WO2013062365A2 - 변이 ｃｔｌａ4 유전자 이입 ｔ 세포 및 이를 포함하는 항암 면역치료용 조성물 - Google Patents

변이 ｃｔｌａ4 유전자 이입 ｔ 세포 및 이를 포함하는 항암 면역치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified T ⁇ cells for anti-cancer T-cell therapy and a composition for anti-cancer treatment comprising the same.
  • T-cell therapy has shown visible results.
  • T ⁇ cell therapy has the basic concept to isolate cancer antigen-specific T cells in the patient's body and to multiply them through in vitro cell culture and return them to the patient's blood to attack seed cancer cells. (Nat. Rev. Immunol., Vol. 6, pp 383). In other words, a small number of cancer-specific T-cells are amplified in vitro and used for treatment.
  • the antigen specificity and tissue penetrating power of T lymphocytes are expected to effectively remove cancer foci scattered in various places at once, and T-cells are directly exposed through extravasation. As it can infiltrate tissues and specifically kill antigen-expressing cells, it has the advantage of removing cancer cells by infiltrating several metastatic tissues respectively. Recently, the development of cell therapy using these anti-cancer T-cells has become more active. It is a situation.
  • LAK LAKUymphokine-activated killer
  • TIL tumor-infiltrating lymphocyte
  • Lymphocyte depletion prior to T-cell injection creates room for the next T-cell to proliferate, while regulating T-cells, a limiting factor for T-cell activation. It is estimated to have the effect of eliminating it. This response rate is the highest response ever to immunotherapeutics ever attempted, giving very encouraging predictions about its potential.
  • T-cell therapies Thanks to the success of cancer antigen-specific T-cell therapies, recent trends in T-cell therapies have led to genetic manipulation of isolated T-cells. Research into genetically engineered T cell therapy in patients is being actively conducted. Genetic T Cell Therapy After multiplying cancer antigen-specific T cells isolated from the cells, T-cells were transformed using a retrovirus for specific gene expression and re-injected into the patient. In many cases, clinical trials are already underway.
  • cancer antigen-specific T cells from the blood of patients with melanoma secrete IFN- ⁇ when stimulated with the cancer antigen Melan-A peptide
  • cancer antigen-specific T cells from cancer tissues or lymph nodes of cancer tissues has been reported to be inactivated, stimulating with cancer antigens, but not secreting IFN-Y.
  • T-cells in the peripheral blood of cancer patients that can recognize and respond to cancer cells, but when these T-cells enter cancer tissues, they are locally inactivated, i.e. tolerated.
  • T-cell tolerance caused by cancer cells is identified, and the functions of the cells are removed, their functions are eliminated or inhibited, antagonists or antibodies to the receptors, etc.
  • Representative receptors known to be involved in T-cell tolerance are CTLA4 (Cytotoxic Ttoxic Lymphocyte ⁇ Associated Protein 4, or T ⁇ Lymphocyte Antigen 4), also called CD152.
  • CTLA4 is a superfamily of immunoglobulins (i ⁇ unoglobulin) that is expressed on the surface of T ⁇ cells and transmits an inhibitory signal to T-cells. Tolerance induction through T-cell inactivation of CTLA4 protein was confirmed by the observation of severe lymphoproliferative disease and autoimmune disease in CTLA4 knockout mice.
  • CTLA4 has a sequence similar to that of CD28, a T ⁇ cell cost imulatory protein, and competitively binds to CD28 against CD80 and CD86, also called B7 in antigen-presenting cells.
  • CTLA4 carries an inhibitory signal and CD28 delivers a stimulatory signal. That is, the binding of B7 and CTLA4 inhibits the activation of T-cells, and the binding of B7 and CD28 induces T-cell activation.
  • PD1 is expressed on the T-cell surface; PE ) is known to inhibit T-cell activation by binding to -L1.
  • PD-L1 is a family member having a structure similar to that of CD28, and is mainly expressed on the surface of immune cells such as T-cells, B-cells, macrophages, and c ⁇ ndritic cells. It is also known to be expressed in some non-lymphoid cells such as cardiovascular endothelial cells.
  • T3 ⁇ 4 ⁇ ng ntibody has been reported to increase anti-cancer immunity (Proc. Natl. Acad. Sci., 17; 99 (19): 12293-7), PI) ⁇ L1 immunosuppressive action on the surface of cancer cells of Evidence is being reported one after another.
  • Ipilimumab an anti-CTLA4 antibody developed by BMS (Bristol-Myers Squibb), has been shown to be clinically effective in suppressing anticancer immunotolerance and showing antitumor effect against metastatic melanoma.
  • BMS Stel-Myers Squibb
  • CTLA4 or anti-PD1 antibodies when used, systemic inhibition of CTLA4 or PI) 1 results in systemic inhibition of T-cell tolerance to autoantigens as well as anticancer T-cells. It is known to cause fatal side effects of autoimmune diseases.
  • the present inventors genetically engineered anticancer T ⁇ cells to express CTLA4 decoy receptor, a CTLA4 mutant from which the intracellular inhibitory signaling domain of CTLA4 has been removed.
  • CTLA4 decoy receptor a CTLA4 mutant from which the intracellular inhibitory signaling domain of CTLA4 has been removed.
  • the inhibition of T ⁇ cell tolerance by cancer cells can be solved to some extent because the inhibitory signal is not transmitted to the cells even when the CLTA4 inducing receptor binds to the ligand B7.
  • Competitive inhibition of the binding of B7, a ligand, with CD28 which still induces T ⁇ cell activation, resulting in T- ⁇ _ ⁇ Zt ⁇ hindering.
  • the present inventors genetically engineered the CTLA4-CD28 chimeric protein by removing the intracellular inhibitory signal transduction domain of CTLA4 and integrating the intracellular stimulatory signaling domain of CD28 protein in place.
  • Designed anti-cancer T-cells see FIG. 1, when ligand is bound to CTLA4, T is induced by binding of CTLA4 to ligand by the action of intracellular activation signal transduction domain of CD28 contained in CTLA4-CD28 chimeric protein.
  • -It has the effect of converting the cell activity suppression signal into a stimulatory signal, which not only overcomes T ⁇ cell tolerance by cancer cells, but also improves anticancer ability through T-cell activation.
  • the object of the present invention is to remove the intracellular signaling domain of the T-cell immune tolerance receptor, and to fuse the intracellular signaling domain of the T-cell activating surface protein CD28 to the fusion protein and It provides a gene that encodes this.
  • Still another object of the present invention is to provide a cancer antigen-specific transformed T-cell transformed with a virus or a non-viral carrier comprising the gene and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the transformed T-cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the transformed T-cells to a subject with cancer disease.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of the transformed T-cells for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating cancer diseases.
  • CTLA4 CD28 chimeric protein or PD1-CD28 chimeric protein, and genes encoding the same.
  • the present invention is a viral or non-viral carrier comprising the gene
  • the present invention provides a manufacturing method.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the transformed T-cell of the present invention.
  • the present invention also provides a method for treating cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the transformed T-cells to a subject having a cancer disease.
  • the present invention provides a use of the transformed T-cell in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating cancer diseases.
  • T-cells incorporating the CTLA4-CD28 chimeric gene or PD1-CD28 chimeric gene according to the present invention not only solve the problem of inhibiting the therapeutic effect due to immunotolerance of cancer cells, but rather the signal transduction of CD28.
  • activating the T-cell has the advantage of maximizing the anticancer effect by inducing the activation,
  • CTLA4 or PI) 1 specifically in cancer cells, the development of autoimmune diseases due to systemic T-cell activation caused by the use of nonspecific CTLA4 or PD1 antagonists such as anti-CTLA4 antibodies. Side effects can be minimized.
  • the anticancer pharmaceutical composition comprising T-cells incorporating the CTLA4-CD28 chimeric gene or PD1-CD28 chimeric gene according to the present invention has T ⁇ cell immunotherapy having remarkably superior cancer treatment efficacy compared to conventional methods. It can be usefully used.
  • FIG. 1 is a diagram showing the principle of cancer treatment of cancer antigen specific T-cells expressing CTLA4-CD28 chimeric protein:
  • CTdc CLLA4 attractant receptor
  • CTC28 CTLA4-CD28 chimeric protein.
  • Figure 2 shows the gene construct and plasmid cleavage map for the expression of CTLA4 ⁇ CD28 It is a figure which shows.
  • CTLA4 EC extracellular domain of CTLA4
  • CD28 CP the intracellular domain of CD28
  • CTLA4 empty retroviral vector without CD28.
  • Figure 3 is a diagram showing the cell division capacity and IFN-Y secretion capacity of T-cells transformed with the CLTA4-CD28 chimeric gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing the secretion capacity of IFN ⁇ ⁇ , cancer cell killing ability and tumor treatment effect of CD8 T-cells transformed with CLTA4—CD28 chimeric gene.
  • FIG. 5 is a diagram showing antigen response when cell culture of T cells transformed with CLTA4 ′ CD28 chimeric gene.
  • Figure 6 is a diagram showing the combination of the engineered CD4 and CD8 T-cell combination therapy.
  • Figure 7 shows the effect of 0T-II ⁇ : ⁇ ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ for E.G7 tumors.
  • Figure 8 shows the 0T—IT cells and CTLA4-CD28 chimeric genes for E.G7 tumors.
  • Figure 1 shows the effect of the combined administration of 0T—II T—cells transformed into. (A: No processing, ⁇ : 0T-1 only, : T-1 + 0T-II, ⁇ : 0T-1 + OT-II CTC28)
  • FIG. 9 is a diagram showing the effect of tumor treatment by the simultaneous transformation of 0T-II and OT-1 ⁇ -cells.
  • Figure 10 shows the anti-melanoma effect of GM CD4 and CD8 T-cell combination therapy.
  • Figure 11 shows Akt phosphorylation of T-cells transformed with CTLA4-CD28 chimeric gene.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of analyzing a T-cell transformed using the gene constructs for CTLA4-CD28 expression using a flow cytometry.
  • Fig. 13 shows the secretion ability of IFN- ⁇ when each receptor of T-cells transformed with CTLA4-CD28 chimeric gene is stimulated.
  • Figure 14 shows the effect of OT-I T-cell administration alone on E.G7 tumors.
  • 15 is a diagram showing the number and antigenic reactivity of these T-cells in mouse spleen after administration of transformed 0T-I and OT-II T-cells to mice with E.G7 tumors.
  • FIG. 16 is a diagram showing the proliferation of genetically engineered T ' cells in the blood of melanoma efficacies of GM CD4 and CD8 T' cell combination therapy.
  • Figure 17 shows the effect on anti-melanoma of the engineered CD4 and CD8 T-cell combination therapy.
  • FIG. 18 is a diagram showing the effect of ILV2 on anti-melanoma of GM CD4 and CD8 T-cell combination therapy.
  • extracellular domain is protruded out of the cell to bind the ligand and the like .
  • Transmembrane domain refers to a domain located in the cell membrane in CTLA4, CD28, etc.
  • Intracellular domain refers to a domain located inside a cell and intracellularly delivering a signal transmitted by binding an extracellular domain and a ligand. The intracellular domain may be classified into an inhibitory signaling domain or an activat ion signaling domain according to the nature of the signal.
  • anticancer includes “prophylaxis” and “treatment”, where “prevention” means cancer antigen specific T- transformed with CTLA4-CD28 chimeric gene or TO1-CD28 chimeric gene according to the present invention. Means any action in which cancer is inhibited or delayed by administration of a composition comprising cells, wherein “treatment” refers to a cancer antigen specific T transformed with the CTLA4-CD28 chimeric gene or PD1 ⁇ CD28 chimeric gene according to the present invention.
  • the present invention provides an intracellular signaling domain of a T-cell surface immune tolerance inducing receptor. Remove and provide a fusion protein that fuses the intracellular signaling domain of the T-cell activating surface protein CD28.
  • the T-cell surface tolerance induction receptor and CD28, a T ⁇ cell activating surface protein are preferably fused by the T-cell surface tolerance induction receptor or the transmembrane domain of CD28, but are not limited thereto.
  • the T-cell surface tolerance induction receptor is preferably CTLA4 (Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen4) or PE) 1.
  • the fusion protein is preferably composed of an extracellular domain of CTLA4 ⁇ a transmembrane domain of CTLA4-an intracellular domain of CD28 or an extracellular domain of CTLA4-a transmembrane domain of CD28 ⁇ a CD28 intracellular domain.
  • the fusion protein is a cell in the extracellular domain of PE ) 1 -PI) 1 _domain rCD28 ⁇ 'i_domain or the extracellular domain of PD-1-transmembrane domain of CD28 -CD28 It is preferable that the domain is configured, but is not limited thereto.
  • the CTLA4 preferably has an amino acid sequence of human-derived SEQ ID NO: 1 or a mouse-derived SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence of 1 to 161 is a site that binds to an extracellular domain, that is, a ligand such as B7, and the amino acid sequence of 162 to 189 is a transmembrane domain,
  • the amino acid sequences from 190 to 223 represent intracellular domains.
  • the CD28 preferably has an amino acid sequence of human-derived SEQ ID NO: 3 or a mouse-derived SEQ ID NO: 4.
  • amino acid sequence of 1 to 152 is a site that binds to an extracellular domain, that is, a ligand such as B7
  • amino acid sequence of 153 to 178 is a transmembrane domain, 179 to 220.
  • Amino acid sequence up to and including the intracellular domain, amino acid sequence of amino acid sequence 1 to 150 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is the site that binds to the extracellular domain, that is, ligands such as B7, amino acids from 151 to 176
  • the sequence is the transmembrane domain, amino acid sequences 177-218 represent intracellular domains.
  • CTLA4 when used for the CLTA4 'CD28 chimeric protein, a portion of the CTLA4 intracellular domain is additionally added to the extracellular domain and the transmembrane domain of CTLA4 within the range where no intracellular inhibition signal of CTLA4 is transmitted. It will be apparent to those skilled in the art that the sequence is further included, or that the CD28 transmembrane domain further contains some sequence of the CD28 transmembrane domain, which is included in the scope of the present invention.
