CN107320711A - 化合物ss‑31在制备治疗弗里德赖希共济失调及相关疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物Szeto‑Schiller‑31(SS‑31)在制备治疗弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia,FRDA)及相关疾病药物中的应用。本发明属于药物领域,具体涉及SS‑31在治疗FRDA疾病中的应用。本发明通过实验发现SS‑31从翻译水平上调FRDA病人细胞中frataxin(FXN)的表达;调节FRDA病人细胞中的铁代谢;促进线粒体中铁硫簇的合成;改善线粒体功能;减少病人细胞中ROS的产生,增强细胞抗氧化应激的能力。结果表明SS‑31具有治疗FRDA的潜在价值。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,涉及化合物Szeto-Schiller-31(SS-31)在治疗弗里德赖希共济失调(FRDA)疾病中的应用。
在本申请全文中,通过第一作者和公开年份来引用各种出版物。这些出版物的完整引用信息记录在说明书后面的参考文献部分。引用的文件和出版物以及在参考文献部分的公开内容通过引用其全部内容并入本申请,以更充分地描述本发明日期之前的现有技术状况。
背景技术
FRDA是一种常染色体单基因突变引起的神经退行性疾病,属于线粒体疾病的范畴。该病发病年龄常在儿童早期,病程呈进程性发展,多于40到50岁死亡。主要临床表现为进行性姿势和步态的共济失调,上运动神经元功能障碍,如构音障碍、腱反射消失、深感觉丧失、心肌病、糖尿病及继发性骨骼畸形等(Abrahao, Pedroso et al.2015)。
FRDA的主要病因是人类第9号染色体上frataxin(FXN)基因的第一个内含子中有GAA序列大量重复扩增,导致FXN的转录沉默,使其表达水平仅为正常的 5-30%(Campuzano,Montermini et al.1996)。FXN的主要功能是参与铁硫簇的装配和血红素的合成。研究表明,FRDA中FXN的缺乏导致线粒体铁硫簇缺乏以及铁硫簇相关酶的活性降低(如线粒体顺乌头酸酶和电子传递链复合物I,II,III),此外FXN的缺乏也造成了线粒体中铁的累积,这些由FXN缺乏所引起的后果都会对线粒体功能乃至细胞造成损伤。因此,提高FRDA病人中FXN的蛋白水平是最直接的治疗方法,但目前还没有非常有效的治疗方案。
迄今为止,虽然一些临床试验已经取得了一定的进展,但尚未发现治疗FRDA 的有效方法(Aranca,Jones et al.2016)。目前对FRDA的治疗方法主要有三种,第一种是抗氧化剂的应用,MitoQ和艾地苯醌是抗氧化剂,可以有效清除细胞中的自由基。III期临床试验之前的初步研究表明艾地苯醌可作为治疗FRDA的安全药物,对心肌肥大和神经功能具有一定的改善作用。然而在III期临床试验中艾地苯醌未能表现出很好的疗效,因此未被批准用于FRDA(Di Prospero,Baker et al.2007)的治疗。由此可见,抗氧化剂用于FRDA的治疗,理论上很美好,但临床试验结果被证明是失败的策略,因此我们要避开仅仅作为抗氧化剂的化合物用于FRDA的治疗这一陷阱。能够提高FXN的表达,解决FRDA发生的病因才是根本。目前尚未发现MitoQ在FRDA临床试验中的研究。第二种是对表观遗传的调控,通过组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)使异染色质乙酰化,从而增强对FXN mRNA和蛋白质水平的表观遗传调控(Soragni,Miao et al.2014)。不幸的是,最终结果显示,在III期试验中,患者并没有得到改善。第三种是铁螯合剂的应用。当FXN缺乏时,细胞会出现线粒体铁积累,由此提出了选择性铁螯合的处理来改善FRDA的策略(Boddaert,Le Quan Sang et al.2007)。研究表明,低剂量的去铁酮与艾地苯醌的联合治疗可能改善神经功能和心肌肥大。但因为铁缺乏会下调FXN的表达,所以长期使用它可能不是一个很好的选择。目前,基因治疗方法已经在细胞和动物模型中以表现出一些有益的效果(Perdomini, Belbellaa et al.2014)。最近,研究人员使用合成的DNA或RNA阻断R环形成,因此触发基因激活表达水平接近野生型细胞的水平,是治疗FRDA的候选战略。 SS-31多肽是Szeto和Schiller合成筛选的一类线粒体靶向的化合物,其最初的研究目的是为了开发一类具有中枢活性的阿片类镇痛药。该四肽是一类芳香族阳离子多肽,其结构基序为交替的芳香环、氨基酸残基以及2’,6’-二甲基酪氨酸残基(Dmt)。SS-31靶向聚集在线粒体内膜上,与心磷脂相互作用,维持线粒体的完整性,维持ATP的正常产生(Birk,Chao et al.2014)。已经证明SS-31在缺血再灌注损伤、心脏衰竭等几种动物疾病模型中显示出一定的效果(Liu,Soong et al. 2014,Nickel,von Hardenberg etal.2015)。但缺血再灌注损伤、心脏衰竭与本申请的疾病FRDA无论从疾病的发病机制,病理生理基础,还是对应的治疗药物、治疗靶点和治疗策略都完全不同,无法给出教导和启示,但是我们还是想大胆的尝试一下SS-31在调控FRDA方面的药用功能。目前为止,没有关于SS-31在调控线粒体铁代谢相关联的疾病方面的研究,更没有和我研究的疾病FRDA相关联的研究。
