CN110520530A - 肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于治疗胃肠癌的遗传修饰组合物，例如非病毒载体和肿瘤浸润性淋巴细胞。公开了利用CRISPR系统产生遗传修饰组合物的方法。还公开了制备和使用用于治疗胃肠癌的遗传修饰组合物的方法。

Description

肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法
交叉引用
本申请要求于2016年10月18日提交的美国临时专利申请号62/409,651和于2017年1月30日提交的美国临时专利申请号62/452,244的权益，所述临时申请中的每一个均通过引用整体并入本文用于所有目的。
背景技术
肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的过继转移在介导转移性黑素瘤的持久消退方面取得了相当大的成功。尽管取得了这些成功，但TIL疗法在其他实体肿瘤环境中的应用仍具有挑战性。这可能是由于肿瘤微环境所发挥的抑制作用和在受体信号传导和效应子功能获得方面的T细胞内在损伤。靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)功能的基于单克隆抗体的免疫检查点抑制剂有时可以减轻T细胞的外在抑制作用，但具有由于它们对非肿瘤反应性T细胞的全身活性而导致的可能致命的自身免疫副作用风险。近来，在用于体内识别肿瘤上的分子靶标的淋巴细胞基因工程方面取得了显著进步，从而导致了靶向肿瘤缓解的显著病例。然而，这些成功在很大程度上局限于血液肿瘤，并且针对实体瘤的更广泛应用受限于缺乏由特定肿瘤中的细胞表达的可鉴别分子以及缺乏可用于特异性结合肿瘤靶标以便介导肿瘤破坏的分子。一些近期进展关注对在一些情况下触发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤特异性突变的鉴别。例如，可使用全外显子组测序方法来鉴别这些内源性突变。Tran E等人,“Cancer immunotherapy based on mutation-specificCD4+T cells in a patient with epithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。
发明内容
本文公开了一种治疗方法，其包括：向有需要的受试者施用预备方案，所述预备方案包括以足以降低所述受试者的免疫应答的量向所述受试者施用至少一种免疫抑制剂；包含足以抑制所述受试者的真菌感染的量的抗真菌剂的药物组合物；以及包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。在一些情况下，方法可以进一步包括施用抗生素。
本文公开了一种治疗方法，其包括：向有需要的受试者施用预备方案，所述预备方案包括以足以抑制所述受试者的免疫应答的量向所述受试者施用至少一种免疫抑制剂；包含足以抑制所述受试者的细菌感染的量的抗生素的药物组合物；以及包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。在一些情况下，方法可以进一步包括施用抗真菌剂。
本文公开了一种治疗方法，其包括：向有需要的受试者施用：包含足以降低所述受试者的免疫应答的量的环磷酰胺和氟达拉滨的药物组合物；包含足以抑制所述受试者的真菌感染的量的氟康唑的药物组合物；以及包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。在一些情况下，方法可以进一步包括施用包含足以抑制受试者的细菌感染的量的三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲噁唑的药物组合物。
本文公开了一种治疗方法，其包括：向有需要的受试者施用包含足以降低所述受试者的免疫应答的量的环磷酰胺和氟达拉滨的药物组合物；包含足以抑制所述受试者的细菌感染的量的三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲噁唑的药物组合物；以及包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。在一些情况下，方法可以进一步包括施用包含足以抑制受试者的真菌感染的量的氟康唑的药物组合物。
本文公开了一种用于治疗癌症的方法，其包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的离体工程化肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中所述离体工程化TIL包含：细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因中的破坏，所述破坏导致所述体外工程化TIL中CISH蛋白质功能的抑制，其中所述破坏位于由SEQ ID NO:68的指导多核酸所结合的序列处。在一些情况下，预备方案包括在施用TIL之前约14天至约24小时施用免疫抑制剂。在一些情况下，预备方案包括在施用TIL之前约10天至约24小时施用免疫抑制剂。预备方案可以包括在施用TIL之前约7天至约24小时施用免疫抑制剂。在一些情况下，免疫抑制剂包括放射治疗剂、生物剂或化学剂。免疫抑制剂可以包括化学剂。化学剂可以包括以下的至少一种：环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、噻替哌、六甲三聚氰胺、白消安、氟达拉滨、亚硝基脲、铂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素。化学剂可包括环磷酰胺。化学剂可为氟达拉滨。可以施用约40mg/kg受试者至约50mg/kg受试者的环磷酰胺。环磷酰胺可以经至少约2天至约5天施用至受试者。在一些情况下，可以施用约10mg/kg受试者至约15mg/kg受试者的环磷酰胺。在一些情况下，环磷酰胺可以经至少约7天至约10天施用至受试者。在一些情况下，可以施用约3mg/kg受试者至约5mg/kg受试者的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用约50mg/kg受试者至约80mg/kg受试者的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用超过50mg/kg的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用约60mg/kg的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用约20mg/m2受试者体表面积至约30mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨。在一些情况下，可以施用约25mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨。在一些情况下，预备方案包括部分或完全的免疫抑制。抗真菌剂可选自：多烯、唑、烯丙基胺和棘白菌素。抗真菌剂可为唑。唑可选自：联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、艾氟康唑(efinaconazole)、氟环唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑。作为唑的抗真菌剂可为氟康唑。在一些情况下，可以施用约100mg至约800mg的氟康唑。可以施用400mg的氟康唑。抗真菌剂可以与TIL同时或顺序施用。可以在TIL之后约第0天至约第4天施用抗真菌剂。在一些情况下，抗生素包括以下的至少一种：细菌壁靶向剂、细胞膜靶向剂、细菌酶干扰剂、杀菌剂、蛋白质合成抑制剂或抑菌剂。在一些情况下，抗生素包括杀菌剂。杀菌剂可为头孢菌素或喹诺酮。在一些情况下，抗生素包括抑菌剂。抑菌剂可以预防性施用。在一些情况下，抑菌剂可为三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒。可以施用约100mg至约1000mg的三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒。在一些情况下，可以施用160mg的三甲氧苄二氨嘧啶。在一些情况下，可以施用800mg的磺胺甲噁唑。在一些情况下，可以施用300mg的戊烷脒。抑菌剂可以在TIL之前、与TIL同时或在TIL之后施用。抑菌剂可以在施用TIL之前约14天至施用TIL之后约6个月施用。在一些情况下，抑菌剂可以在所述TIL之前约8天至TIL之后至少4天施用。
在一些情况下，施用包括静脉内、口服、肌内、腹膜内或胸膜内施用。在一些情况下，免疫抑制剂可通过输注施用。在一些情况下，环磷酰胺可以为约60mg/kg的剂量，并稀释在250ml 5％葡萄糖水溶液中且经1小时输注。在一些情况下，氟达拉滨可以为在100ml0.9％氯化钠(USP)中25mg/m2的剂量，并经约15至约30分钟输注。方法可以进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包含足以激活受试者中的TIL的量的免疫刺激剂。免疫刺激剂可包括以下的至少一种：疫苗、集落刺激剂、干扰素、白介素、病毒、抗原、共刺激剂、免疫原性剂、免疫调节剂或免疫治疗剂。免疫刺激剂可包括白介素。白介素可为阿地白介素，并且可以以约550,000至约800,000IU/kg的剂量施用。在一些情况下，阿地白介素可以以约720,000IU/kg的剂量施用。在一些情况下，方法可以进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包含足以预防受试者感染的量的感染预防剂。在一些情况下，感染预防剂可为疱疹病毒预防剂。在一些情况下，受试者可为HSV阳性。在一些情况下，疱疹病毒预防剂可为伐昔洛韦或阿昔洛韦。在一些情况下，可以通过选自CRISPR、锌指、TALEN及其任何组合的系统来诱导破坏。系统可为CRISPR系统。CRISPR系统可包括选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3和Cas9HiFi的内切核酸酶。内切核酸酶可为Cas9。在一些情况下，内切核酸酶执行破坏。破坏可包括基因的外显子或内含子。破坏可在基因的外显子中。破坏可在前间区序列邻近基序(PAM)的约20个碱基对内。破坏可在前间区序列邻近基序(PAM)的约10个碱基对内。破坏可在前间区序列邻近基序(PAM)的约5个碱基对内。破坏可距离前间区序列邻近基序(PAM)3个碱基对。在一些情况下，破坏在SEQ ID NO:13的外显子或内含子中。破坏可在SEQ ID NO:13的外显子中。在一些情况下，CRISPR系统包括指导多核酸。指导多核酸可与SEQ ID NO:68具有至少约60％的同源性。在一些情况下，破坏包括双链断裂。双链断裂可发生在SEQ ID NO:71或SEQID NO:77处。在一些情况下，TIL可以以约1x 109个细胞、3x 109个细胞、1x 1010个细胞、3x1010个细胞至约1x 1011个细胞的剂量施用。在一些情况下，TIL可经约30分钟施用。在一些情况下，TIL可静脉内施用。静脉内施用可包括输注。
在一些情况下，方法可以进一步包括对TIL进行输注前测试。输注前测试可以包括以下的至少一种：表型测试、效力测试、微生物学测试、内毒素测试、活力测试和肿瘤细胞测试。在一些情况下，表型测试包括检测TIL上的CD3的存在。在一些情况下，效力测试包括在对TIL进行抗CD3刺激后检测IFNγ水平。在一些情况下，微生物学测试包括检测需氧培养物、厌氧培养物的生长、革兰状态、真菌状态或支原体状态。内毒素测试可以包括进行鲎测定。在一些情况下，活力测试包括进行台盼蓝排除测定。在一些情况下，肿瘤细胞测试包括细胞病理学测定。在一些情况下，当输注前测试中的微生物学测试可为阴性时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试中的所述活力测试存在超过至少约70％的活细胞时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试中的表型测试存在至少约80％的CD3阳性时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试在效力测试中对TIL进行抗CD3刺激后的IFNγ为至少约200pg/mL/105个细胞时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中的肿瘤细胞为阴性时，可以施用TIL。
本文公开了一种治疗产品，其包含具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏；以及抗真菌剂的剂型。
本文公开了一种治疗产品，其包含足以抑制受试者的真菌感染的量的叶酸合成抑制剂或核酸交联剂的剂型；以及具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
本文公开了一种治疗产品，其包含选自多烯、唑、烯丙基胺或棘白菌素的抗真菌剂的剂型；以及具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
本文公开了一种治疗产品，其包含具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏，其中所述TIL以约7.0x 107个细胞/mL至约2.0x 108个细胞/mL的冷冻密度冷冻保存。
本文公开了一种治疗产品，其包含：抗真菌剂的剂型；免疫抑制剂的剂型；抗生素的剂型；以及具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。在一些情况下，治疗产品可以进一步包含免疫抑制剂的剂型。免疫抑制剂可以被配制用于在施用TIL之前约14天至约24小时向受试者施用。在一些情况下，免疫抑制剂可以被配制用于在施用TIL之前约10天至约24小时向受试者施用。在一些情况下，免疫抑制剂可以被配制用于在施用TIL之前约7天至约24小时向受试者施用。在一些情况下，免疫抑制剂包括放射治疗剂、生物剂或化学剂。在一些情况下，免疫抑制剂包括化学剂。在一些情况下，化学剂包括以下的至少一种：环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、噻替哌、六甲三聚氰胺、白消安、氟达拉滨、亚硝基脲、铂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素。在一些情况下，化学剂包括环磷酰胺。在一些情况下，化学剂包括氟达拉滨。在一些情况下，可以施用约40mg/kg受试者至约50mg/kg受试者的环磷酰胺。在一些情况下，环磷酰胺可以经至少约2天至约5天施用至受试者。在一些情况下，可以施用约10mg/kg受试者至约15mg/kg受试者的环磷酰胺。在一些情况下，环磷酰胺可以经至少约7天至约10天施用至受试者。在一些情况下，可以施用约3mg/kg受试者至约5mg/kg受试者的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用约50mg/kg受试者至约80mg/kg受试者的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用超过50mg/kg的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用约60mg/kg的环磷酰胺。在一些情况下，可以施用约20mg/m2受试者体表面积至约30mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨。在一些情况下，可以施用约25mg/m2受试者体表面积的氟达拉滨。在一些情况下，免疫抑制剂产生部分或完全的免疫抑制。在一些情况下，抗真菌剂的剂型可选自：多烯、唑、烯丙基胺和棘白菌素。在一些情况下，抗真菌剂可为唑。唑可选自：联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟环唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑。在一些情况下，唑可为氟康唑。在一些情况下，氟康唑可以以约100mg至约800mg的量存在。在一些情况下，氟康唑可以以400mg的量存在。在一些情况下，抗真菌剂的剂型可以与TIL同时或顺序施用。可以在TIL之后约第0天至约第4天施用抗真菌剂的剂型。在一些情况下，治疗产品可以进一步包含抗生素的剂型。抗生素可以包括以下的至少一种：细菌壁靶向剂、细胞膜靶向剂、细菌酶干扰剂、杀菌剂、蛋白质合成抑制剂和抑菌剂。在一些情况下，抗生素包括杀菌剂。杀菌剂可为头孢菌素或喹诺酮。在一些情况下，抗生素的剂型可为抑菌剂。抑菌剂可以被配制用于预防性施用。在一些情况下，抑菌剂可为三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒。在一些情况下，三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒可以以约100mg至约1000mg的量存在。在一些情况下，三甲氧苄二氨嘧啶可以以160mg的量存在。在一些情况下，磺胺甲噁唑可以以800mg的量存在。在一些情况下，戊烷脒可以以300mg的量存在。在一些情况下，抑菌剂可以在TIL之前、与TIL同时或在TIL之后施用。在一些情况下，抑菌剂可以在所述TIL的所述施用之前约14天至所述TIL的所述施用之后约6个月施用。在一些情况下，抑菌剂可以在所述TIL之前约8天至所述TIL之后至少4天施用。治疗产品可以进一步包括施用剂型。
治疗产品可以被配制成通过静脉内、口服、肌内、腹膜内或胸膜内施用来施用。在一些情况下，免疫抑制剂的剂型可被配制成通过输注施用。在一些情况下，环磷酰胺可以以约60mg/kg的剂量施用，并稀释在250ml 5％葡萄糖水溶液中且经1小时输注。在一些情况下，氟达拉滨可以以在100ml 0.9％氯化钠(USP)中25mg/m2的剂量施用，并经约15至约30分钟输注。在一些情况下，免疫刺激剂可以以足以激活受试者中的TIL的量存在。免疫刺激剂包括以下的至少一种：疫苗、集落刺激剂、干扰素、白介素、病毒、抗原、共刺激剂、免疫原性剂、免疫调节剂和免疫治疗剂。在一些情况下，免疫刺激剂的剂型包括白介素。白介素可为阿地白介素，并且可以以约550,000至约800,000IU/kg的剂量施用。在一些情况下，阿地白介素可以以约720,000IU/kg的剂量施用。在一些情况下，治疗产品可以进一步包括足以预防受试者感染的量的感染预防剂的剂型。感染预防剂可为疱疹病毒预防剂。疱疹病毒预防剂可以以对治疗HSV阳性受试者有效的量存在。在一些情况下，疱疹病毒预防剂可为伐昔洛韦或阿昔洛韦。在一些情况下，可以通过选自CRISPR、锌指、TALEN及其任何组合的系统来诱导破坏。系统可为CRISPR系统。CRISPR系统可包括选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3和Cas9HiFi的内切核酸酶。在一些情况下，内切核酸酶可为Cas9。内切核酸酶可以执行破坏。破坏可包括基因的外显子或内含子。在一些情况下，破坏可在基因的外显子中。在一些情况下，破坏可在前间区序列邻近基序(PAM)的约20个碱基对内。在一些情况下，破坏可在前间区序列邻近基序(PAM)的约10个碱基对内。在一些情况下，破坏可在前间区序列邻近基序(PAM)的约5个碱基对内。在一些情况下，破坏可距离前间区序列邻近基序(PAM)3个碱基对。在一些情况下，破坏可在SEQ ID NO:13的外显子或内含子中。在一些情况下，破坏可在SEQ ID NO:13的外显子中。在一些情况下，CRISPR系统包括指导多核酸。指导多核酸可与SEQ ID NO:68具有至少约60％的同源性。破坏可包括双链断裂。在一些情况下，双链断裂发生在SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:77处。在一些情况下，TIL可以以约1x 109个细胞、3x 109个细胞、1x 1010个细胞、3x 1010个细胞至约1x 1011个细胞的量存在。在一些情况下，TIL可经约30分钟施用。在一些情况下，TIL可静脉内施用。静脉内施用可包括输注。在一些情况下，治疗产品可以进一步包括对TIL进行输注前测试。在一些情况下，输注前测试包括以下的至少一种：表型测试、效力测试、微生物学测试、内毒素测试、活力测试和肿瘤细胞测试。在一些情况下，表型测试包括检测所述TIL上的CD3的存在。在一些情况下，效力测试包括在对TIL进行抗CD3刺激后检测IFNγ水平。在一些情况下，微生物学测试包括检测需氧培养物、厌氧培养物的生长、革兰状态、真菌状态或支原体状态。在一些情况下，内毒素测试包括进行鲎测定。在一些情况下，活力测试包括进行台盼蓝排除测定。在一些情况下，肿瘤细胞测试包括细胞病理学测定。在一些情况下，当输注前测试中的所述微生物学测试为阴性时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试中的活力测试具有超过至少约70％的活细胞时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试中的表型测试存在至少约80％的CD3阳性时，可以施用TIL。当输注前测试在效力测试中对TIL进行抗CD3刺激后的IFNγ为至少约200pg/mL/105个细胞时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中的肿瘤细胞为阴性时，可以施用TIL。
本文公开了核酸组合物，所述核酸组合物与SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:69中的任一个具有至少60％的序列同源性。在一些情况下，序列同源性可为至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或高达约100％。
本文公开了治疗诸如癌症等病况的方法，其包括从肿瘤样品获得肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，鉴别突变反应性TIL，以及用CRISPR核酸酶破坏内源基因或其部分。在一些情况下，肿瘤样品可以进行测序分析。在一些情况下，测序分析鉴别肿瘤样品中的突变而不鉴别非肿瘤样品中的突变。在一些情况下，测序分析可以包括全外显子组测序、转录组测序或其组合。测序分析可为全外显子组测序。
在一些情况下，鉴别可以包括将TIL引入表达包含突变的肽的抗原呈递细胞(APC)。在一些情况下，鉴别可以进一步包括检测由被引入到表达包含突变的肽的APC的TIL所分泌的干扰素γ(IFNγ)的存在。肽可以具有约15聚体至约30聚体的长度。肽可以具有25聚体的长度。在一些情况下，鉴别可以包括将TIL引入采用包含突变的多核酸进行电穿孔的抗原呈递细胞(APC)。
在一些情况下，鉴别可以进一步包括检测由被引入到APC的TIL所分泌的干扰素γ(IFNγ)的存在。破坏可以包括TIL的基因组中的双链断裂。双链断裂可以通过CRISPR核酸酶进行。在一些情况下，CRISPR核酸酶可选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3和Cas9HiFi。CRISPR核酸酶可为Cas9。
在一些情况下，方法可以进一步包括扩增TIL。TIL可为人TIL。方法可以进一步包括向受试者施用抗真菌剂。方法可以进一步包括向受试者施用抗生素。
本文公开了治疗有需要的受试者的胃肠癌的方法，其包括从有需要的受试者的胃肠肿瘤样品获得肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，鉴别突变反应性TIL，用CRISPR核酸酶破坏所述突变反应性TIL中的CISH基因，以及将所述TIL扩增至1x109至约2x 1011的剂量；其中对所述胃肠肿瘤样品进行外显子组测序以鉴别存在于所述肿瘤样品中而不存在于健康组织样品中的突变，并且其中所述鉴别包括在抗原呈递细胞(APC)的表面上呈递所述突变并将所述APC与所述TIL一起培养以检测IFN-γ的水平。在一些情况下，呈递可以包括将采用包含突变的多核酸进行电穿孔的抗原呈递细胞(APC)与TIL一起培养。在一些情况下，呈递可以包括将用包含突变的肽脉冲的抗原呈递细胞(APC)与TIL一起培养。细胞因子可以在突变反应性TIL中检测到，而在非突变反应性TIL中检测不到。相比于在非突变反应性TIL中，在突变反应性TIL中可以检测到更高水平的细胞因子。CRISPR核酸酶可为Cas9。TIL可为T细胞。
附图说明
本发明的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本发明的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1显示了四种质粒的结构，包括Cas9核酸酶质粒、HPRT gRNA质粒、AmaxaEGFPmax质粒和HPRT靶载体。
图2示出了通过CRISPR gRNA在潜在靶位点发生的基因修饰百分比。
图3显示了经刺激的T细胞中的CRISPR诱导的DSB。
图4A和图4B示出了在用指导RNA转染后第6天PD-1、CTLA-4，PD-1和CTLA-2，或CCR5、PD-1和CTLA-4的表达。代表性指导物：PD-1(P2、P6、P2/6)，CTLA-4(C2、C3、C2/3)或CCR5(CC2)。A.示出了抑制性受体表达百分比。B.示出了相对于对照指导RNA的归一化抑制性受体表达。
图5A示出了与未染色和无指导物对照相比，采用CRISPR和CTLA-4特异性指导RNA(指导物#2和指导物#3)进行电穿孔后原代人T细胞中的CTLA-4表达。图5B示出了与未染色和无指导物对照相比，采用CRISPR和PD-1特异性指导RNA(指导物#2和指导物#6)进行电穿孔后原代人T细胞中的PD-1表达。
图6示出了在采用CRISPR和多重CTLA-4和PD-1指导RNA进行电穿孔后原代人T细胞中CTLA-4和PD-1表达的FACS结果。
图7A和图7B示出了用CRISPR处理后原代人T细胞中的双敲除百分比。图7A示出了与仅Zap、仅Cas9以及所有指导RNA对照相比，用CTLA-4指导物#2、CTLA-4指导物#3、CTLA-4指导物#2和#3、PD-1指导物#2和CTLA-4指导物#2、PD-1指导物#6和CTLA-4指导物#3处理的T细胞中的CTLA-4敲除百分比。图7B示出了与仅Zap、仅Cas9以及所有指导RNA对照相比，用PD-1指导物#2、PD-1指导物#6、PD-1指导物#2和#6、PD-1指导物#2和CTLA-4指导物#2、PD-1指导物#6和CTLA-4指导物#3处理的T细胞中的PD-1敲除百分比。
图8示出了采用CRISPR和对CTLA-4、PD-1具有特异性的指导RNA或其组合进行电穿孔后的T细胞活力。
图9为CEL-I测定的结果，示出了在仅引入PD-1指导RNA，引入PD-1和CTLA-4指导RNA，或引入CCR5、PD-1和CLTA-4指导RNA，仅Zap或仅gRNA作为对照的条件下，由PD-1指导RNA#2、#6、#2和#6进行的切割。
图10为CEL-I测定的结果，示出了在仅引入CTLA-4指导RNA，引入PD-1和CTLA-4指导RNA，或引入CCR5、PD-1和CLTA-4指导RNA，并在以仅Zap或仅gRNA作为对照的条件下，由CTLA-4指导RNA#2、#3、#2和#3进行的切割。
图11为CEL-I测定的结果，示出了与仅Zap、仅Cas 9或仅指导RNA对照相比，在引入CCR5指导RNA以及CCR5指导RNA、PD-1指导RNA或CTLA-4指导RNA的条件下，由CCR5指导RNA#2进行的切割。
图12示出了如通过CD3FACS表达所测量的，利用5微克和10微克具有2’O-甲基RNA修饰的优化CRISPR指导RNA在原代人T细胞中的TCRα敲除。
图13描绘了在用CRISPR和CTLA-4指导RNA处理后测量T细胞活力和表型的方法。通过对显示正常FSC/SSC谱的经处理细胞的频率(相对于单独电穿孔对照的频率归一化)进行定量来测量表型。还通过FSC/SSC门控群体内的细胞对活力染料的拒染来测量活力。通过CD3和CD62L来测量T细胞表型。
图14示出了在用CRISPR和PD-1指导RNA以及PD-1和CTLA-4指导RNA处理后测量T细胞活力和表型的方法。通过对显示正常FSC/SSC谱的经处理细胞的频率(相对于单独电穿孔对照的频率归一化)进行定量来测量表型。还通过FSC/SSC门控群体内的细胞对活力染料的拒染来测量活力。通过CD3和CD62L来测量T细胞表型。
图15示出了在用原代人T细胞和Jurkat对照的PD-1或CTLA-4指导RNA转染后第4天检测CRISPR基因编辑的T7E1测定的结果。NN为无T7E1核酸酶对照。
图16示出了通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析的结果。示出了PD-1和CTLA-4指导RNA的基因编辑效率百分比。
图17示出了针对单指导转染的通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析的结果。针对用PD-1或CTLA-1指导RNA和CRISPR转染的原代人T细胞示出了具有缺失或插入的序列的百分比。
图18示出了具有双靶向的PD-1序列缺失。
图19示出了具有双靶向的PD-1序列缺失的PCR产物的测序结果。显示样品6和14具有两个gRNA序列的融合物，其间的135bp被切除。
图20示出了CTLA-4的双靶向序列缺失。两个指导RNA序列之间的缺失也存在于双指导靶向CTLA-4(样品9和14)的测序中。T7E1测定通过PCR证实了缺失。
图21A和图21B示出了用抗CTLA-4指导RNA和CRISPR转染后CTLA-4阳性人T细胞的CTLA-4FACS分析。B.示出了用抗CTLA-4指导RNA和CRISPR转染后人T细胞中相对于脉冲对照的CTLA-4敲除效率。
图22描绘了针对CISH、PD-1、CTLA4和AAVS1的修饰的sgRNA。
图23A示出了用抗PD-1CRISPR系统转染后的PD-1表达百分比。图23B示出了与仅Cas9对照相比的PD-1敲除效率百分比。
图24描绘了来自用CRISPR和抗CTLA-4指导RNA转染的CTLA-4染色人T细胞的FACS分析的定量数据。示出了转染后第6天CTLA-4表达百分比和敲除百分比的数据。
图25示出了用CRISPR和抗PD-1指导RNA转染的PD-1染色人T细胞的FACS分析。示出了转染后第14天PD-1表达(抗人CD279PerCP-Cy5.5)的数据。
图26示出了与仅Cas9对照相比，用CRISPR和抗PD-1指导RNA转染的人T细胞的PD-1表达百分比和PD-1敲除百分比。
图27示出了用CRISPR、抗CTLA-4和抗PD-1指导RNA转染的人T细胞的第14天细胞计数和活力。
图28示出了用CRISPR，以及仅抗PD-1指导物#2，抗PD-1指导物#2和#6，或仅抗CTLA-4指导物#3电穿孔后第14天的人T细胞的FACS数据。将工程化T细胞再刺激48小时以评估CTLA-4和PD-1的表达，并与未用指导RNA电穿孔的对照细胞进行比较。
图29示出了用CRISPR，以及抗CTLA-4指导物#2和#3，抗PD-1指导物#2和抗CTLA-4指导物#3，或抗PD-1指导物#2和#6、抗CTLA-4指导物#3和#2电穿孔后第14天的人T细胞的FACS数据。将工程化T细胞再刺激48小时以评估CTLA-4和PD-1的表达，并与未用指导RNA电穿孔的对照细胞进行比较。
图30描绘了针对原代人T细胞中的CISH基因座的CRISPR介导的基因修饰的surveyor测定结果。
图31示出了体细胞突变负荷在各肿瘤类型之间变化。肿瘤特异性新抗原产生和呈现在理论上与突变负荷成正比。
图32示出了可对核酸进行的假尿苷-5’-三磷酸和5-甲基胞苷-5-三磷酸修饰。
图33描绘了用CRISPR和CISH gRNA 1、3、4、5或6转染的293T细胞的密度测定分析的重复实验。
图34A和图34B示出了CISH gRNA 1的重复TIDE分析。
图35A和图35B示出了CISH gRNA 3的重复TIDE分析。
图36A和图36B示出了CISH gRNA 4的重复TIDE分析。
图37A和图37B示出了CISH gRNA 5的重复TIDE分析。
图38A和图38B示出了CISH gRNA 6的重复TIDE分析。
图39示出了显示在原代T细胞中CRISPR敲除后CISH蛋白损失的蛋白质印迹。
图40A和图40B示出了人TIL刺激前后的绝对细胞计数。图40A示出了在RPMI培养基或离体培养基中培养的刺激前后的第一供体细胞计数。图40B示出了在RPMI培养基中培养的刺激前后的第二供体细胞计数。
图41A和图41B示出了用靶向PD-1基因座的CRISPR系统进行电穿孔的人肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或对照细胞的细胞扩增。图41A示出了添加自体饲养细胞时的扩增，或者图41B示出了未添加自体饲养细胞时的扩增。
图42描绘了CISH KO TIL白介素-2扩增的TIL的产生，其通过与固定化的抗CD3和可溶性抗CD28一起温育4天来刺激。在第0天，收集TIL并通过电穿孔递送靶向CISH的CRISPR/Cas9试剂。电穿孔后，在经照射的外周血单核细胞饲养细胞和IL-2存在下，将经修饰的TIL转移至G-Rex烧瓶，用于随后的快速扩增。在第一次细胞计数期间和在第(+)7天继代培养时，收集细胞的较小等分试样以通过测序确定插入/缺失(插入缺失)频率。随后在第(+)14天收获TIL，此时获取样品进行质量控制评估，并随后在输液准备袋(infusion-readybag)中冷冻保存。
图43A、图43B和图43C描绘了CRISPR/Cas9编辑后的CISH基因座的TiDE分析。快速扩增14天后，分离基因组DNA并在PDCD1和CISH内的CRISPR靶区域上进行PCR。使PCR扩增子经受TiDE分析。图示了插入缺失的总频率，以及插入和缺失的分布，该分布基于受试者PV1、PV2和PV3所丢失或获得的插入和缺失的大小(以碱基对计)。
图44描绘了在针对受试者PV1、PV2和PV3的CRISPR/Cas9编辑之后，CISH基因座的TiDE分析的总结。
图45A和图45B示出了CRISPR/Cas9编辑后CISH蛋白表达的损失。电穿孔后14天，再刺激PB T细胞和TIL 48小时来诱导CISH表达，或不对其进行再刺激。对照表示细胞未接受CRISPR/Cas9组分。Cas9+gRNA表示接受Cas9mRNA和设计用于靶向CISH基因座的外显子3的gRNA的细胞。
