JP6074435B2 - 変異ｃｔｌａ４遺伝子移入ｔ細胞及びこれを含む抗がん免疫治療用組成物 - Google Patents

変異ｃｔｌａ４遺伝子移入ｔ細胞及びこれを含む抗がん免疫治療用組成物 Download PDF

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Description

本発明は、抗がんＴ細胞療法のための遺伝子組み換えされたＴ細胞及びこれを含む抗がん治療用組成物に関する。
がんの治療にあたって最も一次的で且つ効果的な方法は、外科的切除術である。しかしながら、外科的切除だけでは残存がんや転移性病巣の除去が容易ではないため、これまで化学療法、放射線療法など種々の治療方法が外科的切除術と並行して行われてきた。しかしながら、このような種々の治療法の発展にも拘わらず、多発性転移や外科的切除後に見られる生化学的再発の効果的な治療は未だ発展していないのが現状であり、現在医学系が解消すべき大きな課題として残っている。
このような種々の臓器の腫瘍病巣や視認できない微細病巣の治療のための立派な代案として、最近、体内の免疫系を用いた免疫療法が脚光を浴びており、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓｃｈｒｅiｂｅｒらによってリンパ球欠乏ラットや強力なエフェクターサイトカインであるインターフェロン（IＦＮ）−γノックアウトラットなどにおいてがんの発生頻度が顕著に増大されることが観察されることから、がんの発生が免疫系、特に、リンパ球によって抑制されているという考え方が信頼性を得ており（Ｎａｔｕｒｅ，２００１，ｖｏｌ４１０；１１０７−１１１１）、特に、がん患者の体内にがん連関抗原を認知し得る特異的な抗体またはＴ細胞が存在するという報告が次から次へと行われていることは、抗がん免疫療法の適用可能性が非常に高いことを立証している。
最近、免疫療法のうち最も脚光を浴びている治療法としては、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋiｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ：ＮＫ細胞）、Ｔ細胞など免疫細胞を患者に直接的に注入する細胞治療法が挙げられる。中でも、Ｔ細胞治療法は眩しい成果を上げているが、Ｔ細胞治療法は、患者体内のがん抗原に特異的なＴ細胞を分離して体外（iｎ ｖiｔｒｏ）細胞培養を通じて大量増殖して患者の血液に戻すことによりがん細胞を攻撃するようにするという基本的な考え方を有している（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Iｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６，ｐｐ３８３）。すなわち、少数のがん特異的なＴ細胞を体外培養を通じてその数を増幅させて治療に用いるということである。
特に、Ｔリンパ球が有する抗原特異性と組織浸透力は、多数の箇所に散在しているがん焦点を一気に且つ効果的に除去することができるという点で期待を集めているが、Ｔ細胞は、自ら血管外遊出を通じて直接的に組織に浸透して特異的に抗原を発現する細胞を殺害することができるので、複数の転移組織にそれぞれ浸透してがん細胞を除去することができるというメリットを有していることから、最近、これらの抗がんＴ細胞を用いた細胞治療法の開発が盛んに行われているのが現状である。
Ｔ細胞を用いた細胞治療は、米国国立保健院（ＮIＨ）のＳｔｅｖｅ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ博士を中心として去る２０〜３０年間リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ：ｌｙｍｐｈｏｋiｎｅ−ａｃｔiｖａｔｅｄ ｋiｌｌｅｒ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴIＬ：ｔｕｍｏｒ−iｎｆiｌｔｒａｔiｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）などの名前で試みられてきたが、その有効性は制限的にしか立証されていない。しかしながら、最近、Ｔ細胞の注入前に患者のリンパ球を予め枯渇させる試みを通じて転移性黒色腫患者において完全寛解をはじめとして５０％の反応率を示すということが報告されることにより、選択的なＴ細胞伝達療法に重要な突破口を切り開いたという評価を受けている（Ｓｃiｅｎｃｅ． ２００２；２９８（５５９４）：８５０−４， Ｊ． Ｃｌiｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２００５；２３（１０）：２３４６−５７）。Ｔ細胞の注入前のリンパ球の枯渇は、後続して注入されるべきＴ細胞が増殖する余地を作る一方で、Ｔ細胞活性化の制限要素である制御性Ｔ細胞を除去する効果があると推定されている。このような反応率は、これまで試みられた免疫治療法の史上最高の反応率であり、その発展可能性に対する非常に励みになる予測を呼び起こしている。
がん抗原に特異的なＴ細胞療法の成功とあいまって、最近のＴ細胞療法の傾向は、分離したＴ細胞に遺伝子組み換えを加えることにより、その性質および効能を向上させた後に、再び患者に注入する遺伝子組み換えＴ細胞療法への取り組みが盛んに行われている。遺伝子組み換えＴ細胞療法は、患者から分離されたがん抗原に特異的なＴ細胞を増殖させた後、特定の遺伝子発現用レトロウィルスを用いてＴ細胞を形質転換させて患者に再注入するという考え方であり、このような考え方は実験室レベルを超えて既に多くの例において臨床試験が行われている。
しかしながら、このようながん特異的なＴ細胞を用いたがん治療療法を通じてがん細胞を効果的に除去するために必ず乗り越えるべき障害要因としてがん細胞が有する免疫抵抗性若しくは免疫抑制力が存在する。免疫系の腫瘍抑制能にも拘わらず、正常ラットや免疫能を維持している正常人においてがんが発生するということは、がん細胞が免疫系に抵抗し得る免疫抵抗性または免疫回避性を保有することになるということを意味する。
がん細胞の免疫抵抗性が生じる原因は未だ明らかに判明されておらず、いくつかの仮説が提示されているが、がん細胞が抗がんリンパ球に対する寛容を誘導するという説が有力である。すなわち、人体内には実際にがん細胞を認知して破壊し得るＴリンパ球が存在するが、がん細胞若しくはがん細胞の周りの微小環境がこれらの抗がんＴ細胞を不活性化させるということである。
実際に黒色腫患者の血液から採取したがん抗原に特異的なＴ細胞は、がん抗原であるＭｅｌａｎ−Ａペプチドで刺激すればIＦＮ−γを分泌するのに対し、がん組織やがん組織リンパ節から採取したがん抗原に特異的なＴ細胞はがん抗原で刺激してもIＦＮ−γを分泌できない非活性化状態にあるという報告がある。これは、がん患者の抹消血液にはがん細胞を認知して反応し得るＴ細胞が存在するが、これらのＴ細胞ががん組織に移行すれば局所的に非活性化、すなわち、寛容に陥るということを意味する。
これは、逆に言えば、がん細胞によるＴ細胞寛容を除去すれば、がん細胞がＴ細胞によって効果的に除去可能になることを意味する。このため、がん細胞に対する免疫学的な寛容を破って抗がんリンパ球を活性化させることが抗がん免疫療法の重要な先決課題であるといえる。
このようながん細胞によるＴ細胞寛容を除去するための種々の研究が行われてきている。特に、がん細胞によるＴ細胞寛容に与かる受容体またはタンパク質などを究明し、この機能を除去または抑制したり、受容体に対する拮抗剤または抗体などを用いて治療効果を高めるための研究が盛んに行われている。
代表的に、Ｔ細胞寛容に与かると知られている受容体は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４：Ｃｙｔｏｔｏｘiｃ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ａｓｓｏｃiａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅiｎ ４またはＴ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔiｇｅｎ ４）であって、ＣＤ１５２とも呼ばれる。ＣＴＬＡ４は、免疫グロブリンのスーパーファミリーの一種であり、Ｔ細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に阻害信号を伝達する。ＣＴＬＡ４タンパク質のＴ細胞非活性化を通じた寛容誘導現象は、ＣＴＬＡ４ノックアウトマウスにおいて深刻なリンパ球増殖性疾患および自己免疫疾患が観察されることにより確認された。
ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８とほとんど同じ配列を有し、抗原提示細胞のＢ７とも呼ばれるＣＤ８０およびＣＤ８６に対してＣＤ２８と競争的に結合するが、Ｂ７と結合する場合にＣＴＬＡ４は阻害信号を、ＣＤ２８は刺激信号を伝達する。すなわち、Ｂ７とＣＴＬＡ４が結合すれば、Ｔ細胞の活性化を阻害し、Ｂ７とＣＤ２８が結合すれば、Ｔ細胞の活性化を誘導するのである。
Ｔ細胞寛容に与かる別のタンパク質は、ＰＤ１である。ＰＤ１はＴ細胞の表面に発現され、ＰＤ−Ｌ１と結合してＴ細胞の活性化を阻害することが知られている。ＰＤ−Ｌ１はＣＤ２８とほとんど同じ構造を有するファミリーメンバーであって、主としてＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞などの免疫細胞の表面に発現され、心臓血管内皮細胞など一部の非リンパ性細胞においても発現されることが知られている。
ＰＤ１ノックアウトマウスにおいて自然に自己免疫疾患が生じ、ＰＤ１刺激によってＴ細胞の内部に陰性信号が伝達されるなど、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ１との相互作用を通じたＴ細胞活性抑制現象は、免疫寛容現象において非常に重要であることが知られている。
ところが、最近、多くの種類のがん組織においてＰＤ−Ｌ１の発現が増大されていることが観察されており（Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２００２ Ａｕｇ；８（８）：７９３−８００）、ＰＤ−Ｌ１に対する阻害抗体を処理すれば、抗がん免疫が増大されるということが報告されているなど（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃi．， １７；９９（１９）：１２２９３−７）、ＰＤ−Ｌ１ががん細胞の表面において免疫抑制作用をしているという証拠が次から次へと報告されている。
