CN108018314A - 用于细胞重编程的方法和组合物 - Google Patents

用于细胞重编程的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN108018314A
CN108018314A CN201711070319.1A CN201711070319A CN108018314A CN 108018314 A CN108018314 A CN 108018314A CN 201711070319 A CN201711070319 A CN 201711070319A CN 108018314 A CN108018314 A CN 108018314A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
nucleic acid
gene
sequence
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711070319.1A
Other languages
English (en)
Inventor
张康
侯睿
李�根
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beautiful Biotechnology Co Ltd
Youhealth Biotech Ltd
University of California
Original Assignee
Beautiful Biotechnology Co Ltd
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beautiful Biotechnology Co Ltd, University of California filed Critical Beautiful Biotechnology Co Ltd
Publication of CN108018314A publication Critical patent/CN108018314A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本文公开了通过干扰眼部细胞中的基因(诸如编码感光细胞特异性核受体和神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白的基因)表达来治疗色素性视网膜炎、黄斑变性和其他视网膜病况的方法和药物组合物。这些方法和组合物采用基于核酸的疗法。

Description

用于细胞重编程的方法和组合物
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并 且通过引用以其全文并入于此。所述ASCII副本创建于2017年10月 31日，命名为49697-713-SEQ.txt，大小为4.31KB。
发明背景
将核酸递送至患者细胞以治疗病况的基因疗法已经开发并测试了 数十年，取得了不同程度的成功。所治疗的病况通常为终期疾病(例如， 癌症，白血病)和使人极度虚弱的疾病(例如，重症联合免疫缺陷)。
发明内容
本文公开了将来自第一细胞类型的细胞重编程成第二细胞类型的 方法，其包括使所述细胞接触：第一指导RNA，该第一指导RNA与基 因的靶位点杂交，其中所述基因编码有助于所述细胞的细胞类型特异性 功能的蛋白质；和在所述靶位点处切割所述基因的链的Cas核酸酶，其 中切割所述链改变所述基因的表达，使得所述细胞不能再执行所述细胞类型特异性功能，从而将所述细胞重编程成所述第二细胞类型。所述基 因可包含突变。所述第一细胞类型可对所述突变敏感，并且其中所述第 二细胞类型为对所述突变有抗性的细胞类型。所述突变可仅在所述第一 细胞类型中造成不利影响。所述不利影响可选自衰老、凋亡、缺乏分化 和异常细胞增殖。所述基因可编码转录因子。所述第一细胞类型和所述第二细胞类型可以是紧密相关的、终末分化的成熟细胞类型。所述重编 程可在体内发生。所述重编程可在体外或离体发生。所述细胞可为胰腺、 心脏、脑、眼、肠、结肠、肌肉、神经系统、前列腺或乳腺的细胞。所 述细胞可为有丝分裂后的细胞。所述细胞可为眼睛中的细胞。所述细胞 可为视网膜细胞。所述视网膜细胞可为视杆。所述细胞类型特异性功能 可为夜间视觉或颜色视觉。所述基因可选自NRL、NR2E3、GNAT1、 RORβ、OTX2、CRX和THRB。所述基因可选自NRL和NR2E3。所述 第一细胞类型可为视杆，并且所述第二细胞类型可为视锥。所述视锥可 使受试者能够具有明视觉。所述第一细胞类型可为视杆，并且所述第二 细胞类型可为多能细胞。所述第一细胞类型可为视杆，并且所述第二细 胞类型可为多能视网膜祖细胞。所述细胞可为癌细胞。所述功能可选自 异常细胞增殖、转移和肿瘤血管化。所述第一细胞类型可为结肠癌细胞， 并且所述第二细胞类型可为良性肠细胞或良性结肠细胞。所述基因可选 自APC、MYH1、MYH2、MYH3、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、 POLE1、POLD1、NTHL1、BMPR1A、SMAD4、PTEN和STK11。所 述第一细胞类型可为恶性B细胞，并且所述第二细胞类型可为良性巨噬 细胞。所述基因可选自C-MYC、CCND1、BCL2、BCL6、TP53、CDKN2A 和CD19。所述细胞可为神经元。所述细胞可为中间神经元。该中间神 经元可为水平细胞。所述第一细胞类型可产生选自淀粉样蛋白β、tau蛋 白及其组合的至少一种蛋白质，并且所述第二细胞类型可不产生所述蛋 白质，或者相比于所述第一细胞类型可产生较少的所述蛋白质。所述第一细胞类型可为神经元，并且所述第二细胞类型可为神经胶质细胞。所 述基因可选自APP和MAPT。所述第一细胞类型产生α突触核蛋白。所 述第一细胞类型可为神经胶质细胞，并且所述第二细胞类型可为产生多 巴胺的神经元。所述基因可选自SNCA、LRRK2、PARK2、PARK7和 PINK1。所述基因可为α突触核蛋白(SNCA)。所述第二细胞类型可 选自多巴胺能神经元和多巴胺能祖细胞。所述第一细胞类型可为非多巴 胺能神经元或神经胶质细胞。
本文进一步公开了利用重编程的细胞治疗有需要受试者的病况的 方法，其中所述重编程的细胞通过使细胞接触以下各项而产生：第一指 导RNA，该第一指导RNA与基因的靶位点杂交，其中所述基因编码有 助于所述细胞的细胞类型特异性功能的蛋白质；和在所述靶位点处切割 所述基因的链的Cas核酸酶，其中切割所述链改变所述基因的表达，使 得所述细胞不能再执行所述细胞类型特异性功能，从而将所述细胞重编 程成所述第二细胞类型。所述重编程的细胞可以是所述受试者自体的。 所述病况可包括视网膜变性。所述病况可选自黄斑变性、色素性视网膜 炎和青光眼。所述病况可为色素性视网膜炎。所述病况可为癌症。所述 癌症可为结肠癌或乳腺癌。所述病况可为神经退行性病况。所述病况可 选自帕金森病和阿尔茨海默病。
本文公开了治疗病况的方法，其包括向有需要的受试者施用：与 第一类型的细胞中基因的靶位点杂交的第一指导RNA，其中所述基因编 码有助于所述第一类型细胞的第一功能的蛋白质；和在所述靶位点处切 割所述基因的链的Cas核酸酶，其中切割所述链改变所述基因的表达， 使得所述第一类型的细胞从第一类型的细胞转变为第二类型的细胞，其中所造成的所述第二类型细胞的存在或增加改善所述病况。改变所述基 因的表达可包括使所述第一类型的细胞中所述基因的表达减少至少约 90％。改变所述基因的表达可包括编辑所述基因，其中所述编辑导致不 从所述基因产生蛋白质或者从所述基因产生非功能性蛋白质。所述病况 可为眼部病况，并且所述第一类型的细胞可为第一类型的眼细胞且所述 第二类型的细胞为第二类型的眼细胞。所述功能可在所述第一类型的眼 细胞中执行，而不在所述第二类型的眼细胞中执行。所述第二类型的眼 细胞可执行第二功能，其中所述第二功能可能不被所述第一类型的眼细 胞执行。所述第一类型的眼细胞可为视杆，且所述第二类型的眼细胞可 为视锥。所述眼部病况可为视网膜变性、色素性视网膜炎或黄斑变性。 所述基因可选自NR2E3和NRL。所述方法可包括将视杆重编程成视锥， 或将视杆重编程成多能视网膜祖细胞。所述眼部病况可为青光眼，且所 述第二类型的眼细胞可为视网膜神经节细胞。所述第一细胞类型可为米 勒(muller)神经胶质细胞。所述基因可为ATOH7。所述基因可为POU4F 基因(POU4F1、POU4F2或POU4F3)，其编码BRN-3蛋白(分别为 BRN3A、BRN3B、BRN3C)。所述基因可为Islet1，也被称为ISL1。所 述基因可为CDKN2A，其编码p16。所述基因可为Six6。所述方法可包 括施用在递送媒介物中的编码所述Cas核酸酶和所述指导RNA的至少 一种多核苷酸，该递送媒介物选自载体、脂质体和核糖核蛋白。所述方 法可包括使所述细胞与第二指导RNA接触。所述方法可包括施用第二 指导RNA。所述方法可包括在所述基因中引入新的剪接位点。引入所述 新的剪接位点可导致外显子或其部分从所述基因的编码序列中去除。所 述外显子可包含所述基因中的突变。所述突变可仅在所述第一细胞类型中造成不利影响。所述不利影响可选自衰老、凋亡、缺乏分化和异常细 胞增殖。所述基因可编码转录因子。所述第一类型的细胞可对所述突变 敏感，并且所述第二类型的细胞可对所述突变有抗性。所述方法可包括 向所述基因引入新的外显子。所述方法可包括向所述基因引入至少一种 核苷酸。所述方法可包括向所述基因引入新的外显子。
本文进一步公开了一种系统，其包含Cas核酸酶或编码所述Cas 核酸酶的多核苷酸、第一指导RNA和第二指导RNA，其中所述第一指 导RNA靶向在基因的至少第一区5’侧的第一位点的Cas9切割，并且所 述第二指导RNA靶向在所述基因的所述第一区3’侧的第二位点的Cas9 切割，从而切除所述基因的所述区域。所述第一指导RNA可靶向在至 少第一外显子5’侧的第一位点的Cas9切割，并且所述第二指导RNA靶 向在至少所述第一外显子3’侧的第二位点的Cas9切割，从而切除所述 至少第一外显子。所述系统可包含供体多核苷酸，其中所述供体多核苷 酸可被插入在所述第一位点与所述第二位点之间。所述供体多核苷酸可 为供体外显子，该供体外显子包含在该供体外显子的5’端和3’端的剪接 位点。所述供体多核苷酸可包含野生型序列。所述基因可选自NRL和 NR2E3。所述第一指导RNA和/或所述第二指导RNA可使Cas9蛋白靶 向包含SEQ ID NO:1-4中任一个的序列。
本文公开了一种试剂盒，其包含Cas核酸酶或编码所述Cas核酸 酶的多核苷酸、第一指导RNA和第二指导RNA，其中所述第一指导RNA 靶向在基因的至少第一区5’侧的第一位点的Cas9切割，并且所述第二 指导RNA靶向在所述基因的所述第一区3’侧的第二位点的Cas9切割， 从而切除所述基因的所述区域。所述第一指导RNA可靶向在至少第一 外显子5’侧的第一位点的Cas9切割，并且所述第二指导RNA可靶向在 至少所述第一外显子3’侧的第二位点的Cas9切割，从而切除所述至少 第一外显子。所述试剂盒可包含供体多核苷酸，其中所述供体核酸可被 插入在所述第一位点与所述第二位点之间。所述供体多核苷酸可为供体 外显子，该供体外显子包含在该供体外显子的5’端和3’端的剪接位点。 所述供体多核苷酸可包含野生型序列。所述基因可选自NRL和NR2E3。 所述第一指导RNA和/或所述第二指导RNA可使Cas9蛋白靶向包含 SEQ ID NO:1-4中任一个的序列。
本文进一步公开了用于治疗受试者的眼部病况的药物组合物，其 包含：Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的多核苷酸；和与选自NRL基 因和NR2E3基因的基因的一部分互补的至少一种指导RNA。所述多核 苷酸可编码所述Cas蛋白，并且所述至少一种指导RNA存在于至少一 种病毒载体中。所述编码所述Cas蛋白的多核苷酸或所述至少一种指导 RNA存在于脂质体中。所述至少一种指导RNA可使Cas蛋白靶向包含 SEQ ID NO:1-4中任一个的序列。可将所述药物组合物配制为用于通过 滴眼器施用的液体。可将所述药物组合物配制为用于玻璃体内施用的液 体。
本文公开了编辑细胞中的基因的方法，其包括使所述细胞接触： 第一指导RNA，该第一指导RNA与基因的靶位点杂交；在所述靶位点 处切割所述基因的链的Cas核酸酶；以及供体核酸。所述供体核酸可经 由非同源末端连接插入所述基因中。所述细胞可为有丝分裂后的细胞。 所述基因可为Mertk基因。所述细胞可为受试者眼睛的视网膜中的细胞。
本文进一步公开了治疗受试者的视网膜变性的方法，其包括使受 试者的视网膜接触：与基因的靶位点杂交的第一指导RNA；在所述靶位 点处切割所述基因的链的Cas核酸酶；以及供体核酸，其中所述供体核 酸经由非同源末端连接插入所述基因中。所述视网膜变性可为色素性视 网膜炎。所述基因可为Mertk基因。
本文公开了治疗受试者的β地中海贫血的方法，其包括使受试者 的造血干细胞/祖细胞接触：与血红蛋白基因的靶位点杂交的第一指导 RNA；在所述靶位点处切割所述血红蛋白基因的链的Cas核酸酶；以及 供体核酸，其中所述供体核酸经由非同源末端连接插入所述基因中。所 述供体核酸可替换所述血红蛋白基因的包含CD41/42突变的部分。
本文公开了治疗受试者的癌症的方法，其包括使受试者的T细胞 接触：与编码免疫检查点抑制剂的基因的靶位点杂交的第一指导RNA； 和在所述靶位点处切割所述基因的链的Cas核酸酶。所述方法可包括使 所述T细胞与供体核酸接触，其中所述供体核酸经由非同源末端连接插 入所述基因中。所述基因可为编码程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的PDCD1。所述癌症可为转移性癌症。所述癌症可为转移性卵巢癌、转移 性黑素瘤、转移性非小细胞肺癌或转移性肾细胞癌。
本文进一步公开了治疗受试者的癌症的方法，其包括使受试者的 癌细胞接触：与编码免疫检查点抑制剂配体的基因的靶位点杂交的第一 指导RNA；和在所述靶位点处切割所述基因的链的Cas核酸酶。所述基 因可为CD274，也被称为PDCD1LG1，其编码程序性死亡配体1(PD-L1)。 所述基因可为PDCD1LG2或程序性死亡配体2(PD-L2)。所述方法可 包括使肿瘤细胞与供体核酸接触，其中所述供体核酸经由非同源末端连 接插入所述基因中。所述癌症可为转移性癌症。所述癌症可为转移性卵 巢癌、转移性黑素瘤、转移性非小细胞肺癌或转移性肾细胞癌。
附图说明
本公开内容的各个方面在所附的权利要求书中具体阐述。通过 参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细 描述以及附图，将获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，在 这些附图中：
图1A示出了腺伴随病毒(AAV)载体，上面的载体编码用于 靶向NRL基因的两种指导RNA，中间的载体编码用于靶向NR2E3 基因的两种指导RNA，而下面的载体编码Cas9。
图1B显示在T7E1试验中，用两种指导RNA靶向NRL基因(左 起第6泳道)比用单一指导RNA靶向NRL基因(左起第5泳道)更 有效。
图1C显示在T7E1试验中，用两种指导RNA靶向NR2E3基因 (左起第6泳道)比用单一指导RNA靶向NRL基因(左起第5泳道) 更有效。
图2示出了施用和评估用于治疗色素性视网膜炎(RP)的Cas9 和指导RNA的病毒介导递送的代表性示意图。
图3A示出了用产生Cas9和Nrl指导RNA的病毒(上图)与 对照病毒(下图)治疗的小鼠视网膜中细胞核(DAPI)、视锥细胞 (mCAR)和病毒表达(mCherry)的染色。
图3B示出了视锥细胞染色(mCAR)的放大视图(相对于图 3A)。
图3C示出了视锥细胞染色(M-视蛋白)的放大视图(相对于 图3A)。
图3D示出了用产生Cas9和Nr1指导RNA的病毒治疗的小鼠 与用对照病毒治疗的小鼠的视网膜外核层(ONL)下部中mCAR阳 性细胞的定量。
图3E示出了用产生Cas9和Nrl指导RNA的病毒治疗的小鼠 与用对照病毒治疗的小鼠的视网膜中mCAR阳性细胞的定量，对所有 mCAR阳性视锥进行计数，包括先前存在的视锥加上新重编程的视锥。
图4示出了野生型小鼠、用对照病毒治疗的RP小鼠以及用产 生Nrl指导RNA或NR2E3指导RNA之一和Cas 9的病毒治疗的RP 小鼠中外核层(ONL)厚度的定量。
图5A示出了经由视网膜电描记术(ERG)得到的，用Cas9/gRNA 对RP进行治疗的小鼠(上图)相对于用对照病毒治疗的相似小鼠(下 图)的视力改善。
图5B示出了未注射小鼠、注射AAV-gRNA的小鼠和注射 AAV-Cas9加AAV-gRNA的小鼠中明视ERG b波振幅的定量。
图6A示出了对于CD41/42特异性gRNA选择的萤光素酶试验。
图6B示出了Cas9 mRNA和Cas9RNP介导的HBB编辑的比较 (左图)，以及使用Cas9RNP-2对不同ssODN进行的筛选(右图)。
图6C示出了使用ssODN(111/37)对HDR介导的编辑的小液 滴数字PCR分析。
图7A示出了野生型和RCS大鼠中Mertk基因的示意图。五边 形为Cas9/gRNA靶序列。五边形内的黑线为Cas9切割位点。
图7B示出了Mertk基因校正AAV载体的示意图。包括周围内 含子的外显子2被夹在Cas9/gRNA靶序列之间，并通过HITI而整合 在Mertk的内含子1内。AAV与血清型8一起包装。黑色半箭头指示 用于验证正确敲入的PCR引物对。
图7C示出了RCS大鼠中Mertk基因校正的实验设计示意图。 在3周时通过视网膜下注射将AAV-rMertk-HITI或AAV AAV-rMertk-HDR之一和AAV-Cas9局部递送至RCS大鼠，并在7-8 周时进行分析。
图7D示出了通过PCR对注射AAV-Cas9和AAV-rMertk-HITI 的眼中正确的基因敲入进行的验证。
图7E示出了通过RT-PCR得到的注射AAV的眼中的相对Mertk mRNA表达。所有条形图的动物数目：RCS大鼠n＝8，正常大鼠n＝8， AAV-Cas9+AAV-rMertk-HITI治疗组n＝6，AAV-Cas9+AAV-rMertk-HDR治疗组n＝3。
图7F示出了视网膜形态，显示注射AAV的眼中的光感受器救 治。与仅具有极薄外核层(ONL)的未治疗和AAV-HDR治疗的RCS 眼相比，观察到光感受器ONL保留的增加(参见方括号)。比例尺 为20μm。
图7G示出了改善的视杆和视锥混合响应(左图，波形；右图， 量化条形图)，表明在注射AAV-Cas9和AAV-rMertk-HITI的眼中b 波值改善。所有条形图的动物数目：RCS大鼠n＝8，正常大鼠n＝8， AAV-Cas9+AAV-rMertk-HITI治疗组n＝8， AAV-Cas9+AAV-rMertk-HDR治疗组n＝6。
图7H示出了注射AAV-Cas9和AAV-rMertk-HITI的眼中改善 的10Hz闪烁视锥响应。所有条形图的动物数目：RCS大鼠n＝8，正 常大鼠n＝8，AAV-Cas9+AAV-rMertk-HITI治疗组n＝8， AAV-Cas9+AAV-rMertk-HDR治疗组n＝6。*P<0.05，Student t检验。
图8示出了功能性外显子2到Mertk基因的Cas9介导恢复的示 意图。
图9示出了用于分裂(split)Cas9 Nr1基因组编辑的AAV载体构 建的示意图。
图10A列出了用于Nrl敲减和阻抑的靶序列。PAM序列加下划 线表示。
图10B为小鼠胚胎成纤维细胞中Nrl gRNA的T7E1试验。附图 按照出现的顺序分别披露了SEQ ID NO 1-2和18-19。
图11示出了用于分裂KRAB-dCas9 Nr1基因阻抑的AAV构建 的示意图。
图12A-E使用经AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9或AAV-Nr1 gRNA/ 分裂Cas9处理的正常小鼠视网膜中细胞的免疫荧光分析，显示了由 CRISPR/Cas9敲减或阻抑策略介导的野生型小鼠中视杆至视锥的细胞 重编程。视紫红质，绿色；DAPI，蓝色。图12A示出了用于编辑或阻抑野生型小鼠中NRL的实验设计。在P7时对小鼠进行处理并在 P30时进行分析。图12B示出了mCAR+细胞(染为红色)的分析。 图12C示出了M-视蛋白+细胞(染为红色)的分析。图12D示出了总 mCAR+和M-视蛋白+细胞的定量。结果显示为平均值±s.e.m.(*p，0.05， studentt检验)。图12E示出了经处理的野生型视网膜中视杆和视锥 特异性标志物的RT-qPCR分析。来自各组的RNA提取自整个视网膜 组织。结果显示为平均值±s.e.m.(*p，0.05，student t检验)。
图12F-H显示了由使用AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9或AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9的CRISPR/Cas9敲减和阻抑策略介导的NRL-GFP 小鼠中视杆至视锥的细胞重编程。图12F示出了用于编辑或阻抑 NRL-GFP小鼠中NRL的实验设计。在P7时对小鼠进行处理并在P30 时进行分析。图12G示出了来自在P7时处理并在P30时收获的小鼠 的mCAR+细胞的免疫荧光分析。GFP，绿色；mCAR，红色；DAPI， 蓝色。图12H示出了mCAR+细胞的定量。结果显示为平均值±s.e.m. (*p<0.05，student t检验)。
图12I示出了用Nrl gRNA/分裂Cas9处理的野生型视网膜中 mCAR+细胞的解剖学位置。箭头指示位于ONL下部和INL上部的异 位定位的mCAR+细胞。图12J示出了用AAV-Nrl-gRNA/分裂Cas9 或AAV-Nrl-gRNA/分裂KRAB dCas9处理的野生型小鼠中钙结合蛋 白+和mCAR+细胞的免疫荧光分析。钙结合蛋白，绿色；mCAAR，红 色；DAPI，蓝色。箭头指示钙结合蛋白+/mCAR+细胞。
图13A-G显示基于CRISPR/Cas9的敲减或阻抑策略采用 AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9或AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9救治了视网 膜变性小鼠的视网膜功能。图13A示出了用于编辑或表达rd 10小鼠 中NRL的实验设计。在P7时对小鼠进行处理并在P60时进行分析。 视杆变性开始于约P18，接着在几天后出现视锥变性。到P60时未检 测到视杆活性，但检测到最低的视锥活性。图13B示出了注射和未注 射的rd10小鼠中的b波振幅(n＝3，结果显示为平均值±s.e.m.，*p<0.05， 配对student t检验)以及注射和未注射的rd10小鼠的视敏度(n＝3， 结果显示为平均值±s.e.m.，*p<0.05，student t检验)的定量。图13C 示出了代表性的ERG波记录，在注射AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9或 AAV-Nrl gRNA/分裂Cas9的眼中显示出改善的视锥响应。图13D示 出了经处理的视网膜中mCAR+细胞的免疫荧光分析。视紫红质，绿色；mCAR，红色；DAPI，蓝色。图13E示出了经处理的视网膜中 mCAR+细胞(平均值±s.e.m.，*p<0.05，student t检验)和ONL厚度 (平均值±s.e.m.，*p<0.05)的定量。图13F示出了经处理的视网膜 中M-视蛋白+细胞的免疫荧光分析。视紫红质，绿色；M-视蛋白，红 色；DAPI，蓝色。图13G示出了经处理的视网膜中M-视蛋白+细胞 的定量。结果显示为平均值±s.e.m.(*p<0.05，student t检验)。
图14A-C呈现了CRISPR/CAS9敲减和阻抑策略采用AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9或AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9重启了3个月龄视网膜 变性小鼠的视网膜功能。在P90时对小鼠进行处理并在P130时进行 分析。到P90时未在Rd10小鼠中检测到视杆或视锥活性。图14A示 出了用于编辑或阻抑Rd10小鼠中NRL的实验设计。图14B示出了经 处理的视网膜中mCAR+细胞的免疫荧光分析。视紫红质，绿色；mCAR， 红色；DAPI，蓝色。图14C示出了rd10经处理的视网膜中mCAR+细胞(*p<0.05，student t检验)、ONL厚度(*p<0.05)、b波振幅 (n＝3，*p<0.05，配对student t检验)和视敏度(n＝3，*p<0.05，student t检验)的定量。图14D示出了用AAV-Nrl gRNA/分裂Cas9或AAV-Nrl gRNA/分裂Cas9处理的经处理成年视网膜变性小鼠中钙结合蛋白+和 视蛋白+细胞的免疫荧光分析，显示出视网膜变性小鼠中水平细胞至 视锥细胞的重编程。在3个月时对Rd10小鼠进行处理，并在6周后 (P130)收获。钙结合蛋白，红色；视蛋白，红色；DAPI，蓝色。 箭头指示钙结合蛋白+/视蛋白+细胞。
图15A-C呈现CRISP/Cas9敲低和阻抑策略采用AAV-Nr1 gRNA/分裂Cas9或AAV-Nr1gRNA/分裂Cas9重启了3个月龄FvB 视网膜变性小鼠的视网膜功能。在P90时对小鼠进行治疗并在P130 时进行分析。图15A示出了用于编辑或阻抑FvB小鼠中NRL的实验 设计。图15B示出了经处理的视网膜中mCAR+细胞的免疫荧光分析。 视紫红质，绿色；mCAR，红色；DAPI，蓝色。图15C示出了rd10 经处理的视网膜中mCAR+细胞(*p<0.05，student t检验)、ONL厚度(*p<0.05)、b波振幅(n＝3，*p<0.05，配对student t检验)和视 敏度(n＝3，*p<0.05，student t检验)的定量。所有结果都显示为平 均值±s.e.m.。
具体实施方式
基因疗法在治疗许多人类疾病方面显示出巨大前景。然而，当 前技术的一个主要缺点在于其最多只能针对特定的突变或单个基因， 从而使得基因疗法难以应用于广泛的患者群体。类似地，使用内源或 自体干细胞的组织修复和再生代表了再生医学的重要目标。然而，由 于自体细胞携带基因疗法旨在克服的遗传突变，而这种方法受到起始 细胞具有正常的遗传组成和功能这一要求的阻碍，因此在许多情况下 是不可行的。本文提供了采用细胞重编程克服上述挑战的方法，该细 胞重编程将对突变敏感的细胞类型转变成对相同突变具有抗性的功 能相关的细胞类型，从而保留组织和功能。这种方法基于以下前提：1)突变通常仅在特定细胞类型中造成其不利影响；2)转录因子的组 合使得能够决定细胞命运，以及3)存在发育可塑性，这允许密切相 关的、终末分化的成熟细胞类型如胰腺细胞、心脏细胞和神经细胞之 间的体内直接转化。此外，关系较远的细胞也可通过发育相关转录因 子的适当组合而在体内直接转化。
本文提供了利用不依赖同源性的靶向整合(HITI)策略的方法， 其基于规律成簇的间隔短回文重复-Cas9(CRISPR-Cas9)。这些方法 在分裂细胞和未分裂细胞中均提供有效的靶向敲入。这些方法可在体 外和体内进行。这些方法在出生后哺乳动物的有丝分裂后细胞中，例 如在脑中提供中靶(on-target)转基因插入。
色素性视网膜炎RP是最常见的眼部退行性疾病之一，影响全 世界超过一百万名患者。其可由超过200个基因中的许多突变引起。 RP的特征在于原发性视杆光感受器死亡和变性，以及随后的继发性 视锥死亡。视杆决定簇NRL的急性基因敲除将成年视杆重编程成视 锥样细胞，从而使其对RP特异性基因突变对视杆光感受器的影响具 有抗性，并因此防止继发性视锥损失。NRL充当视杆与视锥之间的主 切换基因，并激活关键下游转录因子NR2E3。NRL和NR2E3共同作 用以激活视杆特异性基因转录网络并控制视杆分化和命运。NRL或 NR2E2的功能丧失将视杆重编程成视锥细胞命运。该系统为可开发这 类疗法的概念验证提供了机会，该疗法中细胞从对突变敏感的细胞被 重编程成对该突变具有抗性的细胞。
本文提供了用于治疗病况的方法，其包括使对突变敏感的细胞 类型(例如，功能失调或对具有该细胞的受试者有害)中携带突变的 基因靶向失活。本文提供了这些方法的实例，包括采用体内视杆到视 锥的重编程来治疗RP和其他视网膜病况的方法，该重编程通过使用 腺伴随病毒(AAV)递送CRISPR/Cas9靶向灭活视网膜中的NRL或 NR2E来进行(参见，例如，实施例12)。实例表明，可通过灭活视 杆感光细胞命运，对视杆到视锥的特定细胞命运进行重编程，从而保 留视网膜光感受器并救治视觉功能。这些结果指向一种不依赖基因和 突变的新型治疗方法，并且可对遗传病疗法产生广泛的影响。
治疗平台
本文提供了治疗受试者的遗传病况的方法，其包括向受试者的 第一细胞类型的细胞施用改变该第一细胞中的基因表达的本文公开 的治疗剂，其中该基因编码具有对该第一细胞类型特异的功能的蛋白 质。改变基因表达可导致细胞从第一细胞类型重编程成第二细胞类型。 作为非限制性实例，该遗传病况可为色素性视网膜炎，该基因可选自 NRL和NR2E3，并且该治疗剂可为编码Cas核酸酶和靶向该基因的 指导RNA的病毒。该方法可包括将治疗剂施用于视网膜细胞，如视 杆感光细胞，本文也称为“视杆”。该方法可导致视杆重编程成视锥， 从而救治视网膜变性并恢复视网膜功能。因此，第一细胞类型可以是 视杆，而第二细胞类型是视锥(参见，例如，实施例13)。虽然视杆 到视锥的重编程可导致视杆数目和功能的损失和可能随后发生的夜 盲症，但受试者可能愿意忍受夜盲症。