化合物Szeto-Schiller-31(SS-31)分子结构式
发明内容
发明目的
本发明的目的是通过FRDA疾病相关的疾病模型,发现SS-31在制备治疗 FRDA及相关疾病方面新的医药用途。
技术方案
本发明通过实验发现SS-31从翻译水平上调FRDA病人细胞中frataxin(FXN) 的表达;调节FRDA病人细胞中的铁代谢;促进线粒体中铁硫簇的合成;改善线粒体功能;减少病人细胞中ROS的产生,增强细胞抗氧化应激的能力。结果表明SS-31具有治疗FRDA的潜在价值。
第一个方面的技术方案:
化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用。
进一步的,SS-31本身或者其作为主要成分在制备下列药物上的应用:
(1)化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为SS-31 能从翻译水平提高FRDA患者细胞中FXN的表达水平。
(2)化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为化合物SS-31从翻译水平提高细胞中FXN的表达水平并促进铁硫簇的合成和增强线粒体中含铁硫簇的酶活性。
(3)化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为化合物SS-31改善FRDA病人线粒体的质量,包括提高线粒体膜电位,增加ATP水平,促进线粒体内膜嵴的有序排列等形态的改善。
(4)化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为化合物SS-31降低FRDA病人细胞中ROS的水平,提高FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力,所述抵抗氧化应激的能力包括清除ROS能力的增强,对过氧化氢耐受能力的增强。
(5)化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为SS-31 提高FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力。
第二个方面的技术方案:
化合物SS-31在制备从翻译水平提高FRDA病人细胞中FXN表达水平药物或者制剂中的应用。
进一步的,SS-31本身或者其作为主要成分在制备下列药物上的应用:
(1)化合物SS-31在制备从翻译水平提高FRDA病人细胞中FXN表达水平并促进铁硫簇的合成和增强线粒体中含铁硫簇的酶活性的药物或者制剂中的应用。
(2)化合物SS-31在制备解决以下疾病或者相关病理状态药物或者制剂中的应用:改善FRDA病人线粒体的质量,包括提高线粒体膜电位,增加ATP水平,促进线粒体内膜嵴的有序排列等形态的改善;
降低FRDA病人细胞中ROS的水平,提高了FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力,所述细胞抵抗氧化应激的能力,包括清除ROS能力的增强,对过氧化氢耐受能力的增强。
(3)化合物SS-31在制备解决以下疾病或者相关病理状态药物或者制剂中的应用:从翻译水平提高FRDA病人细胞中FXN的表达水平并促进铁硫簇的合成和增强线粒体中含铁硫簇的酶活性;
改善FRDA病人线粒体的质量,包括提高线粒体膜电位,增加ATP水平,促进线粒体内膜嵴的有序排列等形态的改善;
降低FRDA病人细胞中ROS的水平,提高了FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力,所述细胞抵抗氧化应激的能力,包括清除ROS能力的增强,对过氧化氢耐受能力的增强。
本发明的优点:
1、本发明首次将新型靶向线粒体的化合物SS-31用于FRDA及其相关疾病的治疗,可作为制备治疗FRDA及其相关疾病药物的新用途申请,具有巨大的市场价值和社会效益。
2、本发明提供了SS-31作为药物主要成分在FRDA疾病中的应用。SS-31能从翻译水平提高FRDA患者细胞中FXN的表达水平,从病因上解决FRDA疾病治疗中的问题。
3、SS-31改善FRDA病人线粒体的质量,包括提高线粒体膜电位,增加ATP 水平,促进线粒体内膜嵴的有序排列等形态的改善;
