 달성할 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 다수의 산출 용기들, 예를 들어 생물 의학 재료 용기의 바이알들 중 하나 이상에, 예컨대 단일 단위 투여량 투여 또는 다수 투여량 투여를 위해, 투여량 투여를 위한 용량으로, 발현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물 의학 재료 용기의 바이알은 각각 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여하기 위한 세포의 수를 함유할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 각 바이알은 투여를 위한 단일 단위 용량을 함유할 수 있거나 다수의 바이알 중 하나보다 많은 수가, 예컨대 바이알들 중 둘이, 또는 바이알들 중 셋이 함께 투여를 위한 용량을 구성하도록 원하는 용량의 분획을 함유할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 바이알은 일반적으로 투여될 세포, 예를 들어, 이의 하나 이상의 단위 용량을 함유한다. 단위 용량(unit dose)은 대상체에 투여될 세포의 양 또는 수이거나 또는 투여될 세포의 수의 두배(또는 그 이상)일 수 있다. 이는 대상체에 투여될 세포의 최저 용량 또는 가능한 최저 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 용기(예를 들어, 백 또는 바이알)의 각각은 개별적으로 세포의 단위 용량을 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 각 용기는 동일한 또는 대략 또는 실질적으로 동일한 수의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 각 단위 용량은 적어도 또는 약 적어도 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 또는 1 x 108개의 조작된 세포, 총 세포, T 세포, 또는 PBMC를 함유한다. 일부 구현예에서, 각 용기(예를 들어, 백 또는 바이알) 내 제형화된 세포 조성물의 부피는 10mL 내지 100mL, 예컨대 (약) 또는 적어도 (약) 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL 또는 100mL이다. 일부 구현예에서, 용기(예를 들어, 백 또는 바이알) 내 세포는 냉동 보존될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기(예를 들어, 바이알)는 추가 사용이 있을 때까지 액체 질소에 보관될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법에 의해 생산된 상기 세포 또는 상기 세포를 포함하는 조성물은 질병 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 투여된다.
Ⅲ. 유전자 조작을 위한 재조합 수용체
일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물의 세포(예를 들어, CD4+ 세포, CD8+ 세포)는 재조합 단백질을 암호화하는 조작된 세포이다. 일부 구현예에서, 치료용 세포 조성물의 조작된 세포는 재조합 단백질, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 T 세포 수용체(TCR)를 함유하거나 발현한다. 특정 구현예에서, 기술된 제조 또는 조작을 위한 방법은 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하거나 함유하도록 조작된 세포 또는 세포를 함유하는 및/또는 세포를 위해 농축된 집단 또는 조성물을 생산하거나 및/또는 생산할 수 있다.
일부 측면에서, 암호화된 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)이다. 재조합 수용체 중에는 키메라 수용체, 항원 수용체 및 키메라 수용체 또는 항원 수용체의 하나 이상의 성분을 함유하는 수용체가 있다. 재조합 수용체는 리간드-결합 도메인 또는 이의 결합 단편 및 세포내 신호전달 도메인 또는 영역을 함유하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포에 의해 암호화된 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 자가항체 수용체(CAAR), 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 다중 사슬 재조합 수용체의 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하여 전술한 임의의 것의 영역, 도메인 또는 성분을 포함한다. CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에, 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 연결된 세포외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포로부터 발현된 예시적인 재조합 수용체는 둘 이상의 수용체 폴리펩타이드를 함유하고, 일부 경우에 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 다중 사슬 수용체를 포함한다. 일부 측면에서, 재조합 수용체는 함께 기능적 재조합 수용체를 포함하는 둘 이상의 폴리펩타이드를 함유한다. 일부 측면에서, 다중 사슬 수용체는 함께 기능적 재조합 수용체를 포함하는 두 개의 폴리펩타이드를 포함하는 이중 사슬 수용체이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 두 개의 상이한 수용체 폴리펩타이드, 예를 들어, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 사슬; 또는 TCR 감마(TCRγ) 및 TCR 델타 (TCRδ) 사슬을 포함하는 TCR이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 하나 이상의 폴리펩타이드가 다른 수용체 폴리펩타이드의 발현, 활성 또는 기능을 조절, 변형 또는 제어하는 다중 사슬 수용체이다. 일부 측면에서, 다중 사슬 수용체는 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다.
A.
키메라
항원 수용체(CAR)
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 특정 세포 유형의 표면 상에 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 표지자 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예들에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
구체적인 구현예에서, 키메라 수용체와 같은 재조합 수용체는 T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 세포질(세포내) 영역과 같은 세포질 신호전달 도메인 또는 영역(상호 교환적으로 세포내 신호전달 도메인 또는 영역으로도 불림), 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 성분의 세포질 신호전달 도메인 또는 영역(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 세포질 신호전달 도메인 또는 영역 또는 이의 기능적 변이체 또는 신호전달 부분)을 포함하고/거나 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 세포내 신호전달 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드(예를 들어, 항원) 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인을 더 함유하고 있다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 항원과 같은 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR 유사 CAR이고 항원은 TCR과 마찬가지로 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원과 같은 가공된 펩타이드 항원이다.
CAR을 포함하는 예시적 항원 수용체 및 상기 수용체를 조작하고 세포 내로 도입하는 방법은 예를 들어 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416]에 기재된 것들 및/또는 문헌[Sadelain 등, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 등 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 등, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 등, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 바와 같은 CAR 및 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 A1]에 기재된 것을 포함한다. CAR의 예로는 전술한 간행물 중 어느 하나, 예컨대 문헌[WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호 7,446,190, 미국 특허 번호 8,389,282, Kochenderfer 등, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang 등 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens 등, Sci Transl Med. 2013 5(177)]에 개시된 바와 같은 CAR이 포함된다. 또한 문헌[WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호 7,446,190 및 미국 특허 번호 8,389,282]을 참조한다.
일부 구현예에서, 입양 요법에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현되는 항원(예를 들어, 암 표지자) 및/또는 감쇠 반응을 유도하도록 의도된 항원, 예컨대 정상 또는 비질병 세포 유형 상에서 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 표지자 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 구조체화된다. 따라서, CAR은 통상적으로 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 세포외 부분에 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 단클론 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단일 사슬 항체 단편(scFv)과 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포 상에 발현된다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능적 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일반적으로, 펩타이드 MHC 복합체를 겨냥하여 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 TCR 유사 CAR로 지칭될 수도 있다. 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 이러한 분자는 통상적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호 및 선택적으로 공자극 수용체와 조합하여 이러한 수용체를 통한 신호를 모방하거나 이와 유사할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체(예를 들어 CAR)와 같은 재조합 수용체는 항원(또는 리간드)에 특이적으로 결합하는 것과 같이 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 키메라 수용체에 의해 표적화되는 항원 중에는 입양 세포 요법을 통해 표적화될 질병, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것이 있다. 질병 및 병태 중에는 혈액암, 면역계 암, 예컨대 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예컨대 B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 암 및 종양을 포함한 증식성, 신생물성 및 악성 질병 및 장애가 있다.
일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예들에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, CAR은 세포의 표면 상에 발현된 온전한 항원과 같은 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv)을 함유한다.
일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 종양 항원 또는 암 표지자이다. 일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살해 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 알려진 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 BCMA, 예를 들어 인간 BCMA에 특이적인 항-BCMA CAR이다. 마우스 항-인간 BCMA 항체 및 인간 항-인간 항체를 포함하여 항-BCMA 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체 및 상기 키메라 수용체를 발현하는 세포가 앞서 기술되었다. 문헌[Carpenter 등, Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060, WO 2016/090320, WO2016090327, WO2010104949A2 및 WO2017173256]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 문헌[WO 2016/090320 또는 WO2016090327]에 기술된 항체로부터 유래된 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역을 함유하는 scFv와 같은 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 13에 제시된 VH 및 서열 번호: 14에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 15에 제시된 VH 및 서열 번호: 16에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 17에 제시된 VH 및 서열 번호: 18에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 19에 제시된 VH 및 서열 번호: 20에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 21에 제시된 VH 및 서열 번호: 22에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 23에 제시된 VH 및 서열 번호: 24에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 25에 제시된 VH 및 서열 번호: 26에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, VH 또는 VL은 전술한 VH 또는 VL 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고 BCMA에 대한 결합을 유지한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 VL 영역에 대한 아미노 말단이다. 일부 구현예에서, VH 영역은 VL 영역에 대한 카르복시 말단이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 CD19와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로부터 유래되거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 항원은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 FMC63 및 SJ25C1과 같은 마우스 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어, 문헌[미국 특허 공개 번호 US 2016/0152723]에 기재된 바와 같은 인간 항체이다.
일부 구현예에서, CAR은 CD19, 예를 들어 인간 CD19에 특이적인 항-CD19 CAR이다. 일부 구현예에서, scFv 및/또는 VH 도메인은 FMC63으로부터 유래된다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체를 지칭한다(Ling, N. R., 등 (1987). Leucocyte typing III. 302). 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호: 30 및 31에 각각 제시된 CDR-H1 및 CDR-H2 및 서열 번호: 32 또는 33에 제시된 CDR-H3 및 서열 번호: 27에 제시된 CDR-L1 및 서열 번호: 28 또는 34에 제시된 CDR-L2 및 서열 번호: 29 또는 35에 제시된 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 27의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 28의 CDR-L2 서열, 서열 번호: 29의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 30의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 31의 CDR-H2 서열, 및 서열 번호: 32의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 36에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 37에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 38에 제시된다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 39에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호: 39에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 40에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 40에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래된다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체이다(Ling, N. R., 등 (1987). Leucocyte typing III. 302). 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호: 41-43에 각각 제시된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열 및 서열 번호: 44-46에 각각 제시된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 44의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 45의 CDR-L2 서열, 서열 번호: 46의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 41의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 42의 CDR-H2 서열, 및 서열 번호: 43의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 47에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 48에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 49에 제시된다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 50에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 50에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD20에 특이적인 항-CD20 CAR이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD20에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 리툭시맙이거나 이로부터 유래된 리툭시맙 scFv와 같은 항체이다.
일부 구현예에서, CAR은 CD22에 특이적인 항-CD22 CAR이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD22에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD22에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 m971이거나 이로부터 유래된 m971 scFv와 같은 항체이다.
일부 구현예에서, CAR은 GPRC5D에 특이적인 항-GPRC5D CAR이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, GPRC5D에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/090329 및 WO 2016/090312]에 제시된 항체 또는 항체 단편 유래의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역과 같은 두 개의 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함하는 scFv와 같은 항원 결합 단편이다. 링커는 전형적으로 펩타이드 링커, 예를 들어 가요성 및/또는 용해성 펩타이드 링커이다. 링커 중에는 글리신과 세린이 풍부하고/거나 일부 경우에는 트레오닌이 풍부한 것이 있다. 일부 구현예에서, 링커는 용해도를 향상시킬 수 있는 리신 및/또는 글루타메이트와 같은 하전된 잔기를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 하나 이상의 프롤린을 더 포함한다. 일부 측면에서, 글리신 및 세린(및/또는 트레오닌)이 풍부한 링커는 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상기 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이는 적어도 (약) 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75%의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 실질적으로 전부 글리신, 세린 및/또는 트레오닌으로 구성된다. 예시적인 링커는 서열 GGGGS(4GS; 서열 번호: 51) 또는 GGGS(3GS; 서열 번호: 52)의 다양한 수의 반복, 예컨대 상기 서열의 2, 3, 4 및 5개 사이의 반복을 갖는 링커를 포함한다. 예시적인 링커는 서열 번호: 53(GGGGSGGGGSGGGGS), 서열 번호:54(GSTSGSGKPGSGEGSTKG) 또는 서열 번호: 55(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)에 제시된 서열을 갖거나 이로 이루어진 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원(예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터 유래된 바이러스 항원), 세균 항원 및/또는 기생 항원이다. 일부 구현예에서, CAR은 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면 상에 제시된 종양 관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)과 같은 TCR 유사 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로 세포 상에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능적 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일반적으로, 펩타이드 MHC 복합체를 겨냥하여 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 TCR 유사 CAR로 지칭될 수도 있다.
“주요 조직적합성 복합체(Major histocompatibility complex, MHC)”에 대한 언급은 일부 경우에, 세포 기작에 의해 가공된 펩타이드 항원을 포함하여 폴리펩타이드의 펩타이드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩타이드 결합 부위 또는 결합 고랑(groove)을 함유하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 지칭한다. 일부 경우에, MHC 분자는 TCR 또는 TCR 유사 항체와 같은 T 세포 상의 항원 수용체에 의해 인식 가능한 형태로 항원 제시를 위해 펩타이드와의 복합체로, 즉 MHC-펩타이드 복합체를 포함하여 세포 표면 상에 표시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 일부 경우에, 3개의 α 도메인 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는, 막에 걸쳐있는 α 사슬을 갖는 이종이량체이다. 일반적으로 MHC 클래스 II 분자는 두 개의 막관통 당단백질인 α 및 β로 구성되며, 둘 다 전형적으로 막에 걸쳐있다. MHC 분자는 항원 결합 부위 또는 펩타이드에 결합하기 위한 부위 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 기원한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 MHC-펩타이드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포와 같은, 일부 경우에는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포성 계(vesicular system)에서 기원한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, 이는 전형적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 및 마우스에서 H-2라고 통칭되는 연관된 유전자 자리(loci) 그룹에 의해 암호화된다. 따라서, 전형적으로 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지칭될 수 있다.
용어 “MHC-펩타이드 복합체(MHC-peptide complex)” 또는 “펩타이드-MHC 복합체(peptide-MHC complex)” 또는 이의 변형은 예컨대 일반적으로 MHC 분자의 결합 고랑(groove) 또는 틈에서 펩타이드의 비공유 상호작용에 의한 펩타이드 항원 및 MHC 분자의 복합체 또는 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 세포의 표면 상에 존재하거나 표시된다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 TCR, TCR 유사 CAR 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 펩타이드 항원 또는 에피토프와 같은 펩타이드는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 회합할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 보다 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 이를 기초로 한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 전형적으로 약 8 내지 약 24개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식을 위해 (약) 9 내지 22개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식을 위해 (약) 8 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체와 같은 MHC 분자의 맥락에서 펩타이드 인식 시, TCR 또는 TCR 유사 CAR과 같은 항원 수용체는 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생산, 세포 독성 T 세포 반응 또는 다른 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생산하거나 유발시킨다.
일부 구현예에서, TCR 유사 항체 또는 항원 결합 부분은 알려져 있거나, 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어 미국 공개 출원 번호 US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; 및 국제 PCT 공개 번호 WO 03/068201 참조).
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 특이적인 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 유효량의 면역원으로 숙주를 면역화함으로써 생산될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 종양 항원, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 범용 종양 항원, 골수종 항원 또는 기타 항원과 같이 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에서, 이어서 유효량의 면역원이 면역 반응을 유발하기 위해 숙주에 투여되고, 여기서 면역원은 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시에 대하여 면역 반응을 유발하기에 충분한 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지한다. 이어서 숙주로부터 채집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시를 인식하는 원하는 항체가 생산되고 있는지 여부를 결정한다. 일부 구현예에서, 생성된 항체를 분석하여 상기 항체가 MHC-펩타이드 복합체와 MHC 분자 단독, 관심 펩타이드 단독 및 MHC 및 무관한 펩타이드의 복합체를 구별할 수 있는지 확인할 수 있다. 이어서 원하는 항체를 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 파지 항체 라이브러리와 같은 항체 라이브러리 디스플레이 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 라이브러리의 멤버들이 CDR 또는 CDR들의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이되는 돌연변이체 Fab, scFv 또는 기타 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 출원 공개 번호 US20020150914, US2014/0294841; 및 Cohen CJ. 등 (2003) J Mol . Recogn. 16:324-332]을 참조한다.