图46A、图46B和图46C示出了CRISPR编辑后T细胞的生长和活力。图46A示出了电穿孔后第6天的活力。图46B示出了电穿孔后第12天的总细胞数，起始为3x106个细胞。细胞＝无操作；ZAP＝仅电穿孔。图46C示出了在标准组织培养瓶中经11天的TIL的总细胞数，每种条件起始为3x106个细胞。
图47A和图47B示出了CRISPR/Cas9编辑的T细胞和TIL中细胞因子产生的SPICE图。电穿孔后14天，使用平板结合的抗CD3和可溶性抗CD28抗体再刺激T细胞和TIL，并通过细胞内染色和流式细胞术来测定细胞因子产量。
图48A描绘了CRISPR/Cas9编辑后PD-1蛋白表达的损失。电穿孔后14天，再刺激外周血T细胞或TIL 72小时来诱导PD-1表达。PD-1在再刺激的T细胞中表达。图48B示出了再刺激的TIL中的PD-1表达。百分比损失以红色表示。
图49示出了对照和经CISH修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的绝对细胞数。
图50A示出了在第7天在存在IL-2的情况下培养的对照和CISH敲除TIL。图50B示出了在第7天在不存在IL-2的情况下培养的对照和CISH敲除TIL。
图51A示出了PDCD1的脱靶位点。图51B示出了通过GUIDE-Seq鉴别的CISH gRNA。
图52示出了经GUIDE-Seq和GMP PQ制造运行的CISH基因座处的靶向插入缺失的频率(ns,P＝0.93)。
具体实施方式
以下描述和实施例详细阐明了本发明的实施方案。应当理解，本发明不限于本文所述的特定实施方案，并且因此可以变化。本领域技术人员将认识到，本发明存在许多变化和修改，其包含在本发明的范围内。
定义
如本文所用的涉及参考数值及其语法等同项的术语“约”及其语法等同项可包括从该值加上或减去10％的数值范围。例如，“约10”的量包括9至11的量。涉及参考数值的术语“约”还可包括从该值加上或减去10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。
如本文所用的术语“激活(活化)”及其语法等同项可指使细胞从休眠状态转变成活跃状态的过程。该过程可包括对抗原的应答、迁移和/或功能激活状态的表型或遗传改变。例如，术语“激活(活化)”可指T细胞激活的逐步过程。例如，T细胞可能需要至少两个信号，以变得完全激活。第一信号可在TCR被抗原-MHC复合体结合之后发生，而第二信号可通过共刺激分子结合而发生。在体外，抗CD3可模拟第一信号，而抗CD28可模拟第二信号。
如本文所用的术语“邻近(相邻)”及其语法等同项可指正好在参考对象旁边。例如，在核苷酸序列的语境下术语邻近(相邻)可意指其间没有任何核苷酸。例如，多核苷酸A与多核苷酸B相邻(邻近)可意指在A与B之间没有任何核苷酸的AB。
如本文所用的术语“抗原”及其语法等同项可指含有能够被一个或多个受体结合的一个或多个表位的分子。例如，抗原可在被呈递时刺激宿主的免疫系统产生细胞抗原特异性免疫应答，或可产生体液抗体应答。抗原还可具有通过自身或在与另一分子结合存在时引发细胞和/或体液应答的能力。例如，肿瘤细胞抗原可被TCR识别。抗原如新抗原可能与高突变负荷的肿瘤相关，图31。
如本文所用的术语“表位”及其语法等同项可指可以被抗体、B细胞、T细胞或工程化细胞识别的抗原的一部分。例如，表位可以是被TCR识别的癌症表位。抗原内的多个表位也可被识别。表位也可是突变的。
如本文所用的术语“自体”及其语法等同项可指来源于相同的生物体。例如，可将样品(例如，细胞)去除、处理，并在随后的时间返还至相同的受试者(例如，患者)。自体过程不同于同种异体过程，在同种异体过程中，供体和接受者是不同的受试者。
如本文所用的术语“癌症”及其语法等同项可指其独特特性(丧失正常控制)导致不受调节的生长、缺乏分化、局部组织入侵和转移的细胞过度增殖。对于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌、直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和/或尿膀胱癌。如本文所用的，术语“肿瘤”是指，例如，恶性类型或良性类型的细胞或组织的异常生长。
如本文所用的术语“癌症新抗原”或“新抗原”或“新表位”及其语法等同项可指不在正常未突变的宿主基因组中编码的抗原。在一些情况下，“新抗原”可代表由于体细胞突变而产生的致癌病毒蛋白或异常蛋白。例如，新抗原可通过经由病毒蛋白活性的细胞机制破坏而产生。另一实例可以是致癌化合物的暴露，该致癌化合物在一些情况下可导致体细胞突变。这种体细胞突变最终可导致肿瘤/癌症的形成。
如本说明书中所用的术语“细胞毒性”是指细胞的正常状态下非预期或不期望的改变。细胞的正常状态可指在细胞暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件之前呈现或存在的状态。通常，处于正常状态的细胞是处于稳态中的细胞。细胞正常状态的非预期或不期望改变可以以例如细胞死亡(例如，程序性细胞死亡)、复制潜能的降低、细胞完整性如膜完整性的降低、代谢活性的降低、发育能力的降低或本申请中公开的任何细胞毒性作用的形式呈现。
短语“减少细胞毒性”或“降低细胞毒性”是指细胞暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件后，细胞正常状态的非预期或不期望改变的程度或频率的降低。该短语可指降低暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件的单个细胞中的细胞毒性程度，或者指降低当细胞群体暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件时群体中呈现细胞毒性的细胞数目。
如本文所用的术语“工程化”及其语法等同项可指核酸，例如，生物体基因组内的核酸的一个或多个改变。术语“工程化”可指基因的改变、添加和/或缺失。工程化细胞也可指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。
如本文所用的术语“细胞”或“工程化细胞”及其语法等同项可指人或非人动物来源的细胞。
如本文所用的术语“检查点基因”及其语法等同项可指参与抑制过程(例如，反馈环)的任何基因，该基因起到调节免疫应答(例如，减少有害应答的不受控传播的免疫抑制性反馈环)幅度的作用。这些应答可包括有助于分子屏障，该分子屏障防止可能在针对感染的免疫应答和/或维持外周自身耐受性期间出现的附带组织损伤。检查点基因的非限制性实例可包括延伸的CD28受体家族成员及其配体以及参与共抑制途径的基因(例如，CTLA-4和PD-1)。术语“检查点基因”也可指免疫检查点基因。
“CRISPR”、“CRISPR系统”或“CRISPR核酸酶系统”及其语法等同项可包括与DNA以及具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)结合的非编码RNA分子(例如，指导RNA)。参见例如，Sander,J.D.等人,“CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targeting genomes,”Nature Biotechnology,32:347–355(2014)；还参见例如，Hsu,P.D.等人,“Development and applications of CRISPR-Cas9for genomeengineering,”Cell 157(6):1262-1278(2014)。
如本文所用的术语“破坏”及其语法等同项可指例如通过切割、删除、插入、突变、重排或其任意组合而改变基因的过程。破坏可导致蛋白质表达的敲除或敲低。敲除可以是完全或部分敲除。例如，基因可通过敲除或敲低而被破坏。破坏基因可部分降低或完全抑制由该基因所编码的蛋白质的表达。破坏基因还可引起不同基因，例如，下游基因的激活。在一些情况下，术语“破坏”可与诸如抑制、中断或工程化等术语互换使用。
如本文所用的术语“功能”及其语法等同项可指执行、具有或服务于预期目的的能力。功能可包括从基线到正常功能的100％的任何百分比。例如，功能可包括或包括约正常功能的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和/或100％。在一些情况下，术语功能可意指超过或超过约正常功能的100％，例如，正常功能的125％、150％、175％、200％、250％、300％和/或以上。
如本文所用的术语“基因编辑”及其语法等同项可指插入、取代或从基因组去除一个或多个核苷酸的基因工程。可使用核酸酶(例如，天然存在的核酸酶或人工改造的核酸酶)进行基因编辑。
如本文所用的术语“突变”及其语法等同项可包括多核苷酸中一个或多个核苷酸的置换、缺失和插入。例如，多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中的至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸/氨基酸可被置换、删除和/或插入。突变可影响基因或其调控序列的编码序列。突变还可影响基因组序列的结构或所编码的mRNA的结构/稳定性。
如本文所用的术语“非人动物”及其语法等同项可包括除人之外的所有动物物种，包括非人哺乳动物，其可以是天然动物或遗传修饰非人动物。术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核酸”和“寡核苷酸”及其语法等同项可互换使用，并且可指呈线性或环状构象且为单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开内容的目的，这些术语不应被解释为关于长度的限制。这些术语还可涵盖天然核苷酸的类似物以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸骨架)中进行修饰的核苷酸。这些术语的修饰还可涵盖去甲基化、CpG甲基化的添加、细菌甲基化的去除和/或哺乳动物甲基化的添加。通常，特定核苷酸的类似物可具有相同的碱基配对特异性，即，A的类似物可与T进行碱基配对。
如本文所用的术语“外周血淋巴细胞”(PBL)及其语法等同项可指在血液(例如，外周血)中循环的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可指不定位于器官的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可包括T细胞、NK细胞、B细胞或其任意组合。
如本文所用的术语“表型”及其语法等同项可指生物体的可观察特征或特性，如其形态、发育、生化或生理特性、物候、行为和行为产物的组合。根据语境，术语“表型”有时可指群体的可观察特征或特性的组合。
如本文所用的术语“前间区序列”及其语法等同项可指能够与指导RNA的一部分如指导RNA的间隔序列或工程化靶向部分杂交的PAM邻近核酸序列。前间区序列可以是被指导RNA靶向的基因、基因组或染色体内的核苷酸序列。在天然状态下，前间区序列与PAM(前间区序列邻近基序)相邻。由RNA指导的核酸酶切割的位点在前间区序列内。例如，当指导RNA靶向特定的前间区序列时，Cas蛋白将在前间区序列内产生双链断裂，从而切割前间区序列。在切割之后，前间区序列的破坏可导致非同源末端连接(NHEJ)或同源性指导的修复(HDR)。前间区序列的破坏可导致前间区序列的缺失。另外或备选地，前间区序列的破坏可导致外源核酸序列插入到前间区序列中或取代前间区序列。
如本文所用的术语“接受者”及其语法等同项可指人或非人动物。接受者也可以是有需要的接受者。
如本文所用的术语“重组”及其语法等同项可指两个多核酸之间遗传信息交换的过程。出于本公开内容的目的，“同源重组”或“HR”可指例如在双链断裂修复期间可以发生的此类遗传交换的特定形式。该过程可能需要核苷酸序列同源性，例如，使用供体分子进行靶分子(例如，经历双链断裂的分子)的模板修复，并且有时被称为非交叉基因转换或短程(short tract)基因转换。此类转移还可涉及在破坏的靶标与供体之间形成的异源双链体DNA的错配校正，和/或依赖合成的链退火(其中供体可用于重新合成可成为靶标的一部分的遗传信息)，和/或相关过程。这样的特定的HR通常可导致靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸的部分或全部序列可整合到靶多核苷酸中。在一些情况下，术语“重组臂”和“同源臂”可互换使用。
术语“靶载体”和“靶向载体”在本文中可互换使用。
如本文所用的术语“T细胞”及其语法等同项可指来自任何来源的T细胞。例如，T细胞可以是原代T细胞，例如，自体T细胞、细胞系等。T细胞也可以是人类或非人类T细胞。
如本文所用的术语“TIL”或肿瘤浸润性淋巴细胞及其语法等同项可指从肿瘤分离的细胞。例如，TIL可以是迁移到肿瘤的细胞。TIL也可以是已浸润肿瘤的细胞。TIL可以是在肿瘤内发现的任何细胞。例如，TIL可以是T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞或其任意组合。TIL可以是混合的细胞群体。TIL群体可包含不同表型的细胞、不同分化程度的细胞、不同谱系的细胞或其任意组合。
如果所治疗的病况发生变化，则可能出现“治疗效果”。该变化可以是积极的或消极的。例如，“积极效果”可对应于受试者中激活的T细胞数目的增加。在另一个实例中，“消极效果”可对应于受试者中肿瘤的量或大小的降低。如果改善至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，以及最优选100％，则存在所治疗的病况的“变化”。该变化可基于个体的所治疗病况的严重程度的改善，或基于采用和未采用治疗性组合物(该治疗性组合物与本发明的组合物联合施用)进行治疗的个体群体中改善的病况的频率差异。类似地，本公开内容的方法可包括向受试者施用“治疗有效”的量的细胞。术语“治疗有效的”应当理解成具有对应于“具有治疗效果”的定义。
如本文所用的术语“安全港(safe harbor)”和“免疫安全港(immune safeharbor)”及其语法等同项可指可用于整合外源核酸的基因组内的位置，其中该整合不会通过单独添加核酸对宿主细胞的生长造成任何显著的影响。安全港的非限制性实例可包括HPRT、AAVS SITE(例如，AAVS1、AAVS2等)、CCR5或Rosa26。
如本文所用的术语“序列”及其语法等同项可指核苷酸序列，该核苷酸序列可以是DNA或RNA；可以是线性的、环状的或分支的；并且可以是单链的或双链的。序列可以突变。序列可以是任何长度，例如，2至1,000,000个或更多个核苷酸的长度(或在其之间或其以上的任何整数值)，例如，约100至约10,000个核苷酸，或约200至约500个核苷酸。
概述
本文公开了用于治疗疾病或病况如癌症的组合物和方法。本文还公开了用于治疗各种疾病或病况如癌症的治疗方案。治疗方案可包括施用遗传修饰的细胞，例如肿瘤浸润性淋巴细胞，以用于治疗应用。有效的基于过继细胞转移的免疫疗法(ACT)可用于治疗癌症(例如，转移性癌症)患者。例如，可以修饰肿瘤浸润性淋巴细胞以破坏免疫检查点基因。
细胞
本文公开的组合物可以利用细胞。细胞可为原代细胞。细胞可为重组细胞。可从许多非限制性来源获得细胞，该非限制性来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。例如，可使用任何T细胞系。或者，细胞可来源于健康供体、被诊断患有癌症的患者或被诊断患有感染的患者。在另一个实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群体的一部分。还可从细胞治疗库(bank)获得细胞。可以获得对免疫抑制治疗具有抗性的破坏的细胞。还可以在修饰之前选择期望的细胞群体。选择可包括以下中的至少一种：磁分离、流式细胞术选择、抗生素选择。该一个或多个细胞可以是任何血细胞，如外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。该一个或多个细胞可以是任何免疫细胞，如淋巴细胞、B细胞或T细胞。细胞也可以从天然食品、单采血液成分术或受试者的肿瘤样品中获得。细胞可为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在一些情况下，单采血液成分术可为白细胞去除术。白细胞去除术可以是从血液中分离血细胞的过程。在白细胞去除术期间，可以从受试者的手臂中的针头移取血液，通过将全血分成红细胞、血浆和淋巴细胞的机器进行循环，然后通过另一只手臂中的针头使血浆和红细胞返回受试者。在一些情况下，在施用治疗方案和细胞疗法后分离细胞。例如，单采血液成分术可以与细胞施用顺序或同时进行。在一些情况下，在施用细胞产品之前和之后约6周进行单采血液成分术。在一些情况下，在施用细胞产品之后-3周、-2周、-1周、0周、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或多达10年进行单采血液成分术。在一些情况下，通过单采血液成分术获得的细胞可以进行关于特异性裂解、细胞因子释放、代谢组学研究、生物能学研究、细胞因子产生的细胞内FAC、ELISA斑点测定和淋巴细胞亚群分析的测试。在一些情况下，可以冷冻保存细胞产品或单采血液成分术产品的样品用于输注细胞表型和功能的回顾性分析。
可以从罹患癌症的器官中分离TIL。可以从患有癌症的器官中分离一种或多种细胞，该器官可为脑、心脏、肺、眼、胃、胰腺、肾、肝、肠、子宫、膀胱、皮肤、毛发、指甲、耳、腺体、鼻、嘴、嘴唇、脾、牙龈、牙齿、舌头、唾液腺、扁桃体、咽、食管、大肠、小肠、直肠、肛门、甲状腺、胸腺、骨骼、软骨、肌腱、韧带、肾上腺囊、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、幽门、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、精囊、阴茎、淋巴、淋巴结或淋巴管。一种或多种TIL可来自脑、心脏、肝、皮肤、肠、肺、肾、眼、小肠或胰腺。TIL可来自胰腺、肾、眼、肝、小肠、肺或心脏。TIL可来自胰腺。一种或多种细胞可为胰岛细胞，例如，胰腺β细胞。在一些情况下，TIL可来自胃肠癌。TIL培养物可通过多种方式制备。例如，可将肿瘤与非癌组织或坏死区域修剪开。然后可将肿瘤分割成长度为约2-3mm。在一些情况下，可将肿瘤分割成大小为0.5mm至约5mm、约1mm至约2mm、约2mm至约3mm、约3mm至约4mm或约4mm至约5mm。然后可以利用培养基和细胞刺激剂如细胞因子在体外培养肿瘤碎片。在一些情况下，IL-2可用于扩增来自肿瘤碎片的TIL。IL-2的浓度可为约6000IU/mL。IL-2的浓度还可为约2000IU/mL、3000IU/mL、4000IU/mL、5000IU/mL、6000IU/mL、7000IU/mL、8000IU/mL、9000IU/mL或多达约10000IU/mL。一旦TIL被扩增，则可以对其进行体外测定以确定肿瘤反应性。例如，可以通过FACS来评估TIL的CD3、CD4、CD8和CD58表达。还可以使TIL经受共培养、细胞毒性测定、ELISA测定或ELISPOT测定。在一些情况下，TIL培养物可以冷冻保存或经历快速扩增。可以从处于某发育阶段的供体分离细胞如TIL，该阶段包括但不限于胚胎、新生儿、青年和成年阶段。可以从成年人分离TIL。可以其分离细胞的人的年龄可在10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁以下。例如，可以从年龄在6岁以下的人分离细胞。还可以从年龄在3岁以下的人分离细胞如TIL。在一些情况下，人类供体可以是年龄为至少约18岁的成年人。在一些情况下，可以储存血液制品。例如，可以使用cryostore冻存袋来储存和冷冻血液制品。
在一些情况下，可用于细胞疗法的细胞或可被基因组破坏的细胞对于给定因子可是阳性或阴性的。在一些实施方案中，细胞可以是CD3+细胞、CD3-细胞、CD5+细胞、CD5-细胞、CD7+细胞、CD7-细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD8+细胞、CD8-细胞、CD103+细胞、CD103-细胞、CD11b+细胞、CD11b-细胞、BDCA1+细胞、BDCA1-细胞、L-选择蛋白+细胞、L-选择蛋白-细胞、CD25+、CD25-细胞、CD27+、CD27-细胞、CD28+细胞、CD28-细胞、CD44+细胞、CD44-细胞、CD56+细胞、CD56-细胞、CD57+细胞、CD57-细胞、CD62L+细胞、CD62L-细胞、CD69+细胞、CD69-细胞、CD45RO+细胞、CD45RO-细胞、CD127+细胞、CD127-细胞、CD132+细胞、CD132-细胞、IL-7+细胞、IL-7-细胞、IL-15+细胞、IL-15-细胞、凝集素样受体G1阳性细胞、凝集素样受体G1阴性细胞或其分化或去分化细胞。由细胞表达的因子的实例并非意在限制，并且本领域技术人员将理解，细胞对于本领域已知的任何因子可以是阳性的或阴性的。在一些实施方案中，细胞对于两种或更多种因子可以是阳性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8+。在一些实施方案中，细胞对于两种或更多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD25-、CD44-和CD69-。在一些实施方案中，细胞对于一种或多种因子可以是阳性的，并且对于一种或多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8-。然后可将所选择的细胞输注到受试者中。在一些实施方案中，可对具有或不具有一种或多种给定因子的细胞进行选择(例如，可基于一种或多种因子的存在或不存在来分离细胞)。在一些实施方案中，所选择的细胞也可在体外扩增。所选择的细胞可在输注前进行体外扩增。应当理解，在本文公开的任何方法中使用的细胞可以是本文公开的任何细胞的混合物(例如，两个或更多个不同的细胞)。例如，本公开内容的方法可包括细胞，并且该细胞是CD4+细胞和CD8+细胞的混合物。在另一个实例中，本公开内容的方法可包括细胞，并且该细胞是CD4+细胞和幼稚细胞的混合物。在一些情况下，细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择蛋白)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+组成的干细胞样记忆TSCM细胞，干细胞样记忆细胞还可表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出许多与干细胞样记忆细胞不同的功能属性。工程化细胞还可以是包含L-选择蛋白和CCR7的中央记忆TCM细胞，其中该中央记忆细胞可分泌例如IL-2但不分泌IFNγ或IL-4。工程化细胞还可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应记忆TEM细胞，并产生例如效应细胞因子如IFNγ和IL-4。在一些情况下，细胞群体可引入受试者中。例如，细胞群体可以是T细胞和NK细胞的组合。在其他情况下，群体可以是幼稚细胞和效应细胞的组合。细胞群体可以是TIL。
特别地，可诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)(有时与钙离子载体结合)接触对T细胞群体进行体外刺激。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，可使用结合该辅助分子的配体。例如，T细胞群体可在可刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。在一些情况下，4-1BB可用于刺激细胞。例如，可用4-1BB和IL-21或另一种细胞因子刺激细胞。为了刺激CD4T细胞或CD8T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供信号的药剂可以在溶液中或与表面偶联。颗粒与细胞的比例可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。在进一步的实施方案中，细胞如T细胞可与药剂包被的珠子组合，其中该珠子和细胞可随后进行分离，并任选地进行培养。每个珠子可用抗CD3抗体或抗CD28抗体进行包被，或者在一些情况下，可用两者的组合进行包被。在备选的实施方案中，在培养之前，药剂包被的珠子和细胞不分离，而是一起培养。可通过使可附接至抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3x28个珠子)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一些情况下，在缓冲液中，例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，不含二价阳离子如钙和镁)中组合细胞和珠子(例如，比例为1:1的M-450CD3/CD28T顺磁珠)。可使用任何细胞浓度。该混合物可培养或培养约几个小时(例如，约3小时)至或至约14天，或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，该混合物可培养或培养约21天或者至多21天或至多约21天。适用于T细胞培养的条件可包括可以含有增殖和活力所必需的因子的适当培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5(Lonza))，该因子包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-21、IL-15、TGFβ和TNFα或用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉以及还原剂如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo1和X-Vivo 20、Optimizer，其具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量的血清(或血浆)或限定的一组激素，和/或足够用于T细胞生长和扩增的量的细胞因子。在一些情况下，865mL的瓶的RPMI可具有100mL人血清、25mL Hepes 1M、10mL10,000U/mL和10,000μg/mL的青霉素/链霉素，以及0.2mL 50mg/mL的庆大霉素。在添加添加剂之后，可以使用0.2μm x1L过滤器过滤RPMI培养基并在4℃下储存。在一些实施方案中，抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，不包含在要输注到受试者体内的细胞培养物中。在一些情况下，可将人血清在37℃水浴中解冻，然后加热灭活(例如，对于100mL的瓶，在56℃下持续30分钟)。在添加培养基之前，可以通过0.8μm和0.45μm过滤器过滤血清。
靶细胞可维持在支持生长所必需的条件下；例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO2)。在一些情况下，已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。在一些情况下，可使用针对人CD3、CD28、CD2或其任意组合的可溶单特异性四聚体抗体。
在一些情况下，经历破坏的细胞可通过与组织或细胞共培养而被激活或扩增。细胞可以是抗原呈递细胞。人工抗原呈递细胞(aAPC)可表达T细胞受体的配体和共刺激分子，并且可激活并扩增T细胞以用于转移，同时在一些情况下改善其效力和功能。aAPC可被工程化为表达用于T细胞激活的任何基因。aAPC可被工程化为表达用于T细胞扩增的任何基因。aAPC可以是珠子、细胞、蛋白质、抗体、细胞因子或任意组合。aAPC可将信号递送至可经历基因组移植的细胞群体。例如，aAPC可递送信号1、信号2、信号3或任意组合。信号1可以是抗原识别信号。例如，信号1可以是TCR被肽-MHC复合体连接或是可导致CD3信号转导复合体激活的针对CD3的激动性抗体的结合。信号2可以是共刺激信号。例如，共刺激信号可以是分别与ICOS-L、CD70和4-1BBL结合的抗CD28、诱导型共刺激物(ICOS)、CD27和4-1BB(CD137)。信号3可以是细胞因子信号。细胞因子可以是任何细胞因子。细胞因子可以是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或其任意组合。
在一些情况下，人工抗原呈递细胞(artificial antigen presenting cell,aAPC)可用于激活和/或扩增细胞群体。在一些情况下，人工抗原呈递细胞可以不诱导同种异型特异性(allospecificity)。在一些情况下，aAPC可以不表达HLA。可对aAPC进行遗传修饰以稳定表达可用于激活和/或刺激的基因。在一些情况下，K562细胞可用于激活。K562细胞还可用于扩增。K562细胞可以是人红白血病细胞系。K562细胞可被工程化以表达感兴趣的基因。K562细胞可以不内源性表达HLA I类、II类或CD1d分子，但可表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。K562可被工程化以向T细胞传递信号1。例如，K562细胞可被工程化以表达HLAI类。在一些情况下，K562细胞可被工程化以表达另外的分子，如B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗CD3mAb、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合的IL-15、膜结合的IL-17、膜结合的IL-21、膜结合的IL-2、截短的CD19或任意组合。在一些情况下，除CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可表达膜形式的抗CD3mAb、克隆OKT3。在一些情况下，除CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可表达膜形式的抗CD3mAb、克隆OKT3、膜形式的抗CD28mAb。
在一些情况下，可以用抗原和经照射的组织相容抗原呈递细胞(APC)(例如饲养细胞PBMC)进行细胞的再刺激。在一些情况下，可以使用非特异性促细胞分裂原如PHA和同种异体饲养细胞来生长细胞。饲养细胞PBMC可以以40Gy照射。饲养细胞PBMC可以以约10Gy至约15Gy、约15Gy至约20Gy、约20Gy至约25Gy、约25Gy至约30Gy、约30Gy至约35Gy、约35Gy至约40Gy、约40Gy至约45Gy、约45Gy至约50Gy照射。在一些情况下，可以用抗CD3和IL-2来刺激仅含经照射的饲养细胞的对照烧瓶。
aAPC可以是珠子。球形聚苯乙烯珠子可用针对CD3和CD28的抗体进行包被并用于T细胞激活。珠子可以是任何大小。在一些情况下，珠子可以为或可以为约3微米和6微米。珠子可以为或可以为约4.5微米的大小。珠子可以以任何细胞与珠子的比例使用。例如，可使用每毫升100万个细胞3:1的珠子与细胞的比例。aAPC还可以是刚性球形颗粒、聚苯乙烯乳胶微珠、磁性纳米或微米颗粒、纳米级量子点、4、(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)微球、非球形颗粒、5、碳纳米管束、6、椭圆体PLGA微粒、7、纳米虫(nanoworm)、含流体脂双层的系统、8、2D-支持的脂双层(2D-SLB)、9、脂质体、10、RAFTsome/微域脂质体、SLB颗粒(11)或其任意组合。
在一些情况下，aAPC可扩增CD4T细胞。例如，aAPC可被工程化以模拟HLA II类限制性CD4T细胞的抗原加工和呈递途径。K562可被工程化以表达HLA-D、DPα链、DPβ链、Ii、DMα、DMβ、CD80、CD83或其任意组合。例如，可用HLA限制性肽对工程化K562细胞进行脉冲，以便扩增HLA限制性抗原特异性CD4T细胞。
在一些情况下，可将aAPC的使用与外源引入的细胞因子组合，以用于T细胞激活、扩增或任意组合。还可在体内扩增细胞，例如在将基因组移植细胞施用于受试者之后，在受试者的血液中扩增细胞。
在一些情况下，可以将细胞按比例放大至通过标准快速扩增方案(REP)实现的产量。遗传修饰的TIL的平均倍数扩增可以是1071倍。在一些情况下，平均倍数扩增可以是500至2000倍。遗传修饰的TIL的平均倍数扩增可以是500至600、600至700、700至800、800至900、900至1000、1000至多达2000倍。在一些情况下，用于患者输注的工程化细胞剂量可以是约1x1010个敲除的TIL。
施用之前、之后和/或期间的细胞(例如，工程化细胞或工程化原代T细胞或TIL)可以是功能性的。例如，细胞可以在施用后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100天是功能性的。过继转移的细胞可以在施用后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月是功能性的。施用的细胞可以在输注后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30年是功能性的。在一些情况下，施用的细胞可在接受者的终生是功能性的。
进一步地，过继转移的细胞可发挥其正常预期操作的100％的功能。细胞还可发挥其正常预期操作的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能。
在长期培养中，基因组破坏的细胞无法表现出不依赖刺激的生长或转化的特性。例如，在一些情况下，当在没有细胞因子如IL-2的情况下培养时，基因组破坏的细胞无法扩增。在一些情况下，基因组破坏的细胞在接触细胞因子如IL-2后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99天之后可能无法存活。
