CN108291224A - 用于治疗青光眼的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了通过干扰眼部细胞中的基因如p16的表达来治疗青光眼的方法和药物组合物。这些方法和组合物采用基于核酸的疗法。

Description

用于治疗青光眼的方法和组合物

交叉引用

本申请要求2015年9月10日提交的美国临时申请号62/216,374的权益，该临时申请通过引用并入本文。

背景技术

青光眼是致盲的神经退行性疾病。青光眼的风险因素包括升高的眼内压(IOP)、年龄和遗传学。青光眼的特征在于加速和渐进性的视网膜神经节细胞(RGC)死亡。尽管研究了数十年，但青光眼中RGC死亡的机理仍不清楚。

原发性开角型青光眼(POAG)是一组进行性视神经病，其特征在于视网膜神经节细胞(RGC)及其轴突的缓慢而渐进的退化，这导致视神经盘的独特外观和伴随形式的视力损失(Zhang等人，2012)。POAG是西方世界中最常见的青光眼类型，是世界范围内失明的一个主要原因，以及非裔美国人中失明的主要原因(Kwon等人，2009)。IOP和年龄是POAG的形成和发展的主要风险因素。

发明内容

本文公开了治疗受试者的青光眼或其症状的方法，该方法包括向该受试者的眼睛施用：与基因的靶位点杂交的指导RNA，其中所述基因编码促成青光眼或其症状的蛋白质；以及在所述靶位点切割所述基因的链的Cas核酸酶，其中切割所述链改变所述基因的表达，从而减少所述蛋白质对青光眼或其症状的贡献。在一些实施方案中，所述方法包括施用修复模板以代替所述基因的一部分。在一些实施方案中，所述方法包括减少所述蛋白质的表达或降低所述蛋白质的活性。在一些实施方案中，所述方法导致减少眼睛中的视网膜神经节细胞衰老。在一些实施方案中，所述方法包括在选自载体、脂质体和核糖核蛋白的递送媒介物中施用编码Cas核酸酶的多核苷酸和指导RNA。在一些实施方案中，所述基因为p16基因。在一些实施方案中，受试者携带野生型p16基因的p16等位基因变体，其中所述野生型p16基因包含SEQ ID NO.36的编码序列。在一些实施方案中，p16等位基因变体携带促成青光眼或其症状的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，单核苷酸多态性为rs1042522处的丙氨酸残基。在一些实施方案中，指导RNA将Cas核酸酶靶向选自SEQ ID NO：17-35的p16基因的序列。在一些实施方案中，所述基因为Six6基因。在一些实施方案中，受试者携带野生型p16基因的p16等位基因变体，其中所述野生型p16基因包含SEQ ID NO.37的编码序列。在一些实施方案中，Six6基因包含rs33912345处胞嘧啶的单核苷酸多态性。

本文进一步公开了治疗受试者的青光眼的方法，该方法包括向该受试者的眼睛施用与p16信使RNA杂交的反义寡核苷酸，从而经由RNA干扰减少p16基因的表达。在一些实施方案中，减少p16基因的表达减少了视网膜神经节细胞衰老。在一些实施方案中，视网膜神经节细胞衰老减少约10％至约90％。在一些实施方案中，视网膜神经节细胞衰老减少至少约40％。在一些实施方案中，反义寡核苷酸为由选自SEQ ID NO：9-13的序列编码的短发夹RNA。在一些实施方案中，反义寡核苷酸在多核苷酸载体、脂质体或核糖核蛋白中施用。

本文进一步公开了用于治疗青光眼的药物组合物，该药物组合物包含：编码Cas蛋白的多核苷酸；以及与选自p16基因和Six6基因的基因的一部分互补的指导RNA。在一些实施方案中，所述药物组合物包含修复模板，其中所述指导RNA将Cas蛋白靶向所述基因，从而导致所述基因的Cas介导的切割和所述修复模板的插入。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的多核苷酸和指导RNA存在于至少一个病毒载体中。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的多核苷酸或指导RNA存在于脂质体中。在一些实施方案中，p16基因包含SEQ ID NO：36的编码序列。在一些实施方案中，p16基因的一部分包含rs1042522处丙氨酸残基的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，指导RNA将Cas核酸酶靶向选自SEQ ID NO：17-35的p16基因的序列。在一些实施方案中，Six6包含SEQ ID NO：37的编码序列。在一些实施方案中，Six6基因的一部分包含rs33912345处胞嘧啶的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，药物组合物被配制成用于采用滴眼管施用的液体。在一些实施方案中，药物组合物被配制成用于玻璃体内施用的液体。

附图说明

本公开内容的各个方面在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1示出了涉及Six6和p16的分子途径，可用治疗剂靶向所述Six6和p16以减少由青光眼眼内压引起的视网膜衰老和失明。

图2显示SIX6蛋白残基141变体以相似效率与DNA结合。图2A，SIX6结构的计算机建模。上图：在位置141具有组氨酸的SIX6的模型；下图：在位置141具有天冬酰胺的SIX6的模型。图2B示出了在来自患者的类淋巴母细胞中SIX6与p27调节元件结合的ChIP-qPCR分析，该分析显示了两种SIX6变体的相似的结合效率。实验重复3次，+/-SD。CTL，阴性对照；还参见图3。

图3(与图2有关)显示Six6蛋白残基141变体以相似效率与DNA结合。图3A示出了通过对已知靶标进行ChIP信号的qPCR分析对SIX6抗体特异性的验证。p27调节区在Six6^-/-视网膜中显示高度减少的信号。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；*p<0.05)。CTL，阴性对照。图3B和图3C示出了在HA标记的SIX6蛋白变体的过表达之后利用SIX6抗体(图3B)或HA抗体(图3C)进行的ChIP-qPCR实验，该实验显示两种形式均与p27调节区有效地结合。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值。+/-SD。CTL，阴性对照。

图4显示了SIX6(rs33912345)和P16/INK4A(rs3731239)的特定等位基因的联合效应，表明了这两个基因之间的功能性相互作用。图4A示出了通过比值比以Z轴绘制的逻辑回归分析的结果。图4B示出了在通过其SIX6(rs33912345)基因型分层的人淋巴细胞中SIX6和P16/INK4A的mRNA表达的RT-qPCR分析。分析了具有rs33912345-AA(非风险等位基因)的四个细胞系和具有rs33912345-CC(风险等位基因)的四个细胞系。通过用GAPDH对结果进行归一化来计算相对mRNA水平，并将其相对于AA基因型表示出。使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；*p<0.05，***p<0.001)。图4C示出了人视网膜的SA-βgal染色，其指示在患有POAG的视网膜中衰老细胞的数目较高。图4D示出了健康和POAG视网膜中衰老细胞的量化(*p<0.05)；还参见图5。

图5示出了在人青光眼视网膜中增加的衰老。图5A示出了人视网膜的SA-βgal分析的若干实例，显示在患有POAG的视网膜中的衰老细胞的数目较高。图5B示出了在四个健康的人类视网膜和四个POAG人类视网膜中p16/INK4A mRNA表达的RT-qPCR分析，显示出在患病视网膜中p16/INK4A转录物的显著上调。使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；*p<0.05)。

图6显示SIX6风险变体的表达增加与较高的衰老比率有关。图6A示出了RT-qPCR分析，显示SIX6-His变体的过表达增加了fRPC中p16/INK4A的表达。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD，***p<0.001)。CTL，阴性对照。图6B示出了RT-qPCR分析，显示SIX6-His变体的过表达增加了293T细胞中P16/INK4A的表达。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；*p<0.05，**p<0.01)。CTL，阴性对照。图6C示出了Western印迹，其证实了两种SIX6变体在瞬时转染实验中相似的表达水平。CTL，阴性对照。图6D示出了与P16/INK4A启动子有关的SIX6变体的ChIP-qPCR分析，该分析显示了相似的结合水平。CTL，阴性对照。图6E示出了用两种SIX6变体中的任一种转染的fRPC的SA-βgal染色，其显示在用SIX6-141His风险变体转染的细胞中衰老比率较高。CTL，阴性对照。图6F示出了在用SIX6变体转染的fRPC中β-半乳糖苷酶阳性细胞的量化。使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；*p<0.05，**p<0.01)。CTL，阴性对照；还参见图7。

图7示出了在免疫筛选的(immunopanned)RGC中Six6蛋白过表达时衰老相关的分泌表型标志物IL6的诱导。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；*p<0.05)。CTL，阴性对照。

图8示出了在IOP升高时视网膜中SIX6的表达增加和细胞衰老的诱导。图8A示出了通过Western印迹分析的在发育过程和成年阶段中小鼠视网膜中SIX6蛋白的表达。图8B示出了Six6和P16/INK4A mRNA水平的RT-qPCR分析，显示与未处理的视网膜(5d CTL)相比，在诱导急性实验性青光眼后5天(5d IOP)IOP升高的小鼠视网膜中SIX6和P16/INK4A的表达升高。实验在8只动物中重复，使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；*p<0.05)。图8C示出了SIX6蛋白结合的ChIP-qPCR分析，该分析显示与未处理的视网膜(5d CTL)相比，在经历急性眼内压升高(5d IOP)的视网膜中SIX6蛋白结合与P16/INK4A启动子的相关性较高。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；*p<0.05)。CTL，阴性对照。图8D示出了ChIP-qPCR分析，显示与未处理的视网膜(5d CTL)相比，在实验性青光眼(5d IOP)中与P16/INK4A启动子相关的p300的水平较高。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；***p<0.001)。CTL，阴性对照。图8E示出了ChIP-qPCR，其显示与未处理的视网膜(5dCTL)相比，在急性眼内压增加(5d IOP)后在P16/INK4A启动子处H3乙酰化的水平较高。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；*p<0.05)。CTL，阴性对照。图8F示出了从处理和未处理的眼睛分离出的平铺封固(flat mount)的视网膜的SA-βgal染色。在IOP处理的组织中明显可见高数目的衰老细胞。还参见图8。

图9示出了在IOP升高时视网膜中Six6蛋白的较高表达和衰老的诱导。图9A和图9B示出了与未处理的视网膜(5d CTL)相比，在IOP升高后5天(5d IOP)，视网膜中p19ARF(图9A)和p15/CDKN2B(图9B)基因表达的RT-qPCR分析。使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；*p<0.05)。图9C示出了野生型和Six6^-/-视网膜的ChIP-qPCR分析，显示了SIX6蛋白在p16调节元件上的富集。实验重复3次，使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；*p<0.05)。CTL，阴性对照。图9D示出了与未处理的视网膜(5d CTL)相比，在IOP升高(5d IOP)后将Six6蛋白募集至p19ARF和p15/CDKN2B启动子的ChIP-qPCR分析。实验进行3次(+/-SD)。CTL，阴性对照。图9E示出了从处理(5d IOP)和未处理(5d CTL)的眼睛分离出的平铺封固的视网膜的SA-βgal染色，其显示了在处理的组织中高数目的衰老细胞。图9F和图9G分别示出了在提供的小鼠#1和小鼠#2的视网膜中SA-βgal阳性细胞数目的量化。使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；**p<0.01，***p<0.001)。

图10显示IOP升高主要影响视网膜神经节细胞。图10A，在IOP处理(5d IOP)或未处理(5d CTL)的视网膜中横截面的SA-βgal染色。衰老细胞位于神经节细胞层(GCL)中。图10B，采用SA-βgal和BRN3A抗体对IOP处理(5d IOP)或未处理(5d CTL)的平铺封固的视网膜的双重染色。大多数衰老细胞也是BRN3A阳性的。图10C，使用抗-GFP抗体对IOP处理的Thy1-CFP视网膜进行的免疫染色。大多数SA-βgal阳性细胞也是Thy1-CFP阳性的。图10D，免疫筛选示意图，图10E，与未转染(RGC-CTL)或GFP转染(RGC-GFP)纯化的大鼠视网膜神经节细胞相比，His而非Asn形式的Six6显著上调p16/INK4A表达。使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；*p<0.05)。还参见图10。

图11显示IOP升高影响视网膜神经节细胞。图11A，在IOP处理的Thy1-CFP视网膜中双重的SA-βgal和CFP阳性细胞的若干示例。图11B，使用抗-GFP和抗-IL6抗体对IOP处理(5dIOP)和未处理(5d CTL)的Thy1-CFP视网膜进行的免疫染色。特别是在IOP处理的组织中，双重阳性细胞的数目增加。图11C，在3个随机选择的视野中IOP处理的视网膜中IL6/CFP双重阳性细胞的量化(+/-SD)。图11D，在培养物中2天后通过免疫筛选的纯化的RGC。图11E，通过RT-qPCR测量全部视网膜细胞和免疫筛选的细胞中的Brn3a的表达。使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；***p<0.001)。图11F，使用RT-qPCR测量Six6的His和Asn变体在转染细胞中的过表达水平。+/-SD。图11G，与未转染的细胞(RGC-CTL)相比，在Six6变体或GFP(RGC-GFP)过表达时，RGC中的IL6表达的RT-qPCR分析。使用双尾Student t检验计算p值(+/-SD；*p<0.05)。

图12显示Six6或P16的缺乏防止青光眼中的RGC死亡。图12A和图12B示出了在IOP处理(5d IOP)时Six6(图12A)和P16/INK4A(图12B)mRNA水平的RT-qPCR分析，显示与未处理(5d CTL)的视网膜相比，Six6和P16/INK4A的表达仅在野生型(Six6^+/+)视网膜中增加，而在Six6^+/-视网膜中并不增加。实验在8只动物中重复，使用双尾Student t检验计算p值。(+/-SD；*p<0.05，**p<0.01)。图12C示出了对从Six6^+/+和Six6^+/-小鼠的IOP处理和未处理的眼睛分离的平铺封固的视网膜的SA-β-半乳糖苷酶染色，其显示在从杂合小鼠分离出的处理组织中缺乏衰老细胞(蓝条)。图12D，在野生型和P16^-/-小鼠中处理和未处理的视网膜中RGC比的量化。图12E，在野生型和p53KO小鼠中IOP处理和未处理的视网膜中RGC比的量化。图12F，在青光眼中Six6上调时导致RGC死亡的事件顺序的模型。还参见图13。

图13显示Six6的缺乏防止RGC衰老。与Six6^+/+眼睛相比，对从IOP处理(5d IOP)和未处理(5d CTL)Six6^+/-眼睛分离的平铺封固的小鼠视网膜的SA-βgal染色显示在IOP升高时衰老细胞的数目没有增加(底部图)，右侧图：在提供的视网膜中SA-βgal阳性细胞的量化，+/-SD。

图14描绘了在治疗青光眼的受试者的视网膜中测试p16基因编辑的示例性模型的图示。

图15描绘了编码p16sgRNA的载体和编码Cas9的载体的图示。ITR：末端反向重复序列。U6启动子：pol III启动子。hSyn：神经元特异性长期表达启动子。KASH(Klarsicht，ANC-1和Syne/Nesprin同源性)：中间体蛋白质细胞核迁移，蛋白质锚定。hGHpA：人生长激素polyA。EF1α启动子：人延伸因子-1α启动子。HA：标签(人流感血凝素)。

图16示出了在p16基因编辑后接受假处理(对照，正常的眼睛)、升高的眼内压或升高的眼压的小鼠中RGC细胞的数目(每一高倍视野)。

图17示出了在小鼠与人之间高度保守的p16外显子的比对。

具体实施方式

青光眼是世界范围内影响数千万人的失明的主要原因。尽管青光眼发病率高，但对其病因学和发病机理知之甚少并且治疗局限于降低IOP。虽然有侵袭性IOP降低疗法，但大多数患者逐渐丧失视功能并且一些患者将会最终变成法定盲人。存在眼内压升高的多种类型的青光眼，所有这些青光眼均可受益于本文公开的方法和组合物。

SIX6是参与视网膜发育的同源框转录因子的SIX/Sine眼家族的成员。SIX6已被证明在小鼠发育过程中直接调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因的表达。虽然SIX6在视网膜发育过程中的作用正在被多个实验室研究，但极少数报告对于它在成年人视网膜或青光眼发病机理中的分子作用进行探索。若干种SIX6突变和单核苷酸多态性(SNP)已被证明与人类中的眼发育缺陷有关。另外，若干种SNP已与增加的青光眼风险相关联。SIX6变体的影响总是在鉴定疾病过迟后被评估，并且该方法无法正确分离发育缺陷与引起该疾病的遗传组分。

SIX6变体(编码SIX-His的组氨酸)在本文称为“风险变体”，它实际上是跨类群进化保守的。仅在人类分支中检测到Asn变体(青光眼的保护等位基因)；然而对于为何人类具有保护变体是有利的仍未知。若干研究组通过在斑马鱼中过表达人His变体进行救援实验，并且发现该实验无法救援由内源性SIX6蛋白的去除所引起的眼缺陷。有趣的是，zSix6a和zSix6b均在直系同源位置携带His氨基酸。这些结果表明，人His形式的SIX6无法救援眼表型很可能是其他残基的物种特异性差异的结果，而不是His/Asn变体的单独作用。