본원에서 용어 “항체(antibody)”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 기능성(항원-결합) 항체 단편을 포함하는 다클론 및 단클론 항체를 포함하며, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab’)2 단편, Fab’ 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 가변 중쇄(VH) 영역, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한 단일 사슬 항체 단편 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody)) 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전적으로 조작된 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디(intrabodies), 펩티바디(peptibodies), 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화 항체 및 이종 접합 항체, 다중특이성(예를 들어, 이중 특이성) 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 “항체”는 이의 기능성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포괄한다.
일부 경우에 용어 “초가변 영역(hypervariable region)” 또는 “HVR”과 동의어인 “상보성 결정 영역(complementarity determining region)” 및 “CDR”은 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 비인접 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)이 있고 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. 일부 경우에 “프레임워크 영역(framework region)” 및 “FR”은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)이 있고, 각각의 전장 경쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat 등 (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” 넘버링 체계); Al-Lazikani 등, (1997) JMB 273,927-948 (“Chothia” 넘버링 체계); MacCallum 등, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.” (“Contact” 넘버링 체계); Lefranc MP 등, “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (“IMGT” 넘버링 체계); Honegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (“Aho” 넘버링 체계); 및 Martin 등, “Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,” PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, (“AbM” 넘버링 체계)]에 기재된 것을 포함한 다수의 잘 알려진 체계 중 어느 하나를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용된 체계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 체계는 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면 Chothia 체계는 구조적 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 체계 모두에 대한 넘버링은 삽입 문자, 예를 들어 “30a”에 의해 수용되는 삽입(insertion) 및 일부 항체에서 나타나는 결실(deletion)이 있는 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이에 기반한다. 이 두 체계는 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실(“삽입-결실(indel)”)을 배치하여 차이가 있는 넘버링을 만들어낸다. Contact 체계는 복합체 결정(crystal) 구조의 분석에 기반하며 여러 측면에서 Chothia 넘버링 체계와 유사하다. AbM 체계는 Oxford Molecular’s AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된 것에 기반한 Kabat와 Chothia 정의 사이의 절충안이다.
하기 표 4는 Kabat, Chothia, AbM 및 Contact 체계에 의해 각각 식별된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 열거한다. CDR-H1의 경우, Kabat 및 Chothia 넘버링 체계 둘 다를 사용하여 잔기 넘버링이 나열된다. FR들은 예를 들어 CDR-L1 앞에 위치한 FR-L1, CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치한 FR-L2, CDR-L2와 CDR-L3 사이에 위치한 FR-L3과 같은 식으로 CDR들 사이에 위치한다. 도시된 Kabat 넘버링 체계는 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문에, 도시된 Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다는 것에 유의한다.
표 4. 다양한 넘버링 체계에 따른 CDR의 경계.
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 “CDR” 또는 “상보성 결정 영역(complementary determining region)” 또는 개별 지정 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 전술한 체계 중 어느 하나 또는 다른 알려진 체계에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 상보성 결정 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR(예를 들어, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 영역 아미노산 서열에 있는 해당 CDR의 아미노산 서열을 함유한다고 언급될 경우, 상기 CDR은 전술한 체계 중 어느 하나 또는 다른 알려진 체계에 의해 정의된 바와 같은 가변 영역 내의 해당 CDR(예를 들어, CDR-H3)의 서열을 갖는다고 이해된다. 일부 구현예에서, 특정 CDR 서열이 명시된다. 제공된 항체의 예시적인 CDR 서열은 다양한 넘버링 체계를 사용하여 기재되지만, 제공된 항체는 전술한 다른 넘버링 체계 중 어느 하나 또는 당업자에게 알려진 다른 넘버링 체계에 따라 기재된 바와 같은 CDR을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 FR 또는 개별 지정 FR(들)(예를 들어, FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4)은 알려진 체계 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 프레임워크 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에, CDR과 같은 특정 CDR, FR 또는 FR들 또는 CDR들의 식별을 위한 체계는 Kabat, Chothia, AbM 또는 Contact 방법 또는 다른 알려진 체계에 의해 정의된 바와 같이 명시된다. 다른 경우에, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 또는 항원 결합 부분(Fab, F(ab’)2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편(scFv))일 수 있다. 다른 구현예들에서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택되고, 구체적으로 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되고, 더 구체적으로, IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파 또는 람다, 구체적으로 카파로부터 선택된다.
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 단일 도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 항체는 scFv와 같은, 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는, 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체 유래의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
제공된 CAR에 포함된 항체 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)” 또는 “항원 결합 단편(antigen-binding fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 중쇄 가변(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 VH 영역만을 포함하는 단일 도메인 항체; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 제공된 CAR에 있는 항원 결합 도메인은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항체 단편이거나 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 항체는 scFv와 같은 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체 유래의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 본원에 기술되거나 알려진 표적 항원 중 어느 하나와 같이, 종양 세포 또는 암세포와 같은 표적화될 세포 또는 질병의 암 표지자 또는 세포 표면 항원과 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 가수 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 합성 링커, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것과 같이 자연적으로 발생하지 않고/거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않을 수 있는 배열을 포함하는 단편과 같은 재조합으로 생성된 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
“인간화(humanized)” 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된, 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 “인간화 형태(humanized form)”는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 통상적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)의 해당 잔기로 치환되어 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도가 회복되거나 개선된다.
따라서, 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR, 예컨대 이의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역이거나 이를 포함할 수 있는 스페이서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예를 들어, scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로 기능한다. 스페이서는 스페이서의 부재와 비교하여 항원 결합 후에 세포의 반응성 증가를 제공하는 길이의 것일 수 있다.
일부 예에서, 스페이서는 (약) 12개 아미노산 길이이거나 또는 12개 이내의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229개 아미노산, 약 10 내지 200개 아미노산, 약 10 내지 175개 아미노산, 약 10 내지 150개 아미노산, 약 10 내지 125개 아미노산, 약 10 내지 100개 아미노산, 약 10 내지 75개 아미노산, 약 10 내지 50개 아미노산, 약 10 내지 40개 아미노산, 약 10 내지 30개 아미노산, 약 10 내지 20개 아미노산, 또는 약 10 내지 15개의 아미노산을 갖는 것을 포함하고, 열거된 범위들 중 임의의 종점들 사이 임의의 정수를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119개 이하의 아미노산, 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서는 문헌[Hudecek 등 (2013) Clin . Cancer Res., 19:3153, Hudecek 등 (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135 또는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687, 미국 특허 번호 8,822,647 또는 US2014/0271635]에 기재된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지, CH2 및 CH3 중 하나 이상은 IgG4 또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래된다. 일부 경우에, 힌지, CH2 및 CH3은 IgG4로부터 유래된다. 일부 측면에서, 힌지, CH2 및 CH3 중 하나 이상은 키메라이고 IgG4 및 IgG2로부터 유래된 서열을 함유한다. 일부 예에서, 스페이서는 IgG4/2 키메라 힌지, IgG2/4 CH2, 및 IgG4 CH3 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4 및/또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4, IgG2 및/또는 IgG2 및 IgG4로부터 유래된 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열(들) 중 하나 이상을 함유하는 키메라 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 단일 아미노산 돌연변이와 같은 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 변형은 IgG4의 힌지 영역에서 세린(S)을 프롤린(P)으로 치환한 것이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 글리코실화 이질성을 감소시키기 위해 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 치환한 것이며, 예컨대 서열 번호: 70에 제시된 IgG4 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 177번 위치에 해당하는 위치(Uniprot 수탁 번호 P01861; EU 넘버링에 의한 297번 위치 및 서열 번호: 56에 제시된 힌지-CH2-CH3 스페이서 서열의 79번 위치에 해당하는 위치)에서 N의 Q로의 치환 또는 서열 번호: 57에 제시된 IgG2 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 176번 위치에 해당하는 위치(Uniprot 수탁 번호 P01859; EU 넘버링에 의한 297번 위치에 해당하는 위치)에서 N의 Q로의 치환이다.
일부 측면에서, 스페이서는 서열 번호: 58에 제시된 힌지 단독 스페이서와 같은 IgG4 또는 IgG1의 힌지 단독 같은 IgG의 힌지 영역 단독을 함유하며, 서열 번호: 60에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 다른 구현예들에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 56에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 알려진 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 61에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 56-61 중 어느 하나에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 갖는다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 CAR의 경우에 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통한 자극 또는 활성화 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 모방하는 신호전달 성분과 같은 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원 결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막관통 영역 및 세포내 신호전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 일 구현예에서, 수용체(예를 들어, CAR)에 있는 도메인들 중 하나와 자연적으로 회합하는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택되어 수용체 복합체의 다른 멤버들과의 상호 작용이 최소화된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래된 것을 포함한다(즉 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안적으로, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린 등의 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿(triplet)이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커들, 스페이서들 및/또는 막관통 도메인(들)에 의한 것이다.
세포내 신호전달 영역 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합으로 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 유사한 것이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어 글리신 및 세린, 예를 들어 글리신-세린 더블릿(doublet)을 함유하는 것과 같은 2 내지 10개 아미노산 길이의 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이에 존재하고 연결을 형성한다.
수용체(예를 들어, CAR)는 일반적으로 적어도 하나 이상의 세포내 신호전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, ROR1 결합 항체는 하나 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인 및/또는 기타 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가적인 분자의 일부를 더 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR은 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 결찰시, CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 영역은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인들 또는 기타 인자들의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공자극 분자의 세포내 신호전달 영역의 절단 부분은 예를 들어 그것이 효과기 기능 신호를 형질도입하는 경우 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포내 도메인 또는 도메인들을 포함하는 세포내 신호전달 영역은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 천연 맥락에서 항원 수용체 결합 후에 신호전달을 개시하기 위해 상기 수용체와 협력하여 작용하는 공-수용체 및/또는 상기 분자의 임의의 유도체 또는 변이체 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열의 세포질 서열을 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호전달뿐만 아니라 공자극 신호가 필요하다. 따라서, 일부 구현예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분이 CAR에 또한 포함된다. 다른 구현예들에서, CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가의 CAR이 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 측면에서, T 세포 활성화는 두 종류의 세포질 신호전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 설명된다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호전달 성분들 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예에는 TCR 또는 CD3 제타, FcR 감마 또는 FcR 베타로부터 유래된 것이 포함된다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호전달 분자(들)는 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호전달 도메인, 이의 부분, 또는 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, CAR은 공자극 수용체, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS의 신호전달 영역 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 신호전달 영역 및 공자극 성분 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호전달 영역은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극성 CAR 및 공자극 CAR을 포함하며, 둘 다 동일한 세포 상에서 발현된다(WO2014/055668 참조).
특정 구현예에서, 세포내 신호전달 영역은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서 하나 이상의, 예를 들어 둘 이상의 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR에는 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포내 성분들이 포함된다.
일부 경우에, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합 시 CD3 사슬 유도 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제2 세대 CAR은 상기 신호 및 공자극 신호, 예컨대 CD28 또는 CD137과 같은 공자극 수용체 유래 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제3 세대 CAR은 상이한 공자극 수용체의 다중 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 본원에 기술된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 본원에 기술된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일 도메인 VH 항체를 포함하고, 세포내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호전달 영역 사이에 배치된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다. 세포외 도메인과 막관통은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인과 막관통은 본원에 기술된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을, 예컨대 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 CD28의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체와 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 4-1BB의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체와 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 수용체는 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 일부, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지를 함유하는 스페이서, 예컨대 힌지 단독 스페이서를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR의 막관통 도메인은 인간 CD28 또는 이의 변이체의 막관통 도메인 예를 들어, 인간 CD28의 27-아미노산 막관통 도메인(수탁 번호: P10747.1)이거나 또는 서열 번호: 62에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호: 62에 대해 (약) 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함하는 막관통 도메인이며; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 함유하는 막관통 도메인은 서열 번호: 63에 제시된 아미노산의 서열 또는 이에 대해 (약) 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역은 인간 CD28의 세포내 공자극 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부, 예컨대 이의 41개의 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL의 GG로의 치환을 갖는 상기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호: 64 또는 65에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호: 64 또는 65에 대해 적어도 또는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 4-1BB 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부의 세포내 공자극 신호전달 도메인, 예컨대 인간 4-1BB 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부의 42-아미노산 세포질 도메인(수탁 번호: Q07011.1), 예컨대 서열 번호: 66에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호: 66에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역은 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극성 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 단백질 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호: P20963.2) 또는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993]에 기술된 바와 같은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 영역은 서열 번호: 67, 68 또는 69에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호: 67, 68 또는 69에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 IgG의 힌지 영역 단독, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 힌지 단독, 예컨대 서열 번호: 58에 제시된 힌지 단독 스페이서를 함유한다. 다른 구현예들에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 59에 제시된 바와 같은 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 56에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 알려진 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다.
B. T 세포 수용체(
TCR
)
일부 구현예에서, 암호화된 재조합 수용체는 종양, 바이러스 또는 자가 면역 단백질의 항원과 같은 표적 폴리펩타이드의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 부분이다.
일부 구현예에서, “T 세포 수용체(T cell receptor)”또는 “TCR”은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 알려짐) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이고, 이는 MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 통상적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 구별되는 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 용해성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되며, 이곳에서 이는 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 “TCR”은 완전한(full) TCR뿐만 아니라 이의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 미만의 TCR이지만 MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 것과 같이 MHC 분자에서 결합된 특정 펩타이드에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있으나, 그럼에도 완전한 TCR이 결합하는 MHC-펩타이드 복합체와 같은 펩타이드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬과 같은 TCR의 가변 도메인을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하며, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 1차 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 이의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 CDR에 비해 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성을 덜 나타내는 프레임워크 영역(FR)으로 분리된다(예를 들어, 문헌[Jores 등, Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia 등, EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc 등, Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003] 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식을 위한 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과의 상호작용을 위한 주어진 TCR 가변 영역상에서 3개의 CDR 중 가장 중요한 CDR이다. 일부 맥락에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩타이드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, 베타 사슬의 CDR1은 상기 펩타이드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 이의 인식을 담당하는 1차 CDR이거나 이에 가장 강력하게 기여한다. 일부 구현예에서, β 사슬의 가변 영역은 추가 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Janeway 등, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 1개의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단 끝에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 회합한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬(예를 들어, α-사슬 또는 b-사슬)의 세포외 부분은 세포막에 인접한 2개의 면역글로불린 유사 도메인, 예컨대 가변 도메인(예를 들어, Vα 또는 Vb; 전형적으로 Kabat 넘버링 Kabat 등, “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.에 기초한 1 내지 116 아미노산) 및 불변 도메인(예를 들어 α 사슬 불변 도메인 즉 Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링에 기초한 사슬의 117 내지 259 위치 또는 b 사슬 불변 도메인 또는 Cb, 전형적으로 Kabat에 기초한 사슬의 117 내지 295 위치)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유하며, 가변 도메인 각각은 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 이로써 2개의 TCR 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에 2개의 이황화 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양전하를 띤다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 이 구조는 TCR이 CD3 및 이의 서브유닛과 같은 다른 분자와 회합하도록 허용한다. 예를 들어, 막관통 영역을 가진 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정하고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 회합할 수 있다. CD3 신호전달 서브유닛(예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 꼬리는 TCR 복합체의 신호전달 용량에 관여하는 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 즉 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개의 사슬 α 및 β(또는 선택적으로 γ 및 δ)의 이종이량체이거나 단일 사슬 TCR 구조체일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예컨대 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결되는 2개의 별개의 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 이종이량체이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα,β 사슬의 서열과 같은 알려진 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있으며, 이에 대해 실질적으로 전장 코딩 서열이 용이하게 이용가능하다. V 사슬 서열을 포함한 전장 TCR 서열을 세포 공급원으로부터 수득하는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내의 또는 이로부터 단리된 TCR 암호화 핵산의 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭에 의해 또는 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원, 예컨대 세포, 예컨대 T 세포(예를 들어, 세포 독성 T 세포), T 세포 혼성세포 또는 기타 공개적으로 이용 가능한 공급원으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 흉선에서 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 네오에피토프 제한(neoepitope-restricted) TCR이다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양된 T 세포 혼성세포(hybridoma) 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR 서열에 대한 지식을 이용해 합성하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원 또는 이의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝하여 식별되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 기타 림프구 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 단리된 T 세포로부터의 Vα 및 Vβ 레퍼토리를 증폭하여 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 정상적인 건강한 대상체의 T 세포 공급원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 유병 대상체의 T 세포 공급원, 즉 유병 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의해 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키기 위해 퇴화(degenerate) 프라이머가 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 산물이 클로닝되거나 결집되어 링커에 의해 분리되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 결집될 수 있다. 대상체와 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자 특이적일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모체(parent) 또는 스캐폴드(scaffold) TCR 분자의 돌연변이 유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 예컨대 돌연변이 유발에 의해 유도 진화를 거친다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화도 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 예컨대, 스크리닝에 의해 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하여 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 항원 특이적 T 세포에 존재하는 TCR은 예컨대 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특정 친화도 또는 친화력에 의해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 항원 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 자연적으로 발생하는 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원(예를 들어, 암 항원)에 대한 높은 친화도 T 세포 클론이 환자로부터 식별되고, 단리되고, 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론이 인간 면역계통 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템 즉 HLA)로 조작된 형질전환 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원(예를 들어, 문헌[Parkhurst 등 (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 및 Cohen 등 (2005) J Immunol. 175:5799-5808] 참조)을 참조한다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대하여 TCR을 단리하기 위해 파지 디스플레이가 사용된다(예를 들어, 문헌[Varela-Rohena 등 (2008) Nat Med. 14:1390-1395 and Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354] 참조).