本文提供了将细胞从第一细胞类型重编程成第二细胞类型的 方法，其包括使该细胞接触：与基因的靶位点杂交的指导RNA，其 中该基因编码有助于该细胞的细胞类型特异性功能的蛋白质；以及在 该靶位点处切割该基因链的Cas核酸酶，其中切割该链改变该基因的 表达，使得该细胞不能再执行该细胞类型特异性功能，从而将该细胞 重编程成第二细胞类型。
如本文所使用的术语“重编程”是指在遗传上改变细胞中的至少 一个基因，以使该细胞从第一细胞类型转变成第二细胞类型。第一细 胞类型可以是第二细胞类型的更加分化的形式，反之亦然。第一细胞 类型可与第二细胞类型在功能上相关。例如，第一细胞类型和第二细 胞类型可提供与视力相关的功能。同样作为非限制性实例，第一细胞 类型和第二细胞类型可提供与脑活动、神经元活动、肌肉活动、免疫 活动、感觉活动、心血管活动、细胞增殖、细胞衰老以及细胞凋亡相 关的功能。在遗传上改变基因可包括将基因沉默，从而抑制由基因编 码的蛋白质的产生。将基因沉默可包括向基因中引入无义突变以产生 非功能性蛋白质。可通过使用基因编辑引入无义突变来产生人工剪接 变体，其中人工剪接变体缺少至少一个外显子或其部分。
如本文所使用的术语“细胞类型特异性功能”是指对细胞类型特 异的功能。在一些情况下，该功能仅对单个细胞类型是特异的。例如， 细胞类型特异性功能可为明视觉，并且单个细胞类型为视锥感光细胞。 在一些情况下，该功能对细胞子集是特异的。例如，细胞类型特异性 功能通常可为视觉，并且细胞子集可为感光细胞，如视杆、视锥和感 光性视网膜神经节细胞。
术语“第一细胞类型”和“第二细胞类型”在本文中仅用于在其被 连续使用的上下文中将一种细胞类型与另一种相区分。本文公开的方 法或组合物不应受到它们在本申请的一部分中相对于本申请另一部 分的顺序的限制。
本文公开的第一细胞类型可对突变敏感。“对突变敏感”意指该 细胞中的基因突变将对该细胞造成功能性影响。本文公开的第二细胞 类型可对突变具有抗性。“对突变具有抗性”意指该细胞中的基因突变 不会对该细胞造成任何功能性影响，或者该细胞中的基因突变将造成 可接受的、对存在该细胞的受试者无害的功能性影响，或造成对存在 该细胞的受试者具有很少后果或没有后果的功能性影响。例如，对突 变具有抗性的细胞类型可以是不表达该基因或表达可忽略量的该基 因的细胞类型。对突变具有抗性的细胞类型可以是表达该基因但该基 因在该细胞类型中的功能作用不受该突变影响的细胞类型。对突变敏 感的细胞类型执行细胞类型特异性功能，其中该细胞类型特异性功能 通过可携带突变的基因的表达而调节或控制。当基因中发生突变时， 细胞类型特异性功能丧失或改变。本文公开的方法包括编辑基因，从 而导致第一细胞类型(对突变敏感)重编程成第二细胞类型(对突变 具有抗性)。
本文提供了治疗视网膜变性的方法。视网膜变性包括许多疾病， 如色素性视网膜炎、黄斑变性和青光眼。该方法可包括将视网膜细胞 从视杆感光细胞类型重编程成视锥感光细胞类型，其包括使视网膜细 胞接触：与本文公开的基因的靶位点杂交的指导RNA，其中该基因 编码有助于该细胞的夜间视觉或颜色视觉功能的蛋白质；以及在该靶 位点处切割该基因链的Cas核酸酶，其中切割该链改变该基因的表达， 使得视网膜细胞不能再执行夜间视觉或颜色视觉功能，从而将视网膜 细胞重编程成视锥感光细胞类型。视锥感光细胞类型可能能够为受试 者提供明视觉。该基因可选自NRL、NR2E3、GNAT1、RORβ、OTX2、 CRX和THRB。该基因可为NRL。该基因可为NR2E3。
本文提供了治疗视网膜变性的方法。视网膜变性包括许多疾病， 如色素性视网膜炎、黄斑变性和青光眼。该方法可包括将视网膜细胞 从第一细胞类型重编程成第二细胞类型。第一细胞类型可为视杆。第 一细胞类型可为除视杆或视锥外的细胞。第一细胞类型可为神经元。 第一细胞类型可为中间神经元。第一细胞类型可为神经元干细胞或神 经元前体细胞(具有分化成神经元细胞的能力的多能或多潜能细胞)。 使用诸如中间神经元或除视杆外的细胞等细胞的优点是，这些方法可 用来为已经完全失去视杆和视锥受体的末期RP患者提供视力。第二 细胞类型可为视锥。第二细胞类型可为中间细胞。该中间细胞可为已 经经历如本文所述的重编程的(例如，用Cas核酸酶和指导RNA或 RNAi处理的)细胞。该中间细胞可为视杆细胞，其中视杆细胞基因 表达已经下调。视杆细胞基因表达的下调可降低视杆特异性突变的影 响。如本文所用的“视杆特异性突变”通常是指影响视杆细胞功能和表 型的基因突变。换言之，视杆细胞可对视杆细胞突变敏感。这类细胞 可提供组织结构支持以维持正常架构和功能。这些细胞还可分泌对于 维持内源视锥细胞生长和存活至关重要的营养因子。
所述方法可包括将视网膜细胞从视杆感光细胞类型重编程成 多能细胞类型，其包括使视网膜细胞接触：与本文公开的基因的靶位 点杂交的指导RNA，其中该基因编码有助于该细胞的夜间视觉或颜 色视觉功能的蛋白质；以及在该靶位点处切割该基因链的Cas核酸酶， 其中切割该链改变该基因的表达，使得视网膜细胞不能再执行夜间视 觉或颜色视觉功能，从而将视网膜细胞重编程成多能细胞类型。该多 能细胞类型可为多能视网膜祖细胞，即这样的细胞：其在放置在视网 膜中和/或经受视网膜的环境刺激时具有发育成视杆或视锥的潜能。该 多能细胞类型可以是介于视锥和视杆中间的细胞类型。介于视锥和视杆中间的细胞类型可为视网膜神经节多能细胞。在正常的视网膜发育 过程中，视网膜神经节多能细胞将会分化成视锥或视杆。该基因可选 自NRL、NR2E3、GNAT1、RORβ、OTX2、CRX和THRB。该基因 可为NRL。该基因可为NR2E3。
本文提供了治疗癌症的方法。作为非限制性实例，癌症可包括 结肠癌、B细胞淋巴瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和乳腺癌。 该方法可包括将癌细胞从恶性细胞类型重编程成良性细胞类型，其包 括使癌细胞接触：与本文公开的基因的靶位点杂交的指导RNA，其 中该基因编码有助于该细胞增殖的蛋白质；以及在该靶位点处切割该 基因链的Cas核酸酶，其中切割该链改变该基因的表达，使得癌细胞 不能再异常增殖，从而将癌细胞重编程成良性细胞类型。作为非限制 性实例，第一细胞类型可为结肠癌细胞，第二细胞类型可为良性肠细 胞或良性结肠细胞，并且该基因可选自APC、MYH1、MYH2、MYH3、 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、POLE1、POLD1、NTHL1、 BMPR1A、SMAD4、PTEN和STK11。另外，作为非限制性实例，第 一细胞类型可为恶性B细胞，第二细胞类型可为良性巨噬细胞，并且 该基因可为PU.1、CD19、CD20、CD34、CD38、CD45或CD78。第 一细胞类型可为恶性B细胞，第二细胞类型可为良性巨噬细胞，并且 该基因可为C-MYC、CCND1、BCL2、BCL6、TP53、CDKN2A、CREBBP 或EP300。第二细胞类型可比第一细胞类型表达更高的CD68、CD11b、 F480、Cd11c或Ly6g的RNA/蛋白质水平。另外，作为非限制性实例， 第一细胞类型可为雌激素受体阳性乳腺癌细胞和/或Her2阳性乳腺癌 细胞，第二细胞类型可为雌激素受体阴性和/或雌激素受体阴性乳腺癌 细胞，并且该基因可选自雌激素受体基因、Her2基因及其组合。
本文公开的治疗癌症的方法可包括修饰该基因，使得癌细胞丧 失转移能力。该方法可包括修饰该基因，使得癌细胞丧失促进肿瘤血 管化的能力。
RNA干扰(RNAi)
本文提供了施用能够经由RNA干扰来抑制细胞中基因表达的 反义寡核苷酸的方法。对基因进行抑制可导致细胞从第一细胞类型转 变为第二细胞类型。第一细胞类型或细胞类型可为本文公开的任何细 胞类型。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸包含修饰，该修饰提供 对天然存在的DNA酶的消化或降解的抗性。在一些实施方案中，该 修饰为在反义寡核苷酸合成期间使用固相亚磷酰胺方法对反义寡核 苷酸的磷酸二酯骨架的修饰。这将会有效地使大多数形式的DNA酶 对该反义寡核苷酸无效。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含在两种方法中最有 效地促进或增强反义寡核苷酸摄取的递送系统。在一些实施方案中， 该递送系统包括易于被人类细胞吸收的脂质体或脂质容器。在一些实 施方案中，该递送系统是由tat蛋白介导的系统，其允许大分子如寡 核苷酸容易地转移通过细胞膜。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸为小发夹RNA(shRNA)。 这些RNA链通过靶向由感兴趣的基因产生的mRNA而使该基因沉默。 在一些实施方案中，该shRNA可经由计算机软件而定制设计，并使 用设计模板在商业上制备。在一些实施方案中，使用细菌质粒、细菌 DNA的环状链或携带病毒载体的病毒来递送shRNA。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸靶向由NR2E3基因编 码的RNA。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向由NRL基因编 码的RNA。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向由编码视蛋白 的基因编码的RNA。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向由视 紫红质基因编码的RNA。
在一些实施方案中，siRNA的长度为约18个核苷酸至约30个 核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为18个核苷酸。在一些 实施方案中，siRNA的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA 的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为21个核 苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为22个核苷酸。在一些实 施方案中，siRNA的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA 的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为25个核 苷酸。
基因编辑
本文提供了对细胞中的基因进行基因编辑的方法，其中基因编 辑导致细胞从第一细胞类型转变为第二细胞类型。作为非限制性实例， 该方法可用于视网膜病况的治疗。本文进一步提供了一种细胞，其中 该细胞中的基因被本文公开的方法修饰。作为非限制性实例，该细胞 为视网膜的细胞，也称为视网膜细胞。在一些实施方案中，本文公开 的方法和细胞利用基因组编辑来修饰细胞中的靶基因，用于视网膜病 况的治疗。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用核酸酶或 核酸酶系统。在一些实施方案中，核酸酶系统包含位点定向核酸酶。 合适的核酸酶包括但不限于CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶， 包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、 III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V 型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌 指核酸酶(ZFN)；转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；大范 围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白； 重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute蛋白；其任何衍生物；其任何变体；以及其任何片段。在一些实施方案中，可对本文公开的位点定 向核酸酶进行修饰，以便产生能够在不进行切割的情况下位点特异性 地结合靶序列的催化失效(catalyticallydead)核酸酶，从而阻断转录并 降低靶基因表达。
在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用核酸指导的核 酸酶系统。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用规律成簇 的间隔短回文重复(CRISPR)、CRISPR相关(Cas)蛋白系统用于 核酸分子的修饰。在一些实施方案中，本文公开的CRISPR/Cas系统包含Cas核酸酶和指导RNA。在一些实施方案中，本文公开的 CRISPR/Cas系统包含Cas核酸酶、指导RNA和修复模板。该指导 RNA将Cas核酸酶引导至靶序列，在此处该Cas核酸酶切割靶序列 或使靶序列产生切口，从而产生切割位点。在一些实施方案中，该 Cas核酸酶产生双链断裂(DSB)，该双链断裂经由非同源末端连接 (NHEJ)而修复。然而，在一些实施方案中，未介导的或非定向NHEJ 介导的DSB修复导致开放阅读框的破坏，从而导致不期望的结果。 为了规避这些问题，在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用待 插入切割位点处的修复模板，从而允许控制最终编辑的基因序列。修 复模板的这种使用可称为同源性指导的修复(HDR)。在一些实施方 案中，本文公开的方法和细胞利用不依赖同源性的靶向整合(HITI)。 HITI可允许在体外进行分裂细胞和未分裂细胞中的有效靶向敲入，更 重要的是，允许在出生后哺乳动物的有丝分裂后细胞中，例如脑中的 体内中靶转基因插入。
在一些实施方案中，所述修复模板包含对应于靶基因的野生型 序列。在一些实施方案中，所述修复模板包含待递送至切割位点的期 望序列。在一些实施方案中，该期望序列不是野生型序列。在一些实 施方案中，除了用来校正或改变靶基因表达/活性的一个或多个经编辑 的核苷酸之外，该期望序列与靶序列相同。例如，与含有单核苷酸多 态性的靶序列相比，该期望序列可包含单核苷酸差异，其中该单核苷 酸差异是对单核苷酸多态性的核苷酸的置换，该置换恢复野生型表达 /活性或相对于靶基因改变表达/活性。
任何合适的CRISPR/Cas系统均可用于本文公开的方法和组合 物。可使用多种命名系统来提及CRISPR/Cas系统。在Makarova, K.S.等人,“An updated evolutionaryclassification of CRISPR-Cas systems,”Nat Rev Microbiol(2015)13:722-736和Shmakov,S.等人, “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2CRISPR-Cas Systems,”Mol Cell(2015)60:1-13中提供了示例性命名 系统。CRISPR/Cas系统可为I型、II型、III型、IV型、V型、VI型 系统或任何其他合适的CRISPR/Cas系统。如本文所使用的 CRISPR/Cas系统可为1类、2类或任何其他适当分类的CRISPR/Cas 系统。1类CRISPR/Cas系统可使用多种Cas蛋白的复合体来实现调 节。1类CRISPR/Cas系统可包括，例如，I型(例如，I、IA、IB、IC、 ID、IE、IF、IU)、III型(例如，III、IIIA、IIIB、IIIC、IIID)和IV型(例如，IV、IVA、IVB)CRISPR/Cas类型。2类CRISPR/Cas系 统可使用单个大Cas蛋白来实现调节。2类CRISPR/Cas系统可包括， 例如，II型(例如，II、IIA、IIB)和V型CRISPR/Cas类型。CRISPR 系统可彼此互补，和/或可借助反式功能单元来促进CRISPR基因座靶 向。
所述Cas蛋白可为I型、II型、III型、IV型、V型或VI型Cas 蛋白。该Cas蛋白可包含一个或多个域。域的非限制性实例包括指导 核酸识别域和/或指导核酸结合域、核酸酶域(例如，DNA酶域或RNA 酶域、RuvC、HNH)、DNA结合域、RNA结合域、解旋酶域、蛋白 质-蛋白质相互作用域和二聚化域。指导核酸识别域和/或指导核酸结 合域可与指导核酸相互作用。核酸酶域可包括用于核酸切割的催化活 性。核酸酶域可缺乏用于防止核酸切割的催化活性。该Cas蛋白可为 与其他蛋白质或多肽融合的嵌合Cas蛋白。该Cas蛋白可为各种Cas 蛋白的嵌合体，例如，包含来自不同Cas蛋白的域。
Cas蛋白的非限制性实例包括c2c1、C2c2、c2c3、Casl、 CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、 Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csnl 或Csxl2)、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、 Cpf1、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE )、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4 、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、 Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966以及它们的同源物或修饰形式。
所述Cas蛋白可来自任何合适的生物体。非限制性实例包括 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属的种(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinae spiralis)、绿色产 色链霉菌(Streptomyces viridochromo genes)、绿色产色链霉菌 (Streptomycesviridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、还 原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌 (Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤蓝细菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、萘 降解极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌属的 种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝丝 菌属的种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊蓝细菌(Microcystisaeruginosa)、 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、聚球蓝细菌属的种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、 Ammonifexdegensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌 (Natranaerobius thermophilus)、喜温发酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、Allochromatium vinosum、海杆菌属的种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌 (Nitrosococcus halophilus)、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、Methanohalobium evestigatum、多变鱼腥蓝细菌(Anabaenavariabilis)、 产泡沫节球蓝细菌(Nodularia spumigena)、念珠蓝细菌属的种(Nostocsp.)、最大节螺蓝细菌(Arthrospira maxima)、盘状节螺蓝细菌 (Arthrospiraplatensis)、节螺蓝细菌属的种(Arthrospira sp.)、鞘 丝蓝细菌属的种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤蓝细菌属的种(Oscillatoria sp.)、Petrotoga mobilis、 非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、深海单细胞蓝藻(Acaryochloris marina)、Leptotrichia shahii和新凶手弗朗西丝氏菌 (Francisellanovicida)。在一些方面，该生物体为酿脓链球菌。在一 些方面，该生物体为金黄色葡萄球菌。在一些方面，该生物体为嗜热 链球菌。
所述Cas蛋白可衍生自多个细菌种，包括但不限于非典型韦 荣氏球菌(Veillonella atypical)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、Solobacterium moorei 、尖锐粪球菌(Coprococcus catus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、Peptoniphilus duerdenii、Catenibacteriummitsuokai、变异 链球菌(Streptococcus mutans)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)、伪中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、肠氨基酸 球菌(Acidaminococcus intestine)、Olsenella uli、北原酒球菌 (Oenococcus kitaharae)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) 、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌( Lactobacillus gasseri)、大芬戈尔德菌、运动支原体(Mycoplasmamobile)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、羊肺炎支原 体(Mycoplasmaovipneumoniae)、犬支原体(Mycoplasma canis)、 关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、直肠假杆菌(Eubacterium rectale)、嗜热链球菌、长真杆菌(Eubacterium dolichum)、棒状乳 杆菌极取亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens)、多养型 泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus )、阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、解纤维热酸菌( Acidothermus cellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum )、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)、Elusimicrobium minutum、Nitratifractor salsuginis、Sphaerochaeta globus、产琥珀酸丝状杆菌产琥珀酸亚种( Fibrobacter succinogenessubsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌( Bacteroides fragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、彩虹 普雷沃菌(Prevotella micans)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、少食氨基单 胞菌(Aminomonas paucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum )、Candidatus Puniceispirillum marinum、Verminephrobacter eiseniae 、Ralstonia syzygii、Dinoroseobacter shibae、固氮螺菌属( Azospirillum)、汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)、慢生根 瘤菌属(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes )、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)、鼬 鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus )、Acidovorax ebreus、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、食 清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、Roseburiaintestinalis、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、多杀巴斯 德氏菌属多杀亚种(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、华德萨 特菌(Sutterellawadsworthensis)、变形菌(proteobacterium)、侵肺 军团菌(Legionella pneumophila)、Parasutterella excrementihominis 、产琥珀酸沃林氏菌和新凶手弗朗西丝氏菌。术语“衍生”在这种情 况下被定义为从细菌种的天然存在的品种进行修饰，以保持细菌种的 天然存在的品种的重要部分或与细菌种的天然存在的品种的显著同 源性。重要部分可为至少10个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸、 至少30个连续核苷酸、至少40个连续核苷酸、至少50个连续核苷 酸、至少60个连续核苷酸、至少70个连续核苷酸、至少80个连续 核苷酸、至少90个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸。显著同源 性可为至少50％的同源性、至少60％的同源性、至少70％的同源性、 至少80％的同源性、至少90％的同源或至少95％的同源性。可在保留 天然存在的品种的活性的同时对衍生的种进行修饰。
在一些实施方案中，本文所述方法和细胞所利用的 CRISPR/Cas系统为II型CRISPR系统。在一些实施方案中，该II型 CRISPR系统包含用于修饰核酸分子的修复模板。该II型CRISPR系 统在细菌酿脓链球菌中已有描述，其中Cas9和两个非编码小RNA (pre-crRNA和tracrRNA(反式激活CRISPR RNA))以序列特异性 方式共同靶向并降解感兴趣的核酸分子(参见Jinek等人,“A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease inAdaptive Bacterial Immunity,”Science 337(6096):816-821(2012年8月，2012 年6月28日电子公开))。在一些实施方案中，连接两个非编码小 RNA以产生被称为指导RNA的单核酸分子。
在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞使用指导核酸。 指导核酸是指可与另一核酸杂交的核酸。该指导核酸可为RNA。该 指导核酸可为DNA。为DNA的指导核酸可比指导RNA更稳定。该 指导核酸可被编程用于以位点特异性方式与核酸序列结合。待靶向的 核酸或靶核酸可包含核苷酸。该指导核酸可包含核苷酸。靶核酸的一 部分可与该指导核酸的一部分互补。该指导核酸可包含一条多核苷酸 链，并且可被称为“单指导核酸”(即“单指导核酸”,single guide nucleic acid)。该指导核酸可包含两条多核苷酸链，并且可被称为“双指导核 酸”(即“双指导核酸”,double guide nucleic acid)。如果没有另外规定， 术语“指导核酸”是包含性的，同时指代单指导核酸和双指导核酸。