  • CTLA4-CD28 chimera When the transmembrane domain of CD28 is used in a protein, a portion of the extracellular domain of CD28 is further included in the intracellular and transmembrane domains of CD28 within a range that does not affect CTLA4 and ligand binding, or It is also common that the extracellular domain further includes some sequences of the CTLA4 transmembrane domain, which are included in the scope of the present invention. It is obvious to the technician.
  • CTLM-CD 28 chimeric protein source provided in the present invention has an amino acid sequence of any one of the example sequence L. No. 5 ′ .
  • the extracellular domain of CTLA4, the transmembrane domain of CTLA4, and the intracellular domain of CD28 are sequenced.
  • the amino acid sequence of No. 5 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is not limited thereto.
  • the extracellular domain of CTLA4 cell membrane domain of CD28
  • the intracellular domain of CD28 preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • the extracellular domain of PD1-transmembrane domain of PD1-intracellular domain of CD28 or extracellular domain of PE L-transmembrane domain of CD28-intracellular domain of CD28 preferably have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 It is not limited.
  • the present invention is a pore-t gene encoding the fusion protein of the present invention.
  • the cell domain of CTLA4-transmembrane domain of CTLA4 is preferably the nucleo sequence of SEQ ID NO: 9
  • the CD28 cell domain is the nucleotide of SEQ ID NO: 10 It is preferably an id sequence, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a virus or non-viral carrier comprising a gene encoding the fusion protein of the present invention.
  • the viral or non-viral carrier can be used without limitation as long as it can transform animal cells, especially T-cells, etc. by infection.
  • the virus is preferably a retrovirus, a lent ivirus, an adenovirus and an adeno-associated virus, preferably a retrovirus, a lentiviral and an adeno-associated virus.
  • a retrovirus preferably a retrovirus, a lentiviral and an adeno-associated virus.
  • the non-viral carrier is preferably one using a transposon system (Hackett et al., US 6,489,458) and the like, but is not limited thereto. It will be apparent to one skilled in the art that any match can be used.
  • the present invention also provides a T-cell transformed using a virus or non-viral carrier comprising a gene encoding a fusion protein of the present invention.
  • the T-cells are T-cells transfected with a cancer antigen specific T-cell or a CARCChimeric Antigen Receptor gene, which is a chimeric antigen receptor, and a cancer antigen-specific CD4 T-cell (Helper T—cell, helper T-cell). ) Or CD8 T-cells (cytotoxic T-cells).
  • the chimeric antigen receptor is a cell membrane or intracellular signal of T-cell activating proteins (CD3-zeta chain, CD28, 41BBL, 0x40, I COS, high-affinity receptor for IgE (FcsRI) and other T-cell activating proteins)
  • T-cell activating proteins CD3-zeta chain, CD28, 41BBL, 0x40, I COS, high-affinity receptor for IgE (FcsRI) and other T-cell activating proteins
  • the term "transplantation site” refers to a protein in which the delivery site is fused with a single chain Fv fragment of a cancer antigen-specific antibody.
  • T-cells specific for the cancer antigen are cultured in vitro with T-cells (tumor infiltrating lymphocytes) isolated from cancer tissues of the patient .
  • Viruses such as retroviruses are cloned after cloning genes that are known to be known as ' recognized ' receptors, ie, cancer antigen-specific T-cell receptor (TCR) genes.
  • T cell (Science. 2006; 314 (5796): 126-9), extracellular domain of T-cell receptor (TCR)
  • CAR Chimeric Antigen Receptor
  • CAR Transduced CAR ⁇ transfected T ⁇ cells
  • 116 (7): 1035-1044 may be used, but is not limited thereto.
  • the antigen that can be specifically recognized by cancer antigen-specific T cells are cancer antigen-specific T cells.
  • MAGE, WT-1, etc. may be exemplified, but is not limited thereto, and is specific to other cancers.
  • T-cells according to the present invention so long as the antigens expressed by the present invention also meet the object of the present invention.
  • the present invention removes the intracellular inhibitory signal transduction domain of CTLA4 and replaces
  • An anticancer T-cell engineered to express white matter was designed and loaded into CTLA4.
  • CTLA4-CD28 chimeric gene or PD1-CD28 chimeric according to the present invention
  • Anti-cancer treatment ⁇ pharmaceutical composition comprising transgenic T-cells . _silver. It can be useful for T cell-cell immunotherapy, which has remarkably superior cancer efficacy compared to conventional methods.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the transformed T-cells of the present invention.
  • the cancer pharmaceutical composition may comprise a cancer antigen specific CD4 T-cell or CD8 T-cell transformed with CTLA4-CD28 chimeric gene or PD1-CD28 gene, CTLA4—CD28 chimeric gene or PD1— More preferably, it includes both cancer antigen specific CD4 T—cells and CD8 T-cells transformed with the CD28 gene.
  • the cancer or carcinoma is not particularly limited and includes solid cancer and hematological cancer.
  • gastric cancer Preferably gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, Renal cancer, esophageal cancer, biliary cancer, testicular cancer, rectal cancer, head and neck cancer, cervical cancer, ureter cancer, osteosarcoma, neuroblastoma, myeloma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, astrocytoma, neuroblastoma or glioma, etc.
  • compositions according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for oral administration, binders, suspending agents, disintegrating agents, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizing agents, suspending agents, pigments, flavorings, and the like may be used.
  • Isotonic and stabilizing agents can be used in combination, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared in various ways in combination with the pharmaceutically acceptable carriers described above.
  • the anticancer composition may typically include a surfactant that facilitates movement across the membrane.
  • surfactants include the steroid-standing _ .. ⁇ 3 ⁇ 4 0 lZii ⁇ U (I, -3 ⁇ dieul LES oil) propyl - ⁇ , ⁇ , ⁇ - chloride (D0TMA) cationic lipids, or such call Leste And various compounds such as hemisuccinate and phosphatidyl glycerol.
  • the present invention administers to a subject a composition comprising a cancer antigen-specific T cells transformed with the CTLA4 ′ CD28 chimeric gene or PD1-CD28 chimeric gene according to the present invention to treat cancer and inhibit cancer growth.
  • a composition comprising a cancer antigen-specific T cells transformed with the CTLA4 ′ CD28 chimeric gene or PD1-CD28 chimeric gene according to the present invention to treat cancer and inhibit cancer growth.
  • composition according to the invention can be administered in a pharmaceutically effective amount to treat cancer cells or their metastases, or to inhibit the growth of cancer. It may vary depending on various factors such as cancer type, age of the patient, the nature and extent of symptoms, the type of current treatment, the number of treatments, the dosage form and the route, and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the composition according to the present invention may be administered together or sequentially administered with the pharmacological or physiological components described above, and may also be administered in combination with additional conventional therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. . Such administration may be single or multiple administration.
  • Pmel-1, ⁇ - ⁇ , B6 and Thyl.l + congenic B6 mice were obtained from Jackson Lab.
  • 0T-II mice with RAGF 7 ' background were obtained from Taconic. All transgenic mice have a B6 background. Mice were reared in a facility free of specific pathogens within the National Cancer Center and followed the guidelines of the National Center for Laboratory Animal Care and Use.
  • E.G7 lymphoma cells and B16-F10 (B16) melanoma cells were from B6 mice.
  • Phoenix E.co® and Pheonix GP cell lines were obtained from ATCC under the permission of Dr. Garry Nolan (Standford University) (ATCC No. SD3444 and SD3514).
  • CD8 T cells or CD4 + CD25— cells were positively selected using anti-CD8 microbeads (inicrobeads), or CD4 + CD25-regulated T-cell separation kit (Myltenyi). Biotec) was used for negative selection (negative selection).
  • Nucleotide sequences encoding the extracellular and transmembrane domains of mouse-derived CTLA4 (SEQ ID NO: 9) and the nucleotide sequences encoding the intracellular domain of mouse CD28 (SEQ ID NO: 10) for the production of CTLA4-CD28 chimeras were determined by mouse CTLA4 and It was obtained by amplification by polymerase chain reaction (PCR) from the fulllasmid containing CD28 cDNA.
  • the two amplified fragments were combined by blunt end ligation and cloned into a cloning vector.
  • the cDNA of the CTLA4-CD28 chimeric gene was then cloned into pMIG-w retroviral vector (see FIG. 2 (a)) obtained from Dr. Yosef Refaeli of the National Jewish Medical and Research Center.
  • CTLA4 attractant receptor was amplified by PCR using nucleotide sequences encoding the extracellular and transmembrane domains of CTLA4 according to SEQ ID NO: 9 and cloned into pMIG-w retroviral vector (see FIG. 2 (b)). .
  • Jurkat T-cells (1 ⁇ 10 7 ) are retroviral expression plasmids, RE / AP luciferase fulllasmid (provided by Professor Arthur Weiss of the University of California) and pRL-TK Renilla luciferase for standardization was combined with plasmid (Promega).
  • transformation was performed using electroporation at 0.4-cnrgap using Gene Pulser of Bio-Rad Laboratories at 250 V and 950 uF.
  • Luciferase activity was measured using a luminometer (luminometer, Promega, Promega) using a dual-luciferase reporter assay system. The activity of Drosophila luciferase was normalized using Renilla luciferase activity.
  • Jurkat T-cells were transformed according to the above protocol using only retrovirus plasmids except luciferase plasmids.
  • the transformed cells were treated for 10 minutes on ice using either mouse anti-human CD28 antibody or normal hamster IgG or hamster anti-mouse CTLA4 antibody (2 yg / ml). This was followed by crossl inking with goat anti-mouse IgG or anti-hamster IgG (5 yg / ml) for 10 minutes on ice.
  • the plasmid pMD.G which encodes a retroviral plasmid and VSV-G cDNA, was transformed into a Phoenix GP cell line using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). (transfection). After 48 hours, the supernatant containing VSV G pseudotyped retrovirus was recovered. Phoenix Eco cell line was transformed overnight using supernatant containing retrovirus.
  • GFP-positive Phoenix Eco cell lines were developed to produce stable producers for producing ecotropic retroviruses. sorter) (FACS Aria, BD Biosciences).
  • the supernatant containing ecotropic retrovirus was recovered and concentrated 10-fold using a centrifugal filter device (Ami con Ulra-15, cutoff value 100 kDa, Millipore, Millipore).
  • Splenocytes from normal or transformed mice were transformed into anti-CD3s (5 ug / ml, 145-2C11) and anti-CD28 (2 ug / ml, bound to the plate for transformation of T-cells with retroviruses. 37.51) Stimulated using antibodies or antigenic peptides.
  • T-cells were centrifuged at 2500 rpm for 90 minutes using concentrated retroviruses. (Spin infection). This process was repeated one more day.
  • spin infection 6 iig / ml of polybrene (Sigma, Sigma) was added to the culture supernatant, or retrospectin-coated plates ((15 ⁇ g / ml, Takara)
  • polybrene Sigma, Sigma
  • retrospectin-coated plates ((15 ⁇ g / ml, Takara)
  • the procedure was performed 48 hours after stimulation, transformed T-cells were fresh containing 30 unit / nil mouse IL-2 (Invitrogen). Transferred to fresh medium and left for 48-72 hours before pumice.
  • GFP-positive cells (2x10 4 / wel U) isolated by cell-sorting were treated at various concentrations in the presence of irradiated splenocytes (2x 10 5 / wel 1) for 48 hours. Stimulated using CD3 antibody or antigen peptide.
  • Cytokines in supernatants were measured using ELISA Sets from BD Biosciences.
  • transformed Pniel-l T-cells were stimulated with 1 ⁇ hgplOO peptide in the presence of spleen cells for 48 hours and then various activated T-cells were detected. After co-culture with B16 cells (1 ⁇ 10 4 ) for 20 hours, the cells were washed with PBS. The remaining B16 cells were washed for 6 hours at 3 ⁇ 4 thymidine for recovery and radioactivity of cells. ) was pulsed.
  • Transformation using T-cell (Adoptive T-cell transfer)
  • mice were injected subcutaneously at day 0 with either E.G7 cells (1-2 ⁇ 10 6 ) or B16 cells (1 ⁇ 10 5 ). T-cells transformed with retroviruses were introduced into mice on day 7. In the B16 melanoma model, on the day T-cells were introduced, mice were subjected to lymphocyte depletion by nonmyeloablative total body irradiation (TBI) (4 Gy).
  • TBI nonmyeloablative total body irradiation
  • Tumor growth was measured at intervals of 3-4 days using a caliper, and the approximate size was calculated as follows: length X width G ⁇ X ⁇ .
  • mice were euthanized when tumors exceeded 500 ⁇ 2 .
  • extracellular extracellular (ex vivo)
  • the T- cells were fixed and the tube cylinder (fixed and permeabi 1 i zed) (BD cytof ix / cytoperm kit) active on dwin i Then, stained with PE_labeled anti-mouse IL-2 or IFN-Y.
  • CTLA4 mutant and CTLA4 decoy receptor and CTLA4-CD28 chimeric protein (SEQ ID NO: 2), in which the intracellular inhibitory signaling domain of mouse-derived CTLA4 (see SEQ ID NO: 2) has been removed
  • a retroviral construct expressing 6) was constructed as disclosed in FIG. 2 (b).
  • EV refers to pMIG-w, a retroviral vector in which nothing is inserted, and cDNA of CTLA4—CD28 chimera (CTC28) gene and CTLA4 attractant receptor (CTdc) is the IRES-GFP (green fluorescent protein) of pMIG-w. ) Is inserted in front of the cassette.
  • CTC28 CD28 chimera
  • CTdc CTLA4 attractant receptor
  • Jurkat T-cells were treated with an empty plasmid containing no CLTA4 attractor or CTLA4T £ D.28-Mera gene, and a RE / AP luciferase plasmid containing a CD28 response element. After transformation, anti-CD3 and anti-CD28 antibodies When stimulated with anti-CD3 antibody as previously reported. It was confirmed that luciferase activity is significantly increased compared to the case of stimulating alone (see FIG. 3 (a)). This demonstrates that signaling by endogenous CD28 is well occurring.
  • Akt phosphorylation was not increased in the Jurkat cell line transformed with the CTLA4 attractant gene, whereas Akt phosphorylation was performed after the CTLA4—CD28 chimera was transformed into the Jurkat cell line and stimulated with an anti-CTLA4 antibody. Phosphorylation was confirmed to increase (see FIG. 11).