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 변형되거나 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 더 높은 친화도를 갖는 것과 같은 변경된 특성을 가진 TCR을 생성하기 위해 유도 진화 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler 등 (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler 등 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li 등 (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이(Chervin 등 (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하되 이에 한정되지 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근법은 알려진, 모체(parent) 또는 기준 TCR을 조작 또는 변형하는 것을 수반한다. 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 CDR 잔기에서 돌연변이된 돌연변이를 일으킨 TCR을 생성하기 위한 주형(template)으로 야생형 TCR이 사용될 수 있고, 원하는 변경된 특성, 예컨대 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화도를 갖는 돌연변이가 선택된다.
일부 구현예에서, 관심 TCR의 제조 또는 생성에 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 알려져 있거나 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원 결합 부분을 생성하는 데 사용하기에 적합한 펩타이드는 하기 기재된 표적 폴리펩타이드와 같은 관심 표적 폴리펩타이드에서 HLA 제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 이용 가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 식별된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237) 및 SYFPEITHI(Schuler 등 (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC 제한 에피토프는 HLA-A0201이며, 이는 모든 백인의 약 39-46%에서 발현되고 따라서, TCR 또는 다른 MHC-펩타이드 결합 분자를 제조하는 데 사용하기 위한 MHC 항원의 적합한 선택을 의미한다.
컴퓨터 예측 모델을 사용한 프로테아좀 및 면역 프로테아좀에 대한 HLA-A0201 결합 모티프 및 절단 부위는 알려져 있다. MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001에 보다 상세하게 기재됨) 및 SYFPEITHI(Schuler 등 SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된 재조합으로 생산된 천연 단백질 또는 이의 돌연변이 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 랫트 또는 기타 포유동물과 같은 다양한 동물 종 중 하나에서 유래될 수 있다. TCR은 세포 결합 또는 용해성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포 결합 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 2량체 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 문헌[WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186]에 기술된 바와 같은 구조를 가지고 있다.
일부 구현예에서, TCR은 막관통 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하여 임의의 TCR은 T 세포 표면 상에 활성 TCR을 산출하는 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다.
일부 구현예에서 dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩타이드, 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 N 말단 서열에 융합된 제2 폴리펩타이드를 함유하고, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 이 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 천연 사슬 간 이황화 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬 간 이황화 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포외 서열에 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화 결합이 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하는 막관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 이 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 2량체화(dimerization) 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 이 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제2 2량체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 여기에서 제1 및 제2 2량체화 모티프는 용이하게 상호작용하여 TCR α 사슬과 TCR β 사슬을 서로 연결하는 제1 2량체화 모티프에 있는 아미노산과 제2 2량체화 모티프에 있는 아미노산 사이에서 공유결합을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Soo Hoo, W. F. 등 PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. 등 PNAS (USA) 90 3830 (1993); 국제 출원 공개 번호 WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. 등 J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)] 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 도입된 비천연 사슬 간 이황화 결합을 함유하여 TCR 사슬의 회합을 용이하게 한다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 03/020763 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 비이황화물 연결 절단형 TCR이며 여기에서 이종 류신 지퍼(heterologous leucine zipper)가 이의 C-말단에 융합하여 사슬 결합을 촉진한다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO99/60120 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유적으로 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유하고 있다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO99/18129 참조).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제1 분절, TCR β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 해당하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제2 분절, 및 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 분절, 및 β 사슬 세포외 불변 및 막관통 서열의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 분절, 및 선택적으로 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCRβ 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 분절, 및 α 사슬 세포외 불변 및 막관통 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 분절, 및 선택적으로 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 분절을 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어, 화학식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 아미노산 서열을 나타내며 여기서 아미노산은 글리신과 세린이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 분절은 이의 가변 영역 서열이 상기 결합을 향해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제1 분절의 C 말단과 제2 분절의 N 말단 사이(또는 그 반대)의 거리를 포괄할 수 있는 충분한 길이를 가지나 표적 리간드와 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 (약) 10 내지 45개의 아미노산, 예컨대 10 내지 30개의 아미노산 또는 26 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG)5-P-를 갖고 여기서 P는 프롤린이고, G는 글리신이고 S는 세린이다(서열 번호: 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(서열 번호: 23)를 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 연결하는 공유 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬 간 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 분절의 불변 영역 세포외 서열로 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화 결합이 모두 바람직할 수 있다.
도입된 사슬 간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 천연 시스테인 중 하나 이상이 다른 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 제1 및 제2 분절에 있는 비시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비천연 이황화 결합은 문헌[국제 출원 공개 번호 WO2006/000830]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 표적 항원에 대해 (약) 10-5 내지 10-12 M 및 그 안의 모든 개별 수치 및 범위의 평형 결합 상수를 갖는 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 및 β 사슬과 같은 TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 기타 적합한 수단에 의해 증폭되어 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질전환하거나 형질주입시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 번식 및 증폭을 위해 또는 발현을 위해 또는 둘 모두를 위해 설계된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 준비될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 벡터가 도입되어야 하는 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을, 벡터가 DNA 기반인지 또는 RNA 기반인지 고려하여 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원 결합 부분(또는 다른 MHC-펩타이드 결합 분자)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 시토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터와 같은, 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 다른 알려진 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, T 세포 클론이 수득된 후, TCR 알파 및 베타 사슬이 단리되고 유전자 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, TCR 알파 및 베타 유전자는 두 사슬이 공발현되도록 피코르나바이러스 2A 리보솜 스킵 펩타이드를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, TCR의 유전자 전달은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통해 또는 트랜스포손을 통해 달성된다(예를 들어, 문헌[Baum 등 (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha 등 (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; 및 Hackett 등 (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683] 참조).
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위해, 관심 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 총 cDNA로부터 α 및 β 사슬이 PCR 증폭되고 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스) 벡터로 편입된다.
Ⅳ. 투여 방법
일부 측면에서, 조작된 세포(예를 들어, 조작된 CD4+ 및 CD8+ 세포)를 포함하는 치료용 세포 조성물은 예를 들어 본원에 제공된 방법을 사용하여 평가된 조작된 세포를 함유하는 조작된 세포 또는 조성물 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한 치료 방법과 관련하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포 또는 동일한 것을 포함한 조성물은 다양한 증상의 치료, 진단 및 예방에 유용하다. 예를 들어, 조작된 세포 또는 조작된 세포를 포함하는 조성물(예를 들어, 치료용 세포 조성물)은 대상체에서 다양한 질병 및 장애를 치료하는 데 유용하다. 방법 및 용도는 예를 들어, 조작된 세포 또는 동일한 것을 함유하는 조성물을 종양 또는 암과 같은 질병, 병태 또는 장애를 가진 대상체에 투여하는 것을 포함한 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 구현예를 사용하여 평가된 조작된 세포 또는 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 효과적인 유효량으로 투여된다. 용도는 상기 방법 및 치료에서, 및 상기 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서 조작된 세포 또는 조성물의 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법, 예를 들어 치료 방법은 산정된 또는 평가된 조작된 세포 또는 동일한 것을 포함한 조성물을 질병 또는 병태가 있거나 있는 것으로 의심되는 대상체에 투여함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이를 통해 대상체에서 질병 또는 병태 또는 장애를 치료한다.
일부 측면에서, 조작된 세포 또는 조작된 세포 조성물은 질병 또는 장애를 가진 대상체와 같은 대상체에 투여할 수 있다. 입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 알려져 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어, 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238(Gruenberg 등); 미국 특허 번호 4,690,915(Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85]에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Themeli 등 (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara 등 (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila 등 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
치료되는 질병 또는 병태는 항원의 발현이 질병, 병태 또는 장애의 병인과 관련되고/거나 병인에 수반되는, 예를 들어, 상기 질병, 병태 또는 장애를 일으키거나, 악화하거나 또는 그렇지 않으면 그에 수반되는, 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질병 및 병태는 악성 종양 또는 세포의 형질전환(예를 들어, 암), 자가면역 또는 염증성 질환 또는 예를 들어 세균, 바이러스 또는 기타 병원체로 인한 전염병과 연관된 질병 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료할 수 있는 다양한 질병 및 병태와 연관된 항원을 포함하는 예시적인 항원들이 상기에 기술되어 있다. 구체적인 구현예에서, 키메라 항원 수용체 또는 형질전환 TCR은 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
질병, 병태 및 장애 중에는 고형 종양, 혈액성 악성 종양 및 흑색종을 포함한 종양이 있고, 국소화 및 전이성 종양, 감염병, 예컨대 바이러스 또는 기타 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV, HPV로 인한 감염 및 기생충병 및 자가면역 질환 및 염증성 질환이 포함된다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물 또는 기타 증식성 질병 또는 장애이다. 상기 질병은 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(acute myeloid (or myelogenous) leukemia, AML), 만성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(chronic myeloid (or myelogenous) leukemia, CML), 급성 림프구성(또는 림프모구) 백혈병(acute lymphocytic (or lymphoblastic) leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 모발 세포 백혈병(hairy cell leukemia, HCL), 소형 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), 외투 세포 림프종(Mantle cell lymphoma, MCL), 변연부 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma, HL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL), 역형성 거대 세포 림프종(Anaplastic large cell lymphoma, ALCL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 불응성 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 및 다발성 골수종(multiple myeloma, MM)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 성인 ALL, 만성 림프모구 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL)에서 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 NHL이고 상기 NHL은 공격성 NHL, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(드노보 및 비활동성으로부터 형질전환됨), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(primary mediastinal large B cell lymphoma, PMBCL), T 세포/조직세포 풍부 거대 B 세포 림프종(T cell/histocyte-rich large B cell lymphoma, TCHRBCL), 버킷 림프종, 외투 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 선택적으로, 3B 등급 여포성 림프종(follicular lymphoma Grade 3B, FL3B)으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원생 동물 감염, 면역결핍, 시토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스 같은 감염성 질병 또는 병태이나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 자가면역 또는 염증성 질병 또는 병태, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), I 형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 염증성 장질환, 건선, 피부 경화증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 연관된 질병 또는 병태다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 연관된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9; CAIX 또는 G250으로도 알려짐), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG; NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 절단형 표피 성장 인자 단백질(tEGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살해 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 알려짐), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2; 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 알려진 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HIV, HCV, HBV로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원, 및/또는 기생충 항원과 같은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 CD19와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로부터 유래되거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료가 필요한 대상체, 예를 들어, 환자로부터 유래되고, 세포는 단리 및 가공 후에 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, B 세포 악성 종양은 백혈병 또는 림프종이다. 일부 측면에서, 질병 또는 병태는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 성인 ALL, 만성 림프모구 백혈병(CLL), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 일부 경우에, 질병 또는 병태는 NHL이거나 예컨대 공격성 NHL, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(드노보 및 비활동성으로부터 형질전환됨), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), T 세포/조직세포 풍부 거대 B 세포 림프종(TCHRBCL), 버킷 림프종, 외투 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 선택적으로, 3B 등급 여포성 림프종(FL3B)인 NHL을 포함한다. 일부 측면에서, CAR과 같은 재조합 수용체는, B 세포 악성 종양과 연관된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 알려진 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30 또는 이의 조합물이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 다발성 골수종과 같은 골수종이다. 일부 측면에서, CAR과 같은 재조합 수용체는 다발성 골수종과 연관된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다발성 골수종과 연관된 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 항원, 예를 들어 질병 특이적 항원 및/또는 관련 항원과 같은 제2 또는 추가 항원은 다발성 골수종, 예컨대 B 세포 성숙 항원(BCMA), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), CD38(환형 ADP 리보오스 가수 분해 효소), CD138(신데칸-1, 신데칸, SYN-1), CS-1(CS1, CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24), BAFF-R, TACI 및/또는 FcRH5 상에서 발현된다. 다른 예시적인 다발성 골수종 항원은 CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, β2-마이크로글로불린, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1 및 액티빈(activin) 수용체 IIA형(ActRIIA)을 포함한다. 문헌[Benson and Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15; Tao and Anderson, Bone Marrow Research (2011):924058; Chu 등, Leukemia (2013) 28(4):917-27; Garfall 등, Discov Med. (2014) 17(91):37-46]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항원은 림프성 종양, 골수종, AIDS(에이즈) 관련 림프종 및/또는 CD38과 같은 이식 후 림프구 증식에 존재하는 것을 포함한다. 상기 항원에 대해 지시된 항체 또는 항원 결합 단편은 알려져 있고, 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; 미국 공개 번호 US20120189622 또는 US20100260748; 및/또는 국제 PCT 공개 번호 WO2006099875, WO2009080829 또는 WO2012092612 또는 WO2014210064]에 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)은 다중특이성 항체, 다중특이성 키메라 수용체, 예컨대 다중특이성 CAR 및/또는 다중특이성 세포에 함유되어 있다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)의 발현 및/또는 B 세포 성숙 항원(BCMA)의 발현과 연관된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 B 세포 관련 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예의 일부에서, BCMA와 연관된 질병 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 자가면역 질환 또는 장애는 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 루푸스 신염, 염증성 장질환, 류머티스성 관절염, ANCA 연관 혈관염, 특발성 혈소판 감소성 자반병(idiopathic thrombocytopenia purpura, ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenia purpura, TTP), 자가 면역성 혈소판 감소증, 샤가스병(Chagas’ disease), 그레이브병(Grave’s disease), 베게너 육아종증(Wegener’s granulomatosis), 다발성 결절성 동맥염(poly-arteritis nodosa), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 피부 경화증(scleroderma), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), IgA 신장병(nephropathy), IgM 다발성 신경병(polyneuropathies), 혈관염(vasculitis), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 레이노드 증후군(Reynaud’s syndrome), 항인지질 증후군(anti-phospholipid syndrome), 굿파스처 병(Goodpasture’s disease), Kawasaki disease(가와사키 병), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 또는 진행성 사구체 신염(progressive glomerulonephritis)이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 GPRC5D-발현 암이다. 일부 구현예에서, 암은 형질 세포 악성 종양이고 형질 세포 악성 종양은 다발성 골수종(multiple myeloma, MM) 또는 형질세포종(plasmacytoma)이다. 일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종(MM)이다. 일부 구현예에서, 암은 재발성/불응성 다발성 골수종이다.
