CN114848795B - RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，涉及抗衰老药物，具体涉及RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用。激活RORa促进衰老细胞的DNA修复，而减少衰老造成的DNA损伤；并且通过激活RORa恢复血液干细胞的细胞极性，逆转细胞衰老表型。本方案中，通过激活RORa来实现的抗衰效果，其作用及机制明确。本方案主要应用包括胆固醇硫酸酯盐在内的RORa蛋白激动剂来激活RORa蛋白，胆固醇硫酸酯盐成分简单、作用机制明确、安全有效，克服了现有技术中植物提取物或中药复方提取物等抗衰老药物的缺陷，具有良好应用前景。

Description

RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，涉及抗衰老药物，具体涉及RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用。
背景技术
机体衰老一直是生物学研究的热点。衰老是生物有机体或器官等功能持续性减退过程。衰老是个持续渐进的过程，表现在分子，细胞，组织和机体水平上功能逐渐变弱或丧失。在生物体生命周期的后期，随着年龄的增长生物衰老会导致生殖能力的降低和死亡率的增加。衰老是所有多细胞生物由生殖细胞向体细胞分化发育的必然结果。机体衰老与细胞衰老相辅相成。细胞衰老表现为永久性细胞周期停滞，细胞器积累性受损，需要更长的时间对应激做出应答等。
现有技术中，对抗衰老以及相关药物的研究并没有从细胞衰老机理着手，而是倾向于使用一些植物提取物或中药复方提取物从生物体的衰老表现上进行抗衰来研究。中国专利CN102688178B记载了油菜蜂花粉提取物在抗衰老护肤方面有效，中国专利CN102258442B记载了一种复方中药提取物在抗衰老方面的疗效。但是，植物提取物或中药复方提取物成份复杂，其分子机制无法充分阐释清楚，导致类似药物的功效和安全性受质疑。
发明内容
本发明意在提供RORa蛋白及其激动剂在制备抗衰老药物中的应用，用以解决现有抗衰靶点缺乏、抗衰老药物成分复杂且其功效和安全性存疑的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
RORa蛋白在制备抗衰老药物中的应用，所述RORa蛋白处于激活状态。
本方案的原理及优点是：
本方案从揭示血液干细胞衰老机制入手，鉴定出激活RORa蛋白是一条有效逆转血液干细胞衰老表型的途径。通过激活RORa蛋白可以逆转生物体细胞的活性状态，引起细胞亚群的改变，降低细胞的DNA损伤，延缓衰老过程，效果显著。其中，RORa蛋白为维甲酸相关的孤儿受体a(RAR-relatedorphan receptor a，RORa)，作为胞内转录因子且属于核受体亚家族，RORa蛋白处于激活状态具体是Rora蛋白量上有提高，并有更多的核定位以及RORa蛋白的下游调控基因激活。
衰老(aging)是生物随着时间的推移,自发的必然过程,它是复杂的自然现象,表现为结构的退行性改变和机能的衰退,适应性和抵抗力减退。鉴于机体衰老的复杂性，直接研究机体衰老机制以目前的技术手段难以深入阐明。因此从研究器官衰老切入是务实可行的途径。血液系统因其独特优势，如，衰老表型明确且易于检测，样本容易获得及操作，是研究器官衰老的优选器官。细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生物体衰老基本单位，细胞衰老最终会导致整个生物体的衰老。细胞衰老(senescence)是指细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。细胞衰老在形态学上表现为细胞结构的退行性改变(如核膜崩解、染色质结构变化、DNA损伤和细胞去极性化等)；细胞衰老在生理学上的表现为功能衰退与代谢低下(如细胞周期停滞、酶活性降低等)。随着细胞衰老的过程，细胞极性逐渐丧失、DNA损伤逐步积累。
