CN111246862A - 产生基因工程化细胞组合物的方法和相关组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于产生工程化细胞如表达重组受体的细胞的方法和组合物，包括涉及对具有限定比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的输入组合物进行刺激和/或工程化的方法。特定地，所述方法可以用于用基因工程化受体将T细胞工程化，所述基因工程化受体如基因工程化抗原受体，如工程化(重组)TCR和嵌合抗原受体(CAR)，或其他重组嵌合受体。所述方法的特征包括与其他方法相比产生更一致和/或可预测的T细胞产物和/或具有较低毒性的产物。

Description

产生基因工程化细胞组合物的方法和相关组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年8月9日提交的标题为“产生基因工程化细胞组合物的方法和相关组合物(METHODS FOR PRODUCING GENETICALLY ENGI NEERED CELL COMPOSITIONS ANDRELATED COMPOSITIONS)”的美国临时申请号62/543,363和2017年12月8日提交的标题为“产生基因工程化细胞组合物的方法和相关组合物(METHODS FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED CELL COMPOSITIONS AND RELATED COMPO SITIONS)”的美国临时申请号62/596,770的优先权，其内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2018年8月9日创建、大小为35,001千字节的名为735042013140SEQLIST.txt的文件提供。将电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本涉及用于产生工程化细胞如表达重组受体的细胞的方法和组合物，包括涉及对具有限定比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的输入组合物进行刺激和/或工程化的方法。特定地，所述方法可以用于用基因工程化受体将T细胞工程化，所述基因工程化受体如基因工程化抗原受体，如工程化(重组)TCR和嵌合抗原受体(CAR)，或其他重组嵌合受体。所述方法的特征包括与其他方法相比产生更一致和/或可预测的T细胞产物和/或具有较低毒性的产物。
背景技术
可以利用多种方法来制备用于治疗用途的细胞和给予所述细胞。例如，多种方法可以用于制备用于工程化和细胞疗法的细胞(包括T细胞)，包括涉及耗尽或富集某些亚群的方法。需要改进的方法，例如，以降低与某些过继细胞疗法给予相关的毒性，以改进制造工艺，以允许改进的给予，和/或以降低成本或其他资源。提供了满足此类需求的方法、细胞、组合物、试剂盒和系统。
发明内容
本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括组合含有幼稚样CD4+ T细胞的第一细胞组合物与含有幼稚样CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。在一些实施方案中，所述第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+T细胞产生的，和/或所述第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的生物样品分离CD8+T细胞产生的。
在一些实施方案中，在所述组合之前，所述方法包括确定所述第一细胞组合物中幼稚样CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或所述第二组合物中幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。在一些情况下，在所述组合之前，所述方法包括确定来自受试者的生物样品中幼稚样CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。在一些任何此类实施方案中，与来自受试者的生物样品中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，输入组合物中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率被调整或改变。
本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中幼稚样CD4+ T细胞和幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；以及产生含有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
在一些实施方案中，所述方法还包括使输入组合物与含有编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。
本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括使含有来自受试者的生物样品的幼稚样CD4+ T细胞和幼稚样CD8+ T细胞的输入组合物与含有编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码重组受体的核酸引入组合物中的细胞中，其中输入组合物中存在的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞，其中刺激导致细胞的激活和/或增殖。
本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括组合含有幼稚样CD4+ T细胞的第一细胞组合物与含有幼稚样CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；使输入组合物与含有编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码重组受体的核酸引入组合物中的细胞中；以及在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞，其中刺激导致细胞的激活和/或增殖。
在一些任何此类实施方案中，幼稚样CD4+细胞和/或幼稚样CD8+细胞对于选自CD45RA、CD27、CD28、CD62L和CCR7的标记呈表面阳性；和/或对于选自CD25、CD45RO、CD56、KLRG1的标记呈表面阴性；和/或具有CD95的低表达；和/或对于选自IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的细胞因子的细胞内表达呈阴性。在一些实施方案中，幼稚样CD4+细胞和/或幼稚样CD8+细胞对于选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或对于选自CD45RO、CD56、KLRG1的标记呈表面阴性；和/或具有CD95的低表达。在一些方面，幼稚样CD4+细胞和/或幼稚样CD8+细胞对于CD45RA和CCR7呈表面阳性。在一些实施方案中，幼稚样CD4+细胞和幼稚样CD8+细胞对于CD45RA、CD27和CCR7呈表面阳性，并且对于CD45RO呈表面阴性。
在一些任何此类实施方案中，幼稚样CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。在一些方面，与来自受试者的生物样品中的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率已经被调整。
在一些实施方案中，生物样品是或获得自血液、血浆或血清样品。在一些方面，生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些情况下，生物样品是或获得自单采术样品或白细胞单采术样品。在一些实施方案中，受试者是人受试者。
在一些任何此类实施方案中，输入组合物含有比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1或1.0:1与1.2:1之间(每个都包含端值)的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。在一些实施方案中，输入组合物包括比率为或为约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有比率为或为约1.1:1的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
在一些任何此类实施方案中，输入组合物含有从或从约1x 107至5x 109个总细胞或总T细胞、从或从约5x 107至1x 109个总细胞或总T细胞、从或从约1x 108至5x 108个总细胞或总T细胞、或者从或从约2x 108至5x 108个总细胞或总T细胞，或者前述任一项的活群体。在一些情况下，输入组合物含有至少或至少约1x 108、2x 108、3x 108、4x 108或5x 108个总细胞或总T细胞，或者前述任一项的活群体。
在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂能够激活T细胞、CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞；能够通过TCR复合物诱导信号；和/或能够诱导T细胞、CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞的增殖。在一些方面，所述一种或多种刺激剂含有与TCR复合物的成员结合的一级药剂，任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。在一些情况下，所述一种或多种刺激剂还含有与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些例子中，共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
在一些实施方案中，一级和二级药剂含有抗体，任选地其中所述一种或多种刺激剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起孵育。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂存在于固体支持物(任选地珠)的表面上。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂存在于珠的表面上，并且所述珠是顺磁珠。在一些方面，所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7、含有由抗原受体特异性地识别的抗原的疫苗，以及特异性地结合抗原受体的抗独特型抗体或其组合。
在一些任何此类实施方案中，孵育进行2至15天、2至12天、2至12天、2至8天、2至6天、2至4天、4至12天、4至10天、4至8天、4至6天、6至12天、6至10天、6至8天、8至12天、8至10天或10至12天。在一些情况下，孵育进行至少或大约至少或4天、6天、8天、10天或12天。
在一些任何此类实施方案中，含有核酸分子的药剂是病毒载体或者是转座子。在一些情况下，含有核酸分子的药剂是病毒载体并且所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些例子中，病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些情况下，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫疾病、炎性疾病、或者肿瘤或癌症。在一些情况下，靶抗原是肿瘤抗原。在一些例子中，靶抗原选自ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、HMW-MAA、IL-22R-α、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原(oncofetal antigen)、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)(CEA)、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
在一些例子中，所述靶抗原选自受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素(MSLN)、癌胚抗原(CEA)和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、叶酸结合蛋白(FBP)、Fc受体样5(FCRL5，也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、B7-H3、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、CD171、叶酸受体-α、CD44v7/8、αvβ6整合素(avb6整合素)、8H9、神经细胞粘附分子(NCAM)、血管内皮生长因子受体(VEGF受体或VEGFR)、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、NKG2D配体、CD44v6、双抗原、癌症-睾丸抗原、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、黑色素A(MART-1)、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、癌胚胎抗原、TAG72、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ-异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)、癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕酮受体、前列腺特异性抗原、肝配蛋白B2、CD123、CD133、c-Met、O-乙酰化GD2(OGD2)、L1-CAM的CE7表位、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD138、病原体特异性抗原或病原体表达的抗原、和与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，所述抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，重组受体是或含有功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些情况下，嵌合抗原受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。在一些情况下，抗原结合结构域是或含有抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在一些实施方案中，所述片段含有通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些方面，所述片段含有scFv。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体还含有间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有细胞内信号传导区域。在一些情况下，细胞内信号传导区域含有细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或含有初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或含有CD3链(任选地CD3-zeta(CD3ζ)链)的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
在一些实施方案中，CAR包含对抗原具有特异性的scFv、跨膜结构域、衍生自共刺激分子(其任选地是或包含4-1BB)的胞质信号传导结构域、和衍生自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域(其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域)，并且CAR任选地在跨膜结构域与scFv之间还包含间隔子；CAR依次包含对抗原具有特异性的scFv、跨膜结构域、衍生自共刺激分子的胞质信号传导结构域(其任选地是或包含4-1BB信号传导结构域)、和衍生自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域(其任选地是CD3ζ信号传导结构域)；或者CAR依次包含对抗原具有特异性的scFv、间隔子、跨膜结构域、衍生自共刺激分子的胞质信号传导结构域(其任选地是4-1BB信号传导结构域)、和衍生自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域(其任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域)。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体还含有设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域还含有共刺激信号传导区域。在一些方面，共刺激信号传导区域含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些例子中，共刺激信号传导区域含有CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，共刺激信号传导区域位于跨膜结构域与细胞内信号传导区域之间。
在一些任何此类实施方案中，受试者患有疾病或病症，任选地其中重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
在一些实施方案中，所述方法产生输出组合物，其中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率与在通过所述方法产生的多种T细胞组合物中所述比率的平均值相比变化不超过20％或不超过10％或不超过5％，和/或与这个平均值相比变化不超过一个标准差。在一些实施方案中，所述方法产生输出组合物，其中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率在或在约0.5:1与2:1之间或0.8:1与1.6:1之间或1:1与1.5:1之间，每个都包含端值。在一些例子中，输出组合物中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率为或为约1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1或0.8:1。在一些情况下，输出组合物中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率为或为约1:1。
在一些实施方案中，活细胞含有呈细胞凋亡标记阴性(-)的细胞，任选地其中所述细胞凋亡标记是膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
在一些任何此类实施方案中，所述方法是在体外或离体进行。
本文提供了通过本文所述的任何方法产生的输出组合物。还提供了含有所述输出组合物的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还含有药物载体。
本文提供了一种治疗方法，所述方法包括向哺乳动物受试者给予通过所述方法中的任一种产生的输出组合物或任一种所述药物组合物。在一些实施方案中，细胞衍生自被给予细胞的受试者。
在所提供方法的某些实施方案中，幼稚样CD4+细胞和/或幼稚样CD8+细胞对于CD45RA和CCR7呈表面阳性。在所提供方法的一些实施方案中，幼稚样CD4+细胞和/或幼稚样CD8+细胞对于CD27和CCR7呈表面阳性。在所提供方法的特定实施方案中，幼稚样CD4+细胞和幼稚样CD8+细胞对于CD45RA、CD27和CCR7呈表面阳性并且对于CD45RO呈表面阴性。
在所提供方法的某些实施方案中，幼稚样CD4+细胞和/或幼稚样CD8+细胞对于CCR7呈表面阳性并且对于CD62L呈表面阴性。在所提供方法的一些实施方案中，输入组合物包含比率为或为约1.1:1的对于CD45RA和CCR7呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。在所提供方法的特定实施方案中，输入组合物包含比率为或为约1.69:1的对于CD45RA和CD27呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物包含比率为或为约1.69:1的对于CD27和CCR7呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
在某些实施方案中，本文是一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括:组合包含CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。在所提供方法的一些实施方案中，第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+ T细胞产生的，和/或第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的生物样品分离CD8+ T细胞产生的。
在所提供方法的特定实施方案中，在所述组合之前，所述方法包括确定第一细胞组合物中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或第二组合物中CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。在所提供方法的某些实施方案中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。在所提供方法的一些实施方案中，与来自受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率相比，输入组合物中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率被调整或改变。
在特定实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞和CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和产生包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
所提供方法的某些实施方案还包括使输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。
本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：使包含来自受试者的生物样品的CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞和CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码重组受体的核酸引入组合物中的细胞中，其中输入组合物中存在的CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。在所提供方法的一些实施方案中还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞，其中刺激导致细胞的激活和/或增殖。
在特定实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：组合包含CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；使输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码重组受体的核酸引入组合物中的细胞中；以及在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞，其中刺激导致细胞的激活和/或增殖。
在所提供方法的某些实施方案中，CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。在所提供方法的一些实施方案中，与来自受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率相比，CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率已经被调整。在所提供方法的特定实施方案中，输入组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间或1.0:1与1.2:1之间(每个都包含端值)的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞。在所提供方法的某些实施方案中，输入组合物包含比率为或为约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞。
在所提供方法的一些实施方案中，输入组合物包含比率为或为约1.1:1的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞。在特定实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：组合包含CD27+CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD27+CCR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在1.2:1与2.4:1之间，包含端值。
在所提供方法的某些实施方案中，第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+ T细胞产生的，和/或第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的生物样品分离CD8+ T细胞产生的。在所提供方法的一些实施方案中，在所述组合之前，所述方法包括确定第一细胞组合物中CD27+CCR7+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或第二组合物中CD27+CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。在所提供方法的特定实施方案中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD27+CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
在所提供方法的某些实施方案中，与来自受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率相比，输入组合物中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率被调整或改变。在某些实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞和CD27+CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和产生包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
所提供方法的一些实施方案还包括使输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。
在特定实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：使包含来自受试者的生物样品的CD27+CCR7+CD4+ T细胞和CD27+CCR7+CD8+ T细胞的输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码重组受体的核酸引入组合物中的细胞中，其中输入组合物中存在的CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。所提供方法的某些实施方案还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞，其中刺激导致细胞的激活和/或增殖。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：组合包含CD27+CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD27+CCR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；使输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码重组受体的核酸引入组合物中的细胞中；以及在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞，其中刺激导致细胞的激活和/或增殖。
在所提供方法的特定实施方案中，CD27+CCR7+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD27+CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。在所提供方法的某些实施方案中，与来自受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率相比，CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率已经被调整。
在所提供方法的一些实施方案中，输入组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间或1.0:1与1.2:1之间(每个都包含端值)的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。在所提供方法的特定实施方案中，输入组合物包含比率为或为约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。在所提供方法的某些实施方案中，输入组合物包含比率为或为约1.1:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物包含比率为或为约1.69:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：组合包含CD62L-CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值。
在特定实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CD62L-CCR7+CD4+T细胞和CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和产生包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
所提供方法的某些实施方案还包括使输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。在一些实施方案中，本文提供了一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：组合包含CD62L-CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值；使输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码重组受体的核酸引入组合物中的细胞中；以及在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育细胞，其中刺激导致细胞的激活和/或增殖。
在所提供方法的特定实施方案中，CD62L-CCR7+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。在所提供方法的某些实施方案中，与来自受试者的生物样品中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率相比，CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率已经被调整。在所提供方法的一些实施方案中，输入组合物包含比率在或大约在0.5:1与1.5:1之间、1:1与2:1之间、0.75:1与1.5:1之间或0.8:1与1.2:1之间(每个都包含端值)的CD62L-CCR7+CD4+细胞与CD62L-CCR7+CD8+细胞。在所提供方法的特定实施方案中，输入组合物包含比率为或为约1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1或0.8:1的CD62L-CCR7+CD4+细胞与CD62L-CCR7+CD8+细胞。
在所提供方法的某些实施方案中，生物样品是或获得自血液、血浆或血清样品。在所提供方法的一些实施方案中，生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在所提供方法的特定实施方案中，生物样品是或获得自单采术样品或白细胞单采术样品。
附图说明
图1A示出与在T细胞激活、用嵌合抗原受体(CAR)构建体转导和扩增后T细胞组合物中CAR+CD4+ T细胞与CAR+CD8+ T细胞的比率(CAR+CD4+/CD8+比率)相比，对单采术样品中活CD4+细胞与活CD8+细胞的比率(活CD4+/CD8+比率)的双变量拟合分析的图。曲线表示在p＝0.990下双变量正态椭圆的边界。数据点表示来自每个受试者的四个样品的平均比率，所述受试者包括健康受试者(圆形)和患有骨髓瘤的受试者(加号)。
图1B示出与在T细胞激活、用嵌合抗原受体(CAR)构建体转导和扩增后T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率的双变量拟合分析的图。曲线表示在p＝0.990下双变量正态椭圆的边界。数据点表示来自每个受试者的四个样品的平均比率，所述受试者包括健康受试者(圆形)和患有骨髓瘤的受试者(加号)。
图2A-2C示出与工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中不同表型细胞的比率的双变量拟合分析的图。图2A示出与工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中CD45RA+/CCR7+/CD4+与CD45RA+/CCR7+/CD8+细胞的比率的双变量拟合分析的图。图2B示出与工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率的双变量拟合分析的图。图2C示出与工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率的双变量拟合分析的图。曲线表示在p＝0.950下双变量正态椭圆的边界。数据点表示来自每个受试者的多个组合物的平均比率，所述受试者包括健康供体(圆形)和患有多发性骨髓瘤的患者(加号)。
图3A-图3C示出与所产生的工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对来自患有多发性骨髓瘤的七个供体的所选CD4和CD8细胞的起始混合物中不同表型细胞的比率的双变量拟合分析的图。图3A示出与工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中CD27+/CCR7+/CD4+与CD27+/CCR7+/CD8+细胞的比率的双变量拟合分析的图。图3B示出与工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率的双变量拟合分析的图。图3C示出与工程化CAR+ T细胞组合物中的CAR+CD4+/CD8+比率相比，对所选CD4和CD8细胞的起始混合物中CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率的双变量拟合分析的图。曲线表示在p＝0.950下双变量正态椭圆的边界。
具体实施方式
本文提供了制备细胞组合物例如输入细胞组合物的方法，所述细胞组合物用于将细胞基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，所述方法包括产生输入细胞组合物的一个或多个步骤，所述输入细胞组合物含有限定比率、受控比率或所需比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞。在一些情况下，所提供的输入组合物可以通过以下方式来产生：混合或组合具有已知或确定数量或百分比的幼稚样CD4+ T细胞的含有CD4+ T细胞的细胞组合物与具有已知或确定数量或百分比的幼稚样CD8+ T细胞的含有CD8+ T细胞的细胞组合物，例如以实现所选或所需比率。还提供刺激、扩增和/或诱导输入组合物中的细胞增殖的方法。所提供的方法还可以包括与细胞的基因工程化相关的方法，如转导方法，包括用于与过继细胞疗法结合的将重组受体(例如，嵌合抗原受体)引入此类细胞中的方法。
在一个实施方案中，处理所产生的输入组合物包括在刺激条件下孵育细胞，例如在一些方面，以激活细胞用于工程化或转导或用于细胞扩增。在一些实施方案中，所述方法包括将多种细胞类型工程化的步骤，所述细胞类型如CD4+细胞和CD8+细胞，如在输入组合物中分离和存在的那些。在一些方面，进行工程化以将基因工程化抗原受体引入细胞中，所述基因工程化抗原受体如TCR，例如，高亲和力TCR，或功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，所述方法包括对细胞和含有所述细胞的组合物的进一步处理(如进一步孵育，例如在或在约37℃±2℃下)和/或配制。在一些实施方案中，所述处理产生含有基因工程化细胞的所得输出组合物，所述基因工程化细胞如基因工程化CD4+细胞和CD8+细胞，包括其中工程化的CD4+和CD8+细胞以所需比率存在的细胞。在一些实施方案中，所得的已处理输出组合物可以用于将通过所述方法制备的细胞和组合物给予患者的方法中，例如，与过继细胞疗法结合。
在一些方面，含有工程化细胞例如CAR+ T细胞的输出组合物是有利的，其中工程化的CD4+细胞和CD8+细胞是以所需比率存在，或者在所需比率的某一程度的容许误差内。例如，针对多种不同细胞群或细胞类型(如分离的CD4+和CD8+ T细胞群和亚群)富集的工程化细胞可以改进功效或者减小或避免不期望的影响。在一些情况下，此类比率包括对于治疗性用途被认为最佳的那些，例如，对于与过继细胞疗法结合给予患者被认为适当或最佳的输出比率。在一些实施方案中，对于如与过继细胞疗法结合给予受试者，输出组合物中CD4+与CD8+ T细胞的所需比率是从或从约2:1至0.5:1，例如为或为约1:1。在一些方面，含有分离的CD8+和CD4+ T细胞(如含有某一所需比率此类细胞)的组合物增加了最终给予受试者的细胞在体内或在给予受试者后持续存在、扩增、被激活和/或移植的能力。在一些方面，所述组合物改进或增加一种或多种效应子功能或激活表型。例如，在一些方面，与仅给予CD8+群体相比，此类优点可以通过给予CD4+和CD8+群体来实现。
在一些实施方案中，与其他制备、分离、孵育和工程化方法相比，所述方法提供一种或多种优点，如成本、时间和/或资源节约。与其他方法相比，此类优点可以包括以增加的效率和/或降低的复杂度、时间、成本和/或资源使用对以所需比率或接近所需比率存在的多种细胞群进行分离、处理(例如孵育)和/或工程化的能力。
在一些实施方案中，所提供的方法是基于以下观察结果：在用于工程化细胞的某些细胞生产工艺中，CD4+与CD8+细胞的输入比率或其活细胞的比率可能与工程化CD4+与CD8+细胞的输出比率或其活细胞的比率无关。如本文所示，发现输出组合物中工程化CD4+与CD8+ T细胞的所需比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的所需比率或其活细胞的比率)与在对细胞进行生产工艺以产生输出组合物之前在输入组合物中存在的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率相关联或相关，所述生产工艺例如涉及刺激、激活、扩增、增殖和/或转导细胞的一个或多个步骤。此类幼稚样细胞的示例是多种比率的CD4+与CD8+细胞，所述CD4+和CD8+细胞是CD45RA+和CCR7+、CD62L-/CCR7+或CD27+/CCR7+。在一些方面，观察到，尽管用于生成或产生输出组合物的工艺存在变化，但是在输入组合物中幼稚样CD4/CD8细胞的比率与输出组合物中的工程化CD4+与CD8+细胞的比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率)之间存在这种关联。这种变化的来源可以包括多种不同因素，包括可能从一种细胞组合物到下一种细胞组合物引入变化性的工艺的特定步骤或条件；或者所述来源可能来自于从其中分离、选择、衍生或获得被工程化的细胞的个体或样品的差异。
在某些实施方案中，所提供的方法是基于以下观察结果：输出组合物中的工程化CD4+与CD8+ T细胞的所需比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的所需比率或其活细胞的比率)与在对细胞进行生产工艺以产生输出组合物之前输入组合物中存在的CD45RA+/CCR7+CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率相关联或相关，所述生产工艺例如涉及刺激、激活、扩增、增殖和/或转导细胞的一个或多个步骤。在某些方面，观察到，尽管用于生成或产生输出组合物的供体和/或工艺存在变化，但是在输入组合物中CD45RA+/CCR7+CD4+与CD45RA+/CCR7+/CD8+细胞的比率与输出组合物中工程化CD4+与CD8+细胞的比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率)之间存在这种关联。