일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 예정이거나 최종적으로 받는 대상체, 예를 들어 제1 대상체 외의 대상체로부터 단리 및/또는 달리 준비된다. 상기 구현예에서, 이어서 세포는 상이한 대상체, 예를 들어, 같은 종의 제2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스(HLA class) 또는 수퍼타입(supertype)을 발현한다.
세포는, 임의의 적합한 수단, 예를 들어 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안구내(intraocular) 주사, 안구주위(periocular) 주사, 망막하(subretinal) 주사, 유리체내(intravitreal) 주사, 중격-경유성(trans-septal) 주사, 공막하(subscleral) 주사, 맥락막내(intrachoroidal) 주사, 전방내(intracameral) 주사, 결막하 주사(subconjectval injection, subconjuntival injection), 서브 테논(sub-Tenon) 주사, 안구뒤(retrobulbar) 주사, 안구주위(peribulbar) 주사 또는 후부 점막 주사(posterior juxtascleral) 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비강내 및 국소 치료가 바람직한 경우 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량이 세포의 단일 볼루스 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 이는 예를 들어, 3일 이내의 기간에 걸쳐 세포의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 세포의 지속적인 주입 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 용량 또는 임의의 추가 요법, 예를 들어 림프구 고갈 요법, 개입 요법 및/또는 병용 요법의 투여는 통원 전달을 통해 수행된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 진행 경과, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 대상체의 임상 이력과 세포에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서 조성물 및 세포는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 병용 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 하는 데 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 화학 요법제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위해, 화학 요법제, 예를 들어, 조절 화학 요법제를 투여받는다.
일부 측면에서 면역 고갈(예를 들어, 림프구 고갈) 요법으로 대상체를 사전 조절하면 입양 세포 요법(ACT)의 효과를 향상시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 대상체는 세포 요법의 개시 전에 대상체에 시클로포스파미드, 플루다라빈 또는 이의 조합물과 같은 림프구 고갈제 또는 화학 요법제와 같은 사전 조절제를 투여받는다. 예를 들어, 대상체는 세포 요법을 개시하기 적어도 2일 전, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7일 전에 사전 조절제를 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포 요법의 개시 7일 이내 전, 예컨대 6, 5, 4, 3 또는 2일 이내 전에 사전 조절제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 (약) 20mg/kg 내지 100mg/kg, 예컨대 (약) 40mg/kg 내지 80mg/kg 사이의 용량의 시클로포스파미드로 사전 조절된다. 일부 측면에서, 대상체는 (약) 60mg/kg의 시클로포스파미드로 사전 조절된다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 주어진 매일, 격일 또는 3일마다 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 1일 또는 2일 동안 매일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈제가 시클로포스파미드를 포함하는 경우, 대상체에 (약) 100mg/m2 내지 500mg/m2, 예컨대 (약) 200mg/m2 내지 400mg/m2 또는 250mg/m2 내지 350mg/m2(수치 포함)의 용량으로 시클로포스파미드가 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 약 300mg/m2의 시클로포스파미드를 투여한다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 주어진 매일, 격일 또는 3일마다 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 예컨대 1 내지 5일 동안, 예를 들어 3 내지 5일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 세포 요법의 개시 전 3일 동안 매일 약 300mg/m2의 시클로포스파미드가 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구 고갈제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체에 (약) 1mg/m2 내지 100mg/m2, 예컨대 (약) 10mg/m2 내지 75mg/m2, 15mg/m2 내지 50mg/m2, 20mg/m2 내지 40mg/m2 또는 24mg/m2 내지 35mg/m2(수치 포함)의 용량으로 플루다라빈이 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 약 30mg/m2의 플루다라빈이 투여된다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 매일, 격일 또는 3일마다 주어진 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 예컨대 1 내지 5일 동안, 예를 들어 3 내지 5일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 세포 요법의 개시 전 3일 동안 매일 약 30mg/m2의 플루다라빈이 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구 고갈제는 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합물과 같은 제제들의 조합물을 포함한다. 따라서, 상기 제제들의 조합물은 상기 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 일정의 시클로포스파미드 및 상기 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 일정의 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체에 제1 또는 후속 용량 전에 60mg/kg(~2g/m2) 시클로포스파미드 및 3 내지 5개 용량의 25mg/m2 플루다라빈이 투여된다.
일부 구현예에서 세포의 투여 후에, 조작된 세포 집단의 생물학적 활성이 예를 들어, 알려진 다수의 방법 중 하나에 의해 측정된다. 평가 매개변수는 생체내에서, 예를 들어 영상화에 의해 또는 생체외에서, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 분석에 의해 항원에 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포를 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 문헌[Kochenderfer 등, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman 등 J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기술된 세포 독성 분석과 같은 알려진 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석하여 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 평가하여 측정한다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 이의 치료적 또는 예방적 효능이 증가하도록 임의의 수의 방법으로 추가 변형된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 표적화 모이어티에 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 접합될 수 있다. 화합물, 예를 들어 TCR 또는 CAR을 표적화 모이어티에 접합시키는 실시는 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Wadwa 등, J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) 및 미국 특허 5,087,616]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 병용 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 하는 데 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다.
A. 투약(dosing)
일부 구현예에서, 세포의 일정 용량이 제공된 방법,및/또는 제공된 제조품 또는 조성물에 부합되게 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 크기 또는 투여 시기는 대상체에서 특정 질병 또는 병태에 대한 작용으로서 알아낸이다. 일부 경우에, 제공된 기재의 관점에서 특정 질병에 대한 용량의 크기 또는 투여 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 2 x 105개 세포/kg 내지 (약) 2 x 106개 세포/kg, 예컨대 (약) 4 x 105개 세포/kg 내지 (약) 1 x 106개 세포/kg 또는 (약) 6 x 105개 세포/kg 내지 (약) 8 x 105개 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 대상체 체중 1 킬로그램당 2 x 105개 이내의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 (약) 3 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 4 x 10 5개 이내의 세포/kg, (약) 5 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 6 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 7 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 8 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 9 x 105개 이내의 세포/kg, (약) 1 x 106개 이내의 세포/kg 또는 (약) 2 x 106개 이내의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 대상체의 체중 1 킬로그램당 적어도 (약) 또는 (약) 2 x 105개의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 적어도 (약) 또는 (약) 3 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 4 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 5 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 6 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 7 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 8 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 9 x 105개 세포/kg, 적어도 (약) 또는 (약) 1 x 106개 세포/kg, 또는 적어도 (약) 또는 (약) 2 x 106개 세포/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 또는 세포의 하위 유형의 개별 집단은 (약) 10만 내지 (약) 1000억 세포의 범위로 및/또는 대상체의 체중 1kg당 세포의 양으로, 예컨대, 예를 들어, (약) 10만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), (약) 1백만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), 예컨대 (약) 1천만 내지 (약) 1000억 세포(예를 들어, (약) 2천만 세포, (약) 3천만 세포, (약) 4천만 세포, (약) 6천만 세포, (약) 7천만 세포, (약) 8천만 세포, (약) 9천만 세포, (약) 100억 세포, (약) 250억 세포, (약) 500억 세포, (약) 750억 세포, (약) 900억 세포 또는 전술한 수치들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위) 및 일부 경우에 (약) 1억 세포 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 1억2천만 세포, (약) 2억5천만 세포, (약) 3억5천만 세포, (약) 6억5천만 세포, (약) 8억 세포, (약) 9억 세포, (약) 30억 세포, (약) 300억 세포, (약) 450억 세포) 또는 상기 범위 사이의 임의의 수치 및/또는 대상체의 체중 1kg당 세포의 양으로 대상체에 투여된다. 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료의 구체적인 속성에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 세포의 용량이 대상체의 체표면적 또는 체중에 결부되거나 그에 기초하지 않도록 하는 세포의 균일한 용량 또는 세포의 고정된 용량이다. 일부 구현예들에서, 상기 수치는 재조합 수용체 발현 세포의 수를 지칭하고; 다른 구현예들에서, 이는 투여된 T 세포 또는 PBMC 또는 총 세포의 수를 지칭한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 용량은 약 5 x 108개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, 약 1 x 106 내지 5 x 108의 상기 세포 수 범위내, 예컨대 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 , (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108의 상기 세포 수 범위내, 예컨대 (약) 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 또는 5 x 108개 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치들 중 임의의 두 개 사이의 범위내 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우에, 용량은 (약) 1 x 106개 초과의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 (약) 2 x 109개 미만의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.2 x 109개의 상기 세포 수 범위내, 예컨대, (약) 2.5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 8 x 108 또는 1.2 x 109개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치들 중 임의의 두 개 사이의 범위내 수를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포의 용량은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108개의 총 CAR-발현(CAR+) T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 106개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 2.5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포, (약) 또는 2.5 x 108 내지 (약) 5 x 108개의 총 CAR-발현 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포의 용량은 (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.5 x 108개의 총 CAR-발현 세포, 예컨대 (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포의 용량은 적어도 (약) 1 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 105개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1.5 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 약 5 x 106개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 1 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 2.5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 5 x 107개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 1 x 108개의 CAR-발현 세포, 적어도 또는 적어도 약 2.5 x 108개의 CAR-발현 세포, 또는 적어도 또는 적어도 약 5 x 108개의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의(각 수치 포함) 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 적어도 (약) 1 x 105개의 총 재조합 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 예컨대 적어도 (약) 1 x 106개, 적어도 (약) 1 x 107개, 적어도 (약) 1 x 108개의 상기 세포의 수를 포함하는 세포의 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3-발현 또는 CD8-발현의 총 수를 기준으로 하고, 일부 경우에는 또한 재조합 수용체-발현(예를 들어 CAR-발현) 세포의 총 수를 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 CD3-발현 또는 CD8-발현 총 T 세포 또는 CD3-발현 또는 CD8-발현 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 CD3-발현 또는 CD8-발현 총 T 세포 또는 CD3-발현 또는 CD8-발현 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 CD3-발현 또는 CD8-발현 총 T 세포 또는 CD3-발현 또는 CD8-발현 재조합 수용체-발현 세포(각 수치 포함)의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 CD3-발현/CAR-발현 또는 CD8-발현/CAR-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 CD3-발현/CAR-발현 또는 CD8-발현/CAR-발현 세포 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 CD3-발현/CAR-발현 또는 CD8-발현/CAR-발현 세포(각 수치 포함)의 세포 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 용량에 포함된 용량의 CD8+ T 세포는 (약) 1 x 106 내지 5 x 108개의 총 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 CD8+ 세포, 예를 들어, (약) 5 x 106 내지 1 x 108개의 상기 세포의 범위내, 예컨대 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치들 중 임의의 두 개 사이의 범위내 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량을 투여받고, 각각의 용량 또는 총 용량은 전술한 수치들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1 x 107 내지 (약) 0.75 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 0.25 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포(각 수치 포함)의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 (약) 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 2.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 T 세포의 용량이 단일 용량으로 대상체에 투여되거나 2주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 이상의 기간 내에 1회만 투여된다.
입양 세포 요법의 맥락에서, 주어진 “용량(dose)”의 투여는 단일 조성물 및/또는 단일 비중단 투여, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입으로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄하며, 또한 다중 개별 조성물 또는 주입제로 제공된 경우 명시된 기간에 걸쳐, 예컨대 3일 이내에 걸쳐 분할된 용량 또는 복수의 조성물로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄한다. 따라서, 일부 맥락에서, 용량은 단일 시점에서 주어진 또는 개시된, 명시된 세포 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 맥락에서, 용량은 3일 동안 또는 2일 동안 하루에 한 번 또는 하루의 기간에 걸쳐 다중 주입에 의한 것과 같이 3일 이내의 기간에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 용량의 세포는 단일 약학 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 세포는 총체적으로 용량의 세포를 함유하는 복수의 조성물로 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 “분할 용량(split dose)”은 1일을 초과하는 기간에 걸쳐 투여되도록 분할된 용량을 지칭한다. 상기 유형의 투약은 본 방법에 포괄되고 단일 용량으로 간주된다.
따라서, 세포의 용량은 분할 용량, 예를 들어, 시간에 걸쳐 투여되는 분할 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용량은 2일 또는 3일에 걸쳐 대상체에 투여될 수 있다. 분할 투약에 대한 예시적인 방법은 첫 날에 용량의 25%를 투여하고 두 번째 날에 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예들에서, 용량의 33%가 첫 날에 투여되고 두 번째 날에 나머지 67%가 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 용량의 10%가 첫 날에 투여되고, 용량의 30%가 두 번째 날에 투여되며, 용량의 60%가 셋째 날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 3일을 초과하는 기간에 걸쳐 나뉘지는 않는다.
일부 구현예에서, 용량의 세포는 복수의 조성물 또는 용액, 예컨대 제1 및 제2, 선택적으로 그 이상의 투여로 투여될 수 있고, 각각은 용량의 세포를 일부 함유한다. 일부 측면에서, 각각이 상이한 세포들의 집단 및/또는 아형을 함유하는 복수의 조성물이 개별적으로 또는 독립적으로, 선택적으로 특정 기간 내에 투여된다. 예를 들어, 세포들의 집단 및/또는 아형은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 각각 CD8+ 및 CD4+-농축된 집단, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있고, 각각은 개별적으로 재조합 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 용량 또는 CD4+ T 세포의 용량을 포함하는 제1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 용량을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 용량의 투여, 예를 들어, 복수의 세포 조성물의 투여는 세포 조성물들의 개별 투여를 수반한다. 일부 측면에서, 개별 투여는 동시에, 또는 순차적으로 임의의 순서로 수행된다. 일부 구현예에서, 용량은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 제1 조성물 및 제2 조성물은 (약) 0 내지 (약) 12시간 간격으로, (약) 0 내지 (약) 6시간 간격으로 또는 (약) 0 내지 (약) 2시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및 제2 조성물의 투여 개시는 (약) 2시간 이내, (약) 1시간 이내 또는 (약) 30분 이내의 간격, (약) 15분 이내, (약) 10분 이내 또는 (약) 5분 이내의 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제2 조성물의 투여 개시 및/또는 완료는 (약) 2시간 이내, (약) 1시간 이내 또는 (약) 30분 이내의 간격, (약) 15분 이내, (약) 10분 이내 또는 (약) 5분 이내의 간격으로 수행된다.
일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어, 용량의 제1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어, 용량의 제1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포들의 용량 또는 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포 및/또는 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 정의된 비 또는 표적 비를 포함하고, 상기 비는 선택적으로 대략 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이, 예컨대 대략 1:1이다. 일부 측면에서, 표적 비 또는 원하는 비의 상이한 세포의 집단(예컨대 CD4+:CD8+ 비 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비, 예를 들어, 1:1)을 갖는 조성물 또는 용량의 투여는 집단들 중 하나를 함유하는 세포 조성물의 투여 후 집단들 중 다른 하나를 포함하는 별도의 세포 조성물의 투여를 수반하고, 상기 투여는 표적 비 또는 원하는 비이거나 대략적인 표적 비 또는 원하는 비로 수행된다. 일부 측면에서, 정의된 비로 세포들의 용량 또는 조성물의 투여는 T 세포 요법의 증폭, 지속성 및/또는 항종양 활성의 향상으로 이어진다.
일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 용량, 예를 들어 두 개 이상의 용량 또는 다중 연속 용량을 투여받는다. 일부 구현예에서, 두 개의 용량이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 연속 용량, 예를 들어 제2 용량을 투여받는데, 이는 제1 용량 후 대략 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일에 투여된다. 일부 구현예에서, 다중 연속 용량은 제1 용량 후에 투여되어, 추가 용량 또는 용량들이 연속 용량의 투여 후에 투여되도록 한다. 일부 측면에서, 추가 용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제1 용량 및/또는 연속 용량과 동일하거나 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들은 선행 용량들보다 더 크다.