在本方案中，发明人通过对比研究年轻和老年血液干细胞的基因表达谱差异，首次发现RORa参与血液干细胞衰老，具体的表现为，年老小鼠血液干细胞较年轻小鼠血液干细胞中RORa蛋白量降低，DNA损伤增加，细胞极性标志分子Cdc42和微管蛋白以去极化方式分布于胞内(参见图18)【注：其中，Cdc42(细胞分裂周期蛋白42)和微管蛋白(Tublin)是细胞极性的重要标记，并且抑制Cdc42活性可抑制细胞的衰老进程(Cdc42 ActivityRegulates Hematopoietic Stem Cell Aging and Rejuvenation，Maria CarolinaFlorian，Cell Stem Cell 10,520–530,May 4,2012)】。
发明人通过使用RORa蛋白激动剂(包括但不限于胆固醇硫酸酯盐)来激活RORa，能够逆转血液干细胞(HSCs)的衰老表型。具体表现为：激活RORa可促进DNA修复过程而减少由于衰老造成的DNA损伤，并且可以维持和恢复细胞极性，细胞极性恢复表现为Cdc42和微管蛋白在HSCs中以重新呈极化方式分布(参见图1和图2)。相反，在年轻小鼠的血液干细胞中敲除RORa导致年轻小鼠的血液干细胞呈现衰老表型(参见图24-37)。随着小鼠年龄增加，细胞极性表型逐渐丧失，且DNA损伤增加，表现为Cdc42和微管蛋白以无极化方式分布在整个细胞体内(参见图1-图4)。
本方案经过大量实验研究，从小鼠血液干细胞功能损伤、衰老相关表型的调控机制以及DNA损伤修复机制出发，利用如免疫荧光检测和彗星电泳检测等现有技术中的成熟手段，证明了激活RORa对逆转小鼠血液干细胞衰老有显著效果。本方案基于靶点新功能发现和化合物的转化应用，作用机制明确，基于靶点开发药物将克服了现有技术中植物提取物或中药复方提取物的抗衰老药物的缺陷，为开发成分简单、作用机制明确、安全有效且具有良好应用前景的抗衰老药物提供可能。
进一步，所述抗衰老药物用于逆转血液干细胞的衰老状态。
采用上述技术方案，通过激活RORa可以改变细胞的衰老表型，从血液干细胞层面实现抗衰老。血液系统是人体重要组织器官，随着年龄的增长，血液系统和免疫系统功能变弱。组织干细胞对组织器官的再生和修复具有显著的意义，衰老过程中，血液干细胞(造血干细胞，HSCs)细胞数量和活性持续下降，逐渐丧失自我更新和分化的潜能，导致血液细胞再生能力和功能降低，同时免疫力也显著降低。血液系统的衰老同时伴随着免疫功能的衰退，已有的数据表明，人类很多疾病，如贫血，感染，肿瘤等，与血液系统(含免疫系统)的衰老密切相关。作为血液系统的核心，HSCs衰老在该系统功能减退中起到关键作用。
进一步，逆转血液干细胞的衰老状态包括维持细胞极性。
采用上述技术方案，激活RORa可以实现对细胞衰老的缓解，表现为细胞的极性恢复。本方案通过胆固醇硫酸酯盐(不限于)激活RORa，恢复HSCs极性状态，表现为Cdc42和微管蛋白的极性分布。
进一步，逆转血液干细胞的衰老状态包括修复DNA损伤。
采用上述技术方案，激活RORa对细胞衰老造成的的DNA损伤具有良好的修复作用。发明人利用免疫荧光技术以γH2AX作为DNA损伤的相关指标，并利用碱性彗星实验对橄榄矩和尾巴DNA百分比统计分析衰老细胞中DNA断裂的情况。实验数据显示，腹腔注射了胆固醇硫酸盐激活RORa后，小鼠的DNA损伤修复能力更强。其中，DNA损伤具体是指慢性DNA损伤，慢性DNA损伤是指在生物体衰老的过程中，细胞中逐步累积的DNA损伤，包括DNA单链断裂、DNA双链断裂、碱基缺失以及碱基替换等。
进一步，维持细胞极性包括维持和/或恢复细胞分裂周期蛋白42和微管蛋白在细胞中的极性分布状态。
采用上述技术方案，Cdc42(细胞分裂周期蛋白42)和微管蛋白(Tublin)是细胞极性的重要标记，并且抑制Cdc42活性可抑制细胞的衰老进程。
进一步，RORa蛋白激动剂在制备抗衰老药物中的应用。
采用上述技术方案，通过使用RORa蛋白激动剂的方法来对激活RORa蛋白，从而启动相应的下游通路，实现抗衰老目的。RORa蛋白激动剂包括具有激活RORa蛋白功能而设计合成的小分子化合物及天然产物。RORa蛋白激动剂以RORa蛋白为作用靶点，进而改善或逆转生物体、器官以及细胞(例如HSCs)的衰老进程。本方案解决了现有抗衰老靶点缺乏以及衰老药物成分复杂且其功效和安全性存疑的技术问题。通过RORa蛋白激动剂激活RORa是延缓或逆转血液干细胞衰老的核心机制，这也是发明人经过长期研究首次发现和报道。其中，RORa蛋白激动剂是指一切用于激活RORa蛋白的物质。