本文所述的细胞组合物可以冷冻保存。冷冻保存可以在例如5％DMSO最终浓度的Cryostor CS10中进行。冷冻保存可以以约7.5x 107个细胞/mL至约1.5x 108个细胞/mL的冷冻密度进行。冷冻密度可为约1x107个细胞/mL、1.5x107个细胞/mL、2x107个细胞/mL、2.5x107个细胞/mL、3x107个细胞/mL、3.5x107个细胞/mL、4x107个细胞/mL、4.5x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL、5.5x107个细胞/mL、6x107个细胞/mL、6.5x107个细胞/mL、7x107个细胞/mL、7.5x107个细胞/mL、8x107个细胞/mL、8.5x107个细胞/mL、9x107个细胞/mL、9.5x107个细胞/mL、1x108个细胞/mL、1.5x108个细胞/mL、2x108个细胞/mL、2.5x108个细胞/mL、3x108个细胞/mL、3.5x108个细胞/mL、4x108个细胞/mL、4.5x108个细胞/mL、5x108个细胞/mL、5.5x108个细胞/mL、6x108个细胞/mL、6.5x108个细胞/mL、7x108个细胞/mL、7.5x108个细胞/mL或多达约8x108个细胞/mL。
例如，在一些情况下，可以收获、洗涤TIL并将其重悬于缓冲液如Cryostor缓冲液中。可将该制备物与等体积的Cryostore CS10混合。在一些情况下，在将细胞组合物引入有需要的受试者之前将其解冻。
细胞活力可通过流式细胞术和台盼蓝排除法确定。在一些情况下，流式细胞仪上的前向散射和侧向散射可以确定活细胞百分比。在其他情况下，细胞可以用膜联蛋白V染色以确定死亡细胞/活细胞的百分比。台盼蓝排除法也可用于通过血细胞计数器确定细胞活力。在一些情况下，用于施用的至少约50％的细胞可以是有活力的。在其他情况下，约50％、60％、70％、80％、90％、95％或多达100％的细胞可以是有活力的。
细胞靶标
细胞如TIL可以靶向抗原。细胞也可以靶向表位。抗原可以是肿瘤细胞抗原。表位可以是肿瘤细胞表位。可以选择肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)作为克隆和/或寡克隆亚群，其具有针对受试者特异性癌症新抗原的特异性反应性。可以使用以下方法中的至少一种来确定特异性反应性：肿瘤全外显子组测序和串联小基因/合成长肽筛选方法，E.Tran等人,Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+T cells in a patient withepithelial cancer.Science 344,641-645(2014)。肿瘤细胞表位可以衍生自多种肿瘤抗原，例如来自由突变导致的肿瘤的抗原(新抗原或新表位)、共有的肿瘤特异性抗原、分化抗原和在肿瘤中过表达的抗原。在一些情况下，可以通过5’RACE和TCR-PCR鉴别新抗原或新表位。仅列举一些例子，这些抗原例如可衍生自α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、BCR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1融合蛋白或SYT-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、丙糖磷酸异构酶、BAGE-1、GAGE-1,2,8、Gage 3,4,5,6,7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、mucink、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、CEA、gp100/Pmel17、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL13Rα2、肠羧基酯酶、α胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、MUC1、p53、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、存活蛋白、端粒酶、VEGF和/或WT1。肿瘤相关抗原可以是由宿主非正常表达的抗原；肿瘤相关抗原可以是由宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或其他方式的异常显示；肿瘤相关抗原可与正常表达但以异常高水平表达的分子相同；或者肿瘤相关抗原可在异常的情形或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是，例如，蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、其他生物分子或其任意组合。在一些情况下，靶标为新抗原或新表位。例如，新抗原可以是ERBB2IP中的E805G突变。在一些情况下，可以通过全外显子组测序来鉴别新抗原和新表位。在一些情况下，新抗原和新表位靶标可由胃肠癌细胞表达。新抗原和新表位可在上皮癌上表达。
表位可以是基质表位。表位可以在肿瘤微环境的基质上。抗原可以是基质抗原。抗原可以在肿瘤微环境的基质上。仅列举一些例子，这些抗原和这些表位例如可存在于肿瘤内皮细胞、肿瘤血管系统、肿瘤成纤维细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤间质细胞上。这些抗原例如可包括CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4和/或腱生蛋白。
基因组破坏
基因组破坏可包括外显子和内含子。在一些情况下，基因组破坏可以是基因序列的破坏。基因的破坏可以是任何特定基因的破坏。考虑涵盖本申请内的基因的遗传同源物(例如，基因的任何哺乳动物形式)。一些遗传同源物是本领域已知的，但在一些情况下，同源物是未知的。然而，可以通过使用可公开获得的数据库如NCBI BLAST对核酸(DNA或RNA)序列或蛋白质序列进行比较来找到哺乳动物之间的同源基因。
基因组破坏可以改善细胞的功能。例如，基因组破坏可以增强靶标的细胞毒性。基因组破坏还可以增强细胞的增殖或持久性。例如，可以被破坏的基因可以提高癌症免疫疗法的治疗潜力。细胞可被工程化以敲除一个或多个内源基因。可被敲除的内源基因可包括免疫检查点基因。免疫检查点基因可以是刺激性检查点基因或抑制性检查点基因。可以使用基因组参照序列联盟人类基因组序列第38版第2次补充版(GRCh38.p2)程序集提供免疫检查点基因位置。可以使用数据库选择将要敲除的基因。在一些情况下，某些内源基因对基因组工程而言是更可修改的。数据库可包含表观遗传学上许可的靶位点。在一些情况下，数据库可以是ENCODE(DNA元素的百科全书(encyclopedia of DNA Elements))(http://www.genome.gov/10005107)。数据库可鉴别具有可以更容许进行基因组工程的开放染色质的区域。可被破坏的基因可参与减弱TCR信号传导、功能性亲合力或对癌症的免疫力。在一些情况下，当刺激TCR时，待破坏的基因上调。基因可参与抑制细胞扩增、功能性亲合力或细胞因子多功能性。基因可参与负调控细胞因子产生。例如，基因可参与抑制效应细胞因子，例如，IFN-γ和/或TNF的产生。基因还可参与抑制TCR刺激后的支持性细胞因子如IL-2的表达。
细胞可以具有一个或多个破坏的基因。例如，其表达被破坏的一个或多个基因可以是检查点基因，例如PD-1或CISH。在一些情况下，其表达可以被破坏的一个或多个基因在表1中示出。例如，可被破坏的基因可以与本文公开的基因(例如表1中的基因)表现出一定的同一性和/或同源性。因此，考虑可以破坏与表1的基因表现出或大约表现出50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性(在核酸或蛋白质水平)的基因。还考虑可以破坏与表1的基因表现出或大约表现出约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(在核酸或蛋白质水平)的基因。
表1：检查点基因总结
细胞可以具有一个或多个被抑制的基因。例如，其表达被抑制的一个或多个基因可包括表1中的任何一个基因以及其同源或修饰变体。还可通过多种方式进行基因抑制。例如，可通过敲除、改变基因的启动子和/或通过施用干扰RNA来抑制基因表达。这可在生物体水平或在组织、器官和/或细胞水平进行。如果在细胞、组织和/或器官中敲低一个或多个基因，则可通过施用RNA干扰试剂，例如，siRNA、shRNA或微小RNA来抑制该一个或多个基因。例如，可将可表达shRNA的核酸稳定转染到细胞中以敲低表达。此外，可将可表达shRNA的核酸插入T细胞的基因组中，从而敲低T细胞内的基因。
在一些情况下，可被破坏或抑制的基因可以是CISH。CISH基因可以是细胞因子诱导的STAT抑制因子(CIS)(也称为细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)或STAT诱导的STAT抑制因子(SSI))蛋白家族的成员，(参见例如，Palmer等人,Cish actively silences TCRsignaling in CD8+T cells to maintain tumor tolerance,The Journal ofExperimental Medicine 202(12),2095-2113(2015))。基因可以是SOCS蛋白家族的一部分，SOCS蛋白家族可形成可调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分。CISH可参与通过JAK-STAT5途径传导信号的细胞因子如促红细胞生成素、催乳素或白介素3(IL-3)受体的负调控。基因可通过抑制STAT5的酪氨酸磷酸化来抑制STAT5反式激活。已知CISH家族成员是细胞因子诱导的细胞因子信号传导负调节物。基因的表达可由造血细胞中的IL2、IL3、GM-CSF或EPO诱导。蛋白酶体介导的基因蛋白降解可参与促红细胞生成素受体的失活。在一些情况下，待靶向的基因可在肿瘤特异性T细胞中表达。待靶向的基因可在被破坏时增加工程化细胞向抗原相关肿瘤的浸润。
改善效应T细胞的功能性亲合力对于克服肿瘤微环境中的抑制因子和引发肿瘤消退可能是至关重要的。在一些情况下，Cish(细胞因子诱导的SH2蛋白)—细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)家族的成员—可以通过CD8+T细胞中的T细胞受体(TCR)刺激来诱导，可以在肿瘤驻留T细胞中表达，并且可以抑制它们对肿瘤的功能性亲合力。肿瘤特异性CD8+T细胞中Cish的遗传缺失可以增强它们的扩增，功能性亲合力和细胞因子多功能性，导致已建立的肿瘤的显著和持久的消退。Cish与关键TCR信号转导中间体磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)物理地相互作用，使该中间体在TCR刺激后靶向蛋白酶体降解。这些发现建立了一种新的可靶向相互作用，其调节肿瘤特异性CD8+T细胞的功能性亲合力，并且可以被操作用于改善ACT癌症免疫疗法。在一些情况下，Cish敲除或敲低可能导致细胞因子水平升高。与野生型对应细胞的上清液相比，升高的细胞因子水平可包括上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-2或其组合的升高。在其他情况下，敲除或敲低基因如Cish可以包括抗原敏感性的增加。在一些情况下，抗原敏感性的增加可以通过总细胞因子表达水平来测量，抗原敏感性的增加可以是40至100倍。与对照的对应细胞相比，抗原敏感性的增加可以是40至50、50至60、60至70、70至80、80至90、90至100倍。
在一些情况下，如通过IFN-γ、TNF-α和/或IL-2水平所测量的，Cish敲除或敲低可导致细胞因子释放的最大量的增加。在一些情况下，ELISA可以测量上清液中的总细胞因子水平，并且可以不直接测量亚群或细胞水平上的细胞因子产量。为了评估不同的亚群或个体T细胞是否可能导致细胞因子产量增加，可以对CD8+T细胞进行选择、刺激、针对细胞内IFN-γ、TNF-α和IL-2进行共染色并用流式细胞术评估。在一些情况下，Cish可以负向调节肿瘤特异性T细胞中的总效应细胞因子产生和多功能性二者。Cish的遗传全体缺失可以增强功能性亲合力并且使CD8+T细胞成为持久的肿瘤杀伤剂，这可能对复发性肿瘤的记忆应答有影响。
可用任何方法敲除或破坏T细胞中的一个或多个基因。例如，敲除一个或多个基因可包括从T细胞的基因组删除一个或多个基因。敲除还可包括从T细胞去除全部或部分基因序列。还考虑，敲除可包括用一个或多个核苷酸取代T细胞基因组中的全部或部分基因。敲除一个或多个基因还可包括在一个或多个基因中插入序列，从而破坏该一个或多个基因的表达。例如，插入序列可在一个或多个基因的中间产生终止密码子。插入序列还可使一个或多个基因的开放阅读框移动。还考虑，可以将敲除技术的任意组合进行组合。例如，组织特异性敲除或细胞特异性敲除可与诱导型技术相组合，从而产生组织特异性或细胞特异性诱导型敲除。此外，其他系统如发育特异性启动子可与组织特异性启动子和/或诱导型敲除组合使用。
敲除技术还可包括基因编辑。例如，可以使用核酸酶(包括CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，例如Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶)进行基因编辑。核酸酶可以是天然存在的核酸酶、遗传修饰和/或重组的核酸酶。还可使用基于转座子的系统(例如，PiggyBac、睡美人(Sleeping beauty))进行基因编辑。例如，可以使用转座酶进行基因编辑。
在一些情况下，工程化的细胞或含有破坏的基因或其部分的细胞可经历输注前测试。输注前测试可以包括对工程化细胞的培养物进行表型测试、效力测试、微生物学测试、内毒素测试、活力测试和肿瘤细胞测试中的至少一种。举一些例子，表型测试可包括检测CD3、CD4、CD8、CD56、CD45RA、CD45RO、IL-7受体α、CD28的存在。在一些情况下，工程化细胞上的标志物的水平超过至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或至多约100％。当输注前测试中的表型测试可以是至少约80％CD3阳性时，可以施用TIL。
在一些情况下，TIL的效力测试可包括在对TIL培养物进行抗CD3刺激后检测IFNγ的水平。在一些情况下，对TIL培养物进行抗CD3刺激后的IFNγ的水平显著高于可比的对照细胞群体。在一些情况下，当输注前测试在效力测试中对TIL进行抗CD3刺激后产生至少约200pg/mL/105个细胞的IFNγ时，可以施用TIL。在一些情况下，当输注前测试在效力测试中对TIL进行抗CD3刺激后产生至少约50pg/mL/105个细胞、75pg/mL/105个细胞、100pg/mL/105个细胞、150pg/mL/105个细胞、200pg/mL/105个细胞、250pg/mL/105个细胞、300pg/mL/105个细胞的IFNγ时，可以施用TIL。
在一些情况下，针对组合物中肿瘤细胞的存在对TIL群体进行测试。对于在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中的肿瘤细胞，可施用的TIL可为阴性。在其他情况下，在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中存在少于1％的肿瘤细胞。在其他情况下，在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中存在少于2％的肿瘤细胞。在其他情况下，在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中存在少于3％的肿瘤细胞。在其他情况下，在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中存在少于4％的肿瘤细胞。在其他情况下，在细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中存在少于5％的肿瘤细胞。
CRISPR系统
本文所述的方法可利用CRISPR系统。存在至少五种类型的均合并RNA和Cas蛋白的CRISPR系统。I型、III型和IV型组装能够切割与crRNA互补的核酸的多Cas蛋白复合体。I型和III型均需要在将经加工的crRNA组装成多Cas蛋白复合体之前进行pre-crRNA加工。II型和V型CRISPR系统包含与至少一种指导RNA复合的单一Cas蛋白。
在以下文献中讨论了CRISPR系统的一般机制和最新进展：Cong,L.等人,“Multiplex genome engineering using CRISPR systems,”Science,339(6121):819-823(2013)；Fu,Y.等人,“High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Casnucleases in human cells,”Nature Biotechnology,31,822–826(2013)；Chu,VT等人,“Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells,”Nature Biotechnology 33,543–548(2015)；Shmakov,S.等人,“Discovery and functional characterization ofdiverse Class 2CRISPR-Cas systems,”Molecular Cell,60,1-13(2015)；Makarova,KS等人,“An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems”,NatureReviews Microbiology,13,1-15(2015)。靶DNA的位点特异性切割发生在由以下两者决定的位置：1)指导RNA与靶DNA(也称为前间区序列)之间的碱基配对互补性，和2)靶DNA中的短基序(被称为前间区序列邻近基序)(PAM))。例如，可使用CRISPR系统，例如，II型CRISPR系统，产生工程化细胞。本文公开的方法中所使用的Cas酶可以是催化DNA切割的Cas9。通过衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9或任何密切相关的Cas9进行的酶促作用可在靶位点序列处产生双链断裂，该靶位点序列与指导序列的20个核苷酸杂交，并且具有位于该靶序列的20个核苷酸之后的前间区序列邻近基序(PAM)。
在一些情况下，CRISPR系统可以引入突变。突变可以是插入或缺失。例如，CRISPR系统可以引入包含CISH的至少一部分的1bp插入。在一些情况下，用CRISPR系统操纵TIL可能不会对CRISPR系统的电穿孔后的TIL扩增产生负面影响。在一些情况下，为了确定在遗传水平上观察到的敲除频率是否与蛋白质损失相关，可以评估CRISPR敲除后蛋白质如CISH蛋白的表达。例如，可以在电穿孔后第14天使用平板结合的抗CD3和可溶性抗CD28抗体对外周血(PB)T细胞和TIL进行再刺激，以及通过流式细胞术和蛋白质印迹可以对蛋白质例如CISH蛋白的损失进行评估。在一些情况下，CRISPR修饰的PB T细胞和TIL可以扩增14天，然后再刺激48小时。由于CISH是细胞内蛋白质，因此可以收集细胞并通过蛋白质印迹来分析提取物。与通过基因组修饰的TiDE分析得到的高敲除率一致，蛋白质如CISH在敲除的循环T细胞和TIL中基本上不存在或减少。
I.Cas蛋白
载体可与编码CRISPR酶如Cas蛋白(CRISPR相关蛋白)的酶编码序列可操作地连接。Cas蛋白的非限制性实例可包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也被称为Csn1或Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、其同源物或其修饰型。在一些情况下，可以使用催化死亡的Cas蛋白，例如dCas9。未修饰的CRISPR酶可具有DNA切割活性，如Cas9。CRISPR酶可引导靶序列处，如靶序列内和/或靶序列的互补序列内一条链或两条链的切割。例如，CRISPR酶可引导在距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内一条链或两条链的切割。可以使用编码CRISPR酶的载体，该CRISPR酶相对于相应的野生型酶发生突变，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条链或两条链的能力。Cas蛋白可以是高保真Cas蛋白，如Cas9HiFi。在一些情况下，Cas蛋白可以被修饰。例如，Cas可为N7-甲基-Gppp(2’-O-甲基-A)。在一些情况下，可以在临床使用前对Cas蛋白如Cas9蛋白进行测序。例如，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来评估纯化的体外转录产物，以验证临床产品中不存在除Cas9之外的其他mRNA种类。此外，编码Cas蛋白如Cas9的纯化mRNA可以经历通过逆转录和随后的测序的验证，以在核苷酸水平下验证身份。Cas序列可含有核定位序列(NLS)。核定位序列可以来自SV40。NLS可来自以下的至少一种：SV40、核质蛋白、输入蛋白α、C-myc、EGL-13、TUS、BORG、hnRNPA1、Mata2或PY-NLS。NLS可以在Cas蛋白的C末端或N末端上。在一些情况下，Cas蛋白可含有1至5个NLS序列。Cas蛋白可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或至多10个NLS序列。Cas蛋白如Cas9可含有两个NLS序列。Cas蛋白可含有SV40和核质蛋白的NLS序列。Cas蛋白还可含有至少一个非翻译区。
表2酿脓链球菌Cas9(SpCas9)
表3修饰的酿脓链球菌Cas9mRNA
Cas9可指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9)具有至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％的序列同一性和/或序列相似性的多肽。Cas9可指与野生型示例性Cas9多肽(例如，来自酿脓链球菌)具有至多或至多约50％、60％、70％、80％、90％、100％的序列同一性和/或序列相似性的多肽。Cas9可指可包含氨基酸改变如缺失、插入、置换、变体、突变、融合、嵌合或其任意组合的野生型或修饰形式的Cas9蛋白。
可对编码内切核酸酶(例如，Cas蛋白如Cas9)的多核苷酸进行密码子优化以用于在特定细胞如真核细胞中的表达。这种类型的优化可能需要外部来源(例如，重组)DNA的突变，以在编码相同蛋白质的同时模拟预期宿主生物体或细胞的密码子偏好。
可以使用编码包含一个或多个核定位序列(NLS)(诸如多于或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS)的CRISPR酶的载体。例如，CRISPR酶可包含在氨基末端或其附近的多于或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS，在羧基末端或其附近的多于或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个NLS，或这些的任何组合(例如，在氨基末端的一个或多个NLS和在羧基末端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可独立于其他NLS而被选择，使得单个NLS可存在于多于一个拷贝中并且/或者与一个或多个其他NLS组合存在于一个或多个拷贝中。
NLS可为单分或双分的。在一些情况下，与单分NLS不同，双分NLS可具有间隔序列。NLS可来自以下的至少一种：SV40、核质蛋白、输入蛋白α、C-myc、EGL-13、TUS、BORG、hnRNPA1、Mata2或PY-NLS。NLS可位于多肽链内的任何位置，例如，靠近N末端或C末端。例如，NLS可处于沿多肽链从N末端或C末端开始的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个氨基酸或约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个氨基酸内。有时，NLS可处于从N末端或C末端开始的50个氨基酸或更多个氨基酸或者约50个氨基酸或更多个氨基酸，例如，100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个氨基酸内。
内切核酸酶可包含与野生型示例性位点定向多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9)的核酸酶结构域具有至少或至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
虽然酿脓链球菌Cas9(SpCas9)(表2)通常用作CRISPR内切核酸酶以用于基因组工程，但它可能不是每个靶切除位点的最佳内切核酸酶。例如，SpCas9(5’NGG 3’)的PAM序列在整个人类基因组中大量存在，但NGG序列可能无法正确定位以靶向所需基因用于修饰。在一些情况下，不同的内切核酸酶可用于靶向某些基因组靶标。在一些情况下，可以使用具有非NGG PAM序列的合成的SpCas9衍生变体。此外，已经鉴别了来自各种物种的其他Cas9直系同源物，并且这些“非SpCas9”结合也可用于本发明的多种PAM序列。例如，尺寸相对较大的SpCas9(大约4kb编码序列)意味着携带SpCas9cDNA的质粒可能无法在细胞中有效表达。相反，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)的编码序列比SpCas9短大约1千碱基，从而可能允许其在细胞中有效表达。与SpCas9类似，SaCas9内切核酸酶能够在体外修饰哺乳动物细胞中的靶基因以及在体内修饰小鼠中的靶基因。
酿脓链球菌Cas9的替代物可包括在哺乳动物细胞中显示出切割活性的来自Cpf1家族的RNA指导的内切核酸酶。与Cas9核酸酶不同，Cpf1介导的DNA切割的结果为具有短3’突出端的双链断裂。Cpf1的交错切割模式可开启定向基因转移的可能性，类似于传统的限制酶克隆，这可提高基因编辑的效率。与上述Cas9变体和直系同源物一样，Cpf1也可将可由CRISPR靶向的位点数目扩展至缺乏受SpCas9青睐的NGG PAM位点的富含AT的区域或富含AT的基因组。
可将任何功能性浓度的Cas蛋白引入细胞中。例如，可将15微克的Cas mRNA引入细胞中。在其他情况下，可以引入0.5微克至100微克的Cas mRNA。可以引入0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微克的Cas mRNA。
在一些情况下，双切口酶方法可用于引入双链断裂或基因组断裂。Cas蛋白可在核酸酶结构域内的已知氨基酸处突变，从而删除一个核酸酶结构域的活性并生成能够产生单链断裂的切口酶Cas蛋白。切口酶连同靶向相反链的两种不同的指导RNA可用于在靶位点内产生DSB(通常称为“双切口”或“双切口酶”CRISPR系统)。这种方法可显著增加靶标特异性，因为不太可能会在足够接近的距离内产生两个脱靶切口从而引起DSB。
可以在使用前测试核酸酶如Cas9的身份和效力。例如，可以使用分光光度分析、RNA琼脂糖凝胶分析、LC-MS，内毒素分析和无菌测试中的至少一种来确定身份和效力。在一些情况下，身份测试可以确定临床/治疗用途的可接受水平。例如，可接受的分光光度分析结果可以是105±10μL/瓶，1.0±0.1mg/mL。可接受的分光光度分析结果还可以是约90-120±10μL/瓶，1.0±0.1mg/mL或约90-120±10μL/瓶，约0.1至5.0±0.1mg/mL。
在一些情况下，核酸酶如Cas9的UV260/280比率可为约1.0±0.1。UV260-280比率可为约1.0–5.0±0.1。
在一些情况下，核酸酶如Cas9可具有通过RNA琼脂糖凝胶分析测量的完整性/大小。Cas9的大小可为约4500个碱基。Cas9的大小可为约4000至约8000个碱基。Cas9的大小可为约4000至约5000个碱基、约5000至约6000个碱基、约6000至约7000个碱基、约7000至约8000个碱基。在一些情况下，生物分析仪可用于测定核酸酶序列如Cas9的大小。生物分析仪可测定Cas9序列的大小，该大小可为约4000至约5000个碱基、约5000至约6000个碱基、约6000至约7000个碱基、约7000至约8000个碱基。
在一些情况下，可以测定核酸酶如Cas9的内毒素水平。内毒素测试可以是鲎测定。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于3EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于10EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于8EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于5EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于4EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于3EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于2EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于1EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于0.5EU/mL。
在一些情况下，核酸酶如Cas9可经历无菌测试。无菌测试的临床/治疗可接受水平可为0或由培养物上无生长表示。无菌测试的临床/治疗可接受水平可为小于0.5％生长。无菌测试的临床/治疗可接受水平可为小于1％生长。
在一些情况下，可对核酸酶序列如Cas9序列进行测序以确认其身份。例如，可以在产生Cas9mRNA批次之前以约4倍的覆盖度对输入Cas9mRNA转录模板进行测序。可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来评估纯化的体外转录产物，以验证mRNA是Cas9预期的大小，并且临床或治疗产品中不存在其他mRNA种类。在一些情况下，纯化的mRNA将经历通过逆转录酶(RT)介导的逆转录和随后的DNA测序的验证，以在核苷酸水平下验证身份。
在一些情况下，可以通过试运行来测试核酸酶功能的效力。例如，可以测试Cas9在来源于三个独立供体的原代人T细胞中的功能效力。可以以与患者样品相同的方式进行试剂递送。可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过50％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过60％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过65％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过70％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过75％。
II.指导多核酸
指导多核酸可以是DNA或RNA。指导多核酸可以是单链或双链的。在一些情况下，指导多核酸可含有单链区和双链区的区域。指导多核酸还可以形成二级结构。如本文所用的术语“指导RNA(gRNA)”及其语法等同项可指可对靶DNA具有特异性并且可与Cas蛋白形成复合体的RNA。指导RNA可包含指导序列或间隔序列，该序列指定靶位点并将RNA/Cas复合体引导至指定的靶DNA以进行切割。例如，指导RNA可以将CRISPR复合体靶向不同基因并进行靶向双链断裂。靶DNA的位点特异性切割发生在通过以下两者确定的位置：1)指导RNA和靶DNA(也称为前间区序列)之间的碱基配对互补性；和2)靶DNA中被称为前间区序列邻近基序(PAM)的短基序。在一些情况下，可以使用能够识别位于常见表达转录物内的早期外显子中的gRNA的算法来设计gRNA。可以使用评分系统按照脱靶潜力对候选gRNA进行排序，该评分系统可以考虑：(a)gRNA序列与任何紧密匹配的基因组序列之间的错配总数；(b)相对于PAM位点的错配位置，该错配位置与靠近PAM位点的错配对活性的负面影响相关；(c)错配之间的距离，用来说明相邻错配对于破坏指导DNA相互作用的累积效应；及其任何组合。在一些情况下，gRNA与基因组靶位点之间较多的错配可能使得该位点的CRISPR介导的切割的可能性较低。在一些情况下，错配位置与PAM位点直接相邻。在其他情况下，错配位置可以距离PAM位点1个核苷酸至100个千碱基。在一些情况下，包含错配的候选gRNA可能不与PAM相邻。在其他情况下，至少两个包含错配的候选gRNA可以以彼此距离1个核苷酸至100个千碱基的方式结合基因组。错配可以是核苷酸的置换。例如，在一些情况下，G将置换T。gRNA与基因组之间的错配可使CRISPR基因编辑的保真度降低。在一些情况下，正评分gRNA可以长约110个核苷酸，并且可以不含有与互补基因组序列的错配。在其他情况下，正评分gRNA可以长约110个核苷酸，并且可以含有与互补基因组序列的至多3个错配。在其他情况下，正评分gRNA可以长约110个核苷酸，并且可以含有与互补基因组序列的至多20个错配。指导多核酸可与表4中的任何序列具有至少或至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多约100％的序列同一性和/或序列相似性。在一些情况下，指导多核酸可含有核苷酸间连键，该核苷酸间连键可以是硫代磷酸酯。可存在任何数目的硫代磷酸酯。例如，在指导多核酸序列中可存在1至约100个硫代磷酸酯。在一些情况下，存在1至10个硫代磷酸酯。在一些情况下，在指导多核酸序列中存在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个硫代磷酸酯。
表4.靶向PD-1、CTLA-4、AAVS1或CISH基因的修饰的gRNA的序列表。
在一些情况下，可以设计和选择最高评分的gRNA，并且可以通过实验在源自患者的TIL和源自外周血的T细胞中评估每种gRNA的上靶编辑效率。在一些情况下，通过TiDE分析测定的编辑效率可以超过至少约20％。在其他情况下，编辑效率可为约20％至约50％、约50％至约80％、约80％至约100％。在一些情况下，通过TiDE分析测量的编辑效率对于PD-1可为85％，对于CISH可为90％。在一些情况下，可以在GMP试运行中测定插入缺失百分比。例如，可以通过Sanger测序和TIDE分析来分析最终细胞产品的上靶插入缺失形成。可以从来自对照和实验样品的约1x106个细胞中提取基因组DNA，并使其经受使用在已被破坏的基因(如CISH)侧翼的引物进行的PCR。可以使用TIDE软件程序分析Sanger测序色谱图，该程序可以通过比较对照和敲除样品来量化插入缺失频率和插入缺失的大小分布。