일부 측면에서, 제1 및/또는 연속 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학 요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 알아낸이다.
일부 측면에서, 제1 용량의 투여와 연속 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35일, 약 14 내지 약 28일 또는 15 내지 27일이다. 일부 구현예에서, 연속 용량의 투여는 제1 용량의 투여 후 약 14일 초과 및 약 28일 미만의 시점에 수행한다. 일부 측면에서, 제1 용량 및 연속 용량 사이 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들, 예를 들어, 연속 용량들이 연속 용량의 투여 후 투여된다. 일부 측면에서, 추가 연속 용량 또는 용량들은 선행 용량의 투여 후 적어도 약 14일 이상 내지 약 28일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 용량은 선행 용량 후 약 14일 미만에, 예를 들어, 선행 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13일에 투여된다. 일부 구현예에서, 선행 용량 후 약 14일 미만에 및/또는 선행 용량 후 약 28일 초과하여 어떤 용량도 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체 발현 세포의 용량은 제1 용량의 T 세포 및 연속 용량의 T 세포를 포함한 제2 용량(예를 들어, 2배 용량)을 포함하며, 여기서 제1 용량 및 제2 용량 중 하나 또는 둘 모두는 T 세포의 분할 용량 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 일반적으로 질병 부담을 감소시키는 데 효과적일 만큼 충분히 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되며, 이는 일부 측면에서 원하는 세포의 용량 수 또는 세포 유형(들) 및/또는 세포 유형의 원하는 비를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 투여량은 세포의 총 수(또는 체중 1kg당 수) 및 개별 집단 또는 아형의 원하는 비, 예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비에 기초한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 개별 집단 내 세포 또는 개별 세포 유형의 원하는 총 수(또는 체중 1kg당 수)에 기초한다. 일부 구현예에서, 투여량은 개별 집단에서 원하는 총 세포의 수, 원하는 비 및 원하는 세포의 총 수와 같은 상기 특징들의 조합에 기초한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 아형의 세포는 원하는 T 세포의 용량과 같이 원하는 총 세포의 용량의 허용된 차이로 또는 허용된 차이 내로 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 원하는 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 세포 수, 예를 들어 세포 수/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 최소 세포 수 또는 체중 단위당 최소 세포 수 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여되는 총 세포 중, 개별 집단 또는 하위 유형은 원하는 산출 비(예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비)로 또는 부근의 비로, 예를 들어 상기 비의 특정 허용된 차이 또는 오차 내로 존재한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 용량과 같은 하나 이상의 개별 세포 집단 또는 아형의 세포의 원하는 용량의 허용된 차이 또는 차이 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 원하는 하위 유형 또는 집단의 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 원하는 상기 세포 수, 예를 들어 세포 수/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 아형의 최소 세포 수 또는 체중 단위당 집단 또는 아형의 최소 세포 수 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 용량 및 원하는 비에 기초하고/거나 개별 아형들 또는 하위 집단들 중 하나 이상, 예를 들어 각각의 원하는 고정 용량에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정 또는 최소 용량 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비에 기초하고/거나 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정 또는 최소 용량에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 아형과 같은 다중 세포 집단 또는 아형의 원하는 산출 비의 허용된 범위로 또는 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있거나 비들의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 원하는 비(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비)는 (약) 5:1 내지 (약) 5:1(또는 약 1:5 초과 내지 약 5:1 미만), 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1(또는 약 1:3 초과 내지 약 3:1 미만), 예컨대 (약) 2:1 내지 (약) 1:5(또는 약 1:5 초과 내지 약 2:1 미만), 예컨대 (약) 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용된 차이는 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%(상기 범위들 사이의 임의의 수치 포함) 이내이다.
구체적인 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포의 수를 지칭한다. 다른 구현예들에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여되는 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 지칭한다.
일부 측면에서, 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학 요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 병기(stage) 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 알아낸이다.
일부 구현예에서, 본 방법은 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포 및/또는 림프구 고갈 요법의 하나 이상의 추가 용량을 투여하는 단계를 포함하고/거나 본 방법의 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 상이하며, 예를 들어, 초기 용량보다 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상만큼 더 높거나, 초기 용량보다 예를 들어 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상만큼 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의의 선행 치료에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 병기 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 알아낸이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량의 투여는 본원에 제공된 방법에 따라 알아낸 임상 반응에 기초하여 알아낸이다.
Ⅴ. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에 상기 정의를 포함하는 것이 본 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에 상기 정의를 포함하는 것이 본 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
본원에 사용될 때, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수 형태(“a” 또는 “an”)는 “적어도 하나(at least one)” 또는 “하나 이상(one or more)”을 의미한다. 본원에 기재된 측면들 및 변형들은 측면들(aspects) 및 변형들(variations)로 “구성되는(consisting)” 및/또는 “필수적으로 포함하여 구성되는(consisting essentially of)”을 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시내용 전체에서, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 내지 하한 사이 각각의 사이에 오는 값과 상기 언급된 범위에서 임의의 다르게 언급되거나 사이에 오는 값은 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 내지 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로, 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 청구된 주제에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에 사용될 때, 용어 “약(about)”은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 “약(about)”의 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, “약 X”를 지칭하는 기재는 “X”의 기재를 포함한다.
본원에 사용될 때, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 서열 목록에 제시된 것과 같은 개시된 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 “해당한다 또는 상응한다(correspond to)”는 기재는 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 동일성을 극대화하기 위해 개시된 서열과 정렬시 확인된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬함으로써, 본 기술 분야의 당업자는 예를 들어 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 가이드로 사용하여 해당하는 잔기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 해당 위치를 확인하기 위해, 아미노산의 서열은 가장 높은 순서의 일치가 획득되도록 정렬된다(예를 들어 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073] 참조).
본원에 사용될 때, 용어 “벡터(vector)”는 이에 연결된 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 자신이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 “발현 벡터(expression vector)”로 지칭한다. 벡터 중에는 레트로바이러스, 예를 들어 감마레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 있다.
용어 “숙주 세포(host cell)”, “숙주 세포주(host cell line)” 및 “숙주 세포 배양물(host cell culture)”은 상호 교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 “형질전환체(transformants)” 및 “형질전환된 세포(transformed cells)”를 포함하고, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 수(number of passages)에 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용될 때, 세포 또는 세포들의 집단이 특정 표지자에 대해 “양성(positive)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 검출 가능하게 존재함을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출 가능하다.
본원에 사용될 때, 세포 또는 세포들의 집단이 특정 표지자에 대해 “음성(negative)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 실질적으로 검출 가능하게 존재하지 않음을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
본원에 사용될 때, “아미노산 서열 동일성 백분율(percent (%) amino acid sequence identity)” 및 “동일성 백분율(percent identity)”은 아미노산 서열(기준 폴리펩타이드 서열)에 대하여 사용될 때, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어, 대상체 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 당업계 기술 범위 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 비교될 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 알아낼 수 있다.
아미노산 치환은 폴리펩타이드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심 결합 분자(예를 들어, 항체)에 도입될 수 있고, 그 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝된다.
아미노산은 일반적으로 하기와 같은 공통적인 측쇄(side-chain) 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루신(Norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 동일한 클래스의 다른 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용될 때, 조성물(compostion)은 세포를 포함하여 둘 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
본원에 사용될 때, “대상체(subject)”는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이며, 통상적으로 인간이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에 상기 정의를 포함하는 것이 본 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
Ⅵ. 예시적인
구현예
제공된 구현예 중에는 하기가 있다:
1.
임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 CAR을 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―; 을 포함하는 특성들을 수신하는 단계;
(b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 상기 대상체 특성들 중 하나 이상, 상기 투입 조성물 특성들 중 하나 이상, 및 상기 치료용 세포 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 상기 획득된 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계; 및
(e) 상기 훈련된 랜덤 포레스트 모델로부터 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
2.
임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;를 포함하는 특성들을 수신하는 단계;
(b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 상기 대상체 특성들 중 하나 이상, 상기 투입 조성물 특성들 중 하나 이상, 및 상기 치료용 세포 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계; 및
(e) 상기 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델로부터 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
3.
구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계는 상기 정보 특성들 중 각각에 대하여 중요도 정도를 알아내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
4.
구현예 3에 있어서, 상기 중요도 정도는 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및/또는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 포레스트의 트리의 총 수를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
5.
구현예 3에 있어서, 상기 중요도 정도는 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및/또는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 생존 포레스트의 트리의 총 수를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
6.
구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 중요도 정도는 상기 순열 중요도 정도인 것을 특징으로 하는, 방법.
7.
구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 중요도 정도는 상기 평균 최소 깊이인 것을 특징으로 하는, 방법.
8.
구현예 3 또는 구현예 4에 있어서, 상기 중요도 정도는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 포레스트의 트리의 총 수인 것을 특징으로 하는, 방법.
9.
구현예 3 또는 구현예 5에 있어서, 상기 중요도 정도는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 랜덤 생존 포레스트의 트리의 총 수인 것을 특징으로 하는, 방법.
10.
구현예 3 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들은 상기 정보 특성들 중 각각에 대한 상기 중요도 정도의 순위 순서에 의해 식별된 첫 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1의 정보 특성이고, 상기 중요도 정도는 각 정보 특성에 대해 동일한 것을 특징으로 하는, 방법.
11.
제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들은 상기 정보 특성들 중 각각에 대한 상기 중요도 정도의 순위 순서 값들에 의해 식별된 첫 5의 정보 특성이고, 상기 중요도 정도는 각 정보 특성에 대해 동일한 것을 특징으로 하는, 방법.
12.
구현예 3 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들은 상기 정보 특성들 중 각각에 대한 상기 중요도 정도의 순위 순서 값들에 의해 식별된 첫 번째 정보 특성이고, 상기 중요도 정도는 각 정보 특성에 대해 동일한 것을 특징으로 하는, 방법.
13.
임상 반응을 알아내는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; 및
(b) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응들을 알아내도록 훈련된 랜덤 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성임―를 포함하는, 방법.
14.
임상 반응을 알아내는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계; 및
(b) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응들을 알아내도록 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―를 포함하는, 방법.
15.
대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계;
(b) 하기를 포함하는 특성들을 알아내는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;
(c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응들을 알아내도록 훈련된 랜덤 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및
(d) 상기 대상체에 치료법을 적용하는 단계―
(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 독성은 2급 이하의 CRS 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군 또는 중증 신경 독성임), 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―를 포함하는, 방법.
16.
대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계;
(b) 하기를 포함하는 특성들을 알아내는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;
(c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물로 치료될 상기 대상체에서 임상 반응들을 알아내도록 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및
(d) 상기 대상체에 치료법을 적용하는 단계―
(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 독성은 2급 이하의 CRS 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군 또는 중증 신경 독성임), 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―를 포함하는, 방법.
17.
구현예 13 또는 구현예 15에 있어서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 지도 훈련을 사용하여 훈련되고, 상기 지도 훈련은:
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계;
(b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 복수의 대상체 및 상기 획득된 임상 반응들로부터 상기 정보 특성들을 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
18.
구현예 14 또는 구현예 16에 있어서, 상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 지도 훈련을 사용하여 훈련되고, 상기 지도 훈련은:
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계;
(b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
19.
랜덤 포레스트 모델을 개발하는 방법으로서,
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계;
(b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 복수의 대상체 및 상기 획득된 임상 반응들로부터 상기 정보 특성들을 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
20.
랜덤 생존 포레스트 모델을 개발하는 방법으로서,
(a) (i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;을 포함하는 특성들을 수신하는 단계;
(b) 상기 특성들을, 정보 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위한 입력으로 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
21.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체 중 각각에 상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 하나가 투여되고, 상기 대상체에 투여되는 상기 하나의 치료용 세포 조성물은 상기 대상체 유래 샘플의 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물인 것을 특징으로 하는, 방법.
22.
구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는:
a) (약) 50% 이상의 결측 데이터가 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계;
b) 제로 분산, 또는 단일 값과 (약) 95% 이상 동일한 데이터 값들 및/또는 0.1n 미만의 고유 값들(여기서, n = 샘플 수)을 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계;
c) 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치에 의해 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들에 대한 결측 데이터를 대치하는 단계; 및
d) 공변량 클러스터들을 식별하는 단계―상기 공변량 클러스터들은 (약) 0.5 이상의 상관관계 계수를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 상기 공변량 클러스터로부터 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 반복적으로 선택하는 단계―상기 선택된 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들은 모든 남아 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―; 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
23.
구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 (약) 50% 이상의 결측 데이터가 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
24.
구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 제로 분산을 갖거나 또는 (약) 95% 이상의 데이터 값들이 단일 값과 동일하고 0.1n 고유 값들 미만인(여기서, n = 샘플 수) 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
25.
구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치에 의해 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들에 대한 결측 데이터를 대치하는 단계이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
26.
구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 정보 특성들을 식별하기 위한 상기 사전처리하는 단계는 공변량 클러스터들을 식별하는 단계―상기 공변량 클러스터들은 (약) 0.5 이상의 상관관계 계수를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 상기 공변량 클러스터로부터 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 반복적으로 선택하는 단계―상기 선택된 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들은 모든 남아 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―;이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
27.
구현예 1, 3, 4, 6 내지 8, 10 내지 13, 15, 17, 19 및 21 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 랜덤 포레스트 모델은 교차 검증을 사용하여 평가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
28.
구현예 2, 3, 5 내지 7, 9 내지 12, 14, 16, 18 및 20 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 교차 검증을 사용하여 평가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
29.
구현예 27 또는 구현예 28에 있어서, 상기 교차 검증은 10겹 교차 검증이거나 적어도 그 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
30.
구현예 27 또는 구현예 28에 있어서, 상기 교차 검증은 중첩 교차 검증인 것을 특징으로 하는, 방법.
31.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체는 (약) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 25, 15, 또는 10개 대상체이거나 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수인 것을 특징으로 하는, 방법.
32.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체는 (약) 10개 대상체 이상 및 250개 대상체 미만인 것을 특징으로 하는, 방법.
33.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 200개 대상체 미만인 것을 특징으로 하는, 방법.
34.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 이상 및 150개 대상체 미만인 것을 특징으로 하는, 방법.
35.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 150개 대상체 미만인 것을 특징으로 하는, 방법.
36.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 100개 대상체 미만인 것을 특징으로 하는, 방법.
37.
구현예 1 내지 12 및 17 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 대상체는 임상 시험에 참여하고 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
38.
구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체 특성들은 대상체 속성들 및 임상 속성들 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
39.
구현예 38에 있어서, 상기 대상체 속성들은 연령, 중량, 키, 민족, 인종, 성별(sex), 및 체질량 지수 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
40.
구현예 38 또는 구현예 39에 있어서, 상기 임상 속성들은 생체표지자들, 질병 진단, 질병 부담, 질병 지속 기간, 질병 등급, 및 치료 이력 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
41.
구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 투입 조성물 특성들은 세포 표현형들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
42.
구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 세포 표현형, 재조합 수용체-의존성 활성, 및 용량 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
43.
구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 임상 반응들은 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 지속적인 반응, 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상인 약동학적 반응, 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응, 독성 반응, 표적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 또는 CR, PR, 지속적인 반응, OR, 또는 PFS의 결여 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
44.
구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 전혈 샘플, 연막(buffy coat) 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
45.
구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물인 것을 특징으로 하는, 방법.
46.
구현예 45에 있어서, 상기 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물은 이전에 냉동 보존된 것임을 특징으로 하는, 방법.
47.
구현예 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 상기 대상체로부터 수득된 1차 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
48.
구현예 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
49.