4、化合物SS-31降低FRDA病人细胞中ROS的水平,提高FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力,所述抵抗氧化应激的能力包括清除ROS能力的增强,对过氧化氢耐受能力的增强。
附图说明:
图1.SS-31处理FRDA病人细胞浓度的筛选(Western Blotting结果)。
图2.SS-31处理FRDA病人细胞时间点的筛选(Western Blotting结果)。
图3.SS-31处理提高FRDA病人细胞FXN的代表性的结果,数据均以 Mean±SEM表示,n=3。(上:Western Blotting结果;下:量化结果)。
图4.SS-31处理对FRDA病人细胞铁相关蛋白的表达水平的影响,包括病人细胞中IRP2,TfR1,ferritin的蛋白水平(Western Blotting结果)。
图5.SS-31处理对FRDA病人细胞中胞质和线粒体中的不稳定铁池中铁水平的影响,数据均以Mean±SEM表示,n=3。
图6.SS-31处理对FRDA病人细胞中顺乌头酸酶活性的影响(左图),右边是量化统计图,数据均以Mean±SEM表示,n=3。
图7.SS-31处理对FRDA病人细胞中线粒体电子传递链复合物Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ活性的影响,数据均以Mean±SEM表示,n=3。
图8.SS-31处理对FRDA病人细胞中黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD) 蛋白表达量(上图)及其酶活性(下图)的影响,数据均以Mean±SEM表示, n=3。
图9.SS-31处理对FRDA病人细胞中线粒体膜电位的影响,数据均以 Mean±SEM表示,n=3。
图10.SS-31处理对FRDA病人细胞中ATP水平的影响,数据均以Mean±SEM 表示,n=3。
图11.SS-31处理对FRDA病人细胞中NADH/NAD+比值的影响,数据均以 Mean±SEM表示,n=3。
图12.SS-31处理对FRDA病人细胞中线粒体数目的影响,数据均以Mean±SEM 表示,n=3(实时定量PCR结果)。
图13.SS-31处理对FRDA病人细胞中线粒体结构的影响(电镜结果)。
图14.SS-31处理对FRDA病人细胞中ROS水平的影响,数据均以Mean±SEM 表示,n=3(流式细胞结果)。
图15.SS-31处理对FRDA病人细胞中SOD,Catalase活性的测定,数据均以 Mean±SEM表示,n=3。
图16.SS-31处理对FRDA病人细胞中SOD,Catalase蛋白水平的影响(WesternBlotting结果)。
图17.SS-31处理对FRDA病人细胞对过氧化氢抵抗力的影响。
图18.SS-31处理对FRDA病人细胞中FXN mRNA水平的影响,数据均以 Mean±SEM表示,n=3(实时定量PCR结果)。
图19.放线菌素D不能抑制SS-31上调FXN的效果(上:Western Blotting结果;下:量化结果)。
图20.SILAC检测新合成的FXN,数据均以Mean±SEM表示,n=2(质谱检测结果)。
具体实施方式
实验材料和方法
本发明采用FRDA病人来源的淋巴细胞系GM15850为研究对象,以正常人淋巴细胞系GM15849作为对照。细胞培养均在37℃,5%CO2条件下,用含10%胎牛血清(Fetal bovineserum,FBS)、2mM谷氨酸盐、100U/mL青链霉素的 1640培养基培养。
本发明采用的SS-31均由上海强耀生物科技有限公司合成。FXN抗体由本实验室免疫获得。涉及到的其他材料均为商购来源,按照生产厂家所提供的使用说明使用。
实验过程中多次涉及到的Western blotting操作均如下:收集细胞并离心(1000rpm,5min)去上清,用PBS清洗一遍。根据细胞量,加入适量的NP40 细胞裂解液,重悬细胞,置于冰上裂解10min,期间震荡2~3次。15000rpm,4℃,离心10min。将离心后上清转移至新的已预冷的eppendorf(EP)管中,并用 Bradford工作液测定蛋白浓度,已确保每个样品的上样量一致,并加入适量5×SDS-loading buffer,100℃加热5min,使蛋白充分变性。将样品短暂离心后,用微量进样器将样品加入到SDS-PAGE凝胶加样孔中,电压100V进行电泳。电泳结束后将凝胶从装置上取下,除去浓缩胶,将分离胶上的蛋白用电转仪在稳流250mA条件下转移到NC膜上。转膜结束后,将膜放入丽春红染色液中进行染色2min,用pH5.5的酸水洗去未与蛋白结合的染色液,对染好的NC膜进行拍照。接着将膜置于含5%脱脂奶粉的Tris-PM中,室温下封闭1h。封闭结束后,加入适当稀释的一抗,4℃孵育过夜。孵育结束后回收一抗,并用Tris-PM 洗膜,每次10min,洗4次。将膜与适当稀释的二抗室温下孵育1h。孵育结束后用Tris-PM洗4次,每次10min。膜上蛋白与化学发光底物结合,用Westernblot 化学发光成像系统曝光并拍照。