在特定实施方案中，所提供的方法是基于以下观察结果：输出组合物中的工程化CD4+与CD8+ T细胞的所需比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的所需比率或其活细胞的比率)与在对细胞进行生产工艺以产生输出组合物之前输入组合物中存在的CD62L-/CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-/CC R7+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率相关联或相关，所述生产工艺例如涉及刺激、激活、扩增、增殖和/或转导细胞的一个或多个步骤。在某些方面，观察到，尽管用于生成或产生输出组合物的供体和/或工艺存在变化，但是在输入组合物中CD62L-/CCR7+CD4+与CD62L-/CCR7+/CD8+细胞的比率与输出组合物中工程化CD4+与CD8+细胞的比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率)之间存在这种关联。
在一些实施方案中，所提供的方法是基于以下观察结果：输出组合物中的工程化CD4+与CD8+ T细胞的所需比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的所需比率或其活细胞的比率)与在对细胞进行生产工艺以产生输出组合物之前输入组合物中存在的CD27+/CCR7+CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率相关联或相关，所述生产工艺例如涉及刺激、激活、扩增、增殖和/或转导细胞的一个或多个步骤。在某些方面，观察到，尽管用于生成或产生输出组合物的供体和/或工艺存在变化，但是在输入组合物中CD27+/CCR7+CD4+与CD27+/CCR7+/CD8+细胞的比率与输出组合物中工程化CD4+与CD8+细胞的比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率)之间存在这种关联。
在一些方面，所提供的方法确保，通过细胞生产工艺产生的基因工程化细胞(例如CAR+ T细胞)的输出组合物实现了在所述工艺产生的组合物中相对一致的和/或受控的工程化CD4+与CD8+ T细胞的所需比率或其活细胞的比率，这种比率展现较低或低于可接受的方差或阈值方差的方差，所述组合物包括从来自多个不同受试者的样品衍生的那些组合物，所述受试者如具有不同特征的那些受试者，如具有不同年龄、不同数量和/或类型的先前治疗、和不同适应症及其亚型或严重度或等级的受试者。在一些方面，此类工艺产生此类工程化CD4+与CD8+的比率(例如CAR+CD4与CAR+CD8+ T细胞的比率或其活细胞的比率)，所述比率与在通过所述工艺产生的多种T细胞组合物中所述比率的平均值相比变化不超过20％或不超过10％或不超过5％，和/或与这个平均值相比变化不超过一个标准差，或者在此类不同样品和患者中，在通过所述工艺产生的多种T细胞组合物中，变化不超过20％或不超过10％或不超过5％。
在一些实施方案中，如关于工程化CD4与CD8 T细胞的比率，在细胞生产工艺产生的输出组合物中产生更高一致性的工艺的使用可以有利地确保向受试者给药的一致性，这在一些方面可以优化所给予组合物在所治疗受试者中的功效、效力和/或安全性。在一些方面，在工程化输出组合物中针对CD4+和CD8+ T细胞群以所需输出比率富集的工程化细胞可以改进功效或减小或避免不期望的影响。在一些方面，所述分离或富集增加了最终给予受试者的细胞在体内或在给予受试者后持续存在、扩增、被激活和/或移植的能力。在一些方面，所述组合物改进或增加一种或多种效应子功能或激活表型。即使在用于细胞工程化的起始细胞样品中存在供体变化性的情况下，也可以实现此类结果。
在一些实施方案中，本文提供的方法允许产生工程化细胞的治疗性细胞组合物，所述工程化细胞在输出组合物中具有所需输出比率而无需分开处理和/或给予工程化CD4+和CD8+ T细胞。因此，所提供的方法提供更具流线型和/或更受控的方法，以用于制备具有所需输出比率或大约所需输出比率的工程化CD4+ T细胞群与CD8+ T细胞群的组合物。在特定方面，在如所述产生含有所需比率的幼稚样CD4与CD8细胞的输入组合物后，所提供的方法可以用于细胞生产工艺中，其中对CD4+和CD8+ T细胞在单一流工艺中一起进行处理，例如激活、刺激、扩增和/或转导。因此，在一些方面，所述方法允许引入用于过继细胞疗法中的基因工程化抗原受体，其中对细胞群组合地进行分离、孵育和/或工程化，并且与对所述群体分开进行分离、孵育和/或工程化的方法相比，所述方法与增加的效率和/或降低的复杂度、时间、成本和/或资源使用相关。
还提供了通过所述方法制备的细胞和组合物(包括药物组合物和配制品)，以及用于进行所述方法的试剂盒、系统和装置。还提供了使用通过所述方法制备的细胞和组合物的方法(包括治疗方法，如用于过继细胞疗法的方法)，以及用于给予受试者的药物组合物。
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本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.用于以CD4+与CD8+ T细胞或其特定亚型的受控比率产生工程化细胞的方法
本文提供了产生细胞组合物例如输入细胞组合物的方法，所述细胞组合物用于将细胞基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，输入细胞组合物含有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物CD4+和/或CD8+ T细胞的一种或多种亚型或群体。在某些实施方案中，所述一种或多种亚型或群体是幼稚细胞和/或幼稚样细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物含有CD4+ T细胞，并且所述CD4+ T细胞的至少一部分是幼稚样CD4细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物含有CD8+ T细胞，并且所述CD8+ T细胞的至少一部分是幼稚细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物含有和/或具有固定比率、优选比率、靶标比率、限定比率和/或受控比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞。
在某些实施方案中，所述方法包括混合或组合细胞或细胞组合物以生成或产生输入细胞组合物的一个或多个步骤。在某些实施方案中，细胞或细胞组合物是已从样品选择和/或分离的。在一些实施方案中，输入细胞组合物的细胞是已从样品选择和/或分离的。在一些实施方案中，CD4+ T细胞和/或CD4+ T细胞的组合物是从样品选择或分离的。在一些实施方案中，样品是生物样品，如血液样品、单采术样品和/或白细胞单采术样品。在某些实施方案中，样品来自受试者，例如人受试者。在特定实施方案中，CD4+ T细胞的组合物和CD8+T细胞的组合物是从相同样品分离和/或选择的。在某些实施方案中，CD4+ T细胞的组合物和CD8+ T细胞的组合物是从取自或获得自相同受试者的样品分离和/或选择的。
在一些实施方案中，输入细胞组合物的生成或产生包括评估、表征、和/或鉴定细胞的一个或多个步骤。在特定实施方案中，在CD4+ T细胞的组合物中对细胞进行评估、表征、和/或鉴定。在一些实施方案中，在CD8+ T细胞的组合物中对细胞进行评估、表征、和/或鉴定。在一些实施方案中，针对对于指示T细胞中的幼稚样状态和/或与T细胞中的幼稚样状态相关的标记呈阳性的细胞来评估细胞。在某些实施方案中，针对对于指示T细胞中的非幼稚样状态和/或与T细胞中的非幼稚样状态相关的标记呈阴性的细胞来评估细胞。在特定实施方案中，对来自CD4+和CD8+ T细胞组合物(如从来自受试者的生物样品分离的细胞组合物)的细胞进行评估、表征、和/或鉴定，以确定如下细胞的量、水平、份额和/或百分比，所述细胞对于与幼稚样状态相关的一种或多种标记呈阳性和/或对于与非幼稚样状态相关的一种或多种标记呈阴性。在某些实施方案中，对来自CD4+和CD8+ T细胞组合物(如从来自受试者的生物样品分离的细胞组合物)的细胞进行评估、表征、和/或鉴定，以确定作为幼稚样细胞的细胞的量、水平、份额和/或百分比。
在一些实施方案中，所述方法包括混合或组合含有CD4+ T细胞的细胞组合物与含有CD8+ T细胞的细胞组合物，以生成或产生具有限定比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的细胞组合物(例如，输入细胞组合物)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，输入细胞组合物的生成或产生包括以下一个或多个步骤：(i)从样品(例如，生物样品)分离或选择CD4+ T细胞的组合物和/或CD8+ T细胞的组合物；(ii)评估、表征、和/或鉴定CD4+和/或CD8+ T细胞的组合物中如下细胞的量、水平、份额和/或百分比，所述细胞对于与幼稚样状态相关的一种或多种标记呈阳性和/或对于与非幼稚样状态相关的一种或多种标记呈阴性；和/或(iii)以限定比率、固定比率和/或优选比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+T细胞混合或组合CD4+ T细胞的组合物的细胞与CD8+ T细胞的组合物的细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率与样品中存在的所述比率是不同的。
在特定实施方案中，输入细胞组合物的含量、构成和/或组成与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。在某些实施方案中，输入细胞组合物中幼稚和/或幼稚样细胞(例如，幼稚样T细胞)的量、份额、百分比、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或比率与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。在特定实施方案中，输入细胞组合物中幼稚样CD4+ T细胞和/或幼稚样CD8+ T细胞的量、份额、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或比率与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。
在一些实施方案中，所述方法包括对输入组合物的细胞进行基因工程化的一个或多个步骤。在一些实施方案中，基因工程化包括以下一个或多个步骤：在激活和/或刺激细胞的条件下孵育输入细胞组合物的细胞，将基因(例如，重组和/或异源基因)递送至细胞，通过在激活或刺激条件下孵育细胞来扩增细胞，收获细胞，和/或通过冷冻(例如，低温保存)来储存细胞。在一些实施方案中，基因工程化的所述一个或多个步骤产生含有工程化细胞的输出细胞组合物。在某些实施方案中，输出组合物的工程化细胞具有固定比率、限定比率和/或靶标比率的CD4+与CD8+细胞。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括产生工程化细胞如表达重组受体的细胞的一个或多个步骤，所述工程化细胞具有限定比率的CD4+与CD8+ T细胞。在某些实施方案中，本文提供的方法包括将来自起始和/或输入细胞组合物的细胞基因工程化以产生具有限定比率的基因工程化CD4+与CD8+ T细胞的所得和/或输出细胞组合物的一个或多个步骤。在特定实施方案中，基因工程化是或包括转染或转导来自输入细胞组合物的细胞以将含有核酸的药剂引入输入细胞组合物的细胞中。在一些实施方案中，所述核酸编码重组受体，例如，嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，产生输出细胞组合物包括以下一个或多个步骤：激活或刺激输入细胞组合物的细胞；基因工程化、转导或转染来自输入细胞组合物的细胞；和/或扩增被转染的细胞；由此产生具有限定比率如1:1比率的基因工程化CD4+与CD8+ T细胞的输出细胞组合物。
A.细胞和输入细胞组合物的制备
在一些实施方案中，本文提供的方法包括制备用于基因工程化的细胞的一个或多个步骤。在某些实施方案中，所述一个或多个步骤包括从生物样品分离细胞以制备要基因工程化的细胞的组合物，例如，输入细胞组合物。在一些实施方案中，输入细胞组合物的制备包括以下一个或多个步骤：分离两种或更多种细胞类型和/或特定细胞类型或细胞亚型的组合物，并将所述细胞类型和/或所述特定细胞类型的细胞组合物混合或组合为单一输入细胞组合物。在特定实施方案中，评估特定细胞类型的细胞组合物以确定组合物中其他亚型的存在、量和/或比率。在某些实施方案中，混合或组合特定细胞类型的细胞组合物以实现具有固定比率或确定比率的细胞类型或亚型的输入细胞组合物。在一些实施方案中，细胞类型和/或细胞亚型与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。
在某些实施方案中，输入细胞组合物的制备包括以下一个或多个步骤：分离CD4+T细胞的组合物或包括CD4+ T细胞的组合物，分离CD8+ T细胞的组合物或包括CD8+ T细胞的组合物，以及将特定细胞类型的CD4+和CD8+ T细胞组合物混合或组合为单一输入细胞组合物。在某些实施方案中，输入细胞组合物的制备包括对细胞组合物的CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型的份额或量进行评估、确定和/或定量的一个或多个步骤。在特定实施方案中，CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型是或包括幼稚和/或幼稚样CD4+和/或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物中幼稚样细胞的份额或量与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相关联，控制输出细胞组合物的含量、构成和/或组成，与输出细胞组合物的含量、构成和/或组成相对应和/或相关。
在一些实施方案中，从样品分离的细胞(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且在一些实施方案中是人细胞。在一些实施方案中，细胞衍生自受试者的血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，和/或是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞。在一些实施方案中，细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，淋巴细胞是T淋巴细胞或T细胞。在一些实施方案中，细胞包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
在某些实施方案中，T细胞的组合物(例如，CD4+ T细胞组合物和/或CD8+ T细胞组合物)含有依据功能、激活状态、成熟度、分化潜力、扩增、标记或细胞因子分泌谱和/或分化程度进一步分类的细胞亚型。例如，在一些实施方案中，细胞是或包括幼稚和/或幼稚样CD4+和/或CD8+ T细胞。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞，对细胞进行制备、处理、培养和/或工程化，以及在低温保存之前或之后将细胞再引入同一受试者中。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于输入细胞组合物(例如，要基因工程化以例如表达重组受体如CAR的细胞的组合物)中的细胞可以含有已经从样品分离的细胞，所述样品如生物样品，例如从受试者获得或衍生自受试者的样品。在一些实施方案中，分离出所述细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、处理和/或工程化)的人。
在一些方面，衍生出或分离出所述细胞的样品(例如生物样品)是血液或血液衍生的样品，或衍生自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺和/或从其衍生的细胞。在一些实施方案中，细胞是从样品或生物样品衍生、分离和/或选择，所述样品或生物样品可以包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，所述细胞衍生自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞或细胞的组合物(例如，T淋巴细胞或CD4+ T细胞组合物和/或CD8+ T细胞组合物)的分离包括一个或多个制备步骤和/或并非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的所述血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤是在半自动化“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)中根据制造商的说明书来完成的。在一些方面，洗涤步骤是通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明书完成的。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度进行离心来从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中的表达或存在来分开不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用基于此类标记的任何已知的分离方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已经结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分开。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好实施基于除了所需群体以外的细胞表达的标记来实施分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一分离步骤，如后续阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样地，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育来对多种细胞类型同时进行阳性选择。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群或亚型如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞是通过阳性或阴性选择技术分离。在某些实施方案中，CD4+ T细胞和/或CD4+ T细胞的细胞组合物或包括CD4+ T细胞的细胞组合物是通过阳性或阴性选择技术分离。在特定实施方案中，CD8+ T细胞和/或CD8+ T细胞的细胞组合物或包括CD8+ T细胞的细胞组合物是通过阳性或阴性选择技术分离。在特定实施方案中，CD4+ T细胞的组合物和/或CD8+ T细胞的组合物是通过阳性或阴性选择技术分离。
在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+或标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+组合物可以含有如下细胞：可以基于标记的阳性或阴性表达和/或标记的相对表达水平将所述细胞进一步归类或分选为亚群。此类亚型可以包括幼稚、幼稚样和/或非幼稚亚型或亚群。
在某些实施方案中，通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+ T细胞(例如，CD4+ T辅助细胞)分类为幼稚和/或幼稚样细胞，以及非幼稚和/或非幼稚样细胞。在特定实施方案中，通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD8+ T细胞(例如，CD8+ T辅助细胞)分类为幼稚和/或幼稚样细胞，以及非幼稚和/或非幼稚样细胞。
在某些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术分开或分离T淋巴细胞。在特定实施方案中，使用免疫磁性分离技术分开或分离CD4+ T细胞和/或CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，使用免疫磁性分离技术分开或分离CD8+ T细胞和/或CD8+ T细胞的组合物。使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术的分开和分离综述于以下文献中：Methodsin Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:CellBehavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0002439290640000271
HumanaPress Inc.,新泽西州托托瓦。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像
Figure BDA0002439290640000272
或
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珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体特异性地结合至需要分离(例如，需要进行阴性或阳性选择)的一种细胞、多种细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)。
在一些实施方案中，磁性颗粒或磁珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。存在许多用于磁分离方法的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和在欧洲专利说明书EP 452342B(将其通过引用特此并入)中描述的那些。胶体大小的颗粒，如在Owen美国专利号4,795,698以及Liberti等人,美国专利号5,200,084中描述的那些是其他例子。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附接至磁性颗粒或磁珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将所述样品置于磁场中，并且具有附接至其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记细胞)。在一些方面，在相同的选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或进行进一步分离步骤。
在某些实施方案中，所述磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记具有特异性的一抗的包被而附接至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，所述磁响应颗粒保持附接至所述细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附接至所述细胞以用于给予患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，所述可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本(Auburn,CA))来进行。磁激活细胞分选(MACS)系统能够对附接有磁化颗粒的细胞进行高纯度选择。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，使附接至磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附接的种类被洗脱。然后，在第一洗脱步骤完成后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群耗尽。
在某些实施方案中，使用如下系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或制备步骤中的一个或多个。在一些方面，使用所述系统在封闭或无菌环境中实施这些步骤中的每一个，例如，以使误差、用户操作和/或污染最小化。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。
在一些方面，所述分离和/或其他步骤是使用例如CliniMACS系统(MiltenyiBiotec)来进行，以用于在封闭且无菌的系统中以临床规模水平自动化分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制仪器的所有部件并指示系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流速，并且与夹紧阀一起确保经过系统的缓冲液的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，所述CliniMACS系统使用在无菌无热原溶液中提供的偶联抗体的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去除多余颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，再将所述管组连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统将细胞样品自动施加到分离柱上。标记的细胞被保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤被去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后被从柱中洗脱，并且被收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，所述CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理联合体，其允许自动洗涤和通过离心来分级分离细胞。所述CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，将外周血自动分离为红细胞、白细胞和血浆层。所述CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成的细胞培育室，其实现细胞培养方案，例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见，例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文描述的细胞群，在流式细胞术中针对多种细胞表面标记染色的细胞被携载于流体流中。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分选收集并富集(或耗尽)本文描述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用与基于FACS的检测系统组合的微机电系统(MEMS)芯片收集并富集(或耗尽)本文描述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140,Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，可以用多种标记来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞亚组。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记所述抗体或结合配偶体，从而促进分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞是在流体流中载携，如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。
输入细胞组合物
在某些实施方案中，本文提供了产生和/或制备输入细胞组合物的方法。在某些实施方案中，输入细胞组合物是用于基因工程化中的细胞的组合物，所述细胞例如为将用编码重组蛋白(如重组受体，例如CAR)的核酸进行基因工程化的细胞，和/或将会经历产生表达重组蛋白(如重组受体，例如CAR)的基因工程化细胞的过程的细胞。在某些实施方案中，将用编码重组受体的核酸处理、接触和/或孵育输入组合物的细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物含有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物含有CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，它们包括特定的所需比率、固定比率和/或受控比率的作为幼稚和/或幼稚样T细胞的CD4+与CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，作为幼稚和/或幼稚样T细胞的CD4+与CD8+ T细胞的所需比率、固定比率和/或受控比率是细胞的如下比率或数量，在所述比率或数量下，两种类型的细胞或分离的细胞群被包括于输入细胞组合物中，所述输入细胞组合物被设计为在孵育和/或工程化步骤或其他处理步骤完成时和/或在解冻后和/或在即将给予受试者之前，产生具有工程化CD4+与CD8+ T细胞的所需比率、限定比率和/或受控比率或在其容许误差率或差异内的输出细胞组合物。
在某些实施方案中，输入细胞组合物含有一定比率(例如限定比率、受控比率和/或固定比率)的CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞。在特定实施方案中，CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的比率在10:1至0.05:1之间、在8:1至0.1:1之间、在5:1至0.2:1之间、在2.5:1至0.25:1之间、在2.2:1至0.8:1之间、在2:1至0.5:1之间或在1.5:1至1:1之间，包含端值。在特定实施方案中，CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的比率在2:1至0.8:1之间、在1.6:1至0.8:1之间、在1.4:1至0.8:1之间、在1.2:1至0.8:1之间或在1.2:1至0.8:1之间，包含端值。在一些实施方案中，所述比率在2.2:1至0.8:1之间，包含端值。在某些实施方案中，CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的比率为或为约2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1或0.8:1。在某些实施方案中，所述比率为或为约1.1:1。
在特定实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为1x 106、5x 106、1x107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的总细胞或总活细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为1x 106、5x106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x108、5x 108或1x 109的量的表达CD4或CD8的细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109的量的幼稚样CD4+和幼稚样CD8+ T细胞。
在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x108个之间的总细胞或总活细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的表达CD4或CD8的细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在1x 106个与1x1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的幼稚样CD4+和幼稚样CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，输入细胞组合物具有或含有至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的幼稚样细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物含有或包括不超过100％、不超过99％、不超过98％、不超过97％、不超过96％、不超过95％、不超过90％或不超过85％的幼稚样细胞。
在特定实施方案中，本文提供的方法包括产生、生成和/或制备输入细胞组合物的一个或多个步骤。在某些实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括混合或组合CD4+ T细胞的组合物的细胞与CD8+ T细胞的组合物的细胞的一个或多个步骤。
在一些实施方案中，输入组合物的细胞(例如，CD4+ T细胞CD8+ T细胞)已经从样品(例如，生物样品)分离和/或选择。在某些实施方案中，输入组合物的细胞的来源是已经从样品分离和/或选择如单独分离或选择的细胞的组合物，例如，CD4+ T细胞的组合物和CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，CD4+ T细胞的组合物和CD8+ T细胞的组合物是从样品(例如，生物样品)分离和/或选择的，如单独分离和/或选择的。在某些实施方案中，CD4+ T细胞的组合物和CD8+ T细胞的组合物是从相同样品分离和/或选择的。在某些实施方案中，CD4+ T细胞的组合物和CD8+ T细胞的组合物是从取自或获得自相同受试者的样品分离和/或选择的。
在特定实施方案中，CD4+ T细胞的组合物含有或包括至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，CD4+ T细胞的组合物含有或包括不超过100％、不超过99％、不超过98％、不超过97％、不超过96％、不超过95％、不超过90％或不超过85％的CD4+ T细胞。
在某些实施方案中，CD8+ T细胞的组合物含有或包括至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的CD8+ T细胞。在特定实施方案中，CD8+ T细胞的组合物含有或包括不超过100％、不超过99％、不超过98％、不超过97％、不超过96％、不超过95％、不超过90％或不超过85％的CD8+ T细胞。
在某些实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：例如，在组合或混合细胞组合物的细胞之前，对CD4+ T细胞的组合物和/或CD8+ T细胞的组合物中存在的活CD4+ T细胞和/或活CD8+ T细胞的量、份额、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、确定和/或定量。在特定实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：对CD4+ T细胞的组合物和/或CD8+ T细胞的组合物中存在的幼稚样CD4+ T细胞和/或幼稚样CD8+ T细胞的量、份额、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、确定和/或定量。在一些实施方案中，幼稚样CD4+和/或幼稚样CD8+ T细胞是活的幼稚样细胞。
在某些实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：对样品(例如，生物样品)中存在的活CD4+ T细胞和/或活CD8+T细胞的量、份额、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、确定和/或定量。在特定实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：对样品中存在的幼稚样CD4+T细胞和/或幼稚样CD8+ T细胞的量、份额、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、确定和/或定量。在一些实施方案中，幼稚样CD4+和/或幼稚样CD8+ T细胞是活的幼稚样细胞。
在一些实施方案中，输入组合物的细胞是从样品(例如，生物样品)分离和/或选择的。在特定实施方案中，样品中幼稚样细胞的份额(例如，幼稚样CD4+和CD8+ T细胞的份额)是已知的或者已经被确定、测量或评估。在一些实施方案中，对来自样品的细胞进行分离和/或选择以直接产生具有限定比率、固定比率或受控比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的细胞组合物(例如，输入细胞组合物)。在某些实施方案中，用免疫亲和珠选择来分离和/或选择细胞。在一些实施方案中，用亲和柱分离和/或选择细胞。在特定实施方案中，根据WO 2015/164675中所述的任何方法对来自样品的细胞进行分离或选择，以产生具有限定比率、受控比率和/或固定比率的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞的细胞组合物。
在某些实施方案中，输入细胞组合物含有通过第一和第二分离或选择从样品直接分离和/或选择的细胞。在某些实施方案中，输入组合物是通过以下方式产生：进行第一和第二选择，以分离一定量、数量或浓度的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述量、数量或浓度的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞足以产生限定比率、固定比率和/或受控比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，直接分离、选择和/或富集来自样品的细胞以产生富集CD4+细胞和CD8+细胞的输入细胞组合物。在一些实施方案中，已经对样品中幼稚样CD4+和幼稚样CD8+细胞的量、数量、百分比、每体积的数量和/或每重量的数量进行测量、评估和/或确定，并且以足以实现输入细胞组合物的量分离、选择和/或富集CD4+和CD8+细胞，所述输入细胞组合物具有限定比率、固定比率或受控比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞。在一些实施方案中，从样品直接分离、选择和/或富集的细胞是输入细胞组合物并且用于后续处理步骤中，如涉及所富集细胞的孵育、刺激、激活、工程化和/或配制的后续处理步骤。
在一些实施方案中，从样品分离、选择和/或富集的细胞如输入细胞组合物以幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞的限定比率、固定比率或受控比率含有一定比率的CD4+细胞与CD8+细胞。在本文提供的方法的实施方案中，样品的第一和/或第二选择或对其亚群的选择可以以如下方式进行，所述方式产生具有所需比率的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+细胞的输入细胞组合物。
在一些实施方案中，在从样品进行第一和/或第二选择之前，确定样品(例如，生物样品)中CD4+与CD8+ T细胞的比率。在某些实施方案中，在进行第一和/或第二选择之前，确定样品中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率。基于样品中CD4+与CD8+ T细胞的特定比率和/或幼稚样CD4+与CD8+ T细胞的特定比率(它们可以在样品之间变化)，可以针对样品将特定选择方式个性化，例如通过将色谱柱定尺寸或选择免疫亲和试剂的量或浓度，以实现所需比率、固定比率或受控比率。受试者中各种细胞群的相对水平或频率可以基于评估此类群体或亚群上存在的一种或多种标记的表面表达来确定。可以使用用于评估表面标记或蛋白的表达水平的多种熟知方法，如通过基于亲和力的方法例如基于免疫亲和力的方法进行的检测，例如在细胞表面蛋白的情况下，如通过流式细胞术检测。
在一些情境下，幼稚样CD4+与CD8+ T细胞的适当比率可以根据例如以下情况而变化：衍生细胞的受试者的特定疾病、状况或先前治疗，和/或细胞的特定抗原特异性、各种亚群(例如，效应细胞与记忆细胞与幼稚细胞)的特定类型细胞(例如，CD4+细胞)之间的相对表示，和/或将用于孵育细胞的一种或多种条件，如培养基、刺激剂、培养时间、缓冲液、氧含量、二氧化碳含量、抗原、细胞因子、抗体和其他组分。因此，通常或一般已知比另一种细胞类型更快地增殖或扩增的细胞类型可能将不会在每种情况下总是具有这种特性。因此，在一些方面，幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率是基于细胞类型在正常或典型情况下的已知能力，结合对细胞或衍生细胞的受试者的表型或状态的评估，和/或经验证据来确定。
在一些实施方案中，分离和/或步骤是使用免疫磁珠进行的。在一些实施方案中，使含有CD4+和CD8+细胞的细胞样品与含有结合至CD4或CD8的第一免疫亲和试剂的磁珠和含有结合至CD4或CD8中另一种的第二免疫亲和试剂的磁珠接触。分离和/或步骤可以同时和/或依次进行。
在一些实施方案中，第一和/或第二免疫亲和试剂以次最佳产率浓度存在于孵育组合物中，借此所富集组合物含有孵育组合物中少于全部(例如，70％)的总CD4+细胞和/或孵育组合物中少于全部(例如，70％)的CD8+细胞，从而产生富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，亲和试剂的次最佳产率浓度是低于在给定选择或富集中实现所结合细胞的最佳或最大产率所使用或需要的浓度的浓度，所述选择或富集涉及将细胞与所述试剂一起孵育以及回收或分离已经与所述试剂结合的细胞(例如，“产率”是与孵育中被所述试剂靶向、或者所述试剂对其具有特异性、或者具有标记(所述试剂对所述标记具有特异性并且能够结合所述标记)的细胞的总数相比，如此回收或选择的细胞的数量)。次最佳产率浓度通常是在这个过程或步骤中，在回收已经结合至所述试剂的细胞后，实现所结合细胞(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)的少于全部(例如，不超过70％)产率的试剂的浓度或量。在一些实施方案中，不超过或不超过约50％、45％、40％、30％或25％产率是通过亲和试剂的次最佳浓度来实现。所述浓度可以用每个细胞的颗粒或表面的数量或质量和/或每个细胞的药剂(例如，抗体，如抗体片段)的质量数或分子数来表示。在特定实施方案中，次最佳产率浓度足以驱动或实现幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的固定比率、受控比率和/或限定比率。