구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 투입 조성물은 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 상기 치료용 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 상기 투입 조성물로부터 생산되며, 여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
50.
구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물을 포함하고 상기 치료용 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물을 포함하고 상기 투입 조성물의 각각의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 조성물로부터 생산되며, 여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 상기 개별 조성물들 중 각각의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
51.
구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물을 포함하고 상기 치료용 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합 조성물을 포함하고 상기 투입 조성물의 개별 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물로부터 생산되며, 여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 개별 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 상기 CD4+ 및 CD8+ 세포의 혼합 조성물의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
52.
구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것을 특징으로 하는, 방법.
53.
구현예 15 내지 18 및 21 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 미리 알아낸 치료 계획은: a) 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; b) 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 또는 c) 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것;을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
54.
구현예 15 내지 18 및 21 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것은: 상기 미리 알아낸 치료 계획이 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 상기 미리 알아낸 치료 계획이 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 또는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것;을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
55.
구현예 15 내지 18 및 21 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것은: 상기 미리 알아낸 치료 계획이 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 상기 미리 알아낸 치료 계획이 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하거나; 또는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것;을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
56.
구현예 15 내지 18 및 21 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 미리 알아낸 치료 계획을 변경하는 것은 상기 치료용 세포 조성물을 제2 치료제와 병용하여 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
Ⅶ.
실시예들
실시예
1: 치료용 세포 조성물을 이용한
치료에 대한 임상 반응을
평가하기 위한 랜덤
포레스트
및 랜덤 생존
포레스트
랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트를 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 조작된 T 세포를 함유하는 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 재발성 또는 불응성 거대 B 세포 림프종이 있는 대상체의 임상 반응을 예측하도록 훈련시켰다. 상기 모델들을 사용하여 임상 반응과 연관된, 대상체 속성, 치료용 세포 조성물 속성, 및 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용된 출발 물질의 속성을 포함하는 특성들을 식별하였다.
A.
대상체
및 치료
재발성 또는 불응성 거대 B 세포 림프종(LBCL)을 가진 대상체(n = 172)에 각각 동일한 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포의 치료용 세포 조성물을 투여하였다.
치료용 세포 조성물을 생산하기 위해, 백혈구 성분채집술에 의해 획득된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 면역 친화도 기반 선택에 의해 CD4+ 및 CD8+ 세포를 개별적으로 선택하고, 개별 농축된 CD4+ 및 농축된 CD8+ 세포 조성물(예를 들어, 투입 조성물)을 생성한 후, 이를 냉동 보존하였다. 이어서 CD4+ 및 CD8+ 조성물을 해동하고 개별적으로 자극, 형질도입, 및 증폭 단계들을 거치게 하였다.
해동된 CD4+ 및 CD8+ 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체에 결합된 상자성 폴리스티렌-코팅된 비드의 존재 하에서 1:1 비드 대 세포 비로 개별적으로 자극하였다. 자극은 인간 재조합 IL-2, 인간 재조합 IL-15, 및 N-아세틸 시스테인(NAC)을 함유한 배지에서 수행하였다. CD4+ 세포 배지는 인간 재조합 IL-7도 포함하였다.
비드 도입 후, CD4+ 및 CD8+ 세포를 동일한 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 개별적으로 형질도입하였다. 상기 CAR은 뮤린 항체로부터 유래된 항-CD19 scFv, 면역글로불린 스페이서, CD28로부터 유래된 막관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공자극 영역, 및 CD3-제타 세포내 신호전달 도메인을 함유하였다. 상기 벡터는 또한 T2A 서열에 의해 CAR 구조체에 연결된 CAR 발현에 대한 대리 표지자로 기능하는 절단형 EGFR(EGFRt)을 암호화하였다. 세포를 10μg/ml 프로타민 황산염의 존재 하에서 형질도입하였다.
형질도입 후, 자기장에 노출시켜 세포 조성물로부터 비드를 제거하였다. 이후 CD4+ 및 CD8+ 세포 조성물을 생물반응기(Xuri W25 생물반응기)에 의해 연속 혼합과 산소 전달을 통해 증폭을 위해 개별적으로 육성하였다. 배지에 폴록사머를 첨가하였다. 두 세포 조성물 모두를 IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 육성하였다. CD4+ 세포 배지는 IL-7도 포함하였다. CD4+ 및 CD8+ 세포를 수확 전에 각각 4배 증폭되도록 육성하였다. 임계치에 도달한 지 1일 후에, 각 조성물로부터 세포를 개별적으로 수확하고, 제형화하고, 냉동 보존하였다. 예시적인 공정이 표 E1에 요약되어 있다.
대상체들은 치료용 세포 조성물로 치료 전에 림프구 고갈 화학 요법을 받았다. 일부 경우에, 대상체들에 백혈구 성분채집술 후 및 림프구 고갈 화학 요법 전에 질병 통제를 위해 가교 요법을 투여하였다.
정맥내 투여 전에 냉동 보존된 치료용 세포 조성물을 해동하였다. 치료용 세포 조성물을 정의된 양의 제형화된 CD4+ CAR+ 세포 및 제형화된 CD8+ CAR+ 세포를 대략 1:1의 표적 비로 투여하였다. CAR-발현 T 세포의 단일 용량(각각 CD4+ CAR-발현 T 세포 및 CD8+ CAR-발현 T 세포의 개별 주입을 통한 각각의 단일 용량)을 다음과 같이: 50 x 106개 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 용량 수준 1(DL1)의 단일 용량(n = 5 대상체), 100 x 106개 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 용량 수준 2(DL2)의 단일 용량(n = 126 대상체), 또는 150 x 106개 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 용량 수준 3(DL3)의 단일 용량(n = 41 대상체)을 대상체들에 투여하였다. 투여된 T 세포 서브세트의 표적 용량 수준 및 수는 표 E2에 제시된다.
B. 특성 평가 및 사전처리
상기 기술된 치료용 세포 조성물로 치료한 172명의 개인에서 환자 속성, 투입 조성물 속성, 및 치료용 세포 조성물 속성을 포함한 321개 특성의 다변량 분석을 평가하였다.
321개 특성은 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트의 지도 훈련을 위한 특성들을 식별하기 위해 사전처리를 거쳤다. 거의 제로 분산을 갖는 특성들, 70% 초과의 결측 값을 갖는 특성들, 및 높은 상관관계가 있는 특성들(|ρ| > 0.7)을 데이터 세트에서 제거하였다. 70% 미만의 결측 값을 갖는 특성들의 경우, 결측 값들을 평균 또는 최빈값으로 대체하였다.
훈련 데이터는 사전처리된 특성들(예를 들어, 예측인자) 및 20개의 반응(예를 들어, 종속 변수)을 포함하였다. 상기 반응들은 무진행 생존(PFS); 전체 반응률(ORR); 객관적 반응(OR); 완전 반응(CR); 안전성: 신경증 반응(NE) 등급 ≥1 및 등급 ≥3 및 사이토카인 방출 증후군(CRS) 등급 ≥1 및 등급 ≥3; 및 약동학적 특성 종점들: log10 곡선 하 면적(AUC), log10 최대 농도(Cmax), 및 시간 대 피크 농도(Tmax)를 포함하였다.
C. 다변량 지도 학습
10겹 교차 검증을 사용하여 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트를 훈련하고 시험하였다. 특성 중요도 및 연관 순열 기반 p 값들을 사용하여 특성들의 효과의 유의성을 평가하였다. 윌콕슨 순위합 검증, 스피어만 상관관계, 및 콕스 비례 위험 모델을 사용하여 단변량 분석을 지원하였다.
대상체 속성들 및 치료용 세포 조성물 속성들을 포함한 다중 특성들은 조사된 임상 반응들(예를 들어, 종속 변수)과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 환자 종양 부담 및 전신 염증은 CAR T 세포 증폭, 효능 및 안전성과 관련이 있었다. 일반적으로, 종양 부담이 높을수록 생체내 CAR T 세포 증폭이 더 높지만 효능이 낮고 이상 반응 위험이 더 높았다. 기준선에서 더 높은 전신 염증은 이상 반응에 대한 더 높은 위험과 관련이 있었다. 의약품에서, 증가된 항원 특이적 사이토카인 수준은 증폭 및 효능과 양으로(positively) 관련되었고, 덜 분화된 중심 기억 CAR T 세포의 더 높은 빈도는 더 높은 증폭 및 효능과 관련되었다. 표 E3에는 특성 연관성들의 서브세트가 요약되어 있다.
이 데이터는 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 반응으로 환자 임상 결과와 연관된 특성들을 식별하기 위한 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트의 용도를 지지한다.
실시예
2: 전처리 방법
치료용 세포 조성물로 치료한 172명의 개인들에서 평가한, 환자 속성, 투입 조성물 속성, 및 치료용 세포 조성물 속성을 포함하여 321개 특성들을, 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트의 지도 훈련을 위한 특성들을 식별하기 위해, 사전처리하였다. 사전처리는 4개의 순차적 단계로 구성되었다:
1. 결측 데이터가 > 50%인 특성들을 제거하는 단계;
2. 분산이 0 또는 거의 0인 특성들을 제거하는 단계(여기서 거의 0인 분산은 데이터의 > 95%가 단일 값에 의해 지배되고 0.1n 미만의 고유 값(n = 샘플 수)을 갖는 특성으로 정의된다);
3. 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치를 이용하여 결측 데이터를 대치하는 단계; 및
4. 공변량 클러스터를 식별하고 대표적인 특성들을 선택하는 단계.
전처리 단계 4는 첫째로, 숫자 특성들 사이의 피어슨 적률 상관관계, 숫자 및 서수 특성들 사이의 폴리시리얼 상관관계, 및 서수 특성들 사이의 폴리코릭 상관관계로 구성된 이질적 상관관계 매트릭스를 계산함으로써 수행하였다. 해당 변수들에 대한 모든 완전한 관찰 쌍을 사용하여 각각의 변수들의 쌍 사이의 상관관계를 계산했다. 공변량 클러스터는 상관 계수 > 0.5, 예를 들어, |ρ| > 0.5인 변수들의 세트로서 정의하였고, 대표적인 특성들은 데이터세트 내의 모든 다른 나머지 특성과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 나타내는 각각의 클러스터 내의 특성들로서 반복적으로 선택하였다.
전처리를 통해 랜덤 포레스트와 랜덤 생존 포레스트가 훈련된 정보 특성들을 식별했다.
훈련 데이터는 식별된 정보 특성들(예를 들어, 예측인자) 및 20개의 반응(예를 들어, 종속 변수)을 포함하였다. 상기 반응들은 무진행 생존(PFS); 객관적 반응(OR); 완전 반응(CR); 안전성: 신경증 반응(NE) 등급 ≥1 및 등급 ≥3 및 사이토카인 방출 증후군(CRS) 등급 ≥1 및 등급 ≥3; 및 약동학적 특성 종점들: log10 곡선 하 면적(AUC), log10 최대 농도(Cmax), 및 시간 대 피크 농도(Tmax)를 포함하였다.
특성 중요도 및 연관 순열 기반 p 값들을 사용하여 특성들과 임상 반응들의 연관성을 평가하였다.
실시예
3: 거대 B 세포 림프종 치료용 세포 조성물에서 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하기 위한 다변량 지도 학습
상기 실시예 1에 기술된 바와 같이, 키메라 항원 수용체(CAR)를 갖는 조작된 T 세포를 함유한 치료용 세포 조성물로 치료한 재발성 또는 불응성 거대 B 세포 림프종이 있는 대상체들에서 임상 결과에 총체적으로 영향을 주는 특성들을 식별하기 위해 다변량 지도 학습을 수행하였다. 랜덤 포레스트 분류, 회귀, 및 랜덤 생존 포레스트를 사용하여 임상 반응과 연관된, 대상체 속성, 치료용 세포 조성물 속성, 및 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용된 출발 물질(예를 들어, 투입 조성물)의 속성을 포함하는 특성들을 식별하였다.
A. 특성 평가 및 사전처리
대상체 속성, 치료용 세포 조성물 속성, 및 치료용 세포 조성물을 생산하는 데 사용된 출발 물질(예를 들어, 투입 조성물)의 속성을 포함한 총 321개의 특성들을 실시예 1에 기술된 바와 같은 치료용 세포 조성물로 치료한 172명의 개인들에서 평가하였다.
데이터의 초기 스크리닝을 통해 과학적 관련성이 낮은 특성들, 예를 들어, 제조에 특이적인 특성들, 및 낮은 동적 범위를 가진 특성들(예를 들어, 전체 분포가 5% 미만인 경우)을 제거하였다. 초기 스크리닝을 통해 치료용 세포 조성물 속성과 치료용 세포 조성물을 생산하는 데 사용된 출발 물질의 속성과 관련된 136개 특성 및 대상체 속성과 관련된 102개 특성을 포함한, 238개 특성을 식별하였다. 표 E4예 예시적인 특성들이 나와 있다.
238개 특성을 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트 모델의 지도 훈련을 위한 특성들을 식별하기 위해 사전처리하였다. 사전처리는 4개의 단계로 구성되었다:
1. 분산이 0 또는 거의 0인 특성들을 제거하는 단계(여기서 거의 0인 분산은 데이터의 > 95%가 단일 값에 의해 지배되고 0.1n 미만의 고유 값(n = 샘플 수)을 갖는 특성으로 정의하였다);
2. 결측 값이 > 60%인(예를 들어, 이용 가능하지 않은) 특성들을 제거하는 단계;
3. 상관관계가 높은 특성들(|ρ| > 0.5)을 식별하고 하나의 대표적인 특성을 선택하는 단계; 및
4. 연쇄 등식들에 의한 다변량 대치를 이용하여 결측 값들을 대치하는 단계(마우스; vanBuuren 등, Journal of Statistical Software. 2011; 45(3)).
전처리 단계 3은 첫째로, 숫자 특성들 사이의 피어슨 적률 상관관계, 숫자 및 서수 특성들 사이의 폴리시리얼 상관관계, 및 서수 특성들 사이의 폴리코릭 상관관계로 구성된 이질적 상관관계 매트릭스를 계산함으로써 수행하였다. 해당 변수들에 대한 모든 완전한 관찰 쌍을 사용하여 각각의 변수들의 쌍 사이의 상관관계를 계산했다. 공변량 클러스터는 상관 계수 > 0.5인 변수들의 세트로서 정의하고, 대표적인 특성들은 데이터세트 내의 모든 다른 나머지 특성과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 나타내는 각각의 클러스터 내의 특성들로서 반복적으로 선택하였다.
전처리를 통해 공동으로 고려할 76개 대표적인 독립적 특성들을 식별하였다. 76개 특성들 중에서, 특성들 중 33개는 치료용 세포 조성물 속성 및 치료용 세포 조성물을 생산하는 데 사용된 출발 물질의 속성과 관련됐고 47개 특성은 대상체 속성과 관련됐다.
모델에 대한 훈련 데이터는 사전처리된 특성들(예를 들어, 예측인자) 및 20개의 반응(예를 들어, 종속 변수)을 포함하였다. 상기 반응들은: AUC 및 Cmax를 포함한 약동학적 결과; 무진행 생존(PFS), 반응 지속 기간(DOR), 완전 반응(CR), 및 객관적 반응(OR)을 포함한 효능 종점들; 및 임의의 등급 및 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경증 반응(NE)을 포함한 안전성 종점들을 포함하였다. 표 E5는 고려된 예시적인 결과 목록을 제공한다.
a OR은 부분 및 완전 반응률로 이진화된 최상 객관적 반응이었다. PFS, CR, 및 OR은 독립 검토 위원회에서 평가하였다. b CRS는 Lee 기준에 따라 등급을 부여하였다(Lee DW, 등 Blood. 2014;124:188-195). c NE는 연구자 평가에 기초하였으며 NCI(National Cancer Institute) CTCAE(Common Terminology Criteria for Adverse Events) v4.03. AUC0 -28, 주입 후 28일까지 농도 하 면적-시간 곡선; Cmax, 최대 혈청 농도; CRS, 사이토카인 방출 증후군; NE, 신경증 반응; qPCR, 정량적 중합효소연쇄반응에 따라 등급을 부여하였다.
