ES2883131T3

ES2883131T3 - Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN

Info

Publication number: ES2883131T3
Application number: ES17183472T
Authority: ES
Inventors: Philippe Duchateau; ANDRé CHOULIKA; Laurent Poirot
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2034-04-01
Also published as: US10870864B2; US9855297B2; US20200277625A1; US20160184362A1; US20200181643A1; US20210147868A1; US20180237798A1; HK1223399A1; US10584352B2; US11365430B2

Abstract

Un método de preparación de células T para inmunoterapia que comprende las etapas de: (a) Modificar genéticamente las células T mediante la introducción en las células y/o la expresión en las células de al menos: - una endonucleasa guiada por ARN; y - un ARN guía específico que dirige dicha endonucleasa a al menos un locus diana en el genoma de células T, en el que dicha endonucleasa guiada por ARN se fusiona con un NLS, que actúa para conducir la proteína al núcleo a través del complejo nuclear de poros y en el que dicha endonucleasa guiada por ARN se expresa a partir de ARNm transfectado o se proporciona como un polipéptido producido fuera de la célula, y dicho ARN guía se expresa en las células como un transcripto de un vector de ADN; (b) expandir las células resultantes in vitro.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para desarrollar células T modificadas genéticamente, preferiblemente no alorreactivas, para inmunoterapia. Este método implica el uso de endonucleasas guiadas por ARN, en particular el sistema Cas9/CRISPR, para apuntar específicamente a una selección de loci genéticos clave en las células T. Las células T modificadas también están destinadas a expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) para redirigir su actividad inmunitaria hacia células malignas o infectadas. La invención abre el camino a estrategias de inmunoterapia adoptiva estándar y asequibles que utilizan células T para tratar el cáncer, las infecciones virales y las enfermedades autoinmunes.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T autólogas específicas de antígeno generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T utilizadas para la inmunoterapia adoptiva se pueden generar mediante la expansión de células T específicas de antígeno o la redirección de las células T mediante modificación genética (Park, Rosenberg et al., 2011). La transferencia de células T específicas de antígenos virales es un procedimiento bien establecido que se utiliza para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y neoplasias malignas relacionadas con virus raros. De manera similar, se ha demostrado que el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumores tienen éxito en el tratamiento del melanoma.

Se han generado con éxito nuevas especificidades en las células T mediante la transferencia genética de receptores de células T transgénicas o receptores de antígenos quiméricos (CAR) (Jena, Dotti et al., 2010). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en una fracción de direccionamiento que está asociada con uno o más dominios de señalización en una única molécula de fusión. En general, la fracción de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un enlazador flexible. También se han utilizado con éxito fracciones de unión basadas en dominios de receptor o ligando. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación se derivan de la región citoplasmática de las cadenas CD3zeta o gamma del receptor Fc. Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de las células T, sin embargo, no lograron proporcionar una expansión prolongada y actividad antitumoral in vivo. Se han agregado dominios de señalización de moléculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137) solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T modificadas con CAR. Los CAR han permitido redirigir con éxito las células T contra los antígenos expresados en la superficie de las células tumorales de diversas neoplasias, incluidos linfomas y tumores sólidos (Jena, Dotti et al., 2010).

El protocolo actual para el tratamiento de pacientes que utilizan inmunoterapia adoptiva se basa en la transferencia de células autólogas. En este enfoque, los linfocitos T se recuperan de los pacientes, se modifican genéticamente o se seleccionan ex vivo, se cultivan in vitro para amplificar el número de células si es necesario y finalmente se infunden en el paciente. Además de la infusión de linfocitos, el huésped puede manipularse de otras formas que apoyen el injerto de las células T o su participación en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, el acondicionamiento previo (con radiación o quimioterapia) y la administración de factores de crecimiento de linfocitos (tal como IL-2). Cada paciente recibe un tratamiento fabricado individualmente, utilizando los propios linfocitos del paciente (es decir, una terapia autóloga). Las terapias autólogas enfrentan importantes obstáculos técnicos y logísticos para su aplicación práctica, su generación requiere costosas instalaciones dedicadas y personal experto, deben generarse en poco tiempo después del diagnóstico del paciente y, en muchos casos, el pretratamiento del paciente ha resultado en una función inmunológica degradada, de manera que los linfocitos del paciente pueden ser poco funcionales y estar presentes en cantidades muy bajas. Debido a estos obstáculos, la preparación de células autólogas de cada paciente es efectivamente un producto nuevo, lo que resulta en variaciones sustanciales en eficacia y seguridad.

Idealmente, a uno le gustaría usar una terapia estandarizada en la que las células terapéuticas alogénicas podrían prefabricarse, caracterizarse en detalle y estar disponibles para la administración inmediata a los pacientes. Por alogénicas se entiende que las células se obtienen de individuos que pertenecen a la misma especie pero que son genéticamente diferentes. Sin embargo, el uso de células alogénicas tiene actualmente muchos inconvenientes. En huéspedes inmunocompetentes, las células alogénicas son rechazadas rápidamente, un proceso denominado rechazo de huésped contra injerto (HvG), y esto limita sustancialmente la eficacia de las células transferidas. En huéspedes inmunoincompetentes, las células alogénicas pueden injertarse, pero sus especificidades de receptores de células T endógenas (TCR) reconocen el tejido del huésped como extraño, lo que da como resultado la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), que puede provocar daños tisulares graves y la muerte.

Con el fin de obtener células alogénicas de forma eficaz, los inventores divulgaron previamente un método para manipular genéticamente células T, en el que se inactivaban diferentes genes efectores, en particular los que codifican receptores de células T, mediante el uso de nucleasas TAL específicas, más conocidas bajo la marca comercial TALENMR (Cellectis, 8, rue de la Croix Jarry, 75013 PARÍS). Este método ha demostrado ser muy eficaz en células primarias mediante la transfección de ARN como parte de una plataforma que permite la producción en masa de células T alogénicas (documento WO 2013/176915).

También se ha divulgado la inactivación de receptores de células T mediante el uso de nucleasas con dedos de zinc (ZFN) (Torikai et al., 2012, Blood, vol. 119 (24), páginas 5697-5705; documento WO 2013/074916 A1).

Recientemente, se ha desarrollado una nueva herramienta de ingeniería genómica basada en los componentes del sistema inmune adaptativo CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) procarióticas de tipo II de la bacteria S. pyogenes. Este sistema multicomponentes denominado sistema de nucleasa Cas guiado por ARN (Gasiunas, Barrangou et al., 2012; Jinek, Chylinski et al., 2012) o más simplemente CRISPR, involucra una endonucleasa Cas acoplada con moléculas de ARN guía que tienen la capacidad de conducir dicha nucleasa a algunas secuencias genómicas específicas. Cuando la guía de ARN hibrida la secuencia del genoma, la endonucleasa tiene la capacidad de escindir el ADN. El sistema CRISPR/asociado a CRISPR (Cas) implica 1) retención de material genético extraño, llamado "espaciadores", en matrices agrupadas en el genoma del huésped, 2) expresión de ARN de guía cortos (ARNcr) de los espaciadores, 3) unión de los ARNcr a porciones específicas del ADN extraño llamadas protoespaciadores y 4) degradación de los protoespaciadores por nucleasas asociadas a CRISPR (Cas). La especificidad de unión al ADN extraño está controlada por los elementos espaciadores no repetitivos en el pre-ARNcr, que tras la transcripción junto con el ARNtracr, dirige la nucleasa Cas9 al heterodúplex protoespaciador: ARNcr e induce la formación de rompimiento de la cadena doble (DSB). Además, la nucleasa Cas9 corta el ADN solo si una secuencia específica conocida como motivo adyacente del protoespaciador (PAM) está presente inmediatamente secuencia abajo de la secuencia del protoespaciador, cuya secuencia canónica en S. pyogenes es 5-NGG-3', en la que N se refiere a cualquier nucleótido. Más tarde, se ha demostrado que la expresión de un único transcripto ARNcr: ARNtracr quimérico, que normalmente se expresa como dos ARN diferentes en el sistema CRISPR nativo de tipo II, es suficiente para dirigir la nucleasa Cas9 para escindir específicamente secuencias de ADN diana. Al adaptar el sistema CRISPR/Cas endógeno de tipo II de S. pyogenes para su uso en células de mamíferos, varios grupos han demostrado de forma independiente que Cas9 guiado por ARN es capaz de introducir de manera eficiente rompimientos bicatenarios precisos en loci genómicos endógenos en células de mamíferos con altas eficiencias y efectos mínimos fuera del objetivo (Cong et al. 2013, Mali et al. 2013, Cho et al. 2013). Además, se han desarrollado varias formas mutantes de la nucleasa Cas9 para aprovechar sus características para aplicaciones adicionales en la modificación del genoma y la regulación transcripcional. Por ejemplo, una forma mutante de la nucleasa Cas9 funciona como una nickasa (Jinek et al. 2012), generando una ruptura en la cadena complementaria de ADN en lugar de ambas cadenas como ocurre con Cas9 de tipo silvestre. Esto permite la reparación de la plantilla de ADN utilizando una vía de alta fidelidad en lugar de NHEJ, que previene la formación de indeles en el locus objetivo, y posiblemente otras ubicaciones en el genoma para reducir los posibles efectos fuera del objetivo/toxicidad mientras se mantiene la capacidad de experimentar una recombinación homóloga (Cong et al., 2013). Más recientemente, se ha demostrado que el corte emparejado reduce la actividad fuera del objetivo entre 50 y 1.500 veces en las líneas celulares y facilita la eliminación de genes en el cigoto de ratón sin perder la eficiencia de escisión en el objetivo (Ran et al., 2013).

Aunque las endonucleasas guiadas por ARN, tales como el sistema Cas9/CRISPR, parecen ser un enfoque atractivo para la modificación genética de células de mamíferos, su uso en células primarias, en particular en células T, se ve obstaculizado significativamente por el hecho de que:

- Las células T se ven afectadas negativamente por la introducción de ADN en su citoplasma: se observa una alta tasa de apoptosis cuando se transforman células con vectores de ADN;

- El sistema CRISPR requiere una expresión estable de Cas9 en las células. Sin embargo, la expresión prolongada de Cas9 en células vivas puede provocar defectos cromosómicos;

- La especificidad de la endonucleasa guiada por ARN actual está determinada solo por secuencias que comprenden 11 nucleótidos (N12-20NGG, en el que NGG representa el PAM), lo que hace que sea muy difícil identificar secuencias diana en los loci deseados que sean únicos en el genoma.

La presente solicitud tiene como objetivo proporcionar soluciones a estas limitaciones con el fin de implementar eficazmente endonucleasas guiadas por ARN en células T.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método de preparación de células T para inmunoterapia que comprende las etapas de:

(a) Modificar genéticamente las células T mediante la introducción en las células y/o la expresión en las células de al menos:

- una endonucleasa guiada por ARN; y

- un ARN guía específico que dirige dicha endonucleasa a al menos un locus diana en el genoma de células T,

en el que dicha endonucleasa guiada por ARN se fusiona con un NLS, que actúa para conducir la proteína al núcleo a través del complejo de poro nuclear, y en el que dicha endonucleasa guiada por ARN se expresa a partir de ARNm transfectado o se proporciona como un polipéptido producido fuera de la célula, y dicho ARN guía se expresa en las células como un transcripto de un vector de a DN; y

(b) expandir las células resultantes in vitro.

Por lo tanto, la presente invención divulga métodos para modificar células T, en particular células T alogénicas obtenibles de donantes, para hacerlas adecuadas para fines de inmunoterapia, mediante el uso de endonucleasas guiadas por ARN tales como Cas9/CRISPR.

Los métodos de la presente invención permiten más particularmente la modificación precisa del genoma de las células T relevantes para la inmunoterapia inactivando o reemplazando genes implicados en el reconocimiento del MHC y/o proteínas de puntos de control inmunes. En particular, proporcionan secuencias diana relevantes específicas en el genoma para que el ARN guía inactive componentes de TCR sin provocar la muerte de las células.

De acuerdo con varios métodos preferidos, las células modificadas relevantes para la inmunoterapia comprenden además polinucleótidos recombinantes exógenos que codifican el receptor de antígeno quimérico (CAR) de cadena única y de múltiples subunidades para el reconocimiento celular específico. Más particularmente, las células T modificadas para el tratamiento del linfoma están disponibles con CAR dirigido contra el antígeno CD19.

También se describen en el presente documento células o líneas celulares aisladas que comprenden las modificaciones genéticas establecidas en la descripción detallada, Ejemplos y Figuras, así como cualquiera de las proteínas, polipéptidos o vectores útiles para implementar endonucleasas guiadas por ARN en células T.

Como resultado, las células T modificadas se pueden usar como productos terapéuticos, idealmente como un producto "listo para usar", en métodos para tratar o prevenir cáncer, infecciones o enfermedades autoinmunes.

Breve descripción de las figuras y tablas

Figura 1: Representación esquemática de la relación normal entre las células T y la célula presentadora de antígenos. Figura 2: Representación esquemática de las células T terapéuticas modificadas genéticamente proporcionadas por el método de la invención contra las células tumorales del paciente.

Figura 3: Representación esquemática de un CAR de múltiples subunidades, que puede introducirse en las células T modificadas con endonucleasa guiadas por ARN de acuerdo con el método de la invención.

Figura 4: Representación esquemática de un ejemplo del método de modificación de células alogénicas humanas para inmunoterapia.

Figura 5: Análisis de citometría de flujo de la actividad del sistema CRISPR en células T con respecto al gen de TCR (resultados experimentales del ejemplo 2), se transfectaron 5 x106 células T con 10 |jg de ARNm de Cas9 10 jg de ADN plasmídico que expresa ARNgs específico para genes TRAC bajo el control del promotor U6 en presencia de un inhibidor de caspasa. Lectura: 3 días después de la transfección, análisis de citometría de flujo utilizando anticuerpo TCRap. Controles: células no transfectadas.

Figura 6: Análisis de citometría de flujo de la actividad del sistema CRISPR en células T con respecto al gen CD52 (resultados experimentales del ejemplo 2), se transfectaron 5 x106 células T con 10 jg de ARNm de Cas9 10 jg de ADN plasmídico que expresa ARNgs específico para genes CD52 bajo el control del promotor U6 en presencia de un inhibidor de caspasa. Lectura: 3 días después de la transfección, análisis de citometría de flujo con anticuerpo CD52. Controles: células no transfectadas.

Tabla 1: Diferentes programas de citopulso utilizados para determinar el voltaje mínimo requerido para la electroporación en células T derivadas de PBMC.

Tabla 2: Diferentes programas de citopulso utilizados para determinar el voltaje mínimo requerido para la electroporación en células T derivadas de PBMC.

Tabla 3: Secuencias diana para la alteración no genotóxica de Cas9/CRISPR de TCRa.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia en los campos de la terapia génica, la bioquímica, la genética y la biología molecular.

Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, describiéndose en el presente documento métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes, a menos que se especifique lo contrario.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Biblioteca del Congreso, EE. UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de los Estados Unidos. No. 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOg Y (J. Abelson y M. Simon, eds en jefe, Academic Press, Inc., New York), específicamente, los Vols.154 y 155 (Wu et al. eds.) y el Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

En un aspecto general, la presente divulgación se refiere a métodos para nuevas estrategias de inmunoterapia adoptiva en el tratamiento del cáncer y las infecciones.