所述指导核酸可包含可被称为“指导区段”或“指导序列”的区 段。所述指导核酸可包含可被称为“蛋白质结合区段”或“蛋白质结合 序列”的区段。
所述指导核酸可包含一个或多个修饰(例如，碱基修饰，骨 架修饰)，从而为核酸提供新的或增强的特征(例如，改善的稳定性)。 该指导核酸可包含核酸亲和标签。该指导核酸可包含核苷。该核苷可 以是碱基-糖的组合。该核苷的碱基部分可为杂环碱基。这类杂环碱 基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包含与核 苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于那些包含戊呋喃糖基糖 的核苷，磷酸基团可与糖的2'、3'或5'羟基部分连接。在形成指导核 酸时，磷酸基团可使相邻的核苷彼此共价连接从而形成线性聚合化合 物。继而，该线性聚合物的各个末端可进一步连接从而形成环状化合 物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可具有内部 核苷酸碱基互补性，并因此可以以产生完全或部分双链化合物的方式 折叠。在指导核酸内，磷酸基团通常被认为形成指导核酸的核苷间骨 架。指导核酸的键或骨架可为3'至5'磷酸二酯键。
所述指导核酸可包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰 的骨架可包括保留骨架中的磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子 的那些。
其中含有磷原子的合适的修饰指导核酸骨架可包括，例如， 具有正常3'-5'键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷 酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸甲酯和其他烷基膦酸酯如3'-亚烷基 膦酸酯，5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚磷酸酯、包括3'-氨基氨 基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在内的氨基磷酸酯、磷二酰胺、硫代 氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼 烷磷酸酯、2'-5'连接的类似物，以及极性倒置的那些，其中一个或多 个核苷酸间键为3'至3'、5'至5'或2'至2'键。合适的极性倒置的指导 核酸可在最3'端的核苷酸间键处包含单个3'至3'键(即，其中核碱基 缺失或被羟基基团替代的单个倒置核苷残基)。还可包括各种盐(例 如，氯化钾或氯化钠)形式、混合盐形式和游离酸形式。
所述指导核酸可包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子的核 苷间键，特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(即，亚甲 基(甲基亚氨基)或MMI骨架)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、 -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸 二酯的核苷酸间键以-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-表示)。
所述指导核酸可包含吗啉代骨架结构。例如，所述指导核酸 可包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷二 酰胺或其他非磷酸二酯的核苷间键代替磷酸二酯键。
所述指导核酸可包含由短链烷基或环烷基的核苷间键、混合 杂原子和烷基或环烷基的核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环 的核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些多核苷酸骨架可包括具有吗啉 代键的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物骨架、 亚砜骨架和砜骨架；甲酰乙酰骨架和硫代甲酰乙酰骨架；亚甲基甲酰 乙酰骨架和硫代甲酰乙酰骨架；核糖乙酰骨架；含烯烃的骨架；氨基 磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺 酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的 其他骨架。
所述指导核酸可包含核酸模拟物。术语“模拟物”旨在包括其 中仅呋喃糖环被非呋喃糖基团取代或呋喃糖环和核苷酸间键均被非 呋喃糖基团取代的多核苷酸，仅呋喃糖环的取代也可称为糖替代物。 可保留杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以供与合适的靶核酸杂 交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸 的糖骨架可被含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架代替。核苷 酸可被保留并与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。PNA 化合物中的骨架可包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这 为PNA提供含酰胺的骨架。杂环碱基部分可与骨架的酰胺部分的氮 杂氮原子直接或间接结合。
所述指导核酸可包含连接的吗啉代(morpholino)单元(即吗啉 代核酸)，该单元具有与吗啉代环附接的杂环碱基。连接基团c可连 接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子型吗啉代的寡聚化合 物可与细胞蛋白质具有不受欢迎程度较低的相互作用。基于吗啉代的 多核苷酸可为指导核酸的非离子型模拟物。可使用不同的连接基团接 合吗啉代类别中的多种化合物。另一类多核苷酸模拟物可被称为环己 烯基核酸(CeNA)。常存在于核酸分子中的呋喃糖环可被环己烯环 代替。可使用亚磷酰胺化学法制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体， 并将其用于寡聚化合物合成。CeNA单体并入核酸链中可增加 DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可与核酸互补体形成复 合体，该复合体与天然复合体具有相似的稳定性。进一步的修饰可包 括锁定核酸(LNA)，其中2'羟基基团与糖环的4'碳原子连接，由此 形成2'-C,4'-C-氧基亚甲基键，从而形成双环糖部分。该键可为亚甲基 (-CH2-)，桥接2'氧原子和4'碳原子的基团，其中n为1或2。LNA 和LNA类似物可展示出与互补核酸的非常高的双链体热稳定性 (Tm＝+3至+10℃)、对3'核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性性质。
所述指导核酸可包含一个或多个取代的糖部分。合适的多核 苷酸可包含选自以下的糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、 S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基 和炔基可为取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。 特别合适的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、 O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n 和m为1至约10。糖取代基可选自：C1至C10低级烷基、取代的低 级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、 SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、 NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改 善指导核酸的药代动力学性质的基团，或用于改善指导核酸的药效学 性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。合适的修饰可包括2'- 甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE，即烷氧基烷氧基基团)。另外的合适修饰可包括2'-二甲基 氨基氧基乙氧基(即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE) 和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙 基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其他合适的糖取代基可包括甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(--O CH2CH2CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基 (--O--CH2—CH＝CH2)和氟(F)。2'-糖取代基可在阿拉伯糖(上) 位置或核糖(下)位置。合适的2'-阿拉伯糖修饰为2'-F。还可在寡聚 化合物上的其他位置，特别是3'末端核苷上或2'-5'连接的核苷酸中的 糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置处进行类似的修饰。寡聚化合 物还可具有替代戊呋喃糖基糖的糖模拟物，如环丁基部分。
所述指导核酸还可包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或 置换。如本文所使用的“未修饰的”或“天然”核碱基可包括嘌呤碱基(例 如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))和嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶(C)和尿嘧啶U))。修饰的核碱基可包括其他合成的和天 然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、 次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生 物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫 代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-氟尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基 (-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶，以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、 6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿 嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺 嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧 啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺 嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤 以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可包括三环嘧啶， 如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-封条(G-clamp) 如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4) 苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡 啶并吲哚胞苷(H吡啶并(3',2':4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。
杂环碱基部分可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环代替的 那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。核 碱基可用于增加多核苷酸化合物的结合亲和力。这些核碱基可包括5- 取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2- 氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶 置换可使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且可以是合适的碱基置 换(例如，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时)。
指导核酸的修饰可包括将指导核酸与可增强指导核酸的活性、 细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接。这些部分 或缀合物可包括与官能团如伯羟基基团或仲羟基基团共价结合的缀 合物基团。缀合物基团可包括但不限于嵌入剂、报告分子、多胺、聚 酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团，以及可增 强寡聚物的药代动力学性质的基团。缀合物基团可包括但不限于胆固 醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、 罗丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强 对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。可增强药 代动力学性质的基团包括改善核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。 缀合物部分可包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分、胆酸硫醚(例 如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂肪链(例如，十二烷二 醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2- 二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸三乙铵)、多胺或聚乙二醇链， 或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
修饰可包括“蛋白质转导域”或PTD(即细胞穿透肽(CPP))。 PTD可指促进穿过脂双层、微团、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、 多核苷酸、碳水化合物或者有机或无机化合物。PTD可与范围可从小 极性分子到大型大分子和/或纳米颗粒的另一分子相附接，并且可促进 分子穿过膜，例如，从细胞外空间去往细胞内空间，或从细胞质去往 细胞器内。PTD可与多肽的氨基末端共价连接。PTD可与多肽的羧基 末端共价连接。PTD可与核酸共价连接。示例性PTD可包括但不限 于最小肽蛋白质转导域；包含足以直接进入细胞的许多精氨酸(例如， 3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列；VP22 域；果蝇(Drosophila)触角足蛋白转导域；截短的人降钙素肽；聚 赖氨酸；和转运蛋白；从3个精氨酸残基到50个精氨酸残基的精氨 酸均聚物。PTD可以是可激活的CPP(ACPP)。ACPP可包括经由 可切割接头与匹配的聚阴离子(例如，Glu9或“E9”)连接的聚阳离子 CPP(例如，Arg9或“R9”)，其可使净电荷降低至接近零，从而抑制 向细胞中的黏附和摄取。在接头切割时，聚阴离子可被释放，局部地 暴露聚精氨酸及其固有的黏着性，从而“激活”ACPP以穿过膜。
本公开内容提供了指导核酸，其可将相关多肽(例如，位点定 向多肽)的活性引导至靶核酸内的特异性靶序列。该指导核酸可包含 核苷酸。该指导核酸可为RNA。该指导核酸可为DNA。该指导核酸 可包括单指导核酸。该指导核酸可包含间隔区延伸和/或tracrRNA延伸。该间隔区延伸和/或tracrRNA延伸可包含向指导核酸贡献附加功 能(例如，稳定性)的元件。在一些实施方案中，该间隔区延伸和 tracrRNA延伸是可选的。该指导核酸可包含间隔区序列。该间隔区序 列可包含与靶核酸序列杂交的序列。该间隔区序列可为指导核酸的可 变部分。该间隔区序列的序列可被工程化以与靶核酸序列杂交。 CRISPR重复(即，在本示例性实施方案中指最小CRISPR重复)可 包含可与tracrRNA序列(即，在本示例性实施方案中指最小tracrRNA 序列)杂交的核苷酸。最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列可相 互作用，相互作用分子包含碱基配对的双链结构。最小CRISPR重复 和最小tracrRNA序列可一同促进与位点定向多肽结合。最小CRISPR 重复和最小tracrRNA序列可通过单指导连接体连接在一起，从而形 成发夹结构。3’tracrRNA序列可包括前间区序列邻近基序的识别序列。 3’tracrRNA序列可与tracrRNA序列的一部分相同或相似。在一些实 施方案中，3’tracrRNA序列可包含一个或多个发夹。
在一些实施方案中，该指导核酸可包括单指导核酸。该指导核 酸可包含间隔区序列。该间隔区序列可包含可与靶核酸序列杂交的序 列。该间隔区序列可为指导核酸的可变部分。该间隔区序列可在第一 双链体的5’侧。第一双链体可包含最小CRISPR重复与最小tracrRNA 序列之间的杂交区域。第一个双链体可被凸起(bulge)中断。该凸起 可包含未配对的核苷酸。该凸起可促进向指导核酸募集位点定向多肽。 该凸起之后可以是第一茎。第一茎可包含连接最小CRISPR重复和最 小tracrRNA序列的接头序列。第一双链体3'端的最后的配对核苷酸 可与第二接头序列连接。第二接头可包含P。第二接头可将第一双链 体与中间tracrRNA连接。在一些实施方案中，中间tracrRNA可包含 一个或多个发夹区。例如，中间tracrRNA可包含第二茎和第三茎。
在一些实施方案中，所述指导核酸可包括双指导核酸结构。与 单指导核酸结构类似，双指导核酸结构可包含间隔区延伸、间隔区、 最小CRISPR重复、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和tracrRNA 延伸。然而，双指导核酸可以不包含单指导连接体。作为替代，最小 CRISPR重复可包含可与CRISPR重复的一部分相似或相同的3' CRISPR重复序列。类似地，最小tracrRNA序列可包含可与tracrRNA 的一部分相似或相同的5'tracrRNA序列。双指导RNA可经由最小 CRISPR重复和最小tracrRNA序列杂交在一起。
在一些实施方案中，第一区段(即，指导区段)可包含间隔区 延伸和间隔区。指导核酸可经由上述指导区段将结合的多肽引导至靶 核酸内的特定核苷酸序列。
在一些实施方案中，第二区段(即，蛋白质结合区段)可包含 最小CRISPR重复、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和/或 tracrRNA延伸序列。指导核酸的蛋白质结合区段可与位点定向多肽 相互作用。指导核酸的蛋白质结合区段可包含可彼此杂交的两段核苷酸。蛋白质结合区段的核苷酸可杂交形成双链的核酸双链体。该双链 核酸双链体可为RNA。该双链核酸双链体可为DNA。
在一些情况下，指导核酸可以以5'至3'的顺序包含间隔区延伸、 间隔区、最小CRISPR重复、单指导连接体、最小tracrRNA、3'tracrRNA 序列和tracrRNA延伸。在一些情况下，指导核酸可以以任何顺序包 含tracrRNA延伸、3'tracrRNA序列、最小tracrRNA、单指导连接子、 最小CRISPR重复序列、间隔区和间隔区延伸。
指导核酸和位点定向多肽可形成复合体。指导核酸可通过包含 可与靶核酸序列杂交的核苷酸序列而提供对复合体的靶特异性。换言 之，可借助位点定向多肽与指导核酸的至少蛋白质结合区段的缔合将 位点定向多肽引导至核酸序列。指导核酸可针对Cas9蛋白的活性。 指导核酸可针对酶促灭活的Cas9蛋白的活性。
本公开内容的方法可提供遗传修饰的细胞。遗传修饰的细胞可 包含外源指导核酸和/或包含编码指导核酸的核苷酸序列的外源核酸。
间隔区延伸序列
间隔区延伸序列可提供稳定性和/或提供用于修饰指导核酸的 位置。间隔区延伸序列可具有约1个核苷酸至约400个核苷酸的长度。 间隔区延伸序列可具有多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、 260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、 5000、6000或7000个或更多个核苷酸的长度。间隔区延伸序列可具 有少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、 320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、 7000个或更多个核苷酸的长度。间隔区延伸序列的长度可少于10个 核苷酸。间隔区延伸序列的长度可为10至30个核苷酸。间隔区延伸 序列的长度可为30-70个核苷酸。
间隔区延伸序列可包含部分(例如，稳定性控制序列、内切核 糖核酸酶结合序列、核酶)。该部分可影响靶向核酸的RNA的稳定 性。该部分可为转录终止子区段(即，转录终止序列)。指导核酸的 部分可具有约10个核苷酸至约100个核苷酸、约10个核苷酸(nt) 至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、 约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt 至约90nt或约90nt至约100nt、约15个核苷酸(nt)至约80nt、 约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt 至约25nt的总长度。该部分可以是可在真核细胞中起作用的部分。 在一些情况下，该部分可以是可在原核细胞中起作用的部分。该部分 可以是可在真核细胞和原核细胞中均起作用的部分。
合适部分的非限制性实例可包括：5'帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽 (m7G))、核糖开关序列(例如，允许通过蛋白质和蛋白质复合体 调节稳定性和/或可及性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、 使RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序 列、提供追踪的修饰或序列(例如，与荧光分子直接缀合，与有利于 荧光检测的部分、允许荧光检测的序列等缀合)，为蛋白质(例如， 作用于DNA的蛋白质，包括转录激活物、转录阻抑物、DNA甲基转 移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)提 供结合位点的修饰或序列、提供增加的、降低的和/或可控的稳定性的 修饰或序列，或它们的任何组合。间隔区延伸序列可包含引物结合位 点、分子索引(例如，条形码序列)。间隔区延伸序列可包含核酸亲 和标签。
间隔区
指导核酸的指导区段可包含可与靶核酸中的序列杂交的核苷酸 序列(例如，间隔区)。指导核酸的间隔区可经由杂交(即，碱基配 对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，间隔区的核苷酸序 列可以变化并且可决定靶核酸内指导核酸与靶核酸相互作用的位置。
间隔区序列可与位于间隔区邻近基序(PAM)的5'侧的靶核 酸杂交。不同的生物体可包含不同的PAM序列。例如，在酿脓链球 菌中，PAM可以是包含序列5’-XRR-3’的靶核酸中的序列，其中R可 为A或G，其中X为任意核苷酸，并且X紧邻被间隔区序列所靶向 的靶核酸序列的3’侧。
靶核酸序列可为20个核苷酸。靶核酸可少于20个核苷酸。 靶核酸可为至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可为至多5、10、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可 为紧邻PAM第一个核苷酸的5'侧的20个碱基。例如，在包含 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNXRR-3’的序列中，靶核酸可以是 对应于N的序列，其中N为任意核苷酸。
可与靶核酸杂交的间隔区的指导序列可具有至少约6nt的长 度。例如，可与靶核酸杂交的间隔区序列可具有至少约6nt、至少约 10nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少 约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt、约6nt至约80nt、约6nt至约50nt、约6nt至约45nt、约6nt至约40nt、约6nt至约 35nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6 nt至约19nt、约10nt至约50nt、约10nt至约45nt、约10nt至约 40nt、约10nt至约35nt、约10nt至约30nt、约10nt至约25nt、 约10nt至约20nt、约10nt至约19nt、约19nt至约25nt、约19nt 至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、 约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt 至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、 约20nt至约50nt，或约20nt至约60nt的长度。在一些情况下，可 与靶核酸杂交的间隔区序列的长度可为20个核苷酸。可与靶核酸杂 交的间隔区的长度可为19个核苷酸。
间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比可为至少约30％、 至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、 至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、 至少约97％、至少约98％、至少约99％，或100％。间隔区序列与靶 核酸之间的互补性百分比可为至多约30％、至多约40％、至多约50％、 至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、 至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、 至多约99％，或100％。在一些情况下，对于靶核酸互补链的靶序列最5'侧的六个连续核苷酸，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比 可为100％。在一些情况下，对于约20个连续核苷酸，间隔区序列与 靶核酸之间的互补性百分比可为至少60％。在一些情况下，对于靶核 酸互补链的靶序列最5'侧的十四个连续核苷酸，间隔区序列与靶核酸 之间的互补性百分比可为100％，而对于剩余序列则低至0％。在这样 的情况下，间隔区序列可被视为长度为14个核苷酸。在一些情况下， 对于靶核酸互补链的靶序列最5'侧的六个连续核苷酸，间隔区序列与 靶核酸之间的互补性百分比可为100％，而对于剩余序列则低至0％。 在这样的情况下，间隔区序列可被视为长度为6个核苷酸。靶核酸可与crRNA的种子区超过约50％、60％、70％、80％、90％或100％互补。 靶核酸可与crRNA的种子区少于约50％、60％、70％、80％、90％或 100％互补。