进一步，所述RORa蛋白激动剂包括胆固醇硫酸酯及其盐。
采用上述技术方案，通过使用胆固醇硫酸酯及其盐激活RORa，可有效逆转了血液干细胞衰老表型。胆固醇硫酸酯及其盐是一种成分简单、作用机制明确且安全有效的抗衰老药物。方案中使用胆固醇硫酸盐，实验数据表明可以逆转生物体细胞的活性状态，引起的细胞亚群的改变，降低细胞的DNA损伤，延缓衰老过程，效果显著，且安全可靠。胆固醇硫酸酯及其盐是胆固醇硫酸酯类化合物，是人体血浆中已知的最重要的甾醇硫酸酯(盐)之一，胆固醇硫酸酯类化合物是一种重要的调节分子。胆固醇硫酸酯类化合物是细胞膜的一种成分，它具有稳定作用，例如，保护红细胞免受渗透溶解和调节精子获能；胆固醇硫酸酯类化合物可以调节丝氨酸蛋白酶的活性(例如参与凝血、纤溶和表皮细胞粘附的酶)。但是，胆固醇硫酸酯类化合物作为RORa激动剂的抗衰老作用是发明人首次发现，发明人进而分析了胆固醇硫酸酯类化合物在延缓衰老方面的机制：胆固醇硫酸酯类化合物是维甲酸相关的孤儿受体a(RORa)的天然配体，胆固醇硫酸酯类化合物可通过RORa启动下游的DNA修复通路和细胞极性维持通路。
本方案中的胆固醇硫酸酯类化合物包括胆固醇硫酸酯及其盐，描述如下，胆固醇硫酸酯(CAS：1256-86-6)，是胆固醇磺化后的产物。磺化是胆固醇及其衍生物、胆汁酸、维生素D和类固醇的重要修饰方式，通常小分子的磺化被认为与该分子的代谢以及生物转化有关，但是，发明人通过大量研究发现胆固醇磺化后形成的胆固醇硫酸酯具有逆转血液干细胞衰老的功能，而上述功效是现有技术中未曾发现和报道。除了胆固醇硫酸酯本身，其盐形式也具有相应功效(例如胆固醇硫酸酯钠盐，CAS：2864-50-8)，也可以用于延缓或逆转血液干细胞衰老表型的功能。
进一步，所述RORa蛋白激动剂对小鼠的给药方式为腹腔注射。
采用上述技术方案，通过腹腔注射对小鼠进行给药，药物可快速作用于小鼠，实现其对DNA损伤修复的促进作用以及对细胞衰老的逆转作用。
进一步，将所述RORa蛋白激动剂配制成注射剂，所述注射剂包括RORa蛋白激动剂、吐温80和磷酸盐缓冲液。
采用上述技术方案，吐温80和磷酸盐缓冲液是现有技术中常用的助剂，有助于胆固醇硫酸盐在注射剂中的充分分散和乳化，进而提高胆固醇硫酸盐生物利用度。
进一步，所述RORa蛋白激动剂的单次给药剂量为25mg/kg·bw；所述RORa蛋白激动剂的给药频率为每12h给药一次，并持续14天。
采用上述技术方案，25mg/kg·bw的单次给药剂量既能保证药物会对动物体产生DNA损伤修复促进作用，同时不会影其药物对动物体的毒性作用。多次给药分批次多次给药，既能保证小鼠接受到足够的药物剂量，又能保证药物不会由于剂量过大而引起毒性作用，还可保证实验动物的血药浓度在较长时间段内处于较高水平，从而保证了药效的发挥。
附图说明
图1展示了实验例1的Cdc42的荧光免疫检测的显微图片(1龄小鼠)。
图2展示了实验例1的Cdc42的荧光免疫检测的显微图片(2龄小鼠)。
图3展示了实验例1的微管蛋白的荧光免疫检测的显微图片(2龄小鼠)。
图4展示了实验例1的微管蛋白的荧光免疫检测的显微图片(2龄小鼠)。
图5展示了实验例1的极性的HSCs的统计柱状图(1龄小鼠)。
图6展示了实验例1的极性的HSCs的统计柱状图(2龄小鼠)。
图7展示了实验例1的γH2AX的荧光免疫检测的显微图片(1龄小鼠)。
图8展示了实验例1的γH2AX的荧光免疫检测的显微图片(2龄小鼠)。
图9展示了实验例1的具有代表性的HSCs的碱性彗星图(1龄小鼠)。
图10展示了实验例1的具有代表性的HSCs的碱性彗星图(1.5龄小鼠)。
图11展示了实验例1的具有代表性的HSCs的碱性彗星图(2龄小鼠)。
图12展示了实验例1的彗尾DNA百分比测量结果图(1龄小鼠)。
图13展示了实验例1的彗尾DNA百分比测量结果图(1.5龄小鼠)。