在一些实施方案中，例如，当以具有对CD4+和/或CD8+ T细胞的亲和力的两种或更多种选择试剂中的每一种或者一或多种的次最佳产率浓度操作时，此类试剂中的一种或多种是以高于其他此类试剂中的一种或多种的浓度来使用，以如与其他一种或多种试剂所识别的一种或多种细胞类型相比，偏向由该试剂所识别的细胞类型的比率。例如，根据期望以多大程度增加所述比率，与其他一种或多种试剂相比，与期望针对其偏向所述比率的标记特异性结合的试剂可以以增加一半、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多的浓度(例如，每个细胞的药剂或质量)被包括。
在一些实施方案中，当在次最佳范围内和/或用足以实现试剂饱和的细胞操作时，免疫亲和试剂的量与所富集细胞的近似产率成比例。在某些实施方案中，可以按常规方式确定免疫亲和试剂的合适的量或浓度，其取决于所产生的含有富集或选择的CD4+和CD8+ T细胞的组合物的所需比率。
在一些实施方案中，使用磁珠进行分开和/或分离步骤，在所述磁珠中免疫亲和试剂如通过与链霉亲和素突变蛋白的肽配体相互作用被可逆地结合，如WO 2015/164675中所述。此类磁珠的示例是
Figure BDA0002439290640000361
在一些实施方案中，分离和/或步骤是使用磁珠来进行，如可从Miltenyi Biotec商业购得的那些磁珠。
在一些实施方案中，对来自样品的CD4+和CD8+细胞的第一选择或富集是使用基于免疫亲和力的试剂来进行，所述试剂至少分别包括第一和第二亲和色谱基质，所述基质上固定有抗体。在一些实施方案中，第一和/或第二选择中的一个或两个可以采用多种亲和色谱基质和/或抗体，借此将用于相同选择(即第一选择或第二选择)的所述多种基质和/或抗体串联连接。在一些实施方案中，第一和/或第二选择中采用的一种或多种亲和色谱基质吸附或者能够选择或富集至少约50x 106个细胞/mL、100x 106个细胞/mL、200x 106个细胞/mL或400x 106个细胞/mL。在一些实施方案中，可以基于柱的直径和/或长度来调节吸附能力。在一些实施方案中，所选择或富集的组合物的培养启动比率是通过假定基于例如用于选择细胞的一个或多个柱的吸附能力，选择基质的足以实现所述培养启动比率的量和/或以足以实现所述培养启动比率的相对量来实现。
在一个示例性实施方案中，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞具有相等或类似的幼稚样细胞的份额，并且在第一选择与第二选择之间，一种或多种基质的吸附能力是相同的，例如对于二者为或为约1x 108个细胞/mL，借此在第一选择和第二选择中对细胞的富集或选择产生含有CD4+细胞和CD8+细胞的组合物，所述组合物具有为或为约1:1的幼稚样CD4+与CD8+T细胞比率。在特定实施方案中，可以按常规方式选择或确定用于第一和/或第二选择的亲和基质色谱柱的合适的体积、直径或数量，其取决于幼稚样细胞的份额并且取决于所产生的输入细胞组合物的所需比率。
在一些实施方案中，调节一种或多种柱基质的吸附能力，以补偿与来自受试者的起始样品中相应CD4+或CD8+亲本群体的细胞的频率相比，幼稚样细胞(例如，幼稚样CD4+或CD8+细胞)的频率差异。受试者中各种细胞群的相对水平或频率可以基于评估此类群体或亚群上存在的一种或多种标记的表面表达来确定。可以使用用于评估表面标记或蛋白的表达水平的多种熟知方法，如通过基于亲和力的方法例如基于免疫亲和力的方法进行的检测，例如在细胞表面蛋白的情况下，如通过流式细胞术检测。
在一些实施方案中，在细胞组合物(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞组合物)中或在样品(例如，生物样品)中评估、测量和/或检测幼稚样细胞(例如，幼稚样CD4+和/或CD8+ T细胞)。在一些实施方案中，幼稚样T细胞是对于一种或多种标记的表达呈阳性的T细胞，所述标记指示细胞是幼稚细胞和/或是幼稚样细胞。在某些实施方案中，幼稚样T细胞是对于标记的表达呈阳性的细胞，所述标记与T细胞中的幼稚状态或幼稚样状态相关。在特定实施方案中，幼稚样T细胞是对于一种或多种标记的表达呈阴性的T细胞，所述标记指示细胞不是幼稚细胞和/或不是幼稚样细胞。在某些实施方案中，幼稚样T细胞是对于标记的表达呈阴性的细胞，所述标记与T细胞中的非幼稚状态或非幼稚样状态相关。在某些实施方案中，T细胞中的非幼稚状态或非幼稚样状态包括例如但不限于效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T(TEM)细胞及其组合。
在一些实施方案中，幼稚样T细胞对于至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或大于十种标记的表达呈阳性，所述标记指示细胞是幼稚细胞和/或是幼稚样细胞，和/或所述标记与T细胞中的幼稚状态或幼稚样状态相关。在一些实施方案中，所述标记是在细胞表面上表达。在某些实施方案中，幼稚样T细胞对于至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或大于十种标记的表达呈阴性，所述标记指示细胞是非幼稚细胞和/或是非幼稚样细胞，和/或所述标记与T细胞中的非幼稚状态或非幼稚样状态相关。
指示T细胞是幼稚细胞和/或是幼稚样T细胞、和/或与T细胞中幼稚状态或幼稚样状态相关的标记包括但不限于CD27、CD28、CD45RA、CD62L和/或CCR7。在一些实施方案中，幼稚样T细胞(例如，幼稚样CD4+和/或CD8+ T细胞)对于CD27、CD28、CD45RA和/或CCR7的表达呈阳性。在某些实施方案中，幼稚样T细胞对于CD27、CD28、CD45RA和/或CCR7中的一种或多种的表面表达呈阳性。在一些实施方案中，幼稚样T细胞(例如，幼稚样CD4+和/或CD8+ T细胞)对于CD62L的表达呈阴性。
指示细胞是非幼稚细胞和/或是非幼稚样T细胞、和/或与T细胞中的非幼稚状态或非幼稚样状态相关的标记包括但不限于CD25、CD45RO、CD56、KLRG1和/或CD95。在一些实施方案中，幼稚样T细胞(例如，幼稚样CD4+和/或CD8+ T细胞)对于CD25、CD45RO、CD56和/或KLRG1的表达呈阴性。在特定实施方案中，幼稚样T细胞(例如，幼稚样CD4+和/或CD8+ T细胞)具有与非幼稚细胞或非幼稚样细胞相关的标记的低表达。在特定实施方案中，幼稚样T细胞具有CD95的低表达。在某些实施方案中，幼稚样T细胞对于CD25、CD45RO、CD56和/或KLRG1中的一种或多种的表面表达呈阴性。
在一些实施方案中，与非幼稚细胞或非幼稚样细胞相关的标记的低表达是或包括比所述标记在如下细胞中的表达少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的表达：所述细胞是非幼稚样细胞和/或对于一种或多种标记呈阳性的细胞，所述标记指示细胞是非幼稚T细胞和/或是非幼稚样T细胞，和/或所述标记与T细胞中的非幼稚状态或非幼稚样状态相关。在某些实施方案中，与非幼稚细胞或非幼稚样细胞相关的标记的低表达是或包括比所述标记在效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞(TCM)和/或效应记忆T(TEM)细胞中的表达少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的表达。
在一些实施方案中，指示细胞是非幼稚T细胞和/或是非幼稚样T细胞、和/或与T细胞中的非幼稚状态或非幼稚样状态相关的标记包括一种或多种细胞因子。例如，在某些实施方案中，非幼稚T细胞或非幼稚样T细胞对于IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10中的一种或多种的表达和/或产生呈阴性。在一些实施方案中，分泌所述一种或多种细胞因子。在特定实施方案中，例如，在用防止、抑制或减少分泌的药剂处理期间或之后，非幼稚样T细胞在内部表达所述一种或多种细胞因子。
在某些实施方案中，幼稚样T细胞对于CD45RA和CCR7的表达(例如，表面表达)呈阳性。在特定实施方案中，幼稚样CD4+ T细胞对于CD45RA和CCR7的表达(例如，表面表达)呈阳性。在一些实施方案中，幼稚样CD8+ T细胞对于CD45RA和CCR7的表达(例如，表面表达)呈阳性。在特定实施方案中，幼稚样T细胞对于CD45RA、CD27和CCR7的表达(例如，表面表达)呈阳性，并且对于CD45RO的表达(例如，表面表达)呈阴性。在特定实施方案中，幼稚样CD4+ T细胞对于CD45RA、CD27和CCR7的表达(例如，表面表达)呈阳性，并且对于CD45RO的表达(例如，表面表达)呈阴性。在一些实施方案中，幼稚样CD8+ T细胞对于CD45RA、CD27和CCR7的表达(例如，表面表达)呈阳性，并且对于CD45RO的表达(例如，表面表达)呈阴性。
在某些实施方案中，CD4+和/或CD8+ T细胞是活细胞。在某些实施方案中，CD4+和/或CD8+ T细胞是活的幼稚样细胞。所述活细胞对于标记的表达呈阳性，所述标记指示，细胞经历正常功能细胞过程，和/或尚未经历坏死或程序性细胞死亡，或者不在经历坏死或程序性细胞死亡的过程中。在一些实施方案中，可以通过细胞的氧化还原电位、细胞膜的完整性或线粒体的活性或功能来评估活力。在一些实施方案中，活力是在测定中不存在与细胞死亡相关的特定分子，或不存在细胞死亡的指示。
在某些实施方案中，通过测定评估细胞活力，所述测定可以包括但不限于染料摄取测定(例如，钙黄绿素AM测定)、XTT细胞活力测定和染料排除测定(例如，锥虫蓝、伊红或丙啶染料排除测定)。在特定实施方案中，活细胞具有一种或多种细胞凋亡标记(例如，膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3)的阴性表达。在一些实施方案中，活细胞对于一种或多种细胞凋亡标记的表达或激活呈阴性，所述细胞凋亡标记可以包括但不限于半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9和半胱天冬酶10)、Bcl-2家族成员(例如，Bax、Bad和Bid)、膜联蛋白V和/或TUNEL染色。
在一些实施方案中，表达是或包括标记的量、水平、浓度和/或存在。在特定实施方案中，标记是多肽。在一些实施方案中，标记是mRNA。在一些实施方案中，表达是或包括多肽(例如，标记多肽)的量、水平、浓度和/或存在。在某些实施方案中，编码标记的多核苷酸(例如，mRNA或从mRNA衍生的cDNA)的量、水平、浓度和/或存在。在某些实施方案中，表达是或包括位于细胞表面上或在细胞表面上暴露或位于细胞膜内的标记的量、水平、浓度和/或存在。在某些实施方案中，表达是或包括位于细胞表面上或在细胞表面上暴露或位于细胞膜内的标记的量、水平、浓度和/或存在。在特定实施方案中，表达是或包括内部表达，例如，在细胞内部中，如在胞质溶胶、细胞核、内质网和/或高尔基体内的标记的量、水平、浓度和/或存在。
在一些实施方案中，通过进行体外测定对标记进行测量、评估和/或定量。在一些例子中，体外测定是免疫测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、或mRNA表达水平测定。在一些情况下，所用的体外测定可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧向流免疫测定、抑制测定和亲合力测定。在一些实施方案中，通过RNA-seq对标记的表达进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，通过免疫染色技术对标记的表达进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，通过流式细胞术分析对标记的表达进行测量、评估和/或定量。在一些实施方案中，通过内部细胞因子染色对标记的表达进行测量、评估和/或定量。
在一些实施方案中，在CD4+ T细胞组合物的细胞中对标记进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少97％或至少99％的CD4+ T细胞是幼稚样CD4+ T细胞。在某些实施方案中，在10％与50％之间、在20％与60％之间、在25％与75％之间、在30％与80％之间、在40％与90％之间、在50％与100％之间、在30％与50％之间、在40％与60％之间、在50％与70％之间、在60％与80％之间、在70％与90％之间、在80％与100％之间、在5％与25％之间、在25％与50％之间、在50％与75％之间或在75％与99％之间的CD4+ T细胞是幼稚样CD4+ T细胞。在某些实施方案中，幼稚样CD4+ T细胞是活的幼稚样CD4+ T细胞。
在某些实施方案中，在CD8+ T细胞组合物的细胞中对标记进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少97％或至少99％的CD8+ T细胞是幼稚样CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在10％与50％之间、在20％与60％之间、在25％与75％之间、在30％与80％之间、在40％与90％之间、在50％与100％之间、在30％与50％之间、在40％与60％之间、在50％与70％之间、在60％与80％之间、在70％与90％之间、在80％与100％之间、在5％与25％之间、在25％与50％之间、在50％与75％之间或在75％与99％之间的CD8+ T细胞是幼稚样CD4+ T细胞。在某些实施方案中，幼稚样CD8+ T细胞是活的幼稚样CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，将来自CD4+ T细胞的组合物的细胞与来自CD8+ T细胞的组合物的细胞以足以产生输入细胞组合物的量和/或比例混合或组合，所述输入细胞组合物具有以下的CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的比率：在10:1与0.05:1之间、在8:1与0.1:1之间、在5:1与0.2:1之间、在2.5:1与0.25:1之间、在2.2:1与0.8:1之间、在2:1与0.5:1之间或在1.5:1与1:1之间，包含端值。在一些实施方案中，将细胞以足以达到在2.2:1与0.8:1之间(包含端值)的CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的比率的量和/或比例混合。在某些实施方案中，将细胞混合或组合至CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的比率为或为约2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1或0.8:1。在某些实施方案中，将细胞混合或组合至比率为或为约1.1:1。
在一些实施方案中，将为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的总CD4+ T细胞或总活CD4+T细胞与为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5.5x 108或1x 109个的量的总CD8+ T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的输入细胞组合物。在某些实施方案中，将在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的总CD4+ T细胞或总活CD4+ T细胞与为或约为在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的总CD8+ T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的输入细胞组合物。
在一些实施方案中，将为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的幼稚样CD4+ T细胞与为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5.5x 108或1x 109个的量的幼稚样CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的输入细胞组合物。在某些实施方案中，将在5x 105个与1x 1010个之间、1x 106个与1x 1010个之间、在1x107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的幼稚样CD4+ T细胞与为或约为在5x 105个与1x 1010个之间、1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个的量的幼稚样CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD4+幼稚样T细胞与CD8+幼稚样T细胞的输入细胞组合物。
在特定实施方案中，与样品(例如，生物样品)的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率相比，输入细胞组合物的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率已经被调整、变化和/或改变。在特定实施方案中，幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率与生物样品相比的调整、变化或改变为或为约或为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。在某些实施方案中，样品是从其中衍生、分离、选择和/或获得输入细胞组合物的细胞的样品。
在某些实施方案中，输入细胞组合物含有一定比率(例如限定比率、受控比率和/或固定比率)的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞。在特定实施方案中，CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率是在10:1至0.05:1之间、在8:1与0.1:1之间、在5:1与0.2:1之间、在2.5:1与0.25:1之间、在2.2:1与0.8:1之间、在2:1与0.5:1之间或在1.5:1与1:1之间，包含端值。在特定实施方案中，CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率是在2:1与0.8:1之间、在1.6:1与0.8:1之间、在1.4:1与0.8:1之间、在1.2:1与0.8:1之间或在1.2:1与0.8:1之间，包含端值。在一些实施方案中，所述比率是在2.2:1与0.8:1之间，包含端值。在某些实施方案中，CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率为或为约2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1或0.8:1。在某些实施方案中，所述比率为或为约1.1:1。
在特定实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为1x 106、5x 106、1x107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的总细胞或总活细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为5x 105、1x106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的表达CD4或CD8的细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的CD45RA+/CCR7+/CD4+和CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞。
在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x108个之间的总细胞或总活细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在5x 105个与1x 1010个之间、1x106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的表达CD4或CD8的细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在5x 105个与1x 1010个之间、1x 106与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的CD45RA+/CCR7+/CD4+和CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，输入细胞组合物具有或含有至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的CD45RA+/CCR7+细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物含有或包括不超过100％、不超过99％、不超过98％、不超过97％、不超过96％、不超过95％、不超过90％或不超过85％的CD45RA+/CCR7+细胞。
在一些实施方案中，将为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的总CD4+ T细胞或总活CD4+T细胞与为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5.5x 108或1x 109个的量的总CD8+ T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD45RA+/CCR7+/CD4+T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的输入细胞组合物。在某些实施方案中，将在5x 105个与1x 1010个之间、1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的总CD4+T细胞或总活CD4+ T细胞与为或约为在5x105个与1x 1010个之间、1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的总CD8+ T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的输入细胞组合物。
在特定实施方案中，与样品(例如，生物样品)的CD45RA+/CCR7+/CD4+T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率相比，输入细胞组合物的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率已经被调整、变化和/或改变。在特定实施方案中，CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率与生物样品相比的调整、变化或改变为或为约或为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。在某些实施方案中，样品是从其中衍生、分离、选择和/或获得输入细胞组合物的细胞的样品。
在某些实施方案中，输入细胞组合物含有有一定比率(例如限定比率、受控比率和/或固定比率)的CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/C D8+ T细胞。在特定实施方案中，CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CC R7+/CD8+ T细胞的比率是在10:1与0.05:1之间、在8:1与0.1:1之间、在5:1与0.2:1之间、在2.5:1与0.25:1之间、在2.2:1与0.8:1之间、在2:1与0.5:1之间或在2:1与1:1之间，包含端值。在特定实施方案中，CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率是在2:1与0.8:1之间、在1.8:1与1:1之间、在1.8:1与1.2:1之间、在1.2:1与1.4:1之间或在1.8:1与1.6:1之间，包含端值。在一些实施方案中，所述比率是在1.8:1与1.6:1之间，包含端值。在某些实施方案中，CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率为或为约2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.69:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1或1.3:1。在某些实施方案中，所述比率为或为约1.69:1。
在特定实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为1x 106、5x 106、1x107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的总细胞或总活细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为5x 105、1x106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的表达CD4或CD8的细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的CD27+/CCR7+/CD4+和CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞。
在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x108个之间的总细胞或总活细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在5x 105个与1x 1010个之间、1x106与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的表达CD4或CD8的细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在5x 105个与1x 1010个之间、1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的CD27+/CCR7+/CD4+和CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，输入细胞组合物具有或含有至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的CD27+/CCR7+细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物含有或包括不超过100％、不超过99％、不超过98％、不超过97％、不超过96％、不超过95％、不超过90％或不超过85％的CD27+/CCR7+细胞。
在一些实施方案中，将为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x108或1x 109个的量的总CD4+ T细胞或总活CD4+ T细胞与为或约为5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5.5x 108或1x 109个的量的总CD8+ T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合以产生具有限定比率的CD27+/CCR7+/CD4+T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的输入细胞组合物。在某些实施方案中，将在5x 105个与1x1010个之间、1x 106个与1x 1010个之间、在1x107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x108个之间的总CD4+ T细胞或总活CD4+ T细胞与为或约为在5x 105个与1x 1010个之间、1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的总CD8+T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的输入细胞组合物。
在特定实施方案中，与样品(例如，生物样品)的CD27+/CCR7+/CD4+T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率相比，输入细胞组合物的CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率已经被调整、变化和/或改变。在特定实施方案中，CD27+/CCR7+/CD4+T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率与生物样品相比的调整、变化或改变为或为约或为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。在某些实施方案中，样品是从其中衍生、分离、选择和/或获得输入细胞组合物的细胞的样品。
在某些实施方案中，输入细胞组合物含有一定比率(例如限定比率、受控比率和/或固定比率)的CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/C D8+ T细胞。在特定实施方案中，CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/C CR7+/CD8+ T细胞的比率是在10:1与0.05:1之间、在8:1与0.1:1之间、在5:1与0.2:1之间、在2.5:1与0.25:1之间、在2.2:1与0.8:1之间、在2:1与0.5:1之间或在1.5:1与1:1之间，包含端值。在特定实施方案中，CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率是在2:1与0.8:1之间、在1.6:1与0.8:1之间、在1.4:1与0.8:1之间、在1.2:1与0.8:1之间或在1.2:1与0.8:1之间，包含端值。在一些实施方案中，所述比率是在2.2:1与0.8:1之间，包含端值。在某些实施方案中，CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率为或为约2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1或0.8:1。在某些实施方案中，所述比率为或为约1.1:1。
在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x108个之间的总细胞或总活细胞。在某些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的表达CD4或CD8的细胞。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或约为在1x 106个与1x1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的CD62L-/CCR7+/CD4+和CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，输入细胞组合物具有或含有至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的CD62L-/CCR7+细胞。在特定实施方案中，输入细胞组合物含有或包括不超过100％、不超过99％、不超过98％、不超过97％、不超过96％、不超过95％、不超过90％或不超过85％的CD62L-/CCR7+细胞。
在一些实施方案中，将为或约为1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x108、1.1x108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x108、3.0x 108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5x 108或1x 109个的量的总CD4+ T细胞或总活CD4+ T细胞与为或约为1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x108、3.5x 108、4.0x 108、4.5x 108、5x 108、5.5x108或1x 109个的量的总CD8+ T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的输入细胞组合物。在某些实施方案中，将在1x 106个与1x 1010个之间、在1x107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108之间或在1x 108个与3x 108个之间的总CD4+ T细胞或总活CD4+ T细胞与为或约为在1x 106个与1x 1010个之间、在1x 107个与1x 109个之间、在5x 107个与5x 108个之间或在1x 108个与3x 108个之间的量的总CD8+ T细胞或总活CD8+ T细胞混合或组合，以产生具有限定比率的CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的输入细胞组合物。
在特定实施方案中，与样品(例如，生物样品)的CD62L-/CCR7+/CD4+T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率相比，输入细胞组合物的CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率已经被调整、变化和/或改变。在特定实施方案中，CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率与生物样品相比的调整、变化或改变为或为约或为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。在某些实施方案中，样品是从其中衍生、分离、选择和/或获得输入细胞组合物的细胞的样品。
在一些实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：混合或组合CD4+ T细胞组合物的细胞与CD8+ T细胞组合物的细胞，以产生具有在2.2:1至0.8:1之间的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率的输入细胞组合物。在特定实施方案中，在混合或组合之前，在CD4+ T细胞组合物和CD8+ T细胞组合物中对CD45RA+/CCR7+细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或量、水平或百分比进行测量、评估和/或定量。在一些实施方案中，通过检测CD45RA+；CCR7+ T细胞对CD45RA+/CCR7+细胞的量、水平、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在2.2:1至0.8:1之间的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或为约1.1:1的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率。
在一些实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：混合或组合CD4+ T细胞组合物的细胞与CD8+ T细胞组合物的细胞，以产生具有在2.4:1至1:1之间的CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率的输入细胞组合物。在特定实施方案中，在混合或组合之前，在CD4+ T细胞组合物和CD8+ T细胞组合物中对CD27+/CCR7+细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或量、水平或百分比进行测量、评估和/或定量。在一些实施方案中，通过检测CD45RA+；CCR7+ T细胞对CD27+/CCR7+细胞的量、水平、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在2.4:1至1:1之间的CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或为约1.69:1的CD27+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD27+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率。
在一些实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：混合或组合CD4+ T细胞组合物的细胞与CD8+ T细胞组合物的细胞，以产生具有在2.2:1至0.8:1之间的CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率的输入细胞组合物。在特定实施方案中，在混合或组合之前，在CD4+ T细胞组合物和CD8+ T细胞组合物中对CD62L-/CCR7+细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或量、水平或百分比进行测量、评估和/或定量。在一些实施方案中，通过检测CD62L-/CCR7+ T细胞对CD62L-/CCR7+细胞的量、水平、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在2.2:1至0.8:1之间的CD62L-/CCR7+/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7+/CD8+ T细胞的比率。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或为约1.1:1的CD62L-/CCR7/CD4+ T细胞与CD62L-/CCR7/CD8+T细胞的比率。
在一些实施方案中，产生、生成和/或制备输入细胞组合物包括以下一个或多个步骤：混合或组合CD4+ T细胞组合物的细胞与CD8+ T细胞组合物的细胞，以产生具有在2.2:1至0.8:1之间的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率的输入细胞组合物。在特定实施方案中，在混合或组合之前，在CD4+ T细胞组合物和CD8+ T细胞组合物中对幼稚样细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或量、水平或百分比进行测量、评估和/或定量。在一些实施方案中，通过检测CD45RA+；CCR7+ T细胞对幼稚样细胞的量、水平、数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比进行测量、评估和/或定量。在特定实施方案中，输入细胞组合物具有在2.2:1至0.8:1之间的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率。在一些实施方案中，输入细胞组合物具有为或为约1.1:1的CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+ T细胞的比率。
B.细胞的激活或刺激
在一些实施方案中，在基因工程化的过程之前、与基因工程化的过程结合和/或在基因工程化的过程之后，孵育和/或培养细胞。在某些实施方案中，在与基因工程化方案或过程相关的一个或多个步骤之前、期间或之后立即孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括在刺激或激活条件下孵育细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，将细胞孵育持续或持续约15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或大于7天。在一些实施方案中，将细胞孵育持续5分钟与90分钟之间、1小时与4小时之间、2小时与8小时之间、6小时与24小时之间、12小时与48小时之间、16小时与32小时之间、18小时与30小时之间、1天与4天之间或2天与7天之间。在一些实施方案中，将细胞孵育持续2与15天之间、2与12天之间、2与10天之间、2与8天之间、2与6天之间、2与4天之间、4与12天之间、4与10天之间、4与8天之间、4与6天之间、6与12天之间、6与10天之间、6与8天之间、8与12天之间、8与10天之间或10与12天之间。在一些实施方案中，将细胞孵育持续至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或大于14天。
在一些实施方案中，通过包括用于基因转移的一个或多个步骤的方法或工艺对细胞进行基因工程化。在一些实施方案中，基因转移是通过以下方式来完成：首先刺激细胞，如通过在刺激条件下孵育细胞，例如将细胞与诱导如增殖、存活和/或激活的应答的刺激物一起孵育，之后进行基因转移。在一些实施方案中，在基因转移之前，出于激活细胞的目的，在刺激条件下孵育细胞。在一些实施方案中，基因转移是或包括被激活细胞的转导。在特定实施方案中，刺激剂或条件诱导和/或能够诱导细胞的初级信号、信号传导、刺激、激活和/或扩增。
在一些实施方案中，在基因转移之前，在刺激或激活条件下孵育细胞(例如，输入细胞组合物的细胞)。在一些实施方案中，将细胞在刺激或激活条件下孵育持续或持续约15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或大于7天。在一些实施方案中，在基因转移之前，将输入细胞组合物的细胞在刺激或激活条件下孵育持续5分钟与90分钟之间、1小时与4小时之间、2小时与8小时之间、6小时与24小时之间、12小时与48小时之间、16小时与32小时之间、18小时与30小时之间、1天与4天之间或2天与7天之间。在特定实施方案中，将输入细胞组合物的细胞在刺激或激活条件下孵育持续2与15天之间、2与12天之间、2与12天之间、2与8天之间、2与6天之间、2与4天之间、4与12天之间、4与10天之间、4与8天之间、4与6天之间、6与12天之间、6与10天之间、6与8天之间、8与12天之间、8与10天之间或10与12天之间。在一些实施方案中，将细胞孵育持续至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或大于14天。