指导核酸的间隔区区段可被修饰(例如，通过遗传工程)成 与靶核酸内的任何期望序列杂交。例如，间隔区可被工程化(例如， 设计，编程)，以与参与癌症、细胞生长、DNA复制、DNA修复、 HLA基因、细胞表面蛋白、T细胞受体、免疫球蛋白超家族基因、肿 瘤抑制基因、microRNA基因、长非编码RNA基因、转录因子、球蛋 白、病毒蛋白、线粒体基因等的靶核酸中的序列杂交。
可使用计算机程序(例如，机器可读代码)鉴别间隔区序列。 计算机程序可使用变量，如预测的解链温度、二级结构形成和预测的 退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％GC、基因 组发生的频率、甲基化状态、SNP的存在等。
最小CRISPR重复序列
最小CRISPR重复序列可以是与参考CRISPR重复序列(例 如，来自酿脓链球菌的crRNA)具有至少约30％、40％、50％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或 序列同源性的序列。最小CRISPR重复序列可以是与参考CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的crRNA)具有至多约30％、40％、 50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列 同一性和/或序列同源性的序列。最小CRISPR重复可包含可与最小 tracrRNA序列杂交的核苷酸。最小CRISPR重复和最小tracrRNA序 列可形成碱基配对的双链结构。最小CRISPR重复和最小tracrRNA 序列可一同促进与位点定向多肽结合。最小CRISPR重复序列的一部 分可与最小tracrRNA序列杂交。最小CRISPR重复序列的一部分可 与最小tracrRNA序列至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％或100％互补。最小CRISPR重复序列 的一部分可与最小tracrRNA序列至多约30％、40％、50％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补。
最小CRISPR重复序列可具有约6个核苷酸至约100个核苷 酸的长度。例如，最小CRISPR重复序列可具有约6个核苷酸(nt) 至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、 约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约 30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约 15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt 至约40nt、约15nt至约30nt，或约15nt至约25nt的长度。在一些 实施方案中，最小CRISPR重复序列具有约12个核苷酸的长度。
对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小CRISPR重复 序列可与参考最小CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的野生 型crRNA)至少约60％相同。对于一段至少6、7或8个连续的核苷 酸，最小CRISPR重复序列可与参考最小CRISPR重复序列(例如， 来自酿脓链球菌的野生型crRNA)至少约60％相同。例如，对于一段 至少6、7或8个连续的核苷酸，最小CRISPR重复序列可与参考最 小CRISPR重复序列至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％ 相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约 95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。
最小tracrRNA序列
最小tracrRNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来 自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至少约30％、40％、50％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一 性和/或序列同源性的序列。最小tracrRNA序列可以是与参考 tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至 多约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％ 、95％或100％序列同一性和/或序列同源性的序列。最小tracrRNA序 列可包含可与最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA 序列和最小CRISPR重复序列可形成碱基配对的双链结构。最小 tracrRNA序列和最小CRISPR重复可一同促进与位点定向多肽结合。 最小tracrRNA序列的一部分可与最小CRISPR重复序列杂交。最小 tracrRNA序列的一部分可与最小CRISPR重复序列30％、40％、50％ 、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补。
最小tracrRNA序列可具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的 长度。例如，最小tracrRNA序列可具有约6个核苷酸(nt)至约50nt、 约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约 20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt 至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、 约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt 至约30nt，或约15nt至约25nt的长度。在一些实施方案中，最小 tracrRNA序列具有约14个核苷酸的长度。
对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小tracrRNA序 列可与参考最小tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA) 序列至少约60％相同。对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最 小tracrRNA序列可与参考最小tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的 野生型tracrRNA)序列至少约60％相同。例如，对于一段至少6、7 或8个连续的核苷酸，最小tracrRNA序列可与参考最小tracrRNA序 列至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％ 相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约 98％相同、至少约99％相同或100％相同。
最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可包含双螺 旋。双链体第一链的第一个碱基可为鸟嘌呤。双链体第一链的第一个 碱基可为腺嘌呤。最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体 可包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。 最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可包含至多约1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
所述双链体可包含错配。所述双链体可包含至少约1、2、3、4 或5个错配。所述双链体可包含至多约1、2、3、4或5个错配。在 一些情况下，所述双链体包含不多于2个错配。
凸起
凸起可指由最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列组成的双 链体内核苷酸的未配对区。凸起在与位点定向多肽的结合中可能是重 要的。凸起可包含在双链体一侧上未配对的5’-XXXY-3’，和双链体 另一侧上未配对的核苷酸区域，其中X为任意的嘌呤，并且Y可以是可与相对链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
例如，凸起可包含在凸起的最小CRISPR重复链上的未配对 嘌呤(例如，腺嘌呤)。在一些实施方案中，凸起可包含在凸起的最 小tracrRNA序列链的未配对5’-AAGY-3’，其中Y可以是可与最小 CRISPR重复链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
双链体第一侧(例如，最小CRISPR重复侧)上的凸起可包 含至少1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。双链体第一侧 (例如，最小CRISPR重复侧)上的凸起可包含至多1、2、3、4或5 个或更多个未配对的核苷酸。双链体第一侧(例如，最小CRISPR重 复侧)上的凸起可包含1个未配对的核苷酸。
双链体第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的 凸起可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配 对的核苷酸。双链体第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧) 上的凸起可包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个 未配对的核苷酸。双链体第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序 列侧)上的凸起可包含4个未配对的核苷酸。
双链体每条链上具有不同数目的未配对核苷酸的区域可配对 在一起。例如，凸起可包含来自第一条链的5个未配对核苷酸和来自 第二条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的4个未配 对核苷酸和来自第二条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一 条链的3个未配对核苷酸和来自第二条链的1个未配对核苷酸。凸起 可包含来自第一条链的2个未配对核苷酸和来自第二条链的1个未配 对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二 条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核 苷酸和来自第二条链的2个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链 的1个未配对核苷酸和来自第二条链的3个未配对核苷酸。凸起可包 含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二条链的4个未配对核 苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二条链 的5个未配对核苷酸。
在一些情况下，凸起可包含至少一个摆动配对。在一些情况 下，凸起可包含至多一个摆动配对。凸起序列可包含至少1个嘌呤核 苷酸。凸起序列可包含至少3个嘌呤核苷酸。凸起序列可包含至少5 个嘌呤核苷酸。凸起序列可包含至少1个鸟嘌呤核苷酸。凸起序列可 包含至少1个腺嘌呤核苷酸。
P-域(P-DOMAIN)
P域可指可识别靶核酸中前间区序列邻近基序(PAM)的指 导核酸的区域。P域可与靶核酸中的PAM杂交。因此，P域可包含与 PAM互补的序列。P域可位于最小tracrRNA序列的3'侧。P域可位 于3’tracrRNA序列(即，中间tracrRNA序列)内。
P域起始于最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列的双链体 中最后配对的核苷酸3'侧的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15或20个或更多个核苷酸处。P域可起始于最小CRISPR重复和最 小tracrRNA序列的双链体中最后配对的核苷酸3'侧的至多约1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸处。
P域可包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或 20个或更多个连续的核苷酸。P域可包含至多约1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15或20个或更多个连续的核苷酸。
在一些情况下，P域可包含CC二核苷酸(即，两个连续的胞 嘧啶核苷酸)。该CC二核苷酸可与PAM的GG二核苷酸相互作用， 其中PAM包含5’-XGG-3’序列。
P域可以是位于3’tracrRNA序列(即，中间tracrRNA序列) 中的核苷酸序列。P域可包含杂交在一起的双链体核苷酸(例如，发 夹中的核苷酸)。例如，P域可包含与3’tracrRNA序列(即，中间 tracrRNA序列)的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。 P域的活性(例如，指导核酸靶向靶核酸的能力)可通过P-域的杂交 状态来调节。例如，如果P域是杂交的，则指导核酸不能识别其靶标。 例如，如果P域未杂交，则指导核酸可识别其靶标。
P域可与位点定向多肽内的P域相互作用区域相互作用。P域 可与位点定向多肽中富含精氨酸的碱性补丁(patch)相互作用。P域 相互作用区域可与PAM序列相互作用。P域可包含茎环。P域可包含 凸起。
3’tracrRNA序列
3’tracr RNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来自酿 脓链球菌的tracrRNA)具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或序列同 源性的序列。3’tracr RNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如， 来自酿脓链球菌的tracrRNA)具有至多约30％、40％、50％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或 序列同源性的序列。
3’tracrRNA序列可具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的长 度。例如，3’tracrRNA序列可具有约6个核苷酸(nt)至约50nt、 约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约 20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt 至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、 约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt 至约30nt，或约15nt至约25nt的长度。在一些实施方案中，3’ tracrRNA序列具有约14个核苷酸的长度。
对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，3’tracrRNA序列可 与参考3’tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型3’tracrRNA 序列)至少约60％相同。例如，对于一段至少6、7或8个连续的核 苷酸，3’tracrRNA序列可与参考3’tracrRNA序列(例如，来自酿脓 链球菌的野生型3’tracrRNA序列)至少约60％相同、至少约65％相 同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约 85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至 少约99％相同或100％相同。
3’tracrRNA序列可包含多于一个双链体区域(例如，发夹、 杂交区域)。3’tracrRNA序列可包含两个双链体区域。
3’tracrRNA序列也可被称为中间tracrRNA。中间tracrRNA 序列可包含茎环结构。换言之，中间tracrRNA序列可包含不同于第 二茎或第三茎的发夹。中间tracrRNA(即，3’tracrRNA)中的茎环结 构可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多 个核苷酸。中间tracrRNA(即，3’tracrRNA)中的茎环结构可包含至 多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。茎环结构 可包含功能部分。例如，茎环结构可包含适体、核酶、蛋白质相互作用的发夹、CRISPR阵列、内含子和外显子。茎环结构可包含至少约 1、2、3、4或5个或更多个功能部分。茎环结构可包含至多约1、2、 3、4或5个或更多个功能部分。
中间tracrRNA序列中的发夹可包含P域。P域可包含发夹中的 双链区域。
tracrRNA延伸序列
tracrRNA延伸序列可提供稳定性并且/或者为指导核酸的修饰提 供位置。tracrRNA延伸序列可具有约1个核苷酸至约400个核苷酸的长 度。tracrRNA延伸序列可具有多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、 260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸的长度。 tracrRNA延伸序列可具有约20至约5000个或更多个核苷酸的长度。 tracrRNA延伸序列可具有多于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序 列可具有少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、 320、340、360、380、400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可具有 少于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列的长度可小于10个核苷 酸。tracrRNA延伸序列的长度可为10-30个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可为30-70个核苷酸。
tracrRNA延伸序列可包含部分(例如，稳定性控制序列、核酶、 内切核糖核酸酶结合序列)。部分可影响靶向RNA的核酸的稳定性。 部分可为转录终止子区段(即，转录终止序列)。指导核酸的部分可具 有约10个核苷酸至约100个核苷酸、约10个核苷酸(nt)至约20nt、 约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至 约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、 或约90nt至约100nt、约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约 50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的总 长度。该部分可以是可在真核细胞中起作用的部分。在一些情况下，该 部分可以是可在原核细胞中起作用的部分。该部分可以是可在真核细胞 和原核细胞中均起作用的部分。
合适的tracrRNA延伸部分的非限制性实例包括：3'多腺苷酸化的 尾部、核糖开关序列(例如，允许通过蛋白质和蛋白质复合体调节稳定 性和/或可及性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶 向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供追踪 的修饰或序列(例如，与荧光分子直接缀合、与有利于荧光检测的部分、 允许荧光检测的序列等缀合)、为蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白 质，包括转录激活物、转录阻抑物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、 组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)提供结合位点的修饰或序列、 提供提高的、降低的和/或可控的稳定性的修饰或序列，或它们的任意组 合。tracrRNA延伸序列可包含引物结合位点、分子索引(例如，条形码 序列)。在本公开内容的一些实施方案中，tracrRNA延伸序列可包含一 个或多个亲和标签。
单指导核酸
所述指导核酸可为单指导核酸。该单指导核酸可为RNA。单指导 核酸可包含最小CRISPR重复序列与最小tracrRNA序列之间的可被称为 单指导连接体序列的接头。
单指导核酸的单指导连接体可具有约3个核苷酸至约100个核苷 酸的长度。例如，接头可具有约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3nt至 约80nt、约3nt至约70nt、约3nt至约60nt、约3nt至约50nt、约3nt 至约40nt、约3nt至约30nt、约3nt至约20nt或约3nt至约10nt的 长度。例如，接头可具有约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt 至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、 约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至 约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或 约90nt至约100nt的长度。在一些实施方案中，单指导核酸的接头为4 至40个核苷酸。该接头可具有至少约100、500、1000、1500、2000、 2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个 或更多核苷酸的长度。该接头可具有至多约100、500、1000、1500、2000、 2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个 或更多核苷酸的长度。
接头序列可包含功能部分。例如，接头序列可包含适体、核酶、 蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子和外显子。接头序列可包 含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。接头序列可包含至多约 1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
在一些实施方案中，单指导连接体可将最小CRISPR重复的3'端 与最小tracrRNA序列的5'端连接。或者，单指导连接体可将tracrRNA 序列的3'端与最小CRISPR重复的5'端连接。也就是说，单指导核酸可 包含与3'蛋白质结合区段连接的5'DNA结合区段。单指导核酸可包含 与3'DNA结合区段连接的5'蛋白质结合区段。
所述指导核酸可包含长度为10-5000个核苷酸的间隔区延伸序列； 长度为12-30个核苷酸的间隔区序列，其中该间隔区与靶核酸至少50％ 互补；最小CRISPR重复，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌) 或噬菌体的crRNA在6、7或8个连续核苷酸上至少60％的同一性，并 且其中最小CRISPR重复具有5-30个核苷酸的长度；最小tracrRNA序 列，其包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的tracrRNA在6、7或8 个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列具有 5-30个核苷酸的长度；接头序列，其连接最小CRISPR重复和最小 tracrRNA，并包含3-5000个核苷酸的长度；3'tracrRNA，其包含与来自 原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6、7或8个连 续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中3'tracrRNA包含10-20个核苷 酸的长度，并包含双链体区；和/或包含10-5000个核苷酸的长度的 tracrRNA延伸，或它们的任意组合。该指导核酸可被称为单指导核酸。
所述指导核酸可包含长度为10-5000个核苷酸的间隔区延伸序列； 长度为12-30个核苷酸的间隔区序列，其中该间隔区与靶核酸至少50％ 互补；双链体，其包含1)最小CRISPR重复，其包含与来自原核生物 (例如，酿脓链球菌)或噬菌体的crRNA在6个连续核苷酸上至少60％ 的同一性，并且其中最小CRISPR重复具有5-30个核苷酸的长度，2) 最小tracrRNA序列，其包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的tracrRNA 在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列 具有5-30个核苷酸的长度，以及3)凸起，其中该凸起包含双链体的最 小CRISPR重复链上的至少3个未配对核苷酸和双链体的最小tracrRNA 序列链上的至少1个未配对核苷酸；接头序列，其连接最小CRISPR重 复和最小tracrRNA，并包含3-5000个核苷酸的长度；3'tracrRNA，其包 含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6个连 续核苷酸上至少60％的同一性，其中3'tracrRNA包含10-20个核苷酸的 长度，并包含双链体区；P域，其从包含最小CRISPR重复和最小tracrRNA 的双链体下游的1-5个核苷酸开始、包含1-10个核苷酸、包含可与靶核 酸中的前间区序列邻近基序杂交的序列、可形成发夹，且位于3'tracrRNA 区；和/或包含10-5000个核苷酸的长度的tracrRNA延伸，或它们的任 意组合。
双指导核酸
所述指导核酸可为双指导核酸。该双指导核酸可为RNA。该双指 导核酸可包含两个单独的核酸分子(即，多核苷酸)。双指导核酸的两 个核酸分子中的每一个均可包含可彼此杂交的一段核苷酸，使得两个核 酸分子的互补核苷酸杂交而形成蛋白质结合区段的双链双链体。如果未 另行说明，则术语“指导核酸”可以是包括性的，指单分子指导核酸和双分子指导核酸二者。
所述双指导核酸可包含1)第一核酸分子，其包含长度为10-5000 个核苷酸的间隔区延伸序列；长度为12-30个核苷酸的间隔区序列，其 中该间隔区与靶核酸至少50％互补；以及最小CRISPR重复，其包含与 来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的crRNA在6个连续核苷 酸上至少60％的同一性，并且其中最小CRISPR重复具有5-30个核苷酸 的长度；以及2)双指导核酸的第二核酸分子可包含最小tracrRNA序列， 其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6 个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列具有 5-30个核苷酸的长度；3'tracrRNA，其包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中 3'tracrRNA包含10-20个核苷酸的长度，并包含双链体区；和/或包含 10-5000个核苷酸的长度的tracrRNA延伸，或它们的任意组合。