本文公开的方法还可包括向细胞或胚胎中引入至少一种指导RNA或核酸，例如，编码至少一种指导RNA的DNA。指导RNA可与RNA指导的内切核酸酶相互作用以将该内切核酸酶引导至特定的靶位点，在该位点处，指导RNA的5’端与染色体序列中的特异性前间区序列进行碱基配对。
指导RNA可包括两种RNA，例如，CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。指导RNA有时可包括通过crRNA和tracrRNA的一部分(例如，功能部分)融合而形成的单指导RNA(sgRNA)。指导RNA还可以是包含crRNA和tracrRNA的双重RNA。指导RNA可包含crRNA而缺乏tracrRNA。此外，crRNA可与靶DNA或前间区序列杂交。
如上文所讨论的，指导RNA可以是表达产物。例如，编码指导RNA的DNA可以是包含编码指导RNA的序列的载体。可通过用分离的指导RNA或质粒DNA(其包含编码指导RNA的序列和启动子)转染细胞或生物体，将指导RNA转移到细胞或生物体中。还可以以其他方式，如使用病毒介导的基因递送将指导RNA转移到细胞或生物体中。
可以分离指导RNA。例如，可以以分离的RNA的形式将指导RNA转染到细胞或生物体中。可通过使用任何体外转录系统的体外转录来制备指导RNA。可以以分离的RNA的形式而不是以包含指导RNA的编码序列的质粒形式将指导RNA转移到细胞中。
指导RNA可包含DNA靶向区段和蛋白结合区段。DNA靶向区段(或DNA靶向序列或间隔序列)包含可与靶DNA内的特定序列(例如，前间区序列)互补的核苷酸序列。蛋白结合区段(或蛋白结合序列)可与位点定向修饰多肽，例如，RNA指导的内切核酸酶如Cas蛋白相互作用。“区段”意指分子的区段/部分/区域，例如，RNA中的连续核苷酸片段。区段也可意指复合体的区域/部分，使得区段可包含多于一种分子的区域。例如，在一些情况下，靶向DNA的RNA的蛋白结合区段是一种RNA分子，因此该蛋白结合区段包含该RNA分子的区域。在其他情况下，靶向DNA的RNA的蛋白结合区段包含沿互补区域杂交的两个独立的分子。
指导RNA可包含两个独立的RNA分子或单个RNA分子。示例性单分子指导RNA包含DNA靶向区段和蛋白结合区段两者。
示例性的靶向两分子DNA的RNA可包含crRNA样(“CRISPR RNA”或“靶向物-RNA”或“crRNA”或“crRNA重复序列”)分子和相应的tracrRNA样(“反式作用CRISPR RNA”或“激活因子-RNA”或“tracrRNA”)分子。第一RNA分子可以是可包含DNA靶向区段(例如，间隔区)和一段核苷酸的crRNA样分子(靶向物-RNA)，该段核苷酸可形成包含指导RNA的蛋白结合区段的双链RNA(dsRNA)双链体的一半。第二RNA分子可以是可包含一段核苷酸的相应的tracrRNA样分子(激活因子-RNA)，该段核苷酸可形成指导RNA的蛋白结合区段的dsRNA双链体的另一半。换言之，crRNA样分子的一段核苷酸可与tracrRNA样分子的一段核苷酸互补并杂交，以形成指导RNA的蛋白结合域的dsRNA双链体。如此，可以说每个crRNA样分子都具有相应的tracrRNA样分子。crRNA样分子可额外提供单链DNA靶向区段或间隔序列。因此，crRNA样分子和tracrRNA样分子(作为相应的配对)可杂交形成指导RNA。主题两分子指导RNA可包含任何相应的crRNA和tracrRNA对。
指导RNA的DNA靶向区段或间隔序列可与染色体序列中靶位点处的序列(例如，前间区序列)互补，使得指导RNA的DNA靶向区段可与该靶位点或前间区序列进行碱基配对。在一些情况下，指导RNA的DNA靶向区段可包含或包含约10个核苷酸至或至约25个核苷酸或更多个核苷酸。例如，指导RNA的第一区域与染色体序列中的靶位点之间的碱基配对区域可以为或可以为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25个或多于25个核苷酸的长度。有时，指导RNA的第一区域可以为或可以为约19、20或21个核苷酸的长度。
指导RNA可靶向20个核苷酸或约20个核苷酸的核酸序列。靶核酸可少于或少于约20个核苷酸。靶核酸可以是至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可以是至多或至多约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可以是紧邻PAM的第一个核苷酸的5’的20个碱基或约20个碱基。指导RNA可靶向核酸序列。指导多核酸如指导RNA可以结合至与表5或表6中的任何序列具有至少或至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多约100％序列同一性和/或序列相似性的基因组序列。在一些情况下，指导多核酸如指导RNA可以结合距离PAM约1个碱基对至约20个碱基对的基因组区域。指导物可以结合距离PAM约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至多约20个碱基对的基因组区域。
表5工程化的CISH指导RNA(gRNA)靶序列
SEQ ID gRNA No. 外显子 靶标5’-3’
70 1 2 TTGCTGGCTGTGGAGCGGAC
71 2 2 GACTGGCTTGGGCAGTTCCA
72 3 2 TGCTGGGGCCTTCCTCGAGG
73 4 2 CCGAAGGTAGGAGAAGGTCT
74 5 2 ATGCACAGCAGATCCTCCTC
75 6 2 AGAGAGTGAGCCAAAGGTGC
76 1 3 GGCATACTCAATGCGTACAT
77 2 3 GGGTTCCATTACGGCCAGCG
78 3 3 AAGGCTGACCACATCCGGAA
79 4 3 TGCCGACTCCAGCTTCCGTC
80 5 3 CTGTCAGTGAAAACCACTCG
81 6 3 CGTACTAAGAACGTGCCTTC
工程化gRNA靶向的基因组序列在表5和表6中示出。图22示出了靶向CISH基因的修饰的gRNA。
表6 AAVS1gRNA靶序列
SEQ ID 基因 gRNA序列(5’至3’)
82 AAVS1 GTCACCAATCCTGTCCCTAG-
指导核酸，例如，指导RNA可指可与另一核酸(例如，细胞基因组中的靶核酸或前间区序列)杂交的核酸。指导核酸可以是RNA。指导核酸可以是DNA。指导核酸可被编程为或设计成以位点特异性方式与核酸序列结合。指导核酸可包含一条多核苷酸链，并且可被称为单指导核酸。指导核酸可包含两条多核苷酸链，并且可被称为双指导核酸。
指导核酸可包含一种或多种修饰，从而为核酸提供新的或增强的特征。指导核酸可包含核酸亲和标签。指导核酸可包含合成的核苷酸、合成的核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。
指导核酸可包含可与靶核酸中的序列(例如，前间区序列)杂交、例如位于5’端或3’端或其附近的核苷酸序列(例如，间隔区)。指导核酸的间隔区可通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。间隔序列可与位于前间区序列邻近基序(PAM)的5’或3’侧的靶核酸杂交。间隔序列的长度可以是至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。间隔序列的长度可以是至多或至多约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。
指导RNA还可包含形成二级结构的dsRNA双链体区域。例如，由指导RNA形成的二级结构可包括茎(或发夹)和环。环和茎的长度可以变化。例如，环可以在约3至约10个核苷酸长度的范围内，而茎可以在约6至约20个碱基对长度的范围内。茎可包含一个或多个1至约10个核苷酸的凸起。第二区域的总长度可以在约16至约60个核苷酸长度的范围内。例如，环可以为或可以为约4个核苷酸的长度，而茎可以为或可以为约12个碱基对。dsRNA双链体区域可包含可与RNA结合蛋白如RNA指导的内切核酸酶，例如Cas蛋白形成复合体的蛋白结合区段。
指导RNA还可包含可以是基本上单链、位于5’或3’端的尾区。例如，尾区有时不与感兴趣的细胞中的任何染色体序列互补，并且有时不与指导RNA的其余部分互补。此外，尾区的长度可以变化。尾区可以为多于或多于约4个核苷酸的长度。例如，尾区的长度可以在或在约5至或至约60个核苷酸长度的范围内。
指导RNA可作为RNA分子而引入细胞或胚胎中。例如，RNA分子可在体外转录并且/或者可以化学合成。然后指导RNA可作为RNA分子引入细胞或胚胎中。指导RNA也可以以非RNA核酸分子，例如DNA分子的形式引入细胞或胚胎中。例如，编码指导RNA的DNA可以与启动子控制序列可操作地连接，以用于在感兴趣的细胞或胚胎中表达指导RNA。RNA编码序列可以与被RNA聚合酶III(Pol III)识别的启动子序列可操作地连接。
编码指导RNA的DNA分子还可以是线性的。编码指导RNA的DNA分子还可以是环形的。编码指导RNA的DNA序列也可以是载体的一部分。载体的一些实例可包括质粒载体、噬菌粒、粘粒、人工/微型染色体、转座子和病毒载体。例如，编码RNA指导的内切核酸酶的DNA存在于质粒载体中。合适的质粒载体的其他非限制性实例包括pUC、pBR322、pET、pBluescript及其变体。此外，载体可包含另外的表达控制序列(例如，增强子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择性标记序列(例如，抗生素抗性基因)、复制起点等。
当RNA指导的内切核酸酶和指导RNA两者均作为DNA分子被引入细胞中时，每一种可以是不同分子的一部分(例如，含有融合蛋白编码序列的一个载体和含有指导RNA编码序列的第二载体)，或两者可以是相同分子的一部分(例如，含有融合蛋白和指导RNA两者的编码(和调控)序列的一个载体)。
Cas蛋白如Cas9蛋白或其任何衍生物可与指导RNA预先复合，以形成核糖核蛋白(RNP)复合体。RNP复合体可引入原代免疫细胞中。可以定时引入RNP复合体。可在细胞周期的G1、S和/或M期使细胞与其他细胞同步。可在细胞阶段递送RNP复合体，使HDR得以增强。RNP复合体可促进同源性指导的修复。
还可对指导RNA进行修饰。该修饰可包括化学改变、合成修饰、核苷酸添加和/或核苷酸减少。该修饰还可增强CRISPR基因组工程。修饰可改变gRNA的手性。在一些情况下，手性在修饰后可以是一致的或立体纯的(stereopure)。可以合成指导RNA。合成的指导RNA可增强CRISPR基因组工程。还可将指导RNA截短。截短可用于减少不期望的脱靶(off-target)诱变。截短可包含任何数目的核苷酸缺失。例如，截短可包括1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸。指导RNA可包含任何长度的靶互补性区域。例如，靶互补性区域可以为少于20个核苷酸的长度。靶互补性区域可以为多于20个核苷酸的长度。靶互补性区域可以靶向与PAM序列直接相邻的约5bp至约20bp。靶互补性区域可以靶向与PAM序列直接相邻的约13bp。
在一些情况下，可以通过试运行来测试指导多核酸的效力。例如，可以测试指导多核酸在来源于三个独立供体的原代人T细胞中的功能效力。可以以与患者样品相同的方式进行试剂递送。可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过50％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过60％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过65％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过70％。在一些情况下，可以通过对靶基因组基因座进行测序来确定效力，并且在每个供体中的插入缺失频率可以达到或超过75％。
可以使用任何手段将CRISPR系统引入一个细胞或多个细胞中。在一些情况下，可以通过电穿孔或核转染引入CRISPR系统。例如，可使用转染系统(ThermoFisherScientific)进行电穿孔，或者还可使用Nucleofector(Biosystems)将核酸递送到细胞中。可以调整电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞活力。电穿孔设备可具有多种电波形式的脉冲设置，如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型具有独特的最佳场强(E)，该最佳场强取决于施加的脉冲参数(例如，电压、电容和电阻)。最佳场强的施加通过诱导跨膜电压引起电渗透，从而使核酸穿过细胞膜。在一些情况下，可以调整电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲数目、细胞密度和尖端类型以优化转染效率和/或细胞活力。
在一些情况下，可以使用Neon转染系统。Neon系统可以是三组件电穿孔装置，其包括中央控制模块，可通过3英尺长的电线连接到中央控制模块的电穿孔室，以及专用移液器。在一些情况下，专用移液器可以配备有可更换和/或一次性的无菌尖端。在一些情况下，电穿孔室可以配备有可更换和/或一次性的无菌电穿孔比色杯。在一些情况下，由系统(例如Neon系统)的制造商提供的标准电穿孔缓冲液可以用符合GMP的溶液或缓冲液代替。在一些情况下，标准电穿孔缓冲液可以用GMP级磷酸缓冲盐水(PBS)代替。在开始样品电穿孔之前，可以在控制模块上执行自诊断系统检查，以确保Neon系统正确运行。在一些情况下，转染可以在cGMP设施的10,000级洁净室内的1,000级生物安全柜中进行。经培训的医疗技术人员可以在整个制造过程中使用无菌技术，并且最后可以测试产品的无菌性。
在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲电压以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔电压可小于约500伏。在一些情况下，电穿孔电压可以为至少约500伏、至少约600伏、至少约700伏、至少约800伏、至少约900伏、至少约1000伏、至少约1100伏、至少约1200伏、至少约1300伏、至少约1400伏、至少约1500伏、至少约1600伏、至少约1700伏、至少约1800伏、至少约1900伏、至少约2000伏、至少约2100伏、至少约2200伏、至少约2300伏、至少约2400伏、至少约2500伏、至少约2600伏、至少约2700伏、至少约2800伏、至少约2900伏或至少约3000伏。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲电压可以是对细胞类型特异的。例如，1900伏的电穿孔电压对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，约1350伏的电穿孔电压对于Jurkat细胞或原代人类细胞如T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔电压对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，约1000伏至约1300伏的电穿孔电压对于人578T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。
在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲宽度以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔脉冲宽度可小于约5毫秒。在一些情况下，电穿孔宽度可以为至少约5毫秒、至少约6毫秒、至少约7毫秒、至少约8毫秒、至少约9毫秒、至少约10毫秒、至少约11毫秒、至少约12毫秒、至少约13毫秒、至少约14毫秒、至少约15毫秒、至少约16毫秒、至少约17毫秒、至少约18毫秒、至少约19毫秒、至少约20毫秒、至少约21毫秒、至少约22毫秒、至少约23毫秒、至少约24毫秒、至少约25毫秒、至少约26毫秒、至少约27毫秒、至少约28毫秒、至少约29毫秒、至少约30毫秒、至少约31毫秒、至少约32毫秒、至少约33毫秒、至少约34毫秒、至少约35毫秒、至少约36毫秒、至少约37毫秒、至少约38毫秒、至少约39毫秒、至少约40毫秒、至少约41毫秒、至少约42毫秒、至少约43毫秒、至少约44毫秒、至少约45毫秒、至少约46毫秒、至少约47毫秒、至少约48毫秒、至少约49毫秒或至少约50毫秒。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲宽度可以是对细胞类型特异的。例如，30毫秒的电穿孔脉冲宽度对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，约10毫秒的电穿孔宽度对于Jurkat细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔宽度对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，约20毫秒至约30毫秒的电穿孔宽度对于人578T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。
在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲的数目以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔可包括单个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包括多于一个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包括2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲或10个或更多个脉冲。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔脉冲的数目可以是对细胞类型特异的。例如，具有单个脉冲的电穿孔对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，具有3个脉冲的电穿孔对于原代细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔宽度对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，具有约1个至约3个脉冲的电穿孔对于人类细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。用本文所述的任何核酸递送平台(例如，核转染或电穿孔)对细胞进行基因组破坏的效率可以是或可以是约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或超过99.9％。
在一些情况下，可以改变电穿孔的起始细胞密度以优化转染效率和/或细胞活力。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可小于约1x105个细胞。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可以为至少约1x105个细胞、至少约2x105个细胞、至少约3x105个细胞、至少约4x105个细胞、至少约5x105个细胞、至少约6x105个细胞、至少约7x105个细胞、至少约8x105个细胞、至少约9x105个细胞、至少约1x106个细胞、至少约1.5x106个细胞、至少约2x106个细胞、至少约2.5x106个细胞、至少约3x106个细胞、至少约3.5x106个细胞、至少约4x106个细胞、至少约4.5x106个细胞、至少约5x106个细胞、至少约5.5x106个细胞、至少约6x106个细胞、至少约6.5x106个细胞、至少约7x106个细胞、至少约7.5x106个细胞、至少约8x106个细胞、至少约8.5x106个细胞、至少约9x106个细胞、至少约9.5x106个细胞、至少约1x107个细胞、至少约1.2x107个细胞、至少约1.4x107个细胞、至少约1.6x107个细胞、至少约1.8x107个细胞、至少约2x107个细胞、至少约2.2x107个细胞、至少约2.4x107个细胞、至少约2.6x107个细胞、至少约2.8x107个细胞、至少约3x107个细胞、至少约3.2x107个细胞、至少约3.4x107个细胞、至少约3.6x107个细胞、至少约3.8x107个细胞、至少约4x107个细胞、至少约4.2x107个细胞、至少约4.4x107个细胞、至少约4.6x107个细胞、至少约4.8x107个细胞或至少约5x107个细胞。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞活力所需的电穿孔的起始细胞密度可以是对细胞类型特异的。例如，1.5x106个细胞的电穿孔起始细胞密度对于巨噬细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在另一个实例中，5x106个细胞的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。在一些情况下，一定范围的电穿孔起始细胞密度对于给定的细胞类型可能是最佳的。例如，5.6x106至5x107个细胞的电穿孔起始细胞密度对于人类细胞如T细胞可能是最佳的(例如，提供最高的活力和/或转染效率)。
在一些情况下，可以进行GUIDE-Seq分析以确定工程化指导RNA的特异性。在Tsai,S.等人,“GUIDE-Seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage byCRISPR system nucleases,”Nature,33:187-197(2015)中讨论了通过CRISPR系统核酸酶进行的脱靶切割的GUIDE-Seq谱分析的一般机制和方案。为了通过下一代测序评估脱靶频率，可以用Cas9mRNA和指导RNA(例如抗CISH gRNA)转染人原代T细胞。可以在转染后约72小时从转染的细胞中分离基因组DNA，并在潜在的脱靶位点进行PCR扩增。可以使用WellcomeTrust Sanger Insisute Genome Editing数据库(WGE)算法预测潜在的脱靶位点。可以基于与上靶位点的序列同源性来选择候选脱靶位点。在一些情况下，可以利用gRNA与基因组靶位点之间具有约4个或更少错配的位点。对于每个候选脱靶位点，可以设计两个引物对。PCR扩增子可以从未经处理的细胞(对照)和Cas9/gRNA处理的细胞中获得。可以合并PCR扩增子。可以使用TruSeq Nano DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备NGS文库。可以使用250bp配对端工作流程在Illumina HiSeq机器上分析样品。在一些情况下，可以获得每个gRNA文库大约4千万个可映射的NGS读数。这可以相当于针对gRNA的每个候选脱靶位点的约450,000个读数的平均数。在一些情况下，在基因组基因座处，CRISPR介导的破坏的检测可以处于低至1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的频率。
可使用计算预测来选择对于靶基因(例如PD-1和/或CISH功能性破坏)可能是最安全选择的候选gRNA。然后可以使用通过潜在脱靶位点的计算预测引导的聚焦方法根据经验测试候选gRNA。在一些情况下，gRNA脱靶安全性的评估可以采用下一代深度测序方法来分析通过针对每种gRNA的CRISPR设计工具预测的潜在脱靶位点。在一些情况下，可以选择与基因组中的任何序列具有少于3个错配的gRNA(而不是完美匹配预期靶标的gRNA)。在一些情况下，可以选择与基因组中的任何序列具有少于50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个错配的gRNA。在一些情况下，计算机系统或软件可用于通过预测低脱靶可能性来提供候选gRNA的推荐。
在一些情况下，可以用以下方法中的至少一种来鉴别潜在的脱靶位点：GUIDE-Seq和靶向PCR扩增，以及下一代测序。此外，经修饰的细胞(例如Cas9/gRNA处理的细胞)可以经受核型分析以鉴别任何染色体重排或易位。
gRNA可以以任何功能浓度引入。例如，gRNA可以以10微克引入细胞。在其他情况下，gRNA可以以0.5微克至100微克引入。gRNA可以以0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微克引入。
本文公开了一种制备工程化TIL细胞的方法，该方法包括：引入包含至少一种修饰的至少一种指导RNA(gRNA)；以及引入至少一种内切核酸酶；其中所述gRNA包含与至少一个内源基因组互补的至少一种序列。在一些情况下，修饰在5’端、3’端、5’端至3’端，为单碱基修饰、2’-核糖修饰或其任意组合。修饰可选自碱基置换、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化及其任意组合。
在一些情况下，修饰为化学修饰。修饰可选自5’腺苷酸、5’鸟苷-三磷酸帽、5’N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5’三磷酸帽、3’磷酸、3’硫代磷酸、5’磷酸、5’硫代磷酸、Cis-Syn型胸苷二聚体、三聚体、C12间隔区、C3间隔区、C6间隔区、d间隔区、PC间隔区、r间隔区、间隔区18、间隔区9、3’-3’修饰、5’-5’修饰、脱碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3’DABCYL、黑洞猝灭剂(black hole quencher)1、黑洞猝灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2’脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2’脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2’-0-甲基核糖核苷类似物、糖修饰的类似物、摆动性/通用碱基、荧光染料标记、2’氟代RNA、2’O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、3硫代磷酸2-O-甲酯或其任意组合。
可对如本文所述的多核酸进行修饰。修饰可在多核酸的任何位置进行。可对单个多核酸进行多于一种修饰。多核酸可在修饰后经历质量控制。在一些情况下，质量控制可包括PAGE、HPLC、MS或其任意组合。修饰可以是置换、插入、缺失、化学修饰、物理修饰、稳定化、纯化或其任意组合。还可通过以下部分对多核酸进行修饰：5’腺苷酸、5’鸟苷-三磷酸帽、5’N7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5’三磷酸帽、3’磷酸、3’硫代磷酸、5’磷酸、5’硫代磷酸、Cis-Syn型胸苷二聚体、三聚体、C12间隔区、C3间隔区、C6间隔区、d间隔区、PC间隔区、r间隔区、间隔区18、间隔区9、3’-3’修饰、5’-5’修饰、脱碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素BB、生物素TEG、胆固醇TEG、脱硫生物素TEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-生物素、双生物素、PC生物素、补骨脂素C2、补骨脂素C6、TINA、3’DABCYL、黑洞猝灭剂1、黑洞猝灭剂2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、羧基接头、硫醇接头、2’脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2’脱氧核糖核苷类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2’-0-甲基核糖核苷类似物、糖修饰的类似物、摆动性/通用碱基、荧光染料标记、2’氟代RNA、2’O-甲基RNA、甲基膦酸酯、磷酸二酯DNA、磷酸二酯RNA、硫代磷酸酯DNA、硫代磷酸酯RNA、UNA、假尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸或其任意组合。代表性2’O-甲基RNA修饰的gRNA在图22中示出。在一些情况下，修饰可能是永久的。在一些情况下，修饰可能是暂时的。在一些情况下，对多核酸进行多种修饰。多核酸修饰可改变核苷酸的物理化学性质，如其构象、极性、疏水性、化学反应性、碱基配对相互作用或其任意组合。
修饰也可以是硫代磷酸酯置换。在一些情况下，天然磷酸二酯键可易于被细胞核酸酶迅速降解；并且使用硫代磷酸酯(PS)键置换进行的核苷酸间连键的修饰可以对由细胞降解导致的水解更稳定。修饰可增加多核酸的稳定性。修饰还可增强生物学活性。在一些情况下，硫代磷酸酯增强的RNA多核酸可抑制RNA酶A、RNA酶T1、小牛血清核酸酶或其任意组合。这些性质可允许将PS-RNA多核酸用于在体内或体外高概率暴露于核酸酶的应用中。例如，可在多核酸5’端或3’端的最后3-5个核苷酸之间引入硫代磷酸酯(PS)键，这可抑制外切核酸酶降解。在一些情况下，可将硫代磷酸酯键添加至整个多核酸以减少内切核酸酶的攻击。
在一些情况下，可对修饰进行筛选。筛选可包括但不限于测试免疫原性、测试毒性、测试转录效率、测试翻译效率或其任意组合。在一些情况下，修饰可以不是免疫原性的。修饰可以不是毒性的。在一些情况下，候选修饰在并入多核酸之前进行筛选。在其他情况下，对具有不同修饰的多核酸进行筛选，以确定所添加修饰的免疫原性、毒性、功效的水平或任意组合。在一些情况下，针对修饰支持多核酸逆转录的能力进行筛选。在一些情况下，修饰为假尿苷-5’-三磷酸(参见例如，图32)。在其他情况下，修饰为5-甲基胞苷-5’-三磷酸(参见例如，图32)。修饰还可包括手性的改变。
可通过多种方法，例如，通过自动化固相合成来组装指导多核酸。可以使用标准固相DNA/RNA合成来构建多核酸。还可使用合成程序构建多核酸。还可手动或以全自动方式合成多核酸。在一些情况下，合成程序可包括可首先将5′-羟基寡核苷酸转化成相应的5′-H-膦酸酯单酯，随后在咪唑存在的情况下氧化成活化的5′-磷酰咪唑烷酸酯(5’-phosphorimidazolidate)，以及最后在固体支持体上与焦磷酸酯反应。该程序可包括合成后的纯化步骤，如PAGE、HPLC、MS或其任意组合。
在一些情况下，修饰为3硫代磷酸2-O-甲酯添加，表示为“m”。硫代磷酸酯骨架可表示为“(ps)”。可对1个碱基至150个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。可对1个碱基至4个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。可对2个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。可对4个碱基进行3硫代磷酸2-O-甲酯添加。修饰也可以是截短。截短可以是5个碱基的截短。在一些情况下，修饰可以在C末端和N末端核苷酸处，例如：5’[mG](ps)[mG](ps)[mG](ps)[mU](ps)UCCAU UAC GGC CAG CGG UUU UAG AGC UAG AAA UAG CAA GUU AAA AUA AGG CUA GUC CGUUAU CAA CUU GAA AAA GUG GCA CCG AGU CGG UG[mC](ps)[mU](ps)[mU](ps)[mU](ps)U3’。
指导多核酸可具有任何碱基频率。例如，指导多核酸可具有29个A、17个C、23个G、23个U、3个mG、1个mC和4个mU。指导多核酸可具有任何比率的核苷酸碱基。例如，指导多核酸可具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的腺嘌呤百分比。指导多核酸可具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的胞嘧啶百分比。指导多核酸可具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的胸腺嘧啶百分比。指导多核酸可具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的鸟嘌呤百分比。指导多核酸可具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1-5％、3-8％、5-12％、10-15％、8-20％、15-25％、20-30％、25-35％或至多约30-40％的尿嘧啶百分比。指导多核酸可具有约1至约100个核苷酸。指导多核酸可具有约1至30个的单个多核苷酸。指导多核酸可具有约1至10、10至20或20至30个的单个多核苷酸。