Como objetivo principal de la invención está el uso de endonucleasa guiada por ARN, tal como Cas9, para modificar genéticamente células T para producir células adecuadas en terapia celular.

En un primer aspecto, el método descrito en el presente documento es un método de preparación de células T para inmunoterapia que comprende la etapa de:

(a) Modificar genéticamente las células T mediante la introducción y/o expresión en las células de al menos:

- una endonucleasa guiada por ARN; y

- un ARN guía específico que dirige dicha endonucleasa a al menos un locus objetivo en el genoma de células T

(b) expandir las células resultantes.

Por "endonucleasa guiada por ARN" se entiende un polipéptido cuya actividad y especificidad de endonucleasa dependen de su asociación con una molécula de ARN. La secuencia completa de esta molécula de ARN o más generalmente un fragmento de esta molécula de ARN, que es una secuencia preferiblemente más larga de 8 bases de ácidos nucleicos, más preferiblemente más de 10 bases de ácidos nucleicos, incluso más preferiblemente más de 12 bases de ácidos nucleicos, tiene la capacidad para especificar una secuencia diana en el genoma. En general, esta molécula de ARN tiene la capacidad de hibridar dicha secuencia diana y de mediar la actividad endonucleasa de dicha endonucleasa. Un ejemplo de endonucleasa guiada por ARN es Cas9 como parte del sistema Cas9/CRISPR.

Cas 9

Cas9, también denominada Csn1 (COG3513) es una proteína grande que participa tanto en la biogénesis del ARNcr como en la destrucción del ADN invasor. Cas9 se ha descrito en diferentes especies bacterianas tales como S. thermophilus (Sapranauskas, Gasiunas et al.2011), Listeria innocua (Gasiunas, Barrangou et al., 2012; Jinek, Chylinski et al.2012) y S. pyogenes (Deltcheva, Chylinski et al.2011). La proteína Cas9 grande (> 1.200 aminoácidos) contiene dos dominios de nucleasa predichos, a saber, el dominio de nucleasa HNH (similar a McrA) que se encuentra en el medio de la proteína y un dominio de nucleasa similar a RuvC dividido (pliegue de RNasa H) (Haft, Selengut et al., 2005; Makarova, Grishin et al., 2006).

Por "Cas9" también se entiende una endonucleasa modificada o un homólogo de Cas9 que es capaz de procesar la secuencia de ácido nucleico diana. Cas9 puede inducir una escisión en la secuencia diana de ácido nucleico que puede corresponder a un rompimiento bicatenario o un rompimiento monocatenario. La variante de Cas9 puede ser una endonucleasa Cas9 que no existe naturalmente en la naturaleza y que se obtiene mediante modificación de proteínas o mediante mutagénesis aleatoria. Las variantes de Cas9 se pueden obtener, por ejemplo, mediante mutaciones, es decir, eliminaciones de, o inserciones o sustituciones de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de una endonucleasa de S. pyogenes Cas9 (COG3513 - SEQ ID NO: 3). Para realizar el método de la presente invención, tales variantes de Cas9 siguen siendo funcionales, es decir, conservan la capacidad de procesar una secuencia de ácido nucleico diana. La variante Cas9 también puede ser homóloga de Cas9 de S. pyogenes que puede comprender eliminaciones de, o inserciones o sustituciones de, al menos un residuo dentro de la secuencia de aminoácidos de Cas9 de S. pyogenes. También se puede hacer cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea la actividad deseada, en particular la capacidad de unirse a una secuencia diana de ácido nucleico o ARN guía.

El motivo RuvC/RNasaH incluye proteínas que muestran amplios espectros de funciones nucleolíticas, actuando tanto sobre ARN como sobre ADN (RNasaH, RuvC, ADN transposasas e integrasas retrovirales y el dominio PIWI de proteínas Argonauta). Como se describe en este documento, el dominio catalítico RuvC de la proteína Cas9 (SEQ ID NO.4) se puede caracterizar por el motivo de secuencia: D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A, en el que X representa cualquiera de los 20 aminoácidos naturales y [I/L] representa isoleucina o leucina (SEQ ID NO: 1). En otros términos, la presente divulgación se refiere a la variante de Cas9 que comprende al menos la secuencia D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A, en la que X representa cualquiera de los 20 aminoácidos naturales y [I/L] representa isoleucina o leucina (SEQ ID NO: 1).

El motivo HNH es característico de muchas nucleasas que actúan sobre el ADN bicatenario que incluye colicinas, enzimas de restricción y endonucleasas de localización. El dominio HNH (SMART ID: SM00507, nomenclatura de SCOP: familia HNH) está asociado con una variedad de proteínas de unión al ADN, que realizan una variedad de funciones de unión y corte (Gorbalenya 1994; Shub, Goodrich-Blair et al., 1994). Varias de las proteínas son proteínas hipotéticas o putativas sin función bien definida. Las que tienen una función conocida están involucradas en una variedad de procesos celulares que incluyen toxicidad bacteriana, funciones de localización en intrones e inteínas de los grupos I y II, recombinación, reordenamiento del ADN controlado por el desarrollo, empaquetamiento de fagos y actividad de endonucleasa de restricción (Dalgaard, Klar et al., 1997). Estas proteínas se encuentran en virus, arqueobacterias, eubacterias y eucariotas. Curiosamente, al igual que con los motivos LAGLI-DADG y GIY-YIG, el motivo HNH a menudo se asocia con dominios de endonucleasa de elementos de autopropagación como inteínas, intrones del Grupo I y del Grupo II (Gorbalenya 1994; Dalgaard, Klar et al., 1997). El dominio HNH se puede caracterizar por la presencia de un residuo Asp/His conservado flanqueado por residuos His (terminal amino) y His/Asp/Glu (terminal carboxilo) conservados a cierta distancia. Un número sustancial de estas proteínas también puede tener un motivo CX2C en cualquier lado del residuo Asp/His central. Estructuralmente, el motivo HNH aparece como una horquilla central de cadenas p retorcidas, que están flanqueadas a cada lado por una hélice a (Kleanthous, Kuhlmann et al., 1999). El gran dominio HNH de Cas9 está representado por la SEQ ID NO: 5. Como se describe en este documento, el motivo HNH se puede caracterizar por el motivo de secuencia: Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S, en el que X representa cualquiera de los 20 aminoácidos naturales (SEQ ID NO: 2). La presente divulgación se refiere a una variante de Cas9 que comprende al menos la secuencia Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S en la que X representa cualquiera de los 20 aminoácidos naturales (SEQ ID NO: 2).

Esta invención puede ser de particular interés para realizar fácilmente modificaciones de genes multiplex dirigidas y para crear un sistema de nucleasa inducible mediante la introducción del ARN guía en las células de Cas9. Para efectos de la presente divulgación, los inventores han establecido que la proteína Cas9 se puede dividir en dos dominios separados divididos RuvC y HNH de Cas9 que pueden procesar la secuencia de ácido nucleico diana junto o por separado con el ARN guía.

También se pueden ensamblar los dominios RuvC y HNH de diferentes endonucleasas guiadas por ARN u homólogos de Cas para mejorar la eficiencia o especificidad de las nucleasas. Los dominios de diferentes especies pueden dividirse en dos proteínas o fusionarse entre sí para formar una proteína Cas variante. El sistema de división de Cas9 se considera particularmente adecuado para un método inducible de focalización del genoma y para evitar el efecto tóxico potencial de la sobreexpresión de Cas9 dentro de la célula. De hecho, se puede introducir un primer dominio de Cas9 dividida en la célula, preferiblemente transformando de manera estable dicha célula con un transgén que codifica dicho dominio dividido. Luego, la parte dividida complementaria de Cas9 se puede introducir en la célula, de modo que las dos partes divididas se vuelvan a ensamblar en la célula para reconstituir una proteína Cas9 funcional en el momento deseado.

La reducción del tamaño de Cas9 dividida en comparación con Cas9 de tipo silvestre facilita la vectorización y el suministro en la célula, por ejemplo, mediante el uso de péptidos que penetran en la célula. El reordenamiento de dominios de diferentes proteínas Cas permite modular la especificidad y la actividad nucleasa, por ejemplo, dirigiéndose a motivos PAM que son ligeramente diferentes de Cas9 de S. pyogenes

Sistema de Cas9 dividida

La caracterización previa de los dominios RuvC y HNH ha llevado a los inventores a diseñar la proteína Cas9 para crear la proteína Cas9 dividida. Sorprendentemente, los inventores demostraron que estos dos Cas9 divididas podían procesar juntos o por separado el ácido nucleico diana. Esta observación permite desarrollar un nuevo sistema Cas9 utilizando proteína Cas9 dividida. Cada dominio de Cas9 dividida se puede preparar y utilizar por separado. Por lo tanto, este sistema dividido muestra varias ventajas para la vectorización y el suministro de la endonucleasa guiada por ARN en las células T, lo que permite administrar una proteína más corta y/o inactiva, y es particularmente adecuada para inducir la modificación del genoma en las células T en el momento deseado y así limitar la toxicidad potencial de una nucleasa Cas9 integrada.

Por "Cas9 dividida" se entiende en el presente documento una forma reducida o truncada de una proteína Cas9 o variante de Cas9, que comprende un dominio RuvC o HNH, pero no ambos dominios. Tal " Cas9 dividida" se puede utilizar de forma independiente con ARN guía o de forma complementaria, como por ejemplo, una Cas9 dividida que proporciona un dominio RuvC y otro que proporciona el dominio HNH. Pueden usarse juntas diferentes endonucleasas guiadas por ARN dividido que tengan dominios RuvC y/o NHN.

Cada dominio dividido de Cas9 puede derivarse del mismo homólogo de Cas9 o de diferentes. Se han identificado muchos homólogos de Cas9 en las bases de datos del genoma.

Como método de modificación del genoma, la divulgación proporciona las etapas de:

(a) seleccionar una secuencia de ácido nucleico diana, que opcionalmente comprende un motivo PAM en la célula; (b) proporcionar un ARN guía que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; (c) proporcionar al menos un dominio de Cas9 dividida;

(d) introducir en la célula el ARN guía y dicho dominio op dominios divididos de Cas9, de modo que el dominio o dominios de Cas9 dividida procese la secuencia de ácido nucleico diana en la célula.

Dichos dominios divididos de Cas9 (dominios RuvC y HNH) pueden introducirse simultánea o secuencialmente en la célula de modo que dicho dominio o dominios de Cas9 divididas procesen la secuencia de ácido nucleico diana en la célula. Dichos dominios divididos de Cas9 y ARN guía se pueden introducir en la célula utilizando péptidos que penetran en la célula u otros métodos de transfección como se describe a continuación.

En otro aspecto de la divulgación, solo se introduce en dicha célula un dominio de Cas9 dividida, denominado Cas9 compacto. De hecho, sorprendentemente los inventores demostraron que el dominio de Cas9 dividida que comprende el motivo RuvC como se describió anteriormente es capaz de escindir una secuencia de ácido nucleico diana independientemente del dominio dividido que comprende el motivo HNH. Por lo tanto, se pudo establecer que el ARN guía no necesita la presencia del dominio HNH para unirse a la secuencia de ácido nucleico diana y es suficientemente estable para unirse al dominio dividido RuvC.

Preferiblemente, dicho dominio de Cas9 dividida solo es capaz de cortar dicha secuencia de ácido nucleico diana.

Cada dominio dividido se puede fusionar con al menos un dominio activo en el extremo terminal N y/o terminal C, dicho dominio activo se puede seleccionar del grupo que consiste en: nucleasa (por ejemplo, endonucleasa o exonucleasa), polimerasa, quinasa, fosfatasa, metilasa, desmetilasa, acetilasa, desacetilasa, topoisomerasa, integrasa, transposasa, ligasa, helicasa, recombinasa, activador transcripcional (por ejemplo, VP64, VP16), inhibidor transcripcional (por ejemplo, KRAB), enzima que procesa un extremo del ADN (por ejemplo, Trex2, Tdt), molécula informadora (por ejemplo, proteínas fluorescentes, lacZ, luciferasa).

El dominio HNH es responsable del corte de una cadena del ADN bicatenario diana y el dominio plegado de RNasaH similar a RuvC está involucrado en el corte de la otra cadena (que comprende el motivo PAM) de la diana de ácido nucleico bicatenario (Jinek, Chylinski et al., 2012). Sin embargo, en Cas9 de tipo silvestre, estos dos dominios dan como resultado una escisión contundente del ADN invasivo dentro de la misma secuencia diana (protoespaciadora) en las inmediaciones del PAM (Jinek, Chylinski et al., 2012). Cas 9 puede ser una nickasa e induce un evento de corte dentro de diferentes secuencias diana.

Como ejemplo no limitante, Cas9 o Cas9 dividida pueden comprender una mutación o mutaciones en los residuos catalíticos de los dominios similares a HNH o RuvC, para inducir un evento de corte dentro de diferentes secuencias diana. Como ejemplo no limitante, los residuos catalíticos de la proteína Cas9 son los correspondientes a los aminoácidos d 10, D31, H840, H868, N882 y N891 o posiciones alineadas usando el método CLUSTALW sobre homólogos de los miembros de la Familia Cas. Cualquiera de estos residuos se puede reemplazar por cualquier otro aminoácido, preferiblemente por un residuo de alanina. La mutación en los residuos catalíticos significa la sustitución por otros aminoácidos o la eliminación o adición de aminoácidos que inducen la inactivación de al menos uno de los dominios catalíticos de Cas9 . (cf.. En particular, Cas9 o Cas9 dividida puede comprender una o varias de las mutaciones anteriores. En particular, Cas9 dividida comprende solo uno de los dos dominios catalíticos RuvC y HNH. En la presente divulgación, se puede utilizar Cas9 de diferentes especies, homólogos de Cas9, Cas9 modificado variantes funcionales de las mismas. La divulgación prevé el uso de cualquier endonucleasa guiada por ARN o variantes de endonucleasas guiadas por ARN dividido para realizar la escisión del ácido nucleico en una secuencia genética de interés.

Preferiblemente, dichas variantes de Cas9 tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, e incluso más preferiblemente el 95% de identidad con Cas9 de S. pyogenes (COG3513 - SEQ ID NO: 3).

En otro aspecto de la presente divulgación, Cas9 o Cas9 dividida carecen de actividad endonucleolítica. La Cas9 resultante o Cas9 dividida se coexpresa con ARN guía diseñado para comprender una secuencia complementaria de la secuencia de ácido nucleico diana. La expresión de Cas9 que carece de actividad endonucleolítica produce un silenciamiento específico del gen de interés. Este sistema se denomina interferencia CRISPR (CRISPRi) (Qi, Larson et al., 2013). Silenciar significa que el gen de interés no se expresa en forma de proteína funcional. El silenciamiento puede ocurrir en la etapa transcripcional o de traduccional. De acuerdo con la presente divulgación, el silenciamiento puede ocurrir bloqueando directamente la transcripción, más particularmente bloqueando el alargamiento de la transcripción o dirigiéndose a motivos clave que actúan en cis dentro de cualquier promotor, bloqueando estéricamente la asociación de sus factores de transcripción afines que actúan en trans. La Cas9 que carece de actividad endonucleolítica comprende dominios HNH y RuvC no funcionales. En particular, el polipéptido Cas9 o Cas9 dividido comprende mutaciones inactivadoras en los residuos catalíticos de los dominios de tipo RuvC y HNH. Por ejemplo, los residuos catalíticos requeridos para la escisión de la actividad de Cas9 pueden ser D10, D31, H840, H865, H868, N882 y N891 de Cas9 de S. pyogenes (COG3513 - SEQ ID NO: 3) o posiciones alineadas usando el método CLUSTALW en homólogos de miembros de la familia Cas. Los residuos comprendidos en motivos HNH o RuvC pueden ser los descritos en el párrafo anterior. Cualquiera de estos residuos se puede reemplazar por cualquiera de los otros aminoácidos, preferiblemente por un residuo de alanina. La mutación en los residuos catalíticos significa la sustitución por otros aminoácidos o la eliminación o adición de aminoácidos que inducen la inactivación de al menos uno de los dominios catalíticos de Cas9.