在一些实施方案中，在基因转移的一些或全部期间，在刺激或激活条件下孵育细胞。例如，在某些实施方案中，在转导或转染细胞以引入异源核酸的全部过程或一部分过程期间，在刺激条件下孵育细胞。在某些实施方案中，在病毒载体的存在下，在刺激或激活条件下孵育细胞，所述病毒载体例如逆转录病毒载体，如γ逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在特定实施方案中，例如，在基因转移后，立即在刺激或激活条件下孵育细胞。在一些实施方案中，在基因转移后，在刺激或激活条件下孵育细胞以扩增细胞，例如，将细胞扩增为足以用于临床应用的数量。在一些实施方案中，在基因转移后，将细胞在刺激或激活条件下孵育持续或持续约15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或大于7天。在一些实施方案中，在基因转移之前，在基因转移后，将细胞组合物在刺激或激活条件下孵育持续5分钟与90分钟之间、1小时与4小时之间、2小时与8小时之间、6小时与24小时之间、12小时与48小时之间、16小时与32小时之间、18小时与30小时之间、1天与4天之间或2天与7天之间。在一些实施方案中，在基因转移后，将组合物的细胞在刺激或激活条件下孵育持续2与15天之间、2与12天之间、2与12天之间、2与8天之间、2与6天之间、2与4天之间、4与12天之间、4与10天之间、4与8天之间、4与6天之间、6与12天之间、6与10天之间、6与8天之间、8与12天之间、8与10天之间或10与12天之间。在一些实施方案中，将细胞孵育持续至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或大于14天。在一些实施方案中，将细胞扩增足以产生适合于临床应用的细胞数量的时间长度。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或药剂诱导和/或能够诱导细胞的初级信号、信号传导、刺激、激活和/或扩增。
在一些实施方案中，刺激条件或药剂包括一种或多种药剂(例如配体)，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括抗体，如对TCR具有特异性的那些抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，所述刺激条件包括能够刺激共刺激受体的一种或多种药剂(例如，配体)，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以结合至固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在特定实施方案中，所述药剂是与重组受体特异性地结合的抗体。在特定实施方案中，重组受体是抗原结合受体，例如CAR，并且所述药剂是与抗原结合受体特异性地结合的抗独特型抗体。
在一些实施方案中，所述药剂和/或配体附着于磁珠，如顺磁珠(例如，如Dynal珠或MACS珠)。在某些实施方案中，可以通过以下方式从细胞去除所述珠：将细胞置于磁场中，由此将珠从细胞去除和/或分离，例如，使细胞脱珠。在某些实施方案中，在孵育以激活细胞后立即去除珠。在一些实施方案中，在例如通过转导或转染进行基因递送之前去除珠。在某些实施方案中，在基因递送期间去除珠或在基因递送之后立即去除珠。在特定实施方案中，在孵育以扩增细胞之前或期间去除珠。在一些实施方案中，在收获和/或低温保护细胞之前去除珠。
在一些方面，根据多种技术进行孵育，如以下文献中所述的那些：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前，将饲养细胞添加至培养基。
在一些实施方案中，所述刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞是以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)来提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚T淋巴细胞或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞。例如，可以通过从被感染受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。
C.基因工程化
在一些实施方案中，所提供的方法涉及生成或产生工程化细胞的组合物，例如，含有表达重组抗原受体的细胞的细胞组合物。用于引入基因工程化组分例如重组受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
在某些实施方案中，使输入细胞组合物的细胞与含有核酸(例如编码重组受体如CAR)的一种或多种药剂接触，和/或将所述一种或多种药剂引入输入细胞组合物的细胞中。在一些实施方案中，所述药剂是载体，例如，病毒载体、质粒或转座子。在一些实施方案中，细胞是CD4+ T细胞。在某些实施方案中，细胞是CD8+ T细胞。在特定实施方案中，将核酸引入细胞中和/或使细胞与核酸接触产生工程化细胞，所述工程化细胞具有限定比率、所需比率或固定比率的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的，如自然界中未发现的核酸，包括包含对来自多种不同细胞类型的各种结构域进行编码的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，制备方法包括用于以下的步骤：在用于基因工程化和/或产生含有基因工程化细胞的输出细胞组合物的任何步骤或阶段之前(如之前即刻)、期间、或之后(如之后即刻)，冷冻(例如，低温保存)细胞。在某些实施方案中，在分离或选择细胞、将细胞混合或组合为输入细胞组合物、孵育、激活、基因转移、转导、转染、扩增和/或收获的步骤之前、期间或之后，将细胞低温冷冻。在一些实施方案中，收集细胞的全部或一部分用于冷冻。在一些实施方案中，在将细胞基因工程化的工艺中的阶段或步骤之前、期间或之后，收集细胞的一部分用于之后或后续的分析，例如，如在将工程化细胞的组合物给予受试者之后的分析。
在一些实施方案中，冷冻和后续的解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如，在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，使所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
1.用于基因工程化的载体和方法
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒粒子(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550–557。在一些实施方案中，病毒是腺相关病毒(AAV)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括衍生自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干个物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒的gag、pol和/或env序列。已经描述了许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体粒子含有衍生自基于逆转录病毒基因组的载体(如衍生自慢病毒基因组或基于γ逆转录病毒的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的异源核酸含于和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516和5,994,136。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801UniversityBlvd.，Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体在本领域中是已知的，参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516和5,994,136。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.，Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可用于生成自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将这种缺失转移至原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有从3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被复制到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在转导的细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录后生成的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(例如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。也可以包括增强子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合的载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如使一个或两个附接位点突变或缺失来防止整合，或通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径；这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些途径并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述途径。例如，整合酶和附接位点二者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒粒子接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
在一些实施方案中，组合物中待转导的细胞的浓度为从或从约1.0x 105个细胞/mL至1.0x 108个细胞/mL，例如至少或约至少或约1.0x 105个细胞/mL、5x 105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x 106个细胞/mL、1x 107个细胞/mL、5x 107个细胞/mL或1x 108个细胞/mL。
在一些实施方案中，病毒粒子是以病毒载体粒子拷贝或其感染单位(IU)与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，病毒粒子在接触期间是以为或为约或至少为或为约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体粒子存在。
在一些实施方案中，病毒载体粒子的滴度在或在约1x 106IU/mL与1x108IU/mL之间，例如在或在约5x 10 6IU/mL与5x 107IU/mL之间，例如至少6x 106IU/mL、7x 106IU/mL、8x 106IU/mL、9x 106IU/mL、1x 107IU/mL、2x 107IU/mL、3x 107IU/mL、4x 107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100、例如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒粒子接触或孵育。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，例如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触可以通过离心、例如旋转接种(例如离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒粒子和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，例如速度低于用于沉淀细胞的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以为或为约100g至3200g(例如，为或为约或至少为或为约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在某些实施方案中，用包含结合分子的粒子对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，将重组核酸经由转座子转移到T细胞中。适合于与哺乳动物细胞(例如人原代白细胞)一起使用的转座子的例子包括但不限于睡美人(Sleeping Beauty)和Piggybac。基于转座子的转染是由转座酶和转座子组成的两组分系统。在一些实施方案中，将包含转座子的系统工程化成包含外来DNA(本文也称为货物DNA)(例如编码重组受体的基因)，其侧翼为由伴随的转座酶识别的反向重复/正向重复(IR/DR)序列。在一些实施方案中，非病毒质粒编码在启动子的控制下的转座酶。在一些实施方案中，将质粒转染至宿主细胞中导致以足以将转座子整合至基因组DNA中的水平瞬时表达转座酶。
睡美人(SB)是转座子的Tc/1-水手超家族的合成成员，是由鲑科鱼基因组中具有的休眠元件重新构建的。基于SB转座子的转染是一个由转座酶和转座子组成的两组分系统，所述转座子含有导致精确整合到TA二核苷酸中的反向重复/正向重复(IR/DR)序列。将转座子设计成具有侧翼为IR/DR的目标表达盒。SB转座酶结合位于睡美人转座子IR上的特异性结合位点。SB转座酶介导转座子的整合，所述转座子是编码货物序列的可移动元件，在所述货物序列的两侧都侧接着具有催化性酶(SB)结合位点的反向末端重复序列。当SB通过剪切粘贴机制将基因序列在TA靶二核苷酸处插入脊椎动物染色体中时，获得稳定的表达。已将此系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代外周血白细胞。在一些实施方案中，将细胞与SB转座子接触、与SB转座子一起孵育和/或用SB转座子处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码重组受体或CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含SB转座子的质粒接触、与包含SB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含SB转座子的质粒处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含侧翼没有SBIR序列的编码SB转座酶的基因。
PiggyBac(PB)是可以用于将货物DNA整合到宿主(例如人)的基因组DNA中的另一种转座子系统。PB转座酶识别位于转座子两个末端的PB转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且高效地将内容物从原始位点移出并将所述内容物高效地整合到TTAA染色体位点中。PB转座子系统使得能够将PB载体中两个ITR之间的目标基因移动到靶基因组中。已将PB系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代细胞。在一些实施方案中，将待转染的细胞与PB转座子接触、与PB转座子一起孵育、和/或用PB转座子处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含PB转座子的质粒接触、与包含PB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含PB转座子的质粒处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含侧翼没有PB IR序列的编码SB转座酶的基因。
在一些实施方案中，用包含转座酶基因的质粒和包含转座子的质粒进行用转座子的转导，所述转座子含有侧翼为由转座酶识别的反向重复/正向重复(IR/DR)序列的货物DNA序列。在某些实施方案中，货物DNA序列编码异源蛋白质，例如重组T细胞受体或CAR。在一些实施方案中，质粒包含转座酶和转座子。在一些实施方案中，转座酶在遍在启动子或适合于驱动转座酶在靶细胞中表达的任何启动子的控制下。遍在启动子包括但不限于EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、人β-肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIa和U6。在一些实施方案中，货物DNA包含选择盒，所述选择盒允许选择将货物DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。合适的选择盒包括但不限于编码以下的选择盒：卡那霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、红霉素抗性基因和多粘菌素B抗性基因。
在一些实施方案中，将用于用转座子转导的组分(例如包含SB转座酶和SB转座子的质粒)引入靶细胞中。可以采用任何方便的方案，其中取决于靶细胞的位置，所述方案可以将系统组分体外或体内引入靶细胞中。例如，在靶细胞是分离的细胞的情况下，可以例如通过使用标准转化技术，在容许靶细胞活力的细胞培养条件下将所述系统直接引入所述细胞中。此类技术包括但不必限于：病毒感染、转化、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送等。方法的选择通常取决于待转化的细胞的类型和发生转化的环境(即体外、离体或体内)。这些方法的一般性讨论可以在Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995中找到。
在一些实施方案中，在足以从携带转座子的载体上切下反向重复侧翼核酸并且随后将切下的核酸整合到靶细胞的基因组中的条件下，将SB转座子和SB转座酶来源引入多细胞生物体(例如哺乳动物或人)的靶细胞中。一些实施方案还包括确保必需的转座酶活性连同引入的转座子一起存在于靶细胞中的步骤。取决于转座子载体本身的结构，即载体是否包括编码具有转座酶活性的产物的区域，所述方法还可以包括将第二载体引入编码必需转座酶活性的靶细胞中。
在一些实施方案中，引入细胞中的包含转座子的载体核酸的量和编码转座酶的载体核酸的量足以提供所需的将转座子核酸切下并插入靶细胞基因组中。这样，引入的载体核酸的量应提供足够量的转座酶活性和足够拷贝数的期望插入靶细胞中的核酸。引入靶细胞中的载体核酸的量取决于所采用的特定引入方案(例如所采用的特定离体给予方案)的效率而变化。
一旦载体DNA与必需的转座酶组合进入了靶细胞，就经由所提供的转座酶从载体上切下侧翼为反向重复序列的载体核酸区域(即位于睡美人转座酶识别的反向重复序列之间的载体核酸)并将其插入靶细胞的基因组中。这样，载体DNA被引入靶细胞中后进行随后的转座酶介导的切除，并且由载体携带的外来核酸插入靶细胞的基因组中。在特定实施方案中，载体整合到至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％至少7％至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、或至少20％的用SB转座子和/或SB转座酶转染的细胞的基因组中。在一些实施方案中，核酸整合到靶细胞基因组中是稳定的，即，载体核酸保持存在于靶细胞基因组中持续超过瞬时时间段，并且一部分染色体遗传物质传递到靶细胞的后代。
在某些实施方案中，转座子用于将各种大小的核酸(即多核苷酸)整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约0.1kb至200kb、从约0.5kb至100kb、从约1.0kb至约8.0kb、从约1.0至约200kb、从约1.0至约10kb、从约10kb至约50kb、从约50kb至约100kb、或从约100kb至约200kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA的大小范围是从约1.0kb至约8.0kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约200kb。在特定实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如，T细胞)进行转染。例如，用于引入所需受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如，抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。这种第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原性刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如，CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如，通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors forT-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66；或Barrett等人,ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情况下，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在所述培养的至少一部分的同时或期间将所述细胞工程化。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改进治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用于提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改进安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择敏感，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，所述文献描述了使用通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而衍生的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
2.重组受体
在一些实施方案中，用于所提供的方法中或与所提供的方法结合给予的细胞含有或被工程化以含有工程化受体，例如工程化抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR))或T细胞受体(TCR)。还提供了此类细胞的群体、含有此类细胞和/或富集此类细胞的组合物，如其中富集或选择了某种类型的细胞，如T细胞或者CD8+或CD4+ T细胞。组合物包括用于给予(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。还提供用于根据所提供方法和/或用所提供的制品或组合物将细胞和组合物给予受试者(例如，患者)的方法。
在一些实施方案中，细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并由此表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将所述细胞与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达所测量的)的刺激物组合，然后转导被激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
所述细胞通常表达重组受体，如抗原受体(包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR))和其他抗原结合受体(如转基因T细胞受体(TCR))。所述受体还包括其他嵌合受体。
a.嵌合抗原受体(CAR)
在所提供的方法和用途的一些实施方案中，嵌合受体(如嵌合抗原受体)含有一个或多个结构域，所述一个或多个结构域将提供针对所期望抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是激活性细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，从而提供初级激活信号。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改进的寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继细胞治疗方法。
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达对特定抗原(或标记或配体)具有特异性的CAR，所述特定抗原例如为在特定细胞类型的表面上表达的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是多肽。在一些实施方案中，所述抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，如与正常或非靶向细胞或组织相比，所述抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，所述抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定实施方案中，所述重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区域，所述细胞内信号传导区域包括胞质信号传导结构域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域)，如能够在T细胞中诱导初级激活信号的胞质(细胞内)区域，例如T细胞受体(TCR)组分的胞质信号传导结构域(例如CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分)；和/或所述细胞内信号传导区域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
在一些实施方案中，所述嵌合受体还含有与配体(例如抗原)抗原特异性地结合的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，所述嵌合受体是CAR，所述CAR含有与抗原特异性地结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述CAR是TCR样CAR，并且所述抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括例如国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO2013/166321、WO 2013/071154、WO2013/123061；美国专利申请公开号US 2002131960、US2013287748、US20130149337；美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118；以及欧洲专利申请号EP 2537416中描述的那些，和/或Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75描述的那些。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。所述CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物是例如WO 2014031687、US 8,339,645、US7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；以及Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，所述CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原是例如在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如，癌症标记)和/或旨在诱导衰减应答的抗原(如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，所述CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或者一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，所述CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物展现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或接近于通过天然抗原受体(如TCR)的信号，以及任选地通过这种受体与共刺激受体的组合的信号。
在一些实施方案中，所述重组受体(如嵌合受体(例如CAR))包括与抗原(或配体)结合(如特异性地结合)的配体结合结构域。所述嵌合受体靶向的抗原包括在经由过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的背景下表达的抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，所述抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，如与正常或非靶向细胞或组织相比，所述抗原(或配体)在所述疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，所述抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，所述CAR含有抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)。
在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是或包括孤儿酪氨酸激酶受体(ROR1)、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素(MSLN)、癌胚抗原(CEA)和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、叶酸结合蛋白(FBP)、Fc受体样5(FCRL5，也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、B7-H3、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、CD171、叶酸受体-α、CD44v7/8、αvβ6整合素(avb6整合素)、8H9、神经细胞粘附分子(NCAM)、血管内皮生长因子受体(VEGF受体或VEGFR)、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、NKG2D配体、CD44v6、双抗原、癌症-睾丸抗原、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、黑色素A(MART-1)、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、癌胚胎抗原、TAG72、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ-异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)、癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕酮受体、前列腺特异性抗原、肝配蛋白B2、CD123、CD133、c-Met、O-乙酰化GD2(OGD2)、L1-CAM的CE7表位、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD138、病原体特异性抗原或病原体表达的抗原、和与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是CD19。在一些实施方案中，scFv含有衍生自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠衍生的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段是人抗体，例如，如美国专利公开号US 2016/0152723中所披露。
在一些实施方案中，scFv衍生自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.,等人(1987).Leucocytetyping III.302)。FMC63抗体包含SEQ ID NO:38、39分别所示的CDRH1和H2，和SEQ ID NO:40或54所示的CDRH3，和SEQ ID NO:35所示的CDRL1，和CDR L2 36或55，以及CDR L3序列37或34。FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，svFv包含含有SEQ ID NO:35的CDRL1序列、SEQ ID NO:36的CDRL2序列和SEQ ID NO:37的CDRL3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDRH1序列、SEQ ID NO:39的CDRH2序列和SEQ ID NO:40的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41所示的FMC63可变重链区和SEQ ID NO:42所示的FMC63可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头示于SEQ ID NO:56中。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，svFc由SEQ IDNO:57所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:57至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:43至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv衍生自SJ25C1。SJ25C1是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.,等人(1987).Leucocytetyping III.302)。SJ25C1抗体包含SEQ ID NO:47-49分别所示的CDRH1、H2和H3，以及SEQID NO:44-46分别所示的CDRL1、L2和L3序列。所述SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，svFv包含含有SEQ ID NO:44的CDRL1序列、SEQ ID NO:45的CDRL2序列和SEQID NO:46的CDRL3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:47的CDRH1序列、SEQ ID NO:48的CDRH2序列和SEQ ID NO:49的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ IDNO:50所示的SJ25C1可变重链区和SEQ ID NO:51所示的SJ25C1可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头示于SEQ ID NO:52中。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或展现出与SEQ IDNO:53至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有衍生自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有衍生自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，所述CAR含有TCR样抗体，如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，所述抗体或抗原结合片段特异性地识别作为MHC-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物展现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有可由T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，其具有跨越α链的膜，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(如通常是CD8+ T细胞，但是在一些情况下是CD4+ T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中所述肽通常由CD4+ T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在小鼠中统称为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，所述MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，所述MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性地识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽的长度为从或从约9至22个氨基酸，用于在MHC II类复合物中识别。在一些实施方案中，所述肽的长度为从或从约8至13个氨基酸，用于在MHC I类复合物中识别。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)背景中的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如，美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US2006/0034850；US 2007/00992530；US20090226474；US20090304679；和国际PCT公开号WO03/068201)。
在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，所述MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原的表位，所述抗原例如为肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主给予有效量的免疫原以用于引发免疫应答，其中所述免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在所述MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间。然后测定从所述宿主收集的血清以确定是否产生了识别对MHC分子结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目标肽、以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性地结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以生成突变型Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如美国公开申请号US 20020150914、US 2014/0294841；以及Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括抗原结合的片段(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，所述抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，所述抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，所述CAR包含特异性结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原是例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，如本文所述的或本领域已知的任何靶抗原。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可以不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗体的变体，其经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
因此，在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述重组受体(如CAR，如其抗体部分)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，所述重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，所述恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，所述恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔区。与不存在间隔子的情况下相比，所述间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。在一些例子中，所述间隔子的长度为或约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于在Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153，或国际专利申请公开号WO 2014031687中描述的那些。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQID NO:1所示的序列，并且由SEQ ID NO:2所示的序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:3所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:4所示的序列。