图14展示了实验例1的彗尾DNA百分比测量结果图(2龄小鼠)。
图15展示了实验例1的彗星电泳的橄榄矩统计图。
图16展示了实验例2的使用CS处理前后年轻小鼠的RORa蛋白表达情况。
图17展示了实验例2的使用CS处理前后老年小鼠的RORa蛋白表达情况。
图18展示了实验例2的老年小鼠和年轻小鼠在不使用CS处理的情况下的RORa蛋白表达情况。
图19展示了实验例3的P53蛋白免疫荧光实验结果。
图20展示了实验例3的ATM蛋白免疫荧光实验结果。
图21展示了实验例3的PARP1蛋白免疫荧光实验结果。
图22展示了实验例3的DNA修复相关基因的Hallmark分析结果。
图23展示了实验例3的P53通路相关基因的Hallmark分析结果。
图24展示了实验例4的RORa基因敲除后的微管蛋白的免疫荧光实验结果。
图25展示了实验例4的RORa基因敲除后的Cdc42的免疫荧光实验结果。
图26展示了实验例4的RORa基因敲除后的极性HSCs统计结果(微管蛋白)。
图27展示了实验例4的RORa基因敲除后的极性HSCs统计结果(Cdc42蛋白)。
图28展示了实验例4的RORa基因敲除后的γH2AX的荧光免疫实验结果。
图29展示了实验例4的RORa基因敲除后的γH2AX灶点的统计图。
图30展示了实验例4的RORa基因敲除后的γH2AX的荧光强度统计图。
图31展示了实验例4的RORa基因敲除后的具有代表性的HSCs的碱性彗星图(4周)。
图32展示了实验例4的RORa基因敲除后的具有代表性的HSCs的碱性彗星图(8周)。
图33展示了实验例4的RORa基因敲除后的具有代表性的HSCs的碱性彗星图(12周)。
图34展示了实验例4的RORa基因敲除后的彗尾DNA百分比测量结果图(4周)。
图35展示了实验例4的RORa基因敲除后的彗尾DNA百分比测量结果图(8周)。
图36展示了实验例4的RORa基因敲除后的彗尾DNA百分比测量结果图(12周)。
图37展示了实验例4的RORa基因敲除后的彗星电泳的橄榄矩统计图。
具体实施方式
实施例1：
本方案使用的胆固醇硫酸酯类化合物(Cholesteryl sulfate，简称CS)具体为胆固醇硫酸酯钠盐(CAS：2864-50-8)，分子式参见式(Ⅰ)。本方案使用的主要抗体信息如下：Cdc42抗体(Santa Cruz，RRID:AB_631213)、α-Tubulin(Cell Signaling，RRID:AB_2567774)、Cy3羊抗兔IgG(Jackson，RRID:AB_2338000)、Alexa Fluor羊抗兔IgG(Jackson，RRID:AB_2338046)、磷酸化H2AX抗体(Cell Signaling，RRID:AB_2118009)。
Figure BDA0002932407760000071
(1)CS溶液的制备：将CS溶于DMSO，制备浓度为50mg/ml的CS储液。CS工作液是将CS储液稀释为5mg/ml形成。使用CS工作液配制CS组待测试剂(注射剂)，其成分为：CS工作液100μL、吐温80 20μL和PBS 880μL(PBS即为现有技术中常规磷酸缓冲盐溶液)。并同时配制NC组对照试剂(安慰剂)，其成分为：DMSO 100μL、吐温80 20μL和PBS 880μL。
(2)实验方案：
本方案采用C57BL6小鼠进行体内实验，该小鼠品种为现有技术中常规实验用小鼠，具有品系稳定和易于繁殖的优点。野生型小鼠购买于南进大学模式动物实验中心，体重为20g-25g左右，喂养标准饲料，自由饮水，控制室温(24±2℃)，湿度为50％-60％，通风良好。每日交替进行光照与黑暗各12小时。其中，实验用小鼠包括1龄(year，±5-20天)、1.5龄(±5-20天)和2龄(±5-20天)，三个年龄段的C57BL6小鼠(在计算小鼠年龄的时候，由于无法保证实验进行时，正好是1龄、1.5龄和2龄小鼠，通常有5-20天的上下浮动时间)，具体过程如下：
实验组(CS组)：分别对1龄、1.5龄和2龄小鼠腹腔注射CS组待测试剂，剂量为每20g体重使用100μL CS组待测试剂，即每次腹腔注射剂量为25mg/kg·bw。每个年龄段小鼠数量为3只。