实施例1SS-31给药浓度和时间的优化,利于提高FRDA病人细胞FXN的表达
1.1实验材料
细胞:FRDA病人来源的淋巴细胞系GM15850,正常人淋巴细胞系GM15849。培养条件:37℃,5%CO2条件下,用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、 2mM谷氨酸盐、100U/mL青链霉素的1640培养基培养。
SS-31由上海强耀生物科技有限公司合成,溶解于PBS中,储存浓度1mM,-80℃保存。
FXN抗体由本实验室免疫获得,GAPDH抗体购于Abgent。
1.2实验方法
1.1.1用0,2,5,10,20,50,100,200nM SS-31分别处理病人细胞,24小时后收取细胞沉淀,提取蛋白。以健康人细胞为对照,同时培养24小时后,收取细胞沉淀,提取蛋白。Western blotting检测FXN蛋白水平,以GAPDH作为内参。
1.1.2用50nM SS-31处理病人细胞,分别在4,8,12,24,48小时后收取细胞沉淀,提取蛋白。以健康人细胞为对照,Western blotting检测FXN蛋白水平,以GAPDH作为内参。
1.1.3用50nM SS-31处理病人细胞,分别在8,24小时后收取细胞沉淀,提取蛋白。以健康人细胞为对照,Western blotting检测FXN蛋白水平,以GAPDH作为内参。
1.2实验结果
不同浓度的SS-31处理FRDA病人细胞,其FXN的蛋白水平以剂量依赖性方式增加,20至50nM的浓度是最佳的浓度范围(图1)。随后用50nM SS-31 处理细胞,检测不同时间点FXN的蛋白水平,显示处理8小时后就能检测到FXN 的升高(图2)。50nM SS-31能够将病人细胞的FXN水平由正常人水平的30%左右提高至正常人的75%(图3)。结果表明SS-31可用于提高FRDA患者细胞 FXN的表达水平,从病因上解决FRDA疾病治疗中的问题。
实施例2 SS-31处理改善病人细胞铁代谢的平衡
2.1实验材料
IRP2抗体、TfR1抗体由本实验室免疫获得,Ferritin购于Abcam。
钙黄绿素甲酯(calcein-AM)购于sigma公司;RPA(Rhodamine B-[(1,10-phenanthroline-5-yl)-aminocarbonyl]benzyl ester)购自于Squarix公司。
2.2实验方法
2.2.1首先检测SS-31对病人细胞铁代谢相关蛋白水平的影响。用50nm SS-31处理病人细胞8和24小时后收取细胞沉淀,Western Blotting检测IRP2,TfR1, Ferritin,ISCU,FXN的蛋白水平。
2.2.2其次检测SS-31对病人细胞胞质和线粒体中不稳定铁含量的影响。用50nmSS-31处理病人细胞8和24小时后,收集细胞并离心(1000rpm,5min)去上清,用PBS清洗一遍。用适量PBS重悬细胞沉淀,并进行计数,取2×105个细胞进行后续实验。用100μL 10μMCalcein-AM重悬细胞沉淀,37℃避光孵育10 分钟,中间适当轻轻振荡2次。3000r/min离心5min,弃上清。加入PBS缓冲液重悬细胞沉淀,3000r/min离心5分钟,弃上清。加入150μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀,转移至黑色96孔板中。在激发波长495nm,发射波长530nm的条件下检测荧光强度,根据荧光强度计算胞质中铁的相对含量。同样的用线粒体铁染料RPA进行染色后,在激发波长543nm,发射波长601nm的条件下检测荧光强度,计算线粒体中铁的相对含量。
2.3实验结果
实验结果如图4-7所示,SS-31处理24小时后,病人细胞中铁蛋白的表达水平相对于健康人细胞有所上升,表明细胞中铁含量增高。尽管病人细胞中IRP2 蛋白水平高于健康人,但SS-31处理后,病人细胞中IRP2和TfR1的蛋白水平进一步上升,以促进细胞对铁的摄取(图4)。而用荧光染料Calcein-AM和RPA 分别检测胞质和线粒体中的不稳定铁的结果显示,胞质LIP水平保持不变(图5,左图),而线粒体LIP水平显著升高(图5,右图),表明线粒体中生物可利用的铁增加。这些结果表明SS-31能够用于减少病人细胞中铁的累积,增加FRDA病人细胞线粒体可利用铁的含量,有利于铁硫簇的合成。
实施例3 SS-31处理对含铁硫簇的线粒体呼吸链的影响
3.1实验材料
线粒体复合体I活性检测试剂盒(Abcam)
线粒体复合体II活性检测试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)
线粒体复合体III活性检测试剂盒(Biovision Inc.)