在一些实施方案中，所述恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有展现出与SEQ ID NO:1、3、4和5中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:23-31所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有展现出与SEQ ID NO:23-31中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原受体包含与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，抗原识别结构域(例如细胞外结构域)与一种或多种细胞内信号传导组分连接，所述细胞内信号传导组分如模拟在CAR的情况下通过抗原受体复合物(如TCR复合物)进行激活和/或经由另一种细胞表面受体结构域进行信号传导的信号传导组分。在一些实施方案中，嵌合受体包含在细胞外结构域(例如，scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导区域连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与所述细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与所述受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域衍生自天然来源或衍生自合成来源。在所述来源是天然的情况下，所述结构域在一些方面衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自以下的那些(即至少包含以下的一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面，所述合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成跨膜结构域的每个末端会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接是通过接头、间隔子和/或一种或多种跨膜结构域来实现。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。
在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，所述受体含有衍生出跨膜结构域的分子的细胞外部分，如CD28细胞外部分。
所述细胞内信号传导结构域包括通过天然抗原受体模拟或接近信号、通过这种受体与共刺激受体的组合模拟或接近信号、和/或仅通过共刺激受体模拟或接近信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个氨基酸之间的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
所述受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，所述受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，ROR1结合抗体与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR后，所述受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情境下，所述CAR诱导T细胞的功能，如细胞裂解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区域的截短部分(例如如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体协同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情境下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，所述CAR中还包括用于产生次级或共刺激信号的组分。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，T细胞激活被描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞质信号传导序列)以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，所述CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，所述CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括衍生自TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，所述CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有衍生自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，所述CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导区域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR包括信号传导区域和共刺激组分。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有衍生自T细胞共刺激分子的细胞内结构域或其功能变体，如位于跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，所述信号传导区域和/或激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，所述细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，所述细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，借此通过抑制性CAR与其配体的结合来减小或抑制通过靶向疾病的CAR递送的激活信号，例如，以减小脱靶效应。
在某些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，所述CAR涵盖在胞质部分中的一种或多种(例如，两种或更多种)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所述抗原受体还包括标记，和/或表达CAR或其他抗原受体的细胞还包括替代标记如细胞表面标记，所述替代标记可以用于证实细胞被转导或工程化以表达受体。在一些方面，所述标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)，如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短形式，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括生长因子或其他受体的截短形式，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，SEQ ID NO:7或16所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有由抗体西妥昔单抗
Figure BDA0002439290640000781
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，所述表位可以用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和所编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434。在一些方面，所述标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如截短形式的)CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。在一些实施方案中，所述标记是或包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP，如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP，如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，所述标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，所述标记是选择标记。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含赋予针对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博来霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687中所披露的任一种。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ IDNO:7或16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如，MMP可切割接头序列)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记以及任选地接头序列可以是如公开的专利申请号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。
在一些实施方案中，所述标记是并未在T细胞上天然发现的或并未在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被宿主的免疫系统识别为“自身”的分子，所述细胞将被过继转移至所述宿主中。
在一些实施方案中，所述标记不起任何治疗作用和/或不产生除了用作基因工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内将遇到的细胞的配体，如共刺激性或免疫检查点分子，以在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱所述细胞的应答。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是在一些方面包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且所述细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，所述细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。所述细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，所述CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)、以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，所述受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链的间隔子。
在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的一部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:10或11至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:12至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激性信号传导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:13、14或15至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，所述间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ IDNO:1中所示的仅铰链的间隔子。在其他实施方案中，所述间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3中所示。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4中所示。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28衍生的跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、CD28衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv)、间隔子(如任何含有Ig铰链的间隔子)、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ衍生的信号传导结构域。
在一些实施方案中，编码此类CAR构建体的核酸分子例如在编码CAR的序列的下游还包括编码T2A核糖体跳跃元件的序列和/或tEGFR序列。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:6或17所示的T2A核糖体跳跃元件或展现出与SEQ ID NO:6或17至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，还可以产生表达抗原受体(例如CAR)的T细胞以表达作为非免疫原性选择表位的截短EGFR(EGFRt)(例如通过引入编码被T2A核糖体开关隔开的CAR和EGFRt以从相同构建体表达两种蛋白质的构建体)，然后所述非免疫原性选择表位可以用作检测此类细胞的标记(参见例如美国专利号8,802,374)。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:7或16所示的tEGFR序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，肽(如T2A)可以导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，从而导致2A序列末端与下游的下一个肽之间的分离(参见例如，deFelipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如，SEQ ID NO:22)、马鼻炎A病毒(E2A，例如，SEQ ID NO:21)、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus，T2A，例如，SEQ IDNO:6或17)和猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(P2A，例如，SEQ ID NO:19或20)，如美国专利公开号20070116690中所述。
由给予受试者的细胞表达的重组受体(如CAR)通常识别或特异性结合至在所治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与所治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或为所治疗的疾病或病症或其细胞特有的分子。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向所述疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，细胞表达CAR，所述CAR特异性地结合至由疾病或病症的细胞或组织表达或与所述疾病或病症相关的抗原。
b.嵌合自身抗体受体(CAAR)
在一些实施方案中，由与所提供的方法、用途、制品和组合物结合使用的工程化细胞表达的重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR对自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(如工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于特异性结合并杀死表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫疾病，如自身免疫疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示所述自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为用于治疗干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀死自身免疫疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAAR，如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任一种。
在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含次级或共刺激信号传导区域(次级细胞内信号传导区域)。
在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，可以因为自身抗原识别与特定疾病状态(例如自身免疫疾病，如自身抗体介导的自身免疫疾病)相关的靶细胞(如B细胞)上的自身抗体而选择所述自身抗原。在一些实施方案中，自身免疫疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
c.多靶向
在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品和组合物结合使用的细胞包括采用多靶向策略的细胞。在一些实施方案中，所述细胞在细胞上表达多链嵌合抗原受体(CAR)或者表达两种或更多种基因工程化受体，所述受体各自识别相同或不同的抗原并且通常各自包括不同的细胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO2014055668A1(描述激活和共刺激CAR的组合，例如，靶向在脱靶(例如，正常细胞)上单独存在，但仅在要治疗的疾病或病症的细胞上一起存在的两种不同抗原)和Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013)(描述表达激活和抑制性CAR的细胞，如其中激活CAR结合至在正常或未患病细胞和要治疗的疾病或病症的细胞二者都上表达的一种抗原，并且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不需要治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些)。
例如，在一些实施方案中，所述细胞包括表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，所述受体通常在特异性地结合至由第一受体识别的抗原(例如，第一抗原)后能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞还包括第二基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR，例如嵌合共刺激受体)，所述受体通常在特异性地结合至由第二受体识别的第二抗原后能够诱导共刺激信号至免疫细胞。在一些实施方案中，所述第一抗原与所述第二抗原是相同的。在一些实施方案中，所述第一抗原与所述第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，所述第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如CAR或TCR)能够诱导激活信号至所述细胞。在一些实施方案中，所述受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及细胞中的信号转导或蛋白质表达的变化，从而导致免疫应答的起始(如ITAM磷酸化)和/或ITAM介导的信号转导级联的起始、免疫突触的形成和/或所结合受体(例如CD4或CD8等)附近的分子的聚簇、一种或多种转录因子(如NF-κB和/或AP-1)的激活、和/或诸如细胞因子的因子的基因表达的诱导、增殖和/或存活。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体(如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS)的细胞内信号传导结构域或区域。在一些实施方案中，第一和第二受体包括不同的共刺激受体的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区域，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号传导区域，或反之亦然。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第一受体含有包含ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域，并且所述第二受体含有共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在同一细胞中诱导的激活信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答是例如稳健且持续的免疫应答，如增加的基因表达、细胞因子和其他因子的分泌、以及T细胞介导的效应子功能(如细胞杀伤)。
在一些实施方案中，仅第一受体的连接和仅第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面，如果仅连接一种受体，则细胞变得耐受抗原或对抗原无反应，或被抑制，和/或不会被诱导增殖或分泌因子或执行效应子功能。然而，在一些此类实施方案中，在连接多种受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时，实现了所需应答，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或执行免疫效应子功能(如对靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示的。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的结合激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导了抑制或减弱该应答的信号。例子是激活性CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。例如，可以使用这种策略，其中激活性CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些实施方案中，多靶向策略用于如下情况：其中与特定疾病或病症相关的抗原是瞬时地(例如，在与基因工程化相关的刺激后)或永久地在未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达。在此类情况下，由于需要连接两种分开的和单独特异性的抗原受体，特异性、选择性和/或功效可以得到改进。
在一些实施方案中，多种抗原(例如，第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或者疾病或病症上(如在癌细胞上)表达。在一些方面，所述细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(如正常或未患病细胞或组织)和/或工程化细胞本身上表达。在此类实施方案中，由于需要连接多种受体以实现细胞应答，特异性和/或功效得以实现。
d.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且所述分子或其抗原结合部分能够与结合至MHC分子的肽特异性地结合。在一些实施方案中，所述TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR的结构上大体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，所述TCR是如下抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与对肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区上的用于所述肽-MHC复合物的加工肽部分的抗原识别和/或用于与所述肽-MHC复合物的加工肽部分相互作用的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,Public HealthService National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定域或Cα，通常基于Kabat编号的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。所述TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接所述TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得所述TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，所述TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，所述TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将所述蛋白质锚定在细胞膜中并与所述CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，所述TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，所述TCR是含有两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
在一些实施方案中，所述TCR可以从一种或多种已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)生成，所述一种或多种已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码所述TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，所述TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，所述T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，所述TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，所述TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，所述T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对TCR序列的了解以合成方式生成。
在一些实施方案中，所述TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR生成的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来生成，所述T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+ T细胞产生TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如在从人获得的样品(如T细胞)中通过RT-PCR扩增。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增的产物被克隆或组装为通过接头隔开。根据受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化生成。在一些方面，使所述TCR经历例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，所述TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰选择的TCR。在一些实施方案中，可以如通过筛选以评估针对所述肽的CTL活性来选择抗原特异性T细胞。在一些方面，可以如通过结合活性(例如对所述抗原的特定亲和力或亲合力)来选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR。
在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分是已经被修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来生成具有改变的特性(如具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和力)的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法来实现定向进化，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人，(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)ProcNatl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)、或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，可以使用野生型TCR作为模板用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基发生突变，并且选择具有所需的改变特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目标TCR的靶多肽的肽是已知的或者可以容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目标靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)，以及SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in MolecularBiology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是已知的。对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于以下文献中：Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR bindingsites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-12372001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,第409卷(1):75-93 2007)。
在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已经发生改变。在一些实施方案中，TCR可以衍生自各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，所述TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，所述TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR能够形成与CD3的TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，所述TCR是在细胞表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。在一些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至所述恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；和TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至所述恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在所述第一二聚化基序的氨基酸与所述第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将所述TCRα链与所述TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，所述TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法产生scTCR，参见例如，Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO99/60120、WO99/18129、WO 03/020763、WO2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开的PCT号WO03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开的PCT号WO99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列(融合至对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端)构成的第二区段，和将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有由融合至α链细胞外恒定结构域序列N末端的α链可变区序列构成的第一区段，和由融合至序列β链细胞外恒定和跨膜序列N末端的β链可变区序列构成的第二区段，以及任选地将所述第一区段C末端连接至所述第二区段N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有由融合至β链细胞外恒定结构域序列N末端的TCRβ链可变区序列构成的第一区段，和由融合至序列α链细胞外恒定和跨膜序列N末端的α链可变区序列构成的第二区段，以及任选地将所述第一区段C末端连接至所述第二区段N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR中连接所述第一和第二TCR区段的接头可以是能够在保持TCR结合特异性的同时形成单一多肽链的任何接头。在一些实施方案中，所述接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA表示氨基酸序列，其中所述氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，所述第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不会太长而阻断或减少所述scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从或从约10个至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26个至41个氨基酸残基，例如29个、30个、31个或32个氨基酸。在一些实施方案中，接头具有式-PGGG-(SGGG G)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:32)。在一些实施方案中，接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:33)。
在一些实施方案中，所述scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入所述scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。
在dTCR或scTCR含有引入的链间二硫键的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，将形成天然链间二硫键的所述一个或多个天然半胱氨酸取代为另一种残基，如取代为丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现出亲和力，所述平衡结合常数是在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方法扩增，并且克隆到一种或多种合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，所述载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚(LaJolla,Calif.))、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图(Palo Alto,Calif.))。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备重组表达载体。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型具有特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，所述载体可以含有非天然启动子，其可操作地连接至编码所述TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想了其他已知的启动子。
在一些实施方案中，为了生成编码TCR的载体，将α和β链从表达目标TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并且将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所生成的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
D.输出细胞组合物的特征
在特定实施方案中，本文提供的方法产生或生成含有基因工程化细胞的细胞组合物，例如，输出细胞组合物。在某些实施方案中，输出细胞组合物是通过用于基因工程化细胞的一些或所有步骤得到的细胞组合物。在某些实施方案中，输出细胞组合物是从对输入细胞组合物的细胞进行基因工程化的工艺得到的。在某些实施方案中，工艺含有用于激活、转导或转染、扩增和/或收获细胞的一个或多个步骤，所述细胞如从输入细胞组合物获得的细胞。在某些实施方案中，输出细胞组合物含有已经被基因工程化的细胞。在特定实施方案中，输出细胞组合物的细胞已经经历基因工程化工艺的所有步骤。
在一些实施方案中，输出细胞组合物含有细胞，所述细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，所述核酸不是天然存在的，如自然界中未发现的核酸，包括包含对来自多种不同细胞类型的各种结构域进行编码的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，输出细胞组合物含有已经被基因工程化的细胞。在特定实施方案中，输出细胞组合物含有工程化的T细胞。在一些实施方案中，工程化的T细胞包括工程化的CD4+ T细胞和工程化的CD8+ T细胞。在特定实施方案中，输出细胞组合物含有或包括至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的工程化的T细胞。在某些实施方案中，工程化的细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出细胞组合物含有或包括至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％或约100％的表达重组受体的T细胞。在一些实施方案中，重组受体是TCR或CAR。在特定实施方案中，重组受体是CAR。
在某些实施方案中，输出细胞组合物具有在5:1至0.2:1之间、在4:1至0.25:1之间、在3:1至0.33:1之间、在2:1至0.5:1之间、在1.5:1至0.66:1之间或在1.25:1至0.8:1之间的工程化的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率。在特定实施方案中，输出细胞组合物具有在2:1至0.5:1之间的工程化的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率。在一些实施方案中，输出细胞组合物具有为或为约2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1或0.5:1的工程化的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率。在特定实施方案中，输出细胞组合物具有为或为约1:1的工程化的CD4+ T细胞与CD8+T细胞的比率。在特定实施方案中，工程化的T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出细胞组合物具有为或为约2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1或0.5:1的表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率。在特定实施方案中，输出细胞组合物具有为或为约1:1的表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率。在一些实施方案中，重组受体是TCR或CAR。在特定实施方案中，重组受体是CAR。