  • the spleen cells were transformed with an empty plasmid containing no CTLA4-CD28 chimeric gene and a plasmid having a GFP reporter gene containing a CD28 response element, followed by anti-CD28 and anti-CTLA4.
  • stained with antibodies and ⁇ u GE £ - i-positive cells for analysis using flow cytometry sorter CTLA4-CD28 chimeric expression levels were identified that were higher than endogenous CTLA4 expression levels (see Figure 12).
  • CTLA4-CD28 chimeric expression levels were identified that were higher than endogenous CTLA4 expression levels (see Figure 12).
  • the transformed spleen T-cells were stimulated with anti-CD3, anti-CD28 and anti-CTLA4 antibodies, overexpression of CTLA4-CD28 reduced the IFN- ⁇ inhibitory ability of the anti-CTLA4 antibody. Confirmed. (See Figure 13).
  • CTLA4—CD28 chimeric protein does not transmit an inhibitory signal when the ligand binds to the extracellular domain of CTLA4, as well as the CD28 intracellular domain of CTLA4-CD28 chimeric protein. It has been shown that T-cell activation is markedly increased by delivering stimulatory signals intracellularly.
  • an antigen-specific TCR trait called i1 ⁇ 2el-l CD8 T-cells (Pmel-1 T-cells) derived from converting mice were transformed using retroviruses containing the CTLA4-CD28 chimeric gene.
  • Pmel-1 T-cells specifically recognize gplOO, a tumor antigen expressed on the surface of syngenic B16 melanoma cells.
  • the transformed Pmel-1 T-cells showed higher IFN- ⁇ secretion ability than the control (see Fig. 4 (a)), but cytolytic activity on in-vitro against B16 cells. ) Showed no significant improvement (see Figure 4 (b)).
  • Pniel-l T-cells transformed with CTLA4—CD28 chimeric gene showed significant anti-tumor effect when transplanted into lymphocyte-depleted B16 tumor-bearing mice, even when co-treated with high doses of IL-2. It can be confirmed that (see Fig. 4 (c)).
  • Pmel-1 T-1 cells transformed with the CTLA4-CD28 chimeric gene did not show a significant improvement in its function.
  • an anti-OVA TCR transgenic mouse designed to express TCRs that specifically recognize ovalbumin (OVA) in T ⁇ cells was introduced. It was.
  • T cell activation by the OVA antigen was confirmed by the secretion ability of IL2 and IFN-Y.
  • 0T-I and 0T-II T-cells were transformed with retroviruses containing the CTLA4-CD28 chimeric gene and then measured for cytokine production. Stimulated with OVA in the presence of antigen presenting cells (APC).
  • 0T-1 CTC28 or 0T-II CTC28 means 0T ⁇ 1 T-cell or 0T-II T-cell transformed using CTLA4-CD28 chimeric gene.
  • CD4 ⁇ -cells are known to have anti-tumor traces of CD8 ⁇ -cells and are known as ⁇ F ⁇ r ⁇ ⁇ ⁇ r3 ⁇ 4T Reinforced CD4 anti-tumor antitumor-specific CD8 T-cells
  • the tumor effect could be doubled.
  • the present inventors have investigated whether CD4 T-cells transformed using the CTLA4-CD28 chimeric gene can increase the anticancer efficacy of CD8 T-cells by using 0T-I and O-Tl cells according to Experiment 3 Tested. For this, OVA was selected as a model tumor antigen, and a syngeneic EL4 lymphoma cell line (E.G7) transformed with OVA cDNA was selected as a tumor model (see FIG. 6).
  • the results presented in FIGS. 7 and 8 represent at least two independent experimental results.
  • CTLA4-CD28 chimeric gene increased the antigenic reactivity of CD8 T-cells, although it was less effective than CD4 T-cells.
  • CTLA4 and CD28 chimeric genes were used to transform both 0T—II T-cells and 0T-I T-cells to determine whether they could be transformed.
  • transfection with the CTLA4-CD28 chimeric gene when injected into mice with E.G7 tumors (see FIG. 6), only 0 ⁇ - ⁇ Compared with the case of transformation, it showed a much stronger anti-tumor effect.
  • mice with E.G7 tumors were isolated from mice injected with gene-transformed 0T-I and 0T ⁇ II T-cells. And Tov cells were stimulated in vitro with an ovalbumin (0VA) peptide. Genetically transformed 0T-II T-cells had a much higher percentage of IL-2 and IFN ⁇ ⁇ -producing cells than control 0T ⁇ II T-cells when analyzed by intracellular cytokine staining in cells ( See FIG. 15 (a)). In addition, the total number of gene transformed 0T—II T-cells was increased compared to control 0 ⁇ - ⁇ T—cells (see FIG. 15 (b)).
  • the present invention isolated ovalbumin peptides in vitro after isolating whole CD8 T ⁇ cells and transforming 0T-IT-cells transformed with the same number of genetically-transformed 0T-I and empty vectors. And incubated with antigen presenting cells (APCs).
  • the present invention measured IFN-y secretion by ELISA.
  • transgenic 0T—I T-cells produced a greater amount of IFN-Y than 0T-I T-cells transformed with empty vectors (see FIG. 15 (c)).
  • the genetically transformed 0T-I and 0T-II T-cells retained their increased activity even after administration to mice with tumors.
  • Model for Experimental Example 4 the model containing the actual tumor antigen using 0VA called artificial tumor antigen for the test because the anti-tumor effect, CTLA4 eu CD28 transformed with the chimeric gene and the CD4 T-eu CD ⁇ yo cells It is necessary to test the antitumor effect in B16 melanoma is one suitable model tumor because it has an endogenous gplOO antigen specifically recognized by Pme ⁇ 1 CD8 T ⁇ cells.
  • B16 tumors have poor immunogenicity (i ⁇ nugenecity) and are known to be resistant to T-cell immunotherapy, and Pmel-l T-cells transformed with CTLA4-CD28 chimeric gene in the present invention.
  • the antitumor effect was not significantly improved (see Experimental Example 2), it was reported that T-cell immunotherapy using Pmel-1 T ⁇ cells could be effective by adding polyclonal CD4 T-cells. have.
  • Pmel-l T-cells which are CD8 T-cells, were brewed and observed for decreasing tumor volume.
  • polyclonal CD4 T cells (regulatory T—CD4 + CD25—populations) isolated from B6 mice were transformed with CTLA4-CD28 chimeric genes. 1 T-cell and used in combination therapy.
  • CTLA4-CD28 transformation significantly increased IL-2 secretion in CD4 T-cells (see FIG. 5 (a))
  • the present invention is directed to the therapeutic effect of gene-transformed T ⁇ cells in vivo. I knew if I needed -2. As expected, in vivo anti-IL-2 neutralizing antibody treatment resulted in almost no therapeutic effect of gene transformation (see FIG. 18). In conclusion, these results effectively inhibit tumors that have already grown significantly (pre-established) and immunogenicity by selective cell therapy with CTLA4-CD28 gene-transformed CD4 and CD8 T-cells. It has been shown that IL-2 contributes significantly to this therapeutic effect.
  • Pmel-l EV is not transformed Pmel-1 T-cell
  • CD4 EV is not transformed CD
  • Pmel-1 CTC28 means F3 ⁇ 4el-1 T-cell transformed with CTLA4-CD28 chimeric gene
  • CD4 CTC28 refers to CD4 T-cells transformed with CTLA4-CD28 chimeric gene.
  • T-cell immunotherapy with T ⁇ cells transformed with the CTLA4-CD28 chimeric gene induced a large increase in antitumor effect in the combination therapy of CD4 and CD8 T-cells.
  • the efficacy of anticancer T-cell immunotherapy can be greatly increased.

Abstract

본 발명은 항암 T-세포 요법(T-cell therapy)을 위한 형질전환된 T-세포 및 이를 포함하는 항암 치료용 조성물에 대한 것으로, 구체적으로는 상기 형질전환된 T-세포는 T-세포 표면 면역관용(immune tolerance) 유도 수용체인 CTLA4 또는 PD1의 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 제거하고, 이에 T-세포 활성화 표면 단백질인 CD28의 세포내 활성화 전달 도메인을 결합시킨 CTLA4-CD28 키메라(chimera) 단백질 또는 PD1-CD28 키메라 단백질을 코딩하는 유전자가 이입된 것을 특징으로 한다. 상기 CTLA4-CD28 키메라 단백질 또는 PD1-CD28 키메라 단백질을 코딩하는 유전자가 이입된 T-세포는 암 세포의 면역관용 유도로 인한 치료효과 저해 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라, 오히려 CD28의 신호 전달을 활성화시켜 T-세포의 활성화를 유도함으로써 함암 효과를 극대화시킬 수 있다는 장점이 있다. 또한 암세포에 특이적인 T-세포에서만 CTLA4 또는 PD1의 활성을 억제함으로써, 기존 항-CTLA4 항체 등 비특이적 CTLA4 또는 PD1 길항제(antagonist)를 이용할 경우 발생하는 전신적 T-세포 활성화로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 최소화할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
변이 CTLA4유전자 이입 T 세포 및 이를 포함하는 항암 면역치료용 조 성물
【기술분야】
본 발명은 항암 T—세포 요법 (T-cell therapy)을 위한 유전자 변형된 Tᅳ세포 및 이를 포함하는 항암 치료용 조성물에 관한 것이다. 【배경기술】
암의 치료에 있어 가장 일차적이고 효과적인 방법은 외과적 절제술이다. 그 러나 외과적 절제만으로는 잔존 암 (residual tumor)나 전이성 병소 (metastatic foci)의 제거가 쉽지 않으므로 그동안 화학 요법 (chemotherapy), 방사선 요법 (radiation therapy) 등 여러 치료방법이 외과적 절제술과 병행되어 왔다. 그러나 이러한 다양한 치료법의 발전에도 불구하고 다발성 전이 (multiple metastasis)나 외과적 절제 후 보이는 생화학적 재발 (biochemical recurrence)의 효과적인 치료는 아직 어려운 실정이며 현재 의학계가 해결해야 할 큰 숙제로 남아있다.
이러한 여러 장기의 종양 병소 (tumor foci)나 가시적으로 확인이 불가능한 미세 병소 (micro-foci)의 치료를 위한 좋은 대안으로 체내의 면역계를 이용한 면역 요법이 최근 각광받고 있으며， Robert Schreiber.등에 의해 임파구결핍 생쥐나 강 력한 효과 사이토카인 (effector cytokine)인 인터페론 (IFN)ᅳ γ 낙아웃 (Knockout) 생쥐 등에서 암의 발생 빈도가 현저하게 증가함이 관찰됨으로써 암 발생이 면역계， 특히 임파구에 의해 억제되고 있다는 개념이 신빙성을 얻고 있고 (Nature, 2001,. vol410; 1107-1111), 특히 암환자의 체내에 암 -관련 항원 (tumor-associated antigen)을 인지할 수 있는 특이적인 항체 또는 T-세포가 존재한다는 보고가 잇따 르고 있음은 항암 면역요법의 적용 가능성이 매우 높음을 입증하는 것이다.
최근 들어 면역요법 중에 가장 각광 _ ^있 료_ 으로^ 세-포 ^ᅳ자 - 연살해세포 (Natural Killer Cell ： NK세포)， T-세포 등 면역세포를 환자에게 직접 주입하는 세포치료법을 들 수 있다. 그 중에서도 T-세포 치료법은 가시적인 성과를 을리고 있는데， Tᅳ세포 치료법은 환자 체내의 암 항원 특이 T세포를 분리하여 체외 (in vitro) 세포 배양을 통해 대량 증식하여 다시 환자의 혈액으로 돌려줌으로씨 암세포를 공격하도록 한다는 기본적인 개념을 가지고 있다 (Nat. Rev. Immunol . , Vol. 6 , pp 383). 즉， 소수의 암 특이 T-세포를 체외 배양을 통해 그 수를 증폭시 켜 치료에 이용한다는 것이다. 특히 T 림프구 (T lymphocyte)가 가지는 항원 특이성과 조직침투력은 여러 곳에 산재해 있는 암 초점을 한꺼번에 효과적으로 제거할 수 있는 것으로 기대를 모으고 이는데， T-세포는 스스로 혈관외유출 (extravasation)을 통해 직접 조직에 침투하여 특이적으로 항원을 발현하는 세포를 살해할 수 있으므로 여러 전이조직에 각각 침투하여 암세포를 제거할 수 있는 장점을 가지고 있어， 최근 이들 항암 T-세 포를 이용한 세포치료법 개발이 활발해지고 있는 상황이다.
T-세포를 이용한 세포치료는 미국 국립보건원 (NIH)의 Steve Rosenberg 박사 를 주축으로 지난 20~30년간 LAKUymphokine-activated killer), TIL(tumor- infiltrating lymphocyte)등의 이름으로 시도되어 왔으나, 그 유효성은 제한적으로 만 입증되어 왔다. 하지만， 최근 T-세포 주입 전에 환자의 림프구 (lymphocyte)를 미리 고갈 (depletion)시키는 시도를 통하여 전이성 흑색종 (metastat ic melanoma) 환자에서 완전 회복 (complete remiss ion)를 포함하여 50%의 반응율 (response rate) 을 보고함으로써 선택적 T-세포 전달요법 (adoptive T cell transfer therapy)에 중 요한 돌파구를 열었다고 평가되고 있다 (Science. 2002;298(5594) :850—4， J. Clin. Oncol. 2005；23 (10 ):2346-57). T-세포 주입 전 림프구 고갈 ( lymphocyte depletion) 은 다음에 주입될 T-세포가 증식할 여지 (space)를 만들어 주는 한편， Tᅳ세포 활성 화의 제한요소인 조절 T-세포 (regulatory T cell)을 제거해 주는 효과가 있을 것으 로 추정되고 있다. 이러한 반응률은 현재까지 시도된 면역치료법 사상 가장 높은 반응를로써 그 발전 가능성에 대한 매우 고무적인 예측을 불러일으키고 있다.