可以在使用前测试指导多核酸(guiding polynucleic acid)(也称为指导多核酸(guide polynucleic acid))的身份和效力。例如，可以使用分光光度分析、RNA琼脂糖凝胶分析、LC-MS，内毒素分析和无菌测试中的至少一种来确定身份和效力。在一些情况下，身份测试可以确定临床/治疗用途的可接受水平。例如，可接受的分光光度分析结果可以是14±2μL/瓶，5.0±0.5mg/mL。可接受的分光光度分析结果还可以是约10-20±2μL/瓶，5.0±0.5mg/mL或约10-20±2μL/瓶，约3.0至7.0±0.5mg/mL。指导多核酸的可接受的临床/治疗大小可为约100个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约5个碱基至约150个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约20个碱基至约150个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约40个碱基至约150个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约60个碱基至约150个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约80个碱基至约150个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约100个碱基至约150个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约110个碱基至约150个碱基。指导多核酸的临床/治疗大小可为约120个碱基至约150个碱基。
在一些情况下，可以测定指导多核酸的质量。可通过LC-MS分析测定质量。质量可为约32,461.0amu。指导多核酸可具有约330,000amu至约50,000amu的质量。指导多核酸可具有约30,000amu至40,000amu、约40,000amu至约50,000amu的质量。质量可以是指导多核酸的钠盐。
在一些情况下，可以测定指导多核酸的内毒素水平。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于3EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于10EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于8EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于5EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于4EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于3EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于2EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于1EU/mL。内毒素的临床/治疗可接受水平可小于0.5EU/mL。
在一些情况下，指导多核酸可经历无菌测试。无菌测试的临床/治疗可接受水平可为0或由培养物上无生长表示。无菌测试的临床/治疗可接受水平可为小于0.5％生长。无菌测试的临床/治疗可接受水平可为小于1％生长。
治疗方案
本文公开了可用于治疗方案的细胞。例如，受试者可以接受工程化细胞作为治疗癌症或疾病的治疗方案的一部分。举一些例子，治疗方案可包括：手术、化疗、放疗、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗生素或止吐药。在一些情况下，细胞组合物可以与骨髓移植，使用化学治疗剂如氟达拉滨、外线束放疗(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH进行的T细胞消融疗法联合(例如，在该疗法之前、同时或之后)向受试者施用。在一些情况下，可以在手术之前或之后施用扩增的细胞。在一些情况下，手术可以是肿瘤切除术。可以进行手术以分离TIL。
通过正在进行中的本申请，技术人员可以确定用于施用的细胞的治疗有效量。在一些情况下，向受试者施用约5x1010个细胞。在一些情况下，约5x1010个细胞表示施用于受试者的细胞的中值量。在一些实施方案中，约5x1010个细胞对于引起受试者中的治疗反应是必需的。在一些实施方案中，向受试者施用至少约1x106个细胞、至少约2x106个细胞、至少约3x106个细胞、至少约4x106个细胞、至少约5x106个细胞、至少约6x106个细胞、至少约6x106个细胞、至少约8x106个细胞、至少约9x106个细胞、1x107个细胞、至少约2x107个细胞、至少约3x107个细胞、至少约4x107个细胞、至少约5x107个细胞、至少约6x107个细胞、至少约6x107个细胞、至少约8x107个细胞、至少约9x107个细胞、至少约1x108个细胞、至少约2x108个细胞、至少约3x108个细胞、至少约4x108个细胞、至少约5x108个细胞、至少约6x108个细胞、至少约6x108个细胞、至少约8x108个细胞、至少约9x108个细胞、至少约1x109个细胞、至少约2x109个细胞、至少约3x109个细胞、至少约4x109个细胞、至少约5x109个细胞、至少约6x109个细胞、至少约6x109个细胞、至少约8x109个细胞、至少约9x109个细胞、至少约1x1010个细胞、至少约2x1010个细胞、至少约3x1010个细胞、至少约4x1010个细胞、至少约5x1010个细胞、至少约6x1010个细胞、至少约6x1010个细胞、至少约8x1010个细胞、至少约9x1010个细胞、至少约1x1011个细胞、至少约2x1011个细胞、至少约3x1011个细胞、至少约4x1011个细胞、至少约5x1011个细胞、至少约6x1011个细胞、至少约6x1011个细胞、至少约8x1011个细胞、至少约9x1011个细胞或至少约1x1012个细胞。例如，可以向受试者施用约5x1010个细胞。在另一个实例中，以3x106个细胞开始，该细胞可以扩增至约5x1010个细胞，并向受试者施用。在一些情况下，将细胞扩增至足够的数目以用于治疗。例如，5x107个细胞可经历快速扩增以生成足够的数目用于治疗用途。在一些情况下，用于治疗用途的足够数目可以是5x1010个。任何数目的细胞均可被输注用于治疗用途。例如，可向患者输注1x106至5x1012(包括两端值)数目的细胞。可向患者输注可为他们生成的尽可能多的细胞。在一些情况下，输注到患者中的细胞并不全是工程化的。例如，至少90％的输注到患者中的细胞可以是工程化的。在其他情况下，至少40％的输注到患者中的细胞可以是工程化的。在患者中达到治疗有效所必需的细胞的量可根据细胞的活力和细胞被遗传修饰的效率而变化。在一些情况下，遗传修饰后细胞活力的乘积(例如，乘法)可对应于可用来施用于受试者的细胞的治疗性部分(therapeutic aliquot)。在一些情况下，遗传修饰后细胞活力的增加可对应于在患者中施用达到治疗有效所必需的细胞量的减少。
在一些情况下，方法可以包括计算和/或向受试者施用在受试者中实现治疗反应所必需的工程化细胞的量。在一些实施方案中，计算实现治疗反应所必需的工程化细胞的量包括测定工程化细胞的活力。在一些实施方案中，为了在受试者中实现治疗反应，施用于受试者的细胞是活细胞。在一些实施方案中，为了在受试者中实现治疗反应，至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，为了在受试者中实现治疗反应，至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％的细胞在细胞基因组中具有一个或多个被破坏的内源基因或其部分。
在一些情况下，可以通过定量PCR(qPCR)监测过继移植细胞。过继移植细胞的qPCR测定可以指示在引入后存在于受试者中的修饰细胞水平。在一些情况下，可以使用流式细胞术监测过继转移细胞。例如，流式细胞术测定可以确定4-1BB相对于TCR的水平。在一些情况下，可以进行单细胞TCR PCR。可以在输注后第40天确定过继转移细胞的水平。可以在输注后第5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195天或至多第200天鉴别过继转移细胞如修饰细胞的水平。
I.免疫刺激剂
在一些情况下，可将免疫刺激剂引入细胞或受试者。免疫刺激剂可以是特异性的或非特异性的。特异性免疫刺激剂可以提供抗原特异性，例如疫苗或抗原。非特异性免疫刺激剂可以增强免疫应答或刺激免疫应答。非特异性免疫刺激剂可以是佐剂。免疫刺激剂可以是疫苗、集落刺激剂、干扰素、白介素、病毒、抗原、共刺激剂、免疫原性剂、免疫调节剂或免疫治疗剂。免疫刺激剂可以是细胞因子如白介素。一种或多种细胞因子可与本发明的细胞一起引入。细胞因子可用来促进细胞毒性T淋巴细胞(包括过继转移的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞)在肿瘤微环境内扩增。在一些情况下，IL-2可用于促进本文所述细胞的扩增。还可使用细胞因子如IL-15。还可使用免疫疗法领域中的其他相关细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或其任意组合。在一些情况下，使用IL-2、IL-7和IL-15来培养本发明的细胞。白介素可以是IL-2或阿地白介素。阿地白介素可以以低剂量或高剂量施用。高剂量阿地白介素方案可包括每8小时静脉内施用阿地白介素，如耐受，持续至多约14个约0.037mg/kg(600,000IU/kg)的剂量。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以在细胞施用后24小时内施用。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以每8小时以经15分钟输注的方式施用，持续细胞输注后至多约4天。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以以约100,000IU/kg、200,000IU/kg、300,000IU/kg、400,000IU/kg、500,000IU/kg、600,000IU/kg、700,000IU/kg、800,000IU/kg、900,000IU/kg或至多约1,000,000IU/kg的剂量施用。在一些情况下，阿地白介素可以以约100,000IU/kg至300,000IU/kg、300,000IU/kg至500,000IU/kg、500,000IU/kg至700,000IU/kg、700,000IU/kg至约1,000,000IU/kg的剂量施用。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以施用1个剂量至约14个剂量。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以施用至少约1个剂量、2个剂量、3个剂量、4个剂量、5个剂量、6个剂量、7个剂量、8个剂量、9个剂量、10个剂量、11个剂量、12个剂量、13个剂量、14个剂量、15个剂量、16个剂量、17个剂量、18个剂量、19个剂量或至多约20个剂量。在一些情况下，免疫刺激剂如阿地白介素可以施用约1个剂量至3个剂量、3个剂量至5个剂量、5个剂量至8个剂量、8个剂量至10个剂量、10个剂量至14个剂量、14个剂量至20个剂量。在一些情况下，阿地白介素可以施用超过20个剂量。在一些情况下，免疫刺激剂如阿地白介素可以与细胞施用顺序或同时施用。例如，免疫刺激剂可以在约第-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天或直到约第14天施用。在一些情况下，免疫刺激剂如阿地白介素在施用细胞群体后约第0天至第4天施用。在一些情况下，免疫刺激剂(例如，阿地白介素)在约10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时或至多约3小时的时间段内施用。在一些情况下，免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以在施用工程化细胞之前约24小时至施用工程化细胞后约4天施用。免疫刺激剂(例如，阿地白介素)可以在施用工程化细胞后第-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19天或至多约20天施用。
免疫刺激剂如阿地白介素可以作为一次性使用小瓶提供，该小瓶含有作为无菌、白色至米白色冻干饼的2200万IU(-1.3mg)IL-2，加上50mg甘露醇和0.18mg十二烷基硫酸钠，用约0.17mg磷酸二氢钠和0.89mg磷酸氢二钠缓冲至pH值为7.5(范围为7.2至7.8)。小瓶可以用1.2mL无菌注射用水(USP)重构，所得浓度为1800万IU/ml或1.1mg/mL。稀释剂应对准小瓶的侧面，以避免过度起泡。由于小瓶不含防腐剂，因此应在24小时内使用重构溶液。重构的阿地白介素可以用50mL的5％人血清白蛋白(HSA)进一步稀释。在添加RIL-2之前，应将HSA添加至稀释剂中。在玻璃瓶或聚氯乙烯袋中，重构溶液的超过1000倍(即，1mg/mL至1mcg/mL)的稀释度是可接受的。阿地白介素在冷藏温度和室温(2°–30℃)下化学稳定48小时。阿地白介素的施用可以基于总体重来计算。阿地白介素的最终稀释液可以经15分钟输注。
在一些情况下，免疫刺激剂是集落刺激因子。集落刺激因子可以是G-CSF(非格司亭)。非格司亭可以储存在300mcg/ml和480ug/1.6ml的小瓶中。非格司亭可以以皮下注射的方式每日施用。非格司亭施用可以为约5mcg/kg/天。非格司亭施用可以为约1mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约2mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约3mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约4mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约5mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约6mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约7mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约8mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约9mcg/kg/天，非格司亭施用可以为约10mcg/kg/天。在一些情况下，非格司亭可以以约0.5mcg/kg/天至约1.0mcg/kg/天、约1.0mcg/kg/天至1.5mcg/kg/天、约1.5mcg/kg/天至约2.0mcg/kg/天、约2.0mcg/kg/天至约3.0mcg/kg/天、约2.5mcg/kg/天至约3.5mcg/kg/天、约3.5mcg/kg/天至约4.0mcg/kg/天、约4.0mcg/kg/天至约4.5mcg/kg/天的剂量施用。可以每日持续施用非格司亭，直至嗜中性粒细胞计数为至少约1.0x109/L X 3天或至少约5.0x109/L。免疫刺激剂如阿地白介素可以在施用工程化细胞后第-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19天或至多约第20天施用。
II.化疗剂
化疗剂或化疗化合物可以是用于治疗癌症的化学化合物。可与所公开的T细胞组合使用的化疗癌症药剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些抑制剂包括长春新碱、长春花碱、长春地辛和NavelbineTM(长春瑞滨，5’-去甲脱水长春碱(5’-noranhydroblastine))。在其他情况下，化疗癌症药剂包括拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物。如本文所用的，“喜树碱化合物”包括CamptosarTM(盐酸伊立替康)、HycamtinTM(盐酸拓扑替康)和其他衍生自喜树碱及其类似物的化合物。可用于本文公开的方法和组合物的另一类化疗癌症药剂是鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷、替尼泊苷和米托鬼臼肼。本公开内容进一步涵盖称为烷化剂的其他化疗癌症药剂，该药剂使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。这些癌症药剂包括但不限于顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、洛莫司汀(beusterine)、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪。本公开内容涵盖作为化疗剂的抗代谢物。这些类型的药剂的实例包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼(procarbazine)。可用于本文公开的方法和组合物的另一类化疗癌症药剂包括抗生素。实例包括但不限于多柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素(daunorubicin)、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在这些化合物的许多可商购脂质体制剂。本公开内容进一步涵盖其他化疗癌症药剂，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。
本文公开的T细胞可与其他抗肿瘤剂，包括细胞毒性剂/抗肿瘤药和抗血管生成剂联合施用。细胞毒性剂/抗肿瘤药可定义为攻击并杀死癌细胞的药剂。一些细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是烷化剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如，顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、洛莫司汀、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪。其他细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是抗生素，例如多柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在这些化合物的许多可商购脂质体制剂。另一些细胞毒性剂/抗肿瘤药可以是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些抑制剂包括长春新碱、长春花碱和依托泊苷。其他细胞毒性剂/抗肿瘤药包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
还可使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他的血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸以及金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和TIMP-2)。还可使用小分子，包括拓扑异构酶如雷佐生、具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
可与所公开的工程化细胞组合使用的其他抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿可达佐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲三聚氰胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿瓦斯汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克里斯奈托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸依达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫卟吩；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫代鸟嘌呤；噻替哌；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替哌；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药包括但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲三聚氰胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)；抗雄激素(前列腺癌)；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩；苯甲酰基星状孢菌素；β-内酰胺衍生物；β-alethine；βclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈法德；比曲亭A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜亚胺；卡泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨源抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；碰撞霉素A(collismycin A)；碰撞霉素B(collismycin B)；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；塞匹霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢紫杉醇；二氧杂霉菌素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；廿二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；度卡霉素SA(duocarmycin SA)；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮(imidazoacridone)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘代多柔比星；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；异邦格唑(isobengazole)；异高软海绵素B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼；加斯普拉诺利得(jasplakinolide)；卡哈拉里德F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N(lamellarin-Ntriacetate)；兰瑞肽；雷那霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；雷波斯他汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；德卟啉镥(lutetiumtexaphyrin)；lysofylline；裂解肽；美坦辛；曼诺他汀A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙(merbarone)；meterelin；蛋氨酸酶(methioninase)；胃复安；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的治疗；芥末抗癌剂(mustard anticancer agent)；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；parabactin；泊泽尼普定；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊糖多硫酸钠；喷司他丁；喷曲唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin 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III.抗真菌剂
在一些情况下，对接受工程化细胞的受试者施用抗真菌疗法。抗真菌剂可以是可杀死真菌或阻止真菌生长的药物。抗真菌剂的靶标可包括甾醇生物合成、DNA生物合成和β-葡聚糖生物合成。抗真菌剂还可以是叶酸合成抑制剂或核酸交联剂。叶酸合成抑制剂可以是基于磺胺的药物。例如，叶酸合成抑制剂可以是抑制叶酸的真菌合成的药剂，或竞争性抑制剂。基于磺胺的药物或叶酸合成抑制剂可以是甲氨蝶呤或磺胺甲基噁唑。在一些情况下，抗真菌剂可以是核酸交联剂。交联剂可以抑制真菌中的DNA或RNA过程。例如，交联剂可以是5-氟胞嘧啶，其可为胞嘧啶的氟化类似物。5-氟胞嘧啶可通过胞质内转化为5-氟尿嘧啶来抑制DNA和RNA二者的合成。其他抗真菌剂可以是灰黄霉素。灰黄霉素是由灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)产生的抗真菌抗生素。灰黄霉素抑制真菌的有丝分裂，并且可被认为是交联剂。另外的交联剂可以是烯丙基胺(萘替芬和特比萘芬)，其在角鲨烯环氧酶的水平下抑制麦角固醇合成；一种吗啉(morpholene)衍生物(阿莫罗芬)，其抑制麦角固醇途径中的后续步骤处进行。
在一些情况下，抗真菌剂可以来自多烯、唑、烯丙基胺或棘白菌素中的一种。在一些实施方案中，多烯抗真菌剂是两性霉素B、杀假丝菌素、菲律宾菌素、哈霉素、游霉素、制霉菌素或龟裂杀菌素。在一些情况下，抗真菌剂可来自唑家族。唑类抗真菌剂可以抑制羊毛甾醇14α-脱甲基酶。唑类抗真菌剂可以是咪唑，例如联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑或噻康唑。唑类抗真菌剂可以是三唑，例如阿巴康唑、艾氟康唑、氟环唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑或伏立康唑。在一些情况下，唑可以是噻唑，例如阿巴芬净。抗真菌剂可以是烯丙基胺，例如阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬或特比萘芬。抗真菌剂还可以是棘白菌素，例如阿尼芬净、卡泊芬净或米卡芬净。可以是抗真菌剂的另外的药剂可为橙酮、苯甲酸、环匹罗司(ciclopirox)、氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近(haloprogin)、托萘酯、十一烯酸、结晶紫或秘鲁香脂。
本领域技术人员可以基于感染个体的真菌适当地确定应用哪种已知的抗真菌药物。在一些情况下，受试者将接受氟康唑与工程化TIL的组合，该工程化TIL包含至少一部分基因如CISH的基因组敲除。可以预防性地施用抗真菌疗法。
200mg片剂的氟康唑是可用的。在一些情况下，氟康唑可以以50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg或至多约400mg片剂的形式施用。对于不能耐受口服制剂的受试者的静脉内施用，氟康唑以用于注射的2MG/ML溶液出现。氟康唑应以200mg/小时的最大静脉注射速率施用。在一些情况下，输注速率可为约50mg/小时至约500mg/小时。输注速率还可为约20mg/小时至约30mg/小时、约30mg/小时至约40mg/小时、约40mg/小时至约50mg/小时、约50mg/小时至约60mg/小时、约60mg/小时至约70mg/小时、约70mg/小时至约80mg/小时、约80mg/小时至约90mg/小时、约90mg/小时至约100mg/小时、约100mg/小时至约120mg/小时、约120mg/小时至约140mg/小时、约140mg/小时至约160mg/小时、约160mg/小时至约180mg/小时、约180mg/小时至约200mg/小时、约180mg/小时至约220mg/小时、约220mg/小时至约240mg/小时、约240mg/小时至约275mg/小时。
抗真菌剂可以以治疗有效剂量施用。治疗有效剂量是治疗或预防真菌感染但对治疗癌症无效的剂量。例如，可以施用约10mg至约1000mg的抗真菌剂如氟康唑。可以施用约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、825mg、850mg、875mg、900mg、925mg、950mg、975mg或至多约1000mg的氟康唑。可以施用400mg的氟康唑。在一些情况下，抗真菌剂施用可以在细胞疗法之前，在细胞疗法期间或在已施用细胞疗法之后进行。例如，氟康唑施用可以在施用细胞疗法之后约第0天(细胞疗法引入受试者的那天)至约第4天进行。抗真菌剂可以在细胞疗法施用前约14天至细胞疗法完成后约14天施用。抗真菌剂可以在约第-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天或直到约第14天施用。
IV.免疫抑制剂
在一些情况下，受试者可以接受免疫抑制剂作为治疗方案的一部分。免疫抑制剂可以指放射治疗剂、生物剂或化学剂。在一些情况下，免疫抑制剂可包括化学剂。例如，化学药可包括以下的至少一种：环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、噻替哌、六甲三聚氰胺、白消安、氟达拉滨、亚硝基脲、铂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素。化学剂可为环磷酰胺或氟达拉滨。
另外，免疫抑制剂可包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、抗抑免蛋白或其任何衍生物。糖皮质激素可以抑制变态反应、炎症和自身免疫疾病。糖皮质激素可以是强的松、地塞米松和氢化可的松。免疫抑制治疗可包括抑制免疫系统的任何治疗。免疫抑制治疗可帮助缓解、最小化或消除接受者的移植排斥反应。例如，免疫抑制治疗可包括免疫抑制药物。可在移植之前、期间和/或之后使用的免疫抑制药物包括但不限于MMF(霉酚酸酯(Cellcept))、ATG(抗胸腺细胞球蛋白)、抗CD154(CD4OL)、抗CD40(2C10、ASKP1240、CCFZ533X2201)、阿仑单抗(Campath)、抗CD20(利妥昔单抗)、抗IL-6R抗体(托珠单抗，Actemra)、抗IL-6抗体(sarilumab、奥鲁凯珠单抗(olokizumab))、CTLA4-Ig(阿巴西普/Orencia)、贝拉西普(LEA29Y)、西罗莫司(Rapimune)、依维莫司、他克莫司(Prograf)、达利珠单抗(Ze-napax)、巴利昔单抗(Simulect)、英夫利昔单抗(Remicade)、环孢菌素、脱氧精胍菌素、可溶性补体受体1、眼镜蛇毒因子、compstatin、抗C5抗体(依库珠单抗/Soliris)、甲基强的松龙、FTY720、依维莫司、来氟米特、抗IL-2R-Ab、雷帕霉素、抗CXCR3抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体和抗CD122抗体。此外，一种或多于一种免疫抑制剂/药物可一起使用或依次使用。一种或多于一种免疫抑制剂/药物可用于诱导治疗或用于维持治疗。可在诱导和维持阶段使用相同或不同的药物。在一些情况下，达利珠单抗(Zenapax)可用于诱导治疗，而他克莫司(Prograf)和西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。达利珠单抗(Zenapax)还可用于诱导治疗，而低剂量的他克莫司(Prograf)和低剂量的西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。还可使用非药物方案来实现免疫抑制，该非药物方案包括但不限于全身照射、胸腺照射和全部和/或部分脾切除术。
在一些情况下，可以施用细胞抑制剂用于免疫抑制。细胞抑制剂可以抑制细胞分裂。细胞抑制剂可以是嘌呤类似物。细胞抑制剂可以是烷化剂，抗代谢物如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或巯基嘌呤。细胞抑制剂可以是环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、噻替哌、六甲三聚氰胺、白消安、氟达拉滨、亚硝基脲、铂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素中的至少一种。
在一些情况下，免疫抑制剂如氟达拉滨可作为治疗方案的一部分施用。氟达拉滨磷酸盐可以是与生理核苷不同的合成嘌呤核苷，不同之处在于糖部分可以是阿拉伯糖而不是核糖或脱氧核糖。氟达拉滨可以是嘌呤拮抗剂抗代谢物。氟达拉滨可以在50mg小瓶中作为白色、冻干固体饼形式的氟达拉滨磷酸盐粉末的形式提供。在用2mL无菌注射用水重构至浓度为25mg/ml后，溶液的pH可为7.7。氟达拉滨粉末在2-8℃下可稳定至少18个月；当重构时，氟达拉滨在室温下稳定至少16天。因为不存在防腐剂，重构的氟达拉滨通常将在8小时内施用。关于具体的相容性信息，请参阅专门的参考文献。氟达拉滨可在血清中去磷酸化，在细胞内转运并转化为核苷酸氟达拉滨三磷酸；这种2-氟-ara-ATP分子被认为是药物的细胞毒性作用所必需的。氟达拉滨抑制DNA聚合酶、核糖核苷酸还原酶、DNA引发酶，并且可以干扰链延伸以及RNA和蛋白质合成。氟达拉滨可以在100ml0.9％氯化钠(USP)中经15至30分钟以静脉内输注的方式施用。剂量将基于体表面积(BSA)。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量将使用实际体重计算。在一些情况下，可以施用约20mg/m2至约30mg/m2受试者体表面积的免疫抑制剂如氟达拉滨。在一些情况下，可以施用约5mg/m2至约10mg/m2受试者体表面积、约10mg/m2至约15mg/m2受试者体表面积、约15mg/m2至约20mg/m2受试者体表面积、约20mg/m2至约25mg/m2受试者体表面积、约25mg/m2至约30mg/m2受试者体表面积、约30mg/m2至约40mg/m2受试者体表面积的免疫抑制剂如氟达拉滨。在一些情况下，可以施用约1mg/m2、2mg/m2、3mg/m2、4mg/m2、5mg/m2、6mg/m2、7mg/m2、8mg/m2、9mg/m2、10mg/m2、11mg/m2、12mg/m2、13mg/m2、14mg/m2、15mg/m2、16mg/m2、17mg/m2、18mg/m2、19mg/m2、20mg/m2、21mg/m2、22mg/m2、23mg/m2、24mg/m2、25mg/m2、26mg/m2、27mg/m2、28mg/m2、29mg/m2、30mg/m2、31mg/m2、32mg/m2、33mg/m2、34mg/m2、35mg/m2、36mg/m2、37mg/m2、38mg/m2、39mg/m2、40mg/m2、41mg/m2、42mg/m2、43mg/m2、44mg/m2、45mg/m2、46mg/m2、47mg/m2、48mg/m2、49mg/m2、50mg/m2、51mg/m2、52mg/m2、53mg/m2、54mg/m2、55mg/m2、56mg/m2、57mg/m2、58mg/m2、59mg/m2、60mg/m2、61mg/m2、62mg/m2、63mg/m2、64mg/m2、65mg/m2、66mg/m2、67mg/m2、68mg/m2、69mg/m2、70mg/m2、71mg/m2、72mg/m2、73mg/m2、74mg/m2、75mg/m2、76mg/m2、77mg/m2、78mg/m2、79mg/m2、80mg/m2、81mg/m2、82mg/m2、83mg/m2、84mg/m2、85mg/m2、86mg/m2、87mg/m2、88mg/m2、89mg/m2、90mg/m2、91mg/m2、92mg/m2、93mg/m2、94mg/m2、95mg/m2、96mg/m2、97mg/m2、98mg/m2、99mg/m2至约100mg/m2受试者体表面积的免疫抑制剂如氟达拉滨。在一些情况下，免疫抑制剂如氟达拉滨可以以在100ml 0.9％氯化钠(USP)中25mg/m2的剂量施用，并经约15至约30分钟输注。