En particular, Cas9 o cada dominio dividido puede fusionarse con al menos un dominio activo en el extremo terminal N y/o terminal C. Dicho dominio activo se puede seleccionar del grupo que consiste en: nucleasa (por ejemplo, endonucleasa o exonucleasa), polimerasa, quinasa, fosfatasa, metilasa, desmetilasa, acetilasa, desacetilasa, topoisomerasa, integrasa, transposasa, ligasa, helicasa, recombinasa, activador transcripcional (por ejemplo, VP64, VP16), inhibidor transcripcional (por ejemplo, KRAB), enzima de procesamiento de los extremos del ADN (por ejemplo, Trex2, Tdt), molécula informadora (por ejemplo, proteínas fluorescentes, lacZ, luciferasa).

Actividad nucleasa inducible para el sistema de endonucleasa guiada por ARN/ARN guiado

Dada la toxicidad potencial de la endonucleasa guiada por ARN dentro de las células T, debido a las posibles interacciones no específicas con varios ARN en la célula y la dirección esperada fuera del sitio, los inventores han buscado soluciones para inducir la actividad de la endonucleasa guiada por ARN en forma transitoria, idealmente durante la vida útil del ARN guía en las células.

Como solución primaria, la endonucleasa guiada por ARN puede expresarse en una forma estabilizada o inactiva, que se activa tras la activación por una enzima producida por la célula T o la desestabilización de su estructura polipeptídica dentro de la célula T. La estabilidad de la proteína condicional se puede obtener, por ejemplo, mediante la fusión de la endonucleasa con una proteína estabilizadora/desestabilizadora basada, como ejemplo no limitante, en el sistema FKBP/rapamicina, en el que el cambio conformacional de la proteína es inducido por una molécula pequeña.

La dimerización inducida por luz o química de una proteína asociada fusionada a la proteína endonucleasa también se puede usar para bloquear o desbloquear la endonucleasa.

En la situación en la que la endonucleasa guiada por ARN se divide en dos polipéptidos como se sugirió anteriormente, cada división puede fusionarse con una proteína asociada. Ambas proteínas asociadas se dimerizarán tras la adición de una molécula pequeña y reconstituirán, en las células vivas, una endonucleasa activa. Tales sistemas pueden basarse, como ejemplo no limitante, en el uso de FKBB/FRB como compañeros de dimerización y rapamicina como molécula pequeña. Como otro ejemplo, proteína que puede sufrir un cambio conformacional importante al unirse a una molécula pequeña o metabolito insertado en la proteína endonucleasa (una cadena polipeptídica compuesta por dos "divisiones"). La unión (o no) de la molécula pequeña cambiará la Cas9 entre una conformación activa e inactiva. Tales sistemas pueden basarse, como ejemplo no limitante, en el uso de calmodulina y Ca2+.

Cada mitad de la endonucleasa dividida también puede fusionarse con una proteína asociada sensible a la luz. Tales sistemas pueden depender, como ejemplo no limitante, de la luz azul con el Criptocromo 2 (CRY2) y CIB1 como compañeros de fusión o de la luz ultravioleta con los compañeros de fusión UVR8 y COP1 del fotorreceptor ultravioleta-B. Tanto la luz como la sustancia química también pueden combinarse utilizando, por ejemplo, los compañeros Fitocromo B y PIF6 (asociación de luz roja, disociación de luz roja lejana) y un cromóforo PCB exógeno.

ARN guía

El método de la presente invención comprende proporcionar un ARN guía modificado. El ARN guía corresponde a una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria. Preferiblemente, dicho ARN guía corresponde a un ARNcr y un ARNtracr que se pueden usar por separado o fusionados.

En el sistema CRISPR de tipo II natural, las secuencias de direccionamiento del ARN direccionado por CRISPR (ARNcr) se transcriben a partir de secuencias de ADN conocidas como protoespaciadores. Los protoespaciadores se agrupan en el genoma bacteriano en un grupo llamado matriz CRISPR. Los protoespaciadores son secuencias cortas (~20 pb) de ADN extraño conocido separadas por una repetición palindrómica corta y se mantienen como un registro contra futuros encuentros. Para crear el ARNcr, la matriz CRISPR se transcribe y el ARN se procesa para separar las secuencias de reconocimiento individuales entre las repeticiones. El locus de CRISPR que contiene el espaciador se transcribe en un pre-ARNcr largo. El procesamiento del transcripto de la matriz CRISPR (pre-ARNcr) en los ARNcr individuales depende de la presencia de un ARNcr transactivador (ARNtracr) que tiene una secuencia complementaria a la repetición palindrómica. El ARNtracr se híbrida con las regiones repetidas que separan los espaciadores del pre-ARNcr, iniciando la escisión del ARNbc por la RNasa III endógena, que es seguido por un segundo evento de escisión dentro de cada espaciador por Cas9, produciendo ARNcr maduros que permanecen asociados con el ARNtracr y Cas9 y forman el complejo Cas9-ARNtracr:ARNcr. El ARNcr modificado con ARNtracr es capaz de dirigir una secuencia de ácido nucleico seleccionada, obviando la necesidad de RNasa III y el procesamiento del ARNcr en general (Jinek, Chylinski et al., 2012).

En la presente invención, el ARNcr se modifica para comprender una secuencia complementaria a una porción de un ácido nucleico diana de manera que sea capaz de dirigir, preferiblemente escindir la secuencia de ácido nucleico diana. En una realización particular, el ARNcr comprende una secuencia de 5 a 50 nucleótidos, preferiblemente 12 nucleótidos que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana. En una realización más particular, el ARNcr es una secuencia de al menos 30 nucleótidos que comprende al menos 10 nucleótidos, preferiblemente 12 nucleótidos complementarios a la secuencia de ácido nucleico diana.

En otro aspecto, el ARNcr se puede modificar para que comprenda una secuencia más grande complementaria a un ácido nucleico diana. De hecho, los inventores demostraron que el dominio de Cas9 dividido RuvC es capaz de escindir la secuencia de ácido nucleico diana solo con un ARN guía. Por lo tanto, el ARN guía puede unirse a la secuencia de ácido nucleico diana en ausencia del dominio de Cas9 dividido HNH. El ARNcr se puede diseñar para que comprenda una secuencia complementaria más grande, preferiblemente más de 20 pb, para aumentar la hibridación entre el dúplex ADN-ARN sin la necesidad de tener el efecto de estabilidad de la unión del dominio dividido HNH. Por lo tanto, el ARNcr puede comprender una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de más de 20 pb. Dicho ARNcr permite incrementar la especificidad de la actividad de Cas9.

El ARNcr también puede comprender una secuencia complementaria seguida de 4-10 nucleótidos en el extremo 5' para mejorar la eficacia del direccionamiento (Cong, Ran et al., 2013; Mali, Yang et al., 2013). En el método preferido de la invención, la secuencia complementaria del ARNcr es seguida en el extremo 3' por una secuencia de ácido nucleico denominada secuencias repetidas o secuencia de extensión 3'.

La coexpresión de varios ARNcr con distintas regiones complementarias a dos genes diferentes dirigidos a ambos genes puede usarse simultáneamente. Por lo tanto, en los métodos particulares de la invención, el ARNcr puede modificarse para reconocer simultáneamente diferentes secuencias de ácido nucleico diana. En este caso, el mismo ARNcr comprende al menos dos secuencias distintas complementarias a una porción de las diferentes secuencias de ácido nucleico diana. En un método preferido de la invención, dichas secuencias complementarias están espaciadas por una secuencia repetida.

Como un aspecto adicional de la presente divulgación, dicho ARN guía nace de un ácido nucleico peptídico (PNA) o ácido nucleico bloqueado (LNA), en particular para mejorar la estabilidad de dicho ARN guía en las células T.

Motivo PAM

Cualquier secuencia de ácido nucleico diana potencial seleccionada en la presente invención puede tener una secuencia específica en su extremo 3', denominada motivo adyacente protoespaciador o motivo asociado protoespaciador (PAM). El PAM está presente en la secuencia de ácido nucleico dirigida pero no en el ARNcr que se produce para dirigirla. Preferiblemente, el motivo adyacente protoespaciador (PAM) puede corresponder a 2 a 5 nucleótidos comenzando inmediatamente o en las proximidades del protoespaciador en el extremo distal guía. La secuencia y la ubicación del PAM varían entre los diferentes sistemas. El motivo PAM puede ser, por ejemplo, NNAGAA, NAG, NGG, NGGNG, AWG, CC, CC, CCN, TCN, TTC como ejemplos no limitantes (Shah SA, RNA biology, 2013). Los diferentes sistemas de Tipo II tienen diferentes requisitos de PAM. Por ejemplo, el sistema de S. pyogenes requiere una secuencia NGG, en la que N puede ser cualquier nucleótido. Los sistemas de S. thermophilus Tipo II requieren NGGNG (Horvath y Barrangou, 2010) y NNAGAAW (Deveau, Barrangou et al., 2008), mientras que diferentes sistemas de S. mutant toleran NGG o NAAR (Van der Ploeg, 2009). PAM no se restringe a la región adyacente al protoespaciador sino que también puede ser parte del protoespaciador (Mojica, Diez-Villasenor et al., 2009). En un método particular de la invención, la proteína Cas9 se puede modificar para que no reconozca ningún motivo PAM o para reconocer un motivo PAM no natural. En este caso, la secuencia diana seleccionada puede comprender un motivo PAM más pequeño o más grande con cualquier combinación de aminoácidos. En un método preferido de la invención, la secuencia diana seleccionada comprende un motivo PAM que comprende al menos 3, preferiblemente 4, más preferiblemente 5 nucleótidos reconocidos por la variante de Cas9 de acuerdo con la presente divulgación.

La coexpresión de varios ARNcr con distintas regiones complementarias a dos genes diferentes dirigidos a ambos genes puede usarse simultáneamente. Por lo tanto, en particular, el ARNcr puede modificarse para reconocer simultáneamente diferentes secuencias de ácido nucleico diana. En este caso, el mismo ARNcr comprende al menos dos secuencias distintas complementarias a una porción de las diferentes secuencias de ácido nucleico diana. En un método preferido de la invención, dichas secuencias complementarias están espaciadas por una secuencia repetida.

El ARNcr también se puede modificar para aumentar su estabilidad de la estructura secundaria y/o su afinidad de unión por Cas9. En una realización particular, el ARNcr puede comprender un fosfato cíclico 2', 3'. El terminal del fosfato cíclico 2', 3' parece estar involucrado en muchos procesos celulares, es decir, empalme de ARNt, escisión endonucleolítica por varias ribonucleasas, en la autoescisión por ribozima de ARN y en respuesta a diversos estreses celulares, incluida la acumulación de proteína desplegada en el retículo endoplasmático y estrés oxidativo (Schutz, Hesselberth et al., 2010). Los inventores han especulado que el fosfato cíclico 2', 3' mejora la estabilidad del ARNcr o su afinidad/especificidad por Cas9. Por lo tanto, la presente divulgación se refiere al ARNcr modificado que comprende un fosfato cíclico 2', 3' y los métodos para la modificación del genoma basada en el sistema CRISPR/Cas (Jinek, Chylinski et al., 2012; Cong, Ran et al., 2013 ; Mali, Yang et al., 2013) utilizando el ARNcr modificado.

El ARN guía también puede comprender un ARN CRISPR transactivador (ARNtracr). El ARN CRISPR transactivador de acuerdo con la presente divulgación se caracteriza por una secuencia antirepetición capaz de emparejar las bases con al menos una parte de la secuencia de extensión 3' del ARNcr para formar un ARNtracr: ARNcr también denominado ARN guía (ARNg). ARNtracr comprende una secuencia complementaria a una región del ARNcr. Un ARN guía que comprende una fusión de ARNcr y ARNtracr que forma una horquilla que imita el complejo ARNtracr-ARNcr (Jinek, Chylinski et al., 2012; Cong, Ran et al., 2013; Mali, Yang et al., 2013) se puede utilizar para escisión directa mediada por endonucleasa Cas9 del ácido nucleico diana. El ARN guía puede comprender dos secuencias distintas complementarias a una porción de las dos secuencias de ácido nucleico diana, preferiblemente espaciadas por una secuencia repetida.

Recombinación homóloga

Se sabe que las rupturas endonucleolíticas estimulan la tasa de recombinación homóloga. Por lo tanto, también se describe en el presente documento un método para inducir el direccionamiento de genes homólogos en la secuencia diana de ácido nucleico mediante el uso de una endonucleasa guiada por ARN. Este método puede comprender además la etapa de proporcionar un ácido nucleico exógeno a la célula (por ejemplo, ADN del donante) que comprende al menos una secuencia homóloga a una porción de la secuencia de ácido nucleico diana, de modo que se produce una recombinación homóloga entre la secuencia de ácido nucleico diana y dicho ácido nucleico exógeno.

Dicho ácido nucleico exógeno puede comprender porciones primera y segunda que son homólogas a la región 5' y 3' de la secuencia de ácido nucleico diana, respectivamente. Dicho ácido nucleico exógeno también puede comprender una tercera porción posicionada entre la primera y la segunda porción que no comprende homología con las regiones 5' y 3' de la secuencia de ácido nucleico diana. Después de la escisión de la secuencia de ácido nucleico diana, se estimula un evento de recombinación homóloga entre la secuencia de ácido nucleico diana y el ácido nucleico exógeno. Preferiblemente, se utilizan secuencias homólogas de al menos 50 pb, preferiblemente más de 100 pb y más preferiblemente más de 200 pb dentro de dicha matriz donante. Por lo tanto, la secuencia homóloga es preferiblemente de 200 pb a 6.000 pb, más preferiblemente de 1.000 pb a 2.000 pb. De hecho, las homologías de ácido nucleico compartidas se localizan en regiones que flanquean secuencia arriba y secuencia abajo del sitio de la ruptura y la secuencia de ácido nucleico que se va a introducir debe estar ubicada entre los dos brazos.

Dependiendo de la ubicación de la secuencia de ácido nucleico diana en la que se ha producido el evento de rompimiento, dicho ácido nucleico exógeno puede usarse para inactivar un gen, por ejemplo, cuando el ácido nucleico exógeno se encuentra dentro del marco de lectura abierto de dicho gen, o para introducir nuevas secuencias o genes de interés. Las inserciones de secuencia mediante el uso de dicho ácido nucleico exógeno se pueden usar para modificar un gen dirigido existente, mediante la corrección o reemplazo de dicho gen (intercambio de alelos como ejemplo no limitante), o para sobrerregular o subregular la expresión del gen diana (intercambio de promotor como ejemplo no limitante), dicha corrección o reemplazo del gen dirigido.