このため、ＣＴＬＡ４やＰＤ１のようにＴ細胞免疫寛容反応に与かる受容体やタンパク質の活性を抑制すれば、抗がん効果を収めることができるのではないかという期待に応じて、ＣＴＬＡ４やＰＤ１に対する抗体などその活性を抑える戦略のＴ細胞免疫療法に関する研究が活発に行われている。
特に、ＢＭＳ（Ｂｒiｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕiｂｂ）らが開発した抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブは抗がん免疫寛容を抑えて、転移性黒色腫に対する抗腫瘍効果を示すことが臨床的に立証されて、２０１１年ＦＤＡ許可を取得して現在市販中であり、ＢＭＳなどは完全ヒト型抗ＰＤ１抗体に対する臨床試験も進行中であるということが知られている。
しかしながら、抗ＣＴＬＡ４抗体や抗ＰＤ１抗体を用いる場合、ＣＴＬＡ４またはＰＤ１の全身的抑制によって抗がんＴ細胞だけではなく、自己抗原に対するＴ細胞寛容も破壊することにより、全身的な自己免疫疾患という致命的な副作用を来たすことが知られている。
このため、がん抗原に特異的なＴ細胞療法の実質的な臨床適用のために抗がんＴ細胞に対してのみ選択的にＣＴＬＡ４またはＰＤ１などのＴ細胞寛容信号伝達体系を阻害し得る技術の開発が切望されている。
したがって、本発明者らは、ＣＴＬＡ４の細胞内部抑制信号伝達ドメインが除去されたＣＴＬＡ４突然変異体であるＣＴＬＡ４デコイ受容体を発現するように抗がんＴ細胞を遺伝子組み換えして、Ｔ細胞固有のＣＴＬＡ４機能を競争的に抑えることにより、抗がんＴ細胞の活性を増大させようとした。しかしながら、実際にこのように遺伝子組み換えされた抗がんＴ細胞の場合、ＣＬＴＡ４デコイ受容体がリガンドであるＢ７と結合しても、細胞の内部に抑制信号が伝達されないため、がん細胞によるＴ細胞の寛容問題はある程度解決することができるが、依然としてＴ細胞の活性化を誘導するＣＤ２８とリガンドであるＢ７の結合を競争的に抑えることにより、結果的にＴ細胞の活性化がむしろ阻害されるという問題点が見出された。
そこで、本発明者らは、前記ＣＴＬＡ４の細胞内部抑制信号伝達ドメインを除去し、その場所にＣＤ２８タンパク質の細胞内部活性化信号伝達ドメインを融合させたＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされた抗がんＴ細胞（図１参照）を講じて、ＣＴＬＡ４にリガンドが結合される場合、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質に含まれているＣＤ２８の細胞内部活性化信号伝達ドメインの作用によってＣＴＬＡ４とリガンドの結合によるＴ細胞活性抑制信号を活性化信号に切り換える効果をもたらすので、がん細胞によるＴ細胞寛容を克服することができるだけではなく、Ｔ細胞の活性化を通じて抗がん能力が向上される効果をもたらすことにより抗がん効能が大幅に向上され、且つ、全身的なＣＴＬＡ４活性の抑制による自己免疫疾患の発病などの副作用を回避することができて理想的なＴ細胞免疫療法に利用可能であるということを見出し、しかも、ＣＴＬＡ４と同様に、Ｔ細胞の寛容に与かると知られているＰＤ１の細胞内ドメインを除去し、ここにＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質と同様にＰＤ１−ＣＤ２８キメラタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされたＴ細胞もまたＴ細胞活性化を増大させて理想的なＴ細胞免疫療法に利用可能であるということを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
米国登録特許８０２６２２４：Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗiｔｈ iｎｃｒｅａｓｅ iｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃiｔｙ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ、登録日：２０１１年９月２７日、出願人：Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Iｎｓｔiｔｕｔｅ， Iｎｃ． 米国登録特許７７４４８７５： Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｔｈｅｒｅｐｅｕｔiｃ ｅｎｄｐｏiｎｔ ｆｏｒ ａｎｔi−ＣＴＬＡ４ ｂａｓｅ iｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｄiｓｅａｓｅ、登録日：２０１０年６月２９日、出願人：Ｍｅｄａｒｅｘ， Iｎｃ． 米国登録特許７７００５５６： Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｕｓiｎｇ ＣＴＬＡ４ ｍｕｔａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、登録日： ２０１０年４月２０日、出願人：Ｂｒiｔｓｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕiｂｂ Ｃｏ．
"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓiｓ ｏｆ ＣＴＬＡ−４ ｆｕｎｃｔiｏｎ iｎ ｖiｖｏ" Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ Ｅ． Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｊ Iｍｍｕｎｏｌ． ２０００ Ｍａｙ １５；１６４（１０）：５３１９−２７． "Ｓｈｏｒｔ ｃｙｔｏｐｌａｓｍiｃ ＳＤＹＭＮＭ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ２８ iｓ ｓｕｆｆiｃiｅｎｔ ｔｏ ｃｏｎｖｅｒｔ ＣＴＬＡ−４ ｔｏ ａ ｐｏｓiｔiｖｅ ｓiｇｎａｌiｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ" Ｙiｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂiｏｌ． ２００３ Ｊａｎ；７３（１）：１７８−８２．
本発明の目的は、Ｔ細胞免疫寛容受容体の細胞内信号伝達ドメインを除去し、Ｔ細胞活性化表面タンパク質ＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインを融合させた融合タンパク質およびこれをコードする遺伝子を提供することである。
本発明の他の目的は、前記遺伝子を含むウィルスまたは非ウィルス性担体に形質転換されたがん抗原特異的形質転換されたＴ細胞およびその製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換されたＴ細胞を含むがん治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、薬学的に有効な量の前記形質転換されたＴ細胞をがん疾患にかかった個体に投与するステップを含むがんの治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換されたＴ細胞をがん疾患治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供することである。
前記目的を達成するために、Ｔ細胞の表面にＣＴＬＡ４またはＰＤ１の細胞内部抑制信号伝達ドメインを除去し、その場所にＣＤ２８タンパク質の細胞内部活性化信号伝達ドメインが融合された融合タンパク質であるＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質またはＰＤ１−ＣＤ２８キメラタンパク質およびこれをコードする遺伝子を提供する。
また、本発明は、前記遺伝子を含むウィルスまたは非ウィルス性担体に形質転換されたがん抗原特異的形質転換されたＴ細胞およびその製造方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明の形質転換されたＴ細胞を含むがん治療用薬学的組成物を提供する。
さらにまた、本発明は、薬学的に有効な量の前記形質転換されたＴ細胞をがん疾患にかかった個体に投与するステップを含むがんの治療方法を提供する。
加えて、本発明は、前記形質転換されたＴ細胞をがん疾患治療用薬学的組成物の製造に用いる用途を提供する。
本発明に係るＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８キメラ遺伝子が移入されたＴ細胞は、がん細胞の免疫寛容による治療効果阻害問題を解決することができるだけではなく、むしろＣＤ２８の信号伝達を活性化させてＴ細胞の活性化を誘導することにより抗がん効果を極大化させることができるというメリットがある。
また、がん細胞においてのみ特異的にＣＴＬＡ４またはＰＤ１の活性を抑えることにより、既存の抗ＣＴＬＡ４抗体など非特異的ＣＴＬＡ４またはＰＤ１拮抗剤を用いる場合に生じる全身的Ｔ細胞活性化による自己免疫疾患発病などの副作用を極力抑えることができる。
このため、本発明に係るＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８キメラ遺伝子が移入されたＴ細胞を含む抗がん治療用薬学組成物は、既存の方法に比べて顕著に優れたがん治療効能を有するＴ細胞免疫療法に用いて好適である。