本文描述的实验表明细胞衰老在青光眼的发病机理中发挥关键作用。细胞衰老是不可逆的生长停滞的状态。当衰老细胞在组织中积累时，其受损的功能可导致疾病发展和/或进展的倾向。如本文所示，SIX6直接调节P16/INK4A(细胞衰老和老化的指示物)的表达。此外，在急性IOP升高时，P16/INK4A表达上调，这转而可引起RGC的死亡(参见图1)。因此，P16/INK4A上调似乎是多种信号如遗传风险、年龄和其他因素如升高的IOP的下游整合。这可提供对于最常见风险因素IOP如何引起青光眼的解释。此外，它还提供了遗传易感性与青光眼的发病机理的其他因素之间的分子联系。

P16/INK4A在本领域被分类为肿瘤抑制基因，并且由被称为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)的基因编码。针对本申请的目的，该基因以及分别由该基因转录或翻译的任何RNA或蛋白质将被称为p16。

如本文所示，SIX6His变体在IOP升高时增加P16/INK4A表达，这转而使得RGC进入衰老状态，从而可导致青光眼中RGC死亡的增加。本文描述的实验结果提供了对于青光眼的发病机理的重要见解，并促使利用CRISPR/Cas基因编辑系统减少P16/INK4A基因表达。

P16是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和细胞周期进程的有效负调节剂。因此，如通过SAβ-gal测定和SASP所测量的上调的P16/INK4A表达和衰老表型通常指示不可逆的细胞周期停滞。意外地，在视网膜神经节细胞(有丝分裂后神经元)中观察到升高的p16表达和衰老，所述细胞被认为是不能复制的。因此，一种可能性是RGC可含有能复制的干细胞样群体；或者，p16可能在这些有丝分裂后细胞中发挥先前未认识到的作用。

除了SIX6和P16/INK4以外，还可能存在涉及IOP、RGC死亡和青光眼的发展的其他因素。本文描述的实验结果还表明，细胞衰老中的另一个关键参与者P53促成RGC死亡，如通过在缺乏p53的小鼠中RGC免受IOP诱导的损害所证实的。另外的数据显示在IOP诱导视网膜损害时，衰老相关的分泌表型(SASP)的组分，即分泌型分子的表达增加。此外，白介素1(IL1)的诱导是对IOP诱导的RGC损害的早期反应。已知IL1的诱导转而导致激活NF-kB依赖性衰老相关的IL6和IL8表达。这些数据表明，衰老相关的细胞因子网络在IOP处理的视网膜中被激活。位于9p21基因座中的其他基因也在青光眼的病理中具有潜在作用。例如，p19ARF可通过影响眼脉管系统发育而独立地促成青光眼发病机理。

本文公开了用于预防和治疗青光眼的核酸疗法。核酸疗法(例如，RNAi、CRISPR/Cas)是具有高选择性和特异性的靶向疗法。然而，在一些情况下，核酸疗法还受到不良的细胞内摄取、有限的血液稳定性和非特异性免疫刺激的阻碍。为了解决这些问题，探索了核酸组合物的多种修饰，例如，针对更好的稳定性和/或更低的毒性的新型接头、针对提高的靶特异性和/或靶递送的结合部分的优化，以及针对提高的稳定性和/或减小的脱靶效应的核酸聚合物修饰。

在一些实施方案中，组成核酸组合物的不同组分的排列或顺序进一步影响细胞内摄取、稳定性、毒性、功效和/或非特异性免疫刺激。例如，如果核酸组分包括结合部分、聚合物和多核酸分子(或多核苷酸)，则结合部分、聚合物和/或多核酸分子(或多核苷酸)的顺序或排列(例如，结合部分-多核酸分子-聚合物、结合部分-聚合物-多核酸分子或聚合物-结合部分-多核酸分子)进一步影响细胞内摄取、稳定性、毒性、功效和/或非特异性免疫刺激。

治疗平台

本文公开了治疗受试者的青光眼的方法，该方法包括向该受试者施用抑制肿瘤抑制基因的表达的治疗剂，其中在眼部细胞中通过眼内压上调所述肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，该肿瘤抑制基因为p16。本文进一步公开了治疗受试者的青光眼的方法，该方法包括向该受试者施用抑制诱导视网膜神经节细胞衰老的蛋白质的治疗剂。本文公开了治疗受试者的青光眼的方法，该方法包括向该受试者施用抑制p16基因表达或p16基因表达产物(例如，RNA或蛋白质)表达或活性的治疗剂。本文进一步公开了治疗受试者的青光眼的方法，该方法包括向该受试者施用抑制Six6表达或Six6基因表达产物表达或活性的治疗剂。

在一些实施方案中，所述青光眼为原发性开角型青光眼(POAG)，也称为原发性开角型青光眼、慢性开角型青光眼、慢性单纯性青光眼和单纯性青光眼。POAG通常是由小梁堵塞或眼部排水渠道的阻塞引起的。本文提供的实例证明了本文所述针对POAG的方法和组合物的有用性。然而，这些实例绝非意在将本发明的实用性局限于POAG。本领域技术人员将容易理解如何将本文公开的方法和组合物用于包含眼内压的任何病况，如青光眼。

在一些实施方案中，所述青光眼为原发性闭角型青光眼，也称为原发性闭角型青光眼、狭角性青光眼、瞳孔阻滞性青光眼、急性充血性青光眼、间歇性闭角型青光眼、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼。原发性闭角型青光眼可由虹膜接触小梁网进而阻止房水从眼部流出，从而导致眼内压升高而引起。在一些实施方案中，所述青光眼为选自原发性先天性青光眼、婴幼儿型青光眼或遗传性青光眼(例如，青光眼家族史)的发育性青光眼。

在一些实施方案中，所述受试者已被诊断患有青光眼。在一些实施方案中，本文公开的方法包括诊断受试者患有青光眼。在一些实施方案中，诊断包括执行选自以下方法的至少一种方法：眼压测量法、前房角检查、视神经的可见损伤的检查、杯盘比的测量、视野测试、光学相干断层扫描、扫描激光偏振测量和扫描激光检眼镜检查。在一些实施方案中，当受试者的眼压大于或等于21mmHg或2.8kPa时将该受试者诊断为患有青光眼。一般认为正常的眼压在10mmHg与20mmHg之间，平均为15.5mmHg，有约2.75mmHg的波动。在一些实施方案中，当受试者具有异常的视杯(例如，杯盘比大于0.3)时，将该受试者诊断为患有青光眼。在一些实施方案中，当受试者具有青光眼的风险因素时，对该受试者进行诊断，所述风险因素包括但不限于眼内压、青光眼家族史、偏头痛、高血压、肥胖症及其组合。

本文公开的方法和组合物可减轻青光眼的症状。在一些实施方案中，青光眼的症状选自失明、视力下降、视力模糊、侧面视力下降、视野减小、杯盘比大于0.3、眼痛、看到光晕、红眼、眼内压很高(>30mmHg)、恶心、呕吐、固定的中等散大瞳孔和椭圆形瞳孔。在一些实施方案中，受试者不经历任何眼痛。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可与多种已知的青光眼疗法组合得到治疗青光眼的多管齐下的方法。已知的青光眼疗法包括但不限于药物、激光治疗和手术。在一些实施方案中，所述药物包括前列腺素类似物、β肾上腺素能受体拮抗剂、α2-肾上腺素能激动剂、肾上腺素、有丝分裂剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂或碳酸酐酶抑制剂。在一些实施方案中，所述激光治疗选自氩激光小梁成形术、选择性激光小梁成形术、Nd:YAG激光周边虹膜切开术或二极管激光环消融(Diode laser cycloablation)。在一些实施方案中，所述手术选自管道成形术、小梁切除术、青光眼引流性植入物的应用和巩膜切除术。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物比已知的青光眼疗法更可取，因为与已知的青光眼疗法相比它们侵袭性较小、眼部受损的风险较低或存在较少副作用。RNA干扰(RNAi)

在一些实施方案中，所述治疗剂为反义寡核苷酸，其为能够经由RNA干扰抑制p16基因表达的合成RNA链。在一些实施方案中，所述治疗剂为反义寡核苷酸，其为能够经由RNA干扰抑制Six6基因表达的合成RNA链。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸包含修饰，该修饰提供对天然存在的DNA酶的消化或降解的抗性。在一些实施方案中，该修饰为在反义寡核苷酸合成期间使用固相亚磷酰胺方法对反义寡核苷酸的磷酸二酯骨架的修饰。这将会有效地使大多数形式的DNA酶对该反义寡核苷酸无效。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含以两种方法最有效地促进或增强反义寡核苷酸摄取的递送系统。在一些实施方案中，该递送系统包括易于被人类细胞吸收的脂质体或脂质容器。在一些实施方案中，该递送系统是由tat蛋白介导的系统，其允许大分子如寡核苷酸容易地转移通过细胞膜。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸为小发夹RNA(shRNA)。这些RNA链通过靶向由感兴趣的基因产生的mRNA而使该基因沉默。在一些实施方案中，该shRNA可经由计算机软件而定制设计，并使用设计模板在商业上制备。在一些实施方案中，使用细菌质粒、细菌DNA的环状链或携带病毒载体的病毒来递送shRNA。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸靶向由p16基因编码的RNA。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向由Six6基因编码的RNA。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向由p53基因编码的RNA。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向由IL1基因编码的RNA。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向由CDKN2D基因编码的RNA。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸为与由p16基因编码的转录物的一部分杂交的siRNA或shRNA，其中该转录物的一部分由在人p16基因的位置23836-24142处发现的外显子(参见表7中的SEQ ID NO：1)编码。该外显子在小鼠p16与人p16之间高度保守(参见，例如，图17)。在一些实施方案中，该反义寡核苷酸靶向对应于(例如，用U核苷酸代替T核苷酸)选自SEQ ID NO：36-40的序列的RNA。

在一些实施方案中，siRNA的长度为约18个核苷酸至约30个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的长度为25个核苷酸。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸与p16转录物的靶序列杂交。在一些实施方案中，靶序列为选自SEQ ID NO：4-8的序列。在一些实施方案中，靶序列由选自SEQ ID NO：9-13(参见表7)的序列编码。在一些实施方案中，靶序列由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少90％同源的序列编码。在一些实施方案中，靶序列由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约80％同源的序列编码。在一些实施方案中，靶序列由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约85％同源的序列编码。在一些实施方案中，靶序列由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约90％同源的序列编码。在一些实施方案中，靶序列由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约95％同源的序列编码。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸为靶向p16转录物的shRNA。在一些实施方案中，该shRNA由选自SEQ ID NO：9-13(参见表7)的序列编码。在一些实施方案中，该shRNA由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少90％同源的序列编码。在一些实施方案中，该shRNA由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约80％同源的序列编码。在一些实施方案中，该shRNA由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约85％同源的序列编码。在一些实施方案中，该shRNA由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约90％同源的序列编码。在一些实施方案中，该shRNA由与选自SEQ ID NO：9-13的序列至少约95％同源的序列编码。

基因编辑

在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用基因组编辑来修饰细胞中的DNA分子，以用于青光眼的治疗。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用基因组编辑来修饰细胞中的靶基因，以用于青光眼的治疗。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用核酸酶或核酸酶系统。在一些实施方案中，核酸酶系统包含位点定向核酸酶。合适的核酸酶包括但不限于CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute蛋白；其任何衍生物；其任何变体；以及其任何片段。在一些实施方案中，可对本文公开的位点定向核酸酶进行修饰，以便产生能够在不进行切割的情况下位点特异性地结合靶序列的催化失效核酸酶，从而阻断转录并降低靶基因表达。

在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用核酸指导的核酸酶系统。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)、CRISPR相关(Cas)蛋白系统用于核酸分子的修饰。在一些实施方案中，本文公开的CRISPR/Cas系统包含Cas核酸酶和指导RNA。在一些实施方案中，本文公开的CRISPR/Cas系统包含Cas核酸酶、指导RNA和修复模板。该指导RNA将Cas核酸酶引导至靶序列，在此处该Cas核酸酶切割靶序列或使靶序列产生切口，从而产生切割位点。在一些实施方案中，该Cas核酸酶产生双链断裂(DSB)，该双链断裂经由非同源末端连接(NHEJ)而修复。然而，在一些实施方案中，未介导的或非定向NHEJ介导的DSB修复导致开放阅读框的破坏，从而导致不期望的结果。为了规避这些问题，在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用待插入切割位点处的修复模板，从而允许控制最终编辑的基因序列。修复模板的这种使用可称为同源性指导的修复(HDR)。

在一些实施方案中，所述修复模板包含对应于靶基因的野生型序列。在一些实施方案中，所述修复模板包含待递送至切割位点的期望序列。在一些实施方案中，该期望序列不是野生型序列。在一些实施方案中，除了用来校正或改变靶基因表达/活性的一个或多个经编辑的核苷酸之外，该期望序列与靶序列相同。例如，与含有单核苷酸多态性的靶序列相比，该期望序列可包含单核苷酸差异，其中该单核苷酸差异是对单核苷酸多态性的核苷酸的置换，该置换恢复野生型表达/活性或相对于靶基因改变表达/活性。

任何合适的CRISPR/Cas系统均可用于本文公开的方法和组合物。可使用多种命名系统来提及CRISPR/Cas系统。在Makarova,K.S.等人,“An updated evolutionaryclassification of CRISPR-Cas systems,”Nat Rev Microbiol(2015)13:722-736和Shmakov,S.等人,“Discovery and Functional Characterization of Diverse Class2CRISPR-Cas Systems,”Mol Cell(2015)60:1-13中提供了示例性命名系统。CRISPR/Cas系统可为I型、II型、III型、IV型、V型、VI型系统或任何其他合适的CRISPR/Cas系统。如本文所使用的CRISPR/Cas系统可为1类、2类或任何其他适当分类的CRISPR/Cas系统。1类CRISPR/Cas系统可使用多种Cas蛋白的复合体来实现调节。1类CRISPR/Cas系统可包括，例如，I型(例如，I、IA、IB、IC、ID、IE、IF、IU)、III型(例如，III、IIIA、IIIB、IIIC、IIID)和IV型(例如，IV、IVA、IVB)CRISPR/Cas类型。2类CRISPR/Cas系统可使用单个大Cas蛋白来实现调节。2类CRISPR/Cas系统可包括，例如，II型(例如，II、IIA、IIB)和V型CRISPR/Cas类型。CRISPR系统可彼此互补，和/或可借助反式功能单元来促进CRISPR基因座靶向。

所述Cas蛋白可为I型、II型、III型、IV型、V型或VI型Cas蛋白。该Cas蛋白可包含一个或多个域。域的非限制性实例包括指导核酸识别域和/或指导核酸结合域、核酸酶域(例如，DNA酶域或RNA酶域、RuvC、HNH)、DNA结合域、RNA结合域、解旋酶域、蛋白质-蛋白质相互作用域和二聚化域。指导核酸识别域和/或指导核酸结合域可与指导核酸相互作用。核酸酶域可包括用于核酸切割的催化活性。核酸酶域可缺乏用于防止核酸切割的催化活性。该Cas蛋白可为与其他蛋白质或多肽融合的嵌合Cas蛋白。该Cas蛋白可为各种Cas蛋白的嵌合体，例如，包含来自不同Cas蛋白的域。

Cas蛋白的非限制性实例包括c2c1、C2c2、c2c3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csnl或Csxl2)、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966以及它们的同源物或修饰形式。

所述Cas蛋白可来自任何合适的生物体。非限制性实例包括酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属的种(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinae spiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromo genes)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、假真菌样芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤蓝细菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌属的种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝丝菌属的种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊蓝细菌(Microcystisaeruginosa)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、聚球蓝细菌属的种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、Ammonifexdegensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、喜温发酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、Allochromatium vinosum、海杆菌属的种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、Methanohalobium evestigatum、多变鱼腥蓝细菌(Anabaenavariabilis)、产泡沫节球蓝细菌(Nodularia spumigena)、念珠蓝细菌属的种(Nostocsp.)、最大节螺蓝细菌(Arthrospira maxima)、盘状节螺蓝细菌(Arthrospiraplatensis)、节螺蓝细菌属的种(Arthrospira sp.)、鞘丝蓝细菌属的种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤蓝细菌属的种(Oscillatoria sp.)、Petrotoga mobilis、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、深海单细胞蓝藻(Acaryochloris marina)、Leptotrichia shahii和新凶手弗朗西丝氏菌(Francisellanovicida)。在一些方面，该生物体为酿脓链球菌。在一些方面，该生物体为金黄色葡萄球菌。在一些方面，该生物体为嗜热链球菌。