Métodos de suministro

Los métodos descritos en este documento implican la introducción de una molécula de interés tal como ARN guía (ARNcr, ARNtracr, o ARN guía de fusión), Cas9 dividida, Cas9, ácido nucleico exógeno, enzima de procesamiento de los extremos del ADN en una célula. El ARN guía, Cas9 dividida, Cas9, ácido nucleico exógeno, enzima de procesamiento de los extremos del ADN u otras moléculas de interés pueden sintetizarse in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos, preferiblemente transgenes, comprendidos en el vector que codifica ARN o polipéptidos en la célula. Alternativamente, la molécula de interés podría producirse fuera de la célula y luego introducirse en ella.

Los inventores han considerado cualquier medio conocido en la técnica para permitir la administración dentro de las células o compartimentos subcelulares de agentes/compuestos químicos y moléculas (proteínas y ácidos nucleicos) que incluyen medios de administración liposomal, portadores poliméricos, portadores químicos, lipoplexos, poliplexos, dendrímeros, nanopartículas, emulsión, endocitosis natural o vía de fagocitosis como ejemplos no limitantes, así como métodos físicos tales como la electroporación.

Como una realización del método de la invención, los polinucleótidos que codifican la endonucleasa guiada por ARN se transfectan en forma de ARNm, que se introduce directamente en las células, por ejemplo mediante electroporación.

Los inventores han determinado diferentes condiciones óptimas para la electroporación de ARNm en células T mostradas en la Tabla 1. El inventor utilizó la tecnología cytoPulse que permite, mediante el uso de campos eléctricos pulsados, permeabilizar transitoriamente células vivas para el suministro de material a las células. La tecnología, basada en el uso de formas de onda de electroporación PulseAgile (Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 EE. UU.), garantiza el control preciso de la duración del pulso, la intensidad así como el intervalo entre los pulsos (patente de los Estados Unidos No. 6.010.613 y el documento WO2004083379). Todos estos parámetros pueden modificarse para alcanzar las mejores condiciones para una alta eficiencia de transfección con una mínima mortalidad. Básicamente, los primeros pulsos de campo eléctrico elevado permiten la formación de poros, mientras que los pulsos de campo eléctrico inferiores posteriores permiten mover el polinucleótido al interior de la célula. En un aspecto de la presente invención, los inventores describen las etapas que condujeron al logro de > 95% de eficiencia de transfección de ARNm en células T, y el uso del protocolo de electroporación para expresar transitoriamente diferentes tipos de proteínas en células T. En particular, la divulgación se refiere a un método de transformación de células T que comprende poner en contacto dicha célula T con ARN y aplicar a la célula T una secuencia de pulsos ágiles que consta de:

(a) un pulso eléctrico con un intervalo de voltaje de 2.250 a 3.000 V por centímetro, un ancho de pulso de 0,1 ms y un intervalo de pulso de 0,2 a 10 ms entre los pulsos eléctricos de la etapa (a) y (b);

(b) un pulso eléctrico con un intervalo de voltaje de 2.250 a 3.000 V con un ancho de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso eléctrico de la etapa (b) y el primer pulso eléctrico de la etapa (c); y

(c) 4 pulsos eléctricos con un voltaje de 325 V con un ancho de pulso de 0,2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos eléctricos.

El método de transformación de la célula T puede comprender poner en contacto dicha célula T con ARN y aplicar a la célula T una secuencia de pulsos ágil que consta de:

(a) un pulso eléctrico con un voltaje de 2.250, 2.300, 2.350, 2.400, 2.450, 2.500, 2.550, 2.400, 2.450, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900 o 3.000 V por centímetro, un ancho de pulso de 0,1 ms y un intervalo de pulso de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ms entre los pulsos eléctricos de la etapa (a) y (b);

(b) un pulso eléctrico con un intervalo de voltaje de 2.250, 2.250, 2.300, 2.350, 2.400, 2.450, 2.500, 2.550, 2.400, 2.450, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900 o 3.000 V con un ancho de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso eléctrico de la etapa (b) y el primer pulso eléctrico de la etapa (c); y

Cualquier valor incluido en el intervalo de valores descrito anteriormente se divulga en la presente solicitud. El medio de electroporación puede ser cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Preferiblemente, el medio de electroporación tiene una conductividad en un intervalo que abarca de 0,01 a 1,0 miliSiemens.

Transducción viral

De acuerdo con la presente divulgación, se encontró que el uso de vectores virales como se define a continuación para la transducción de los ácidos nucleicos que codifican las endonucleasas guiadas por ARN y/o los transcriptos que se usarán como ARN guía es una posible alternativa a los medios anteriores de transfección. Los métodos para la transducción viral son bien conocidos en la técnica. Sin embargo, tales métodos pueden encontrar algunas limitaciones en la situación actual debido a la integración estable de los vectores retrovirales o lentivirales en el genoma de las células T y la expresión resultante de la endonucleasa durante un largo período de tiempo. Esto puede tener efectos nocivos sobre las células T dependiendo del nivel de especificidad conferido por la guía de ARN.

Pseudo-transducción mediante encapsidación viral de endonucleasa guiada por ARN

Dadas algunas de las desventajas de los medios y materiales existentes para administrar endonucleasas guiadas por ARN a sus sitios de acción en las células T, los inventores han buscado métodos de administración alternativos, en particular métodos de administración en los que las endonucleasas guiadas por ARN son introducidas en forma de polipéptido fusionando dichos componentes virales polipeptídicos. Como ejemplo, las endonucleasas guiadas por ARN pueden fusionarse con proteínas del complejo de integración previa del VIH, tal como Vpr o Vpx. En consecuencia, las endonucleasas guiadas por ARN en forma de polipéptido pueden actuar sobre una diana específica en el genoma de la célula huésped tan pronto como se liberan en la célula después de la entrada del virus y la desencapsulación.

Para la aplicación terapéutica, en la que el uso de los componentes retrovirales anteriores puede plantear problemas, porque son "proteínas auxiliares" para las infecciones virales oportunistas, los inventores podrían encontrar inesperadamente una alternativa. Han observado que las endonucleasas guiadas por ARN, en particular Cas9, podrían incorporarse en partículas de vector lentiviral durante el ensamblaje del virión y que dichas endonucleasas 'auto' incorporadas son suficientes para actuar de manera que modifiquen un genoma diana después de la infección de una célula diana por tal vector viral.

De acuerdo con este aspecto de la divulgación, se proporciona un método de modificación del genoma que involucra uno o varias de las etapas de:

a) ensamblar al menos un vector de virus en presencia de una endonucleasa; dicha endonucleasa preferiblemente no está fusionada con ningún componente lentiviral

b) poner en contacto al menos una célula diana con dicho vector viral,

c) en la que después de la internalización de dicho vector de virus por dicha célula diana, dicha nucleasa reconoce y escinde al menos una diana específica en el genoma de dicha al menos una célula diana.

De acuerdo con la presente divulgación, los vectores virales incluyen los derivados de un virus tal como un retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la influenza), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de doble cadena, incluidos adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C, virus de tipo B, virus de tipo D de mamíferos, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, JM, Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, tercera edición, BN Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996). Los términos "vector viral" o "vector" se refieren a una partícula de virus modificada que puede usarse para introducir una molécula de ácido nucleico y/o un péptido u otra molécula en una célula diana.

Los inventores han demostrado que después de la transferencia al citoplasma celular, la endonucleasa guiada por ARN retiene su actividad y puede asociarse fácilmente con el ARN guía. Dicho ARN guía también puede encapsularse durante el ensamblaje del virión y, por lo tanto, liberarse simultáneamente en el citoplasma de las células T.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente divulgación, el vector de virus es un vector de base lentiviral o retroviral (LV), que preferiblemente no son integradores. Los LV son partículas virales defectuosas en la replicación que comprenden un núcleo de proteína interno que rodea el material genético del virus, generalmente llamado núcleo de nucleocápside y una membrana lipídica externa. Estas partículas virales defectuosas en la replicación se ensamblan expresando proteínas codificadas por los genes lentivirales gag y pol en células de empaquetamiento. Los genes gag y pol codifican poliproteínas y una proteasa que procesa estas poliproteínas en componentes individuales de la partícula del virus.

Una NLS, una secuencia de aminoácidos que actúa para conducir la proteína al núcleo celular a través del complejo nuclear de poros, puede fusionarse con la endonucleasa guiada por ARN para mejorar su eficacia de suministro. Por lo general, una NLS consta de una o más secuencias cortas de aminoácidos cargados positivamente tales como lisinas o argininas tales como aquellas de las proteínas conocidas de antígeno T grande de CV40 -PKKKRKV-, nucleoplasmina -KR [PAATKKAGQA KKKK-, p54 -RIRKKLR-, SOX9 -PRRRK-, NS5A -PPRKKRTVV-.

Independientemente del uso presente de endonucleasas guiadas por ARN de acuerdo con la divulgación, el método anterior de encapsidación viral puede expandirse a otros tipos de endonucleasas de corte raro, tales como nucleasas TAL, nucleasas de dedo de Zing o endonucleasas de localización, con respecto a cualquier tipo de células que puedan ser infectadas por vectores virales.

Métodos de administración de péptidos que penetran en las células

Los inventores han investigado métodos de administración adicionales como parte de la presente divulgación, en particular el uso de péptidos penetrantes de células (CPP) para introducir la endonucleasa guía de ARN y/o guiada por ARN en las células T.

Por consiguiente, el método de la divulgación puede comprender una etapa de preparación de la composición que comprende un péptido que penetra en las células unido a la guía de ARN y/o la endonucleasa guiada por ARN. Dicho CPP, preferiblemente del extremo terminal N o terminal C del CPP también se puede asociar con las moléculas. Esta asociación puede ser covalente o no covalente. Los CPP se pueden subdividir en dos clases principales, la primera requiere un enlace químico con la molécula y la segunda implica la formación de complejos no covalentes estables. Los CPP unidos covalentemente forman un conjugado covalente por entrecruzamiento químico (por ejemplo, enlace disulfuro) o por clonación seguida por la expresión de un CPP proteína de fusión endonucleasa guiada por ARN. Preferiblemente, dicho CPP tiene una función disulfuro de piridilo de manera que la molécula modificada con tiol forma un enlace disulfuro con el CPP. Dicho enlace disulfuro se puede escindir en particular en un entorno reductor tal como el citoplasma. Los CPP unidos en forma no covalente son preferentemente péptidos anfipáticos.

Aunque la definición de CPP está en constante evolución, generalmente se describen como péptidos cortos de menos de 35 aminoácidos derivados de proteínas o de secuencias quiméricas, que son capaces de transportar biomoléculas hidrófilas polares a través de la membrana celular de una manera independiente del receptor. Los CPP pueden ser péptidos catiónicos, péptidos que tienen secuencias hidrófobas, péptidos anfipáticos, péptidos que tienen una secuencia rica en prolina y antimicrobiana y péptidos quiméricos o bipartitos (Pooga y Langel 2005). En particular, el CPP catiónico puede comprender múltiples CPP básicos o catiónicos (por ejemplo, arginina y/o lisina). Preferiblemente, los CCP son anfipáticos y poseen una carga neta positiva. Los CPP pueden penetrar las membranas biológicas, desencadenar el movimiento de varias biomoléculas a través de las membranas celulares hacia el citoplasma y mejorar su desplazamiento intracelular, facilitando así las interacciones con la diana. Los ejemplos de CPP pueden incluir: Tat, una proteína activadora de la transcripción nuclear que es una proteína de 101 aminoácidos requerida para la replicación viral por el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), penetratina, que corresponde a la tercera hélice de la homeoproteína Antennapedia en Drosophila, secuencia del péptido señal del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) de Kaposi, secuencia del péptido señal de la integrina p3; transportadores moleculares ricos en guanina, MPG, pep-1, péptido flecha dulce, dermaseptinas, transportano, pVEC, calcitonina humana, proteína priónica de ratón (mPrPr), secuencia de Arg del péptido de poliarginina, proteína VP22 del virus del herpes simple, péptidos antimicrobianos Buforina I y SynB (documento US2013/0065314). Las nuevas variantes de CPP pueden combinar diferentes dominios de transducción.

Células T no alorreactivas:

Los receptores de células T (TCR) son receptores de la superficie celular que participan en la activación de las células T en respuesta a la presentación del antígeno. El TCR generalmente está hecho de dos cadenas, alfa y beta, que se ensamblan para formar un heterodímero y se asocia con las subunidades transductoras de CD3 para formar el complejo receptor de células T presente en la superficie celular. Cada cadena alfa y beta del TCR consta de una región variable (V) y constante (C) del terminal N similar a la inmunoglobulina, un dominio transmembrana hidrófobo y una región citoplasmática corta. En cuanto a las moléculas de inmunoglobulina, la región variable de las cadenas alfa y beta se genera mediante recombinación V(D)J, creando una gran diversidad de especificidades antigénicas dentro de la población de células T. Sin embargo, a diferencia de las inmunoglobulinas que reconocen el antígeno intacto, las células T se activan mediante fragmentos de péptidos procesados en asociación con una molécula del MHC, lo que introduce una dimensión adicional en el reconocimiento de antígenos por las células T, conocida como restricción del MHC. El reconocimiento de las disparidades del MHC entre el donante y el receptor a través del receptor de células T conduce a la proliferación de células T y al desarrollo potencial de GvHD. Se ha demostrado que la expresión superficial normal del TCR depende de la síntesis y el ensamblaje coordinados de los siete componentes del complejo (Ashwell y Klusner, 1990). La inactivación de TCR alfa o TCR beta puede resultar en la eliminación del TCR de la superficie de las células T impidiendo el reconocimiento del aloantígeno y por lo tanto GVHD. Sin embargo, la alteración del TCR generalmente da como resultado la eliminación del componente de señalización de CD3 y altera los medios de expansión adicional de las células T.

Como un objetivo principal de la presente invención es el uso de endonucleasa guiada por ARN como se describió previamente en un método para modificar células T no alorreactivas, para uso en inmunoterapia.

Este método comprende más particularmente las etapas de modificar las células T como se describió previamente inactivando al menos un componente del receptor de células T (TCR) usando una endonucleasa guiada por ARN asociada con un ARN guía específico.

El injerto de células T alogénicas es posible inactivando al menos un gen que codifica un componente del TCR. El TCR deja de ser funcional en las células inactivando el gen TCR alfa y/o el gen o genes TCR beta. La inactivación de TCR en células T alogénicas tiene como objetivo prevenir o reducir la GvHD.