図１は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質を発現するがん抗原に特異的なＴ細胞のがん治療原理を示す図である：ＣＴｄｃ：ＣＬＬＡ４デコイ受容体；およびＣＴＣ２８：ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質。（以下、他の図面の説明においても同様である。） 図２は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８の発現のための遺伝子構造体およびプラスミド制限酵素切断地図を示す図である。（ａ）ｐＭIＧ−ｗレトロウィルス性ベクターの制限酵素切断地図（ｒｅｓｔｒiｃｔiｏｎ ｍａｐ）；および（ｂ）ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８のレトロウィルス性遺伝子構造体の構造。ＣＴＬＡ４ＥＣ：ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン；ＴＭ：膜貫通ドメイン；ＣＤ２８ＣＰ：ＣＤ２８の細胞内ドメイン；およびＥＶ：ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８が含まれていない空きレトロウィルス性ベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）。（以下、他の図面の説明においても同様である。） 図３は、ＣＬＴＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＴ細胞の細胞分裂能力およびIＦＮ−γ分泌能力を示す図である。（ａ）いかなる遺伝子組み換えをしなかった場合のルシフェラーゼ活性；（ｂ）ＣＴｄｃまたはＣＴＣ２８に形質転換した場合のルシフェラーゼ活性；（ｃ）ＣＴｄｃまたはＣＴＣ２８に形質転換した場合のＴ細胞分裂能力；および（ｄ）ＣＴｄｃまたはＣＴＣ２８に形質転換した場合のIＦＮ−γ分泌能力。 図４は、ＣＬＴＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞のIＦＮ−γの分泌能力、がん細胞殺傷能力および腫瘍治療効果を示す図である。（ａ）ＣＴＣ２８に形質転換した場合のIＦＮ−γ分泌能力；（ｂ）ＣＴＣ２８に形質転換した場合のがん細胞殺傷能力；および（ｃ）ＣＴＣ２８に形質転換した場合の腫瘍治療効果。 図５は、ＣＬＴＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＴ細胞の細胞培養時の抗原反応性を示す図である。（ａ）ＣＤ４ ＯＴ−II細胞を用いた場合のIＬ−２の分泌能力；（ｂ）ＣＤ４ ＯＴ−II細胞を用いた場合のIＦＮ−γの分泌能力；（ｃ）ＣＤ８ ＯＴ−I細胞を用いた場合のIＬ−２の分泌能力；および（ｄ）ＣＤ８ ＯＴ−I細胞を用いた場合のIＦＮ−γの分泌能力。 図６は、遺伝子組み換えＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞併合治療モデルを示す図である。 図７は、Ｅ．Ｇ７腫瘍へのＯＴ−II Ｔ細胞の単独投与の効果を示す図である。 図８は、Ｅ．Ｇ７腫瘍へのＯＴ−I Ｔ細胞とＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞の併合投与の効果を示す図である。（▲：いかなる処理もしなかった場合、△：ＯＴ−Iのみを用いた場合、●：ＯＴ−I＋ＯＴ−II、□：ＯＴ−I＋ＯＴ−II ＣＴＣ２８）（ａ）ＯＴ−I Ｔ細胞：ＯＴ−II Ｔ細胞＝２：０．５；（ｂ）ＯＴ−I Ｔ細胞：ＯＴ−II Ｔ細胞＝２：１；および（ｃ）ＯＴ−I Ｔ細胞：ＯＴ−II Ｔ細胞＝２：２ 図９は、ＯＴ−IIおよびＯＴ−I Ｔ細胞の同時形質転換による腫瘍治療効果を示す図である。（▲：いかなる処理もしなかった場合、■：ＯＴ−I＋ＯＴ−II、●：ＯＴ−I＋ＯＴ−II ＣＴＣ２８、□：ＯＴ−I ＣＴＣ２８＋ＯＴ−II ＣＴＣ２８） 図１０は、遺伝子組み換えＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞併合療法の抗黒色腫効果を示す図である。（▲：いかなる処理もしなかった場合、○：Ｐｍｅｌ−１ ＥＶ、■：Ｐｍｅｌ−１ ＥＶ＋ＣＤ４ ＥＶ、□：Ｐｍｅｌ−１ ＣＴＣ２８＋ＣＤ４ ＣＴＣ２８）（ａ）腫瘍の体積の変化を示す図；および（ｂ）生存率の変化を示す図 図１１は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＴ細胞のＡｋｔリン酸化を示す図である。 図１２は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８発現のための遺伝子構造体を用いて形質転換したＴ細胞を柔細胞分類器を用いて分析した結果を示す図である。 図１３は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＴ細胞の各受容体を刺激したとき、IＦＮ−γの分泌能力を示す図である。 図１４は、Ｅ．Ｇ７腫瘍へのＯＴ−I Ｔ細胞の単独投与の効果を示す図である。 図１５は、Ｅ．Ｇ７腫瘍を有するマウスに形質転換されたＯＴ−IおよびＯＴ−II Ｔ細胞を投与した後、マウス脾臓内のこれらのＴ細胞の数および抗原反応性を示す図である。（ａ）形質転換されたＯＴ−IおよびＯＴ−II Ｔ細胞の細胞培養時の抗原反応性を柔細胞分類器を用いて分析した結果；（ｂ）形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞のマウス体内増殖度を柔細胞分類器を用いて計算した結果；および（ｃ）形質転換されたＯＴ−I Ｔ細胞の細胞培養時における抗原反応後のIＦＮ−γの分泌能。 図１６は、遺伝子組み換えＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞併合療法の抗黒色腫効果のうち血液内遺伝子組み換えＴ細胞の増殖度を示す図である。（ａ）血液細胞のうちＣＤ４ Ｔ細胞の割合を柔細胞分類器を用いて分析した結果；（ｂ）血液細胞のうちＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞の割合を柔細胞分類器を用いて分析した結果；（ｃ）血液内ＣＤ４ Ｔ細胞の数を柔細胞分類器を用いて計算した結果（●：ＣＤ４ ＥＶ、□：ＣＤ４ ＣＴＣ２８）；および（ｄ）血液内Ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞の数を柔細胞分類器を用いて計算した結果（●：Ｐｍｅｌ−１ ＥＶ、□：Ｐｍｅｌ−１ ＣＴＣ２８）。 図１７は、遺伝子組み換えＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞併合療法の抗黒色腫に対する効果を示す図である。（▲：いかなる処理もしなかった場合、■：Ｐｍｅｌ−１ ＥＶ＋ＣＤ４ ＥＶ、◆：Ｐｍｅｌ−１ ＥＶ＋ＣＤ４ ＣＴＣ２８、□：Ｐｍｅｌ−１ ＣＴＣ２８＋ＣＤ４ ＣＴＣ２８） 図１８は、遺伝子組み換えＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞併合療法の抗黒色腫に対するIＬ−２の効果を示す図である。（▲：いかなる処理もしなかった場合、■：ＣＴＣ２８＋対照群IｇＧ抗体、◇：ＣＴＣ２８＋抗IＬ−２抗体、□：ＣＴＣ２８＋対照群IｇＧ抗体）
以下、本発明の用語について詳細に説明する。
本発明において、用語「細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａiｎ）」は、細胞の外部に突出されてリガンドなどと結合し得るドメインを意味し、
「膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａiｎ）」は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８などにおいて、細胞膜に位置するドメインを意味し、
「細胞内ドメイン（iｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａiｎ）」は、細胞の内部に位置し、細胞外ドメインとリガンドが結合されて伝達される信号を細胞内に伝達するドメインを意味する。
前記細胞内ドメインは、信号の性質に応じて、阻害信号伝達ドメインまたは活性信号伝達ドメインに分けられる。
本発明において、用語「抗がん」は、「予防」および「治療」を含み、ここで、「予防」とは、本発明に係るＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたがん抗原に特異的なＴ細胞を含む組成物投与によってがんが抑制または遅延されるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、本発明に係るＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたがん抗原に特異的なＴ細胞を含む組成物投与によってがんの症状が好転したり良好になったりするあらゆる行為を意味する。
以下、本発明について詳述する。
本発明は、Ｔ細胞表面免疫寛容誘導受容体の細胞内信号伝達ドメインを除去し、Ｔ細胞活性化表面タンパク質ＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインを融合させた融合タンパク質を提供する。
前記Ｔ細胞表面寛容誘導受容体とＴ細胞活性化表面タンパク質であるＣＤ２８は、Ｔ細胞表面寛容誘導受容体またはＣＤ２８の膜貫通ドメインによって融合されることが好ましいが、これに限定されない。
前記Ｔ細胞表面寛容誘導受容体は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４：Ｃｙｔｏｔｏｘiｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃiａｔｅｄ ａｎｔiｇｅｎ ４）またはＰＤ１であることが好ましい。
前記融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン−ＣＴＬＡ４の膜貫通ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインまたはＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン−ＣＤ２８の膜貫通ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインから構成されることが好ましいが、これに限定されない。
前記融合タンパク質は、ＰＤ１の細胞外ドメイン−ＰＤ１の膜貫通ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインまたはＰＤ−１の細胞外ドメイン−ＣＤ２８の膜貫通ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインから構成されることが好ましいが、これに限定されない。
前記ＣＴＬＡ４は、配列番号１のヒト由来のアミノ酸配列または配列番号２のマウス由来のアミノ酸配列を有することが好ましい。
前記配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列において、１〜１６１番目までのアミノ酸配列が、細胞外ドメイン、すなわち、Ｂ７などのリガンドと結合する部位であり、１６２〜１８９番目までのアミノ酸配列は膜貫通ドメイン、１９０〜２２３番目までのアミノ酸配列は細胞内ドメインを示す。
前記ＣＤ２８は、配列番号３のヒト由来のアミノ酸配列または配列番号４のマウス由来のアミノ酸配列を有することが好ましい。
前記配列番号３のアミノ酸配列において、１〜１５２番目までのアミノ酸配列が、細胞外ドメイン、すなわち、Ｂ７などのリガンドと結合する部位であり、１５３〜１７８番目までのアミノ酸配列は膜貫通ドメイン、１７９〜２２０番目までのアミノ酸配列は細胞内ドメインを示し、配列番号４のアミノ酸配列において、１〜１５０番目までのアミノ酸配列が、細胞外ドメイン、すなわち、Ｂ７などのリガンドと結合する部位であり、１５１〜１７６番目までのアミノ酸配列は膜貫通ドメイン、１７７〜２１８番目までのアミノ酸配列は細胞内ドメインを示す。