암 항원 특이적 T-세포 요법의 성공에 힘입어 최근 T-세포 요법의 경향은 분리한 T-세포에 유전자 조작을 ^^ ^ _질_및ᅳ효 _능_을ᅳ ¾ ᅵ - ᅳ후ᅳ다시 환자에게 주입하는 유전자 조작 T-세포 요법 (genetically engineered T cell therapy)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 유전자 조작 Tᅳ세포 요법은 환자로 부터 분리된 암항원 특이적 T세포를 증식시킨 후， 특정 유전자 발현용 레트로바이 러스 (retrovirus)를 이용하여 T-세포를 형질전환 (transduct ion)시켜 환자에게 재주 입하는 개념이며， 이러한 개념은 실험실 수준을 벗어나 이미 많은 예에서 임상시험 이 진행되고 있다.
'
그러나， 이러한 암 특이 T-세포를 이용한 암 치료요법을 통해 암세포를 효 과적으로 제거하기 위해서 반드시 넘어야 할 장애요인으로 암세포가 가지는 면역저 항성 혹은 면역억제력이 존재한다. 면역계의 종양 억제능에도 불구하고 정상생쥐에 서나 면역능을 유지하고 있는 정상인에서 암이 발생한다는 것은 암세포가 면역계에 저항할 수 있는 면역저항성 또는 면역회피성을 보유하게 된다는 것을 의미한다. 암세포의 면역저항성이 생기는 원인은 아직 명확하게 밝혀지지는 않았으며 , 여러 가설이 제시되고 있지만， 암세포가 항암 임파구에 대한 관용 (tolerance)을 유 도한다는 설이 유력하다. 즉， 인체 내에는 실제 암세포를 인지하고 파괴시킬 수 있 는 T-임파구가 존재하지만 암세포 혹은 암세포주위의 미세 환경 (microenvironment) 이 이들 항암 Tᅳ세포를 불활성화 시킨다는 것이다.
실제로 혹색종 환자의 혈액에서 채취한 암항원 특이 Tᅳ세포는 암 항원인 Melan-A 펩타이드로 자극하면 IFN-γ를 분비하는 반면， 암 조직이나 암 조직 림프 절에서 채취한 암 항원특이 T-세포는 암 항원으로 자극해도 IFN-Y를 분비하지 못 하는 비활성화상태에 있다는 보고가 있다. 이는 암 환자의 말초혈액에는 암 세포를 인지하여 반응할 수 있는 T—세포가 존재하지만 이들 T-세포가 암 조직에 가게 되면 국소적으로 비활성화， 즉 관용 (tolerance)에 빠지게 됨을 의미한다.
이는 역으로 말하면， 암 세포에 의한 Tᅳ세포 관용을 제거하게 되면 암세포 가 Tᅳ세포에 의해 효과적으로 제거될 수 있음을 의미한다. 따라서 암세포에 대한 면역학적 관용을 깨서 항암 임파구를 활성화시키는 것이 항암 면역요법의 중요한 선결과제라고 할 수 있다.
이러한 암 세포에 의한 T-세포 관용을 제거하기 위한 다양한 연구가 진행되 어 왔다. 특히 암 세포에 의한 T-세포 관용에 관¾ ^ᅳ^ 는ᅳ -질ᅳ등을 규명하고, 이의 기능 (function)을 제거 또는 억제하거나， 수용체에 대한 길항제 (antagonist) 또는 항체 (antibody) 등을 이용하여 치료효과를 높이기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 대표적으로 T-세포 관용에 관여하는 것으로 알려진 수용체는 CTLA4 (Cytotoxic Tᅳ Lymphocyteᅳ Associated Protein 4, 또는 Tᅳ Lymphocyte Antigen 4)로서， CD152라고도 불린다. CTLA4는 면역글로불린 (i瞧 unoglobulin)의 슈퍼패밀리 (superfamily)의 일종으로， Tᅳ세포의 표면에 발현되며 T-세포에 저해신호 (inhibitory signal)를 전달한다. CTLA4 단백질의 T-세포 비활성화를 통한 관용유 도현상은 CTLA4 낙아웃 마우스 (knockout mice)에서 심각한 임파구증식성 질환 (lymphoproliferative disease) 및 자가면역질환이 관찰됨으로써 확인되었다.
CTLA4는 Tᅳ세포 보조자극인자 (cost imulatory protein)인 CD28과 유사한 서 열을 가지며， 항원제시세포 (antigen-presenting cells)의 B7이라고도 불리는 CD80 및 CD86에 대해 CD28과 경쟁적으로 결합하는데， B7과 결합할 경우 CTLA4는 저해신 호를， CD28은 자극신호 (st imulatory signal)를 전달한다. 즉， B7과 CTLA4이 결합하 면 T-세포의 활성화 (activation)를 저해하며， B7과 CD28이 결합하면 T-세포의 활성 화를 유도하는 것이다.
Tᅳ세포 관용에 관여하는 또 다른 단백질은 PD1이다. PD1은 T-세포 표면에 발현되며; PE)-L1과 결합하여 T-세포의 활성화를 저해하는 것으로 알려져 있다. PD- L1은 CD28와 유사한 구조를 가진 패밀리 멤버 (family member)로서， 주로 T-세포， B-세포， 마크로파지 (macrophage), 수지상 세포 (c^ndritic cell) 등의 면역세포 표 면에 발현되며， 심장 혈관내피세포 등 일부 비림프성 (non- lymphoid) 세포에서도 발 현되는 것으로 알려져 있다.
PD1 낙아웃 마우스 (knockout mouse)에서 자연적으로 자가면역질환이 생기고， PD1 자극에 의해 Tᅳ세포 내부에 음성 신호 (negative signal)가 전달되는 등, PDᅳ L1 과 PI)1의 상호작용을 통한 T-세포 활성 억제현상은 면역관용현상에서 매우 중요한 것으로 알려져 있다.
그런데 최근, 많은 종류의 암 조직에서 PD-L1의 발현이 증가되어 있는 것이 관찰되었으며 (Nat. Med. , 2002 -
Figure imgf000006_0001
T¾^ng ntibody)를 처리하면 항암 면역이 증가되었다는 보고가 있는 등 (Proc. Natl. Acad. Sci., 17；99( 19)： 12293-7) , PI)ᅳ L1이 암세포 표면에서 면역억제작용을 하고 있다는 증거들이 속속 보고되고 있다.
따라서， CTLA4나 PI)1과 같이 T—세포 면역관용 반웅에 관여하는 수용체나 단 백질의 활성을 억제하면 항암 효과를 거둘 수 있을 것이라는 기대에 따라, CTLA4나 PD1에 대한 항체 등 이의 활성을 억제하는 전략의 Tᅳ세포 면역요법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
특히， BMS(Bristol-Myers Squibb) 등이 개발한 항ᅳ CTLA4 항체인 이필리무맵 (Ipilimumab)은 항암 면역관용을 억제하여， 전이성 혹색종 (metastat ic melanoma)에 대한 항종양 효과를 보임이 임상적으로 입증되에 2011년 FOA 허가를 취득하여 현 재 시판 중에 있으며， BMS 등은 완전 인간형 항ᅳ PD1 항체에 대한 임상시험도 진행 중에 있는 것으로 알려져 있다.
하지만， 항 -CTLA4 항체나 항ᅳ PD1 항체를 사용할 경우, CTLA4 또는 PI)1의 전 신적 억제 (systemic inhibition)로 인해 항암 T-세포 뿐 아니라， 자가항원에 대한 T-세포 관용도 파괴함으로써， 전신적인 자가면역질환이라는 치명적인 부작용을 초 래하는 것으로 알려져 있다.
따라서， 암 항원 특이적 T-세포 요법의 실질적인 임상 적용을 위해서 항암 T-세포 에 대해서만 선택적으로 CTLA4또는 PD1 등의 T-세포 관용 신호전달체계를 저해할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이에, 본 발명자들은 CTLA4의 세포내부 억제신호 전달도메인 (intracellular inhibitory signaling domain)이 제거된 CTLA4 돌연변이체 (mutant)인 CTLA4 유인 수용체 (CTLA decoy receptor)를 발현하도록 항암 Tᅳ세포를 유전자조작하여， Tᅳ세포 고유의 CTLA4 (endogenous CTLA4) 기능을 경쟁적으로 억제함으로써 항암 T-세포의 활성을 증가시키려 하였다. 그러나, 실제 이렇게 유전자 조작된 항암 Tᅳ세포의 경 우, CLTA4 유인 수용체가 리간드인 B7과 결합하더라도 세포 내부로 억제신호가 전 달되지 않으므로 암세포에 의한 Tᅳ세포 관용 문제는 어느 정도 해결할 수 있지만， 여전히 Tᅳ세포의 활성화를 유도하는 CD28과 리간드인 B7의 결합을 경쟁적으로 억제 (competitive inhibition)함으로써 결과적으로 T-^^_ ^ Zt^회훼 -해-된-다
-는^ r점可 7 이에， 본 발명자들은 상기 CTLA4의 세포내부 억제신호 전달 도메인을 제거 하고， 그 자리에 CD28 단백질의 세포내부 활성화신호 전달 도메인 (intracellular stimulatory signaling domain)을 융합시킨 CTLA4-CD28 키메라 단백질을 발현하도 록 유전자 조작된 항암 T-세포 (도 1 참조)를 고안하여， CTLA4에 리간드가 결합될 경우, CTLA4-CD28 키메라 단백질에 포함된 CD28의 세포내부 활성화신호 전달 도메 인의 작용에 의해 CTLA4와 리간드의 결합으로 인한 T-세포 활성 억제신호를 활성화 신호 (stimulatory signal)로 바꾸는 효과를 가져오게 되므로, 암 세포에 의한 Tᅳ세 포 관용을 극복할 수 있을 뿐 아니라, T-세포의 활성화를 통해 항암 능력이 향상되 는 효과를 가져음으로써 항암 효능이 크게 향상되며, 또한 전신적인 CTLA4 활성 억 제로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 회파할 수 있어 이상적인 Tᅳ세포 면역 요법에 이용가능하다는 점을 확인하였고， 또한, CTLA4와마찬가지로 T-세포 관용에 관여하는 것으로 알려진 PD1의 세포내 도메인을 제거하고, 이에 CTLA4-CD28 키메라 단백질과 유사하게 PD1-CD28 키메라 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 T—세포 역 시 T세포 활성화를 증가시켜 이상적인 Tᅳ세포 면역요범에 이용가능함을 확인함으로 써 본 발명을 완성하였다.
【선행기술문헌】
【특허문헌】
미국등록특허 8026224： Tumor eel Is with increase immunogenecity and uses thereof, 등록일자: 2011년 9월 27일, 출원인： Dana-Farber Cancer Institute, Inc .
미국등록특허 7744875: Surrogate therepeutic endpoint for anti-CTLA4 — base immunotherapy of disease, 등록일자: 2010년 6월 29일， 출원인: Medarex, Inc.
미국등록특허 7700556： Method of treatment using CTLA4 mutant molecules 등록일자: 2010년 4월 20일， 출원인: Britsol-Myers Squibb Co.
【비특허문헌】
" S^Lyc t uiaL_3aa. Lysi_s_.oi ...CTLA-4 -. f uHet-i-en— i-n— vi-vc ~ Μ'33"ϋθ"ΓΓβτ~ΈΤΤν " "e t al, J Immunol. 2000 May 15 ;164(10) :5319-27.
"Short cyto l smic SDYMNM segment of CD28 is sufficient to convert CTLA-4 to a positive signaling receptor" Yin L. et al . , J Leiikoc Biol . 2003 Jan；73(1) :178-82.
【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】 본 발명의 목적은 T—세포 면역 관용 수용체의 세포 내 신호전달 도메인을 제거하고， T-세포 활성화 표면 단백질 CD28의 세포 내 신호전달 도메인을 융합사킨 융합단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러 스성 담체 (carrier)로 형질전환 (transduction)된 암 항원 특이적 형질전환된 T-세 포 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 상기 형질전환된 T- 세포를 암 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 T-세포를 암 질환 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공하는 것이디-.
【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위하여， T-세포 표면에 CTLA4 또는 PE)1의 세포내부 억제신호 전달 ί메인를 제거하고， 그 자리에 CD28 단백질의 세포내부 활성화신호 전달 도메인이 융합된 융합단백질인 CTLA4— CD28 키메라 단백질 또는 PD1-CD28 키메 라 단백질， 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체
_( 3工 i—e )—로ᅳ형-질 -전환 <4 ansduc ^
제조방법을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 형질전환된 T-세포를 암 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
아울러 본 발명은 상기 형질전환된 T-세포를 암 질환 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
【유리한 효과】 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라 유전자가 이입된 T-세포는 암 세포의 면역관용으로 인한 치료효과 저해 문제를 해결할 수 있 을 뿐 아니라， 오히려 CD28의 신호 전달을 활성화시킴으로써 T-세포의 활성화를 유 도함으로써 항암효과를 극대화시킬 수 있다는 장점이 있으며，
또한 암세포에서만 특이적으로 CTLA4 또는 PI)1의 활성을 억제함으로써， 기 존 항ᅳ CTLA4 항체 등 비특이적 CTLA4 또는 PD1 길항제 (antagonist)를 이용할 경우 발생하는 전신적 T-세포 활성화로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 최소화할 수 있다.
따라서， 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1— CD28 키메라 유전자가 이입된 T-세포를 포함하는 항암 치료용 약학 조성물은 기존의 방법에 비해 현저하게 우수한 암 치료 효능을 갖는 Tᅳ세포 면역요법에 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 CTLA4-CD28 키메라 단백질을 발현하는 암 항원 특이적 T—세포의 암 치료 원리를 나타내는 도이다:
CTdc:CLLA4 유인 수용체 ; 및
CTC28:CTLA4-CD28 키메라 단백질.
(—아하一타ᅳ 면-의ᅳ설—명쩨겨—도ᅳ동밀—함" 7)_
도 2는 CTLA4ᅳ CD28의 발현을 위한 유전자 구조체 및 플라스미드 개열지도를 나타내는 도이다.
(a) pMIG-w 레트로바이러스성 백터의 개열지도 (restriction map); 및
(b) CTLA4-CD28의 레트로바이러스성 유전자 구조체의 구조.