Al inactivar un gen se pretende que el gen de interés no se exprese en forma de una proteína funcional. En particular, la modificación genética del método se basa en la expresión, en las células proporcionadas para la modificación, de la endonucleasa guiada por ARN de manera que la misma catalice la escisión en un gen diana inactivando así dicho gen diana. Los rompimientos de la cadena de ácido nucleico causados por la endonucleasa se reparan comúnmente mediante los distintos mecanismos de recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ). Sin embargo, NHEJ es un proceso de reparación imperfecto que a menudo da como resultado cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escisión. Los mecanismos implican volver a unir lo que queda de los dos extremos del ADN a través de una nueva ligación directa (Critchlow y Jackson, 1998) o mediante la denominada unión de extremos mediada por microhomología (Betts, Brenchley et al., 2003; Ma, Kim et al., 2003). La reparación a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) a menudo da como resultado pequeñas inserciones o eliminaciones y puede usarse para la creación de inactivaciones de genes específicos. Dicha modificación puede ser una sustitución, eliminación o adición de al menos un nucleótido. Las células en las que ha ocurrido un evento de mutagénesis inducida por escisión, es decir, un evento de mutagénesis consecutivo a un evento de NHEJ, pueden identificarse y/o seleccionarse mediante un método bien conocido en la técnica.

Los inventores han determinado secuencias diana apropiadas dentro de los 3 exones que codifican TCR, lo que permite una reducción significativa de la toxicidad, al tiempo que conserva la eficacia de escisión. Las secuencias diana preferidas se indican en la Tabla 2 (+ para una proporción más baja de células negativas para TCR, + para una proporción intermedia, ++ para una proporción más alta).

T l ^ 2: n i i n r i r l ARN í n n l l T

(continuación)

Método de modificación de células T resistentes a fármacos:

Para mejorar la terapia del cáncer y el injerto selectivo de células T alogénicas, se puede conferir resistencia a fármacos a las células T modificadas para protegerlas de los efectos secundarios tóxicos de la quimioterapia o los agentes inmunosupresores. De hecho, los inventores han observado que la mayoría de los pacientes fueron tratados con quimioterapia y agentes que reducen el sistema inmunológico como estándar de atención, antes de los ensayos que implican inmunoterapia de células T. También encontraron que podían aprovechar estos tratamientos para ayudar a la selección de las células T modificadas, ya sea agregando medicamentos de quimioterapia en medios de cultivo para la expansión de las células ex vivo antes del tratamiento, u obteniendo una expansión selectiva de las células T modificadas in vivo en pacientes sometidos a tratamientos de quimioterapia o inmunosupresores.

Además, la resistencia a los fármacos de las células T también permite su enriquecimiento in vivo o ex vivo, ya que las células T que expresan el gen de resistencia a los fármacos sobrevivirán y se multiplicarán en relación con las células sensibles a los fármacos. En particular, la presente divulgación se refiere a un método para modificar células T alogénicas y resistentes a fármacos para inmunoterapia que comprende:

(a) Proporcionar una célula T;

(b) Seleccionar al menos un fármaco;

(c) Modificar la célula T para conferir resistencia al fármaco a dicha célula T;

(d) Expandir dicha célula T modificada en presencia de dicho fármaco y, opcionalmente, las etapas anteriores pueden combinarse con las etapas descritas anteriormente de:

(e) Modificar dicha célula T inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR); (f) Clasificar las células T transformadas, que no expresan TCR en su superficie celular.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, el método comprende la etapa de inactivar al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR), mientras se modifica adicionalmente dicha célula T para conferir resistencia a un fármaco, más particularmente un agente de quimioterapia. La resistencia a un fármaco se puede conferir a una célula T expresando un gen de resistencia al fármaco. Se han identificado alelos variantes de varios genes tales como la dihidrofolato reductasa (DHFR), la inosina monofosfato deshidrogenasa 2 (IMPDH2), la calcineurina o la metilguanina transferasa (MGMT) para conferir resistencia a los fármacos a una célula. Dicho gen de resistencia a fármacos puede expresarse en la célula introduciendo un transgén que codifica dicho gen en la célula o integrando dicho gen de resistencia a fármacos en el genoma de la célula mediante recombinación homóloga.

La resistencia a un fármaco se puede conferir a una célula T inactivando uno o más genes responsables de la sensibilidad de la célula al fármaco (gen o genes de sensibilización al fármaco), tal como el gen de la hipoxantinaguanina fosforribosil transferasa (HPRT) (GenBank: M26434.1). En particular, HPRT puede inactivarse en células T modificadas para conferir resistencia a un metabolito citostático, la 6-tioguanina (6TG), que es convertida por HPRT en nucleótido citotóxico de tioguanina y que se usa actualmente para tratar pacientes con cáncer, en particular leucemias (Hacke, Treger et al., 2013). Otro ejemplo, si la inactivación de CD3 normalmente expresada en la superficie de la célula T puede conferir resistencia a anticuerpos anti-CD3 como teplizumab.

De lo contrario, dicha resistencia al fármaco se puede conferir a la célula T mediante la expresión de al menos un gen de resistencia al fármaco. Dicho gen de resistencia al fármaco se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la "resistencia" a un agente, tal como un agente quimioterapéutico (por ejemplo, metotrexato). En otras palabras, la expresión del gen de resistencia al fármaco en una célula permite la proliferación de las células en presencia del agente en mayor medida que la proliferación de una célula correspondiente sin el gen de resistencia al fármaco. Un gen de resistencia al fármaco de la divulgación puede codificar resistencia a un antimetabolito, metotrexato, vinblastina, cisplatino, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos citotóxicos, antiinmunofilinas, sus análogos o derivados y similares.

Se han identificado varios genes de resistencia a los fármacos que pueden usarse potencialmente para conferir resistencia a los fármacos a las células diana (Takebe, Zhao et al., 2001; Sugimoto, Tsukahara et al., 2003; Zielske, Reese et al., 2003; Nivens, Felder et al., 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al., 2005; Kushman, Kabler et al., 2007).

Un ejemplo de gen de resistencia a fármacos también puede ser una forma mutante o modificada de dihidrofolato reductasa (DHFR). La DHFR es una enzima involucrada en la regulación de la cantidad de tetrahidrofolato en la célula y es esencial para la síntesis de ADN. Los análogos de folato tales como el metotrexato (MTX) inhiben la DHFR y, por lo tanto, se utilizan como agentes antineoplásicos en la clínica. Se han descrito diferentes formas mutantes de DHFR que tienen una mayor resistencia a la inhibición por anti-folatos usados en terapia. En un aspecto particular, el gen de resistencia a fármacos de acuerdo con la presente divulgación puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica una forma mutante de DHFR de tipo silvestre humano (GenBank: AAH71996.1) que comprende al menos una mutación que confiere resistencia a un tratamiento antifolato, tal como el metotrexato. En un aspecto particular, la forma mutante de DHFR comprende al menos un aminoácido mutado en la posición G15, L22, F31 o F34, preferiblemente en las posiciones L22 o F31 ((Schweitzer, Dicker et al., 1990); solicitud internacional WO94/24277; patente de los Estados Unidos No. 6.642.043).

Como se usa en este documento, "agente antifolato" o "análogos de folato" se refiere a una molécula dirigida a interferir con la ruta metabólica del folato en algún nivel. Los ejemplos de agentes antifolato incluyen, por ejemplo, metotrexato (MTX); aminopterina; trimetrexato (NeutrexinMR); edatrexato; ácido N10-propargil-5,8-dideazafólico (CB3717); ZD1694 (Tumodex), ácido 5,8-dideazaisofólico (IAHQ); ácido 5,10-dideazatetrahidrofólico (DDATHF); ácido 5-deazafólico; PT523 (N-alfa-(4-amino-4-desoxipteroil)-N-delta-hemiftaloil-L-ornitina); 10-etil-10-deazaaminopterina (DDATHF, lomatrexol); piritrexim; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; Pemetrexato y PDX (10-propargil-10-deazaaminopterina).

Otro ejemplo de gen de resistencia a fármacos también puede ser una forma mutante o modificada de ionisina-5'-monofosfato deshidrogenasa II (IMPDH2), una enzima limitante de la velocidad en la nueva síntesis de nucleótidos de guanosina. La forma mutante o modificada de IMPDH2 es un gen de resistencia al inhibidor de IMPDH. Los inhibidores de la IMPDH pueden ser el ácido micofenólico (MPA) o su profármaco micofenolato de mofetilo (MMF). La IMPDH2 mutante puede comprender al menos una, preferiblemente dos mutaciones en el sitio de unión a MAP de la IMPDH2 humana de tipo silvestre (NP_000875.2) que conducen a una resistencia significativamente aumentada al inhibidor de IMPDH. Las mutaciones se encuentran preferiblemente en las posiciones T333 y/o S351 (Yam, Jensen et al., 2006; Sangiolo, Lesnikova et al., 2007; Jonnalagadda, Brown et al., 2013). En un aspecto particular, el residuo de treonina en la posición 333 se reemplaza con un residuo de isoleucina y el residuo de serina en la posición 351 se reemplaza con un residuo de tirosina.

Otro gen de resistencia a fármacos es la forma mutante de calcineurina. La calcineurina (PP2B) es una proteína fosfatasa de serina/treonina expresada de manera ubicua que está involucrada en muchos procesos biológicos y que es fundamental para la activación de las células T. La calcineurina es un heterodímero compuesto por una subunidad catalítica (CnA; tres isoformas) y una subunidad reguladora (CnB; dos isoformas). Después del acoplamiento del receptor de células T, la calcineurina desfosforila el factor de transcripción NFAT, lo que le permite translocarse al núcleo y activar al gen clave, tal como IL2. FK506 en complejo con FKBP12, o ciclosporina A (CsA) en complejo con CyPA bloquean el acceso de NFAT al sitio activo de la calcineurina, evitando su desfosforilación y por lo tanto inhibiendo la activación de células T (Brewin, Mancao et al., 2009). El gen de resistencia a fármacos de la presente divulgación puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica una forma mutante de calcineurina resistente al inhibidor de calcineurina tal como FK506 y/o CsA. En un aspecto particular, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoácido mutado del heterodímero a de calcineurina de tipo silvestre en las posiciones: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360, preferiblemente mutaciones dobles en las posiciones T351 y L354 o V314 y Y341. La correspondencia de las posiciones de los aminoácidos descritas en el presente documento se expresa frecuentemente en términos de las posiciones de los aminoácidos en forma de heterodímero de calcineurina humana de tipo silvestre (GenBank: ACX34092.1).

En otro aspecto particular, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoácido mutado del heterodímero b de calcineurina de tipo silvestre en las posiciones: V120, N123, L124 o K125, preferiblemente mutaciones dobles en las posiciones L124 y K125. La correspondencia de las posiciones de los aminoácidos descritas en el presente documento se expresa frecuentemente en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma del polipéptido heterodímero b de calcineurina humana de tipo silvestre (GenBank: ACX34095.1).

Otro gen de resistencia a fármacos es la 0(6)-metilguanina metiltransferasa (MGMT) que codifica la alquil guanina transferasa humana (hAGT). AGT es una proteína reparadora del ADN que confiere resistencia a los efectos citotóxicos de los agentes alquilantes, tal como las nitrosoureas y la temozolomida (TMZ). La 6-bencilguanina (6-BG) es un inhibidor de AGT que potencia la toxicidad de la nitrosourea y se coadministra con TMZ para potenciar los efectos citotóxicos de este agente. Varias formas mutantes de MGMT que codifican variantes de AGT son altamente resistentes a la inactivación por 6-BG, pero conservan su capacidad para reparar el daño del ADN (Maze, Kurpad et al., 1999). En un aspecto particular, la forma mutante de AGT puede comprender un aminoácido mutado de la posición P140 de AGT de tipo silvestre (UniProtKB: P16455).

Otro gen de resistencia a fármacos puede ser el gen de la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MDR1). Este gen codifica una glicoproteína de membrana, conocida como glicoproteína P (P-Gp), involucrada en el transporte de subproductos metabólicos a través de la membrana celular. La proteína P-Gp muestra una amplia especificidad hacia varios agentes de quimioterapia estructuralmente no relacionados. Por lo tanto, la resistencia a los fármacos puede conferirse a las células mediante la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica MDR-1 (NP_000918).

El gen de resistencia a fármacos también pueden ser antibióticos citotóxicos, tales como el gen ble o el gen mcrA. La expresión ectópica del gen ble o mcrA en una célula inmunitaria proporciona una ventaja selectiva cuando se expone al agente quimioterapéutico, respectivamente, la bleomicina o la mitomicina C.

Con respecto a los agentes inmunosupresores, la presente divulgación proporciona las posibles etapas opcionales de:

(a) Proporcionar una célula T, preferiblemente de un cultivo celular o de una muestra de sangre;

(b) Seleccionar un gen en dicha célula T que exprese una diana para un agente inmunosupresor;

(c) Introducir en dicha endonucleasa guiada por ARN de células T capaz de inactivar selectivamente por escisión del ADN, preferiblemente por ruptura de doble cadena, dicho gen que codifica una diana para dicho agente inmunosupresor,

(d) Expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.

Preferiblemente, dicho método comprende inactivar un componente del receptor de células T (TCR).

Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la función inmunitaria mediante uno de varios mecanismos de acción. En otras palabras, un agente inmunosupresor es un papel desempeñado por un compuesto que exhibe una capacidad para disminuir el alcance y/o la voracidad de una respuesta inmune. Como ejemplo no limitante, un agente inmunosupresor puede ser un inhibidor de la calcineurina, una diana de la rapamicina, un bloqueador de la cadena a de la interleucina 2, un inhibidor de la inosina monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la reductasa del ácido dihidrofólico, un corticosteroide o un antimetabolito inmunosupresor. Los inmunosupresores citotóxicos clásicos actúan inhibiendo la síntesis de ADN. Otros pueden actuar mediante la activación de células T o inhibiendo la activación de células auxiliares. El método de acuerdo con la invención permite conferir resistencia inmunosupresora a las células T para inmunoterapia inactivando la diana del agente inmunosupresor en las células T. Como ejemplos no limitantes, las dianas para el agente inmunosupresor pueden ser un receptor para un agente inmunosupresor tal como: CD52, receptor de glucocorticoides (GR), un miembro del gen de la familia FKBP y un miembro del gen de la familia de la ciclofilina.

En huéspedes inmunocompetentes, las células alogénicas normalmente son rechazadas rápidamente por el sistema inmunológico del huésped. Se ha demostrado que los leucocitos alogénicos presentes en los productos sanguíneos no irradiados persistirán durante no más de 5 a 6 días (Boni, Muranski et al., 2008). Por lo tanto, para evitar el rechazo de células alogénicas, el sistema inmunológico del huésped debe suprimirse eficazmente. Los glucocorticoidesesteroides se utilizan ampliamente con fines terapéuticos para la inmunosupresión (Coutinho y Chapman, 2011). Esta clase de hormonas esteroides se une al receptor de glucocorticoides (GR) presente en el citosol de las células T, lo que resulta en la translocación al núcleo y la unión de motivos de ADN específicos que regulan la expresión de varios genes involucrados en el proceso inmunológico. El tratamiento de las células T con esteroides glucocorticoides da como resultado niveles reducidos de producción de citocinas que conducen a la anergia de las células T e interfieren en la activación de las células T. Alemtuzumab, también conocido como CAMPATH1-H, es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido a CD52, una glicoproteína unida a glicosilfosfatidil-inositol (GPI) de 12 aminoácidos (Waldmann y Hale, 2005). CD52 se expresa en niveles altos en linfocitos T y B y niveles más bajos en monocitos, aunque está ausente en granulocitos y precursores de la médula ósea. Se ha demostrado que el tratamiento con alemtuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra CD52, induce un rápido agotamiento de los linfocitos y monocitos circulantes. Se usa con frecuencia en el tratamiento de linfomas de células T y, en ciertos casos, como parte de un régimen de acondicionamiento para el trasplante. Sin embargo, en el caso de la inmunoterapia adoptiva, el uso de fármacos inmunosupresores también tendrá un efecto perjudicial sobre las células T terapéuticas introducidas. Por lo tanto, para utilizar eficazmente un enfoque de inmunoterapia adoptiva en estas condiciones, las células introducidas necesitarían ser resistentes al tratamiento inmunosupresor.