对照组(NC组)：分别对1龄、1.5龄和2龄小鼠腹腔注射NC组对照试剂，剂量为每20g体重使用100μL NC组对照试剂。每个年龄段小鼠数量为3只。
在实验组和对照组中，腹腔注射均进行28次(每12h注射一次，连续注射14天)。
完成上述腹腔注射操作之后，将小鼠处死，利用流式分选技术分选出小鼠HSCs(血液干细胞、造血干细胞)。首先制备骨髓中单细胞悬液：取上述处理后的小鼠(同龄同样处理的三只小鼠骨髓混合)，断颈处死，在75％的酒精溶液中浸泡5min；用手术剪刀轻轻剪开小鼠下肢的皮下以及肌肉组织，取双侧大腿和小腿；用1mL的注射器大约1mL的PBS冲洗大腿和小腿的骨髓腔中，收集冲洗液，此步骤重复两次(同龄同样处理的三只小鼠骨髓混合)；收集骨髓腔中冲洗液的液体到50mL的离心管中；用红细胞裂解液裂解20min，50g，离心3min；用血球计数板计数后，加入相应的流式抗体，4℃孵育20min；用PBS洗两次，加到流式管中，上机进行检测，通过流式分选获得小鼠HSCs。
实验例1：
取实施例1制备的小鼠HSCs进行本实验例的检测，具体如下：
1.细胞极性相关标志物免疫荧光检测(Cdc42和微管蛋白)
细胞的极性是指细胞(群)两端具有不同的形态或功能，随着细胞衰老的进程，细胞极性逐渐消失。研究证明Cdc42(细胞分裂周期蛋白42)和HSCs中的微管蛋白(Tublin)是细胞极性的重要标记(Cdc42 Activity Regulates Hematopoietic Stem Cell Aging andRejuvenation，Maria Carolina Florian，Cell Stem Cell 10,520–530,May 4,2012)。Cdc42和微管蛋白的高度不对称定位与位于细胞侧面的底物结合位点无关，也与整个细胞质的不均匀分布无关，而是引起细胞极性改变的关键，可影响和反应出细胞的衰老的状态。在正常小鼠的HSCs中，Cdc42和微管蛋白高度集中在沿中心核/中心体/细胞膜轴的中心区附近和细胞质空间中，处于细胞的一侧。而随着细胞的衰老过程，Cdc42和微管蛋白的极化分布状态逐渐变得紊乱。本方案采用Cdc42和微管蛋白作为标记分子，并将Cdc42和微管蛋白作为检测衰老状态小鼠的HSC极性状态的重要指标，来检测不同年龄段小鼠的细胞衰老状态以及使用CS之后衰老状态的缓解情况。
免疫荧光实验步骤大致如下：取适量细胞，按照每1×105细胞数在玻片上滴加，于37℃孵箱干燥。用10倍体积4％的多聚甲醛固定液在常温下固定10min，PBS浸洗10min。用0.2％Triton X-100in PBS在常温下对细胞破膜20min，然后用2％BSA in PBST溶液，常温封闭50min。按照抗体说明书用1％BSA in PBST稀释一抗，在湿盒中4℃封闭过夜，PBST浸洗15min。按照抗体说明书用1％BSA in PBST稀释相应的二抗，常温孵育1h，PBST浸洗15min。滴加5μL DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS浸洗10min。用含抗荧光淬灭剂的封片液5μL封片加盖玻片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
实验结果如图1、图2、图3和图4所示，免疫荧光的结果显示NC组小鼠的HSCs的Cdc42和微管蛋白的极化分布状态变得极为紊乱，Cdc42的活性升高(现有文献报道抑制Cdc42活性可抑制细胞的衰老进程)。其中，Cdc42的活性升高是指：Cdc42极性不对称分布属于稳定状态，活性相对较低；而活化后则在HSCs中弥散分布，属于高活性状态。而使用CS处理小鼠，Cdc42和微管蛋白的极化分布得以一定程度上维持，Cdc42活性得到了抑制。在图1和图2中，第一列图像中的红色荧光表示Cdc42，第二列图像中的蓝色荧光表示DAPI染色的HSCs细胞核(DNA)，第三列图像中的融合荧光是将第一列和第二列对应的图像融合后形成。在图3和图4中，第一列图像中的绿色荧光表示微管蛋白，第二列图像中的蓝色荧光表示DAPI染色的HSCs细胞核(DNA)，第三列图像中的融合荧光是将第一列和第二列对应的图像融合后形成。在图2-图4中，第一排图像为对照组(NC组)的测试结果(1龄小鼠或者2龄小鼠)，第二排图像为针对实验组(CS组)的测试结果(1龄小鼠或者2龄小鼠)。