在一些实施方案中，所述方法产生输出细胞组合物，所述输出细胞组合物具有在这种限定比率、所需比率或固定比率的某一容忍差异或误差范围内的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率、表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率、和/或表达CAR的CD4+ T细胞与表达CAR的CD8+ T细胞的比率，和/或所述方法在某一百分比的进行所述方法的时间中，如在至少或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％的所述时间中产生这一比率。在一些实施方案中，容忍差异在所述比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％或约75％内。在一些方面，所述比率在所需比率的10％、20％或30％内，和/或在至少70％、80％或90％的进行所述方法的时间中在该比率内。在某些实施方案中，所述比率在至少90％的进行所述方法的时间中在1:1比率的50％内。
在一些实施方案中，工程化的、表达重组受体的和/或表达CAR的CD4+与CD8+ T细胞的容忍差异和/或限定比率是或已经通过以下方式来确定：将不同细胞类型如CD4+和CD8+ T细胞以多种测试比率或数量给予一个或多个受试者，并评估一种或多种参数。在一些方面，限定比率或固定比率或容忍差异的确定包括在给予受试者后评估一种或多种结果。在一些方面，所述结果包括选自以下的那些：疾病症状的改善，以及指示安全性和/或低毒性或不存在毒性的结果。
在某些实施方案中，通过本文提供的方法产生的输出细胞组合物具有在2:1与0.5:1之间的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率。在某些实施方案中，输出组合物含有比率为或为约1:1的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞。在一些实施方案中，输出细胞组合物是从本文所述的输入细胞组合物(例如，第I-A节中所述的输入细胞组合物)产生，并且具有在2:1与0.5:1之间的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率。在特定实施方案中，从输入细胞组合物产生的输出细胞组合物具有1:1的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率，且容忍差异为50％、25％、10％或更小。在某些实施方案中，工程化的T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，工程化的T细胞表达CAR。
II.组合物和配制品
本文提供了含有根据本文所述的孵育(例如，刺激)方法制备的细胞的组合物或配制品。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可以用于获得细胞的输出细胞组合物，所述输出细胞组合物具有限定的表达重组受体的CD4+与CD8+ T细胞的比率，如用作治疗性细胞组合物。本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的输出细胞组合物。
在一些实施方案中，使用本文所述的任何方法产生的细胞(例如，输出细胞组合物的细胞)是作为组合物来提供，包括药物组合物和配制品，如包括用于以给定剂量或其分数给予的细胞数量的单位剂型组合物。在特定实施方案中，用重组受体将输出细胞组合物的细胞基因工程化(例如，CAR-T细胞)。在某些实施方案中，药物组合物和配制品通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包括至少一种另外的治疗剂。
在一些实施方案中，细胞组合物(例如，输出细胞组合物)是出于细胞疗法的目的来产生或制造。在一些实施方案中，细胞组合物是药物组合物或配制品。此类组合物可以根据所提供的方法使用，例如，以评估其对于在疾病、病症和障碍的预防或治疗中、或在检测、诊断和预后方法中使用的释放。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对给予所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。在一些实施方案中，本文提供的方法可以用于比较由相同工程化细胞构成但具有不同的药物配制品的细胞组合物的表面聚糖表达。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在特定实施方案中，本文提供的方法可以用于比较由相同工程化细胞构成但具有不同的药学上可接受的载体的细胞组合物的表面聚糖表达。
在一些实施方案中，用药学上可接受的载体配制T细胞疗法(如工程化T细胞，例如，CAR T细胞)。在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。配制品或组合物还可以含有可用于用细胞预防或治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，包括其中活性与所述细胞互补和/或各自的活性不会互相造成不良影响的一种或多种活性成分。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药学活性剂或药物，如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞，例如输出细胞组合物的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，根据情况，重复治疗直至出现所需的对疾病症状的抑制为止。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注给予组合物、通过多次推注给予组合物、或通过连续输注给予组合物来递送。
可以将细胞(例如，输出细胞组合物的细胞)配制用于使用标准给予技术、配制品和/或装置来给予。提供了用于储存和给予组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，给予可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以从一个受试者获得，并将其给予同一受试者或不同但相容的受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射给予，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给予。当给予治疗组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，药剂或细胞群是肠胃外给予的。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方案中，药剂或细胞群是通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送给予受试者。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，所述无菌液体制剂在一些方面可以被缓冲至选择的pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更易于制备。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以是冻干的。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于所需的给予途径和制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保对微生物作用的防止。可以通过使用吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
用于体内给予的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于要治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、给予所述药剂或细胞是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对所述药剂或所述细胞的反应、以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将所述组合物一次或在一系列治疗中合适地给予受试者。
III.给予方法
还提供了细胞和组合物(如本文所述的输出组合物中存在的那些)在疾病、病症和障碍的治疗中的使用方法和用途，在所述疾病、病症和障碍中表达由重组受体(例如CAR)识别的抗原。本文还提供了治疗方法，其包括向受试者给予通过所述的任何工程化方法产生的输出细胞组合物。在一些实施方案中，所述方法包括使用本文所述的任何方法产生基因工程化的T细胞，如输出细胞组合物的基因工程化的T细胞，以及给予通过本文所述的方法产生的基因工程化的T细胞。
提供了给予工程化细胞和组合物的方法，以及此类工程化细胞和组合物用于治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症)的用途。所提供的方法和用途包括用于过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将工程化细胞或含有细胞(如来自如所述的输出组合物的细胞)的组合物给予受试者、组织或细胞，如患有、有风险患上或者被怀疑患有疾病、病症或障碍的受试者。在一些实施方案中，例如通过过继细胞疗法如过继T细胞疗法将细胞、群体和组合物给予患有要治疗的特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，将细胞或组合物给予受试者，如患有或者有风险患上疾病或病症的受试者，所述细胞或组合物改善所述疾病或病症的一种或多种症状，如通过减轻表达由工程化T细胞所识别抗原的癌症中的肿瘤负荷来改善。
在一些方面，所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达，和/或参与疾病、病症或障碍的病因，例如导致、加剧或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫疾病或炎性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。上文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的多种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，免疫调节多肽和/或重组受体(例如，嵌合抗原受体或TCR)特异性地结合至与疾病或病症相关的抗原。在一些实施方案中，受试者患有疾病、障碍或病症，任选地癌症、肿瘤、自身免疫疾病、障碍或病症或感染性疾病。
在一些实施方案中，疾病、障碍或病症包括与各种癌症相关的肿瘤。在一些实施方案中，癌症可以是位于受试者体内的任何癌症，例如但不限于位于头和颈、乳房、肝、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、脑、子宫颈、骨、皮肤、眼睛、膀胱、胃、食管、腹膜或肺的癌症。例如，抗癌剂可以用于治疗结肠癌、宫颈癌、中枢神经系统癌、乳腺癌、膀胱癌、肛门癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经内分泌癌、软组织癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、胆囊癌或食管癌。在一些情况下，癌症可以是血液癌。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤，如实体瘤、淋巴瘤、白血病、血液肿瘤、转移性肿瘤或其他癌症或肿瘤类型。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症选自结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。
疾病、病症和障碍包括：肿瘤，所述肿瘤包括实体瘤、血液学恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或淋巴母细胞性)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)，B细胞恶性肿瘤选自急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原选自孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、人白细胞抗原A(HLA-A1)、MAGE A1、HLA-A2、NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、αvβ6整合素(avb6整合素)、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、CD44v6、双抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、前列腺干细胞抗原(PSCA)、NKG2D、癌症-睾丸抗原癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、MART-1、糖蛋白100(gp100)、癌胚胎抗原、ROR1、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，抗原或配体是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，抗原或配体抗原是或包括孤儿酪氨酸激酶受体(ROR1)、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素(MSLN)、癌胚抗原(CEA)和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、叶酸结合蛋白(FBP)、Fc受体样5(FCRL5，也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、B7-H3、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、CD171、叶酸受体-α、CD44v7/8、αvβ6整合素(avb6整合素)、8H9、神经细胞粘附分子(NCAM)、血管内皮生长因子受体(VEGF受体或VEGFR)、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、NKG2D配体、CD44v6、双抗原、癌症-睾丸抗原、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、黑色素A(MART-1)、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、癌胚胎抗原、TAG72、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ-异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)、癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕酮受体、前列腺特异性抗原、肝配蛋白B2、CD123、CD133、c-Met、O-乙酰化GD2(OGD2)、L1-CAM的CE7表位、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD138、病原体特异性抗原或病原体表达的抗原、和与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。在一些方面，疾病或病症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些情况下，疾病或病症是NHL(例如或包括作为侵袭性NHL的NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B))。在一些方面，重组受体如CAR特异性地结合至与疾病或病症相关或者在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些方面，重组受体如CAR特异性地结合至与疾病或病症相关或在与多发性骨髓瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，由受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原，如GPRC5D或BCMA。
在一些实施方案中，抗原是病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，基于细胞的疗法是或包括给予细胞如T细胞，所述细胞靶向在病灶如肿瘤或癌症的表面上表达的分子。在一些实施方案中，免疫细胞表达T细胞受体(TCR)或其他抗原结合受体。在一些实施方案中，免疫细胞表达重组受体，如转基因TCR或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，细胞对受试者而言是自体的。在一些实施方案中，细胞对受试者而言是同种异体的。
用于过继细胞疗法的工程化细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞疗法描述于例如以下文献中：授予Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85。参见例如，Themeli等人,(2013)NatBiotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人,(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人,(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从要接受所述细胞疗法的受试者或从衍生自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞衍生自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将所述细胞给予同一受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从要接受或最终接受所述细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者与第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。细胞可以通过任何合适的手段来给予。给药和给予可以部分取决于给予是短暂的还是长期的。各种给药时间表包括但不限于在不同时间点的单次或多次给予、推注给予和脉冲输注。
在一些实施方案中，所提供的方法包括向受试者给予输出细胞组合物(如第I节中所述的细胞组合物)的细胞的一个或多个步骤。在某些实施方案中，输出细胞组合物的细胞包括工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞。在一些实施方案中，工程化CD4+和CD8+ T细胞表达T细胞受体(TCR)或其他抗原结合受体。在一些实施方案中，免疫细胞表达重组受体，如转基因TCR或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，输出细胞组合物的细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，细胞对受试者而言是同种异体的。
在某些实施方案中，将输出细胞组合物的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在相同组合物、剂量或混合物中给予受试者。因此，在一些实施方案中，将表达重组受体的CD4+ T细胞和表达重组受体的CD8+ T细胞(例如，CAR+CD4+和CAR+CD8+)在相同组合物、剂量或混合物中给予受试者。
在某些实施方案中，将细胞(例如，输出细胞组合物或细胞亚型的单独群体的细胞)以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重的所述细胞量的范围给予受试者，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包括少于约1x 108个表达重组受体(例如，CAR)的总细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在约1x 106至1x108个此类细胞的范围内，如2x 106、5x106、1x 107、5x 107或1x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约1x 105至5x108个表达CAR的总T细胞、1x 105至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、1x 105至1x 108个表达CAR的总T细胞、1x 105至5x 107个表达CAR的总T细胞、1x105至2.5x 107个表达CAR的总T细胞、1x 105至1x 107个表达CAR的总T细胞、1x 105至5x 106个表达CAR的总T细胞、1x 105至2.5x 106个表达CAR的总T细胞、1x 105至1x 106个表达CAR的总T细胞、1x 106至5x 108个表达CAR的总T细胞、1x 106至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、1x 106至1x 108个表达CAR的总T细胞、1x 106至5x 107个表达CAR的总T细胞、1x 106至2.5x 107个表达CAR的总T细胞、1x 106至1x 107个表达CAR的总T细胞、1x 106至5x106个表达CAR的总T细胞、1x 106至2.5x 106个表达CAR的总T细胞、2.5x 106至5x 108个表达CAR的总T细胞、2.5x 106至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、2.5x 106至1x 108个表达CAR的总T细胞、2.5x 106至5x 107个表达CAR的总T细胞、2.5x 106至2.5x 107个表达CAR的总T细胞、2.5x 106至1x 107个表达CAR的总T细胞、2.5x 106至5x106个表达CAR的总T细胞、5x 106至5x 108个表达CAR的总T细胞、5x 106至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、5x 106至1x 108个表达CAR的总T细胞、5x 106至5x 107个表达CAR的总T细胞、5x 106至2.5x 107个表达CAR的总T细胞、5x 106至1x 107个表达CAR的总T细胞、1x 107至5x 108个表达CAR的总T细胞、1x 107至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、1x 107至1x 108个表达CAR的总T细胞、1x 107至5x 107个表达CAR的总T细胞、1x 107至2.5x 107个表达CAR的总T细胞、2.5x 107至5x 108个表达CAR的总T细胞、2.5x 107至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、2.5x 107至1x108个表达CAR的总T细胞、2.5x 107至5x 107个表达CAR的总T细胞、5x 107至5x108个表达CAR的总T细胞、5x 107至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、5x 107至1x 108个表达CAR的总T细胞、1x 108至5x 108个表达CAR的总T细胞、1x 108至2.5x 108个表达CAR的总T细胞、或2.5x 108至5x 108个表达CAR的总T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x 105个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x 105个表达CAR的细胞、至少或至少约5x 105个表达CAR的细胞、至少或至少约1x 106个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x 106个表达CAR的细胞、至少或至少约5x 106个表达CAR的细胞、至少或至少约1x 107个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x107个表达CAR的细胞、至少或至少约5x 107个表达CAR的细胞、至少或至少约1x 108个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x 108个表达CAR的细胞、或者至少或至少约5x 108个表达CAR的细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：从或从约1x 105至5x 108个表达重组受体的总细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，从或从约5x 105至1x 107个表达重组受体的总细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，或者从或从约1x 106至1x 107个表达重组受体的总细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂量包含以下细胞数量：至少或至少约1x 105个表达重组受体的总细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少1x 106、至少或至少约1x 107、至少或至少约1x 108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于表达重组受体(例如CAR+)的细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：从或从约1x 105至5x 108个CD3+或CD8+总T细胞或者表达重组受体的CD3+或CD8+细胞、从或从约5x 105至1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或者表达重组受体的CD3+或CD8+细胞、或者从或从约1x 106至1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或者表达重组受体的CD3+或CD8+细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量，所述剂量包含以下细胞数量：从或从约1x 105至5x 108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5x105至1x 107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或者从或从约1x 106至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量的CD8+ T细胞(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)包括在约1x 106与5x 108个之间的表达重组受体(例如CAR)的总CD8+细胞，例如在约5x 106至1x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、2.5x 107、5x107、7.5x 107、1x 108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，向患者给予多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞剂量包括给予从或从约1x 107至0.75x 108个表达重组受体的总CD8+ T细胞、1x107至2.5x 107个表达重组受体的总CD8+ T细胞、从或从约1x 107至0.75x 108个表达重组受体的总CD8+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞剂量包括给予或给予约1x107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108或5x 108个表达重组受体的总CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，表达重组受体的T细胞)的剂量是作为单剂量给予受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
在一些方面，药物组合物和配制品是作为单位剂型组合物提供，所述单位剂型组合物包括用于以给定剂量或其分数给予的细胞数量。在一些实施方案中，如与孵育(例如，刺激)细胞的其他方法相比，所提供的方法以可预测的给药时间线产生细胞。在一些情况下，用于给予的细胞剂量是基于输入细胞组合物中幼稚样细胞的数量来确定。
在一些方面，剂量的大小取决于受试者的疾病或病症的负荷。例如，在一些方面，在剂量中给予的细胞数量是基于就在所述细胞剂量开始给予之前在受试者中存在的肿瘤负荷来确定。在一些实施方案中，第一剂量和/或随后剂量的大小与疾病负荷呈逆相关。在一些方面，如在疾病负荷大的情况下，向受试者给予较少量的细胞。在其他实施方案中，如在疾病负荷较低的情况下，向受试者给予较大量的细胞。
在给予细胞后，工程化细胞群的生物学活性在一些实施方案中是例如通过许多已知方法中的任一种来测量。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的方法来测量，所述方法如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，细胞的生物学活性是通过测定一种或多种细胞因子(如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物学活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量。
细胞可以通过任何合适的手段来给予。将细胞以实现治疗效果(如降低肿瘤负荷)的给药方案给予。给药和给予可能部分取决于免疫调节化合物的给予时间表，所述免疫调节化合物可以在开始给予T细胞疗法之前、之后和/或同时给予。T细胞疗法的各种给药时间表包括但不限于在不同时间点的单次或多次给予、推注给予和脉冲输注。在某些实施方案中，工程化的T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，工程化的T细胞表达CAR。
在特定实施方案中，在相同组合物、剂量或混合物中给予受试者的CD4+T细胞与CD8+ T细胞的比率在5:1至0.2:1之间、在4:1至0.25:1之间、在3:1至0.33:1之间、在2:1至0.5:1之间、在1.5:1至0.66:1之间或在1.25:1至0.8:1之间。在一些实施方案中，在相同组合物、剂量或混合物中给予受试者的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为或为约2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1或0.5:1。
在特定实施方案中，在相同组合物、剂量或混合物中给予受试者的表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率在5:1与0.2:1之间、在4:1与0.25:1之间、在3:1与0.33:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.66:1之间、或在1.25:1与0.8:1之间。在某些实施方案中，在相同组合物、剂量或混合物中给予受试者的表达重组受体的CD4+T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率为或为约2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1或0.5:1。在特定实施方案中，所给予的表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率为或为约1:1。在一些实施方案中，重组受体是TCR或CAR。在特定实施方案中，重组受体是CAR。
在一些实施方案中，被给予受试者的剂量、组合物或混合物中工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率在这个限定比率、所需比率或固定比率的某一容忍差异或误差范围内。在一些实施方案中，所述容忍差异在靶标比率、限定比率、优选比率和/或固定比率的为或为约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％内。
在一些实施方案中，将通过本文提供的方法产生的细胞组合物(例如，输出组合物)在单一组合物、剂量或混合物中给予受试者，所述细胞组合物具有在2:1与0.5:1之间的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率。在某些实施方案中，所述组合物含有比率为或为约1:1的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞。在一些实施方案中，从输入细胞组合物(例如，第I-A1节中所述的输入细胞组合物)产生的细胞组合物具有在2:1与0.5:1之间的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率，并且是在单一组合物、剂量或混合物中给予受试者。在特定实施方案中，从输入细胞组合物产生的细胞组合物具有1:1的工程化CD4+ T细胞与工程化CD8+ T细胞的比率，且容忍差异为50％、25％、10％或更小。
在一些实施方案中，将细胞作为另一组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依次给予。例如，在一些实施方案中，抗癌剂或免疫调节剂可以用于与过继细胞疗法的组合疗法中，所述过继细胞疗法使用表达重组受体(例如，CAR)的工程化细胞。在一些情境下，将细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共给予，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂包括细胞因子(如IL-2)，以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括给予化学治疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂包括一种或多种淋巴细胞清除疗法，如在开始给予工程化细胞之前或同时。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法包括给予磷酰胺，如环磷酰胺。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法可以包括给予氟达拉滨。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法中不包括氟达拉滨。在一些实施方案中，不给予淋巴细胞清除疗法。
在一些实施方案中，所述方法包括在开始细胞疗法之前向受试者给予预调理剂，如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在开始细胞疗法之前至少2天，如之前至少3、4、5、6或7天，向受试者给予预调理剂。在一些实施方案中，在开始细胞疗法之前不超过7天，如之前不超过6、5、4、3或2天，向受试者给予预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺以单剂量给予，或者可以以多个剂量给予，如每天、每隔一天或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予一次环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，以在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或250mg/m2与350mg/m2之间(包含端值)的剂量向受试者给予环磷酰胺。在一些情况下，向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺以单剂量给予，或者可以以多个剂量给予，如每天、每隔一天或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前，每天向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，以一定剂量向受试者给予氟达拉滨，所述剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间、或24mg/m2与35mg/m2之间(包含端值)。在一些情况下，向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单剂量给予，或者可以以多个剂量给予，如每天、每隔一天或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者给予60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。
IV.制品和试剂盒
还提供了制品，如试剂盒和装置，所述制品用于根据用于过继细胞疗法的所提供方法将细胞给予受试者，并且用于细胞和组合物(例如如所述的输入组合物或输出组合物)的储存和给予。
制品包括一个或多个容器(通常多个容器)、包装材料、以及在一个或多个容器和/或包装上或与一个或多个容器和/或包装相关的标签或包装说明书(通常包括用于将细胞给予受试者的说明书)。
在一些实施方案中，容器含有要给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。制品通常包括多个容器，每个容器含有细胞的单一单位剂量。单位剂量可以是要在第一剂量中给予受试者的细胞的量或数量，或者是要在第一剂量或任何一个或多个连续剂量中给予的细胞的数量的两倍(或更多)。它可以是会与给予方法结合给予受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。在一些实施方案中，单位剂量是根据本文的方法，会在单剂量中给予患有特定疾病或病症的任何受试者或任何受试者的最小细胞数量或细胞数量，或参考单位或目标参考单位或在目标范围内的参考单位的最小数量。
合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和柔性袋(如输液袋)。在特定实施方案中，容器是袋，例如柔性袋，如适合用于将细胞输注到受试者的那些，例如柔性塑料或PVC袋、和/或IV溶液袋。在一些实施方案中，袋是可密封的和/或能够灭菌的，以便提供细胞和组合物的无菌溶液和递送。在一些实施方案中，容器(例如袋)具有如下的容量：为或为约或至少为或至少约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、或1000mL容量，如在为或为约10mL与为或为约100mL之间、或在为或为约10mL与为或为约500mL之间的容量，每个都包含端值。在一些实施方案中，容器(例如袋)是稳定的材料和/或由稳定的材料制成，和/或在各种温度中的一个或多个温度下(如在冷的温度(例如低于或低于约或为或为约-20℃、-80℃、-120℃、135℃和/或在适合于低温保存的温度)和/或其他温度(如适合于解冻细胞的温度和体温(如为或为约37℃))中)提供细胞的稳定储存和/或维持，例如，以允许在即将治疗之前例如在受试者的位置或治疗的位置(例如在床边)解冻。
容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，容器具有一个或多个端口，例如，无菌接入端口，例如，用于将管路或插管与一个或多个管连接，例如，用于静脉内或其他输注和/或用于连接以便从其他容器(如细胞培养和/或存储袋或其他容器)来回转移。示例性容器包括输液袋、静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可被注射用针刺穿的塞子的那些。
制品还可以包括具有一条或多条识别信息和/或使用说明的包装说明书或标签。在一些实施方案中，信息或说明指示，内容物可以或应当用于治疗特定病症或疾病，和/或提供用于其的说明。标签或包装说明书可以指示，制品的内容物将用于治疗疾病或病症。在一些实施方案中，标签或包装说明书提供了例如根据所提供的方法的任何实施方案，经由涉及给予第一剂量和一个或多个连续剂量的细胞的方法，治疗受试者(例如，已经衍生细胞的受试者)的说明。在一些实施方案中，说明指定在第一剂量中给予一个单位剂量(例如制品中单一单独容器的内容物)，随后在指定的时间点或在指定的时间窗口内和/或在检测受试者中一种或多种因子或结果的存在或不存在或量或程度之后，给予一个或多个连续剂量。
在一些实施方案中，说明指定向受试者给予一个或多个单位剂量。
在一些实施方案中，标签或包装说明书或包装包含指示从其衍生细胞和/或要进行给予的受试者的具体身份的标识符。在自体转移的情况下，衍生细胞的受试者的身份与要给予细胞的受试者的身份相同。因此，识别信息可以指定，要将细胞给予特定患者，例如最初衍生细胞的患者。这种信息可以以条形码或其他编码标识符的形式存在于包装材料和/或标签中，或者可以指示受试者的姓名和/或其他识别特征。
在一些实施方案中，制品包括一个或多个(通常多个)容器，所述容器含有包含细胞(例如其单独的单位剂型)的组合物，并且所述制品还包括在其中含有组合物的一个或多个另外的容器，所述组合物包括例如要与细胞组合(例如，同时或以任何顺序依次)给予的另一种药剂，如细胞毒性剂或其他治疗剂。可替代地或另外地，制品还可以包括另一个或相同容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液。它还可以包括其他材料，如其他缓冲液、稀释剂、过滤器、管路、针和/或注射器。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、给予、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