在一些情况下，免疫抑制剂如环磷酰胺可作为治疗方案的一部分施用。环磷酰胺可以是氮芥衍生的烷化剂。环磷酰胺在肝脏中转化为活性代谢物后起到烷化剂的作用；该药物还具有有效的免疫抑制活性。静脉内施用后的血清半衰期的范围为3-12小时；在施用后长达72小时，可在血清中检测到药物和/或其代谢物。按照指导用无菌注射用水重构后，环磷酰胺可在室温下稳定24小时或在保持在2-8℃下时稳定6天。剂量将基于受试者的体重。如所述，如果受试者肥胖(BMI>35)，药物剂量将使用实际体重计算。在一些情况下，可以施用约1mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg,20mg/kg至约30mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约70mg/kg、约70mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约90mg/kg、约90mg/kg至约100mg/kg的免疫抑制剂如环磷酰胺。在一些情况下，施用超过50mg/kg受试者的免疫抑制剂如环磷酰胺。在一些情况下，可以施用约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、50mg/kg、51mg/kg、52mg/kg、53mg/kg、54mg/kg、55mg/kg、56mg/kg、57mg/kg、58mg/kg、59mg/kg、60mg/kg、61mg/kg、62mg/kg、63mg/kg、64mg/kg、65mg/kg、66mg/kg、67mg/kg、68mg/kg、69mg/kg、70mg/kg、71mg/kg、72mg/kg、73mg/kg、74mg/kg、75mg/kg、76mg/kg、77mg/kg、78mg/kg、79mg/kg、80mg/kg、81mg/kg、82mg/kg、83mg/kg、84mg/kg、85mg/kg、86mg/kg、87mg/kg、88mg/kg、89mg/kg、90mg/kg、91mg/kg、92mg/kg、93mg/kg、94mg/kg、95mg/kg、96mg/kg、97mg/kg、98mg/kg、99mg/kg至约100mg/kg受试者的免疫抑制剂如环磷酰胺。在一些情况下，可以经至少约1天至约3天、3天至5天、5天至7天、7天至约10天、10天至14天、14天至约20天施用免疫抑制剂如环磷酰胺。在一些情况下，环磷酰胺可以为约60mg/kg的剂量，并稀释在250ml 5％葡萄糖水溶液中且经1小时输注。
免疫抑制剂可以是例如环磷酰胺和氟达拉滨的方案。例如，可以向接受工程化细胞疗法的受试者施用环磷酰胺氟达拉滨方案。可以以60mg/kg每日一次持续2天和25mg/m2每日一次持续5天的方案来施用环磷酰胺氟达拉滨方案。可以在施用本发明的工程化细胞之前1小时至14天施用化疗方案，例如环磷酰胺氟达拉滨。可以以不同剂量施用化疗方案。例如，受试者可以接受较高的初始剂量，然后接受较低的剂量。受试者可以接受较低的初始剂量，然后接受较高的剂量。
在一些情况下，免疫抑制剂可为抗体。可以以治疗有效剂量施用抗体。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。可以施用的多克隆抗体可为抗淋巴细胞或抗胸腺细胞抗原。单克隆抗体可以是抗IL-2受体抗体、抗CD25抗体或抗CD3抗体。还可以使用抗CD20抗体。B细胞消融疗法，如与CD20反应的药剂(例如Rituxan)，也可用作免疫抑制剂。
免疫抑制剂还可以是抗抑免蛋白。抗抑免蛋白可以是环孢素、他克莫司、依维莫司或西罗莫司。另外的免疫抑制剂可以是干扰素如IFN-β、阿片样物质、抗TNF结合剂、霉酚酸酯(mycophenolate)或芬戈莫德。
免疫抑制剂还可以指放射治疗剂。放射治疗可包括辐射。可以以12Gy施用全身辐射。辐射剂量可以包括对全身(包括健康组织)的12Gy累积剂量。辐射剂量可以包括5Gy至20Gy。辐射剂量可以是5Gy、6Gy、7Gy、8Gy、9Gy、10Gy、11Gy、12、Gy、13Gy、14Gy、15Gy、16Gy、17Gy、18Gy、19Gy或至多20Gy。辐射可以是全身辐射或局部身体辐射。在辐射是全身辐射的情况下，辐射可以是均匀的或不均匀的。例如，当辐射可能不均匀时，身体的较窄区域如颈部可以比较宽区域如臀部接收更高的剂量。例如，在一个实施方案中，受试者可以经历高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。待向患者施用的上述治疗的剂量将随着所治疗病况的确切性质和治疗的接受者而变化。用于人类施用的剂量的变化可以根据本领域公认的实践进行。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量通常将在1至约100mg的范围内，通常每日施用持续1至30天的时间段。优选的每日剂量为1至10mg/天，但在一些情况下，可以使用高达40mg/天的较大剂量(在美国专利号6,120,766中描述)。
V.抗生素剂
可以向受试者施用抗生素作为治疗方案的一部分。可以以治疗有效剂量施用抗生素。抗生素可以杀死细菌或抑制细菌的生长。抗生素可以是广谱抗生素，广谱抗生素可以靶向广泛的细菌。第3代或第4代的广谱抗生素可以是头孢菌素或喹诺酮。
抗生素可以是窄谱抗生素，窄谱抗生素可以靶向特定类型的细菌。抗生素如青霉素和头孢菌素可以靶向细菌细胞壁。抗生素如多粘菌素可以靶向细胞膜。抗生素可以干扰必需的细菌酶，例如以下抗生素：利福霉素、闰年霉素、喹诺酮和磺胺。抗生素还可以是蛋白质合成抑制剂，例如大环内酯、林可酰胺和四环素。抗生素还可以是环脂肽如达托霉素、甘氨酰环素如替加环素、噁唑烷酮如利奈唑胺，以及闰年霉素如非达霉素。
在一些情况下，抗生素可以是第1代、第2代、第3代、第4代或第5代。第1代抗生素可以具有窄谱。第1代抗生素的实例可以是青霉素(青霉素G或青霉素V)、头孢菌素(头孢唑啉、头孢噻吩、头孢匹林、Cephalethin、头孢拉定或头孢羟氨苄)。在一些情况下，抗生素可以是第2代。第2代抗生素可以是青霉素(阿莫西林或氨苄青霉素)、头孢菌素(头孢呋辛、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢丙烯、氯碳头孢)。在一些情况下，抗生素可以是第3代。第3代抗生素可以是青霉素(羧苄青霉素和替卡西林)或头孢菌素(头孢克肟、头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑肟和头孢他啶)。抗生素还可以是第4代抗生素。第4代抗生素可以是头孢吡肟。抗生素还可以是第5代。第5代抗生素可以是头孢洛林或头孢比罗。
在一些情况下，抗生素可以是细菌壁靶向剂、细胞膜靶向剂、细菌酶干扰剂、杀菌剂、蛋白质合成抑制剂或抑菌剂。细菌壁靶向剂可以是青霉素衍生物(青核素)、头孢菌素(头孢烯)、单环内酰胺和碳青霉烯。β-内酰胺抗生素具有杀菌或抑菌作用，并通过抑制细菌细胞壁的肽聚糖层的合成而起作用。在一些情况下，抗生素可以是蛋白质合成抑制剂。蛋白质合成抑制剂可以是氨苄青霉素，其充当酶转肽酶的不可逆抑制剂，而酶转肽酶是细菌产生细胞壁所需的。氨苄青霉素抑制二分裂中细菌细胞壁合成的第三个也是最后一个阶段，最终导致细胞裂解；因此，氨苄青霉素通常具有溶菌作用。在一些情况下，杀菌剂可以是头孢菌素或喹诺酮。在其他情况下，抑菌剂是三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒。
在一些情况下，可以施用预防PCP肺炎的药剂。例如，可以施用三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲噁唑以预防肺炎。三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲噁唑(TMP/SMX；示例性磺胺药)的剂量可以是每周三次每日(非连续日)1片口服，其在第一剂量的化疗时或之后施用并持续至少约6个月，直至至少连续2次实验室研究的CD4计数大于200。在一些情况下，可以施用160mg的三甲氧苄二氨嘧啶。可以施用约100至约300mg的三甲氧苄二氨嘧啶。可以施用约100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg或至多约300mg的三甲氧苄二氨嘧啶。在一些情况下，可以以800mg施用磺胺甲噁唑。可以施用约500mg至约1000mg的磺胺甲噁唑。可以施用约500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、825mg、850mg、875mg、900mg、925mg、950mg、975mg或至多约1000mg的磺胺甲噁唑。在一些情况下，可以以治疗有效量施用TMP/SMX方案。可以每日施用约1X至约10X的TMP/SMX。可以每日施用1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、11X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X或至多约20X的TMP/SMX。在一些情况下，可以按周施用TMP/SMX。例如，可以每周施用1X、2X、3X、4X、5X、6X或至多约7X的TMP/SMX。TMP/SMX方案可以在施用细胞疗法如TIL后约第-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天或直到约第14天施用。
如权利要求37至48中任一项所述的方法，其中所述抑菌剂在TIL之前约8天至所述TIL之后至少4天施用。
在一些情况下，具有磺胺变态反应的受试者可以接受戊烷脒。戊烷脒可以通过气雾剂施用。每个雾化器300mg戊烷脒，在入选前一周内开始施用并每月持续，直至CD4计数在连续两次随访实验室研究中达到200以上，以及在化疗后持续至少6个月。戊烷脒可用于预防PCP感染的发生。戊烷脒可以以300mg小瓶的冻干粉末提供，并将通过雾化器施用。可以施用约300mg至约500mg的戊烷脒。在一些情况下，可以施用约100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg或至多约800mg的戊烷脒。
在一些情况下，抑菌剂如抗生素可以在TIL之前，与所述TIL同时或在所述TIL之后施用。在一些情况下，抑菌剂可以在施用所述TIL之前约14天至所述TIL的所述施用之后约6个月施用。
VI.抗病毒剂
在一些情况下，抗病毒剂可作为治疗方案的一部分施用。在一些情况下，可以向受试者施用疱疹病毒预防剂作为治疗方案的一部分施用。疱疹病毒预防剂可为伐昔洛韦(Valtrex)。Valtrex可口服用于预防HSV血清学呈阳性的受试者发生疱疹病毒感染。Valtrex可以以500mg片剂的形式提供。可以以治疗有效剂量施用伐昔洛韦。例如，可以施用约50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg或至多约700mg片剂的伐昔洛韦。如果受试者能够耐受口服摄入，则在氟达拉滨的最后剂量之后的第二天开始以500mg的剂量每日口服伐昔洛韦。抗病毒疗法可以在施用细胞疗法如TIL疗法后约第-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天或直到约第14天施用。
在一些情况下，受试者可能无法服用口服药物来预防疱疹。在这些情况下，可以施用阿昔洛韦。阿昔洛韦可以作为500mg/瓶的注射用粉末提供。在一些情况下，可以以治疗有效量施用阿昔洛韦。可以口服施用约50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg或至多约700mg的阿昔洛韦。可以每日施用1X、2X、3X、4X、5X、6X或至多约7X的阿昔洛韦。阿昔洛韦可以在施用细胞疗法如TIL疗法后约第-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天或直到约第14天施用。在一些情况下，阿昔洛韦可静脉内施用。例如，可以以1mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg,20mg/kg至约30mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约70mg/kg、约70mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约90mg/kg、约90mg/kg至约100mg/kg施用阿昔洛韦。在一些情况下，施用超过50mg/kg的阿昔洛韦。阿昔洛韦可以在10mL无菌注射用水中重构至浓度为50mg/mL。重构溶液应在12小时内使用。可以将静脉注射溶液稀释至7mg/mL或更低的浓度并经1小时输注以避免肾损伤。
疾病参数
在一些情况下，疾病水平可以与治疗方案或细胞施用按顺序或同时确定。目标病变的疾病水平可以如下衡量：完全响应(CR)：所有目标病变消失，部分响应(PR)：以基线最长直径(LD)总和为参考，目标病变的LD的总和至少减少30％，进展(PD)：以自治疗开始以来记录的最小LD总和为参考，目标病变的LD总和至少增加20％，或出现一个或多个新病变，稳定的疾病(SD)：既没有足够的减小以符合PR，也没有足够的增加以符合PD(以最小的LD总和为参考)。在其他情况下，可以衡量非目标病变。非目标病变的疾病水平可以是完全响应(CR)：所有非目标病变消失并且肿瘤标志物水平正常化，不完全响应：一个或多个非目标病变持续，进展(PD)：出现一个或多个新病变。现有非目标病变的明确进展。
在一些情况下，可以评估经历治疗方案和细胞施用的受试者的最佳总体响应。最佳总体响应可以是从治疗开始到疾病进展/复发所记录的最佳响应(对于进行性疾病，以自治疗开始以来所记录的最小测量值为参考)。受试者的最佳响应指定(assignment)可取决于衡量和确认标准的达成。到达进展的时间可以从随机化之日起测量。
表7.病变评价
目标病变 非目标病变 新病变 总响应
CR CR 否 CR
CR 非CR/非PD 否 PR
PR 非PD 否 PR
SD 非PD 否 SD
PD 任何 是或否 PD
任何 PD 是或否 PD
任何 任何 是 PD
要被指定为PR或CR状态，必须通过重复研究来确认肿瘤测量值的变化，该重复研究应在首次满足响应标准后至少约4周进行。在SD的情况下，随访测量必须在研究进入后以6-8周的最小间隔至少一次满足SD标准。在一些情况下，总体响应的持续时间可以从满足CR/PR的衡量标准的时间(首次记录的时间)开始测量，直到客观上记录到复发或进行性疾病的第一个日期为止(对于进行性疾病，以自治疗开始以来所记录的最小测量值为参考)。总体完全响应的持续时间可以从首次满足CR的衡量标准的时间开始测量，直到客观上记录到复发性疾病的第一个日期。稳定的疾病的测量可以从治疗开始起，直到满足进展标准，以自治疗开始以来所记录的最小测量值为参考。
在一些情况下，可以使用直尺或卡尺以公制表示法测量和记录可测量的疾病。可以尽可能地在接近治疗开始时进行所有基线评估。当病变是浅表的(例如，皮肤结节和可触及的淋巴结)并且使用卡尺得到的直径超过至少约10mm时，病变可以被认为是可测量的。在一些情况下，可以进行彩色摄影。
在其他情况下，可以采用计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)。可以对5mm或更小的切片厚度进行CT。如果CT扫描的切片厚度大于5mm，则可测量病变的最小大小应为切片厚度的两倍。在一些情况下，可以使用FDG-PET扫描。FDG-PET可用于评估新病变。在基线时为阴性FDG-PET，而在随访时为阳性FDG-PET是基于新病变的进行性疾病(PD)的征兆。基线时没有FDG-PET并且随访时为阳性FDG-PET：如果随访时的阳性FDG-PET对应于通过CT证实的新疾病部位，则这为PD。如果随访时的阳性PDG-PET对应于CT上预先存在的疾病部位且基于解剖学图像其可能没有进展，则这可能不是PD。在一些情况下，在剩余的射线照相异常被认为代表纤维化或瘢痕形成的情况下，FDG-PET可用于以类似于活组织检查的方式升级对CR的响应。阳性FDG-PET扫描病变是指FDG亲和的病变，其摄取大于衰减校正图像上周围组织的摄取的两倍。
在一些情况下，可以进行病变评估。完全响应(CR)可以是所有目标病变的消失。任何病理性淋巴结(靶标或非靶标)的短轴可能减小至小于10mm。部分响应(PR)可以是目标病变的直径总和减少至少30％，以直径的基线总和为参考。进行性疾病(PD)可以是目标病变的直径总和增加至少20％，以最小总和为参考。除了相对增加20％之外，总和还必须表现出至少5mm的绝对增加。稳定的疾病(SD)既没有足够的减小以符合PR，也没有足够的增加以符合PD，以最小的直径总和为参考。
在一些情况下，可以评估非目标病变。非目标病变的完全响应可以是肿瘤标志物水平的消失和正常化。所有淋巴结的大小必须是非病理性的(短轴小于10mm)。如果肿瘤标志物最初高于正常上限，则它们必须正常化以使患者被认为是完全临床响应。非CR/非PD是一种或多种非目标病变的持续和/或肿瘤标志物水平保持高于正常限度。进行性疾病可以是一种或多种新病变的出现和/或现有非目标病变的明确进展。明确的进展通常不应该胜过目标病变状态。
在一些情况下，最佳总体响应可以是从治疗开始直到疾病进展/复发所记录的最佳响应。
毒性标准
在一些情况下，可以确定治疗方案或细胞施用的毒性。毒性测定可包括治疗方案的毒性、免疫效果和抗肿瘤效力。毒性研究可以利用CTCAE 3.0版进行毒性和不良事件报告。特异性地与工程化细胞输注有关的早期毒性(紧接着细胞输注之后和阿地白介素施用之前观察到的毒性)通常是轻微的并且可以包括发热、发冷、头痛和不适。在施用阿地白介素后发生但被认为与工程化细胞施用有关的毒性可包括免疫介导的事件，例如白癜风、短暂性葡萄膜炎、听力损失和前庭功能障碍。在细胞施用之前使用非清髓性方案可以增加治疗的毒性，因为在受试者中发生严重的骨髓抑制。在一些情况下，施用高剂量阿地白介素的标准方法可以是持续给药直至发生3或4级事件。最常见的4级事件是肺和肾损害，以及精神状态的变化。这些毒性有时可能需要插管以保护受试者的气道。在一些情况下，致命的并发症是可能的，并且在危及生命的转移性癌症的背景下进行治疗可能是适当的。
在一些情况下，用本文所述的治疗方案或细胞产品治疗的受试者可能经历与该方案或细胞产品相关的不良事件。不良事件可以是在与人使用药物相关的治疗过程中发生的任何反应、副作用或意外事件，无论该事件是否被认为与治疗相关或具有临床意义。在一些情况下，不良事件可包括由受试者报告的事件，以及体格检查或实验室评估中的临床上显著的异常发现。新的疾病、症状、体征或临床上显著的实验室异常或预先存在的病况或异常的恶化可被认为是不良事件。所有不良事件，包括实验室评估中临床上显著的异常发现，无论严重程度如何，都将被随访直到降至2级或更低，淋巴细胞减少症和脱发除外。如果预计不良事件不会降至2级或更低，则受试者可停止治疗。
在一些情况下，治疗方案可以与毒性降低剂一起施用。毒性降低剂可以是发热或呕吐减少剂。例如，可以施用美司钠以减少诸如恶心、呕吐和腹泻等毒性。
美司钠可以是稀释溶液(1至20mg/mL)，并且在冷藏下可以物理和化学稳定至少24小时。在室温下，美司钠可以在D5W中化学稳定48-72小时，在D5W/0.45％NaCl中化学稳定48-72小时，或在0.9％NaCl中化学稳定24小时。美司钠可以在D5W或0.9％NaCl中稀释至小于或等于20mg美司钠/ml流体的浓度，并以连续输注的方式静脉内施用。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量将使用实际体重计算。
在其他情况下，另外的支持药物可包括盐酸昂丹司琼。盐酸昂丹司琼可用于在化疗预备方案期间控制恶心和呕吐。它可能导致头痛、头晕、肌痛、嗜睡、不适和虚弱。较少见的副作用包括胸痛、低血压、瘙痒、便秘和尿潴留。在其他情况下，还可以施用呋塞米。呋塞米可用于在环磷酰胺化疗预备方案期间增加排尿。不良反应包括头晕、眩晕、感觉异常、虚弱、直立性低血压、光敏感、皮疹和瘙痒。
施用方法
本文提供的可以是用于向患有诸如癌症等病况的受试者施用治疗方案的方法。在一些情况下，可以以单位剂型提供细胞组合物(例如，包含TIL例如具有CISH破坏的TIL(包括自体TIL)的细胞组合物)。细胞组合物(例如，包含TIL(包括自体TIL)例如具有CISH破坏的TIL的细胞组合物)可以在溶液中重悬并输注施用。本文提供的还可以是包括免疫刺激剂、免疫抑制剂、抗生素、抗真菌剂、止吐药、化疗剂、放疗及其任何组合的治疗方案。包括上述任何一种的治疗方案可以被冻干并在水溶液(例如，盐水溶液)中重构。在一些情况下，通过选自皮下注射、肌内注射、皮内注射、经皮施用、静脉内(“i.v.”)施用、鼻内施用、淋巴管内注射和口服施用的途径来施用治疗(例如，细胞治疗如TIL，例如具有CISH破坏的TIL(包括自体TIL))。在一些情况下，通过淋巴管内微导管向受试者输注包含TIL的细胞组合物。
许多药物可以作为液体、胶囊、片剂或咀嚼片剂口服施用。由于口服途径最为方便且通常是最安全和最便宜的，因此是最常用的一种途径。然而，由于药物通常通过消化道移动的方式，口服途径具有局限性。对于口服施用的药物，可以在口腔和胃中开始吸收。然而，大多数药物通常从小肠吸收。药物经过肠壁并进入肝脏，然后通过血流运输到其目标部位。肠壁和肝脏化学地改变(代谢)许多药物，从而减少到达血流的药物量。因此，为产生相同效果，这些药物在静脉内注射时通常以较小剂量给药。
对于皮下途径，将针头插入皮肤正下方的脂肪组织中。药物在注射后进入小血管(毛细血管)并被血流带走。或者，药物通过淋巴管到达血流。当需要更大体积的药物产品时，肌内途径优于皮下途径。由于肌肉位于皮肤和脂肪组织下方，因此使用较长的针头。药物通常注入上臂、大腿或臀部的肌肉。药物被吸收到血流中的速度部分取决于肌肉的血液供应：血液供应越稀少，药物吸收所花费的时间越长。对于静脉内途径，将针头直接插入静脉。含有药物的溶液可以以单剂量或通过连续输注给药。对于输注，溶液通过重力(从可折叠的塑料袋)移动，或者更常见地，通过输注泵穿过细柔性管移动到插入静脉中的管(导管)，该静脉通常在前臂中。在一些情况下，细胞或治疗方案输注施用。输注可以进行一段时间。例如，输注可以是经约5分钟至约5小时的一段时间施用细胞或治疗方案。输注可以进行约5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时或至多约5小时的一段时间。
在一些实施方案中，使用静脉内施用在整个身体中快速且以良好控制的方式递送精确剂量。静脉内施用还用于刺激性溶液，该刺激性溶液如果通过皮下或肌内注射给药，会引起疼痛和伤害组织。静脉内注射可比皮下或肌内注射更难以施用，因为将针头或导管插入静脉可能是困难的，特别如果人是肥胖的。当静脉内给药时，药物被立即输送到血流中并且趋向于比通过任何其他途径给药更容易起效。因此，医疗保健从业人员密切监测接受静脉内注射的人是否有药物正在起作用或正在引起不希望的副作用的迹象。此外，通过该途径给予的药物的效果趋于持续更短的时间。因此，一些药物必须通过连续输注进行给药以保持其效果恒定。对于鞘内途径，将针头插入下脊柱中的两个椎骨之间并插入脊髓周围的空间。然后将药物注入椎管内。通常使用少量局部麻醉剂以麻醉注射部位。当需要药物对大脑、脊髓或覆盖它们的组织层(脑膜)产生快速或局部效果时使用这种途径，例如，用于治疗这些结构的感染。
经由口腔通过吸入施用的药物可以雾化成比通过鼻腔途径施用的药物更小的液滴，以便药物可以通过气管(windpipe)(气管(trachea))进入肺。它们进入肺的深度取决于液滴的大小。较小的液滴会进入更深，这会增加吸收的药物量。在肺的内部，它们被吸收到血流中。施加至皮肤的药物通常用于其局部效果，并且因此最常用于治疗浅表皮肤病症，例如银屑病、湿疹、皮肤感染(病毒、细菌和真菌)、瘙痒和皮肤干燥。药物与非活性物质混合。根据非活性物质的稠度，制剂可以是软膏剂、霜剂、洗剂、溶液、粉末或凝胶。
在一些情况下，可以根据受试者的体重给予治疗方案。在确定为肥胖(BMI>35)的受试者中，可能需要使用实际体重。BMI通过下式计算：BMI＝体重(kg)/[身高(m)]2。
男性的理想体重可以计算为50kg+2.3*(超过60英寸的英寸数)或女性的理想体重可以计算为45.5kg+2.3(超过60英寸的英寸数)。可以对超过其理想体重20％的受试者计算校正的体重。校正的体重可以是理想体重+(0.4x(实际体重–理想体重))之和。在一些情况下，体表面积可用于计算剂量。体表面积(BSA)可以通过下式计算：BSA(m2)＝√身高(cm)*体重(kg)/3600。
在一些情况下，包括细胞疗法的药物组合物可通过任何途径单独施用或与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用，并且可以以单剂量和多剂量进行这样的施用。更具体地，药物组合物可与各种药学上可接受的惰性载体以片剂、胶囊、锭剂、糖锭、手糖(handcandies)、粉末、喷雾剂、水性悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆等形式进行组合。这样的载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。此外，可借助通常用于此类目的的各种类型的试剂将这样的口服药物制剂适当地变甜和/或调味。
在一些情况下，治疗方案可以与载体或赋形剂一起施用。示例性的载体和赋形剂可包括葡萄糖、氯化钠、蔗糖、乳糖、纤维素、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇(malitol)、明胶、PEG、PVP及其任何组合。
在一些情况下，赋形剂如葡萄糖或氯化钠的百分比可为约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％或至多约15％。
本文描述了治疗接受者的疾病(例如，癌症如胃肠癌)的方法，其包括将包含工程化细胞的一种或多种细胞(包括器官和/或组织)移植到接受者。通过细胞内基因组移植制备的细胞可用于治疗癌症。在一些实施方案中，治疗胃肠癌的方法包括：a)从肿瘤样品(例如，来自患有胃肠癌的受试者的肿瘤样品)获得肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)；b)鉴别突变反应性TIL；以及用Cas核酸酶破坏所述突变反应性TIL中的内源基因或其部分。在一些实施方案中，使肿瘤样品经受测序分析，例如全外显子组测序、转录组测序或其组合。在一些实施方案中，鉴别包括将TIL引入采用包含突变的肽(例如，约15聚体突变肽直至约30聚体突变肽，例如25聚体突变肽)脉冲的抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，使TIL与表达肽的APC接触以确定TIL的反应性。肽可以包含可以被TIL靶向的肿瘤突变。例如，APC可以表达多种肽，一些肽编码可用于鉴别肿瘤反应性TIL的肿瘤突变。可以分离或纯化那些被鉴别为具有肿瘤反应性的TIL，并将其用于基因组工程。在一些情况下，肿瘤反应性TIL可以用CRISPR系统进行基因组工程化。CRISPR系统可用于敲除肿瘤反应性TIL中的内源基因，例如CISH。CRISPR系统可用于敲除肿瘤反应性TIL中的内源基因，例如PD-1。在一些实施方案中，鉴别包括将所述TIL引入采用包含突变的多核酸电穿孔的抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，鉴别进一步包括检测细胞因子如IL-2、IFN-γ、IL-6，脱粒，细胞增殖等。
实施例
实施例1：鉴别每个基因位点处具有最高双链断裂(DSB)诱导的gRNA。
指导RNA的设计和构建：
将指导RNA(gRNA)设计成期望的基因区域。基于由脱靶位置所确定的最高排名值来选择用于生成gRNA(在表1中示出)的多个引物。gRNA以寡核苷酸对进行排序：5’-CACCG-gRNA序列-3’和5’-AAAC-反向互补gRNA序列-C-3’(寡核苷酸对的序列在表1中列出)。
表8.用于生成gRNA的引物(为了克隆目的，将序列CACCG添加至有义链，并将AAAC添加至反义链)。
使用靶序列克隆方案将gRNA克隆在一起。简言之，使用T4PNK(NEB)和10X T4连接缓冲液(NEB)，在热循环仪中采用以下方案将寡核苷酸对磷酸化并一起退火：37℃30分钟，5分钟，然后以/分钟逐渐降至用FastDigest BbsI(Fermentas)消化pENTR1-U6-Stuffer-gRNA载体，FastAP(Fermentas)和10X Fast消化缓冲液用于连接反应。使用T4DNA连接酶和缓冲液(NEB)将所消化的pENTR1载体与来自先前步骤的磷酸化并退火的寡核苷酸双链体(稀释度1:200)连接在一起。将连接物在室温下温育1小时，然后转化，并随后使用GeneJET质粒小量制备试剂盒(GeneJET Plasmid Miniprep Kit)(ThermoScientific)进行小量制备。对质粒进行测序以确认正确的插入。
gRNA的验证
以1x 10∧5个细胞/孔的密度将HEK293T细胞铺在24孔板中。将150uL的Opti-MEM培养基与1.5ug的gRNA质粒、1.5ug的Cas9质粒合并。将另外150uL的Opti-MEM培养基与5μL的Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen)合并。将这些溶液合并在一起并在室温下温育15分钟。将DNA-脂质复合体逐滴添加至24孔板的孔中。将细胞在37℃下温育3天，并使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒(Thermo Scientific)收集基因组DNA。通过Surveyor消化、凝胶电泳和密度测定对gRNA的活性进行定量(图61)(Guschin,D.Y.,等人,“A Rapid andGeneral Assay for Monitoring Endogenous Gene Modification,”Methods inMolecular Biology,649:247-256(2010))。结果
Cas9在不同gRNA序列的协助下产生双链断裂(DSB)的效率在表9中列出。表9中的百分数指示样品中基因修饰的百分比。
表9.Cas9/gRNA对在各个靶基因位点处产生双链断裂(DSB)的效率
HPRT AAVS1 CCR5 PD1 CTLA4
gRNA#1 27.85％ 32.99％ 21.47％ 10.83％ 40.96％
gRNA#2 30.04％ 27.10％ >60％ >60％ 56.10％
gRNA#3 <1％ 39.82％ 55.98％ 37.42％ 39.33％
gRNA#4 <5％ 25.93％ 45.99％ 20.87％ 40.13％
gRNA#5 <1％ 27.55％ 36.07％ 30.60％ 15.90％
gRNA#6 <5％ 39.62％ 33.17％ 25.91％ 36.93％
在所有五个测试的靶基因位点处均产生DSB。在这些位点中，CCR5、PD1和CTLA4提供了最高的DSB效率。使用本文所述的相同方法测试其他靶基因位点，包括hRosa26。
列出了与供体对照和仅Cas9对照相比的双链断裂百分比。对三个代表性靶基因位点(即CCR5、PD1和CTLA4)进行测试。
实施例2：GUIDE-Seq文库制备
为了检查已知为全基因组的PD-1gRNA的脱靶切割，通过测序或GUIDE-seq实现双链断裂(DSB)的无偏倚鉴别。这是一种采用将双链寡核苷酸捕获到由CRISPR/Cas9产生的DSB中，随后进行下一代测序以确定遗传修饰的位置的方法。
将使用固相可逆固定化磁珠(Agencourt DNAdvance)分离的人T细胞用CovarisS200仪器剪切至平均长度500bp，进行末端修复，进行A加尾，并与合并了8-nt随机分子指标物的半功能性衔接子连接。使用两轮巢式锚定PCR(其中引物与寡核苷酸标签互补)进行靶标富集。末端修复热循环仪程序：12℃15min；37℃15min；72℃15min；保持在4℃。
映射回基因组的GUIDE-Seq读取的起始位点能够使DSB定位在几个碱基对内。根据制造商说明书，使用Illumina Library Quantification试剂盒的Kapa Biosystems试剂盒对文库进行定量。使用通过对每个样品运行qPCR所给出的每uL分子数目的平均数量估计值，将总文库集合相对于1.2X 10∧10个分子进行归一化，除以待汇集在一起用于测序的文库的数目。这给出了每个样品的按分子输入，并且还给出每个样品的按体积输入。将通过GUIDE-Seq评估的由截短的gRNA引导的三种RGN的上靶和脱靶位点的读取进行映射。在所有的情况下，靶位点序列的前间区序列在x轴的左侧而PAM序列在x轴的右侧。根据Illumina的标准方案将文库变性并加载到Miseq上，以便采用Illumina Miseq试剂盒V2-300循环(Illumina Miseq Reagent Kit V2-300cycle)(2x 150bp配对端)进行测序。