黄嘌呤氧化酶测定试剂盒(南京建成科技有限公司)
3.2实验方法
3.2.1首先是顺乌头酸酶活性的检测:按照比例配制8%分离胶(双蒸水3.64mL,10×TB缓冲液0.94mL,30%Acr-Bis 1.68mL,1M柠檬酸钠22.5μL,10%APS 31μL,TEMED 6.25μL),将溶液混合均匀。取5mL分离胶灌入制胶装置中,然后加入1mL 50%的乙醇封住凝胶的液面,待分离胶凝固后将乙醇倒掉,不要有残留,再加入配制的堆积胶(双蒸水1.16mL,10×TB缓冲液0.11mL,30% Acr-Bis 0.2mL,1M柠檬酸钠5.25μL,10%APS 21μL,TEMED 3.75μL)。将堆积胶加入后立即将梳齿插入,小心不要产生气泡。待堆积胶凝固后方可将梳齿小心地拔掉。将80μg蛋白样品和适量4×sample buffer混合后上样。在4℃条件下用70V电泳14h,电泳结束后,将胶小心地放入10mL的染色液中,37℃避光孵育30min,等显色完毕后,将胶放在双蒸水中终止反应。
3.2.2线粒体复合物I/II/III和XOD活性的测定均严格按照试剂盒说明书进行。
3.3实验结果
实验结果如图所示,线粒体顺乌头酸酶活性(m-aco)在SS-31处理后显著增加,胞质顺乌头酸酶活性(c-aco)也有所上升,但不显著(图6),SS-31处理对相应的蛋白质水平均没有改变(图6,aco2和IRP1)。SS-31处理能够改善呼吸链复合物II和复合物III的活性,复合物I的活性未得到改善(图7)。黄嘌呤氧化酶(XOD)是一种产生活性氧的酶,同样需要铁硫簇作为辅基。我们发现在SS-31处理后病人细胞中XOD的活性没有变化(图8)。同时,SS-31处理对非铁硫簇酶柠檬酸合酶的活性也没有影响。这些结果表明SS-31诱导的FXN 上调促进线粒体中铁硫簇的生物合成,特异性地促进含铁硫簇酶的活性,特别是线粒体呼吸链的活性,有利于提高FRDA病人细胞线粒体的功能。
实施例4 SS-31对病人细胞线粒体的质量和数量的影响
4.1实验材料
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(北京索莱宝科技有限公司)
基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)(碧云天生物科技有限公司)
NADH/NAD+检测试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)
ATP含量的检测试剂盒(Sigma公司试剂盒)
4.2实验方法
4.2.1线粒体膜电位是线粒体完整性的重要指标。用50nM SS-31处理病人细胞0,8和24小时后,收集细胞并离心(1000rpm,5min)去上清,用PBS清洗一遍。用适量PBS重悬细胞沉淀,并进行计数,取2×105个细胞进行后续实验。用荧光探针JC-1对细胞进行染色,20分钟后离心,去除染料,用PBS清洗细胞,然后用荧光酶标仪分别读出红色荧光和绿色荧光的强度,计算其比值,比值越大说明线粒体膜电位越高。
4.2.2 ATP是线粒体功能的指标。用50nM SS-31处理病人细胞0,8和24小时后,收集细胞并离心(1000rpm,5min)去上清,用PBS清洗一遍,离心获得细胞沉淀。ATP含量的测定严格按照ATP检测试剂盒说明书进行操作。
4.2.3 NADH/NAD+能够反应线粒体的氧化磷酸化水平,比值越低,说明细胞氧化磷酸化很活跃,有利于ATP的生成。用50nM SS-31处理病人细胞,分别在0, 24和48小时后收取细胞沉淀。按照试剂盒说明书分别测定NADH和NAD+,计算各自含量,求其比值。
4.2.4对于线粒体数量的测定,用50nM SS-31处理病人细胞,分别在0,24和 48小时后收取细胞,严格按照试剂盒说明书提取基因组DNA,以基因组DNA 为模板,通过荧光定量PCR检测线粒体基因cyt b和核基因组基因Actin的拷贝数,从而比较线粒体的相对数目。