B. 다변량 지도 학습
10겹 교차 검증을 사용하여 랜덤 포레스트 및 랜덤 생존 포레스트를 훈련하여 임상 반응에 대한 기여도에서 각 특성의 중요도를 평가하였다.
랜덤 포레스트는 결정 트리들로 구성된다. 각 트리는 과적합을 방지하기 위해 환자들의 서브세트 및 특성들의 서브세트를 사용하여 훈련되었다(도 1a-1b). 관심 반응을 가장 잘 분리하기 위해 특성 공간의 서브세트들을 선택하고, 분류에 대한 지니 불순도, 회귀에 대한 루트 평균 제곱 오차, 또는 생존에 대한 일치성 지수를 최소화하도록 수백 개의 결정 트리를 구성하였다.
임상 반응을 알아내는 데 중요한 특성들을 식별하기 위해 모델들을 평가하였다. 순열 시험으로 특성 중요도의 유의성에 대한 P 값들을 평가하였다(Altmann A, 등 Bioinformatics. 2010;26(10):1340-1347).
1. 약동학적 반응
다섯 개의 예시적인 유의한 특성 클러스터가 치료용 세포 조성물에 의한 치료 후 log10AUC0 - 28와의 상관관계에 중요한 것으로서 식별되었다. 예시적인 특성들은 연령, 치료용 세포 조성물 중의 CD8+ T 세포의 효과기 사이토카인 분비, 스크리닝 동안의 호염기구, 질병 조직학(PBMCL: 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종), 및 환자가 받은 선행 치료의 수를 포함하였다(도 2a).
치료용 세포 조성물로 치료받은 환자가 젊을수록 더 높은 CAR T 세포 증폭을 경험하는 경향이 있었다. CAR T 증폭을 정량적 중합효소연쇄반응에 의해 측정하고, 유세포 분석에 의해 검증하였다. 단변량적으로, 이것은 또한 참이었고(도 2b), 다인자 모델에서 모든 다른 인자들이 주어졌을 때 연령의 기여를 누적 국소 효과 추정이라는 기술을 사용하여 정량화하였다. 이 기술은, 예를 들어, 연령에서의 각각의 1년 증가가 모든 다른 대상체, 투입 조성물, 및 치료용 세포 조성물 특성과 무관하게 log10AUC0 -28과 어떻게 연관되는지를 정량화할 수 있다. 도 2c는 모든 다른 특성과 무관하게, log10AUC0 -28에 대한 환자 연령의 누적 국소 효과를 도시한다.
log10AUC0 -28은 또한 환자가 치료용 세포 조성물로 치료하기 전에 받은 치료의 수와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 더 적은 선행 요법은 더 높은 CAR T 세포 증폭과 연관이 있었다(도 2d-2e).
더 나이브한 표현형을 반영하는, 치료용 세포 조성물의 CD8+ 세포의 더 낮은 효과기 사이토카인 분비는 또한 AUC0 -28에 의해 측정된 바와 같은 증가된 세포 증폭과 상관관계가 있었다(도 2f-2g).
2. 효능: PFS 및 CR
도 3a-3c는 PFS와 연관된 예시적인 특성들을 도시한다. 더 긴 PFS는 치료용 세포 조성물에서 CD4+ 세포의 더 높은 기능성 사이토카인 생산과 연관되었다(도 3a-3b).
감소된 종양 부담(림프구 고갈 화학 요법 전에 더 낮은 LDH 수준에 의해 반영됨)을 가진 환자들 및 여포성 림프종으로부터 형질전환된(tFL) LBCL 또는 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBCL)을 가진 환자들은 또한 더 긴 PFS를 달성하였다(도 3a 및 3c). 빌리루빈과 PFS 사이에 약한 연관성이 나타났지만, 효과는 정상 수준의 빌리루빈보다 낮은 대상체에 의해 유도되는 것으로 나타났다.
도 4a-4e는 완전 반응(CR)과 연관된 예시적인 특성들을 도시한다. 치료용 세포 조성물에 의한 더 높은 기능성 사이토카인 생산은 완전 반응(CR; 도 4a-4c)을 달성할 가능성이 더 높은 것과 연관되었다. 감소된 종양 부담을 가진 환자들은 또한 완전 반응을 달성할 가능성이 더 높았다(도 4a 및 4d-4e).
3. 안전성: NE 및 CRS
도 5a-5e는 안전성 반응과 연관된 예시적인 특성들을 도시한다. 림프구 고갈 화학 요법을 받기 전에 LDH 수준으로 측정했을 때 더 큰 종양 부담을 가진 환자들은 치료용 세포 조성물을 투여받은 후에 임의 등급의 신경증 반응(NE) 또는 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 경험할 가능성이 더 높았다(도 5a-5d).
성분채집술과 치료용 세포 조성물의 주입 사이에 가교 요법이 필요했던 환자들은 또한 CRS를 경험할 위험이 더 높았으며, 이는 가교 요법이 필요한 병태의 중증도 때문일 가능성이 있다(도 5a, 5b, 및 5e).
표 E6에 임상 반응과 연관된 예시적인 특성들이 요약되어 있다.
치료용 세포 조성물의 세포들의 종양 부담 및 항원 특이적 기능은 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 PK(세포 증폭; AUC0 -28), 효능(PFS, CR), 및 안전성(CRS, NE) 반응과 연관된 가장 중요한 특성들이었다.
더 높은 종양 부담은 증가된 CAR T 세포 증폭(AUC0 -28), CRS 위험 및 신경증 반응, 및 감소된 효능과 연관되었다. 종양 부담과 관계없이, 치료용 세포 조성물에서 항원 특이적 사이토카인 수준의 증가된 발현 및 덜 발현된 CAR T 세포는 증가된 증폭 및 효능과 연관이 있었다.
이 결과들은 대상체 및 제조 데이터(예를 들어, 투입 조성물 특성 및 치료용 세포 조성물 특성)에 기초한 세포 요법에 대한 지도 학습 접근법이 환자 임상 결과에 대한 다인자적 효과에 대한 통찰력을 제공한다는 것을 보여준다.
본 발명은 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해, 예를 들어 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 의도가 있는 것은 아니다. 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 기재 및 가르침에서 명백해질 것이다. 상기 변형은 본 개시내용의 진정한 범위와 개념에서 벗어나지 않고 실시될 수 있으며, 본 개시내용의 범위에 속하도록 의도된다.
서열
SEQUENCE LISTING
<110> Juno Therapeutics, Inc.
<120> METHODS OF IDENTIFYING FEATURES
ASSOCIATED WITH CLINICAL RESPONSE AND USES THEREOF
<130> 735042023740
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 63/024,494
<151> 2020-05-13
<150> US 63/037,592
<151> 2020-06-10
<160> 69
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<213> Artificial Sequence
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
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Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
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Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
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Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
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Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
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Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
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Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
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Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
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Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
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Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
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Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
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Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
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Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
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Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
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Ile Gly Leu Phe Met
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Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
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Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
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Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
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Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
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Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
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Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
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<223> T2A
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Gly Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
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Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
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<212> PRT
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Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
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Pro Gly Pro
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<213> Artificial Sequence
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Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
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<212> PRT
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<220>
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Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA
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1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
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Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
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<223> Variable light (VL) Anti-BCMA
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Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA
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Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<213> Artificial Sequence
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<223> Variable light (VL) Anti-BCMA
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
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<223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable light (VL) Anti-BCMA
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<213> Artificial Sequence
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<223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA
<400> 19
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1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
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Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
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Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
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<223> Variable light (VL) Anti-BCMA
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Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
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Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
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<223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Gly Tyr Ser Lys Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable light (VL) Anti-BCMA
<400> 22
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
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35 40 45
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Arg Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable light (VL) Anti-BCMA
<400> 24
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ile Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Val Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable light (VL) Anti-BCMA
<400> 26
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 27
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 28
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 29
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 30
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 31
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 32
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 33
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1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 34
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 35
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1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 36
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 38
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 39
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence encoding scFv
<400> 39
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 40
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 41
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 42
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 43
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 47
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 48
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 50
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 52
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 54
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 55
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 56
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH2-CH3 spacer
<400> 56
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 57
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 58
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH3 spacer
<400> 59
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 60
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 61
<211> 282
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IgD-hinge-Fc
<400> 61
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 62
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747)
<400> 62
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 63
<211> 66
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747)
<400> 63
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 64
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747)
<400> 64
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 65
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (LL to GG)
<400> 65
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 66
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1)
<400> 66
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 67
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 68
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 69
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Claims (72)
- 임상 반응을 알아내는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―; 및
(b) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들(informative features)에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응을 알아내도록 훈련된 랜덤 포레스트 모델(random forests model)에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―;
를 포함하는, 방법.
- 임상 반응을 알아내는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―; 및
(b) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응을 알아내도록 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델(random survival forests model)에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―;
를 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 임상 반응은 완전 반응(complete response, CR), 부분 반응(partial response, PR), 지속적인 반응, 무진행 생존(progression free survival, PFS), 객관적 반응(objective response, OR), 목표 약동학적 반응 이상인 약동학적 반응, 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응, 독성 반응, 표적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 또는 CR, PR, 지속적인 반응, 또는 객관적 반응(OR)의 결여이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 임상 반응은 완전 반응(CR) 또는 완전 반응(CR)의 결여인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 임상 반응은 부분 반응(PR) 또는 부분 반응(PR)의 결여인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 임상 반응은 객관적 반응(OR) 또는 객관적 반응(OR)의 결여인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 임상 반응은 독성 반응 또는 독성 반응의 결여인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제3항 또는 제7항에 있어서,
상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome, CRS) 또는 중증 신경 독성인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 임상 반응은 지속적인 반응 또는 지속적인 반응의 결여인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 임상 반응은 반응 지속 기간(duration of response, DOR)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 임상 반응은 적어도 또는 적어도 약 3개월의 반응 지속 기간(DOR)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 임상 반응은 무진행 생존(PFS)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 임상 반응은 적어도 또는 적어도 약 3개월의 무진행 생존(PFS)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 임상 반응은 목표 약동학적 반응 이상인 약동학적 반응인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제3항 또는 제14항에 있어서,
상기 약동학적 반응은:
(i) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 치료용 세포 조성물의 CAR T 세포의 증폭;
(i) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 대상체에서 최대 CAR T 세포 농도;
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 대상체에서 CAR T 세포 농도가 최대인 시점; 또는
(iv) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 치료용 세포 조성물의 CAR T 세포에 상기 대상체의 노출;
의 정도인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계;
(b) 하기를 포함하는 특성들을 알아내는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 상기 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 상기 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;
(c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물을 이용한 치료에 대한 상기 대상체의 임상 반응을 알아내도록 훈련된 랜덤 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및
(d) 상기 대상체에 치료법(treatment)을 적용하는 단계―
(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 경미한 독성 반응은 2급 이하의 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획(treatment regimen)이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 중증 신경 독성임), 목표목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―;
를 포함하는, 방법.