在第二个实验中，PD-1gRNA的GUIDE-Seq分析揭示仅有一个可重现的脱靶修饰。该位点与通过预测位点的深度测序检测到的单个脱靶位置相匹配，证明了两种方法之间的相关性。因此，对脱靶的NGS分析是灵敏和全面的。针对PD-1的gRNA设计是高度特异性的，只有一个可检测的脱靶位点，该位点位于基因组的惰性部分中，并且预期该位点的修饰不会导致任何不利影响。针对CISH的gRNA设计是高度特异性的，没有可测量的脱靶活性。
实施例3.对TIL进行基因组工程化以敲除PD-1、CTLA-4和CISH
将来自符合条件的IIIc-IV期癌症患者的合适肿瘤切除并切成小的3–5mm2碎片，并置于含有生长培养基和高剂量(HD)IL-2的培养板或小培养瓶中。在此“预快速扩增方案(pre-rapid expansion protocol)”(pre-REP)阶段，初始将TIL扩增3-5周，达到至少50×106个细胞。使用Neon转染系统(100uL或10ul试剂盒，Invitrogen，Life Technologies)对TIL进行电穿孔。使TIL沉淀并用T缓冲液洗涤一次。针对10ul尖端，以在10μL T缓冲液中2x105个细胞的密度将TIL进行重悬，而针对100ul尖端以在100ul T缓冲液中3x 106个细胞的密度将TIL进行重悬。然后使用15ug Cas9mRNA和10-50ug PD-1、CTLA-4和CISH gRNA-RNA(100mcl尖端)以1400V、10ms、3个脉冲对TIL进行电穿孔。转染后，以1000个细胞/effectuL将TIL铺在不含抗生素的培养基中，并在5％CO2下温育24hr。24hr恢复后，可将TIL转移至含抗生素的培养基中，并在5％CO2下进行培养。
然后通过在PBMC饲养细胞和IL-2存在的情况下使用抗CD3刺激TIL，使细胞在两周内经受快速扩增方案(REP)。对扩增的TIL(当前的数十亿个细胞)进行洗涤、汇集并输注到患者中，然后进行一或两个周期的HD IL-2治疗。在TIL转移之前，可采用使用环磷酰胺(Cy)和氟达拉滨(Flu)的预备方案治疗患者，该预备方案短暂地消耗宿主淋巴细胞从而为输注的TIL“腾出空间(making room)”并去除细胞因子汇集和调节性T细胞以便促进TIL存续。受试者在30分钟内接受其自身的修饰的TIL细胞的输注，并留在医院中以监测不良事件，直到他们从治疗中恢复。图40A和图40B示出了两个不同受试者的TIL的细胞扩增。图41A和图41B示出了用CRISPR系统和抗PD-1指导物进行电穿孔并在添加饲养细胞或不添加饲养细胞的情况下进行培养的TIL的细胞扩增。
实施例4：gRNA修饰
修饰的指导RNA的设计和构建
将指导RNA(gRNA)设计成期望的基因区域。基于由脱靶位置所确定的最高排名值来选择多种gRNA(在表4中示出)。将靶向PD-1、CTLA-4和CISH基因序列的gRNA修饰成含有3硫代磷酸2-O-甲酯添加(图22和图32)。
实施例5：用于胃肠癌的TIL疗法的I期临床试验
患有可评估的胃肠癌的受试者将经历肿瘤样品的切除。将生长并扩增肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。肿瘤浸润性淋巴细胞的多个个体片段或多个个体培养物将离体生长。单独扩增个体培养物，并且当从每种培养物中扩增足够产量的TIL(大约108个细胞)时，将TIL冷冻保存并取等分试样用于免疫学测试。使原始肿瘤的等分试样经受外显子组测序，并且在可能时使其经历转录组测序以鉴别与受试者的正常细胞相比在癌症中独特存在的突变。使用体外功能性测试来测试每种培养的TIL制备物的等分试样对经鉴别的突变的反应性。简而言之，用25聚体肽对受试者的抗原呈递细胞进行脉冲，该25聚体肽包括中心的突变肽，该突变肽的侧翼为12个正常氨基酸。或者，将编码所有突变的体外转录RNA电穿孔到患者的抗原呈递细胞中。使用这些技术中的任一种或两种，然后测试预先冷冻保存的TIL培养物用于鉴别所识别的确切突变的反应性。然后使具有针对个体癌症突变的高度反应性的培养物经受CISH基因的CRISPR敲除。可以从每个患者选择至多五种不同的培养物用于该过程。将具有已证明的突变反应性的培养物送至良好生产规范(GMP)细胞生产设施，其中CRISPR技术用于敲除CISH基因。通过基于分解追踪插入缺失(TIDE)分析的DNA测序来确定CISH基因的敲除。然后利用OKT3和饲养细胞快速扩增CISH基因成功敲除的细胞群体。然后将冷冻保存的淋巴细胞用于患者治疗。在该临床试验方案的第一部分中，每组使用一名受试者，以109个CISH敲除细胞/受试者开始剂量递增。以半对数增量处理个体受试者，并且如果观察到由于细胞输注造成的高于2级的任何毒性，则随后将该组扩展至另外的患者。使用以下剂量：1)109个细胞2)3x109个细胞3)1010个细胞4)3x 1010个细胞5)3x 1010至2x 1011个细胞。患者接受淋巴细胞清除预备方案，然后输注工程化细胞和高剂量IL-2。在施用细胞产品后约4至6周评估患者的细胞持久性以及临床反应。每位患者仅接受单个疗程，并且每月对患者进行随访，收集淋巴细胞和血清用于免疫学研究。
评估了在患有难治性转移性癌症的患者中施用CISH基因敲除的突变反应性自体淋巴细胞的安全性。还确定了在患有转移性癌症的患者中使用淋巴细胞的标准非清髓性预处理方案——具有CISH基因敲除的突变反应性TIL加上高剂量IL-2的响应速率，以及患有转移性胃肠癌的患者中CISH敲除突变反应性淋巴细胞的存活和持久性。
实施例6：在鼠模型中的CISH敲低
为了探索Cish在CD8+T细胞中的作用，从野生型(WT)或Cish-/-pmel-1小鼠中分离CD8+T细胞，用来自C57BL/6小鼠的肽脉冲的脾细胞刺激，并检查在体外的增殖和细胞因子产生。CD8+T细胞分离后的流式细胞术分析揭示，CD8+T细胞分化状态在有或没有Cish的情况下都在稳态下保持不变。在体外引发后一周CD8+T细胞的计数揭示，在没有Cish的情况下具有显著更多的T细胞。细胞凋亡的评估可以解释这种增加的体外T细胞扩增。对引发的T细胞进行TCR刺激并用核染色剂7-AAD和膜联蛋白V染色，膜联蛋白V与凋亡前细胞的细胞表面上的磷脂酰丝氨酸结合。
实施例7：Cish缺陷的黑素瘤鼠模型
Cish缺陷的CD8+T细胞的体内功能意义可以通过使用pmel-1黑素瘤模型来确定。将具有或不具有Cish的黑素瘤特异性pmel-1T细胞过继转移(ACT)到已建立的携带B16黑素瘤的C57BL/6宿主中，并通过荧光标记肿瘤细胞的IVIS成像和转移的工程化细胞的流式细胞术分析来评估肿瘤生长和体内持久性。与WT T细胞相比，Cish缺陷的pmel-1T细胞的ACT导致已建立的较大肿瘤的显著且持久的消退。这种显著的消退还导致存活改善，Cish-/-T细胞的ACT使荷瘤小鼠的存活延长超过60天。在同系标记的pmel-1T细胞的ACT后对经处理的小鼠的连续取样揭示出与从该小鼠的WT同窝小鼠获得的T细胞相比，Cish缺陷的T细胞显著扩增和延迟收缩。
实施例8：Rag1-/-中Cish缺陷的黑素瘤鼠模型
使用缺乏适应性免疫系统的荷瘤宿主评估了Cish调节的CD8+T细胞固有的体内肿瘤杀伤。将具有或不具有Cish的低于治疗数目的pmel-1T细胞(2.5x 105个)过继转移到“空的”Rag1-/-B16荷瘤宿主中，减少施用疫苗(1x 107PFU)和外源IL-2(2x 104IU)，然后评估肿瘤生长。预期施用低于治疗量的肿瘤特异性Cish缺陷的CD8+T细胞而非WT CD8+T细胞使肿瘤长期“维持”或消退，可触及肿瘤块超过50天没有进展。将确定Cish-/-肿瘤特异性T细胞是否在体内维持其增大的功能性亲合力。为此，在转移后7天，用磁珠从脾细胞离体富集同系标记的pmel-1T细胞，并评估针对肽脉冲靶标的IFN-γ释放。可以导致离体刺激的Cish-/-的功能性亲合力与WT T细胞相比显著增加。当靶向通常表达低水平抗原的肿瘤时，这种增强的功能性亲合力的明显“维持”可能是重要的。通过CD8耗尽的ACT后35天，Cish-/-肿瘤特异性T细胞才消除，然后进行肿瘤生长分析以评估长期肿瘤特异性。
实施例9：gRNA安全性分析
为了通过下一代深度测序评估脱靶位点，用靶向PD-1或CISH的CRISPR/Cas9试剂对人外周血来源的T细胞进行电穿孔，并在转染后72小时收获基因组DNA。通过PCR从靶T细胞池扩增每个位点(预测的Cas9切割位点周围的250个核苷酸)，并使用Illumina Hi-Seq机器进行深度测序。这使得能够对来自PCR产物池的序列读数进行了非常深入的分析，每个脱靶位点平均有450,000个序列读数可用于检测。因此，使用该方法甚至可以容易地检测低丰度的脱靶修饰。
将来自用CRISPR/Cas9试剂转染的T细胞的每个脱靶位点的深度测序输出与未处理的T细胞进行比较，以鉴别已经经历CRISPR介导的修饰的位点。对于PD-1，71个候选位点中只有1个显示出脱靶修饰频率高于未处理对照细胞中观察到的频率的证据(参见表10)，并且针对CISH分析的位点都没有显示出CRISPR介导的修饰的证据(参见表11)。针对PD-1gRNA所发现的脱靶活性显示出小于1％的破坏频率，并且该位点映射到基因组内的序列，该序列不属于任何已知的编码基因，并且因此如果经修饰不太可能对T细胞功能有任何影响。
实施例10：反应性TIL的鉴别和分离
从癌症病变分离TIL。对在与用无关串联小基因(TMG)RNA或指定的TMG-MCSP构建体(其编码通过全外显子组和转录组测序鉴别的61个突变)转染的自体树突细胞共培养后的24个个体TIL培养物进行ELISPOT测定。IFN-γ产量通过ELISPOT试验，或对与树突细胞(DC)共培养后的TIL培养物的CD8+和/或CD4+T细胞上的4-IBB或CD28表达进行的流式细胞术分析来确定，该树突细胞用无关TMG RNA或TMG-MCSP转染或者与TMG-MCSP编码的突变长肽一起温育过夜。
对显示出对MCSP的反应性的TIL培养物进行了基于流式细胞术的TCR-Vβ谱型分析。使用来自经富集的TCR-Vβ群体的TCR-α和β链序列进行抗MCSP TCR-Vβ群体的基于磁珠的富集，该经富集的TCR-Vβ群体通过5’RACE和TCR-PCR确定。
表10：通过深度测序分析的PD-1gRNA的预测的脱靶位点。示出了DNA序列及其基因组位置，以及基因组位点与gRNA之间的错配数目。如果位点位于基因内，则记录该基因名称。突变频率下的空白意味着没有比未处理的对照细胞中观察到的更高的可检测频率。
表11：通过深度测序分析的CISH gRNA的预测的脱靶位点。示出了DNA序列及其基因组位置，以及基因组位点与gRNA之间的错配数目。如果位点位于基因内，则记录该基因名称。突变频率下的空白意味着没有比未处理的对照细胞中观察到的更高的可检测频率，而‘TBD’表示需要后续测序的位点。
实施例10：患有转移性癌症的患者中肿瘤浸润性淋巴细胞过继转移的I/II期试验，其中编码CISH的基因使用CRISPR/Cas 9系统灭活目的：
主要目的是1)确定在患有难治性转移性癌症的患者中施用敲除CISH基因的突变反应性自体淋巴细胞的安全性；以及2)确定在患有转移性癌症的患者中标准非清髓性预处理方案加上施用敲除CISH基因的突变反应性TIL加上高剂量IL-2的响应率。次要目的是评估在患有转移性癌症的患者中CISH敲除突变反应性淋巴细胞的存活和持久性。
资格
年龄大于或等于18且小于或等于70岁的受试者符合资格。受试者患有标准化疗难治的可评估转移性癌症，转移性癌症病变适合于手术切除以制备TIL，对高剂量阿地白介素施用没有禁忌症，并且没有并发的重大医学疾病或任何形式的免疫缺陷。
纳入标准
纳入标准包括可测量的癌症黑素瘤，其具有至少一个可切除用于TIL产生的病变，加上可测量的另一个病变以及转移性癌症的确诊。具有三处或更少的直径小于1cm并且无症状的脑转移的患者是符合资格的。经立体定向放射外科治疗的病变必须在治疗后1个月是临床稳定的，以使患者符合资格。具有手术切除的脑转移的患者符合资格。至少一种一线标准疗法后的进行性疾病：距可能影响抗癌免疫应答的任何这些先前抗体疗法的时间必须已经经过六周，在此时，患者接受预备方案以允许抗体水平下降。先前接受过伊匹木单抗且记录为GI毒性的患者必须有用正常结肠活检物进行的正常结肠镜检查。患者年龄大于或等于18岁且小于或等于70岁，并且临床体力状态为ECOG0或1。患者的预期寿命超过三个月。两种性别的患者必须自愿在入选本研究直至治疗后四个月的时间内实行节育。
血清学
患者为HIV抗体血清反应阴性。HIV血清反应阳性的患者可能具有降低的免疫能力，并且因此对实验性治疗的响应较低且更易受其毒性影响。患者为乙型肝炎抗原血清反应阴性，丙型肝炎抗体血清反应阴性。如果丙型肝炎抗体测试为阳性，则必须通过RT-PCR测试患者是否存在抗原，并且患者必须是HCV RNA阴性。有生育潜力的妇女的妊娠试验必须呈阴性。
血液学
绝对嗜中性粒细胞计数在没有非格司亭支持的情况下大于1000/mm3，WBC≥3000/mm3，血小板计数≥100,000/mm3，血红蛋白>8.0g/dl。
化学
患者的血清ALT/AST≤正常上限的2.5倍，血清肌酸酐≤1.6mg/dl，并且总胆红素≤1.5mg/dl，患有Gilbert综合征的患者除外，其总胆红素必须小于3.0mg/dl。在患者接受预备方案时，任何先前的全身治疗已过去超过四周，并且患者的毒性已恢复至1级或更低(毒性如脱发或白癜风除外)。患者在先前的治疗后患有进行性疾病。患者可以在过去3周内经历过小外科手术，只要所有毒性已恢复至1级或更低。在患者接受预备方案时，距可能影响抗癌免疫应答的任何抗体疗法(包括抗CTLA4抗体疗法)的时间已经过去六周，以允许抗体水平下降。
排除标准
排除怀孕或哺乳期或有任何形式的原发性免疫缺陷(例如重症联合免疫缺陷病)的有生育潜力的妇女。排除患有并发机会性感染的患者。排除患有活动性全身感染(例如，需要抗感染治疗)、凝血功能障碍，或心血管、呼吸系统或免疫系统的其他活动性重大医学疾病(如通过阳性铊应激或可比测试证明的，心肌梗死、心律失常、阻塞性或限制性肺病)的患者。排除同时进行全身性类固醇治疗的患者，对环磷酰胺或氟达拉滨有严重的速发型超敏反应病史的患者，或有冠状动脉血运重建或缺血症状的病史的患者。记录的患者LVEF小于或等于45％；对于年龄>65岁，临床上显著的房性和/或室性心律失常的患者，需要进行测试，该房性和/或室性心律失常包括但不限于：心房颤动、室性心动过速、二度或三度心脏传导阻滞。
筛选评估
在开始化疗方案前四周内：
完整的病史和体格检查，包括体重、ECOG和生命体征以及眼科检查，详细记录存在的任何病变的确切大小和位置。(注意：患者病史可在8周内获得)，胸部X射线，EKG，胸部、腹部和骨盆的基线CT以及脑部MRI，以评估疾病状态。如果基于患者的体征和症状有临床指示，则进行另外的扫描和X射线。对于吸烟史较长(过去2年内吸烟20包/年)或有呼吸功能障碍症状的患者进行肺功能测试。(注意：在治疗的8周内进行)。对于年龄大于或等于60岁的患者或有缺血性心脏病、胸痛或有临床意义的房性和/或室性心律失常病史的患者进行心脏评估(铊应激、超声心动图、MUGA等)，该房性和/或室性心律失常包括但不包括仅限于：心房颤动、室性心动过速、心脏传导阻滞。LVEF小于或等于45％的患者将是不合格的。存在心脏风险因素的60岁以下患者可以经历如上所述的心脏评估(例如，糖尿病、高血压和肥胖。)(注意：可在治疗的8周内进行)。HIV抗体滴度和HbsAG测定，以及抗HCV(可在化疗开始日期的3个月内进行。)。抗CMV抗体滴度、HSV血清学和EBV小组(panel)。(注意，可在化疗开始日期的3个月内进行；已知对上述任何一项呈阳性的患者不需要重新测试。)
在开始化疗方案前14天内：
基线血液测试，Chem 20：(钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、总CO2(碳酸氢盐)、肌酸酐、葡萄糖、尿素氮(BUN)、白蛋白、钙总量、镁总量(Mg)、无机磷、碱性磷酸酶、ALT/GPT、AST/GOT、总胆红素、直接胆红素、LD、总蛋白、总CK、尿酸)、甲状腺小组、分类CBC和血小板计数、PT/PTT、尿分析，以及培养，如果有指示。在开始化疗方案前7天内：
对所有有生育潜力、ECOG体力状态为0或1的妇女进行β-HCG妊娠测试(血清或尿液)。
研究设计
患有可评估的转移性癌症的患者经历肿瘤切除术。来自肿瘤的淋巴细胞(TIL)根据图42中示出的过程进行生长和扩增。使肿瘤浸润性淋巴细胞的多个个体片段或多个个体培养物生长。单独扩增个体培养物，并且当从每种培养物中扩增足够产量的TIL(大约108个细胞)时，将TIL冷冻保存并取等分试样用于免疫学测试。原始肿瘤的等分试样经受外显子组测序，并且在可能的情况下进行转录组测序，以鉴别与正常细胞相比在癌症中独特存在的突变。使用先前描述的方法来测试每种培养的TIL制剂的等分试样对这些突变的反应性。简而言之，用25聚体肽对患者的抗原呈递细胞进行脉冲，该25聚体肽包括中心的突变肽，该突变肽的侧翼为12个正常氨基酸。或者，将编码所有突变的体外转录RNA电穿孔到患者的抗原呈递细胞中。使用这些技术中的任一种或两种，测试先前冷冻保存的TIL培养物对个体癌症突变的反应性，并使其经历CISH基因的CRISPR敲除。从每个患者选择至多五种不同的培养物用于该过程。
将具有已证明的突变反应性的培养物送至GMP细胞生产设施，其中CRISPR技术用于在cGMP条件下敲除CISH基因。通过基于分解追踪插入缺失(TIDE)分析的DNA测序来确定CISH基因的敲除。然后利用OKT3和饲养细胞快速扩增CISH基因成功敲除的细胞群体。将冷冻保存的淋巴细胞用于患者治疗。
在该方案的第一部分中，每组使用一个患者，以109个CISH敲除细胞/患者开始剂量递增。以半对数增量处理个体患者，并且如果观察到高于2级的任何毒性，则该组扩展至另外的患者。因此使用以下剂量：109个细胞、3x 109个细胞、1010个细胞、3x 1010个细胞以及3至10x 1010个细胞。
患者接受淋巴细胞清除预备方案，然后输注细胞和高剂量阿地白介素。在施用细胞产品后约4-6周评估患者的细胞持久性以及临床反应。每位患者仅接受单个疗程，并且每月对患者进行随访，收集淋巴细胞和血清用于免疫学研究。
药物施用
具有环磷酰胺和氟达拉滨的预备方案：
时间作为实例提供并且可以改变，只要维持药物施用之间的类似时间关系即可。对于每日一次给予的药物，研究药物开始时间应在计划时间的2小时内给予。所有其他药物应在计划时间的+/-一小时内给予；施用的时长均为+/-15分钟。利尿剂的施用、电解质补充以及水合(hydration)和电解质的监测都应按临床指示进行—下面记录的剂量和时间仅作为实例提供。根据医学指示，输注可能会减慢或延迟。第-7和第-6天
6AM水合物：用含有10meq/L氯化钾的0.9％氯化钠注射液以2.6ml/kg/小时开始水合(在环磷酰胺前11小时开始并持续水合直至最后一次环磷酰胺输注后的24小时)。在预备方案期间的任何时间，如果尿排出量<1.5ml/kg/小时或体重超过环磷酰胺输注前的体重值>2kg，则可静脉内施用呋塞米10-20mg。在施用呋塞米后，应按照指示来监测和处理血清钾。
4PM：针对恶心给予昂丹司琼(0.15mg/kg/剂量[基于患者体重在8mg至16mg之间四舍五入到最接近的偶数mg剂量]，静脉内，每8小时一次，持续3天)。
5PM：250ml D5W中的环磷酰胺(60mg/kg/天，持续2天，静脉内)，美司钠15mg/kg/天(持续2天，经1hr)。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量使用实际体重计算。
10pm：在每个环磷酰胺剂量后，以合适的稀释剂(参见药物部分)稀释，经23小时以静脉内3mg/kg/小时开始美司钠输注。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量使用实际体重计算。
第-7至第-3天
氟达拉滨25mg/m2/天，IVPB每日，经30分钟，持续5天。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量使用如附录2所述的实际体重计算。(在第-7和第-6天，在环磷酰胺和美司钠施用后约1-2小时开始施用氟达拉滨)。
第0天(最后一个剂量的氟达拉滨后2至4天)：
通过非过滤管经20至30分钟静脉内施用自体TIL输注液，在输注期间轻轻搅动袋子以防止细胞凝集。
阿地白介素如下所述。第1-4天(第0天是细胞输注的那一天)：
阿地白介素如下所述。从第1天或第2天开始，非格司亭可以以5mcg/kg/天(不超过300mcg/天)的剂量皮下施用。每日持续施用非格司亭，直至嗜中性粒细胞计数>1.0x109/L持续3天或>5.0x109/L。
表12：治疗时间线和所施用的药物
1最后一个剂量的氟达拉滨后的2至4天
2细胞输注后24小时内开始
3持续直至嗜中性粒细胞计数>1X109/L(持续3个连续日)或>5x109/L。4TMP/SMX时间表应调整为每周三次(周一、周三、周五)QD并持续至少六个月，直到CD4>200X 2
5持续直至ANC>1000/mm36；HSV阳性的患者持续直至CD4>200X2
阿地白介素：静脉内施用
阿地白介素以720,000IU/kg(基于总体重)的剂量以静脉推注的方式经15分钟施用，从细胞输注的24小时内开始并持续至多5天(最多15个剂量)。剂量优选每8小时施用一次；然而，根据患者的耐受性，剂量之间可间隔至多24小时。如果在最后一个剂量的阿地白介素的24小时内在有支持措施的情况下毒性没有充分恢复，则停止阿地白介素给药。除了对阿地白素而言常见的可逆3级毒性如腹泻、恶心、呕吐、低血压、皮肤变化、厌食、粘膜炎、吞咽困难或全身症状和实验室改变(如附录3所述)之外，如果患者由于阿地白介素达到3级或4级毒性，则延迟或停止给药。管理毒性。如果这些毒性可以通过支持措施在24小时内容易地逆转，则然后给予另外的剂量。
在开始预备方案之前
单采血液成分术如所示。在开始预备方案之前的14天内，对患者进行全血细胞计数，电解质、BUN、肌酸酐、肝功能测试，TBNK和血清化学。如果任何结果超出了确定的资格标准，则患者不会继续进行实验，直到可以解决该异常。
在预备方案期间：每日
全血细胞计数，Chem 20等价物：(钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、总CO2(碳酸氢盐)、肌酸酐、葡萄糖、尿素氮(BUN)、白蛋白、钙总量、镁总量(Mg)、无机磷、碱性磷酸酶、ALT/GPT、AST/GOT、总胆红素、直接胆红素、LD、总蛋白、总CK、尿酸、尿分析。
细胞输注后
除非另有临床指示，否则每小时(+/-15分钟)监测生命体征持续4小时，然后常规(每4-6小时)监测生命体征。一旦总淋巴细胞计数大于200/mm3，每周抽取TBNK用于外周血CD4计数(当患者住院时)。
住院期间，每1-2天
根据临床指示的系统和体格检查的回顾，CBC，Chem 20等价物：钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、总CO2(碳酸氢盐)、肌酸酐、葡萄糖、尿素氮(BUN)、白蛋白、钙总量、镁总量(Mg)、无机磷、碱性磷酸酶、ALT/GPT、AST/GOT、总胆红素、直接胆红素、LD、总蛋白、总CK、尿酸。根据临床指示进行其他测试。
研究后评估(随访)
在施用细胞产品后6周(+/-2周)，所有患者返回医院进行评估。每个计划的评估患者经理：体格检查，Chem 20等价物：钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、总CO2(碳酸氢盐)、肌酸酐、葡萄糖、尿素氮(BUN)、白蛋白、钙总量、镁总量(Mg)、无机磷、碱性磷酸酶、ALT/GPT、AST/GOT、总胆红素、直接胆红素、LD、总蛋白、总CK、尿酸、全血细胞计数、临床指示的甲状腺小组、TBNK，直到CD4>200X 2、毒性评估，包括系统回顾。如临床指示的胸部、腹部和骨盆的CT。如果有临床指示，可以进行其他扫描或X射线，例如脑MRI、骨扫描。在第一次随访访视时可以进行5升单采血液成分术，如果患者不能进行单采血液成分术，则可以获得大约96ml血液。随后，在持续至少3个月的随访访视时获得大约60ml血液。冷冻保存外周血单核细胞，以便可以进行免疫学测试。
感染预防
杰氏肺囊虫(Pneumocystis Jirovecii)肺炎
所有患者均接受作为双倍强度(DS)片剂(DS片剂＝TMP 160mg/片和SMX 800mg/片)的三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲噁唑[SMX]的固定组合，每日口服，每周三次(非连续日)，在第-5天到第-8天之间开始。在具有磺胺变态反应的患者中，戊烷脒替代TMP/SMX-DS。戊烷脒在化疗开始日期的一周内以300mg/雾化器进行雾化施用。
疱疹病毒预防
在化疗结束后第二天，以每日500mg的剂量向HSV血清学阳性的患者口服给予伐昔洛韦，如果患者不能口服药物，则给予阿昔洛韦，250mg/m2，静脉内，经12小时。据报道，静脉内阿昔洛韦引起可逆性肾功能不全，而口服阿昔洛韦不会。据报道，较高剂量的阿昔洛韦引起神经毒性，包括谵妄、震颤、昏迷、急性精神障碍和异常EEG。如果发生这种情况，进行剂量调整或停药。阿昔洛韦不与其他干扰DNA合成的核苷类似物(例如更昔洛韦)同时使用。在肾脏疾病中，根据产品标签调整剂量。肺囊虫和疱疹的预防将在化疗后持续6个月。如果化疗后6个月CD4计数小于200，则预防将持续至连续2次测量的CD4计数大于200。
真菌预防(氟康唑)
患者在化疗结束后第二天开始口服400mg氟康唑，并持续至绝对嗜中性粒细胞计数大于1000/mm3。在无法口服的患者中，该药物可以以在0.9％氯化钠(USP)中400mg的剂量每日静脉内给药。
经验性抗生素
对于一次38.3℃的发热，或温度为38.0℃或以上且至少间隔1小时的两次发热，以及ANC<500/mm3，患者开始使用广谱抗生素，第3代或第4代头孢菌素或喹诺酮。所有患有原因不明的发热或任何感染性并发症的患者均可获得感染性疾病会诊。
血液制品支持
使用每日CBC作为指导，患者根据需要接受血小板和浓集红细胞(PRBC)。对所有血液制品进行照射。为全血和血小板输血使用白细胞过滤器，以减少对输入的WBC的敏感性并降低CMV感染的风险。
控制副作用的其他伴随药物
可以给予控制治疗副作用的伴随药物。如果发生严重的畏寒，则静脉内给予哌替啶(25-50mg)。根据需要给予其他支持疗法，并且支持疗法可包括对乙酰氨基酚(650mg经4h)、吲哚美辛(50-75mg经6h)和雷尼替丁(150mg g12h)。如果患者需要类固醇治疗，则他们将退出治疗。需要输血的患者将接受经照射的血液制品。对于恶心和呕吐，每8小时静脉内施用0.15mg/kg/剂量的昂丹司琼。对于不受昂丹司琼控制的恶心和呕吐，根据需要施用另外的止吐药。中心静脉导管的抗生素覆盖可以按研究者的决断来提供。
肿瘤活组织检查
可以进行肿瘤组织或淋巴结的活组织检查，但在治疗过程中这不是必需的。研究可以评估肿瘤的抗原表达，并评估从这些活活检物中生长的淋巴细胞的反应性。活组织检查可以在基线、治疗过程之后以及在响应的情况下进行。仅在基于所进行的程序以及粒细胞和血小板计数预期发病率最小时才进行这些活组织检查。仅在活组织检查在医院不需要超过1天时才允许进行活组织检查。
免疫学测试：
可以在施用细胞产品之前和之后6周(+/-2周)进行单采血液成分术。在其他时间点，使用在Ficoll垫层(Ficoll cushion)上离心通过纯化从全血获得患者外周血淋巴细胞(PBL)。将这些PBMC的等分试样冷冻保存用于细胞功能的免疫监测。多种测试，包括特异性裂解和细胞因子释放评估、代谢组学和生物能量研究(使用Seahorse)、细胞因子产生的细胞内FACS、ELISA斑点测定和淋巴细胞亚群分析，可用于评估治疗的免疫相关性。通常，这些测定中2至3倍的差异表明真正的生物学差异。将所有输注的细胞产品的样品冷冻保存，并对输注细胞的表型和功能进行广泛的回顾性分析，以尝试在体外找到与体内抗肿瘤活性相关的输注细胞的特性。TIL样品的分析将包括评估输注的TIL的活性、特异性和端粒长度。在本研究项目过程中收集的血液和组织标本可以存入库，并在将来用于研究新的科学问题。
阿地白介素(白介素-2，Proleukin，重组人白介素2)
制剂/重构：阿地白介素作为一次性使用小瓶提供，该小瓶含有作为无菌、白色至米白色冻干饼的2200万IU(1.3mg)IL-2，加上50mg甘露醇和0.18mg十二烷基硫酸钠，用约0.17mg磷酸二氢钠和0.89mg磷酸氢二钠缓冲至pH值为7.5(范围为7.2至7.8)。小瓶用1.2mL无菌注射用水(USP)重构，所得浓度为1800万IU/ml或1.1mg/mL。稀释剂应对准小瓶的侧面，以避免过度起泡。轻轻涡旋内容物直至完全溶解。不要摇晃。由于小瓶不含防腐剂，因此应在24小时内使用重构溶液。
稀释度/稳定性：重构的阿地白介素应当用50mL的5％人血清白蛋白(HSA)进一步稀释。在添加RIL-2之前，将HSA添加至稀释剂中。在玻璃瓶或聚氯乙烯袋中，重构溶液的超过1000倍(即，1mg/mL至1mcg/mL)的稀释度是可接受的。阿地白介素在冷藏温度和室温(2°–30℃)下化学稳定48小时。
施用：剂量基于总体重计算。阿地白介素的最终稀释液经15分钟输注。当住院时施用阿地白介素。
氟达拉滨
施用：氟达拉滨在100ml 0.9％氯化钠(USP)中经15至30分钟以静脉内输注的方式施用。剂量基于体表面积(BSA)。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量使用实际体重计算。
环磷酰胺
施用：环磷酰胺在250ml D5W中稀释并经1小时输注。剂量基于患者的体重。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量使用实际体重计算。
美司钠(2-巯基乙磺酸钠，Mesnum，Mesnex，NSC-113891)
施用：在D5W或0.9％NaCl中稀释至小于或等于20mg美司钠/ml流体的浓度，并以连续输注的方式静脉内施用。如果患者肥胖(BMI>35)，药物剂量使用实际体重计算，如附录2所述。毒性包括恶心、呕吐和腹泻。
非格司亭(粒细胞集落刺激因子，G-CSF，非格司亭，Neupogen)
非格司亭是商购获得的，以300ug/ml和480ug/1.6ml小瓶供应。非格司亭应该冷藏，并且不允许。非格司亭以每日皮下注射的方式给药。
实施例14：GMP工艺验证
对CRISPR/Cas9系统的临床转化考虑的是将经敲除TIL产品扩大到通过标准快速扩增方案(REP)实现的产量的能力。利用改进的REP策略，在CRISPR/Cas9试剂的电穿孔后，在3个独立的cGMP工艺验证运行中实现了1071倍的平均倍数扩增(表13以及图43A、图43B、图43C和图44)。由于现在具有同时开始多个REP的能力，该系统将持续产生超过1x1010个经敲除TIL的细胞产量以用于患者输注。冷冻保存也是可以实现的，表14。
表13：在cGMP工艺验证期间实现的细胞产量
表14：在cGMP工艺验证期间实现的冷冻保存
实施例11：检测蛋白质水平的基因组破坏
为了确定在遗传水平上观察到的敲除频率是否与蛋白质损失相关，评估了CRISPR/Cas9敲除后PD-1蛋白和CISH蛋白的表达。外周血(PB)T细胞和TIL可以在电穿孔后第14天使用平板结合的抗CD3和可溶性抗CD28抗体进行再刺激，并且通过流式细胞术和蛋白质印迹分别对PD-1蛋白和CISH蛋白的丧失进行评估。如图48所示，在第14天，在>90％的PB T细胞和TIL中PD-1蛋白丧失。这些数据证实敲除细胞在修饰后丧失了靶蛋白表达，并且重要的是，证明敲除细胞在修饰后得到保留、扩增，并且是有活力的，图46。
采用相同的策略来确定在蛋白质水平下的CISH敲除程度。将CRISPR/Cas9修饰的PB T细胞和TIL扩增14天，然后再刺激48小时。随后收集细胞并通过蛋白质印迹分析提取物，因为CISH是细胞内蛋白质。与通过基因组修饰的TiDE分析得到的高敲除率一致，CISH蛋白在敲除PB T细胞和TIL中基本上不存在(图45)。这些数据表明，这种在原代人T细胞和TIL中基于CRISPR/Cas9的基因破坏的策略导致高效的靶向基因敲除。
实施例12：非常复杂的评估的简化表示(Simplified Presentation of IncrediblyComplex Evaluations，SPICE)分析
除了在CRISPR/Cas9编辑后维持高细胞活力和增殖之外，还试图确定经敲除的T细胞在活化后是否保留效应子功能。使用细胞内染色和流式细胞术结合非常复杂的评估的简化表示(SPICE)分析，证明经敲除的T细胞在再刺激时维持细胞因子多功能性。这表明在CRISPR/Cas9介导的基因编辑后PB T细胞和TIL的效应子功能得到保留(图47A和图47B)。
实施例13：在具有和没有IL-2的情况下良好生产规范TIL的生长动力学
选择良好生产规范运行中使用的肿瘤浸润性淋巴细胞作为寡克隆亚群，使用肿瘤全外显子组测序和串联小基因/合成长肽筛选可知，该寡克隆亚群具有针对患者特异性癌症新抗原的特异性反应性。在长期培养中，在存在IL-2的情况下观察到细胞扩增(图50A)。在IL-2停用后第7天，在不存在IL-2的情况下进行生长实验，图50B。在没有IL-2的情况下，细胞数目和活力降低，并且到第7天，仅剩下少量活细胞(图50B)。
实施例14：通过GUIDE-Seq的脱靶频率检测
为了通过GUIDE-Seq评估脱靶频率，使用Neon转染系统，100μL尖端，采用8pmol或16pmol双链寡核苷酸(dsODN)(5’GTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTAT-3’)，在存在或不存在15μg Cas9mRNA和10μg的CISH gRNA的情况下对3x106个人PBL来源的T细胞进行电穿孔，图52。转染后72小时收获基因组DNA，并且通过PCR和Sanger测序以及随后的TiDE分析来评估在CISH靶位点处dsODN的整合频率。使用Covartis S2超声波破碎仪(Covartis)将基因组DNA剪切至平均长度为500bp。使用Agencourt AMPure XP珠子纯化试剂盒(BeckmanCoulter)纯化剪切的DNA，然后使用Anza DNA末端修复试剂盒(Thermo Fisher)将任何粘性DNA末端转化为5’磷酸化平端。然后使用PCR将条码化测序衔接子连接到基因组片段，以产生准备用于NGS分析的最终文库。
实施例15：CISH破坏的TIL的细胞遗传学分析
对在GMP制造工艺确认运行期间产生的CISH敲除的突变反应性TIL进行细胞遗传学分析。使用抗CD3和抗CD28抗体刺激TIL，然后使用Neon电穿孔系统基于电穿孔递送Cas9mRNA(15μg)和CISH gRNA(10μg)。电穿孔后，CISH破坏的突变反应性TIL在经照射的饲养细胞存在下经历REP 14天，此时分析样品的细胞遗传学。对以下5个样品进行细胞遗传学分析：PQ1CISH KO突变反应性TIL、PQ2CISH KO突变反应性TIL、PQ3预处理、PQ3CISH KO突变反应性TIL以及PQ3对照。