また、ＣＬＴＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質にＣＴＬＡ４の膜貫通ドメインが用いられる場合、ＣＴＬＡ４の細胞内阻害信号が伝達されない範囲内においてＣＴＬＡ４の細胞外ドメインと膜貫通ドメインにさらにＣＴＬＡ４細胞内ドメインの一部の配列が含まれる場合、または、ＣＤ２８の細胞内ドメインにＣＤ２８膜貫通ドメインの一部の配列がさらに含まれる場合も、本発明の権利範囲に含まれるという点は通常の技術者にとって自明であり、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質にＣＤ２８の膜貫通ドメインが用いられる場合、ＣＴＬＡ４とリガンドの結合に影響を及ぼさない範囲内においてＣＤ２８の細胞外ドメインの一部がＣＤ２８の細胞内ドメインと膜貫通ドメインにさらに含まれる場合、または、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインにＣＴＬＡ４膜貫通ドメインの一部の配列がさらに含まれる場合も、本発明の権利範囲に含まれるという点もまた通常の技術者にとって自明である。
本発明において提供されるＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質の一例は、配列番号５〜配列番号７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を有する。
前記ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン−ＣＴＬＡ４の膜貫通ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列であることが好ましいが、これに限定されない。
前記ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン−ＣＤ２８の細胞膜ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
前記ＰＤ１の細胞外ドメイン−ＰＤ１の膜貫通ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインまたはＰＤ−１の細胞外ドメイン−ＣＤ２８の膜貫通ドメイン−ＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。

また、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。
前記ＣＴＬＡ４の細胞ドメイン−ＣＴＬＡ４の膜貫通ドメインは、配列番号９のヌクレオチド配列であることが好ましく、ＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列番号１０のヌクレオチド配列であることが好ましいが、これに限定されない。
さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子を含むウィルスまたは非ウィルス性担体を提供する。
前記ウィルスまたは非ウィルス性担体は、動物細胞、特に、Ｔ細胞などを感染によって形質転換させ得るものであれば、特に制限なしに使用可能である。
前記ウィルスは、レトロウィルス（ｒｅｔｒｏｖiｒｕｓ）、レンチウィルス（ｌｅｎｔiｖiｒｕｓ）、アデノウィルス（ａｄｅｎｏｖiｒｕｓ）およびアデノ関連ウィルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃiａｔｅｄ ｖiｒｕｓ）であることが好ましく、レトロウィルス、レンチウィルスおよびアデノ関連ウィルスであることがより好ましいが、これに限定されない。
前記非ウィルス性担体としては、トランスポゾンシステムを用いること（Ｈａｃｋｅｔｔら、ＵＳ６，４８９，４５８）が好ましいが、これに限定されることはなく、一般的に使用可能な非ウィルス性担体のうち、本発明に目的に見合ういかなるものであっても使用可能であるということは通常の技術者にとって自明である。
さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子を含むウィルスまたは非ウィルス性担体を用いて形質転換されたＴ細胞を提供する。
前記Ｔ細胞は、がん抗原に特異的なＴ細胞またはキメラ抗原受容体であるＣＡＲ（Ｃｈiｍｅｒiｃ Ａｎｔiｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子が形質転換されたＴ細胞であり、がん抗原に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）またはＣＤ８ Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）であることが好ましいが、これに限定されない。
前記キメラ抗原受容体とは、Ｔ細胞活性化タンパク質（ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、４１ＢＢＬ、Ｏｘ４０、IＣＯＳ、高親和性IｇＥ受容体（ＦｃεＲI）およびその他のＴ細胞活性化タンパク質）の細胞膜若しくは細胞内信号伝達部位をがん抗原に特異的な抗体の抗原結合部位（単一鎖Ｆｖフラグメント）と融合させたタンパク質を通称する。
前記がん抗原に特異的なＴ細胞は、患者のがん組織から分離したＴ細胞（腫瘍浸潤リンパ球）を体外培養したもの、がん抗原を特異的に認知する受容体、すなわち、がん抗原に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子をクローニングした後、レトロウィルスなどのウィルス性ベクターを用いて患者抹消血液から分離した全体Ｔ細胞に形質転換して得たＴ細胞（ＴＣＲ遺伝子組み換えＴ細胞）（Ｓｃiｅｎｃｅ． ２００６；３１４（５７９６）：１２６−９）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外ドメインをがん抗原に特異的な抗体に置き換えたキメラ抗原受容体であるＴ細胞受容体（ＣＡＲ：Ｃｈiｍｅｒiｃ Ａｎｔiｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｊ． Ｃｌiｎ． Iｎｖｅｓｔ． １１７：１４６６−１４７６ （２００７））に形質転換させたＣＡＲ形質転換Ｔ細胞（Ｂｌｏｏｄ． ２０１０； １１６（７）：１０３５−１０４４）などが使用可能であるが、これに限定されない。
本発明において、がん抗原に特異的なＴ細胞が特異的に認識し得る抗原としては、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、葉酸受容体、IＬ−１３Ｒα２、Ｌｅｗiｓ−Ｙ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＭＡＧＥ、ＷＴ−１などが挙げられるが、これに限定されるものではなく、他のがんにおいて特異的に発現される抗原も本発明の目的に見合う限り、本発明に係るＴ細胞免疫療法に使用可能であるということは通常の技術者にとって自明である。
本発明は、ＣＴＬＡ４の細胞内部抑制信号伝達ドメインを除去し、その場所にＣＤ２８タンパク質の細胞内部活性化信号伝達ドメインを融合させたＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされた抗がんＴ細胞（図１参照）を講じて、ＣＴＬＡ４にリガンドが結合される場合、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質に含まれているＣＤ２８の細胞内部活性化信号伝達ドメインの作用によってＣＴＬＡ４とリガンドの結合によるＴ細胞活性抑制信号を活性化信号に切り換える効果をもたらすので、がん細胞によるＴ細胞寛容を克服することができるだけではなく、Ｔ細胞の活性化を通じて抗がん能力が向上される効果を極大化させることができるというメリットがあり、且つ、がん細胞においてのみ特異的にＣＴＬＡ４またはＰＤ１の活性を抑えることにより、既存の抗ＣＴＬＡ４抗体など非特異的なＣＴＬＡ４またはＰＤ１拮抗剤を用いる場合に発生する全身的Ｔ細胞活性化による自己免疫疾患発病などの副作用を極力抑えることができる。
このため、本発明に係るＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８キメラ遺伝子が移入されたＴ細胞を含む抗がん治療用薬学組成物は、既存の方法に比べて顕著に優れたがん治療効能を有するＴ細胞免疫療法に用いて好適である。
さらに、本発明は、本発明の形質転換されたＴ細胞を含むがん治療用薬学的組成物を提供する。
前記がん治療用薬学的組成物は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８遺伝子に形質転換されたがん抗原に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞を含むことが好ましく、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８遺伝子に形質転換されたがん抗原に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を両方とも含むことがより好ましい。
前記がんまたはがん種には特に制限はなく、固形がんおよび血液がんを含む。好ましくは、胃がん、肺がん、乳房がん、卵巣がん、肝がん、気管支がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、すい臓がん、膀胱がん、大腸がん、結腸がん、すい臓がん、子宮頚部がん、脳がん、前立腺がん、骨がん、皮膚がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、腎臓がん、食道がん、胆道がん、睾丸がん、直腸がん、頭頚部がん、頚椎がん、尿管がん、骨肉腫、神経細胞亜種、黒色腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経母細胞腫または神経膠種などを含み、さらに好ましくは、大腸がん、卵巣がん、胃がん、すい臓がん、乳房がんなどが挙げられる。
本発明に係る組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して種々の剤形に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウェーハなどの剤形に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形に製造することができる。また、前記抗がん組成物は、典型的に膜を通過した移動を容易にする界面活性剤を含んでいてもよい。このような界面活性剤としては、ステロイドから誘導されたもの、または、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）などの陽イオン性脂質、またはコレステロールヘミスクシナート、ホスファチジルグリセロールなどの各種の化合物などが挙げられる。