CTLA4 EC: CTLA4의 세포외 도메인;
TM: 막횡단 도메인;
CD28 CP: CD28의 세포내 도메인； 및
EV: CTLA4— CD28이 포함되지 않은 빈 레트로바이러스성 백터 (empty vector) . (이하 다른 도면의 설명에서도 동일함.) .
도 3은 CLTA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포의 세포 분열 능력 및 IFN-Y 분비능력을 나타내는 도이다.
(a) 아무런 유전자조작을 하지 않은 경우의 루시퍼라제 활성;
(b) CTdc 또는 CTC28로 형질전환한 경우의 루시퍼라제 활성 ;
(c) CTdc 또는 CTC28로 형질전환한 경우의 T-세포 분열 능력; 및
(d) CTdc 또는 CTC28로 형질전환한 경우의 IFN-γ 분비능력 .
도 4는 CLTA4— CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD8 T-세포의 IFNᅳ γ의 분 비능력， 암 세포 살상능력 및 종양치료 효과를 나타내는 도이다.
(a) CTC28로 형질전환한 경우의 IFNᅳ γ 분비능력 ;
(b) CTC28로 형질전환한 경우의 암 세포 살상능력; 및
(c) CTC28로 형질전환한 경우의 종양치료 효과.
도 5는 CLTA4ᅳ CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T 세포의 세포배양시 항원 반웅성을 나타내는 도이다.
(a) CD40T-II 세포를 이용한 경우의 IL-2 분비능력 ;
' (b) CD40T-II 세포를 이용한 경우의 IFN-Y 분비능력 ;
(c) CD80T-I 세포를 이용한 경우의 IL— 2 분비능력; 및
(d) CD80T-I 세포를 이용한 경우의 IFN-γ 분비능력 .
도 6은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합치료 모델을 나타내는 도이다. 도 7은 E.G7 종양에 대한 0T-II Τ:^ΐ ¾¾ ^의ᅳ효^를ᅳ 타 i늗"^이다. 도 8은 E.G7 종양에 대한 0T— I T세포와 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전 환된 0T— II T—세포의 병합투여의 효과를 나타내는 도이다. (A ： 아무런 처리도 하지 않은 경우， Δ ： 0T-1만을 사용한 경우， · ： T-1 + 0T-II, □ ： 0T-1 + OT-II CTC28)
(a) OT-1 T—세포 ： 0Tᅳ II Tᅳ세포 비율 = 2 ： 0.5；
(b) OT-1 T-세포 ： OT-II Tᅳ세포 비율 = 2 ： 1； 및
(c) OT-1 Τ-세포 ： ΟΤ-Π Τ-세포 비율 = 2 ： 2 .
도 9는 0T-II 및 OT-1 Τ-세포의 동시 형질전환에 의한 종양치료 효과를 나 타내는 도이다.
(▲ ： 아무런 처리도 하지 않은 경우， ■ ： 0T-1 + 0T-II, · ： 0T-1 + OT- II CTC28, □ ： OT-1 CTC28 + OT-II CTC28)
도 10은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합요법의 항 혹색종 (melanoma) 효 과를 나타내는 도이다.
, (▲ ： 아무런 처리도 하지 않은 경우， O ： Pmel-1 EV, ■ ： Pmel-1 EV + CD4 EV, □ ： Pmel-1 CTC28 + CD4 CTC28)
(a) 종양부피의 변화를 나타내는 도면; 및
(b) 생존율 변화를 나타내는 도면
도 11은 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포의 Akt 인산화를 나 타내는 도이다.
도 12는 CTLA4-CD28 발현을 위한 유전자 구조체들을 이용 형질전환한 T-세 포를 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과 나타내는 도이다.
도 13은 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포의 각 수용체를 자 극하였을 때， IFN— γ의 분비 능력을 나타내는 도이다.
도 14는 E.G7 종양에 대한 OT-I T-세포 단독투여의 효과를 나타내는 도이다. 도 15는 E.G7 종양을 가진 마우스에 형질전환된 0T-I 및 OT-II T-세포를 투 여한 후, 마우스 비장 (spleen) 내 이들 T-세포의 수 및 항원 반응성을 나타내는 도 이다.
(a) 형질전환된 0T-I 및 ΟΤ-Π T-세포의 세포배양시 항원 반웅성을 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과;
(b) 형질전환된 OT-II T-세포의 마우스 체내 증식도를 유세포 분류기를 사 용 해서 계산한 결과; 및
(c) 형질전환된 OT-I T-세포의 세포배양시 항원 반웅 후 의 분비 능 력ᅳ
도 16은 유전자조작 CD4 및 CD8 Tᅳ세포 병합요법의 항 혹색종 (melanoma) 효 ' 과중 혈액내 유전자 조작 Tᅳ세포의 증식도를 나타내는 도이다.
(a) 혈액세포중 CD4 T-세포의 비율을 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과;
(b) 혈액세포중 pmel-l T-세포의 비율을 유세포 분류기를 사용해서 분석한 결과;
(c) 혈액내 CD4 Tᅳ세포의 수를 유세포 분류기를 사용해서 계산한 결과
( · ： CD4 EV, □ ： CD4 CTC28); 및
(d) 혈액내 Pmel-l T-세포의 수를 유세포 분류기를 사용해서 계산한 결과 ( · ： Pmel-l EV, □ ： Pmel-l CTC28) .
도 17은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합요법의 항 혹색종 (melanoma)에 대한 효과를 나타내는 도이다.
(A ： 아무런 처리도 하지 않은 경우， 顯 ： pmel— 1 EV + CD4 EV, ♦ ： Pmel-l EV + CD4 CTC28, □ ： Pmel-l CTC28 + CD4 CTC28)
도 18은 유전자조작 CD4 및 CD8 T-세포 병합요법의 항 혹색종 (melanoma)에 대한 ILᅳ 2의 효과를 나타내는 도이다.
(A ： 아무런 처리도 하지 않은 경우， 園 ： CTC28 + 대조군 IgG 항체， ◊ ： CTC28 + 항 -ILᅳ 2 항체， ᄆ ： CTC28 + 대조군 IgG 항체)
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명의 용어를 상세히 설명한다. 본 발명에서 용어 "세포외 도메인 (extracellular domain)" 은 세포 외부로 돌출되 어 리간드 등과 결합할 수ᅳ ^도—메인를.^ _미_흐 I
"막횡단 도메인 (transmembrane domain)" 은 CTLA4, CD28 등에 있어서， 세포막에 위치하는 도메인를 의미하며 "세포내 도메인 (intracellular domain)" 은 세포 내부에 위치하며 세포외 도메인 과 리간드가 결합되어 전달되는 신호를 세포내로 전달하는 도메인을 의미한다. 상기 세포내 도메인은 신호의 성격에 따라 저해신호 전달 도메인 (inhibitory signaling domain) 또는 활성신호 전달 도메인 (act ivat ion signaling domain)으로 구분될 수 있다.
본 발명에서 용어， "항암" 이란 "예방" 및 "치료 " 를 포함하며， 여기서 "예방 "이란 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 TO1-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 T-세포를 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거 나 지연되는 모든 행위를 의미하고， "치료''란 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1ᅳ CD28 키메라 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 T-세포를 포함 하는 조성물 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의 미한다. 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 T-세포 표면 면역 관용 유도 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 제거하 고, T-세포 활성화 표면 단백질 CD28의 세포 내 신호전달 도메인을 융합시킨 융합 단백질을 제공한다.
상기 T—세포 표면 관용 유도 수용체와 Tᅳ세포 활성화 표면 단백질인 CD28은 T-세포 표면 관용 유도 수용체 또는 CD28의 막횡단 도메인에 의해 융합되는 것이 바람직하 나 이에 한정되지 않는다.
상기 T-세포 표면 관용 유도 수용체는 CTLA4( Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen4) 또는 PE)1인 것이 바람직하다.
상기 융합단백질은 CTLA4의 세포외 도메인ᅳ CTLA4의 막횡단 도메인 -CD28의 세포 내 도메인 또는 CTLA4의 세포 외 도메인 -CD28의 막횡단 도메인ᅳ CD28의 세포 내 도메인 으로 구성된 것이 바람직 하나 이에 한정되지 않는다.
상기 융합단백질은 PE)1의 세포외 도메인 -PI)1의 ᅳ단 도 _메ᅳ인 rCD28^„ ]i_내 .도메 인 또는 PD-1의 세포 외 도메인 -CD28의 막횡단 도메인 -CD28의 세포 내 도메인으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 CTLA4는 인간 유래 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 마우스 유래 서열번호 2 의 아미노산서열을 가지는 것이 바람직하다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 내지 161 번까지의 아미노 산 서열이 세포외 도메인， 즉 B7 등의 리간드와 결합하는 부위이며, 162 내지 189 번까지의 아미노산 서열은 막횡단 도메인， 190번 내지 223번까지의 아미노산 서열 은 세포내 도메인을 나타낸다.
상기 CD28은 인간 유래 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 마우스 유래 서열번호 4 의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열에서 1 내지 152 번까지의 아미노산 서열이 세포 외 도메인， 즉 B7 등의 리간드와 결합하는 부위이며, 153 내지 178번까지의 아미노 산 서열은 막횡단 도메인， 179번 내지 220번까지의 아미노산 서열은 세포내 도메인 을 나타내며， 서열번호 4의 아미노산 서열에서 1 내지 150 번까지의 아미노산 서열 이 세포외 도메인， 즉 B7 등의 리간드와 결합하는 부위이며， 151 내지 176번까지의 아미노산 서열은 막횡단 도메인， 177번 내지 218번까지의 아미노산 서열은 세포내 도메인을 나타낸다. 또한, CLTA4ᅳ CD28 키메라 단백질에 CTLA4의 막횡단 도메인이 이용될 경후, CTLA4의 세포내 저해 신호가 전달되지 않는 범위 내에서 CTLA4의 세포외 도메인과 막횡단 도메인에 부가적으로 CTLA4 세포내 도메인의 일부 서열이 더 포함되는 경우, 또는 CD28의 세포내 도메인에 CD28 막횡단 도메인의 일부 서열이 더 포함되는 경우도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것이라는 점은 통상의 기술자에게 자명한 것이며， CTLA4-CD28 키메라 단백질에 CD28의 막횡단 도메인이 이용될 경우, CTLA4와 리간드 의 결합에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 CD28의 세포외 도메인 일부가 CD28의 세포내 도메인과 막횡단 도메인에 더 포함되는 경우， 또는 CTLA4의 세포외 도메인 에 CTLA4 막횡단 도메인의 일부 서열이 더 포함되는 경우도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것이라는 점 역시 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
본 발명에서 제공되는 CTLM-CD28 키메라 단백질원 한 예ᅳ^스 L열.번호— 5ᅳ 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가진다.
상기 CTLA4의 세포 외 도메인ᅳ CTLA4의 막횡단 도메인ᅳ CD28의 세포내 도메인은 서열 번호 5의 아미노산서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 CTLA4의 세포 외 도메인ᅳ CD28의 세포막 도메인 CD28의 세포내 도메인은 서열 번호 7의 아미노산서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 PD1의 세포외 도메인 -PD1의 막횡단 도메인 -CD28의 세포 내 도메인 또는 PE L 의 세포 외 도메인 -CD28의 막횡단 도메인 -CD28의 세포 내 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
[표 1] 본 발명에서 제공되는 아미노산서열
Figure imgf000017_0001
또한, 본 발명은 본 발명의 융합단백질을ᅳ L딩하는 유전자를 ᅳ공-t다. - 상기 CTLA4의 세포 도메인 -CTLA4의 막횡단 도메인은 서열번호 9의 뉴클레오 서열인 것이 바람직하고， CD28 세포 내 도메인은 서열번호 10의 뉴클레오타 이드 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명은 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이 러스 또는 비바이러스성 담체 (non-viral carrier)를 제공한다.
상기 바이러스 또는 비바이러스성 담체는 동물세포， 특히 T-세포 등을 감염 에 의해 형질전환 (transduction)시킬 수 있는 것이라면 제한 없이 사용가능하다. 상기 바이러스는 레트로바이러스 (retrovirus), 렌티바이러스 ( lent ivirus)， 아데노바이러스 (adenovirus) 및 아데노—연관 바이러스 (adeno-associated virus)가 바람직하며, 레트로바이러스， 렌티바이러스 및 아데노 -연관 바이러스가 보다 바람 직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 비바이러스성 담체는 트랜스포손 시스템 (transposon system)을 이용하 는 것 (Hackett 등， US 6,489,458) 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며， 통상적으로 사용될 수 있는 비바이러스성 담체 중에서 본 발명에 목적에 부합되는 어떠한 것이라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 또한， 본 발명은 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 바이 러스 또는 비바이러스성 담체를 이용하여 형질전환된 T—세포를 제공한다.
상기 T-세포는 암 항원 특이적 T-세포 또는 키메릭 항원 수용체인 CARCChimeric Antigen Receptor) 유전자가 형질전환된 T-세포이며， 암 항원 특이적 CD4 T-세포 (Helper T— cell, 보조 T-세포) 또는 CD8 T-세포 (cytotoxic T-cell, 세포 독성 T-세포)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 키메릭 항원 수용체란 T-세포 활성화 단백질 (CD3-zeta chain, CD28, 41BBL, 0x40， I COS, high-affinity receptor for IgE (FcsRI) 및 기타 T—세포 활 성화 단백질)의 세포막 혹은 세포내 신호전달부위를 암 항원 특이적 항체의 항원결 합부위 (single chain Fv fragment)와 융합시킨 단백질을 통칭한다.
상기 암 항원에 특이적인 T—세포는 환자의 암조직으로부터 분리한 T-세포 (tumor infiltrating lymphocyte)를 체외 배양한 것_， 암 항.원 특.이^ -으로-인지하 '는 수용체, 즉 암 항원 특이적 Tᅳ세포 수용체 (T-cell receptor (TCR)) 유전자를 클 로닝 (cloning)한 후， 레트로바이러스 (retrovirus) 등의 바이러스성 백터 (viral vector)를 이용하여 환자말초혈액으로부터 분리한 전체 Tᅳ세포에 형질전환 (transduction) 하여 수득한 T-세포 (TCR유전자 변형 T-세포, TCR gene-modified
T cell)(Science. 2006 ;314(5796)： 126-9) , TCR(T-cell receptor)의 세포외 도메인
(extracellular ctomain)을 암 항원 특이적 항체로 대체시킨 키메릭 항원 수용체인
CAR(Chimeric Antigen Receptor )(J. Clin. Invest . 117:1466-1476 (2007))으로 형
질전환시킨 CARᅳ형질전환 Tᅳ세포 (CAR— transduced T-cel 1 )(Blood. 2010；
116(7) :1035-1044) 등이 사용될 수 있으나， 이에 한정되는 것이 아니다.