Como aspecto preferido de las etapas anteriores, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es CD52, y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) comprende un anticuerpo humanizado dirigido al antígeno CD52. Como otro aspecto, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es un receptor glucocorticoide (GR) y el tratamiento inmunosupresor de la etapa d) comprende un corticosteroide tal como dexametasona. Como otro aspecto, dicho gen diana de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro del gen de la familia FKBP o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) comprende FK506 también conocido como Tacrolimus o fujimicina. Como otro aspecto, dicho miembro del gen de la familia FKBP es FKBP12 o una variante del mismo. Como otro aspecto, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro del gen de la familia de la ciclofilina o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) comprende ciclosporina.

En un aspecto particular de la divulgación, la etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de dos genes seleccionados del grupo que consiste en CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, TCR alfa y TCR beta. En otro aspecto, la etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de más de dos genes. La modificación genética se opera preferiblemente ex vivo usando al menos dos guías de ARN dirigidas a los diferentes genes.

Al inactivar un gen, se pretende que el gen de interés no se exprese en una forma de proteína funcional.

Modificación de células T altamente activas para inmunoterapia

En el alcance de la presente divulgación también se incluye una célula T aislada obtenida de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Dicha célula T de acuerdo con la presente divulgación puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre de cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas inducidas. Las células humanas representativas son células CD34+. Las células T de acuerdo con la divulgación se pueden seleccionar del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T colaboradores. En otro aspecto, dicha célula puede derivarse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la divulgación, se puede obtener una fuente de células de un sujeto a través de una variedad de métodos no limitantes. Las células T pueden obtenerse de diversas fuentes no limitantes, que incluyen células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertos aspectos de la presente divulgación, se puede usar cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En otro aspecto, dicha célula puede derivarse de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. En otro aspecto, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente divulgación también se incluye una línea celular obtenida a partir de una célula T transformada de acuerdo con el método descrito previamente. Las células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de ser obtenidas mediante el método anterior se incluyen en el alcance de la presente divulgación.

Puntos de control inmunológico

Los expertos en la técnica entenderán que el término "puntos de control inmunológico" significa un grupo de moléculas expresadas por células T. Estas moléculas sirven eficazmente como "frenos" para submodular o inhibir una respuesta inmunitaria. Las moléculas de punto de control inmunológico incluyen, pero no se limitan a, muerte programada 1 (PD-1, también conocida como PDCD1 o CD279, número de acceso: n M_005018), antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA-4, también conocido como CD152, GenBank número de acceso AF414120.1), LAG3 (también conocido como CD223, número de acceso: NM_002286.5), Tim3 (también conocido como HAVCR2, GenBank número de acceso: JX049979.1), BTLA (también conocido como CD272, número de acceso: NM_181780.3), BY55 (también conocido como CD160, GenBank número de acceso: CR541888.1), TIGIT (también conocido como IVSTM3, número de acceso: NM_173799), LAIR1 (también conocido como CD305, GenBank número de acceso: CR542051.1, SIGLEC10 (GenBank número de acceso: AY358337.1), 2B4 (también conocido como CD244, número de acceso: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASPP8, CASP CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3 , PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 que inhiben directamente las células inmunes. Por ejemplo, CTLA-4 es una proteína de la superficie celular expresada en ciertas células T CD4 y CD8; cuando se acoplan a sus ligandos (B7-1 y B7-2) en las células presentadoras de antígenos, se inhiben la activación y la función efectora de las células T. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de modificación de células T, especialmente para inmunoterapia, que comprende modificar genéticamente las células T inactivando al menos una proteína implicada en el punto de control inmunológico, en particular PD1 y/o CTLA-4 o cualquiera de las proteínas de punto de control inmunológico a las que se hace referencia en la Tabla 3.

En un aspecto preferido, se inactivan al menos dos genes que codifican proteínas de puntos de control inmunológico, seleccionadas del grupo que consiste en: CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKIF1, ILRIL10 HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3.

En un aspecto preferido adicional, la inactivación de la proteína del punto de control inmunológico anterior se combina con la inactivación propuesta anteriormente, en particular de los componentes de TCR.

En otro aspecto preferido, dicha célula T modificada de acuerdo con la presente divulgación comprende dos genes inactivados seleccionados del grupo que consiste en CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR. beta, TCR alfa y TCR beta, PD1 y TCR alfa, PD1 y TCR beta, CTLA-4 y TCR alfa, CTLA-4 y TCR beta, LAG3 y TCR alfa, LAG3 y TCR beta, Tim3 y TCR alfa, Tim3 y TCR beta, BTLA y TCR alfa, BTLA y TCR beta, BY55 y TCR alfa, BY55 y TCR beta, TIGIT y TCR alfa, TIGIT y TCR beta, B7H5 y TCR alfa, B7H5 y TCR beta, LAIR1 y TCR alfa, LAIR1 y TCR beta, SIGLEC10 y TCR alfa, SIGLEC10 y TCR beta, 2B4 y TCR alfa, 2B4 y TCR beta y/o expresa un CAR o un CAR de múltiples cadenas.

Células T modificadas que expresan receptores de antígenos quiméricos contra células malignas

CAR de cadena sencilla

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T específicas de antígeno autólogo generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T utilizadas para la inmunoterapia adoptiva se pueden generar mediante la expansión de células T específicas de antígeno o la redirección de las células T mediante modificación genética (Park, Rosenberg et al., 2011). La transferencia de células T específicas de antígeno viral es un procedimiento bien establecido que se utiliza para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y neoplasias malignas relacionadas con virus raros. De manera similar, se ha demostrado que el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumores tienen éxito en el tratamiento del melanoma.

Tabla 3: Lista de enes ue codifican roteínas de untos de control inmunoló ico

Se han generado con éxito nuevas especificidades en las células T mediante la transferencia genética de receptores de células T transgénicas o receptores de antígenos quiméricos (CAR) (Jena, Dotti et al., 2010). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en una fracción de direccionamiento que está asociada con uno o más dominios de señalización en una única molécula de fusión. En general, la fracción de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un enlazador flexible. También se han utilizado con éxito fracciones de unión basadas en dominios de receptor o ligando. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación se derivan de la región citoplasmática de las cadenas CD3zeta o gamma del receptor Fc. Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de las células T, sin embargo, no lograron proporcionar una expansión prolongada y actividad antitumoral in vivo. Se han agregado dominios de señalización de moléculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137) solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T modificadas con CAR. Los CAR han permitido redirigir con éxito las células T contra los antígenos expresados en la superficie de las células tumorales de diversas neoplasias malignas, incluidos linfomas y tumores sólidos (Jena, Dotti et al., 2010).

La presente invención incluye además la posibilidad de expresar un receptor de antígeno quimérico como se describe en la bibliografía en células T modificadas como se describe en el presente documento.

CD19 es una diana atractiva para la inmunoterapia porque la gran mayoría de la leucemia linfoblástica aguda B (B-ALL) expresa de manera uniforme CD19, mientras que la expresión está ausente en células no hematopoyéticas, así como en células mieloides, eritroides y T, y células madre de la médula ósea. Se están llevando a cabo ensayos clínicos dirigidos a CD19 en neoplasias malignas de células B con respuestas antitumorales alentadoras. La mayoría infunde células T genéticamente modificadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) con especificidad derivada de la región scFv de un anticuerpo monoclonal de ratón específico de CD19 FMC63 (Nicholson, Lenton et al., 1997; Cooper, Topp et al., 2003; Cooper, Jena et al., 2012) (solicitud internacional: WO2013/126712).

Como ejemplo de receptor de antígeno quimérico monocatenario que se expresará en las células T modificadas genéticamente de acuerdo con la presente divulgación, se encuentra un polipéptido único que comprende al menos un dominio de unión al ligando extracelular, un dominio transmembrana y al menos un dominio transductor de señal, en el que dicho dominio de unión al ligando extracelular comprende un scFV derivado del anticuerpo monoclonal 4G7 anti-CD19 específico. Una vez transducido a la célula T, por ejemplo mediante el uso de transducción retroviral o lentiviral, este CAR contribuye al reconocimiento del antígeno CD19 presente en la superficie de las células B malignas implicadas en linfoma o leucemia.

También pueden introducirse otros ejemplos de receptor de antígeno quimérico en las células T de acuerdo con la presente divulgación, tales como receptores de antígeno portadores de CAR dirigidos contra marcadores antigénicos de mieloma múltiple o leucemia linfoblástica, tales como TNFRSF17 (UNIPROT Q02223), SLAMF7 (UNIPROT Q9NQ25), GPRC5D (UNIPROT Q9NZD1), FKBP11 (UNIPROT Q9NYL4), KAMP3, ITGA8 (UNIPROT P53708) y FCRL5 (UNIPROT Q68SN8).

Como ejemplos adicionales, el antígeno de la diana puede ser de cualquier grupo de moléculas de diferenciación (por ejemplo, CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123 y CD138), un antígeno de superficie asociado al tumor, tal como ErbB2 (HER2/neu), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), variante III de EGFR (EGFRvlll), CD19, CD20, CD30, Cd 40, disialogangliósido GD2, mucina ductal-epitelial, gp36, TAG-72, glicoesfingolípidos, antígeno asociado a glioma, gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxil esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, Prostasan, antígeno prostático específico (PSA), PAP, NY-Es O-1, LAGA-1a, p53, prostein, PSMA, supervivencia y telomerasa, antígeno tumoral 1 de carcinoma de próstata (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrina b2, CD22, factor de crecimiento de insulina (IGF1)-I, IGF-II, receptor de IGFI, mesotelina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un epítopo peptídico específico del tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, antígenos estromales tumorales, el dominio extra A (e Da ) y el dominio extra B (EDB) de fibronectina y el dominio A1 de tenascina-C (TnC A1) y proteína asociada a fibroblastos (fap); un antígeno específico de linaje o específico de tejido, tal como CD3, Cd 4, Cd 8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), b 7-2 (CD86), GM-CSF, receptores de citocinas, endoglina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF 17) o un antígeno de superficie específico del virus tal como un antígeno específico del VIH (como gp120 del VIH); un antígeno específico del EBV, un antígeno específico del CMV, un antígeno específico del VPH, un antígeno específico del virus de Lassa, un antígeno específico del virus de la influenza así como cualquier derivado o variante de estos marcadores de superficie. Los antígenos no son necesariamente antígenos marcadores de superficie, sino que también pueden ser pequeños antígenos endógenos presentados por HLA de clase I en la superficie de las células.

CAR de múltiples subunidades

Los receptores de antígenos quiméricos de la técnica anterior introducidos en células T se han formado a partir de polipéptidos de cadena sencilla que necesitan la adición en serie de dominios de señalización. Sin embargo, al mover los dominios de señalización desde su posición natural yuxtamembrana puede interferir con su función. Para superar este inconveniente, el solicitante diseñó recientemente un CAR de múltiples cadenas derivado de FceRI para permitir la posición yuxtamembrana normal de todos los dominios de señalización relevantes. En esta nueva arquitectura, el dominio de unión de IgE de alta afinidad de la cadena alfa de FceRI se reemplaza por un dominio de unión de ligando extracelular tal como scFv para redirigir la especificidad de las células T contra las dianas celulares y las colas de los terminales N y/o C de la cadena beta de FceRI se utilizan para colocar las señales coestimuladoras en posiciones normales de yuxtamembrana.

Por consiguiente, el CAR expresado por la célula T modificada puede ser un receptor de antígeno quimérico multicadena (CAR) particularmente adaptado a la producción y expansión de células T modificadas. Dichos CAR de cadenas múltiples comprenden al menos dos de los siguientes componentes:

a) un polipéptido que comprende el dominio transmembrana de la cadena alfa de FceRI y un dominio de unión al ligando extracelular,

b) un polipéptido que comprende una parte de la cola citoplasmática de los terminales N y C y el dominio transmembrana de la cadena beta de FceRI y/o

c) al menos dos polipéptidos que comprenden cada uno una parte de la cola intracitoplasmática y el dominio transmembrana de la cadena gamma de FceRI, por lo que diferentes polipéptidos se multimerizan juntos espontáneamente para formar CAR dimérico, trimérico o tetramérico.

De acuerdo con tales arquitecturas, los dominios de unión de ligandos y los dominios de señalización nacen en polipéptidos separados. Los diferentes polipéptidos se anclan en la membrana en una estrecha proximidad, lo que permite interacciones entre sí. En tales arquitecturas, los dominios de señalización y coestimuladores pueden estar en posiciones de yuxtamembrana (es decir, adyacentes a la membrana celular en el lado interno de la misma), lo que se considera que permite una función mejorada de los dominios coestimuladores. La arquitectura de múltiples subunidades también ofrece más flexibilidad y posibilidades de diseñar CAR con más control sobre la activación de las células T. Por ejemplo, es posible incluir varios dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares que tienen diferente especificidad para obtener una arquitectura CAR multiespecífica. También es posible controlar la relación relativa entre las diferentes subunidades en el CAR de múltiples cadenas. Este tipo de arquitectura ha sido descrita recientemente por el solicitante en el documento PCT/US2013/058005.

El ensamblaje de las diferentes cadenas como parte de un único CAR multicadena se hace posible, por ejemplo, utilizando las diferentes cadenas alfa, beta y gamma del receptor de alta afinidad para IgE (FceRI) (Metzger, Alcaraz et al., 1986) a las que se fusionan los dominios de señalización y coestimuladores. La cadena gamma comprende una región transmembrana y una cola citoplasmática que contiene un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) (Cambier, 1995).

El CAR de cadenas múltiples puede comprender varios dominios de unión a ligandos extracelulares, para unir simultáneamente diferentes elementos en la diana, aumentando así la activación y función de las células inmunes. En un aspecto, los dominios de unión al ligando extracelular se pueden colocar en tándem en el mismo polipéptido transmembrana y, opcionalmente, se pueden separar mediante un enlazador. En otro aspecto, dichos dominios de unión a ligandos extracelulares diferentes pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR de múltiples cadenas. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una población de CAR de cadenas múltiples que comprenden cada uno de los dominios de unión de ligandos extracelulares diferentes. En particular, la presente divulgación se refiere a un método de modificación de células inmunes que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de dicha célula una población de CAR de cadenas múltiples, cada una de las cuales comprende dominios de unión a ligandos extracelulares diferentes. También se describe en el presente documento un método de modificación de una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula inmunitaria e introducir en dicha célula polinucleótidos que codifican polipéptidos que componen una población de CAR de cadenas múltiples, cada una de las cuales comprende dominios de unión a ligandos extracelulares diferentes. En un aspecto particular, el método de modificación de una célula inmunitaria comprende expresar en la superficie de la célula al menos una parte de la cadena beta y/o gamma de FceRI fusionada a un dominio de transducción de señales y varias partes de las cadenas alfa de FceRI fusionadas a diferentes dominios de unión al ligando extracelular. En un aspecto más particular, dicho método comprende introducir en dicha célula al menos un polinucleótido que codifica una parte de la cadena beta y/o gamma de FceRI fusionada a un dominio transductor de señal y varias cadenas alfa de FceRI fusionadas a diferentes dominios de unión al ligando extracelular. Por población de CAR de múltiples cadenas, se entiende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR de múltiples cadenas, cada una de los cuales comprende diferentes dominios de unión al ligando extracelular. Los diferentes dominios de unión al ligando extracelular de acuerdo con la presente divulgación pueden preferiblemente unirse simultáneamente a diferentes elementos en la diana, aumentando así la activación y función de las células inmunes.