进一步分离出不同年龄段小鼠的HSCs，进行免疫荧光检测，镜检观察后，随机选取来自同龄同样处理的小鼠HSCs 80个细胞，统计极性HSCs的百分比，同龄同样处理重复3次，结果以mean±SD来表示，使用T检验评价其显著性，实验结果如图5和图6所示(图中oHSC即为本方案的HSCs)。其中，极性的HSCs即为显微镜下Cdc42和微管蛋白呈极性不对称分布状态；反之，如果两种蛋白不再呈极性不对称分布状态，则为非极性的HSCs。柱形图显示经CS处理后的老年小鼠极化状态的HSC细胞明显高于未处理对照组。综上所述，我们认为CS显著恢复衰老HSC中极性表型。图5和图6中，深色数据柱表示实验组(CS组)的HSCs细胞测试结果，浅色数据柱表示对照组(NC组)的HSCs细胞测试结果。
2.DNA损伤相关免疫荧光检测(γH2AX)
随着小鼠年龄的增长，小鼠细胞中DNA损伤累积，可通过检测DNA损伤的累积程度来判断细胞的衰老状态(Quiescent Hematopoietic Stem Cells Accumulate DNA Damageduring Aging that Is Repaired upon Entry into Cell Cycle，Isabel Beerman，CellStem Cell 15,1–14,July 3,2014)。DNA损伤会激活DNA损伤反应(DDR)。其中，DNA双链断裂DSB的形成触发许多因素的激活，包括组蛋白变体H2AX的磷酸化，产生γH2AX。H2AX的磷酸化在DDR中起关键作用，并且是在包含受损染色质的位点组装DNA修复蛋白以及激活阻止细胞周期进程的关卡蛋白所必需的。H2AX表达的分析可用于检测衰老过程中DNA损伤的累积程度，组蛋白H2AX磷酸化就是DNA损伤的最显著的标志。本方案利用免疫荧光技术以γH2AX作为DNA损伤的相关指标，对1龄和2龄小鼠的HSCs中γH2AX的水平进行了检测，相关操作方法参见对Cdc42和微管蛋白的免疫荧光检测(替换成相应抗体)，实验结果详见图7、图8(图中HSPC即为HSCs，标尺为5μm，图中为每种处理的一个具有代表性的细胞)。在图7和图8中，第一列图像中的红色荧光表示γH2AX，第二列图像中的蓝色荧光表示DAPI染色的HSCs细胞核(DNA)，第三列图像中的融合荧光是将第一列和第二列对应的图像融合后形成。图7中的第一排图像为NC组的1龄小鼠，第二排为像为CS组的1龄小鼠。图8中的第一排图像为NC组的2龄小鼠，第二排为像为CS组的2龄小鼠。由图7和图8的实验结果可知，CS处理的老年小鼠的γH2AX的表达量和荧光较对照显著减低，而老化的HSC中观察到的γH2AX病灶标志老年小鼠DNA损伤的细胞衰老的生理状态。
3.DNA彗星检测
为了直接评估和量化衰老过程对HSCs的DNA损伤的影响，我们使用碱性彗星试验来测量。检测过程大致为：微波炉沸腾水，将胶瓶开盖融化，然后取对应管数的胶放到37℃金属浴中备用(每管50μL)并预热载玻片；在融化胶同时准备细胞(冰上)、计数，稀释到1×105/mL；取5μL细胞到准备的胶管中，快速混合均匀，然后快速涂片，涂薄涂开点(整个过程在37℃金属浴上进行)；将载玻片放4℃冷却10min；加裂解液，4℃裂解1h；倒掉裂解液，加AUS溶液(NaOH 0.4g、200mM EDTA 250μL、双蒸水49.75mL)放置20min；彗星电泳仪加入AES电泳液(NaOH 8g；500mM EDTA、pH 8.0 2mL、双蒸水补至1L)，21V电泳30min；取载玻片，用双蒸水漂洗2次各5min；用70％酒精漂洗5min，置于37℃干燥；再沿边缘加100μL SYBR染液(10000×
Figure BDA0002932407760000111
Gold in DMSO 1μL、TE缓冲液,pH 7.5，30mL)，暗处放置30min；用双蒸水漂洗5min；37℃干燥后上机成像。