V.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，向其给予免疫调节多肽、工程化细胞或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗”(“treatment”)(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结果或表型的完全或部分改善或减轻。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓和、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改进预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一种或多种效果。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数以外的原本相同的条件相比时，或者与另一种条件相比时，降低功能或活性。例如，与不存在细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在给予的情况下，药剂(例如，药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，药物配制品或工程化细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效动力学作用的量。治疗有效量可以根据诸如以下等因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重、以及所给予的免疫调节多肽或工程化细胞。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)给予免疫调节多肽、工程化细胞或组合物。
“预防有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或疾病较早期在受试者中使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对给予所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所示)是指，在使用标准比对算法(如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，人们可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应的残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
氨基酸取代可以包括用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。所述取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入感兴趣的结合分子(例如抗体)、和针对所希望的活性(例如保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用的，单数形式“一种/个(a/an)”和“所述(the)”包括复数种/个指示物，除非上下文另外明确说明。例如，“一种/一个”(“a”)或“一种/一个”(“an”)意指“至少一种/至少一个”或“一种/一个或多种/多个”。应理解，本文所述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“本质上由方面和变化组成”。
贯穿本公开文本，要求保护的主题的各种方面以范围形式呈现。应理解，以范围形式描述仅为了方便和简洁，并且不应被视为对要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围情况下，应理解，在所述范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文中在提到“约”某个值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。在某些实施方案中，“约”所述值是指在所述值的±25％、±20％、±10％、±5％、±1％、±0.1％、或±0.01％内的值。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，细胞或细胞群针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知呈所述标记阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知呈所述标记阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知呈所述标记阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知呈所述标记阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的，具有相同功能或生物学活性的突变型后代。
VI.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含幼稚样CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含幼稚样CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+ T细胞产生的，和/或所述第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的所述生物样品分离CD8+ T细胞产生的。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定所述第一组合物中幼稚样CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或所述第二组合物中幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
4.根据实施方案2所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自所述受试者的生物样品中所述幼稚样CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比生物样品。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率被调整或改变。
6.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中幼稚样CD4+ T细胞和幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中所述幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。
8.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
使包含来自受试者的生物样品的幼稚样CD4+ T细胞和幼稚样CD8+ T细胞的输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中，
其中所述输入组合物中存在的幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
9.根据实施方案7或实施方案8所述的方法，所述方法还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
10.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含幼稚样CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含幼稚样CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；
使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞：
对于选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的标记呈表面阳性；和/或
对于选自CD25、CD45RO、CD56、CD62L和KLRG1的标记呈表面阴性；和/或
具有CD95的低表达；和/或
对于选自IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的细胞因子的细胞内表达呈阴性。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞：
对于选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或
对于选自CD45RO、CD56、CD62L和KLRG1的标记呈表面阴性；和/或
具有CD95的低表达。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞对于CD45RA和CCR7呈表面阳性。
14.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞对于CD27和CCR7呈表面阳性。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和所述幼稚样CD8+细胞对于CD45RA、CD27和CCR7呈表面阳性并且对于CD45RO呈表面阴性。
16.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞对于CCR7呈表面阳性并且对于CD62L呈表面阴性。
17.根据实施方案3-16中任一项所述的方法，其中幼稚样CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或幼稚样CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
18.根据实施方案8-17中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中所述幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，幼稚样CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率已经被调整。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间、1.5:1与2:1之间、1.6:1与1.8:1之间或1.0:1与1.2:1之间的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞，每个都包含端值。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.69:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.1:1的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
22.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.1:1的对于CD45RA和CCR7呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
23.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.69:1的对于CD45RA和CD27呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
24.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+ T细胞产生的，和/或所述第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的所述生物样品分离CD8+ T细胞产生的。
26.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定所述第一组合物中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或所述第二组合物中CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
27.根据实施方案24-26中任一项所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
28.根据实施方案24-27中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+C D45RA+CD8+ T细胞的比率被调整或改变。
29.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞和CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中所述CCR7+C D45RA+CD4+T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+C D4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
30.根据实施方案29中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。
31.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
使包含来自受试者的生物样品的CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞和CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中，
其中所述输入组合物中存在的CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+C D45RA+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
32.根据实施方案31所述的方法，所述方法还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
33.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；
使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
34.根据实施方案24-33中任一项所述的方法，其中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CCR7+C D45RA+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
35.根据实施方案31-34中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率相比，CCR7+CD45RA+CD4+ T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+ T细胞的比率已经被调整。
36.根据实施方案24-35中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间或1.0:1与1.2:1之间的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞，每个都包含端值。
37.根据实施方案24-36中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞。
38.根据实施方案24-37中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.1:1的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞。
39.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD27+CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD27+C CR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD27+C CR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在1.2:1与2.4:1之间，包含端值。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+ T细胞产生的，和/或所述第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的所述生物样品分离CD8+ T细胞产生的。
41.根据实施方案39或实施方案40所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定所述第一组合物中CD27+CCR7+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或所述第二组合物中CD27+CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
42.根据实施方案39-41中任一项所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD27+CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
43.根据实施方案39-42中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率被调整或改变。
44.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞和CD27+CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
45.根据实施方案39-44中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。
46.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
使包含来自受试者的生物样品的CD27+CCR7+CD4+ T细胞和CD27+CCR7+CD8+ T细胞的输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中，
其中所述输入组合物中存在的CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
47.根据实施方案46或实施方案47所述的方法，所述方法还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
48.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD27+CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD27+CCR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；
使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
49.根据实施方案39-48中任一项所述的方法，其中CD27+CCR7+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD27+CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
50.根据实施方案39-49中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率相比，CD27+CCR7+CD4+ T细胞与CD27+CCR7+CD8+ T细胞的比率已经被调整。
51.根据实施方案39-50中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间或1.0:1与1.2:1之间的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞，每个都包含端值。
52.根据实施方案39-51中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。
53.根据实施方案39-52中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.1:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。
54.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD62L-CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值。
55.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞和CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的输入组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与幼稚样CD8+ T细胞的比率相比，所述输入组合物中的所述比率被调整或改变。
56.根据实施方案54或55所述的方法，所述方法还包括使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入组合物中的细胞中。
57.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD62L-CCR7+CD4+ T细胞的第一细胞组合物与包含CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值；
使所述输入组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
58.根据实施方案56或57所述的方法，其中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD62L-CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
59.根据实施方案55-58中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率相比，CD62L-CCR7+CD4+ T细胞与CD62L-CCR7+CD8+ T细胞的比率已经被调整。
60.根据实施方案55-59中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在或大约在0.5:1与1.5:1之间、1:1与2:1之间、0.75:1与1.5:1之间或0.8:1与1.2:1之间的CD62L-CCR7+CD4+细胞与CD62L-CCR7+CD8+细胞，每个都包含端值。
61.根据55-60所述的方法，其中所述输入组合物包含比率为或为约1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1或0.8:1的CD62L-CCR7+CD4+细胞与CD62L-CCR7+CD8+细胞。
62.根据实施方案2-9、18-23、25-32、34-38、40-47、50-53、55-56或59-61中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或获得自血液、血浆或血清样品。
63.根据实施方案2-9、18-23、25-32、34-38、40-47、50-53、55-56或59-62中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
64.根据实施方案2-9、18-23、25-32、34-38、40-47、50-53、55-56或59-63中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或获得自单采术样品或白细胞单采术样品。
65.根据实施方案2-9、18-23、25-32、34-38、40-47、50-53、55-56或59-64中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含从或从约1x 107至5x 109个总细胞或总T细胞、从或从约5x 107至1x 109个总细胞或总T细胞、从或从约1x 108至5x 108个总细胞或总T细胞、或者从或从约2x 108至5x 108个总细胞或总T细胞，或者前述任一项的活群体。
67.根据实施方案1-66中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含至少或至少约1x 108、2x 108、3x 108、4x 108或5x 108个总细胞或总T细胞，或者前述任一项的活群体。
68.根据实施方案9-23、32-38、47-53、57-67中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂能够激活T细胞、CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞；能够通过TCR复合物诱导信号；和/或能够诱导T细胞、CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞的增殖。
69.根据实施方案9-23、32-38、47-53、57-68中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含与TCR复合物的成员结合的一级药剂，任选地与CD3特异性结合的一级药剂。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂还包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
72.根据实施方案70或实施方案71所述的方法，其中所述一级和二级药剂包含抗体，任选地其中所述一种或多种刺激剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起孵育。
73.根据实施方案9-23、32-38、47-53、57-72中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂存在于固体支持物的表面上，所述固体支持物任选地为珠。
74.根据实施方案9-23、32-38、47-53、57-73中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7、包含由所述抗原受体特异性地识别的抗原的疫苗、和特异性地结合所述抗原受体的抗独特型抗体或其组合。
75.根据实施方案9-23、32-38、47-53、57-74中任一项所述的方法，其中所述孵育进行2至15天、2至12天、2至12天、2至8天、2至6天、2至4天、4至12天、4至10天、4至8天、4至6天、6至12天、6至10天、6至8天、8至12天、8至10天或10至12天。
76.根据实施方案9-23、32-38、47-53、57-75中任一项所述的方法，其中所述孵育进行至少或大约至少或4天、6天、8天、10天或12天。
77.根据实施方案7-23、30-39、45-53或57-76中任一项所述的方法，其中包含所述核酸分子的所述药剂是病毒载体或者是转座子。
78.根据实施方案77所述的方法，其中包含所述核酸分子的所述药剂是病毒载体并且所述病毒载体是逆转录病毒载体。
79.根据实施方案78所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
80.根据实施方案7-23、30-38、45-53或56-79中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
81.根据实施方案80所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
82.根据实施方案80或实施方案81所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
83.根据实施方案80-82中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素(MSLN)、癌胚抗原(CEA)和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、叶酸结合蛋白(FBP)、Fc受体样5(FCRL5，也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、B7-H3、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、CD171、叶酸受体-α、CD44v7/8、αvβ6整合素(avb6整合素)、8H9、神经细胞粘附分子(NCAM)、血管内皮生长因子受体(VEGF受体或VEGFR)、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、NKG2D配体、CD44v6、双抗原、癌症-睾丸抗原、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、黑色素A(MART-1)、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、癌胚胎抗原、TAG72、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ-异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)、癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕酮受体、前列腺特异性抗原、肝配蛋白B2、CD123、CD133、c-Met、O-乙酰化GD2(OGD2)、L1-CAM的CE7表位、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD138、病原体特异性抗原或病原体表达的抗原、和与通用标签相关的抗原。
84.根据实施方案7-23、30-38、45-53或56-83中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
85.根据实施方案7-23、30-38、45-53或56-83中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
86.根据实施方案85所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
87.根据实施方案86所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
88.根据实施方案87所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
89.根据实施方案87或实施方案88所述的方法，其中所述片段包含scFv。
90.根据实施方案86-89中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体还包含间隔子和/或铰链区。
91.根据实施方案86-90中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含细胞内信号传导区域。
92.根据实施方案91所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
93.根据实施方案92所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
95.根据实施方案91-94中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体还包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
96.根据实施方案91-95中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域还包含共刺激信号传导区域。
97.根据实施方案96所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
98.根据实施方案96或实施方案97所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
99.根据实施方案96-98中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区域之间。
100.根据实施方案2-9、11-23、25-32、34-38、40-47、50-53、55-56或59-99中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
101.根据实施方案1-100中任一项所述的方法，其中所述方法产生输出组合物，其中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率与在通过所述方法产生的多种T细胞组合物中所述比率的平均值相比变化不超过20％或不超过10％或不超过5％，和/或与这个平均值相比变化不超过一个标准差。
102.根据实施方案1-101中任一项所述的方法，其中所述方法产生输出组合物，其中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率在或在约0.5:1与2:1之间或0.8:1与1.6:1之间或1:1与1.5:1之间，每个都包含端值。
103.根据实施方案101或实施方案102中任一项所述的方法，其中所述输出组合物中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率为或为约1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1或0.8:1。
104.根据实施方案101-103中任一项所述的方法，其中所述输出组合物中表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞的比率，任选地其活细胞的比率为或为约1:1。
105.根据实施方案66-104中任一项所述的方法，其中所述活细胞包含呈细胞凋亡标记阴性(-)的细胞，任选地其中所述细胞凋亡标记是膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。
106.根据实施方案1-105中任一项所述的方法，其是在体外或离体进行的。
107.一种输出组合物，所述输出组合物通过根据实施方案104中任一项所述的方法产生。
108.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案107所述的输出组合物。
109.根据实施方案108所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药物载体。
110.一种治疗方法，所述方法包括向哺乳动物受试者给予通过实施方案105中任一项所述的方法产生的输出组合物或根据实施方案108或实施方案109所述的药物组合物。
111.根据实施方案110所述的方法，其中所述细胞衍生自被给予所述细胞的受试者。
VII.实施例
仅出于说明性目的包括以下实施例，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：起始组合物的表型与CAR+ T细胞组合物中表达CAR的CD4+和CD8+细胞的 比率之间的相关性
含有表达嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的CAR+ T细胞组合物是通过从11个单独供体收集的单采术产生，其中从每个供体样品分开处理四个测试样品。一个供体是患有骨髓瘤的患者，其余供体是健康受试者。在洗涤每个单采术样品后，针对细胞活力使用细胞凋亡标记以及针对CD4和CD8的表面表达，通过流式细胞术评估每个样品，以确定每次单采术样品运行中活CD4+与CD8+ T细胞的比率(CD4/CD8比率)。
通过基于免疫亲和力的选择从单采术样品选择CD4+和CD8+ T细胞。将CD4+ T细胞和CD8+ T细胞以活CD4+与CD8+细胞的1:1比率组合。针对细胞活力使用细胞凋亡特异性标记以及针对包括CD4、CD8、CD45RA和CCR7的标记的表面表达，通过流式细胞术评估组合细胞的样品。确定所选CD4和CD8细胞的混合物中活CD45RA+/CCR7+CD4+与活CD45RA+/CCR7+CD8+的比率(CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率)。
为了产生CAR+ T细胞组合物，将组合的CD4+和CD8+ T细胞通过与抗CD3和抗CD28抗体包被的珠在细胞因子的存在下一起孵育来激活，然后用编码抗BCMA CAR的慢病毒载体转导。CAR含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、间隔子、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区域、和CD3-ζ衍生的细胞内信号传导结构域。在转导后，将细胞扩增，然后通过低温保存冷冻。将冷冻组合物中的细胞解冻，并通过流式细胞术使用BCMA-Fc试剂评估活力、CD4和CD8的表面表达以及CAR表达。确定呈CD4+的活CAR+细胞与呈CD8+的活CAR+细胞的比率(CAR+CD4/CD8比率)。
将单采术样品中的CD4/CD8比率或所选CD4和CD8细胞的混合物中的CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率与工程化CAR-T细胞组合物中的CAR+CD4/CD8比率进行事后(post facto)比较。通过双变量分析评估来自每个受试者的平均比率的相关度，并且表示所绘制数据的0.990概率区的双变量正态椭圆分别示出于图1A和图1B中。表1A和表1B分别展示关于图1A和图1B中绘制的数据进行的皮尔逊相关性分析的结果。
Figure BDA0002439290640001331
如图1A和表1A中所示，在这个实验中，来自单采术样品的CD4+与CD8+T细胞的活CD4/CD8比率与最终组合物中的CAR+CD4/CD8比率不相关。这个结果与以下观察结果一致：在激活之前基于总活细胞以1:1比率混合纯化的CD4和CD8 T细胞与输出T细胞组合物中CD4+和CD8+ T细胞的1:1比率不一定相关。
如图1B和表1B中所示，在这个实验中，最终T细胞组合物中的CAR+CD4/CD8比率与起始幼稚样细胞CD4/CD8 T细胞比率正相关，如通过CD4与C D8细胞的混合物中的CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率的比率所确定。特定地，图1B中的结果示出，基于皮尔逊相关系数和p值<0.0001，在起始样品中CD45RA+/CCR7+/CD4+细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+细胞的比率与T细胞组合物中的CAR+CD4/CD8比率之间的相关性高。虽然在输入组合物中和过程运行之间存在变化，但该相关性仍保持。基于来自这个示例性样品组的该模型拟合，确定约1.1:1的CD45RA+/CCR7+/CD4+与CD45RA+/CCR7+/CD8+的比率可产生输出T细胞组合物中约1:1的CAR+CD4/CD8比率。
这些数据支持以下假设：可能通过控制幼稚样CD4+亚组与幼稚样CD8+T细胞受试者的比率(如通过CD45RA+和CCR7+表面表达所确定)，来控制和/或调整输出T细胞组合物中CD4+细胞与CD8+细胞的比率和/或组成。
实施例2：起始T细胞群的表型与工程化CAR+ T细胞组合物中CAR+CD4+和CAR+CD8+T细胞的比率之间的相关性
由从15名健康供体和一名多发性骨髓瘤患者收集的单采术样品产生总计50种工程化CAR+ T细胞组合物。为了产生CAR-T组合物，将活的所选CD4+和CD8+ T细胞以1:1比率组合为起始细胞组合物，然后如实施例1中所述进行激活、转导和扩增。针对活力以及针对包括CD4、CD8、CD27、CD45RA、CCR7和CD62L的标记的表面表达，通过流式细胞术评估来自组合的活CD4+和CD8+ T细胞的起始组合物的样品。
针对CAR表达以及针对包括CD4和CD8的标记的表面表达，评估来自工程化CAR+ T细胞组合物的样品。计算相同供体的单独CAR+ T细胞组合物中CD4+CAR+ T细胞与CD8+CAR+T细胞的比率(CAR+CD4/CD8比率)的平均值，所述CAR+ T细胞组合物是使用与实施例1中所述相同的示例性工艺来产生，但是某些工艺参数发生变化。针对与组合的活CD4+与CD8+细胞的起始组合物的各种表型的相关性，分析平均CAR+CD4/CD8比率。在激活之前以1:1比率组合所选CD4+和CD8+ T细胞不一定与所产生的输出细胞组合物中1:1的CAR+CD4/CD8比率相关。
通过双变量分析来评估平均CAR+CD4/CD8比率与来自每个供体的表型之间的相关度。针对CD45RA+/CCR7+/CD4+ T细胞与CD45RA+/CCR7+/CD8+的比率(CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率；图2A)；CD62L-/CCR7+/CD4+与CD62L-/CCR7+/CD8+的比率(CD62L-/CCR7+CD4/CD8比率；图2B)；和CD27+/CCR7+/CD4+与CD27+/CCR7+/CD8+的比率(CD27+/CCR7+CD4/CD8比率；图2C)，示出表示0.950概率的双变量正态椭圆。表2展示关于图2A-图2C中绘制的数据进行的皮尔逊相关性分析的结果。
Figure BDA0002439290640001351
分析指示，使用实施例1中所述的示例性方案，CAR+CD4/CD8比率与健康供体的CD45RA+/CCR7+CD4/CD8 T细胞比率呈正相关，但是在这个实验中，对于一个患者样品并非如此。显示CAR+CD4/CD8比率与健康供体和患者样品起始细胞组合物二者中的CD62L-/CCR7+CD4/CD8比率和CD27+/CCR7+CD4/CD8比率呈正相关。基于模型拟合，计算出预测1.69:1的起始CD27+/CCR7+CD4/CD8比率可产生具有约1:1的CAR+CD4/CD8比率的输出细胞组合物。这些结果与以下发现一致：可以调整起始细胞组合物中的CD27+CCR7+CD4/CD8比率以控制和/或预测工程化细胞组合物的所得CAR+CD4/CD8比率。