また、本発明は、本発明に係るＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子またはＰＤ１−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたがん抗原に特異的なＴ細胞を含む組成物を個体に投与してがんを治療し、がんの成長を抑える方法を提供する。
本発明に係る組成物は、がん細胞またはそれらの転移を治療するために、または、がんの成長を抑えるために、薬学的に有効な量で投与可能である。がんの種類、患者の年齢、体重、症状の特性および軽重、現在治療法の種類、治療回数、投与形態および経路など種々の要因によって異なり、通常の技術者によって容易に決定可能である。本発明に係る組成物は、上述した薬理学的または生理学的成分を一緒に投与してもよく順次に投与してもよい。なお、さらなる従来の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与してもよい。このような投与は、単一または多重の投与であってもよい。前記全ての要素を考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、通常の技術者によって容易に決定可能である。
以下、本発明を下記の実施例および実験例によって詳細に説明する。
但し、下記の実施例および実験例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例および実験例によって限定されることはない。
＜実施例１＞マウスおよび細胞の準備
Ｐｍｅｌ−１、ＯＴ−I、Ｂ６とＴｈｙ１．１＋コンジェニックＢ６マウスは、ジャクソン研究所から入手した。ＲＡＧ１−／−背景を有するＯＴ−IIマウスは、タコニックから入手した。形質転換マウスは全てＢ６背景を有する。マウスは、国立がんセンター内の特定の病原体がない施設において飼育され、国立センターの実験動物管理および使用委員会のガイドラインを遵守した。
Ｅ．Ｇ７リンパ腫細胞およびＢ１６−Ｆ１０（Ｂ１６）黒色腫細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−２１１３およびＣＲＬ−６４７５）はＢ６マウスから由来した。フェニックスエコー（Ｐｈｅｏｎiｘ Ｅｃｏ）およびフェニックスＧＰ細胞株は、Ｇａｒｒｙ Ｎｏｌａｎ博士（スタンフォード大学）の許可下でＡＴＣＣから入手した（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＳＤ３４４４およびＳＤ３５１４）。
ＣＤ８ Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、抗ＣＤ８マイクロビーズを用いてポジティブ選択するか、あるいは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞分離キット（ミルテニーバイオテク社製）を用いてネガティブ選択した。
＜実施例２＞プラスミドの製作
ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラを製作するために、マウス由来ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインと膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）とマウスＣＤ２８の細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）はマウスＣＴＬＡ４およびＣＤ２８ｃＤＮＡを含むプラスミドから重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａiｎ ｒｅａｃｔiｏｎ）によって増幅して得た。
増幅された両断片は平滑末端のライゲーションによって結合されてクローニングベクターにクローニングされた。
次いで、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子のｃＤＮＡは、米国国立ユダヤ医学研究センターのＹｏｓｅｆ Ｒｅｆａｅｌi博士から入手したｐＭIＧ−ｗレトロウィルス性ベクター（図２（ａ）参照）にクローニングされた。
ＣＴＬＡ４デコイ受容体は、配列番号９によるＣＴＬＡ４の細胞外および膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列を用いてＰＣＲによって増幅した後、ｐＭIＧ−ｗレトロウィルス性ベクターにクローニングした（図２（ｂ）参照）。
＜実施例３＞ルシフェラーゼ分析およびウェスタンブロット
ジャーカットＴ細胞（１×１０７）は、レトロウィルス発現プラスミド、ＲＥ／ＡＰルシフェラーゼプラスミド（カリフォルニア大学のＡｒｔｈｕｒ Ｗｅiｓｓ教授提供）および標準化のためのｐＲＬ−ＴＫレニラルシフェラーゼプラスミド（プロメガ社製）と混合した。
次いで、２５０Ｖおよび９５０μＦの条件下でバイオラッドラボラトリーズ製のジーンパルサーを用いて０．４−ｃｍ−ｇａｐに電気穿孔法を用いて形質転換させた。
形質転換後に、刺激前に２４時間放置し、次いで、刺激のために、抗マウスIｇＧ（５μｇ／ｍｌ）と抗ハムスターIｇＧ抗体（５μｇ／ｍｌ）でコーティングされて一晩中放置された９６ウェルプレートを洗浄した後、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）単独、または正常ハムスターIｇＧやハムスター抗ＣＬＴＡ４抗体（９Ｈ１０、２μｇ／ｍｌ）でコーティングした後、室温で２時間放置した。
次いで、１×１０５細胞を各ウェルに添加し、３７℃で６時間培養した後、溶解させた。いくつかの実験のためには水溶性抗ＣＤ２８抗体がプレートに結合された抗ＣＴＬＡ４抗体の代わりに培地に直接的に添加された。
ルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼ報告分析システムを用いて、ルミノメーター（プロメガ社製）を用いて測定した。ショウジョウバエルシフェラーゼの活性は、レニラルシフェラーゼ活性を用いて標準化させた。
ウェスタンブロット分析のために、ルシフェラーゼプラスミドを除外し、レトロウィルスプラスミドのみを用いて前記プロトコールに従ってジャーカットＴ細胞を形質転換した。
形質転換された細胞の刺激のために、形質転換された細胞は、マウス抗ヒトＣＤ２８抗体または一般ハムスターIｇＧまたはハムスター抗マウスＣＴＬＡ４抗体（２μｇ／ｍｌ）のうちの一つを用いて氷上において１０分間処理し、次いで、ヤギ抗マウスIｇＧまたは抗ハムスターIｇＧ（５μｇ／ｍｌ）と１０分間氷上において架橋させた。
次いで、細胞を３０分間３７℃の水槽に入れ、氷を用いて冷却されたＰＢＳを添加して反応を中止した。細胞溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に用いられ、ニトロセルロース膜（ミリポア）に移されて、抗リン酸Ａｋｔまたは抗Ａｋｔ抗体（セルシグナリング社製）によって検出された。ＨＲＰ−標識２次抗体（ジャクソン免疫研究所）は１次抗体を検出するのに用いられ、ブロットはピアス社製のスーパーシグナルウェストピコを用いて化学発光反応によって視覚化させた。
＜実施例４＞レトロウィルスの製作および形質転換
リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いてレトロウィルス性プラスミドとＶＳＶ−ＧｃＤＮＡをコードするプラスミドであるｐＭＤ．ＧをフェニックスＧＰ細胞株に形質転換した。４８時間後にＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウィルスを含む上澄み液を回収した。フェニックスエコー細胞株はレトロウィルスを含む上澄み液を用いて一晩中形質転換した。
３〜５日経過後に、ＧＦＰ陽性フェニックスエコー細胞株はエコトロピックレトロウィルスを産生するための安定的な生産株の製作のために細胞分類器（ＦＡＣＳ Ａｒiａ、ＢＤバイオサイエンス社製）によって分離された。エコトロピックレトロウィルスを含む上澄み液は回収された後、遠心分離フィルタ機（Ａｍiｃｏｎ Ｕｌｒａ−１５、カットオフ値１００ ｋＤａ、ミリポア社製）によって１０倍濃縮された。レトロウィルスを用いたＴ細胞の形質転換のために正常または形質転換されたマウス由来の脾臓細胞をプレートに結合された抗ＣＤ３ε（５μｇ／ｍｌ、１４５−２Ｃ１１）および抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ、３７．５１）抗体または抗原性ペプチドを用いて刺激した。
刺激後に２４時間となる時点で、Ｔ細胞は濃縮されたレトロウィルスを用いて２５００ｒｐｍにおいて９０分間遠心分離して形質転換（スピン感染）させた。この過程を同じ日にさらに一回繰り返し行った。スピン感染を行う間に、６μｇ／ｍｌのポリブレン（シグマ社製）が培養上澄み液に添加されるか、あるいは、形質転換効率を高めるためにレトロネクチンがコーティングされたプレート（１５μｇ／ｍｌ、タカラ社製）において前記過程が行われた。刺激後に４８時間となる時点で、形質転換されたＴ細胞は３０ｕｎiｔ／ｍｌのマウスIＬ−２（インビトロジェン社製）を含む新鮮な培地に移されて分析前に４８〜７２時間放置された。
＜実施例５＞サイトカインＥＬIＳＡ、細胞増殖および細胞毒性分析（Ｐ−ＪＡＭテスト）
細胞選別によって分離されたＧＦＰ−陽性細胞（２×１０４／ｗｅｌｌ）は、４８時間照射された脾臓細胞（２×１０５／ｗｅｌｌ）の存在下で様々な濃度の抗ＣＤ３抗体または抗原ペプチドによって刺激された。
上澄み液内のサイトカインは、ＢＤバイオサイエンス社製のＥＬIＳＡセットを用いて測定した。
細胞増殖の測定のために４８時間刺激された細胞を３Ｈ−チミジンを用いてパルスして、さらに２４時間刺激した。細胞は細胞ハーベスタによって回収され、放射能活性はワラックトリルックス１４５０シンチレーションカウンタによって測定された。
細胞毒性の分析のために形質転換されたＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞を４８時間照射脾臓細胞の存在下で１μＭのｈｇｐ１００ペプチドを用いて刺激した後、様々な活性化されたＴ細胞をＢ１６細胞（１×１０４）とともに２０時間をかけて共同培養した後、ＰＢＳを用いて洗浄した。残ったＢ１６細胞は、細胞の回収および放射能活性の測定前に６時間をかけて３Ｈ−チミジンを用いてパルスした。