CS(25mg/kg)处理后，分选出不同年龄段(1，1.5和2)对照组和实验组老年小鼠HSCs用于碱性彗星实验，并对老年HSC的彗星尾部DNA百分比和橄榄矩进行统计评分(n＝120-150)。从不同年龄段老年小鼠中分离出的具有代表性的HSCs的碱性彗星图详见图9、图10和图11。由实验结果可知，与对照组的HSCs相比较，从实验组小鼠中纯化的HSCs中DNA损伤的水平显著降低。对小鼠HSCs对照组(NC组)和实验组(CS,25mg/kg)彗星电泳的橄榄矩和DNA百分比进行统计评分，DNA损伤(彗尾DNA百分比)测量结果的分析结果详见图12、图13和图14，彗尾橄榄矩测量结果详见图15。结果显示：我们通过比较从实验组小鼠分离出的细胞与从对照组小鼠纯化得到的细胞，进一步分析了HSC群体的橄榄尾矩。正如我们之前所观察到的，与对照组小鼠相比，实验组小鼠的HSC始终显示出DNA断裂的显著降低。综上所述，这些实验表明，HSC在衰老过程中会积累DNA断裂，且随着年龄的增加DNA损伤越严重，而给与CS治疗实验组小鼠DNA损伤显著恢复。
与对照组的HSCs相比较，从实验组小鼠中纯化的HSCs中DNA损伤的水平显著降低。其中辐照后1h的DNA损伤对照组和实验组并无显著差异，但随着时间的增加实验组橄榄矩和尾巴DNA百分比与对照组之间的差异也越大。
综上所述，上述实验结果表明，CS显著加速辐照后小鼠HSCs的DNA损伤修复，具有较高的临床价值和参考意义。
实验例2：RORa蛋白的免疫荧光检测
选取8-12周龄小鼠作为年轻小鼠，并选用18月龄作为老年小鼠进行实验。除实验用小鼠有所改变外，其他实验设置以及实验过程参见实施例1，实验结束后，取小鼠的血液干细胞进行免疫荧光实验，实验结果参见图16(yHSCs代表年轻小鼠)和图17(oHSCs代表老年小鼠)。图16和图17中，左侧图像是选取具代表性的一个细胞图像，右侧图像是每种处理统计了约80个细胞的荧光强度，取平均值后的统计图(数据形式为mean±SD，使用T检验P值判断显著性)。实验结果显示，使用CS处理年轻小鼠和老年小鼠，RORa蛋白的表达量上调，说明了CS具有激活RORa蛋白的作用，RORa蛋白的激活可引起细胞衰老状态的逆转。其中，CS对老年小鼠的作用更为显著。
本实验例还研究了老年小鼠和年轻小鼠在RORa蛋白表达量上(未使用CS治疗的时候)的差异，实验结果如图18所示，可见老年小鼠中RORa蛋白表达量显著低于年轻小鼠。
实验例3：RORa蛋白的下游调控蛋白的变化
使用免疫荧光的方法检测了RORa蛋白的下游调控蛋白的变化情况，针对2龄小鼠检测了CS处理前后P53蛋白、ATM蛋白的表达情况，以及针对1龄小鼠检测了CS处理前后PARP1蛋白的表达情况，上述蛋白均为DNA修复通路上的相关蛋白，实验结果见图19、图20、图21，说明使用RORa蛋白激动剂可以对DNA修复蛋白产生一定的调节作用。
针对DNA修复和P53信号通路进行特征基因集合分析(Hallmark gene sets)，发现大量DNA修复相关基因的表达受到CS处理的影响，大量P53信号通路相关基因的表达受到CS处理的影响。详见图22和图23，说明RORa蛋白激动剂CS可以对DNA修复和P53信号通路产生较大影响。
实验例4：RORa蛋白敲除实验
使用现有技术中的常规Cre/loxP重组酶系统敲除小鼠RORa蛋白，进而检测RORa蛋白缺失后的小鼠衰老表型。基于Cre/loxP的基因敲除，首先要在胚胎干细胞的基因组中引入loxP序列，接着通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变，获得目的基因敲除的小鼠。实验结果显示，在年轻小鼠的血液干细胞中敲除RORa导致年轻小鼠的血液干细胞呈现衰老表型。其中，图24和图25分别为RORa基因敲除小鼠的微管蛋白和Cdc42蛋白在细胞中的分布情况的免疫荧光检测图，图26和图27分别为RORa基因敲除小鼠的依照微管蛋白计算的和依照Cdc42蛋白计算的极性HSCs的统计柱状图(免疫荧光检测方法和统计方法参见实验例1)。