본 발명에서 암 항원 특이적 Tᅳ세포가 특이적으로 인식할 수 있는 항원은
MUC1, CD19, HER2, EGFR, CD20, CEA, PSMA, GD2, 폴레이트 수용체 (Folate
receptor), IL-13Ra2, Lewis-Y 항원 (ant igen)， NY-ESO-1, MART-1, gplOO, 타이로
시나제 (tyrosinase) , 타이로시나제—연관 단백질 (tyrosinase— related proteins) ,
MAGE, WT-1등이 예시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며， 다른 암에서 특이
적으로 발현되는 항원들도 본 발명의 목적에 부합되는 한， 본 발명에 따른 T-세포
면역요법에 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
본 발명은 CTLA4의 세포내부 억제신호 전달도메인를 제거하고， 그 자리에
CD28 단백질의 세포내부 활성화신호 전달 도메인을 융합시킨 CTLA4ᅳ CD28 키메라 단
백질을 발현하도록 유전자조작된 항암 T-세포 (도 1 참조)를 고안하여， CTLA4에 리
간드가 결합될 경우， CTLA4-CD28 키메라 단백질에 포함된 CD28의 세포내부 활성화
신호 전달 도메인의 작용에 의해 CTLA4와 리간드의 결합으로 인한 T—세포 활성 억
제신호를 활성화신호 (stimulatory signal)로 바꾸는 효과를 가져오게 돠므로, 암
세포에 의한 T-세포 관용을 극복할 수 있을 뿐 아니라, T-세포의 활성화를 통해 항
암 능력이 향상되는 효과를 극대화시킬 수 있다는 장점이 있으며, 또한 암세포에서
만 특이적으로 CTLA4 또는 PD1의 활성을 억제함으로써， 기존 항 -CTLA4 항체 등 비
특이적 CTLA4또는 PD1 길항제 (antagonist)를 이용할 경우 발생하는 전신적 Tᅳ세포
활성화로 인한 자가면역질환 발병 등의 부작용을 최소화할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라
유전자가 이입된 T—세포를 포함하는 항암 치료^ᅳ약학 조성. _은. 기존^ᅳ방ᅳ법에 비 ¬¬해 현저하게 우수한 암 치료 효능을 갖는 Tᅳ세포 면역요법에 유용하게 사용될 수
있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학 적 조성물을 제공한다.
상기 암치료용 약학적 조성물에는 CTLA4-CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 CD4 T-세포 또는 CD8 T-세포를 포함하는 것이 바람직하고， CTLA4— CD28 키메라 유전자 또는 PD1— CD28 유전자로 형질전환된 암 항 원 특이적 CD4 T—세포 및 CD8 T-세포를 모두 포함하는 것이 보다 바람직하다. 상기 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며， 고형암 및 혈액암을 포함한 다. 바람직하게 위암， 폐암, 유방암， 난소암， 간암， 기관지암, 비인두암, 후두암， 췌장암, 방광암， 대장암, 결장암， 췌장암， 자궁경부암， 뇌암， 전립선암, 골암, 피 부암, 갑상선암， 부갑상선암, 신장암 식도암, 담도암， 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암， 골육종, 신경세포아종， 혹색종， 섬유육종， 횡문근육종， 성상세포 종, 신경모세포종 또는 신경교종 등을 포함하며， 더욱 바람직하게는, 대장암, 난소 암， 위암， 췌장암， 유방암 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있 다. 경구 투여시에는 결합제， 활탁제, 붕해제， 부형제, 가용화제， 분산제， 안정화 거 1， 현탁화제， 색소， 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완층제， 보 존제， 무통화제 , 가용화제， 등장제， 안정화제 등을 흔합하여 사용할 수 있으며， 국 소 투여용의 경우에는 기제, 부형제， 윤활제， 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발 명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 흔합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어， 경구 투여시에는 정제， 트로키， 캡 슬, 엘릴시르， 서스펜션, 시럽， 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며， 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한， 상기 항 암 조성물은 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에—서 _ ^ .. ¾0lZii U二 (요, -3二디을레 오일)프로필 -Ν,Ν,Ν-트리메틸암모늄클로라이드 (D0TMA) 등의 양이온성 지질， 또는 콜 레스테를 헤미숙시네이트， 포스파티딜 글리세를 등의 각종 화합물 등이 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CTLA4ᅳ CD28 키메라 유전자 또는 PD1-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 암 항원 특이적 Tᅳ세포를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 암을 치료하고 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여， 또 는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류， 환자의 연령， 체증, 증상의 특성 및 정도， 현재 치료법의 종류， 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며， 통상의 기술자에 의 해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리 학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며， 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하 여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중 요하며， 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이하， 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용 이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다. <실시예 1>마우스 및 세포준비
Pmel-1, ΟΤ-Ι, B6와 Thyl.l+ 콘제닉 (congenic) B6 마우스는 잭슨 연구소 (Jackson Lab.)에서 입수하였다. RAGF7' 배경 (background)을 지닌 0T - II 마우스 는 타코닉 (Taconic)에서 입수하였다. 형질 전환 마우스 모두는 B6 배경을 가진다. 마우스는 국립 암센터 내의 특정 병원체가 없는 시설에서 사육되었으며, 국립 센터 의 실험동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 준수하였다.
E.G7 림프종 세포 및 B16-F10 (B16) 혹색종 세포 (ATCC No. CRL-2113 및 CRL-6475)는 B6 마우스에서 유래했다. 피닉스 에코 (Pheonix E.co ᅩ및ᅳ피닉스 (Pheonix) GP 세포주는 Garry Nolan 박사 (스탠포드 대학)의 허가 하에 ATCC로부터 입수하였다 (ATCC No. SD3444 및 SD3514) . CD8 Tᅳ세포 또는 CD4+CD25— Τᅳ세포는 항 -CD8 마이크로 비즈 (inicrobeads)를 사용하 여 포지티브 선별 (positive select ion)하거나， CD4+CD25- 조절 T-세포 분리 키트 (밀터니 바이오텍， Myltenyi Biotec)를 사용하여 네커티브 선별 (negative selection) 하였다.
<실시예 2>플라스미드 제작
CTLA4-CD28 키메라 제작을 위해 마우스 유래 CTLA4의 세포외 도메인과 막횡 단 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 9)과 마우스 CD28의 세포내 도 메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 10)은 마우스 CTLA4 및 CD28 cDNA를 포함하는 풀라스미드로부터 중합 효소 연쇄 반웅 (polymerase chain reaction ： PCR)에 의해 증폭하여 수득하였다.
증폭된 두 단편은 블런트 엔드 라이게이션 (blunt end ligation)에 의해 결 합되어 클로닝 백터 (cloning vector)로 클로닝되었다.
이어 CTLA4-CD28 키메라 유전자의 cDNA는 미국 국립 쥬이쉬 의학연구센터 (National Jewish Medical and Research Center)의 Yosef Refaeli 박사로부터 입수 한 pMIG-w 레트로바이러스성 백터 (도 2(a) 참조)에 클로닝 되었다.
CTLA4 유인 수용체는 서열번호 9에 따른 CTLA4의 세포외 및 막횡단 도메인 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이용하여 PCR로 증폭한 후， pMIG-w 레트로바이러 스성 백터에 클로닝 하였다 (도 2(b) 참조).
[표 2] 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드서열
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<실시예 3>루시퍼라제 분석 및 웨스턴 블랏 (Western blot)
주르캇 (Jurkat) T-세포 (1Χ107)는 레트로 바이러스 발현 플라스미드， RE/AP 루시페라제 풀라스미드 (캘리포니아 대학의 Arthur Weiss 교수 제공) 및 표준 화를 위한 pRL-TK 레닐라 (Renilla) 루시퍼라제 플라스미드 (Promega사)와 흔합하였 다.
이후， 250 V 및 950 uF 조건에서 바이오 래드 (Bio-Rad Laboratories)의 진 펄서 (Gene Pulser)를 이용하여 0.4-cnrgap에서 전기천공법 (electroporat ion)을 이 용하여 형질전환시켰다.
형질전환 후, 자극 (stimulation) 전에 24시간 방치하였으며， 이후 자극을 위해， 항ᅳ마우스 IgG(5 ug/ml)와 항-햄스터 IgG항체 (5 yg/ml)로 코팅되어 하룻 밤 (overnight) 방치된 96-웰 플레이트 (well plate)를 세척한 후, 항 -CD3 항체 (1 Ug/ml) 단독， 또는 정상 햄스터 IgG나 햄스터 항— CLTA4 항체 (9H10, 2 yg/nil)로 코팅한 후, 실온에서 2시간 방치하였다.
'이후， 1X105 세포를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 6 시간 배양한 후， 용해 (lysis) 시켰다. 몇 가지 실험을 위해서는 수용성 항 -CD28 항체가 플레이트에 결합 된 항- CTLA4항체 대신에 배지에 직접 첨가되었다.
루시페라제 활성은 듀얼—루시퍼라제 보고 분석 시스템 (Dual luciferase reporter assay system)을 이용하여， 루미노미터 ( luminometer , 프로메가 사, Promega)를 이용하여 측정하였다. 초파리 루시퍼라제의 활성은 레닐라 루시퍼라제 활성을 이용하여 표준화 (normalization)하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해， 루시페라제 플라스미드를 제외하고 레트로 바이 러스 플라스미드만을 사용하여 상기 프로토콜에 따라 주르캇 T-세포를 형질전환 하 였다.
형질전환된 세포의 자극을 위해， 형질전환된 세포는 마우스 항 -인간 CD28 항체 또는 일반 햄스터 IgG또는 햄스터 항-마우스 CTLA4 항체 (2 yg/ml의 ) 중 하 나를 이용하여 얼음 위에서 10분간 처리하였으며， 이어서 염소 항-마우스 IgG또는 항-햄스터 IgG (5 yg/ml)와 10 분간 빙상에서 가교 (crossl inking)시켰다.
그 후, 세포를 30 분간 37°C의 수조에 넣고， 얼음을 이용하여 냉각된 PBS를 첨가하 여 반응을 중지시켰다. 세포 용해물 (cell lysates)은 SDS-PAGE 분석에 이용되고， 니트로 셀를로오스 막 (밀리포어)에 옮겨져서， 항 -인산 Akt(anti-phosph으 Akt) 또는 항 -Akt 항체 (셀 시그널링사, Cell Signaling)를 이용하여 검출되었다. HRP-표지 2 차 항체 (잭슨 면역연구 랩， Jackson I醒 noresearch Laboratories)는 ·1차 항체를 검출하는데 이용되었으며, 블랏 (blots)은 피어스사의 슈퍼시그널 웨스트 피코 (Super Signal West Pico)를 이용하여 화학 발광 반웅에 의해 시각화했다.
<실시예 4> 레트로 바이러스 제작 및 형질전환
리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (인비트로젠사， Invitrogen)을 이용하여 레트로바이러스성 플라스미드 (retroviral plasmid)와 VSV-G cDNA를 코딩하는 플라 스미드인 pMD.G를 피닉스 (Phoenix) GP 세포주에 형질전환 (transfection)시켰다. 48 시간 후 VSV G 가형식 (pseudotyped) 레트로 바이러스를 포함하는 상등액을 회수하 였다. 피닉스 에코 (Phoenix Eco) 세포주는 레트로바이러스를 포함하는 상청액을 이 용하여 밤새 형질전환 시켰다.
3~5일 경과 후 GFP 양성 피닉스 에코 세포주는 에코트로픽 (ecotropic) 레트 로 바이러스를 생산하기 위한 안정적 생산주 제작을 위해서 세포 선별기 (cell sorter) (FACS Aria, 비디 바이오사이언스 사, BD Biosciences)를 이용하여 분리되 었다. 에코트로픽 레트로바이러스를 포함하는 상등액은 회수된 후, 원심분리 필터 기 (centrifugal filter device) (Ami con Ulra-15, 컷오프 값 100 kDa, 밀리포어사, Millipore)를 이용하여 10배 농축되었다. 레트로바이러스를 이용한 T-세포의 형질 전환을 위해 정상 또는 형질전환된 마우스 유래의 비장세포를 플레이트에 결합된 항ᅳ CD3s (5 ug/ml, 145 - 2C11) 및 항 -CD28 (2 ug/ml, 37.51) 항체 또는 항원성 펩티드 (antigenic peptides)를 이용하여 자극하였다.
자극 후 24시간 되는 시점에, T-세포는 농축된 레트로바이러스를 이용하여 2500 rpm에서 90분간 원심분리하여.형질전환 (스핀 감염， spin infection)시켰다. 이 과 정은 같은 날 한 번 더 반복되었다. 스핀 감염을 수행하는 동안， 6 iig/ml의 폴리 브렌 (polybrene, 시그마사， Sigma)이 배양 상등액에 첨가되거나, 형질전환 효율을 높이기 위해 레트로넥틴 (Retronectin)-코팅된 플레이트 ((15 μ g/ml , 타카라사， Takara)에서 상기 과정이 수행되었다. 자극 후 48시간 되는 시점에， 형질전환된 T- 세포는 30 unit /nil의 마우스 IL-2(인비트로젠사， Invitrogen)를 포함하는 신선한 배지 (fresh medium)로 옮겨져서 부석 전에 48~72 시간 동안 방치되었다.
<실시예 5>사이토카인 ELISA, 세포 증식 및 세포 독성 분석 (P-J履 테스트)
세포 선별 (cell-sorting)에 의해 분리된 GFPᅳ양성 세포 (2x 104/wel U는 48 시간 동안 조사된 비장세포 (irradiated splenocytes) (2x 105/wel 1 )의 존재 하에 다양한 농도의 항- CD3 항체 또는 항원 펩티드를 이용하여 자극되었다.