所述Cas蛋白可衍生自多个细菌种，包括但不限于非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypical)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、Solobacterium moorei、尖锐粪球菌(Coprococcus catus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、Peptoniphilus duerdenii、Catenibacteriummitsuokai、变异链球菌(Streptococcus mutans)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)、伪中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcusintestine)、Olsenella uli、北原酒球菌(Oenococcus kitaharae)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、大芬戈尔德菌、运动支原体(Mycoplasma mobile)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、犬支原体(Mycoplasma canis)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、直肠假杆菌(Eubacteriumrectale)、嗜热链球菌、长真杆菌(Eubacterium dolichum)、棒状乳杆菌极取亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens)、多养型泥杆菌(Ilyobacterpolytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)、Elusimicrobium minutum、Nitratifractorsalsuginis、Sphaerochaeta globus、产琥珀酸丝状杆菌产琥珀酸亚种(Fibrobactersuccinogenes subsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、血色红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、彩虹普雷沃菌(Prevotella micans)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、少食氨基单胞菌(Aminomonaspaucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、Candidatus Puniceispirillummarinum、Verminephrobacter eiseniae、Ralstonia syzygii、Dinoroseobacter shibae、固氮螺菌属(Azospirillum)、汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、Acidovorax ebreus、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、Roseburiaintestinalis、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、多杀巴斯德氏菌属多杀亚种(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、华德萨特菌(Sutterellawadsworthensis)、变形菌(proteobacterium)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、Parasutterella excrementihominis、产琥珀酸沃林氏菌和新凶手弗朗西丝氏菌。术语“衍生”在这种情况下被定义为从细菌种的天然存在的品种进行修饰，以保持细菌种的天然存在的品种的重要部分或与细菌种的天然存在的品种的显著同源性。重要部分可为至少10个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸、至少30个连续核苷酸、至少40个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少60个连续核苷酸、至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸。显著同源性可为至少50％的同源性、至少60％的同源性、至少70％的同源性、至少80％的同源性、至少90％的同源或至少95％的同源性。可在保留天然存在的品种的活性的同时对衍生的种进行修饰。

在一些实施方案中，本文所述方法和细胞所利用的CRISPR/Cas系统为II型CRISPR系统。在一些实施方案中，该II型CRISPR系统包含用于修饰核酸分子的修复模板。该II型CRISPR系统在细菌酿脓链球菌中已有描述，其中Cas9和两个非编码小RNA(pre-crRNA和tracrRNA(反式激活CRISPR RNA))以序列特异性方式共同靶向并降解感兴趣的核酸分子(参见Jinek等人,“A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in AdaptiveBacterial Immunity,”Science 337(6096):816-821(2012年8月，2012年6月28日电子公开))。在一些实施方案中，连接两个非编码小RNA以产生被称为指导RNA的单核酸分子。

在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞使用指导核酸。指导核酸是指可与另一核酸杂交的核酸。该指导核酸可为RNA。该指导核酸可为DNA。为DNA的指导核酸可比指导RNA更稳定。该指导核酸可被编程用于以位点特异性方式与核酸序列结合。待靶向的核酸或靶核酸可包含核苷酸。该指导核酸可包含核苷酸。靶核酸的一部分可与该指导核酸的一部分互补。该指导核酸可包含一条多核苷酸链，并且可被称为“单指导核酸”(即“单指导核酸”)。该指导核酸可包含两条多核苷酸链，并且可被称为“双指导核酸”(即“双指导核酸”)。如果没有另外规定，术语“指导核酸”是包含性的，同时指代单指导核酸和双指导核酸。

所述指导核酸可包含可被称为“指导区段”或“指导序列”的区段。所述指导核酸可包含可被称为“蛋白质结合区段”或“蛋白质结合序列”的区段。

所述指导核酸可包含一个或多个修饰(例如，碱基修饰，骨架修饰)，从而为核酸提供新的或增强的特征(例如，改善的稳定性)。该指导核酸可包含核酸亲和标签。该指导核酸可包含核苷。该核苷可以是碱基-糖的组合。该核苷的碱基部分可为杂环碱基。这类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于那些包含戊呋喃糖基糖的核苷，磷酸基团可与糖的2'、3'或5'羟基部分连接。在形成指导核酸时，磷酸基团可使相邻的核苷彼此共价连接从而形成线性聚合化合物。继而，该线性聚合物的各个末端可进一步连接从而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可具有内部核苷酸碱基互补性，并因此可以以产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在指导核酸内，磷酸基团通常被认为形成指导核酸的核苷间骨架。指导核酸的键或骨架可为3'至5'磷酸二酯键。

所述指导核酸可包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架可包括保留骨架中的磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。

其中含有磷原子的合适的修饰指导核酸骨架可包括，例如，具有正常3'-5'键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸甲酯和其他烷基膦酸酯如3'-亚烷基膦酸酯，5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚磷酸酯、包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在内的氨基磷酸酯、磷二酰胺、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯、2'-5'连接的类似物，以及极性倒置的那些，其中一个或多个核苷酸间键为3'至3'、5'至5'或2'至2'键。合适的极性倒置的指导核酸可在最3'端的核苷酸间键处包含单个3'至3'键(即，其中核碱基缺失或被羟基基团替代的单个倒置核苷残基)。还可包括各种盐(例如，氯化钾或氯化钠)形式、混合盐形式和游离酸形式。

所述指导核酸可包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子的核苷间键，特别是-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-(即，亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架)、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-(其中天然磷酸二酯的核苷酸间键以-O-P(＝O)(OH)-O-CH₂-表示)。

所述指导核酸可包含吗啉代骨架结构。例如，所述指导核酸可包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷二酰胺或其他非磷酸二酯的核苷间键代替磷酸二酯键。

所述指导核酸可包含由短链烷基或环烷基的核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基的核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环的核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些多核苷酸骨架可包括具有吗啉代键的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物骨架、亚砜骨架和砜骨架；甲酰乙酰骨架和硫代甲酰乙酰骨架；亚甲基甲酰乙酰骨架和硫代甲酰乙酰骨架；核糖乙酰骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH₂组成部分的其他骨架。

所述指导核酸可包含核酸模拟物。术语“模拟物”旨在包括其中仅呋喃糖环被非呋喃糖基团取代或呋喃糖环和核苷酸间键均被非呋喃糖基团取代的多核苷酸，仅呋喃糖环的取代也可称为糖替代物。可保留杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以供与合适的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可被含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架代替。核苷酸可被保留并与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。PNA化合物中的骨架可包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这为PNA提供含酰胺的骨架。杂环碱基部分可与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。

所述指导核酸可包含连接的吗啉代单元(即吗啉代核酸)，该单元具有与吗啉代环附接的杂环碱基。连接基团c可连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子型吗啉代的寡聚化合物可与细胞蛋白质具有不受欢迎程度较低的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可为指导核酸的非离子型模拟物。可使用不同的连接基团接合吗啉代类别中的多种化合物。另一类多核苷酸模拟物可被称为环己烯基核酸(CeNA)。常存在于核酸分子中的呋喃糖环可被环己烯环代替。可使用亚磷酰胺化学法制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体，并将其用于寡聚化合物合成。CeNA单体并入核酸链中可增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可与核酸互补体形成复合体，该复合体与天然复合体具有相似的稳定性。进一步的修饰可包括锁定核酸(LNA)，其中2'羟基基团与糖环的4'碳原子连接，由此形成2'-C,4'-C-氧基亚甲基键，从而形成双环糖部分。该键可为亚甲基(-CH2-)，桥接2'氧原子和4'碳原子的基团，其中n为1或2。LNA和LNA类似物可展示出与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对3'核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性性质。

所述指导核酸可包含一个或多个取代的糖部分。合适的多核苷酸可包含选自以下的糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基。特别合适的是O((CH₂)_nO)mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON((CH₂)_nCH₃)₂，其中n和m为1至约10。糖取代基可选自：C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善指导核酸的药代动力学性质的基团，或用于改善指导核酸的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。合适的修饰可包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE，即烷氧基烷氧基基团)。另外的合适修饰可包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基(即，O(CH₂)₂ON(CH₃)2基团，也称为2'-DMAOE)和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂。

其他合适的糖取代基可包括甲氧基(-O-CH₃)、氨基丙氧基(--O CH₂CH₂CH₂NH₂)、烯丙基(-CH₂-CH＝CH₂)、-O-烯丙基(--O--CH₂—CH＝CH₂)和氟(F)。2'-糖取代基可在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。合适的2'-阿拉伯糖修饰为2'-F。还可在寡聚化合物上的其他位置，特别是3'末端核苷上或2'-5'连接的核苷酸中的糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置处进行类似的修饰。寡聚化合物还可具有替代戊呋喃糖基糖的糖模拟物，如环丁基部分。

所述指导核酸还可包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或置换。如本文所使用的“未修饰的”或“天然”核碱基可包括嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))和嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶U))。修饰的核碱基可包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-氟尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶，以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可包括三环嘧啶，如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-封条(G-clamp)如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H吡啶并(3',2':4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。

杂环碱基部分可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环代替的那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。核碱基可用于增加多核苷酸化合物的结合亲和力。这些核碱基可包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶置换可使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且可以是合适的碱基置换(例如，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时)。

指导核酸的修饰可包括将指导核酸与可增强指导核酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接。这些部分或缀合物可包括与官能团如伯羟基基团或仲羟基基团共价结合的缀合物基团。缀合物基团可包括但不限于嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团，以及可增强寡聚物的药代动力学性质的基团。缀合物基团可包括但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。可增强药代动力学性质的基团包括改善核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分可包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分、胆酸硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂肪链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸三乙铵)、多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。

修饰可包括“蛋白质转导域”或PTD(即细胞穿透肽(CPP))。PTD可指促进穿过脂双层、微团、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或者有机或无机化合物。PTD可与范围可从小极性分子到大型大分子和/或纳米颗粒的另一分子相附接，并且可促进分子穿过膜，例如，从细胞外空间去往细胞内空间，或从细胞质去往细胞器内。PTD可与多肽的氨基末端共价连接。PTD可与多肽的羧基末端共价连接。PTD可与核酸共价连接。示例性PTD可包括但不限于最小肽蛋白质转导域；包含足以直接进入细胞的许多精氨酸(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列；VP22域；果蝇(Drosophila)触角足蛋白转导域；截短的人降钙素肽；聚赖氨酸；和转运蛋白；从3个精氨酸残基到50个精氨酸残基的精氨酸均聚物。PTD可以是可激活的CPP(ACPP)。ACPP可包括经由可切割接头与匹配的聚阴离子(例如，Glu9或“E9”)连接的聚阳离子CPP(例如，Arg9或“R9”)，其可使净电荷降低至接近零，从而抑制向细胞中的黏附和摄取。在接头切割时，聚阴离子可被释放，局部地暴露聚精氨酸及其固有的黏着性，从而“激活”ACPP以穿过膜。

本公开内容提供了指导核酸，其可将相关多肽(例如，位点定向多肽)的活性引导至靶核酸内的特异性靶序列。该指导核酸可包含核苷酸。该指导核酸可为RNA。该指导核酸可为DNA。该指导核酸可包括单指导核酸。该指导核酸可包含间隔区延伸和/或tracrRNA延伸。该间隔区延伸和/或tracrRNA延伸可包含向指导核酸贡献附加功能(例如，稳定性)的元件。在一些实施方案中，该间隔区延伸和tracrRNA延伸是可选的。该指导核酸可包含间隔区序列。该间隔区序列可包含与靶核酸序列杂交的序列。该间隔区序列可为指导核酸的可变部分。该间隔区序列的序列可被工程化以与靶核酸序列杂交。CRISPR重复(即，在本示例性实施方案中指最小CRISPR重复)可包含可与tracrRNA序列(即，在本示例性实施方案中指最小tracrRNA序列)杂交的核苷酸。最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列可相互作用，相互作用分子包含碱基配对的双链结构。最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列可一同促进与位点定向多肽结合。最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列可通过单指导连接体连接在一起，从而形成发夹结构。3’tracrRNA序列可包括前间区序列邻近基序的识别序列。3’tracrRNA序列可与tracrRNA序列的一部分相同或相似。在一些实施方案中，3’tracrRNA序列可包含一个或多个发夹。

在一些实施方案中，所述指导核酸可包括单指导核酸。该指导核酸可包含间隔区序列。该间隔区序列可包含可与靶核酸序列杂交的序列。该间隔区序列可为指导核酸的可变部分。该间隔区序列可在第一双链体的5’侧。第一双链体可包含最小CRISPR重复与最小tracrRNA序列之间的杂交区域。第一个双链体可被凸起(bulge)中断。该凸起可包含未配对的核苷酸。该凸起可促进向指导核酸募集位点定向多肽。该凸起之后可以是第一茎。第一茎可包含连接最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列的接头序列。第一双链体3'端的最后的配对核苷酸可与第二接头序列连接。第二接头可包含P。第二接头可将第一双链体与中间tracrRNA连接。在一些实施方案中，中间tracrRNA可包含一个或多个发夹区。例如，中间tracrRNA可包含第二茎和第三茎。

在一些实施方案中，所述指导核酸可包括双指导核酸结构。与单指导核酸结构类似，双指导核酸结构可包含间隔区延伸、间隔区、最小CRISPR重复、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和tracrRNA延伸。然而，双指导核酸可以不包含单指导连接体。作为替代，最小CRISPR重复可包含可与CRISPR重复的一部分相似或相同的3'CRISPR重复序列。类似地，最小tracrRNA序列可包含可与tracrRNA的一部分相似或相同的5'tracrRNA序列。双指导RNA可经由最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列杂交在一起。

在一些实施方案中，第一区段(即，指导区段)可包含间隔区延伸和间隔区。指导核酸可经由上述指导区段将结合的多肽引导至靶核酸内的特定核苷酸序列。

在一些实施方案中，第二区段(即，蛋白质结合区段)可包含最小CRISPR重复、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和/或tracrRNA延伸序列。指导核酸的蛋白质结合区段可与位点定向多肽相互作用。指导核酸的蛋白质结合区段可包含可彼此杂交的两段核苷酸。蛋白质结合区段的核苷酸可杂交形成双链的核酸双链体。该双链核酸双链体可为RNA。该双链核酸双链体可为DNA。

在一些情况下，指导核酸可以以5'至3'的顺序包含间隔区延伸、间隔区、最小CRISPR重复、单指导连接体、最小tracrRNA、3'tracrRNA序列和tracrRNA延伸。在一些情况下，指导核酸可以以任何顺序包含tracrRNA延伸、3'tracrRNA序列、最小tracrRNA、单指导连接子、最小CRISPR重复序列、间隔区和间隔区延伸。

指导核酸和位点定向多肽可形成复合体。指导核酸可通过包含可与靶核酸序列杂交的核苷酸序列而提供对复合体的靶特异性。换言之，可借助位点定向多肽与指导核酸的至少蛋白质结合区段的缔合将位点定向多肽引导至核酸序列。指导核酸可针对Cas9蛋白的活性。指导核酸可针对酶促灭活的Cas9蛋白的活性。

本公开内容的方法可提供遗传修饰的细胞。遗传修饰的细胞可包含外源指导核酸和/或包含编码指导核酸的核苷酸序列的外源核酸。

间隔区延伸序列

间隔区延伸序列可提供稳定性和/或提供用于修饰指导核酸的位置。间隔区延伸序列可具有约1个核苷酸至约400个核苷酸的长度。间隔区延伸序列可具有多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、40、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸的长度。间隔区延伸序列可具有少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000个或更多个核苷酸的长度。间隔区延伸序列的长度可少于10个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可为10至30个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可为30-70个核苷酸。

间隔区延伸序列可包含部分(例如，稳定性控制序列、内切核糖核酸酶结合序列、核酶)。该部分可影响靶向核酸的RNA的稳定性。该部分可为转录终止子区段(即，转录终止序列)。指导核酸的部分可具有约10个核苷酸至约100个核苷酸、约10个核苷酸(nt)至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt、约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的总长度。该部分可以是可在真核细胞中起作用的部分。在一些情况下，该部分可以是可在原核细胞中起作用的部分。该部分可以是可在真核细胞和原核细胞中均起作用的部分。

合适部分的非限制性实例可包括：5'帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽(m7G))、核糖开关序列(例如，允许通过蛋白质和蛋白质复合体调节稳定性和/或可及性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、使RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供追踪的修饰或序列(例如，与荧光分子直接缀合，与有利于荧光检测的部分、允许荧光检测的序列等缀合)，为蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活物、转录阻抑物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)提供结合位点的修饰或序列、提供增加的、降低的和/或可控的稳定性的修饰或序列，或它们的任何组合。间隔区延伸序列可包含引物结合位点、分子索引(例如，条形码序列)。间隔区延伸序列可包含核酸亲和标签。

间隔区

指导核酸的指导区段可包含可与靶核酸中的序列杂交的核苷酸序列(例如，间隔区)。指导核酸的间隔区可经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，间隔区的核苷酸序列可以变化并且可决定靶核酸内指导核酸与靶核酸相互作用的位置。

间隔区序列可与位于间隔区邻近基序(PAM)的5'侧的靶核酸杂交。不同的生物体可包含不同的PAM序列。例如，在酿脓链球菌中，PAM可以是包含序列5’-XRR-3’的靶核酸中的序列，其中R可为A或G，其中X为任意核苷酸，并且X紧邻被间隔区序列所靶向的靶核酸序列的3’侧。

靶核酸序列可为20个核苷酸。靶核酸可少于20个核苷酸。靶核酸可为至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可为至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可为紧邻PAM第一个核苷酸的5'侧的20个碱基。例如，在包含5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNXRR-3’的序列中，靶核酸可以是对应于N的序列，其中N为任意核苷酸。

可与靶核酸杂交的间隔区的指导序列可具有至少约6nt的长度。例如，可与靶核酸杂交的间隔区序列可具有至少约6nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt、约6nt至约80nt、约6nt至约50nt、约6nt至约45nt、约6nt至约40nt、约6nt至约35nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约19nt、约10nt至约50nt、约10nt至约45nt、约10nt至约40nt、约10nt至约35nt、约10nt至约30nt、约10nt至约25nt、约10nt至约20nt、约10nt至约19nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt，或约20nt至约60nt的长度。在一些情况下，可与靶核酸杂交的间隔区序列的长度可为20个核苷酸。可与靶核酸杂交的间隔区的长度可为19个核苷酸。