También se describe en el presente documento una célula inmunitaria aislada que comprende una población de CAR de múltiples cadenas, cada una de las cuales comprende diferentes dominios de unión al ligando extracelular.

El dominio de transducción de señales o el dominio de señalización intracelular de CAR de cadenas múltiples es responsable de la señalización intracelular después de la unión del dominio de unión al ligando extracelular a la diana dando como resultado la activación de la célula inmunitaria y la respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transducción de señales es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en la que se expresa el CAR de múltiples cadenas. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citolítica o una actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas.

En la presente solicitud, el término "dominio de transducción de señales" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función de señal efectora y dirige a la célula para que realice una función especializada.

Los ejemplos preferidos de dominio de transducción de señales para su uso en CAR de una o varias cadenas pueden ser las secuencias citoplasmáticas del receptor Fc o del receptor de células T y los correceptores que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento del receptor de antígeno como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señales comprende dos clases distintas de secuencia de señalización citoplasmática, las que inician la activación primaria dependiente del antígeno y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. La secuencia de señalización citoplasmática primaria puede comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina de ITAM. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos que se encuentran en la cola intracitoplasmática de una variedad de receptores que sirven como sitios de unión para tirosina quinasas de clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM pueden incluir como ejemplos no limitantes los derivados de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En un aspecto preferido, el dominio de transducción de señalización del CAR de múltiples cadenas puede comprender el dominio de señalización de CD3zeta, o el dominio intracitoplasmático de las cadenas beta o gamma de FceRI.

En un aspecto particular, el dominio de transducción de señales del CAR de cadenas múltiples comprende una molécula de señal coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta inmune eficaz.

Los dominios de unión al ligando pueden ser cualquier receptor de antígeno previamente usado, y al que se hace referencia, con respecto al CAR monocatenario mencionado en la bibliografía, en particular scFv de anticuerpos monoclonales.

Los CAR biespecíficos o multiespecíficos como se describe en el documento WO 2014/4011988 también entran en el alcance de la presente divulgación.

Activación y expansión de células T

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T, las células T pueden activarse y expandirse generalmente usando métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.352.694; 6,534,055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232,566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20060121005. Las células T se pueden expandir in vitro o in vivo.

Generalmente, las células T obtenidas por el método de la invención se expanden por contacto con una superficie que tiene unido un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3 TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T.

En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse in vitro, tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, Briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, se puede usar un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Como pueden apreciar fácilmente los expertos en la técnica, la relación de partículas a células puede depender del tamaño de partícula en relación con la célula diana. En otros aspectos, las células, tales como las células T, se combinan con perlas recubiertas con agente, las perlas y las células se separan posteriormente y luego se cultivan las células. En un aspecto alternativo, antes del cultivo, las perlas y células recubiertas con agente no se separan sino que se cultivan juntas. Las proteínas de la superficie celular se pueden ligar permitiendo que las perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y anti-CD28 (perlas 3x28) entren en contacto con las células T. En un aspecto, las células (por ejemplo, 4 a 10 células T) y perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T en una proporción de 1: 1) se combinan en un tampón, preferiblemente PBS (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). De nuevo, los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede usar cualquier concentración de células. La mezcla se puede cultivar durante varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 días o cualquier valor entero intermedio por hora. En otro aspecto, la mezcla se puede cultivar durante 21 días. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que pueden contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluido suero (por ejemplo, suero bovino fetal o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, IL-4, 11L-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la materia. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos agregados, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o suplementado con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina o citocinas suficientes para el crecimiento y expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (por ejemplo, aire más 5% de CO2). Las células T que han estado expuestas a distintos tiempos de estimulación pueden presentar diferentes características.

En otro aspecto particular, dichas células se pueden expandir mediante cocultivo con tejido o células. Dichas células también pueden expandirse in vivo, por ejemplo en la sangre del sujeto después de administrar dicha célula al sujeto.

Aplicaciones Terapéuticas

Las células T que pueden obtenerse mediante los diferentes métodos descritos anteriormente están destinadas a usarse como un medicamento para tratar, entre otros, cáncer, infecciones o enfermedades inmunes en un paciente que lo necesite.

Dicho tratamiento puede ser para mejoramiento, curativo o profiláctico. Puede ser parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogo, se entiende que las células, la línea celular o la población de células utilizadas para tratar pacientes se originan en dicho paciente o en un donante compatible con antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénico se entiende que las células o población de células utilizadas para tratar pacientes no se originan en dicho paciente sino en un donante.

La invención es particularmente adecuada para la inmunoterapia alogénica, en la medida en que permite la transformación de células T, típicamente obtenidas de donantes, en células no alorreactivas. Esto puede realizarse bajo protocolos estándar y reproducirse tantas veces como sea necesario. Las células T modificadas resultantes pueden agruparse y administrarse a uno o varios pacientes, estando disponibles como un producto terapéutico "listo para usar". Las células que se pueden usar con los métodos divulgados se describen en la sección anterior.

Dichos tratamientos son principalmente para tratar pacientes diagnosticados con cáncer, infección viral, trastornos autoinmunes o enfermedad de injerto contra huésped (GvHD). Los cánceres son preferiblemente leucemias y linfomas, que tienen tumores líquidos, pero también pueden afectar a tumores sólidos. Los tipos de cánceres a tratar con los CAR descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos y neoplasias, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen los tumores/cánceres de adultos y los tumores/cánceres pediátricos.

Las presentes células T, cuando están armadas con CAR específicos dirigidos contra las propias células inmunes del paciente, permiten la inhibición o regulación de dichas células, que es una etapa clave para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como poliartritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, esclerodermia, fibromialgia, miositis, espondilitis anquilosante, diabetes insulinodependiente de tipo I, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y esclerosis múltiple (MS).

El tratamiento puede tener lugar en combinación con una o más terapias seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

De acuerdo con un aspecto preferido de la divulgación, dicho tratamiento es particularmente adecuado para pacientes que se someten a tratamientos inmunosupresores o quimioterapéuticos. De hecho, la presente divulgación se basa preferiblemente en células o población de células, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para dicho agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería ayudar a la selección y expansión de las células T obtenidas por el método de acuerdo con la invención dentro del paciente.

De acuerdo con un aspecto, dichas células T obtenidas mediante el método de la invención pueden experimentar una expansión robusta de células T in vivo tras la administración a un paciente, y pueden persistir en los fluidos corporales durante un período de tiempo prolongado, preferiblemente durante una semana, más preferiblemente durante 2 semanas, incluso más preferiblemente durante al menos un mes. Aunque se espera que las células T persistan durante estos períodos, se pretende que su vida en el cuerpo del paciente no exceda un año, preferiblemente 6 meses, más preferiblemente 2 meses e incluso más preferiblemente un mes.

La administración de las células o la población de células se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, incluso mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa o intralinfática o intraperitoneal. En un aspecto, las composiciones de células se administran preferiblemente mediante inyección intravenosa.

La administración de las células o población de células puede consistir en la administración de 104 - 109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal incluyendo todos los valores enteros de números de células dentro de esos intervalos. Las células o la población de células se pueden administrar en una o más dosis. En otro aspecto, dicha cantidad eficaz de células se administra como dosis única. En otro aspecto, dicha cantidad eficaz de células se administra como más de una dosis durante un período de tiempo. El momento de la administración está a criterio del médico responsable y depende del estado clínico del paciente. Las células o la población de células se pueden obtener de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades efectivas de un tipo de célula dado para una enfermedad o afecciones particulares está dentro del conocimiento de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

En otro aspecto, dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende esas células se administra por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En ciertos aspectos de la presente divulgación, las células se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen pero no se limitan al tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con nataliziimab para pacientes con MS o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. En aspectos adicionales, las células T obtenidas por el método de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66: 807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. Mm n. 5: 763-773, 93). En un aspecto adicional, las composiciones de células obtenidas por el método de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T usando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otro aspecto, las composiciones celulares se administran después de una terapia ablativa de células B tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en un aspecto, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con alta de dosis de quimioterapia seguida de un trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertos aspectos, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de células inmunes expandidas. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía. Dichas células modificadas obtenidas por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar a pacientes que lo necesiten contra el rechazo del huésped contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD); por lo tanto, en el alcance de la presente divulgación se encuentra un método para tratar a pacientes que lo necesitan contra el rechazo de huésped contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) que comprende tratar a dicho paciente administrando a dicho paciente una cantidad eficaz de células modificadas que comprenden genes TCR alfa y/o TCR beta inactivados.

Otras definiciones

- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica se designan en el presente documento de acuerdo con el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa Gln o residuo de glutamina, R significa Arg o residuo de arginina y D significa Asp o residuo de ácido aspártico.

- La sustitución de aminoácidos significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo, la sustitución de un residuo de arginina por un residuo de glutamina en una secuencia de péptidos es una sustitución de aminoácidos.

- Los nucleótidos se designan de la siguiente manera: se utiliza un código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

- "Como se usa en este documento," ácido nucleico" o "polinucleótidos" se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de las acciones de ligadura, escisión, endonucleasa y exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos naturales (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos naturales (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos naturales), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en las fracciones de azúcar y/o en las fracciones de base de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, la sustitución de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido o azúcares se pueden funcionalizar como éteres o ésteres. Además, toda la fracción de azúcar se puede reemplazar con estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como azúcares aza y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en una fracción de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

- Por "polinucleótido que comprende sucesivamente una primera región de homología con secuencias cadena arriba de dicha ruptura bicatenaria, una secuencia que se insertará en el genoma de dicha célula y una segunda región de homología con secuencias cadena abajo de dicha ruptura bicatenaria" se pretende significar un constructo de ADN o una matriz que comprende una primera y una segunda porción que son homólogas a las regiones 5' y 3' de un ADN diana in situ. El constructo de ADN también comprende una tercera porción colocada entre la primera y la segunda porción que comprende alguna homología con la secuencia de ADN correspondiente in situ o, alternativamente, no comprende homología con las regiones 5' y 3' del ADN diana in situ. Después de la escisión del ADN diana, se estimula un evento de recombinación homóloga entre el genoma que contiene el gen diana comprendido en el locus de interés y esta matriz, en la que la secuencia genómica que contiene el ADN diana se reemplaza por la tercera porción de la matriz y una parte variable de la primera y segunda porciones de dicha matriz.

- por "ADN diana", "secuencia de ADN diana", "secuencia diana de ADN", "secuencia diana de ácido nucleico", "secuencia diana" o "sitio de procesamiento" se entiende una secuencia de polinucleótidos que puede ser dirigida y procesada por una endonucleasa de corte raro de acuerdo con la presente divulgación. Estos términos se refieren a una ubicación específica de ADN, preferiblemente una ubicación genómica en una célula, pero también a una porción de material genético que puede existir independientemente del cuerpo principal de material genético, tal como plásmidos, episomas, virus, transposones o en orgánulos tales como las mitocondrias como ejemplo no limitante. Como ejemplos no limitantes de secuencias diana guiadas por ARN, están aquellas secuencias del genoma que pueden hibridar el ARN guía que dirige la endonucleasa guiada por ARN a un locus deseado.

- Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" se entiende cualquier vector de suministro que pueda usarse en la presente invención para poner en contacto celular (es decir, "contactar") o suministrar dentro de las células o compartimentos subcelulares (es decir, "introducir") agentes/productos químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarias en la presente invención. Incluye, pero no se limita a, vectores de suministro liposomal, vectores de suministro viral, vectores de suministro de fármacos, vehículos químicos, vehículos poliméricos, lipoplexos, poliplexos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonido), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de suministro permiten el suministro de moléculas, sustancias químicas, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores tales como plásmidos o péptidos penetrantes. En estos últimos casos, los vectores de suministro son portadores de moléculas.

- Los términos "vector" o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un "vector" en el presente documento incluye, entre otros, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la influenza), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de cadena doble que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C, virus de tipo B, virus de tipo D de mamífero, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, JM, Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, tercera Edición, Bn Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por "vector lentiviral" se entienden vectores lentivirales basados en VIH que son muy prometedores para el suministro de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficiencia una amplia gama de tipos de células diferentes. Los vectores lentivirales generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envoltura y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Al igual que el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana mediante la interacción de las glicoproteínas de la superficie viral con los receptores de la superficie celular. Al entrar, el ARN viral se somete a una transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa viral. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal de doble cadena, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas. Por "vectores lentivirales integradores (o LV)", se entiende tales vectores como ejemplo no limitante, que son capaces de integrar el genoma de una célula diana. Al contrario, por "vectores lentivirales no integradores (o NILV)" se entiende vectores de suministro de genes eficientes que no integran el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores de suministro y los vectores pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Por célula o células se entiende cualquier célula viva eucariota, célula primaria y línea celular derivada de estos organismos para cultivos in vitro.

- Por "célula primaria" o "células primarias" se entienden las células extraídas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para el crecimiento in vitro, que han experimentado muy pocas duplicaciones de población y, por lo tanto, son más representativas de los principales componentes funcionales y características de tejidos de los que se derivan, en comparación con líneas celulares tumorigénicas continuas o inmortalizadas artificialmente.

Como ejemplos no limitantes, las líneas celulares se pueden seleccionar del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células HUVEC; células Molt 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; Estos modelos también se pueden utilizar para seleccionar moléculas biológicamente activas de interés en la investigación y la producción y en varios campos tales como el químico, los biocombustibles, los compuestos terapéuticos y la agronomía como ejemplos no limitativos.

- Por "mutación" se entiende la sustitución, eliminación, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar la estructura de la secuencia genómica o la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

- Por "variante o variantes", se entiende una variante repetida, una variante, una variante de unión al ADN, una variante de nucleasa TALE, una variante de polipéptido obtenida por mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula original.

- Por "variante funcional" se entiende un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio de proteína; tal mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína original o dominio de proteína o propiedades adicionales, o mayor o menor actividad.

- Por "gen" se entiende la unidad básica de la herencia, que consiste en un segmento de ADN dispuesto de manera lineal a lo largo de un cromosoma, que codifica una proteína o segmento de proteína específico. Un gen incluye típicamente un promotor, una región no traducida 5', una o más secuencias codificantes (exones), opcionalmente intrones, una región no traducida 3'. El gen puede comprender además un terminador, potenciadores y/o silenciadores.