상청액 (supernatant) 내의 사이토카인은 BD 바이오사이언스 (BD Biosciences)의 ELISA세트 (ELISA Sets)를 이용하여 측정하였다.
세포 증식 (cell proliferation) 측정을 위해 48 시간 동안 자극된 세포를 ¾ᅳ티미딘 (Thymidine)을 이용하여 펄스 (pulse)하여， 추가적으로 24시간 동안 자극 하였다. 세포는 세포 하베스터를 이용하여 수거되어으며， 방사능활성 (radioactivity)은 왈랏 트리룩스 1450 신틸레이션' 카운터 (Wallac Trilux 1450 scintillation counter)를 이용하여 측정도ᅵ었다.
세포 독성 분석을 위해 형질전환된 Pniel-l T-세포를 48 시간 조사 비장 세포의 존 재하에 1 μΜ의 hgplOO 펩티드를 이용하여 자극한 후， 다양한 활성화된 T-세포를 B16 세포 (1X104)와 함께 배양한 20시간 동안 공동 배양 (co— culture)한 후， PBS로 세척하였다ᅳ 남은 B16 세포는 세포의 회수 및 방사능활성 측정 ¾에 6 시간 동안 ¾ᅳ티미딘 (Thymidine)을 이용하여 필스 (pulse)하였다. <실시예 6> T-세포를 이용한 형질전환 (Adoptive T-cell transfer)
B6 마우스에 0 일째 E.G7 세포 (1~2X106) 또는 B16 세포 (1X105)를 피하 주사했다. 레트로바이러스로 형질전환된 T-세포는 7일째에 마우스로 이입되었다. B16 흑색종 모델의 경우 T-세포가 이입되는 날에， 마우스를 골수 비형성 전신 조사 (nonmyeloablative total body irradiation, TBI) (4 Gy)하여 림프구 고갈 (lymphocle letion) 시켰다.
종양의 성장은 캘리퍼 (caliper)를 사용하여 3~4일 간격으로 측정하였으며， 대략적인 크기 는 다음과 같이 계산되었다 ： 길이 (麵) X 폭 G菌) X π .
종양의 크기가 500醒2를 초과하면 마우스를 안락사시켰다. 형질전환된 Τ-세포의 세 포내 사이토카인 염색을 위해, 세포외 (ex vivo)에서 활성화된 T-세포가 고정 및 관 통 (fixed and permeabi 1 i zed) (BD cytof ix/cytoperm 키트)뒨ᅵ후， PE_표지된 항一마 우스 IL-2 또는 IFN-Y로 염색되었다.
<실험예 1> CTLA4-CD28 키메라 단백질의 T-세포 활성화 효과
마우스 유래 CTLA4(서열번호 2 참조)의 세포내부 억제신호 전달 도메인 (intracellular inhibitory signaling domain)가 제거된 CTLA4돌연변이체 (mutant ) 인 CTLA4 유인 수용체 (CTLA decoy receptor) 및 CTLA4-CD28 키메라 단백질 (서열번 호 6 참조)을 발현하는 레트로바이러스성 유전자 구조체 (retroviral construct)를 도 2(b)에 개시된 바와 같이 제작하였다.
도 2에서 EV는 아무 것도 삽입되지 않은 레트로바이러스 백터인 pMIG-w를 의미하며， CTLA4— CD28 키메라 (CTC28) 유전자와 CTLA4 유인 수용체 (CTdc)의 cDNA는 pMIG-w의 IRES— GFP (녹색 형광 단백질) 카세트 (cassette) 앞에 삽입되었다.
주르캇 (Jurkat) T-세포를 CLTA4 유인 수용체 또는 CTLA4T£D.28ᅳ리—메라 유전 자를 포함하지 않는 빈 플라스미드와， CD28 반웅부위 (CD28 response element)를 함 유하는 RE/AP 루시페라제 플라스미드로 형질전환시킨 후， 항 -CD3 및 항 -CD28 항체 로 자극한 경우， 이전의 보고와 같이 항ᅳ CD3 항체. 단독으로 자극한 경우에 비해 루 시퍼라제 활성이 크게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 3(a) 참조). 이는 내생적 (endogenous) CD28에 의한 신호전달이 잘 일어나고 있음을 입증해 주는 것이다. 유사하게 주르캇 (Jurkat) T-세포를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하는 플라스미드와 RE/AP 투시페라제 플라스미드로 형질전환시킨 후， 항— CD3 및 항- CTLA4 항체로 자극한 경우, 역시 항 -CD3 항체 단독으로 자극한 경우에 비해 루시퍼 라제 활성이 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, CTLA4 유인체 수용체 유전자 를 포함하는 경우에는 루시퍼라제 활성이 거의 증가하지 않음을 확인할 수 있었다 (도 3(b) 참조).
또한， CTLA4 유인 유전자가 형질전환된 주르캇 (Jurkat) 세포주에서는 Akt 인산화가 증가하지 않은 반면에， CTLA4— CD28 키메라를 주르캇 세포주에 형질전환한 후， 항 -CTLA4항체로 자극을 한 경우, Akt 인산화는 증가함을 확인할 수 있었다 (도 11 참조).
이는 CTLA4-CD28 키메라 단백질을 이용할 경우， CTLA4의 세포외 도메인에 리간드가 결합하더라도 실제로 세포내로는 CD28에 의한 활성화 신호가 전달되고 있 음을 입증하는 것이다. 이러한 점은 T-세포 활성화 결과로도 입증되는데, 도 2(b)와 같이 GFP를 리 포터로 사용하여 형질전환된 T—세포의 활성화를 측정한 결과, CTLA4 유인 유전자로 형질전환된 T-세포는 아무 처리도 하지 않은 경우에 비해서 떨어지는 분열능과 IFN-Y 분비능을 보이는 반면 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 T-세포는 정상적인 분열능과 훨씬 증가된 IFN-Y 분비능을 보이는 것으로 확인되었다 (도 3(c) 및 도 3(d) 참조). 또한, 비장 세포에 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하지 않는 빈 플라스미 드와， CD28 반응부위 (CD28 response element)를 함유하는 GFP리포터 유전자를 갖는 플라스미드로 형질전환시킨 후, 항ᅳ CD28 및 항— CTLA4 항체로 염색하 Λᅮ G.E£—ᅵ양성세 포를 유세포 분류기를 이용해서 분석한 결과， CTLA4-CD28 키메라 발현 수준은 내생 적 CTLA4 발현수준보다 더 높았다는 것을 확인하였다 (도 12 참조). 또한， 상기와 같은 형질전환된 비장 T-세포에 항ᅳ CD3, 항 -CD28 및 항— CTLA4 항체로 자극했을 때， CTLA4-CD28의 과발현은 항 -CTLA4 항체의 IFN-γ 억제능을 감 소시키는 것을 확인하였다. (도 13 참조).
이러한 점을 종합해보면， CTLA4— CD28 키메라 단백질은 리간드가 CTLA4의 세 포외 도메인에 결합할 경우， 저해 신호 (inhibitory signal)를 전달하지 않을 뿐 아 니라, CTLA4-CD28 키메라 단백질의 CD28 세포내 도메인에 의한 활성화 신호 (stimulatory signal)를 세포내로 전달함으로써 T-세포 활성화가 현저하게 증가하 는 것으로 확인되었다. <실험예 2> CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD8 T-세포의 항암 능력
종양 항원 특이적인 T-세포의 CTLA4-CD28 키메라 유전자의 발현으로, Tᅳ세 포의 항종양 활성이 강화될 수 있는지 확인하기 위하여， i½el-l이라고 불리는 혹색 종 항원 특이적 (antigen-specific) TCR 형질전환 마우스로부터 유래된 CD8 T-세포 (Pmel-1 T-세포)를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하는 레트로바이러스를 이용하 여 형질전환시켰다. Pmel-1 T-세포는 동계 (syngenic) B16 흑색종 세포 표면에 발현 되는 종양 항원인 gplOO을 특이적으로 인식한다.
그 결과， 형질전환된 Pmel-1 T-세포는 컨트롤에 비해서 높은 IFN-γ 분비능 을 보이는 것으로 나타났지만 (도 4(a) 참조)， B16 세포에 대한 in-vitro 상에서의 세포용해활성 (cytolytic activity)은 그다지 큰 향상을 보이지 않는 것으로 나타났 다 (도 4(b) 참조). 또한， CTLA4— CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pniel-l T-세포는 림프구 고갈된 B16 종양ᅳ함유 마우스에 이입한 경우， 고용량의 IL— 2와 병용 처리한 경우에도 큰 항 종양 효과의 향상을 보이지 않음을 확인할 수 있었다 (도 4(c) 참 조). 결론적으로, 실험예 1과는 다르게 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-1 Tᅳ세포는 그 기능에 있어서 큰 향상을 나타내지는 않았다.
<실험예 3> CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환에 의한항원 특이적 T-세 포의 항원 반응성 변화
실험예 1과 실험예 2의 차이는 실험예 1의 경우는 정상 마우스로부터 분리 된 Tᅳ세포는 CD4 및 CD8 Tᅳ세포가 흔합된 것인 반면， Pmel-1 T-세포는 CD8 T-세포 만이 존재한다는 점이다. 따라서， CTLA4-CD28 키메라 유전자의 형질전환에 의해 CD4 및 CD8 T—세포의 종양 항원 특이적 반웅 (response)이 상이하게 조절되는지 확 인할 필요가 있다. '
동일한 항원에 대한 CD4 및 CD8 T-세포의 반웅을 확인하기 위하여， 오발부 민 (ovalbumin ： OVA)을 특이적으로 인식하는 TCR을 Tᅳ세포에서만 발현하도록 제작 된 항 -OVA TCR 형질전환 마우스를 도입하였다. 특히 , CD4 및 CD8 T-세포의 반응을 나누어 볼 수 있도록 CD4 항ᅳ OVA TCR 형질전환 마우스 (0Τ-Π) 및 CD8 항 -OVA TCR 형질전환 마우스 (0T-I)로부터 각각 OVA 특이적 CD4 및 CD8 세포를 분리하여 CTLA4— CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환시킨 후， OVA 항원에 의한 Tᅳ세포 활성화 를 IL2 및 IFN-Y의 분비능을 통해 확인하였다.
0T-I 및 0T-II T—세포 (0T-I 및 0Τ-Π 유래의 T-세포)를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질전환시킨 후， 사이토카인의 생산능력을 측정하기 위해 항원제시세포 (antigen presenting cell ： APC) 존재 하에 OVA로 자 극하였다. 본 발명에서 0T-1 CTC28 또는 0T-II CTC28은 CTLA4-CD28 키메라 유전자 를 이용하여 형질전환된 0Tᅳ 1 T-세포 또는 0T-II T-세포를 의미한다.
그 결과, CTLA4ᅳ CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환에 의해 OT-'K도 5(d) 참조) 및 ΟΤ-ΙΙ Τᅳ세포 (도 5(b) 참조) 모두 의 생산능력이 향상되었음 을 확인할 수 있었다.
또한 IL-2의 생산능력은 ΟΤ-ΙΙ Τ-세포의 경우는 IL-2 생산을 컨트를과 비교 하여 10~20 배 가량 크게 증가했지만 (도 5(a) 참조)， ΟΤ-Ι Τ-세포의 경우는 약간의 상승만이 확인되었다 (도 5(c) 참조). 즉， CD4 Τᅳ세포 반웅은 특히 IL-2 생산능력의 측면에서 CDS Τ-세포에 비해 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환에 의한 영향이 큰 것으로 확인되었다. <실험예 4> CTLA4-CD28 키메라 유전자의 CD4 및 CD8 Τ-세포로의 동시 형질전환에 의한 Τ-세포의 항종양 효과
CD4 Τ-세포가 CD8 Τ-세포의 항 종양흔^ ᅳ점ᅳ은ᅳ^ᅳ알려겨 있 ^ ^F^r^^¥¥^r¾T강화된 CD4의 반웅은 종양 항원 특이적 CD8 T-세포의 항 종양 효과를 배가할 수 있을 것으로 판단된다. 본 발명자들은 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 CD4 T-세 포가 CD8 T-세포의 항암 효능을 증가시킬 수 있는지를 실험예 3에 따른 0T-I 및 ΟΤ-ΙΙ T-세포를 이용하여 시험하였다. 이를 위해 OVA를 모델 종양 항원으로， OVA cDNA로 형질전환된 동계 (syngenic) EL4 림프종 세포주 (E.G7)를 종양 모델로 선정하 였다 (도 6 참조).
CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 ΟΤ-Π T-세포를 E.G7를 포함하는 마우스에 이입한 결과, 별다른 종양 치료효과를 나타내지 않음을 확인할 수 있었다 (도 7 참조).
하지만， 0Tᅳ I T-세포와 조합할 경우， 그 효과는 달라지는 것을 확인할 수 있었는데, OT-I T-세포 단독으로 사용한 경우에도 다소 효과는 보였지만, CTLA4- CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 0T-II T-세포와 병용할 경우 항 종양 효과가 급격하게 증가되는 것으로 나타났으며， 그 증가 정도는 CTLA4ᅳ CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 0T— II T-세포의 농도에 비례하는 것으로 나타났다 (도 8 (a) 내지 도 8(c), 도 14 참조).
특히 0T— I T-세포와 형질전환된 0Tᅳ II T—세포가 2 :2로 사용된 경우에는 15 일 경과 후에 종양이 완전히 사라지는 것으로 나타났으며， 2:1로 사용된 경우에는 15일 경과 후에 종양이 거의 없어졌지만， 다시 종양 부피가 다소 증가하는 것으로 확인되었다. ᅵ
상기 실험에서 종양 크기는 그룹마다 적어도 5 마리의 마우스의 종양 크기 의 평균을 기록하였으며 (* ： p = 0.0391， 0.0078, "* ： p = 0.0078, 월콕 슨 부합—페어 테스트, Wilcoxon matched pair test), 도 7 및 도 8에서 제시된 결 과는 적어도 2 개의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.
CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용한 형질전환이 CD4 T-세포보다는 덜 효과 적이기는 하지만 CD8 T-세포의 항원반응성 역시 증가시킴을 상기 실험예를 통해 확 인할 수 있었으므로， CD4 및 CD8 T—세포를 동시에 CTLA4ᅳ CD28 키메라 유전자를 이 용하여 형질전환 ^은 항 f양 희：¾.수 있는가를—-확 -인—하 zᅵᅳ위하 여， 0T— II T-세포와 0T-I T-세포 모두를 CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형 질전환시킨 후， E.G7 종양을 가진 마우스 (도 6 참조)에 주사하였을 때, 0Τ-Π에만 형질전환시킨 경우에 비해， 훨씬 강력한 항 종양효과를 보임을 확인할 수 있었다
(도 9 참조).
상기 실험에서 종양 크기는 그룹마다 적어도 5 마리의 마우스의 종양 크기 의 평균을 기록하였으며 Γ ： p = 0.0029, 월콕슨 부합 -페어 테스트, Wilcoxon matched pair test), 도 9에서 제시된 결과는 적어도 3 개의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.
E.G7 종양을 가진 마우스에서 유전자 형질 전환된 T-세포의 활성을 실험하 기 위해서， 유전자 형질 전환된 0T-I 및 0Tᅳ II T-세포를 주입한 마우스로부터 비장 세포 (splenocytes)를 분리했고， 오발부민 (ovalbumin;0VA) 펩티드를 가지고 생체 외 에서 상기 Tᅳ세포들을 자극했다. 새포 내 사이토카인 염색 (intracellular cytokine staining)에 의해서 분석했을 때 유전자 형질 전환된 0T-II T-세포는 대조군 0Tᅳ II T-세포들보다 IL-2 및 IFNᅳ γ 생산 세포들이 훨씬 높은 비율이었다 (도 15(a) 참조). 게다가, 유전자 형질 전환된 0T— II T-세포의 전체 수는 대조군 0Τ-Π T—세포와 비 교해서 증가되었다 (도 15(b) 참조). 0T-I T-세포 세포의 경우, 비장에서 형질 전환 된 0T-I T-세포의 비율은 새포 내 사이토카인 염색 분석에 필요한 값 (0.1%이상)보 다 너무 낮았다. 그 결과， 본 발명은 전체 CD8 Tᅳ세포를 분리한 후 동일한 수의 유전지- 형질 전환된 0T-I 및 빈 백터로 형질전환된 0T-I T—세포를 시험관 내 (in vitro)에서 오발부민 펩티드 및 항원제시세포 (APCs)와 함께 배양하여 자극했다. 그 리고 본 발명은 ELISA에 의해서 IFN-y 분비를 측정했다. 또다시， 유전자 형질 전 환된 0T— I T-세포는 빈 백터로 형질 전환된 0T-I T—세포보다 많은 양의 IFN-Y 생 산했다 (도 15(c) 참조). 그래서 유전자 형질 전환된 0T-I 및 0T— II T-세포는 종양 을 가진 마우스에 투여된 이후에도 그 증가된 활성을 유지함을 알 수 있었다.
<실험예 5〉 혹색종 모델에서의 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 종양 항원 특이적 T-세포의 항종양효과
실험예 4에서의 모델은 0VA라는 인위적인 종양 항원에 대해서 항종양 효과 를 시험한 것이므로, CTLA4ᅳ CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD4및ᅳ CD§-Tᅭ세포를 이용하여 실제 종양항원을 함유하는 모델에서의 항 종양 효과를 시험하는 것이 필 요하다. B16 혹색종은 적합한 모델 종양의 하나인데， 이는 Pme卜 1 CD8 Tᅳ세포가 특 이적으로 인식할 수 있는 내재적 (endogeneous) gplOO 항원을 가지고 있기 때문이다. 하지만， B16 종양은 좋지 않은 면역원성 (i麵 nugenecity)을 가지고 있으며 , T-세포 면역요법에 저항성을 가지고 있다고 알려져 있으며, 본 발명에서의 CTLA4- CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-l T-세포를 사용한 경우에도 항 종양 효과 의 향상은 크지 않았지만 (실험예 2 참조)， 다클론 CD4 T-세포의 첨가를 통해 Pmel- 1 Tᅳ세포를 이용한 T-세포 면역요법이 효과가 있을 수 있다는 보고가 있다.
본 실험에서는 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 Pmel-l T-세포와 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 다클론 CD4 Tᅳ세포를 함께 사용할 경우 항 종양 효과가 증가될 수 있는지를 시험하였다.
B6 마우스에 B16 혹색종 세포를 피하주사하고 7일 후， 5 Gy의 전신 방사선 조사를 통해 림프구 고갈 (lymphocyte dep let ion)과정을 거친 후， 형질전환 마우스 (transgenic mice)로부터 분리한 혹색종 특이적 CD8 T-세포인 Pmel-l T-세포를 정 맥주사하고 종양의 부피 감소 정도를 관찰하였다.
또한， CD4 T-세포와의 병합치료를 위하여서는 B6 마우스로부터 분리한 다클 론 CD4 T세포 (조절 T—세포가 제거된 CD4+CD25— 집단)를 CTLA4-CD28 키메라 유전자 로 형질전환시켜， Pmelᅳ 1 T-세포와 병행 치료에 이용하였다.
그 결과, CD4 T—세포 및 Pme卜 1 T-세포 모두를 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환시키고， B16 종양을 함유하는 B6 마우스에 정맥주사할 경우, 형질전환되지 않은 CD4 T-세포 및 Pmel-l Tᅳ세포를 사용할 경우에 비해 훨씬 강력한 항종양 효과 를 보인다는 점을 종양 크기 및 생존율 측정을 통해 확인하였다 (도 10(a) 및 도 10(b) 참조). 또한 이러한 항종양 효과는 말초혈액내의 CD4 T-세포 및 Pmel— 1 T-세 포의 비율 및 절대수의 증가와 밀접하게 관련되어 있음을 확인하였다 (도 16 (a) 내 지 (d) 참조). CTLA4-CD28 키메라의 Tᅳ세포 증식 증가효과는 CD4 T-세포에서 CD8 Tᅳ세포에서보다 크게 나타났다 (8.6배 vs 3.7배;도 16(c) 내지 (d) 참조). 본 발명 에서 CD4 Tᅳ세포 단독의 유전자 형질전환이 Pmel-l T세포의 항암 효과를 증가시킬 수 있는지를 점검했다. 기대했던 것과 같이， 유견자.형질 전환된 CD4:ᅳ T二세표는 종 양 의 증식을 크게 억제했다. Pmel-l T—세포의 추가적인 유전자 형질 전환은 종양 의 성장을 더욱 억제했다 (도 17 참조). 따라서， CD4 및 CD8 Tᅳ세포 모두를 형질전 환하는 것이 항종양효과를 극대화시킬 수 있음을 알 수 있었다. 마지막으로，
CTLA4-CD28 형질 전환이 CD4 T-세포에서 IL-2 분비를 유의적으로 증가되었기 때문 에 (도 5(a) 참조), 본 발명은 생체 내에서 유전자 형질 전환된 Tᅳ세포의 치료 효과 에 IL-2가 필요한지 의문을 가졌다. 예상대로， 생체 내 항 -IL-2 중화 항체 처리에 의해， 유전자 형질 전환의 치료 효과가 거의 없어짐이 확인되었다 (도 18 참조). 결 론적으로， 이러한 결과들은， 이미 크게 성장하였고 (pre-established) 면역원성이 약한 종양을 CTLA4-CD28 유전자 형질 전환된 CD4 및 CD8 T-세포를 이용한 선택적 세포치료 (adoptive transfer therapy)에 의해서 효과적으로 억제할 수 있고， 이 치 료효과에 IL-2가 중요하게 기여함을 보여주었다.
본 발명에서 Pmel-l EV는 형질전환되지 않은 Pmel-1 T-세포， CD4 EV는 형질 전환되지 않은 CD4, Pmel-1 CTC28은 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 F¾el- 1 T-세포를 의미하며 , CD4 CTC28는 CTLA4-CD28 키메라 유전자로 형질전환된 CD4 T- 세포를 의미한다.
결론적으로， CTLA4-CD28 키메라 유전자를 이용하여 형질전환된 Tᅳ세포를 이용한 T-세포 면역요법은 CD4 및 CD8 T-세포의 병합요법에서 항종양 효과의 큰 증가를 유발하였으며， 이는 CTLA4 수용체를 통한 T-세포 면역관용을 회피함으로써 항암 T—세포 면역요법의 효능이 크게 증가될 수 있음을 증명한 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
T-세포 표면 면역 관용 유도 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 제거하고, Tᅳ세포 활성화 표면 단백질 CD28의 세포 내 신호전달 도메인을 융합시킨 융합단백 질.
【청구항 2】
제 1항에 있어서 , T-세포 표면 면역 관용 유도 수용체와 Tᅳ세포 활성화 표 면 단백질 CD28 융합단백질은 T—세포 표면 관용 유도 수용체 또는ᅵ CD28의 막횡단 도메인에 의해 융합되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， T-세포 표면 관용 유도 수용체는 CTLA4(Cytotoxic T- ᄂ卿 hocyteᅳ Associated Protein 4， T-Lymphocyte Antigen 4) 또는 PDl인 것을 특징 으로 하는 융합단백질.
【청구항 4】
제 1항에 있어세 융합단백질은 CTLA4의 세포외 도메인 -CTLA4의 막횡단 도 메인 -CD28의 세포 내 도메인 또는 CTLA4의 세포 외 도메인 -CD28의 막횡단 도메인- CD28의 세포 내 도메인으로 구성된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 5】 ·
제 1항에 있어서， 융합단백질은 PD1의 세포외 도메인 -PD1의 막횡단 도메인- CD28의 세포 내 도메인 또는 PI)ᅳ 1의 세포 외 도메인 -CD28의 막횡단 도메인 CD28의 세포 내 도메인으로 구성된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 6]
제 3항에 있어서， CTLA4는 인간 유래 서열번호 1 또는 마우스 유래 서열번 호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 7]
제 1항에 있어서， CD28은 인간 유래 서열번호 3 또는 마우스 유래 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 8】
제 6항에 있어서， 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 세포외 도메인은 1 내지 161번째까지 아미노산 서열이고, 세포막 도메인은 162 내지 189번 째까지의 아미노산 서열이고， 세포 내 도메인은 190 내지 223번까지의 아미노산 서 열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 9】
제 7항에 있어서， 세포외 도메인은 서열번호 3의 1 내지 152번째까지 아미 노산 서열이거나, 서열번호 4의 1 내지 150번째까지 아미노산 서열이고， 세포막 도 메인은 서열번호 3의 153 내지 178번째가지의 아미노산 서열이거나，서열번호 4의 151 내지 176번째까지 아미노산 서열이고， 세포 내 도메인은 서열번호 3의 179 내 지 220번까지의 아미노산 서열이거나 서열번호 4의 177 내지 218번째까지 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 10】
, 제 4항에 있어서， CTLA4의 세포 외 도메인 -CTLA4의 막횡단 도메인 -CD28의 세 포내 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열인 것 을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 11】
제 4항에 있어서， CTLA4의 세포 외 도메인 -CD28의 세포막 도메인 -CD28의 세 포내 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로ᅳ하—는ᅳ융ᅳ합단백질.
【청구항 12] 제 5항에 있어서， PE)1의 세포외 도메인 -PD1의 막횡단 도메인 -CD28의 세포 내 도메인 또는 PD-1의 세포 외 도메인 -CD28의 막횡단 도메인 -CD28의 세포 내 도메 인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
【청구항 13】
제 1항 내지 제 12항의 어느 한 항에 따른 융합단백질을 코딩하는 유전자.
【청구항 14】 ·
제 13항에 있어서， CTLA4의 세포 도메인 -CTLA4의 막횡단 도메인은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 융합단백질을 코딩하는 유전자.
【청구항 15】
제 13항에 있어서, CD28 세포 내 도메인은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 융합단백질을 코딩하는 유전자.
【청구항 16】
제 13항의 유전자를 포함하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체 . .
【청구항 17】
제 16항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스 (retrovirus), 렌티바이 러스 (lentivirus), 아데노바이러스 (adenovirus) 및 아데노 -연관 바이러스 (adeno- associated virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이러스 또는 비바이러스성 담체 .
【청구항 18】
제 16항의 바이러스 또는 비바이러스성 담체를 이용하여 형질전환 (transduct ion)된 T—세포.
【청구항 19】 제 18항에 있어서， 상기 T-세포는 암 항원 특이적 CD4 T-세포， CD8 T-세포 또는 CD4 T-세포 및 CD8 T—세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 T-세포.
【청구항 20】
제 18항에 있어서, 상기 T-세포는 암 항원 특이적인 T—세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 T-세포.
【청구항 21]
제 20항에 있어세 상기 암 항원 특이적인 T-세포는 환자의 암 조직으로부 터 분리한 T-세포， 암항원 특이적으로 인지하는 수용체 유전자로 형질전환된 T-세 포 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자로 형질전환된 T-세포로 구성된 군으 로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환된 T-세포.
【청구항 22】
제 20항에 있어서， 암 항원은 MUCl, CD19, HER2, EGFR, CD20, CEA, PSMA,
GD2, 폴레이트 수용체 (Folate receptor), IL-13Ra2, Lewis-Y 항원 (antigen), NY- ESO-1, MARTᅳ 1， gplOO, 타이로시나제 (tyrosinase) , 타이로시나제ᅳ연관 단백질 (tyrosinase-related proteins), MAGE 및 WT-1 로 구성된 군으로부터 선택되는 어 느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환된 T-세포.
【청구항 23]
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 T-세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 24】
제 23항에 있어서， 상기 형질전환된 T—세포는 암 항원 특이적 CD4 T-세포， CD8 T-세포 또는 CD4 T—세포 및 CD8 T-세포를 포함하는 것을 특¾^^흐1^^앞치 료용 약학적 조성물.
【청구항 25】 .
제 16항의 바이러스 또는 비바이러스성 담체를 이용하여 T-세포를 형질 전환 시키는 단계를 포함하는 제 18항의 형질 전환된 T-세포의 제조 방법.
【청구항 26】
약학적으로 유효한 양의 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 T-세포를 암 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법. 、
【청구항 27】
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 T-세포를 암 질환 치료용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도.
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