在一些情况下，所述双指导核酸可包含1)第一核酸分子，其包 含长度为10-5000个核苷酸的间隔区延伸序列；长度为12-30个核苷酸 的间隔区序列，其中该间隔区与靶核酸至少50％互补；最小CRISPR重 复，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的crRNA在 6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小CRISPR重复具有 5-30个核苷酸的长度和凸起的至少3个未配对核苷酸；以及2)双指导 核酸的第二核酸分子可包含最小tracrRNA序列，该最小tracrRNA序列 包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6 个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列具有 5-30个核苷酸的长度和凸起的至少1个未配对核苷酸，其中该凸起的1 个未配对核苷酸位于与最小CRISPR重复的3个未配对核苷酸相同的凸 起中；3'tracrRNA，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬 菌体的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中3' tracrRNA包含10-20个核苷酸的长度，并包含双链体区；P域，其从包 含最小CRISPR重复和最小tracrRNA的双链体下游的1-5个核苷酸开始、 包含1-10个核苷酸、包含可与靶核酸中的前间区序列邻近基序杂交的序 列、可形成发夹，并位于3'tracrRNA区；和/或包含10-5000个核苷酸的 长度的tracrRNA延伸，或它们的任意组合。
指导核酸和位点定向多肽的复合体
所述指导核酸可与位点定向多肽(例如，核酸指导的核酸酶，Cas9) 相互作用，从而形成复合体。指导核酸可将位点定向多肽引导至靶核酸。
在一些实施方案中，可将指导核酸工程化，使得复合体(例如， 包含位点定向多肽和指导核酸)可在位点定向多肽的切割位点之外结合。 在这种情况下，靶核酸可不与该复合体相互作用，并且靶核酸可被切除 (例如，摆脱复合体)。
在一些实施方案中，可将指导核酸工程化，使得复合体可在位点 定向多肽的切割位点之内结合。在这种情况下，靶核酸可与该复合体相 互作用，并且靶核酸可被结合(例如，与复合体结合)。
本公开内容的任何指导核酸、本公开内容的位点定向多肽、效应 蛋白质、多重基因靶向剂、供体多核苷酸、串联融合蛋白、报道基因元 件、感兴趣的遗传元件、分裂系统(split system)的组分和/或实施本公 开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子可以是重组、 纯化和/或分离的。
在一些实施方案中，所述方法包括使用CRISPR/Cas系统改变核 酸分子中的突变。在一些实施方案中，该突变为置换、插入或缺失。在 一些实施方案中，该突变为单核苷酸多态性。
在一些情况下，靶序列的长度为10-30个核苷酸。在一些情况下， 靶序列的长度为15-30个核苷酸。在一些情况下，靶序列的长度为约11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，靶序列的长度为约15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。
在一些情况下，CRISPR/Cas系统采用Cas9酶或其变体。在一些 实施方案中，本文公开的方法和细胞采用编码Cas9酶或其变体的多核苷 酸。在一些实施方案中，该Cas9为具有两个活性切割位点的双链核酸酶， 该双螺旋的每条链均有一个活性切割位点。在一些情况下，该Cas9酶或 其变体产生双链断裂。在一些实施方案中，该Cas9酶为野生型Cas9酶。在一些实施方案中，该Cas9酶为野生型Cas9酶或酿脓链球菌Cas9酶的 天然存在的变体或突变体。该变体可以是与野生型Cas9酶部分同源的酶， 同时保持Cas9核酸酶活性。该变体可以是仅包含野生型Cas9酶的一部 分的酶，同时保持Cas9核酸酶活性。在一些实施方案中，该野生型Cas9 酶为酿脓链球菌Cas9酶。在一些实施方案中，该野生型Cas9酶由GenBank ID AKP81606.1给出的氨基酸序列表示。在一些实施方案中， 该变体与GenBankID AKP81606.1给出的氨基酸序列至少约95％同源。 在一些实施方案中，该变体与GenBankID AKP81606.1给出的氨基酸序 列至少约90％同源。在一些实施方案中，该变体与GenBankID AKP81606.1给出的氨基酸序列至少约80％同源。在一些实施方案中， 该变体与GenBankID AKP81606.1给出的氨基酸序列至少约70％同源。 在一些情况下，该Cas9酶是为了在本文所述细胞中的最佳表达和/或活 性而从野生型Cas9酶修饰的优化Cas9酶。在一些实施方案中，该Cas9 酶为经修饰的Cas9酶，其中经修饰的Cas9酶包含如本文所述的Cas9 酶或其变体和附加的氨基酸序列。作为非限制性实例，附加的氨基酸序 列可向Cas9酶或其变体提供附加的活性、稳定性或鉴别标签/条形码。
天然存在的酿脓链球菌Cas9酶切割DNA以产生双链断裂。在一 些实施方案中，本文公开的Cas9酶起Cas9切口酶的作用，其中Cas9 缺口酶是经修饰以使靶序列产生切口，从而产生单链断裂的Cas9酶。在 一些实施方案中，本文公开的方法包括将Cas9切口酶与靶向靶序列的超 过一种指导RNA一起使用，以在靶序列处以交错模式切割每条DNA链。 在一些实施方案中，将Cas9切口酶与两种指导RNA一起使用可提高本 文公开的CRISPR/Cas系统的靶标特异性。在一些实施方案中，使用两 个或更多个指导RNA可导致产生基因组缺失。在一些实施方案中，该 基因组缺失为约5个核苷酸至约50,000个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，该基因组缺失为约5个核苷酸至约1,000个核苷酸的缺失。在一 些实施方案中，本文公开的方法包括使用多种指导RNA。在一些实施方 案中，所述多种指导RNA靶向单个基因。在一些实施方案中，所述多 种指导RNA靶向多个基因。
在一些情况下，所述指导RNA对靶序列的特异性为约80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一些情况下，所述指导 RNA具有小于约20％、15％、10％、5％、3％、1％或更低的脱靶结合率。
在一些实施方案中，与靶序列杂交的指导RNA与靶序列具有约 95％、98％、99％、99.5％或100％的序列互补性。在一些情况下，该杂 交为高度严格杂交条件下的杂交。
在一些实施方案中，所述指导RNA使核酸酶靶向编码神经视网膜 亮氨酸拉链(NRL)蛋白的基因。在一些实施方案中，所述指导RNA 包含与NRL编码基因的靶序列杂交的序列。在一些实施方案中，该靶序 列选自SEQ ID NO:1-2。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ ID NO: 1-2的序列至少90％同源。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ IDNO:1-2的序列至少约80％同源。在一些实施方案中，该靶序列与选自 SEQ ID NO:1-2的序列至少约85％同源。在一些实施方案中，该靶序列 与选自SEQ ID NO:1-2的序列至少约90％同源。在一些实施方案中，该 靶序列与选自SEQ ID NO:1-2的序列至少约95％同源。
在一些实施方案中，所述指导RNA使核酸酶靶向编码核受体亚家 族2组E成员3(NR2E3)蛋白的基因。在一些实施方案中，所述指导 RNA包含与NR2E3编码基因的靶序列杂交的序列。在一些实施方案中， 该靶序列选自SEQ ID NO:3-4。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ ID NO:3-4的序列至少90％同源。在一些实施方案中，该靶序列与选自 SEQID NO:3-4的序列至少约80％同源。在一些实施方案中，该靶序列 与选自SEQ ID NO:3-4的序列至少约85％同源。在一些实施方案中，该 靶序列与选自SEQ ID NO:3-4的序列至少约90％同源。在一些实施方案 中，该靶序列与选自SEQ ID NO:3-4的序列至少约95％同源。
DNA指导的核酸酶
在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用核酸指导的核酸 酶系统。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞使用DNA指导的 核酸酶系统。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞使用Argonaute 系统。
Argonaute蛋白可为可与靶核酸结合的多肽。Argonaute蛋白可为 核酸酶。Argonaute蛋白可为真核、原核或古菌的Argonaute蛋白。 Argonaute蛋白可为原核Argonaute蛋白(pArgonaute)。pArgonaute可 来源于古菌。pArgonaute可来源于细菌。该细菌可选自嗜热细菌和嗜温 细菌。该细菌或古菌可选自风产液菌(Aquifex aeolicus)、铜绿微囊蓝 细菌(Microsystis aeruginosa)、Clostridium bartlettii、微小杆菌属(Exiguobacterium)、好热黄无氧芽孢菌(Anoxybacillus flavithermus)、 伯林盐几何菌(Halogeometricum borinquense)、嗜冷嗜盐菌(Halorubrum lacusprofundi)、Aromatoleum aromaticum、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、细长聚球蓝细菌 (Synechococcus elongatus)和嗜热细长聚球蓝细菌(Thermosynechococcus elogatus)，或它们的任意组合。该细菌可为嗜 热细菌。该细菌可为风产液菌。该嗜热细菌可为嗜热栖热菌(T. thermophilus)(TtArgonaute)。Argonaute可来自聚球蓝细菌属。Argonaute 可来自细长聚球蓝细菌。pArgonaute可为野生型pArgonaute的变异 pArgonaute。
在一些实施方案中，本公开内容的Argonaute为I型原核Argonaute (pAgo)。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute携带DNA核酸靶 向核酸。在一些实施方案中，该DNA核酸靶向核酸靶向双链DNA (dsDNA)的一条链以产生dsDNA的切口或断裂。在一些实施方案中， 切口或断裂触发宿主DNA修复。在一些实施方案中，宿主DNA修复为 非同源末端连接(NHEJ)或同源定向重组(HDR)。在一些实施方案 中，该dsDNA选自基因组、染色体和质粒。在一些实施方案中，该I 型原核Argonaute为长的I型原核Argonaute。在一些实施方案中，该长 的I型原核Argonaute具有N-PAZ-MID-PIWI域架构。在一些实施方案 中，该长的I型原核Argonaute具有催化活性的PIWI域。在一些实施方 案中，该长的I型原核Argonaute具有由天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天 冬氨酸/组氨酸(DEDX)编码的催化四联体。在一些实施方案中，该催 化四联体结合一个或多个Mg+离子。在一些实施方案中，该催化四联体 不结合Mg+离子。在一些实施方案中，该催化四联体结合一个或多个 Mn+离子。在一些实施方案中，催化活性的PIWI域在中等温度下具有 最佳活性。在一些实施方案中，该中等温度为约25℃至约45℃。在一些 实施方案中，该中等温度为约37℃。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute锚定DNA指导的5'磷酸端。在一些实施方案中，所述DNA 指导在其5'端具有脱氧胞嘧啶。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute 为嗜热栖热菌Ago(TtAgo)。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute 为细长聚球蓝细菌Ago(SeAgo)。
在一些实施方案中，该原核Argonaute为II型pAgo。在一些实施 方案中，该II型原核Argonaute携带RNA核酸靶向核酸。在一些实施方 案中，该RNA核酸靶向核酸靶向双链DNA(dsDNA)的一条链以产生 dsDNA的切口或断裂。在一些实施方案中，切口或断裂触发宿主DNA 修复。在一些实施方案中，宿主DNA修复为非同源末端连接(NHEJ) 或同源定向重组(HDR)。在一些实施方案中，该dsDNA选自基因组、 染色体和质粒。在一些实施方案中，该II型原核Argonaute选自长的II 型原核Argonaute和短的II型原核Argonaute。在一些实施方案中，该长 的II型原核Argonaute具有N-PAZ-MID-PIWI域架构。在一些实施方案 中，该长的II型原核Argonaute不具有N-PAZ-MID-PIWI域架构。在一 些实施方案中，该短的II型原核Argonaute具有MID和PIWI域，但不 具有PAZ域。在一些实施方案中，该短的II型pAgo具有PAZ域的类 似物。在一些实施方案中，该II型pAgo不具有催化活性的PIWI域。 在一些实施方案中，该II型pAgo缺乏由天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天 冬氨酸/组氨酸(DEDX)编码的催化四联体。在一些实施方案中，编码 II型原核Argonaute的基因与编码核酸酶、解旋酶或其组合的一个或多 个基因簇集。该核酸酶或解旋酶可以是天然的、设计的或可为其结构域。 在一些实施方案中，该核酸酶选自Sir2、RE1和TIR。在一些实施方案 中，该II型pAgo锚定RNA指导的5'磷酸端。在一些实施方案中，该 RNA指导在其5'端具有尿嘧啶。在一些实施方案中，该II型原核 Argonaute为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)Argonaute(RsAgo)。
在一些实施方案中，一对pAgo可携带RNA核酸靶向核酸和/或 DNA核酸靶向核酸。I型pAgo可携带RNA核酸靶向核酸，其各自能够 靶向双链DNA的一条链，以在双链DNA中产生双链断裂。在一些实施 方案中，一对pAgo包含两个I型pAgo。在一些实施方案中，一对pAgo包含两个II型pAgo。在一些实施方案中，一对pAgo包含I型pAgo和 II型pAgo。
Argonaute蛋白可通过指导核酸而靶向至靶核酸序列。
所述指导核酸可以是单链或双链的。所述指导核酸可为DNA、 RNA或DNA/RNA杂合体。所述指导核酸可包含化学修饰的核苷酸。
所述指导核酸可与靶多核苷酸的有义链或反义链杂交。
所述指导核酸可具有5’修饰。5'修饰可为磷酸化、甲基化、羟甲 基化、乙酰化、泛素化或苏素化(sumolyation)。该5'修饰可为磷酸化。
所述指导核酸的长度可为10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 个核苷酸或碱基对。在一些实例中，所述指导核酸的长度可小于10个核 苷酸或碱基对。在一些实例中，所述指导核酸的长度可大于50个核苷酸 或碱基对。
所述指导核酸可为指导DNA(gDNA)。该gDNA可具有5'磷酸 化末端。该gDNA可以是单链或双链的。该gDNA的长度可为10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或碱基对。在一些实例中，该 gDNA的长度可小于10个核苷酸。在一些实例中，该gDNA的长度可 大于50个核苷酸。
多重化
本文公开了用于进行多重基因组工程化的方法、组合物、系统和/ 或试剂盒。在本公开内容的一些实施方案中，位点定向多肽可包含指导 核酸，从而形成复合体。该复合体可与靶核酸接触。靶核酸可被该复合 体切割和/或修饰。本公开内容的方法、组合物、系统和/或试剂盒可用 于快速、有效和/或同时地修饰多个靶核酸。该方法可使用如本文所述的任何位点定向多肽(例如，Cas9)、指导核酸以及位点定向多肽与指导 核酸的复合体来进行。
本公开内容的位点定向核酸酶可以以任何组合进行组合。例如， 可使用多种CRISPR/Cas核酸酶来靶向不同靶序列或相同靶标的不同区 段。在另一个实例中，Cas9和Argonaute可组合用于靶向不同靶标或相 同靶标的不同部分。在一些实施方案中，位点定向核酸酶可与多种不同 的指导核酸一起使用，以同时靶向多种不同序列。
核酸(例如，指导核酸)可与非天然序列(例如部分、内切核糖 核酸酶结合序列、核酶)融合，从而形成核酸模块。该核酸模块(例如， 包含与非天然序列融合的核酸)可串联缀合，从而形成多重基因靶向剂 (例如，多模块，如阵列)。该多重基因靶向剂可包含RNA。该多重基 因靶向剂可与一种或多种内切核糖核酸酶接触。该内切核糖核酸酶可与 非天然序列结合。结合的内切核糖核酸酶可在由非天然序列限定的指定 位置处切割多重基因靶向剂的核酸模块。该切割可加工(例如，释放) 各个核酸模块。在一些实施方案中，经加工的核酸模块可包含全部、一 些非天然序列或不包含非天然序列。经加工的核酸模块可被位点定向多 肽结合，从而形成复合体。该复合体可靶向至靶核酸。靶核酸可被该复 合体切割和/或修饰。
多重基因靶向剂可用于同时和/或以化学计量的量修饰多个靶核 酸。多重基因靶向剂可以是串联的如本文所述的任意核酸靶向核酸。多 重基因靶向剂可指包含一个或多个核酸模块的连续核酸分子。核酸模块 可包含核酸和非天然序列(例如，部分、内切核糖核酸酶结合序列、核 酶)。该核酸可为非编码RNA，如微小RNA(miRNA)、短干扰RNA (siRNA)、长非编码RNA(lncRNA或lincRNA)、内源siRNA (endo-siRNA)，piwi相互作用RNA(piRNA)、反式作用短干扰RNA (tasiRNA)、重复相关的小干扰RNA(rasiRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、 小核RNA(snRNA)、转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)或 它们的任意组合。该核酸可为编码RNA(例如，mRNA)。该核酸可为 任何类型的RNA。在一些实施方案中，该核酸可为核酸靶向核酸。
非天然序列可位于核酸模块的3'端。非天然序列可位于核酸模块 的5'端。非天然序列可位于核酸模块的3'端和5'端。非天然序列可包含 可与内切核糖核酸酶结合的序列(例如，内切核糖核酸酶结合序列)。 非天然序列可以是被内切核糖核酸酶序列特异性地识别的序列(例如， RNA酶T1切割未配对的G碱基，RNA酶T2切割As的3'端，RNA酶 U2切割未配对A碱基的3'端)。非天然序列可以是在结构上被内切核 糖核酸酶识别的序列(例如，发夹结构、单链-双链接合处，例如，Drosha 识别发夹内的单链-双链接合处)。非天然序列可包含可与CRISPR系统 内切核糖核酸酶结合的序列(例如，Csy4、Cas5和/或Cas6蛋白)。
在非天然序列包含内切核糖核酸酶结合序列的一些实施方案中， 核酸模块可被相同的内切核糖核酸酶结合。核酸模块可不包含相同的内 切核糖核酸酶结合序列。核酸模块可包含不同的内切核糖核酸酶结合序 列。不同的内切核糖核酸酶结合序列可被相同的内切核糖核酸酶结合。 在一些实施方案中，核酸模块可被不同的内切核糖核酸酶结合。
所述部分可包含核酶。核酶可切割自身，从而释放多重基因靶向 剂的每个模块。合适的核酶可包括肽基转移酶23S rRNA、RNA酶P、I 组内含子、II组内含子、GIR1分支核酶、Leadzyme、发夹核酶、锤头 状核酶、HDV核酶、CPEB3核酶、VS核酶、glmS核酶、CoTC核酶、 合成核酶。
多重基因靶向剂的核酸模块的核酸可以是相同的。核酸模块可相 差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、 50个或更多个核苷酸。例如，不同核酸模块可在核酸模块的间隔区区域 中有所不同，从而使核酸模块靶向不同靶核酸。在一些情况下，不同核酸模块可在核酸模块的间隔区区域中有所不同，但仍靶向相同靶核酸。 核酸模块可靶向相同的靶核酸。核酸模块可靶向一种或多种靶核酸。
核酸模块可包含调节序列，该调节序列可允许核酸模块的适当翻 译或扩增。例如，核酸模块可包含启动子、TATA盒、增强子元件、转 录终止元件、核糖体结合位点、3'未翻译区、5'未翻译区、5'帽子序列、 3'聚腺苷酸化序列、RNA稳定性元件等。
编码设计的指导核酸和/或核酸指导的核酸酶的核酸
本公开内容提供了一种核酸，其包含编码本公开内容的指导核酸、 本公开内容的核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基 因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的 组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白 质分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本公开内容的指导核酸、 本公开内容的核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基 因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的 组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白 质分子的核酸可为载体(例如，重组表达载体)。
在一些实施方案中，所述重组表达载体可为病毒构建体(例如， 重组腺伴随病毒构建体)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重 组逆转录病毒构建体等。
合适的表达载体可包括但不限于病毒载体(例如，基于痘苗病毒、 脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺伴随病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫 缺陷病毒的病毒载体)、逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏 死病毒以及来源于逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类 白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿 瘤病毒的载体)、植物载体(例如，T-DNA载体)等。例如，对于真核 宿主细胞，可提供下列载体：pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。可使用其他载体，只要它们与宿主细胞相容。
在一些情况下，所述载体可为线性化载体。该线性化载体可包含 核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)和/或指导核酸。该线性化载体可以 不是环状质粒。该线性化载体可包含双链断裂。该线性化载体可包含编 码荧光蛋白(例如，橙色荧光蛋白(OFP))的序列。该线性化载体可 包含编码抗原(例如，CD4)的序列。该线性化载体可在编码所设计的 核酸靶向核酸部分的载体区域中被线性化(例如，切割)。例如，该线 性化载体可在所设计的核酸靶向核酸的5'区中被线性化(例如，切割)。 该线性化载体可在所设计的核酸靶向核酸的3'区中被线性化(例如，切 割)。在一些情况下，该线性化载体或闭合超螺旋载体包含编码核酸酶 (例如，Cas9或Argonaute)的序列、驱动编码核酸酶的序列的表达的 启动子(例如，CMV启动子)、编码标志物的序列、编码亲和标签的 序列、编码指导核酸的一部分的序列、驱动编码指导核酸的一部分的序 列的表达的启动子以及编码选择性标记(例如，氨苄青霉素)的序列， 或它们的任意组合。
所述载体可包含转录和/或翻译控制元件。根据所使用的宿主/载体 系统，在表达载体中可使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种， 包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。
在一些实施方案中，编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的 核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、 报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的 方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与控制 元件(例如，转录控制元件)如启动子可操作地连接。该转录控制元件可在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)和/或原核细胞(例如，细菌或古 菌细胞)中起作用。在一些实施方案中，编码本公开内容的设计的指导 核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)、 效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元 件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的 实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与多个控制元 件可操作地连接。与多个控制元件的可操作连接可允许编码本公开内容 的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、供体多核 苷酸、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开 内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列在 原核或真核细胞中表达。
合适的真核启动子(即，在真核细胞中起作用的启动子)的非限 制性实例可包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV) 胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)的 那些启动子、人延伸因子-1启动子(EF1)、包含与鸡β-活化启动子(CAG) 融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体、鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋 白-I。该启动子可为真菌启动子。该启动子可为植物启动子。可找到植 物启动子的数据库(例如，PlantProm)。该表达载体还可含有用于翻译 起始的核糖体结合位点和转录终止子。该表达载体还可包含用于对表达 进行扩增的适当序列。该表达载体还可包含编码与Argonaute融合的非 天然标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷 酸序列，从而产生融合蛋白。
在一些实施方案中，编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的 核酸指导的核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)、效应蛋白质、供体多 核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元 件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任 何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与诱导型启动子(例如，热休克启 动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、 雌激素受体调节的启动子等)可操作地连接。在一些实施方案中，编码 本公开内容的指导核酸、本公开内容核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、 供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的 遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必 需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与组成型启动子(例如， CMV启动子，UBC启动子)可操作地连接。在一些实施方案中，核苷 酸序列可与空间受限和/或时间受限的启动子(例如，组织特异性启动子、 细胞类型特异性启动子等)可操作地连接。