4.2.5电子显微镜观察线粒体:获取处理后的细胞,用PBS重悬细胞沉淀,800×g离心5分钟,弃上清;向EP管中加入1mL的2.5%戊二醛,重悬细胞沉淀进行固定,800×g离心5分钟,弃上清。PBS清洗两次。用1%四氧化锇重悬细胞沉淀进行后固定,800×g离心5分钟,弃上清。PBS清洗两次,用30%-100%丙酮逐级脱水10-30分钟,将样品包埋于环氧树脂中,进行超薄切片,IB-5型离子溅射喷镀仪喷金,JEM-1011型透射电子显微镜观察线粒体结构变化。
4.3实验结果
在SS-31处理后,病人细胞红色荧光与绿色荧光强度的比值表明病人细胞的 MMP上升(图9);SS-31处理显著提高了病人细胞中的ATP水平(图10),表明氧化磷酸化水平增强;SS-31处理使病人细胞中NADH/NAD+的比值降低至健康细胞的水平(图11);这些结果表明SS-31处理患改善了病人细胞中线粒体的质量。此外,我们量化线粒体DNA的拷贝数,并发现SS-31处理能够轻微增加病人细胞中线粒体的拷贝数(图12)。电镜结果也证实SS-31处理改善了病人细胞的内膜结构,由原来的异常龟背状嵴变为正常有序的折叠结构(图13)。总之,SS-31处理显著改善了病人细胞线粒体的质量,一定程度上增加线粒体数量,可用于治疗明显具有“线粒体疾病”特征的FRDA疾病。
实施例5 SS-31对病人细胞抵抗氧化应激的能力的影响
5.1实验材料
ROS检测试剂盒(碧云天)、SOD活性检测试剂盒(南京建成)、catalase活性检测试剂盒(南京建成)
5.2实验方法
5.2.1首先用流式细胞仪检测细胞ROS含量,步骤如下:六孔板培养细胞,SS-31 处理适当时间。处理结束后,离心收集细胞;按照1:1 000用无血清培养液稀释 DCFDA,使其终浓度为10μM。将收集好的细胞悬浮于稀释好的DCFDA,细胞浓度为1×105-2×107个/mL,37℃细胞培养箱中孵育20分钟;孵育结束后,用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,为了充分去除未进入细胞内的DCFDA;500×g 离心5分钟;弃上清,加入500μL PBS重悬细胞沉淀,500×g离心5分钟;重复上步骤三次;加入500μL PBS重悬细胞沉淀后转移至流式管中,使用流式细胞仪分析细胞中ROS的含量。
5.2.2其次分别用Western blotting检测SOD和Catalase的蛋白水平,用相关试剂盒检测酶活性。最后用CCK8检测SS-31处理后的病人细胞对过氧化氢的抵抗力。
5.3实验结果
在病人细胞中的ROS水平高于在健康对照细胞中的ROS水平(图14,左图)。 SS-31处理显著降低了病人细胞中的ROS水平(图14,右图);SS-31处理增加了过氧化氢酶的表达和活性(图15,左图和图16);SS-31处理没有改变病人细胞中SOD1和SOD2的蛋白水平,但是在SS-31处理8小时后,总SOD活性显着增加(图15,右图和图16);SS-31处理增强了病人细胞对H2O2介导的细胞毒性的抵抗能力(图17)。总之,这些数据表明SS-31处理降低了病人细胞中 ROS水平,并增强了其抗氧化的能力,可用于减轻FRDA病人细胞遭遇的氧化胁迫的压力。
实施例6确定SS-31从转录还是翻译水平调控FXN的表达
6.1实验材料
放线菌酮D(Sigma)
TRIpure(北京百泰克)
2×SYBR real-time PCR premixture kit(Invitrogen)
6.2实验方法
6.2.1检测FXN mRNA的水平:用SS-31处理病人细胞后收集细胞沉淀,用Trizol 法提取RNA,反转录获得cDNA,荧光定量PCR检测FXN mRNA的水平。
6.2.2最后通过Actinomycin D抑制mRNA的合成,检测SS-31对FXN蛋白水平的影响:将病人细胞分为两组,一组用50nM SS-31单独处理8小时,一组用50 nM SS-31和0.5μg/mL放线菌酮D同时处理8小时,收集细胞沉淀,Western blotting检测FXN的蛋白水平。
6.2.3检测新合成的FXN的蛋白水平:将病人细胞转移到具有同位素标记的培养基中,分为两组,一组加SS-31,一组不加SS-31,24小时后收取细胞沉淀;裂解细胞,分别取1mg总蛋白,通过免疫沉淀获得目的蛋白FXN。将洗脱的样品做质谱检测,同时根据同位素的信号强度判断新合成的FXN的蛋白差异。