使13.0mL TIL悬浮培养物经历2.0小时的秋水仙酰胺处理，收获细胞，并通过G显带以400条带水平的分辨率完整地分析20个分裂中期。针对染色体4和9之间的易位，筛选另外30个分裂中期。细胞基因组学结果表明：
PQ 3对照：46，XX和46，XX。结果表明正常的女性核型。没有观察到易位。
表15：PQ3细胞遗传学总结
分析的分裂中期细胞的数目 20
筛选的分裂中期细胞的数目 30
核型分析的分裂中期细胞的数目 2
PQ 3预处理：46，XX和46，XX，t(4；9)(q31.3；q13)[9]/46，XX。分析的21个分裂中期细胞中的9个在4q31.3带的4号染色体的长臂与9q13带的9号染色体的长臂之间具有相互易位。其余12个分裂中期细胞中的每一个都具有46，XX核型，具有两个正常的4号和9号染色体。
表16：PQ3预处理总结
分析的分裂中期细胞的数目 21
筛选的分裂中期细胞的数目 0
核型分析的分裂中期细胞的数目 4
PQ1突变反应性TIL：46，XX。45，X，-X，add(1)(p13)，der(14)t(1；14)(p13；p11.1)，+21，i(21)(q10)。45，X，-X，add(1)(p13)，-7，+11，der(14)t(1；14)(p13；p11.1)。43，X，dic(x；12)(q21；p13)，-17，-19，der(21；22)(q10；q10)，+22。46，X，Del(x)(q21)。45，XX，-7，-18，+r/46，XX，del(8)(p12)，+14，i(14)(q10)。分析的23个分裂中期细胞中的6个具有数目和/或结构上的染色体异常。这些细胞中的除了一个之外的所有细胞都具有三个或更多个异常，这些异常优先涉及X染色体(4个细胞)和近端着丝粒染色体(13、14、15、21、22)短臂的重排。这六个细胞中只有两个共享相同的异常，符合克隆的标准。
表17：PQ1突变反应性TIL
分析的分裂中期细胞的数目 23
筛选的分裂中期细胞的数目 0
核型分析的分裂中期细胞的数目 4
PQ2突变反应性TIL：46，XX。45，XX der(15；22)(q10；q10)。分析的50个分裂中期细胞中的一个具有15号染色体与22号染色体之间的易位。
表18：PQ2突变反应性TIL
分析的分裂中期细胞的数目 20
筛选的分裂中期细胞的数目 30
核型分析的分裂中期细胞的数目 2
PQ3突变反应性TIL：46，XX。46，XX，t(4；9)(q31.3；q13)。46，XX，Del(7)(p11.2)。分析的20个分裂中期细胞中的8个在4q31.3带的4号染色体的长臂与9q13带的9号染色体的长臂之间具有相互易位。另外一个细胞具有7号染色体短臂的缺失，这被解释为非克隆事件，可能代表随机染色体断裂。
表19：PQ3突变反应性TIL
分析的分裂中期细胞的数目 20
筛选的分裂中期细胞的数目 0
核型分析的分裂中期细胞的数目 4

Claims (193)

1.一种治疗方法，其包括：
向有需要的受试者施用：
a)预备方案，所述预备方案包括以足以降低所述受试者的免疫应答的量向所述受试者施用至少一种免疫抑制剂；
b)包含足以抑制所述受试者的真菌感染的量的抗真菌剂的药物组合物；以及
c)包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括施用抗生素。
3.一种治疗方法，其包括：
向有需要的受试者施用：
a)预备方案，所述预备方案包括以足以抑制所述受试者的免疫应答的量向所述受试者施用至少一种免疫抑制剂；
b)包含足以抑制所述受试者的细菌感染的量的抗生素的药物组合物；以及
c)包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
4.如权利要求3所述的方法，其进一步包括施用抗真菌剂。
5.一种治疗方法，其包括：
向有需要的受试者施用：
a)包含足以降低所述受试者的免疫应答的量的环磷酰胺和氟达拉滨的药物组合物；
b)包含足以抑制所述受试者的真菌感染的量的氟康唑的药物组合物；以及
c)包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
6.如权利要求5所述的方法，其进一步包括施用包含足以抑制所述受试者的细菌感染的量的三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲噁唑的药物组合物。
7.一种治疗方法，其包括：
向有需要的受试者施用：
a)包含足以降低所述受试者的免疫应答的量的环磷酰胺和氟达拉滨的药物组合物；
b)包含足以抑制所述受试者的细菌感染的量的三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲噁唑的药物组合物；以及
c)包含多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的药物组合物，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
8.如权利要求7所述的方法，其进一步包括施用包含足以抑制所述受试者的真菌感染的量的氟康唑的药物组合物。
9.一种用于治疗癌症的方法，其包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的离体工程化肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中所述离体工程化TIL包含：细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因中的破坏，所述破坏导致所述体外工程化TIL中CISH蛋白质功能的抑制，其中所述破坏位于由SEQ ID NO:68的指导多核酸所结合的序列处。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述预备方案包括在施用所述TIL之前约14天至约24小时施用免疫抑制剂。
11.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述预备方案包括在施用所述TIL之前约10天至约24小时施用免疫抑制剂。
12.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述预备方案包括在施用所述TIL之前约7天至约24小时施用免疫抑制剂。
13.如权利要求1至4和10至12中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂包括放射治疗剂、生物剂或化学剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述免疫抑制剂包括所述化学剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述化学剂包括以下的至少一种：环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、噻替哌、六甲三聚氰胺、白消安、氟达拉滨、亚硝基脲、铂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述化学剂包括所述环磷酰胺。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述化学剂为氟达拉滨。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中施用约40mg/kg所述受试者至约50mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述环磷酰胺经至少约2天至约5天施用至所述受试者。
20.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中施用约10mg/kg所述受试者至约15mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述环磷酰胺经至少约7天至约10天施用至所述受试者。
22.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中施用约3mg/kg所述受试者至约5mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
23.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中施用约50mg/kg所述受试者至约80mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
24.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中施用超过50mg/kg的所述环磷酰胺。
25.如权利要求24所述的方法，其中施用约60mg/kg的所述环磷酰胺。
26.如权利要求15至25中任一项所述的方法，其中施用约20mg/m2所述受试者的体表面积至约30mg/m2所述受试者的体表面积的所述氟达拉滨。
27.如权利要求26所述的方法，其中施用约25mg/m2所述受试者的体表面积的所述氟达拉滨。
28.如权利要求1至4和10至27中任一项所述的方法，其中所述预备方案包括部分或完全的免疫抑制。
29.如权利要求1、2、4和10至28中任一项所述的方法，其中所述抗真菌剂选自：多烯、唑、烯丙基胺和棘白菌素。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述抗真菌剂为所述唑。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述唑选自：联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟环唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述唑为氟康唑。
33.如权利要求32所述的方法，其中施用约100mg至约800mg的所述氟康唑。
34.如权利要求33所述的方法，其中施用400mg的所述氟康唑。
35.如权利要求1、2、4和10至34中任一项所述的方法，其中所述抗真菌剂与所述TIL同时或顺序施用。
36.如权利要求35所述的方法，其中在所述TIL之后约第0天至约第4天施用所述抗真菌剂。
37.如权利要求2-4和10至36中任一项所述的方法，其中所述抗生素包括以下的至少一种：细菌壁靶向剂、细胞膜靶向剂、细菌酶干扰剂、杀菌剂、蛋白质合成抑制剂或抑菌剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述抗生素包括杀菌剂。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述杀菌剂为头孢菌素或喹诺酮。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述抗生素包括抑菌剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述抑菌剂预防性施用。
42.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述抑菌剂为三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒。
43.如权利要求42所述的方法，其中施用约100mg至约1000mg的所述三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒。
44.如权利要求43所述的方法，其中施用160mg的所述三甲氧苄二氨嘧啶。
45.如权利要求43所述的方法，其中施用800mg的所述磺胺甲噁唑。
46.如权利要求43所述的方法，其中施用300mg的所述戊烷脒。
47.如权利要求37至46中任一项所述的方法，其中所述抑菌剂在所述TIL之前、与所述TIL同时或在所述TIL之后施用。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述抑菌剂在所述TIL的所述施用之前约14天至所述TIL的所述施用之后约6个月施用。
49.如权利要求37至48中任一项所述的方法，其中所述抑菌剂在所述TIL之前约8天至所述TIL之后至少4天施用。
50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述施用包括静脉内、口服、肌内、腹膜内或胸膜内施用。
51.如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂通过输注施用。
52.如权利要求15至51中任一项所述的方法，其中所述环磷酰胺为约60mg/kg的剂量，并稀释在250ml 5％葡萄糖水溶液中且经1小时输注。
53.如权利要求15至52中任一项所述的方法，其中所述氟达拉滨为在100ml 0.9％氯化钠(USP)中25mg/m2的剂量，并经约15至约30分钟输注。
54.如权利要求1至53中任一项所述的方法，其进一步包括施用包含足以激活所述受试者中的所述TIL的量的免疫刺激剂的药物组合物。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述免疫刺激剂包括以下的至少一种：疫苗、集落刺激剂、干扰素、白介素、病毒、抗原、共刺激剂、免疫原性剂、免疫调节剂或免疫治疗剂。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述免疫刺激剂包括所述白介素。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述白介素为阿地白介素，并且以约550,000至约800,000IU/kg的剂量施用。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述阿地白介素以约720,000IU/kg的剂量施用。
59.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其进一步包括施用包含足以预防所述受试者的感染的量的感染预防剂的药物组合物。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述感染预防剂为疱疹病毒预防剂。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述受试者为HSV阳性。
62.如权利要求60至61中任一项所述的方法，其中所述疱疹病毒预防剂为伐昔洛韦或阿昔洛韦。
63.如权利要求1至62中任一项所述的方法，其中通过选自CRISPR、锌指、TALEN及其任何组合的系统来诱导所述破坏。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述系统为CRISPR系统。
65.如权利要求63至64中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3和Cas9HiFi的内切核酸酶。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述内切核酸酶为Cas9。
67.如权利要求65至66中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶执行所述破坏。
68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述破坏包括基因的外显子或内含子。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述破坏在基因的外显子中。
70.如权利要求1至69中任一项所述的方法，其中所述破坏在前间区序列邻近基序(PAM)的约20个碱基对内。
71.如权利要求1至70中任一项所述的方法，其中所述破坏在前间区序列邻近基序(PAM)的约10个碱基对内。
72.如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中所述破坏在前间区序列邻近基序(PAM)的约5个碱基对内。
73.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中所述破坏距离前间区序列邻近基序(PAM)3个碱基对。
74.如权利要求1至73中任一项所述的方法，其中所述破坏在SEQ ID NO:13的外显子或内含子中。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述破坏在SEQ ID NO:13的外显子中。
76.如权利要求63至75中任一项所述的方法，其中所述CRISPR系统包括指导多核酸。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述指导多核酸与SEQ ID NO:68具有至少约60％的同源性。
78.如权利要求1至77中任一项所述的方法，其中所述破坏包括双链断裂。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述双链断裂发生在SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:77处。
80.如权利要求1至79中任一项所述的方法，其中所述TIL以约1 x 109个细胞、3 x 109个细胞、1 x 1010个细胞、3 x 1010个细胞至约1 x 1011个细胞的剂量施用。
81.如权利要求1至80中任一项所述的方法，其中所述TIL经约30分钟施用。
82.如权利要求1至81中任一项所述的方法，其中所述TIL静脉内施用。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述静脉内包括输注。
84.如权利要求1至83中任一项所述的方法，其进一步包括对所述TIL进行输注前测试。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述输注前测试包括以下的至少一种：表型测试、效力测试、微生物学测试、内毒素测试、活力测试和肿瘤细胞测试。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述表型测试包括检测所述TIL上的CD3的存在。
87.如权利要求85至86中任一项所述的方法，其中所述效力测试包括在对所述TIL进行抗CD3刺激后检测IFNγ水平。
88.如权利要求85至87中任一项所述的方法，其中所述微生物学测试包括检测需氧培养物、厌氧培养物的生长、革兰状态、真菌状态或支原体状态。
89.如权利要求85至88中任一项所述的方法，其中所述内毒素测试包括进行鲎测定。
90.如权利要求85至89中任一项所述的方法，其中所述活力测试包括进行台盼蓝排除测定。
91.如权利要求85至90中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞测试包括细胞病理学测定。
92.如权利要求84至91中任一项所述的方法，其中当所述输注前测试中的所述微生物学测试为阴性时，施用所述TIL。
93.如权利要求84至92中任一项所述的方法，其中当所述输注前测试中的所述活力测试存在超过至少约70％的活细胞时，施用所述TIL。
94.如权利要求84至93中任一项所述的方法，其中当所述输注前测试中的所述表型测试存在至少约80％的CD3阳性时，施用所述TIL。
95.如权利要求84至94中任一项所述的方法，其中当所述输注前测试在所述效力测试中对所述TIL进行抗CD3刺激后的IFNγ为至少约200pg/mL/105个细胞时，施用所述TIL。
96.如权利要求84至95中任一项所述的方法，其中当所述输注前测试在所述细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中的肿瘤细胞为阴性时，施用所述TIL。
97.一种治疗产品，其包含具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏；以及抗真菌剂的剂型。
98.一种治疗产品，其包含足以抑制所述受试者的真菌感染的量的叶酸合成抑制剂或核酸交联剂的剂型；以及具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
99.一种治疗产品，其包含选自多烯、唑、烯丙基胺或棘白菌素的抗真菌剂的剂型；以及具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
100.一种治疗产品，其包含具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏，其中所述TIL以约7.0 x 107个细胞/mL至约2.0 x 108个细胞/mL的冷冻密度冷冻保存。
101.一种治疗产品，其包含：
a)抗真菌剂的剂型；
b)免疫抑制剂的剂型；
c)抗生素的剂型；以及
e)具有多种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的剂型，所述肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)包含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)基因的至少一部分的破坏。
102.如权利要求97至100中任一项所述的治疗产品，其中所述治疗产品进一步包含免疫抑制剂的剂型。
103.如权利要求102所述的治疗产品，其中所述免疫抑制剂被配制用于在所述TIL的施用之前约14天至约24小时向受试者施用。
104.如权利要求102至103中任一项所述的治疗产品，其中所述免疫抑制剂被配制用于在所述TIL的所述施用之前约10天至约24小时向受试者施用。
105.如权利要求102至104中任一项所述的治疗产品，其中所述免疫抑制剂被配制用于在所述TIL的所述施用之前约7天至约24小时向受试者施用。
106.如权利要求102至105中任一项所述的治疗产品，其中所述免疫抑制剂包括放射治疗剂、生物剂或化学剂。
107.如权利要求106所述的治疗产品，其中所述免疫抑制剂包括所述化学剂。
108.如权利要求107所述的治疗产品，其中所述化学剂包括以下的至少一种：环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、噻替哌、六甲三聚氰胺、白消安、氟达拉滨、亚硝基脲、铂、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲菌素、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素。
109.如权利要求108所述的治疗产品，其中所述化学剂包括环磷酰胺。
110.如权利要求108所述的治疗产品，其中所述化学剂包括氟达拉滨。
111.如权利要求108至110中任一项所述的治疗产品，其中施用约40mg/kg所述受试者至约50mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
112.如权利要求111所述的治疗产品，其中所述环磷酰胺经至少约2天至约5天施用至所述受试者。
113.如权利要求108至110中任一项所述的治疗产品，其中施用约10mg/kg所述受试者至约15mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
114.如权利要求113所述的治疗产品，其中所述环磷酰胺经至少约7天至约10天施用至所述受试者。
115.如权利要求108至110中任一项所述的治疗产品，其中施用约3mg/kg所述受试者至约5mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
116.如权利要求108至110中任一项所述的治疗产品，其中施用约50mg/kg所述受试者至约80mg/kg所述受试者的所述环磷酰胺。
117.如权利要求108至110中任一项所述的治疗产品，其中施用超过50mg/kg的所述环磷酰胺。
118.如权利要求117所述的治疗产品，其中施用约60mg/kg的所述环磷酰胺。
119.如权利要求108至118中任一项所述的治疗产品，其中施用约20mg/m2所述受试者的体表面积至约30mg/m2所述受试者的体表面积的所述氟达拉滨。
120.如权利要求119所述的治疗产品，其中施用约25mg/m2所述受试者的体表面积的所述氟达拉滨。
121.如权利要求102至120中任一项所述的治疗产品，其中所述免疫抑制剂产生部分或完全的免疫抑制。
122.如权利要求97至121中任一项所述的治疗产品，其中所述抗真菌剂的剂型选自：多烯、唑、烯丙基胺和棘白菌素。
123.如权利要求122所述的治疗产品，其中所述抗真菌剂为唑。
124.如权利要求123所述的治疗产品，其中所述唑选自：联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟环唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑。
125.如权利要求124所述的治疗产品，其中所述唑为氟康唑。
126.如权利要求124至125中任一项所述的治疗产品，其中所述氟康唑以约100mg至约800mg的量存在。
127.如权利要求126所述的治疗产品，其中所述氟康唑以400mg的量存在。
128.如权利要求97至127中任一项所述的治疗产品，其中所述抗真菌剂的剂型与所述TIL同时或顺序施用。
129.如权利要求128所述的治疗产品，其中在所述TIL之后约第0天至约第4天施用所述抗真菌剂的剂型。
130.如权利要求97至129中任一项所述的治疗产品，其进一步包含抗生素的剂型。
131.如权利要求130所述的治疗产品，其中所述抗生素包括以下的至少一种：细菌壁靶向剂、细胞膜靶向剂、细菌酶干扰剂、杀菌剂、蛋白质合成抑制剂和抑菌剂。
132.如权利要求131所述的治疗产品，其中所述抗生素包括杀菌剂。
133.如权利要求132所述的治疗产品，其中所述杀菌剂为头孢菌素或喹诺酮。
134.如权利要求130至133中任一项所述的治疗产品，其中所述抗生素的剂型为抑菌剂。
135.如权利要求134所述的治疗产品，其中所述抑菌剂被配制用于预防性施用。
136.如权利要求134至135中任一项所述的治疗产品，其中所述抑菌剂为三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒。
137.如权利要求136所述的治疗产品，其中所述三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲噁唑或戊烷脒以约100mg至约1000mg的量存在。
138.如权利要求137所述的治疗产品，其中所述三甲氧苄二氨嘧啶以160mg的量存在。
139.如权利要求137所述的治疗产品，其中所述磺胺甲噁唑以800mg的量存在。
140.如权利要求137所述的治疗产品，其中所述戊烷脒以300mg的量存在。
141.如权利要求131至140中任一项所述的治疗产品，其中所述抑菌剂在所述TIL之前、与所述TIL同时或在所述TIL之后施用。
142.如权利要求141所述的治疗产品，其中所述抑菌剂在所述TIL的所述施用之前约14天至所述TIL的所述施用之后约6个月施用。
143.如权利要求131至142中任一项所述的治疗产品，其中所述抑菌剂在所述TIL之前约8天至所述TIL之后至少4天施用。
144.如权利要求1至49中任一项所述的治疗产品，其进一步包括施用所述剂型。
145.如权利要求144所述的治疗产品，其中所述治疗产品被配制用于静脉内、口服、肌内、腹膜内或胸膜内施用。
146.如权利要求102至145中任一项所述的治疗产品，其中所述免疫抑制剂的剂型被配制成通过输注施用。
147.如权利要求108至146中任一项所述的治疗产品，其中所述环磷酰胺以约60mg/kg的剂量施用，并稀释在250ml 5％葡萄糖水溶液中且经1小时输注。
148.如权利要求108至147中任一项所述的治疗产品，其中所述氟达拉滨以在100ml0.9％氯化钠(USP)中25mg/m2的剂量施用，并经约15至约30分钟输注。
149.如权利要求97至148中任一项所述的治疗产品，其中所述免疫刺激剂以足以激活所述受试者中的所述TIL的量存在。
150.如权利要求149所述的治疗产品，其中所述免疫刺激剂包括以下的至少一种：疫苗、集落刺激剂、干扰素、白介素、病毒、抗原、共刺激剂、免疫原性剂、免疫调节剂和免疫治疗剂。
151.如权利要求150所述的治疗产品，其中所述免疫刺激剂的剂型包括白介素。
152.如权利要求151所述的治疗产品，其中所述白介素为阿地白介素，并且以约550,000至约800,000IU/kg的剂量施用。
153.如权利要求152所述的治疗产品，其中所述阿地白介素以约720,000IU/kg的剂量施用。
154.如权利要求97至153中任一项所述的治疗产品，其中所述治疗产品进一步包含足以预防所述受试者的感染的量的感染预防剂的剂型。
155.如权利要求154所述的治疗产品，其中所述感染预防剂为疱疹病毒预防剂。
156.如权利要求155所述的治疗产品，其中所述疱疹病毒预防剂以对治疗HSV阳性受试者有效的量存在。
157.如权利要求155至156中任一项所述的治疗产品，其中所述疱疹病毒预防剂为伐昔洛韦或阿昔洛韦。
158.如权利要求97至157中任一项所述的治疗产品，其中通过选自CRISPR、锌指、TALEN及其任何组合的系统来诱导所述破坏。
159.如权利要求158所述的治疗产品，其中所述系统为CRISPR系统。
160.如权利要求158至159中任一项所述的治疗产品，其中所述CRISPR系统包括选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3和Cas9HiFi的内切核酸酶。
161.如权利要求160所述的治疗产品，其中所述内切核酸酶为Cas9。
162.如权利要求160至161中任一项所述的治疗产品，其中所述内切核酸酶执行所述破坏。
163.如权利要求97至162中任一项所述的治疗产品，其中所述破坏包括基因的外显子或内含子。
164.如权利要求163所述的治疗产品，其中所述破坏在基因的外显子中。
165.如权利要求97至164中任一项所述的治疗产品，其中所述破坏在前间区序列邻近基序(PAM)的约20个碱基对内。
166.如权利要求97至164中任一项所述的治疗产品，其中所述破坏在前间区序列邻近基序(PAM)的约10个碱基对内。
167.如权利要求97至164中任一项所述的治疗产品，其中所述破坏在前间区序列邻近基序(PAM)的约5个碱基对内。
168.如权利要求97至167中任一项所述的治疗产品，其中所述破坏距离前间区序列邻近基序(PAM)约3个碱基对。
169.如权利要求97至168中任一项所述的治疗产品，其中所述破坏在SEQ ID NO:13的外显子或内含子中。
170.如权利要求169所述的治疗产品，其中所述破坏在SEQ ID NO:13的外显子中。
171.如权利要求158至170中任一项所述的治疗产品，其中所述CRISPR系统包括指导多核酸。
172.如权利要求171所述的治疗产品，其中所述指导多核酸与SEQ ID NO:68具有至少约60％的同源性。
173.如权利要求97至172中任一项所述的治疗产品，其中所述破坏包括双链断裂。
174.如权利要求173所述的治疗产品，其中所述双链断裂发生在SEQ ID NO:71或SEQID NO:77处。
175.如权利要求97至174中任一项所述的治疗产品，其中所述TIL以约1 x 109个细胞、3x 109个细胞、1 x 1010个细胞、3 x 1010个细胞至约1 x 1011个细胞的量存在。
176.如权利要求97至175中任一项所述的治疗产品，其中所述TIL经约30分钟施用。
177.如权利要求97至176中任一项所述的治疗产品，其中所述TIL静脉内施用。
178.如权利要求177所述的治疗产品，其中所述静脉内包括输注。
179.如权利要求97至178中任一项所述的治疗产品，其进一步包括对所述TIL进行输注前测试。
180.如权利要求179所述的治疗产品，其中所述输注前测试包括以下的至少一种：表型测试、效力测试、微生物学测试、内毒素测试、活力测试和肿瘤细胞测试。
181.如权利要求180所述的治疗产品，其中所述表型测试包括检测所述TIL上的CD3的存在。
182.如权利要求180至181中任一项所述的治疗产品，其中所述效力测试包括在对所述TIL进行抗CD3刺激后检测IFNγ水平。
183.如权利要求180至182中任一项所述的治疗产品，其中所述微生物学测试包括检测需氧培养物、厌氧培养物的生长、革兰状态、真菌状态或支原体状态。
184.如权利要求180至183中任一项所述的治疗产品，其中所述内毒素测试包括进行鲎测定。
185.如权利要求180至184中任一项所述的治疗产品，其中所述活力测试包括进行台盼蓝排除测定。
186.如权利要求180至185中任一项所述的治疗产品，其中所述肿瘤细胞测试包括细胞病理学测定。
187.如权利要求97至186中任一项所述的治疗产品，其中当所述输注前测试中的所述微生物学测试为阴性时，施用所述TIL。
188.如权利要求97至187中任一项所述的治疗产品，其中当所述输注前测试中的所述活力测试存在超过至少约70％的活细胞时，施用所述TIL。
189.如权利要求97至188中任一项所述的治疗产品，其中当所述输注前测试中的所述表型测试存在至少约80％的CD3阳性时，施用所述TIL。
190.如权利要求97至189中任一项所述的治疗产品，其中当所述输注前测试在所述效力测试中对所述TIL进行抗CD3刺激后的IFNγ为至少约200pg/mL/105个细胞时，施用所述TIL。
191.如权利要求97至190中任一项所述的治疗产品，其中当所述输注前测试在所述细胞病理学测试中检查的每至少约200个TIL中的肿瘤细胞为阴性时，施用所述TIL。
192.一种核酸组合物，其与SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:69中的任一个具有至少60％的序列同源性。
193.如权利要求192所述的核酸组合物，其中所述序列同源性为至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或高达约100％。
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