- Como se usa en este documento, el término "locus" es la ubicación física específica de una secuencia de ADN (por ejemplo, de un gen) en un cromosoma. El término "locus" puede referirse a la ubicación física específica de una secuencia diana de endonucleasa de corte raro en un cromosoma. Tal locus puede comprender una secuencia diana que es reconocida y/o escindida por una endonucleasa de corte raro de acuerdo con la divulgación. Se entiende que el locus de interés de la presente divulgación no solo puede calificar una secuencia de ácido nucleico que existe en el cuerpo principal de material genético (es decir, en un cromosoma) de una célula, sino también una porción de material genético que puede existir independientemente para dicho cuerpo principal de material genético tal como plásmidos, episomas, virus, transposones o en orgánulos tales como mitocondrias como ejemplos no limitantes.

- El término "escisión" se refiere al rompimiento de la cadena covalente de un polinucleótido. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Tanto la escisión de cadena sencilla como la escisión de cadena doble son posibles, y la escisión de la cadena doble puede producirse como resultado de dos eventos de escisión de cadena sencilla distintos. La escisión híbrida de ADN, ARN o ADN/ARN de cadena doble puede dar como resultado la producción de extremos romos o escalonados.

- Por "proteína de fusión" se entiende el resultado de un proceso bien conocido en la técnica que consiste en la unión de dos o más genes que originalmente codifican proteínas separadas o parte de ellas, la traducción de dicho "gen de fusión" da como resultado un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales.

- "Identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos es función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Se pueden usar varios algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con, por ejemplo, configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con polipéptidos específicos descritos en este documento y que preferiblemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos.

- "Dominio de transducción de señales" o "ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora análoga en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, media una respuesta de células T, que incluye, pero no se limita a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, entre otros, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también incluye, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, CD27, c D28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

- Una "molécula coestimuladora" se refiere a la pareja de unión análoga en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora de la célula, tal como, pero sin limitarse a, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula del m Hc de clase I, BTLA y el receptor del ligando Toll.

- Una "señal coestimuladora", como se usa en este documento, se refiere a una señal, que en combinación con una señal primaria, tal como la ligadura de TCR/CD3, conduce a la proliferación de células T y/o sobrerregulación o subregulación de moléculas clave.

- "Anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de una única molécula de anticuerpo. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden construir otras moléculas además de la estructura canónica del anticuerpo con dos especificidades de unión. Se apreciará además que la unión de antígenos por anticuerpos biespecíficos puede ser simultánea o secuencial. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante técnicas químicas (véase, por ejemplo, Kranz et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), mediante técnicas de "polidoma" (véase la patente de los Estados Unidos No. 4.474.893) o mediante técnicas de ADN recombinante, todas ellas conocidas. Como ejemplo no limitante, cada dominio de unión comprende al menos una región variable de una cadena pesada de anticuerpo ("región VH o H"), en la que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente al marcador de linfocitos tal como CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente al antígeno tumoral.

- El término "dominio de unión a ligando extracelular" como se usa en este documento se define como un oligopéptido o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión al ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. Por lo tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedades autoinmunes y células cancerosas.

- El término "sujeto" o "paciente", como se usa en este documento, incluye todos los miembros del reino animal, incluidos los primates no humanos y los seres humanos.

- La descripción escrita anteriormente de la invención proporciona una manera y un proceso de hacerla y usarla de tal manera que cualquier persona experta en esta técnica pueda hacerla y usarla, esta habilitación se proporciona en particular para el objeto de las reivindicaciones adjuntas, que forman parte de la descripción original.

Cuando se indica en este documento un límite o intervalo numérico, se incluyen los puntos finales. Además, todos los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.

Habiendo descrito en general esta invención, se puede obtener una comprensión adicional haciendo referencia a ciertos ejemplos específicos, que se proporcionan en este documento con fines ilustrativos únicamente, y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplos

Ejemplo 1: Método general para modificar células alogénicas humanas para inmunoterapia

Para una mejor comprensión de la divulgación, en la Figura 4 se ilustra el método para modificar células alogénicas humanas para inmunoterapia. El método comprende una combinación de uno o varios de las siguientes etapas:

1. Proporcionar células T de un cultivo celular o de una muestra de sangre de un paciente individual o de un banco de sangre y activar dichas células T utilizando perlas activadoras anti-CD3/C28. Las perlas proporcionan las señales primarias y coestimuladoras que se requieren para la activación y expansión de las células T.

2. La transducción de dichas células con CAR de múltiples cadenas permite redirigir las células T contra los antígenos expresados en la superficie de las células diana de diversas neoplasias que incluyen linfomas y tumores sólidos, en particular contra el antígeno CD19. Para mejorar la función del dominio coestimulador, los inventores han diseñado un CAR de múltiples cadenas derivado de FceRi como se describió previamente. La transducción se puede realizar antes 0 después de las inactivaciones de genes utilizando la endonucleasa guiada por ARN.

3. Modificación de células T no alorreactivas y opcionalmente resistentes:

a) Es posible inactivar TCR alfa en dichas células para eliminar el TCR de la superficie de la célula y evitar el reconocimiento del tejido del huésped como extraño por el TCR alogénico y así evitar la GvHD.

b) También es posible inactivar un gen que codifica la diana para un agente inmunosupresor o un fármaco de quimioterapia para hacer que dichas células sean resistentes al tratamiento inmunosupresor o de quimioterapia para prevenir el rechazo del injerto sin afectar a las células T trasplantadas. En este ejemplo, el objetivo de los agentes inmunosupresores es CD52 y el agente inmunosupresor es un anticuerpo anti-CD52 monoclonal humanizado.

Como muestran los inventores a continuación, el uso de endonucleasa guiada por ARN es particularmente ventajoso para lograr inactivaciones de genes dobles en células T simplemente introduciendo dos ARN guía (ARNg) distintos, cada uno dirigido a un gen, tal como los genes TCR alfa y CD52. Esto se puede hacer electroporando células T con ARNm que codifica Cas9 y simultáneamente transcripción de plásmidos de ADN que codifican el ARNg específico. Alternativamente, el ARNg se puede transcribir a partir de secuencias de ADN integradas de manera estable en el genoma usando vectores retrovirales. Los inventores han descubierto que la expresión transitoria de Cas9 a partir de ARNm da como resultado una alta tasa de transformación y es menos dañina para las células T. Luego, las células T inactivadas se clasifican utilizando perlas magnéticas. Por ejemplo, las células T que aún expresan el gen objetivo (por ejemplo, CD52) se pueden eliminar mediante la fijación en una superficie sólida, y las células inactivadas no están expuestas al estrés de pasar a través de una columna. Este método suave aumenta la concentración de células T modificadas adecuadamente.

4. Expansión in vitro de células T modificadas antes de la administración a un paciente o in vivo después de la administración a un paciente mediante la estimulación del complejo CD3. Antes de la etapa de administración, los pacientes pueden someterse a un tratamiento inmunosupresor tal como CAMPATH1-H, un anticuerpo anti-CD52 monoclonal humanizado.

5. Exponer opcionalmente dichas células con anticuerpos biespecíficos ex vivo antes de la administración a un paciente o in vivo después de la administración a un paciente para acercar las células modificadas a un antígeno diana.

Ejemplo 2: Inactivación específica de los genes TCR y CD52 en las células T

1 - Construcción de plásmidos de CAS9 y ARNg

La secuencia que codifica Cas9 de S. pyogenes se sintetizó de nuevo (GeneCust) y estaba flanqueada por 3xNLS y una etiqueta HA en el extremo terminal C (pCLS22972 (SEQ ID NO: 53)). Las secuencias que codifican el ARNg que se dirigen a las respectivas secuencias de 20 pb (5' a 3') en el gen TCRa (SEQ ID NO: 54) y el gen CD52 (SEQ ID NO: 55) se clonaron en el plásmido derivado de pUC57 secuencia abajo de un promotor U6 que conduce respectivamente a los vectores plasmídicos, pCLS24029 (SEQ ID NO: 56) y pCLS24027 (SEQ ID NO:57).

2- Síntesis de ARNm de CAS9

El ARNm que codifica CAS9 se produjo y se poliadeniló usando el kit mMessage mMachine T7 Ultra (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, el ARN se purificó con columnas RNeasy (Qiagen), se eluyó en tampón de electroporación y se cuantificó (espectrofotómetro Nanodrop ND-1000) midiendo la absorbancia a 260 nm. La calidad del ARN se verificó en un gel de agarosa de formaldehído/MOPS desnaturalizante.

3 - Transfecciones

Se transfectaron células de linfocitos T mediante electrotransferencia de ARNm que codifica CAS9 y plásmidos que codifican ARNg usando un sistema AgilePulse MAX (Harvard Apparatus) 4 días después de la activación (Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28, Life Technologies). Brevemente, las células T se activaron previamente varios días (3 5) antes de la transfección con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28 e IL2. Un día antes de la electroporación, se cambió el medio de cultivo y las células se sembraron a razón de 106 células/ml; 24 h más tarde, las células T se lavaron en medio de citoporación T (Harvard Apparatus), las perlas de activación se eliminaron decantando la suspensión de células T de un tubo insertado en un imán EasySep (StemCell Technologies). A continuación, se sedimentaron las células T, se resuspendieron en medio de citoporación T a razón de 25 x 106 células/ml. Se mezclaron 5 x106 células con 10 |jg del ARNm que codifica CAS9 y los plásmidos que codifican el ARNg que se dirige a TCRa o en una cubeta de 0,4 cm. La electroporación consistió en dos pulsos de 0,1 ms a 1200 V seguidos de cuatro pulsos de 0,2 ms a 130 V. Después de la electroporación, las células T se diluyeron en medio de cultivo y se incubaron a 37 °C/CO2 al 5% durante 24 horas antes de otro cambio de medio. Tres días después de la electroporación, las células T se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de IgG de cabra anti-ratón conjugado con PE o APC específico para evaluar la expresión en la superficie celular de TCRa o CD52, respectivamente. La inactivación de los genes TCRa o CD52 se analizó (MACSQuant) mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en las Figuras 5 y 6 , que muestran que los genes TCR y CD52 se han inactivado respectivamente en una proporción significativa de las células analizadas.

Ejemplo 3: Análisis funcional de las células T modificadas electroporadas con un ARNm monocistrónico que codifica un receptor de antígeno quimérico monocatenario (CAR) anti-CD19:

Para verificar que la modificación del genoma no afectó la capacidad de las células T modificadas para presentar actividad antitumoral cuando se les proporcionó un receptor de antígeno quimérico (CAR CD19), las células T previamente dirigidas usando Cas9 y el ARN guía específico dirigidos a TCRa, se transfectaron adicionalmente con 10 jg de ARN que codifica un CAR anti-CD19. Veinticuatro horas después, las células T se incubaron durante 4 horas con células Daudi que expresan CD19. La sobrerregulación de la superficie celular de CD107a, un marcador de liberación de gránulos citotóxicos por linfocitos T (llamado desgranulación) se midió mediante análisis de citometría de flujo (Betts, Brenchley et al., 2003).

Se resuspendieron 5x 106 células T activadas previamente varios días (3-5) con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28 e IL2 en tampón de citoporación T, y se electroporaron en cubetas de 0,4 cm sin ARNm o con 10 jg de ARNm que codifica un CAR de cadena sencilla

Veinticuatro horas después de la electroporación, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de IgG de cabra anti ratón conjugado con PE específico para evaluar la expresión de la superficie celular de CAR en las células vivas. Los datos se muestran en la Figura 20. A indica que la gran mayoría de las células T vivas electroporadas con el ARNm monocitrónico descrito previamente expresan CAR en su superficie. Veinticuatro horas después de la electroporación, las células T se cocultivaron con células Daudi (CD19+) durante 6 horas y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la expresión del marcador de desgranulación CD107a en su superficie (Betts, Brenchley et al., 2003).

Los resultados mostraron que las células negativas para TCRa y las células T positivas para TCRa tenían la misma capacidad para desgranularse en respuesta a PMA/ionomicina (control positivo) o células Daudi CD19+. La sobrerregulación de CD107 depende de la presencia de un CD19+. Estos datos sugieren que modificación del genoma utilizando Cas9 no tuvo un impacto negativo en la capacidad de las células T para montar una respuesta antitumoral controlada.

Lista de referencias citadas en la descripción

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de preparación de células T para inmunoterapia que comprende las etapas de:

- una endonucleasa guiada por ARN; y

- un ARN guía específico que dirige dicha endonucleasa a al menos un locus diana en el genoma de células T, en el que dicha endonucleasa guiada por ARN se fusiona con un NLS, que actúa para conducir la proteína al núcleo a través del complejo nuclear de poros y

en el que dicha endonucleasa guiada por ARN se expresa a partir de ARNm transfectado o se proporciona como un polipéptido producido fuera de la célula, y dicho ARN guía se expresa en las células como un transcripto de un vector de ADN;

(b) expandir las células resultantes in vitro.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha endonucleasa guiada por ARN comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con los dominios RuvC o HNH de Cas9 de S. pyogenes (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2).

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la endonucleasa guiada por ARN es Cas9.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la endonucleasa guiada por ARN se divide en al menos 2 polipéptidos, uno que comprende RuvC y otro que comprende HNH.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la endonucleasa guiada por ARN se expresa en una forma estabilizada o inactiva, que se activa tras la activación por una enzima producida por la célula T o la desestabilización de su estructura polipeptídica dentro de la célula T.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ARN guía se expresa a partir de un ADN plasmídico.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho NLS consiste en una o más secuencias cortas de aminoácidos cargados positivamente tales como lisinas o argininas.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho NLS es PKKKRKV del antígeno T grande de la proteína conocida de SV40.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho NLS es -KR[PAATKKAGQA]KKKK- de nucleoplasmina.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho NLS se selecciona de RIRKKL- de p54, PRRRK de SOX9 y PPRKKRTVV de NS5A.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho vector de ADN es un vector episomal.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho vector de ADN comprende un promotor U6 para una transcripción más eficaz de dicho ARN guía en las células T.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha endonucleasa se transfecta usando vectores liposomales.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que al menos un locus diana codifica un componente del receptor de células T (TCR).

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además la etapa de clasificar las células T transformadas que no expresan TCR en su superficie celular.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho componente del receptor de células T es TCRa.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho ARN guía hibrida específicamente una secuencia diana de TCRa seleccionada de la SEQ ID NO: 6 a la Se Q ID NO: 52 enumeradas en la Tabla 2.

18. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que al menos un locus dirigido por dicha endonucleasa guiada por ARN y el ARN guía codifica una proteína de punto de control inmune seleccionada entre CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASPIO, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1 B2 y GUCY1 B3.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho locus dirigido por dicha endonucleasa guiada por ARN y ARN guía codifica PDCD1 o CTLA-4.

20. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que al menos un locus dirigido por dicha endonucleasa guiada por ARN y a Rn guía es un gen sensibilizador a fármacos o un gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho locus diana es CD52, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT) o un receptor de glucocorticoides (GR).

22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que se induce la recombinación homóloga en dicho locus diana para introducir un ADN exógeno o una mutación en el genoma de la célula T.

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que comprende además introducir en dichas células T un receptor de antígeno quimérico (CAR).

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho CAR está codificado por un polinucleótido recombinante exógeno.

25. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que dichas células T en la etapa a) se derivan de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T colaboradores.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dichas células T en la etapa a) se derivan de linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+.