实施例3：基于起始组合物的表型产生CAR+ T细胞组合物的工艺
由从3名单独供体收集的单采术产生含有表达CAR的自体T细胞的十种CAR+ T细胞组合物，所述单独供体包括两名健康供体和一名多发性骨髓瘤患者。如实施例1中所述从单采术样品选择CD4+和CD8+ T细胞。针对活力和包括CD27、CCR7、CD4和CD8的表面标记，通过流式细胞术评估单采术样品和所选的CD4+和CD8+ T细胞。确定所选CD4+和CD8+ T细胞中CD27+/CCR7+细胞的频率，且每名供体在单采术样品中展现不同的CD27+/CCR7+CD4+细胞与CD27+/CCR7+CD8+细胞的比率。例如，患者样品展现约12.2:1的CD27+/CCR7+CD4+细胞与CD27+/CCR7+CD8+细胞的比率，而两个健康供体样品展现3.56:1和2.15:1的CD27+/CCR7+CD4+细胞与CD27+/CCR7+CD8+细胞的比率。输入细胞组合物是通过以下方式产生：(1)以1:1的活CD4+与CD8+比率(活CD4/CD8)组合所选的CD4+和CD8+细胞，或(2)在激活之前以1.69:1的CD27+/CCR7+CD4+细胞与CD27+/CCR7+CD8+细胞的比率(CD27+/CCR7+CD4/CD8)组合CD4+和CD8+细胞。基本上如实施例1中所述对来自输入组合物的总计300x 106个细胞或100x 106个细胞进行激活、转导和扩增以产生输出细胞组合物。
未观察到激活步骤中的细胞总数影响CAR+CD4/CD8比率。从含有以约1.69:1比率混合的CD27+/CCR7+CD4/CD8细胞的起始组合物(包括来自患者样品)产生的输出细胞组合物展现接近1:1的所需目标比率的CAR+CD4/CD8比率(例如在约1.86:1至1:1.86之间)。与从以1.69:1的CD27+/CCR7+CD4+细胞与CD27+/CCR7+CD8+细胞的比率含有CD4+和CD8+细胞的输入组合物产生的组合物相比，从含有以1:1比率混合的活CD4/CD8细胞的输入组合物产生的输出细胞组合物显示CAR+CD4/CAR+CD8比率的更大变化。在这个实验中，在激活100x 106个细胞或300x 106个细胞时，在示例性工艺中使用患者物质产生的输出组合物分别展现约7.6和8.6的CAR+CD4/CAR+CD8比率。当在类似工艺中基于表型例如以1.69:1的CD27+CCR7+CD4+:CD27+CCR7+CD8+ T细胞比率混合时，在激活100x 106个细胞或300x 106个细胞时，最终CAR+CD4/CAR+CD8比率分别为1.6和1.3。这些结果与以下发现一致：特定表型(例如CD27+/CCR7+细胞)可能与从健康供体和患者样品二者产生的输出组合物中的所得CAR+CD4/CAR+CD8比率相关。
实施例4：对于来自患病受试者的样品，对起始组合物的表型与CAR+T细胞组合物 中表达CAR的CD4+和CD8+细胞的比率之间的相关性的评估
由从患有多发性骨髓瘤的7名单独供体收集的单采术产生含有表达嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的CAR+ T细胞组合物。
通过基于免疫亲和力的选择从单采术样品选择CD4+和CD8+ T细胞。将CD4+ T细胞和CD8+ T细胞以活CD4+与CD8+细胞的1:1比率组合。针对包括CD4、CD8、CD27、CD45RA、CCR7和CD62L的标记的表面表达，评估组合的细胞的样品。在所选CD4和CD8细胞的混合物中，确定以下细胞表型的比率：(1)CD27+/CCR7+CD4+细胞与CD27+/CCR7+CD8+细胞的比率(CD27+/CCR7+CD4/CD8比率)，(2)CD45RA+/CCR7+CD4+细胞与CD45RA+/CCR7+CD8+细胞的比率(CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率)，和(3)CD62L-/CCR7+CD4+细胞与CD62L-/CCR7+CD8+细胞的比率(CD62L-/CCR7+CD4/CD8比率)。
使用基本上如实施例1中所述的工艺产生表达抗BCMA CAR的CAR+ T细胞组合物，所述工艺包括对所产生细胞的激活、转导、扩增和低温保存。将冷冻组合物中的细胞解冻，并通过流式细胞术使用BCMA-Fc试剂评估活力、CD4和CD8的表面表达以及CAR表达。确定呈CD4+的活CAR+细胞与呈CD8+的活CAR+细胞的比率(CAR+CD4/CD8比率)。
将所选CD4与CD8细胞的混合物中的CD27+/CCR7+CD4/CD8比率、CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率或CD62L-/CCR7+CD4/CD8比率与工程化CAR-T细胞组合物中的CAR+CD4/CD8比率进行事后比较。通过表示所绘制数据的0.950概率区的双变量正态椭圆评估来自每名受试者的平均比率的相关度并显示于图3A-图3C中。如图所示，基于皮尔逊相关性分析，起始样品中的CD27+/CCR7+CD4/CD8比率、CD45RA+/CCR7+CD4/CD8比率或CD62L-/CCR7+CD4/CD8比率与T细胞组合物中的CAR+CD4/CD8比率之间的相关性是显著的。表3A-表3C展示关于图3A-图3C中所绘制数据进行的相关性分析的结果。显著性<0.05用*标注。
Figure BDA0002439290640001371
Figure BDA0002439290640001381
本发明在范围上并不旨在限于具体公开的实施方案，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0002439290640001391
Figure BDA0002439290640001401
Figure BDA0002439290640001411
Figure BDA0002439290640001421
序列表
<110> JUNO THERAPEUTICS, INC.
MUJACIC, Mirna
RAHARDJO, Ayu
<120> 产生基因工程化细胞组合物的方法和相关组合物
<130> 735042013140
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/543,363
<151> 2017-08-09
<150> US 62/596,770
<151> 2017-12-08
<160> 57
<170>用于Windows 4.0版本的FastSEQ
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子（IgG4铰链）
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子（IgG4铰链）
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28（登录号P10747的氨基酸153-179）
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28（登录号P10747的氨基酸114-179）
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28（P10747的氨基酸180-220）
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28（LL至GG）
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 4-1BB（Q07011.1的氨基酸214-255）
<300>
<308> UniProt Q07011.1
<309> 1995-02-01
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP可切割接头
<400> 18
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 20
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 21
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 22
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa= Gly、Cys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa=Cys或Thr
<400> 23
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 24
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 25
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 26
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 27
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 28
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 29
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 30
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 31
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性接头序列
<220>
<221> REPEAT
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 32
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性接头序列
<400> 33
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 34
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 56
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735

Claims (105)

1.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含幼稚样CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含幼稚样CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+T细胞产生的，和/或所述第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的生物样品分离CD8+T细胞产生的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定所述第一细胞组合物中幼稚样CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或所述第二细胞组合物中幼稚样CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自所述受试者的生物样品中幼稚样CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或幼稚样CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率相比，所述输入细胞组合物中幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率被调整或改变。
6.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中幼稚样CD4+T细胞和幼稚样CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的输入细胞组合物，其中幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率相比，所述输入细胞组合物中的所述比率被调整或改变。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入细胞组合物中的细胞中。
8.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
使包含来自受试者的生物样品的幼稚样CD4+T细胞和幼稚样CD8+T细胞的输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中，其中所述输入细胞组合物中存在的幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，所述方法还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
10.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含幼稚样CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含幼稚样CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；
使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞：
对于选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的标记呈表面阳性；和/或
对于选自CD25、CD45RO、CD56、CD62L和KLRG1的标记呈表面阴性；和/或
具有CD95的低表达；和/或
对于选自IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的细胞因子的细胞内表达呈阴性。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞：
对于选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或
对于选自CD45RO、CD56、CD62L和KLRG1的标记呈表面阴性；和/或
具有CD95的低表达。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞对于CD45RA和CCR7呈表面阳性。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞对于CD27和CCR7呈表面阳性。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和所述幼稚样CD8+细胞对于CD45RA、CD27和CCR7呈表面阳性并且对于CD45RO呈表面阴性。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述幼稚样CD4+细胞和/或所述幼稚样CD8+细胞对于CCR7呈表面阳性并且对于CD62L呈表面阴性。
17.根据权利要求3-16中任一项所述的方法，其中幼稚样CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或幼稚样CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中的幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率相比，幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率已经被调整。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间、1.5:1与2:1之间、1.6:1与1.8:1之间或1.0:1与1.2:1之间的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞，每个都包含端值。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.69:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.1:1的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.1:1的对于CD45RA和CCR7呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
23.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.69:1的对于CD45RA和CD27呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
24.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.69:1的对于CD27和CCR7呈表面阳性的幼稚样CD4+细胞与幼稚样CD8+细胞。
25.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CCR7+CD45RA+CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+T细胞产生的，和/或所述第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的生物样品分离CD8+T细胞产生的。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定所述第一细胞组合物中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或所述第二细胞组合物中CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的比率相比，所述输入细胞组合物中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的比率被调整或改变。
30.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞和CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的输入细胞组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率相比，所述输入细胞组合物中的所述比率被调整或改变。
31.根据权利要求30中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入细胞组合物中的细胞中。
32.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
使包含来自受试者的生物样品的CCR7+CD45RA+CD4+T细胞和CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中，
其中所述输入细胞组合物中存在的CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
33.根据权利要求32所述的方法，所述方法还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
34.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CCR7+CD45RA+CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；
使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
35.根据权利要求25-34中任一项所述的方法，其中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的比率相比，CCR7+CD45RA+CD4+T细胞与CCR7+CD45RA+CD8+T细胞的比率已经被调整。
37.根据权利要求25-36中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间或1.0:1与1.2:1之间的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞，每个都包含端值。
38.根据权利要求25-37中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.1:1的CCR7+CD45RA+CD4+细胞与CCR7+CD45RA+CD8+细胞。
40.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD27+CCR7+CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含CD27+CCR7+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD27+CCR7+CD4+T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率在或大约在1.2:1与2.4:1之间，包含端值。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第一细胞组合物是通过从获得自受试者的生物样品分离CD4+T细胞产生的，和/或所述第二细胞组合物是通过从获得自所述受试者的生物样品分离CD8+T细胞产生的。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定所述第一细胞组合物中CD27+CCR7+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或所述第二细胞组合物中CD27+CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中，在所述组合之前，所述方法包括确定来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD27+CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率相比，所述输入细胞组合物中CD27+CCR7+CD4+T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率被调整或改变。
45.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CD27+CCR7+CD4+T细胞和CD27+CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的输入细胞组合物，其中CD27+CCR7+CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率在或大约在2.2:1至0.8:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率相比，所述输入细胞组合物中的所述比率被调整或改变。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其还包括使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入细胞组合物中的细胞中。
47.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
使包含来自受试者的生物样品的CD27+CCR7+CD4+T细胞和CD27+CCR7+CD8+T细胞的输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中，
其中所述输入细胞组合物中存在的CD27+CCR7+CD4+T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值。
48.根据权利要求47所述的方法，所述方法还包括在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
49.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD27+CCR7+CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含CD27+CCR7+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD27+CCR7+CD4+T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率在或大约在0.8:1与2.2:1之间，包含端值；
使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
50.根据权利要求40-49中任一项所述的方法，其中CD27+CCR7+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD27+CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
51.根据权利要求40-50中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CD27+CCR7+CD4+T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率相比，CD27+CCR7+CD4+T细胞与CD27+CCR7+CD8+T细胞的比率已经被调整。
52.根据权利要求40-51中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率在或大约在0.8:1与2.0:1之间、0.8:1与1.6:1之间、0.8:1与1.4:1之间、0.8:1与1.2:1之间或1.0:1与1.2:1之间的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞，每个都包含端值。
53.根据权利要求40-52中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1或1.0:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。
54.根据权利要求40-53中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.1:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。
55.根据权利要求40-53中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.69:1的CD27+CCR7+CD4+细胞与CD27+CCR7+CD8+细胞。
56.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD62L-CCR7+CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含CD62L-CCR7+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+T细胞与CD62L-CCR7+CD8+T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值。
57.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
确定获得自受试者的生物样品中或从所述生物样品衍生的一个或多个样品中CD62L-CCR7+CD4+T细胞和CD62L-CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比；和
产生包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的输入细胞组合物，其中
CD62L-CCR7+CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值，其中与来自所述受试者的生物样品中
CD62L-CCR7+CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的比率相比，所述输入细胞组合物中的所述比率被调整或改变。
58.根据权利要求56或57所述的方法，所述方法还包括使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述输入细胞组合物中的细胞中。
59.一种产生细胞组合物的方法，所述方法包括：
组合包含CD62L-CCR7+CD4+T细胞的第一细胞组合物与包含CD62L-CCR7+CD8+T细胞的第二细胞组合物以产生输入细胞组合物，其中CD62L-CCR7+CD4+T细胞与CD62L-CCR7+CD8+T细胞的比率在或大约在0.5:1与2:1之间，包含端值；
使所述输入细胞组合物与包含编码重组受体的核酸分子的药剂在一定条件下接触，以将编码所述重组受体的核酸引入所述组合物中的细胞中；和
在所述接触之前、期间和/或之后刺激所述细胞，其中刺激包括在一种或多种刺激剂的存在下孵育所述细胞，其中刺激导致所述细胞的激活和/或增殖。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中CD62L-CCR7+CD4+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比和/或CD62L-CCR7+CD8+T细胞的数量、每体积的数量、每重量的数量和/或百分比是通过流式细胞术来确定。
61.根据权利要求57-60中任一项所述的方法，其中与来自所述受试者的生物样品中CD62L-CCR7+CD4+T细胞与CD62L-CCR7+CD8+T细胞的比率相比，CD62L-CCR7+CD4+T细胞与CD62L-CCR7+CD8+T细胞的比率已经被调整。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率在或大约在0.5:1与1.5:1之间、1:1与2:1之间、0.75:1与1.5:1之间或0.8:1与1.2:1之间的CD62L-CCR7+CD4+细胞与CD62L-CCR7+CD8+细胞，每个都包含端值。
63.根据权利要求57-62所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含比率为或为约1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1或0.8:1的CD62L-CCR7+CD4+细胞与CD62L-CCR7+CD8+细胞。
64.根据权利要求2-9、18-24、26-33、35-39、41-48、51-54、57-58或61-63中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或获得自血液、血浆或血清样品。
65.根据权利要求2-9、18-24、26-33、35-39、41-48、51-54、57-58或61-64中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
66.根据权利要求2-9、18-24、26-33、35-39、41-48、51-54、57-58或61-65中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或获得自单采术样品或白细胞单采术样品。
67.根据权利要求2-9、18-24、26-33、35-39、41-48、51-54、57-58或61-66中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含从或从约1x 107至5x 109个总细胞或总T细胞、从或从约5x 107至1x 109个总细胞或总T细胞、从或从约1x 108至5x 108个总细胞或总T细胞、或者从或从约2x 108至5x 108个总细胞或总T细胞，或者前述任一项的活群体。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述输入细胞组合物包含至少或至少约1x 108、2x 108、3x 108、4x 108或5x 108个总细胞或总T细胞，或者前述任一项的活群体。
70.根据权利要求9-24、33-39、48-54、59-69中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂能够激活T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；能够通过TCR复合物诱导信号；和/或能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的增殖。
71.根据权利要求9-24、33-39、48-54、59-70中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂包含与TCR复合物的成员结合的一级药剂，任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂还包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
74.根据权利要求72或权利要求73所述的方法，其中所述一级和二级药剂包含抗体，任选地其中所述一种或多种刺激剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体一起孵育。
75.根据权利要求9-24、33-39、48-54、59-74中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂存在于固体支持物的表面上，所述固体支持物任选地为珠。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂存在于珠的表面上并且所述珠是顺磁珠。
77.根据权利要求9-24、33-39、48-54、59-76中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激剂选自CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；和重组IL-7、包含由所述抗原受体特异性地识别的抗原的疫苗、和特异性地结合所述抗原受体的抗独特型抗体或其组合。
78.根据权利要求9-24、33-39、48-54、59-77中任一项所述的方法，其中所述孵育进行2至15天、2至12天、2至12天、2至8天、2至6天、2至4天、4至12天、4至10天、4至8天、4至6天、6至12天、6至10天、6至8天、8至12天、8至10天或10至12天。
79.根据权利要求9-24、33-39、48-54、59-78中任一项所述的方法，其中所述孵育进行至少或大约至少或4天、6天、8天、10天或12天。
80.根据权利要求7-24、31-40、46-55或59-79中任一项所述的方法，其中包含所述核酸分子的所述药剂是病毒载体或者是转座子。
81.根据权利要求80所述的方法，其中包含所述核酸分子的所述药剂是病毒载体并且所述病毒载体是逆转录病毒载体。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
83.根据权利要求7-24、31-39、46-54或58-82中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
85.根据权利要求83或权利要求84所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
86.根据权利要求83-85中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素(MSLN)、癌胚抗原(CEA)和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、叶酸结合蛋白(FBP)、Fc受体样5(FCRL5，也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、B7-H3、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、CD171、叶酸受体-α、CD44v7/8、αvβ6整合素(avb6整合素)、8H9、神经细胞粘附分子(NCAM)、血管内皮生长因子受体(VEGF受体或VEGFR)、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、NKG2D配体、CD44v6、双抗原、癌症-睾丸抗原、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、黑色素A(MART-1)、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、癌胚胎抗原、TAG72、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ-异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)、癌胚抗原(CEA)、雌激素受体、孕酮受体、前列腺特异性抗原、肝配蛋白B2、CD123、CD133、c-Met、O-乙酰化GD2(OGD2)、L1-CAM的CE7表位、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD138、病原体特异性抗原或病原体表达的抗原、和与通用标签相关的抗原。
87.根据权利要求7-24、31-39、46-55或58-86中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
88.根据权利要求7-24、31-39、46-55或58-86中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含：含有与抗原特异性地结合的抗原结合结构域的细胞外结构域和含有ITAM的细胞内信号传导结构域。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
91.根据权利要求89或权利要求90所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链任选CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
92.根据权利要求89、90和91中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域还包含共刺激信号传导区域。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
95.根据权利要求88-93中任一项所述的方法，其中：
所述CAR包含对所述抗原具有特异性的scFv、跨膜结构域、衍生自任选地是或包含4-1BB的共刺激分子的胞质信号传导结构域、和任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域的衍生自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，并且所述CAR任选地还包含在所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子；
所述CAR依次包含对所述抗原具有特异性的scFv、跨膜结构域、任选地为或包含4-1BB信号传导结构域的衍生自共刺激分子的胞质信号传导结构域、和任选地是CD3ζ信号传导结构域的衍生自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域；或
所述CAR依次包含对抗原具有特异性的scFv、间隔子、跨膜结构域、任选地是4-1BB信号传导结构域的衍生自共刺激分子的胞质信号传导结构域、和任选地是或包含CD3ζ信号传导结构域的衍生自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域。
96.根据权利要求2-9、11-24、26-33、35-39、41-48、51-55、57-58或61-95中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中所述方法产生输出组合物，其中表达重组受体的CD4+T细胞与表达重组受体的CD8+T细胞的比率，任选地其活细胞的比率与在通过所述方法产生的多种T细胞组合物中所述比率的平均值相比变化不超过20％或不超过10％或不超过5％，和/或与这个平均值相比变化不超过一个标准差。
98.根据权利要求1-97中任一项所述的方法，其中所述方法产生输出组合物，其中表达重组受体的CD4+T细胞与表达重组受体的CD8+T细胞的比率，任选地其活细胞的比率在或在约0.5:1与2:1之间或0.8:1与1.6:1之间或1:1与1.5:1之间，每个都包含端值。
99.根据权利要求97或权利要求98中任一项所述的方法，其中所述输出组合物中表达重组受体的CD4+T细胞与表达重组受体的CD8+T细胞的比率，任选地其活细胞的比率为或为约1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1或0.8:1。
100.根据权利要求97-99中任一项所述的方法，其中所述输出组合物中表达重组受体的CD4+T细胞与表达重组受体的CD8+T细胞的比率，任选地其活细胞的比率为或为约1:1。
101.一种输出组合物，所述输出组合物通过根据权利要求1-100中任一项所述的方法产生。
102.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求101所述的输出组合物。
103.根据权利要求102所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药物载体。
104.一种治疗方法，所述方法包括向哺乳动物受试者给予通过根据权利要求1-100中任一项所述的方法产生的输出组合物或根据权利要求102或权利要求103所述的药物组合物。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述细胞衍生自被给予所述细胞的受试者。
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