6.3实验结果
实验结果如图所示,SS-31对FXN的mRNA水平没有影响(图18)。放线菌酮D是真核生物mRNA合成的抑制剂,当病人细胞同时用SS-31和Actinomycin D处理时,FXN的蛋白质水平仍然升高(图19),证明SS-31从翻译水平而不是转录水平上调FXN的表达。接着我们使用SILAC技术来观察翻译是否通过SS-31 增强。我们发现SS-31显著增加了新合成的FXN(图20),这表明SS-31处理促进了FXN新的合成,上调了FXN翻译水平。本研究从机制上揭示SS-31提高 FXN的水平,用于治疗FRDA病人是因为SS-31在翻译水平调控FXN的表达,从根本上解决了因FXN表达量的减少造成FRDA疾病的棘手的难题。
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Claims (10)
1.化合物SS-31在制备从翻译水平提高FRDA病人细胞中FXN表达水平药物或者制剂中的应用。
2.化合物SS-31在制备从翻译水平提高FRDA病人细胞中FXN表达水平并促进铁硫簇的合成和增强线粒体中含铁硫簇的酶活性的药物或者制剂中的应用。
3.化合物SS-31在制备解决以下疾病或者相关病理状态药物或者制剂中的应用:
改善FRDA病人线粒体的质量,包括提高线粒体膜电位,增加ATP水平,促进线粒体内膜嵴的有序排列等形态的改善;
降低FRDA病人细胞中ROS的水平,提高了FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力,所述细胞抵抗氧化应激的能力,包括清除ROS能力的增强,对过氧化氢耐受能力的增强。
4.化合物SS-31在制备解决以下疾病或者相关病理状态药物或者制剂中的应用:
从翻译水平提高FRDA病人细胞中FXN的表达水平并促进铁硫簇的合成和增强线粒体中含铁硫簇的酶活性;
改善FRDA病人线粒体的质量,包括提高线粒体膜电位,增加ATP水平,促进线粒体内膜嵴的有序排列等形态的改善;
降低FRDA病人细胞中ROS的水平,提高了FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力,所述细胞抵抗氧化应激的能力,包括清除ROS能力的增强,对过氧化氢耐受能力的增强。
5.化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用。
6.如权利5所述的化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为SS-31能从翻译水平提高FRDA患者细胞中FXN的表达水平。
7.如权利5或者6任意一项所述的化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为化合物SS-31从翻译水平提高细胞中FXN的表达水平并促进铁硫簇的合成和增强线粒体中含铁硫簇的酶活性。
8.如权利5或者6任意一项所述的化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为化合物SS-31改善FRDA病人线粒体的质量,包括提高线粒体膜电位,增加ATP水平,促进线粒体内膜嵴的有序排列等形态的改善。
9.如权利5所述的化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为化合物SS-31降低FRDA病人细胞中ROS的水平,提高FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力,所述抵抗氧化应激的能力包括清除ROS能力的增强,对过氧化氢耐受能力的增强。
10.如权利5所述的化合物SS-31在制备治疗FRDA疾病药物或者制剂中的应用,其特征为SS-31提高FRDA病人细胞抵抗氧化应激的能力。
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