间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比可为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或100％。间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比可为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％，或100％。在一些情况下，对于靶核酸互补链的靶序列最5'侧的六个连续核苷酸，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比可为100％。在一些情况下，对于约20个连续核苷酸，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比可为至少60％。在一些情况下，对于靶核酸互补链的靶序列最5'侧的十四个连续核苷酸，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比可为100％，而对于剩余序列则低至0％。在这样的情况下，间隔区序列可被视为长度为14个核苷酸。在一些情况下，对于靶核酸互补链的靶序列最5'侧的六个连续核苷酸，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比可为100％，而对于剩余序列则低至0％。在这样的情况下，间隔区序列可被视为长度为6个核苷酸。靶核酸可与crRNA的种子区超过约50％、60％、70％、80％、90％或100％互补。靶核酸可与crRNA的种子区少于约50％、60％、70％、80％、90％或100％互补。

指导核酸的间隔区区段可被修饰(例如，通过遗传工程)成与靶核酸内的任何期望序列杂交。例如，间隔区可被工程化(例如，设计，编程)，以与参与癌症、细胞生长、DNA复制、DNA修复、HLA基因、细胞表面蛋白、T细胞受体、免疫球蛋白超家族基因、肿瘤抑制基因、microRNA基因、长非编码RNA基因、转录因子、球蛋白、病毒蛋白、线粒体基因等的靶核酸中的序列杂交。

可使用计算机程序(例如，机器可读代码)鉴别间隔区序列。计算机程序可使用变量，如预测的解链温度、二级结构形成和预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％GC、基因组发生的频率、甲基化状态、SNP的存在等。

最小CRISPR重复序列

最小CRISPR重复序列可以是与参考CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的crRNA)具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或序列同源性的序列。最小CRISPR重复序列可以是与参考CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的crRNA)具有至多约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或序列同源性的序列。最小CRISPR重复可包含可与最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列可形成碱基配对的双链结构。最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列可一同促进与位点定向多肽结合。最小CRISPR重复序列的一部分可与最小tracrRNA序列杂交。最小CRISPR重复序列的一部分可与最小tracrRNA序列至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补。最小CRISPR重复序列的一部分可与最小tracrRNA序列至多约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补。

最小CRISPR重复序列可具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，最小CRISPR重复序列可具有约6个核苷酸(nt)至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt，或约15nt至约25nt的长度。在一些实施方案中，最小CRISPR重复序列具有约12个核苷酸的长度。

对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小CRISPR重复序列可与参考最小CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型crRNA)至少约60％相同。对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小CRISPR重复序列可与参考最小CRISPR重复序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型crRNA)至少约60％相同。例如，对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小CRISPR重复序列可与参考最小CRISPR重复序列至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。

最小tracrRNA序列

最小tracrRNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或序列同源性的序列。最小tracrRNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至多约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或序列同源性的序列。最小tracrRNA序列可包含可与最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列可形成碱基配对的双链结构。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复可一同促进与位点定向多肽结合。最小tracrRNA序列的一部分可与最小CRISPR重复序列杂交。最小tracrRNA序列的一部分可与最小CRISPR重复序列30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补。

最小tracrRNA序列可具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，最小tracrRNA序列可具有约6个核苷酸(nt)至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt，或约15nt至约25nt的长度。在一些实施方案中，最小tracrRNA序列具有约14个核苷酸的长度。

对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小tracrRNA序列可与参考最小tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)序列至少约60％相同。对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小tracrRNA序列可与参考最小tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)序列至少约60％相同。例如，对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，最小tracrRNA序列可与参考最小tracrRNA序列至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。

最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可包含双螺旋。双链体第一链的第一个碱基可为鸟嘌呤。双链体第一链的第一个碱基可为腺嘌呤。最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。

所述双链体可包含错配。所述双链体可包含至少约1、2、3、4或5个错配。所述双链体可包含至多约1、2、3、4或5个错配。在一些情况下，所述双链体包含不多于2个错配。

凸起

凸起可指由最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列组成的双链体内核苷酸的未配对区。凸起在与位点定向多肽的结合中可能是重要的。凸起可包含在双链体一侧上未配对的5’-XXXY-3’，和双链体另一侧上未配对的核苷酸区域，其中X为任意的嘌呤，并且Y可以是可与相对链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。

例如，凸起可包含在凸起的最小CRISPR重复链上的未配对嘌呤(例如，腺嘌呤)。在一些实施方案中，凸起可包含在凸起的最小tracrRNA序列链的未配对5’-AAGY-3’，其中Y可以是可与最小CRISPR重复链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。

双链体第一侧(例如，最小CRISPR重复侧)上的凸起可包含至少1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。双链体第一侧(例如，最小CRISPR重复侧)上的凸起可包含至多1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。双链体第一侧(例如，最小CRISPR重复侧)上的凸起可包含1个未配对的核苷酸。

双链体第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。双链体第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起可包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。双链体第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起可包含4个未配对的核苷酸。

双链体每条链上具有不同数目的未配对核苷酸的区域可配对在一起。例如，凸起可包含来自第一条链的5个未配对核苷酸和来自第二条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的4个未配对核苷酸和来自第二条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的3个未配对核苷酸和来自第二条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的2个未配对核苷酸和来自第二条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二条链的1个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二条链的2个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二条链的3个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二条链的4个未配对核苷酸。凸起可包含来自第一条链的1个未配对核苷酸和来自第二条链的5个未配对核苷酸。

在一些情况下，凸起可包含至少一个摆动配对。在一些情况下，凸起可包含至多一个摆动配对。凸起序列可包含至少1个嘌呤核苷酸。凸起序列可包含至少3个嘌呤核苷酸。凸起序列可包含至少5个嘌呤核苷酸。凸起序列可包含至少1个鸟嘌呤核苷酸。凸起序列可包含至少1个腺嘌呤核苷酸。

P-域(P-DOMAIN)

P域可指可识别靶核酸中前间区序列邻近基序(PAM)的指导核酸的区域。P域可与靶核酸中的PAM杂交。因此，P域可包含与PAM互补的序列。P域可位于最小tracrRNA序列的3'侧。P域可位于3’tracrRNA序列(即，中间tracrRNA序列)内。

P域起始于最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列的双链体中最后配对的核苷酸3'侧的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸处。P域可起始于最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列的双链体中最后配对的核苷酸3'侧的至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸处。

P域可包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个连续的核苷酸。P域可包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个连续的核苷酸。

在一些情况下，P域可包含CC二核苷酸(即，两个连续的胞嘧啶核苷酸)。该CC二核苷酸可与PAM的GG二核苷酸相互作用，其中PAM包含5’-XGG-3’序列。

P域可以是位于3’tracrRNA序列(即，中间tracrRNA序列)中的核苷酸序列。P域可包含杂交在一起的双链体核苷酸(例如，发夹中的核苷酸)。例如，P域可包含与3’tracrRNA序列(即，中间tracrRNA序列)的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。P域的活性(例如，指导核酸靶向靶核酸的能力)可通过P-域的杂交状态来调节。例如，如果P域是杂交的，则指导核酸不能识别其靶标。例如，如果P域未杂交，则指导核酸可识别其靶标。

P域可与位点定向多肽内的P域相互作用区域相互作用。P域可与位点定向多肽中富含精氨酸的碱性补丁(patch)相互作用。P域相互作用区域可与PAM序列相互作用。P域可包含茎环。P域可包含凸起。

3’tracrRNA序列

3’tracr RNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的tracrRNA)具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或序列同源性的序列。3’tracr RNA序列可以是与参考tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的tracrRNA)具有至多约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性和/或序列同源性的序列。

3’tracrRNA序列可具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，3’tracrRNA序列可具有约6个核苷酸(nt)至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt，或约15nt至约25nt的长度。在一些实施方案中，3’tracrRNA序列具有约14个核苷酸的长度。

对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，3’tracrRNA序列可与参考3’tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型3’tracrRNA序列)至少约60％相同。例如，对于一段至少6、7或8个连续的核苷酸，3’tracrRNA序列可与参考3’tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌的野生型3’tracrRNA序列)至少约60％相同、至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。

3’tracrRNA序列可包含多于一个双链体区域(例如，发夹、杂交区域)。3’tracrRNA序列可包含两个双链体区域。

3’tracrRNA序列也可被称为中间tracrRNA。中间tracrRNA序列可包含茎环结构。换言之，中间tracrRNA序列可包含不同于第二茎或第三茎的发夹。中间tracrRNA(即，3’tracrRNA)中的茎环结构可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。中间tracrRNA(即，3’tracrRNA)中的茎环结构可包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。茎环结构可包含功能部分。例如，茎环结构可包含适体、核酶、蛋白质相互作用的发夹、CRISPR阵列、内含子和外显子。茎环结构可包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。茎环结构可包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。

中间tracrRNA序列中的发夹可包含P域。P域可包含发夹中的双链区域。

tracrRNA延伸序列

tracrRNA延伸序列可提供稳定性并且/或者为指导核酸的修饰提供位置。tracrRNA延伸序列可具有约1个核苷酸至约400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可具有多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可具有约20至约5000个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可具有多于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可具有少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可具有少于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列的长度可小于10个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可为10-30个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可为30-70个核苷酸。

tracrRNA延伸序列可包含部分(例如，稳定性控制序列、核酶、内切核糖核酸酶结合序列)。部分可影响靶向RNA的核酸的稳定性。部分可为转录终止子区段(即，转录终止序列)。指导核酸的部分可具有约10个核苷酸至约100个核苷酸、约10个核苷酸(nt)至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt、约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的总长度。该部分可以是可在真核细胞中起作用的部分。在一些情况下，该部分可以是可在原核细胞中起作用的部分。该部分可以是可在真核细胞和原核细胞中均起作用的部分。

合适的tracrRNA延伸部分的非限制性实例包括：3'多腺苷酸化的尾部、核糖开关序列(例如，允许通过蛋白质和蛋白质复合体调节稳定性和/或可及性)、形成dsRNA双链体(即，发夹)的序列、将RNA靶向亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供追踪的修饰或序列(例如，与荧光分子直接缀合、与有利于荧光检测的部分、允许荧光检测的序列等缀合)、为蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活物、转录阻抑物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)提供结合位点的修饰或序列、提供提高的、降低的和/或可控的稳定性的修饰或序列，或它们的任意组合。tracrRNA延伸序列可包含引物结合位点、分子索引(例如，条形码序列)。在本公开内容的一些实施方案中，tracrRNA延伸序列可包含一个或多个亲和标签。

单指导核酸

所述指导核酸可为单指导核酸。该单指导核酸可为RNA。单指导核酸可包含最小CRISPR重复序列与最小tracrRNA序列之间的可被称为单指导连接体序列的接头。

单指导核酸的单指导连接体可具有约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，接头可具有约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3nt至约80nt、约3nt至约70nt、约3nt至约60nt、约3nt至约50nt、约3nt至约40nt、约3nt至约30nt、约3nt至约20nt或约3nt至约10nt的长度。例如，接头可具有约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt的长度。在一些实施方案中，单指导核酸的接头为4至40个核苷酸。该接头可具有至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多核苷酸的长度。该接头可具有至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多核苷酸的长度。

接头序列可包含功能部分。例如，接头序列可包含适体、核酶、蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子和外显子。接头序列可包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。接头序列可包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。

在一些实施方案中，单指导连接体可将最小CRISPR重复的3'端与最小tracrRNA序列的5'端连接。或者，单指导连接体可将tracrRNA序列的3'端与最小CRISPR重复的5'端连接。也就是说，单指导核酸可包含与3'蛋白质结合区段连接的5'DNA结合区段。单指导核酸可包含与3'DNA结合区段连接的5'蛋白质结合区段。

所述指导核酸可包含长度为10-5000个核苷酸的间隔区延伸序列；长度为12-30个核苷酸的间隔区序列，其中该间隔区与靶核酸至少50％互补；最小CRISPR重复，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的crRNA在6、7或8个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小CRISPR重复具有5-30个核苷酸的长度；最小tracrRNA序列，其包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的tracrRNA在6、7或8个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列具有5-30个核苷酸的长度；接头序列，其连接最小CRISPR重复和最小tracrRNA，并包含3-5000个核苷酸的长度；3'tracrRNA，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6、7或8个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中3'tracrRNA包含10-20个核苷酸的长度，并包含双链体区；和/或包含10-5000个核苷酸的长度的tracrRNA延伸，或它们的任意组合。该指导核酸可被称为单指导核酸。

所述指导核酸可包含长度为10-5000个核苷酸的间隔区延伸序列；长度为12-30个核苷酸的间隔区序列，其中该间隔区与靶核酸至少50％互补；双链体，其包含1)最小CRISPR重复，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的crRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小CRISPR重复具有5-30个核苷酸的长度，2)最小tracrRNA序列，其包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列具有5-30个核苷酸的长度，以及3)凸起，其中该凸起包含双链体的最小CRISPR重复链上的至少3个未配对核苷酸和双链体的最小tracrRNA序列链上的至少1个未配对核苷酸；接头序列，其连接最小CRISPR重复和最小tracrRNA，并包含3-5000个核苷酸的长度；3'tracrRNA，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，其中3'tracrRNA包含10-20个核苷酸的长度，并包含双链体区；P域，其从包含最小CRISPR重复和最小tracrRNA的双链体下游的1-5个核苷酸开始、包含1-10个核苷酸、包含可与靶核酸中的前间区序列邻近基序杂交的序列、可形成发夹，且位于3'tracrRNA区；和/或包含10-5000个核苷酸的长度的tracrRNA延伸，或它们的任意组合。

双指导核酸

所述指导核酸可为双指导核酸。该双指导核酸可为RNA。该双指导核酸可包含两个单独的核酸分子(即，多核苷酸)。双指导核酸的两个核酸分子中的每一个均可包含可彼此杂交的一段核苷酸，使得两个核酸分子的互补核苷酸杂交而形成蛋白质结合区段的双链双链体。如果未另行说明，则术语“指导核酸”可以是包括性的，指单分子指导核酸和双分子指导核酸二者。

所述双指导核酸可包含1)第一核酸分子，其包含长度为10-5000个核苷酸的间隔区延伸序列；长度为12-30个核苷酸的间隔区序列，其中该间隔区与靶核酸至少50％互补；以及最小CRISPR重复，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的crRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小CRISPR重复具有5-30个核苷酸的长度；以及2)双指导核酸的第二核酸分子可包含最小tracrRNA序列，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列具有5-30个核苷酸的长度；3'tracrRNA，其包含与来自细菌(例如，酿脓链球菌)的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中3'tracrRNA包含10-20个核苷酸的长度，并包含双链体区；和/或包含10-5000个核苷酸的长度的tracrRNA延伸，或它们的任意组合。

在一些情况下，所述双指导核酸可包含1)第一核酸分子，其包含长度为10-5000个核苷酸的间隔区延伸序列；长度为12-30个核苷酸的间隔区序列，其中该间隔区与靶核酸至少50％互补；最小CRISPR重复，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的crRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小CRISPR重复具有5-30个核苷酸的长度和凸起的至少3个未配对核苷酸；以及2)双指导核酸的第二核酸分子可包含最小tracrRNA序列，该最小tracrRNA序列包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中最小tracrRNA序列具有5-30个核苷酸的长度和凸起的至少1个未配对核苷酸，其中该凸起的1个未配对核苷酸位于与最小CRISPR重复的3个未配对核苷酸相同的凸起中；3'tracrRNA，其包含与来自原核生物(例如，酿脓链球菌)或噬菌体的tracrRNA在6个连续核苷酸上至少60％的同一性，并且其中3'tracrRNA包含10-20个核苷酸的长度，并包含双链体区；P域，其从包含最小CRISPR重复和最小tracrRNA的双链体下游的1-5个核苷酸开始、包含1-10个核苷酸、包含可与靶核酸中的前间区序列邻近基序杂交的序列、可形成发夹，并位于3'tracrRNA区；和/或包含10-5000个核苷酸的长度的tracrRNA延伸，或它们的任意组合。

指导核酸和位点定向多肽的复合体

所述指导核酸可与位点定向多肽(例如，核酸指导的核酸酶，Cas9)相互作用，从而形成复合体。指导核酸可将位点定向多肽引导至靶核酸。

在一些实施方案中，可将指导核酸工程化，使得复合体(例如，包含位点定向多肽和指导核酸)可在位点定向多肽的切割位点之外结合。在这种情况下，靶核酸可不与该复合体相互作用，并且靶核酸可被切除(例如，摆脱复合体)。

在一些实施方案中，可将指导核酸工程化，使得复合体可在位点定向多肽的切割位点之内结合。在这种情况下，靶核酸可与该复合体相互作用，并且靶核酸可被结合(例如，与复合体结合)。

本公开内容的任何指导核酸、本公开内容的位点定向多肽、效应蛋白质、多重基因靶向剂、供体多核苷酸、串联融合蛋白、报道基因元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统(splitsystem)的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子可以是重组、纯化和/或分离的。