编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶(例 如，Cas9或Argonaute)、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向 剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/ 或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的 核苷酸序列可被包装在生物区室中或其表面上以供递送至细胞。生物区 室可包括但不限于病毒(慢病毒，腺病毒)、纳米球、脂质体、量子点、 纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。
本公开内容的复合体、多肽和核酸向细胞中的引入可通过病毒或 噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙 沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质 体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导 的核酸递送等进行。
密码子优化
编码核酸指导的核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)的本文公开 的多核苷酸可以是密码子优化的。这种类型的优化可需要外来DNA的 突变(例如，重组)，以在编码相同蛋白质时模拟预期宿主生物体或细 胞的密码子偏好。因此，密码子可以变化，但编码的蛋白质保持不变。 例如，如果预期的靶细胞为人细胞，则人密码子优化的多核苷酸Cas9 可被用于产生合适的Cas9。作为另一非限制性实例，如果预期的宿主细 胞为小鼠细胞，则编码Cas9的小鼠密码子优化的多核苷酸可为合适的 Cas9。编码CRISPR/Cas蛋白的多核苷酸可针对许多感兴趣的宿主细胞 进行密码子优化。编码Argonaute的多核苷酸可针对许多感兴趣的宿主 细胞进行密码子优化。宿主细胞可以是来自任何生物体的细胞(例如， 细菌细胞、古菌细胞、单细胞真核生物的细胞、植物细胞、藻类细胞(例 如，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、莱茵衣藻(Lactoomonas reinhardtii)、海洋富油微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)、蛋白核 小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、Sargassum patens C.Aaardh等)、真 菌细胞(例如，酵母细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、 刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两 栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、 牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长动物、人等)的细胞等)。可以不需要密码子优化。在一些情况下，密码子优化可以是优 选的。
递送
本公开内容的位点定向核酸酶可在细胞内进行内源或重组表达。 位点定向核酸酶可在染色体上、染色体外或在质粒、合成染色体或人工 染色体上编码。另外或备选地，位点定向核酸酶可作为多肽或编码多肽 的mRNA提供或递送至细胞。在这样的实例中，多肽或mRNA可通过 本领域已知的标准机制来递送，诸如通过使用细胞可透过的肽、纳米颗 粒、病毒颗粒、病毒递送系统或其他非病毒递送系统。
另外或备选地，本文公开的指导核酸可由细胞内的遗传或附加型 DNA提供。指导核酸可从细胞内的RNA或mRNA逆转录。可将指导核 酸提供或递送至表达相应的位点定向核酸酶的细胞。另外或备选地，指 导核酸可与位点定向核酸酶同时或相继地提供或递送。可使用本领域已 知的标准DNA或RNA生成技术化学合成、组装或以其他方式生成指导 核酸。另外或备选地，可从基因组DNA、附加型DNA分子、分离的核 酸分子或任何其他来源的核酸分子切割、释放或以其他方式得到指导核 酸。
小分子抑制剂
在一些实施方案中，所述治疗剂为小分子抑制剂。该小分子抑 制剂可不含多核苷酸。该小分子抑制剂可不含肽。在一些实施方案中， 该小分子抑制剂直接结合至与pl6a表达相关的蛋白质或结构以破坏其 功能。通常，小分子抑制剂容易穿过细胞膜，因此可以不需额外的修 饰来帮助其细胞摄取。
基因靶标
本文提供了用CRISPR/Cas系统编辑本文公开的基因的方法。本 文进一步提供了使从本文公开的基因表达的RNA与反义寡核苷酸接触， 从而改变由该基因编码的蛋白质产生的方法。本文进一步提供了编辑本 文公开的基因或改变本文公开的基因的表达的方法。在一些实施方案中， 编辑基因或改变基因的表达包括降低基因的表达、减少基因产物(例如 RNA、蛋白质)的表达、降低基因产物的活性或它们的组合。
在一些实施方案中，所述基因编码核受体。在一些实施方案中， 该基因编码亮氨酸拉链蛋白。在一些实施方案中，该基因编码视蛋白。 在一些实施方案中，该基因编码G偶联蛋白受体。在一些实施方案中， 该基因为肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，该基因编码促进细胞衰老 的蛋白。在一些实施方案中，该基因编码促进细胞凋亡的蛋白质。在一 些实施方案中，该基因编码促进细胞分化的蛋白质。在一些实施方案中， 该基因编码抑制细胞增殖的蛋白质。在一些实施方案中，该基因编码抑 制细胞生存的蛋白质。
在一些实施方案中，所述基因的特征在于具有本文提供的序列标 识符(SEQ IDNO)的序列。在一些实施方案中，该基因的特征在于与 本文提供的序列标识符(SEQ ID NO)具有同源性或与其同源的序列。 当在本文中用来相对于参考序列描述氨基酸序列或核酸序列时，术语“同 源”、“同源性”或“百分比同源性”可使用Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993中进行了修改)所述的公式来确定。这样的公式被并 入Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基本局部比对搜索 工具(BLAST)程序中。可使用到本申请的申请日止最新版本的BLAST 确定序列的百分比同源性。
本文公开的任一种基因均可为人类基因。该基因可编码由血细胞 表达的蛋白质。该基因可编码血红蛋白。该基因可编码在人类受试者的 眼细胞上表达的蛋白质。作为非限制性实例，该基因可编码G蛋白偶联 受体(GPCR)。该GPCR可选自编码视蛋白(例如视，紫红质)或转 导蛋白(例如，GNAT1)的基因。同样作为非限制性实例，该基因可编 码亮氨酸拉链蛋白。该基因可为神经视网膜特异性亮氨酸拉链基因(Nrl)。 该基因可编码Nrl蛋白。该基因可包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2 的至少10个连续核苷酸。同样，作为非限制性实例，该基因可编码核受 体。该基因可为感光细胞特异性核受体(PNR)基因。该基因可编码PNR蛋白。PNR也被称为NR2E3(核受体亚家族2，组E，成员3)。该基 因可包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的至少10个连续核苷酸。该基 因可为Mertk基因。该基因可为其他眼基因，包括视网膜母细胞瘤基因、 athonal7基因、Pax6基因。
本文提供了包括修饰本文公开的细胞中的本文公开的基因的方法。 该基因可为非眼部基因，并且该细胞可为非眼部细胞。作为非限制性实 例，该基因可为UMOD、TMEM174、SLC22A8、SLC12A1、SLC34A1、 SLC22A12、SLC22A2、MCCD1、AQP2、SLC7A13、KCNJ1、SLC22A6 或Pax3，并且该细胞可为肾细胞。作为非限制性实例，该基因可为 PNLIPRP1、SYCN、PRSS1、CTRB2、CELA2A、CTRB1、CELA3A、 CELA3B、CTRC、CPA1、PNLIP或CPB1，并且该细胞可为胰腺细胞。 作为非限制性实例，该基因可为GFAP、OPALIN、OLIG2、GRIN1、 OMG、SLC17A7、C1orf61、CREG2、NEUROD6、ZDHHC22、VSTM2B 或PMP2，并且该细胞可为脑细胞。作为非限制性实例，该基因可编码 免疫检查点抑制剂，并且该细胞可为T细胞。作为非限制性实例，该基 因可为PD-1，并且该细胞可为T细胞。该基因可为PD-L1或PD-L2， 并且该细胞可为肿瘤细胞。
细胞
本文提供了修饰由本文公开的细胞表达的核酸分子的方法。本文 进一步提供了改变由本文公开的细胞表达的核酸分子的表达和/或活性 的方法。在一些实施方案中，该方法包括修饰核酸分子或改变其表达/ 活性，其中该核酸分子存在于体内细胞中。在一些实施方案中，该方法 包括修饰核酸分子或改变其表达/活性，其中该核酸分子存在于体外细胞 中。在一些实施方案中，该方法包括修饰核酸分子或改变其表达/活性， 其中该核酸分子存在于离体细胞中。在一些实施方案中，该方法包括修 饰核酸分子或改变其表达/活性，其中该核酸分子存在于原位细胞中。
在一些实施方案中，该细胞为视网膜细胞。在一些实施方案中， 该细胞为感光细胞。在一些实施方案中，该感光细胞为视杆。在一些实 施方案中，该感光细胞为视锥。在一些实施方案中，该感光细胞为感光 性视网膜神经节细胞。在一些实施方案中，该细胞为视神经细胞。在一 些实施方案中，该细胞为神经节细胞。在一些实施方案中，该细胞为无 长突细胞。在一些实施方案中，该细胞为视网膜神经节细胞。
在一些实施方案中，该细胞已从待治疗的受试者中分离。在一些 实施方案中，该细胞为干细胞。在一些实施方案中，该细胞为脐带血干 细胞。在一些实施方案中，该细胞为血细胞。在一些实施方案中，该细 胞为造血干细胞。在一些实施方案中，该细胞为造血多能细胞。在一些 实施方案中，该细胞为癌细胞。在一些实施方案中，该细胞为上皮细胞。 在一些实施方案中，该细胞为肠细胞。在一些实施方案中，该细胞为多 能细胞。在一些实施方案中，该细胞为多潜能细胞。在一些实施方案中， 该细胞为诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，该iPSC来源 于神经细胞。在一些实施方案中，该iPSC来源于眼细胞。在一些实施方案中，该细胞为分化为视网膜神经节细胞或其多能祖细胞的iPSC。
药物组合物与施用模式
本文公开了用于治疗视网膜退行性病况的药物组合物，其包含本 文所述的抑制基因表达和蛋白质活性的治疗剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物是用于向眼部施用的制剂。 在一些实施方案中，用于向眼部施用的制剂包含使其适用于向眼部施用 的增稠剂、表面活性剂、润湿剂、基础成分、载体、赋形剂或盐。在一 些实施方案中，用于向眼部施用的制剂具有使其适用于向眼部施用的pH、 盐或张度(tonicity)。本文描述了用于向眼部施用的制剂的这些方面。 在一些实施方案中，该药物组合物为眼用制品。该药物组合物可包含增 稠剂以延长药物组合物与眼部的接触时间。在一些实施方案中，该增稠 剂选自聚乙烯醇、聚乙二醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素和它们的组合。 在一些实施方案中，将增稠剂过滤并灭菌。
本文公开的药物组合物可包含用于眼部的药学上可接受的载体、 药学上可接受的赋形剂或药学上可接受的盐。用于眼部的药学上可接受 的载体、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的盐的非限制性实例包 括透明质酸、硼酸、氯化钙、过硼酸钠、磷酸(phosphonic acid)、氯 化钾、氯化镁、硼酸钠、磷酸钠和氯化钠。
本文公开的药物组合物应与泪分泌物等渗。在一些实施方案中， 该药物组合物具有0.5-2％NaCl的张度。在一些实施方案中，该药物组 合物包含等渗媒介物。作为非限制性实例，等渗媒介物可包含硼酸或磷 酸二氢钠。
在一些实施方案中，所述药物组合物具有约3至约8的pH。在一 些实施方案中，该药物组合物具有约3至约7的pH。在一些实施方案中， 该药物组合物具有约4至约7的pH。处于该pH范围之外的药物组合物 在施用时可能刺激眼睛或在眼睛中形成颗粒。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含表面活性剂或润 湿剂。在本文公开的药物组合物中所采的表面活性剂的非限制性实例为 苯扎氯铵、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和磺基琥珀酸二辛酯钠。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含在容纳药物组合 物的容器被打开之后防止微生物污染的防腐剂。在一些实施方案中，该 防腐剂选自苯扎氯铵、氯丁醇、乙酸苯汞、乙酸氯己定和硝酸苯汞。
在一些实施方案中，所述药物组合物(例如，洗剂或软膏)包含 基础成分。该基础成分可选自氯化钠、碳酸氢钠、硼酸、硼砂、硫酸锌、 石蜡以及蜡或脂肪物质。在一些实施方案中，该药物组合物为洗剂。在 一些实施方案中，该洗剂以粉末或冻干产品的形式提供给受试者(或施 用该洗剂的受试者)，在临使用前将其重建。
将药物组合物直接施用于眼部可避免治疗剂在除眼部之外的位置 中的任何不期望的脱靶效应。例如，静脉内或全身施用药物组合物可导 致抑制除眼部细胞之外的细胞中的基因表达，在该细胞中抑制该基因可 能具有有害作用。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含编码任一种本文公开的 核酸分子(例如，shRNA、指导RNA、核酸酶编码的多核苷酸)的多核 苷酸载体。在一些实施方案中，该多核苷酸载体为表达载体。在一些实 施方案中，该多核苷酸载体为病毒载体。在一些实施方案中，该药物组 合物包含病毒，其中该病毒将载体和/或核酸分子递送至受试者的细胞。 在一些实施方案中，该病毒为逆转录病毒。在一些实施方案中，该病毒 为慢病毒。在一些实施方案中，该病毒为腺伴随病毒(AAV)。在一些 实施方案中，该AAV选自血清型1、2、5、7、8和9。在一些实施方案 中，该AAV为AAV血清型2。在一些实施方案中，该AAV为AAV血 清型8。
由于对免疫系统的刺激最小以及AAV在不分裂的视网膜细胞中 提供持续多年的表达的能力，AAV对于本文所公开的方法可能特别有用。 AAV可以能够转导视网膜内的多种细胞类型。在一些实施方案中，所述 方法包括AAV的玻璃体内施用(例如，注射到眼睛的玻璃体液中)。 在一些实施方案中，该方法包括AAV的视网膜下施用(例如，注射到 视网膜下)。
在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物包含在AAV载体中 的外源可调节的启动子系统。作为非限制性实例，该外源可调节的启动 子系统可为四环素诱导型表达系统。
本文公开的药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的 盐、赋形剂或媒介物。用于本药物组合物的药学上可接受的盐、赋形剂 或媒介物包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调 味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、递 送媒介物、张度剂、助溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和 表面活性剂。
中性缓冲盐水或混有血清白蛋白的盐水可以是示例性的合适载体。 所述药物组合物可包含抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质如 血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨 基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和 其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇 如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂 如吐温(Tween)、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。同样作 为示例，合适的张度增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、 甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢 也可用作防腐剂。合适的助溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合 剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。合适的 表面活性剂或润湿剂包括失水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、 氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal)等。缓冲液可为常规缓冲液，诸如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或 Tris-HCl。乙酸盐缓冲液的pH可为约4-5.5，Tris缓冲液的pH可为约7-8.5。 另外的药物剂在Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,A.R. Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990中阐述。
所述组合物可为液体形式或冻干或冷冻干燥形式，并可包含一种 或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨 胀剂(参见例如，美国专利号6,685,940、6,566,329和6,372,716)。在 一个实施方案中，包含冻干保护剂，该冻干保护剂为非还原糖如蔗糖、 乳糖或海藻糖。通常包含的冻干保护剂的量使得在重建时，所得制剂将会是等渗的，尽管高渗或轻度低渗的制剂也可能是合适的。此外，冻干 保护剂的量应足以防止蛋白质在冻干时不可接受的量的降解和/或聚集。 预冻干制剂中糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂的 浓度为约10mM至约400mM。在另一个实施方案中，包含表面活性剂， 例如非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如， 聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)； 聚(乙二醇)苯基醚(例如，Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基 硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基-磺基甜菜碱、十四烷基-磺基甜菜碱、 亚油酰基-磺基甜菜碱或十八烷酰-磺基甜菜碱；十二烷基-肌氨酸、十四 烷基-肌氨酸、亚油酰基-肌氨酸或十八烷酰-肌氨酸；亚油酰基-甜菜碱、 十四烷基-甜菜碱或十六烷基-甜菜碱；十二烷酰胺基丙基-甜菜碱、椰油 酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、十四烷酰胺基丙基-甜菜 碱、十六烷酰胺基丙基-甜菜碱或异十八酰胺丙基-甜菜碱(例如，十二 烷酰胺丙基)；十四烷酰胺基丙基-二甲胺、十六烷酰胺基丙基-二甲胺 或异十八酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基(ofeyl) 牛磺酸二钠；MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson， N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，普 朗尼克(Pluronics)、PF68等)。可存在于预冻干制剂中的表面活性剂 的示例性量为约0.001-0.5％。高分子量结构添加剂(例如，填充剂，粘 合剂)可包括例如阿拉伯树胶、白蛋白、藻酸、磷酸钙(二碱式)、纤 维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、葡聚糖、糊精、葡萄糖结合剂、蔗糖、 侵填体(tylose)、预胶凝淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、 麦芽糖、山梨糖醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二 钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔胶、液体葡萄糖、可压缩糖、硅酸 镁铝、麦芽糖糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、藻酸钠、 黄蓍胶微晶纤维素、淀粉和玉米醇溶蛋白。高分子量结构添加剂的示例性浓度为按重量计0.1％-10％。在其他实施方案中，可包含膨胀剂(例如， 甘露糖醇，甘氨酸)。
所述组合物可适用于肠胃外给药。示例性的组合物适用于通过技 术人员可用的任何途径(诸如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、 脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径)向动 物注射或输注。肠胃外制剂通常将会是无菌、无热原的等渗水溶液，任 选地含有药学上可接受的防腐剂。
非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可 注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液， 包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、 右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营 养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏右旋糖的补充剂等。还可存 在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气 体等。通常参见Remington's Pharmaceutical Science,第16版,Mack Eds., 1980。
本文所述的组合物可配制用于以提供产品的局部浓度(例如，团 注、贮库(depot)效应)和/或在特定局部环境中稳定性或半衰期增加的 方式进行受控或持续递送。该组合物可包含本文公开的多肽、核酸或载 体与提供活性剂的受控或持续释放的颗粒制品(聚合化合物如聚乳酸、 聚乙醇酸等以及药剂如生物可降解的基质、可注射的微球、微胶囊颗粒、微胶囊、生物可侵蚀的颗粒珠、脂质体和可植入递送装置)的制剂，该 制剂随后可作为贮库型注射剂递送。用于配制这样的持续或受控递送手 段的技术是已知的，并且已经开发了多种聚合物并用于药物的受控释放 和递送。这样的聚合物通常是生物可降解的和生物相容的。由于参与捕 获生物活性蛋白质剂的温和和水性条件，聚合物水凝胶，包括由对映异 构体聚合物或多肽片段络合形成的聚合物水凝胶以及具有温度或pH敏 感性质的水凝胶可能是提供药物贮库效应所期望的。参见例如WO 93/15722中对用于递送药物组合物的控释多孔聚合物微粒的描述。
适用于此目的的材料可包括聚交酯(参见例如美国专利号 3,773,919)、聚(α-羟基羧酸)聚合物如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988A)、 L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22: 547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,J.Biomed. Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、 乙烯醋酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。其他生物可降解的聚合物包括聚(内酯)、聚(缩醛)、聚(原酸酯)和聚(原碳酸酯)。持续释放组合物还可包 含脂质体，该脂质体可通过本领域已知的若干种方法中的任一种制备(参 见例如Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-92(1985))。 载体本身或其降解产物应在靶组织中是无毒的，且不应进一步加重病况。 这可通过在目标病症的动物模型中进行常规筛选来确定，或者，如果这 样的模型不可用，则在正常动物中进行筛选。
适用于肌内、皮下、肿瘤周围或静脉内注射的制剂可包含生理上 可接受的无菌水性或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重建 成无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释 剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、 甘油、克列莫佛(cremophor)等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄 油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。通过例如使用涂层如卵磷脂、通过 在分散剂的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当 的流动性。适用于皮下注射的制剂还含有可选的添加剂，如防腐剂、润 湿剂、乳化剂和分散剂。
对于静脉内注射，活性剂可任选地在水溶液中配制，优选在生理 上相容的缓冲液如Hank溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。
肠胃外注射任选地包括团注或连续输注。用于注射的制剂任选地 以添加有防腐剂的单位剂量形式呈现，例如在安瓿或多剂量容器中。本 文所述的药物组合物可为适用于以在油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、 溶液或乳液的形式肠胃外注射的形式，并含有配方剂如悬浮剂、稳定剂 和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物制剂包括处于水溶性形式的活性剂 水溶液。此外，任选地将悬浮液制备为适当的油性注射悬浮液。
备选地或另外地，可通过将已吸收或封装本文公开的治疗剂的膜、 海绵或其他合适材料植入患处来局部施用该组合物。在使用植入装置的 情况下，可将该装置植入任何合适的组织或器官中，并且本文公开的治 疗剂、核酸或载体的递送可经由团注或经由连续施用或经由导管使用连 续输注直接通过该装置进行。
包含本文公开的治疗剂的某些制剂可口服施用。以该方式施用的 制剂可与常用于调配固体剂型如片剂和胶囊的那些载体一起配制或不一 起配置。例如，可将胶囊设计成当生物利用度最大化并且首过降解最小 化时在胃肠道内释放该制剂的活性部分。可包含其他的药剂以促进选择 性结合剂的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑 剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
鉴于本公开内容和配制技术的常识，可根据预期的施用途径、递 送形式和期望的剂量来确定合适的和/或优选的药物制剂。无论施用方式 如何，均可根据患者体重、体表面积或器官大小计算有效剂量。
用于为涉及本文所述的每种制剂的治疗确定适当剂量的计算的进 一步细化在本领域中常规进行，并在本领域常规执行的任务范围内。可 通过使用适当的剂量-响应数据来确定合适的剂量。
“药学上可接受的”可指对于在包括人在内的动物中的应用，联邦 或州政府的管理机构已批准或可批准，或列于美国药典或其他普遍认可 的药典中。
“药学上可接受的盐”可指药学上可接受且具有期望的母体化合物 药理学活性的化合物的盐。