- 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위해 대상체 유래의 샘플로부터 T 세포를 선택하는 단계;
(b) 하기를 포함하는 특성들을 알아내는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 상기 대상체로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 상기 투입 조성물로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 투입 조성물은 상기 대상체 유래 상기 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 투입 조성물로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 대상체에 투여될 것임―;
(c) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체를 치료하기 전에, 사전처리에 의해 식별된 정보 특성들에 기초하여, 상기 치료용 세포 조성물로 치료될 상기 대상체에서 임상 반응을 알아내도록 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델에 상기 특성들을 입력으로 적용하는 단계―상기 입력으로 적용된 특성들은 상기 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하는 데 사용된 것들과 동일한 정보 특성들임―; 및
(d) 상기 대상체에 치료법을 적용하는 단계―
(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 3개월 초과의 지속적인 반응, 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응, 및 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응(선택적으로 상기 경미한 독성 반응은 2급 이하의 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 2급 이하의 신경 독성임)으로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 독성 반응(선택적으로 상기 독성 반응은 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 중증 신경 독성임), 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 진행성 질병(PD), 3개월 미만의 지속적인 반응, 및 3개월 미만의 PFS로 구성된 군에서 선택된 임상 반응을 가질 것으로 알아내지면, 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 상기 미리 알아낸 치료 계획에 비해 변경된 상기 치료용 세포 조성물을 포함하는 치료 계획을 상기 대상체에 적용함―
를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 완전 반응(CR)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 완전 반응(CR)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 진행성 질병(PD)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 부분 반응(PR)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 부분 반응(PR)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 진행성 질병(PD)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 초과의 지속적인 반응을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 3개월 초과의 지속적인 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 3개월 미만의 지속적인 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 초과의 지속적인 반응을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 3개월 초과의 지속적인 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 3개월 미만의 지속적인 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 3개월 미만의 무진행 생존(PFS)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이을 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 상기 대상체가 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 3개월 이상 동안의 무진행 생존(PFS)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 3개월 미만의 무진행 생존(PFS)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 객관적 반응(OR)을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 객관적 반응(OR)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 진행성 질병(PD)을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체의 약동학적 반응을 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 목표 약동학적 반응 이상의 목적하는 약동학적 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 상기 목표 약동학적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제25항에 있어서,
상기 약동학적 반응은:
(i) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 치료용 세포 조성물의 CAR T 세포의 증폭;
(i) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 대상체에서 최대 CAR T 세포 농도;
(iii) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 대상체에서 CAR T 세포 농도가 최대인 시점; 또는
(iv) 상기 치료용 세포 조성물로 상기 대상체의 치료 이후 상기 치료용 세포 조성물의 CAR T 세포에 상기 대상체의 노출;
의 정도인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 상기 대상체가 독성 반응을 가질 것인지를 알아내도록 훈련되고, 여기서:
(1) 상기 대상체가 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 미리 알아낸 치료 계획이 적용되거나; 또는
(2) 상기 대상체가 독성 반응을 가질 것으로 알아내지면 상기 대상체는 상기 변경된 치료 계획이 적용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제27항에 있어서,
상기 독성 반응은 중증 CRS 또는 중증 신경 독성인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료용 세포 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제1항, 제3항 내지 제16항, 제18항 내지 제20항, 제22항, 및 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 랜덤 포레스트 모델은 지도 훈련(supervised training)을 사용하여 훈련되고, 상기 지도 훈련은:
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 상기 질병 또는 병태와 연관된 상기 항원에 결합하는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;
(b) 정보 특성들을 식별하기 위해, 상기 특성들을 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계; 및
(d) 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위해, 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 상기 획득된 임상 반응들을 입력으로 적용하는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 제2항, 제3항, 제8항 내지 제13항, 제15항, 제17항, 제21항, 제23항, 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 랜덤 생존 포레스트 모델은 지도 훈련을 사용하여 훈련되고, 상기 지도 훈련은:
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 상기 질병 또는 병태와 연관된 상기 항원에 결합하는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;
(b) 정보 특성들을 식별하기 위해, 상기 특성들을 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계; 및
(d) 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위해, 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 입력으로 적용하는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 랜덤 포레스트 모델을 개발하는 방법으로서,
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;
(b) 정보 특성들을 식별하기 위해, 상기 특성들을 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계; 및
(d) 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위해, 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 상기 획득된 임상 반응들을 입력으로 적용하는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 랜덤 생존 포레스트 모델을 개발하는 방법으로서,
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;
(b) 정보 특성들을 식별하기 위해, 상기 특성들을 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 하나 이상의 대상체 특성, 하나 이상의 투입 조성물 특성, 및 하나 이상의 치료용 세포 조성물 특성을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계; 및
(d) 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위해, 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 입력으로 적용하는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 CAR을 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;
(b) 정보 특성들을 식별하기 위해, 상기 특성들을 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 상기 대상체 특성들 중 하나 이상, 상기 투입 조성물 특성들 중 하나 이상, 및 상기 치료용 세포 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 지도 학습을 사용하여 랜덤 포레스트 모델을 훈련하기 위해, 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 상기 획득된 임상 반응들을 입력으로 적용하는 단계; 및
(e) 상기 훈련된 랜덤 포레스트 모델로부터 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 임상 반응과 연관된 특성들을 식별하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 하기를 포함하는 특성들을 수신하는 단계:
(i) 질병 또는 병태와 연관된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 치료용 세포 조성물로 상기 대상체가 치료받기 전에, 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 알아낸 대상체 특성들―상기 치료용 세포 조성물은 상기 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것임―;
(ii) 복수의 투입 조성물 중 각각으로부터 알아낸 투입 조성물 특성들―상기 복수의 투입 조성물 중 각각은 상기 복수의 대상체 중 각각 유래 샘플로부터 선택된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포를 포함하는 상기 치료용 세포 조성물을 생산하기 위해 사용됨―; 및
(iii) 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각으로부터 알아낸 치료용 세포 조성물 특성들―상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 각각은 상기 복수의 투입 조성물 중 하나로부터 생산되고 상기 CAR을 발현하고, 상기 치료용 조성물은 상기 복수의 대상체 중 하나에 투여될 것임―;
(b) 정보 특성들을 식별하기 위해, 상기 특성들을 사전처리하는 단계―상기 정보 특성들은 상기 대상체 특성들 중 하나 이상, 상기 투입 조성물 특성들 중 하나 이상, 및 상기 치료용 세포 조성물 특성들 중 하나 이상을 포함하는 상기 특성들의 서브세트를 포함함―;
(c) 상기 복수의 치료용 조성물 중 하나로 치료 이후 상기 복수의 대상체 중 각각으로부터 시간 경과에 따른 임상 반응들을 획득하는 단계;
(d) 지도 학습을 사용하여 랜덤 생존 포레스트 모델을 훈련하기 위해, 상기 복수의 대상체 유래 상기 정보 특성들 및 임상 반응들을 입력으로 적용하는 단계; 및
(e) 상기 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델로부터 상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 임상 반응은 완전 반응(CR), 부분 반응(PR), 지속적인 반응, 무진행 생존(PFS), 객관적 반응(OR), 목표 약동학적 반응 이상인 약동학적 반응, 무(no) 또는 경미한(mild) 독성 반응, 독성 반응, 표적 반응에 비해 감소된 약동학적 반응, 또는 CR, PR, 지속적인 반응, 또는 객관적 반응(OR)의 결여이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들을 식별하는 단계는 상기 정보 특성들 중 각각에 대하여 중요도 정도를 알아내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제37항에 있어서,
상기 중요도 정도는 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및/또는 상기 정보 특성이 루트 노드(root node)를 분할하는 상기 훈련된 랜덤 포레스트 모델의 트리(trees)의 총 수를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제37항에 있어서,
상기 중요도 정도는 순열 중요도 정도, 평균 최소 깊이, 및/또는 상기 정보 특성이 루트 노드를 분할하는 상기 훈련된 랜덤 생존 포레스트 모델의 트리의 총 수를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 임상 반응들과 연관된 상기 정보 특성들은 상기 정보 특성들 중 각각에 대하여 상기 중요도 정도의 순위 순서 값들(rank ordering values)에 의해 식별된 첫 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1의 정보 특성이고, 상기 중요도 정도는 각 정보 특성에 대해 동일한 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 대상체 중 각각에 상기 복수의 치료용 세포 조성물 중 하나가 투여되고, 상기 대상체에 투여되는 상기 하나의 치료용 세포 조성물은 상기 대상체 유래 샘플의 투입 조성물로부터 생산된 치료용 세포 조성물인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
정보 특성들을 식별하기 위해 상기 사전처리하는 단계는:
a) (약) 50% 이상의 결측 데이터를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계;
b) (i) 제로 분산(zero variance), (ii) 단일 값과 (약) 95% 이상 동일한 데이터 값들, 및/또는 (iii) 0.1n 미만의 고유 값들(여기서, n = 샘플 수)을 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계;
c) 연쇄 방정식에 의한 다중 대치(multivariate imputation by chained equations)에 의해, 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들에 대하여 결측 데이터를 대치하는 단계; 및
d) 공변량 클러스터들(covariate clusters)을 식별하는 단계―상기 공변량 클러스터들은 (약) 0.5 이상의 절대값을 갖는 상관관계 계수를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 치료용 세포 조성물 특성들 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 상기 공변량 클러스터로부터 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 반복적으로 선택하는 단계―상기 선택된 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들은 모든 남아 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―;
중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
정보 특성들을 식별하기 위해 상기 사전처리하는 단계는 (약) 50% 이상의 결측 데이터를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
정보 특성들을 식별하기 위해 상기 사전처리하는 단계는 (약) 60% 이상의 결측 데이터를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
정보 특성들을 식별하기 위해 상기 사전처리하는 단계는 (i) 제로 분산을 갖거나 또는 (ii) 단일 값과 (약) 95% 이상 동일한 데이터 값들, 및 0.1n 미만의 고유 값들(여기서, n = 샘플 수)을 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 제거하는 단계이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
정보 특성들을 식별하기 위해 상기 사전처리하는 단계는 연쇄 방정식에 의한 다중 대치(multivariate imputation by chained equations)에 의해 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들에 대한 결측 데이터를 대치하는 단계이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
정보 특성들을 식별하기 위해 상기 사전처리하는 단계는 공변량 클러스터들을 식별하는 단계―상기 공변량 클러스터들은 (약) 0.5 이상의 절대값을 갖는 상관관계 계수를 갖는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 치료용 세포 조성물 특성들 및 이들의 조합의 세트들을 포함함―, 및 상기 공변량 클러스터로부터 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들을 반복적으로 선택하는 단계―상기 선택된 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들은 모든 남아 있는 대상체 특성들, 투입 조성물 특성들, 및 치료용 세포 조성물 특성들과 가장 낮은 평균 절대 상관관계를 가짐―;이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 대상체는 (약) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 25, 15, 또는 10개 대상체이거나 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 대상체는 (약) 10개 대상체 이상 및 250개 대상체 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 200개 대상체 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 대상체는 (약) 20개 이상 및 150개 대상체 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제30항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 대상체는 (약) 20개 대상체 이상 및 100개 대상체 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체 특성들은 대상체 속성들 및 임상 속성들 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제53항에 있어서,
상기 대상체 속성들은 연령, 중량, 키, 민족, 인종, 성별(sex), 및 체질량 지수 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제53항 또는 제54항에 있어서,
상기 임상 속성들은 생체표지자들, 질병 진단, 질병 부담, 질병 지속 기간, 질병 등급, 및 치료 이력 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체 특성들은 투약 암(dosing arm), 가교 화학 요법, 가교 화학 요법 및 방사선요법, 가교 화학 요법 전신 치료, 세포 기원, 화학 요법 후 재발 또는 불응성, 진단 유형, 질병 코호트, 질병 부담, 재발성 또는 불응성 질병, 질병 기원, 성별(gender), 치료용 세포 조성물 투여 경로, LDH의 배수 변화, 신장, 병변 수, 산소 포화도, 온도(℃), 치료용 세포 조성물에 의한 가장 긴 종양 직경 사전처리, SPD의 배수 변화, SPD 값 림프구 고갈 화학 요법-전, BMI, 체중, 성별(sex), 민족, 인종, 연령, IPI 점수, ECOG 점수, 질병 병기, 림프구 고갈 화학 요법-전 LDH에 기초한 질병 부담, 림프구 고갈 화학 요법-전 SPD에 기초한 질병 부담, 치료 시 활성 CNS 질병을 갖는 대상체, 림프절외 질병 분류에 기초한 질병 부담, 림프절외 부위의 수, 부피가 큰 질병 분류에 기초한 질병 부담, 질병 조직학, 선행 요법 차수의 수, 선행 전신 요법 차수의 수, 선행 동종이계 조혈 줄기세포 이식(allo-HSCT), 선행 자가 조혈 줄기세포 이식(auto-HSCT), 화학적불응성 또는 화학적민감성 질병 유형, 질병 통제를 위한 가교 항암 요법, 백혈구 성분채집술 날짜로부터 첫 번째 주입까지의 일 수, 진단으로부터 치료용 세포 조성물에 의한 치료까지의 개월 수, 기준선 C 반응성 단백질(CRP), 백혈구 성분채집술-전 림프구 수(10^9/L), 유전자 이중 발현자, 이중 유전자 이상, 삼중 유전자 이상, 이중 또는 삼중 유전자 이상, 이중 또는 삼중 유전자 이상 또는 유전자 이중 발현자, 알부민 수준, 알칼리 포스파타아제 수준, 호염기구 수, 절대 호염기구 수, 직접 빌리루빈, 총 빌리루빈, 혈액 요소 질소 수준, 칼슘 수준, 이산화탄소 수준, 염화물 수준, 크레아티닌 수준, 호산구 수, 호산구 절대 수, 글루코스 수준, 적혈구용적률 수준, 헤모글로빈 수준, LDH 수준, 병변 수, 림프구 수, 림프구 절대 수, 마그네슘 수준, 단핵구 절대 수, 단핵구 수, 호중구 절대 수, 호중구 수, 인산염 수준, 혈소판 수, 칼륨 수준, 총 단백질, 적혈구 수, 아스파르트산 아미노기 전달효소 수준, 알라닌 아미노기 전달효소 수준, 나트륨 수준, 직경들의 곱의 합, 트리글리세리드, 가장 긴 종양 직경, 수직 종양 직경, 요산 수준, 및 백혈구 수 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 투입 조성물 특성들은 세포 표현형들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 투입 조성물 특성들은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+, CAS3-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28-/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD4+, CD45RA+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+, CAS+/CD4+, CAS+/CD3+/CD4+, CD4+ 클론성, CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+, CAS3-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28-/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD85RA-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD8+, CD85RA+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD85RA-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD85RA+/CD8+, CAS+/CD8+, CAS+/CD3+/CD8+, 및 CD8+ 클론성 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료용 세포 조성물 특성들은 세포 표현형, 재조합 수용체-의존성 활성, 및 용량(dose) 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료용 세포 조성물 특성들은 CAS3-/CCR7-/CD27-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD8+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD8+, CAS3-/CD27+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD8+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD8+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD8+, CAS+/CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CAR+/CD8+, CD3+/CD8+, CAR+/CD8+, CD8+ 세포의 클론성, EGFRt+/CD8+, 사이토카인-/CD8+, IFNG+/CD8+, IFNg+/IL2/CD8+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD8+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD8+, CAR+/IFNg+/CD8+, IFNg+/TNFa+/CD8+, CAR+/IL2+/CD8+, IL2+/TNFa+/CD8+, CD8+에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD8+, CD8+ 세포의 생존 세포 농도, CD8+ 세포의 벡터 복제수, CD8+의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD8+의 생존력, GMCSF+/CD8+, IFNG+/CD8+, IL10+/CD8+, IL13+/CD8+, IL2+/CD8+, IL4+/CD8+, IL5+/CD8+, IL6+/CD8+, MIP1A+/CD8+, MIP1B+/CD8+, sCD137+/CD8+, TNFa+/CD8+, CD8+ 세포의 용량, CD8+ 세포의 용량 수준, CD8+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD8+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD8+ 세포의 투여된 총 생존 세포, CD8+ 세포의 총 용량, CAS3-/CCR7-/CD27-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD27-/CD4+,CAS3-/CCR7+/CD27+/CD4+, CAS3-/CD27+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27-/CD4+, CAS3-/CD28+/CD27+/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7-/CD45RA+/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA-/CD4+, CAS3-/CCR7+/CD45RA+/CD4+, CAS+/CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CAR+/CD4+, CD3+/CD4+, CAR+/CD4+, CD4+ 세포의 클론성, EGFRt+/CD4+, 사이토카인-/CD4+, IFNG+/CD4+, IFNg+/IL2/CD4+, IFNg+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/IL17+/TNFa+/CD4+, IFNg+/IL2+/TNFa+/CD4+, CAR+/IFNg+/CD4+, IFNg+/TNFa+/CD4+, CAR+/IL2+/CD4+, IL2+/TNFa+/CD4+, CD4+에 의한 세포 용해, CAR+/TNFa+/CD4+, CD4+ 세포의 생존 세포 농도, CD4+ 세포의 벡터 복제수, CD4+의 EGFRt+ 벡터 복제수, CD4+의 생존력, GMCSF+/CD4+, IFNG+/CD4+, IL10+/CD4+, IL13+/CD4+, IL2+/CD4+, IL4+/CD4+, IL5+/CD4+, IL6+/CD4+, MIP1A+/CD4+, MIP1B+/CD4+, sCD137+/CD4+, TNFa+/CD4+, CD4+ 세포의 용량, CD4+ 세포의 용량 수준, CD4+ 세포의 투여된 생존 세포 백분율, CD4+ 세포의 투여된 총 비생존 세포, CD4+ 세포의 투여된 총 생존 세포, 및 CD4+ 세포의 총 용량 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 전혈 샘플, 연막(buffy coat) 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제62항에 있어서,
상기 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물은 이전에 냉동 보존된 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 상기 대상체로부터 수득된 1차 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 투입 조성물은 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 상기 치료용 세포 조성물은 상기 CAR을 발현하는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고 상기 투입 조성물로부터 생산되며, 여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물들을 포함하고
상기 치료용 세포 조성물은 상기 CAR을 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물들을 포함하고, 상기 투입 조성물의 각각의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 조성물로부터 생산되며,
여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 상기 개별 조성물들 중 각각의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 투입 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물들을 포함하고,
상기 치료용 세포 조성물은 상기 CAR을 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합 조성물을 포함하고, 상기 투입 조성물의 개별 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물로부터 생산되며,
여기서 상기 투입 조성물 특성들은 상기 투입 조성물의 상기 개별 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물들의 투입 조성물 특성들을 포함하고, 상기 치료용 세포 조성물 특성들은 상기 치료용 조성물의 상기 CD4+ 및 CD8+ 세포의 혼합 조성물의 치료용 세포 조성물 특성들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항 내지 제31항 및 제41항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미리 알아낸 치료 계획은:
a) 상기 대상체에 개별적으로 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포;
b) 상기 대상체에 개별적으로 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포; 또는
c) 상기 대상체에 개별적으로 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포;
를 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항 내지 제31항 및 제41항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변경된 치료 계획은:
a) 상기 미리 알아낸 치료 계획이 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때, 상기 대상체에 개별적으로 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포;
b) 상기 미리 알아낸 치료 계획이 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때, 상기 대상체에 개별적으로 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포; 또는
c) 상기 미리 알아낸 치료 계획이 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때, 상기 대상체에 개별적으로 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포;
를 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항 내지 제31항 및 제41항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변경된 치료 계획은:
a) 상기 미리 알아낸 치료 계획이 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때, 상기 대상체에 개별적으로 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포;
b) 상기 미리 알아낸 치료 계획이 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때, 상기 대상체에 개별적으로 50 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 50 x 106개 CD4+CAR+ T 세포; 또는
c) 상기 미리 알아낸 치료 계획이 75 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 75 x 106개 CD4+CAR+ T 세포를 개별적으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함할 때, 상기 대상체에 개별적으로 25 x 106개 CD8+CAR+ T 세포 및 25 x 106개 CD4+CAR+ T 세포;
를 투여하는 것을 포함하는 단일 치료이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제16항 내지 제31항 및 제41항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변경된 치료 계획은 상기 치료용 세포 조성물을 제2 치료제와 병용하여 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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