在一些实施方案中，所述方法包括使用CRISPR/Cas系统改变核酸分子中的突变。在一些实施方案中，该突变为置换、插入或缺失。在一些实施方案中，该突变为单核苷酸多态性。

在一些情况下，靶序列的长度为10-30个核苷酸。在一些情况下，靶序列的长度为15-30个核苷酸。在一些情况下，靶序列的长度为约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，靶序列的长度为约15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。

在一些情况下，CRISPR/Cas系统采用Cas9酶或其变体。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞采用编码Cas9酶或其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，该Cas9为具有两个活性切割位点的双链核酸酶，该双螺旋的每条链均有一个活性切割位点。在一些情况下，该Cas9酶或其变体产生双链断裂。在一些实施方案中，该Cas9酶为野生型Cas9酶。在一些实施方案中，该Cas9酶为野生型Cas9酶或酿脓链球菌Cas9酶的天然存在的变体或突变体。该变体可以是与野生型Cas9酶部分同源的酶，同时保持Cas9核酸酶活性。该变体可以是仅包含野生型Cas9酶的一部分的酶，同时保持Cas9核酸酶活性。在一些实施方案中，该野生型Cas9酶为酿脓链球菌Cas9酶。在一些实施方案中，该野生型Cas9酶由GenBank IDAKP81606.1给出的氨基酸序列表示。在一些实施方案中，该变体与GenBank ID AKP81606.1给出的氨基酸序列至少约95％同源。在一些实施方案中，该变体与GenBank ID AKP81606.1给出的氨基酸序列至少约90％同源。在一些实施方案中，该变体与GenBank ID AKP81606.1给出的氨基酸序列至少约80％同源。在一些实施方案中，该变体与GenBank ID AKP81606.1给出的氨基酸序列至少约70％同源。在一些情况下，该Cas9酶是为了在本文所述细胞中的最佳表达和/或活性而从野生型Cas9酶修饰的优化Cas9酶。在一些实施方案中，该Cas9酶为经修饰的Cas9酶，其中经修饰的Cas9酶包含如本文所述的Cas9酶或其变体和附加的氨基酸序列。作为非限制性实例，附加的氨基酸序列可向Cas9酶或其变体提供附加的活性、稳定性或鉴别标签/条形码。

天然存在的酿脓链球菌Cas9酶切割DNA以产生双链断裂。在一些实施方案中，本文公开的Cas9酶起Cas9切口酶的作用，其中Cas9缺口酶是经修饰以使靶序列产生切口，从而产生单链断裂的Cas9酶。在一些实施方案中，本文公开的方法包括将Cas9切口酶与靶向靶序列的超过一种指导RNA一起使用，以在靶序列处以交错模式切割每条DNA链。在一些实施方案中，将Cas9切口酶与两种指导RNA一起使用可提高本文公开的CRISPR/Cas系统的靶标特异性。在一些实施方案中，使用两个或更多个指导RNA可导致产生基因组缺失。在一些实施方案中，该基因组缺失为约5个核苷酸至约50,000个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，该基因组缺失为约5个核苷酸至约1,000个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用多种指导RNA。在一些实施方案中，所述多种指导RNA靶向单个基因。在一些实施方案中，所述多种指导RNA靶向多个基因。

在一些情况下，所述指导RNA对靶序列的特异性为约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一些情况下，所述指导RNA具有小于约20％、15％、10％、5％、3％、1％或更低的脱靶结合率。

在一些实施方案中，与靶序列杂交的指导RNA的特异性与靶序列具有约95％、98％、99％、99.5％或100％的序列互补性。在一些情况下，该杂交为高度严格杂交条件下的杂交。

在一些实施方案中，所述指导RNA将核酸酶靶向p16基因。在一些实施方案中，所述指导RNA包含与p16基因的靶序列杂交的序列。在一些实施方案中，该靶序列选自SEQ IDNO：17-35。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ ID NO：17-35的序列至少90％同源。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ ID NO：17-35的序列至少约80％同源。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ ID NO：17-35的序列至少约85％同源。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ ID NO：17-35的序列至少约90％同源。在一些实施方案中，该靶序列与选自SEQ ID NO：3-4的序列至少约95％同源。

DNA指导的核酸酶

在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞利用核酸指导的核酸酶系统。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞使用DNA指导的核酸酶系统。在一些实施方案中，本文公开的方法和细胞使用Argonaute系统。

Argonaute蛋白可为可与靶核酸结合的多肽。Argonaute蛋白可为核酸酶。Argonaute蛋白可为真核、原核或古菌的Argonaute蛋白。Argonaute蛋白可为原核Argonaute蛋白(pArgonaute)。pArgonaute可来源于古菌。pArgonaute可来源于细菌。该细菌可选自嗜热细菌和嗜温细菌。该细菌或古菌可选自风产液菌(Aquifex aeolicus)、铜绿微囊蓝细菌(Microsystis aeruginosa)、Clostridium bartlettii、微小杆菌属(Exiguobacterium)、好热黄无氧芽孢菌(Anoxybacillus flavithermus)、伯林盐几何菌(Halogeometricum borinquense)、嗜冷嗜盐菌(Halorubrum lacusprofundi)、Aromatoleum aromaticum、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus)和嗜热细长聚球蓝细菌(Thermosynechococcus elogatus)，或它们的任意组合。该细菌可为嗜热细菌。该细菌可为风产液菌。该嗜热细菌可为嗜热栖热菌(T.thermophilus)(TtArgonaute)。Argonaute可来自聚球蓝细菌属。Argonaute可来自细长聚球蓝细菌。pArgonaute可为野生型pArgonaute的变异pArgonaute。

在一些实施方案中，本公开内容的Argonaute为I型原核Argonaute(pAgo)。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute携带DNA核酸靶向核酸。在一些实施方案中，该DNA核酸靶向核酸靶向双链DNA(dsDNA)的一条链以产生dsDNA的切口或断裂。在一些实施方案中，切口或断裂触发宿主DNA修复。在一些实施方案中，宿主DNA修复为非同源末端连接(NHEJ)或同源定向重组(HDR)。在一些实施方案中，该dsDNA选自基因组、染色体和质粒。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute为长的I型原核Argonaute。在一些实施方案中，该长的I型原核Argonaute具有N-PAZ-MID-PIWI域架构。在一些实施方案中，该长的I型原核Argonaute具有催化活性的PIWI域。在一些实施方案中，该长的I型原核Argonaute具有由天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸/组氨酸(DEDX)编码的催化四联体。在一些实施方案中，该催化四联体结合一个或多个Mg+离子。在一些实施方案中，该催化四联体不结合Mg+离子。在一些实施方案中，该催化四联体结合一个或多个Mn+离子。在一些实施方案中，催化活性的PIWI域在中等温度下具有最佳活性。在一些实施方案中，该中等温度为约25℃至约45℃。在一些实施方案中，该中等温度为约37℃。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute锚定DNA指导的5'磷酸端。在一些实施方案中，所述DNA指导在其5'端具有脱氧胞嘧啶。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute为嗜热栖热菌Ago(TtAgo)。在一些实施方案中，该I型原核Argonaute为细长聚球蓝细菌Ago(SeAgo)。

在一些实施方案中，所述原核Argonaute为II型pAgo。在一些实施方案中，该II型原核Argonaute携带RNA核酸靶向核酸。在一些实施方案中，该RNA核酸靶向核酸靶向双链DNA(dsDNA)的一条链以产生dsDNA的切口或断裂。在一些实施方案中，切口或断裂触发宿主DNA修复。在一些实施方案中，宿主DNA修复为非同源末端连接(NHEJ)或同源定向重组(HDR)。在一些实施方案中，该dsDNA选自基因组、染色体和质粒。在一些实施方案中，该II型原核Argonaute选自长的II型原核Argonaute和短的II型原核Argonaute。在一些实施方案中，该长的II型原核Argonaute具有N-PAZ-MID-PIWI域架构。在一些实施方案中，该长的II型原核Argonaute不具有N-PAZ-MID-PIWI域架构。在一些实施方案中，该短的II型原核Argonaute具有MID和PIWI域，但不具有PAZ域。在一些实施方案中，该短的II型pAgo具有PAZ域的类似物。在一些实施方案中，该II型pAgo不具有催化活性的PIWI域。在一些实施方案中，该II型pAgo缺乏由天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸/组氨酸(DEDX)编码的催化四联体。在一些实施方案中，编码II型原核Argonaute的基因与编码核酸酶、解旋酶或其组合的一个或多个基因簇集。该核酸酶或解旋酶可以是天然的、设计的或可为其结构域。在一些实施方案中，该核酸酶选自Sir2、RE1和TIR。在一些实施方案中，该II型pAgo锚定RNA指导的5'磷酸端。在一些实施方案中，该RNA指导在其5'端具有尿嘧啶。在一些实施方案中，该II型原核Argonaute为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)Argonaute(RsAgo)。

在一些实施方案中，一对pAgo可携带RNA核酸靶向核酸和/或DNA核酸靶向核酸。I型pAgo可携带RNA核酸靶向核酸，其各自能够靶向双链DNA的一条链，以在双链DNA中产生双链断裂。在一些实施方案中，一对pAgo包含两个I型pAgo。在一些实施方案中，一对pAgo包含两个II型pAgo。在一些实施方案中，一对pAgo包含I型pAgo和II型pAgo。

Argonaute蛋白可通过指导核酸而靶向至靶核酸序列。

所述指导核酸可以是单链或双链的。所述指导核酸可为DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。所述指导核酸可包含化学修饰的核苷酸。

所述指导核酸可与靶多核苷酸的有义链或反义链杂交。

所述指导核酸可具有5’修饰。5'修饰可为磷酸化、甲基化、羟甲基化、乙酰化、泛素化或苏素化(sumolyation)。该5'修饰可为磷酸化。

所述指导核酸的长度可为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或碱基对。在一些实例中，所述指导核酸的长度可小于10个核苷酸或碱基对。在一些实例中，所述指导核酸的长度可大于50个核苷酸或碱基对。

所述指导核酸可为指导DNA(gDNA)。该gDNA可具有5'磷酸化末端。该gDNA可以是单链或双链的。该gDNA的长度可为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或碱基对。在一些实例中，该gDNA的长度可小于10个核苷酸。在一些实例中，该gDNA的长度可大于50个核苷酸。

多重化

本文公开了用于进行多重基因组工程化的方法、组合物、系统和/或试剂盒。在本公开内容的一些实施方案中，位点定向多肽可包含指导核酸，从而形成复合体。该复合体可与靶核酸接触。靶核酸可被该复合体切割和/或修饰。本公开内容的方法、组合物、系统和/或试剂盒可用于快速、有效和/或同时地修饰多个靶核酸。该方法可使用如本文所述的任何位点定向多肽(例如，Cas9)、指导核酸以及位点定向多肽与指导核酸的复合体来进行。

本公开内容的位点定向核酸酶可以以任何组合进行组合。例如，可使用多种CRISPR/Cas核酸酶来靶向不同靶序列或相同靶标的不同区段(segment)。在另一个实例中，Cas9和Argonaute可组合用于靶向不同靶标或相同靶标的不同部分(section)。在一些实施方案中，位点定向核酸酶可与多种不同的指导核酸一起使用，以同时靶向多种不同序列。

核酸(例如，指导核酸)可与非天然序列(例如部分、内切核糖核酸酶结合序列、核酶)融合，从而形成核酸模块。该核酸模块(例如，包含与非天然序列融合的核酸)可串联缀合，从而形成多重基因靶向剂(例如，多模块，如阵列)。该多重基因靶向剂可包含RNA。该多重基因靶向剂可与一种或多种内切核糖核酸酶接触。该内切核糖核酸酶可与非天然序列结合。结合的内切核糖核酸酶可在由非天然序列限定的指定位置处切割多重基因靶向剂的核酸模块。该切割可加工(例如，释放)各个核酸模块。在一些实施方案中，经加工的核酸模块可包含全部、一些非天然序列或不包含非天然序列。经加工的核酸模块可被位点定向多肽结合，从而形成复合体。该复合体可靶向至靶核酸。靶核酸可被该复合体切割和/或修饰。

多重基因靶向剂可用于同时和/或以化学计量的量修饰多个靶核酸。多重基因靶向剂可以是串联的如本文所述的任意核酸靶向核酸。多重基因靶向剂可指包含一个或多个核酸模块的连续核酸分子。核酸模块可包含核酸和非天然序列(例如，部分、内切核糖核酸酶结合序列、核酶)。该核酸可为非编码RNA，如微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、长非编码RNA(lncRNA或lincRNA)、内源siRNA(endo-siRNA)，piwi相互作用RNA(piRNA)、反式作用短干扰RNA(tasiRNA)、重复相关的小干扰RNA(rasiRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)或它们的任意组合。该核酸可为编码RNA(例如，mRNA)。该核酸可为任何类型的RNA。在一些实施方案中，该核酸可为核酸靶向核酸。

非天然序列可位于核酸模块的3'端。非天然序列可位于核酸模块的5'端。非天然序列可位于核酸模块的3'端和5'端。非天然序列可包含可与内切核糖核酸酶结合的序列(例如，内切核糖核酸酶结合序列)。非天然序列可以是被内切核糖核酸酶序列特异性地识别的序列(例如，RNA酶T1切割未配对的G碱基，RNA酶T2切割As的3'端，RNA酶U2切割未配对A碱基的3'端)。非天然序列可以是在结构上被内切核糖核酸酶识别的序列(例如，发夹结构、单链-双链接合处，例如，Drosha识别发夹内的单链-双链接合处)。非天然序列可包含可与CRISPR系统内切核糖核酸酶结合的序列(例如，Csy4、Cas5和/或Cas6蛋白)。

在非天然序列包含内切核糖核酸酶结合序列的一些实施方案中，核酸模块可被相同的内切核糖核酸酶结合。核酸模块可不包含相同的内切核糖核酸酶结合序列。核酸模块可包含不同的内切核糖核酸酶结合序列。不同的内切核糖核酸酶结合序列可被相同的内切核糖核酸酶结合。在一些实施方案中，核酸模块可被不同的内切核糖核酸酶结合。

所述部分可包含核酶。核酶可切割自身，从而释放多重基因靶向剂的每个模块。合适的核酶可包括肽基转移酶23S rRNA、RNA酶P、I组内含子、II组内含子、GIR1分支核酶、Leadzyme、发夹核酶、锤头状核酶、HDV核酶、CPEB3核酶、VS核酶、glmS核酶、CoTC核酶、合成核酶。

多重基因靶向剂的核酸模块的核酸可以是相同的。核酸模块可相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。例如，不同核酸模块可在核酸模块的间隔区区域中有所不同，从而使核酸模块靶向不同靶核酸。在一些情况下，不同核酸模块可在核酸模块的间隔区区域中有所不同，但仍靶向相同靶核酸。核酸模块可靶向相同的靶核酸。核酸模块可靶向一种或多种靶核酸。

核酸模块可包含调节序列，该调节序列可允许核酸模块的适当翻译或扩增。例如，核酸模块可包含启动子、TATA盒、增强子元件、转录终止元件、核糖体结合位点、3'未翻译区、5'未翻译区、5'帽子序列、3'聚腺苷酸化序列、RNA稳定性元件等。

编码设计的指导核酸和/或核酸指导的核酸酶的核酸

本公开内容提供了一种核酸，其包含编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核酸可为载体(例如，重组表达载体)。

在一些实施方案中，所述重组表达载体可为病毒构建体(例如，重组腺伴随病毒构建体)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体等。

合适的表达载体可包括但不限于病毒载体(例如，基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺伴随病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒的病毒载体)、逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒以及来源于逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)、植物载体(例如，T-DNA载体)等。例如，对于真核宿主细胞，可提供下列载体：pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。可使用其他载体，只要它们与宿主细胞相容。

在一些情况下，所述载体可为线性化载体。该线性化载体可包含核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)和/或指导核酸。该线性化载体可以不是环状质粒。该线性化载体可包含双链断裂。该线性化载体可包含编码荧光蛋白(例如，橙色荧光蛋白(OFP))的序列。该线性化载体可包含编码抗原(例如，CD4)的序列。该线性化载体可在编码所设计的核酸靶向核酸部分的载体区域中被线性化(例如，切割)。例如，该线性化载体可在所设计的核酸靶向核酸的5'区中被线性化(例如，切割)。该线性化载体可在所设计的核酸靶向核酸的3'区中被线性化(例如，切割)。在一些情况下，该线性化载体或闭合超螺旋载体包含编码核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)的序列、驱动编码核酸酶的序列的表达的启动子(例如，CMV启动子)、编码标志物的序列、编码亲和标签的序列、编码指导核酸的一部分的序列、驱动编码指导核酸的一部分的序列的表达的启动子以及编码选择性标记(例如，氨苄青霉素)的序列，或它们的任意组合。

所述载体可包含转录和/或翻译控制元件。根据所使用的宿主/载体系统，在表达载体中可使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。

在一些实施方案中，编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与控制元件(例如，转录控制元件)如启动子可操作地连接。该转录控制元件可在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)和/或原核细胞(例如，细菌或古菌细胞)中起作用。在一些实施方案中，编码本公开内容的设计的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与多个控制元件可操作地连接。与多个控制元件的可操作连接可允许编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列在原核或真核细胞中表达。