由图24-图27的实验结果可知，RORa基因敲除之后，小鼠微管蛋白和Cdc42蛋白在细胞中的极性分布现象减弱或者消失，说明了RORa蛋白对维持小鼠的HSCs细胞的极性起到了非常关键的作用。图28为RORa基因敲除小鼠的γH2AX的荧光免疫实验结果，图29为γH2AX灶点的统计图，图30为γH2AX的荧光强度统计图。图28-图30的实验结果显示，RORa基因敲除之后，小鼠HSCs中DNA损伤加剧，说明了RORa蛋白在促进DNA损伤修复中起到了重要作用。图31、图32和图33展示了RORa基因敲除小鼠的HSCs细胞的具有代表性的HSCs的碱性彗星图，图34、图35和图36展示了不同处理的彗尾DNA百分比测量结果，图37展示了不同处理的彗星电泳的橄榄矩统计图。图31-图37的实验结果说明了，RORa基因敲除之后，小鼠HSCs中的DNA损伤大量累积，RORa蛋白是DNA修复过程中的关键调控因子。其中，图24-图37中，空白对照(CTRL)是指没有进行基因敲除的小鼠。对Roraloxp/loxp(对照组，n＝3)和MX-1-Cre/Roraloxp/loxp(实验组，n＝3)小鼠使用聚集胞苷(PiPc，15mg/kg)分别进行腹腔注射诱导敲除；实验组和对照组均为两天一次，连续注射5次，并于注射后4wks,8wks(第6周时补充注射三次PiPc),12wks(第6，10周时各补充注射三次PiPc)，利用流式细胞分选技术分选HSCs细胞，用于免疫荧光检测分析。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1. RORa蛋白在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，所述RORa蛋白处于激活状态；RORa蛋白处于激活状态具体是RORa蛋白量上有提高，并有更多的核定位以及RORa蛋白的下游调控基因激活。
2.根据权利要求1所述的RORa蛋白在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，所述抗衰老药物用于逆转血液干细胞的衰老状态。
3.根据权利要求2所述的RORa蛋白在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，逆转血液干细胞的衰老状态包括维持细胞极性。
4.根据权利要求3所述的RORa蛋白在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，逆转血液干细胞的衰老状态包括修复DNA损伤。
5.根据权利要求4所述的RORa蛋白在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，维持细胞极性包括维持和/或恢复细胞分裂周期蛋白42和微管蛋白在细胞中的极性分布状态。
6. RORa蛋白激动剂在制备抗衰老药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的RORa蛋白激动剂在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，所述RORa蛋白激动剂包括胆固醇硫酸酯及其盐。
8.根据权利要求7所述的RORa蛋白激动剂在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，所述RORa蛋白激动剂对小鼠的给药方式为腹腔注射。
9.根据权利要求8所述的RORa蛋白激动剂在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，将所述RORa蛋白激动剂配制成注射剂，所述注射剂包括RORa蛋白激动剂、吐温80和磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求8所述的RORa蛋白激动剂在制备抗衰老药物中的应用，其特征在于，所述RORa蛋白激动剂的单次给药剂量为25mg/kg•bw；所述RORa蛋白激动剂的给药频率为每12h给药一次，并持续14天。
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