＜実施例６＞Ｔ細胞を用いた形質転換
Ｂ６マウスに０日目にＥ．Ｇ７細胞（１〜２×１０６）またはＢ１６細胞（１×１０５）を皮下注射した。レトロウィルスに形質転換されたＴ細胞は７日目にマウスに移入された。Ｂ１６黒色腫モデルの場合、Ｔ細胞が移入される日に、マウスを骨髄非形成全身照射（ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔiｖｅ ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ iｒｒａｄiａｔiｏｎ、ＴＢI）（４Ｇｙ）してリンパ球枯渇させた。
腫瘍の成長はカリパーを用いて３〜４日おきに測定し、おおまかな大きさ（ｍｍ２）は次のように計算された：長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×π。腫瘍の大きさが５００ｍｍ２を超えると、マウスを安楽死させた。形質転換されたＴ細胞の細胞内サイトカインの染色のために、細胞外（ｅｘ ｖiｖｏ）において活性化されたＴ細胞が固定および貫通（ＢＤ ｃｙｔｏｆiｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキット）された後、ＰＥ標識された抗マウスIＬ−２またはIＦＮ−γによって染色された。
＜実験例１＞ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質のＴ細胞活性化効果
マウス由来ＣＴＬＡ４（配列番号２参照）の細胞内部抑制信号伝達ドメインが除去されたＣＴＬＡ４突然変異体であるＣＴＬＡ４デコイ受容体およびＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質（配列番号６参照）を発現するレトロウィルス性遺伝子構造体を図２（ｂ）に示すように製作した。
図２において、ＥＶは何も挿入されていないレトロウィルスベクターであるｐＭIＧ−ｗを意味し、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ（ＣＴＣ２８）遺伝子とＣＴＬＡ４デコイ受容体（ＣＴｄｃ）のｃＤＮＡはｐＭIＧ−ｗのIＲＥＳ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）カセットの前に挿入された。
ジャーカットＴ細胞をＣＬＴＡ４デコイ受容体またはＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を含んでいない空きプラスミドと、ＣＤ２８反応エレメントを含有するＲＥ／ＡＰルシフェラーゼプラスミドに形質転換させた後、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激した場合、以前の報告のように、抗ＣＤ３抗体単独で刺激した場合に比べてルシフェラーゼ活性が大幅に増大されることを確認することができた（図３（ａ）参照）。これは、内生のＣＤ２８による信号伝達が上手に行われていることを立証している。
同様に、ジャーカットＴ細胞をＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を含むプラスミドとＲＥ／ＡＰルシフェラーゼプラスミドに形質転換させた後、抗ＣＤ３および抗ＣＴＬＡ４抗体で刺激した場合、やはり抗ＣＤ３抗体単独で刺激した場合に比べてルシフェラーゼ活性が大幅に増大することを確認することができた。これに対し、ＣＴＬＡ４デコイ受容体遺伝子を含む場合にはルシフェラーゼ活性がほとんど増大されないことを確認することができた（図３（ｂ）参照）。
また、ＣＴＬＡ４デコイ遺伝子が形質転換されたジャーカット細胞株においてはＡｋｔリン酸化が増大されないのに対し、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラをジャーカット細胞株に形質転換した後、抗ＣＴＬＡ４抗体で刺激した場合、Ａｋｔリン酸化は増大されることを確認することができた（図１１参照）。
これは、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質を用いる場合、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインにリガンドが結合しても実際に細胞内にはＣＤ２８による活性化信号が伝達されていることを立証している。
この点はＴ細胞の活性化結果によっても立証されるが、図２（ｂ）に示すように、ＧＦＰをレポータとして用いて形質転換されたＴ細胞の活性化を測定した結果、ＣＴＬＡ４デコイ遺伝子に形質転換されたＴ細胞はいかなる処理もしなかった場合に比べて分裂能とIＦＮ−γ分泌能が劣っているのに対し、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＴ細胞は正常な分裂能と遥かに増大されたIＦＮ−γ分泌能を示すことが確認された（図３（ｃ）および図３（ｄ）参照）。
また、脾臓細胞にＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を含んでいない空きプラスミドと、ＣＤ２８反応エレメントを含有するＧＦＰレポータ遺伝子を有するプラスミドに形質転換させた後、抗ＣＤ２８および抗ＣＴＬＡ４抗体で染色し、ＧＦＰ陽性細胞を柔細胞分類器を用いて分析した結果、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラの発現レベルは内生のＣＴＬＡ４の発現レベルよりも高いことを確認した（図１２参照）。
さらに、上述した形質転換された脾臓Ｔ細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および抗ＣＴＬＡ４抗体で刺激したときに、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８の過発現は抗ＣＴＬＡ４抗体のIＦＮ−γ抑制能を低減することを確認した（図１３参照）。
この点から明らかなように、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質は、リガンドがＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに結合する場合に阻害信号を伝達しないだけではなく、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラタンパク質のＣＤ２８の細胞内ドメインによる活性化信号を細胞内に伝達することにより、Ｔ細胞活性化が顕著に増大されることが確認された。
＜実験例２＞ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＣＤ８ Ｔ細胞の抗がん能力
腫瘍抗原に特異的なＴ細胞のＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子の発現によって、Ｔ細胞の抗腫瘍活性が強化されるか否かを確認するために、Ｐｍｅｌ−１と呼ばれる黒色腫抗原特異的なＴＣＲ形質転換マウスから由来したＣＤ８ Ｔ細胞（Ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞）をＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を含むレトロウィルスを用いて形質転換させた。Ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞は、同系Ｂ１６黒色腫細胞の表面に発現される腫瘍抗原であるｇｐ１００を特異的に認識する。
その結果、形質転換されたＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞はコントロールに比べて高いIＦＮ−γ分泌能を示すことが分かるが（図４（ａ）参照）、Ｂ１６細胞へのiｎ−ｖiｔｒｏ上における細胞溶解活性はあまり向上されていないことが分かる（図４（ｂ）参照）。また、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞は、リンパ球枯渇されたＢ１６腫瘍含有マウスに移入した場合、高容量のIＬ−２と併用処理した場合にも抗腫瘍効果の大幅な向上は示さないことを確認することができた（図４（ｃ）参照）。結論的に、実験例１とは異なり、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞はその機能面において大幅な向上は示さなかった。
＜実験例３＞ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を用いた形質転換による抗原特異的なＴ細胞の抗原反応性の変化
実験例１と実験例２の違いは、実験例１の場合には正常マウスから分離されたＴ細胞はＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞が混合されたものであるのに対し、Ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞はＣＤ８ Ｔ細胞のみが存在するという点である。このため、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子の形質転換によってＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の腫瘍抗原特異的な反応が互いに異なるように調節されるか否かを確認する必要がある。
同じ抗原に対するＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の反応を確認するために、オボアルブミン（ＯＶＡ）を特異的に認識するＴＣＲをＴ細胞においてのみ発現するように製作された抗ＯＶＡ ＴＣＲ形質転換マウスに取り込んだ。特に、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の反応を分けて観察するために、ＣＤ４抗ＯＶＡ ＴＣＲ形質転換マウス（ＯＴ−II）およびＣＤ８抗ＯＶＡ ＴＣＲ形質転換マウス（ＯＴ−I）からそれぞれＯＶＡ特異的ＣＤ４およびＣＤ８細胞を分離してＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を用いて形質転換させた後、ＯＶＡ抗原によるＴ細胞活性化をIＬ２およびIＦＮ−γの分泌能を通じて確認した。