合适的真核启动子(即，在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例可包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)的那些启动子、人延伸因子-1启动子(EF1)、包含与鸡β-活化启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体、鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋白-I。该启动子可为真菌启动子。该启动子可为植物启动子。可找到植物启动子的数据库(例如，PlantProm)。该表达载体还可含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。该表达载体还可包含用于对表达进行扩增的适当序列。该表达载体还可包含编码与Argonaute融合的非天然标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生融合蛋白。

在一些实施方案中，编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与诱导型启动子(例如，热休克启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、雌激素受体调节的启动子等)可操作地连接。在一些实施方案中，编码本公开内容的指导核酸、本公开内容核酸指导的核酸酶、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可与组成型启动子(例如，CMV启动子，UBC启动子)可操作地连接。在一些实施方案中，核苷酸序列可与空间受限和/或时间受限的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)可操作地连接。

编码本公开内容的指导核酸、本公开内容的核酸指导的核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)、效应蛋白质、供体多核苷酸、多重基因靶向剂、串联融合多肽、报道元件、感兴趣的遗传元件、分裂系统的组分和/或实施本公开内容的方法的实施方案所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列可被包装在生物区室中或其表面上以供递送至细胞。生物区室可包括但不限于病毒(慢病毒，腺病毒)、纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。

本公开内容的复合体、多肽和核酸向细胞中的引入可通过病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等进行。

密码子优化

编码核酸指导的核酸酶(例如，Cas9或Argonaute)的多核苷酸可以是密码子优化的。这种类型的优化可需要外来DNA的突变(例如，重组)，以在编码相同蛋白质时模拟预期宿主生物体或细胞的密码子偏好。因此，密码子可以变化，但编码的蛋白质保持不变。例如，如果预期的靶细胞为人细胞，则人密码子优化的多核苷酸Cas9可被用于产生合适的Cas9。作为另一非限制性实例，如果预期的宿主细胞为小鼠细胞，则编码Cas9的小鼠密码子优化的多核苷酸可为合适的Cas9。编码CRISPR/Cas蛋白的多核苷酸可针对许多感兴趣的宿主细胞进行密码子优化。编码Argonaute的多核苷酸可针对许多感兴趣的宿主细胞进行密码子优化。宿主细胞可以是来自任何生物体的细胞(例如，细菌细胞、古菌细胞、单细胞真核生物的细胞、植物细胞、藻类细胞(例如，布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、莱茵衣藻(Lactoomonas reinhardtii)、海洋富油微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、Sargassum patens C.Aaardh等)、真菌细胞(例如，酵母细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长动物、人等)的细胞等)。可以不需要密码子优化。在一些情况下，密码子优化可以是优选的。

递送

本公开内容的位点定向核酸酶可在细胞内进行内源或重组表达。位点定向核酸酶可在染色体上、染色体外或在质粒、合成染色体或人工染色体上编码。另外或备选地，位点定向核酸酶可作为多肽或编码多肽的mRNA提供或递送至细胞。在这样的实例中，多肽或mRNA可通过本领域已知的标准机制来递送，诸如通过使用细胞可透过的肽、纳米颗粒、病毒颗粒、病毒递送系统或其他非病毒递送系统。

另外或备选地，指导核酸可由细胞内的遗传或附加型DNA提供。指导核酸可从细胞内的RNA或mRNA逆转录。可将指导核酸提供或递送至表达相应的位点定向核酸酶的细胞。另外或备选地，指导核酸可与位点定向核酸酶同时或相继地提供或递送。可使用本领域已知的标准DNA或RNA生成技术化学合成、组装或以其他方式生成指导核酸。另外或备选地，可从基因组DNA、附加型DNA分子、分离的核酸分子或任何其他来源的核酸分子切割、释放或以其他方式得到指导核酸。

小分子抑制剂

在一些实施方案中，所述治疗剂为小分子抑制剂。该小分子抑制剂可不含多核苷酸。该小分子抑制剂可不含肽。在一些实施方案中，该小分子抑制剂直接结合至与pl6a表达相关的蛋白质或结构以破坏其功能。通常，小分子抑制剂容易穿过细胞膜，因此可以不需额外的修饰来帮助其细胞摄取。

基因靶标

在一些实施方案中，本文公开的方法包括采用CRISPR/Cas系统编辑本文所述的基因。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使由本文所述基因表达的RNA与反义寡核苷酸接触，从而减少由该基因编码的蛋白质的产生。在一些实施方案中，本文公开的方法描述了编辑某基因或改变该基因的表达。在一些实施方案中，编辑某基因或改变该基因的表达包括减少基因的表达、减少基因的产物(例如，RNA、蛋白质)的表达、降低基因的产物的活性或其组合。

在一些实施方案中，所述基因为肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，该基因编码促进细胞衰老的蛋白。在一些实施方案中，该基因编码促进细胞凋亡的蛋白质。在一些实施方案中，该基因编码促进细胞分化的蛋白质。在一些实施方案中，该基因编码抑制细胞增殖的蛋白质。在一些实施方案中，该基因编码抑制细胞生存的蛋白质。

在一些实施方案中，所述基因的特征在于具有本文提供的序列标识符(SEQ IDNO)的序列。在一些实施方案中，该基因的特征在于与本文提供的序列标识符(SEQ ID NO)具有同源性或与其同源的序列。当在本文中用来相对于参考序列描述氨基酸序列或核酸序列时，术语“同源”、“同源性”或“百分比同源性”可使用Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993中进行了修改)所述的公式来确定。这样的公式被并入Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中。可使用到本申请的申请日为止最新版本的BLAST确定序列的百分比同源性。

所述基因可以为p16基因。该p16基因可以为哺乳动物p16基因。该p16基因可以为人p16基因。该人p16基因可具有基因登录ID号NG_007485.1，但可以理解在人类种群内存在天然变异。该p16基因可包含p16编码序列。该p16基因可包含SEQ ID NO.36的p16编码序列。该p16基因可以是具有SEQ ID NO.36的p16编码序列的p16基因的天然存在的等位基因变体。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36至少60％同源。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36至少70％同源。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36至少80％同源。该p16编码序列可与SEQ IDNO.36至少90％同源。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36 60％同源至99％同源。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36 70％同源至99％同源。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36 80％同源至99％同源。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36 90％同源至99％同源。该p16编码序列可与SEQ ID NO.36 95％同源至99％同源。

所述基因可以为Six6基因。该Six6基因可以为哺乳动物p16基因。该Six6基因可以为人Six6基因。该人Six6基因可具有基因登录ID号NG_007374.2，但可以理解在人类种群内存在天然变异。该Six6基因可包含Six6编码序列。该Six6基因可包含SEQ ID NO.37的Six6编码序列。该Six6基因可以是具有SEQ ID NO.37的Six6编码序列的Six6基因的天然存在的等位基因变体。该Six6编码序列可与SEQ ID NO.37至少60％同源。该Six6编码序列可与SEQID NO.37至少70％同源。该Six6编码序列可与SEQ ID NO.37至少80％同源。该Six6编码序列可与SEQ ID NO.37至少90％同源。该Six6编码序列可与SEQ ID NO.37 60％同源至99％同源。该Six6编码序列可与SEQ ID NO.37 70％同源至99％同源。该Six6编码序列可与SEQID NO.37 80％同源至99％同源。该Six6编码序列可与SEQ ID NO.37 90％同源至99％同源。该Six6编码序列可与SEQ ID NO.37 95％同源至99％同源。

所述基因可以为p53基因。该p53基因可以为哺乳动物p53基因。该p53基因可以为人p53基因。该人p53基因可具有基因登录ID号NG_017013.2，但可以理解在人类种群内存在天然变异。该p53基因可包含p53编码序列。该p53基因可包含SEQ ID NO.38的p53编码序列。该p53基因可以是具有SEQ ID NO.38的p53编码序列的p53基因的天然存在的等位基因变体。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38至少60％同源。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38至少70％同源。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38至少80％同源。该p53编码序列可与SEQ IDNO.38至少90％同源。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38 60％同源至99％同源。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38 70％同源至99％同源。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38 80％同源至99％同源。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38 90％同源至99％同源。该p53编码序列可与SEQ ID NO.38 95％同源至99％同源。

所述基因可以为白介素1(IL-1)基因。该白介素-1可以为白介素1α或白介素1β。该IL-1基因可以为哺乳动物IL-1基因。该IL-1基因可以为人IL-1基因。该人IL-1基因可具有选自NG_008851.1和NG_008850.1的基因登录ID号，但可以理解在人类种群内存在天然变异。IL-1基因可包含IL-1编码序列。该IL-1基因可包含SEQ ID NO.39的IL-1编码序列。该IL-1基因可以是具有SEQ ID NO.39的IL-1编码序列的IL-1基因的天然存在的等位基因变体。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.39至少60％同源。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.39至少70％同源。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.39至少80％同源。该IL-1编码序列可与SEQID NO.39至少90％同源。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.39 60％同源至99％同源。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.39 70％同源至99％同源。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.3980％同源至99％同源。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.39 90％同源至99％同源。该IL-1编码序列可与SEQ ID NO.39 95％同源至99％同源。

所述基因可以为CDKN2D基因，其编码p19/Arf。该CDKN2D基因可以为哺乳动物CDKN2D基因。该CDKN2D基因可以为人CDKN2D基因。该人CDKN2D基因可具有基因登录ID号NC_000019.10，但可以理解在人类种群内存在天然变异。该CDKN2D基因可包含CDKN2D编码序列。该CDKN2D基因可包含SEQ ID NO.40的CDKN2D编码序列。该CDKN2D基因可以是具有SEQID NO.40的CDKN2D编码序列的CDKN2D基因的天然存在的等位基因变体。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40至少60％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40至少70％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40至少80％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40至少90％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40 60％同源至99％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40 70％同源至99％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40 80％同源至99％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40 90％同源至99％同源。该CDKN2D编码序列可与SEQ ID NO.40 95％同源至99％同源。

细胞

本文公开了修饰由具有修饰的核酸分子的一个细胞和多个细胞表达的核酸分子的方法。本文进一步公开了改变由细胞表达的核酸分子的表达和/或活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括修饰核酸分子或改变其表达/活性，其中该核酸分子存在于体内细胞中。在一些实施方案中，该方法包括修饰核酸分子或改变其表达/活性，其中该核酸分子存在于体外细胞中。在一些实施方案中，该方法包括修饰核酸分子或改变其表达/活性，其中该核酸分子存在于离体细胞中。在一些实施方案中，该方法包括修饰核酸分子或改变其表达/活性，其中该核酸分子存在于原位细胞中。

在一些实施方案中，所述细胞为视网膜细胞。在一些实施方案中，该细胞为视神经细胞。在一些实施方案中，该细胞为神经节细胞。在一些实施方案中，该细胞为无长突细胞。在一些实施方案中，该细胞为视网膜神经节细胞。

在一些实施方案中，所述细胞已从待治疗的受试者中分离。在一些实施方案中，该细胞为干细胞。在一些实施方案中，该细胞为脐带血干细胞。在一些实施方案中，该细胞为多能细胞。在一些实施方案中，该细胞为多潜能细胞。在一些实施方案中，该细胞为诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，该iPSC来源于神经细胞。在一些实施方案中，该iPSC来源于眼细胞。在一些实施方案中，该细胞为分化为视网膜神经节细胞或其多能祖细胞的iPSC。

药物组合物与施用模式

本文公开了用于治疗青光眼的药物组合物，其包含本文所述的抑制基因表达和蛋白质活性的治疗剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物是用于向眼部施用的制剂。在一些实施方案中，用于向眼部施用的制剂包含使其适用于向眼部施用的增稠剂、表面活性剂、润湿剂、基础成分、载体、赋形剂或盐。在一些实施方案中，用于向眼部施用的制剂具有使其适用于向眼部施用的pH、盐或张度(tonicity)。本文描述了用于向眼部施用的制剂的这些方面。在一些实施方案中，该药物组合物为眼用制品。该药物组合物可包含增稠剂以延长药物组合物与眼部的接触时间。在一些实施方案中，该增稠剂选自聚乙烯醇、聚乙二醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素和它们的组合。在一些实施方案中，将增稠剂过滤并灭菌。

本文公开的药物组合物可包含用于眼部的药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂或药学上可接受的盐。用于眼部的药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的盐的非限制性实例包括透明质酸、硼酸、氯化钙、过硼酸钠、磷酸、氯化钾、氯化镁、硼酸钠、磷酸钠和氯化钠。

本文公开的药物组合物应与泪分泌物等渗。在一些实施方案中，该药物组合物具有0.5-2％NaCl的张度。在一些实施方案中，该药物组合物包含等渗媒介物。作为非限制性实例，等渗媒介物可包含硼酸或磷酸二氢钠。

在一些实施方案中，所述药物组合物具有约3至约8的pH。在一些实施方案中，该药物组合物具有约3至约7的pH。在一些实施方案中，该药物组合物具有约4至约7的pH。处于该pH范围之外的药物组合物在施用时可能刺激眼睛或在眼睛中形成颗粒。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含表面活性剂或润湿剂。在本文公开的药物组合物中所采的表面活性剂的非限制性实例为苯扎氯铵、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和磺基琥珀酸二辛酯钠。

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含在容纳药物组合物的容器被打开之后防止微生物污染的防腐剂。在一些实施方案中，该防腐剂选自苯扎氯铵、氯丁醇、乙酸苯汞、乙酸氯己定和硝酸苯汞。

在一些实施方案中，所述药物组合物(例如，洗剂或软膏)包含基础成分。该基础成分可选自氯化钠、碳酸氢钠、硼酸、硼砂、硫酸锌、石蜡以及蜡或脂肪物质。在一些实施方案中，该药物组合物为洗剂。在一些实施方案中，该洗剂以粉末或冻干产品的形式提供给受试者(或施用该洗剂的受试者)，在临使用前将其重建。

将药物组合物直接施用于眼部可避免治疗剂在除眼部之外的位置中的任何不期望的脱靶效应。例如，静脉内或全身施用药物组合物可导致抑制除眼部细胞之外的细胞中的基因表达，在该细胞中抑制该基因可能具有有害作用。

在一些实施方案中，所述药物组合物包含编码任一种本文公开的核酸分子(例如，shRNA、指导RNA、核酸酶编码的多核苷酸)的多核苷酸载体。在一些实施方案中，该多核苷酸载体为表达载体。在一些实施方案中，该多核苷酸载体为病毒载体。在一些实施方案中，该药物组合物包含病毒，其中该病毒将载体和/或核酸分子递送至受试者的细胞。在一些实施方案中，该病毒为逆转录病毒。在一些实施方案中，该病毒为慢病毒。在一些实施方案中，该病毒为腺伴随病毒(AAV)。在一些实施方案中，该AAV选自血清型1、2、5、7、8和9。在一些实施方案中，该AAV为AAV血清型2。在一些实施方案中，该AAV为AAV血清型8。

由于对免疫系统几乎无刺激以及在不分裂的视网膜细胞中提供持续多年的表达的能力，AAV对于本文所公开的方法可能特别有用。AAV可以能够转导视网膜内的多种细胞类型。在一些实施方案中，所述方法包括AAV的玻璃体内施用(例如，注射到眼睛的玻璃体液中)。在一些实施方案中，该方法包括AAV的视网膜下施用(例如，注射到视网膜下)。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物包含在AAV载体中的外源可调节的启动子系统。作为非限制性实例，该外源可调节的启动子系统可为四环素诱导型表达系统。

本文公开的药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物。用于本药物组合物的药学上可接受的盐、赋形剂或媒介物包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、递送媒介物、张度剂、助溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。

中性缓冲盐水或混有血清白蛋白的盐水可以是示例性的合适载体。所述药物组合物可包含抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如吐温(Tween)、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。同样作为示例，合适的张度增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢也可用作防腐剂。合适的助溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或润湿剂包括失水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal)等。缓冲液可为常规缓冲液，诸如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸盐缓冲液的pH可为约4-5.5，Tris缓冲液的pH可为约7-8.5。另外的药物剂在Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990中阐述。

所述组合物可为液体形式或冻干或冷冻干燥形式，并可包含一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨胀剂(参见例如，美国专利号6,685,940、6,566,329和6,372,716)。在一个实施方案中，包含冻干保护剂，该冻干保护剂为非还原糖如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常包含的冻干保护剂的量使得在重建时，所得制剂将会是等渗的，尽管高渗或轻度低渗的制剂也可能是合适的。此外，冻干保护剂的量应足以防止蛋白质在冻干时不可接受的量的降解和/或聚集。预冻干制剂中糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂的浓度为约10mM至约400mM。在另一个实施方案中，包含表面活性剂，例如非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；聚(乙二醇)苯基醚(例如，Triton)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基-磺基甜菜碱、十四烷基-磺基甜菜碱、亚油酰基-磺基甜菜碱或十八烷酰-磺基甜菜碱；十二烷基-肌氨酸、十四烷基-肌氨酸、亚油酰基-肌氨酸或十八烷酰-肌氨酸；亚油酰基-甜菜碱、十四烷基-甜菜碱或十六烷基-甜菜碱；十二烷酰胺基丙基-甜菜碱、椰油酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、十四烷酰胺基丙基-甜菜碱、十六烷酰胺基丙基-甜菜碱或异十八酰胺丙基-甜菜碱(例如，十二烷酰胺丙基)；十四烷酰胺基丙基-二甲胺、十六烷酰胺基丙基-二甲胺或异十八酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基(ofeyl)牛磺酸二钠；MONAQUAT^TM系列(MonaIndustries，Inc.，Paterson，N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，普朗尼克(Pluronics)、PF68等)。可存在于预冻干制剂中的表面活性剂的示例性量为约0.001-0.5％。高分子量结构添加剂(例如，填充剂，粘合剂)可包括例如阿拉伯树胶、白蛋白、藻酸、磷酸钙(二碱式)、纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、葡聚糖、糊精、葡萄糖结合剂、蔗糖、侵填体(tylose)、预胶凝淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、膨润土、麦芽糖、山梨糖醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔胶、液体葡萄糖、可压缩糖、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、藻酸钠、黄蓍胶微晶纤维素、淀粉和玉米醇溶蛋白。高分子量结构添加剂的示例性浓度为按重量计0.1％-10％。在其他实施方案中，可包含膨胀剂(例如，甘露糖醇，甘氨酸)。