“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”可指这样的赋形剂、载体 或佐剂，其可与本公开内容的至少一种抗体一起施用于受试者，并且在 以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时不破坏该至少一种抗体的药理 学活性且是无毒的。
“药学上可接受的媒介物”可指与本公开内容的至少一种抗体一起 施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于可注射给药。在 一些实施方案中，所述方法包括注射该药物组合物。在一些实施方案中， 该方法包括经由眼内注射施用液体形式的药物组合物。在一些实施方案 中，该方法包括经由眼周注射施用液体形式的药物组合物。在一些实施 方案中，该方法包括经由玻璃体内注射施用液体形式的药物组合物。虽 然这些施用模式中的一些可能对受试者没有吸引力(例如，玻璃体内注 射)，但它们在渗透眼屏障方面可能是最有效的，并且与滴眼剂相比， 治疗剂可能不太会被眼泪或眨眼冲走，这提供了便利性和低负担。
在一些实施方案中，所述方法包括全身施用药物组合物。在一些 实施方案中，治疗剂为多核苷酸载体，其中多核苷酸载体包含指导RNA、 反义寡核苷酸或Cas编码多核苷酸。多核苷酸载体可包含用于以细胞特 异性方式驱动载体的核酸分子表达的条件启动子。作为非限制性实例， 该条件启动子可仅在视网膜神经节细胞中驱动表达，或仅将表达驱动至 在视网膜神经节细胞中具有功能作用的水平。
在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于非注射给药。在 一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于局部给药。作为非限制性 实例，核酸分子可悬浮在适用于滴入眼中的盐溶液或缓冲液中。
在一些实施方案中，所述药物组合物可被配制为滴眼剂、凝胶、 洗剂、软膏、悬浮液或乳液。在一些实施方案中，所述药物组合物被配 制为固体制品，诸如眼部插入物。例如，眼部插入物可与在一段时间内 释放药物组合物的接触镜类似地形成或成型，从而有效地输送延长释放 制剂。凝胶或软膏可施用于眼睑下或眼睑内或眼角中。
在一些实施方案中，所述方法可包括在临睡前或在受试者可保持 闭眼的一段时间之前施用药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括 指示受试者保持眼睛闭合或施用覆盖物(例如，绷带、胶带、眼罩)， 以保持在施用药物组合物后眼睛闭合至少1分钟、至少5分钟、至少10 分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2 小时、至少4小时或至少8小时。该方法可包括指示受试者在施用药物 组合物后1分钟至8小时保持眼睛闭合。该方法可包括指示受试者在施 用药物组合物后1分钟至2小时保持眼睛闭合。该方法可包括指示受试 者在施用药物组合物后1分钟至30分钟保持眼睛闭合。
在一些实施方案中，所述方法包括仅向受试者施用一次药物组合 物以治疗青光眼。在一些实施方案中，该方法包括第一次和第二次施用 药物组合物以治疗青光眼。第一次和第二次可间隔一小时至十二小时的 时间段。第一次和第二次可间隔一天至一周的时间段。第一次和第二次 可间隔一周至一个月的时间段。在一些实施方案中，该方法包括每天、 每周、每个月或每年向受试者施用药物组合物。在一些实施方案中，该 方法可包括最初进行积极治疗，逐渐减少为维持治疗。作为非限制性实 例，该方法可包括最初注射药物组合物，随后以滴眼剂形式施用药物组 合物来维持治疗。此外，作为非限制性实例，该方法可包括最初在约1 周至约20周每周施用药物组合物的注射，随后每二至十二个月经由注射或局部给药来施用药物组合物。
在一些实施方案中，治疗剂为小分子抑制剂，并且将药物组合物 配制用于口服施用。
试剂盒/系统
本文提供了试剂盒和系统，其包含Cas核酸酶或编码该Cas核 酸酶的多核苷酸、第一指导RNA和第二指导RNA。该Cas核酸酶和 第一/第二指导RNA可为本文公开的那些中的任一种。第一指导RNA 可靶向在基因的至少第一区5’侧的第一位点的Cas9切割，并且第二 指导RNA靶向在该基因的第一区3’侧的第二位点的Cas9切割，从而 切除该基因的该区域，该区域在后文中被称为切除区。该区域可包含 外显子。该区域可包含外显子的一部分。该区域可包含外显子的约1％ 至约100％。该区域可包含外显子的约2％至约100％。该区域可包含 外显子的约5％至约100％。该区域可包含外显子的约5％至约99％。 该区域可包含外显子的约1％至约90％。该区域可包含外显子的约5％ 至约90％。该区域可包含外显子的约10％至约100％。该区域可包含 外显子的约10％至约90％。该区域可包含外显子的约15％至约100％。 该区域可包含外显子的约15％至约85％。该区域可包含外显子的约 20％至约80％。该区域可基本由外显子组成。该区域可包含超过一个 外显子。该区域可包含内含子或其部分。外显子或内含子的部分可为 至少约1个核苷酸。外显子或内含子的部分可为至少约5个核苷酸。 外显子或内含子的部分可为至少约10个核苷酸。
本文提供了试剂盒和系统，其包含本文公开的供体多核苷酸。 该供体多核苷酸可包含末端，该末端可适于插入第一位点与第二位点 之间。该供体多核苷酸可为供体外显子，该供体外显子包含在5’端和 3’端的剪接位点。该供体多核苷酸可包含供体外显子，该供体外显子 包含在该供体外显子的5’端和3’端的剪接位点。该剪接位点允许在基因 的开放阅读框中包含外显子，因此该剪接位点将确保该供体外显子在感 兴趣的细胞中转录。该供体多核苷酸可包含野生型序列。该供体多核苷 酸可与切除区同源。该供体多核苷酸可与切除区至少约99％同源。供体 多核苷酸可与切除区至少约95％同源。供体多核苷酸可与切除区至少约 90％同源。该供体多核苷酸可与切除区至少约85％同源。该供体多核苷 酸可与切除区至少约80％同源。除了该供体多核苷酸包含野生型序列而 切除区包含突变之外，该供体多核苷酸可与切除区相同。在一些情况下， 该供体多核苷酸与切除区不相似。该供体多核苷酸可与切除区不到约 90％同源。该供体多核苷酸可与切除区不到约80％同源。该供体多核苷 酸可与切除区不到约70％同源。该供体多核苷酸可与切除区不到约60％ 同源。该供体多核苷酸可与切除区不到约50％同源。该供体多核苷酸可 与切除区不到约40％同源。该供体多核苷酸可与切除区不到约30％同源。 该供体多核苷酸可与切除区不到约20％同源。该供体多核苷酸可与切除 区不到约10％同源。该供体多核苷酸可与切除区不到约8％同源。该供 体多核苷酸可与切除区不到约5％同源。该供体多核苷酸可与切除区不到约90％同源。该供体多核苷酸可与切除区不到约2％同源。
本文提供了用于治疗眼部病况的试剂盒和系统，其包含至少一种 指导RNA，该指导RNA靶向选自NRL和NR2E3的基因中的序列。第 一指导RNA和/或第二指导RNA可使Cas9蛋白靶向包含SEQ ID NO: 1-4中任一个的序列。第一指导RNA和/或第二指导RNA可使Cas9 蛋白靶向与SEQ ID NO:1-4中任一个至少90％同源的序列。
某些术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与 所请求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同含义。应理解， 前文的一般描述和下文的实施例仅是示例性和解释性的，并非限制任 何所请求保护的主题。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的 使用包括复数。必须指出，除非上下文另有明确规定，如在说明书和 所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包 括复数个指代物。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用表示“和 /或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”的使用并不是限 制性的。
如本文所用的，范围和量可表示为“约”特定值或范围。约还包 括确切的量。例如，“约5μL”指“约5μL”，也指“5μL”。通常，术语“约” 包括预期在实验误差范围内的量。术语“约”包括所提供的值减10％至 加10％范围内的值。例如，“约50％”指“45％至55％之间”。另外，举 例而言，“约30”指“27至33之间”。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应被解释为限制所 描述的主题。
如本文所用，术语“个体”、“受试者”和“患者”指任何哺 乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物为人。在一些实施方案中， 该哺乳动物为非人的哺乳动物。
术语“统计学显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且 通常指比标志物的正常浓度或更低浓度低两个标准偏差(2SD)。该 术语是指统计学证据表明存在差异。它被定义为当零假设实际为真时， 作出拒绝零假设的决定的概率。该决定通常使用p值作出。小于0.05 的p值被认为是统计学显著的。
如本文所用的，术语“治疗”和“处理”是指向受试者施用有 效量的组合物，使得受试者的疾病的至少一种症状减轻或疾病改善， 例如，具有有益或期望的临床结果。对于本发明来说，有益或期望的 临床结果包括但不限于一种或多种症状减轻、疾病程度降低、疾病状 态稳定(例如，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓 和，以及缓解(部分或全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。 或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。需要治疗 的受试者包括已被诊断患有疾病或病况的受试者，以及由于遗传易感 性或其他有助于该疾病或病况的因素而易于发展出该疾病或病况的 受试者，作为非限制性实例，受试者的体重、饮食和健康是可能导致 受试者易于发展出糖尿病的因素。需要治疗的受试者还包括需要医疗 或手术关注、护理或管理的受试者。
无需进一步阐述，相信本领域技术人员利用以上描述可最大程 度地利用本发明。以下实施例仅是说明性的，并非以任何方式限制本 公开内容的其余部分。
实施例
本文描述的实施例和实施方案仅出于说明的目的，并非意在限制 本文提供的权利要求的范围。本领域技术人员想到的各种修改或变化都 将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
实施例1.在体外利用两种指导RNA的CRISPR-Cas9靶向
为测试基于CRISPR-CAS9的细胞重编程策略以治疗RP并保留视 觉功能，采用了两种AAV载体，一种表达Cas9，而另一种携带靶向NRL 或NR2E3基因的gRNA(参见图1A)。为构建双gRNA表达载体，使 用了pAAV-U6gRNA-EF1a mCherry。将两个20bp gRNA序列分别亚克 隆至载体中。本研究所用的CRISPR/Cas9靶序列(20bp靶标和以下划 线示出的3bp PAM序列)如下所示：对于NRL敲减， GAGCCTTCTGAGGGCCGATC TGG(SEQ ID NO.1)和GTATGGTGTGGAGCCCAACG AGG(SEQ ID NO.2)，对于NR2E3 敲减，GGCCTGGCACTGATTGCGAT GGG(SEQ ID NO.3)和 AGGCCTGGCACTGATTGCGA TGG(SEQ ID NO.4)。相对于单个 gRNA的靶向和灭活效率，评估了用同一基因中的两个gRNA同时靶向 两个位点的靶向和灭活效率。采用切割错配的双链DNA模板的T7E1 核酸酶试验测定了小鼠成纤维细胞中的基因敲减效率。这个双gRNA系 统的敲减效率具有比单指导RNA系统高得多的编辑效率(参见图1B和 1C)。因此，在所有随后的体内实验中都采用这个双靶向敲除策略。
实施例2.在体内利用两种指导RNA的CRISPR-Cas9靶向
在P0(出生后第7天)经由视网膜下注射将编码Cas 9和两种靶 向NRL基因的指导RNA的AAV递送至WT小鼠。简言之，对经麻醉 的小鼠的眼睛进行散瞳，并在用解剖显微镜直接可视化下，使用玻璃微 量移液管(内径为50～75μm)和泵式显微注射仪器(PicospritzerIII；Parker Hannifin Corporation)，将1μl AAV混合物通过小切口注射到视网膜下 空间中。通过视网膜下小液泡的形成观察到成功的注射。显示视网膜损 伤如出血的任何小鼠均不包括在本研究中。在P30将小鼠处死以用于组 织学分析。将视网膜冷冻切片并针对视锥标志物进行染色，该视锥标志 物包括抗鼠视锥抑制蛋白(mCAR)抗体和抗中波长视蛋白(M-视蛋白) 抗体。还将mCherry作为标志物进行成像以标记通过AAV载体转导的 区域和细胞。结果显示，AAV8-Cas9+AAV8-NRL gRNA1-mCherry不 能诱导任何表型，提示单个gRNA1不能有效引入基因组序列破坏。与 体外T7E1试验一致，利用两种gRNA在体内观察到命运转换表型。在 对照视网膜中，视锥细胞核存在于ONL的顶层，而视杆细胞核填充ONL 的其余部分(参见图3A)。观察到用AAV8-Cas9+AAV8-NRL gRNA2+3-mCherry转导的视网膜，并且在外核层(ONL)下部存在一些 mCAR+细胞(参见图3B)。在ONL层下部的额外的mCAR+细胞具有 正常的视杆外段(参见图3B)。在左侧未注射的对照视网膜中未观察到 在ONL层下部的额外的mCAR+细胞。定量显示，在AAV8-Cas9+ AAV8-NRL gRNA2+3-mCherry共同注射组中，ONL层下部的额外 mCAR+细胞显著增加(图3D)。利用M-视蛋白抗体的染色也显示，这 些细胞表达另一种视锥特异性基因——Opn1mw(图3C)，提示视锥样 基因表达程序的可行性。
实施例3.向色素性视网膜炎(RP)模型小鼠中视网膜下注射编码靶向NRL或NR2E3的 Cas9/CRISPR系统的AAV
为检验将变性的视杆部分地转化成视锥足以救治视网膜变性并恢 复视网膜功能的假设，在P0时将AAV-gRNA/Cas9注射至RD10小鼠的 视网膜下空间中。RD10小鼠为患有快速视杆光感受器变性的人的常染 色体隐性RP的模型。RD10小鼠携带视杆-磷酸二酯酶(PDE)基因的 自发突变，从而导致从P18附近开始的快速视杆变性。视杆变性在出生 后60天内完成，并伴有视锥变性。由于光感受器变性不与视网膜发育重 叠，并且光响应可在出生后约一个月内被记录，因此相比其他RD模型 如rd1突变体，RD10小鼠更接近地模拟典型的人RP。
在出生后的7至8周之间进行分析。为确定该AAV-gRNA/Cas9 治疗对视网膜生理学功能的影响，测试了视网膜电描记术(ERG)响应 以测量视杆(暗视，完成了暗视ERG但尚未分析数据)和视锥(明视) 的电活动。该ERG测试在注射后6周(P50)进行。所有经 AAV-gRNA/Cas9治疗的眼睛都展现出显著改善的明视b波值，提示增 强的视锥功能(参见图5B)。这些结果表明，AAV-gRNA/Cas9治疗救 治了光感受器变性并保留视网膜视觉功能。
DNA分析揭示出AAV-gRNA/Cas9注射的眼睛中正确的敲减。此 外，与未注射的对照相比，AAV-gRNA/Cas9注射导致显著改善的ONL 厚度保留(参见图4)。与在ONL中仅具有1-2个(或稀疏分布的)感 光细胞细胞核的未治疗眼睛不同，AAV-gRNA/Cas9治疗的眼睛中存在3-5层ONL，表明AAV-gRNA/Cas9治疗阻止了感光细胞变性。利用定 量RT-PCR(qRT-PCR)测量视杆光感受器基因和视锥光感受器基因的 相对表达水平。这些分析显示出视锥特异性基因的表达增加。
值得注意的是，在经治疗的眼睛中观察到ONL厚度的显著增加。 有趣的是，ONL中的许多细胞并未表达视杆标志物或视锥标志物，提示 它们可能已被重编程成中间细胞命运。对所观察到的救治效果的一种另 外或备选的解释是，这些中间细胞将视杆特异性基因下调，因此使得它 们对由视杆特异性基因突变引起的死亡/变性有抗性。这些中间细胞可能 保持了正常的组织结构完整性和对内源性视锥存活必不可少的分泌的营 养因子。因此，视觉功能的获得可能部分是由于现有视锥的救治效果， 而并非视杆向视锥命运的重编程。
实施例4.用Cas介导的同源性引导的修复来靶向血红蛋白基因突变以用于治疗β地中 海贫血
β地中海贫血是血红蛋白(Hb)产生减少的血液病症。Hb编码基 因中被称为CD41/42(-TCTT)的突变与该病症相关。该基因的修复可 能对患有该病症的受试者具有治疗效果。
为特异性地靶向来源于患者的造血干细胞/祖细胞(HSPC)中均 质和异质的CD41/42突变，选择了两个位于突变位点处的CRISPR/Cas9 靶序列。然后采用基于单链退火原理(SSA)的萤光素酶试验测试了特 异性和效率。SSA是在朝向同一方向的两个重复序列之间产生双链断裂 时开始的过程。通过将野生型和CD41/42突变序列放入两个部分重复的 萤光素酶表达盒之间，当特异性剪切被CRISPR/Cas9系统介导时，萤光 素酶表达被激活。gRNA-1和gRNA-2都显示出良好的特异性，但gRNA-2 具有更高的效率(图6A)。选择gRNA-2用于进一步的HSPC编辑。接 下来，测试了不同Cas9形式和单链寡脱氧核苷酸(ssODN)的编辑效率。 通过HDR特异性PCR和小液滴数字PCR评估了HDR介导的编辑。在 Cas9 mRNA和两个Cas9 RNP中，Cas9 RNP-2显示出最高的HDR效率 (图6B，左侧)。设计了7种不对称的ssODN并采用Cas9 RNP-2进行 了筛选，其中ssODN-111/37得到最高的HSPC编辑效率评分(图6B， 左侧和图6C)。
质粒。为构建gRNA表达载体，采用了pX330(Addgene，42230)。 如前所述，将两个突变特异性靶序列分别亚克隆至载体中。本研究所用 的CRISPR/Cas9靶序列(20bp靶标和以下划线示出的3bp PAM序列) 如下所示：gRNA-1：GGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGG(SEQ ID NO.:6)；gRNA-2：GGTAGACCACCAGCAGCCTAAGG(SEQ ID NO.:7)。 购买了用于Cas9体外转录的质粒。
萤光素酶试验。为选择突变特异性gRNA，合成了野生型和 CD41/42突变的序列，并将其分别克隆至pGL4-SSA中。将 pX330-gRNA-Cas9、pGL4-SSA-HBB和pGL4-hRluc共转染至293T细胞 中。采用双萤光素酶报告基因测定系统来进行萤光素酶试验。
体外转录。采用以下引物扩增用于gRNA-2体外转录的模板： gRNA-2-F：TAATACGACTCACTATAGGGACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID NO.:8)和gRNA-F：AAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO.:9) ；将质粒MLM 3639线性化并随后用于Cas9体外转录。将gRNA和 Cas9体外转录、纯化并用于HSPC电穿孔。
Cas9 RNP的组装。为了用Cas9 RNP对20μl细胞悬浮液(100,000 个细胞)进行电穿孔，通过在Cas9缓冲液中添加1.2摩尔过量的gRNA 来制备5μl gRNA溶液。将含有100pmolCas9的另一5μl溶液缓慢添加 至该gRNA溶液，并在与靶细胞混合之前于室温下温育超过10分钟。
来源于患者的CD34+HSPC的分离和培养。将来自具有CD41/42 突变的患者的冷冻保存的动员外周血PBMC用于HSPC分离和培养。
来源于患者的CD34+HSPC中的HBB编辑。为编辑来源于患者 的HSPC，在用Cas9mRNA或Cas9 RNP进行电穿孔前两天如前所述分 离并培养HSPC。将100,000个HSPC沉淀并重悬于20μl Lonza P3溶液 中，并与10ul Cas9 RNP和1ul 100uM ssODN模板，或相同摩尔的Cas9 mRNA、gRNA和1ul 100uM ssODN模板混合。对该混合物进行电穿孔、 基因型分型并用于红系分化。
经编辑的细胞的基因型分型。用HDR特异性正向引物和通用反向 引物进行HDR特异性PCR，HDR-F：CCCAGAGGTTCTTCGAATCC (SEQ ID NO.:10)；通用-R：TCATTCGTCTGTTTCCCATTC(SEQ ID NO.:11)。还利用BstBI(NEB,R0519)限制性消化来评估HDR介导 的编辑：首先扩增CD41/42突变附近的区域，然后用BstBI消化以供HDR 编辑的突变。还通过小液滴数字PCR(ddPCR,QX200,Bio-Rad Laboratories,Inc.)评估了CD41/42突变的HDR介导的编辑，HBB-F： CTGCCTATTGGTCTATTTTCC(SEQ ID NO.:12)；HBB-R：ACTCAGTGTGGCAAAGGTG(SEQ ID NO.:13)；探针-供体： 6-FAM/CCCAGAGGTTCTTCGAATCCTTTG/BHQ1(SEQ ID NO.:14)； 探针-突变：HEX/CTTGGACCC AGAGGTTGAGTCC/BHQ1(SEQ ID NO.:15)。
流式细胞术。在LSR细胞分析仪(BD Biosciences)上分析了分 离和电穿孔后的HSPC的纯度和谱系。
靶向深度测序。采用CRISPR Design Tool搜索了前12个预测的脱 靶位点。从HSPCDNA扩增中靶区和潜在的脱靶区并用于文库构建。用 于扩增基因组区的引物如下列出：HBB-F： TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTGCCTATTGGT CTATTTTCC(SEQ ID NO.:16)；HBB-R： GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACTCAGTGTGG CAAAGGTG(SEQ ID NO.:17)。接下来，采用Ampure珠(Beckman Coulter)纯化来自第一步的PCR扩增子，然后使其经受第二轮PCR以 附接样品特异性条形码。将纯化的PCR产物等比例集中以供采用 IlluminaMiSeq进行配对末端测序。将原始读取映射至小鼠参考基因组mm9。如前所述分析高质量读取(评分>30)的插入和缺失(插入/缺失) 事件以及最大似然估计(MLE)计算。由于对插入/缺失的新一代测序分 析不能检测大小较大的缺失和插入事件，因此以上示出的CRISPR-Cas9 靶向效率和活性被低估。
实施例5.用于体内视网膜变性的不依赖同源性的靶向整合(HITI)基因替代疗法
皇家外科医学院(Royal College of Surgeons，RCS)大鼠是广泛 采用的遗传性视网膜变性的动物模型，该遗传性视网膜变性被称为色素 性视网膜炎，是人类失明的常见原因。Mertk基因中的纯合突变具有从 内含子1至外显子2的1.9kb缺失，其导致视网膜色素上皮(RPE)的 吞噬功能缺陷，随之发生RPE和覆盖的光感受器的变性以及失明(图 7A)。可通过形态学和经由视网膜电描记术(ERG)的视觉功能测试来 评估RCS大鼠的视网膜变性。在RCS大鼠中，光感受器外核层(ONL) 变性中的形态变化早在出生后第16天(P16)发生。为了恢复眼睛中 Mertk基因的视网膜功能，生成了可经由HITI(AAV-rMertk-HITI)将 Mertk的外显子2的功能性拷贝复制至内含子1中的AAV载体。为了对 比，还生成了用于恢复缺失的1.9bp区(AAV-rMertk-HDR)的HDR AAV 载体(图7B)。在出生后3周时将AAV注射到大鼠眼睛中，并在7-8 周时进行分析(图7C)。从DNA分析检测到AAV注射的眼睛中正确 的DNA敲入(图7D和图8)。与未治疗的对照和HDR-AAV对照相比， HITI-AAV注射导致Mertk mRNA表达水平的显著提高和ONL厚度的更 好保留(图7E和7F)。H&E染色确认了所注射的眼睛中光感受器ONL 的增加。相反，未治疗的和HDR-AAV治疗的眼睛在ONL中仅具有一 至两个或稀疏分布的感光细胞体。还在HITI-AAV中观察到MERTK蛋 白表达，但未在HDR-AAV注射的眼睛中观察到(图7G)。为确定该 治疗对视网膜的生理学功能的影响，在注射后4周(P50)测试ERG响 应以测量视杆和视锥功能的电活动(10Hz闪烁)。简言之，用1％局部 托吡卡胺对深度麻醉的小鼠的眼睛进行散瞳。在每个角膜上放置一个活 性晶状体电极，在尾巴中皮下放置接地针状电极，并在大致眼睛之间在 头部皮下放置参比电极。用Ganzfeld碗中的氙灯递送光刺激，并用来自Diagnosys的软件处理结果。如所发表的那样进行明视ERG：在30cd/m2的背景光中光适应10分钟后，在10cd/m2的低背景光下用34cd/m2的闪 光激发视锥响应，并对50次扫描的信号取平均值。所有用HITI-AAV 治疗的眼睛都展现出显著改善的ERG b波响应(图7H)。类似地，衡 量视锥响应的10Hz闪烁值显著提高，并且是未治疗眼睛的该值的超过 4倍。这些结果表明，AAV-HITI治疗能够在RCS大鼠模型中救治并保 留视网膜视觉功能。
实施例6.腹膜内注射编码靶向结肠癌细胞的Cas9/CRISPR系统的AAV
将编码Cas 9和两种指导RNA的一种或多种病毒腹膜内注射至患 有结肠癌的受试者中，该指导RNA靶向携带驱动结肠癌的突变的基因。 该基因为APC。或者，该基因为MYH1、MYH2、MYH3、MLH1、MSH2、 MSH6、PMS2、EPCAM、POLE1、POLD1、NTHL1、BMPR1A、SMAD4、 PTEN或STK11。四周后获得结肠活检，并将其与在用该病毒治疗之前 从该受试者获得的结肠活检进行比较。与在治疗前获得的活检样品相比， 在治疗后获得的活检样品中结肠癌细胞的数目更少且小肠细胞更多。结 论是结肠癌细胞已被重编程成良性小肠细胞。
实施例7.静脉内注射编码靶向淋巴瘤细胞的Cas9/CRISPR系统的AAV
将编码Cas 9和两种指导RNA的一种或多种病毒静脉内注射至患 有B细胞淋巴瘤的受试者中，该指导RNA靶向携带驱动B细胞淋巴瘤 的突变的基因。该基因为C-MYC。或者，该基因为CCND1、BCL2、 BCL6、TP53、CDKN2A或CD19。四周后获得血液样品，并将其与在 用该病毒治疗之前从该受试者获得的血液样品进行比较。与在治疗前获 得的血液样品相比，在治疗后获得的血液样品中B细胞的数目更少且巨 噬细胞更多。结论是B细胞淋巴瘤细胞已被重编程成良性巨噬细胞。
实施例8.静脉内注射编码靶向T细胞的Cas9/CRISPR系统的AAV以用于免疫疗法
将编码Cas 9和两种指导RNA的一种或多种病毒静脉内注射至转 移性黑素瘤患者中，该指导RNA靶向PD-1和/或PD-L1检查点抑制剂 编码基因。或者，该患者患有另一种癌症，如转移性卵巢癌、转移性肾 细胞癌或转移性非小细胞肺癌。T细胞被该病毒感染并且PD-1编码基因 被灭活，使得T细胞数目和应答最大化。表达PD-L1的患者的癌细胞也 被感染并且PD-L1同样被灭活，从而减少T细胞激活和细胞因子产生的 PD-L1抑制，该PD-L1抑制在正常情况下为癌细胞提供免疫逃逸。
实施例9.分裂Cas9递送平台
如下进行视网膜中NRL的CRISPR/Cas9介导的靶向灭活以在体 内实现视杆至视锥的重编程。由于腺伴随病毒温和的免疫应答、长期的 转基因表达和良好的安全性特性，因此选择该病毒用于基因转移。为了 克服该病毒有限的包装能力，使用分裂Cas9系统。使用分裂-内含肽 (intein)将酿脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白分裂为两部分。每个SpCas9 部分均与其相应的分裂-内含肽部分相融合。共表达后，重构完整的 SpCas9蛋白。通过以该方式利用两个AAV载体(参见图9)，每个载 体的残余包装能力均适应广泛的基因组工程功能性，包括经由单gRNA 或双gRNA递送的多重靶向以及用于原位疗法的AAV-CRISPR-Cas9介 导的靶向体内基因阻抑。
实施例10.使用一个或两个gRNA的双载体递送的有效性
评估了双AAV载体方法对Cas9和靶向NRL的gRNA的递送。 设计了具有一个或两个靶向NRL的gRNA的构建体，以便确定通过两 个gRNA靶向相同基因的两个位点是否比采用单个gRNA具有更高的靶 向效率。靶序列示于10A中，其中PAM序列加下划线表示。此外，为 了避免AAV中的重复序列损害载体稳定性和病毒滴度，使用人U6启动 子和小鼠U6启动子来独立地驱动每个gRNA。采用了额外的非同源 tracrRNA。使用标准T7内切核酸酶1对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 中的基因编辑率进行定量。用分裂Cas9-Nrl载体共转染MEF，并使用基因组DNA进行T7E1试验(图10B)。箭头指示由基因组编辑引起的、 由对异源双链DNA特异的T7E1酶产生的切割的DNA。从切割带强度 与总带强度的比例计算突变频率。用双gRNA靶向策略对基因靶向效率 的改善优于单gRNA方法。
实施例11.KRAB转录阻抑物在双载体系统中的纳入