ＯＴ−IおよびＯＴ−II Ｔ細胞（ＯＴ−IおよびＯＴ−II由来のＴ細胞）をＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を含むレトロウィルスに形質転換させた後、サイトカインの産生能力を測定するために抗原提示細胞（ａｎｔiｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔiｎｇ ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）の存在下でＯＶＡで刺激した。本発明において、ＯＴ−I ＣＴＣ２８またはＯＴ−II ＣＴＣ２８は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子によって形質転換されたＯＴ−I Ｔ細胞またはＯＴ−II Ｔ細胞を意味する。
その結果、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を用いた形質転換によってＯＴ−I（図５（ｄ）参照）およびＯＴ−II Ｔ細胞（図５（ｂ）参照）が両方ともIＦＮ−γの産生能力が向上されたことを確認することができた。
また、IＬ−２の産生能力は、ＯＴ−II Ｔ細胞の場合にはコントロールと比較して約１０〜２０倍大幅に増大されたが（図５（ａ）参照）、ＯＴ−I Ｔ細胞の場合には僅かな上昇のみが確認された（図５（ｃ）参照）。すなわち、ＣＤ４ Ｔ細胞反応は、特にIＬ−２の産生能力の側面からみて、ＣＤ８ Ｔ細胞に比べてＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を用いた形質転換による影響が多大であることが確認された。
＜実験例４＞ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞への同時形質転換によるＴ細胞の抗腫瘍効果
ＣＤ４ Ｔ細胞がＣＤ８ Ｔ細胞の抗腫瘍効果に必要であるということはよく知られている。このため、腫瘍抗原に対する強化されたＣＤ４の反応は、腫瘍抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を倍加させることができるものと認められる。
本発明者らは、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子によって形質転換されたＣＤ４ Ｔ細胞がＣＤ８ Ｔ細胞の抗がん効能を増大させることができるか否かについて、実験例３によるＯＴ−IおよびＯＴ−II Ｔ細胞を用いて試験した。このために、ＯＶＡをモデル腫瘍抗原として、ＯＶＡ ｃＤＮＡに形質転換された同系ＥＬ４リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７）を腫瘍モデルとして選定した（図６参照）。
ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子によって形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞をＥ．Ｇ７を含むマウスに移入した結果、これといった腫瘍治療効果を示さないことを確認することができた（図７参照）。
しかしながら、ＯＴ−I Ｔ細胞と組み合わせる場合に、その効果は変化することを確認することができたが、ＯＴ−I Ｔ細胞単独で用いた場合にも僅かな効果はあることが認められたが、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子によって形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞と併用する場合に抗腫瘍効果が急増されることが分かり、その増大の度合いは、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子によって形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞の濃度に比例することが分かる（図８（ａ）〜図８（ｃ）、図１４参照）。
特に、ＯＴ−I Ｔ細胞と形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞が２：２の割合で用いられた場合には、１５日経過後に腫瘍が完全に消えることが分かり、ＯＴ−I Ｔ細胞と形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞が２：１の割合で用いられた場合には、１５日経過後に腫瘍がほとんど消えたが、再び腫瘍の体積がやや増大されることが確認された。
前記実験において、腫瘍の大きさはグループごとに少なくとも５匹のマウスの腫瘍の大きさの平均を記録しており（＊：ｐ＝０．０３９１、＊＊：ｐ＝０．００７８、＊＊＊：ｐ＝０．００７８、ウィルコクソンの符号付き順位検定）、図７および図８に示す結果は、少なくとも２つの独立した実験結果を示す。
ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を用いた形質転換がＣＤ４ Ｔ細胞よりはあまり効果的ではないとはいえ、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原反応性もまた増大させることを前記実験例を通じて確認することができたため、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を同時にＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を用いて形質転換させることにより抗腫瘍効果を極大化させることができるか否かを確認するために、ＯＴ−II Ｔ細胞とＯＴ−I Ｔ細胞の両方をＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子を用いて形質転換させた後、Ｅ．Ｇ７腫瘍を有するマウス（図６参照）に注射した。このとき、ＯＴ−IIにのみ形質転換させた場合に比べて、遥かに強力な抗腫瘍効果を示すことを確認することができた（図９参照）。
前記実験において、腫瘍の大きさはグループごとに少なくとも５匹のマウスの腫瘍の大きさの平均を記録しており（＊：ｐ＝０．００２９、ウィルコクソンの符号付き順位検定）、図９に示す結果は、少なくとも３つの独立した実験結果を示す。
Ｅ．Ｇ７腫瘍を有するマウスにおいて遺伝子形質転換されたＴ細胞の活性を実験するために、遺伝子形質転換されたＯＴ−IおよびＯＴ−II Ｔ細胞を注入したマウスから脾臓細胞を分離し、オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドをもって生体外において前記Ｔ細胞を刺激した。細胞内サイトカイン染色によって分析したときに、遺伝子形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞は対照群ＯＴ−II Ｔ細胞よりもIＬ−２およびIＦＮ−γの産生能力が遥かに高い割合を示した（図１５（ａ）参照）。さらに、遺伝子形質転換されたＯＴ−II Ｔ細胞の総数は、対照群であるＯＴ−II Ｔ細胞と比べて増大された（図１５（ｂ）参照）。ＯＴ−I Ｔ細胞の場合、脾臓において形質転換されたＯＴ−I Ｔ細胞の割合は、細胞内サイトカインの染色分析に必要な値（０．１％以上）よりも遥かに低かった。その結果、本発明では、全体のＣＤ８ Ｔ細胞を分離した後、同数の遺伝子形質転換されたＯＴ−Iおよび空きベクターに形質転換されたＯＴ−I Ｔ細胞を試験管内（iｎ ｖiｔｒｏ）においてオボアルブミンペプチドおよび抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）とともに培養して刺激した。そして、本発明では、ＥＬIＳＡによってIＦＮ−γの分泌を測定した。さらに、遺伝子形質転換されたＯＴ−I Ｔ細胞は、空きベクターに形質転換されたＯＴ−I Ｔ細胞よりも多量のIＦＮ−γを産生した（図１５（ｃ）参照）。このため、遺伝子形質転換されたＯＴ−IおよびＯＴ−II Ｔ細胞は、腫瘍を有するマウスに投与された後にもその増大された活性を維持することが分かる。
＜実験例５＞黒色腫モデルにおけるＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換された腫瘍抗原特異的なＴ細胞の抗腫瘍効果
実験例４におけるモデルは、ＯＶＡという人為的な腫瘍抗原に対して抗腫瘍効果を試験したものであるため、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を用いて実際に腫瘍抗原を含有するモデルにおける抗腫瘍効果を試験することが必要である。
Ｂ１６黒色腫は好適なモデル腫瘍の一つであるが、これは、Ｐｍｅｌ−１ＣＤ８ Ｔ細胞が特異的に認識し得る内生のｇｐ１００抗原を有しているためである。
しかしながら、Ｂ１６腫瘍は良好ではない免疫原性を有しており、Ｔ細胞免疫療法に抵抗性を有していることが知られており、本発明におけるＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞を用いた場合にも抗腫瘍効果の向上は顕著ではなかったが（実験例２参照）、多クローンＣＤ４ Ｔ細胞の添加を通じてＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞を用いたＴ細胞免疫療法が効果があるかもしれないという報告がある。
本実験においては、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞とＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換された多クローンＣＤ４ Ｔ細胞を併用する場合に抗腫瘍効果が増大されるか否かについて試験した。
Ｂ６マウスにＢ１６黒色腫細胞を皮下注射してから７日後に、５Ｇｙの全身放射線照射を通じてリンパ球枯渇過程を経た後、形質転換マウスから分離した黒色腫特異的なＣＤ８ Ｔ細胞であるＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞を静脈注射し、腫瘍の体積減少の度合いを観察した。
さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞との併合治療のために、Ｂ６マウスから分離した多クローンＣＤ４ Ｔ細胞（制御性Ｔ細胞が除去されたＣＤ４＋ＣＤ２５−集団）をＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換させて、Ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞と並行治療に用いた。