组合物可适用于肠胃外给药。示例性的组合物适用于通过技术人员可用的任何途径(诸如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径)向动物注射或输注。肠胃外制剂通常将会是无菌、无热原的等渗水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。

非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏右旋糖的补充剂等。还可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。通常参见Remington'sPharmaceutical Science,第16版,Mack Eds.,1980。

本文所述的组合物可配制用于以提供产品的局部浓度(例如，团注、贮库(depot)效应)和/或在特定局部环境中稳定性或半衰期增加的方式进行受控或持续递送。该组合物可包含本文公开的多肽、核酸或载体与提供活性剂的受控或持续释放的颗粒制品(聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等以及药剂如生物可降解的基质、可注射的微球、微胶囊颗粒、微胶囊、生物可侵蚀的颗粒珠、脂质体和可植入递送装置)的制剂，该制剂随后可作为贮库型注射剂递送。用于配制这样的持续或受控递送手段的技术是已知的，并且已经开发了多种聚合物并用于药物的受控释放和递送。这样的聚合物通常是生物可降解的和生物相容的。由于参与捕获生物活性蛋白质剂的温和和水性条件，聚合物水凝胶，包括由对映异构体聚合物或多肽片段络合形成的聚合物水凝胶以及具有温度或pH敏感性质的水凝胶可能是提供药物贮库效应所期望的。参见例如WO 93/15722中对用于递送药物组合物的控释多孔聚合物微粒的描述。

适用于此目的的材料可包括聚交酯(参见例如美国专利号3,773,919)、聚(α-羟基羧酸)聚合物如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988A)、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。其他生物可降解的聚合物包括聚(内酯)、聚(缩醛)、聚(原酸酯)和聚(原碳酸酯)。持续释放组合物还可包含脂质体，该脂质体可通过本领域已知的若干种方法中的任一种制备(参见例如Eppstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-92(1985))。载体本身或其降解产物应在靶组织中是无毒的，且不应进一步加重病况。这可通过在目标病症的动物模型中进行常规筛选来确定，或者，如果这样的模型不可用，则在正常动物中进行筛选。

适用于肌内、皮下、肿瘤周围或静脉内注射的制剂可包含生理上可接受的无菌水性或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重建成无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛(cremophor)等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。通过例如使用涂层如卵磷脂、通过在分散剂的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。适用于皮下注射的制剂还含有可选的添加剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。

对于静脉内注射，活性剂可任选地在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液如Hank溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。

肠胃外注射任选地包括团注或连续输注。用于注射的制剂任选地以添加有防腐剂的单位剂量形式呈现，例如在安瓿或多剂量容器中。本文所述的药物组合物可为适用于以在油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液的形式肠胃外注射的形式，并含有配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物制剂包括处于水溶性形式的活性剂水溶液。此外，任选地将悬浮液制备为适当的油性注射悬浮液。

备选地或另外地，可通过将已吸收或封装本文公开的治疗剂的膜、海绵或其他合适材料植入患处来局部施用该组合物。在使用植入装置的情况下，可将该装置植入任何合适的组织或器官中，并且本文公开的治疗剂、核酸或载体的递送可经由团注或经由连续施用或经由导管使用连续输注直接通过该装置进行。

包含本文公开的治疗剂的某些制剂可口服施用。以该方式施用的制剂可与常用于调配固体剂型如片剂和胶囊的那些载体一起配制或不一起配置。例如，可将胶囊设计成当生物利用度最大化并且首过降解最小化时在胃肠道内释放该制剂的活性部分。可包含其他的药剂以促进选择性结合剂的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。

鉴于本公开内容和配制技术的常识，可根据预期的施用途径、递送形式和期望的剂量来确定合适的和/或优选的药物制剂。无论施用方式如何，均可根据患者体重、体表面积或器官大小计算有效剂量。

用于为涉及本文所述的每种制剂的治疗确定适当剂量的计算的进一步细化在本领域中常规进行，并在本领域常规执行的任务范围内。可通过使用适当的剂量-响应数据来确定合适的剂量。

“药学上可接受的”可指对于在包括人在内的动物中的应用，联邦或州政府的管理机构已批准或可批准，或列于美国药典或其他普遍认可的药典中。

“药学上可接受的盐”可指药学上可接受且具有期望的母体化合物药理学活性的化合物的盐。

“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”可指这样的赋形剂、载体或佐剂，其可与本公开内容的至少一种抗体一起施用于受试者，并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时不破坏该至少一种抗体的药理学活性且是无毒的。

“药学上可接受的媒介物”可指与本公开内容的至少一种抗体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于可注射给药。在一些实施方案中，所述方法包括注射该药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括经由眼内注射施用液体形式的药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括经由眼周注射施用液体形式的药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括经由玻璃体内注射施用液体形式的药物组合物。虽然这些施用模式中的一些可能对受试者没有吸引力(例如，玻璃体内注射)，但它们在渗透眼屏障方面可能是最有效的，并且与滴眼剂相比，治疗剂可能不太会被眼泪或眨眼冲走，这提供了便利性和低负担。

在一些实施方案中，所述方法包括全身施用药物组合物。在一些实施方案中，治疗剂为多核苷酸载体，其中多核苷酸载体包含指导RNA、反义寡核苷酸或Cas编码多核苷酸。多核苷酸载体可包含用于以细胞特异性方式驱动载体的核酸分子表达的条件启动子。作为非限制性实例，该条件启动子可仅在视网膜神经节细胞中驱动表达，或仅将表达驱动至在视网膜神经节细胞中具有功能作用的水平。

在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于非注射给药。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于局部给药。作为非限制性实例，核酸分子可悬浮在适用于滴入眼中的盐溶液或缓冲液中。

在一些实施方案中，所述药物组合物可被配制为滴眼剂、凝胶、洗剂、软膏、悬浮液或乳液。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为固体制品，诸如眼部插入物。例如，眼部插入物可与在一段时间内释放药物组合物的接触镜类似地形成或成型，从而有效地输送延长释放制剂。凝胶或软膏可施用于眼睑下或眼睑内或眼角中。

在一些实施方案中，所述方法可包括在临睡前或在受试者可保持闭眼的一段时间之前施用药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括指示受试者保持眼睛闭合或施用覆盖物(例如，绷带、胶带、眼罩)，以保持在施用药物组合物后眼睛闭合至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时或至少8小时。该方法可包括指示受试者在施用药物组合物后1分钟至8小时保持眼睛闭合。该方法可包括指示受试者在施用药物组合物后1分钟至2小时保持眼睛闭合。该方法可包括指示受试者在施用药物组合物后1分钟至30分钟保持眼睛闭合。

在一些实施方案中，所述方法包括仅向受试者施用一次药物组合物以治疗青光眼。在一些实施方案中，该方法包括第一次和第二次施用药物组合物以治疗青光眼。第一次和第二次可间隔一小时至十二小时的时间段。第一次和第二次可间隔一天至一周的时间段。第一次和第二次可间隔一周至一个月的时间段。在一些实施方案中，该方法包括每天、每周、每个月或每年向受试者施用药物组合物。在一些实施方案中，该方法可包括最初进行积极治疗，逐渐减少为维持治疗。作为非限制性实例，该方法可包括最初注射药物组合物，随后以滴眼剂形式施用药物组合物来维持治疗。此外，作为非限制性实例，该方法可包括最初在约1周至约20周每周施用药物组合物的注射，随后每二至十二个月经由注射或局部给药来施用药物组合物。

在一些实施方案中，所述治疗剂为小分子抑制剂，并且将药物组合物配制用于口服施用。

某些术语

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与所请求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同含义。应理解，前文的一般描述和下文的实施例仅是示例性和解释性的，并非限制任何所请求保护的主题。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。必须指出，除非上下文另有明确规定，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个指代物。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”的使用并不是限制性的。

如本文所用的，范围和量可表示为“约”特定值或范围。约还包括确切的量。例如，“约5μL”意指“约5μL”，也指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差范围内的量。术语“约”包括所提供的值减10％至加10％范围内的值。例如，“约50％”指“45％至55％之间”。另外，举例而言，“约30”指“27至33之间”。

本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应被解释为限制所描述的主题。

如本文所用，术语“个体”、“受试者”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物为人。在一些实施方案中，该哺乳动物为非人的哺乳动物。

术语“统计学显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常指比标志物的正常浓度或更低浓度低两个标准偏差(2SD)。该术语是指统计学证据表明存在差异。它被定义为当零假设实际为真时，作出拒绝零假设的决定的概率。该决定通常使用p值作出。小于0.05的p值被认为是统计学显著的。

如本文所用的，术语“治疗”和“处理”是指向受试者施用有效量的组合物，使得受试者的疾病的至少一种症状减轻或疾病改善，例如，具有有益或期望的临床结果。对于本发明来说，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状减轻、疾病程度降低、疾病状态稳定(例如，不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和，以及缓解(部分或全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。需要治疗的受试者包括已被诊断患有疾病或病况的受试者，以及由于遗传易感性或其他有助于该疾病或病况的因素而易于发展出该疾病或病况的受试者，作为非限制性实例，受试者的体重、饮食和健康是可能导致受试者易于发展出糖尿病的因素。需要治疗的受试者还包括需要医疗或手术关注、护理或管理的受试者。

无需进一步阐述，相信本领域技术人员利用以上描述可最大程度地利用本发明。以下实施例仅是说明性的，并非以任何方式限制本公开内容的其余部分。

实施例

通过使用遗传相关性和功能性研究的组合，本文提供的实施例表明SIX6风险变体在细胞培养物、动物模型和人类青光眼视网膜中增加P16/INK4A表达并导致RGC衰老。

另外，这些实施例表明SIX6风险变体(rs33912345，His141Asn)的遗传效应被另一种主要的POAG风险基因P16/INK4A(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A)加强。纯合SIX6风险等位基因(CC)的上调导致P16/INK4A表达随着后续细胞衰老而增加，如在IOP升高的小鼠模型中和在人类POAG眼中所证明的。这些数据表明，SIX6和/或IOP通过直接增加P16/INK4A表达从而导致成年人视网膜中的RGC衰老来促进POAG。

本文描述的实施例和实施方案仅出于说明的目的，并非意在限制本文提供的权利要求的范围。本领域技术人员想到的各种修改或变化都将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。

实施例1.SIX6-rs33912345与POAG风险的相关性

将POAG病例定义为这样的个体，其在可靠的视野(VF)测试中显示出符合青光眼性视神经病的特征性VF缺陷。如果在随后的测试中重现VF缺陷，或者如果单一的符合条件的VF伴随着至少一只眼睛中0.7或更大的杯盘比(CDR)，则将个体分类为受到影响。眼前段的检查不显示IOP升高的继发性原因的体征，如剥脱综合征或色素播散综合征，并且过滤结构被认为基于临床测量是开放的。对照具有正常的视神经(杯盘比≤0.6)和正常的眼内压。

进行遗传相关性研究，并且SIX6的一个错义变体-rs33912345(NM_007374.2:c.421C>A；NP_031400.2:p.His141Asn)与POAG密切相关。为了进一步研究高加索人群中SIX6-rs33912345与POAG之间的遗传相关性，在1130位POAG患者和4036位对照中利用单核苷酸引物延伸实验对SIX6基因中的rs33912345(C/A)进行基因型分型。在POAG患者中SIX6中rs33912345的C风险等位基因频率(0.46)显著高于对照(0.38)，等位基因P＝4.49E-12，比值比(OR)1.39，95％，CI 1.27–1.53(表1)。

表1.SIX6与POAG的相关性

用于基因型分型的引物列于表2中。一式三份地进行测定。利用GAPDH通过结果的归一化计算相对mRNA水平。用于qRT-PCR的引物列于表2中。采用独立的双样本t检验分析定量PCR数据的差异。采用卡方检验针对与Hardy-Weinberg平衡的偏离筛选SNP基因型分型结果。经由利用程序PLINK进行的卡方检验来计算等位基因相关性(Purcell等人，2007)(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)。还针对该检验生成无症状p值。

表2.引物序列信息

SIX6中的人类风险等位基因His141是跨物种保守的(表3)，并且氨基酸141位于SIX6蛋白的同源域中。

表3.SIX6His 141(H/N，粗体)的跨物种保守性

利用患有POAG的墨西哥人群组进行重复研究，并发现了显著相关性(P＝0.11)(表4)。随后利用这两个群组和文献(Carnes等人，2014)中报道的另一群组进行荟萃分析(meta-analysis)。总之，合并的结果表明显著的相关性(等位基因P＝4.84E-16，表4)。

表4.POAG中SNP rs33912345的荟萃分析结果

采用ICM软件(Cardozo等人，1995)进行计算机建模分析以研究SIX6 His141Asn变异对SIX6的三维结构和功能的影响。从未将SIX6转录因子结晶以供X射线分析或通过NMR进行研究。为了围绕H141N变异建立DNA结合域的结构模型，在蛋白质数据库中搜索同源转录因子。该搜索确定了以下具有相关转录因子的片段的条目：2dmu、1qry、1vnd、1yrn、2lkx，并且2个通过晶体学或NMR进行解析。随后尝试对鉴定的结构域进行结构叠加。全部结构域均具有结构上(拓扑学上)相似的DNA结合基序，覆盖了约134至189残基的区域。通过使SIX6序列穿(threading)到共有结构上采用ICM软件(Cardozo等人，1995)对134至189残基建立SIX6的结构同源性模型。3D建模表明该残基位于DNA结合表面以外，从而预测该残基对DNA结合无影响(图2A)，但可能会影响SIX6与其他转录因子和辅因子相互作用的能力。

为了在体内评估两种SIX6变体与DNA调节元件结合的效率，首先通过对分离自野生型(WT)和SIX6敲除(KO)的视网膜(转染后48h收获的细胞)的染色质进行染色质免疫沉淀(ChIP)测定来测试SIX6抗体的特异性。SIX6蛋白与p27调节元件有效地结合(图3A)。使用相同的方法，观察到SIX6蛋白的His141和Asn141两种变体以相似的效率与来源于患者的类淋巴母细胞中的p27调节元件结合(图2B)。此外，HEK293T细胞中过表达的HA标记形式的SIX6与p27调节元件结合。采用对SIX6蛋白或HA标签具有特异性的抗体进行的ChIP实验表明，两种形式的SIX6蛋白(His141和Asn141)均与p27调节区有效地结合(图3B，图3C)。得出以下结论：残基141的任一种变体的存在都不能改变SIX6与这种已知DNA调节元件的结合效率。

实施例2.SIX6和P16/INK4A对POAG风险的联合效应

由于SIX6和P16是显示与POAG风险的最强遗传相关性的两种基因，因此使用逻辑回归模型和计算的比值比(OR)研究SIX6-rs33912345和P16/INK4A-rs3731239对POAG风险的联合效应。通过逻辑回归模型(Chen等人，2010；Chen等人，2011)计算SIX6-rs33912345(C/A)和P16/INK4A-rs3731239(A/G)的联合效应。构建整体双基因座(9′2)相依表，其列举了全部9个双基因座基因型组合。根据先前描述的方法(Chen等人，2010；Chen等人，2011)，计算比值比和95％置信区间，从而针对两个基因座处的共同等位基因比较每个基因型组合与纯合性的基线。

与非风险等位基因SIX6-rs33912345AA和P16/INK4A-rs3731239GG的基线的OR相比，风险等位基因SIX6-rs33912345CC和P16/INK4A-AA的OR为2.73(P<0.05，CI(1.63-4.62)，图4A和表5)，表明了其对POAG风险的联合效应。

表5.逻辑回归分析，SIX6(rs33912345；p16INK4a(rs3731239))

*p<0.05

为了研究SIX6-rs33912345和P16/INK4A-rs3731239基因型与SIX6和P16/INK4A的表达之间的关系，使用逆转录然后进行定量PCR(RT-qPCR)来测量两种基因在来源于患者的人类类淋巴母细胞中的mRNA水平。在携带SIX6风险等位基因的细胞系中检测到较高的SIX6水平(1.4倍)。此外，P16/INK4A mRNA在具有风险基因型的细胞中的表达是在具有保护基因型的细胞中的表达的2.3倍(图4B)。进一步测量了在来自健康和青光眼患者的视网膜中P16/INK4A mRNA的水平，并观察到在患有青光眼的眼睛中有显著升高的表达(图5B)。为了研究P16/INK4A的升高的表达是否与增加的细胞衰老有关，对健康和青光眼的人类视网膜进行衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-βgal)测定。一致的是，来自青光眼患者的视网膜表现出增加的衰老，如通过神经节细胞层(GCL)中显著较高数目的蓝色阳性细胞所指示的(图4C、图4D和图5A)。