通过使用KRAB转录阻抑物实现了转录干扰。基于实施例10中 所述的双AAV载体系统，通过将KRAB阻抑物域与Cas9蛋白序列的N 末端融合，将KRAB转录阻抑物并入分裂Cas9系统(图11)。这为基 因疗法创造了无疤痕和潜在可逆的方法，其中诱变的风险由于Cas9核酸 酶活性的灭活而最小化。
实施例12.野生型和NRL-GFP小鼠中视杆至视锥的细胞重编程
在出生后第7天(p7)将靶向NRL的AAV-gRNA/Cas9或 AAV-gRNA/KRAB-dCas9注射至野生型小鼠的视网膜下空间，并在P30 时将其处死用于组织学分析(图12A)。评估了AAV2衣壳和酪氨酸突 变体Y444F的转导效率。Y444F突变体载体显示出相比于AA2增强的 视网膜转导，并在后续研究中使用。将视网膜骤冻、切片并针对包括视 锥抑制蛋白(mCAR)和中等波长视蛋白(M-视蛋白)在内的视锥标志 物进行染色。如染色切片和细胞测定所示(图12B-D)，用Cas9-gRNA 观察到重编程的光感受器表型。与野生型对照相比，在ONL中显示出 视锥特异性表达。使用定量RT-PCR(qRT-PCR)来测量重编程视网膜 和对照中视杆或视锥基因的相对表达水平。视杆特异性基因发生下调， 伴随着视锥特异性基因的上调(图12E)。
向转基因NRL-GFP小鼠(其中所有视杆感光细胞都被标记)视网 膜下注射所述的AAV-NRL gRNA/Cas9(图12F)。观察到mCAR阳性 细胞数目的显著增加和Nrl-GFP+视杆光感受器的伴随性减少(图12G和 12H)。在内核层的内部注意到许多形态上类似于视锥的细胞，使人联 想到野生型视网膜中的水平细胞(HC)(图12I)。另外，检测到这些 细胞同时表达视锥标志物m-CAR和HC标志物钙结合蛋白(图12J)， 表明水平细胞也保持着经历视锥样细胞重编程的潜力。结论是视杆已被 重编程为视锥样细胞。
实施例13
靶向rd10小鼠中的NRL，该小鼠为常染色体隐性RP的模型。这 些rd10小鼠携带视杆磷酸二酯酶基因的自发突变，并在P18前后开始展 现出快速的视杆变性。到P60时，视杆不再可见，伴有视锥光感受器变 性。为评估视杆向视锥的转化是否足以逆转视网膜变性并救治视觉功能， 在P7时将AAV-gRNA/Cas9或AAV-gRNA/KRAB-dCas9注射至rd10小 鼠中。通过测量视网膜电描记术(ERG)反应和视动性眼球震颤(OKN) 来确定这样的治疗对视锥生理功能和视敏度的影响，从而对注射后6周 (P60)的视锥光感受器活性(明视反应)和视敏度进行定量(图13A)。 简言之，通过用围绕放置测试动物的平台的四台计算机监视器创建虚拟 现实室来测量OKN。在使动物适应测试条件之后，将覆盖有垂直正弦波 光栅的虚拟圆柱体投影到监视器上。该虚拟条纹圆柱体的对比度被设置 在最高水平(100％，黑色0，白色255，从250cd/m2以上照射)，条纹 数目从每屏幕4个(2个黑色和2个白色)开始。测试以在13的速度下 顺时针旋转1分钟的方式开始，随后逆时针旋转1分钟。位于动物上方 的摄像机允许无偏见的观察者跟踪并记录头部运动。数据被测量为周期/ 度(c/d)，并表示为平均值±S.D.，使用t检验统计分析进行比较。p值 <0.05被认为是统计上显著的。用AAV-gRNA/Cas9或KRAB-dCas9处 理的所有眼睛都具有改善的视锥功能和视觉功能，如明视b波值和敏度 的显著改善所示(图13B-C)。此外，在对AAV-NRL gRNA/Cas9或 KRAB-dCas9处理的rd10视网膜的组织学分析中观察到许多mCAR阳 性细胞和M-视蛋白阳性细胞(图13D-G)，这与视觉功能改善的发现 一致。未处理的眼睛在ONL中只有稀疏分布的感光细胞细胞核，而 AAV-gRNA/Cas9或AAV-gRNA/KRAB-dCas9处理的眼睛具有3-5层 ONL(图13D)，表明该处理防止了光感受器变性并保留ONL。
实施例14.晚期/末期疾病中视锥样细胞的产生
在P60时将AAV-gRNA/Cas9或AAV-gRNA/KRAB-dCas9经视网 膜下注射至不存在活的光感受器且ERG不可记录的rd10小鼠中(图 14A)。如明视b波值和视敏度的显著改善以及视锥mCAR阳性细胞数 目的伴随增加所示(图14B-C)，用AAV-gRNA/Cas9或 AAV-gRNA/KRAB-dCas9处理的所有眼睛都具有改善的视锥功能和视 觉功能。在新生和成年rd10小鼠中，在用AAV-gRNA/Cas9或AAV-gRNA/KRAB-dCas9处理的所有眼睛中，都观察到在很大一部分视锥视蛋白+细胞中共定位的钙结合蛋白表达(图14D)。结论是中间神经 元至视锥的重编程可应用于视杆和视锥光感受器已经基本变性和丧失的 晚期/末期RP的基因治疗。
实施例15.在3个月龄的FvB视网膜变性小鼠中恢复视网膜功能
具有编码cGMP磷酸二酯酶(PDE)B亚基的Pde6brd1纯合突变 的FVB/N小鼠显示出可遗传的常染色体隐性视网膜变性，其特征在于视 杆光感受器的快速初始丧失以及到p35时的后续视锥光感受器丧失。在 P60时向这样的小鼠视网膜下注射AAV-gRNA/KRAB-dCAS9(图15A)。 如先前的实施例一样地进行组织学分析。AAV-gRNA/KRAB-dCAS9处 理的视网膜显示出mCAR+细胞的出现以及显著改善的明视b波值和视 敏度，显示视觉功能改善(图15B-C)。结论是本文所述的CRISPR/Cas-9 介导的细胞重编程是不依赖于基因和突变的疗法。
序列表
<110> 优美佳生物技术有限公司
加利福尼亚大学董事会
<120> 用于细胞重编程的方法和组合物
<130> 49697-713
<140>
<141>
<150> 62/479,167
<151> 2017-03-30
<150> 62/417,194
<151> 2016-11-03
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 1
gagccttctg agggccgatc tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 2
gtatggtgtg gagcccaacg agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 3
ggcctggcac tgattgcgat ggg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 4
aggcctggca ctgattgcga tgg 23
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成标签
<400> 5
His His His His His His
1 5
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 6
ggctgctggt ggtctaccct tgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 7
ggtagaccac cagcagccta agg 23
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 8
taatacgact cactataggg acccagaggt tgagtcctt 39
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 9
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 10
cccagaggtt cttcgaatcc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 11
tcattcgtct gtttcccatt c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 12
ctgcctattg gtctattttc c 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 13
actcagtgtg gcaaaggtg 19
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探针
<400> 14
cccagaggtt cttcgaatcc tttg 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探针
<400> 15
cttggaccca gaggttgagt cc 22
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 16
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagctgccta ttggtctatt ttcc 54
<210> 17
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 17
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagactcag tgtggcaaag gtg 53
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 18
tccctgtatt cagaacaagg ggg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：靶序列
<400> 19
agtcactgtc agaaccagaa agg 23

Claims (28)

1.一种将细胞从第一细胞类型重编程成第二细胞类型的方法，其包括使所述细胞接触：
a)与基因的靶位点杂交的指导RNA，其中所述基因编码有助于所述细胞的细胞类型特异性功能的蛋白质；以及
b)Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的多核苷酸，其中所述Cas核酸酶在所述靶位点处切割所述基因的链，
其中切割所述链改变所述基因的表达，使得所述细胞不能再执行所述细胞类型特异性功能，从而将所述细胞重编程成所述第二细胞类型。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述基因包含在所述第一细胞类型中导致不利影响的突变，其中所述不利影响选自衰老、凋亡、缺乏分化和异常细胞增殖。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述基因编码转录因子。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为胰腺、心脏、脑、眼、肠、结肠、肌肉、神经系统、前列腺或乳腺的细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为有丝分裂后的细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为眼细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述眼细胞为视网膜细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述视网膜细胞为视杆。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞类型特异性功能为夜间视觉或颜色视觉。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述基因选自NRL、NR2E3、GNAT1、RORβ、OTX2、CRX和THRB。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞类型为视杆并且所述第二细胞类型为视锥。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为癌细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞类型特异性功能选自异常细胞增殖、转移和肿瘤血管化。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述第一细胞类型为结肠癌细胞，并且所述第二细胞类型为良性肠细胞或良性结肠细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述基因选自APC、MYH1、MYH2、MYH3、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、POLE1、POLD1、NTHL1、BMPR1A、SMAD4、PTEN和STK11。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述第一细胞类型为恶性B细胞，并且所述第二细胞类型为良性巨噬细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述基因选自C-MYC、CCND1、BCL2、BCL6、TP53、CDKN2A和CD19。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为神经元。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一细胞类型产生选自淀粉样蛋白β、tau蛋白及其组合的至少一种蛋白质，并且所述第二细胞类型不产生所述蛋白质，或者相比于所述第一细胞类型产生较少的所述蛋白质。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述第一细胞类型为神经元，并且所述第二细胞类型为神经胶质细胞。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述基因选自APP和MAPT。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述第一细胞类型产生α突触核蛋白。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述第一细胞类型为神经胶质细胞，并且所述第二细胞类型为产生多巴胺的神经元。
24.如权利要求18所述的方法，其中所述基因选自SNCA、LRRK2、PARK2、PARK7和PINK1。
25.如权利要求18所述的方法，其中所述基因为α突触核蛋白(SNCA)。
26.如权利要求18所述的方法，其中所述第二细胞类型选自多巴胺能神经元和多巴胺能祖细胞。
27.如权利要求18所述的方法，其中所述第一细胞类型为非多巴胺能神经元或神经胶质细胞。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA和Cas核酸酶、或编码所述Cas核酸酶的多核苷酸存在于递送媒介物中，其中所述递送媒介物选自病毒载体、脂质体和核糖核蛋白。
CN201711070319.1A 2016-11-03 2017-11-03 用于细胞重编程的方法和组合物 Pending CN108018314A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662417194P 2016-11-03 2016-11-03
US62/417,194 2016-11-03
US201762479167P 2017-03-30 2017-03-30
US62/479,167 2017-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108018314A true CN108018314A (zh) 2018-05-11

Family

ID=62021117

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780082185.7A Pending CN110139654A (zh) 2016-11-03 2017-11-03 用于细胞重编程的方法和组合物
CN201711070319.1A Pending CN108018314A (zh) 2016-11-03 2017-11-03 用于细胞重编程的方法和组合物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780082185.7A Pending CN110139654A (zh) 2016-11-03 2017-11-03 用于细胞重编程的方法和组合物

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20180119122A1 (zh)
EP (1) EP3534911A4 (zh)
JP (1) JP2021511776A (zh)
CN (2) CN110139654A (zh)
AU (1) AU2017355481A1 (zh)
BR (1) BR112019009116A2 (zh)
CA (1) CA3042691A1 (zh)
HK (1) HK1254984A1 (zh)
WO (1) WO2018085644A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114848795A (zh) * 2021-02-03 2022-08-05 四川大学 RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190381157A1 (en) * 2017-01-29 2019-12-19 Zequn Tang Methods of immune modulation against foreign and/or auto antigens
CN111885915B (zh) 2018-03-19 2023-04-28 瑞泽恩制药公司 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制
CN112654710A (zh) 2018-05-16 2021-04-13 辛瑟高公司 用于指导rna设计和使用的方法和系统
WO2020205664A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Youhealth Biotech, Limited Compositions and methods for cellular reprogramming to rescue visual function
WO2020209800A2 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 Agency For Science, Technology And Research A method of altering a differentiation status of a cell
CN112741906B (zh) * 2019-10-31 2022-07-05 华东师范大学 一种用于治疗b型血友病的产品
CN111235130B (zh) * 2019-11-15 2022-11-25 武汉大学 II类V型CRISPR蛋白CeCas12a及其在基因编辑的应用
CN115414499A (zh) * 2022-09-21 2022-12-02 天津大学 一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015080758A1 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Al-Qahtani Ahmed H Method and composition for the treatment of moderate to severe keratoconjunctivitis sicca
WO2015148860A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
CN106061510A (zh) * 2013-12-12 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr‑cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6730821B2 (en) * 2000-03-16 2004-05-04 Deltagen, Inc. Transgenic mice containing retina-specific nuclear receptor gene disruptions
US6863796B2 (en) * 2002-07-02 2005-03-08 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd Method for reducing cu surface defects following cu ECP
US20100196889A1 (en) * 2006-11-13 2010-08-05 Bankaitis-Davis Danute M Gene Expression Profiling for Identification, Monitoring and Treatment of Colorectal Cancer
WO2010135917A1 (zh) * 2009-05-26 2010-12-02 厦门大学 一种检测核酸序列变异的方法
WO2014134627A1 (en) * 2013-03-01 2014-09-04 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Methods for modulating development and function of photoreceptors cells
ES2883131T3 (es) * 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
US20160237455A1 (en) * 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
WO2015134812A1 (en) * 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
EP3553176A1 (en) * 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
WO2015164378A1 (en) * 2014-04-22 2015-10-29 Q-State Biosciences, Inc. Analysis of compounds for pain and sensory disorders
EP3289080B1 (en) * 2015-04-30 2021-08-25 The Trustees of Columbia University in the City of New York Gene therapy for autosomal dominant diseases
EP3347469A4 (en) * 2015-09-10 2019-02-27 Youhealth Biotech, Limited METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING GLAUCOMA
CN105567718B (zh) * 2016-01-22 2021-11-09 东华大学 一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015080758A1 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Al-Qahtani Ahmed H Method and composition for the treatment of moderate to severe keratoconjunctivitis sicca
CN106061510A (zh) * 2013-12-12 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr‑cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
WO2015148860A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114848795A (zh) * 2021-02-03 2022-08-05 四川大学 RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用
CN114848795B (zh) * 2021-02-03 2023-04-14 四川大学 RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3534911A4 (en) 2020-06-17
WO2018085644A1 (en) 2018-05-11
CN110139654A (zh) 2019-08-16
AU2017355481A1 (en) 2019-05-23
BR112019009116A2 (pt) 2019-10-15
US20180119122A1 (en) 2018-05-03
US20220033792A1 (en) 2022-02-03
CA3042691A1 (en) 2018-05-11
JP2021511776A (ja) 2021-05-13
EP3534911A1 (en) 2019-09-11
HK1254984A1 (zh) 2019-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108018314A (zh) 用于细胞重编程的方法和组合物
US11135247B2 (en) Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
CN108291224A (zh) 用于治疗青光眼的方法和组合物
JP2023030067A (ja) Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法
KR102596302B1 (ko) 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
JP7275043B2 (ja) 増大したｈＡＴファミリートランスポゾン媒介遺伝子導入ならびに関連する組成物、システムおよび方法
CN109715198A (zh) 用于治疗血红蛋白病的材料和方法
JP2021505187A (ja) 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物
BR112020008654A2 (pt) composições casz e métodos de uso
KR20200066616A (ko) 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물
CN109328231A (zh) 用于治疗1a型糖原贮积病的材料和方法
CN108463211A (zh) 用于治疗肌联蛋白类肌病和其它肌联蛋白病变的材料和方法
CN109996880A (zh) 基于模块化aav递送系统的crispr-cas基因组工程
CN109715801A (zh) 用于治疗α1抗胰蛋白酶缺乏的材料和方法
US11760983B2 (en) Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
JP7480062B2 (ja) ラパマイシン耐性細胞
US11278570B2 (en) Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
CN110214149A (zh) 用于治疗疼痛相关病症的材料和方法
Martinez Velazquez et al. The next generation of molecular and cellular therapeutics for inherited retinal disease
TW201918556A (zh) 用於細胞重編程之方法及組合物
WO2020205664A1 (en) Compositions and methods for cellular reprogramming to rescue visual function

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1254984

Country of ref document: HK

RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180511

RJ01 Rejection of invention patent application after publication