その結果、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞の両方をＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換させ、Ｂ１６腫瘍を含有するＢ６マウスに静脈注射する場合、形質転換されていないＣＤ４ Ｔ細胞およびＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞を用いる場合に比べて遥かに強力な抗腫瘍効果を示すということを、腫瘍の大きさおよび生存率の測定を通じて確認した（図１０（ａ）および図１０（ｂ）参照）。また、このような抗腫瘍効果は、抹消血液内のＣＤ４ Ｔ細胞およびＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞の割合および絶対数の増大と密接に関連していることを確認した（図１６（ａ）〜（ｄ）参照）。ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラのＴ細胞増殖の増大効果は、ＣＤ４ Ｔ細胞の方において、ＣＤ８ Ｔ細胞よりも顕著であった（８．６倍ｖｓ３．７倍；図１６（ｃ）〜（ｄ）参照）。本発明において、ＣＤ４ Ｔ細胞単独の遺伝子形質転換が、Ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞の抗がん効果を増大させることができるか否かを点検した。期待の通り、遺伝子形質転換されたＣＤ４ Ｔ細胞は腫瘍の増殖を大幅に抑えた。Ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞のさらなる遺伝子形質転換は腫瘍の成長をさらに抑えた（図１７参照）。このため、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方を形質転換した方が、抗腫瘍効果を極大化させることができるということが分かる。最後に、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８形質転換がＣＤ４ Ｔ細胞においてIＬ−２の分泌を有意的に増大させたため（図５（ａ）参照）、本発明は、生体内において遺伝子形質転換されたＴ細胞の治療効果にIＬ−２が必要であるかについて疑問を抱いた。予想の通りに、生体内の抗IＬ−２中和抗体処理によって、遺伝子形質転換の治療効果がほとんど無くなることが確認された（図１８参照）。結論として、これらの結果は、既に大きく成長しており、しかも、免疫原性が弱い腫瘍を、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８遺伝子形質転換されたＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を用いた選択的な細胞治療によって効果的に抑えることができ、この治療効果にIＬ−２が大きく寄与することを示している。
本発明において、Ｐｍｅｌ−１ ＥＶは、形質転換されていないＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞を意味し、ＣＤ４ ＥＶは、形質転換されていないＣＤ４を意味し、Ｐｍｅｌ−１ ＣＴＣ２８は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＰｍｅｌ−１ Ｔ細胞を意味し、ＣＤ４ ＣＴＣ２８は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子に形質転換されたＣＤ４ Ｔ細胞を意味する。
結論として、ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８キメラ遺伝子によって形質転換されたＴ細胞を用いたＴ細胞免疫療法は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の併合療法において抗腫瘍効果の大きな増大をもたらし、これは、ＣＴＬＡ４受容体を通じたＴ細胞免疫寛容を回避することにより、抗がんＴ細胞免疫療法の効能が大幅に増大可能であることを立証している。

Claims (13)

  1. 配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸配列を有する融合タンパク質を含む癌治療のための免疫寛容を抑制する遺伝子組み換えＴ細胞であり、
    前記融合タンパク質は、細胞内信号伝達ドメインを除去したＴ細胞表面免疫寛容誘導受容体である細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４：Ｃｙｔｏｔｏｘiｃ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ａｓｓｏｃiａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅiｎ ４またはＴ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔiｇｅｎ ４）と、Ｔ細胞活性化表面タンパク質ＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインとを含み、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＴＬＡ４またはＣＤ２８の膜貫通ドメインによってＣＴＬＡ４に融合されることを特徴とするＴ細胞。
  2. ＣＴＬＡ４は、配列番号１のヒト由来のアミノ酸配列または配列番号２のマウス由来のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞。
  3. ＣＤ２８は、配列番号３のヒト由来のアミノ酸配列または配列番号４のマウス由来のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞。
  4. 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列において、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは１〜１６１番目までのアミノ酸配列であり、ＣＴＬＡ４の細胞膜ドメインは１６２〜１８９番目までのアミノ酸配列であり、ＣＴＬＡ４の細胞内信号伝達ドメインは１９０〜２２３番目までのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載のＴ細胞。
  5. ＣＤ２８の細胞外ドメインは、配列番号３の１〜１５２番目までのアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号４の１〜１５０番目までのアミノ酸配列であり、ＣＤ２８の細胞膜ドメインは、配列番号３の１５３〜１７８番目までのアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号４の１５１〜１７６番目までのアミノ酸配列であり、ＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインは、配列番号３の１７９〜２２０番目までのアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号４の１７７〜２１８番目までのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のＴ細胞。
  6. 配列番号５のアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列を有する前記融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、ＣＴＬＡ４の膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインを含むことを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞。
  7. 配列番号７のアミノ酸配列を有する前記融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、ＣＤ２８の細胞膜ドメイン、及びＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインを含むことを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞。
  8. 前記Ｔ細胞は、がん抗原に特異的なＴ細胞であることを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞。
  9. 前記がん抗原に特異的なＴ細胞は、がん抗原に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞、がん抗原に特異的なＣＤ８ Ｔ細胞、またはがん抗原に特異的なＣＤ４ Ｔ細胞およびがん抗原に特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の組み合わせであることを特徴とする請求項８に記載の形質転換されたＴ細胞。
  10. 前記がん抗原に特異的なＴ細胞は、患者のがん組織から分離したＴ細胞、がん抗原特異的に認知する受容体遺伝子に形質転換されたＴ細胞およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子に形質転換されたＴ細胞よりなる群から選ばれるいずれか一種であることを特徴とする請求項８に記載のＴ細胞。
  11. がん抗原は、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、葉酸受容体、IＬ−１３Ｒα２、Ｌｅｗiｓ−Ｙ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＭＡＧＥおよびＷＴ−１よりなる群から選ばれるいずれか一種であることを特徴とする請求項８に記載のＴ細胞。
  12. 請求項１から請求項１１のうちのいずれか１項に記載のＴ細胞を含むがん治療用薬学的組成物。
  13. 請求項１に記載のＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、ＣＴＬＡ４の膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインよりなる融合タンパク質を含むＴ細胞の製造方法であって、
    （a）ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインとＣＴＬＡ４の膜貫通ドメインをコードする配列番号９の配列を有するヌクレオチド、及びＣＤ２８の細胞内信号伝達ドメインをコードする配列番号１０の配列を有するヌクレオチドを結合させることにより、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを製造する工程と、
    （b）前記ポリヌクレオチドを含むウイルスまたは非ウイルス性担体を構成する工程と、
    （c）前記ウイルスまたは非ウイルス性担体を用いてがん抗原に特異的なＴ細胞を形質転換させるステップを含むＴ細胞の製造方法。
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