实施例3.Six6对P16/INK4A的转录调节

为了研究SIX6是否参与P16/INK4A的转录调节，使SIX6-His141或SIX6-Asn141变体在人类胎儿视网膜祖细胞(fRPC)中瞬时表达，并使用RT-qPCR定量P16/INK4A mRNA水平。

如前所述，从16周胎龄的人类胎儿神经视网膜分离出fRPC(Luo等人，2014)。从RPE层分离出整个视神经视网膜，将其切碎并用胶原酶I消化。将细胞和细胞群集接种到在低氧培养箱(37℃、3％O₂、5％CO₂、100％湿度)中的Ultraculture培养基中的人纤连蛋白(Akron)涂覆的烧瓶中，该培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、10ng/ml rhbFGF和20ng/mlrhEGF。利用TrypZean、核酸酶和确定的胰蛋白酶抑制剂在80％汇合下使细胞传代。

在SIX6-His141转染的细胞中观察到P16/INK4A mRNA显著较高的表达(图6A)。当SIX6-His141和SIX6-Asn141在HEK293T细胞中以相似的水平过表达时观察到类似的趋势(图6B、图6C)，这表明SIX6的变异的影响不是细胞类型特异性的。为了测试两种HA标记的SIX6蛋白变体是否均可以直接与P16/INK4A启动子结合，使用抗-SIX6和抗-HA抗体进行ChIP测定。两种蛋白质变体均以相似的效率与P16/INK4A启动子结合(图6D，未示出)。总之，这些数据表明SIX6可充当P16/INK4A基因的直接激活剂，并且SIX6-His141变体更有可能激活P16/INK4A表达。

考虑到P16/INK4A的升高的表达是细胞衰老的标志，对通过SIX6的任一种变体(SIX6-His141和SIX6-Asn141)的瞬时过表达导致的fRPC的衰老进行了测试。有趣的是，转染后仅24h，表达SIX6-His141变体的fRPC细胞就经历了两次衰老，这与在对照条件下的那些细胞或用SIX6-Asn141变体转染的那些细胞一样容易，如通过SA-β-gal测定和通过衰老的分泌性标志物IL6的上调所评估的(图6E、图6F和图7)。总之，这些数据表明SIX6-His141风险变体通过直接诱导P16/INK4A表达而增加fRPC的衰老。

实施例4.急性青光眼小鼠模型中SIX6和P16/INK4A的上调

实验性高眼压症小鼠模型已广泛用于研究IOP与青光眼性视神经病的机理之间的关系(Gross等人，2003)。为了研究青光眼在SIX6-His风险变体和P16/INK4A表达的环境中的相关性，使用了小鼠青光眼模型。通过将盐溶液滴注到前房中实现1月龄C57BL/6J、p16^-/-、Thy1-CFP(Lindsey等人，2013)、Six6^+/-(Larder等人，2011)、p53^-/-(129-Trp53tm1Tyj/J，The Jackson Laboratory)小鼠的IOP的单侧升高，并维持在70mm Hg的高压下。对p16^-/-系进行工程化以去除共同的外显子E2和E3，因此该系为p16和p19/Arf基因的无效等位基因(Serrano等人，1996)。通过眼压计测量IOP。为了在实验上提升IOP，首先用基于体重的氯胺酮(80mg/kg)、赛拉嗪(16mg/kg)的腹膜内注射将动物麻醉。以45分钟的间隔经由相同途径提供附加麻醉。采用单滴0.5％盐酸丙美卡因实现角膜麻醉。随后将一滴0.5％盐酸丙美卡因和0.5％托吡卡胺施加于右眼。采用水热垫使体温维持在37℃至38℃。使用30号针头刺穿右眼的中间周围角膜；用无菌生理盐水(平衡盐溶液)对前房进行插管；并且通过调节盐水高度以测压方式控制IOP。用压陷眼压计(Tonolab；Icare，Espoo，Finland)监测IOP并在90mm Hg压力下维持一小时。在实验后5天收获的视网膜平铺封固片中对RGC的衰老进行评估。简而言之，用CO₂对小鼠施以安乐死，切开眼球，并将其固定在冰冷磷酸盐缓冲的4％低聚甲醛(pH7.4)中持续30分钟，然后将视网膜平铺封固。

首先，对小鼠Six6基因的序列进行分析，揭示了小鼠基因组仅编码Six6-His变体(参见表4)。Western印迹分析证实SIX6在成年视网膜中的表达水平与在胚胎期观察到的水平相当(图8A)。当IOP升高后5天测量Six6和P16/INK4A mRNA水平时，来自IOP处理的眼睛的视网膜中Six6和P16/INK4A mRNA表达水平均显著高于对照眼睛中的表达水平(图8B)。还注意到在IOP升高时p15/CDKN2B和p19/ARF的表达增加(图9A、图9B)。

由于在细胞培养物中工程化表达时SIX6与P16/INK4A启动子结合(图6D)，因此还在体内测试了成年小鼠视网膜中SIX6与该启动子的结合。为了测试该结合，比较了从野生型和Six6KO视网膜分离的染色质中的ChIP效率。仅能在野生型视网膜中观察到可检测信号，而在Six6^-/-视网膜中则不能观察到可检测信号(图9C)。另外，研究了通过IOP升高是否改变视网膜中SIX6与P16/INK4A启动子的结合。在从IOP升高的视网膜和对照视网膜分离的染色质中进行ChIP-qPCR测定，并观察到在IOP升高时SIX6与P16/INK4A启动子的结合显著提高(图8C)。这一现象与组蛋白乙酰转移酶p300(P16/INK4A表达的已知辅激活因子)的募集升高(图8D)以及组蛋白H3的泛乙酰化(与活性调节元件相关的修饰)增加(图8E)有关。重要的是，在IOP升高时Six6没有募集至p19ARF或p15/CDKN2B启动子(图9D)，这表明SIX6对P16/INK4A的影响是基因特异性的。随后利用SA-β-gal测定来测试经处理的视网膜中的细胞是否经历衰老。正如所预期的，与在未处理的视网膜中观察到仅有极少数衰老细胞相比，在5只测试小鼠中的5只小鼠中，观察到IOP处理的视网膜中的衰老细胞急剧积累(图8F和图9E)。

进一步研究了在IOP处理的视网膜中RGC是否经历了衰老。视网膜横截面的图像表明大多数衰老细胞位于GCL(图10A)。利用抗-Brn3a抗体(RGC标志物)对IOP处理和未处理的平铺封固视网膜进行免疫组织化学。大部分β-半乳糖苷酶阳性细胞还是BRN3A阳性的(图10B)。通过比较Thy1-CFP转基因小鼠中的β-gal染色模式证实了这些发现，其中所述RGC通过CFP荧光进行特异性标记(图10C和图11A)。对于双重染色，在衰老测定之后进行抗-GFP抗体染色以揭示Thy1-CFP视网膜的完整荧光。

研究了在培养的RGC中，SIX6变体的工程化表达对p16/INK4A和衰老相关的分泌表型标志物IL6的表达的影响。通过利用抗-Thy-1抗体(Winzeler和Wang，2013提供了该抗体的描述)进行免疫筛选来分离来自大鼠视网膜的RGC(图10D)。根据公开的详细方案(Winzeler和Wang,2013)进行免疫筛选程序和视网膜神经节细胞培养。通过细胞形态学以及相对于全部视网膜细胞的分离的RGC中的Brn3a表达水平来验证该程序的功效(图11D，图11E)。值得注意的是，仅在引入Six6的His变体的RGC中观察到p16和IL6的表达增加(图10E、图11F、图11G)。一致的是，IOP处理的视网膜中的IL6阳性RGC明显多于对照中的IL6阳性RGC(图11B，图11C)。总之，这些数据表明RGC是该青光眼模型中受影响的主要细胞。

实施例5.Six6或p16的缺乏防止青光眼中的RGC死亡

使用杂合小鼠测试SIX6在诱导的衰老和P16/INK4A表达的调节中的作用。如前所述，实施急性眼内压升高并在IOP后5天收集视网膜并进行测定。与野生型同窝仔畜相反，在SIX6^+/-视网膜中IOP升高时减少的SIX6表达伴有减少的P16/INK4A表达(图12A，图12B)。有趣的是，在SIX6^+/-小鼠中没有观察到β-gal阳性细胞(图12C，图13)，这表明SIX6的单倍剂量不足足以防止RGC的衰老。

总之，这些结果表明了这样一种模型，其中增加的P16/INK4A表达是青光眼中细胞衰老的主要原因。与以上数据一致，p16/INK4a表达的缺乏防止了RGC死亡(图12D)。

为了测试P53的缺乏是否可以防止由IOP升高引起的RGC死亡，将来自p53^-/-小鼠的IOP处理的小鼠视网膜中的RGC数目与IOP处理的野生型小鼠进行比较。与野生型小鼠相比，p53的缺乏显著地减少了IOP时的RGC死亡(图12E)。还观察到P53的错义变体(rs1042522(NM_000546.5:c.215C>G；NP_000537.3:p.Pro72Arg))与POAG的遗传相关性，这与其在青光眼发病机理中的作用一致(参见表6)。

表6.p53-rs1042522(Pro72Arg)风险等位基因与POAG的相关性

总之，这些发现产生了这样一种模型(图12F)，其中IOP升高通过增加的SIX6表达以及SIX6(特别是His变体)与p16/INK4A启动子(特别是His变体)的结合导致P16/INK4A的上调。增加的p16/INK4A表达导致RGC进入细胞衰老。延长的衰老可导致视网膜神经节细胞死亡增加和随之而来的失明。

实施例6.用CRISPR/Cas进行视网膜的p16基因编辑

比较对照小鼠与具有视网膜p16基因编辑的小鼠的眼内压升高后的RGC数量。处理的示意图示于图14中。

质粒构建。使用pX552(Addgene，#60958)进行AAV包装和体内转导(参见图15)。除了sgRNA表达之外，该质粒还促进对细胞核的荧光辅助分选。该质粒含有两个表达盒：EGFP-KASH和用于克隆新的靶向质粒的sgRNA骨架。可用SapI消化该质粒，从而产生用于连接根据靶位点序列(20bp)设计的退火和磷酸化DNA寡核苷酸的粘性末端。通过以下方法克隆载体：采用SapI进行骨架载体消化，进行寡核苷酸磷酸化退火反应以产生具有对应于SapI生成的载体粘性末端的突出端的sgRNA插入片段，以及进行磷酸化/退火的寡核苷酸与消化的载体的连接反应。将载体转化并进行微量制备以供测序。

根据制造商的说明书将sgRNA插入片段克隆至pX552载体中。用于将G1、G2gRNA克隆至pX552载体中的序列为：pX552-G1-F：ACCGCCGAAAGAGTTCGGGGCGT；pX552-G1-R：AACACGCCCCGAACTCTTTCGGC；pX552-G2-F：ACCGGTACGACCGAAAGAGTTCG；pX552-G2-R：AACCGAACTCTTTCGGTCGTACC。

玻璃体内注射。本研究中使用第5天的C57BL/6小鼠。通过腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪的混合物将小鼠麻醉。用1％局部用托吡卡胺扩张瞳孔。使用AAV血清型2/8转导神经节细胞。对于玻璃体内注射，将1μL的Cas9和gRNA病毒混合物注射至玻璃体腔中(AAV8-Cas9:AAV8-p16gRNA1:AAV8-p16gRNA2＝1:0.5:0.5，AAV8-Cas9为1.5x10¹⁰GC)，或1μL的PBS作为对照。10天后对同一动物重复相同的注射。使小鼠再保持3周以诱导急性青光眼。

急性青光眼的动物模型。通过使用100mg/kg氯胺酮和10mg/kg赛拉嗪的混合物的腹膜内注射使小鼠麻醉。用0.5％盐酸丁卡因局部麻醉角膜，并用1％托吡卡胺扩张瞳孔。用连接至正常盐水储器的30号输注针头对眼前房进行插管，将储器升高以维持110mmHg的眼内压(Tono-Pen；Medtronic Solan)持续60min。1h后，取出针头并使眼内压正常。在处死前使动物恢复1周。

视网膜平铺封固片和RGC量化。将小鼠处死并摘出其眼睛，并在4％低聚甲醛中固定1h。在制备视网膜平铺封固片之后，通过使用单克隆小鼠抗-Brn3a(1:200)鉴定RGC。通过与Alexa Fluor 555驴抗小鼠IgG(1:500)一起温育使抗体结合可视化。通过使用KeyenceBZ-9000显微镜获得图像。通过利用Image Pro Plus(6.0版；Media Cybernetics)对存活的RGC(亮红色的点)进行计数。结果示于图16中。

接受假处理(眼内压未升高)的小鼠中的细胞计数为大约1600个细胞/视野。在不存在p16基因编辑的情况下IOP升高的小鼠中的细胞计数为大约600个细胞/视野。在p16基因编辑后接受IOP的小鼠中的细胞计数为大约1000个细胞/视野。在没有基因编辑的情况下接受IOP的细胞与在有基因编辑的情况下接受IOP的细胞之间的差异是统计上显著的(p<0.05)。因此，得出以下结论：p16基因编辑针对IOP对RGC细胞衰老的影响提供大约50％的救援。

实施例7.p16siRNA、shRNA和指导RNA

表7提供了如本文所述用于改变p16基因表达的示例性siRNA、shRNA和指导RNA靶标。此外，表7提供了用于设计如本文所述用于改变p16基因表达的附加寡核苷酸的p16中的靶序列。

表7.用于改变p16表达的寡核苷酸

表8.野生型人基因编码序列(仅外显子)

Claims (30)

1.一种治疗受试者的青光眼或其症状的方法，该方法包括向该受试者的眼睛施用：

a)与基因的靶位点杂交的指导RNA，其中所述基因编码促成青光眼或其症状的蛋白质；以及

b)在所述靶位点切割所述基因的链的Cas核酸酶，

其中切割所述链改变所述基因的表达，从而减少所述蛋白质对青光眼或其症状的贡献。

2.根据权利要求1所述的方法，包括施用修复模板以代替所述基因的一部分。

3.根据权利要求1所述的方法，包括减少所述蛋白质的表达或降低所述蛋白质的活性。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法导致减少眼睛中的视网膜神经节细胞衰老。

5.根据权利要求1所述的方法，包括在选自载体、脂质体和核糖核蛋白的递送媒介物中施用编码所述Cas核酸酶的多核苷酸和所述指导RNA。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因为p16基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者携带野生型p16基因的p16等位基因变体，其中所述野生型p16基因包含SEQ ID NO.36的编码序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述p16等位基因变体携带促成青光眼或其症状的单核苷酸多态性。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述单核苷酸多态性为rs1042522处的丙氨酸残基。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述指导RNA将所述Cas核酸酶靶向选自SEQ IDNO：17-35的p16基因的序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因为Six6基因。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者携带野生型p16基因的p16等位基因变体，其中所述野生型p16基因包含SEQ ID NO.37的编码序列。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Six6基因包含rs33912345处胞嘧啶的单核苷酸多态性。

14.一种治疗受试者的青光眼的方法，该方法包括向该受试者的眼睛施用与p16信使RNA杂交的反义寡核苷酸，从而经由RNA干扰减少p16基因的表达。

15.根据权利要求14所述的方法，其中减少p16基因的表达减少了视网膜神经节细胞衰老。

16.根据权利要求15所述的方法，其中视网膜神经节细胞衰老减少约10％至约90％。

17.根据权利要求15所述的方法，其中视网膜神经节细胞衰老减少至少约40％。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述反义寡核苷酸为由选自SEQ ID NO：9-13的序列编码的短发夹RNA。

19.根据权利要求14所述的方法，其中所述反义寡核苷酸在多核苷酸载体、脂质体或核糖核蛋白中施用。

20.一种用于治疗青光眼的药物组合物，其包含：

a.编码Cas蛋白的多核苷酸；以及

b.与选自p16基因和Six6基因的基因的一部分互补的指导RNA。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其包含修复模板，其中所述指导RNA将所述Cas蛋白靶向所述基因，从而导致所述基因的Cas介导的切割和所述修复模板的插入。

22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中编码所述Cas蛋白的多核苷酸和所述指导RNA存在于至少一个病毒载体中。

23.根据权利要求20所述的药物组合物，其中编码所述Cas蛋白的多核苷酸或所述指导RNA存在于脂质体中。

24.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述p16基因包含SEQ ID NO：36的编码序列。

25.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述p16基因的一部分包含rs1042522处丙氨酸残基的单核苷酸多态性。

26.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述指导RNA将所述Cas核酸酶靶向选自SEQ ID NO：17-35的p16基因的序列。

27.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述Six6包含SEQ ID NO：37的编码序列。

28.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述Six6基因的一部分包含rs33912345处胞嘧啶的单核苷酸多态性。

29.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成用于采用滴眼管施用的液体。

30.根据权利要求20所述的药物组合物，其中药物组合物被配制成用于玻璃体内施用的液体。